ES2378870T3 - Vacuna que comprende péptidos Amb a 1 para uso en el tratamiento de alergia a ambrosía - Google Patents

Vacuna que comprende péptidos Amb a 1 para uso en el tratamiento de alergia a ambrosía Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende: (i) al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW03B (RDLLENGAIFLPSG; SEC ID Nº: 9), RGW03A (DVFENGAIFVPSG; SEC ID Nº: 8) o RGW03 (KDLLENGAIFVTSG; SEC ID Nº: 7) o una variante de los mismos; (ii) al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW01 (GMIKSNDGPPI; SEC ID Nº: 1), RGW01A (GLIKSHDGPPV; SEC ID Nº: 2) o RGW01B (GLIKSNDGPAA; SEC ID Nº: 3) o una variante de los mismos; (iii) al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW04 (KAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 10) o RGW04A (SAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 11) o una variante de los mismos; y (iv) opcionalmente al menos un polipéptido original seleccionado entre cualquiera de SEC ID Nº: 4-6 y 12-31 o una variante de los mismos; en la que dichas variantes de (i) a (iv) son: (a) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en: - la secuencia de péptido original equivalente; o - una secuencia homóloga que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con la secuencia de péptido original equivalente, secuencia que es capaz de inducir inmunotolerancia en un individuo a la secuencia de péptido original equivalente, o (b) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una secuencia que representa: - un fragmento de al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia peptídica original equivalente; o - un homólogo de dicho fragmento que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con dichos al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia peptídica original equivalente, secuencia que es capaz de inducir inmunotolerancia en un individuo a la secuencia peptídica original equivalente, para su uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia

Description

Vacuna que comprende péptidos Amb a 1 para uso en el tratamiento de alergia a ambrosía
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para prevenir o tratar alergia a ambrosía.
Antecedentes de la invención
El reconocimiento de antígeno de células T requiere que las células presentadoras de antígeno (CPA) presenten fragmentos de antígeno (péptidos) en su superficie celular en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Las células T usan sus receptores de células T específicos de antígeno (TCR) para reconocer los fragmentos de antígeno presentados por las CPA. Tal reconocimiento actúa como un desencadenante del sistema inmune para generar una diversidad de respuestas para erradicar el antígeno que se ha reconocido.
El reconocimiento de antígenos externos por el sistema inmune de un organismo, tal como el hombre, puede en algunos casos dar como resultado enfermedades, conocidas como afecciones atópicas. Los ejemplos de estas últimas son las enfermedades alérgicas incluyendo asma, dermatitis atópica y rinitis alérgica. En este grupo de enfermedades, los linfocitos B generan anticuerpos de la clase IgE (en seres humanos) que se unen a antígenos obtenidos externamente, que se denominan en este contexto alérgenos ya que estas moléculas provocan una respuesta alérgica. La producción de IgE específica de alérgeno es dependiente de linfocitos T que también se activan por (son específicos para) el alérgeno. Los anticuerpos de IgE específicos de alérgenos se unen a la superficie de células tales como basófilos y mastocitos debido a la expresión por estas células de receptores de superficie para IgE.
El entrecruzamiento de moléculas de IgE unidas a superficie por alérgenos da como resultado la desgranulación de estas células efectoras causando la liberación de mediadores inflamatorios tales como histamina, 5-hidroxitriptamina y mediadores lipídicos tales como los sulfidoleucotrienos. Además de los acontecimientos dependientes de IgE, determinadas enfermedades alérgicas tales como asma se caracterizan por acontecimientos independientes de IgE.
Las enfermedades alérgicas mediadas por IgE actualmente se tratan con agentes que proporcionan alivio o prevención sintomática. Los ejemplos de tales agentes son antihistaminas, agonistas 12 y glucocorticoides. Adicionalmente, algunas enfermedades mediadas por IgE se tratan mediante procedimientos de desensibilización que implican la inyección periódica de componentes o extractos de alérgeno. Los tratamientos de desensibilización pueden inducir una respuesta de IgG que compite con IgE por el alérgeno o los mismos pueden inducir células T supresoras específicas que bloquean la síntesis de IgE dirigida frente al alérgeno. Esta forma de tratamiento no siempre es eficaz y comporta el riesgo de provocar efectos secundarios graves, particularmente choque anafiláctico general. Esto puede ser fatal a menos que se reconozca inmediatamente y se trate con adrenalina. Un tratamiento terapéutico que disminuiría o eliminaría la respuesta inmune alérgica indeseada a un alérgeno particular, sin alterar la reactividad inmune a otros antígenos extraños o desencadenar una respuesta alérgica él mismo sería de gran beneficio para los individuos alérgicos.
Los alérgenos de ambrosía se reconocen universalmente como una causa principal de enfermedades alérgicas en seres humanos y animales, incluyendo asma, rinitis alérgica y dermatitis alérgica. El documento WO 96/13589 describe péptidos de los alérgenos de proteína principales de polen de ambrosía corto y métodos de tratamiento y diagnóstico de sensibilidad a alérgenos de polen de ambrosía. Las proteínas presentes en el polen de ambrosía son particularmente importantes. Por ejemplo, aproximadamente el 75% de aquellos que sufren de fiebre del heno en los Estados Unidos son alérgicos al polen de ambrosía. Fiebre del heno es el término común para una forma de alergia estacional caracterizada por estornudos, mucosidad y picazón de ojos. El término “fiebre del heno” surgió debido a que esta forma de enfermedad alérgica es más frecuente durante la “temporada del heno” que corresponde con la época de floración de muchas plantas, que es cuando las mismas liberan las cantidades más elevadas de polen. Esto es particularmente frecuente desde el final del verano hasta el principio del otoño, típicamente desde el final de junio hasta el final de septiembre (en el Hemisferio Norte).
Se ha calculado que para adultos en los Estados Unidos, la fiebre del heno es la 5ª enfermedad principal crónica y una causa principal de ausentismo laboral, que da como resultado cerca de 4 millones de días laborales de ausencia
o perdidos cada año, dando como resultado un coste total de más de 700 millones de dólares en pérdida de productividad total. Las alergias son la afección crónica más frecuentemente informada en niños, limitando las actividades de más del 40% de ellos. Cada año, las alergias provocan más de 17 millones de visitas ambulatorias al médico en los Estados Unidos; las alergias estacionales tales como la fiebre del heno representan más de la mitad de estas visitas por alergia.
Por lo tanto, un tratamiento terapéutico o preventivo sería de gran beneficio para seres humanos que sufren o que están en riesgo de sufrir alergia a ambrosía.
Sumario de la invención
La alergia a ambrosía está causada típicamente por ambrosía Común (Ambrosia artemisiifolia). El alérgeno principal en el polen de ambrosía es Amb a 1. Esta proteína existe como varias isoformas diferentes, Amb a 1.1, 1.2, 1.3 y
1.4.
Los presentes inventores han descubierto que determinadas combinaciones de fragmentos peptídicos obtenidos a partir de las proteínas Amb a 1 son particularmente útiles para la desensibilización de individuos a estos alérgenos. Las combinaciones de polipéptidos de la invención se han seleccionado por su capacidad de unirse a muchas moléculas del CMH de Clase II, por ser altamente solubles, por no desencadenar liberación de histamina a partir de basófilos extraídos a partir de un panel de individuos alérgicos a la ambrosía y por inducir una respuesta de citoquina en una proporción elevada de sujetos a partir de un panel de individuos alérgicos a ambrosía. Por lo tanto, las composiciones, productos, vectores y formulaciones de la invención se pueden proporcionar a individuos para prevenir o tratar alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
Los péptidos de la invención se seleccionaron como epítopos de células T potenciales a través de métodos in silico. Cuando se identificaron las regiones que contenían epítopos, las mismas se analizaron adicionalmente para determinar cuáles de ellas estaban altamente conservadas entre las cuatro isoformas diferentes de Amb a 1. Estos polipéptidos candidatos después se seleccionaron adicionalmente para uso potencial en inducción de inmunotolerancia. Más específicamente, los mismos se analizaron para determinar características de solubilidad y la capacidad de inducir liberación de citoquina a partir de PBMC obtenidas de individuos alérgicos a ambrosía. En algunos casos, las secuencias peptídicas se sometieron a ingeniería genética para mejorar la solubilidad y/o reducir la formación de dímeros.
Una dificultad asociada con los enfoques de desensibilización basados en inmunización peptídica estriba en cómo seleccionar un tamaño apropiado y región del alérgeno como la base del péptido que se tiene que usar para la inmunización. El tamaño del péptido de elección es crucial. Si el péptido es demasiado pequeño, la vacuna no será eficaz para inducir una respuesta inmunológica. Si los péptidos son demasiado grandes o si el antígeno completo se introduce en un individuo, existe el riesgo de inducir reacciones adversas, tales como anafilaxis, que pueden ser fatales. Este riesgo puede ser mayor si los péptidos son poco solubles.
Los polipéptidos de la invención se han seleccionado para conservar especificidad de células T a la vez que tienen un tamaño lo suficientemente pequeño para no poseer una estructura terciaria significativa que les posibilitaría conservar la conformación de un epítopo de unión a IgE de la molécula completa. Por lo tanto, los polipéptidos de la invención no inducen entrecruzamiento significativo de moléculas de IgE específicas adyacentes en células tales como mastocitos y basófilos y han demostrado que no causan liberación de histamina significativa a partir de basófilos humanos.
Una ventaja de la invención es la capacidad de los péptidos de dirigirse ampliamente a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH). Los receptores de células T (TCR) son altamente variables en su especificidad. La variabilidad se genera, al igual que con las moléculas de anticuerpo, a través de acontecimientos de recombinación genética dentro de la célula. Los TCR reconocen antígenos en forma de péptidos cortos unidos a moléculas codificadas por los genes del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH). Estos productos génicos son las mismas moléculas que dan origen a “tipos de tejido” usados en trasplante y también se denominan moléculas de Antígeno de Leucocitos Humano (HLA), términos que se pueden usar de forma intercambiable. Las moléculas del CMH individuales poseen ranuras de unión a péptido las cuales, debido a su forma y carga son capaces de unirse únicamente a un grupo limitado de péptidos. Los péptidos unidos por una molécula del CMH pueden no necesariamente unirse por otras moléculas del CMH.
Cuando una molécula de proteína tal como un antígeno o alérgeno se capta por células presentadoras de antígeno tales como linfocitos B, células dendríticas, monocitos y macrófagos, la molécula se degrada enzimáticamente dentro de la célula. El proceso de degradación da origen a fragmentos peptídicos de la molécula que, si son del tamaño, carga y forma apropiados, se pueden unir dentro de la ranuras de unión a péptido de determinadas moléculas del CMH y presentarse posteriormente sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno. Si los complejos péptido/CMH están presentes en la superficie de las células presentadoras de antígeno en números suficientes los mismos pueden después activar células T que portan los receptores de células T específicos de péptido/CMH apropiados.
Debido a la naturaleza polimórfica del CMH, los individuos en una población no consanguínea tal como el hombre expresarán diferentes combinaciones de moléculas del CMH en sus superficies celulares. Debido a que las moléculas del CMH diferentes se pueden unir a péptidos diferentes de la misma molécula en base al tamaño, la carga y la forma del péptido, diferentes individuos presentarán un repertorio diferente de péptidos unidos a sus moléculas del CMH. La identificación de epítopos de péptidos de unión a CMH universales en una población no consanguínea tal como el hombre es más difícil que en animales endogámicos (tales como determinadas cepas de ratones de laboratorio). En base a la expresión del CMH diferencial entre individuos y las diferencias intrínsecas en la unión y presentación de péptido que esto presenta, es poco probable que un péptido único se pueda identificar que será útil para la terapia de desensibilización en el hombre.
Otra ventaja de la invención es la selección de péptidos y combinaciones peptídicas en base a las respuestas observadas en PBMC aisladas recientemente a partir de individuos alérgicos a ambrosía. A diferencia de escenarios de artefacto donde se establecen líneas de células clonales a partir de pacientes alérgicos con el fin de ensayar las respuestas de células T, la evaluación de respuestas ex vivo de PBMC aisladas recientemente permite una visión representativa de la importancia de población relativa de diferentes péptidos sin distorsión potencial inducida por el proceso de cultivo.
Sin embargo, las combinaciones de péptidos de la invención proporcionan una amplia cobertura de eficacia sobre la población humana dirigiéndose a múltiples moléculas del CMH diferentes. Esta cobertura amplia se ilustra mediante la capacidad de combinaciones de péptidos de la invención de provocar una respuesta de citoquina positiva en muchos individuos dentro de la población. Una vacuna formulada con los péptidos de la invención tendría por lo tanto una utilidad amplia.
El trabajo de los inventores ha producido combinaciones de péptidos con las siguientes características:
-
la combinación induce una respuesta de citoquina en una proporción elevada de sujetos a partir de un panel de individuos alérgicos a ambrosía
-
los péptidos de las combinaciones son solubles
-
los péptidos de las combinaciones no inducen liberación de histamina significativa en un panel de individuos alérgicos a ambrosía.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición que comprende:
(i)
al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW03B (RDLLENGAIFLPSG; SEC ID Nº: 9), RGW03A (DVFENGAIFVPSG; SEC ID Nº: 8) o RGW03 (KDLLENGAIFVTSG; SEC ID Nº: 7) o una variante de los mismos;
(ii)
al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW01 (GMIKSNDGPPI; SEC ID Nº: 1), RGW01A (GLIKSHDGPPV; SEC ID Nº: 2) o RGW01B (GLIKSNDGPPA; SEC ID Nº: 3) o una variante de los mismos;
(iii) al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW04 (KAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 10) o RGW04A (SAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 11) o una variante de los mismos; y
(iv) opcionalmente al menos un polipéptido original seleccionado entre cualquiera de SEC ID Nº: 4-6 y 12-31 o una variante del mismo;
en la que dichas variantes de (i) a (iv) son:
(a) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en:
-
la secuencia peptídica original equivalente; o
-
una secuencia homóloga que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con la secuencia peptídica original equivalente, secuencia que es capaz de inducir la inmunotolerancia en un individuo a la secuencia peptídica original equivalente, o
(b) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una secuencia que representa:
-
un fragmento de al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia peptídica original equivalente; o
-
un homólogo de dicho fragmento que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con dichos al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia peptídica original equivalente,
secuencia que es capaz de inducir la inmunotolerancia en un individuo a la secuencia peptídica original equivalente, para su uso en la prevención o el tratamiento de la alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la proporción de individuos sensibles a diferentes combinaciones peptídicas de la invención
medida mediante la producción de IL-13 o IFN-gamma.
La Figura 2 muestra la producción promedio de IL-10 (pg/ml) por PBMC a partir de individuos alérgicos a
ambrosía cuando se estimulan con diferentes péptidos de la invención.
La Figura 3 muestra el nivel de IL-10 (pg/ml) producido por PBMC a partir de individuos alérgicos a
ambrosía cuando se estimulan con diferentes combinaciones peptídicas.
Descripción de las secuencias mencionadas en el presente documento
SEC ID Nº: 1 a 31 proporcionan secuencias polipeptídicas usadas en la invención. SEC ID Nº: 32 en adelante proporcionan secuencias adicionales.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a combinaciones de péptidos que se pueden usar en inducción de inmunotolerancia. Tales combinaciones peptídicas se basan en péptidos que pueden comprender, consistir en o que consisten básicamente en las secuencias mostradas en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. También se pueden usar las variantes de estos péptidos específicos. Las variantes pueden comprender, consistir en o consisten básicamente en secuencias que son fragmentos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 u homólogos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.
En una realización la invención se refiere a una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía. La composición típicamente comprende o consiste en al menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce polipéptidos, hasta un máximo de trece. En otras palabras, la composición comprende entre cuatro y trece polipéptidos. Los polipéptidos se seleccionan independientemente como se ha descrito anteriormente.
La invención también proporciona productos y formulaciones que comprenden los polipéptidos de la invención y composiciones y productos que comprenden polinucleótidos capaces de expresar las combinaciones de polipéptidos de la invención para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia. Tal inducción de inmunotolerancia típicamente será a un epítopo (por ejemplo, un epítopo del CMH de clase II) presente en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.
En una realización, la invención proporciona una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia que comprende:
(i)
al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW03B (RDLLENGAIFLPSG; SEC ID Nº: 9), RGW03A (DVFENGAIFVPSG; SEC ID Nº: 8) o RGW03 (KDLLENGAIFVTSG; SEC ID Nº: 7) o una variante de los mismos;
(ii)
al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW01 (GMIKSNDGPPI; SEC ID Nº: 1), RGW01A (GLIKSHDGPPV; SEC ID Nº: 2) o RGW01B (GLIKSNDGPPA; SEC ID Nº: 3) o una variante de los mismos;
(iii) al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW04 (KAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 10) o RGW04A (SAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 11) o una variante de los mismos; y
(iv) opcionalmente uno o más polipéptidos originales seleccionados independientemente entre cualquiera de SEC ID Nº: 4-6 y 12-31 o variantes de los mismos;
en la que dichas variantes son:
(a) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en:
-
la secuencia peptídica original equivalente; o
-
una secuencia homóloga que tiene una homología de al menos el 65% con la secuencia peptídica original equivalente,
secuencia que es capaz de inducir inmunotolerancia en un individuo a la secuencia peptídica original equivalente o
(b) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una secuencia que representa:
-
un fragmento de la secuencia peptídica original equivalente; o
-
un homólogo de un fragmento de la secuencia peptídica original equivalente,
secuencia que es capaz de inducir inmunotolerancia en un individuo a la secuencia peptídica original equivalente y que tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos y en la que dicho homólogo tiene una homología de al menos el 65% con cualquiera de 9 aminoácidos contiguos en la secuencia peptídica original equivalente.
Especies de ambrosía
Las especies de ambrosía Ambrosia artemisiifolia (ambrosía común) y en un menor alcance Ambrosia trifida (ambrosía gigante), son responsables de una alta proporción de alergia a la ambrosía en el mundo entero, particularmente alergias asociadas con polen de ambrosía, tal como la fiebre del heno. La ambrosía común es nativa de Norteamérica, pero se ha extendido a casi todos los continentes del mundo entero. La ambrosía florece en el hemisferio norte desde principios de julio-mediados de agosto o hasta que llega el tiempo más frío. La ambrosía es una planta pionera que está bien adaptada a la colonización de suelo disturbado recientemente. Aunque en hábitats naturales está limitada con frecuencia por competición con otras plantas, en áreas en las que los humanos han limpiado la vegetación existente, la ambrosía rápidamente se establece ampliamente y de forma agresiva. Por tanto, la ambrosía es muy abundante en vías rurales, líneas de vallas, terrenos baldíos, excavaciones nuevas, campos cultivados, jardines y prados mal mantenidos. Por lo tanto, está bien adaptada a una amplia diversidad de climas, puede tolerar un intervalo de pH del suelo amplio (desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 8,5) y también es resistente a salinidad elevada.
Fragmentos peptídicos de alérgenos de polen de ambrosía
El alérgeno principal en el polen de ambrosía es Amb a 1. Esta proteína existe como varias isoformas diferentes, Amb a 1.1, 1.2, 1.3 y 1.4. Estas isoformas se exponen en su totalidad en el Ejemplo 1. Los presentes inventores han identificado las regiones en Amb a 1 que comprenden epítopos de células T de unión a CMH de Clase II y que están altamente conservados entre isoformas (véase el análisis en el Ejemplo 1). En base a esta información, los péptidos obtenidos a partir de las regiones pertinentes de Amb a 1 son adecuados para prevenir o tratar alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia a todas las isoformas de Amb a 1.
Los términos “péptido” y “polipéptido” se usan de forma intercambiable en el presente documento. Las proteínas anteriores también se denominan en el presente documento “los alérgenos”.
Las Tablas 3, 4 y 6 exponen las secuencias de péptidos de la invención, indicando, cuando es apropiado, la proteína parental a partir de la cual se obtiene cada péptido.
Combinaciones peptídicas
La composición típicamente comprende una combinación de al menos tres polipéptidos diferentes de la invención, hasta un máximo de trece polipéptidos diferentes. Por consiguiente, la composición de la invención puede consistir en tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce y trece péptidos.
Las combinaciones de polipéptidos en la composición de la invención se seleccionan para proporcionar una cobertura amplia de la población humana hasta donde sea posible, es decir, la composición de la invención producirá una respuesta inmune en una proporción elevada de individuos alérgicos a ambrosía, preferentemente más del 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 60% o el 70% de individuos alérgicos a ambrosía en un panel o población de tales individuos. El número de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía puede ser cualquier número adecuado, típicamente al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o al menos 100 individuos. Preferentemente la población tiene frecuencias alélicas del CMH dentro del intervalo de frecuencias que son ilustrativas de la población caucásica. Las frecuencias alélicas de la población de referencia para 11 familias alélicas de DRB1 comunes se muestran en la Tabla 1 (Datos de HLA Facts Book, Parham and Barber).
La composición de la invención comprende:
-
al menos un polipéptido seleccionado entre un polipéptido de RGW01, RGW01A o RGW01B o una variante de los mismos; y
-
al menos un polipéptido seleccionado entre un polipéptido de RGW03, RGW03A o RGW03B o una variante de los mismos; y
-
al menos un polipéptido seleccionado entre un polipéptido de RGW04 o RGW04A (también denominado RGW4A) o una variante de los mismos.
Opcionalmente, la composición puede comprender adicionalmente al menos un polipéptido adicional seleccionado entre un polipéptido de cualquiera de RGW02, RGW09, RGW06 o RGW06A, RGW10, RGW10A, RGW05 o RGW05A o una variante de los mismos.
Opcionalmente, la composición puede comprender adicionalmente al menos un polipéptido adicional seleccionado entre un polipéptido de cualquiera de RGW07, RGW07C, RGW07D o una variante de los mismos. El al menos un polipéptido adicional es preferentemente un polipéptido de RGW07D o una variante del mismo.
Más específicamente, en una realización, la invención proporciona por lo tanto una composición que comprende entre tres y trece polipéptidos, que consisten en:
a) al menos uno de los polipéptidos de RGW01, RGW01A o RGW01B o una variante de los mismos, preferentemente RGW01; y b) al menos uno de los polipéptidos de RGW03, RGW03A o RGW03B o una variante de los mismos, preferentemente RGW03B; y c) al menos uno de los polipéptidos de cualquiera de RGW04 o RGW04A o una variante de los mismos, preferentemente RGW04A; y opcionalmente d) al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente tres de los polipéptidos de cualquiera de RGW02,
RGW09, RGW06, RGW06A, RGW10, RGW10A, RGW05 o RGW05A o una variante de los mismos, preferentemente RGW02 y/o RGW06A y/o RGW05; y opcionalmente e) al menos uno de los polipéptidos de cualquiera de RGW07, RGW07C, RGW07D o una variante de los mismos, preferentemente RGW07D.
5 En otras palabras, una realización específica de la invención proporciona una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia que comprende entre tres y trece secuencias peptídicas, en la que la composición consiste en:
10 a) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:
RGW01 GMIKSNDGPPI; RGW01A GLIKSHDGPPV; RGW01B GLIKSNDGPAA;
o una variante de los mismos, y; 15 b) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:
RGW03 KDLLENGAIFVTSG; RGW03A DVFENGAIFVPSG; RGW03B RDLLENGAIFLPSG;
o variantes de los mismos y; c) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:
20 RGW04 KAGMIPAEPGEA RGW4A SAGMIPAEPGEA;
o variantes de los mismos y opcionalmente; d) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:
25 RGW02 GSSQIWIDHSSLSKS;
RGW04 KAGMIPAEPGEA;
RGW4A SAGMIPAEPGEA;
RGW06 VVNSDKTIDGRGVKVE;
RGW06A AINNDKTIDGRGAKVE;
RGW09 ETRRSLKTSGAYN;
RGW10 FGFFQVVNNNYD;
RGW10A HGFFQVVNNNYD;
RGW05 KEGTLRFAAAQNRP;
RGW05A KEGTLRFGAAQNRP;
o variantes de los mismos y opcionalmente; e) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:
RGW07 GEAAIKLTSSAGVLS; RGW07C KGEAAIKLTSSAGVLSK; RGW07D KGEAAIKLTSSAGVLSKK;
o variantes de los mismos.
Se apreciará que (a) a (e) anteriormente representan criterios rigurosos y altamente selectivos para la identificación de combinaciones adecuadas de la invención. Por ejemplo, si se seleccionan seis péptidos aleatoriamente a partir
35 de las secuencias de la invención habría cerca de un millón de combinaciones posibles para elegir. Por el contrario, es útil considerar un ejemplo de una combinación de seis polipéptidos en la cual se aplican los criterios anteriores. Por ejemplo, considerar una combinación en la que se seleccionan los siguientes polipéptidos:
i) uno cualquiera de los polipéptidos de RGW01, RGW01A o RGW01B y uno cualquiera de los polipéptidos de RGW03, RGW03A o RGW03B y uno cualquiera de los polipéptidos de RGW04 y RGW04A; y ii) tres polipéptidos adicionales seleccionados entre los polipéptidos de cualquiera de RGW02, RGW09, RGW06, RGW06A, RGW10, RGW10A, RGW05 o RGW05A; y finalmente
En base a una selección de este tipo, el número de combinaciones posibles representa una fracción de minuto de las combinaciones disponibles totales si los criterios determinados por los inventores no se aplican.
En base a lo anterior, una combinación particularmente preferida de la invención comprende o consiste en los polipéptidos de RGW01, RGW03B, RGW04A, RGW02, RGW05 y RGW06A o variantes de los mismos.
Una combinación preferida adicional comprende o consiste en los polipéptidos de RGW01, RGW03B, RGW04A, RGW02, RGW05, RGW06A y RGW07D.
Sujeto a lo anterior, la composición puede comprender opcionalmente polipéptidos adicionales hasta un total de trece polipéptidos únicos. Estos polipéptidos adicionales están relacionados con (es decir, son típicamente homólogos y/o fragmentos de) las otras secuencias, es decir SEC ID Nº: 1 a 31, que no están entre los polipéptidos ya seleccionados. Los péptidos adicionales son típicamente variantes funcionales de uno de los péptidos de SEC ID Nº: 1 a 31. Los polipéptidos adicionales pueden ser idénticos a cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Por lo tanto, la composición puede comprender hasta trece polipéptidos diferentes proporcionados en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a
31. Sin embargo, los polipéptidos adicionales opcionales no necesitan ser el 100% idénticos a cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Los mismos son al menos el 65% idénticos a al menos 9 (por ejemplo al menos 10, 11, 12 ó 13) o más aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31, no seleccionados previamente entre el polipéptido o polipéptidos seleccionados previamente. Estos aminoácidos contiguos pueden comprender un epítopo del CMH de clase II, por ejemplo que se una a cualquiera de las moléculas del CMH mencionadas en el presente documento. En otras palabras, la composición puede comprender opcionalmente polipéptidos adicionales hasta un total de trece polipéptidos únicos, en los que los polipéptidos adicionales:
(i)
comprenden una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 anteriores no seleccionados en (a) a (e) anteriormente; y
(ii)
tienen de 9 a 20 aminoácidos de longitud.
en la que cada polipéptido diferente es para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
Por lo tanto, con más detalle la invención proporciona un producto que contiene entre tres y trece polipéptidos como se define en (a) a (e) anteriormente; y opcionalmente:
(f)
Un polipéptido:
(i)
que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 no seleccionados en a) a d) anteriormente; y
(ii)
que tiene de 9 a 20 aminoácidos de longitud; y opcionalmente (g) Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) anteriormente; y opcionalmente
(h)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a g) anteriormente; y opcionalmente
(i)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a h) anteriormente; y opcionalmente
(j)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a i) anteriormente; y opcionalmente
(k)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a j) anteriormente; y opcionalmente
(l)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a k) anteriormente; y opcionalmente
(m)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a l) anteriormente; y opcionalmente
(n)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a m) anteriormente; y opcionalmente
(o)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a n) anteriormente; y opcionalmente
(p)
Un polipéptido como se define en f), pero adicionalmente no seleccionado en f) a o) anteriormente para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
Las composiciones o productos de la invención pueden comprender variantes de cualquiera de las secuencias definidas anteriormente. La variante típicamente comprende 1, 2, 3 o más de los epítopos del CMH de clase II presentes en el péptido correspondiente de SEC ID Nº: 1 a 31.
Las variantes funcionales se mencionan en el presente documento. Tales variantes pueden ser capaces de inducir inmunotolerancia en un individuo a un epítopo del CMH de clase II presente en el péptido correspondiente de SEC ID Nº: 1 a 31 y por tanto comprenderá típicamente una secuencia que se une a la misma molécula del CMH de clase II y/o se reconoce por una célula T que reconoce el epítopo correspondiente en el polipéptido de SEC ID Nº: 1 a 31.
Las variantes de SEC ID Nº: 1 a 31 pueden ser fragmentos obtenidos mediante truncamiento. El truncamiento se refiere a la eliminación de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos de los extremos N y/o C terminales de un polipéptido de SEC ID Nº: 1 a 31.
Los fragmentos también se pueden generar mediante una o más supresiones internas, con la condición de que el núcleo de 9 aminoácidos que forma el epítopo de la célula T no se altere de forma sustancial.
Por ejemplo, una variante de SEC ID Nº: 1 puede comprender un fragmento de SEC ID Nº: 1, es decir, una secuencia más corta. Ésta puede incluir una supresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez
o más aminoácidos del extremo N terminal de SEC ID Nº: 1 o del extremo C terminal de SEC ID Nº: 1. Tales supresiones se pueden realizar a partir de ambos extremos de SEC ID Nº: 1. Una variante de SEC ID Nº: 1 puede incluir aminoácidos adicionales (por ejemplo a partir de la secuencia de la proteína parental a partir de la cual se obtiene el péptido) que se extienden más allá del extremo o extremos de SEC ID Nº: 1. Una variante puede incluir una combinación de las supresiones y adiciones descritas anteriormente. Por ejemplo, se pueden suprimir aminoácidos a partir de un extremo de SEC ID Nº: 1, pero se pueden añadir aminoácidos adicionales a partir de la secuencia de proteína parental de longitud completa en el otro extremo de SEC ID Nº: 1. El mismo análisis de variantes anteriores también se aplica a SEC ID Nº: 2 a 31.
Un péptido variante puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 o un fragmento de las mismas. Un péptido variante comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Más preferentemente, una variante adecuada puede comprender una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 98% con al menos 9 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Este nivel de identidad de aminoácidos se puede observar en cualquier sección del péptido, aunque preferentemente es en la región del núcleo. El nivel de identidad de aminoácidos es a lo largo de al menos 9 aminoácidos contiguos pero también puede ser de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15 o al menos 16 ó 17 aminoácidos dependiendo del tamaño de los péptidos de comparación. Por consiguiente, cualquiera de los niveles de identidad especificados anteriormente puede ser a través de la longitud completa de la secuencia.
En relación con secuencias de aminoácidos, “identidad de secuencia” se refiere a las secuencias que tienen el valor indicado cuando se evaluó usando ClustalW (Thompson et al, Nucleic Acids Res. 11 de Nov de1994; 22(22): 467380) con los siguientes parámetros:
Parámetros de alineamiento por pares – Método: preciso, Matriz: PAM, Penalización de apertura de hueco: 10,00, Penalización de extensión de hueco: 0,1; Parámetros de alineamiento múltiple – Matriz: PAM, Penalización de apertura de hueco: 10,00, % de identidad por retraso: 30, Penalización de huecos finales: activada, Distancia de separación de hueco: 0, Matriz negativa: no, Penalización de extensión de hueco: 0,20, Penalizaciones de hueco específicas de resto: activada, Penalizaciones de hueco hidrófilo: activada, Restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un resto particular tiene por objeto incluir restos idénticos que simplemente se han derivatizado.
Un péptido variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más o hasta 10 sustituciones de aminoácido a partir de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.
Las variantes de sustitución preferentemente implican el reemplazo de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y la realización de sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, un aminoácido se puede sustituir con un aminoácido alternativo que tiene propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que se pueden usar para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes:
Ala
alifático, hidrófobo, neutro Met hidrófobo, neutro
Cys
polar, hidrófobo, neutro Asn polar, hidrófilo, neutro
Asp
polar, hidrófilo, cargado (-) Pro hidrófobo, neutro
Glu
polar, hidrófilo, cargado (-) Gln polar, hidrófilo, neutro
Phe
aromático, hidrófobo, neutro Arg polar, hidrófilo, cargado (-)
Gly
alifático, neutro Ser polar, hidrófilo, neutro
His
aromático, polar, hidrófilo, cargado (-) Thr polar, hidrófilo, neutro
Ile
alifático, hidrófobo, neutro Val alifático, hidrófobo, neutro
Lys
polar, hidrófilo, cargado (+) Trp aromático, hidrófobo, neutro
Leu
alifático, hidrófobo, neutro Tyr aromático, polar, hidrófobo
Las variantes adicionales incluyen aquellas en las cuales en lugar del aminoácido de origen natural el aminoácido que aparece en la secuencia es un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos usados en las secuencias 5 también se pueden modificar, por ejemplo, marcar, con la condición de que la función del péptido no se afecte negativamente de forma significativa.
Cuando el péptido tiene una secuencia que varía de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 o un fragmento de las mismas, las sustituciones se pueden producir a través de la longitud completa de la secuencia, dentro de la 10 secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 o fuera de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Por ejemplo, las variaciones descritas en el presente documento, tales como adiciones, supresiones, sustituciones y modificaciones, se pueden producir dentro de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Un péptido variante puede comprender o consistir básicamente en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 en la cual se han realizado una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos. Un péptido variante puede
15 comprender un fragmento de la proteína parental que es más grande que cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. En esta realización, las variaciones descritas en el presente documento, tales como sustituciones y modificaciones, se pueden producir dentro y/o fuera de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.
Los péptidos variantes de la invención tienen de 9 a 20 o más preferentemente de 13 a 17 aminoácidos de longitud. 20 Los péptidos pueden ser de la misma longitud que las secuencias peptídicas en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.
Los péptidos se pueden obtener químicamente a partir del alérgeno de polipéptido, por ejemplo mediante escisión proteolítica o se pueden obtener en un sentido intelectual a partir del alérgeno de polipéptido, por ejemplo usando la secuencia de aminoácidos del alérgeno de polipéptido y sintetizando péptidos en base a la secuencia. Los péptidos
25 se pueden sintetizar usando métodos bien conocidos en la técnica.
Cuando los polipéptidos comprenden restos que son típicamente difíciles de conservar durante la preparación, estos restos se pueden reemplazar. Por ejemplo, glutamato forma espontáneamente piroglutamato en solución particularmente cuando está presente en el extremo N de un péptido. Por tanto, los restos de los péptidos de la
30 invención que corresponden a un glutamato o un resto de glutamina en la secuencia de una secuencia de proteína de alérgeno nativa se pueden reemplazar con piroglutamato en los péptidos de la invención cuando un resto de este tipo está presente en el extremo N de un péptido.
El término “péptido” incluye no sólo moléculas en las cuales los restos de aminoácidos se unen mediante enlaces
35 peptídicos (-CO-NH-) sino también moléculas en las cuales el enlace peptídico está invertido. Tales peptidomiméticos retro-inversos se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los que se describen en Meziere et al (1997) J. Immunol. 159.3230-3237. Este enfoque implica preparar pseudopéptidos que contienen cambios que implican a la estructura principal y no la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al (1997) muestran que, al menos para respuestas del CMH de clase II y células T auxiliares,
40 estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlace peptídico CO-NH son mucho más resistentes a la proteólisis.
De forma similar, se puede prescindir del enlace peptídico con todo siempre que se use un resto enlazador apropiado que conserve la separación entre los átomos de carbono del resto de aminoácido; es particularmente 45 preferido si el resto enlazador tiene sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planitud que el enlace peptídico. También se apreciará que el péptido se puede bloquear de forma conveniente en su extremo N o C de forma de ayudar a reducir la susceptibilidad a digestión exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino N terminal de los péptidos se puede proteger sometiéndolo a reacción con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo C terminal del péptido se puede proteger sometiéndolo a reacción con una amina. Otros ejemplos de
50 modificaciones incluyen glicosilación y fosforilación. Otra modificación potencial es que los hidrógenos en las aminas de cadena lateral de R o K se pueden reemplazar con grupos metileno (-NH2 - -NH(Me) o –N(Me)2).
Los análogos de péptidos de acuerdo con la invención también pueden incluir variantes peptídicas que aumentan o disminuyen la semivida del péptido in vivo. Los ejemplos de análogos capaces de aumentar la semivida de péptidos 55 usados de acuerdo con la invención incluyen análogos peptoides de los péptidos, derivados de D-aminoácidos de
los péptidos e híbridos péptido-peptoide. Una realización adicional de los polipéptidos de variante usados de acuerdo con la invención comprende formas de D-aminoácidos del polipéptido. La preparación de polipéptidos usando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos reduce enormemente cualquier degradación indeseada de un agente de este tipo mediante procesos metabólicos normales, reduciendo las cantidades de agente que se necesita administrar, junto con la frecuencia de su administración.
Los péptidos proporcionados por la presente invención se pueden obtener a partir de variantes de corte y empalme de las proteínas parentales codificadas por ARNm generados mediante corte y empalme alternativo de los transcritos primarios que codifican las cadenas de proteína parental. Los péptidos también se pueden obtener a partir de mutantes de aminoácido, variantes de glicosilación y otros derivados covalentes de las proteínas parentales que conservan al menos una propiedad de unión al CMH de los alérgenos. Los derivados ilustrativos incluyen moléculas en las que los péptidos de la invención se modifican covalentemente mediante sustitución, química, enzimática u otro medio apropiado con un resto diferente a un aminoácido de origen natural. Además se incluyen variantes de origen natural de las proteínas parentales encontradas en diferentes ácaros. Una variante de este tipo se puede codificar por una variante alélica o representar una variante de corte y empalme alternativo.
Las variantes como se describen anteriormente se pueden preparar durante la síntesis del péptido o mediante modificación post-producción o cuando el péptido esté en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.
De acuerdo con la invención, los péptidos adicionales que la composición puede comprender preferentemente son variantes funcionales de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Es decir, los péptidos son preferentemente capaces de inducir una respuesta inmune. En particular, los péptidos son preferentemente capaces de inducir producción de citoquina en individuos alérgicos a ambrosía. Típicamente, la composición de la invención comprenderá por lo tanto, al menos un polipéptido o variante del mismo que produce una respuesta de citoquina en más del 45, 50, 55%, preferentemente el 60% o el 65% de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía. El número de individuos en un panel de individuos alérgicos a ambrosía puede ser cualquier número mayor de uno, por ejemplo al menos 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 individuos. Preferentemente la composición comprende al menos dos, tres
o más preferentemente cuatro péptidos de este tipo. Preferentemente la respuesta de citoquina es producción de IL13 o IFN-gamma. La producción de citoquina se puede medir mediante cualquier método adecuado. La producción de una citoquina típicamente se considera que ha ocurrido como respuesta a un péptido si el nivel de citoquina producido en presencia del péptido es al menos 2, 3, 4 ó 5 veces superior al nivel de fondo de dicha citoquina que se produce en la ausencia de un estímulo (es decir, el nivel producido por el mismo individuo en ausencia del péptido o cualquier otro estímulo). Como alternativa, la producción de una citoquina se puede considerar que ha ocurrido si la cantidad de citoquina producida supera un límite reconocido, típicamente 90, 95 o preferentemente 100 !g/ml, típicamente a partir de una muestra de aproximadamente 1,25 x 106 células en 250 !l.
Los métodos adecuados para medir producción de citoquina típicamente incluyen la medición de la liberación de citoquina a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o partir de una muestra tomada de un sujeto. La muestra típicamente es sangre o suero. La liberación de citoquina a partir de PBMC se mide después de incubar las células en presencia de un péptido determinado. Los sobrenadantes de la mezcla de incubación después se ensayan para determinar la presencia de una citoquina, usando cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo de ELISA, ELISPOT o ensayo citométrico de flujo. Los métodos particularmente preferidos incluyen ensayos en serie Multiplex bead como se describe en, por ejemplo, Jager et al; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, Vol 10(1) pág. 133-139. Típicamente, la composición puede comprender al menos un péptido adicional o variante del mismo que no esté entre los polipéptidos seleccionados previamente, hasta un total de trece péptidos diferentes, que producen una respuesta de citoquina en más del 30%, el 35%, el 40%, preferentemente el 45% o el 50% de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía.
La composición comprende además uno o más péptidos adicionales o variantes de los mismos que no están entre los polipéptidos seleccionados previamente, hasta un total de trece péptidos diferentes, que producen una respuesta de citoquina en más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, preferentemente el 30% o el 35% de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía.
La composición puede comprende además uno o más péptidos adicionales que inducen la liberación de IL-10. IL-10 se conoce como un modulador inmune que puede cambiar la respuesta de células T de una respuesta de tipo alérgica. Una liberación de IL-10 significativa puede conducir a la inducción de células T reguladoras que dan origen a o que mejoran la tolerancia de la presencia de otros péptidos en la composición.
Preferentemente, dicho péptido puede inducir la liberación de IL-10 en al menos el 35, el 40, el 45, el 50 o el 55% de una población. En esta realización, por lo tanto el péptido es capaz de unirse a un subconjunto de alelos del CMH que es ilustrativo de una proporción equivalente de la población de muestra. Preferentemente, los péptidos inducen la liberación de IL-10 en el 55% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más o el 90% o más de una población.
“Inducción de liberación de IL-10” se define en el presente documento como una liberación que es medible mediante métodos usados comúnmente en la técnica. Típicamente, la respuesta se mide in vitro usando células T obtenidas a partir de los individuos alérgicos. Una “inducción” se valora como un nivel de IL-10 que es mayor que aquél observado en una muestra de control cuando las células T no están expuestas al péptido. En algunas realizaciones, una inducción de liberación de IL-10 adecuada para inducción de inmunotolerancia se puede definir como una liberación de IL-10 de al menos el 35, el 40, el 45, el 50 o el 55% de la cantidad promedio de IL-10 liberada como respuesta al alérgeno de proteína completa del cual el primer polipéptido es un fragmento. Se ha de comprender que el alérgeno de proteína usado como una comparación puede ser el polipéptido intacto completo o puede ser una forma truncada que comprende los epítopos de células T que median la respuesta inmune al alérgeno de proteína. Comúnmente, los péptidos individuales obtenidos a partir del alérgeno de proteína demostrarán una liberación de IL10 promedio que es mucho más baja que la obtenida como respuesta al alérgeno de proteína completo o truncado como se ha definido anteriormente. Sin embargo, los péptidos individuales que muestran liberación de IL-10 de al menos el 35, el 40, el 45, el 50 o el 55% de la liberación de IL-10 al alérgeno de proteína completo o truncado pueden ser agentes de inducción de inmunotolerancia particularmente adecuados. Los péptidos también pueden presentar una respuesta promedio que es igual que o mayor que, la respuesta observada en respuesta al alérgeno de proteína completo o truncado.
Como alternativa el nivel promedio de IL-10 liberado se puede medir en términos absolutos, en cuyo caso un nivel promedio por encima de aproximadamente 400, 450, 500 ó 550 pg/ml se considerará que es una inducción, típicamente a partir de una muestra de aproximadamente 1,25 x 106 células en 250 !l.
Se ha de comprender que el promedio puede ser la media, la mediana o la moda de las liberaciones de IL-10 individuales observadas en la población. Se ha de comprender que cuando un individuo en la población presenta una liberación inusualmente baja o inusualmente alta de IL-10 en comparación con los otros miembros de la población, se pueden excluir del promedio. Esto puede permitir la medición de un promedio que sea más ilustrativo de las respuestas mostradas en la población. El término “inusualmente bajo” o “inusualmente alto” se puede referir a diferenciales de 10 veces o 20 veces en comparación con un promedio más ilustrativo de las liberaciones de IL-10 que excluye los individuos que muestran características de liberación de IL-10 inusuales.
Las variantes adecuadas capaces de unirse a TCR se pueden obtener empíricamente o seleccionarse de acuerdo con criterios conocidos. Dentro de un péptido único existen determinados restos que contribuyen a la unión dentro de la ranura de unión a antígeno del CMH y otros restos que interaccionan con regiones hipervariables del receptor de células T (Allen et al (1987) Nature 327: 713-5).
Dentro de los restos que contribuyen a la interacción de receptor de células T, se ha demostrado una jerarquía que corresponde a la dependencia de activación de células T tras la sustitución de un resto peptídico determinado. Usando péptidos que han tenido uno o más restos de contacto de receptor de células T sustituidos por un aminoácido diferente, varios grupos han demostrado efectos profundos sobre el proceso de activación de células T. Evavold & Allen (1991) Nature 252: 1308-10 demostraron la disociación de proliferación de células T y producción de citoquina. En este modelo in vitro, un clon de células T específico de restos 64-76 de hemoglobina (en el contexto de I-Ek), se expuso a un análogo peptídico en el que cual se había realizado una sustitución conservativa de ácido glutámico por ácido aspártico. Esta sustitución no interfirió significativamente con la capacidad del análogo de unirse a I-Ek.
A continuación de la exposición in vitro de un clon de células T a este análogo, no se detectó proliferación aunque se mantuvo la secreción de IL-4, al igual que la capacidad del clon de ayudar a respuestas de células B. En un estudio posterior el mismo grupo demostró la separación de citólisis mediada por células T de la producción de citoquinas. En este caso, el primero permaneció inalterado mientras que el último estuvo alterado. La eficacia de ligandos peptídicos alterados in vivo se demostró inicialmente en un modelo murino de EAE (encefalomielitis alérgica experimental) por McDevitt y colegas (Smilek et al (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 9633-9637). En este modelo se induce EAE mediante inmunización con el péptido encefalitogénico Ac1-11 de MBP (proteína básica de mielina). La sustitución en la posición cuatro (lisina) con un resto de alanina generó un péptido que se unió bien a su elemento limitante (Aa!A1u), pero que era no inmunogénico en la cepa susceptible PL/JxSJLF1 y que, además prevenía la aparición de EAE cuando se administraba antes o después de la inmunización con el péptido encefalitogénico. Por tanto, se pueden identificar restos que influyen sobre la capacidad de los péptidos de inducir diversas funciones de las células T.
De forma provechosa, los péptidos se pueden diseñar para favorecer la proliferación de células T y la inducción de de desensibilización. Metzer y Wraith han demostrado capacidad de inducción de tolerancia mejorada de péptidos en los cuales se han realizado sustituciones que aumentan la afinidad péptido-CMH (Meztler & Wraith (1993) Int Immunol �: 1159-65). Sloan-Lancaster et al (1993) Nature 363: 156-9 demostraron que un ligando de péptido alterado puede provocar anergia a largo plazo y profunda en células T clonadas.
Las composiciones de la invención son capaces de inducir una respuesta de fase tardía en un individuo que está sensibilizado a los alérgenos. La expresión “respuesta de fase tardía” incluye el significado como se expone en Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, págs. 1113-1130. La respuesta de fase tardía puede ser cualquier respuesta de fase tardía (LPR). Preferentemente, los péptidos son capaces de inducir una respuesta asmática tardía (LAR) o una respuesta rinítica tardía o una respuesta dérmica de fase tardía o una respuesta ocular de fase tardía. Si un péptido particular puede dar origen a una LPR o no se puede terminar usando métodos bien conocidos en la técnica; un método particularmente preferido es el que se describe en Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay Ab. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. En: Handbook of Experimental Immunology (4) Capítulo 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications, 1986.
Por tanto, preferentemente, los péptidos individuales de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo que se ha sensibilizado a los alérgenos. Si un individuo se ha sensibilizado o no a los alérgenos se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos tales como ensayo de punción de piel con soluciones de extractos de alérgenos, inducción de LPR cutánea, historia clínica, exposición a alérgeno y ensayo de radioalergoabsorbencia (RAST) para medición de IgE específica de alérgeno. Si un individuo particular se espera o no que se beneficie del tratamiento se puede determinar mediante el médico en base a, por ejemplo, tales ensayos.
La desensibilización o inducción de inmunotolerancia de un individuo a los alérgenos significa inhibición o amortiguación de reacciones tisulares alérgicas inducidas por los alérgenos en individuos sensibilizados apropiadamente. Se ha demostrado que las células T se pueden activar selectivamente y posteriormente volverlas no sensibles. Además la inducción de anergia o eliminación de estas células T conduce a la desensibilización del paciente para un alérgeno particular. La desensibilización se manifiesta en sí misma como una reducción de una respuesta a un alérgeno o un péptido obtenido de un alérgeno o preferentemente una eliminación de una respuesta de este tipo, a la segunda administración o administraciones adicionales del alérgeno o péptido obtenido de alérgeno. La segunda administración se puede realizar después de que un período de tiempo adecuado ha pasado para permitir que ocurra la desensibilización, esto es preferentemente cualquier período entre un día y varias semanas. Un intervalo de aproximadamente dos semanas es preferido.
Aunque las composiciones de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo alérgico a ambrosía, se debe apreciar que cuando se usa una composición para tratar a un paciente es preferible que se use una concentración suficientemente baja de la composición de forma de que no ocurra LPR observable pero que la respuesta sea suficiente para desensibilizar parcialmente las células T de forma que se pueda proporcionar la próxima dosis (preferentemente más elevada) y así sucesivamente. De esta manera la dosis se acumula para proporcionar una desensibilización completa pero con frecuencia sin inducir nunca una LPR en el paciente. Sin embargo, la composición o péptido es capaz de hacerlo a una concentración más elevada que la que se administra.
Las composiciones de la invención preferentemente son capaces de inducir una respuesta de fase tardía en el 50%
o más de un panel de individuos alérgicos a ambrosía de la población. Más preferentemente, las composiciones son capaces de inducir una LPR en el 55% o más, el 60% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más o el 90% o más de individuos sensibilizados en un panel. Si las composiciones son capaces o no de inducir una LPR en un porcentaje determinado de un panel de sujetos se puede determinar mediante métodos que se conocen bien en la técnica.
Se comprenderá que los péptidos de la invención comprenden un epítopo de célula T que consiste en un núcleo de 9 aminoácidos que son la secuencia esencial mínima necesaria para la unión al CMH de clase II. Sin embargo, los péptidos también pueden comprender restos adicionales flanqueantes del núcleo de 9 aminoácidos. Por lo tanto, los péptidos pueden comprender una región que contiene un epítopo de célula T, en la que algunos restos se pueden modificar sin afectar la función del epítopo. Por consiguiente, las variantes funcionales de los péptidos como se ha definido anteriormente incluyen péptidos que se alteran para mejorar su solubilidad con relación a la secuencia nativa de los péptidos. La solubilidad mejorada es provechosa para la inducción de inmunotolerancia de sujetos a alérgenos a partir de los cuales se obtienen los péptidos de la invención, ya que la administración de agentes poco solubles a sujetos provoca respuestas inflamatorias no inductoras de inmunotolerancia indeseadas. La solubilidad de los péptidos se puede mejorar alterando los restos que flanquean la región que contiene un epítopo de célula T. Un péptido de la invención se puede someter a ingeniería genética para ser más soluble de forma que el mismo comprenda:
i) N terminal a los restos del péptido que flanquean un epítopo de célula T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los dos a seis aminoácidos contiguos inmediatamente N terminales a dichos restos en la secuencia de la proteína a partir de la cual se obtiene el péptido; y/o i) C terminal a los restos del péptido que flanquean un epítopo de célula T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden al uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente C terminales a dichos restos en la secuencia de la proteína a partir de la cual se obtiene el péptido; o ii) N y/o C terminal a los restos del péptido que flanquean un epítopo de célula T, al menos un aminoácido seleccionado entre arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato.
Opcionalmente, los péptidos se pueden someter a ingeniería genética adicionalmente para ser más solubles de forma que:
i) cualquier resto de cisteína en la secuencia nativa del péptido se reemplaza con serina o ácido 2aminobutírico; y/o ii) cualquier resto en el extremo N y/o C de la secuencia nativa del péptido, que no esté comprendido en un epítopo de célula T, se suprimen; y/o iii) cualquiera de dos aminoácidos consecutivos que comprenden la secuencia Asp-Gly en los hasta cuatro aminoácidos en el extremo N y/o C de la secuencia nativa del péptido, que no están comprendidos en un epítopo de célula T, se suprimen.
�?cidos nucleicos y vectores
Los péptidos individuales que forman las composiciones y productos de la invención se pueden administrar directamente o se pueden administrar indirectamente mediante expresión a partir de una secuencia codificante. Por ejemplo, se puede proporcionar un polinucleótido que codifica un péptido de una composición o un producto de la invención, tal como cualquiera de los péptidos descritos anteriormente. Un péptido usado en la invención se puede producir de esta manera partir de o administrarse en forma de un polinucleótido que lo codifica y es capaz de expresarlo. Cualquier referencia en el presente documento al uso, suministro o administración de un péptido de la invención tiene por objeto incluir el uso indirecto, suministro o administración de un péptido de este tipo a través de la expresión a partir de un polinucleótido que lo codifica.
Los términos “molécula de ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado a partir de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido se puede proporcionar en forma aislada o purificada. Una secuencia de ácido nucleico que “codifica” un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de una secuencia reguladora apropiada. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5’ (amino) y un codón de parada de traducción en el extremo 3’ (carboxi). Para los propósitos de la invención, tales secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero sin limitación ADNc a partir de ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias genómicas a partir de ADN o ARN viral o procariota e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción se puede localizar 3’ de la secuencia codificante.
Los polinucleótidos se pueden sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al (1931, Molecular Cloning – a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Las moléculas de polinucleótido se pueden proporcionar en forma de un casete de expresión que incluye secuencias de control unidas operativamente a la secuencia insertada, permitiendo de ese modo la expresión del péptido de la invención in vivo en un sujeto diana. Estos casetes de expresión, a su vez, típicamente se proporcionan dentro de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores virales recombinantes) que son adecuados para uso como reactivos para inmunización de ácido nucleico. Un casete de expresión de este tipo se puede administrar directamente a un sujeto hospedador. Como alternativa, un vector que comprende un polinucleótido se puede administrar a un sujeto hospedador. Preferentemente el polinucleótido se prepara y/o administra usando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector que sea capaz de aportar una cantidad suficiente de información genética y permitir la expresión de un péptido de la invención.
Por tanto, la presente invención utiliza vectores de expresión que comprenden tales secuencias polinucleotídicas.
Además, se apreciará que las composiciones y productos de la invención pueden comprender una mezcla de polipéptidos y polinucleótidos. Por consiguiente, la invención proporciona una composición o producto como se define en el presente documento, en la que en lugar de uno cualquiera del polipéptido está un polinucleótido capaz de expresar dicho polipéptido.
Los vectores de expresión se construyen de forma rutinaria en la técnica de biología molecular y pueden implicar, por ejemplo, el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como por ejemplo señales de poliadenilación que pueden ser necesarias y que se posicionan en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados serán evidentes para los expertos en la materia. A modo de ejemplo adicional a este respecto se hace referencia a Sambrook et al.
Por tanto, se puede proporcionar un polipéptido usado en la invención suministrando un vector de este tipo a una célula y permitiendo que ocurra la transcripción a partir del vector. Preferentemente, un polinucleótido para uso en la invención en un vector está unido operativamente a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedadora, es decir, el vector es un vector de expresión.
“Unido operativamente” se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes descritos se configuran de forma de realizar su función habitual. Por lo tanto, una secuencia reguladora dada, tal como un promotor, unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico es capaz de lograr la expresión de esa secuencia cuando las enzimas apropiadas están presentes. El promotor no tiene que ser contiguo a la secuencia, siempre y cuando el mismo funcione para dirigir la expresión de la misma. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias no traducidas pero transcritas entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico y la secuencia promotora puede aún considerarse que está “unida operativamente” a la secuencia codificante.
Se han descrito varios sistemas de expresión en la técnica, cada uno de los cuales consiste típicamente en un vector que contiene un gen o secuencia de nucleótidos de interés unido operativamente a secuencias de control de expresión. Estas secuencias de control incluyen secuencias promotoras transcripcionales y secuencias de inicio y terminación de la transcripción. Los vectores de la invención pueden ser por ejemplo, vectores de plásmido, virus o fago provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Un “plásmido” es un vector en forma de un elemento genético extra cromosómico. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN o usarse para transfectar o transformar una célula hospedadora, por ejemplo, una célula hospedadora de mamífero. Los vectores también se pueden adaptar para usarse in vivo, por ejemplo para permitir la expresión in vivo del polipéptido.
Un “promotor” es una secuencia de nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un polinucleótido que codifica un polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor se induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores represibles (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor se reprime por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y promotores constitutivos. El término “promotor” o “elemento de control” tiene por objeto incluir regiones promotoras de longitud completa y segmentos funcionales (por ejemplo, que controla transcripción o traducción) de estas regiones.
Un polinucleótido, casete de expresión o vector de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente una secuencia de péptido señal. La secuencia de péptido señal generalmente se inserta en unión operativa con el promotor de forma que el péptido señal se exprese y facilite la secreción de un polipéptido codificado por secuencia codificante también en unión operativa con el promotor.
Típicamente una secuencia de péptido señal codifica un péptido de 10 a 30 aminoácidos por ejemplo 15 a 20 aminoácidos. Con frecuencia los aminoácidos son principalmente hidrófobos. En una situación típica, un péptido señal dirige a una cadena polipeptídica en crecimiento que porta el péptido señal al retículo endoplasmático de la célula que lo expresa. El péptido señal se escinde en el retículo endoplasmático, permitiendo la secreción del polipéptido a través del aparato de Golgi. Por tanto, un péptido de la invención se puede proporcionar a un individuo mediante expresión a partir de células dentro del individuo y secreción a partir de esas células.
Como alternativa, los polinucleótidos de la invención se pueden expresar de una manera adecuada para permitir la presentación de un péptido de la invención mediante una molécula del CMH de clase II en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Por ejemplo, un polinucleótido, casete de expresión o vector de la invención se puede dirigir a células presentadoras de antígeno o la expresión de péptido codificado se puede estimular preferentemente
o inducir de forma preferencial en tales células.
Los polinucleótidos de interés se pueden usar in vitro, ex vivo o in vivo en la producción de un péptido de la invención. Tales polinucleótidos se pueden administrar o usarse en la prevención o tratamiento de alergia mediante inducción de inmunotolerancia.
Los métodos para suministro génico se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nº 5.399.346, 5.580.859 y 5.531.466. La molécula de ácido nucleico se puede introducir directamente en el sujeto receptor, tal como mediante inyección intramuscular o intradérmica convencional; administración de partículas transdérmica; inhalación, por vía tópica o por modos de administración oral, intranasal o mucosal. La molécula alternativamente se puede introducir ex vivo en células que se han retirado de un sujeto. Por ejemplo, un polinucleótido, casete de expresión o vector de la invención se puede introducir en CPA de un individuo ex vivo. Las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés se introducen nuevamente en el sujeto de forma que se pueda montar una respuesta inmune frente al péptido codificado por la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico usadas en tal inmunización generalmente se denominan en el presente documento “vacunas de ácido nucleico”.
Los polipéptidos, polinucleótidos, vectores o células de la invención pueden estar presentes en una forma sustancialmente aislada. Los mismos se pueden mezclar con vehículos o diluyentes que no interferirán con su uso pretendido y aún considerarse como sustancialmente aisladas. Las mismas también pueden estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso las mismas comprenderán generalmente al menos el 90%, por ejemplo al menos el 95%, el 98% o el 99% de las proteínas, polinucleótidos, células o masa seca de la preparación.
Células presentadoras de antígeno (CPA)
La invención abarca el uso in vitro de un método para producir una población de CPA que presente los péptidos de la invención en su superficie, que se puedan usar posteriormente en terapia. Un método de este tipo se puede llevar a cabo ex vivo en una muestra de células que se han obtenido a partir de un paciente. Las CPA producidas de esta manera por lo tanto forman un agente farmacéutico que se puede usar en el tratamiento o prevención de alergia por ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia. Las células deberían ser aceptadas por el sistema inmune del individuo debido a que las mismas se obtienen a partir de ese individuo. La administración de células que se han producido de esta manera al individuo a partir del cual las mismas se obtuvieron originalmente, forma de este modo una realización terapéutica de la invención.
Formulaciones y composiciones
Los péptidos, polinucleótidos, vectores y células de la invención se pueden proporcionar a un individuo en solitario o en combinación. Cada molécula o célula de la invención se puede proporcionar a un individuo en una forma aislada, sustancialmente aislada, purificada o sustancialmente purificada. Por ejemplo, un péptido de la invención se puede proporcionar a un individuo sustancialmente libre de otros péptidos.
Aunque puede ser posible para los péptidos, polinucleótidos o composiciones de acuerdo con la invención presentarse en forma bruta, es preferible presentarlos como una formulación farmacéutica. Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica para uso en la prevención o el tratamiento de alergia a ambrosía mediante la inducción de inmunotolerancia que comprende una composición, vector o producto de acuerdo con la invención junto con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más ingredientes terapéuticos diferentes. El vehículo o vehículos tienen que ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no dañinos para el receptor de los mismos. Típicamente los vehículos para inyección y la formulación final, son estériles y sin pirógenos.
La formulación de una composición que comprende el péptido, polinucleótidos o células de la invención se puede llevar a cabo usando químicas y metodologías de formulación farmacéutica convencionales las cuales están fácilmente disponibles al moderadamente experto.
Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más moléculas o células de la invención se pueden combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias de tamponamiento de pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares generalmente son agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmune en el individuo que recibe la composición y que se pueden administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden incluir en los mismos, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una discusión exhaustiva de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J., 1991).
Tales composiciones se pueden preparar, envasar o comercializar en una forma adecuada para administración de bolo o para administración continua. Las composiciones inyectables se pueden preparar, envasar o comercializar en formas de dosificación unitaria, tal como en ampollas o en recipientes multidosis que contienen un conservante. Las composiciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones de liberación sostenida implantables o biodegradables. Tales composiciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes o de dispersión. En una realización de una composición para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, un polvo o gránulos) para reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua sin pirógenos estéril) antes de administración parenteral de la composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar o comercializar en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como los agentes de dispersión, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en el presente documento. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio isotónica y aceites fijos tales como mono- o di-glicéridos sintéticos. Otras composiciones administrables por vía parenteral que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como un componente de un sistema de polímero biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implante pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble o una sal poco soluble.
Como alternativa, los péptidos o polinucleótidos de la presente invención se pueden encapsular, adsorber a o asociarse con vehículos particulados. Los vehículos particulados adecuados incluyen aquellos que se obtienen a partir de polímeros de metacrilato de polimetilo, así como también micropartículas de PLG obtenidas a partir de poli(láctidos) y poli(láctido-co-glicólidos). Véase, por ejemplo, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10: 362-368. También se pueden usar otros sistemas particulados y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así como también conjugados de estas moléculas.
La formulación de cualquiera de los péptidos, polinucleótidos o células mencionados en el presente documento dependerá de factores tales como la naturaleza de la sustancia y el método de administración. Cualquier sustancia de este tipo se puede administrar en una diversidad de formas de dosificación. La misma se puede administrar por vía oral (por ejemplo, como tabletas, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o gránulos), por vía parenteral, por vía epicutánea, por vía subcutánea, mediante inhalación, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraesternal, por vía transdérmica, por vía intradérmica, por vía sublingual, por vía intranasal, por vía bucal o mediante técnicas de infusión. La sustancia también se puede administrar como supositorios. Un médico será capaz de determinar la vía de administración necesaria para cada individuo particular.
Las composiciones de formulaciones de la invención comprenderán una concentración adecuada de cada péptido/polinucleótido/célula que sea eficaz sin causar reacción adversa. Típicamente, la concentración de cada péptido de la composición estará en el intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml. Más preferentemente en el intervalo de 0,3 a 200 nmol/ml, 3 a 180 nmol/ml, 10 a 150 nmol/ml o 30 a 120 nmol/ml. La composición o formulaciones deben tener una pureza de más del 95 o el 98% o una pureza de al menos el 99%.
Por lo tanto, en una realización, los péptidos, polinucleótidos, células o composiciones de la invención se usan para terapia en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes. Los agentes se pueden administrar por separado, simultáneamente o en secuencia. Los mismos se pueden administrar en la misma composición o en composiciones diferentes. Por consiguiente, en un método de la invención, el sujeto también se puede tratar con un agente terapéutico adicional.
Por lo tanto, también se puede formular una composición que comprenda una molécula y/o célula de la invención y también una o más moléculas terapéuticas diferentes. Una composición de la invención se puede usar como alternativa simultáneamente, secuencialmente o por separado con una o más composiciones terapéuticas diferentes como parte de un tratamiento combinado.
Métodos terapéuticos e individuos que se tienen que tratar
La presente invención se refiere a péptidos, polinucleótidos, vectores y células que son capaces de desensibilizar o inducir inmunotolerancia en individuos humanos a los alérgenos descritos anteriormente y por lo tanto son útiles en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía. La invención proporciona composiciones, productos, vectores y formulaciones para uso en la prevención o el tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia. La invención también proporciona métodos para inducir inmunotolerancia o desensibilizar a un individuo alérgico a ambrosía que comprende administrar, en solitario o en combinación los polipéptidos/polinucleótidos/células de la invención como se ha descrito anteriormente.
El individuo que se tiene que tratar o al que se tiene que proporcionar la composición o formulación de la invención es preferentemente un ser humano. Se apreciará que el individuo que se tiene que tratar se puede saber que es sensible a los alérgenos, que está en riesgo de sensibilizarse o que se sospecha que se está sensibilizando. El individuo se puede ensayar para determinar la sensibilización usando técnicas bien conocidas en la técnica como se ha descrito en el presente documento. Como alternativa, el individuo puede tener una historia familiar de alergia a ambrosía. Puede no ser necesario ensayar a un individuo para la sensibilización a ambrosía ya que el individuo puede presentar síntomas de alergia cuando se expone a la ambrosía. Exposición significa proximidad a, por ejemplo, una planta de ambrosía o a una sustancia o producto obtenido a partir de una planta de ambrosía o a una sustancia o producto que contiene o que comprende cualquiera de los anteriores. La sustancia o producto obtenido a partir de una planta de ambrosía es típicamente polen de ambrosía. Proximidad significa a 10 metros o menos, 5 metros o menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos o 0 metros de los artículos descritos anteriormente. Los síntomas de alergia pueden incluir picor de los ojos, mucosidad, dificultades para respirar, picor y enrojecimiento de la piel o erupción.
El individuo que se tiene que tratar puede ser de cualquier edad. Sin embargo, preferentemente, el individuo puede estar en el grupo de edad de 1 a 90, 5 a 60, 10 a 40 o más preferentemente 18 a 35.
Preferentemente, el individuo que se tiene que tratar es de una población que tiene frecuencias alélicas del CMH dentro del intervalo de frecuencias que son ilustrativos de la población caucásica. Las frecuencias alélicas de población de referencia para 11 familias de alelos de DERB1 comunes se muestran en la Tabla 1 (Datos de HLA Facts Book, Parham and Barber).
Tabla 1
DRB1
1 3 4 7 8 11 12 13 14 15 16
%
6,4 14,7 15,7 8,8 3,4 8,3 3,9 14,7 2,9 17,6 2,5
% de población de referencia
9,4 11,1 12,8 13,2 3,7 13,4 2,3 10,2 3,2 10,7 3,6
Las frecuencias de referencia se obtuvieron mediante análisis de estudios múltiples que indicaban frecuencias y las figuras mostradas son valores medios. Por lo tanto preferentemente, el individuo que se tiene que tratar es de una población que tiene frecuencias alélicas del CMH equivalentes a la población de referencia para los alelos a los que se hace referencia en la Tabla 1 (tal como para al menos 1, 2, 3, 4, 5 o todos los alelos), por ejemplo dentro de los intervalos de esas figuras más o menos el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 10, el 15 o el 20%.
Preferentemente el individuo es de una población en la que las frecuencias alélicas de los siguientes alelos de DRB1 son:
4 – al menos el 9% 7 – al menos el 10% 11 – al menos el 8%
El individuo puede haber tenido alergia a ambrosía durante al menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años. El individuo puede sufrir de una erupción, congestión nasal, descarga nasal y/o tos causada por la alergia. Al individuo puede o no haberse administrado otras composiciones/compuestos que tratan alergia a ambrosía.
El individuo típicamente vive en una región geográfica con un clima caliente y húmedo. El individuo típicamente sufre de una alergia a ambrosía en una estación particular. La estación típicamente corresponde a la época de floración de la ambrosía, que típicamente es del verano a otoño, preferentemente finales del verano (de julio a agosto en el hemisferio norte) a principios de otoño (septiembre a octubre en el hemisferio norte). El individuo alérgico a ambrosía es típicamente alérgico al polen de ambrosía.
Inmunoterapia de combinación
Ya que muchos individuos son alérgicos o pueden necesitar la desensibilización a varios antígenos de polipéptidos, la presente invención también proporciona medios para desensibilizar a individuos que son alérgicos a múltiples antígenos. “Tolerancia” inducida en un individuo a un primer antígeno de polipéptido o alérgeno puede crear en el individuo un “entorno tolerante” en el que las respuestas inmunes inapropiadas a otros antígenos se pueden regular negativamente con el fin de proporcionar tolerancia a otros antígenos.
Este hallazgo significa que los individuos que son alérgicos a múltiples alérgenos se pueden tratar en un período de tiempo enormemente reducido y que los individuos gravemente alérgicos a algunos alérgenos (por ejemplo, cacahuete) pero más suavemente alérgicos a otros alérgenos (por ejemplo, caspa de gato) se pueden beneficiar de una terapia en la que se establece la tolerancia al alérgeno más suave y después este entorno de tolerancia se usa para proporcionar tolerancia al otro alérgeno más extremo. Adicionalmente, los individuos que sufren de un trastorno autoinmune que están sensibilizados de forma adicional (o de otra manera que son inmunes) a un antígeno o alérgeno no relacionado se pueden beneficiar de un régimen de tratamiento en donde la tolerancia al antígeno o alérgeno no relacionados establecen primer lugar y después este entorno de tolerancia se usa para proporcionar tolerancia al auto antígeno asociado con el trastorno autoinmune.
Por lo tanto se proporciona un método para desensibilizar a un individuo alérgico a ambrosía al alérgeno de ambrosía como se ha descrito anteriormente y uno o más antígenos polipeptídicos diferentes adicionales. El método implica, en una primera etapa, administrar al individuo una composición/producto/formulación (composición primaria) de acuerdo con la invención como se ha descrito en el presente documento y en el que la administración se lleva a cabo en una manera suficiente para generar un estado hiposensible frente al alérgeno de ambrosía. Una vez que se ha establecido un estado hiposensible hacia el alérgeno de ambrosía o ha ocurrido al menos un cambio hacia la desensibilización, el método implica la administración de una composición secundaria que comprende un segundo antígeno polipeptídico diferente hacia el cual se tiene que sensibilizar el individuo. La administración de la composición secundaria se lleva a cabo de una manera tal de aprovechar el entorno de tolerancia establecido mediante el uso de la composición primaria, en el que ahora es posible establecer la tolerancia al segundo antígeno polipeptídico diferente. La composición secundaria se administra junto con la primera composición primaria o un fragmento más grande del alérgeno a partir del cual se obtiene la composición primaria. “Administrar junto con” significa la administración simultánea o concurrente, por ejemplo, cuando los dos están presentes en la misma composición o se administran en composiciones separadas casi al mismo tiempo pero en sitios diferentes, así como la administración de los antígenos polipeptídicos en composiciones separadas en momentos diferentes. Por ejemplo, la composición secundaria se puede administrar antes de o posteriormente a la administración de la primera composición en el mismo sitio o en un sitio diferente. El tiempo entre administraciones puede variar desde aproximadamente varios segundos de diferencia hasta aproximadamente varios minutos de diferencia, varias horas de diferencia o incluso varios días de diferencia. Además, se pueden emplear diferentes métodos de administración.
El segundo antígeno polipeptídico preferentemente es un alérgeno diferente al alérgeno de ambrosía. Los alérgenos adecuados para uso en los métodos de la invención se pueden obtener y/o producir, por supuesto usando métodos conocidos. Las clases de alérgenos adecuados incluyen, pero sin limitación, otros alérgenos de ambrosía, polen, 5 caspa de animal (especialmente caspa de gato), grasas, mohos, polvos, antibióticos, venenos de insectos urticantes y una diversidad de alérgenos del entorno (incluyendo químicos y metales), fármacos y alimentos. Los alérgenos de árbol común incluyen polen de álamo, álamo, fresno, abedul, arce, roble, olmo, árbol de nogal americano y árbol de pacana; los alérgenos de plantas comunes incluyen altamisa, ambrosía, plátano inglés, acebeda y amaranto; los alérgenos de contacto de plantas incluyen los de roble venenoso, hiedra y ortigas; los alérgenos de hierba común 10 incluyen césped inglés, alérgenos de Timothy, de Johnson, de Bermuda, de centeno y hierba azul; los alérgenos comunes también se pueden obtener a partir de mohos u hongos tales como Alternaria, Fusarium, Hormodendrum, Aspergillus, Micropolyspora, Mucor y actinomycetes termofílicos; se pueden obtener alérgenos epidérmicos a partir de polvos del hogar u orgánicos (típicamente de origen fúngico) o de fuentes animales tales como plumas y caspa de perro; los alérgenos alimenticios comunes incluyen alérgenos de la leche y el queso (lácteos), huevos, trigo, 15 nueces (por ejemplo, cacahuete), alimentos marinos (por ejemplo, mariscos), de guisantes, de frijoles y de gluten; los alérgenos comunes del entorno incluyen metales (níquel y oro), químicos (formaldehído, trinitrofenol y turpentina), Látex, goma, fibra (algodón o lana), arpillera, colorante para el cabello, cosméticos, detergentes y alérgenos de perfume; los alérgenos de fármaco comunes incluyen alérgenos de anestesia local y de salicilato; los alérgenos de antibiótico incluyen penicilina, tetraciclina y alérgenos de sulfonamida; y los alérgenos de insecto 20 común incluyen veneno de abeja, avispa y hormiga y alérgenos del cáliz de cucaracha. Los alérgenos particularmente bien caracterizados incluyen, pero sin limitación, el alérgeno mayor de gato Fel dl, fosfolipasa A2 de veneno de abeja (PLA) (Akdis et al. (1996) J. Clin. Invest. 98: 1676-1683), alérgenos de polen de abedul Bet v 1 (Bauer et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 107: 536-541) y el alérgeno de césped multi-epitópico recombinante rKBG8.3 (Cao et al. (1997) Immunology 90: 46-51). Estos y otros alérgenos adecuados están disponibles en el
25 mercado y/o se pueden preparar fácilmente como extractos siguiendo técnicas conocidas.
Preferentemente, el segundo alérgeno de polipéptido se selecciona entre la lista de secuencias de alérgeno y números de acceso de base de datos (números de acceso de NCBI Entrez) más adelante. NCBI es el Centro Nacional de Información de Biotecnología y es una división del Instituto de Salud Nacional de los Estados Unidos. El
30 sitio web de NCBI, donde se puede buscar acceso a la base de datos, es www.ncbi.nlm.nih.gov/. Secuencias y números de acceso de base de datos de alérgeno (números de acceso de NCBI Entrez):
Dermatophagoides pteronyssinus
35 Der p 1
Der p 2
Der p 3
Der p 4 KYXNPHFIGXRSVITXLME Der p 5
10
Der p 6
AIGXQPAAEAEAPFQISLMK
15
Der p 7
Der p920 IVGGSNASPGDAVYQIAL
Dermatophagoides farinae
Der f1
25 Der f 2
Der f 3
Der f 4 AVGGQDADLAEAPFQISLLK Der f 7
Secuencias de alérgenos de ácaros adicionales (acceso de NCBI entrez):
1170095; 1359436; 2440053; 666007; 487661; 1545803; 84702; 84699; 625532; 404370; 1091577; 1460058; 7413; 9072; 387592. Gato Secuencias felinas (acceso de NCBI entrez):
539716; 539715; 423193; 423192; 423191; 423190; 1364213; 1364212; 395407; 163827; 163823; 163825; 1169665; 232086; 1169666. Látex Secuencias de Hevea: Hev b I
Hev b 3
Secuencias de Hevea adicionales (acceso de NCBI entrez):
15 3319923; 3319921; 3087805; 1493836; 1480457; 1223884; 3452147; 3451147; 1916805; 232267; 123335; 2501578; 3319662; 3288200; 1942537; 2392631; 2392630; 1421554; 1311006; 494093; 3183706; 3172534; 283243; 1170248; 1708278; 1706547; 464775; 266312; 231586; 123337; 116359; 123062; 2213877; 542013; 2144920; 1070656; 2129914; 2129913; 2129912; 100135; 82026; 1076559; 82028; 82027; 282933; 280399;
20 100138; 1086972; 108697; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 913758; 913757; 913756; 234388; 1092500; 228691; 1177405; 18839; 18837; 18835; 18833; 18831; 1209317; 1184668; 168217; 168215; 168213; 168211; 168209; 348137.
Césped inglés 25 Secuencias de Lolium:
126385 Lol p 1
1268386 Lol p 2a
126387 Lol p 3 2498581 Lol p 5a
2498582 Lol p 5b
10 455288 Lol p isoforma 9
15 1582249 Lol p 11
Secuencias de Lolium adicionales (acceso de NCBI entrez):
5 135480; 417103; 687261; 687259; 1771355; 2388662; 631955; 542131; 542130; 542129; 100636; 626029; 542132; 320616; 320615; 320614; 100638; 100634; 82450; 626028; 100639; 283345; 542133; 1771353; 1763163; 310877; 310875; 250525; 55317; 515377; 510911; 939932; 439950; 2718; 168316; 168314; 485371; 2388664; 2832717; 2828273; 548867.
10 �?rbol de Olivo
Secuencias de olivo
416610 Ole e 1 15
20
Parietaria Secuencias de Parietaria 24997750 Par j P2
25
1352506 Par j P5
1532056 Par j P8
1532058 Par j P9
2497749 Par j P9
1086003 Par j 1
Secuencias de Parietaria adicionales (acceso de NCBI entrez):
543659; 1836011; 1836010; 1311513; 1311512; 1311511, 1311510; 1311509; 240971. Césped de variedad Timothy 15 Secuencias de Phleum Phl p 1
Phl p 1
Phlp 2
Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5b Phl p 5a
Phl p 5
Phl p 5 Phl p 5
Phl p 5
10 Phl p 5
Phl p 5b
Phl p 5a
Phl p 5
Phl p 5b
15 Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5
Phl p 5b
Phl p 5a Phl p 5
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 6
Phl p 6
Phlp6
Phl p 6
Phl p 7
Phl p 11
Secuencias de Phleum adicionales (acceso de NCBI entrez):
458878; 548863; 2529314; 2529308; 24i5702; 2415700; 2415698; 542168; 542167; 626037; 542169; 541814; 20 542171; 253337; 253336; 453976; 439960 .
Avispa (y relacionados)
Secuencias de Vespula: 25 465054 ALÉRGENO VES V 5
30 1709545 ALÉRGENO VES M 1
1352699 ALÉRGENO VES V1
1346323 ALÉRGENO VES V2
549194 ALÉRGENO VES VI
15 Secuencias de Vespula adicionales (acceso de NCBI entrez): 549193; 549192; 549191; 549190; 549131; 117414; 126761; 69576; 625255; 627131; 627188; 627187; 482382; 112561; 627186; 627185; 1923233; 317645; 317647; 745570; 225764; 162551. 20 Secuencias de alérgeno de árbol (principalmente abedul): 114922 Bet v 1
130975 Bet v 2
1168696 Bet v 3
809536 Bet v 4
15 543675 Que a I - Quercus alba = árboles de roble (fragmento) GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL
543509 Car b I - Carpinus betulus = árboles de carpinus (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQADGC
20 543491 Aln g I - Alnus glutinosa = árboles de aliso (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI
1204056 Rubisco 25
Secuencias de alérgeno de árboles adicionales (número de acceso NCBI entrez):
30 131919; 128193; 585564; 1942360; 2554672; 2392209; 2414158; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3015520; 2935416; 464576; 1705843; 1168701; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1842188; 2564228; 2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 1813311; 1536831; 534910; 534900; 534318; 1340000; 1339998; 2149808; 66207; 2129477; 1076249; 1076247; 629480; 481805; 81443; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963;
35 1361962;1361961 ;1361960;1361959;320546;629483; 629482; 629481; 541804; 320545; 81444; 541814:; 629484; 474911; 452742; 1834387; 298737; 298736; 1584322; 1584321; 584320; 1542873; 1542871; 1542869; 1542867; 1542865; 1542863; 1542861; 1542859; 1542857; 1483232; 1483230; 1483228; 558561; 551640; 488605; 452746;
452744; 452740; 452738; 452736; 452734; 452732; 452730; 452728; 450885; 17938; 17927; 17925; 17921; 297538; 510951; 231331; 231329; 166953. Cacahuete Secuencias de cacahuete 1168391 Aran h1
Ambrosía
15 Secuencias de Ambrosía 113478 Amb a 1
113479 Amb a 2
113477 Amb a 1.3
113476 Amb a 1.2
113475 Amb a 1.1
Secuencias de cedro 493634 Cry j IB precursor
493632 Cry j IA precursor
1076242 Cry j II precursor - Cedro japonés
1076241 Cry j II proteína - Cedro japonés
541803 Cry j I precursor - Cedro japonés 541802 Cry j I precursor- Cedro japonés
5
Perro
Secuencias de canis:
10
Can f 1
Fragmento de albúmina sérica 15 EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL Fragmento de albúmina sérica
Can f 2
Proteína de alérgeno de perro adicional (acceso de NCBI entrez): 1731859
Caballo Secuencias de Equus: 10 1575778 Equ c1
3121755 Equ c 2
SQXPQSETDYSQLSGEWNTIYGAASNIXK Euroglyphus (ácaro) 20 Secuencias de Euroglyphus: Eur m 1 (variante)
Eur m 1 (variante)
30 Eur m 1 (variante) Eur m 1 (variante)
Secuencias de Poa (césped)
113560 POA P 9 Secuencias de cucaracha
2231297 Cr p2
1703445 Bla g 2
2326190 Bla g 5
Secuencias de cucaracha adicionales (números de acceso de NCBI Entrez): 2580504; 1580797; 1580794; 13622590; 544619; 544618; 1531531; 1580792; 1166573; 1176397; 2317849.
Secuencias de alérgeno (general)
Números de acceso de NCBI
2739154; 3719257; 3703107; 3687326; 3643813; 3087805; 1864024; 1493836; 1480457; 2593176; 2593174; 1575778; 763532; 746485; 163827; 163823; 3080761; 163825; 3608493; 3581965; 2253610; 2231297; 2317849; 3409499; 3409498; 3409497; 3409496; 3409495; 3409494; 3409493; 3409492; 3409491; 3409490; 3409431; 3409488; 3409487; 3409486; 3409485; 3409484; 3409483; 3409482; 3409481; 3409480; 3409479; 3409478; 3409477; 3409476; 3409475; 3409474; 3409473; 3409472; 3409471; 3409470; 3409469; 3409468; 3409467; 3409466; 3409465; 3409464; 3409463; 3409462; 3409461; 3409460; 3409459; 3409458; 3409457; 3409456; 3318885; 3396070; 3367732; 1916805; 3337403; 2851457; 2851456; 1351295; 549187; 136467; 1173367; 2499810; 2498582; 2498581; 1346478; 1171009; 126608; 114091; 2506771; 1706660; 1169665; 1169531; 232086; 416318; 114922; 2497701; 1703232; 1703233; 1703233; 1703232; 3287877; 3122132; 3182907; 3121758; 3121756; 3121755; 3121746; 3121745; 3319925; 3319923; 3319921; 3319651; 3318731; 3318779; 3309647; 3309047; 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1850542; 1850540; 283117; 452742; 1842045; 1839305; 1836011; 1836010; 1829900; 1829319; 1829318; 1829317; 1829316; 1829315; 1829314; 1825459; 1803187; 159653; 1773369; 1769849; 1769847; 608690; 310877; 310875; 1438761; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 1311631; 1246120; 1246119; 1246118; 1246117; 1246116; 1478293; 1478292; 1311642; 1174278; 1174276; 1086972; 1086974; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 999009; 999356; 999355; 994866; 994865; 913758; 913757; 913756; 913285; 913283; 926885; 807138; 632782; 601807; S468S2; 633938; 544619; 544618; 453094; 4S 1275; 451274; 407610; 407609; 404371; 409328; 299551; 299550; 264742; 261407; 255657; 250902; 250S2S; 1613674; 1613673; 1613672; 1613671; 1613670; 1613304; 1613303; 1613302; 1613240; 1613239; 1613238; 1612181; 1612180; 1612179; 1612178; 1612177; 1612176; 1612175; 1612174; 1612173; 1612172; 1612171; 1612170; 1612169; 1612168; 1612167; 1612166; 1612165; 1612164; 1612163; 1612162; 1612161; 1612160; 16121 S9; 1612158; 1612157; 16121 S6; 1612155; 16121 S4; 16121 S3; 1612152; 1612151; 1612150; 1612149; 1612148; 1612147; 1612146; 1612145; 1612144; 1612143; 1612142; 1612141; 1612140; 1612139; 1093120; 447712; 447711; 447710; 1587177; 158542; 1582223; 1582222; 1531531; 1580792; 886215; 1545317; 1545315; 1545313; 1545311; 545831; 1545887; 1545885; 1545883; 1545881; 1545879; 1545877; 1545875; 166486; 1498496; 1460058; 972513; 1009442; 1009440; 1009438; 1009436; 1009434; 7413; 1421808; 551228; 452606; 32905; 1377859; 1364213; 1364212; 395407; 22690; 22688; 22686; 22684; 488605; 17680; 1052817; 1008445; 1008443; 992612; 706811; 886683; 747852; 939932; 19003; 1247377; 1247375; 1247373; 862307; 312284; 999462; 999460; 999458; 587450; 763064; 886209; 1176397; 1173557; 902012; 997915; 997914; 997913; 997912; 997911; 997910; 99790; 997908; 997907; 997906; 997905; 997904; 997903; 997902; 997901; 997900; 997319; 997318; 997317; 997316; 997315; 997314; 997313; 997312; 910984; 910983; 910982; 910981; 511604; 169631; 169629; 169627; 168316; 168314; 607633; 555616; 293902; 485371; 455288; 166447; 166445; 166443; 166435; 162551; 160780; 552080; 156719; 156715; 515957; 515956; 515955; 515954; 515953; 459163; 166953; 386678; 169865.
Los alérgenos/antígenos particularmente preferidos incluyen: proteína de caspa de gato Fel d1; proteínas de Ambrosía Der P1, Der P2 y Der P7, proteína de Ambrosía amb a 1.1, a 1.2, a 1.3 o a1.4; proteínas de Césped inglés loI p1 y lol p 5; proteínas de césped variedad Timothy phl p 1 y phl p5; proteína de césped Bermuda Cyn d 5; proteínas de Alternaria alternata Alt a 1 , Alt a 2 y Enolasa (Alt a 6); proteína de Abedul Bet v1 y P14; proteínas de Cucaracha alemana Bla g 2, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 y Bla g 6; proteína de Altamisa Art v1; proteína de Cardo ruso Sal k 1 y Sal k 2; cacahuete Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, profilinas de planta o proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno de leucocitos humanos.
Métodos de administración
Una vez se han formulado, las composiciones de la invención se pueden administrar a un sujeto in vivo usando una diversidad de vías y técnicas conocidas. Por ejemplo, una composición se puede proporcionar como una solución, suspensión o emulsión inyectable y administrarse por vía parenteral, subcutánea, epicutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, inyección intravenosa usando una aguja y jeringa convencional o usando un sistema de inyección de jet líquido. Las composiciones también se pueden administrar por vía tópica a la piel o tejido mucosal, tal como por vía nasal, por vía intratraqueal, por vía intestinal, por vía rectal o por vía vaginal o proporcionarse como una pulverización finamente dividida adecuada para administración respiratoria o pulmonar. Otros modos de administración incluyen administración oral, supositorios, administración sublingual y técnicas de administración transdérmica activa o pasiva.
Cuando un péptido de la invención se tiene que administrar, se prefiere administrar el péptido a un sitio en el organismo en el que tendrá la capacidad de contactar células presentadoras de antígeno adecuadas y donde éste o éstos tendrán la oportunidad de ponerse en contacto con células T del individuo. Cuando se tiene que administrar una CPA, se prefiere administrar la CPA a un sitio en el organismo en el que la misma tendrá la capacidad de contactar y activar células T adecuadas del individuo.
Regímenes de administración
La administración de los péptidos/polinucleótidos/células (tal como la composición que contiene una pluralidad de péptidos) se puede realizar mediante cualquier método adecuado como se ha descrito anteriormente. Cantidades adecuadas del péptido se pueden determinar empíricamente, pero típicamente están en el intervalo proporcionado más adelante. Una administración única de cada péptido puede ser suficiente para tener un efecto beneficioso para el paciente, pero se apreciará que puede ser beneficioso si el péptido se administra más de una vez, en cuyo caso los regímenes de administración típicos pueden ser, por ejemplo, una o dos veces a la semana durante 2-4 semanas cada 6 meses o una vez al día durante una semana cada cuatro a seis meses. Como se apreciará, cada péptido o polinucleótido o combinación de péptidos y/o polinucleótidos se puede administrar a un paciente en solitario o en combinación.
Las dosis de administración dependerán de varios factores incluyendo la naturaleza de la composición, la vía de administración y el programa y el tiempo del régimen de administración. Las dosis adecuadas de una molécula de la invención pueden estar en el orden de hasta 15 !g, hasta 20 !g, hasta 25 !g, hasta 30 !g, hasta 50 !g, hasta 100 !g, hasta 500 !g o más por administración. Las dosis adecuadas puede ser menores de 15 !g, pero al menos 1 ng o al menos 2 ng o al menos 5 ng o al menos 50 ng o al menos 100 ng o al menos 500 ng o al menos 1 !g o al menos 10 !g. Para algunas moléculas de la invención, la dosis usada puede ser más elevada, por ejemplo, hasta 1 mg, hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg, hasta 5 mg o mayor. Tales dosis se pueden proporcionar en una formulación líquida, a una concentración adecuada para permitir un volumen apropiado para administración mediante la vía seleccionada.
Kits
5 La invención también se refiere a una combinación de componentes descritos en el presente documento adecuada para su uso en un tratamiento de la invención que están envasados en la forma de un kit en un recipiente. Tales kits pueden comprender una serie de componentes para permitir un tratamiento de la invención. Por ejemplo, un kit puede comprender uno o más péptidos, polinucleótidos y/o células diferentes de la invención o uno o más péptidos,
10 polinucleótidos o células de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales adecuados para administración simultánea o para administración secuencial o separada. El kit puede opcionalmente contener otro reactivo o reactivos adecuados o instrucciones y similares.
La invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos: 15 Ejemplo 1
Epítopos de célula T potenciales
20 Las regiones de Amb a 1 descritas más adelante se identificaron como que comprenden potencialmente uno o más epítopos de células T:
Tabla 2
REGIÓN DE INTERÉS
RESTOS EN AMB A 1 (isoforma 1.3) SECUENCIA
A
178-189 GMIKSNDGPPIL
B
202-213 GSSQIWIDHCSLSKS
C
343-354 DKDLLENGAIFVTSGSDPVLTPVQ
D
364-375 PVQSAGMIPAEPGEA
E
103-114 EGTLRFAAAQNRPLW
F
130-141 QELVVNSDKTIDGRGVKVEII
G
376-387 GEAAIKLTSSAGVFSCHP
H
226-237 GSTHVTISNCKF
I
280-297 FGFFQWNNNYDRWGTYA
J
38-48 ETRSLQACEALN
25 Las secuencias proporcionadas para las regiones G, I y J en la solicitud de prioridad, GB 0815258.3 son las siguientes: GEAAIKLTSSAGVLSCRP (Región G), HGFFQVVNNNYDRGTYA (Región I) y ETRRLTTSGAYN (Región J). Estas secuencias se han corregido en la Tabla 2 de forma que las mismas corresponden a las regiones pertinentes de la secuencia de longitud completa de Amb a 1 isoforma 1.3 como se proporciona más adelante.
30 Las regiones mostradas en la Tabla 2 se analizaron adicionalmente posteriormente para observar cuál de ellas estaba altamente conservada entre las 4 isoformas de Amb a1 diferentes mostradas más adelante (1.1, 1.2, 1.3 y 1.4). Para las secuencias más adelante, se usan los siguientes estilos de texto para indicar regiones de interés:
Región A, Región B, Región C, Región D, Región E, Región F, Región G, Región H, Región I, Región J
Se consideró que los siguientes péptidos estaban altamente conservados y por lo tanto se tomaron para ensayos adicionales
Tabla 3
Péptido
Obtenido de la región de interés Secuencia SEC ID Nº:
RGW01
A GMIKSNDGPPI I
RGW01A
A GLIKSHDGPPV 2
RGW01B
A GLIKSNDGPAA 3
RGW02
B GSSQIWIDHSSLSKS 4
RGW02A
B GSSQIWIDHCSLSKS 5
RGW02B
B GGSQIWIDHCSLSKA 6
RGW03
C KDLLENGAIFVTSG 7
RGW03A
C DVFENGAIFVPSG 8
RGW03B
C RDLLENGAIFLPSG 9
RGW04
D KAGMIPAEPGEA 10
RGW4A
D SAGMIPAEPGEA 11
RGW05
E KEGTLRFAAAQNRP 12
RGW05A
E KEGTLRFGAAQNRP 13
RGW06
F VVNSDKTIDGRGVKVE 14
RGW06A
F AINNDKTIDGRGAKVE 15
RGW07
G GEAAIKLTSSAGVLS 16
Péptido
Obtenido de la región de interés Secuencia SEC ID Nº:
RGW07A
G GEAVLRLTSSAGVLS 17
RGW07B
G GESALSLTSSAGVLS 18
RGW07C
G KGEAAIKLTSSAGVLSK 19
RGW07D
G KGEAAIKLTSSAGVLSKK 20
RGW08
H GSTHVTISNSKF 21
RGW08A
H GSTHVTISNCKF 22
RGW08B
H GSTHFTVSNCLF 23
RGW08C
H GSTHFTVSNSLF 24
RGW08D
H GTTRLTVSNSLF 25
RGW09
J ETRRSLKTSGAYN 26
RGW10
J FGFFQVVNNNYD 27
RGW10A
I HGFFQVVNNNYD 28
RGW11
I VNNNYDRWGTYA 29
RGW11A
I VNNNYDKWGSYA 30
RGW11B
I VNNNYERWGSYA 31
Como será evidente, las secuencias anteriores no son necesariamente idénticas a las secuencias nativas de las regiones de interés. En particular, los péptidos de la invención se pueden someter a ingeniería genética para mejorar la solubilidad y/o reducir la formación de dímero y/o reducir la probabilidad de entrecruzamiento de IgE con relación a las secuencias nativas. La siguiente tabla (Tabla 4) proporciona ilustraciones específicas de los principios anteriores aplicados por los inventores para producir los péptidos de la Tabla 3 (SEC ID Nº: 1 a 31).
Tabla 4
Secuencia
Identificacióna pl GRAVY Comentarios
GMIKSNDGPPIL
Región A 5,84 -0,083
GMIKSNDGPPI
RGW01 (SEC ID: 1) 5,84 -0,436 El péptido sometido a ingeniería genética tiene valor GRAVY más bajo: más soluble
GSSQIWIDHCSLSKS
Región B 6,73 -0,273
GSSQIWIDHCSLSKS
RGW02 (SEC ID: 4) 6,73 -0,493 El péptido sometido a ingeniería genética tiene ser en lugar de cys (evita la formación de dímero) y tiene valor GRAVY más bajo: más soluble
DKDLLENGAIFVTSGSDPVLTPVQ
Región C
RDLLENGAIFLPSG
RGW03B (SEC ID: 9) Péptido sometido a ingeniería genética significativamente más corto: evita el riesgo de liberación de histamina a través del entrecruzamiento de IgE
AIKLTSSAGVFSCHP
Región G
GEAAIKLTSSAGVLS
RGW07 (SEC ID: 16) 6,00 0,60 El péptido sometido a ingeniería genética carece de cys en los últimos tres restos (para prevenir la formación de dímero) y tiene L reemplazando F al igual que ocurre en 1.1, 1.2 y 1.4.
10 Las filas resaltadas en gris en la tabla anterior representan la secuencia nativa de una región. Los péptidos modificados de acuerdo con la invención se muestran debajo de cada secuencia nativa. Los restos en negritas y subrayado representan adiciones a o sustituciones de la secuencia nativa.
15 Ensayos de citoquina y selección de combinaciones preferidas
Los perfiles de secreción de citoquina de PBMC de 50 individuos se analizaron como respuesta a la estimulación peptídica usando los péptidos de SEC ID Nº: 1 a 31. Los sobrenadantes del ensayo de liberación de citoquina se ensayaron para determinar la presencia de IL-13 e IFN-gamma, usando un ensayo en serie multiplex bead.
20 Un ensayo de liberación de citoquina típico requiere 40 x 106 PBMC por sujeto. Con más detalle, 250 !l de una solución de 200 !g/ml de la concentración del antígeno o péptido apropiado se distribuyen en los pocillos apropiados de placas de 48 pocillos. Las placas se incuban en una incubadora de CO2 al 5% a 37ºC durante un máximo de 4 horas. 250 !l de una suspensión de 5 x 106 células/ml de PBMC se añade posteriormente a cada pocillo y las placas
25 se regresan a la incubadora durante 5 días. A continuación de la estimulación, las muestras del sobrenadante se recogen para ensayo mediante ensayo multiplex bead de acuerdo con protocolos convencionales. Los datos se analizaron para sujetos que tienen una respuesta de Interferón gamma o IL-13 > 100 pg/ml y los péptidos se priorizaron en base al % de índice de sujetos que responden como se muestra más adelante en la Tabla 5.
Tabla 5
Número de sujetos que responden >100 pg/ml
% de sujetos que responden
RGW01
34 68
RGW01A
25 50
RGW03
25 50
RGW01B
24 48
RGW04
23 46
RGW 03A
22 44
RGW 03B
22 44
RGW 10
21 42
RGW 04A
20 40
RGW 10A
20 40
RGW 05
19 38
RGW 02
18 36
RGW 09
18 36
RGW 06
17 34
RGW 06A
17 34
RGW11A
17 34
RGW 05A
16 32
RGW 08B
10 20
RGW11B
10 20
RGW 02B
9 18
RGW 07A
9 18
RGW 11
8 16
RGW 08A
6 12
RGW 08D
6 12
RGW 02A
5 10
RGW 07B
5 10
RGW 08
4 8
RGW 07
2 4
RGW 08C
2 4
5 En base a lo anterior una combinación preferida de la invención se seleccionó para que contuviera: RGW01 (potencialmente sustituido con RGW01A o RGW01B); y uno de RGW03, RGW03A o RGW03B; y uno de RGW04 o RGW04A.
A partir de los péptidos restantes, los siguientes más potentes son RGW02, RGW09, RGW06, RGW06A, RGW10 o
10 RGW10A, RGW05 o RGW05A. Una combinación peptídica preferida puede comprender típicamente al menos un péptido adicional seleccionado entre este grupo.
Ya que la solubilidad es un criterio clave para administrar péptidos a pacientes, se realizó un ensayo de solubilidad in vitro adicional para evaluar la solubilidad de péptidos en un entorno ácido (pH 2,97, HCl 0,1 mM, 0,5% (p/v), 1
15 tioglicerol (ca. 46 mM), trehalosa 230 mM). Por ejemplo, se observó que RGW03B tiene una solubilidad de 3,85 mg/ml en comparación con <0,62 mg/ml para RGW03. Por consiguiente, los inventores han determinado que RGW03B se prefiere con respecto a RGW03.
La Figura 1 muestra el número de individuos que responden a una mezcla de núcleo de RGW01, RGW03B y
20 RGW04A. Un análisis combinado de las respuestas positivas de IFN gamma o IL-13 para los péptidos representados en la mezcla de núcleo muestra que estos 3 péptidos proporcionan cobertura para 38/50 individuos alérgicos a ambrosía (76% de la población de estudio). Esto indica que los péptidos de la mezcla de núcleo se unen a casi todas las moléculas DR del CMH de clase II y que estos complejos se reconocen por células T en la mayoría de los individuos alérgicos. El efecto creciente de la adición de RGW02, RGW05 y RGW06A también se muestra. El
25 beneficio de la adición de epítopos a partir del segundo grupo de péptidos se muestra claramente.
Se realizó un ensayo adicional de citoquina para evaluar la liberación de IL-10 a partir del mismo panel de individuos, inducido por los péptidos de SEC ID Nº 1 a 31. El análisis de respuesta de IL-10 muestra que RGW07 y RGW07B inducen cantidades significativas de IL-10 (Figura 2). RGW07 por sí solo indujo IL-10 en 49/50 individuos. 30 Una combinación peptídica preferida por lo tanto puede comprender típicamente al menos un péptido adicional seleccionado entre el grupo de RGW07. Un análisis combinado de las respuestas positivas de IFN-gamma o IL-13
para los péptidos representados en las mezclas de 6 péptidos identificados en la Figura 1 (RGW01 + RGW03B + RGW04A + RGW02 + RGW05 + RGW06A) junto con RGW07 dio una respuesta positiva de IFN gamma o IL-13 en 49/50 sujetos. Por tanto, esta combinación peptídica cubre eficazmente la población de estudio completa y se esperaría cobertura completa con el uso de variantes de solubilidad mejorada de RGW07 (véase más adelante). Las
5 combinaciones peptídicas que comprenden (RGW01 + RGW03B + RGW04A + RGW02 + RGW05 + RGW06A) o variantes de los mismos junto con RGW07 o variantes del mismo también tienen la ventaja de proporcionar una respuesta positiva de IL-10 (véase más adelante y la Figura 3).
El ensayo de solubilidad demostró que RGW07 tenía mala solubilidad en un entorno ácido, así que se añadieron restos de lisina adicionales a RGW07 (indicado en la Tabla 6). Los péptidos modificados se ensayaron para determinar solubilidad y su capacidad de inducir IL-10 a partir de PBMC en presencia de la mezcla de péptidos identificados en la Figura 1 (RGW01 + RGW03B + RGW04A + RGW02 + RGW05 + RGW06A). Los controles incluían la mezcla de péptido sin variante de RGW07 y con alérgeno Amb a 1 completo. Los resultados se muestran en la Figura 3.
15 Tabla 6 – Solubilidad de RGW07 y variantes
Péptido
Secuencia Restos en Amb a 1 Punto isoeléctrico (pl) GRAVY Solubilidad mg/ml
RGW07
GEAAIKLTSSAGVLS 376-390 6,00 0,69 0,7
RGW 07C
KGEAAIKLTSSAGVLSK K376-390K 9,70 0,15 1,55
RGW 07D
KGEJIKLTSSAGVLSKK K376-390KK 10,00 -0,07 4,26
En base a estos análisis, se observó que RGW07D se prefería tanto por solubilidad como por su capacidad de inducir IL-10 en presencia de los otros seis péptidos.
Ejemplo 2 – Ensayo de liberación de histamina
El propósito de este ensayo era identificar péptidos individuales que son capaces de activar basófilos sanguíneos
25 (como un sustituto de mastocitos tisulares) que da como resultado la liberación de histamina que puede dar como resultado reacciones alérgicas durante la terapia. Los péptidos o combinaciones de péptidos que inducen la liberación de histamina frecuentemente se pueden considerar inadecuados para inclusión en la vacuna de péptidos.
La liberación de histamina requiere el entrecruzamiento de moléculas de IgE específicas adyacentes en la superficie del basófilo. Los péptidos que se estaban evaluando eran pequeños (11 a 18 aminoácidos de longitud) y, por lo tanto, no deberían poseer una estructura terciaria significativa que les posibilitaría retener la conformación de un epítopo de unión a IgE de la molécula completa. Adicionalmente, los monómeros peptídicos en solución, incluso si los mismos están unidos por IgE, no deben ser capaces de reticular moléculas de IgE adyacentes.
35 Se evaluó la liberación de histamina a partir de sangre completa periférica fresca de sujetos alérgicos a ambrosía. Se usaron basófilos de sangre periférica como un sustituto de mastocitos tisulares que no eran prácticos para el ensayo. La sangre se incubó in vitro con péptidos individuales identificados en el Ejemplo 1 (RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A, RGW07 y RGW07D). Adicionalmente, se analizaron las respuestas a mezclas preferidas de 7 péptidos identificados en el Ejemplo 1. Las mezclas preferidas ensayadas de 7 péptidos consistían en i) RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A, RGW07 y ii) RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A y RGW07D.
La liberación de histamina en respuesta al extracto de alérgeno de ambrosía completo se midió en cada sujeto para confirmar la sensibilización de basófilos. Se incluyó un control positivo en cada ensayo que representa la liberación 45 de histamina total, generado congelando/descongelando las células dos veces. Se generó un control negativo para liberación de histamina espontánea incubando células en tampón únicamente.
El ensayo se realizó usando el kit de Inmunoensayo de Liberación de Histamina Immunotech de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación de la exposición in vitro de basófilos sanguíneos a péptidos, mezclas de péptidos, alérgeno completo o tampón en pocillos de placa de microtitulación, los sobrenadantes se retiraron y la histamina en las muestras se convirtió a acil histamina. Las muestras aciladas se ensayaron mediante un ELISA de acil histamina competitivo.
Los péptidos se ensayaron para determinar su capacidad de inducir liberación de histamina a lo largo de un intervalo
55 de 5 log en base 10 (1 a 10.000 ng/ml). El intervalo de concentración ensayado se seleccionó en base a dosis teóricas in vivo de péptido que se pueden conseguir durante la terapia. Por ejemplo, una dosis de 31 !g (aproximadamente 3 nmol/equivalente de péptido) de cada péptido que entra en un volumen de sangre de 5 litros, daría como resultado una concentración en sangre de 6 ng/ml, en el extremo inferior del intervalo de dosis del ensayo de liberación de histamina. Se usó extracto de alérgeno de ambrosía completo a lo largo de un intervalo de concentración ligeramente más elevado (10 a 100.000 ng/ml).
Se realizaron mediciones únicas para cada dilución. Después de la finalización del ELISA, los niveles de histamina individuales se determinaron mediante interpolación de la curva normal generada en el ensayo de ELISA. Los resultados de las muestras se ajustaron para permitir la dilución. Cuando dos o más diluciones consecutivas de una preparación de péptido/alérgeno provocaba >15% de liberación de histamina total observada en el control positivo
5 congelado o descongelado (>15% de control positivo) o cuando un valor único de >15% de control positivo se consiguió en la concentración más elevada ensayada (10 !g/ml para péptidos), esto se consideró una “liberación de histamina positiva”.
Durante el estudio se completó un total de 49 ensayos de liberación de histamina. De éstos, 6 ensayos se
10 rechazaron, debido a niveles inaceptablemente elevados (>15% de control positivo) de liberación espontánea en los pocillos de control negativo más tampón. Por lo tanto, se incluyó un total de 43 sujetos en el análisis. 20 de estos sujetos se ensayaron con el péptido RGW07D y la mezcla que lo contenía. Los hallazgos del estudio se resumen en la Tabla 7.
15 Tabla 7
Péptido o combinación
Sujetos con liberación de histamina >15% de control positivo Liberación de histamina media de 43 ó 20 sujetos como un % del control positivo a 10 !g/ml Liberación de histamina máxima (% de control positivo a 10 !g/ml)
1) RGW 01
0/43 1% 0%
2) RGW 03B
0/43 1% 0%
3) RGW 04A
0/43 0% 0%
4)RGW05
0/43 0% 0%
5) RGW 02
0/43 1% 0%
6) RGW 06A
0/43 1% 0%
7) RGW 07
0/43 1% 0%
8) Péptidos 1-6 y RGW07 en combinación
0/43 1% 0%
9) RGW 07D
0/20 3% 0%
10) Péptidos 1-6 y RGW07D en combinación
2/20* 5% 20%
Control de alérgeno de ambrosía
28/43 25% 78%
* Péptidos 1-6 y RGW07D en combinación fueron >15% en dos sujetos únicamente a 10 !g/ml.
Se muestran los resultados para la dosis más elevada de péptidos ensayada en el ensayo (10 !g/ml). El control de alérgeno de ambrosía indujo liberación de histamina significativa en el 65% de los 43 sujetos. Incluso a la
20 concentración más baja de 10 ng/ml, el extracto de alérgeno completo indujo liberación de histamina significativa en 22/43 (51%) individuos con una liberación media para los 43 sujetos del 30% del control positivo. El extracto de ambrosía completo crudo contenía aproximadamente el 0,5% de alérgeno mayor Amb aI, enfatizando la sensibilidad exquisita del ensayo de basófilo in vitro para evaluar la seguridad de los péptidos los cuales a 10 !g/ml están presentes en un más de >10.000 veces con respecto a Amb aI en el extracto crudo a 10 ng/ml.
25 Los datos muestran que los ocho péptidos individuales no provocan liberación de histamina significativa a partir de los basófilos de individuos alérgicos a ambrosía cuando se comparan con el alérgeno completo. Una combinación de péptidos RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A, RGW07 tampoco provocó liberación de histamina significativa en los 43 sujetos.
30 La combinación de péptidos RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A y RGW07D dio una respuesta positiva débil en 2 individuos con valores del 16% y el 20% del control positivo a la concentración de péptido más elevada de 10 !g/ml. Los valores de % de liberación en las cuatro concentraciones más bajas ensayadas fueron <15%, es decir negativos. Dado el gran exceso de dosis de péptido ensayado en este ensayo en
35 comparación con concentraciones en sangre probables de los péptidos a continuación de dosificación clínica – la concentración más elevada ensayada representa un exceso de >1000 veces con respecto a las concentraciones en sangre esperadas – no se anticipa que esta combinación de péptido provocará una liberación de histamina significativa mediante activación y desgranulación de basófilos o mastocitos mediada por IgE o por mediada por péptido directo.
40 Ejemplo 3: Ensayo clínico de combinación peptídica
Una mezcla preferida de 7 péptidos que consiste en los péptidos RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A y RGW07D se ensaya en un ensayo clínico ciego controlado con placebo aleatorizado. La eficacia de esta 45 mezcla para reducir los síntomas alérgicos se evalúa. El diseño de estudio del ensayo clínico está de acuerdo con
las directrices de la buena práctica clínica.
Los sujetos alérgicos a ambrosía se seleccionan para identificar respuesta dérmica de fase tardía (LPSR) y los valores del ensayo de provocación conjuntival (CPT) a continuación de exposición con alérgeno de ambrosía. Los
5 detalles de los ensayos de LPSR y CPT se proporcionan más adelante. Las titulaciones se realizan con el fin de identificar las concentraciones mínimamente eficaces de alérgeno completo para la generación de un valor de LPSR y CPT apropiado. Se toman muestras de sangre para evaluar los niveles de IgE específica de ambrosía.
Las respuestas de línea basal dérmica y conjuntival al alérgeno de ambrosía para todos los sujetos se establecen
10 usando una Exposición de Línea Basal que tiene lugar entre 1 y 4 semanas antes del estudio de la administración de la medicación. Se administra una inyección intradérmica de alérgeno de ambrosía a la concentración mínimamente eficaz identificada en la selección en la superficie volar de un antebrazo seleccionado. Los sujetos se evalúan para asegurar que los mismos experimentan una respuesta dérmica de fase temprana (EPSR), una CPT y una Respuesta Dérmica de Fase Tardía (LPSR) a alérgeno de ambrosía completo y la magnitud de la reacción de línea
15 basal se registra de la manera siguiente:
15 minutos (± 3 minutos) después de la inyección, el perfil de cualquier EPSR se dibuja en la piel con un bolígrafo. Los diámetros más largo y ortogonal se miden y se registran para cada respuesta y se calcula el área de la respuesta de cada brazo.
20 A un mínimo de 30 minutos después de la inyección, el alérgeno de ambrosía a la concentración mínimamente eficaz identificada en la selección se instila en un ojo seleccionado. La picazón calificada por el sujeto y el enrojecimiento y secreción lagrimal calificada por el observador se puntúan después de 5 minutos (± 2 minutos). El sistema de puntuación se muestra en la Tabla 8 más adelante.
25 Ocho horas (± 10 minutos) después de cada inyección se dibuja el perfil de cualquier respuesta de fase tardía en la piel con un bolígrafo. Los diámetros más largo y ortogonal se miden y se registran para cada respuesta y se calcula el área de la respuesta en cada brazo.
30 Los sujetos que producen una reacción de línea basal adecuada se asignan a grupos de dosificación, se aleatorizan y se introducen en la Fase de Tratamiento.
Tabla 8
Síntoma
Puntuación
Enrojecimiento de la conjuntiva (calificado por el observador)
0 = ninguno 1 = ligero (apenas perceptible) 2 = moderado (enrojecimiento notable) 3 = grave (enrojecimiento intenso)
Secreción lagrimal (calificado por el observador)
0 = ninguna 1 = ligera (apenas perceptible) 2 = moderada (lagrimeo ocasional) 3 = grave (lágrimas bajan por la mejilla)
Picazón (autoevaluada)
0 = ninguna 1 = ligera (sensación de hormigueo ocasional) 2 = moderada (picazón notable pero sin necesidad de frotar el ojo) 3 = grave (picazón con necesidad de frotar el ojo) 4 = insoportable (picazón insoportable con un deseo compulsivo de frotar el ojo)
35 La Fase de Tratamiento consiste en un periodo de 6 semanas para cada sujeto. Durante este periodo un grupo de sujetos recibe una inyección intradérmica única para cada una de la mezcla preferida (0,03, 0,3, 3, 1, 12 nmol de cada péptido por dosis) o placebo de diluyente en la Visita 1 de la Fase de Tratamiento el día uno. Se realizan inyecciones intradérmicas en la superficie flexora del antebrazo seleccionado. Después se realiza una
40 administración repetida en las Visitas 2, 3 y 4 de la Fase de Tratamiento, cada una con dos semanas de diferencia (14 ± 2 días). Una cohorte de 10 sujetos recibe tratamiento a cada nivel de dosis (8 reciben la mezcla preferida y 2 el placebo). La primera cohorte recibe 0,03 nmol de cada péptido en la mezcla y cada cohorte posterior en el grupo recibe el nivel de dosis más elevado siguiente.
45 19 a 28 semanas después del comienzo del tratamiento se vuelven a ensayar las respuestas dérmica y conjuntival de los sujetos al alérgeno completo en una exposición post tratamiento (PTC.) Las respuestas dérmicas al alérgeno de ambrosía se evalúan mediante medición de la EPSR y LPSR como se ha descrito anteriormente. El área promedio de respuesta se calcula como se ha descrito anteriormente. Las respuestas conjuntivales a alérgeno de ambrosía se evaluaron mediante medición del CPT como se ha descrito anteriormente. Se toman muestras de sangre para medición de IgE específica de ambrosía.
El área de EPSR promedio después de tratamiento se compara con el área de EPSR de línea basal para cada sujeto. El cambio global en el área de EPSR para los 10 pacientes en cada cohorte se evaluó posteriormente. El área de LPSR promedio después del tratamiento se compara con el área de LPSR de línea basal para cada sujeto. El cambio global en el área de LPSR de los 10 pacientes en cada cohorte se evaluó posteriormente. La puntuación de CPT después del tratamiento se compara con la puntuación de CPT de línea basal para cada sujeto. El cambio global en la puntuación de CPT para los 10 pacientes en cada cohorte se evaluó posteriormente.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CIRCASSIA LIMITED
<120> PÉPTIDO PARA VACUNA
<130> N.105763ASA
<150>
GB 0814986.6 <151>
<150>
GB 0815218.3 <151>
<160> 149
<170> Patentln versión 3.4
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 2
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 3
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> péptido sintético
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 6
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<211> 14
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 7
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<211> 13
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 8
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 9 <210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 11
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 12
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 14
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> péptido sintético
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<213> Artificial
<220>
<223> péptido sintético 15
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
25 <400> 22
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Artificial
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Artificial
<220>
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 29
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<212> PRT
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 34
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 37
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<211> 18
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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30
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<211> 12
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
35
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 40 45
<210> 41
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<211> 12
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 42
15
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
20
<400> 43
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<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<213> Ambrosia artemisiifolia
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
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<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (3)..(3)
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<220>
<221>
MISC_FEATURE 15 <222> (10)..(10)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221>
MISC_FEATURE 20 <222> (16)..(16)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 50
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<211> 132
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
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<212> PRT 15 <213> Dermatophagoides pteronyssinus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4) 20 <223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 52 <212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
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<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
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<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 58
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<211> 213
<212> PRT
<213> Dermatophagoides farinae
<400> 59
<210> 60
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<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
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<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 61
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Lolium perenne
<400> 63
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<211> 97
<212> PRT
<213> Lolium perenne
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<212> PRT
<213> Lolium perenne
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<213> Lolium perenne
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<213> Lolium perenne
<220>
<221> MISC_FEATURE 10 <222> (103)..(103)
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<400> 68
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<213> Parietaria judaica
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<212> PRT
<213> Parietaria judaica
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<212> PRT
<213> Parietaria judaica
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<213> Parietaria judaica
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<213> Phleum pratense
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<212> PRT
<213> Phleum pratense
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<213> Phleum pratense
<400> 79
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<211> 276
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 80
<210> 81
<211> 284
<212> PRT
<213> Phleum pratense
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<211> 286
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 82
<210> 83
<211> 287
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 83
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<213> Phleum pratense
<400> 84
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<213> Phleum pratense
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<211> 276
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<211> 284
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 89
<210> 90
<211> 286
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 90
<210> 91
<211> 281
<212> PRT
<213> Phleum pratense
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<210> 92
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<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 92
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<212> PRT
<213> Phleum pratense
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<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 94
<210> 95
<211> 312
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 95
<210> 96
<211> 280
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 96
<210> 97
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<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 97
<210> 98
<211> 312
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 98
<210> 99
<211> 138
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 99
<210> 100
<211> 57
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 100
<210> 101
<211> 80
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 101
5 <210> 102
<211> 106
<212> PRT
<213> Phleum pratense
10 <400> 102
<210> 103
<211> 138
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 103
<210> 104
<211> 132
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 104 <210> 105
<211> 78
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 105 <210> 106
<211> 131
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 106 <210> 107
<211> 227
<212> PRT
<213> Vespula vulgaris
<400> 107
<210> 108
<211> 300
<212> PRT
<213> Vespula maculifrons
<400> 108
<210> 109
<211> 336
<212> PRT
<213> Vespula vulgaris
<400> 109
<210> 110
<211> 331
<212> PRT
<213> Vespula vulgaris
<400> 110 <210> 111
<211> 206
<212> PRT
<213> Vespula vulgaris
<400> 111 <210> 112
<211> 160
<212> PRT
<213> Betula pendula
<400> 112 <210> 113
<211> 133
<212> PRT
<213> Betula pendula
<400> 113 <210> 114
<211> 205
<212> PRT
<213> Betula pendula
<400> 114
<210> 115
<211> 85
<212> PRT
<213> Betula pendula
<400> 115
5 <210> 116
<211> 24
<212> PRT
<213> Quercus alba
10 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = aminoácido desconocido
15 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa = aminoácido desconocido
20 <400> 116
<210> 117 25 <211> 40
<212> PRT
<213> Carpinus betulus
<220> 30 <221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa = aminoácido desconocido
<400> 117
<210> 118
<211> 44
<212> PRT
<213> Alnus glutinosa 10
<400> 118
15 <210> 119
<211> 110
<212> PRT
<213> Betula pendula
20 <400> 119
<210> 120
<211> 626
<212> PRT
<213> Arachis hypogaea
<400> 120
<210> 121
<211> 392
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 121
<210> 122
<211> 397
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 122
<210> 123
<211> 397
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 123
<210> 124
<211> 398
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 124
<210> 125
<211> 396
<212> PRT
<213> Ambrosia artemisiifolia
<400> 125
<210> 126
<211> 373
<212> PRT
<213> Cryptomeria japonica
<400> 126
<210> 127
<211> 374
<212> PRT
<213> Cryptomeria japonica
<400> 127
<210> 128
<211> 514
<212> PRT
<213> Cryptomeria japonica
<400> 128
<210> 129
<211> 514
<212> PRT
<213> Cryptomeria japonica
<400> 129
<210> 130
<211> 373
<212> PRT
<213> Cryptomeria japonica
<400> 130
<210> 131
<211> 374
<212> PRT
<213> Cryptomeria japonica
<400> 131
<210> 132
<211> 174
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 132 <210> 133
<211> 24
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 133
<210> 134
<211> 265
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 134
<210> 135
<211> 180
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 135 <210> 136
<211> 187
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 136
<210> 137
<211> 29 5 <212> PRT
<213> Equus caballus
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (3)..(3)
<223> Xaa = aminoácido desconocido
<220>
<221>
MISC_FEATURE 15 <222> (28)..(28)
<223> Xaa = aminoácido desconocido
<400> 137
<210> 138
<211> 211
<212> PRT
<213> Euroglyphus maynei
<400> 138
<210> 139
<211> 211
<212> PRT
<213> Euroglyphus maynei
<400> 139
<210> 140
<211> 211
<212> PRT
<213> Euroglyphus maynei
<400> 140
<210> 141
<211> 212
<212> PRT
<213> Euroglyphus maynei
<400> 141
<210> 142
<211> 307
<212> PRT
<213> Poa pratensis
<400> 142 <210> 143
<211> 333
<212> PRT
<213> Poa pratensis
<400> 143
<210> 144
<211> 373
<212> PRT
<213> Poa pratensis
<400> 144
<210> 145
<211> 685
<212> PRT
<213> Periplaneta americana
<400> 145
<210> 146
<211> 446
<212> PRT
<213> Periplaneta americana
<400> 146
<210> 147
<211> 352
<212> PRT
<213> Blattella germánica
<400> 147
<210> 148
<211> 182
<212> PRT
<213> Blattella germanica
<400> 148
<210> 149
<211> 200
<212> PRT
<213> Blattella germanica
<400> 149
<210> 150
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> péptido sintético
<400> 150

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición que comprende:
    (i)
    al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW03B (RDLLENGAIFLPSG; SEC ID Nº: 9), RGW03A (DVFENGAIFVPSG; SEC ID Nº: 8) o RGW03 (KDLLENGAIFVTSG; SEC ID Nº: 7) o una variante de los mismos;
    (ii)
    al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW01 (GMIKSNDGPPI; SEC ID Nº: 1), RGW01A (GLIKSHDGPPV; SEC ID Nº: 2) o RGW01B (GLIKSNDGPAA; SEC ID Nº: 3) o una variante de los mismos;
    (iii) al menos un polipéptido original seleccionado entre RGW04 (KAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 10) o RGW04A (SAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 11) o una variante de los mismos; y
    (iv) opcionalmente al menos un polipéptido original seleccionado entre cualquiera de SEC ID Nº: 4-6 y 12-31 o una variante de los mismos;
    en la que dichas variantes de (i) a (iv) son:
    (a) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en:
    -
    la secuencia de péptido original equivalente; o
    -
    una secuencia homóloga que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con la secuencia de péptido original equivalente, secuencia que es capaz de inducir inmunotolerancia en un individuo a la secuencia de péptido original equivalente, o
    (b) un polipéptido de 9 a 20 aminoácidos de longitud que comprende una región que consiste en una secuencia que representa:
    -
    un fragmento de al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia peptídica original equivalente; o
    -
    un homólogo de dicho fragmento que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con dichos al menos 9 aminoácidos contiguos de la secuencia peptídica original equivalente,
    secuencia que es capaz de inducir inmunotolerancia en un individuo a la secuencia peptídica original equivalente, para su uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
  2. 2. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición:
    a) es capaz de inducir inmunotolerancia en al menos el 50% o al menos el 60% de un panel de individuos alérgicos a ambrosía en la población; y/o b) comprende al menos un polipéptido adicional hasta un total de trece polipéptidos únicos/diferentes, en la que los polipéptidos adicionales:
    -
    comprenden una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 anteriores no seleccionadas en (i) a (iv); y
    -
    tiene de 9 a 30 aminoácidos de longitud; y/o
    c) comprende hasta un máximo de trece polipéptidos.
  3. 3.
    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 (b) que tiene 9 a 20 ó 13 a 17 aminoácidos de longitud y/o en la que dicho polipéptido tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.
  4. 4.
    Una composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende el polipéptido RGW01 o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); el polipéptido RGW03B
    o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); y el polipéptido RGW04A o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b).
  5. 5.
    Una composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos un polipéptido seleccionado entre un polipéptido de RGW02 (GSSQIWIDHSSLSKS; SEC ID Nº: 4), RGW09 (ETRRSLKTSGAYN; SEC ID Nº: 26), RGW06 (VVNSDKTIDGRGVKVE; SEC ID Nº: 14), RGW06A (AINNDKTIDGRGAKVE; SEC ID Nº: 15), RGW10 (FGFFQVVNNNYD; SEC ID Nº: 27) o RGW10A (HGFFQVVNNNYD; SEC ID Nº: 28), RGW05 (KEGTLRFAAAQN-RP; SEC ID Nº: 12) o RGW05A (KEGTLRFGAAQNRP ; SEC ID Nº: 13) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); y opcionalmente que comprende además un polipéptido de RGW07 (GEAAIKLTSSAGVLS; SEC ID Nº: 16), RGW07C (KGEAAIKLTSSAGVLSK SEC ID Nº: 19) o RGW07D (KGEAAIKLTSSAGVLSKK SEC ID Nº: 20) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b).
  6. 6.
    Una composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende RGW01 o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); RWG03B o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); RGW04A o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); RGW02 o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); RGW05 o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); RGW06A o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); y RGW07D o una variante del mismo como se define en la reivindicación 1 (a)
    o (b).
  7. 7. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que:
    (i)
    uno o más de los polipéptidos tiene una o más modificaciones seleccionadas entre las siguientes:
    (a)
    acetilación N terminal;
    (b)
    amidación C terminal;
    (c)
    uno o más hidrógenos en las aminas de cadena lateral de Arginina y/o Lisina reemplazadas con un grupo metileno;
    (d)
    glicosilación; y
    (e)
    fosforilación; y/o
    (ii)
    al menos uno de los péptidos se ha sometido a ingeniería genética para ser soluble de forma que el mismo comprende:
    (a)
    N terminal a los restos del péptido que flanquean un epítopo de célula T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los dos a seis aminoácidos contiguos inmediatamente N terminales a dichos restos en la secuencia de la proteína a partir de la cual se obtiene el péptido; y/o
    (b)
    C terminal a los restos del péptido que flanquean un epítopo de célula T: uno a seis aminoácidos contiguos que corresponden a los uno a seis aminoácidos contiguos inmediatamente C terminales a dichos restos en la secuencia de la proteína a partir de la cual se obtiene el péptido; o
    (c)
    N y/o C terminal a los restos del péptido que flanquean un epítopo de célula T, al menos un aminoácido seleccionado entre arginina, lisina, histidina, glutamato y aspartato,
    en la que el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 3,5 mg/ml y el epítopo de célula T tiene una solubilidad de menos de 3,5 mg/ml; y/o
    (iii) al menos uno de los péptidos se ha sometido a ingeniería genética para que sea soluble de forma que adicionalmente:
    (a)
    cualquier resto de cisteína en la secuencia nativa del péptido se reemplaza con serina o ácido 2aminobutírico; y/o
    (b)
    cualquier resto hidrófobo en los hasta tres aminoácidos en el extremo N y/o C de la secuencia nativa del péptido, que no están comprendidos en un epítopo de célula T, se suprimen; y/o
    (c)
    dos aminoácidos consecutivos cualquiera que comprenden la secuencia Asp-Gly en los hasta cuatro aminoácidos en el extremo N y/o C de la secuencia nativa del péptido, que no están comprendidos en un epítopo de célula T, se suprimen; y/o
    (iv) cada polipéptido tiene una concentración en el intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml, 0,3 a 200 nmol/ml o 30 a 120 nmol/ml
  8. 8.
    Una composición que comprende al menos tres secuencias polinucleotídicas las cuales cuando se expresan provocan la producción de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que opcionalmente cada secuencia polinucleotídica capaz de expresar un polipéptido diferente está presente en el mismo o en diferentes vectores polinucleotídicos, para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
  9. 9.
    Un producto que contiene entre tres y trece polipéptidos, en el que al menos un polipéptido se selecciona entre cada uno de los siguientes grupos de polipéptidos:
    a) RGW01 (GMIKSNDGPPI; SEC ID Nº: 1), RGW01A (GLIKSHDGPPV; SEC ID Nº: 2) o RGW01B (GLIKSNDGPAA; SEC ID Nº: 3) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); b) RGW03B (RDLLENGAIFLPSG; SEC ID Nº: 9), RGW03A (DVFENGAIFVPSG; SEC ID Nº: 8) o RGW03 (KDLLENGAIFVTSG; SEC ID Nº: 7) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a)
    o (b); y c) RGW04 (KAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 10) o RGW04A (SAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 11) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); en la que cada polipéptido diferente es para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia.
  10. 10. Un producto que contiene entre tres y trece secuencias polinucleotídicas, cada una de las cuales codifica un polipéptido diferente como se define en la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos un polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado entre cada uno de los siguientes grupos de polipéptidos:
    a) RGW01 (GMIKSNDGPPI; SEC ID Nº: 1), RGW01A (GLIKSHDGPPV; SEC ID Nº: 2) o RGW01B (GLIKSNDGPAA; SEC ID Nº: 3) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); b) RGW03B (RDLLENGAIFLPSG; SEC ID Nº: 9), RGW03A (DVFENGAIFVPSG; SEC ID Nº: 8) o RGW03 (KDLLENGAIFVTSG; SEC ID Nº: 7) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b); y c) RGW04 (KAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 10) o RGW04A (SAGMIPAEPGEA; SEC ID Nº: 11) o una variante de los mismos como se define en la reivindicación 1 (a) o (b);
    y en el que cada polinucleótido diferente es para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía en un ser humano.
  11. 11.
    Una formulación farmacéutica que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; o un producto de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10; y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia; en la que opcionalmente dicha composición, vector o producto se formula para la administración oral, administración nasal, administración epicutánea, administración subcutánea, administración sublingual, administración intradérmica, administración bucal o para administración mediante inhalación o mediante inyección.
  12. 12.
    La composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o producto como se define en la reivindicación 9 ó 10, comprendiendo adicionalmente un alérgeno de polipéptido adicional para uso en la inducción de inmunotolerancia de un individuo al alérgeno de polipéptido adicional.
  13. 13.
    Un método in vitro para determinar si las células T reconocen una composición como se define en la reivindicación 1 que comprende poner en contacto dichas células T con dicha composición y detectar si dicha composición estimula a dichas células T.
  14. 14.
    Un método in vitro para determinar si un individuo tiene o está en riesgo de una afección en la que la afección se caracteriza por síntomas alérgicos como respuesta a un alérgeno de ambrosía, comprendiendo el método ensayar si el individuo tiene células T que responden a una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, determinando de ese modo si el individuo tiene o está en riesgo de la afección.
  15. 15.
    El método de la reivindicación 14, en el que una respuesta inmune de células T a dicha composición se mide poniendo en contacto a la composición con células T en una muestra tomada a partir del sujeto, en condiciones que permiten que la composición y las células T interaccionen; y determinar si cualquiera de las células T se estimulan o no y de ese modo determinar si está presente o ausente una respuesta inmune de células T o no.
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