ES2353362T3 - Péptidos para insensibilización contra alergenos. - Google Patents
Péptidos para insensibilización contra alergenos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2353362T3 ES2353362T3 ES08788348T ES08788348T ES2353362T3 ES 2353362 T3 ES2353362 T3 ES 2353362T3 ES 08788348 T ES08788348 T ES 08788348T ES 08788348 T ES08788348 T ES 08788348T ES 2353362 T3 ES2353362 T3 ES 2353362T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- polypeptide
- peptide
- peptides
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Una composición para su uso en la prevención o tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico por tolerización que comprende (i) un polipéptido de HDM203B DLRQMRTVTPIRMQGGSGS, o (ii) una variante de un polipéptido de acuerdo con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en: - la secuencia de (i); o - una secuencia que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de (i) cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo con respecto a la secuencia de (i), o (iii) una variante de un polipéptido de acuerdo con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una secuencia que representa cualquiera de: - un fragmento de la secuencia de (i); o - un homólogo de un fragmento de la secuencia de (i), cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo con respecto a la secuencia de (i) y tiene al menos 9 aminoácidos de longitud y en el que dicho homólogo tiene una homología de al menos el 70% con cualquiera de los 9 aminoácidos contiguos en la secuencia de (i).
Description
Péptidos para insensibilización contra
alérgenos.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden péptidos para prevenir o tratar la alergia a los
ácaros del polvo doméstico, y en particular a combinaciones óptimas
de péptidos para prevenir o tratar dicha alergia.
El reconocimiento de antígenos de los linfocitos
T requiere células presentadoras de antígeno (APC) para presentar
fragmentos de antígeno (péptidos) en su superficie celular en
asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC). Los linfocitos T usan sus receptores de linfocitos T
específicos de antígeno (TCR) para reconocer los fragmentos de los
antígenos presentados por las APC. Dicho reconocimiento actúa como
un desencadenante para el sistema inmunológico para generar una
variedad de respuestas para erradicar el antígeno que se ha
reconocido.
El reconocimiento de antígenos externos por el
sistema inmunológico de un organismo, tal como un ser humano,
puede, en algunos casos, producir enfermedades, conocidas como
afecciones atópicas. Las enfermedades alérgicas, son ejemplos de
estas últimas, incluyendo asma, dermatitis atópica y rinitis
alérgica. En este grupo de enfermedades, los linfocitos B generan
anticuerpos de la clase de IgE (en seres humanos) que se unen a
antígenos derivados externamente, que, en este contexto, se
denominan alérgenos ya que estas moléculas suscitan una respuesta
alérgica. La producción de IgE específica de alérgeno depende de los
linfocitos T que también se activan por (son específicos para) el
alérgeno. Los anticuerpos de IgE específicos de alérgeno se unen a
la superficie de células, tales como, basófilos y mastocitos en
virtud de la expresión por estas células de receptores de la
superficie de IgE.
El entrecruzamiento de moléculas de IgE unidas a
la superficie por alérgenos produce la desgranulación de estas
células efectoras causando la liberación de mediadores inflamatorios
tales como histamina, 5-hidroxitriptamina y
mediadores lipídicos tales como los sulfidoleucotrienos. Además de
acontecimientos dependientes de IgE, ciertas enfermedades
alérgicas, tales como asma, se caracterizan por acontecimientos
independientes de IgE.
Las enfermedades alérgicas mediadas por IgE se
tratan actualmente con agentes que proporcionan alivio sintomático
o prevención. Las antihistaminas, los agonistas de \beta2 y los
glucocorticosteroides son ejemplos de dichos agentes. Además,
algunas enfermedades mediadas por IgE se tratan por procedimientos
de insensibilización que implican la inyección periódica de
componentes o extractos alergénicos. Los tratamientos de
insensibilización pueden inducir una respuesta de IgG que compite
con la IgE para el alérgeno, o pueden inducir linfocitos T
supresores específicos que bloquean la síntesis de IgE dirigida
contra el alérgeno. Esta forma de tratamiento no siempre es
efectiva y plantea el riesgo de provocar efectos secundarios graves,
particularmente choque anafiláctico general. Esto puede ser fatal,
a menos que se reconozca de forma inmediata y se trate con
adrenalina. Un tratamiento terapéutico que disminuyese o eliminase
la respuesta alérgica inmune no deseada contra un alérgeno
particular, sin modificar la reactividad inmunológica contra otros
antígenos extraños o desencadenar una respuesta alérgica en sí
sería de gran beneficio para las personas alérgicas.
Los ácaros del polvo doméstico se reconocen
universalmente como una de las principales causas de enfermedades
alérgicas en seres humanos y en animales, incluyendo asma, rinitis
alérgica y dermatitis alérgica. Dos especies de ácaros
estrechamente relacionadas son responsables de la mayoría de las
alergias producidas por los ácaros del polvo doméstico en todo el
mundo. Se trata de Dermatophagoides pteronyssinus
(predominantemente en Europa) y Dermatophagoides farinae
(predominantemente en América). Los alérgenos de los ácaros del
polvo doméstico derivan principalmente de las proteínas de la pared
intestinal de los ácaros, que están presentes en las heces y
normalmente se conocen como proteínas Der p (para D.
pteronyssinus) o Der f (para D. farinae). Un ácaro
promedio producirá aproximadamente 20 bolas fecales cada día de su
vida: dos veces su propio peso corporal. Típicamente, un gramo de
polvo puede contener hasta 500 ácaros, mientras que un colchón puede
contener más de dos millones. La cantidad de material acaricida
presente aumenta con la antigüedad. Una décima parte del peso de
una almohada de 6 años de antigüedad puede constar de ácaros y
desechos de ácaros. En una alfombra, típicamente habrá entre 1.000
y 10.000 ácaros por metro cuadrado.
Las enfermedades alérgicas, particularmente
asma, son un problema enorme y que se amplía en las naciones
industrializadas del mundo. Se ha calculado que el
5-10% de la población de las principales naciones
industrializadas sufre de asma. De ésas, aproximadamente un quinto
tendrá asma severo necesitando hospitalización frecuente. El coste
del asma en los Estados Unidos se ha calculado por un valor de 12,6
mil millones de dólares (7,9 mil millones de libras) al año. Las
cifras para Europa son incluso más altas. Un estudio canadiense
calculó los costes del asma como un promedio de 21 libras al año
por cada miembro de la población de las principales naciones
industrializadas. Cada año morirán 2.000 personas como resultado del
asma en el Reino Unido solamente.
El asma es una enfermedad crónica causada por
reacciones e irritación alérgicas en el sistema respiratorio. Entre
el 50% y el 90% de los asmáticos que reaccionan al material
aerotransportado es sensible a los alérgenos del ácaro del polvo, y
en un estudio Británico el 10% de la población general reaccionó a
los alérgenos del ácaro del polvo. Casi doscientos millones de
americanos viven en áreas seriamente afectadas por la plaga del
ácaro del polvo doméstico. La sensibilización a este material ocurre
en la infancia, principalmente entre los tres y seis meses de la
edad pero el asma es de por vida.
Por lo tanto, un tratamiento terapéutico o
preventivo sería de gran beneficio para los seres humanos que
padecen o están en riesgo de padecer la alergia del ácaro del polvo
doméstico.
Los presentes inventores han descubierto que
ciertas combinaciones de fragmentos peptídicos derivados del
alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 1 (Der p 1, Der f 1), del
alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 2 (Der p2, Der f 2) y del
alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 3 (Der p 7, Der f 7) son
particularmente útiles insensibilizando a individuos frente a estos
alérgenos. Se han seleccionado combinaciones del polipéptido de la
invención para determinar su capacidad de inducir una respuesta a
citocina en una elevada proporción de sujetos de un panel de
individuos alérgicos al ácaro del polvo doméstico.
Los polipéptidos de la invención se
seleccionaron inicialmente como epítopos de linfocitos T mediante el
uso de evaluaciones realizadas por ordenador e in vitro de
las características de unión del MHC a péptidos. Véase, por
ejemplo, la Tabla 3 que demuestra la capacidad de una variedad de
péptidos derivados de los alérgenos anteriores para unirse a tipos
de DR múltiples en ensayos de unión del MHC de clase II. Se
identificaron epítopos adicionales por homología. Después, estos
polipéptidos candidatos se exploraron adicionalmente para el uso
potencial en toleriza-
ción.
ción.
Una dificultad asociada a estrategias para la
insensibilización basada en la inmunización del péptido radica en
cómo seleccionar un tamaño y una región apropiados del alérgeno como
la base para el péptido a usar para la inmunización. El tamaño del
péptido de elección es crucial. Si el péptido es demasiado pequeño,
la vacuna no sería eficaz induciendo una respuesta inmunológica. Si
los péptidos son demasiado grandes, o si se introduce todo el
antígeno en un individuo, existe el riesgo de inducir reacciones
adversas, tales como anafilaxia, que pueden ser fatales.
Los polipéptidos de la invención se han
seleccionado para conservar especificidad de la célula de T al mismo
tiempo que son bastante pequeños de tamaño para no poseer
estructura terciaria significativa que les permitiría conservar la
conformación de un epítopo de unión a la IgE de la molécula entera.
Por lo tanto, los polipéptidos de la invención no inducen
entrecruzamiento significativo de las moléculas de IgE específicas
adyacentes en células tales como mastocitos y basófilos y por
consiguiente no causan liberación significativa de histamina.
Una ventaja de la invención es la capacidad de
los péptidos para dirigir ampliamente a las moléculas del Complejo
Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Los receptores de linfocitos T
(TCR) son muy variables en su especificidad. La variabilidad se
genera, como con las moléculas de anticuerpos, mediante
acontecimientos de recombinación de genes dentro de la célula. Los
TCR reconocen al antígeno en forma de péptidos cortos unidos a
moléculas codificadas por los genes del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC). Estos productos génicos son las mismas
moléculas que dan lugar a los "tipos de tejidos" usados en
trasplantes y también se denominan moléculas de antígenos
leucocitarios humanos (HLA) cuyo término puede utilizarse
indistintamente. Las moléculas individuales del MHC poseen surcos
de unión a péptidos que, debido a su forma y carga, sólo pueden
unirse a un grupo limitado de péptidos. Los péptidos unidos por una
molécula del MHC pueden no estar necesariamente unidos por otras
moléculas del
MHC.
MHC.
Cuando una molécula de proteína tal como un
antígeno o un alérgeno es captada por células presentadoras de
antígeno tales como linfocitos B, células dendríticas, monocitos y
macrófagos, la molécula se degrada enzimáticamente dentro de la
célula. El proceso de degradación da lugar a fragmentos peptídicos
de la molécula que, si son del tamaño, carga y forma apropiados,
pueden entonces unirse dentro del surco de unión al péptido de
ciertas moléculas del MHC y exponerse posteriormente sobre la
superficie de las células presentadoras de antígeno. Si los
complejos péptido/MHC están presentes sobre la superficie de las
células presentadoras de antígeno en cantidad suficiente, pueden
entonces activar a los linfocitos T que llevan los receptores
apropiados de linfocitos T específicos del péptido/MHC.
Debido a la naturaleza polimórfica del MHC,
individuos en una población exogámica, tal como ser humano,
expresarán diferentes combinaciones de moléculas del MHC en sus
superficies celulares. Puesto que moléculas del MHC diferentes
pueden unirse a péptidos diferentes de la misma molécula basándose
en el tamaño, carga y forma del péptido, individuos diferentes
presentarán un repertorio diferente de péptidos unidos a sus
moléculas del MHC. La identificación de epítopos peptídicos de
unión al MHC en una población exogámica, tal como ser humano, es más
difícil que en animales endogámicos (tales como determinadas cepas
de ratones de laboratorio). Basándose en la expresión diferencial
del MHC entre los individuos y en las diferencias intrínsecas en la
unión y en la presentación a péptidos que esto conlleva, es poco
probable que pueda identificarse un solo péptido que será de
utilidad para la terapia de insensibilización en seres humanos.
Sin embargo, las combinaciones peptídicas de la
invención, proporcionan una amplia cobertura de eficacia sobre la
población humana dirigiendo moléculas del MHC diferentes múltiples.
Por lo tanto, una vacuna formulada con los péptidos de la invención
tendría amplia utilidad.
El trabajo de los inventores ha producido
combinaciones peptídicas con las siguientes características:
- la combinación induce una respuesta a citocina en una elevada proporción de sujetos de un panel de individuos alérgicos al ácaro del polvo doméstico
- los péptidos de las combinaciones son solubles.
\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una composición para usar en la prevención o el
tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico por
tolerización que comprende:
(i) un polipéptido de HDM203B
DLRQMRTVTPIRMQGGSGS, o
(ii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste
en:
- la secuencia de (i); o
- una secuencia que tiene al menos un 70% de homología con la secuencia de (i) cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo para la secuencia de (i), o
(iii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una
secuencia que representa cualquiera de:
- un fragmento de la secuencia de (i); o
- un homólogo de un fragmento de la secuencia de (i),
cuya secuencia puede hacer tolerante a un
individuo para la secuencia de (i) y tiene una longitud de al menos
9 aminoácidos, y en el que dicho homólogo tiene al menos un 70% de
homología con cualquiera de los 9 aminoácidos contiguos en la
secuencia de (i).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona adicionalmente
un polipéptido de HDM203B DLRQMRTVTPIRMQGGSGS, o una variante del
mismo como se ha definido en (ii) o (iii) anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En este documento, también se describe una
composición para usar en la prevención o tratamiento de la alergia
a los ácaros del polvo doméstico por tolerización, que comprende al
menos un polipéptido seleccionado de HDM203B (SEC ID 83), HDM201
(SEC ID 80), HDM205 (SEC ID 85), HDM203A (SEC ID 82), HDM202 (SEC ID
81), SEC ID Nº: 1 a 79, 84, u 86 a 104 (que es cualquiera de las
SEC ID Nº: 1 a 104) o una variante de las mismas. Típicamente, la
composición comprende al menos cuatro polipéptidos, en la que los
polipéptidos se seleccionan independientemente de cualquiera de los
siguientes:
(i) un polipéptido de las SEC ID Nº:1 a 104;
o
(ii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste
en:
- cualquiera de las secuencias de (i); o
- una secuencia que tiene al menos un 65% de homología con cualquiera de las secuencias de (i) cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo para cualquiera de las secuencias de (i); o
(iii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una
secuencia que representa cualquiera de:
- un fragmento de la secuencia de (i); o
- un homólogo de un fragmento de la secuencia de (i),
cuya secuencia puede hacer tolerante a un
individuo para cualquiera las secuencias de (i) y tiene una longitud
de al menos 9 aminoácidos, y en el que dicho homólogo tiene al
menos un 65% de homología con cualquiera de los 9 aminoácidos
contiguos en cualquiera de las secuencias de (i).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 - Comparación de secuencias de Der p 1
frente a Der f 1 (Fig 1A), Der p 2 frente a Der f2 (Fig 1B) y Der p
7 frente a Der f 7 (Fig 1C). Las regiones que contienen epítopos se
destacan en gris. Las localizaciones de péptidos específicos se
indican por líneas por encima o por debajo de la secuencia. La
secuencia de Der p 1 es la secuencia disponible públicamente con el
Nº de acceso P08176, en el NCBI. Las secuencias correspondientes
para Der p 2 y Der p 7 (Tabla 6) son los N^{os} de acceso P49278 y
P49273 respectivamente, en el NCBI. La secuencia para Der f 1 se
toma del Nº de acceso P16311, en el NCBI, Der F2 es del Nº de acceso
Q00855, en el NCBI, y Der f 7 es del Nº de acceso Q26456, en el
NCBI.
La Figura 2 muestra el porcentaje de individuos
sensibles a diferentes péptidos de la invención medido por la
producción de IL13 o IFN-gamma.
Las Figuras 3 y 4 muestran el porcentaje de
individuos sensibles a diferentes combinaciones peptídicas de la
invención medido por la producción de IL13 o
IFN-gamma.
Las SEC ID Nº: 1 a 104 proporcionan las
secuencias polipeptídicas como se expone en las Tablas 3 a 8. Las
SEC ID Nº: 105 en adelante proporcionan secuencias adicionales.
La invención se refiere a péptidos y a
combinaciones de péptidos que pueden usarse en la tolerización. Los
péptidos descritos en este documento pueden comprender, consistir
en, o consistir esencialmente en las secuencias mostradas en
cualquiera de HDM203B (SEC ID 83), HDM201 (SEC ID 80), HDM205 (SEC
ID 85), HDM203A (SEC ID 82), HDM202 (SEC ID 81), las SEC ID Nos 1 a
79, 84, u 86 a 104 (que es cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104).
También pueden utilizarse las variantes de estos péptidos
específicos. Las variantes pueden comprender, consistir en, o
consistir esencialmente en secuencias que son fragmentos de
cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104 u homólogas de cualquiera de
las SEC ID Nº: 1 a 104.
En una realización, la invención se refiere a
una composición para el uso en la prevención o tratamiento de la
alergia a los ácaros del polvo doméstico. Típicamente, la
composición comprende o consiste en, al menos, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, diez, once, o doce polipéptidos, hasta un máximo
de trece. Es decir, la composición comprende entre cuatro y trece
polipéptidos. Los polipéptidos descritos en este documento se
seleccionan independientemente de cualquiera de los siguientes:
(i) un polipéptido de las SEC ID Nº: 1 a 104;
o
(ii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste
en:
- cualquiera de las secuencias de (i); o
- una secuencia que tiene al menos un 65% de homología con cualquiera de las secuencias de (i) cuya secuencia puede hacer tolerante para un individuo de cualquiera de las secuencias de (i), o
(iii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una
secuencia que representa cualquiera de:
- un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i); o
- un homólogo de un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i), cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo para cualquiera de las secuencias de (i) y tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos, y en el que dicho homologo tiene al menos una homología del 65% con cualquiera de los 9 aminoácidos contiguos en cualquiera de las secuencias de (i).
La invención también proporciona productos y
formulaciones que comprenden los polipéptidos de la invención y las
composiciones, productos y vectores que comprenden polinucleótidos
que pueden expresar los polipéptidos de la invención para el uso en
la prevención o tratamiento de la alergia del ácaro del polvo
doméstico por tolerización. Dicha tolerización estará típicamente
presente en un epítopo (por ejemplo un epítopo del MHC de clase II)
presente en cualquiera de las SEC ID Nº 1 a 104.
Los alérgenos principales del ácaro del polvo
doméstico incluyen el alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 1 (Der
p 1, Der f 1), el alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 2 (Der p 2,
Der f 2) y alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 3 (Der p 7, Der f
7), en el que Der p "X" y Der f "X" indica que la proteína
"X" es un homólogo que deriva de D.
pteronyssinus y D. farinae respectivamente.
Como se indica en la figura 1, cada una de las proteínas de Der p
es altamente homóloga a su proteína de Der f. correspondiente.
Las regiones que comprenden epítopos de
linfocitos T que se unen al MHC de clase II están particularmente
muy conservadas entre los homólogos de Der p y Der f de una proteína
determinada. Por lo tanto, los péptidos derivados de las regiones
relevantes de, por ejemplo, la proteína 1 de D. pteronyssinus
o D. farinae son convenientes para el uso en la prevención o
tratamiento de la alergia del ácaro del polvo doméstico por
tolerización para el alérgeno del ácaro del polvo del Grupo 1. De
manera similar, los péptidos derivados de las regiones relevantes
de la proteína 2 de cualquier especie son adecuados para el uso en
la prevención o tratamiento de alergia del ácaro del polvo
doméstico por el tolerización para el alérgeno del ácaro del polvo
del Grupo 2, y los péptidos derivados de las regiones relevantes de
la proteína 7 de cualquier especie son adecuados para el uso en la
prevención o tratamiento de la alergia del ácaro del polvo doméstico
por el tolerización para el alérgeno del ácaro del polvo del grupo
7.
El alérgeno del Grupo 1 es una cisteína proteasa
homóloga a la papaína. Se ha observado que esta enzima escinde la
ocludina, un componente de proteína de las uniones estrechas
intercelulares. Esto revela una posible razón para la alergenicidad
de determinadas enzimas. Destruyendo la integridad de las uniones
estrechas entre las células epiteliales, Der p 1 y Der f 1 pueden
tener acceso anormal a las células presentadoras de antígeno
subepiteliales, a los mastocitos residentes y a los eosinófilos.
La función del alérgeno del Grupo 2 se
desconoce, aunque Der p 2 y Der f 2 muestran homología distante a
una familia de proteínas de unión a lípidos. Se ha observado que,
los niveles de IgE en suero, en respuesta al estímulo con Der p 2
in vivo, representan aproximadamente una tercera parte de la
respuesta total de IgE en suero frente al estímulo con extractos de
todo el ácaro.
La función del alérgeno del Grupo 7 también se
desconoce. Se ha observado que, los niveles de IgE en suero en
respuesta al estímulo con Der p 7 in vivo representan
aproximadamente una quinta parte de la respuesta total de IgE en
suero frente al estímulo con extractos de todo el ácaro.
Los péptidos descritos en este documento derivan
de los alérgenos del ácaro del polvo del Grupo 1, Grupo 2 y Grupo 3
como se muestra en las tablas 3 a 8. En este documento, los términos
"péptido" y "polipéptido" se utilizan indistintamente. En
este documento, las proteínas anteriores también se denominan "los
alérgenos".
Las tablas 3 a 8 indican las secuencias de los
péptidos, indicando la proteína parental de la cual deriva cada
péptido. En las tablas 4 a 6, las secuencias se disponen en pares.
En cada par la secuencia superior se ha seleccionado como un
epítopo de linfocito T mediante el uso de ensayos de unión
péptido-MHC. La secuencia inferior se ha
seleccionado por una búsqueda de homología dentro de la secuencia de
la proteína alternativa en el Grupo del alérgeno del ácaro del
polvo proporcionado. Por ejemplo, en la Tabla 4, el péptido HDM01
deriva de Der p 1, la secuencia homóloga debajo de él deriva de Der
f 1.
La composición comprende típicamente una
combinación de al menos cuatro polipéptidos diferentes descritos en
este documento, hasta un máximo de trece polipéptidos diferentes.
Por consiguiente, la composición de la invención puede consistir en
cuatro, cinco, seis, siete ocho, nueve, diez, once, doce o trece
péptidos.
La composición de la invención puede comprender
típicamente al menos un polipéptido o una variante del mismo (por
ejemplo una variante funcional) seleccionado de un péptido que
deriva de cada uno de Der p 1, Der p 2 y Der p 7 (o los
equivalentes de Der f). Las combinaciones del polipéptido en la
composición de la invención se seleccionan para proporcionar una
cobertura de la población humana tan amplia como sea posible, es
decir, la composición de la invención producirá una respuesta
inmune en una parte elevada de individuos alérgicos al ácaro del
polvo, preferiblemente más del 30%, 40%, 45%, 50%, 60% o 70% de
individuos alérgicos al ácaro del polvo en un panel o población de
dichos individuos. El número de individuos en una población de
individuos alérgicos al ácaro del polvo puede ser cualquier número
adecuado, típicamente al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o al
menos 100 individuos. Preferiblemente, la población tiene
frecuencias alélicas del MHC dentro del intervalo de frecuencias
que son representativas de la población Caucásica. En la Tabla 1 se
muestran las frecuencias alélicas de la población de referencia
para 11 familias del alelo común DRB1 (datos procedentes de HLA
Facts Book, Parham y Barber).
Las composiciones descritas en este documento
comprenden típicamente al menos un polipéptido seleccionado de un
polipéptido de HDM203B (SEC ID 83), HDM202 (SEC ID 81), HDM201 (SEC
ID 80), HDM205 (SEC ID 85), HDM203A (SEC ID 82), o una variante de
los mismos. Preferiblemente, la composición comprende al menos dos,
tres o cuatro polipéptidos seleccionados independientemente de un
polipéptido de HDM203B (SEC ID 83), HDM202 (SEC ID 81), HDM201 (SEC
ID 80), HDM205 (SEC ID 85), HDM203A (SEC ID 82), o una variante de
los mismos, a condición de que no se seleccione más de un
polipéptido o una variante de las SEC ID Nº: 82 y 83.
Las variantes particulares de HDM202 (SEC ID 81)
son HDM202D (SEC ID 102; FKNRFLMSAEA), HDM202E (SEC ID 103;
FKNRFLMSAE) y HDM202H (SEC ID 104; EFKNRFLMSAE), que son
truncamientos de la secuencia HDM202. Se considera que cada una de
estas secuencias puede modificarse para añadir al menos uno (y hasta
6) restos en extremo N y/o C seleccionado de R, K, H, E y D.
Opcionalmente, la composición puede comprender,
además, al menos un polipéptido adicional seleccionado de un
polipéptido de cualquiera de las SEC Nº: 5, 51, 52, 100, 101, 72,
73, 74, o una variante de las mismas. Preferiblemente, el al menos
un polipéptido adicional es un polipéptido de cualquiera de las SEC
ID Nº: 51, 73, 100 y 101.
Opcionalmente, la composición puede comprender,
además, al menos un polipéptido adicional seleccionado de un
polipéptido de cualquiera de las SEC Nº: 1, 9, 21, 24, 48, 54, 56,
57, 62, 63, 65, 76, 84 y 86, o una variante de las mismas.
Preferiblemente, el al menos un polipéptido adicional es un
polipéptido de cualquiera de las SEC ID Nº: 63 y 65, o una variante
de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En este documento también se describe una
composición que comprende de cuatro a trece polipéptidos, que
consisten en:
a) al menos uno de los polipéptidos de las SEC
ID Nº: 83 y 82, o variantes de las mismas, preferiblemente la SEC
ID Nº: 83;
b) al menos dos de los polipéptidos de las SEC
ID Nº: 80, 81 y 85, o variantes de las mismas; y opcionalmente
c) al menos uno de los polipéptidos de
cualquiera de las SEC ID Nº: 5, 51, 52, 100, 101, 72, 73, y 74, o
una variante de las mismas, preferiblemente la SEC ID Nº: 51, 73,
100 y 104 o una variante de las mismas; y/o
d) al menos uno de los polipéptidos de
cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 9, 21, 24, 48, 54, 56, 57, 62, 63,
65, 76, 84 y 86, o una variante de las mismas, preferiblemente las
SEC ID Nº: 63 y 65, o una variante de las mismas. Adicionalmente,
en este documento se describe una composición para el uso en la
prevención o el tratamiento de la alergia del ácaro del polvo por
tolerización que comprende entre cuatro y trece secuencias
peptídicas, en el que la composición consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
a) al menos uno de los polipéptidos con las
siguientes secuencias:
o una variante de las mismas,
y;
\vskip1.000000\baselineskip
b) al menos dos de los polipéptidos con las
siguientes secuencias:
o variantes de las mismas, y
opcionalmente;
\vskip1.000000\baselineskip
c) al menos uno de los polipéptidos con las
siguientes secuencias:
o una variante de las mismas,
y/o;
d) al menos uno de los polipéptidos con las
siguientes secuencias:
o una variante de las mismas. *E =
ácido
aminobutírico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se apreciará que los anteriores (a) a (d)
representan criterios rigurosos y muy selectivos para la
identificación de combinaciones peptídicas adecuadas. Por ejemplo,
si se tuvieran que seleccionar ocho péptidos al azar de las
secuencias de la invención habría casi 100 mil millones de
combinaciones posibles para elegir. Por el contrario, es útil
considerar un ejemplo de una combinación de ocho polipéptidos en los
cuales se apliquen los criterios anteriores. Por ejemplo,
considerar una combinación en la que se seleccionen los siguientes
polipéptidos:
i) cualquiera de los dos polipéptidos de las SEC
ID Nº: 80, 81 y 85 y al menos uno de los polipéptidos de las SEC ID
Nº: 82 y 83; y
ii) dos polipéptidos más, seleccionados de los
polipéptidos de cualquiera de las SEC ID Nº: 5, 51, 52, 72, 73, 74,
100 y 101; y finalmente
iii) dos polipéptidos más, seleccionados de los
polipéptidos de cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 9, 21, 24, 48, 54,
56, 57, 62, 63, 65, 76, 84 y 86.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en dicha selección, el número de
combinaciones posibles representa menos del 0,0006% de las
combinaciones disponibles totales si no se aplican los criterios
determinados por los inventores.
De acuerdo con lo anterior, una combinación
particularmente preferida de la invención comprende o consiste en
los polipéptidos de HDM201 (SEC ID 80), HDM203B (SEC ID 83), HDM205
(SEC ID 85), HDM03W (SEC ID 101), HDM101A (SEC ID 73), HDM26B (SEC
ID 63), HDM35A (SEC ID 65), y opcionalmente SEC ID Nº: 24, o
variantes de las mismas.
Otra combinación preferida de la invención
comprende o consiste en los polipéptidos de HDM201 (SEC ID 80),
HDM203B (SEC ID 83), HDM205 (SEC ID 85) y HDM03W (SEC ID 101).
\vskip1.000000\baselineskip
Dependiendo de lo anterior, la composición puede
comprender, opcionalmente, polipéptidos adicionales, hasta un total
de trece polipéptidos únicos. Estos polipéptidos adicionales se
refieren a (es decir, son típicamente homólogos y/o fragmentos de)
las otras secuencias, es decir, las SEC ID Nº: 1 a 104, que no están
entre los polipéptidos ya seleccionados. Los péptidos adicionales
son variantes típicamente funcionales de uno de los péptidos de las
SEC ID Nº: 1 a 104. Los polipéptidos adicionales pueden ser
idénticos a cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104. Por lo tanto, la
composición puede comprender hasta trece polipéptidos diferentes
como se proporciona por cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104. Sin
embargo, no es necesario que los polipéptidos opcionales
adicionales tengan una identidad del 100% con respecto a cualquiera
de las SEC ID Nº: 1 a 104. Preferiblemente, tienen al menos una
identidad del 65% con al menos 9 (por ejemplo, al menos 10, 11, 12 ó
13) o más aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a
104, no seleccionados en sí entre el polipéptido (o polipéptidos)
previamente seleccionado. Estos aminoácidos contiguos pueden
comprender un epítopo del MHC de clase II, que se una, por ejemplo,
a cualquiera de las moléculas del MHC mencionadas en este documento.
En otras palabras, la composición puede comprender, opcionalmente,
polipéptidos adicionales, hasta un total de trece polipéptidos
únicos, en la que los polipéptidos adicionales:
- (i)
- comprenden una secuencia con al menos una identidad de secuencia del 65% con al menos 9 o mas aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104 anteriores, no seleccionadas en (a) a (d) anteriores; y
- (ii)
- tienen una longitud de 9 a 30 aminoácidos.
en la que cada polipéptido diferente es para el
uso simultáneo, por separado o secuencial en la prevención o
tratamiento de la alergia del ácaro del polvo por tolerización.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, en este documento se describe un
producto que contiene entre cuatro y trece polipéptidos, como se
define en (a) a (d) anteriores; y opcionalmente:
(e) el polipéptido A:
- (i)
- que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104 no seleccionadas en a), a d) anteriores; y
- (ii)
- una longitud de 9 a 30 aminoácidos; y opcionalmente
(f) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en d); y opcionalmente
(g) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a f) anteriores; y
opcionalmente
(h) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a g) anteriores; y
opcionalmente
(i) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a h) anteriores; y
opcionalmente
(j) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a i) anteriores; y
opcionalmente
(k) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a j) anteriores; y
opcionalmente
(l) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a k) anteriores; y
opcionalmente
(m) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a l) anteriores; y
opcionalmente
(n) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a m) anteriores; y
opcionalmente
(o) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a n) anteriores; y
opcionalmente
(p) el polipéptido A, como se define en e), pero
adicionalmente no seleccionado en e) a o) anteriores para el uso
simultáneo, por separado o secuencial en la prevención o tratamiento
de la alergia del ácaro del polvo por tolerización.
\vskip1.000000\baselineskip
En este documento también se describe una
composición para el uso en la prevención o tratamiento de la alergia
a los ácaros del polvo doméstico por tolerización que comprende uno
o más polipéptidos, en la que el polipéptido se selecciona de
cualquiera de los siguientes:
(i) un polipéptido de cualquiera de HDM203B (SEC
ID 83), HDM202 (SEC ID 81), HDM201 (SEC ID 80), HDM205 (SEC ID 85),
HDM203A (SEC ID 82), las SEC ID Nº: 1 a 79, 84, u 86 a 104 (que es
una cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104); ó
(ii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste
en:
- -
- cualquiera de las secuencias de (i); o
- -
- una secuencia que tenga una homología de al menos el 65% con cualquiera de las secuencias de (i) cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo para cualquiera de las secuencias de (i), o
(iii) una variante de un polipéptido de acuerdo
con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30
aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una
secuencia que representa cualquiera de:
- -
- un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i); o
- -
- un homólogo de un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i),
cuya secuencia puede hacer tolerante a un
individuo para cualquiera de las secuencias de (i) y tiene al menos
9 aminoácidos de longitud, y en la que dicho homólogo tiene una
homología de al menos el 65% con cualquiera de los 9 aminoácidos
contiguos en cualquiera de las secuencias de (i).
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones o productos de la invención
pueden comprender variantes de cualquiera de las secuencias
definidas anteriormente. La variante típicamente comprende 1, 2, 3 o
más de los epítopos del MHC de clase II presentes en el péptido
correspondiente de las SEC ID Nº: 1 a 104.
En este documento se han mencionado las
variantes funcionales. Dichas variantes pueden hacer tolerante a un
individuo para un epítopo del MHC de clase II presente en el péptido
correspondiente de las SEC ID Nº: 1 a 104, y por lo tanto,
comprenderá típicamente una secuencia que se una a la misma molécula
del MHC de clase II y/o reconozca un linfocito T el cual reconoce
al epítopo correspondiente en el polipéptido de las SEC ID Nº: 1 a
104.
Las variantes de las SEC ID Nº: 1 a 104 pueden
ser fragmentos derivados por truncamiento. El truncamiento se
refiere a la eliminación de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos de los extremos N y/o
C-terminales de un polipéptido de las SEC ID Nº: 1 a
104. En el Ejemplo 5, se proporcionan ejemplos de truncamientos
adecuados para fines ilustrativos. En particular, se proporcionan
truncamientos de la SEC ID Nº: 81 como las SEC ID Nº: 102 a 104. De
manera similar, son truncamientos una serie de las variantes
preferidas de HDM03 (las SEC ID Nº: 89 a 101). Los truncamientos
particularmente preferidos de HDM03 son HDM03V y HDM03W (SEC ID 100
y 101).
También pueden generarse fragmentos por una o
más deleciones internas, siempre que los 9 aminoácidos nucleares
que constituyen el epítopo del linfocito T no estén sustancialmente
modificados.
Por ejemplo, una variante de la SEC ID Nº: 1
puede comprender un fragmento de la SEC ID Nº: 1, es decir, una
secuencia más corta. Esto puede incluir una deleción de uno, dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más
aminoácidos del extremo N-terminal de la SEC ID Nº:
1 o del extremo C-terminal de la SEC ID Nº: 1.
Dichas deleciones pueden realizarse a partir de los dos extremos de
la SEC ID Nº: 1. Una variante de la SEC ID Nº: 1 puede incluir
aminoácidos adicionales (por ejemplo de la secuencia de la proteína
parental de la que deriva el péptido) extendiéndose más allá del
extremo (o extremos) de la SEC ID Nº: 1. Una variante puede incluir
una combinación de las deleciones y adiciones indicadas
anteriormente. Por ejemplo, pueden delecionarse aminoácidos de un
extremo de la SEC ID Nº: 1, pero en el otro extremo de la SEC ID Nº:
1, pueden añadirse aminoácidos adicionales de la secuencia de la
proteína parental de longitud completa. Esto mismo en relación a
las variantes se aplica a las SEC ID Nº: 2 a 104.
Un péptido variante puede incluir una o más
sustituciones de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de
cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104 o un fragmento de las mismas Un
péptido variante puede comprender una secuencia con una identidad
de secuencia de al menos el 65% con al menos 9 o más aminoácidos
contiguos en cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104. Más
preferiblemente una variante adecuada puede comprender una identidad
de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el
80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos
el 98% con al menos 9 aminoácidos contiguos de cualquiera de las SEC
ID Nº: 1 a 104. Este nivel de identidad de aminoácidos puede
observarse en cualquier sección del péptido, aunque es preferible
la región nuclear. El nivel de identidad de aminoácidos es sobre al
menos 9 aminoácidos contiguos pero puede ser al menos de 10, 11,
12, 13, 14 15 o al menos de 16 ó 17 aminoácidos, dependiendo del
tamaño de los péptidos de comparación. Por consiguiente, cualquiera
de los niveles de identidad especificados anteriormente puede estar
a lo largo de toda la longitud de secuencia.
En relación con las secuencias de aminoácidos,
"identidad de secuencia" se refiere a secuencias que tienen el
valor indicado cuando se evalúan usando ClustalW (Thompson et
al, Nucleic Acids Res. 11 Nov 1994; 22 (22):
4673-80) con los siguientes parámetros: Método -
Parámetros de alineamiento por parejas: exacto, matriz: PAM,
penalización por apertura de huecos: 10,00, penalización por
extensión de huecos: 0,10; Parámetros de alineamiento múltiple -
Matriz: PAM, penalización por apertura de huecos: 10,00, % de
identidad por retraso: 30, penalización por huecos en los extremos:
sobre, distancia de separación de huecos: 0, matriz negativa: no,
penalización de extensión de huecos: 0,20, penalización por huecos
en restos específicos: sobre, penalización de huecos hidrófilos:
sobre, restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un
resto particular tiene por objeto incluir restos idénticos que
simplemente se han derivatizado.
Un péptido variante puede comprender 1, 2, 3, 4,
5 o más, o hasta 10 sustituciones de aminoácidos de cualquiera de
las SEC ID Nº: 1 a 104. Las variantes de sustitución implican
preferiblemente la sustitución de uno o más aminoácidos con el
mismo número de aminoácidos y realizar sustituciones de aminoácidos
conservativos. Por ejemplo, un aminoácido puede sustituirse por un
aminoácido alternativo que tenga propiedades similares, por
ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro
aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido
hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro
aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas
propiedades de los 20 aminoácidos principales que pueden usarse para
seleccionar sustitutos convenientes son las siguientes:
Otras variantes incluyen aquellas en las que en
lugar del aminoácido de origen natural, el aminoácido que aparece
en la secuencia es un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos
usados en las secuencias también pueden modificarse, por ejemplo,
marcarse, a condición de que la función del péptido no resulte
adversamente afectada de manera significativa. Cuando el péptido
tiene una secuencia que varía de la secuencia de cualquiera de las
SEC ID Nº: 1 a 104 o un fragmento de las mismas, las sustituciones
pueden producirse a lo largo de toda la longitud de la secuencia,
dentro de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104 o
fuera de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104. Por
ejemplo, las variaciones descritas en este documento, tales como
adiciones, deleciones, sustituciones y modificaciones, pueden
producirse dentro de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº: 1
a 104. Un péptido variante puede comprender o consistir
esencialmente en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las
SEC ID Nº: 1 a 104 en las que pueden haberse realizado una, dos,
tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos. Un péptido variante
puede comprender un fragmento de la proteína parental que sea más
grande que cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104. En esta
realización, las variaciones descritas en este documento, tales
como sustituciones y modificaciones, pueden producirse dentro y/o
fuera de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104.
Los péptidos variantes de la invención tienen
una longitud total de 9 a 30 aminoácidos. Preferiblemente, pueden
tener una longitud de 9 a 20, o más preferiblemente, de 13 a 17
aminoácidos. Los péptidos pueden tener la misma longitud que las
secuencias peptídicas de una cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a
20.
Los péptidos pueden derivar químicamente del
alergeno polipeptídico, por ejemplo, por escisión proteolítica o
pueden derivar, en un sentido intelectual, del alérgeno
polipeptídico, por ejemplo usando la secuencia de aminoácidos del
alérgeno polipeptídico y sintetizando péptidos basados en la
secuencia. Los péptidos pueden sintetizarse usando métodos bien
conocidos en la técnica.
Cuando los polipéptidos comprenden restos que
son típicamente difíciles de conservar durante la fabricación,
estos restos pueden sustituirse. Por ejemplo, el glutamato forma
espontáneamente piroglutamato en solución particularmente cuando
está presente en el extremo N de un péptido. Por lo tanto, los
restos de los péptidos de la invención que corresponden a glutamato
en la secuencia de una secuencia de la proteína nativa del alérgeno
pueden substituirse por piroglutamato en los péptidos de la
invención cuando dichos restos están presentes en el extremo N de
un péptido.
El término "péptido" no sólo incluye a las
moléculas en las que los restos aminoacídicos están unidos por
enlaces (-CO-NH-) peptídicos sino también a las
moléculas en las que el enlace peptídico está invertido. Dichos
peptidomiméticos retroinversos pueden prepararse usando métodos
conocidos en la técnica, por ejemplo, como los descritos en Meziere
et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta
estrategia implica la preparación de pseudopéptidos que contienen
cambios que implican a la cadena principal y no a la orientación de
las cadenas laterales. Meziere et al (1997) demuestran que,
por lo menos para las respuestas del MHC de clase II y de los
linfocitos T auxiliares, estos pseudopéptidos son útiles. Los
péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO
en lugar de enlaces CO-NH peptídicos, son mucho más
resistentes a la proteolisis.
De manera similar, el enlace peptídico puede
distribuirse en el conjunto siempre que se use un resto enlazador
apropiado que conserve el espacio entre los átomos de carbono de los
restos aminoacídicos; particularmente esto se prefiere si el resto
enlazador tiene la misma distribución de carga y sustancialmente la
misma planariedad de un enlace peptídico. Se apreciará también que
el péptido pueda bloquearse de forma conveniente en su extremo N- ó
C- para ayudar a reducir la susceptibilidad a la digestión
exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino
N-terminal de los péptidos puede protegerse por
reacción con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo
C-terminal puede protegerse por reacción con una
amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen la glicosilación y
fosforilación. Otra posible modificación es que los hidrógenos de
las aminas de la cadena lateral de R o K puedan sustituirse por
grupos metileno (-NH_{2} \rightarrow -NH(Me) o
-N(Me)_{2}).
Los análogos de los péptidos de acuerdo con la
invención también pueden incluir variantes peptídicas que aumentan
o disminuyen la semivida in vivo de los péptidos. Los
ejemplos de análogos que pueden aumentar la semivida de los
péptidos, usados de acuerdo con la invención, incluyen peptoides
análogos de los péptidos, D-aminoácidos derivados
de los péptidos, e híbridos péptido-peptoides. Una
realización adicional de los polipéptidos variantes, usados de
acuerdo con la invención, comprende formas
D-aminoácidos del polipéptido. La preparación de
polipéptidos usando D-aminoácidos en lugar de
L-aminoácidos disminuye enormemente cualquier
degradación no deseada de dicho agente por procesos metabólicos
normales, disminuyendo las cantidades de agente necesarias de
administrar, junto con la frecuencia de su administración.
Los péptidos que proporciona la presente
invención pueden derivar de variantes de corte y empalme de las
proteínas parentales codificadas por el ARNm generado por corte y
empalme alternativo de los transcritos primarios que codifican las
cadenas de la proteína parental. Los péptidos también pueden derivar
de mutantes de aminoácidos, variantes de glicosilación y otros
derivados covalentes de las proteínas parentales que conservan al
menos una propiedad de unión al MHC de los alérgenos. Los derivados
ejemplares incluyen moléculas en las que los péptidos de la
invención se modifican covalentemente por sustitución, química,
enzimática u otros medios apropiados con un resto distinto al de un
aminoácido de origen natural. Adicionalmente se incluyen variantes
de origen natural de las proteínas parentales encontradas en
diferentes ácaros. Dicha variante puede estar codificada por una
variante alélica o representar una variante de corte y empalme
alternativa.
Las variantes, como se describe anteriormente,
pueden prepararse durante la síntesis del péptido o por modificación
post-producción, o cuando el péptido está en forma
recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida,
mutagénesis al azar, o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos
nucleicos.
De acuerdo con la invención, los péptidos
adicionales que la composición puede comprender son preferiblemente
variantes funcionales de cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104. Es
decir, los péptidos pueden preferiblemente inducir una respuesta
inmune. En particular, los péptidos pueden, preferiblemente, inducir
la producción de citocina en individuos alérgicos al ácaro del
polvo doméstico. Típicamente, la composición de la invención
comprenderá, por lo tanto, al menos un polipéptido o una variante de
los mismos que produce una respuesta a citocina mayor que el 30,
35, 40%, preferiblemente el 45% o el 50% de individuos, en una
población de individuos alérgicos al ácaro del polvo doméstico. En
un panel de individuos alérgicos al ácaro del polvo, el número de
individuos puede ser cualquier número mayor que uno, por ejemplo, al
menos 20, 30, 40, 50, 80, o al menos 100 individuos. La composición
comprende preferiblemente al menos dos, tres o más preferiblemente
cuatro de dichos péptidos. Preferiblemente, la respuesta a la
citocina es la producción de IL13 o de IFN-gamma. La
producción de citocina puede medirse por cualquier método adecuado.
Típicamente, se considera que la producción de una citocina se ha
producido en respuesta a un péptido si el nivel de citocina
producido en presencia del péptido es al menos 2, 3, 4 o 5 veces
sobre el nivel de fondo de dicha citocina que se produce en ausencia
de un estímulo (es decir, el nivel producido por el mismo individuo
en ausencia del péptido o de cualquier otro estímulo). De manera
alternativa, puede considerarse que la producción de una citocina ha
tenido lugar si la cantidad de citocina producida excede un límite
reconocido, típicamente 90, 95, o preferiblemente 100 pg/ml,
típicamente de una muestra de aproximadamente 1,25x10^{6} células
en 250 \mul.
Los métodos adecuados para medir la producción
de citocina, incluyen típicamente medir la liberación de citocina
de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una
muestra tomada de un sujeto. La muestra es típicamente sangre o
suero. La liberación de citocina de las PBMC se mide después de
incubar las células en presencia de un polipéptido determinado.
Después, se ensayan los sobrenadantes de la mezcla de incubación
para determinar la presencia de una citocina, usando cualquier
ensayo adecuado, por ejemplo un ensayo ELISA, ELISPOT o un ensayo
de citometría de flujo. Los métodos particularmente preferidos
incluyen ensayos Múltiples de matrices de perlas como se describe,
por ejemplo, en Jager et al; Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology, 2003, Vol 10 (1) págs.
133-139. Típicamente, la composición puede
comprender al menos un péptido adicional o una variante del mismo
que no está entre los polipéptidos ya seleccionados, hasta un total
de trece péptidos diferentes, lo que produce una respuesta a
citocina mayor del 20%, 25%, preferiblemente del 30%, 35% o 40% de
los individuos en una población de individuos alérgicos al ácaro del
polvo doméstico.
Adicionalmente la composición puede comprender
uno o más péptidos adicionales o variantes de los mismos que no
están entre los polipéptidos ya seleccionados, hasta un total de
trece péptidos diferentes, lo que produce una respuesta a citocina
mayor del 10%, 15%, preferiblemente del 20% de los individuos en una
población de individuos alérgicos al ácaro del polvo doméstico.
Las variantes adecuadas que pueden unirse a los
TCR pueden derivar empíricamente o seleccionarse de acuerdo con
criterios conocidos. Dentro de un sólo péptido hay determinados
restos que contribuyen a la unión dentro del surco de unión del
antígeno al MHC y otros restos que interaccionan con regiones
hipervariables del receptor de linfocitos T (Allen et al
(1987) Nature 327: 713-5).
Dentro de los restos que contribuyen a la
interacción del receptor de linfocitos T, se ha demostrado una
jerarquía que pertenece a la dependencia de la activación de
linfocitos T después de la sustitución de un resto peptídico
determinado. Usando péptidos que han tenido uno o más restos en
contacto con el receptor de linfocitos T sustituidos por un
aminoácido diferente, diversos grupos han demostrado efectos
profundos después del proceso de la activación de linfocitos T.
Evavold y Allen (1991) Nature 252: 1308-10)
demostraron la disociación de la proliferación de linfocitos T y la
producción de citocina. En este modelo in vitro, se
expuso un clon de linfocito T específico para los restos
64-76 de hemoglobina (en el contexto de
l-E^{k}), con un análogo peptídico en el cual se
había efectuado una sustitución conservativa del ácido aspártico por
ácido glutámico. Esta substitución no interfirió significativamente
con la capacidad del análogo para unirse a
l-E^{k}.
Después de la exposición in vitro de un
clon de linfocito T con este análogo, no se detectó proliferación
aunque se mantuvo la secreción de IL-4, así como la
capacidad del clon para ayudar a las respuestas de los linfocitos
B. En un estudio posterior el mismo grupo demostró la separación de
la citólisis mediada por linfocitos T de la producción de citocina.
En este caso, la primera permaneció no modificada mientras que la
última se deterioró. La eficacia de ligandos peptídicos modificados
in vivo se demostró inicialmente en un modelo murino de EAE
(encefalomielitis alérgica experimental) por McDevitt y col. (Smilek
et al (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:
9633-9637. En este modelo la EAE se induce por
inmunización con el péptido encefalitogénico Acl-11
de la MBP (proteína básica de mielina). La substitución en la
posición cuatro (lisina) por un resto de alanina generó un péptido
que se unía bien a su elemento de restricción
(A\alpha^{u}A\beta^{u}), pero que era
no-inmunogenético en la cepa susceptible PL/JxSJLFI
y que, además impidió la aparición de EAE cuando se administró
antes o después de la inmunización con el péptido encefalitogénico.
Por lo tanto, pueden identificarse restos en péptidos que inciden
en la capacidad de los péptidos para inducir diversas funciones de
los linfocitos T.
Ventajosamente, pueden diseñarse péptidos para
favorecer la proliferación de linfocitos T y la inducción de
insensibilización. Metzler y Wraith han demostrado capacidad
tolerogénica mejorada de péptidos en los cuales se han realizado
sustituciones que aumentaban la afinidad del MHC por el péptido
(Metzler & Wraith (1993) Int Immunol \sim:
1159-65). Sloan-Lancaster et
al (1993) Nature 363: 156-9, demostraron que un
ligando peptídico modificado puede causar anergia profunda y a largo
plazo en linfocitos T clonados.
Las composiciones de la invención pueden inducir
una respuesta de fase tardía en un individuo que está sensibilizado
a los alergénos. La expresión "respuesta de fase tardía"
incluye el significado como se expone en Allergy and Allergic
Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, págs.
1113-1130. La respuesta de fase tardía puede ser
cualquier respuesta de fase tardía (LPR). Preferiblemente, los
péptidos pueden inducir una respuesta asmática tardía (LAR) o una
respuesta rinítica tardía o una respuesta dérmica de fase tardía o
una respuesta ocular de fase tardía. Si un péptido en particular
puede dar lugar o no a una LPR puede determinarse usando métodos
bien conocidos en la técnica; un método particularmente preferido es
el descrito en Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay AB.
Provocation test and measurements of mediators from mast cells and
basophils in asthma and allergic rhinitis. En: Handbook of
Experimental Immunology (4) Capítulo 127, Editor: Weir DM,
Blackwell Scientific Publications, 1986.
Por lo tanto, preferiblemente, los péptidos
individuales de la invención pueden inducir una LPR en un individuo
que se he sensibilizado a los alérgenos. Si un individuo se ha
sensibilizado o no a los alérgenos puede determinarse por
procedimientos bien conocidos tales como ensayo de punción en la
piel con soluciones de extractos alérgenos, inducción de las LPR
cutáneas, historia clínica, exposición al alérgeno y ensayo de
radioalergoabsorbencia (RAST) para medir la IgE específica del
alérgeno. El médico puede determinar si se espera o no que un
individuo particular se beneficie del tratamiento, basándose, por
ejemplo, en dichos ensayos.
Insensibilizar o hacer tolerante a un individuo
a los alérgenos significa la inhibición o la supresión de las
reacciones alérgicas en los tejidos inducidas por los alérgenos en
individuos apropiadamente sensibilizados. Se ha demostrado que los
linfocitos T pueden activarse selectivamente y después volverse
insensibles. Por otra parte la anergización o eliminación de estos
linfocitos T conduce a la insensibilización del paciente para un
alérgeno particular. La insensibilización se manifiesta, en sí
misma, como una reducción en respuesta a un alérgeno o a un péptido
derivado de un alérgeno, o preferiblemente una eliminación de dicha
respuesta, en segundas y posteriores administraciones del alérgeno
o del péptido derivado del alérgeno. La segunda administración puede
realizarse después de que haya transcurrido un período de tiempo
adecuado para permitir que ocurra la insensibilización; éste es
preferiblemente cualquier período entre un día y varias semanas. Se
prefiere un intervalo de aproximadamente dos semanas.
Aunque las composiciones de la invención pueden
inducir una LPR en un individuo alérgico al ácaro del polvo, debe
apreciarse que cuando se usa una composición, para tratar a un
paciente, es preferible usar una concentración de la composición
suficientemente baja de manera que no ocurrirá ninguna LPR
observable pero la respuesta será suficiente para insensibilizar
parcialmente a los linfocitos T de manera que pueda administrase la
siguiente dosis (preferiblemente más alta) y así sucesivamente. De
esta manera la dosis se intensifica para proporcionar la
insensibilización completa pero a menudo sin inducir nunca una LPR
en el paciente. Con independencia, la composición o el péptido
pueden hacer esto a una concentración más alta a la
administrada.
Preferiblemente, las composiciones de la
invención pueden inducir una respuesta de fase tardía en el 50% o
más de un panel de individuos de la población de alérgicos al ácaro
del polvo. Más preferiblemente, las composiciones pueden inducir
una LPR en el 55% o más, el 60% o más, el 65% o más, el 70% o más,
el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, o el 90% o más de los
individuos sensibilizados en un panel. Si las composiciones pueden
inducir o no una LPR en un determinado porcentaje de un panel de
sujetos puede determinarse por métodos bien conocidos en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se entenderá que los péptidos de la invención
comprenden un epítopo de linfocito T que consiste en un núcleo de 9
aminoácidos que son la secuencia esencial mínima requerida para la
unión al MHC de clase II. Sin embargo, los péptidos también pueden
comprender restos adicionales flanqueando los 9 aminoácidos
nucleares. Los péptidos pueden, por lo tanto, comprender una región
que contiene un epítopo de linfocito T, en el cual algunos restos
pueden modificarse sin afectar la función del epítopo. Por
consiguiente, los variantes funcionales de los péptidos, como se ha
definido anteriormente, incluyen péptidos que se modifican para
mejorar su solubilidad en relación con la secuencia nativa de los
péptidos. La solubilidad mejorada es ventajosa para hacer tolerantes
a sujetos para alérgenos de los cuales derivan los péptidos de la
invención, puesto que la administración de agentes poco solubles a
los sujetos causa respuestas inflamatorias
no-tolerantes, indeseables. La solubilidad de los
péptidos puede mejorarse modificando los restos que flanquean la
región que contiene un epítopo de linfocito T. Un péptido de la
invención puede modificarse por ingeniería genética para ser más
soluble de tal manera que comprenda:
- i)
- N terminal para los restos del péptido que flanquean a un epítopo del linfocito T: de uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los de dos a seis aminoácidos contiguos inmediatamente en la posición N terminal a dichos restos en la secuencia de la proteína de la que deriva el péptido; y/o
- ii)
- C terminal para los restos del péptido que flanquean a un epítopo del linfocito T: de uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los de uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente C terminal a dichos restos en la secuencia de la proteína de la que deriva el péptido; o
- iii)
- dos N y C terminal para los restos del péptido que flanquean a un epítopo del linfocito T, al menos un aminoácido seleccionado de arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera opcional, los péptidos pueden
modificarse adicionalmente por ingeniería genética para ser más
solubles, de manera que:
- i)
- cualquiera de los restos de cisteína en la secuencia nativa del péptido se sustituye por serina o ácido 2-aminobutírico; y/o
- ii)
- cualquiera de los restos en el extremo N o C de la secuencia nativa del péptido, no comprendido en un epítopo del linfocito T, se delecione; y/o
- iii)
- cualquiera de los dos aminoácidos consecutivos que comprenden la secuencia Asp-Gly en los hasta cuatro aminoácidos en el extremo N o C de la secuencia nativa del péptido, no comprendidos en un epítopo del linfocito T, se delecione.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos individuales que componen las
composiciones y los productos de la invención pueden administrare
directamente, o pueden administrarse indirectamente por expresión de
una secuencia codificante. Por ejemplo, puede proporcionarse un
polinucleótido que codifique un péptido de la invención, tal como
cualquiera de los péptidos descritos anteriormente. Por lo tanto,
un péptido de la invención puede producirse a partir de o
suministrarse en forma de un polinucleótido que codifica, y que
puede expresarlo. Cualquier referencia en este documento respecto
al uso, suministro o administración de un péptido de la invención
tiene por objeto incluir el uso, suministro o administración
indirecta de dicho péptido mediante expresión de un polinucleótido
que lo codifica.
En este documento, las expresiones "molécula
de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan
indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos
de cualquier longitud, tanto desoxirribonucleótidos como
ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no
limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico,
ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes,
plásmidos, vectores, ADN de cualquier secuencia aislado, ARN de
cualquier secuencia aislada, sondas de ácidos nucleicos y cebadores.
Un polinucleótido de la invención puede proporcionarse en forma
aislada o purificada. Una secuencia de ácido nucleico que
"codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido
nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el
caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se
coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiada. Los
límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de
inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la
traducción en el extremo 3' (carboxilo). Para los fines de la
invención, dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero
sin limitación, ADNc de virus, ARNm procariota o eucariota,
secuencias genómicas de ADN o ARN viral o procariota e incluso
secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la
transcripción puede localizarse en la posición 3' de la secuencia
codificante.
Los polinucleótidos de la invención pueden
sintetizase de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica,
como se describe, a modo de ejemplo, en Sambrook et al
(19104, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor
Press).
Las moléculas polinucleotídicas pueden
proporcionarse en forma de un casete de expresión que incluye
secuencias de control unidas operativamente a la secuencia
insertada, permitiendo así la expresión del péptido de la invención
in vivo en un sujeto diana. Estos casetes de expresión, a su
vez, se proporcionan típicamente en vectores (por ejemplo,
plásmidos o vectores virales recombinantes) que son adecuados para
usar como reactivos para la inmunización de los ácidos nucleicos.
Dicho casete de expresión puede administrarse directamente a un
sujeto hospedador. De manera alternativa, un vector que comprende un
polinucleótido de la invención puede administrarse a un sujeto
hospedador. Preferiblemente el polinucleótido se prepara y/o se
administra usando un vector genético. Un vector adecuado puede ser
cualquier vector que pueda llevar una cantidad suficiente de
información genética y permita la expresión de un péptido de la
invención.
En este documento se describen adicionalmente
vectores de expresión que comprenden dichas secuencias
polinucleotídicas. Por lo tanto, se describe un vector para usar en
la prevención o tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo
por tolerización que comprende cuatro o más secuencias
polinucleotídicas que codifican diferentes polipéptidos de la
invención y opcionalmente una o más secuencias polinucleotídicas
adicionales que codifican diferentes polipéptidos como se define en
este documento. El vector puede comprender 4, 5, 6 ó 7 secuencias
polinucleotídicas que codifican diferentes polipéptidos de la
invención.
Adicionalmente, deberá apreciarse que las
composiciones y productos de la invención pueden comprender una
mezcla de polipéptidos y polinucleótidos. Por consiguiente, se
describe una composición o producto como se define en este
documento, en el que en lugar de uno cualquiera del polipéptido es
un polinucleótido que puede expresar dicho polipéptido.
Los vectores de expresión se construyen
rutinariamente en la técnica de la biología molecular y pueden, por
ejemplo, implicar el uso de ADN plasmídico e iniciadores,
promotores, amplificadores y otros elementos apropiados, tales
como, por ejemplo, señales de poliadenilación que pueden ser
necesarias, y que se sitúan en la orientación correcta, para
permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores
adecuados serían evidentes para los expertos en la materia. Como
ejemplo adicional en este sentido se hace referencia a Sambrook
et al.
Por lo tanto, un polipéptido de la invención
puede proporcionarse suministrando dicho vector a una célula y
permitiendo que ocurra la transcripción del vector. Preferiblemente,
un polinucleótido descrito en este documento o para su uso, como se
describe en este documento, en un vector está unido operativamente a
una secuencia de control que puede proporcionar la expresión de la
secuencia codificante por la célula hospedadora, es decir, el
vector es un vector de expresión.
"Unido operativamente" se refiere a un
reordenamiento de elementos en los que los componentes así descritos
se configuran de modo que realizan su función habitual. Por lo
tanto, una secuencia reguladora determinada, tal como un promotor,
unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico, puede
efectuar la expresión de esta secuencia cuando está presente la
enzima apropiada. No es necesario que el promotor esté contiguo a
la secuencia, siempre y cuando funcione para dirigir la expresión de
la misma. De esta manera, por ejemplo, la intervención de
secuencias transcritas todavía no traducidas pueden estar presentes
entre la secuencia promotora y la secuencia de ácidos nucleicos y
la secuencia promotora puede todavía considerarse "unida
operativamente" a la secuencia codificante.
En la técnica se han descrito varios sistemas de
expresión, cada uno de los cuales consiste típicamente en un vector
que contiene un gen o una secuencia de nucleótidos de interés unida
operativamente a secuencias de control de expresión. Estas
secuencias de control incluyen secuencias promotoras
transcripcionales y secuencias de inicio y terminación
transcripcionales. Los vectores de la invención pueden ser, por
ejemplo, plásmidos, vectores de virus o de fagos dotados de un
origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión
de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.
Un "plásmido" es un vector en forma de un elemento genético
extracromosómico. Los vectores pueden contener uno o más genes
marcadores de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a
ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de
resistencia para un vector fúngico. Los vectores pueden usarse
in vitro, por ejemplo, para la producción de ADN o ARN o
usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora, por
ejemplo, una célula hospedadora de mamífero. Los vectores también
pueden adaptarse para usarse in vivo, por ejemplo, para
permitir la expresión in vivo del polipéptido.
Un "promotor" es una secuencia de
nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un
polinucleótido que codifica un polipéptido. Los promotores pueden
incluir promotores inducibles (en los que la expresión de una
secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor se
induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.),
promotores reprimibles (en los que la expresión de una secuencia
polinucleotídica unida operativamente al promotor se reprime por un
analito, cofactor, proteína reguladora, etc), y promotores
constitutivos. Se pretende que el término "promotor" o
"elemento de control" incluya regiones promotoras de longitud
completa y segmentos funcionales (por ejemplo, controles de
transcripción o traducción) de estas regiones.
Un polinucleótido, un casete de expresión o un
vector, descritos en este documento, puede comprender además una
secuencia de señal peptídica. La secuencia de señal peptídica se
inserta generalmente en unión operativa con el promotor de tal
manera que el péptido de señal se exprese y facilite la secreción de
un polipéptido codificado por una secuencia codificante también en
unión operativa con el promotor.
Típicamente una secuencia de señal peptídica
codifica un péptido de 10 a 30 aminoácidos por ejemplo de 15 a 20
aminoácidos. Con frecuencia, los aminoácidos son predominantemente
hidrófobos. En una situación típica, un péptido de señal dirige una
cadena polipeptídica creciente que lleva el péptido de señal al
retículo endoplásmico de la célula que expresa. El péptido de señal
se escinde en el retículo endoplasmico, permitiendo la secreción
del polipéptido mediante el aparato de Golgi. Por lo tanto, puede
proporcionarse un péptido de la invención a un individuo por la
expresión de las células dentro del individuo, y la secreción de
esas células.
De manera alternativa, los polinucleótidos
descritos en este documento pueden expresarse de una manera adecuada
para permitir la presentación de un péptido de la invención por una
molécula del MHC de clase II en la superficie de una célula
presentadora de antígenos. Por ejemplo, un polinucleótido, un casete
de expresión o un vector pueden dirigirse a células presentadoras
de antígeno, o la expresión del péptido codificado puede estimularse
o inducirse preferencialmente en dichas células.
Los polinucleótidos de interés pueden usarse
in vitro, ex vivo o in vivo en la producción de un
péptido de la invención. Dichos polinucleótidos pueden
administrarse o usarse en la prevención o en el tratamiento de la
alergia por tolerización.
En la técnica se conocen métodos para el
suministro de genes. Véanse, por ejemplo, las patentes de estados
unidos Nº: 5.399.346, 5.58.859 y 5.5104.466. La molécula de ácido
nucleico puede introducirse directamente en el sujeto receptor, tal
como por inyección intramuscular o intradérmica convencional;
administración mediante partículas transdérmicas; por inhalación;
por vía tópica u oral, intranasal o modos de administración a través
de la mucosa. Como alternativa, la molécula puede introducirse ex
vivo en células que se han extraído de un sujeto. Por
ejemplo, en las APC de un individuo ex vivo puede
introducirse un polinucleótido, un casete o un vector de expresión.
Las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés
se re-introducen en el sujeto de tal forma que
puede generarse una respuesta inmune contra el péptido codificado
por la molécula del ácido nucleico. En este documento, las
moléculas de ácido nucleico usadas en dicha inmunización se
denominan, en general, "vacunas de ácido nucleico".
Los polipéptidos, polinucleótidos, vectores o
células descritos en este documento pueden estar presentes en una
forma sustancialmente aislada. Pueden mezclarse con vehículos o
diluyentes que no interferirán con su uso previsto y aún así se
considerarán sustancialmente aislados. También pueden estar en una
forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderán
generalmente al menos el 90%, por ejemplo, al menos el 95%, el 98% o
el 99%, de las proteínas, de los polinucleótidos, de las células o
de la masa seca de la preparación.
En este documento se describe adicionalmente el
uso in vitro de un método para producir una población de APC
presentes en la superficie de los péptidos de la invención, que
posteriormente puede usarse en terapia. Dicho método puede
realizarse ex vivo en una muestra de células que se ha
obtenido de un paciente. Por lo tanto, las APC producidas de esta
manera forman un agente farmacéutico que puede usarse en el
tratamiento o prevención de la alergia del ácaro del polvo por
tolerización. El sistema inmunológico del individuo debe aceptar las
células ya que derivan de este individuo. Por lo tanto, el
suministro de células, que se han producido de esta manera, al
individuo de quien se obtuvieron originalmente, forma una forma de
realización terapéutica de la presente descripción.
Los péptidos, polinucleótidos, vectores y
células descritos en este documento pueden proporcionarse a un
individuo ya sea por separado o en combinación. Cada molécula o
célula puede proporcionarse a un individuo en una forma aislada,
sustancialmente aislada, purificada o sustancialmente purificada.
Por ejemplo, un péptido de la invención puede proporcionarse a un
individuo sustancialmente sin los otros péptidos.
Aunque puede ser posible que los péptidos,
polinucleótidos o composiciones de acuerdo con la invención se
presenten en forma no procesada, es preferible presentarlos como una
formulación farmacéutica. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto
adicional de la invención, la presente invención proporciona una
formulación farmacéutica para su uso en la prevención o el
tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo por tolerización
que comprende una composición, vector o producto de acuerdo a la
invención junto con uno o más vehículos o diluyentes
farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más ingredientes
terapéuticos. El vehículo (o vehículos) debe ser "aceptable"
en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la
formulación y no perjudicial para el receptor de los mismos.
Típicamente, los vehículos para inyección, y la formulación final,
son estériles y sin pirógenos.
La formulación de una composición que comprende
el péptido, los polinucleótidos o las células descritos en este
documento puede realizarse usando químicas y metodologías de
formulación farmacéutica convencionales, todas ellas fácilmente
disponibles de manera razonable para el experto en la materia.
Por ejemplo, las composiciones que contienen una
o más moléculas o células de la invención pueden combinarse con uno
o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En el
excipiente o vehículo pueden estar presentes sustancias auxiliares
tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias
tamponantes de pH y similares. Estos excipientes, vehículos y
sustancias auxiliares son generalmente agentes farmacéuticos que no
inducen una respuesta inmune en el individuo que recibe la
composición, y que pueden administrarse sin toxicidad indebida. Los
excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin
limitación, líquidos tales como agua, solución salina,
polietilenglicol, ácido hialurónico y etanol. Las sales
farmacéuticamente aceptables también pueden incluirse en el mismo,
por ejemplo, sales minerales, ácidos como clorhidratos,
hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de
ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos,
benzoatos, y similares. Una discusión completa de excipientes,
vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables está
disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.,
N.J. 1991).
Dichas composiciones pueden prepararse,
envasarse o comercializarse en una forma adecuada para la
administración en embolada o para la administración continua. Las
composiciones inyectables pueden prepararse, envasarse o
comercializarse en forma de dosis unitarias, como en ampollas o en
envases multidosis que contienen un conservante. Las composiciones
incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones
en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables
de liberación prolongada o biodegradable. Además, dichas
composiciones pueden comprender uno o más ingredientes adicionales,
incluyendo pero sin limitación, agentes de suspensión,
estabilizantes o dispersantes. En una realización de una composición
para la administración parenteral, el ingrediente activo se
proporciona en forma seca (por ejemplo, un polvo o gránulos) para la
reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril
sin pirógenos) antes de la administración parenteral de la
composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas pueden
prepararse, envasarse o comercializarse en forma de una suspensión
o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o
solución puede formularse de acuerdo con la técnica conocida y
puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes
adicionales tales como agentes de dispersión, agentes humectantes o
agentes de suspensión descritos en este documento. Dichas
formulaciones inyectables estériles pueden prepararse usando un
diluyente o disolvente no tóxico, parenteralmente aceptable, tal
como agua o 1,3-butano diol, por ejemplo. Otros
diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación,
solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, y
aceites no volátiles, tales como mono- o
di-glicéridos sintéticos. Otras composiciones
parenteralmente administrables que son útiles incluyen aquellas que
comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en forma
de preparado liposomal, o como un componente de un sistema
polimérico biodegradable. Las composiciones para la liberación o
implantación prolongada pueden comprender materiales poliméricos o
hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión,
una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble, o una
sal poco soluble.
De manera alternativa, los péptidos o
polinucleótidos que se describen en este documento pueden
encapsularse, adsorberse a, o asociarse con, vehículos
particulados. Los vehículos particulados adecuados incluyen los
derivados de polímeros de polimetil metacrilato, así como
micropartículas de PLG derivadas de poli(láctidos) y
poli(láctico-glicólidos). Véase, por
ejemplo, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res.
10:362-368. También pueden usarse otros sistemas y
polímeros particulados, por ejemplo, polímeros tales como
polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así
como conjugados de estas moléculas.
La formulación de cualquiera de los péptidos,
polinucleótidos o células mencionados en este documento dependerá
de factores tales como la naturaleza de la sustancia y el método de
administración. Cualquiera de dichas sustancias puede administrarse
en una diversidad de formas de dosificación. Puede administrarse por
vía oral (por ejemplo, en forma de comprimidos, trociscos,
pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o
gránulos dispersables), por vía parenteral, por vía epicutánea, por
vía subcutánea, por inhalación, por vía intravenosa, por vía
intramuscular, por vía intraesternal, por vía transdérmica, por vía
intradérmica, por vía sublingual, por vía instranasal, por vía
bucal o mediante técnicas de infusión. La sustancia también puede
administrarse en forma de supositorios. Un médico podrá determinar
la vía de administración requerida para cada individuo en
particular. Las composiciones de las formulaciones descritas en este
documento comprenderán una concentración adecuada de cada
péptido/polinucleótido/célula para ser eficaz sin causar reacciones
adversas. Típicamente, la concentración de cada péptido en la
composición estará en el intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml. Más
preferiblemente en el intervalo de 0,3 a 200 nmol/ml, de 3 a 180
nmol/ml, de 10 a 150 nmol/ml o de 30 a 120 nmol/ml. La composición
o formulaciones deben tener una pureza superior al 95% o 98% o una
pureza de al menos el 99%.
Por lo tanto, en una realización, los péptidos,
polinucleótidos, células o composiciones descritas en este
documento se usan para terapia en combinación con uno o más de otros
agentes terapéuticos. Los agentes pueden administrarse, por
separado, simultánea o secuencialmente. Pueden administrarse en la
misma o en diferentes composiciones. Por consiguiente, en un método
descrito en este documento, el sujeto también puede tratarse con un
agente terapéutico adicional.
Por lo tanto, puede formularse una composición
que comprenda una molécula y/o célula descrita en este documento y
también una o más de otras moléculas terapéuticas. De manera
alternativa, una composición de la invención puede usarse de forma
simultánea, secuencial o por separado con uno o más de otras
composiciones terapéuticas, como parte de un tratamiento
combinado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente descripción se refiere a péptidos,
polinucleótidos, vectores y células que pueden insensibilizar o
hacer tolerantes, a individuos humanos, a los alérgenos descritos
anteriormente y son por tanto útiles en la prevención o el
tratamiento de la alergia del ácaro del polvo. La invención
proporciona composiciones, productos, vectores y formulaciones para
el uso en la prevención o el tratamiento de la alergia a los ácaros
del polvo por tolerización. Adicionalmente, en este documento se
describe un método para hacer tolerante o insensibilizar a un
individuo alérgico al ácaro del polvo que comprende administrar,
solos o en combinación, los polipéptidos/polinucleótidos/células
como se ha descrito anteriormente.
El individuo a tratar o al que se le ofrece la
composición o formulación de la invención es preferiblemente un ser
humano. Se apreciará que puede saberse que el individuo a tratar sea
alérgico a los alérgenos, esté en riesgo de ser alérgico o se
sospeche que sea alérgico. Se pueden realizar ensayos en el
individuo para determinar la sensibilización usando técnicas bien
conocidas en el campo técnico y como se describe en este documento.
De manera alternativa, el individuo puede tener antecedentes
familiares de alergia a los ácaros del polvo. Puede que no sea
necesario someter a ensayo a un individuo para determinar la
sensibilización a los ácaros del polvo debido a que el individuo
puede mostrar síntomas de alergia cuando se expone a los ácaros del
polvo. Por exposición se entiende proximidad, por ejemplo, a una
prenda de ropa, un colchón, almohada, funda de almohada, sábana,
manta u otro material de cama que no se haya lavado a una
temperatura superior a 50ºC durante más de aproximadamente una
semana, o una alfombra, cortina o mobiliario tapizado que no se ha
limpiado al vacío durante más de aproximadamente una semana. Por
proximidad que se entiende estar a 10 metros o menos, 5 metros o
menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos, o 0 metros de los
elementos descritos anteriormente. Los síntomas de la alergia
pueden incluir picor en los ojos, moqueo nasal, dificultad para
respirar, enrojecimiento de la piel con picazón o erupción.
Los individuos a tratar pueden tener cualquier
edad. Sin embargo, preferiblemente, el individuo puede estar en el
grupo de 1 a 90, de 5 a 60, de 10 a 40, o más preferiblemente de 18
a 35 años de edad.
Preferiblemente, el individuo a tratar procede
de una población que tiene frecuencias alélicas del MHC dentro del
intervalo de frecuencias que son representativas de la población
Caucásica. En la Tabla 1 se muestran las frecuencias alélicas de la
población de referencia para 11 familias del alelo común DRB1 (datos
procedentes de HLA Facts Book, Parham y Barber).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las frecuencias de referencia se obtuvieron por
análisis de estudios múltiples que indican frecuencias y los datos
presentados son valores medios. Por lo tanto, preferiblemente, el
individuo a tratar procede de una población que tiene frecuencias
alélicas del MHC equivalentes a las de la población de referencia
para los alelos indicados en la Tabla 1 (tales como para al menos
1, 2, 3, 4, 5 o todos los alelos), por ejemplo dentro de los
intervalos de los datos más o menos 1, 2, 3, 5, 10, 15 o 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, el individuo procede de una
población donde las frecuencias alélicas de los siguientes alelos
DRB1 es:
4 - al menos el 9%
7 - al menos el 10%
11 - al menos el 8%.
\vskip1.000000\baselineskip
El individuo puede haber tenido alergia a los
ácaros del polvo durante al menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año
o 5 años. El Individuo puede padecer una erupción, congestión nasal,
secreción nasal y/o tos causada por la alergia. El individuo puede
o no haber recibido otras composiciones/compuestos que tratan la
alergia al ácaro del polvo. El individuo puede vivir en una región
geográfica con una humedad relativa media diaria superior al 50%,
preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o 90%. El individuo
puede vivir en una región geográfica que se sabe que sustenta
poblaciones de ácaros del polvo, por ejemplo la mitad oriental de
los Estados Unidos (y las principales ciudades de la costa
occidental de los Estados Unidos), las zonas pobladas de Canadá,
Europa occidental, Japón, Corea y zonas costeras de América del Sur,
Australia y Sudáfrica.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que muchos individuos son alérgicos, o
pueden necesitar la insensibilización a varios antígenos
polipeptídicos, la presente invención también proporciona medios de
insensibilización a individuos que son alérgicos a antígenos
múltiples. La "tolerancia", inducida en un individuo a un
primer antígeno o alérgeno polipeptídico, puede crear en el
individuo un "entorno tolerogénico" en el que pueden regularse
negativamente respuestas inmunes inadecuadas a otros antígenos para
proporcionar tolerancia a otros antígenos.
Este hallazgo significa que individuos alérgicos
a alérgenos múltiples pueden tratarse en un período de tiempo muy
reducido, y que individuos seriamente alérgicos a algunos alérgenos
(por ejemplo, a los cacahuetes), pero más levemente alérgicos a
otros alérgenos (por ejemplo, a la caspa de gato) pueden
beneficiarse de una terapia en la que se establece la tolerancia al
alergeno más leve y a continuación, este entorno tolerogénico, se
usa para proporcionar tolerancia a los otros alérgenos más
extremos. Además, los individuos que padecen un trastorno autoinmune
que, además están sensibilizados (o inmunizados de otro modo) a un
antígeno o alérgeno no relacionado, pueden beneficiarse de un
régimen de tratamiento en el que primero se estableció la tolerancia
al antígeno o al alérgeno no relacionado y después se usó este
entorno tolerogénico para proporcionar tolerancia al autoantígeno
asociado con el trastorno
autoinmune.
autoinmune.
Por lo tanto, se proporciona un método para
insensibilizar a un individuo alérgico a los ácaros del polvo, como
se describe anteriormente y uno o más antígenos polipeptídicos
diferentes adicionales. El método supone, en una primera etapa,
administrar al individuo una composición/producto/formulación
(composición primaria) de acuerdo con la invención, como se
describe en este documento, y en el que la administración se realiza
de manera suficiente para generar un estado hiposensible contra los
alérgenos del ácaro del polvo. Una vez que se ha establecido el
estado hiposensible hacia los alérgenos del ácaro del polvo, o se ha
producido al menos un cambio hacia la insensibilización, el método
supone la administración de una composición secundaria que
comprende un segundo antígeno polipeptídico diferente al cual va a
sensibilizarse el individuo. La administración de la composición
secundaria se realiza de tal manera que se aprovecha el entorno
tolerogénico establecido por el uso de la composición primaria, por
lo que ahora es posible establecer tolerancia al segundo antígeno
polipeptídico diferente. La composición secundaria se coadministra
con la primera composición primaria o con un fragmento de Feld1 más
grande. "Coadministrar" se refiere a la administración
simultánea o conjunta, por ejemplo, cuando las dos están presentes
en la misma composición o se administran en distintas composiciones,
casi al mismo tiempo pero en sitios diferentes, así como la
administración de los antígenos polipeptídicos en distintas
composiciones en tiempos diferentes. Por ejemplo, la composición
secundaria puede administrarse antes o después de administrar la
primera composición, en el mismo sitio o en un sitio diferente. El
periodo de tiempo entre las administraciones puede variar de
aproximadamente varios segundos de diferencia a aproximadamente
varios minutos de diferencia, varias horas de diferencia o incluso
varios días de diferencia. Por otra parte, pueden emplearse
diferentes métodos de administración.
El segundo antígeno polipeptídico es
preferiblemente un alérgeno diferente al alérgeno del ácaro del
polvo. Los alérgenos adecuados para su uso en los métodos de la
invención pueden, por supuesto, obtenerse y/o producirse usando
métodos conocidos. Las clases de alérgenos adecuados incluyen, pero
sin limitación, otros alérgenos de ácaros del polvo, polen, caspa
de animales (especialmente caspa de gato), hierbas, hongos, polvo,
antibióticos, venenos de insecto por picadura, y una variedad de
alérgenos ambientales (incluidos los productos químicos y metales),
farmacológicos y alimentarios. Los alérgenos comunes de los árboles
incluyen polen del álamo, chopo, fresno, abedul, arce, roble, olmo,
nogal, y pacanas; los alérgenos comunes de las plantas incluyen los
de la artemisa, ambrosía, plátano Inglés, acedera y amaranto; los
alérgenos por contacto de plantas incluyen los del roble venenoso,
hiedra y ortigas venenosas; los alérgenos comunes de herbáceas
incluyen césped, agróstide, hierba de don Carlos, pasto Bermuda,
alérgenos de festuca y pasto azul; también pueden obtenerse
alérgenos comunes de moho u hongos como Alternaria, Fusarium,
Hormodendrum, Aspergillus, Micropolyspora, Mucor y actinomicetos
termófilos; los alérgenos epidérmicos pueden obtenerse del polvo
doméstico u orgánico (típicamente de origen fúngico), o de fuentes
animales, tales como plumas y caspa de perro; los alérgenos
alimentarios comunes incluyen alérgenos de la leche y queso
(diario), huevo, trigo, frutos secos (por ejemplo, cacahuete),
productos del mar (por ejemplo, marisco), guisante, judía y gluten;
los alérgenos ambientales comunes incluyen alérgenos de metales
(níquel y oro), productos químicos (formaldehído, trinitrofenol y
aguarrás), látex, caucho, fibras (algodón o lana), arpillera, tinte
para el cabello, cosméticos, detergentes y perfumes; los alérgenos
comunes de fármacos incluyen alérgenos de anestésicos locales y
salicilato; y los alérgenos de antibióticos incluyen alérgenos de
penicilina, tetraciclina y sulfonamidas, y los alérgenos comunes de
insectos incluyen veneno de abeja, de avispa y de hormiga, y
alérgenos del cáliz de las cucarachas. Los alérgenos particularmente
bien caracterizados incluyen, pero sin limitación, el alérgeno
principal del gato Fel d1, veneno de abeja fosfolipasa A2 (PLA)
(Akdis et al. (1996) J. Clin. Invest.
98:1676-1683), el alérgeno del polen del abedul Bet
v 1 (Bauer et al. (1997) Clin. Exp. Immunol.
107:536-541), y el alérgeno de hierba recombinante
multi-epitopico rKBG8.3 (Cao et al. (1997)
Immunology 90:46-51). Estos y otros alérgenos
adecuados se encuentran disponibles en el mercado y/o pueden
prepararse fácilmente como extractos siguiendo técnicas
conocidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, el segundo alérgeno
polipeptídico se selecciona de la siguiente lista de secuencias y
números de acceso de la base de datos (números de acceso de entrada
al NCBI) de alérgenos. El NCBI es el centro Nacional de información
Biotecnología y es una división del Instituto Nacional de la salud
de los Estados Unidos. El sitio Web del NCBI, que puede facilitar
el acceso a la base de datos solicitada, es
www.ncbi.nlm.nih.gov/Allergen secuencias and database accession
numbers (números de acceso de entrada NCBI):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los alérgenos/antígenos particularmente
preferidos incluyen: la proteína Fel d1 de la caspa de gato, las
proteínas Der P1, P2 y Der P7 del ácaro del polvo doméstico; la
proteína amb a 1.1, a 1.2, a 1.3 ó a 1.4 de la ambrosía; las
proteínas del raigrás lol p 1 y lol p 5; las proteínas de la
agróstide phl p1 y phl p5; la proteína del pasto Bermuda Cyn d 5;
las proteínas de Alternaria alternata Alt a 1, Alt a 2 y
Enolasa (Alt a 6), la proteína del abedul Bet v1 y P14; las
proteínas de la cucaracha alemana Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g
4, Bla g 5 y Bla g 6; las proteínas de artemisa Art v 1; la proteína
de la barrilla de borde Sal k 1 y 2; las profilinas de la planta de
cacahuete Ara h 1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6 o
proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno leucocitario
humano.
\newpage
Una vez formuladas las composiciones de la
invención pueden administrarse a un sujeto en vivo usando una
diversidad de vías y técnicas conocidas. Por ejemplo, una
composición puede proporcionarse como una solución, suspensión o
emulsión inyectable y administrarse por vía parenteral, por
inyección subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular,
intraarterial, intraperitoneal, intravenosa usando una aguja y una
jeringa convencional, o usando un sistema de inyección por chorro
líquido. Las composiciones también pueden administrarse por vía
tópica en la piel o en el tejido mucoso, tal como por vía nasal, vía
intratraqueal, vía intestinal, vía rectal o vía vaginal, o
proporcionarse como un pulverizador finamente dividido adecuado para
la administración respiratoria o pulmonar. Otros modos de
administración incluyen la administración oral, supositorios,
administración sublingual, y técnicas de administración
transdérmica activa o pasiva.
Cuando se administra un péptido de la invención,
se prefiere administrar el péptido en un sitio del cuerpo en el que
tendrá la posibilidad de ponerse en contacto con las células
presentadoras de antígeno adecuadas, y en el que, este, o estos,
tendrán la oportunidad de ponerse en contacto con los linfocitos T
del individuo. Cuando se administra una APC, se prefiere
administrar la APC en un sitio del cuerpo en el que tendrá la
posibilidad de ponerse en contacto con, y activar, los linfocitos T
adecuados del individuo..
La administración de los
péptidos/polinucleótidos/células (tal como la composición que
contiene una pluralidad de péptidos) puede realizarse por cualquier
método adecuado como se ha descrito anteriormente. Las cantidades
adecuadas del péptido pueden determinarse empíricamente, pero
típicamente, están en el intervalo que se proporciona a
continuación. Una sola administración de cada péptido puede ser
suficiente para tener un efecto beneficioso para el paciente, pero
se apreciará que puede ser beneficioso si el péptido se administra
más de una vez, en cuyo caso los regímenes de administración
típicos pueden ser, por ejemplo, una vez o dos veces a la semana
durante 2-4 semanas cada 6 meses o una vez al día
durante una semana cada cuatro a seis meses. Como se apreciará,
cada péptido o polinucleótido, o combinación de péptidos y/o
polinucleótidos puede administrarse a un paciente por separado o en
combinación.
Las dosificaciones para la administración
dependerán de una serie de factores que incluyen la naturaleza de
la composición, la vía de administración y el programa y horario del
régimen de administración. Las dosis adecuadas de una molécula
descrita en este documento pueden ser del orden de hasta 15 \mug,
hasta 20 \mug, hasta 25 \mug, hasta 30 \mug, hasta 50 \mug,
hasta 100 \mug, hasta 500 \mug o más por administración. Las
dosis adecuadas puede ser menores de 15 \mug, pero al menos de 1
ng, o al menos de 2 ng, o al menos de 5 ng, o al menos de 50 ng, o
al menos de 100 ng, o al menos de 500 ng o al menos de 1 \mug, o
al menos de 10 \mug. Para algunas moléculas descritas en este
documento, la dosis usada puede ser mayor, por ejemplo, hasta 1 mg,
hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg, hasta 5 mg o superior. Dichas
dosis pueden proporcionarse en una formulación líquida, a una
concentración adecuada para permitir un volumen adecuado para la
administración por la vía seleccionada.
La presente descripción también se refiere a una
combinación, de los componentes descritos en este documento,
adecuada para su uso en el tratamiento de la invención, que se
envasa en forma de un kit en un recipiente. Dichos kits pueden
comprender una serie de componentes para permitir el tratamiento de
la invención. Por ejemplo, un kit puede comprender uno o más
péptidos, polinucleótidos y/o células diferentes descritos en este
documento, o uno o más péptidos, polinucleótidos o células
descritos en este documento y uno o más agentes terapéuticos
adicionales adecuados para la administración simultánea, o para la
administración secuencial o por separado. Opcionalmente, el kit
puede contener otro reactivo (o reactivos) adecuado o instrucciones
y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se ilustra con los siguientes
ejemplos:
Ejemplo
1
El objetivo de este estudio es identificar un
panel de péptidos distintos con fuertes afinidades para los siete
alotipos más comunes de HLA-DRB1* del MHC de clase
II humano (incluyendo en total aproximadamente el 63% de los
alotipos encontrados en la población caucásica promedio). Con el fin
de identificar péptidos de unión en los alérgenos del ácaro del
polvo doméstico (HDM), Der p 1, Der p 2 y Der p 7, se realizaron
ensayos de unión in vitro en un subconjunto de péptidos
procedentes de estas proteínas alergénicas. Inicialmente, los
péptidos para ensayar en los ensayos de unión, se identificaron
mediante un tratamiento informático conocido como "encadenamiento
peptídico" (realizado por Biovation, Ltd., Aberdeen, Escocia,
Reino Unido). Se trata de un análisis bioinformático de péptidos
consecutivos a partir de una secuencia para determinar la
posibilidad de alojarse dentro del surco de unión de las moléculas
HLA-DR del MHC de clase II. Este subconjunto de
péptidos se pre-exploró para determinar la
solubilidad en un medio ácido, acuoso y se seleccionó un panel final
de 44 péptidos para ensayar en un ensayo de unión in vitro
al MHC de clase II.
El ensayo empleado es un ensayo de unión
competitivo al MHC de clase II, en el que cada péptido se analiza
para determinar su capacidad de desplazar a un agente de unión de
control conocido de cada uno de los alotipos del MHC de clase II
investigados. Los alotipos y péptidos de control usados en este
estudio se muestran en la Tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron cada uno de los 44 péptidos del
HDM (que se muestran en las Tablas 3A y 3B) en el ensayo de
competición y se exploraron para determinar la unión relativa en
comparación con el péptido de control. Debido a la naturaleza del
ensayo competitivo, los datos de cada péptido se representan como
una proporción de su propia CI50 respecto a la del péptido control.
Por lo tanto, un péptido que tiene un valor de CI50 que es igual al
del péptido de control tiene una afinidad de unión idéntica,
mientras que péptidos con una proporción menor que uno tienen una
mayor afinidad y aquellos con una proporción mayor que uno tienen
una menor afinidad.
\vskip1.000000\baselineskip
La solubilidad en solución acuosa en un criterio
esencial para que un péptido sea un agente terapéutico eficaz. Por
lo tanto, como consecuencia de la exploración en cuanto a la
solubilidad deberán eliminarse péptidos muy hidrófobos con una
elevada frecuencia de restos aminoacídicos hidrófobos grandes en
registros de unión múltiples. Esta es una característica de agentes
de unión HLA-DRB1 * promiscuos. Los datos de los
ensayos de unión se muestran en la Tabla 3B. Para cada uno de los
alotipos en el estudio, se muestra la unión relativa de cada
péptido. Los datos muestran que, 24 de los 44 péptidos ensayados, se
unieron a uno o más de los alotipos del MHC de clase II. Se observa
un intervalo de reactividad cruzada con 5 péptidos que sólo se unen
a un alotipo, 8 péptidos que se unen a dos, 9 péptidos que se unen
a tres y 2 péptidos que se unen a cuatro alotipos diferentes del
MHC de Clase II (red). También se espera que dichos péptidos
pudieran unirse a alotipos similares que no se han ensayado a
través de la homología de las estructuras del MHC. Esto puede
observarse en la reactividad cruzada de péptidos para DRB1 * 0101,
* 0401, * 0701 y * 1101 en varios casos en este documento. También
se muestra el estado de solubilidad del péptido a las
concentraciones más altas en la solución acuosa del ensayo de
unión. El valor ilustra la concentración más baja a la que se
observa un precipitado blanco insoluble. No parece haber ningún
efecto significativo inespecífico de la formación de precipitado en
los ensayos. Varios péptidos que se precipitan a altas
concentraciones también se unen al MHC de clase II; sin embargo,
también varios muestran ninguna capacidad para competir con los
péptidos de control. Es de esperar que los péptidos propensos a
formar precipitados puedan presentar una alta afinidad y unión
promiscua debido a la presencia de muchos restos hidrófobos.
En la Tabla 3A se indica el % de pureza de los
péptidos. Esto es significativo ya que se observa que el grado de
pureza varía del 60-90%. Esto tendría un efecto
considerable en la capacidad de un péptido para competir si este es
relativamente impuro. Por ejemplo, HDM23A y HDM32 muestran unión de
afinidad baja, sin embargo, tiene una pureza reducida (66,7% y
68,7% respectivamente) en comparación con otros péptidos HDM. Por lo
tanto, si se tiene en cuenta la pureza, pueden de hecho tener una
afinidad equivalente a un péptido con una pureza superior.
Puede observarse que algunos alotipos del MHC de
clase II alotipos se unen a más péptidos que otros, lo que es,
probablemente, de esperar, ya que existe variabilidad entre las
posiciones de bolsillo en los diferentes surcos de unión al MHC de
clase II. Sin embargo, existen también una serie de diferencias bien
caracterizadas entre las afinidades de los diversos péptidos de
control. Es evidente que un péptido de control de alta afinidad
será más difícil de desplazar por la competencia del péptido de HDM
dando como resultado la identificación de pocos péptidos de unión.
Esto puede ilustrarse por los datos presentados en este documento.
Por ejemplo, el péptido de control hemaglutinina de la gripe
307-319, tiene diversas afinidades según el alotipo,
en el que DRB1 *0101 > *0401 > *0701 > *1101. Esto se
refleja en el número de agentes de unión para cada uno de los
alotipos, en el que DRB1 *0101 tiene el menor número de agentes de
unión (5) y DRB1 *1101 tiene el mayor (14). Adicionalmente, el
ensayo de unión para RB1 *1501 es muy riguroso debido a la alta
afinidad de la Proteína Básica de Mielina 85-99 por
este alotipo. En la exploración de alto rigor el péptido Fel d 1,
EQVAQYKA-LPVVLENA, que se ensayó en un estudio
anterior, proporcionó una proporción de 0.97 lo que indica que con
ese rigor podrían identificarse agentes de unión de elevada
afinidad.
Además, para identificar agentes de unión de
menor afinidad, el ensayo también se realizó en condiciones menos
rigurosas. Se observó que todos los péptidos de unión a Der p tenían
una alta proporción cuando se ensayaron contra este alotipo,
mostrando que eran agentes de unión de baja afinidad en comparación
con el péptido de control. El ensayo de unión DQA1 *0102/DQB1 *0602
usa un péptido de la cadena B de insulina humana, que es de menor
afinidad en comparación con los usados en los ensayos de DR. Esto
determina que el ensayo de DQ es muy sensible y tiende a producir
valores de proporción muy bajos para los agentes de unión más
fuertes para este alotipo del MHC de clase II. Esta sensibilidad
también explica el número relativamente alto de péptidos de unión a
DQ dentro del panel explorado. Por último, en un análisis más
minucioso, se ha observado que los péptidos identificados como
ligandos para la superfamilia DRB1 *0101, *0401, *0701, incorporan
un motivo que es característico de los agentes de unión promiscuos
de esta familia de alotipos donde: P1 = Y, F, W, L, I, V, o M
(resto aromático o hidrófobo grande), P6 = S, T, C, A, P, V, I, M
(resto pequeño, sin carga). De los 16 péptidos (por ejemplo, HDM 21
B RGKPFQLEAVFEANQNT) identificados como agentes de unión para todos
o una combinación de estos 3 alotipos, 14 (87,5%) contienen este
motivo, lo que sugiere que se trata de agentes de unión promiscuos
con una serie de afinidades para los alotipos
1-4-7.
\vskip1.000000\baselineskip
Una serie de péptidos han demostrado tener la
capacidad de unirse a alotipos del MHC de Clase II ensayados y
pueden ensayarse para determinar su capacidad de estimular la
proliferación in vitro de linfocitos T CD4+ y de estimular
la secreción de citocinas de linfocitos T.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las secuencias de cada uno de los 24 péptidos
identificados anteriormente como de unión al MHC de Class II se
usaron para explorar la secuencia de la proteína alternativa en el
grupo del alérgeno del ácaro del polvo del cual deriva la secuencia
parental. Por ejemplo, el péptido HDM01 en la Tabla 3A es de Der p
1, por lo tanto la secuencia de HDM01 se usó para investigar una
secuencia homóloga en Der f 1. La misma práctica se aplicó en los
24 péptidos identificados anteriormente. Los péptidos identificados
en el ejemplo 1 y en el Ejemplo 2 se muestran en las Tablas 4 a
6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 4, la secuencia de Der p 1 de la
cual derivan las posiciones "restos en parentales" es la
secuencia disponible al público con el Nº de acceso P08176 del
NCBI. Las secuencias correspondientes para Der p 2 (Tabla 5) y Der
p 7 (Tabla 6) son los N^{os} de acceso P49278 y P49273 del NCBI,
respectivamente. La secuencia para Der f 1 se toma del Nº de acceso
16311 del NCBI, Der f 2 es del Nº de acceso Q00855 del NCBI y Der f
7 es del Nº de acceso Q26456 del NCBI.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El objetivo de este estudio es identificar un
panel de péptidos distintos con fuertes afinidades para los siete
alotipos más comunes de HLA-DRB1* del MHC de clase
II humano (incluyendo en total aproximadamente el 63% de los
alotipos encontrados en la población caucásica promedio). Con el fin
de identificar péptidos de unión en los alérgenos del ácaro del
polvo doméstico, Der p 1, Der p 2 y Der p 7, se identificaron
péptidos mediante un tratamiento informático conocido como
"encadenamiento peptídico" usando el algoritmo EpiMatrix
disponible en el mercado (EpiVax Inc.). Se trata de un análisis
bioinformático de péptidos a partir de una secuencia para
determinar la posibilidad de alojarse dentro del surco de unión de
las moléculas HLA-DR del MHC de clase II. EpiMatrix
es un algoritmo basado en matrices que clasifica segmentos de 10
aminoácidos de longitud, solapando con 9 aminoácidos, de cualquier
secuencia polipeptídica por probabilidad de unión a cada una de las
moléculas del MHC seleccionadas. (De Groot et al., AIDS
Research and Human Retroviruses 13:539-41 (1997)).
Schafer et al, 16 Vaccine 1998 (1998), publicaron el
procedimiento para desarrollar motivos matriciales. En este
ejemplo, se evalúa la posible unión a HLADR1, DR2, DR3, DR4, DR7,
DR8, DR11, DR13 y DR15. Los supuestos ligandos del MHC se
seleccionan puntuando cada tramo de 10 unidades en una secuencia de
proteína. Esta puntuación se obtiene comparando la secuencia de las
10 unidades con la matriz de las secuencias de 10 aminoácidos que
se sabe que se une a cada alelo del MHC. Estudios retrospectivos han
demostrado que EpiMatrix predice con exactitud ligandos del MHC
publicados (Jesdale et al., in Vaccines '97 (Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997)). También se ha
confirmado el éxito de la predicción de péptidos que se unen a
moléculas múltiples del MHC.
La probabilidad estimada de unirse a una
molécula del MHC seleccionada se calcula por EpiMatrix de la
siguiente manera. Los péptidos se puntúan estimando la promoción o
inhibición de unión relativa de cada aminoácido, en comparación con
agentes de unión al MHC conocidos para un determinado alelo del MHC.
Esta información se suma a través del péptido y a todo el péptido
se le asigna una puntuación resumen (puntuación EMX). Después de
comparar la puntuación EMX con las puntuaciones de los ligandos del
MHC conocidos, EpiMatrix obtiene una "probabilidad de unión
estimada" (abreviada como EBP, aunque no es estrictamente una
probabilidad). La EBP describe la proporción de péptidos, con
puntuaciones EpiMatrix tan altas o más altas, que se unirán a una
molécula del MHC determinada. Las EBP varían del 100% (muy probable
que se unan) a menos del 1% (muy poco probable que se
unan).
unan).
Los análisis EpiMatrix se realizaron en toda la
secuencia de Der p 1 como se publica en la base de datos del NCBI
(nº de acceso P08176 del NCBI). Este análisis identificó péptidos
nucleares (y sus secuencias flanqueantes) derivados de las
secuencias anteriores que se predice que tienen buena unión al MHC
de clase ll. Estas secuencias se muestran a continuación en la
Tabla 7A. Las Tablas 7B y 7C muestran las secuencias para los
análisis equivalentes de secuencias conocidas de Der p 2 y Der p 7,
respectivamente (nº de acceso P49278 y P49273 del NCBI).
En las Tablas 7A - C: La columna "restos en la
secuencia" proporciona la ubicación del péptido en las secuencias
que se analizaron. El péptido núcleo (aminoácidos intermedios en
negrita) define la secuencia de unión real que se identificó
durante el análisis. Los flancos estabilizadores
(N-terminal y C-terminal, no en
negrita) se incluyeron para su uso con la secuencia núcleo y son
típicamente necesarios para ayudar en la fabricación de los
péptidos. El "número de aciertos" se refiere al número de
afinidades de unión altas previstas para todos los tipos de MHC
ensayados dentro de la secuencia. La "Puntuación de grupo
EpiMatrix" deriva del número de aciertos normalizados para la
longitud del grupo. Por lo tanto, la puntuación de grupo es el
exceso o déficit de las propiedades de unión al MHC agregadas
previstas en relación con un patrón peptídico al azar. Se considera
que una puntuación de 10 o más indica amplias propiedades de unión
al MHC. Epivax también analizó la hidrofobicidad de péptidos que
contienen epítopos. Las puntuaciones superiores a 1 se consideran
inadecuadas para la administración y/o la fabricación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Basándose en los péptidos y epítopos
identificados en los Ejemplos 1 a 3, los inventores seleccionaron
los péptidos mostrados en la Tabla 8 para ensayo adicional. Algunos
de los péptidos seleccionados pueden considerarse como variantes de
los péptidos de los Ejemplos 1 a 3, pero también se consideran como
péptidos de la invención. En particular, los restos en negrita en
la Tabla 8 indican modificaciones del resto correspondiente en la
secuencia nativa de la proteína parental. Estas modificaciones
reducen la formación de dímeros peptídicos y mejoran la solubilidad
sin disminuir la funcionalidad de un péptido como un epítopo de
linfocito T. Las modificaciones mostradas son la sustitución de una
cisteína (C) en la secuencia nativa por una serina (S) o ácido 5
aminobutírico (B), o cistina (\hat{C}) según lo indicado.
Adicionalmente, algunas secuencias pueden
comprender más o menos restos de la proteína parental de la cual
derivan, cuando se comparan con las secuencias de los péptidos de
los Ejemplos 1 a 3. Por lo tanto, dichas secuencias pueden
considerarse que representan las variantes de truncamiento o de
extensión de los péptidos de los ejemplos 1 a 3. Por ejemplo, el
péptido HDM03F corresponde a los restos 149-165 de
Der p1. HDM03E corresponde a los restos 149-167.
Por consiguiente, puede considerarse que HDM03F es una variante del
truncamiento de HDM03E formada por la retirada de 2 restos del
extremo N de HDM03E. Los "restos en las posiciones parentales"
en la Tabla 8 se refiere a las secuencias de Der p 1, Der p 2 y Der
p 7 como se usa en las tablas 4 a 7. Esos péptidos indicados en la
Tabla 8 que tienen un resto de glutamato (E) N terminal, por ejemplo
HDM03K, L, V y W, pueden tener el glutamato sustituido por
piroglutamato para mejorar la estabilidad durante la fabricación,
sin afectar la función del péptido. Los datos del ensayo adicional
de estos péptidos (Ejemplo 5) se obtienen típicamente usando
péptidos en los que se ha producido dicha sustitución.
Ejemplo
5
Se analizaron perfiles de secreción de citocinas
de las PBMC en respuesta a la estimulación peptídica usando los
péptidos del Ejemplo 3. Los sobrenadantes del ensayo de liberación
de citocina se analizaron para determinar la presencia de 2
citocinas, IFN-\gamma e IL-13,
usando ensayos de ELISA. Se analizaron perfiles de secreción de
citocinas de las PBMC en respuesta a la estimulación peptídica
usando los péptidos indicados. Los sobrenadantes del ensayo de
liberación de citocina se analizaron para determinar la presencia de
2 citocinas, IFN-\gamma e IL-13,
usando un ensayo de ELISA o un ensayo múltiple de matriz de
perla.
Un ensayo típico de liberación de citocina
necesita 40x10^{6} PBMC por sujeto. Con más detalle, se
distribuyen 250 \mul de una solución 200 \mug/ml de la
concentración de antígeno o péptido apropiado en los pocillos
apropiados de placas de 48 pocillos. Las placas se incuban en una
incubadora humifidificada con CO_{2} al 5% a 37ºC durante un
máximo de 4 horas. Después, a cada pocillo, se añaden 250 \mul de
una suspensión de PBMC de 5x10^{6} cél/ml y las placas regresan a
la incubadora durante 5 días. Después de la estimulación, se
recogen muestras del sobrenadante del cultivo para el ensayo por
ELISA o el ensayo múltiple de matriz de perla de acuerdo con
protocolos convencionales.
Las respuestas de Il-13 e
IFN-gamma para cada péptido se puntuaron como
epítopos de linfocitos T positivos siempre que la cantidad de
citocina producida en el pocillo para cada péptido superase 100
pg/ml, es decir, 100 pg por 1,25x10^{6} células. Por lo tanto, se
consideró que un individuo ha respondido a un péptido si las
células de ese individuo producen una respuesta superior a 100
pg/ml, para Il-13 o IFN-gamma. En la
figura 2 se muestra el porcentaje de respondedores para cada
péptido.
Los cinco primeros péptidos por porcentaje de
individuos con una respuesta IL-13 o
IFN-gamma superior a 100 pg/ml son HDM203B, HDM201,
HDM205, HDM203A y HDM202, y (las SEC ID Nº: 83, 80, 85, 82 y 81).
HDM203A y 203B son variantes de la misma secuencia con 203B
modificado de tal manera que una serina sustituye a una cisteína
(en el tercer resto del extremo C) para lograr una mejor capacidad
de fabricación y estabilidad. Por lo tanto, una combinación
preferida de péptidos debería comprender al menos uno de estos
péptidos o una variante de los mismos.
Los siguientes péptidos más potentes son HDM09A,
HDM03D, HDM03E, HDM101, HDM101A, HDM101B (SEC ID Nº: 5, 51, 52, 72,
73 y 74). Una combinación peptídica preferida puede comprender,
típicamente, al menos un péptido adicional seleccionado de este
grupo. De este grupo, HDM03D y HDM03E, son variantes de secuencia
entre sí sustituyendo la serina y el ácido aminobutírico
(respectivamente) por cisteína (en el quinto resto del extremo C de
la secuencia nativa de Der p 1) para lograr una mejor capacidad de
fabricación y la estabilidad. Estas Secuencias se consideran
equivalentes.
También se consideran adecuadas otras variantes
de HDM03, concretamente, HDM03V y HDM03W (SEC ID Nº: 100 y 101).
Estas variantes son fragmentos que comprende un truncamiento hasta
los últimos once o diez (respectivamente) restos C terminal del
HDM03D. Estos péptidos no se incluyen en el ensayo descrito
anteriormente, pero en los ensayos se consideran por lo menos
equivalentes a HDM03D (datos no presentados).
HDM101, HDM101A, y HDM101B también son variantes
de secuencias entre sí, teniendo HDM101A una serina y HDM101B un
ácido aminobutírico sustituyendo a una cisteína en HDM101 (tercer
resto del extremo N). Los tres péptidos de la serie HDM101 se
consideran equivalentes, prefiriéndose HDM101A o HDM101B para una
mejor capacidad de fabricación y estabilidad.
Los siguientes péptidos restantes ensayados
tuvieron respuestas en > 25% de los individuos con los que se
realizo el ensayo: HDM01 [Der p1], HDM01A [Der p1], HDM06A [Der p2],
HDM07 [Der p1], HDM19A [Der p2], HDM21A [Der p2], HDM23C [Der p2],
HDM26B [Der p2], HDM35A [Der p7], HDM48 [Der p7], HDM51A [Der f 7],
HDM102A [Der p1], HDM204 [Der p1] y HDM206 [Der p1] (SEC ID Nº.
1,48, 54, 56,57, 9, 62, 63, 65, 21,24, 76, 84 y 86,
respectivamente). Típicamente, una combinación peptídica preferida
puede comprender al menos un péptido adicional seleccionado de este
grupo. Cuando se contempla qué péptidos adicionales se añaden a la
mezcla, deben seleccionarse representantes de este último grupo
preferiblemente de epítopos procedentes de Der p2 y Der p7 ya que
los grupos anteriores están dominados por Der p 1. HDM26B [Der p2]
y HDM35A [Der p7] son particularmente preferidos. Estudios
adicionales (datos no mostrados) demuestran que estos son los
péptidos de mejor rendimiento de Der p 2 y Der p 7,
respectivamente.
La Figura 3 muestra el número de individuos que
responden a una mezcla núcleo de HDM201, HDM202,
HDM203B y HDM205. También se muestra el efecto incremental de añadir HDM03D y HDM101 A, y el efecto incremental adicional de añadir HDM26B y HDM35A. El beneficio de la adición de epítopos del segundo y tercer grupo de péptidos se muestra claramente.
HDM203B y HDM205. También se muestra el efecto incremental de añadir HDM03D y HDM101 A, y el efecto incremental adicional de añadir HDM26B y HDM35A. El beneficio de la adición de epítopos del segundo y tercer grupo de péptidos se muestra claramente.
Es importante destacar que la adición de
péptidos 03D, 26B, 35A, 101A a la mezcla núcleo convierte a 4
individuos no respondedores a respondedores. También es evidente
que la eliminación de uno de los péptidos 201, 202, 203B o 205 de
la mezcla no reduciría el número de respondedores totales a las
mezclas propuestas ya que la mayoría de las personas tienen tres o
cuatro respuestas a este grupo peptídico. Esto se muestra en la
Figura 4, que muestra resultados similares para una mezcla núcleo
de HDM201, HDM203B y HDM205.
Claims (15)
1. Una composición para su uso en la prevención
o tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico por
tolerización que comprende
- (i)
- un polipéptido de HDM203B DLRQMRTVTPIRMQGGSGS, o
- (ii)
- una variante de un polipéptido de acuerdo con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en:
- -
- la secuencia de (i); o
- -
- una secuencia que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de (i) cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo con respecto a la secuencia de (i), o
- (iii)
- una variante de un polipéptido de acuerdo con (i), en la que dicha variante es un polipéptido de 9 a 30 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una secuencia que representa cualquiera de:
- -
- un fragmento de la secuencia de (i); o
- -
- un homólogo de un fragmento de la secuencia de (i),
- \quad
- cuya secuencia puede hacer tolerante a un individuo con respecto a la secuencia de (i) y tiene al menos 9 aminoácidos de longitud y en el que dicho homólogo tiene una homología de al menos el 70% con cualquiera de los 9 aminoácidos contiguos en la secuencia de (i).
2. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende adicionalmente los polipéptidos de
HDM201 ESVKYVQSNGGAI, HDM205 SYYRYVAREQS, HDM03W ELVDSASQHG, o una
variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (ii) o
(iii).
3. La composición de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 que consiste en los polipéptidos de:
o una variante de los mismos como
se define en la reivindicación 1 (ii) o
(iii).
4. La composición como se define en
reivindicación 2 ó 3, en la que el resto de glutamato presente en el
extremo N terminal de los polipéptidos de HDM201 ESVKYVQSNGGAI y/o
HDM03W ELVDSASQHG, se sustituye por piroglutamato.
5. La composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en la que composición:
- a)
- puede hacer tolerante al menos al 50% o al menos al 60% de un panel de individuos alérgicos al ácaro del polvo en la población; y/o
- b)
- comprende al menos un polipéptido adicional hasta un total de trece polipéptidos únicos/diferentes, en el que los polipéptidos adicionales:
- -
- comprenden una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con al menos 9 aminoácidos contiguos o más, en cualquiera de las SEC ID Nº: 1 a 104, como se muestra en las Tablas 4 a 6 y 8, que no se encuentran entre los polipéptidos ya seleccionados; y
- -
- tienen una longitud de 9 a 30, 9 a 20 o de 13 a 17 aminoácidos; y/o
- c)
- comprenden un máximo de hasta trece polipéptidos.
6. La composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en la que uno o más de los
polipéptidos tiene una o más modificaciones seleccionadas de las
siguientes:
- (i)
- acetilación N terminal;
- (ii)
- amidación C terminal;
- (iii)
- uno o más hidrógenos en las aminas de cadena lateral de la arginina y/o lisina está sustituido por un grupo metileno;
- (iv)
- glicosilación, y
- (v)
- fosforilación.
7. La composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores en la que al menos uno de los
péptidos se ha modificado por ingeniería genética para ser soluble,
de manera que comprende:
- i)
- N terminal para los restos del péptido que flanquean un epítopo de linfocitos T:
- \quad
- de uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los de dos a seis aminoácidos contiguos inmediatamente a la posición N terminal en relación con dichos restos en la secuencia de la proteína de la cual deriva el péptido; o
- ii)
- C terminal para los restos del péptido que flanquean un epítopo de linfocitos T:
- \quad
- de uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los de uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente a la posición C terminal en relación con dichos restos en la secuencia de la proteína de la cual deriva el péptido; o
- iii)
- en ambas N y C terminal para los restos del péptido que flanquean un epítopo de linfocitos T, al menos un aminoácido seleccionado de arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato,
en la que el polipéptido tiene una solubilidad
de al menos 3,5 mg/ml y el epítopo de linfocitos T tiene una
solubilidad inferior a 3,5 mg/ml; y/o
en la que al menos uno de los péptidos se ha
modificado por ingeniería genética para ser soluble, de
manera
que:
que:
- iv)
- cualquier resto de cisteína en la secuencia nativa del péptido se sustituye por serina o ácido 2-aminobutírico; y/o
- v)
- cualquier resto hidrófobo en los hasta tres aminoácidos en el extremo N o C de la secuencia nativa del péptido, no comprendido en un epítopo del linfocito T, se deleciona; y/o
- vi)
- cualquiera de los dos aminoácidos consecutivos que comprenden la secuencia Asp-Gly en los hasta cuatro aminoácidos en el extremo N o C de la secuencia nativa del péptido, no comprendidos en un epítopo del linfocito T, se deleciona.
8. La composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores en la que cada polipéptido tiene
una concentración en el intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml, de 0,3 a
200 nmol/ml o de 30 a 120 nmol/ml.
9. Una composición o vector para su uso en la
prevención o tratamiento de la alergia de los ácaros del polvo por
tolerización, en el que en lugar de cualquiera de los polipéptidos,
como se define en las reivindicaciones 1 a 5, existe un
polinucleótido que puede expresar dicho polipéptido, en la que la
composición o el vector comprende, opcionalmente, de cuatro a trece
secuencias polinucleotídicas diferentes que codifican, cada una, un
polipéptido dife-
rente.
rente.
10. Un producto que contiene de 4 a 13
polipéptidos, incluyendo un polipéptido de la composición de la
reivindicación 1, en el que cada polipéptido diferente es para el
uso simultáneo, por separado o secuencial en la prevención o
tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo doméstico por
tolerización, en el que el producto, opcionalmente, incluye además
los polipéptidos de la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5.
11. Un polipéptido de HDM203B
DLRQMRTVTPIRMQGGSGS, o una variante del mismo, como se define en la
reivindicación 1 (ii) ó (iii).
12. Una formulación farmacéutica para su uso en
la prevención o tratamiento de la alergia a los ácaros del polvo
por tolerización que comprende una composición o un vector de
acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 o un producto de
acuerdo con la reivindicación 10; y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable, en el que, opcionalmente, la
composición, el vector o el producto se formulan para la
administración oral, nasal, epicutánea, subcutánea, sublingual,
intradérmica, bucal, por inhalación o por inyección.
13. La composición como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9 o el producto como se define en la
reivindicación 10, que adicionalmente comprende un alérgeno
polipeptídico adicional, para su uso para hacer tolerante a un
individuo con respecto al alérgeno polipeptídico adicional.
14. Un método in vitro para determinar si
los linfocitos T reconocen un polipéptido como se define en la
reivindicación 1, que comprende poner en contacto dichos linfocitos
T con dicho polipéptido y detectar si dicho polipéptido estimula a
dichos linfocitos T.
15. Un método in vitro para determinar si
un individuo presenta o corre el riesgo de presentar una afección
en la que la afección se caracteriza por síntomas de alergia
en respuesta a un alérgeno del ácaro del polvo doméstico,
comprendiendo el método determinar mediante ensayo si el individuo
presenta linfocitos T que responden a una composición como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, lo que permite
determinar si el individuo presenta o está en riesgo de presentar
la afección; en el que, opcionalmente, se mide una respuesta de los
linfocitos T con respecto a dicha composición poniendo la
composición en contacto con los linfocitos T presentes en una
muestra extraída del sujeto, en condiciones que permitan que la
composición y los linfocitos T interaccionen; y determinando si
algunos de los linfocitos T se estimulan o no y determinando, por lo
tanto, si existe o no una respuesta inmunitaria por los linfocitos
T.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0715949 | 2007-08-15 | ||
| GB0715949A GB0715949D0 (en) | 2007-08-15 | 2007-08-15 | Peptide with improved solubility |
| GB0716224 | 2007-08-20 | ||
| GB0723337 | 2007-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2353362T3 true ES2353362T3 (es) | 2011-03-01 |
Family
ID=38566457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES08788348T Active ES2353362T3 (es) | 2007-08-15 | 2008-08-15 | Péptidos para insensibilización contra alergenos. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2353362T3 (es) |
| GB (1) | GB0715949D0 (es) |
-
2007
- 2007-08-15 GB GB0715949A patent/GB0715949D0/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-08-15 ES ES08788348T patent/ES2353362T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB0715949D0 (en) | 2007-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6040207B2 (ja) | アレルゲンに対する脱感作のためのペプチド | |
| ES2353360T3 (es) | Combinaciones de péptidos para vacunas contra la alergia a los gatos. | |
| ES2378870T3 (es) | Vacuna que comprende péptidos Amb a 1 para uso en el tratamiento de alergia a ambrosía | |
| ES2573651T3 (es) | Péptidos para vacunas contra la alergia al abedul | |
| DK2393830T3 (en) | Grass peptides for vaccine | |
| ES2353362T3 (es) | Péptidos para insensibilización contra alergenos. | |
| AU2013203568B2 (en) | Peptides for desensibilization against allergens |