ES2402956T3 - Péptido con formación de dímeros reducida - Google Patents

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Paul Laidler
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Abstract

Una composición que comprende: i) al menos un péptido de 9 a 25 aminoácidos de longitud en donde el péptido comprende una región quecomprende al menos un epítopo de célula T; y ii) al menos un agente que inhibe la formación de dímeros del péptido y que se selecciona entre tioglicerol ytioanisol.

Description

Péptido con formación de dímeros reducida
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a péptidos que se formulan en composiciones para evitar o reducir la formación de dímeros.
Antecedentes de la Invención
El reconocimiento de antígenos por las células T requiere que las células presentadoras de antígenos (APC) presenten fragmentos de antígenos (péptidos) sobre su superficie celular asociados con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las células T utilizan sus receptores de células T específicos de antígenos (TCR) para reconocer con una elevada especificidad los fragmentos de antígeno presentados por la APC. Dicho reconocimiento actúa como un desencadenante para que el sistema inmunitario genere una gama de respuestas para erradicar el antígeno que ha sido reconocido.
La mayor parte de la especificidad del reconocimiento por las células T de los fragmentos de antígeno es proporcionada por una subsecuencia más pequeña de aminoácidos dentro de los fragmentos. Esta subsecuencia es conocida como epítopo de célula T. En el caso de alergenos extracelulares y auto- o alo-antígenos, los péptidos son presentados sobre moléculas de Clase II del MHC, que son reconocidas por las células T CD4. Por consiguiente, se ha centrado el interés en los trastornos alérgicos y auto- o alo-inmunitarios en los epítopos de células que se unen a la Clase II del MHC.
Dado su papel en el sistema inmunitario, existe un considerable interés en tales epítopos para su uso como agentes terapéuticos para modular los sistemas inmunitarios de los sujetos. Por ejemplo, se ha demostrado que la administración de epítopos peptídicos a sujetos da como resultado la inducción de tolerancia al antígeno del cual deriva el epítopo. Los agentes terapéuticos basados en dicho efecto tienen un gran potencial en la prevención y el tratamiento de la alergia, y las enfermedades auto- o alo-inmunitarias en las que es deseable la regulación a la baja de una respuesta inmunitaria.
El progreso adicional en estas áreas se ve obstaculizado por numerosos problemas. En primer lugar, las secuencias epitópicas de los alergenos y los auto- y alo-antígenos son a menudo escasamente solubles, y por lo tanto son problemáticos tanto para su fabricación como para su administración a los sujetos. En segundo lugar, la mayor parte de los epítopos están típicamente escasamente definidos. La mayor parte de los epítopos conocidos en la técnica están vagamente identificados al ser una secuencia núcleo presente en alguna parte dentro de una secuencia más larga, típicamente de aproximadamente veinte aminoácidos. La propia secuencia núcleo a menudo no está identificada. En ausencia de una definición clara de la secuencia núcleo de un epítopo, no ha sido posible modificar los epítopos de células T conocidas para mejorar su solubilidad, puesto que esto pone en riesgo la eliminación de los residuos del núcleo para el reconocimiento por las células T.
Compendio de la invención
Los péptidos que comprenden epítopos de células T pueden ser propensos a la formación de dímeros en disolución. Esto puede dar como resultado una pérdida de especies activas y en el caso de las mezclas de diferentes péptidos puede dar como resultado heterodímeros degradantes novedosos que pueden incrementar la unión de IgE o IgG sobre la superficie de los mastocitos. La dimerización también puede conducir a la agregación de péptidos en forma de productos precipitados insolubles. De este modo, los péptidos que comprenden epítopos de células T son a menudo inapropiados para ser tolerados por un sujeto debido a que provocan respuestas inmunitarias no deseables y/o no pueden ser almacenados durante períodos de tiempo prolongados sin formar agregados y/o son problemáticos tanto para su fabricación como para su administración a sujetos.
La secuencia de aminoácidos mínima de un epítopo de células T requerida para la unión a moléculas de la Clase II del MHC se puede identificar con precisión y generalmente comprende aproximadamente nueve aminoácidos. Los autores de la presente invención han realizado el descubrimiento de que es posible reducir la formación de dímeros añadiendo ciertos agentes específicos a una composición que comprende dicho péptido. De este modo, una composición que comprende un péptido y un agente que inhibe la formación de díimeros, es una composición en la que el péptido está presente en una forma predominantemente monomérica, y por lo tanto tiene una solubilidad mejorada sin reducir la capacidad del péptido para estimular las células T específicas y sin llegar a ser suficientemente grande como para poseer una estructura terciaria significativa que le pueda permitir conservar la conformación de un epítopo de entrecruzamiento con IgG o IgE. Por consiguiente las respuestas inmunitarias aguas abajo causadas por dicho entrecruzamiento no se producen, y las composiciones están bien adaptadas para la inducción de inmunotolerancia por el individuo a la proteína de la cual deriva el péptido. Además, la formación reducida de dímeros de las composiciones de la invención tiene ventajas adicionales para la inducción de inmunotolerancia por los individuos, puesto que los dímeros de los péptidos pueden ser más inmunogénicos, debido posiblemente al entrecruzamiento con las inmunoglobulinas. Por consiguiente, la presente invención proporciona:
5 Una composición que comprende: i) al menos un péptido de 9 a 25 aminoácidos de longitud en donde el péptido comprende una región que comprende al menos un epítopo de célula T; y ii) al menos un agente que inhibe la formación de dímeros del péptido y que se selecciona entre tioglicerol y tioanisol;
10 La presente invención también proporciona: Un método in vitro para diagnosticar la presencia o ausencia en un sujeto de una respuesta inmunitaria de células T a la proteína de la cual deriva el epítopo, comprendiendo el método:
i) poner en contacto una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 o 15 9 con células T en una muestra tomada de un sujeto, en condiciones que permiten que el péptido y las células T interaccionen; y ii) determinar si algunas de las células T son estimuladas o no y de ese modo si se encuentra presente o ausente una respuesta inmunitaria de las células T.
20 Descripción detallada de la invención
Se debe entender que las referencias a la inserción, deleción, sustitución de aminoácidos en la presente memoria no requieren la inserción, deleción o sustitución física real, y que en lugar de ello se puede sintetizar un péptido que comprende una secuencia que representa (o es el resultado final de) que la inserción, deleción o sustitución se ha
25 producido.
Aminoácidos
La siguiente tabla muestra las propiedades de los aminoácidos. Los pesos moleculares se muestran debajo del
30 código de tres letras para cada aminoácido. Los pesos moleculares dados son los de los aminoácidos libres, neutros; los pesos de los residuos se pueden obtener por sustracción de un equivalente de agua (18 g/mol). Las cifras se obtuvieron de The Merck Index, (Budavari, S., ed.) Merck & Co., Rahway, (1989).
Ala 89
Alifático, hidrófobo, neutro Met 149 hidrófobo, neutro
Cys 121
polar, hidrófobo, neutro Asn 132 polar, hidrófilo, neutro
Asp 133
polar, hidrófilo, cargado (-) Pro 115 hidrófobo, neutro
Glu 147
polar, hidrófilo, cargado (-) Gln 146 polar, hidrófilo, neutro
Phe 165
Aromático, hidrófobo, neutro Arg 174 polar, hidrófilo, cargado (+)
Gly 75
Alifático, neutro Ser 105 polar, hidrófilo, neutro
His 155
aromático, polar, hidrófilo, cargado (+) Thr 119 polar, hidrófilo, neutro
Ile 131
Alifático, hidrófobo, neutro Val 117 alifático hidrófobo, neutro
Lys 146
polar, hidrófilo, cargado(+) Trp 204 aromático, hidrófobo, neutro
Leu 131
Alifático, hidrófobo, neutro Tyr 181 aromático, polar, hidrófobo
35 Epítopos de células T de la Clase II del MHC
El epítopo de células T que se une a la Clase II del MHC comprendido en los péptidos de la invención es típicamente la secuencia de aminoácidos mínima que es capaz de unirse a moléculas de Clase II y capaz de estimular las células T cuando es presentado a las células T asociado con la Clase II sobre la superficie celular. El epítopo es
40 típicamente uno que se une a una molécula de clase II del MHC humano, tal como cualquiera de las moléculas mencionadas en la presente memoria.
Una molécula de clase II del MHC consiste en dos proteínas, a y �, cada una de las cuales está codificada por un gen diferente. En los seres humanos, hay tres agrupaciones de genes que codifican diferentes proteínas a y �. Estas
45 son las agrupaciones de Antígenos Leucocitarios Humanos (HLA), DR, DQ y DP. Cada agrupación comprende múltiples genes A diferentes que codifican diferentes variantes de la proteína a y múltiples genes B diferentes que codifican diferentes variantes de la proteína �. Los heterodímeros de Clase II del MHC resultantes son por lo tanto extremadamente diversos, y consecuentemente lo son los epítopos de células T a los cuales se unen.
El sitio de unión de las moléculas del MHC de Clase II está compuesto por dos proteínas separadas que forman una hendidura. La hendidura está abierta en los extremos, lo que permite en teoría que se una un péptido de cualquier longitud. Sin embargo, solamente 9 aminoácidos pueden ocupar la propia hendidura. Las identidades de los 9 aminoácidos que ocupan la hendidura definen si un péptido dado se unirá o no a una molécula del MHC de Clase II dada y si se encuentra disponible para la presentación a las células T. Estos 9 aminoácidos representan por lo tanto la secuencia mínima que se requiere para la unión del MHC de Clase II. Generalmente se supone que dicha secuencia será capaz de estimular las células T cuando se presenta a las células T asociada con la Clase II sobre la superficie celular. No obstante, esto puede ser confirmado experimentalmente mediante métodos convencionales de la técnica.
Tales métodos pueden comprender típicamente poner en contacto el epítopo con las células T en una muestra tomada de un sujeto, en condiciones que permiten que el epítopo y las células T interaccionen; y después determinar si cualquiera de las células T está estimulada o no. La determinación de si las células T son estimuladas
o no se puede lograr mediante cualquier método adecuado, por ejemplo detectando la producción de citoquinas por las células T, en donde la producción de citoquina indica que las células T han sido estimuladas. Las citoquinas adecuadas incluyen interferón gamma, interleuquina 4 e interleuquina 13. La producción de citoquinas se puede detectar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo un análisis ELISA, ELISPOT o un análisis de citometría de flujo. Las células T de una muestra de un sujeto se encuentran típicamente presentes en una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de una muestra de sangre o suero tomada del sujeto.
El epítopo de célula T que se une al MHC de Clase II de la invención consiste típicamente en 8 o 9 aminoácidos, pero puede consistir en 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del epítopo puede ser definida en sentido amplio por su referencia adicional al sitio de unión de las moléculas del MHC de Clase II. Este sitio de unión tiene bolsillos de unión específicos, que se corresponden con las posiciones de anclaje primarias y secundarias en la secuencia del epítopo del péptido de unión. Los bolsillos de unión se definen por las posiciones de aminoácidos en la secuencia de la molécula del MHC de Clase II, y generalmente no son absolutamente discriminatorias para un aminoácido específico en el epítopo. Por lo tanto la especificidad de unión al péptido de cualquier molécula del MHC dada es relativamente amplia. De este modo, los péptidos que se unen al mismo alotipo del MHC muestran cierto grado de similitud, pero no hay un requerimiento de identidad.
Para el tipo del MHC de Clase II humano más común, HLA-DR, las posiciones de anclaje clave para la unión a los bolsillos de unión son las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 del epítopo peptídico (contando desde el residuo más N terminal que ocupa la hendidura al más C terminal). Los diferentes alelos de HLA-DR que tienen aminoácidos similares en sus bolsillos de unión se unen por lo tanto típicamente a péptidos con aminoácidos similares en las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9. Por consiguiente, la región que contiene un epítopo de células T que se une al MHC de Clase II tiene preferiblemente aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 1, 4, 6, 7 y 9 que permiten la unión a la gama más amplia de alelos HLA-DR. Los ejemplos de las propiedades de unión características de los diferentes alelos HLA-DR se exponen más abajo:
Los alelos DR con Glicina en la posición 86 de la cadena � muestran fuertes preferencias por cadenas laterales hidrófobas grandes (Trp, Tyr, Phe) en la posición 1 del péptido, mientras la Valina en la posición 86 restringe el tamaño del bolsillo y altera las preferencias hacia cadenas laterales hidrófobas pequeñas (Val y Ala) en esta posición. Los aminoácidos hidrófobos de tamaño medio Leu e Ile son bien aceptados en todos los alelos DR. Los alelos DR con Gln en la posición 70, Lisina en la posición 71, y Arginina o Gln en la posición 74 de la cadena � tienen una carga global positiva en el bolsillo 4, que requiere aminoácidos cargados negativamente Asp y Glu en la posición 4 del péptido de unión (como por ejemplo en DRB 1*0301). Los alelos DR con este motivo están asociados con dos enfermedades autoinmunitarias: lupus eritematoso generalizado y tiroiditis de Hashimoto. Los alelos DR con Gln o Arg en la posición 70, Arg o Lys en la posición 71 y Glu o Ala en la posición 74 de la cadena � se unen a péptidos similares a los inmediatamente anteriores puesto que la única diferencia significativa es en la posición 74. No obstante, cuando está presente Ala en la posición 74, el bolsillo 4 aumenta de tamaño y puede alojar aminoácidos más grandes tales como Phe, Trp, e Ile (como por ejemplo en DRB1 *0401, 04, 05). Se espera que los alelos que portan Glu en la posición 74 permitan residuos polares pequeños, como Ser y Thr en la posición 4 del péptido de unión. Los alelos DR con este motivo están asociados con una susceptibilidad a la artritis reumatoide. Los alelos DR con Asp en la posición 70, Glu o Arg en la posición 71, y Leu o Ala en la posición 74 de la cadena � excluyen los péptidos con aminoácidos cargados negativamente en la posición 4 (por ejemplo DRB 1 *0402). Esto es debido a la presencia de Asp en la posición 70. Los alelos DR con este motivo están asociados con las enfermedades autoinmunitarias Artritis reumatoide juvenil (ARJ), pénfigo vulgar, y enfermedad/síndrome broncopulmonar alérgico.
Los polimorfismos en la posición 9 de la cadena � definen el tamaño del bolsillo de unión 9 en todos los alelos DR.
Los alelos con Trp en esta posición aceptan solamente aminoácidos pequeños en la posición 9 del péptido de unión,
p. ej. Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro (como por ejemplo en DRB 1*101 y *1501). Glu en la posición 9, combinada con Asp en la posición 57, cargan negativamente el bolsillo 9, facilitando la acomodación de aminoácidos cargados positivamente, tales como Lys (como por ejemplo en DRB 1*0401 y *0404) e Histidina (como por ejemplo en DRB 1*0402). En la mayor parte de los alelos del MHC de clase II, Asp en la posición 57 forma un enlace de hidrógeno unido por sal con Arg en la posición 76, permitiendo que el bolsillo también aloje aminoácidos alifáticos y polares. En los casos en los que Asp en la posición 57 es remplazado por Ser (por ejemplo DRB 1 *0405) o Ala (DQ8), se destruye la red de puentes de hidrógeno y Arg en la posición 76 puede atraer fuertemente aminoácidos cargados negativamente tales como Asp o Glu en la posición 9 del péptido de unión (como por ejemplo en DRB 1 *0405).
Un ejemplo de una secuencia preferida para un epítopo por lo tanto tiene Trp, Tyr, Phe, Val o Ala en la posición 1; Asp, Glu, Ser o Thr en la posición 4; y Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Pro en la posición 9. Un ejemplo adicional de una secuencia preferida para un epítopo tiene un aminoácido aromático o hidrófobo grande en la posición 1, por ejemplo Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile o Val, y un aminoácido no cargado, pequeño en la posición 6, por ejemplo Ser, Thr, Ala, Pro, Val, Ile o Met. Aproximadamente 87,5% de los péptidos de unión a todas o una combinación de moléculas del MHC de Clase II codificadas por los alelos DRB1*0101, *0401 y *0701 contienen este motivo. Además, puesto que los epítopos de células T derivados de alergenos y antígenos autoinmunitarios no contienen típicamente un gran número de repeticiones de un aminoácido o aminoácidos dados, los epítopos preferidos de la invención comprenden típicamente al menos 5, 6, 7 o 8 aminoácidos diferentes.
La secuencia amínica precisa de un epítopo puede ser pronosticada por algoritmos basados en ordenador y confirmada mediante análisis bioquímico in vitro. Los algoritmos disponibles en el mercado adecuados incluyen el algoritmo EpiMatrix (EpiVax Inc.). Otros algoritmos se encuentran disponibles, por ejemplo en http://www.imtech.res.in/raghava/propred/ y http://www.imtech.res.in/raghava/mhc2pred/. El análisis con estos algoritmos comprende típicamente el parseo de una secuencia de polipéptidos más grande en múltiples péptidos pequeños solapantes. Las secuencias de estos péptidos pequeños se analizan después utilizando el algoritmo para identificar aquellos que se pronostica que se unen a las moléculas del MHC de Clase II. Los péptidos pequeños solapantes tienen típicamente 9 unidades.
Los péptidos candidato que puntúan más alto en este análisis se evalúan a continuación para determinar su capacidad para unirse a un panel de moléculas del MHC de Clase II codificadas por diferentes alelos de Clase II in vitro utilizando análisis de unión convencionales. Por ejemplo se puede utilizar un análisis de unión del MHC de Clase II competitivo, en donde cada péptido es analizado por su capacidad para desplazar un aglutinante de control conocido de cada uno de los alotipos del MHC de Clase II humano investigados. En dicho análisis se asigna a cada péptido un valor de CI50 (la concentración a la cual se logra la inhibición del 50% de la unión del péptido de control). A menor CI50 mayor afinidad de un péptido para un alotipo del MHC de clase II dado.
Se considera que el epítopo o los epítopos de un polipéptido son aquellos péptidos que muestran la mayor afinidad de unión hacia las moléculas del MHC de Clase II. Los epítopos particularmente preferidos muestran una elevada afinidad hacia las diferentes moléculas de la Clase II codificadas por más de uno, preferiblemente dos, más preferiblemente tres, cuatro o cinco alelos del MHC de Clase II.
Los epítopos particularmente preferidos son aquellos que están comprendidos en las regiones que son propensas a la formación de dímeros, como se define más abajo.
Regiones que contienen al menos un epítopo de célula T que se une al MHC de Clase II
Los análisis bioquímicos para la identificación de un epítopo de célula T típicamente no son capaces de definir la posición de la secuencia epitópica mínima dentro de una secuencia más grande con más exactitud que aproximadamente 12 aminoácidos, y más típicamente 15, 20 o más aminoácidos. La razón de esto es que una secuencia grande debe ser fragmentada físicamente en péptidos solapantes más pequeños, o los péptidos solapantes más pequeños deben ser fabricados de novo antes de la evaluación in vitro de la capacidad de estos péptidos para unirse a las moléculas del MHC de Clase II. Los expertos en la técnica reconocerán que cuanto más pequeños sean los fragmentos de péptidos solapantes utilizados, mas tiempo consume y más intenso es el trabajo en el procedimiento de fabricación. Por lo tanto, los epítopos son identificados a menudo por estar contenidos dentro de una región polipeptídica más grande. Se prevé que los péptidos de la invención puedan comprender dicha región más grande. Por consiguiente, en los péptidos de la invención, la región que contiene un epítopo de células T de unión a MHC de Clase II tiene típicamente 8 o 9 aminoácidos de longitud, pero puede tener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.
La región de la invención es típicamente una secuencia que es propensa a la formación de dímeros. Se entenderá que esta incluye tanto la formación de homodímeros (es decir la asociación de monómeros peptídicos con otros monómeros peptídicos idénticos) como la formación de heterodímeros (es decir la asociación de monómeros peptídicos con monómeros peptídicos diferentes). También se entenderá que por secuencia propensa a la formación de dímeros, se pretende hacer referencia también a secuencias que son propensas a formas oligómeros de orden superior, tales como trímeros, tetrámeros y similares. La región de la invención puede comprender o consistir en cualquier secuencia que sea propensa a la formación de dímeros. La secuencia de aminoácidos concreta dentro de una región dada que promueve la formación de dímeros puede estar comprendida dentro de la secuencia de unión al MHC de clase II mínimo del epítopo de la célula T, o puede estar comprendida dentro de los residuos que flanquean esta secuencia. La secuencia propensa a la formación de dímeros puede consistir de este modo enteramente en la secuencia de unión al MHC de clase II mínimo del epítopo de la célula T.
Las secuencias particularmente preferidas comprenden al menos un residuo de cisteína. El experto en la técnica apreciará que cualquier péptido que contiene un único residuo de cisteína puede formar dímeros, ya sea consigo mismo, o con otros péptidos que contienen cisteína con los cuales se puede poner en contacto. Los péptidos que contienen dos o más cisteínas tienen el potencial de formar cadenas largas que después se pueden agregar. Dicha formación de un dímero/agregado conduce al riesgo de unión de IgE o de unión de IgG y de este modo tiene una respuesta inflamatoria local. Por consiguiente, una región preferida de la invención deriva típicamente de una proteína con una elevada proporción de residuos de cisteína. Por ejemplo, la región de la invención puede derivar de una proteína que tiene más de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35% de residuos de cisteína como una proporción del número total de residuos de aminoácido en la proteína. La región de la invención se selecciona preferiblemente entre una secuencia dentro de semejante proteína que tiene una proporción menor de residuos de cisteína. Por consiguiente, la región puede comprender hasta un máximo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20% de residuos de cisteína como una proporción del número total de residuos de aminoácido en la región. Los residuos de cisteína pueden estar incluidos en la secuencia de unión al MHC de Clase II del epítopo, o pueden estar incluidos en los residuos que flanquean esta secuencia.
Otras secuencias propensas a la formación de dímeros pueden ser identificadas mediante análisis in silico utilizando métodos computacionales adecuados, o mediante análisis in vitro utilizando métodos de laboratorio adecuados que cuantifican la proporción de una secuencia que está presente en forma monomérica o dimérica como se expone más abajo. Para una secuencia que es propensa a la dimerización, la proporción de secuencia presente en forma de dímero puede ser mínima, es decir, menor de aproximadamente 0,5% o 1% en el estado sólido, pero esta aumentará típicamente a lo largo del tiempo hasta al menos aproximadamente 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% para el material almacenado en disolución durante un período de tiempo adecuado en condiciones adecuadas. Los períodos de tiempo y las condiciones adecuados incluyen intervalos de tiempo y condiciones en las cuales un experto en la técnica podría esperar razonablemente mantener una secuencia en disolución antes de su uso. Por ejemplo, son típicos períodos de tiempo de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, o aproximadamente 72 horas, aunque algunas disoluciones se pueden mantener durante períodos más largos, por ejemplo, al menos a semana, a mes, 6 meses, 1 año, 2 años, 3 años o más. Las condiciones de almacenamiento pueden ser típicamente a temperatura y humedad relativa ambientes, o típicamente a 25°C y una humedad relativa de 60%, pero podrían incluir cualquiera de las condiciones de almacenamiento convencionales encontradas por los expertos en la técnica, por ejemplo aproximadamente 4°C, -20°C, o -80°C.
La sensibilidad de la respuesta inmunitaria es tal que se considera probable que solamente una pequeña proporción de dímero desencadene una respuesta inmunitaria no deseable.
Para la evaluación de la proporción de una secuencia presente en una forma dada, un método adecuado es, por ejemplo, la electroforesis en gel analítica en condiciones no desnaturalizantes. En dicho método, se hace circular una disolución de la secuencia en un gel de poliacrilamida, junto con un una serie de marcadores de peso molecular convencionales. Si la secuencia forma dímeros, se observará una banda de proteína en el gel correspondiente a una especie con un peso molecular aproximadamente dos veces el calculado para la suma de los aminoácidos de la secuencia. (De un modo similar, cualquier trímero o tetrámero presente se observará como bandas correspondientes a especies con pesos moleculares de aproximadamente tres o cuatro veces el calculado para la suma de los pesos de los residuos de aminoácido de la secuencia). Puesto que es raro que 100% de una secuencia esté presente en forma oligomérica, también se puede observar una segunda banda correspondiente a una especie que tiene aproximadamente el peso molecular calculado para la suma de los aminoácidos de la secuencia – ésta representa la secuencia en forma monomérica. Se pueden utilizar las intensidades relativas de las bandas para cuantificar la proporción de la secuencia que está presente en cada forma. Métodos similares pueden evaluar el peso molecular mediante medios alternativos, por ejemplo, centrifugación analítica, espectrometría de masas o cromatografía de exclusión por tamaños. Alternativamente, se pueden cuantificar los oligómeros utilizando la cromatografía de líquidos de alta redisolución en fase reversa (RP-HPLC) donde los dímeros y las especies oligoméricas superiores se separan de los monómeros basándose en las diferencias en sus caracteres hidrófobos. La identificación de la especie se logra utilizando la detección espectrométrica de masas. Los mismos métodos se pueden adaptar para evaluar si un péptido dado muestra tendencia a la heterodimerización con cualquier otro péptido o molécula.
Adicionalmente, la región de la invención puede tener una solubilidad de menos de 3,5 mg/ml en disolución acuosa a pH 2,0 a 12,0, o pH 2,0 a 11,0, pH 2,0 a 10,0, pH 2,0 a 9,0, pH 2,0 a 8,0 o pH 2,0 a 7,0; y/o comprender 1, 2, 3 o 4 residuos de cisteína; y/o tener un punto isoeléctrico menor de 4,5; y / o tener una puntuación GRAVY por encima de +0,25. Estos parámetros pueden ser evaluados mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede evaluar la solubilidad mediante métodos in vitro convencionales, se pueden evaluar GRAVY y el punto isoeléctrico in silico utilizando métodos computacionales adecuados, tales como la herramienta ProtParam (Gasteiger E. et al pp.571-607 The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005); John M. Walker (ed)) que se encuentra disponible en http://www.expasy.ch/tools/protparam.html.
Péptidos
El péptido de la invención puede comprender o consistir en la secuencia nativa de la región como se define anteriormente o puede comprender o consistir en la secuencia nativa de la región diseñada para reducir la formación de dímeros. La región se diseña mediante la modificación de su secuencia nativa. Las modificaciones particularmente preferidas son aquellas en las que:
-
al menos un residuo de cisteína de la secuencia nativa de la región es sustituido por serina, ácido 2aminobutírico, alanina o glicina; y /o
-
al menos un residuo de cisteína de la secuencia nativa de la región se cisteinila para crear un residuo de cistina; y /o
El residuo o los residuos que son modificados pueden estar formados en cualquier parte por la secuencia de la región. En una realización el residuo o los residuos que son modificados no están incluidos en la secuencia de la región de unión al MHC de clase II mínimo. En una realización preferida, la modificación no crea un nuevo epítopo ni afecta a las propiedades de unión del MHC de clase II de la región.
El péptido de la invención contiene típicamente de 9 a 25 aminoácidos, y puede contener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoácidos. Se apreciará que el péptido de la invención puede consistir enteramente en la región definida anteriormente, o puede comprender aminoácidos adicionales flanqueando la región hasta un máximo de 25 aminoácidos, siempre que los aminoácidos adicionales no promuevan la formación de dímeros. Los aminoácidos adicionales que promueven la formación de dímeros pueden ser evaluados mediante los métodos descritos en la sección "regiones" anterior.
Es probable que los péptidos de más de 25 aminoácidos de longitud posean una estructura terciaria suficiente para entrecruzar la IgG o la IgE sobre las superficies celulares dando como resultado respuestas inmunitarias no deseables tales como la activación de las células B o la desgranulación de los mastocitos.
Síntesis de péptidos
Los péptidos de la invención se obtienen en sentido intelectual del polipéptido que comprende la región definida anteriormente. Esto se realiza haciendo uso de la secuencia de aminoácidos de la región y sintetizando péptidos basados en la secuencia. Los péptidos se pueden sintetizar utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos preferidos incluyen las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida y muy preferiblemente un sintetizador de péptidos automático o semi-automático. Típicamente, utilizando dichas técnicas, se acoplan un aminoácido protegido con a-N-carbamoílo y un aminoácido anclado a la cadena peptídica en crecimiento sobre una resina a la temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidinona o cloruro de metileno en presencia de agentes de acoplamiento tales como diciclohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol en presencia de una base tal como diisopropiletilamina. El grupo protector a-N-carbamoilo se elimina de péptido-resina resultante utilizando un reactivo tal como ácido trifluoroacético o piperidina, y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido deseado que se va a añadir a la cadena peptídica. Los grupos N-protectores adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen t-butiloxicarbonilo (tBoc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).
El término "péptido" incluye no solamente moléculas en las que los residuos de aminoácido están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino también moléculas en las cuales el enlace peptídico se invierte. Tales peptidomiméticos retro-inversos se pueden elaborar utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo tales como los descritos por Meziere et al (1997) en J. Immunol.159, 3230-3237. Este enfoque implica la elaboración de pseudopéptidos que contienen cambios que afectan a la cadena principal, y no a la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al (1997) demuestran que, al menos para las respuestas del MHC de clase II y de las células T coadyuvantes, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteolisis.
De un modo similar, el enlace peptídico puede ser suprimido completamente siempre que se utilice un radical conector apropiado que conserve el espaciamiento entre los átomos de carbono de los residuos de aminoácido; es particularmente preferido que el radical conector tenga sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planaridad que el enlace peptídico. También se apreciará que el péptido puede ser bloqueado convenientemente en su extremo N o C con el fin de ayudar a reducir su susceptibilidad a la digestión exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino N-terminal de los péptidos puede ser protegido mediante reacción con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo C-terminal del péptido puede ser protegido mediante reacción con una amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen la glicosilación y la fosforilación. Otra modificación potencial consiste en que los hidrógenos de las aminas de las cadenas laterales de R o K pueden ser sustituidos por grupos metileno (-NH2 - -NH(Me) o -N(Me)2).
5 Los análogos de los péptidos de acuerdo con la invención también pueden incluir variantes peptídicas que aumentan
o disminuyen la vida media del péptido in vivo. Los ejemplos de los análogos capaces de incrementar la vida media de los péptidos utilizados de acuerdo con la invención incluyen los análogos peptoides de los péptidos, los derivados de D-aminoácidos de los péptidos, y los híbridos péptido-peptoide. Una realización adicional de los polipéptidos
10 variantes utilizados de acuerdo con la invención comprende formas de D-aminoácidos del polipéptido. La preparación de polipéptidos utilizando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos disminuye enormemente cualquier ruptura no deseada de dicho agente por los procesos metabólicos normales, disminuyendo las cantidades de agentes que es necesario administrar, junto con la frecuencia de su administración.
15 Composiciones
La composición de la invención comprende típicamente: i) al menos un péptido de 9 a 25 aminoácidos de longitud en donde el péptido comprende una región que comprende al menos un epítopo de célula T; y
20 ii) al menos un agente que inhibe la formación de dímeros del péptido y que se selecciona entre tioglicerol y tioanisol.
Concretamente, las composiciones preferidas de la invención comprenden tioglicerol al 0,5% o tioanisol al 0,5%.
25 Un ejemplo de una composición adecuada de la invención comprende:
Componente
Función Concentración en la mezcla de formulación Cantidad nominal por lote (400 g)
péptido, sal acetato, HCL, amonio o TFA
Ingrediente activo 1,4 mM Variable, dependiente del análisis y la pureza
Dihidrógenofosfato de potasio
Componente tampón 0,357 g
Ácido fosfórico concentrado
Componente tampón 10 mM 0,159 g
1-Tioglicerol
Agente reductor 0,5% p/p 2,0 g
D-Manitol
Agente de tonicidad 210 mM 15,305 g
WFI estéril
Vehículo N/A hasta 400 g
Los valores anteriores se basan en un lote de 400 g típico que comprende al menos un péptido.
30 Por mínima proporción de péptido presente en disolución en forma de dímero se quiere significar que un máximo de 5%, 4%, 3%, 2% o 1% está presente en forma de dímero. Se entenderá que la proporción de péptido presente como dímero en disolución será la proporción presente como dímero después de un período de tiempo adecuado en disolución. Los períodos de tiempo adecuados incluyen intervalos de tiempo que un experto en la técnica podría esperar razonablemente para mantener una secuencia en disolución antes de su uso. Por ejemplo,
35 aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, o aproximadamente 72 horas. La proporción de un péptido presente en una forma dada puede ser evaluada mediante cualquier método adecuado como se describe en la sección "Regiones" más arriba.
Cuando el epítopo deriva de un alergeno, las composiciones de la invención son típicamente capaces de inducir una
40 fase tardía de la respuesta en un individuo que está sensibilizado al alergeno. El término "fase tardía de la respuesta" incluye el significado mostrado en Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, págs. 1113-1130. La fase tardía de la respuesta puede ser cualquier fase tardía de la respuesta (LPR). Preferiblemente, las composiciones que comprenden un epítopo derivado de un alergeno proteico son capaces de inducir una respuesta asmática tardía (LAR) o una respuesta rinítica tardía, o una respuesta cutánea tardía o una
45 respuesta ocular de fase tardía. Se puede determinar si una composición concreta puede dar lugar o no a una LPR utilizando métodos bien conocidos en la técnica; un método particularmente preferido es el descrito por Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay AB. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. En: Handbook of Experimental Immunology (4) Capítulo 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications, 1986. De este modo, preferiblemente, las composiciones individuales de la
50 invención son capaces de inducir una LPR en un individuo que ha sido sensibilizado al alérgeno proteico del cual deriva el epítopo.
Se puede determinar si un individuo ha sido sensibilizado o no a la proteína de la cual deriva el epítopo mediante procedimientos bien conocidos tales como la detección de anticuerpos en la sangre o el suero del individuo que son específicos para la proteína. Cuando el epítopo deriva de un alergeno, las pruebas adecuadas para la sensibilización al alergeno incluyen la prueba cutánea de punción con soluciones de extractos de proteínas, inducción de LPR cutánea, historial clínico, sensibilización con alergenos y prueba de radioalergoadsorción (RAST) para medir la IgE específica de la proteína. El médico puede determinar si se espera que un individuo concreto se beneficie del tratamiento, por ejemplo, con tales pruebas o determinaciones.
Desensibilizar o hacer que un individuo tolere la proteína de la cual deriva el epítopo representa la inhibición o amortiguación de las reacciones del tejido inmunológico inducidas por dicha proteína en individuos apropiadamente sensibilizados. Se ha demostrado que las células T pueden activarse selectivamente, y después volverse insensibles. Por otra parte la anergización o la eliminación de estas células T conduce a la desensibilización del paciente para una proteína concreta. La desensibilización se manifiesta como una reducción en la respuesta a una proteína o péptido derivado de proteína, o preferiblemente una eliminación de dicha respuesta, en la segunda administración y administraciones adicionales de la proteína o péptido derivado de la proteína. La segunda administración se puede realizar después de que haya transcurrido un período de tiempo adecuado para permitir que se produzca la desensibilización; este es preferiblemente cualquier período entre un día y varias semanas. Se prefiere un intervalo de alrededor de dos semanas.
Aunque las composiciones de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo que ha sido sensibilizado a la proteína, se debe apreciar que cuando se utiliza una composición para tratar a un paciente es preferible emplear una concentración suficientemente baja de la composición de manera que no se produzca una LPR observable pero la respuesta sea suficiente para desensibilizar las células T de forma que se pueda administrar la siguiente dosis (preferiblemente más alta), y así sucesivamente. De este modo se aumenta la dosis hasta proporcionar una desensibilización total, pero a menudo sin inducir nunca una LPR en el paciente. Aunque, la composición o péptido sea capaz de hacerlo a una concentración más elevada que la administrada.
La composición de la invención típicamente tiene una capacidad reducida para provocar una fase temprana de la respuesta en un individuo. Por "capacidad reducida para provocar una fase temprana de la respuesta", se entenderá que la composición de la invención dará como resultado una menor gravedad en los síntomas de la fase temprana (tales como desgranulación de basófilos o mastocitos) con respecto a una composición que comprende un péptido que comprende la misma región que la composición de la invención, pero sin la modificación de su secuencia para reducir la formación de dímeros, y que carece de un agente que reduce la formación de dímeros. Por consiguiente, la composición de la invención producirá una fase menos temprana de la respuesta que un péptido equivalente predominantemente presente en forma dimérica. El péptido es equivalente porque comprende el mismo epítopo de células T de unión a MHC de Clase II.
Alternativamente o adicionalmente, la composición de la invención tiene típicamente una capacidad mejorada para inducir tolerancia en un individuo. Por "capacidad mejorada para inducir tolerancia", se entenderá que la composición de la invención producirá un mayor nivel de desensibilización en un individuo que una composición que comprende un péptido que comprende la misma región que la composición de la invención, pero sin modificación de su secuencia para reducir la formación de dímeros, y que carece de un agente que reduce la formación de dímeros. Por consiguiente, la composición de la invención producirá un mayor nivel de desensibilización que un péptido equivalente predominantemente presente en forma dimérica. El péptido es equivalente debido a que comprende el mismo epítopo de célula T de unión a MHC de Clase II.
La desensibilización se define como anteriormente, y su nivel se puede caracterizar mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, en el asma alérgica, una LAR más pequeña producida en respuesta a la inhalación de la proteína de la cual deriva el epítopo (o un péptido derivado de la proteína) indicaría un mayor nivel de desensibilización después del tratamiento con la composición de la invención. El tamaño de una LAR se puede evaluar mediante cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo, detección de la reducción del Volumen Espiratorio Forzado (FEV) de un individuo después de la administración de la proteína. Una reducción mayor del FEV indica una LAR mayor. La composición de la invención da como resultado preferiblemente una LAR al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% más pequeña que una composición que comprende un péptido equivalente predominantemente presente en forma dimérica.
Alternativamente, un mayor nivel de desensibilización puede estar indicado por una reducción mayor de la producción específica para la proteína de citoquinas inflamatorias tales como interferón gamma, interleuquina 4 e interleuquina 13 por las células T. La producción de citoquinas por las células T se puede detectar mediante cualquier método adecuado, por ejemplo un ELISA, un análisis ELISPOT o un análisis de citometría de flujo. Los métodos particularmente preferidos incluyen análisis Multiplex de matrices de cuentas como describen, por ejemplo de Jager et al; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, Vol 10(1) págs. 133-139. Por "una reducción mayor", se prefiere que el tratamiento con la composición de la invención de como resultado la producción de preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% menos citoquinas inflamatorias que una composición que comprende un péptido equivalente predominantemente en forma dimérica.
Las composiciones preferidas de la invención comprenden al menos un péptido que comprende o consiste en la secuencia correspondiente a un cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 74 y opcionalmente Tioglicerol. Las composiciones particularmente preferidas comprenden al menos un primer y un segundo péptido, en donde el primer y el segundo péptidos comprenden cada uno o consisten en una secuencia diferente seleccionada entre las secuencias de los SEQ ID NO: 37 (MLA01), SEQ ID NO: 38 (MLA04), SEQ ID NO: 39 (MLA05), o SEQ ID NO: 40 (MLA12). Por ejemplo, el primer y el segundo péptido pueden comprender o consistir en las secuencias de a) los SEQ ID NOS: 37 (HLA01) y 38 (MLA04); b) los SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 39 (MLA05); c) los SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 40 (MLA12); d) los SEQ ID NOS: 38 (MLA04) y 39 (MLA05); e) los SEQ ID NOS: 38 (MLA04) y 40 (MLA12); o f) los SEQ ID NOS: 39 (MLA05) y 40 (MLA12), respectivamente.
Polinucleótidos, vectores y células
Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, fragmento génico, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un polinucleótido de la invención puede ser proporcionado en forma aislada o purificada. Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que es transcrita (en el caso del ADN) y traducida (en el caso del ARNm) a un polipéptido in vivo cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Para los fines de la invención, dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no están limitadas a, ADNc procedente de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas procedentes de ADN o ARN viral o procariótico, e incluso secuencias de ADN sintético. Se puede localizar una secuencia de terminación de la transcripción 3' con respecto a la secuencia codificante.
Los polinucleótidos de la invención se pueden sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como los descritos a modo de ejemplo den Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Las moléculas de polinucleótidos de la presente invención pueden ser proporcionadas en forma de una casete de expresión que incluye secuencias de control conectadas operablemente a la secuencia insertada, permitiendo de ese modo la expresión del péptido de la invención in vivo en un sujeto elegido como diana. Estas casetes de expresión, a su vez, se proporcionan típicamente dentro de vectores (p. ej., plásmidos o vectores virales recombinantes) que son adecuados para su uso como reactivos para la inmunización de ácido nucleico. Dicha casete de expresión se puede administrar directamente a un sujeto anfitrión. Alternativamente, se puede administrar un vector que comprende un polinucleótido de la invención a un sujeto anfitrión. Preferiblemente el polinucleótido se prepara y/o se administra utilizando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector que sea capaz de portar una cantidad suficiente de información genética, y permitir la expresión de un péptido de la invención.
La presente invención incluye de este modo vectores de expresión que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos. De este modo, la presente invención proporciona un vector para su uso en la prevención o el tratamiento de la alergia por inducción de inmunotolerancia que comprende una o más secuencias de polinucleótidos que codifican diferentes polipéptidos de la invención y opcionalmente una o más secuencias de polinucleótidos adicionales que codifican diferentes polipéptidos definidos en la presente memoria.
Además, se apreciará que las composiciones y productos de la invención pueden comprender una mezcla de polipéptidos y polinucleótidos. Por consiguiente, la invención proporciona una composición o producto definidos en la presente memoria, en donde en lugar de un polipéptido cualquiera es un polinucleótido capaz de expresar dicho polipéptido.
Los vectores de expresión se construyen de manera rutinaria en la técnica de la biología molecular y pueden implicar por ejemplo el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, intensificadores y otros elementos apropiados, tales como por ejemplo señales de poliadenilación que pueden ser necesarias, y que se posicionan en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica. A modo de ejemplo adicional en este aspecto los autores de la presente invención hacen referencia a Sambrook et al.
De este modo, se puede proporcionar un polipéptido de la invención liberando dicho vector en una célula y permitiendo que se produzca la transcripción del vector. Preferiblemente, un polinucleótido de la invención o para su uso en la invención en un vector está conectado operablemente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula anfitriona, esto es, el vector es un vector de expresión.
"Conectado operablemente" hace referencia a una disposición de los elementos en la que los componentes así descritos están configurados de manera que realizan su función habitual. De este modo, una secuencia reguladora dada, tal como un promotor, conectada operablemente a una secuencia de ácido nucleico es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia cuando están presentes las enzimas apropiadas. No es necesario que el promotor sea contiguo a la secuencia, siempre que funcione dirigiendo la expresión de la misma. De este modo, por ejemplo, se pueden encontrar presentes secuencias intermedias no traducidas aunque transcritas entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico y el promotor todavía se puede considerar "conectado operablemente" a la secuencia codificante.
Se han descrito en la técnica numerosos sistemas de expresión, cada uno de los cuales consiste típicamente, en un vector que contiene un gen o secuencia de nucleótidos de interés conectado operablemente a secuencias de control de la expresión. Estas secuencias de control de la expresión incluyen secuencias promotoras transcripcionales y secuencias de inicio y terminación de la transcripción. Los vectores de la invención pueden ser por ejemplo, vectores plasmídicos, de virus o fagos provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido mencionado y opcionalmente un regulador del promotor. Un "plásmido" es un vector en forma de un elemento genético extracromosómico. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN o utilizar para transfectar o transformar una célula anfitriona, por ejemplo, una célula anfitriona de mamífero. Los vectores también se pueden adaptar para ser utilizados in vivo, por ejemplo para permitir la expresión in vivo del polipéptido.
Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un polinucleótido que codifica un polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (cuando la expresión de una secuencia de polinucleótidos conectada al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores reprimibles (cuando la expresión de una secuencia de polinucleótidos conectada operablemente al promotor es reprimida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. Se pretende que el término "promotor" o "elemento de control" incluya regiones promotoras completas y segmentos funcionales (p. ej., que controlan la transcripción o la traducción) de estas regiones.
Un polinucleótido, casete de expresión o vector de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente una secuencia peptídica señal. La secuencia peptídica señal se inserta generalmente en una conexión operable con el promotor de manera que el péptido señal sea expresado y facilite la secreción de un polipéptido codificado por la secuencia codificante también en conexión operable con el promotor.
Típicamente una secuencia peptídica señal codifica un péptido de 10 a 30 aminoácidos, por ejemplo de 15 a 20 aminoácidos. A menudo los aminoácidos son predominantemente hidrófobos. En una situación típica, un péptido señal dirige una cadena polipeptídica en crecimiento que porta el péptido señal al retículo endoplásmico de la célula de expresión. El péptido señal es escindido en el retículo endoplásmico, permitiendo la secreción del polipéptido a través del aparato de Golgi. De este modo, se puede proporcionar un péptido de la invención a un individuo mediante su expresión a partir de células dentro del individuo, y secreción a partir de estas células.
Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden ser expresados de una manera adecuada para permitir la presentación de un péptido de la invención por una molécula del MHC de clase II en la superficie de una célula presentadora de antígenos. Por ejemplo, un polinucleótido, casete de expresión o vector de la invención puede ser dirigido a células presentadoras de antígenos, o la expresión del péptido codificado puede ser estimulada o inducida preferentemente en dichas células.
Se pueden utilizar los polinucleótidos de interés in vitro, ex vivo o in vivo en la producción de un péptido de la invención. Tales polinucleótidos se pueden administrar o utilizar en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos por tolerancia.
Los métodos para la liberación de genes son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.399.346, 5.580.859 y 5.589.466. La molécula de ácido nucleico puede ser introducida directamente en el sujeto receptor, por ejemplo mediante inyección intramuscular o intradérmica convencional; liberación de partículas transdérmica; inhalación; tópicamente, o mediante modos de administración orales, intranasales o mucosales. La molécula se puede introducir alternativamente ex vivo en células que han sido retiradas del sujeto. Por ejemplo, se puede introducir un polinucleótido, casete de expresión o vector de la invención en las APC de un individuo ex vivo. Las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés se re-introducen en el sujeto de manera que se pueda montar una respuesta inmunitaria contra el péptido codificado por la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico utilizadas Las moléculas de ácido nucleico utilizadas en dicha inmunización son referidas generalmente en la presente memoria como "vacunas de ácido nucleico".
Los polipéptidos, polinucleótidos, vectores o células de la invención pueden estar presentes en una forma sustancialmente aislada. Se pueden mezclar con portadores o diluyentes que no interferirán en su uso pretendido y sin embargo considerarse sustancialmente aislados. También pueden estar en forma sustancialmente purificada, en cuya caso comprenderán generalmente al menos 90%, p. ej. al menos 95%, 98% o 99%, de las proteínas, polinucleótidos, células o masa seca de la preparación.
Formulaciones
Los péptidos, polinucleótidos, vectores y células de la invención se pueden proporcionar a un individuo individualmente o combinados. Cada molécula o célula de la invención puede ser proporcionada a un individuo en una forma aislada, sustancialmente aislada, purificada o sustancialmente purificada. Por ejemplo, se puede proporcionar un péptido de la invención a un individuo sustancialmente libre de los otros péptidos.
Si bien puede ser posible presentar en forma bruta los péptidos, polinucleótidos o composiciones de acuerdo con la invención, es preferible presentarlos en forma de una formulación farmacéutica. De este modo, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica para que un individuo tolere una proteína de la cual deriva un péptido de la invención, que comprende una composición, vector o producto de acuerdo con la invención junto con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más ingredientes terapéuticos diferentes. El portador o los portadores deben ser 'aceptables' en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación (en particular no deben promover la formación de dímeros) y no deletéreos para el receptor de los mismos. Típicamente, los portadores para inyectables, y la formulación final, son estériles y libres de pirógenos.
Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más moléculas o células de la invención se pueden combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las sustancias coadyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH, antioxidantes, agentes quelantes y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias coadyuvantes son generalmente agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmunitaria en el individuo que recibe la composición, y que se pueden administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, líquidos tales como agua, disolución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Se encuentra disponible una discusión completa de los excipientes, vehículos y sustancias coadyuvantes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Tales composiciones se pueden preparar, envasar, o vender en una forma adecuada para su administración en embolada o para su administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, envasar, o vender en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampollas o en recipientes de múltiples dosis que contienen un conservante. Las composiciones incluyen, pero no están limitadas a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas, y formulaciones de liberación sostenida implantables o biodegradables. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero no limitados a, agentes de suspensión, estabilizantes, o dispersantes. En una realización de una composición para la administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, polvo o gránulos) para su reconstitución con un vehículo adecuado (p. ej., agua libre de pirógenos, estéril) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar, o vender en forma de una suspensión o disolución acuosa u oleosa inyectable estéril o un polvo para su reconstitución. Esta suspensión o disolución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida, y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes, o agentes de suspensión descritos en la presente memoria. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar utilizando un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como una disolución acuosa (incluyendo agua) o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero no están limitados a, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, y aceites fijados tales como mono- o di-glicéridos sintéticos. Otras composiciones administrables parenteralmente que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal, o como un componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para la liberación sostenida o la implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble, o una sal escasamente soluble.
Alternativamente, los péptidos o polinucleótidos de la presente invención pueden ser encapsulados, adsorbidos sobre, o asociados con, portadores particulados. Los portadores particulados adecuados incluyen aquellos derivados de polímeros de poli(metacrilato de metilo), así como también micropartículas de PLG derivadas de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicólidos). Véase, p. ej., Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. También se pueden utilizar otros sistemas particulados y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliomitina, espermina, espermidina, así como también productos conjugados de estas moléculas y polímeros diseñados genéticamente tales como polímeros de tipo seda-elastina (Ghandehari y Cappello (1998) Pharm. Res. 15: 813-815).
Asimismo, los péptidos se pueden formular a elevadas concentraciones >100 nmoles/mL con dimetilsulfóxido, óxido de polietileno, polietilenglicol u otros excipientes adecuados para su uso con dispositivos de liberación de fármacos implantables.
La formulación de cualquiera de los péptidos, polinucleótidos o células mencionado en la presente memoria dependerá de factores tales como la naturaleza de la sustancia y el método de liberación. Se puede administrar cualquiera de estas sustancias en una variedad de formas de dosificación. Se puede administrar oralmente (p. ej. en forma de comprimidos, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o gránulos), parenteralmente, subcutáneamente, por inhalación, intravenosamente, intramuscularmente, intraesternalmente, transdérmicamente, intradérmicamente, sublingualmente, instranasalmente, bucalmente o mediante técnica de infusión. La sustancia también se puede administrar en forma de supositorios. Un médico será capaz de determinar la ruta de administración requerida para cada individuo concreto.
Las composiciones de formulaciones de la invención comprenderán una concentración adecuada de cada péptido/polinucleótido/célula para que sean eficaces sin ocasionar una reacción adversa. Típicamente, la concentración de cada péptido en la composición estará en el intervalo de 0,03 a 200 nmoles/ml. Más preferiblemente en el intervalo de 0,3 a 200 nmoles/ml, de 3 a 180 nmoles/ml, de 10 a 150 nmoles/ml o de 30 a 120 nmoles/ml. La composición o las formulaciones deben tener una pureza de más de 95% o 98% o una pureza de al menos 99%.
Por lo tanto se puede formular una composición que comprende una molécula y/o célula de la invención y también una o más moléculas terapéuticas distintas. Se puede utilizar alternativamente una composición de la invención simultáneamente, sucesivamente o por separado con una o más composiciones terapéuticas distintas como parte de un tratamiento combinado.
Métodos terapéuticos e individuos a tratar
La presente invención hace referencia a composiciones que comprenden péptidos que son capaces de desensibilizar o hacer tolerantes a individuos humanos a proteínas de las cuales derivan los péptidos de la invención. Tales proteínas son típicamente alergenos u otros antígenos para los cuales no es deseable una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de tales antígenos incluyen antígenos asociados con enfermedades autoinmunitarias, antígenos asociados con la enfermedad injerto frente a anfitrión o el rechazo de transplantes (referidas en la presente memoria como condiciones aloinmunitarias) y antígenos asociados con respuestas inmunitarias materno-fetales, por ejemplo Enfermedad Hemolítica del Recien Nacido Rhesus D. Las composiciones de la invención son por lo tanto útiles en la prevención o el tratamiento de una enfermedad alérgica, una enfermedad autoinmunitaria, una afección aloinmunitaria o una respuesta materno-fetal. La invención proporciona composiciones, productos, vectores y formulaciones para su uso en la prevención o el tratamiento de las afecciones anteriores. La invención también proporciona un método para prevenir o tratar a un sujeto que tiene las afecciones anteriores, que comprende administrar, ya sea individualmente o combinados, los polipéptidos/polinucleótidos/células de la invención descritos anteriormente.
El individuo que se va a tratar o al que se va a proporcionar la composición o la formulación de la invención es preferiblemente un ser humano. Se apreciará que se puede saber que el individuo que se va a tratar está sensibilizado hacia el alergeno o antígeno concreto, en riesgo de ser sensibilizado o se sospecha que está sensibilizado. El individuo puede ser sometido a pruebas de sensibilización utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica y como se describe en la presente memoria. Alternativamente, el individuo puede tener una historia familiar de las afecciones descritas anteriormente. Puede no ser necesario someter a prueba a un individuo para determinar la sensibilización a alergenos debido a que el individuo puede presentar síntomas de alergia cuando se sitúa en las proximidades de una fuente de alergeno adecuada. Por proximidad se quiere significar a 10 metros o menos, 5 metros o menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos, o a 0 metros de la fuente. Los síntomas de alergia pueden incluir picor en los ojos, secreción nasal, dificultades para respirar, piel enrojecida con picazón o sarpullido. El individuo que se va a tratar puede tener cualquier edad. Sin embargo, preferiblemente, el individuo puede estar en un grupo de edad de 1 a 90, de 5 a 60, de 10 a 40, o más preferiblemente de 18 a 35. Preferiblemente, el individuo que se va a tratar es de una población que tiene frecuencias alélicas del MHC en el intervalo de frecuencias que son representativas de la población Caucásica. Las frecuencias alélicas de las poblaciones de referencia para 11 familias alélicas DRB1 comunes se muestran en la Tabla 1 (Datos de HLA Facts Book, Parham y Barber).
Tabla 1
DRB1
1 3 4 7 8 11 12 13 14 15 16
%
6,4 14,7 15,7 8,8 3,4 8,3 3,9 14,7 2,9 17,6 2,5
% Población de Referencia
9,4 11,1 12,8 13,2 3,7 13,4 2,3 10,2 3,2 10,7 3,6
Las frecuencias de referencia se obtuvieron mediante análisis de múltiples estudios que informan sobre frecuencias y las cifras mostradas son los valores medios. Preferiblemente por lo tanto, el individuo que se va a tratar es de una población que tiene frecuencias alélicas del MHC equivalentes a la población de referencia para los alelos referidos en la Tabla 1 (tal como por ejemplo al menos 1, 2, 3, 4, 5 o todos los alelos), por ejemplo en los intervalos de esas cifras mas o menos 1, 2, 3, 5, 10, 15 o 20%.
Preferiblemente el individuo es de una población en la que las frecuencias alélicas de los siguientes alelos DRB 1 son: 4 - al menos 9% 7 - al menos 10% 11 - al menos 8%.
El individuo que se va a tratar de una enfermedad alérgica puede haber tenido alergia durante al menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años. El individuo puede padecer sarpullido, congestión nasal, descarga nasal y/o tos causada por la alergia. Se pueden haber administrado o no al individuo otras composiciones/compuestos que traten la alergia.
La invención es particularmente adecuada para su uso en individuos que pueden necesitar recibir múltiples administraciones de las composiciones de la invención como se ha descrito anteriormente. Es más probable que los péptidos que son más propensos a la formación de dímeros que los péptidos de la invención induzcan una respuesta adversa en un individuo que recibe múltiples administraciones. Puesto que los péptidos monoméricos son menos inmunogénicos que los péptidos diméricos, la invención también es particularmente adecuada para la administración a un individuo que tiene o se encuentra en riesgo de tener una afección, en donde la afección se caracteriza por una reacción inflamatoria adversa a un tratamiento que comprende un péptido. Una reacción inflamatoria adversa a un tratamiento que comprende un péptido puede ser diagnosticada como resultado del comienzo de cualquiera de los síntomas de alergia definidos anteriormente después de la administración de un tratamiento que comprende un péptido. Se puede considerar que un individuo está en riesgo de dicha reacción por cualquier razón médica, por ejemplo, un historial familiar de reacciones similares, un historial médico personal de múltiples respuestas alérgicas, o respuestas a la punción cutánea o parche cutáneo fuertemente positivas a alergenos comunes.
Alergenos y antígenos
Los alergenos adecuados de los cuales puede derivar la región que contiene un epítopo de células T que se une a la Clase II del MHC pueden ser obtenidos y/o producidos, por supuesto, utilizando métodos conocidos. Las clases de alergenos adecuados incluyen, pero no están limitados a, pólenes, caspa de animales (en particular caspa de gato), pastos, mohos, polvos, antibióticos, venenos de insectos que pican, y una variedad de alergenos ambientales (incluyendo químicos y metales), fármacos y alimentos. Los alergenos de árboles comunes incluyen los pólenes de álamo, álamo blanco, fresno, abedul, roble, olmo, nogal, y pecana; los alergenos de plantas comunes incluyen aquellos de artemisa, ambrosía, llantén menor, acetosella y bledo; los alergenos de contacto de plantas incluyen aquellos de roble venenoso, hiedra venenosa y ortigas; los alergenos del pasto común incluyen alergenos de ballico, heno, sorgo, grama fina, festuca y poa de los prados; también se pueden obtener alergenos comunes de mohos u hongos tales como Candida, Alternaria, Fusarium, Hormodendrum, Aspergillus, Micropolispora, Mucor y actinomicetos termófilos; se pueden obtener alergenos epidérmicos de polvo doméstico u orgánico (típicamente de origen fúngico), de artrópodos tales como los ácaros domésticos (Dermatophagoides pteronyssinus), o de fuentes animales tales como plumas, y caspa de perro; los alergenos alimentarios comunes incluyen alergenos de leche y queso (productos lácteos), huevo, trigo, nuez (p, ej., cacahuete), mariscos (p, ej., moluscos de concha), guisante, judía y gluten; los alergenos medioambientales comunes incluyen alergenos de metales (níquel y oro), químicos (formaldehído, trinitrofenol y trementina), Látex, caucho, fibra (algodón o lana), arpillera, tinte capilar, cosméticos, detergentes y perfumes; los alergenos de fármacos comunes incluyen alergenos anestésicos locales y salicilatos; los alergenos de antibióticos incluyen alergenos de penicilina, tetraciclina y sulfonamida; y los alergenos de insectos comunes incluyen el veneno de abeja, avispa y hormiga, y alergenos de cáliz de cucaracha. Los alergenos particularmente bien caracterizados incluyen, pero no están limitados a, el principal alergeno producido por la glicoproteína Fel dl de gato doméstico Felis catus (Felis domesticus), los epítopos principal y críptico del alergeno Der p I (Hoyne et al. (1994) Immunology 83190-195), la fosfolipasa A2 de veneno de abeja (PLA) (Akdis et al. (1996)
J. Clin. Invest. 98:1676-1683), el alergeno Bet v 1 de polen de abedul (Bauer et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 107: 536-541), y el alergeno de pasto recombinante multi-epitópico rKBG8.3 (Cao et al. (1997) Immunology 90:46-51). Estos y otros alergenos adecuados se encuentran disponibles en el mercado y/o se pueden preparar fácilmente en forma de extractos siguiendo las técnicas conocidas.
5 Preferiblemente, el alergeno se selecciona de la lista de secuencias de alergenos y números de acceso de las bases de datos (números de acceso Entrez NCBI) más abajo. El NCBI es el Centro Nacional para la información de Biotecnología y es una división de los Institutos Nacionales de Salud de los EEUU. El sitio de la red NCBI, a partir del cual se puede buscar acceso a la base de datos, es www.ncbi.nlm.nih.gov/. Secuencias de alergenos y números de acceso de la base de datos (números de acceso Entrez NCBI):
Ácaro del polvo doméstico
Dermatophagoides pteronyssinus
15 Der p 1
Der p 2
Der p 3
Der p 4 25 KYXNPHFIGXRSVITXLME
Der p 5
30 Der p 6 AIGXQPAAEAEAPFQISLMK
Der p 7 Der p9 IVGGSNASPGDAVYQIAL
Dermatophagoides farinae
Der f 1
Der f 2
Der f 3
15 Der f 4 AVGGQDADLAEAPFQISLLK 20 Der f 7
Secuencias de alergenos de ácaros adicionales (acceso Entrez NCBI):
25 1170095; 1359436; 2440053; 666007; 487661; 1545803; 84702; 84699; 625532; 404370; 1091577; 1460058; 7413; 9072; 387592.
Gato Secuencias de Felis (Acceso Entrez NCBI):
539716; 539715; 423193; 423192; 423191; 423190; 1364213; 1364212; 395407; 163827; 163823; 163825; 5 1169665; 232086; 1169666.
Látex Secuencias Hevea:
10 Hev b 1
Hev b 3
Secuencias adicionales de Hevea (Acceso Entrez NCBI):
3319923; 3319921; 3087805; 1493836; 1480457; 1223884; 3452147; 3451147; 1916805; 232267; 123335;
20 2501578; 3319662; 3288200; 1942537; 2392631; 2392630; 1421554; 1311006; 494093; 3183706; 3172534; 283243; 1170248; 1708278; 1706547; 464775; 2661042; 231586; 123337; 116359; 123062; 2213877; 542013; 2144920; 1070656; 2129914; 2129913; 2129912; 100135; 82026; 1076559; 82028; 82027; 282933; 280399; 100138; 1086972; 108697; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 913758; 913757; 913756; 234388; 1092500; 228691; 1177405; 18839; 18837; 18835; 18833; 18831; 1209317; 1184668; 168217; 168215;
25 168213; 168211; 168209; 348137.
Ballico
Secuencias de Lolium:
30 126385 Lol p 1
126386 Lol p 2a
126387 Lol p 3
40 2498581 Lol p 5a 2498582 Lol p 5b
455288 Lol p isoforma 9
1582249 Lol p 11
Secuencias adicionales de Lolium (Acceso Entrez NCBI):
135480; 417103; 687261; 687259; 1771355; 2388662; 631955; 542131; 542130; 542129; 100636; 626029; 542132;
15 320616; 320615; 320614; 100638; 100634; 82450; 626028; 100639; 283345; 542133; 1771353; 1763163; 1040877; 1040875; 250525; 551047; 515377; 510911; 939932; 439950; 2718; 168316; 168314; 485371; 2388664; 2832717; 2828273; 548867.
Olivo Secuencias de olivo
416610 Ole e 1
Parietaria Secuencias de Parietaria:
18 2497750 Par j P2
1352506 Par j P5
1532056 Par j P8
10 1532058 Par j P9
2497749 Par j P9
1086003 Par j 1
Secuencias adicionales de Parietaria (Acceso Entrez NCBI):
543659; 1836011; 1836010; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 240971. 25 Heno
Secuencias de Phleum:
Phl p 1
Phl p 1
Phlp 2
Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5b
15 Phl p 5a
Phl p 5 Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5
15 Phl p 5 Phl p5b
Phl p5a
Phl p 5
Phl p 5b
15 Phl p 5 Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5b
Phl p 5a
15 Phl p 5
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 7
Phl p 11
Secuencias adicionales de Phleum (Acceso Entrez NCBI):
458878; 548863; 2529314; 2529308; 2415702; 2415700; 2415698; 542168; 542167; 626037; 542169; 541814; 542171; 253337; 253336; 453976; 439960.
Avispa (y afines) Secuencias de Vespula:
465054 ALLERGEN VES V 5
1709545 ALLERGEN VES M 1
1352699 ALLERGEN VES V 1
1346323 ALLERGEN VES V 2
549194 ALLERGEN VES VI
20 Secuencias adicionales de Vespula (Acceso Entrez NCBI):
549193; 549192; 549191; 549190; 5491104; 117414; 126761; 69576; 625255; 6271104; 627188; 627187; 482382; 112561; 627186; 627185; 1923233; 1047645; 1047647; 745570; 225764; 162551.
Secuencias de alergenos de árboles (principalmente abedul):
114922 Bet v 1
130975 Bet v 2
1168696 Bet v 3
15 809536 Bet v 4
543675 Que a I - Quercus alba = robles (fragmento)
GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL
20 543509 Car b I - Carpinus betulus = carpes (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQAIXK
543491 Aln g I - Alnus glutinosa = alisos (fragmento) 25 GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI
1204056 Rubisco
30 Secuencias de alergenos de árboles adicionales (Número de acceso Entrez NCBI):
131919; 128193; 585564; 1942360; 2554672; 2392209; 2414158; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3015520; 2935416; 464576; 1705843; 1168701; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1842188; 2564228; 2564226; 2564224; 35 2564222; 2564220; 2051993; 18131041; 15368104; 534910; 534900; 5341048; 1340000; 1339998; 2149808; 66207; 2129477; 1076249; 1076247; 629480; 481805; 81443; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963; 1361962; 1361961; 1361960; 1361959; 320546; 629483; 629482; 629481; 541804; 320545; 81444; 541814:; 629484; 474911; 452742; 1834387; 298737; 298736; 1584322; 1584321; 584320; 1542873; 1542871; 1542869; 1542867; 1542865; 1542863; 1542861; 1542859; 1542857; 1483232; 1483230; 1483228; 558561;
40 551640; 488605; 452746; 452744; 452740; 452738; 452736; 452734; 452732; 452730; 452728; 450885; 17938; 17927; 17925; 17921; 297538; 510951; 2104331; 2104329; 166953.
Cacahuete
45 Secuencias de cacahuete 26
1168391 Ara h 1
5
Ambrosía
Secuencias de Ambrosia
10
113478 Amb a 1
113479 Amb a 2
113477 Amb a 1.3
113476 Amb a 1.2
113475 Amb a 1.1
10 Secuencias de Cedro 493634 Cry j IB precursor
15 493632 Cry j IA precursor 1076242 Cry j II precursor – Cedro Japonés
1076241 Cry j II proteína – Cedro Japonés
541803 Cry j I precursor – Cedro Japonés
541802 Cry j I precursor- Cedro Japonés
Perro Secuencias de Canis:
10 Can f 1
Albúmina de suero fragmento EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL
Albúmina de suero fragmento
Can f 2
Proteína alergeno de perro adicional (Acceso Entrez NCBI):
1731859 5 Caballo Secuencias de Equus:
1575778 Equ cl
10 3121755 Equ c 2 SQXPQSETDYSQLSGEWNTIYGAASNIXK 15 Euroglyphus (ácaro) Secuencias de Euroglyphus:
Eur m 1 (variante)
20 Eur m 1 (variante)
25 Eur m 1 (variante)
30 Eur m 1 (variante)
Secuencias de Poa (pasto)
113562 ALERGENO POLEN POA P 9
113561 POA P 9
113560 POA P 9
Secuencias de cucaracha
2833325 Cr p1
2231297 Cr p2
1703445 Bla g 2
1705483 Bla g 4
2326190 Bla g 5
Secuencias de cucaracha adicionales (números de acceso Entrez NCBI):
2580504; 1580797; 1580794; 1362590;544619;544618; 5315104; 1580792; 1166573; 1176397; 21047849.
Secuencias de alergenos (general):
Números de acceso NCBI
2739154; 3719257; 3703107; 3687326; 3643813; 3087805; 1864024; 1493836; 1480457; 25910476; 25910474; 575778; 763532; 746485; 163827; 163823; 3080761; 163825; 3608493; 3581965; 2253610; 2231297; 21047849; 3409499; 3409498; 3409497; 3409496; 3409495; 3409494; 3409493; 3409492; 3409491; 3409490; 34094104; 3409488; 3409487; 3409486; 3409485; 3409484; 3409483; 3409482; 3409481; 3409480; 3409479; 3409478; 3409477; 3409476; 3409475; 3409474; 3409473; 3409472; 3409471; 3409470; 3409469; 3409468; 3409467; 3409466; 3409465; 3409464; 3409463; 3409462; 3409461; 3409460; 3409459; 3409458; 3409457; 3409456; 3318885; 3396070; 3367732; 1916805; 3337403; 2851457; 2851456; 1351295; 549187; 136467; 1173367; 2499810; 2498582; 2498581; 1346478; 1171009; 126608; 114091; 2506771; 1706660; 1169665; 1169531; 232086; 4161048; 114922; 2497701; 1703232; 1703233; 1703233; 1703232; 3287877; 3122132; 3182907; 3121758; 3121756; 31217SS; 3121746; 3121745; 3319925; 3319923; 3319921; 3319651; 33187104; 3318779; 3309647; 3309047; 3309045; 3309043; 3309041; 3309039; 3288200; 3288068; 2924494; 3256212; 3256210; 3243234; 3210053; 3210052; 3210051; 3210050; 3210049; 3210048; 3210047; 3210046; 3210045; 3210044; 3210043; 3210042; 3210041; 3210040; 3210039; 3210038; 3210037; 3210036; 3210035; 3210034; 3210033; 3210032; 3210031; 3210030; 3210029; 3210028; 3210027; 3210026; 3210025; 3210024; 3210023; 3210022; 3210021; 3210020; 3210019; 3210018; 3210017; 3210016; 3210015; 3210014; 3210013; 3210012; 3210011; 3210010; 3210009; 3210008; 3210007; 3210006; 3210005; 3210004; 3210003; 3210002; 3210001; 3210000; 3209999; 3201547; 27811 S2; 2392605; 2392604; 2781014; 1942360; 2554672; 2392209; 3114481; 3114480; 2981657; 3183706; 3152922; 3135503; 313SS01; 3135499; 3135497; 2414158; 1321733; 1321731; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3095075; 3062795; 3062793; 3062791; 2266625; 2266623; 2182106; 3044216; 2154736; 3021324; 3004467; 3005841; 3005839; 3004485; 3004473; 3004471; 3004469; 3004465; 2440053; 1805730; 2970629; 29591048; 2935527; 2935416; 809536; 730091; 585279; 584968; 2498195; 2833325; 2498604; 2498317; 2498299; 2493414; 2498586; 2498585; 2498576; 2497749; 2493446; 2493445; 1513216; 729944; 2498099; 548449; 465054; 465053; 465052; 548671; 548670; 548660; 548658; 548657; 2832430; 232084; 2500822; 2498118; 2498119; 2498119; 2498118; 1708296; 1708793; 416607; 416608; 416608; 416607; 2499791; 2498580; 2498579; 2498578; 2498577; 2497750; 1705483; 1703445; 1709542; 1709545; 17105104; 1352699; 1346568; 1346323; 1346322; 2507248; |1352240; 1352239; 1352237; 1352229; 1351935; 1350779; 1346806; 1346804; 1346803; 1170095; 1168701; 1352506; 1171011; 1171008; 1171005; 1171004; 1171002; 1171001; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1168696; 1168391; 1168390; 1168348; 1173075; 1173074; 1173071; 1169290; 11610470; 1168402; 729764; 729320; 729979; 729970; 729315; 730050; 730049; 730048; 549194; 549193; 549192; 549191; 549190; 5491104; 549188; 549185; 549184; 549183; 549182; 549181; 549180; 549179; 464471; 585290; 416731; 1169666; 113478; 113479; 113477; 113476; 113475; 130975; 119656; 113562; 113561; 113560; 416610; 126387; 126386; 126385; 132270; 416611; 416612; 416612; 416611; 730035; 127205; 1352238; 125887; 549186; 137395; 730036; 133174; 114090; 131112; 126949; 129293; 124757; 129501; 416636; 2801531; 2796177; 2796175; 2677826; 2735118; 2735116; 2735114; 2735112; 2735110; 2735108; 2735106; 2735104; 2735102; 2735100; 2735098; 2735096; 2707295; 2154730; 2154728; 1684720; 2580504; 2465137; 2465135; 2465133; 2465131; 2465129; 2465127; 2564228; 2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 1313972; 1313970; 1313968; 1313966; 2443824; 2488684; 2488683; 2488682; 2488681; 2488680; 2488679; 2488678; 2326190; 2464905; 2415702; 2415700; 2415698; 2398759; 2398757; 2353266; 2338288; 1167836; 414703; 2276458; 1684718; 2293571; 1580797; 1580794; 2245508; 2245060; 1261972; 2190552; 1881574; 511953; 1532058; 1532056; 1532054; 1359436; 666007; 487661; 217308; 1731859; 217306; 217304; 1545803; 1514943; 577696; 516728; 506858; 493634; 493632; 2154734; 2154732; 543659; 1086046; 1086045; 2147643; 2147642; 1086003; 1086002; 1086001; 543675; 543623; 543509; 543491; 1364099; 2147108; 2147107; 1364001; 1085628; 631913; 631912; 631911; 2147092; 477301; 543482; 345521; 542131; 542130; 542129; 100636; 2146809; 480443; 2114497; 2144915; 72355; 71728; 319828; 1082946; 1082945; 1082944; 539716; 539715; 423193; 423192; 423191; 423190; 1079187; 627190; 6271104; 627188; 627187; 482382; 1362656; 627186; 627185; 627182; 482381; 85299; 85298; 2133756; 2133755; 1079186; 627181; 321044; 321043; 112559; 112558; 1362590; 2133564; 1085122; 10710471; 627144; 627143; 627142; 627141; 280576; 102835; 102834; 102833; 102832; 84703; 84702; 84700; 84699; 84698; 84696; 477888; 477505; 102575; 102572; 478272; 2130094; 629813; 629812; 542172; 542168; 542167; 481432; 320620; 280414; 626029; 542132; 320615; 320614; 100638; 100637; 100635; 82449; 320611; 320610; 280409; 320607; 320606; 539051; 539050; 539049; 539048; 322803; 280407; 100501; 100498; 100497; 100496; 1362137; 1362136; 1362135; 1362134; 1362133; 1362132; 1362131; 1362130; 1362129; 1362128; 100478; 21291041; 1076531; 1362049; 1076486; 2129817; 2129816; 2129815; 2129814; 2129813; 2129812; 2129805; 2129804; 2129802; 2129801; 2129800; 2129799; 479902; 479901; 2129477; 1076247; 629480; 1076242; 1076241; 541803; 541802; 280372; 280371; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963; 1361962; 1361961; 1361960; 1361959; 320546; 2119763; 543622; 541804; 478825; 478824; 478823; 421788; 320545; 81444; 626037; 626028; 539056; 483123; 481398; 481397; 100733; 100732; 100639; 625532; 1083651; 322674; 322673; 81719; 81718; 2118430; 2118429; 2118428; 2118427; 419801; 419800; 419799; 419798; 282991; 100691; 322995; 322994; 101824; 626077; 414553; 398830; 1311457; 1916292; 1911819; 1911818; 1911659; 1911582; 467629; 467627; 467619; 467617; 915347; 1871507; 1322185; 1322183; 1047645; 1047647; 1850544; 1850542; 1850540; 2810417; 452742; 1842045; 1839305; 1836011; 1836010; 1829900; 18291049; 18291048; 18291047; 18291046; 18291045; 18291044; 1825459; 18010487; 159653; 1773369; 1769849; 1769847; 608690; 1040877; 1040875; 1438761; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 13116104; 1246120; 1246119; 1246118; 1246117; 1246116; 1478293; 1478292; 1311642; 1174278; 1174276; 1086972; 1086974; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 999009; 999356; 999355; 994866; 994865; 913758; 913757; 913756; 913285; 913283; 926885; 807138; 632782; 601807; 546852; 633938; 544619; 544618; 453094; 451275; 451274; 407610; 407609; 404371; 409328; 299551; 299550; 264742; 261407; 255657; 250902; 250525; 1613674; 1613673; 1613672; 1613671; 1613670; 1613304; 1613303; 1613302; 1613240; 1613239; 1613238; 1612181; 1612180; 1612179; 1612178; 1612177; 1612176; 1612175; 1612174; 1612173; 1612172; 1612171; 1612170; 1612169; 1612168; 1612167; 1612166; 1612165; 1612164; 1612163; 1612162; 1612161; 1612160; 1612159; 1612158; 1612157; 1612156; 1612155; 1612154; 1612153; 1612152; 1612151; 1612150; 1612149; 1612148; 1612147; 1612146; 1612145; 1612144; 1612143; 1612142; 1612141; 1612140; 1612139; 1093120; 447712; 447711; 447710; 1587177; 158542; 1582223; 1582222; 15315104; 1580792; 886215; 15451047; 15451045; 15451043; 15451041; 15458104; 1545887; 1545885; 1545883; 1545881; 1545879; 1545877; 1545875; 166486; 1498496; 1460058; 972513; 1009442; 1009440; 1009438; 1009436; 1009434; 7413; 1421808; 551228; 452606; 32905; 1377859; 1364213; 1364212; 395407; 22690; 22688; 22686; 22684; 488605; 17680; 1052817; 1008445; 1008443; 992612; 706811; 886683; 747852; 939932; 19003; 1247377; 1247375; 1247373; 862307; 312284; 999462; 999460; 999458; 587450; 763064; 886209; 1176397; 1173557; 902012; 997915; 997914; 997913; 997912; 997911; 997910; 99790; 997908; 997907; 997906; 997905; 997904; 997903; 997902; 997901; 997900; 9971049; 9971048; 9971047; 9971046; 9971045; 9971044; 9971043; 9971042; 910984; 910983; 910982; 910981; 511604; 169631; 169629; 169627; 168316; 168314; 607633; 555616; 293902; 485371; 455288; 166447; 166445; 166443; 166435; 162551; 160780; 552080; 156719; 156715; 515957; 515956; 515955; 515954; 515953; 459163; 166953; 386678; 169865.
Los epítopos de células T particularmente preferidos derivan de los alergenos: proteína Fel d1 de caspa de gato; proteínas Der P1, Der P2 y Der P7 de ácaro de polvo doméstico; proteína de ambrosía amb a 1.1, a 1.2, a1.3 o a1.4; proteínas de ballico lol p1 y lol p5; proteínas del heno ph1 p1 y ph1 p5; proteína de grama fina Cyn d 5; proteínas alternas de Alternaria Alt a 1, Alt a 2 y Enolasa (Alt a 6); proteína de Abedul Bet v1 y P14; proteínas de Cucaracha Alemana Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 y Bla g 6; proteína de Artemisa Art v1; proteína de Cardo ruso Sal k 1 y Sal k 2; cacahuete Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, profilinas de plantas o proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno leucocitario humano.
Los antígenos autoinmunitarios adecuados de los cuales puede derivar el epítopo de células T que se une a la Clase II del MHC se pueden obtener y/o producir, por supuesto, utilizando métodos conocidos. Los antígenos autoinmunitarios adecuados incluyen los antígenos principales en las siguientes enfermedades autoinmuniitarias: Encefalomielitis aguda diseminada (ADEM); enfermedad de Addison; Espondilitis anquilosante; Síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS); Anemia aplásica; Hepatitis autoinmunitaria; Ooforitis autoinmunitaria; enfermedad Celiaca; enfermedad de Crohn; Diabetes melitus tipo 1; Pénfigo gestacional; Síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barré (GBS); enfermedad de Hashimoto; Púrpura trombocitopénica idiopática; Enfermedad de Kawasaki; Lupus eritematoso; Esclerosis múltiple; Miastenia grave; Narcolepsia, síndrome Mioclono Opsoclono (OMS); Neuritis óptica; Tiroiditis de Ord; Pénfigo; Anemia perniciosa; Poliartritis en perros; Cirrosis biliar primaria; Artritis reumatoide; síndrome de Reiter; síndrome de Sjögren; Arteritis de Takayasu; Arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"); Anemia hemolítica autoinmunitaria de Warm; Granulomatosis de Wegener.
Otros epítopos preferidos pueden derivar de antígenos implicados en las respuestas inmunitarias materno-fetales, por ejemplo antígenos Rhesus D implicados en la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido Rhesus D.
Otros epítopos preferidos pueden derivar de antígenos implicados en la enfermedad injerto contra anfitrión o el rechazo de transplantes (respuestas aloinmunitarias), por ejemplo de moléculas de Clase II del MHC (referidas por ora parte antígenos leucocitarios humanos - HLA), preferiblemente del dominio a3 y/o el dominio transmembrana de las moléculas de Clase I del MHC, muy preferiblemente de la molécula HLA-A2 de Clase I del MHC.
Los epítopos pueden ser de proteínas que se administran al individuo, por ejemplo para una terapia. Dichas proteínas pueden actuar como neoantígenos en el individuo, como por ejemplo en la situación en la que el individuo no expresa la proteína. La proteína terapéutica puede ser el factor VIII, la salcatonina u hormona del crecimiento humana.
5 Los siguientes Ejemplos ilustran la invención:
Ejemplo 1
10 Péptidos derivados de Antígenos Leucocitarios Humanos
Los péptidos de la Tabla 2 derivan de HLA-A2 y fueron identificados mediante análisis in silico por contener epítopos de células T que se unen a la clase II del MHC. Las secuencias nativas de HLA-A2 se encuentran en las filas con el fondo sombreado. Los péptidos marcados con * fueron diseñados para reducir la formación de diméros. Los
15 residuos alterados se muestran en negrita y subrayados. E = ácido 2-aminobutírico. La afinidad de unión de cada péptido por las diferentes moléculas de clase II del MHC fue evaluada después in vitro mediante ELISA, como lo fue la capacidad de los péptidos para estimular las células T específicas.
HLA-A2 y deriva del dominio a3 de la molécula HLA-A2. Este péptido tiene un peso molecular de 1708. El péptido TRA31 (HPISDHEATLRCWAL - SEQ ID NO: 4) es un análogo de TRA30 y también deriva del dominio a3 de la 25 molécula HLA-A2, excepto que el residuo de alanina se remplaza por un residuo de prolina, y el residuo de valina se remplaza por un residuo de isoleucina. TRA32 (HPVSDHEATLRCWAL - SEQ ID NO: 7) es otro análogo de TRA30 y también deriva del dominio a3 de la molécula HLA-A2, excepto que el residuo de alanina se remplaza por un residuo de prolina. El péptido TRA39 (RCWALSFYPAEITLT - SEQ ID NO: 10) corresponde a los aminoácidos 202-216 de la proteína HLA-A2, y deriva del dominio a3 de la molécula HLA-A2. Este péptido tiene un peso molecular de 1770. El 30 péptido TRA 40 (RCWALGFYPAEITLT - SEQ ID NO: 12) es un análogo de TRA39, y deriva del dominio a3 de la molécula HLA-A2, excepto que el residuo de serina de la posición 207 es remplazado por un residuo de glicina. Los ocho péptidos diseñados de la Tabla 2 fueron diseñados mediante sustitución del residuo de cisteína o bien por serina o bien por ácido 2-aminobutírico (como se muestra) para reducir la formación de dímeros y mejorar la solubilidad. La siguiente tabla ilustra el éxito de esta estrategia ya que TRA33 y 36 tienen una solubilidad superior a
35 la de TRA 30, y TRA42 tiene una solubilidad superior a la de TRA40.
Además, algunos de los péptidos anteriores han sido sometidos a ensayo para determinar si los péptidos modificados eran más o menos capaces de activar las células T que los péptidos originales. En particular, los
5 péptidos mostrados en la tabla de más abajo se sometieron a ensayo frente a células T de dos sujetos. Los dos sujetos fueron pacientes sometidos a transplante renal que llevaban > 1 año desde el transplante y no seleccionados para la función renal. El Sujeto 1 tuvo una respuesta Elispot de células T específicas del péptido HLA media mientras el sujeto 2 tuvo una respuesta Elispot muy baja (véase la tabla de más abajo – los péptidos originales están sombreados en gris).
10 El análisis se realizó como sigue: Se preparan células mononucleares a partir de sangre periférica (PBMC) de pacientes mediante gradiente de ficoll (30min.). Las PBMC se incuban con los péptidos, control positivo o control negativo (medio solamente) en una placa Elispot con Interferon gamma (48 horas de incubación). Después de la incubación, la placa de Elispot se lava (30 min.) y se añade el producto conjugado de anticuerpo anti-interferon
15 gamma-enzima a la placa de Elispot (1,5 horas de incubación). La placa de Elispot se lava (30 min.) y se añade el sustrato para teñir los Elispots (20 min. de incubación). A continuación se lee la placa. El número de manchas equivale al número de células T activadas.
Recuento Elispot
Péptido
Sujeto 1 Sujeto 2
TRA30
12,5 1,5
TRA33
12,5 0,5
TRA31
17,5 0,5
TRA34
14 1,5
TRA39
10,5 0,5
TRA41
15,5 0
TRA40
10,5 0,5
TRA41
10,5 0
20 Como se muestra, en el sujeto (sujeto 1) con buenas respuestas, éstas se mantuvieron cuando se sometió a ensayo con péptidos modificados versus los péptidos originales. De un modo similar, para el sujeto que no respondió al péptido original (sujeto 2), la modificación de los péptidos no cambió esto. De este modo, la modificación no afecta a la capacidad de los péptidos para activar las células T y en particular no crea un nuevo epítopo falso. Esto es, el diseño de los péptidos no disminuye su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria.
25 Ejemplo 2
Péptidos derivados de alergenos de Ácaro del Polvo Doméstico
30 Los péptidos de la Tabla 3 derivan de alergenos principales de los Ácaros del Polvo Doméstico y se identificó mediante análisis in silico que contenían epítopos de células T que se unen a la clase II del MHC. Las secuenciasnativas de las proteínas alergénicas de Ácaros de Polvo Doméstico están en las filas con el fondo sombreado. Los péptidos marcados con * fueron diseñados para reducir la formación de dímeros. Los residuos alterados se muestran en negrita y subrayados.
35 = ácido 2-aminobutírico. Se evaluó la afinidad de unión para cada péptido original para diferentes moléculas de clase II del MHC mediante estudios de unión in vitro.
Tabla 3
Los péptidos HDM02, HDM03, HDM06, HDM100, 101, 102 y 203 derivan del alergeno de ácaro del polvo doméstico principal Der p1. Los péptidos HDM19 y HDM26 derivan del alergeno del ácaro del polvo doméstico principal Der p2. Todos los péptidos diseñados de la Tabla 3 fueron diseñados mediante remplazo del residuo de cisteína o bien por serina o bien por ácido 2-aminobutírico (según se muestra) para reducir la formación de dímeros. La idoneidad de varios de los péptidos diseñados anteriores para su uso en la inducción de inmunotolerancia para tratar o prevenir la alergia a los ácaros del polvo doméstico se demuestra más abajo. La siguiente Tabla presenta los resultados de un análisis de liberación de citoquinas realizado sobre PBMC tomadas de una población de individuos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico (N = número de individuos de la población). Se considera que una respuesta positiva es la producción de al menos 100 pg/ml de citoquina. Como se muestra, el número de individuos en la población que produce las citoquinas IFN-y y IL-13 en respuesta a los péptidos indicados no es significativamente alterado por el proceso de diseño. De este modo, el diseño de los péptidos no disminuye su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria.
Se analizaron los perfiles de secreción de citoquinas de las PBMC en respuesta a la estimulación con péptidos utilizando los péptidos indicados. Los sobrenadantes del análisis de liberación de citoquinas se sometieron a ensayo para determinar la presencia de 2 citoquinas, IFN-y e IL-13, utilizando o bien un análisis ELISA o bien un análisis Multiplex de matrices de cuentas.
Un análisis de liberación de citoquinas típico requiere 40 x 106 PBMC por sujeto. Con más detalle, se distribuyen 250 μl de una disolución de 200 μg/ml de la concentración de antígeno o péptido apropiada en los pocillos apropiados de placas de 48 pocillos. Las placas se incuban en una incubadora con 5% de CO2 humidificada a 37°C durante un máximo de 4 horas. Después se añaden 250 μl de una suspensión de PBMC de 5 x 106 células/ml a cada pocillo y las placas se devuelven a la incubadora durante 5 días. Después de la estimulación, se recogen las muestras del sobrenadante de cultivo para someterlas a ensayo mediante ELISA o análisis Multiplex de matrices de cuentas de acuerdo con los protocolos convencionales.
Péptido
Secuencia Respondedores con IFN-g >100 Respondedores con IL-13 >100
N=55
HDM101
NYCQIYPPNVNKIREA 2 1
HDM101A
NYSQIYPPNVNKIREA 4 4
HDM101B
NYEQIYPPNVNKIREA 1 2
HDM102
NAQRFGISNYCQI 16 13
HDM102A
NAQRFGISNYSQI 14 16
HDM102B
NAQRFGISNY QI 15 17
HDM 100
RFGISNYCQIYPPNVNK 6 6
HDM100A
RFGISNYSQIYPPNVNK 10 8
HDM100B
RFGISNYBQIYPPNVNK 6 10
La Figura 1 muestra los resultados de un análisis similar para la producción de IL10 en respuesta a HDM203A y 203B en una población de 34 individuos alérgicos a los ácaros del polvo doméstico. Una vez más, las respuestas de todos los individuos no fueron significativamente diferentes en los péptidos diseñados versus los no diseñados.
5 Ejemplo 3
Péptidos derivados de alergenos de ambrosía
10 Los péptidos de más abajo derivan del alergeno principal del polen de Ambrosía (Amb a1, No. Acc. NCBI AAA32669) y se identificó mediante análisis in silico que contenían epítopos de células T que se unen a la clase II del MHC. Las secuencias nativas de las proteínas alergénicas de ambrosía están en las filas con el fondo sombreado. Los péptidos marcados con * fueron diseñados para reducir la formación de dímeros. Los residuos alterados se muestran en negrita y subrayados. La afinidad de unión para cada péptido original para las diferentes
15 clases de moléculas de la clase II del MHC se evaluó mediante estudios de unión in vitro.
Utilizando métodos equivalentes a los del Ejemplo 2, se sometieron a ensayo estos péptidos para determinar la
20 capacidad para inducir la producción de citoquinas en las PBMC tomadas de una población de individuos alérgicos a la ambrosía. Los niveles de IFN-gamma producidos por cada sujeto se muestran en la Figura 2. Como se muestra, el péptido diseñado (RGW02) no induce respuestas significativamente diferentes al péptido no diseñado (RGW02B). Por lo tanto el péptido diseñado es adecuado para su uso en la inducción de inmunotolerancia para el tratamiento o la prevención de la alergia al polen de ambrosía. Se podría realizar una sustitución equivalente con ácido 2 amino
25 butirico para dar RGW02c: GSSQIWIDH BSLSKS (SEQ ID NO.72).
La idoneidad de varios de los péptidos diseñados anteriores para su uso en la inducción de inmunotolerancia para
30 tratar o prevenir la alergia a la ambrosía se demuestra más abajo. La siguiente Tabla presenta los resultados de un análisis de liberación de citoquinas realizado sobre PBMC tomadas de siete individuos alérgicos a la ambrosía (A -G). Como se muestra, el nivel de producción de IL-10 por el péptido modificado (RGW02) no es significativamente diferente del nivel producido por el péptido original (RGW02A) De este modo, el diseño del péptido no disminuye su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria.
35 Se analizaron los perfiles de secreción de citoquinas a partir de las PBMC en respuesta a la estimulación con péptidos utilizando el péptido indicado. Los sobrenadantes del análisis de liberación de citoquinas se sometieron a ensayo para determinar la presencia de IL-10, utilizando o bien un análisis ELISA o bien un análisis Multiplex de matrices de cuentas. Un análisis de liberación de citoquinas típico requiere 40 x 106 PBMC por sujeto. Con más detalle, se distribuyen 250 μl de una disolución de 200 μg/ml de la concentración de antígeno o péptido apropiada en los pocillos apropiados de placas de 48 pocillos. Las placas se incuban después en una incubadoras con 5% de CO2 humidificada a 37°C durante un máximo de 4 horas. A continuación se añaden 250 μl de una suspensión de PBMC de 5 x 106 células/ml a cada pocillo y las placas se devuelven a la incubadora durante 5 días. Después de la estimulación, las muestras del sobrenadante de cultivo se cosechan para someterlas a ensayo para determinar mediante ELISA o análisis Multiplex de matrices de cuentas de acuerdo con los protocolos convencionales.
Sujeto
Péptido IL-10 (pg/ml)
A
RGW02 248,91
A
RGW02A 255,52
B
RGW02 227,18
B
RGW02A 224,34
C
RGW02 452,45
C
RGW02A 486,75
D
RGW02 80,54
D
RGW02A 67,40
E
RGW02 310,34
E
RGW02A 323,84
F
RGW02 203,12
F
RGW02A 225,41
G
RGW02 283,75
G
RGW02A 240,41
10 Ejemplo 4
Péptidos derivados de alergenos de Gato
Los péptidos de la Tabla 4 derivan del alergeno de gato principal Fel d1 que fue identificado mediante análisis in vitro
15 por contener epítopos de células T que se unen a la clase II del MHC. Cada uno de los cinco péptidos contiene un único residuo de cisteína, cuya cadena lateral contiene un grupo funcional tiol. Aunque pueden existir tioles libres en estado libre, éstos son fácilmente oxidados para formar puentes disulfuro intermoleculares o residuos de cistina. La oxidación de los residuos de cisteína presentes en los péptidos dará como resultado la formación de dímeros. Estos dímeros pueden surgir debido al entrecruzamiento entre dos péptidos con la misma secuencia en formulaciones
20 individuales, o diferentes péptidos dentro de una mezcla.
Mientras los péptidos individuales tienen una longitud de la cadena máxima de 17 aminoácidos, la dimerización dará como resultado moléculas más grandes que podrían desencadenar la desgranulación de los mastocitos con una liberación concomitante de histamina. Obviamente esto no es deseable, pero la presencia de residuos de cisteína en
25 algunos de los péptidos seleccionados puede hacer que se observe este efecto.
Por consiguiente, el enfoque principal de este Ejemplo consistió en evaluar la capacidad de cada agente o mezcla de agentes, para reducir o inhibir la formación de dímeros de péptidos que surgen de la oxidación de tioles libres para formar puentes disulfuro intermoleculares. La conclusión del Ejemplo es la identificación de agentes que se
30 puedan incluir en una formulación o composición de cada uno de los péptidos individuales para reducir la formación de dímeros.
Tabla 4 Estas secuencias también se pueden diseñar para remplazar residuos de cisteína como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto:
Péptido
Secuencia de aminoácidosa Peso molecular (Da) Punto isoeléctricoa
MLA01
CPAVKRDVDLFLT 1476,77 5,95 SEQ ID NO: 37
MLA04
KALPWLENARILKNCV 1880,35 9,31 SEQ ID NO: 38
MLA05
RILKNCVDAKMTEEDKE 2022,34 5,11 SEQ ID NO: 39
Péptido
Secuencia de aminoácidosa Peso molecular (Da) Punto isoeléctricoa
MLA12
TAMKKLQDCYVENGLI 1826,18 5,73 SEQ ID NO: 40
MLA15
ISSSKDCMGEAVQNTV 1668,88 4,37 SEQ ID NO: 41
aDatos generados a partir de la información de la secuencia primaria utilizando la herramienta ProtParam del ExPASy Molecular Biology Server (http://wwww.expas.org)
MLA01a
SPAVKRDVDLFLT SEQ ID NO: 62
MLA01b
PAVKRDVDLFLT SEQ ID NO: 63
MLA04a
KALPVVLENARILKNSV SEQ ID NO: 64
MLA04b
KALPVVLENARILKN V SEQ ID NO: 65
MLA05a
RILKNSVDAKMTEEDKE SEQ ID NO: 66
MLA05b
RILKN VDAKMTEEDKE SEQ ID NO: 67
MLA12a
TAMKKIQDSYVENGLI SEQ ID NO: 68
MLA12b
TAMKKIQD YVENGLI SEQ ID NO: 69
MLA15a
ISSSKDSMGEAVQNTV SEQ ID NO: 70
MLA15b
ISSSKD MGEAVQNTV SEQ ID NO: 71
5 Los péptidos diseñados no se someten a ensayo adicionalmente en este Ejemplo.
Métodos
10 Los péptidos utilizados en este estudio tienen una pureza mínima de >90%. La eficacia de cada aditivo para reducir la formación de dímeros se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) y RP-HPLC. En la SEC, las moléculas se separan basándose en su peso molecular aparente. Las moléculas más pequeñas se pueden distribuir en una proporción mayor de la matriz de la columna y son retenidas durante más tiempo que los analitos de peso molecular mayor. Los dímeros eluirán de la columna con un peso molecular aparente aproximadamente dos
15 veces el de los monómeros correspondientes. La separación mediante RP-HPLC separa las especies basándose en las diferencias en su carácter hidrófobo. La cantidad de dímero formado se determina como un porcentaje de la razón del área del pico total (%PAR) para el cromatograma.
Formulaciones básicas
20 Se llevaron a cabo estudios utilizando una matriz universal en la que cada uno de los agentes potenciales fue añadido a la concentración apropiada. La matriz universal se preparó en agua desionizada y contenía
•
ácido clorhídrico 5 mM (HCl)
•
cloruro de sodio 140 mM (NaCl)
25 Se utilizó el HCl 5 mM para proporcionar un entorno de pH bajo, esto es, aprox. pH 2,3. A pH bajo, los grupos tiol libres se protonarán completamente y como tales son mucho menos susceptibles a la oxidación que a pH >6. El pH bajo proporciona un entorno que promueve la solubilidad de cada uno de los péptidos. A pH 2,3 todos los péptidos deben mostrar propiedades catiónicas, esto es, están cargados positivamente, y por lo tanto deben ser solubles hasta cierto punto. Se ha utilizado HCl a una concentraciones de hasta 10% v/v en inyecciones intravenosas.
Se incluyó NaCl 140 mM para producir una matriz con una fuerza iónica más o menos equivalente al entorno fisiológico, esto es, isotónica. Puesto que los péptidos se administrarán intradérmicamente durante los estudios Clínicos es importante que las formulaciones utilizadas estén próximas a la isotonicidad. Se espera observar efectos
5 similares en matrices de tonicidad baja.
Agentes sometidos a ensayo
Los agentes añadidos a la matriz universal se muestran en la Tabla 5 junto con las concentraciones a las cuales se 10 utilizaron.
Tabla 5
Agente
Concentración en matriz universal (%p/v) Propiedades
Control
N/A N/A
Ácido ascórbico
1,0 Antioxidante
Hidroxianisol butilado (BHA)
0,002 Antioxidante, Conservante
Hidroxitolueno butilado (BHT)
0,002 Antioxidante, Conservante
Metabisulfito de sodio
1,0 Antioxidante
Tiosulfato de sodio
0,1 Antioxidante
Hidrocloruro de cisteína
0,5 Antioxidante, Agente Reductor
Hidrocloruro de L-metionina
0,5 Antioxidante, Agente Reductor
1-Tioglicerol
0,5 Antioxidante, Agente conservante
Ácido tioglicólico
0,2 Agente reductor
Citrato de sodio
1,0 Agente quelante
EDTA disódico
1,0 Agente quelante
Mezcla 1
·
EDTA disódico 1,0
·
Metionina 0,5
·
BHA 0,002
Mezcla 2
·
EDTA disódico 1,0
·
Tioglicerol 0,5
·
BHA 0,002
Resultados
El nivel de formación de dímeros en presencia de cada agente se muestra en la Tabla 6. Los agentes que redujeron con éxito la formación de dímeros se destacan en negrita.
Tabla 6 Los datos generados mediante la exclusión cromatografía de exclusión por tamaños sobre muestras preparadas como antes y almacenadas hasta durante una semana identificaron dos agentes, 1-Tioglicerol Hidrocloruro de Cisteína, que eran eficaces en la prevención de la formación de dímeros de péptidos. Además, una mezcla de
Porcentaje de formación de dímeros (%PAR)
T=0
72 hrs 1 semana 2 semanas 5 semanas
Aditivo
25°C/60%HR 5°C 25°C/60%HR 5°C 25°C/60%HR -20°C 5°C
Control
1,16 6,52 3,20 8,72 3,23 11,43 2,42 7,51
Ácido ascórbico
0,14 1,76 0,53 5,62 ND ND ND ND
BHA
1,56 8,80 4,38 10,10 ND ND ND ND
Porcentaje de formación de dímeros (%PAR)
T=0
72 hrs 1 semana 2 semanas 5 semanas
BHT
1,25 11,48 7,13 12,67 ND ND ND ND
Metabisulfito de Na
0,32 0,12 2,49 1,41 ND ND ND ND
Tiosulfato de Na
-* -* -* -* ND ND ND ND
HCL Cisteína
0,35 0,18 0,38 0,24 0,02 0,02 0,23 0,69
DL-Metionina
1,20 3,78 2,01 6,70 ND ND ND ND
1-Tioglicerol
0,22 0,46 0,63 0,36 0,35 0,37 0,38 1,43
Citrato de Na
43,82 43,48 43,86 42,95 ND ND ND ND
EDTA disódico
1,26 4,64 7,27 12,60 ND ND ND ND
Mezcla 1
6,44 16,87 22,76 20,24 ND ND ND ND
•
BHA
•
EDTA
•
DL-Metionina
Mezcla 2
0,60 0,29 0,70 0,67 1,67 1,29 0,33 2,08
•
BHA
•
EDTA
•
1-Tioglicerol
-*: No disponible debido a cromatografía inusual ND: Ninguno detectado HR: Humedad relativa
5 agentes, a saber, EDTA, BHA y 1-Tioglicerol (Mezcla 2), también parecía evitar la formación de dímeros. De los agentes restantes, el ácido ascórbico y la DL-Metionina parecían retrasar la formación de dímeros en comparación con la matriz de control, esto es, HCl 5 mM y NaCl 140 mM, pero la presencia de los otros aditivos dio como resultado un incremento de la formación de dímeros.
10 La evaluación del contenido de dímeros fue continua para las mezclas de péptidos preparadas en la matriz de Control y las matrices que contenían 1-Tioglicerol, Hidrocloruro de L-cisteína y Mezcla 2 en los puntos temporales de dos semanas y cinco semanas en las condiciones mostradas en la Tabla 6.
Después de la generación de datos a partir del escrutinio preliminar se emprendió la tarea de evaluar la capacidad
15 de las matrices que contenían Hidrocloruro de cisteína y 1-tioglicerol para inhibir la propensión de los péptidos que contenían cisteína individuales y pares mezclados de estos péptidos para dimerizarse en comparación con la matriz sola. Para cada una de las mezclas de excipientes, se prepararon todas las posibles combinaciones de péptidos binarias. Las muestras se analizaron mediante RP-HPLC inmediatamente y después de un almacenamiento a 25°C/HR 60% durante una semana. Las cantidades de dímero formado se presentan en la Tabla 7. La cantidad de
20 dímero formado se determina como un porcentaje de la proporción del área del pico total (%PAR) para el cromatograma en cada caso.
Se considera que la eficacia del Hidrocloruro de cisteína en la prevención de la dimerización procede de la formación de péptidos cisteinilados.
Tabla 7.
Porcentaje de la razón del área del pico (%PAR)
Péptidos en la muestra
Dímeros formados T=0 T=72 h T = 1 semana
Control
Cisteína 1-Tioglicerol Control Cisteína 1-Tioglicerol Control Cisteína 1-Tioglicerol
MLA01
MLA01 3,85 0,49 ND 43,81 ND ND 66,81 ND ND
MLA04
MLA04
ND ND ND 2,51 ND ND 4,76 ND ND
MLA05
MLA05 0,55 ND ND 1,99 ND ND 1,65 0,21 ND
MLA12
MLA12
ND ND ND 0,46 ND ND 1,72 ND ND
MLA01
MLA01
2,92 0,48 ND 35,47 ND ND 39,49 0,52 ND
MLA04
MLA04
ND ND ND 1,32 ND ND 271 ND ND
MLA01+04
ND ND ND 10,84 ND ND 18,44 0,61 ND
MLA01
MLA01
2,73 0,73 ND 41,11 ND ND 45,59 0,26 ND
MLA05
MLA05
0,35 ND ND 2,21 ND ND 3,18 ND ND
MLA01+05
0,67 ND ND 14,2 ND ND 18,35 0,25 ND
MLA01
MLA01
2,7 0,2 ND 29,62 ND ND 40,03 0,23 ND
MLA12
MLA12 ND ND ND 2,09 0,1 ND 3,43 0,18 ND
MLA01+12
0,23 ND ND 9,92 0,28 ND 17,19 0,51 ND
MLA04
MLA04
ND ND ND 0,91 ND ND 2,32 ND ND
MLA05
MLA05
ND ND ND 2,25 ND ND 3,26 ND ND
MLA04+05
ND ND ND 2,59 0,29 ND 6,1 1,42 ND
MLA04
MLA04
ND ND ND 0,44 ND ND 2,42 ND ND
MLA12
MLA12
ND ND ND 1,1 0,33 ND 2,13 0,32 ND
MLA04+12
ND ND ND 2,38 ND ND 6,28 ND ND
MLA05
MLA05
ND ND ND 8,17 ND ND 1,85 ND ND
MLA12
MLA12
ND ND ND 9,78 ND ND 1,28 ND ND
MLA05+12
ND 1 49 ND 209 10,48 0,28 4,4 17,85 0,97
ND Ninguno detectado
Ejemplo 5
5 Péptidos derivados de proteínas asociadas con enfermedades auto- y alo-inmunitarias
Todos los péptidos de las tablas 8, 9 y 10 derivan de proteínas asociadas con enfermedades alo-inmunitarias según se indica, y se identificó previamente mediante análisis in silico o in vitro que contenían epítopos de células T que se unían a la clase II del MHC. Las secuencias nativas de las proteínas están en las filas con el fondo sombreado. Los
10 péptidos marcados con * fueron diseñados para reducir la formación de dímeros. Los residuos alterados se muestran en negrita y subrayados.
Tabla 8 – Trombocitopenia Neonatal Aloinmune
NAIT01
H2N H2N AWCSDEALPL COOH SEQ ID NO: 73
NAIT01A*
H2N AWSSDEALPL COOH SEQ ID NO: 74 Diseñado a partir de NAIT01
Derivado de glicoproteína IIIa de plaquetas
Tabla 9 – Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido
HDN28
H2N AYFGLSVAWCLPKPL COOH SEQ ID NO: 42
HDN28A*
H2N AYFGLSVAWCLPKPL COOH SEQ ID NO: 43 Diseñado a partir de HDN28
Derivado de antígeno del grupo sanguíneo D de Rhesus

Tabla 10 - Trombocitopenia Aloinmune
AIT02
H2N TTRGVSSCQQCLAVS COOH SEQ ID NO: 44
AIT02A*
H2N TTRGVSSSQQSLAVS COOH SEQ ID NO: 45 Diseñado a partir de AIT02
AIT47
H2N IDLPEELSLSFNATCL COOH SEQ ID NO: 46
AIT47A*
H2N DLPEELSLSFNATSL COOH SEQ ID NO: 47 Diseñado a partir de AIT47
AIT53
H2N FKDSLIVQVTFDCDC COOH SEQ ID NO: 48
AIT53A*
H2N FKDSLIVQVTFDSDS COOH SEQ ID NO: 49 Diseñado a partir de AIT53
AIT70
H2N PGSYEDTCEKCPTCP COOH SEQ ID NO: 50
AT70A*
H2N PGSYEDTSEKSPTSP COOH SEQ ID NO: 51 Diseñado a partir de AIT70
AIT77
H2N DDCWRFQYYEDSSG COOH SEQ ID NO: 52
AIT77A*
H2N IDDSVVRFQYYEDSSG COOH SEQ ID NO: 53 Diseñado a partir de AIT77
Derivado de glicoproteína IIIa de plaquetas

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición que comprende:
    i) al menos un péptido de 9 a 25 aminoácidos de longitud en donde el péptido comprende una región que comprende al menos un epítopo de célula T; y ii) al menos un agente que inhibe la formación de dímeros del péptido y que se selecciona entre tioglicerol y tioanisol.
  2. 2.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde: a) la proporción de péptido que está presente en forma de dímero en la disolución en ausencia de dicho agente es de al menos 0,5%, opcionalmente en donde dicho dímero en disolución se mide después de que el péptido haya estado en disolución durante al menos 72 horas a aproximadamente 25°C y a una humedad relativa de aproximadamente 60%; y/o b) dicho epítopo es un epítopo de célula T que se une a la Clase II del MHC; y/o c) menos del 5% de dicho péptido está presente en forma dimérica en la disolución; y/o d) dicho péptido tiene una capacidad mejorada para inducir tolerancia en un individuo en comparación con la forma de dímero de dicho péptido; y/o e) la secuencia nativa de la región comprende al menos un residuo de cisteína; y/o f) la secuencia nativa de la proteína de la cual deriva la región comprende aproximadamente 33% de residuos de cisteína; y/o g) la secuencia nativa de la región comprende uno, dos, tres o más residuos de cisteína hasta un máximo de 25% del número total de residuos de aminoácido en dicho péptido.
  3. 3.
    Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho péptido no comprende un epítopo susceptible de entrecruzamiento con IgG expresada sobre la superficie celular de las células B o la IgE expresada sobre la superficie de mastocitos o basófilos y/o en donde la región consiste enteramente en la secuencia mínima del epítopo de la célula T.
  4. 4.
    Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde dicho epítopo deriva
    de: i) un alergeno seleccionado entre un alergeno vegetal (concretamente alergeno del pasto), alergenos de caspa de animales, un alergeno de moho u hongo, un alergeno del polvo, un antibiótico u otro fármaco, un veneno de un insecto que pica, un alergeno medioambiental y un alergeno alimentario; o ii) un antígeno seleccionado entre los principales antígenos asociados con Encefalomielitis aguda diseminada (ADEM); enfermedad de Addison; Espondilitis anquilosante; Síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS); Anemia aplásica; Hepatitis autoinmunitaria; Ooforitis autoinmunitaria; enfermedad Celíaca; enfermedad de Crohn; Diabetes melitus tipo 1; Pénfigo gestacional; Síndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; síndrome de Guillain-Barré (GBS); enfermedad de Hashimoto; Púrpura trombocitopénica idiopática; Enfermedad de Kawasaki; Lupus eritematoso; Esclerosis múltiple; Miastenia grave; Narcolepsia, Síndrome Mioclono Opsoclono (OMS); Neuritis óptica; Tiroiditis de Ord; Pénfigo; Anemia perniciosa; Poliartritis en perros; Cirrosis biliar primaria; Artritis reumatoide; síndrome de Reiter; síndrome de Sjögren; Arteritis de Takayasu; Arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"); Anemia hemolítica autoinmunitaria de Warm; Granulomatosis de Wegener.
  5. 5.
    Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el epítopo deriva de proteína Fel d1 de caspa de gato; proteínas Der P1, Der P2 y Der P7 de ácaro de polvo doméstico; proteína de ambrosía amb a 1.1, a 1.2, a1.3 o a1.4; proteínas de ballico lol p1 y lol p5; proteínas del heno ph1 p1 y ph1 p5; proteína de grama fina Cyn d 5; proteínas alternas de Alternaria Alt a 1, Alt a 2 y Enolasa (Alt a 6); proteína de Abedul Bet v1 y P14; proteínas de Cucaracha Alemana Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 y Bla g 6; proteína de Artemisa Art v1; proteína de Cardo ruso Sal k 1 y Sal k 2; cacahuete Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, profilinas de plantas o proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno leucocitaro humano.
  6. 6.
    Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento
    o la prevención de una enfermedad alérgica, una enfermedad autoinmunitaria, una respuesta aloinmunitaria o una respuesta inmunitaria materno-fetal por inducción de inmunotolerancia, o para su uso en la inducción de inmunotolerancia en un individuo a un neoantígeno o a una proteína que está siendo suministrada al individuo en una terapia.
  7. 7.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la enfermedad alérgica o la enfermedad autoinmunitaria comprenden una respuesta inmunitaria a un alergeno o antígeno según se define en la reivindicación 4, o la respuesta aloinmunitaria está implicada en el rechazo de transplantes o la enfermedad injerto versus anfitrión, o la respuesta inmunitaria materno-fetal es la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido Rhesus D.
  8. 8.
    Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos un
    primer y un segundo péptidos, en donde el primer y el segundo péptidos comprenden o consisten cada uno en una secuencia diferente seleccionada entre las secuencias de los SEQ ID NO: 37 (MLA01), SEQ ID NO: 38 (MLA04), SEQ ID NO: 39 (MLA05), o SEQ ID NO: 40 (MLA12).
  9. 9.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el primer y el segundo péptidos comprenden o consisten en la secuencias de los SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 38 (MLA04), SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 39 (MLA05), SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 40 (MLA12), SEQ ID NOS: 38 (MLA04) y 39 (MLA05), SEQ ID NOS: 38 (MLA04) y 40 (MLA12) o SEQ ID NOS: 39 (MLA05) y 40 (MLA12).
  10. 10.
    Un método in vitro para diagnosticar la presencia o ausencia en un sujeto de una respuesta inmunitaria de las
    células T a la proteína de la cual deriva el epítopo, comprendiendo el método: i) poner en contacto una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 o 9 con células T en una muestra tomada del sujeto, en condiciones que permiten que el péptido y las células T interaccionen; y ii) determinar si cualquiera de las células T son estimuladas o no y de se modo si se encuentra presente o ausente una respuesta inmunitaria de las células T.
  11. 11.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde:
    (a)
    las células T están presentes en una población de PBMC aisladas de una muestra de sangre o suero tomada del sujeto; y/o
    (b)
    la etapa (ii) comprende medir la producción de una citoquina por las células T; y/o
    (c)
    la producción de dicha citoquina, opcionalmente interferon-gamma, es detectada mediante un ELISPOT o un análisis Multiplex de matrices de cuentas.
  12. 12.
    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en donde:
    (a)
    la composición comprende al menos un péptido que comprende o consiste en la secuencia correspondiente a uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 74; y/o
    (b)
    la composición comprende al menos un primer y un segundo péptidos, en donde el primer y segundo péptidos comprenden o consisten cada uno en una secuencia diferente seleccionada entre las secuencias de los SEQ ID NO: 37 (MLA01), SEQ ID NO: 38 (MLA04), SEQ ID NO: 39 (MLA05), y SEQ ID NO: 40 (MLA12); preferiblemente en donde el primer y segundo péptidos comprenden o consisten en las secuencias de los SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 38 (MLA04), SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 39 (MLA05), SEQ ID NOS: 37 (MLA01) y 40 (MLA12), SEQ ID NOS: 38 (MLA04) y 39 (MLA05), SEQ ID NOS: 38 (MLA04) y 40 (MLA12) o SEQ ID NOS: 39 (MLA05) y 40 (MLA12), respectivamente; y/o
    (c)
    el agente es tioglicerol.
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