ES2353360T3 - Combinaciones de péptidos para vacunas contra la alergia a los gatos. - Google Patents
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Abstract
Una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a los gatos en un individuo por tolerización que comprende los polipéptidos: CPAVKRDVDLFLT (SEC ID Nº: 1) EQVAQYKALPVVLENA (SEC ID Nº: 2) KALPVVLENARILKNCV (SEC ID Nº: 3) RILKNCVDAKMTEEDKE (SEC ID Nº: 4) KENALSLLDKIYTSPL (SEC ID Nº: 5) TAMKKIQDCYVENGLI (SEC ID Nº: 6) SRVLDGLVMTTISSSK (SEC ID Nº: 7) en la que uno o más de los péptidos se pueden sustituir por una variante o fragmento del péptido sustituido, en la que: (a) la variante es un polipéptido que comprende dos o más sustituciones de aminoácidos conservativos en comparación con el péptido sustituido o (b) la variante es un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad con el polipéptido sustituido o (c) el fragmento es un polipéptido derivado por deleción de uno o dos aminoácidos de los extremos N o C terminales o de un aminoácido de los extremos N y C terminales del péptido sustituido, y en la que (i) dicha variante o fragmento es capaz de provocar una respuesta inmune que desensibiliza al individuo frente a la proteína Fel d1 y (ii) ningún otro péptido está presente en la composición.
Description
Combinaciones de péptidos para vacunas contra la
alergia a los gatos.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden péptidos para prevenir o tratar la alergia a los
gatos y en particular a combinaciones óptimas de péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
El reconocimiento de antígenos por células T
requiere células presentadoras de antígenos (CPA) para presentar
fragmentos de antígenos (péptidos) en su superficie celular en
asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC). Las células T usan sus receptores específicos de antígenos de
células T (TCR) para reconocer los fragmentos de antígenos
presentados por las CPA. Dicho reconocimiento actúa como un
activador del sistema inmune para generar a intervalo de respuestas
para erradicar el antígeno que se ha reconocido.
El reconocimiento de antígenos externos por el
sistema inmune de un organismo, tal como el hombre, puede dar como
resultado en algunos casos enfermedades, conocidas como condiciones
atópicas: los ejemplos de las últimas son las enfermedades
alérgicas incluyendo el asma, dermatitis atópica y rinitis alérgica.
En este grupo de enfermedades, los linfocitos B generan anticuerpos
de la clase IgE (en seres humanos) que se unen a antígenos
derivados externamente, a los que se hace referencia en este
contexto como alérgenos puesto que estas moléculas provocan una
respuesta alérgica. La producción de IgE específicas de alérgenos es
dependiente de linfocitos T que también se activan por (son
específicos para) el alérgeno. Los anticuerpos de IgE específicas de
alérgenos se unen a la superficie de células tales como basófilos y
mastocitos en virtud de la expresión de receptores de superficie
para IgE por esas
células.
células.
El entrecruzamiento de moléculas de IgE unidas a
la superficie por alérgenos da como resultado la desgranulación de
estas células efectoras provocando la liberación de mediadores
inflamatorios tales como histamina
5-hidroxitriptamina y medidores lipídicos tales
como los sulfidoleucotrienos. Además de los eventos dependientes de
IgE, determinadas enfermedades alérgicas tales como el asma se
caracterizan por eventos independientes de IgE.
Las enfermedades alérgicas mediadas por IgE se
tratan actualmente con agentes que proporcionan alivio sintomático
o prevención. Los ejemplos de dichos agentes son antihistaminas,
agonistas \beta2 y glucocorticosteroides. Además, algunas
enfermedades mediadas por IgE se tratan por procedimientos de
desensibilización que implican la inyección periódica de
componentes de alérgenos o extractos. Los tratamientos de
desensibilización pueden inducir una respuesta de IgG que compita
con IgE por el alérgeno o pueden incluir células T supresoras
específicas que bloquean la síntesis de IgE dirigida frente a
alérgeno. Esta forma de tratamiento no es siempre eficaz y presenta
el riesgo de provocar efectos secundarios graves, particularmente
choque anafiláctico general. Esto puede ser letal a no ser que se
reconozca inmediatamente y se trate con adrenalina. Un tratamiento
terapéutico que disminuiría o eliminaría la respuesta
inmune-alérgica no deseada frente a un alérgeno
particular, sin alterar la reactividad inmune frente a otros
antígenos extraños o activar una respuesta alérgica por si mismo
sería de gran beneficio para individuos
alérgicos.
alérgicos.
Aproximadamente el 10% de la población humana
mundial son alérgicos a los gatos (Felis domesticus) y hasta
el 67% de los pacientes asmáticos son sensibles a alérgenos de gato.
El alérgeno principal producido por gatos es la glucoproteína Fel
d1, que provoca una respuesta en el 90-95% de los
pacientes que padecen alergia a los gatos. Un tratamiento
terapéutico preventivo sería por lo tanto de gran beneficio para
seres humanos que padecen o tienen riesgo de padecer alergia a los
gatos.
Los métodos terapéuticos que implican
administración de composiciones que comprenden 13 péptidos derivados
de Fel d1 se describe en el documento WO 99/34826. La inducción de
una población de células T con actividad reguladora después de la
administración de una composición que contiene 12 polipéptidos
derivados de Fel d1 se describe en Verhoel et al. (PloS
Medicine, 2005, Vol. 2(3), pág. 253-261). El
efecto de varios péptidos individuales derivados de Fel d1 sobre
las características de proliferación y liberación de citocinas de
células mononucleares de sangre periférica descritas en Haselden
et al. (J Allergy Clin Immunol, 2001, Vol. 108(3),
pág. 349-356).
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han descubierto que
determinadas combinaciones de fragmentos de péptidos de la proteína
de Fel d1 son particularmente útiles en la desensibilización de
individuos frente a alérgeno de Fel d1. Las combinaciones de
polipéptidos de la invención se han seleccionado por su capacidad de
unirse a muchas moléculas de MHC de Clase II y provoca la
proliferación de células T con una liberación de histamina mínima.
Las composiciones, productos, vectores y formulaciones de la
invención pueden por lo tanto proporcionarse a individuos para
prevenir o tratar alergia a gatos por tolerización.
Los polipéptidos de la invención se
seleccionaron inicialmente como epítopos potenciales de células T a
través del uso de ensayos de unión MHC-péptido.
Véase por ejemplo la Figura 1 que demuestra la capacidad de una
serie de péptidos derivados de las cadenas 1 y 2 de Fel d1 para
unirse a múltiples tipos de DR en ensayos de unión de MHC de clase
II. Estos polipéptidos candidatos se exploraron adicionalmente
después para su uso potencial en la tolerización.
Una dificultad asociada con estrategias para la
desensibilización basadas en la inmunización por péptidos se halla
en como en seleccionar un tamaño y región apropiados del alérgeno
como las bases para el péptido a usar para inmunización. El tamaño
de péptido de elección es crucial. Si el péptido es muy pequeño, la
vacuna no sería eficaz en la inducción de una respuesta
inmunológica. Si los péptidos son muy grandes o si el antígeno
total se introduce en un individuo, hay riesgo de inducir reacciones
adversas tales como anafilaxis, que pueden ser letales.
Los polipéptidos de la invención se han
seleccionado para mantener especificidad de células T mientras que
tienen un tamaño lo suficientemente pequeño para no tener estructura
terciaria significativa que les permita mantener la conformación de
un epítopo de unión de IgE de la molécula total. Los polipéptidos de
la invención por lo tanto no inducen entrecruzamiento significativo
de molécula de IgE específicas adyacentes en células tales como
mastocitos y basófilos y consecuentemente no provocan liberación de
histamina significativa.
Los péptidos de la invención son beneficiosos en
que después de la administración de una muestra de células T dan
como resultado una proliferación de células T mientras que provocan
una liberación de histamina mínima. Esto se demuestra en el Ejemplo
2. Los polipéptidos de las invenciones son capaces de inducir una
respuesta de fase tardía en un individuo alérgico a los gatos. La
composición, productos y formulaciones de la invención que
comprenden estos polipéptidos o polinucleótidos que son capaces de
expresar estos polipéptidos son por lo tanto útiles y eficaces en
la reducción de la hipersensibilidad frente al alérgeno de Fel d1 en
individuos que están sensibilizados a este alérgeno.
Una ventaja adicional de la invención es la
capacidad de la combinación de péptidos de dirigirse de manera
general a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC).
Los receptores de células T (TCR) son muy variables en su
especificidad. La variabilidad se genera, como con moléculas de
anticuerpo, a través de eventos de recombinación de genes dentro de
la célula. Los TCR reconocen antígenos en forma de péptidos pequeños
unidos en moléculas codificadas por los genes del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC). Estos productos génicos son las mismas
moléculas que dan lugar a "tipos tisulares" usados en el
trasplante y también se denominan moléculas de Antígenos de
Leucocitos Humanos (HLA) cuyos términos se pueden usar de manera
intercambiable. Las moléculas individuales de MHC tienen ranuras de
enlace peptídicos que, debido a su forma y carga sólo son capaces
de unir un grupo limitado de péptidos. Los péptidos unidos por una
molécula de MHC puede que no estén unidos necesariamente por otras
moléculas de MHC.
Cuando una molécula de proteína tal como un
antígeno de alérgeno se capta por células presentadoras de antígenos
tales como linfocitos B, células dendríticas, monocitos y
macrófagos, la molécula se degrada enzimáticamente dentro de la
célula. El proceso de degradación da lugar a fragmentos de péptidos
de la molécula que, si son del tamaño, carga y forma apropiados,
pueden unirse dentro de la ranura de enlace peptídico de
determinadas moléculas de MHC y presentarse posteriormente en la
superficie de las células presentadoras de antígenos. Si los
complejos de MHC/péptidos están presentes en la superficie de la
célula presentadora de antígenos en números suficientes pueden
entonces activar células T que portan los receptores de células T
específicos de MHC/péptido apropiados.
Debido a la naturaleza polimórfica del MHC, los
individuos en una población exogámica tal como el hombre expresarán
diferentes combinaciones de moléculas de MHC en sus superficies.
Puesto que diferentes moléculas de MHC pueden unir péptidos
diferentes de la misma molécula basándose en el tamaño, carga y
forma del péptido, diferentes individuos presentarán un repertorio
diferentes de péptidos unidos a sus moléculas de MHC. La
identificación de epítopos de péptidos que se unen a MHC
universales en una población exogámica tal como el hombre es más
difícil que en animales endogámicos (tales como determinadas cepas
de ratones de laboratorio). Basándose en la expresión diferencial
de MHC entre individuos y las diferencias inherentes en la enlace
peptídicos y presentación que esto conlleva, es poco probable que
se puede identificar un solo péptido que sea útil para la terapia
de desensibilización en un hombre.
La combinación de péptidos de la invención, sin
embargo, proporciona una amplia cobertura de eficacia sobre la
población humana dirigiéndose a la mayoría de la población de MHC.
No será, por ejemplo, necesario tipificar al paciente o al
individuo para determinar que clase de moléculas de MHC de Clase II
tiene el o ella para determinar que péptido o combinación de
péptidos sería eficaz. Una vacuna formulada con los péptidos de la
invención tendría por lo tanto amplia utilidad.
La invención proporciona:
- \bullet
- Una composición para su uso en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos en un individuo por tolerización que comprende los polipéptidos
- CPAVKRDVDLFLT (SEC ID Nº: 1);
- EQVAQYKALPVVLENA (SEC ID Nº: 2);
- KALPVVLENARILKNCV (SEC ID Nº: 3);
- RILKNCVDAKMTEEDKE (SEC ID Nº: 4);
- KENALSLLDKIYTSPL (SEC ID Nº: 5);
- TAMKKIQDCYVENGLI (SEC ID Nº: 6);
- SRVLDGLVMTTISSSK (SEC ID Nº: 7);
- en la que uno o más de los péptidos pueden sustituirse por una variante o fragmento del péptido sustituido, en la que:
- (a)
- la variante es un polipéptido que comprende dos o más sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con el péptido sustituido o
- (b)
- la variante es un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad con el polipéptido sustituido o
- (c)
- el fragmento es un polipéptido que deriva de la deleción de uno o más aminoácidos de los extremos N o C terminales o de un aminoácido de los extremos N y C terminales del péptido sustituido,
- y en la que (i) dicha variante o fragmento es capaz de provocar una respuesta inmune que desensibiliza al individuo a la proteína Fel d1 y (ii) no están presentes otros péptidos en la composición.
- \bullet
- Una composición para su uso en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos por tolerización que consiste en secuencias de polinucleótidos que cuando se expresan provocan la producción de una composición de polipéptidos como anteriormente.
- \bullet
- Un vector de expresión para uso en la prevención o tratamiento de alergia a los gatos por tolerización que consiste en siete secuencias diferentes de polinucleótidos, codificando cada secuencia de polinucleótidos uno de los polipéptidos de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, estando unida operativamente cada secuencia de polinucleótidos a una secuencia de control proporcionando expresión de la secuencia codificante.
- \bullet
- Un producto para su uso en la prevención o tratamiento de alergia a los gatos por tolerización que consiste en los polipéptidos de la composición de polipéptidos descrita anteriormente, en la que cada polipéptido diferente es para uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos en un ser humano.
- \bullet
- Un producto para su uso en la prevención o tratamiento de alergia a los gatos por tolerización que consiste en polinucleótidos capaces de expresar los polipéptidos diferentes de la composición de polipéptidos descrita anteriormente, en la que cada polinucleótido es para su uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención o tratamiento de alergia a los gatos en un ser humano.
- \bullet
- Una formulación farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de alergia a los gatos por tolerización que comprende una composición, vector o producto de acuerdo con cualquiera de lo anterior y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
- \bullet
- Una composición o producto como se define anteriormente, comprendiendo adicionalmente un antígeno de polipéptido adicional para su uso en la tolerización de un individuo frente al antígeno de polipéptido adicional, en el que el antígeno de polipéptido adicional es diferente de Fel de1.
- \bullet
- Un método in vitro de determinar si un individuo tiene o presenta riesgo de una afección, caracterizándose la afección por síntomas alérgicos en respuesta a un alérgeno de gato, comprendiendo el método el ensayo de si el individuo tiene células T que responden a una composición de acuerdo con la invención, por lo tanto determinando si el individuo tiene o presenta riesgo de la afección.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 - los péptidos derivados de las cadenas
1 y 2 de Fel d1 se ensayaron para la capacidad de unirse a
múltiples tipos de DR en ensayos de unión de MHC de Clase II. Los
péptidos que mostraron características de unión promiscuas se
seleccionaron y combinaron para generar mezclas de péptidos que se
unieran a una amplia población de tipos de MHC de Clase II.
Figura 2 - Representación gráfica de mezclas de
péptidos que muestran aquellas que se unen a una amplia población
de tipos de MHC de Clase II.
\newpage
Figura 3 - Proliferación: porcentaje de
respondedores y calidad de respuesta. La Figura 3 resume respuestas
proliferativas frente a péptidos y antígenos. El porcentaje de
individuos que generan una respuesta proliferativa detectable se
muestra en las barras negras. Las barras grises (débil), blancas
(moderada) y reticuladas (fuerte) proporcionan un análisis de la
calidad de estas respuestas. La calidad se define arbitrariamente
por el Índice de Estimulación IS: relación de recuentos en
presencia de antígeno/péptido divididos por recuentos en medio
solo). Por tanto para el péptido 1 (MLA01), el 12% de los sujetos
generan una respuesta proliferativa y de estos el 92% fueron
débiles, ninguna fue moderada y el 8% fueron intensas. Las
respuestas proliferativas frente a antígenos/péptidos individuales
fueron variables (barra negra). El 92% de los sujetos tuvieron
respuestas proliferativas positivas frente al antígeno de control
positivo PPD. La mayoría de estas fueron respuestas fuertes (barras
reticuladas). El 75% de sujetos respondieron al extracto de caspa de
gato, siendo el 59% de las respuestas (es decir el 59% del 75%)
débil. La respuesta a la mezcla de los 7 péptidos preferidos (SEC
ID Nº: 1 a 7) fue casi idéntica al extracto de caspa de gato
(CAT).
Figura 4 - Porcentaje de respondedores por
citocina. La Figura 4 resume el porcentaje de individuos que
generaron una respuesta detectable frente a cada uno de los
péptidos/antígenos por producción de las tres citocinas medidas. El
antígeno de control positivo PPD provocó una producción de citocinas
en casi todos los individuos (IFN-\gamma: 91%,
IL-13:97% e IL-10: 96%). El alérgeno
total de gato y la mezcla de los 7 péptidos provocaron una
respuesta de citocinas en aproximadamente el 80% o más de los
sujetos. Los péptidos individuales provocaron respuestas de
frecuencia distinta. En general la producción de citocinas pareció
ser un método más sensitivo para detectar respuestas con
porcentajes más grandes de individuos que proporcionaron respuestas
de citocinas positivas que respuestas proliferativas. En la mayoría
de los casos se detectó una secreción de IL-10 en
mayor número de individuos el IFN-\gamma se
detectó menos frecuentemente.
Figura 5 - Porcentaje de individuos que producen
IFN-\gamma e intensidad de respuesta después del
cultivo celular con péptido/antígeno. Las respuestas de
IFN-\gamma se detectaron en el
26-44% de los sujetos en respuesta a péptidos
individuales. Estas respuestas fueron predominantemente de muy bajas
a bajas a moderadas. Los antígenos complejos indujeron respuestas
más frecuentes (mezcla de péptido el 80%, caspa de gato el 79%, PPD
el 91%). Estas respuestas fueron de bajas a moderadas a altas. Las
respuestas de PPD fueron particularmente altas (89 de las
respuestas de PPD fueron por encima de 100 pg/ml).
Figura 6 - Porcentaje de individuos que producen
IL-13 e intensidad de respuesta después del cultivo
celular con péptido/antígeno. Las respuestas de
IL-13 se detectaron entre el 33-68%
de los sujetos en respuesta a péptidos individuales. Estas
respuestas fueron predominantemente de muy bajas a bajas, sin
embargo se detectó un número significativo de respuestas moderadas.
Esto puede reflejar la naturaleza de Th2 de sensibilización
alérgica en estos sujetos. Los antígenos complejos inducidos
indujeron respuestas más frecuentes (mezcla de péptidos el 85%,
caspa de gato el 93%, PPD el 97%). Estas respuestas fueron de bajas
a moderadas a altas.
Figura 7 - Porcentaje de individuos que producen
IL-10 e intensidad de respuesta después del cultivo
celular con péptido/antígeno. Estas respuestas de
IL-10 se detectaron entre el 46-75%
de los sujetos en respuesta a péptidos individuales. Estas
respuestas fueron predominantemente de muy bajas a bajas. Los
complejos de antígeno indujeron respuestas más frecuentes (mezcla
de péptidos el 93%, caspa de gato el 96%, PPD el 96%). Estas
respuestas fueron de bajas a moderadas. Se observaron muy pocas
respuestas "altas" de IL-10.
Figura 8 - Un gráfico representativo que muestra
el área LPSR medio antes y después del tratamiento para los ocho
pacientes en la cohorte de 12,0 nmol del ensayo clínico de una
mezcla preferida de péptidos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las SEC ID Nº: 1 a 16 proporcionan las
secuencias de polipéptidos de la invención. Las SEC ID Nº: 1 a 16
corresponden a los péptidos MLA01, MLA03, MLA04, MLA05, MLA07,
MLA12, MLA14, MLA02, MLA06, MLA11, MLA15, MLA16, MLA08, MLA09,
MLA10 y MLA13 respectivamente como se muestra en los Ejemplos y la
Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona una composición para su
uso en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos en un
individuo por tolerización que comprende los polipéptidos 1, 2, 3,
4, 5, 6 y 7, en la que uno o más de los péptidos pueden sustituirse
por una variante o fragmentos del péptido sustituido y en la que (i)
dicha variante o fragmento es capaz de provocar una respuesta
inmune que desensibiliza al individuo frente a la proteína Fel d1 y
(ii) no está presente ningún otro péptido en la composición.
La invención también proporciona productos y
formulaciones que comprenden los polipéptidos de la invención y
composiciones, productos y vectores que comprenden polinucleótidos
capaces de expresar los polipéptidos de la invención para su uso en
la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos por
tolerización.
El alérgeno principal producido por el gato
doméstico Felis catus (Felis domestics) es la
glucoproteína Fel d1. Esta proteína de 39 kDa está formada a partir
de dos subunidades de 17 kDa, cada una consiste en dos péptidos
unidos por disulfuro (Cadena 1 y Cadena 2 de Fel d1). La secuencia
de aminoácidos de Feld d1 se describe en el documento WO 91/06571.
La fuente principal de la proteína Fel d1 son las glándulas
sebáceas, sin embargo la expresión también se detecta en las
glándulas salivales y las glándulas anales. La función de la
proteína Fel d1 actualmente se desconoce, sin embargo es
posiblemente una proteína de unión a feromonas.
Los péptidos de la invención proceden de Fel d1.
Los términos "péptido" y "polipéptido" se usan de manera
intercambiable en el presente documento. Fel d1 también se denomina
"el alérgeno".
La composición de la invención consiste en los
polipéptidos de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
Es decir, la invención proporciona una
composición para su uso en la prevención o tratamiento de la alergia
a los gatos por tolerización que consiste en los polipéptidos de
las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 que tienen las siguientes
secuencias de aminoácidos:
- CPAVKRDVDLFLT (SEC ID Nº: 1);
- EQVAQYKALPVVLENA (SEC ID Nº: 2);
- KALPVVLENARILKNCV (SEC ID Nº: 3);
- RILKNCVDAKMTEEDKE (SEC ID Nº: 4);
- KENALSLLDKIYTSPL (SEC ID Nº: 5);
- TAMKKIQDCYVENGLI (SEC ID Nº: 6);
- SRVLDGLVMTTISSSK (SEC ID Nº: 7);
\vskip1.000000\baselineskip
Otros péptidos de Fel d1 son:
- LFLTGTPDEYVEQVAQY (SEC ID Nº: 8);
- KMTEEDKENALSLLDK (SEC ID Nº: 9);
- LTKVNATEPERTAMKK (SEC ID Nº: 10);
- ISSSKDCMGEAVQNTV (SEC ID Nº: 11);
- AVQNTVEDLKLNTLGR (SEC ID Nº: 12)
La invención describe variantes de cualquiera de
las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. Los
fragmentos de péptidos de acuerdo con la invención pueden obtenerse
por truncamiento, por ejemplo por eliminación de uno o más
aminoácidos de los extremos N y/o C terminales de un polipéptido.
Los fragmentos también se pueden generar por una o más deleciones
internas, dado que los aminoácidos de núcleo 9 que constituyen el
epítopo de la célula T no están sustancialmente alterados.
Por ejemplo, una variante de la SEC ID Nº: 1
puede comprender un fragmento de la SEC ID Nº: 1, es decir una
secuencia más corta. Esto puede incluir una deleción de uno, dos,
tres o cuatro aminoácidos del extremo N terminal de la SEC ID Nº: 1
o del extremo C terminal de la SEC ID Nº: 1. Dichas deleciones
pueden hacerse a partir de ambos extremos de la SEC ID Nº: 1. Una
variante de SEC ID Nº: 1 puede incluir aminoácidos adicionales (por
ejemplo de la secuencia de la proteína Fel d1 de gato) extendiéndose
más allá del extremo o extremos de la SEC ID Nº: 1. Una variante
puede incluir una combinación de las deleciones y adiciones
analizadas anteriormente. Por ejemplo, se pueden eliminar
aminoácidos de un extremo de la SEC ID Nº: 1, pero pueden añadirse
aminoácidos adicionales de la longitud total de la secuencia de la
proteína Fel d1 en el otro extremo de la SEC ID Nº: 1. El mismo
análisis de las variantes anteriores también se aplica a las SEC ID
Nº: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
Un péptido variante puede incluir una o más
sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos
de cualquiera de la SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó
12 o un fragmento de las mismas. Un péptido variante puede
comprender una secuencia que tiene al menos 65% de identidad de
secuencia con al menos 9 o más aminoácidos contiguos en cualquiera
de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. Más
preferiblemente una variable adecuada puede comprender al menos el
70%, al menos 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el
90%, al menos el 95%, o al menos el 98% de identidad de aminoácidos
con al menos 9 aminoácidos contiguos de cualquiera de las SEC ID
Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. Este nivel de identidad
de aminoácidos puede observarse en cualquier sección del péptido,
sin embargo está preferiblemente en la región de núcleo. El nivel
de identidad de aminoácidos está sobre al menos 9 de los de
aminoácidos contiguos pero puede estar al menos sobre 10, 11, 12,
13, 14, 15 o al menos 16 ó 17 aminoácidos, dependiendo del tamaño de
los péptidos de comparación. Por consiguiente, cualquiera de los
niveles de identidad especificados anteriormente puede darse a
través de la longitud total de la secuencia.
En relación a secuencias de aminoácidos,
"identidad de secuencia" se refiere a secuencias que tienen el
valor definido cuando se evalúan utilizando ClustalW (Thompson
et al., 1994, anteriormente) con los siguientes parámetros:
Parámetros del alineamiento por pares - Método: preciso, Matriz:
PAM, penalización por apertura de huecos: 10,00, penalización por
extensión de huecos 0,10; Parámetros de alineamiento múltiple -
Matriz: PAM, penalización por apertura de huecos: 10,00, % de
identidad por retraso: 30, penalización de huecos terminales: si,
distancia de separación de huecos: 0, matriz negativa: no,
penalización por extensión de huecos: 0,20, penalización por huecos
en restos específicos: si, penalizaciones por huecos hidrófilos: si,
Restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un resto
particular pretende incluir restos idénticos que simplemente se han
derivatizado.
Un péptido variante puede comprender 1, 2, 3, 4,
5 o más o hasta 10 sustituciones de aminoácidos a partir de
cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12.
Las variantes de sustitución preferiblemente implican la
sustitución de uno o más aminoácidos con el mismo número de
aminoácidos y haciendo sustituciones de aminoácidos conservativos.
Por ejemplo, un aminoácido puede estar sustituido con un aminoácido
alternativo que tiene propiedades similares, por ejemplo, otro
aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro,
otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido
hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro
aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos
principales que se pueden usar para seleccionar sustituyentes
adecuados son de la siguiente manera:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes adicionales incluyen las que en
lugar del aminoácido que se produce de forma natural el aminoácido
que aparece en la secuencia es un análogo estructural del mismo. Los
aminoácidos usados en las secuencias también se pueden modificar,
por ejemplo marcar, dado que la función del péptido no se ve
afectada de manera adversa significativamente. Cuando el péptido
tiene una secuencia que varía de la secuencia de cualquiera de las
SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 o un fragmento de
las mismas, las sustituciones se pueden producir a través de la
longitud total de la secuencia, entre la secuencia de cualquiera de
las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 o fuera de la
secuencia de cualquiera de la SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11 ó 12. Por ejemplo, las variaciones descritas en el presente
documento, tales como adiciones, deleciones, sustituciones y
modificaciones, se pueden producir dentro de la secuencia de
cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó
12. Un péptido variante puede comprender o consistir esencialmente
de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 en las que se han hecho una, dos,
tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos. Un péptido variante
puede comprender un fragmento de Fel d1 que es más grande que
cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó
12. En esta realización las variaciones descritas en el presente
documento tales como sustituciones y modificaciones se pueden
producir dentro y/o fuera de la secuencia de cualquiera de las SEC
ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12.
Los péptidos variantes de la invención tienen de
9 a 30 aminoácidos de longitud total. Preferiblemente, pueden tener
de 9 a 20 o más preferiblemente de 13 a 17 aminoácidos de longitud.
Los péptidos pueden tener la misma longitud que las secuencias de
péptidos en cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11 ó 12.
\newpage
Los péptidos pueden derivar químicamente del
alérgeno de polipéptido, por ejemplo por escisión proteolítica o
pueden derivarse en un sentido intelectual del alérgeno de
polipéptido, por ejemplo haciendo uso de la secuencia de
aminoácidos del alérgeno de polipéptido y sintetizando péptidos
basados en la secuencia. Los péptidos se pueden sintetizar usando
métodos bien conocidos en la técnica.
El término "péptido" incluye no sólo
moléculas en las que los restos de aminoácidos se unen por enlaces
peptídicos (-CO-NH-) pero también moléculas en las
que el enlace peptídico esté invertido. Dichos péptidos miméticos
retroinversos pueden generarse usando métodos conocidos en la
técnica, por ejemplo los descritos en Meziere et al.(1997)
J. Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque implica
generar pseudopéptidos que contienen cambios que implican la cadena
principal y no la orientación de las cadenas laterales. Meziere
et al. (1997) muestran que, al menos para las respuestas del
MHC de clase II y células T auxiliares, estos pseudopéptidos son
útiles. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces
NH-CO en lugar de enlaces peptídicos
CO-NH, son mucho más resistentes a la
proteolisis.
proteolisis.
De manera similar, el enlace peptídico puede
distribuirse en el conjunto dado que se usa un resto de unión
apropiado que mantiene la separación entre los átomos de carbono de
los restos de aminoácidos; se prefiere particularmente si el resto
de enlace tiene sustancialmente la misma distribución de carga y
sustancialmente la misma planareidad que el enlace peptídico.
También se apreciará que el péptido pueda bloquearse
convenientemente en su extremo N o C para ayudar a reducir la
susceptibilidad frente a la digestión exoproteolítica. Por ejemplo,
el grupo amino N terminal de los péptidos puede protegerse mediante
la reacción con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo de C
terminal del péptido puede protegerse mediante la reacción con una
amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen glucosilación y
fosforilación. Otra modificación potencial es que los hidrógenos de
las aminas de cadena lateral de R o K puedan sustituirse con grupos
metileno (-NH_{2} \rightarrow -NH(Me) o
-N(Me)_{2}).
Los análogos de los péptidos de acuerdo con la
invención pueden incluir también variantes de péptidos que aumentan
o disminuyen la semivida del péptido in vivo. Los ejemplos de
análogos capaces de aumentar la semivida de péptidos usados de
acuerdo con la invención incluyen análogos peptoides de péptidos,
derivados de D-aminoácidos de los péptidos e
híbridos péptido-peptoide. Una realización adicional
de los polipéptidos variantes usados de acuerdo con la invención
comprende formas de aminoácidos D-aminoácidos del
polipéptido. La preparación de polipéptidos usando
D-aminoácidos en lugar de
L-aminoácidos disminuye mucho cualquier degradación
no deseada de dicho agente por procesos metabólicos normales,
disminuyendo las cantidades de agente que necesita administrarse,
junto con la frecuencia de su administración.
Los péptidos proporcionados por la presente
invención pueden proceder de variantes de corte y empalme de Fel d1
codificada por ARNm generado por corte y empalme alternativo de los
transcritos primarios que codifican las cadenas de Fel d1. Los
péptidos también pueden proceder de mutantes de aminoácidos,
variantes de glucosilación y otros derivados covalentes de Fel d1
que mantienen al menos una propiedad de unión a MHC del alérgeno.
Los derivados ejemplares incluyen moléculas en las que los péptidos
de la invención se modifican covalentemente por sustitución, medios
químicos, enzimáticos u otros apropiados con un resto distinto que
un aminoácido que se produzca de manera natural. Adicionalmente se
incluyen variantes que se producen de manera natural de Fel d1
encontradas en gatos diferentes. Dichas variantes pueden estar
codificadas por una variante alélica o representar una variante de
corte y empalme alternativa.
Como se describe anteriormente las variantes se
pueden preparar durante la síntesis del polipéptido o por
modificación postproducción o cuando el péptido está en forma
recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida,
mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o unión de ácidos
nucleicos.
La invención también describe péptidos que son
preferiblemente variantes funcionales de cualquiera de la SEC ID
Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12. Es decir, los péptidos
preferiblemente son capaces de inducir una respuesta inmune. En
particular, son capaces de inducir una respuesta de fase tardía en
un individuo alérgico a los gatos. Esto se puede ensayar por la
capacidad del péptido de inducir proliferación de células T en una
muestra de células T. Los métodos de ensayo de la inducción de
proliferación de células T se conocen bien en la técnica y uno de
estos métodos se ilustra en el Ejemplo 2. Preferiblemente el uno o
más péptidos adicionales son capaces de provocar la proliferación
de células T en al menos el 20% de las muestras de células T, en
las que cada muestra se obtiene a partir de diferentes individuos
alérgicos a los gatos en la población. Las composiciones de la
invención son preferiblemente capaces de inducir la proliferación de
células T en el 30% o más de las muestras de células T obtenidas de
un panel de individuos alérgicos a los gatos. Más preferiblemente,
las composiciones son capaces de inducir la proliferación de células
T en el 35% o más, 40% o más, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85% o 90% o más de las muestras obtenidas a partir de
individuos sensibilizados en un panel. El número de individuos en
un panel de individuos alérgicos a los gatos puede ser cualquier
número mayor que uno, por ejemplo al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30,
50, 80 o al menos 100 individuos. Se prefiere si los péptidos
provocan la proliferación de células T, pero no conducen a la
liberación de histamina de cada preparación de mastocitos o
basófilos enriquecidos a partir de un individuo sensibilizado. Puede
haber algo de liberación de histamina, preferiblemente la
composición no provoca significativamente más liberación de
histamina que una composición que comprende los 7 polipéptidos
diferentes mostrados en las
SEC ID Nº: 1 a 7.
SEC ID Nº: 1 a 7.
Las variantes adecuadas capaces de unirse a TCR
pueden derivar empíricamente o se pueden seleccionar de acuerdo con
criterios conocidos. Dentro de un único péptido hay determinados
restos que contribuyen a la unión en la ranura de unión del
antígeno a MHC y otros restos que interaccionan con regiones
hipervariables del receptor de células T (Allen et al.
(1987) Nature 327: 713-5).
Dentro de los restos que contribuyen a la
interacción del receptor de células T, se ha demostrado una
jerarquía que pertenece a la dependencia de la activación de
células T tras la sustitución de un resto de péptido dado. Usando
péptidos que han tenido uno o más restos en contacto con receptor de
células T sustituidos con un aminoácido diferente, varios grupos
han demostrado profundos efectos tras el proceso de activación de
células T. Evavold y Allen (1991) Nature 252:
1308-10) demostraron la disociación de la
proliferación de células T y la producción de citocinas. En este
modelo in vitro, un clon de célula T específico para los
restos 64-76 de hemoglobina (en el contexto de
l-E^{k}), se expuso a un análogo de péptido en el
que se había hecho una sustitución conservativa de ácido aspártico
por ácido glutámico. Esta sustitución no interfirió
significativamente con la capacidad del análogo para unirse a
l-E^{k}.
Después de la exposición in vitro de un
clon de célula T con este análogo, no se detectó proliferación sin
embargo se mantuvo la secreción de IL-4, como lo
hizo la capacidad del clon para ayudar a la respuesta de las
células B. En un estudio posterior el mismo grupo demostró la
separación de la histolisis mediada por células T de la producción
de citocinas. En este caso, la primera permaneció inalterada
mientras que la última se alteró. La eficacia de los ligandos de
péptido alterados in vivo se demostró inicialmente en un
modelo murino de EAE (encefalomielitis alérgica experimental) por
McDevitt y colaboradores (Smilek et al. (1991) Proc Natl
Acad Sci USA 88: 9633-9637). En este modelo la EAE
se induce por inmunización con el péptido encefalitogénico
Ac1-11 de MBP (proteína básica de mielina). La
sustitución en la posición cuatro (lisina) con un resto de alanina
generó un péptido que se une bien a su elemento de restricción
(A\alpha^{u}A\beta^{u}), pero que no era inmunogénico en la
cepa susceptible PL/JxSJLF1 y el que, adicionalmente evitó el
comienzo de EAE cuando se administró antes o después de la
inmunización con el péptido encefalitogénico. Por tanto, los restos
se pueden identificar en péptidos que afectan la capacidad de los
péptidos para inducir diversas funciones de las células T.
Ventajosamente, se pueden diseñar péptidos para
favorecer la proliferación de células T e inducción de
desensibilización. Metzler y Wraith han demostrado capacidad
tolerogénica mejorada de péptidos en los que se han hecho
sustituciones que aumentan la afinidad MHC-péptido
(Metzler & Wraith(1993) Int Immunol \sim:
1159-65). Que un ligando de péptido alterado pueda
provocar alergia prolongada y profunda en células T clonadas se
demostró por Sloan-Lancaster et al.(1993)
Nature 363: 156-9.
Las composiciones de la invención son capaces de
inducir una respuesta de fase tardía en un individuo que está
sensibilizado frente al alérgeno de Fel d1. La expresión
"respuesta de fase tardía" incluye el significado como se
expone en Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.),
Blackwell Science, pág. 1113-1130. La respuesta de
fase tardía puede ser cualquier respuesta de fase tardía (LPR).
Preferiblemente, los péptidos son capaces de inducir una respuesta
asmática tardía (LAR) o una respuesta rinítica tardía o una
respuesta cutánea de fase tardía o una respuesta ocular de fase
tardía. Si un péptido particular puede dar lugar o no a una LPR se
puede determinar usando métodos bien conocidos en la técnica; un
método particularmente preferido es el descrito en Cromwell O,
Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay AB. Los ensayos de exposición y
las medidas de mediadores a partir de mastocitos y basófilos en el
asma y la rinitis alérgica. En: Handbook of Experimental Immunology
(4) Capítulo 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific
Publications, 1986.
Por tanto, preferiblemente, los péptidos
individuales de la invención son capaces de inducir una LPR en un
individuo al que se ha sensibilizado frente al alérgeno de Fel d1.
Sin un individuo se ha sensibilizado o no frente al alérgeno puede
determinarse por procedimientos bien conocidos tales como ensayo de
punción con soluciones de extractos de alérgenos, inducción de LPR
cutáneas, historia clínica, exposición a alérgeno y ensayo
radioalergosorbente (RAST) para medidas de la IgE específica de
alérgeno. Si se espera o no que un individuo particular se
beneficie del tratamiento puede determinarse por el médico
basándose, por ejemplo, en dichos ensayos.
La desensibilización o tolerización de un
individuo frente a alérgeno de Fel d1 significa la inhibición o
amortiguación de la reacciones de tejido alérgico inducidas por Fel
d1 en individuos sensibilizados apropiadamente. Se ha mostrado que
las células T se pueden activar selectivamente y después volverse no
insensible. Además la anergización o eliminación de estas células T
conduce a la desensibilización del paciente para un alérgeno
particular. La desensibilización se manifiesta por sí misma como
una reducción en la respuesta frente a un alérgeno o péptido
derivado de alérgeno o preferiblemente una eliminación de dicha
respuesta, en segundas administraciones y administraciones
adicionales del alérgeno o péptido del alérgeno. La segunda
administración puede hacerse después de que haya transcurrido un
periodo adecuado de tiempo para permitir que se produzca la
desensibilización, es decir, preferiblemente cualquier periodo entre
un día y varias semanas. Se prefiere un intervalo de
aproximadamente dos semanas.
Aunque las composiciones de la invención son
capaces de inducir una LPR en un individuo alérgico a los gatos,
debe apreciarse que cuando se usa una composición para tratar a un
paciente es preferible que una concentración lo suficientemente
baja de la composición se use de modo que no se producirá ninguna
LPR observable pero la respuesta será suficiente para
desensibilizar parcialmente a las células T de modo que la siguiente
dosis (preferiblemente más alta) se pueda dar y sucesivamente. De
este modo la dosis se acumula para proporcionar desensibilización
total pero a menudo sin ni siquiera inducir una LPR en el paciente.
Sin embargo, la composición o péptido es capaz de hacerlo a una
concentración más alta de la que se administra.
\newpage
Las composiciones de la invención
preferiblemente son capaces de inducir una respuesta de fase tardía
en el 50% o más de un panel de individuos alérgicos a los gatos de
la población. Más preferiblemente, las composiciones son capaces de
inducir una LPR en el 55% o más, 60% o más, 65% o más, 70% o más,
75% o más, 80% o más, 85% o más o 90% o más de individuos
sensibilizados en un panel. Si las composiciones son capaces o no de
inducir una LPR en un determinado porcentaje de un panel de sujetos
se puede determinar por métodos que se conocen bien en la
técnica.
técnica.
Las combinaciones preferidas de péptidos
típicamente se unen a un gran número de moléculas de HLA diferentes.
Esto es beneficioso en que una parte mayor de individuos en una
población se tolerizará por la combinación. Por tanto, las
combinaciones preferidas comprenden:
- (iii)
- al menos dos péptidos que exhiben unión fuerte y al menos un péptido que exhibe unión moderada a cada elemento de un panel de moléculas de HLA; o
- (iv)
- al menos un péptido que exhibe unión fuerte y al menos dos péptidos que exhiben unión moderada a cada elemento de dicho panel de moléculas de HLA;
- \quad
- comprendiendo el panel de moléculas de HLA al menos siete moléculas de HLA diferentes codificadas por alelos diferentes que tienen una frecuencia acumulativa en una población humana exogámica de al menos el 80% o al menos el 85%, 90%, 95% o 99%.
La fuerza de unión de MHC puede evaluarse por
cualquier método adecuado. Los métodos preferidos incluyen ensayos
de inhibición competitiva en los que la unión se mide en relación
con un péptido de referencia. El péptido de referencia es
típicamente un péptido que se conoce que es un elemento de unión
fuerte para una molécula de MHC dada. En dicho ensayo, un péptido
es un elemento de unión débil para una molécula de HLA dada si tiene
una CI50 de más de 100 veces menor que el péptido de referencia
para la molécula de HLA dada. Un péptido es un elemento de unión
moderado si tiene una CI50 más de 20 veces pero menos de 100 veces
menor que el péptido de referencia para la molécula de HLA dada. Un
péptido es un elemento de unión fuerte si tiene una CI50 menos de
20 veces menor que el péptido de referencia para la molécula de HLA
dada.
La población exogámica humana puede ser
cualquier población, típicamente una población Caucásica. El panel
de molécula de HLA típicamente comprende al menos
HLA-DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13 y DR15 y
opcionalmente también comprende HLA-DRB4 y DRB5.
Los péptidos de referencia adecuados para estas moléculas de HLA
son:
- DR1 (alelo DRB1*0101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT);
- DR3 (alelo DRB1*0301): MT216 (AKTIAYDEEARRGLE);
- DR4 (alelo DRB 1*0401): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT);
- DR7 (alelo DRB 1 *0701): YKL (AAYAAAKAAALAA);
- DR 11 (alelo DRB1*1101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT);
- DR13 (alelo DRB1*1301): B1 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE);
- DR15 (alelo DRB1*1501): A3 152-166 (EAEQLRRAYLDGTGVE);
- DRB4 (alelo DRB4*0101): E2/E7 (AGDLLAIETDKATI); y
- DRB5 (alelo DRB5*0101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT).
\vskip1.000000\baselineskip
Las combinaciones preferidas de péptidos
típicamente inducen liberación de histamina en una muestra a partir
de un individuo alérgico a los gatos que contiene basófilos o
mastocitos, que es más del 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10% mayor que la
liberación de histamina inducida en una muestra a partir de un mismo
individuo o población de individuos por el alérgeno Fel d1
total.
Más preferiblemente, la combinación induce
liberación de histamina que no es más del 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%
mayor que la liberación de histamina inducida en una muestra a
partir del mismo individuo o población de individuos por una
composición que comprende los 7 polipéptidos diferentes mostrados en
las SEC ID Nº: 1 a 7.
Una muestra de un individuo alérgico a los gatos
es típicamente una muestra de células monoclonales de sangre
periférica (PBMC) que puede estar preparada como es convencional en
la técnica. Un ejemplo de un método adecuado implica el aislamiento
de PBMC a partir de una muestra de sangre heparinizada obtenida a
partir de un sujeto. Las PBMC se aíslan típicamente a partir de
dicha muestra por separación en gradiente de densidad.
La liberación de histamina se puede evaluar por
cualquier método adecuado, por ejemplo por ELISA. Varios kit de
ensayo adecuados están disponibles en el mercado para ensayar
niveles de liberación de histamina a partir de células en respuesta
a cualquier agente de liberación de histamina dado. Típicamente, una
muestra aproximadamente de 5x10^{5} a 5x10^{6} PBMC se incubará
con un agente de liberación de histamina dado a una concentración
dada. La concentración de histamina en el medio de incubación o una
muestra del medio de incubación se medirá al final de la
incubación. La incubación es típicamente durante 30 minutos a
37ºC.
Cuando el agente de liberación de histamina es
un péptido o combinación de péptidos se administrará típicamente a
varias diluciones diferentes dentro de un intervalo de concentración
comparable a aquel que se esperaría que estuviera presente in
vivo. Por ejemplo, una dosis de 10 mg de un único péptido que
entra en un volumen de sangre de 5 litros daría como resultado una
concentración de sangre de 2 ng/ml (2x10^{-6} mg/ml). Por tanto,
un intervalo de concentración adecuado para un péptido o combinación
de péptidos es típicamente de 10 mg/ml a 1 mg/ml. Las medidas
únicas, por duplicado o triplicado se pueden hacer a cada dilución
ensayada dentro de dicho intervalo. Aproximadamente 5x10^{5} PBMC
se requieren típicamente para cada medida. Los controles positivos
adecuados también se ensayarán a concentraciones apropiadas que
pueden determinarse fácilmente por los expertos. Los controles
positivos adecuados incluyen el alérgeno total de Fel d1 o una
alternativa adecuada tal como extracto de caspa de gato total
disponible en el mercado. La liberación de histamina espontánea por
una muestra de células que no está tratada con un agente de
liberación de histamina también se puede medir como un control
negativo/indicador de liberación de histamina de fondo. Cuando dos o
más diluciones de una preparación de péptido/alérgeno provocan el
10% o más de liberación de histamina por encima del fondo o cuando
un único valor del 10% o más por encima del fondo se consigue a la
concentración más alta ensayada, se considerará típicamente una
"liberación de histamina positiva".
La concentración de histamina en el medio de
incubación de cualquier muestra se medirá típicamente por
ELISA. Los ensayos de ELISA adecuados típicamente implican la adición de un agente de acilación de histamina a una muestra del medio de incubación junto con un tampón adecuado. La histamina acilada es más estable que la histamina y las muestras tratadas de este modo pueden almacenarse durante más tiempo antes del análisis. El análisis típicamente implica la adición de reactivos anti-acil-histamina conjugados con fosfatasa alcalina, seguido de la adición de un sustrato de fosfatasa alcalina cromogénico adecuado. La concentración de histamina se determina por medida a la absorbancia y comparación con una curva patrón calibrada frente a concentraciones de histamina
conocidas.
ELISA. Los ensayos de ELISA adecuados típicamente implican la adición de un agente de acilación de histamina a una muestra del medio de incubación junto con un tampón adecuado. La histamina acilada es más estable que la histamina y las muestras tratadas de este modo pueden almacenarse durante más tiempo antes del análisis. El análisis típicamente implica la adición de reactivos anti-acil-histamina conjugados con fosfatasa alcalina, seguido de la adición de un sustrato de fosfatasa alcalina cromogénico adecuado. La concentración de histamina se determina por medida a la absorbancia y comparación con una curva patrón calibrada frente a concentraciones de histamina
conocidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las combinaciones preferidas de péptidos
típicamente inducen un perfil de liberación de citocinas en una
muestra a partir de un individuo alérgico a los gatos que contiene
células T, que es equivalente al perfil de liberación de citocinas
inducido en una muestra a partir del mismo individuo o población de
individuos por el alérgeno de Fel d1
total.
total.
Más preferiblemente, la combinación induce un
perfil de liberación de citocinas en una muestra a partir de una
población de individuos o individuos alérgicos a los gatos que
contienen células T, lo que es equivalente al perfil de liberación
de citocinas inducida en una muestra a partir del mismo individuo o
población por una composición que comprende los 7 polipéptidos
diferentes mostrados en las SEC ID Nº: 1 a 7.
Una muestra de un individuo o población de
alérgicos a los gatos es típicamente una muestra de células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) que se puede preparar
como es habitual en la técnica. El perfil de liberación de
citocinas puede evaluarse por cualquier método adecuado. Los métodos
adecuados incluyen medir el nivel de uno, dos, tres o más citocinas
diferentes liberadas en una muestra en ensayos independientes. Los
ensayos adecuados incluyen ensayo de Luminex y ELISA.
Un perfil de liberación de citocinas inducido en
una muestra se considera que es equivalente al perfil de liberación
de citocinas de una muestra diferente cuando el nivel de
determinadas citocinas específicas producidas es similar en ambos
ejemplos. Más específicamente, los perfiles de liberación de
citocinas de dos muestras diferentes se considera que son
equivalentes cuando los niveles de IL-10 e
IL-13 producidos en una muestra difieren en no más
del 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10% de los niveles de IL-10
e IL-13 producidos en la segunda muestra.
Por tanto, una combinación de péptidos preferida
induce a la producción de IL-10 e
IL-13 a niveles que difieren en no más del 10% de
los niveles de IL-10 e IL-13
inducidos en una muestra a partir de un mismo individuo o población
de individuos por el alérgeno de Fel d1 total.
\newpage
Un ensayo de liberación de citocinas típico es
de la siguiente manera:
- se distribuyen 250 \mul de una solución de 200 \mug/ml de la concentración de antígeno o péptido adecuado en los pocillos adecuados de, por ejemplo, placas de 48 pocillos. Las placas se incuban después en una incubadora humidificada al 5% de CO_{2} a 37ºC durante un máximo de 4 horas.
- Después se añaden 250 \mul de una suspensión de PBMC a 5x10^{6} células/ml a cada pocillo y se devuelven las placas a la incubadora durante 5 días. Las muestras de sobrenadante de cultivo se recogen después como alícuotas múltiples para su uso en ensayos de ELISA. Las muestras se pueden congelar y almacenar antes del análisis. Se ensaya una alícuota para la presencia de una citocina.
- Típicamente la presencia de una citocina se establece usando un ensayo ELISA de acuerdo con prácticas convencionales en la técnica. Las concentraciones de citocinas en una muestra se determinan típicamente por interpolación a partir de curvas patrón generadas en el mismo ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos individuales que forman las
composiciones y productos de la invención se pueden administrar
directamente o se pueden administrar indirectamente por la
expresión a partir de una secuencia codificante. Por ejemplo, se
puede proporcionar un polinucleótido que codifique un péptido de la
invención, tal como cualquiera de los péptidos descritos
anteriormente. Un péptido de la invención puede producirse entonces
a partir de o suministrarse en forma de un polinucleótido que
codifica y es capaz de expresarlo. Cualquier referencia en el
presente documento al uso, suministro o administración de un
péptido de la invención pretende incluir la administración,
suministro o uso indirecto de dicho péptido por medio de la
expresión a partir de un polinucleótido que lo codifica.
Por consiguiente, la invención proporciona una
composición para su uso en la prevención o tratamiento de alergia a
los gatos por tolerización que consiste en secuencias de
polinucleótidos que cuando se expresan provocan la producción de
una composición para su uso en al prevención o tratamiento de una
alergia a los gatos por tolerización que consiste en los
polipéptidos de las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
La expresión "molécula de ácido nucleico" y
el término "polinucleótido" se usan de una manera
intercambiable en el presente documento y se refieren a una forma
polimérica de nucleótidos de cualquier longitud,
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos.
Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un
fragmento génico, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos
recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier
secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos
nucleicos y cebadores. Un polinucleótido de la invención puede
proporcionarse en una forma aislada o purificada. Una secuencia de
ácido nucleico que "codifica" un polinucleótido seleccionado
es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en caso de
ADN) y traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in
vivo cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras
adecuadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por
un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de
terminación de traducción en el extremo 3' (carboxi). Para los fines
de la invención, dichas secuencias de ácidos nucleicos pueden
incluir, pero sin limitación, ADNc de virus, ARNm eucariota o
procariota, secuencias genómicas de ARN o ADN virales o procariotas
e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de
terminación de la transcripción puede localizarse en la posición 3'
de la secuencia codificante.
Los polinucleótidos de la invención se pueden
sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica,
como se describe a modo de ejemplo en Sambrook et al.(1989,
Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor
Press).
Las moléculas de polinucleótidos de la presente
invención se pueden proporcionar en forma de un casete de expresión
que incluye secuencias de control unidas operativamente a la
secuencia insertada, por lo tanto permitiendo la expresión del
péptido de la invención in vivo en un sujeto diana. Estos
casetes de expresión, a su vez, se proporcionan típicamente dentro
de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores virales
recombinantes) que son adecuados para su uso como reactivos para la
inmunización de ácidos nucleicos. Dicho casete de expresión puede
administrarse directamente a un sujeto hospedador. Como alternativa,
un vector que comprende un polinucleótido de la invención se puede
administrar a un sujeto hospedador. Preferiblemente el
polinucleótido se prepara y/o se administra usando un vector
genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector que es capaz
de portar una cantidad suficiente de información genética y
permitir la expresión de un péptido de la invención.
La presente invención incluye por tanto vectores
de expresión que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos.
Por tanto, la presente invención proporciona un vector para su uso
en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos por
tolerización que comprende cuatro o más secuencias de
polinucleótidos que codifican diferentes polipéptidos de la
invención y opcionalmente una o más secuencias de polinucleótidos
adicionales que codifican diferentes polipéptidos como se define en
el presente documento. El vector puede comprender las secuencias de
polinucleótidos que codifican los polipéptidos diferentes de la
invención.
Adicionalmente, se apreciará que las
composiciones y productos de la invención pueden comprender una
mezcla de polipéptidos y polinucleótidos. Por consiguiente, la
invención proporciona una composición o producto como se define en
el presente documento, donde en lugar de uno cualquiera de los
polipéptidos está un polinucleótido capaz de expresar dicho
polipéptido.
Los vectores de expresión se construyen de
manera rutinaria en la técnica de biología molecular y pueden por
ejemplo implicar el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores,
potenciadores y otros elementos apropiados, tales como por ejemplo
señales de poliadenilación que pueden ser necesarias y que se sitúan
en la orientación correcta, para permitir la expresión de un
péptido de la invención. Otros vectores adecuados serán evidentes
para expertos en la materia. Como de ejemplo adicional en este
sentido se hace referencia a Sambrook et al.
Por tanto, un polipéptido de la invención puede
proporcionarse por el suministro de dicho vector a una célula y
permitiendo que se produzca la transcripción a partir del vector.
Preferiblemente, un polinucleótido de la invención o para su uso de
la invención en un vector está unido operativamente a una secuencia
de control que es capaz de proporcionar la expresión de la
secuencia codificante por la célula hospedadora, es decir el vector
es un vector de expresión.
"Ligado operativamente" se refiere a una
organización de elementos en la que los componentes descritos de
esa manera se configuran para realizar su función normal. Por tanto,
una secuencia reguladora dada, tal como un promotor, unido
operativamente a una secuencia de ácido nucleico es capaz de
efectuar la expresión de esa secuencia cuando están presentes las
enzimas adecuadas. El promotor no necesita ser contiguo a la
secuencia, siempre que funcione para dirigir la expresión del
mismo. Por lo tanto, por ejemplo, las secuencias de intervención no
traducidas aunque transcritas pueden estar presentes entre la
secuencia de promotor y la secuencia de ácido nucleico y la
secuencia de promotor puede considerarse aún "unida
operativamente" a la secuencia codificante.
Se han descrito varios sistemas de expresión en
la técnica, cada uno de los cuales consiste típicamente en un
vector que contiene un gen o secuencia de nucleótido de interés
unido operativamente a secuencias de control de expresión. Estas
secuencias de control de expresión incluyen secuencias de promotor
de transcripción y secuencias de inicio y terminación de
transcripción. Los vectores de la invención pueden ser por ejemplo,
plásmidos, vectores de virus o fagos proporcionados con un origen de
replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho
polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Un
"plásmido" es un vector en forma de un elemento genético
extracromosomal. Los vectores pueden contener uno o más genes
marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a
ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de
resistencia para un vector fúngico. Los vectores se pueden usar
in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN o
usarse para introducirse por transfección o transformar una célula
hospedadora, por ejemplo, una célula hospedadora de mamífero. Los
vectores también pueden estar adaptados para usarse in vivo,
por ejemplo, para permitir la expresión in vivo del
polipéptido.
polipéptido.
Un "promotor" es una secuencia de
nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un
polinucleótido que codifica un polipéptido. Los promotores pueden
incluir promotores inducibles (en los que la expresión de una
secuencia de polinucléotidos unida operativamente al promotor se
induce por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), los
promotores reprimibles (en los que la expresión de una secuencia de
polinucleótidos unida operativamente al promotor está reprimida por
un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y promotores
constitutivos. Se pretende que el término "promotor" o la
expresión "elemento de control" incluyan regiones del promotor
de longitud total de promotor y segmentos funcionales (por ejemplo,
controles de transcripción o traducción) de estas regiones.
Un polinucleótido, casete de expresión o vector
de acuerdo con la presente invención pueden comprender
adicionalmente una secuencia de péptido señal. La secuencia de
péptido señal generalmente se inserta en una unión operativa con el
promotor de modo que el péptido señal se expresa y facilita la
secreción de un polipéptido codificado por una secuencia
codificante también en unión operativa con el promotor.
Típicamente una secuencia de péptido señal
codifica un péptido de 10 a 30 aminoácidos por ejemplo de 15 a 20
aminoácidos. A menudo los aminoácidos son predominantemente
hidrófobos. En una situación típica un péptido señal se dirige a
una cadena de polipéptido en crecimiento que porta el péptido señal
al retículo endoplasmático de la célula que se exprese. El péptido
señal se escinde en el retículo endoplasmático, permitiendo la
secreción del polipéptido por medio del aparato de Golgi. Por
tanto, un péptido de la invención puede proporcionarse a un
individuo por expresión a partir de células dentro del individuo y
secreción de esas células.
Como alternativa, los polinucleótidos de la
invención se pueden expresar de un modo adecuado para permitir la
presentación de un polipéptido de la invención por una molécula de
MHC de clase II en la superficie de una célula presentadora de
antígenos. Por ejemplo, un polinucleótido, casete de expresión o
vector de la invención se puede dirigir a células presentadoras de
antígenos o la expresión del péptido codificado puede estimularse o
inducirse preferencialmente en dichas células.
Los polinucleótidos de interés se pueden usar
in vitro, ex vivo o in vivo en la producción
de un péptido de la invención. Dichos polinucleótidos se pueden
administrar o usar en la prevención o tratamiento de la alergia a
los gatos por tolerización.
Los métodos para el suministro de genes se
conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados
Unidos Nº 5.399.346, 5.580.859 y 5.589.466. La molécula de ácido
nucleico se puede introducir directamente en el sujeto receptor,
tal como por inyección intradérmica o intramuscular convencional;
suministro transdérmico de partículas; inhalación; por vía tópica o
por medios de administración orales, intranasales o mucosos. La
molécula alternativamente se puede introducir ex vivo en
células que se han extraído de un sujeto. Por ejemplo, un
polinucleótido, casete de expresión o vector de la invención se
puede introducir en CPA de un individuo ex vivo. Las células
que contienen la molécula de ácido nucleico de interés se vuelven a
introducir en el sujeto de modo que una respuesta inmune se puede
generar contra el péptido codificado por la molécula de ácido
nucleico. Las moléculas de ácido nucleico usadas en dicha
inmunización se denominan generalmente en el presente documento
"vacunas de ácidos nucleicos".
Los polipéptidos, polinucleótidos, vectores o
células de la invención pueden estar presentes en una forma
sustancialmente aislada. Pueden estar mezclados con vehículos o
diluyentes que no interferirán con su uso destinado y todavía se
pueden considerar como aislados sustancialmente. También estar en
una forma purificada sustancialmente, en cuyo caso generalmente
pueden al menos el 90%, por ejemplo al menos el 95%, el 98% o el
99% de las proteínas, polinucleótidos, células o masa seca de la
preparación.
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La invención abarca el uso in vitro de un
método de producir una población de CPA que presenta los péptidos
de la invención en su superficie, que pueden usarse posteriormente
en terapia. Dicho método puede realizarse ex vivo en una
muestra de células que se han obtenido de un paciente. Las CPA
producidas de este modo por lo tanto forman un agente farmacéutico
que se puede usar en el tratamiento o prevención de la alergia a
los gatos por tolerización. El sistema inmune del individuo debe
aceptar a las células porque proceden de ese individuo. El
suministro de células que se han producido de este modo al individuo
a partir del cual se obtuvieron originalmente, por tanto forma una
realización terapéutica de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos, polinucléotidos, vectores y
células de la invención se pueden proporcionar a un individuo solos
o en combinación. Cada molécula o célula de la invención se puede
proporcionar a un individuo en una forma sustancialmente aislada,
purificada o sustancialmente purificada. Por ejemplo, un péptido de
la invención se puede proporcionar a un individuo sustancialmente
libre de los otros péptidos.
Mientras que puede ser posible para los
péptidos, polinucleótidos o composiciones de acuerdo con la
invención que estén presentes en una forma bruta, es preferible
presentarlos como una formulación farmacéutica. Por tanto, de
acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la presente
invención proporciona una formulación farmacéutica para su uso en
la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos por
tolerización que comprende una composición, vector o producto de
acuerdo con la invención junto con uno o más diluyentes o vehículos
farmacéuticamente aceptables y opcionalmente uno o más de otros
ingredientes terapéuticos. El vehículo o vehículos debe ser
aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes
de la formulación y no debe ser nocivo para el receptor del mismo.
Típicamente, los vehículos para inyección y la formulación final,
son estériles y libres de pirógenos. La formulación de una
composición que comprende el péptido, polinucleótidos o células de
la invención se puede realizar usando químicas y metodologías de
formulación farmacéutica convencional todas las cuales están
fácilmente disponibles de manera razonable para el experto.
Por ejemplo, las composiciones que contienen una
o más moléculas o células de la invención se pueden combinar con
uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las
sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o
emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH y similares, puede
estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes,
vehículos y sustancias auxiliares son generalmente agentes
farmacéuticos que no inducen una respuesta inmune en el individuo
que recibe la composición y que se pueden administrar sin toxicidad
indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen,
pero sin limitación, líquidos tales como agua, solución salina,
polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. Las sales
farmacéuticamente aceptables también se pueden incluir en los
mismos, por ejemplo, sales ácidas minerales tales como
hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares y las
sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos,
malonatos, benzoatos y similares. Un análisis exhaustivo de
sustancias auxiliares, vehículos y excipientes farmacéuticamente
aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences
(Mack Pub. Co., N. J. 1991).
Dichas composiciones pueden estar preparadas,
envasadas o se pueden vender de una forma adecuada para la
administración en embolada o para la administración continua. Las
composiciones inyectables pueden estar preparadas, envasadas o
venderse en forma de dosificaciones unitarias, tales como en
ampollas o recipientes multidosis que contienen un conservante. Las
composiciones incluyen, pero sin limitación, suspensiones,
soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y
formulaciones de liberación prolongada implantables o
biodegradables. Dichas composiciones pueden comprender
adicionalmente uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero
sin limitación, agentes de suspensión, de estabilización o de
dispersión. En una realización de una composición para la
administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en
forma seca (por ejemplo, un polvo o gránulos) para la
reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril
libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la
composición reconstituida. Las composiciones farmacéuticas pueden
estar preparadas, envasadas o venderse en forma de una solución o
suspensión oleosa o inyectable acuoso estéril. Esta suspensión o
solución se puede formular de acuerdo con la técnica conocida y
puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes
adicionales tales como agentes de dispersión, agentes humectantes o
agentes de suspensión descritos en el presente documento. Dichas
formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando un
disolvente o diluyente no tóxico parenteralmente aceptable, tal
como, por ejemplo, agua o 1,3-butano diol. Otros
disolventes y eluyentes aceptables incluyen, pero sin limitación,
solución de Ringer, solución de cloruro sódico isotónico y aceites
fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos. Otras composiciones
parenteralmente administrables que son útiles incluyen las que
comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una
preparación liposomal o como un componente de sistemas de polímeros
biodegradables. Las composiciones para liberación prolongada o
implantación pueden comprender materiales hidrófobos o poliméricos
farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de
intercambio iónico, un polímero poco soluble o una sal poco
soluble.
Como alternativa, los péptidos o polinucléotidos
de la presente invención pueden estar encapsulados, adsorbidos a, o
asociados con, vehículos particulares. Los vehículos particulares
adecuados incluyen los derivados de polímeros de polimetil
metacrilato, así como micropartículas de PLG derivadas a partir de
poli(lactidos) y
poli(lactidos-co-glicolidos).
Véase, por ejemplo, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:
362-368. Otros polímeros y sistemas particulados
también se pueden usar, por ejemplo, polímeros tales como
polilisina, poliarginina, poliomitina, espermina, espermidina, así
como conjugados de estas moléculas.
La formulación de cualquiera de los péptidos,
polinucleótidos o células mencionadas en el presente documento
dependerá de factores tales como la naturaleza de la sustancia y el
método de suministro. Cualquiera de estas sustancias puede
administrarse en una variedad de formas de dosificación. Se puede
administrar por vía oral (por ejemplo como comprimidos, trociscos,
pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos o polvos
dispersables), por vía parenteral, subcutánea, por inhalación, por
vía intradérmica, intravenosa, intramuscular, intraesternal,
transdérmica o por técnicas de infusión. La sustancia también se
puede administrar como supositorios. Un médico será capaz de
determinar la vía de administración requerida para cada individuo
particular.
Las composiciones de formulaciones de la
invención comprenderán una concentración adecuada de cada
péptido/polinucleótido/célula que sea eficaz sin provocar una
reacción adversa. Típicamente, la concentración de cada péptido en
la composición estará en el intervalo de 0,03 a 200 mmol/ml. Más
preferiblemente de intervalo de 0,3 a 200 nmol/ml, de 3 a 180
nmol/ml, de 5 a 75 nmol/ml o de 10 a 50 nmol/ml. La composición o
formulaciones tiene que tener una pureza de más del 95% o 98% o una
pureza de al menos el 99%.
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La presente invención se refiere a péptidos,
polinucleótidos, vectores y células que son capaces de
desensibilizar o hacer tolerantes a individuos humanos frente al
alérgeno de Fel d1 y por lo tanto son útiles en la prevención o
tratamiento de la alergia a los gatos. La invención proporciona
composiciones, productos, vectores y formulaciones para su uso en
la prevención o tratamiento de alergia a los gatos por tolerización.
La invención también proporciona un método de tolerización o
desensibilización de un individuo alérgico a los gatos que comprende
la administración, solos o en combinación de los
polipéptidos/polinucleótidos/células de la invención como se
describe
anteriormente.
anteriormente.
El individuo a tratar o al que se proporciona la
composición o formulación de la invención es preferiblemente un ser
humano. Se apreciará que puede saberse que el individuo a tratar
está sensibilizado a la alergia a Fel d1, a riesgo de
sensibilizarse o de que se sospeche que está sensibilizado. El
individuo se puede ensayar para sensibilización usando métodos bien
conocidas en la técnica y como se describe en el presente documento.
Como alternativa, el individuo puede tener una historia familiar de
alergia a los gatos. Puede que no sea necesario ensayar un
individuo para la sensibilización frente a Fel d1 porque el
individuo puede presentar síntomas de alergia cuando se pone cerca
de un gato. Cerca significa 10 metros o menos, 5 metros o menos, 2
metros o menos, 1 metro o menos o a 0 metros del gato. Los síntomas
de alergia pueden incluir picor de ojos, nariz que moquea,
dificultades respiratorias, enrojecimiento y picor de piel o
erupción.
El individuo a tratar puede tener cualquier
edad. Sin embargo, preferiblemente, el individuo puede estar en el
grupo de edad de 1 a 90, 5 a 60,10 a 40 o más preferiblemente de 18
a 35. Los grupos de individuos que probablemente se beneficien del
tratamiento son por ejemplo propietarios de gatos, veterinarios y
otras personas que están en contacto con gatos.
Preferiblemente, el individuo a tratar es de una
población que tiene las frecuencias alélicas de MHC dentro del
intervalo de frecuencias que son representativas de la población
Caucásica. Las frecuencias alélicas de la población de referencia
para 11 familias de alelos de DRB1 comunes se muestran en la Tabla 3
del Ejemplo 2 (Datos del Libro HLA Facts, Parham y Barber). Las
frecuencias de referencia se obtuvieron por análisis de estudios
múltiples que indicaban las frecuencias y las figuras mostradas son
valores medios. Preferiblemente por lo tanto, el individuo a tratar
es de una población que tiene frecuencias alélicas de MHC
equivalentes a la población de referencia para los alelos
mencionados en la Tabla 3 (tales como para al menos 1, 2, 3, 4, 5 o
todos los alelos), por ejemplo dentro de los intervalos de las
figuras más o menos el 1, 2, 3, 5, 10, 15 ó 20%.
Preferiblemente el individuo es de una población
en la que las frecuencias alélicas de los siguientes alelos de DRB1
son:
4 - al menos el 9%
7 - al menos el 10%
11 - al menos el 8%.
El individuo puede haber tenido alergia a los
gatos durante al menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años.
El individuo puede padecer erupción, congestión nasal, secreción
nasal y/o tos causado por la alergia. Puede que se le hayan
administrado o no al individuo otras composiciones/compuestos que
tratan la alergia a los gatos. El individuo puede vivir en una
población que comprende al menos 0,1 gatos por habitante humano.
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La invención también proporciona un método para
detectar si un individuo tiene o está en riesgo de desarrollar un
trastorno, en el que el trastorno comprende síntomas alérgicos en
respuesta a alérgenos de gato.
El individuo es típicamente un mamífero,
preferiblemente un ser humano. El individuo ha ensayar en el método
está preferiblemente entre las edades de 1 año a 80 años, más
preferiblemente entre las edades de 1 año y 60, 50, 40, 30 ó 20
años y más preferiblemente entre las edades de 1 año y 16 años.
Se puede haber diagnosticado al individuo o se
puede sospechar que padece un trastorno que está clasificado como
intrínseco o no alérgico, por ejemplo, asma intrínseca o no
alérgica. El individuo puede carecer de una respuesta de
anticuerpos detectable frente a un alérgeno de gato, en particular
una respuesta de IgE frente a alérgeno de gato. Los ensayos
adecuados para detectar IgE incluyen el sistema Pharmacia^{TM}
CAP. Usando este sistema, el individuo típicamente puntúa 0 ó
0/1.
El individuo puede ser un paciente que padece o
se le ha diagnosticado que padece síntomas que son típicamente
asociados con alergia tales como picor de ojos, nariz que moquea,
dificultades respiratorias, enrojecimiento y picor de piel o
erupción, en ausencia de un activador identificable. La primera
ocurrencia o diagnóstico de estos síntomas puede producirse cuando
el individuo es mayor de 15 años de edad. Por ejemplo, el individuo
puede tener al menos 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ó 30 años en
la primera ocurrencia o diagnóstico de los síntomas de alergia que
se asocian típicamente con alergia.
El método de la invención concierne la
determinación de si un individuo tiene una respuesta de células T
frente a alérgeno de gato, en particular el alérgeno de gato
principal, Fel d1. Dicha respuesta de células T estará presente en
individuos alérgicos a los gatos. Sin quedar ligado por ninguna
hipótesis, los inventores consideran que los trastornos intrínsecos
o no alérgicos también están provocados de hecho por una respuesta
inmune dirigida por células T, independiente de IgE. Por
consiguiente estos trastornos también tienen un activador de
alérgeno, pero no da lugar a IgE específicas de alérgeno. Más bien
da lugar a una respuesta de células T que puede estar caracterizada
por la proliferación en células T o la liberación de citocinas. Por
ejemplo, las citocinas liberadas pueden incluir
IL-5, que está implicada en el reclutamiento de
eosinófilos. Por consiguiente, la respuesta de células T puede
dirigir la inducción de reacciones eosinofílicas en un
individuo.
Si un individuo tiene una respuesta de células T
frente a Fel d1 se determina midiendo si el individuo tiene o no
una respuesta de células T frente a un péptido o combinación de
péptidos de acuerdo con la invención. Si el individuo tiene o no
dicha respuesta puede determinarse por cualquier método adecuado,
típicamente un método que se pueda usar para detectar la
proliferación de células T con experiencia previa de exposición a
alérgeno o la presencia de citocinas liberadas por células con
experiencia previa de exposición a alérgeno. Una respuesta positiva
por las células T del paciente frente al péptido o combinación de la
invención indica que el paciente tiene o es más probable que
desarrolle síntomas de tipo de alergia en respuesta al alérgeno.
Una respuesta negativa indica que el paciente tiene síntomas de tipo
de alergia que no están provocados por el alérgeno de gato o es
menos probable que desarrolle síntomas de tipo alergia en respuesta
al alérgeno de gato.
Las células T que responden al péptido o
combinación en el método generalmente son células T que se han
presensibilizado al alérgeno in vivo. Estas células T con
experiencia previa de exposición a alérgeno generalmente están
presentes en la sangre periférica de un individuo, es decir dentro
de la población de células mononucleares en sangre periférica
(PBMC) en el individuo. Las células T pueden ser células T CD4 y/o
CD8.
En el método las células T pueden ponerse en
contacto con el péptido o combinación de la invención in
vitro o in vivo, preferiblemente in vitro en una
muestra del individuo.
Generalmente las células T que se ponen en
contacto en el método se toman del individuo en una muestra de
sangre, sin embargo se pueden usar otros tipos de muestras que
contienen células T. La muestra se puede añadir directamente al
ensayo o puede procesarse primero. Típicamente el procesamiento
puede comprender técnicas estándar tales como un gradiente de
centrifugación para separar las células T, con resuspensión en
cualquier volumen adecuado. Como alternativa, el procesamiento
puede comprender la dilución de la muestra, por ejemplo con agua,
tampón o medio. La muestra puede diluirse de 1, 5 a 100 veces, por
ejemplo de 2 a 50 o de 5 a 10 veces.
El procesamiento puede comprender la separación
de componentes de la muestra. Las células mononucleares típicas
(MC) se separan de las muestras. Las MC comprenderán las células T y
células presentadoras de antígenos (CPA). Por tanto en el método
las CPA presentes en las MC separadas pueden presentar el péptido a
las células T. En otra realización sólo las células T, tales como
células T CD4, se pueden purificar a partir de la muestra. Las
PBMC, MC y células T se pueden separar de la muestra usando métodos
conocidos en la técnica.
Preferiblemente las células T usadas en el
ensayo están en forma de muestras no procesadas o diluidas, son
células T recientemente aisladas (tales como en forma de PBMC o MC
aisladas recientemente) que se usan directamente ex vivo, es
decir no están cultivadas antes de usarse en el método o son células
descongeladas (que estaban congeladas anteriormente). Sin embargo
las células T se pueden cultivar antes de su uso, por ejemplo en
presencia del alérgeno y generalmente también citocinas que
promueven el crecimiento exógeno. Durante el cultivo el alérgeno
está presente típicamente en la superficie de las CPA, tales como
las CPA usadas en el método. El precultivo de las células T puede
conducir a un aumento de la sensibilidad del método. Por tanto las
células T se pueden convertir en líneas celulares, tales como
líneas celulares a corto plazo.
La CPA que está presente típicamente en el
método puede proceder del mismo individuo que la célula T o de un
individuo diferente. La CPA puede ser una CPA que se produce de
manera natural o una CPA artificial. La CPA es una célula que es
capaz de presentar el antígeno a una célula T. Es típicamente una
célula B, célula dendrítica o macrófago. Se separa típicamente de
la misma muestra que la célula T y se copurifica típicamente con la
célula T. Por tanto la CPA puede estar presente en PBMC o MC. La CPA
es típicamente una célula aislada recientemente ex vivo o
una célula cultivada. Puede estar en una forma de una línea celular,
tal como línea celular inmortalizada o a corto plazo. La CPA puede
expresar moléculas de MHC de clase II vacías en su superficie.
En una realización el péptido o combinación de
la invención se añade directamente a un ensayo que comprende
células T y CPA. Como se analiza anteriormente las células T y CPA
en dicho ensayo pueden estar en forma de MC.
En una realización el péptido o combinación de
péptidos se proporciona a la CPA en presencia de la célula T. La
CPA se proporciona después a la célula T, típicamente después de que
se permita que presente el alérgeno en su superficie. El péptido o
combinación de péptidos pueden captarse dentro de la CPA y
presentarse o simplemente pueden captarse sobre la superficie sin
entrar dentro de la CPA.
Típicamente se añaden de 10^{5} a 10^{7},
preferiblemente de 2,5x10^{5} a 10^{6} PBMC a cada ensayo. En
el caso en el que el péptido o combinación de péptidos se añaden
directamente al ensayo se añaden típicamente como un péptido con
una concentración de 10^{-1} a 10^{3} \mug/ml,
preferiblemente de 0,5 a 50 \mug/ml o de 1 a 10 \mug/ml.
Típicamente tiempo durante el cual las células T
se incuban con el péptido o combinación es de 4 a 24 horas
(preferiblemente de 5 a 18 horas) para las células T efectoras o
durante más de 24 horas para células de memoria central. Se ha
descubierto que cuando se usan PBMC ex vivo se pueden incubar
5,0x10^{6} PBMC en 10 \mug/ml de péptido durante 5 horas a
37ºC.
La proliferación de las células T incubadas
puede medirse por cualquier método adecuado. Por ejemplo por medida
de flujo citométrico de incorporación del compuesto fluorescente
CFSE después de la incubación con péptido o midiendo la
incorporación del compuesto radiomarcado
^{3}H-timidina después de la incubación con
péptido. Un ejemplo típico del último método es de la siguiente
manera:
Se distribuyen 100 \mul de concentración de
péptido apropiada en los pocillos apropiados de placas de 96
pocillos. Las placas se sitúan después en una incubadora
humidificada al 5% de CO_{2} fijada a 37ºC durante un máximo de 4
horas. Las PBMC aisladas como es convencional en la técnica se
preparan a una concentración de 2x10^{6} células/ml en medio
total a temperatura ambiente. Se distribuyen 100 \mul de una
solución celular en cada uno de los pocillos de las placas de 96
pocillos que contienen antígeno/péptido. Después se incuban las
placas durante de 6 a 8 días. Los cultivos se pulsan con solución de
timidina tritiada añadiendo 10 \mul de solución madre de timidina
tritiada (1,85 MBq/ml en medio RPMI libre de suero) a cada pocillo.
Después se vuelven a introducir las placas en el incubador durante
entre 8 y 16 horas. Los cultivos se recogen después en tiras de
filtro y las tiras de filtro secas se recuentan usando un contador
de centelleo beta apropiado. Los recuentos a partir de pocillos que
contienen péptido se comparan estadísticamente con pocillos que
contienen medio solo (12 pocillos por grupo). Una diferencia
estadísticamente significativa entre los pocillos solo con medio y
los pocillos estimulados por péptido se considera una simulación
positiva de las PBMC por el péptido o combinación de péptidos.
La liberación de citocinas puede medirse por
cualquier método adecuado tal como ensayo de ELISA. Dichos métodos
se conocen bien en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que muchos individuos son alérgicos o
pueden requerir desensibilización frente a varios antígenos de
polipéptidos, la invención actual también proporciona medios de
desensibilizar individuos que son alérgicos a múltiples antígenos.
La "tolerancia" inducida en un individuo frente a un primer
alérgeno o antígeno de polipéptido puede generar en el individuo un
"ambiente que produce tolerancia inmunológica" en el que las
respuestas inmunes inapropiadas frente a otros antígenos se pueden
regular negativamente para proporcionar tolerancia frente a
otros
antígenos.
antígenos.
Este hallazgo significa que los individuos
alérgicos a múltiples alérgenos pueden tratarse en un periodo de
tiempo muy reducido y que los individuos muy alérgicos a algunos
alérgenos (por ejemplo, cacahuetes) pero medianamente alérgicos a
otros alérgenos (por ejemplo caspa de gato) se pueden beneficiar de
una terapia en la que la tolerancia al alérgeno más suave se
establece y después este ambiente se usa para producir tolerancia
inmunológica se usa para proporcionar tolerancia frente al otro
alérgeno más fuerte. Además, lo individuos que padecen un trastorno
autoinmune están sensibilizados adicionalmente (o a diferencia
inmune) a un alérgeno o antígeno no relacionado se pueden
beneficiar de un régimen de tratamiento en el que la tolerancia al
alérgeno o antígeno no relacionado se establece primero y este
ambiente en el que se produce tolerancia inmunológica se usa para
proporcionar tolerancia al autoantígeno asociado con el trastorno
autoinmune.
Por lo tanto, un método de desensibilización se
proporciona de un individuo alérgico a los gatos frente a un
antígeno de Fel d1 y uno o más antígenos de polipéptidos diferentes
adicionales. El método supone, en una primera etapa, la
administración al individuo de una composición/producto/formulación
(una composición primaria) de acuerdo con la invención como se
escribe en el presente documento y en el que la administración se
realiza de una manera suficiente para generar un estado hipo
responsivo frente al antígeno de Fel d1. Una vez que se ha
establecido un estado hiporresponsivo hacía el antígeno Fel d1 o al
menos se ha producido un cambio hacia la sensibilización, el método
supone una administración de una composición secundaria que
comprende un segundo antígeno de polipéptido diferente frente al
cual el individuo se va ha sensibilizar. La administración de la
composición secundaria se realiza de un modo para beneficiarse del
ambiente en el que produce tolerancia inmunológica establecida por
el uso de la composición primaria, en el que ahora es posible
establecer tolerancia frente al segundo antígeno de polipéptido
diferente. La composición secundaria se coadministra con la
composición primaria o un fragmento más grande de Fel d1. Por
"coadministrar" significa la administración simultánea o
concurrente, por ejemplo, cuando las dos están presentes en la misma
composición o se administran en composiciones separadas casi al
mismo tiempo pero en sitios diferentes, así como el suministro de
antígenos de polipéptidos en composiciones separadas en diferentes
tiempos. Por ejemplo, la composición secundaria se puede suministrar
antes de o después del suministro de la primera composición (o un
fragmento mayor de Fel d1) en el mismo o diferente sitio. La
temporización entre los suministros puede variar de una separación
de cerca de varios segundos a una separación de cerca de varios
minutos, una separación de varias horas o una separación de varios
días. Además, se pueden emplear diferentes métodos de
suministro.
suministro.
El segundo antígeno de polipéptido es
preferiblemente un alérgeno diferente al alérgeno de Fel d1. Los
alérgenos adecuados para su uso en los métodos de la invención se
pueden obtener por supuesto y/o producir usando métodos conocidos.
Las clases de alérgenos adecuados incluyen, pero sin limitación,
pólenes, caspa de animales distintas de la caspa de gato, céspedes,
mohos, polvos, antibióticos, picaduras venenosas de insectos y una
variedad de alérgenos ambientales (incluyendo químicos y metales),
farmacológicos y alimentarios. Los alérgenos de árboles comunes
incluyen pólenes del álamo, fresno, abedul, arce, roble, olmo, nogal
y pacanas; los alérgenos de plantas comunes incluyen los de
artemisa, ambrosia, plátano inglés, acedera y centinodia; los
alérgenos de contacto de plantas incluyen aquellos del roble
venenoso, la hiedra y ortigas venenosas; alérgenos de herbáceas
comunes que incluyen césped, agróstide, hierba de don carlos, pasto
Bermuda, alérgenos de festuca y pasto azul; también se pueden
obtener alérgenos comunes a partir de mohos u hongos tales como
Alternaría, Fursarium, Homodendrum, Aspergillus, Micropolispora,
Mucor y actinomicetos termófilos; los alérgenos epidérmicos se
pueden obtener a partir de polvos doméstico u orgánico (típicamente
fúngicos en origen), de artrópodos tales como ácaros domésticos
(Dermatophagoides pteronyssinus) o de fuentes animales tales como
plumas y caspa de perro; los alérgenos alimentarios comunes
incluyen leche y queso (diaria), huevo, trigo, frutos secos (por
ejemplo cacahuete), productos de mar (por ejemplo, marisco),
guisantes, judías y alérgenos del gluten; los alérgenos ambientales
comunes incluyen metales (níquel y oro), productos químicos
(formaldehído, trinitrofenol y turpentina), látex, goma, fibra
(algodón o lana), arpillera, tinte de pelo, cosméticos, alérgenos de
detergente y de perfume; los alérgenos farmacológicos comunes
incluyen anestésicos locales y alérgenos de salicilato; los
alérgenos de antibióticos incluyen alérgenos de penicilina,
tetraciclina y sulfonamida y los alérgenos de insectos comunes
incluyen abeja, avispa y veneno de hormiga y alérgenos del cáliz de
cucarachas. Los alérgenos particularmente bien caracterizados
incluyen, pero sin limitación, los epítopos crípticos y principales
del alérgeno de Der p I (Hoyne et al. (1994) Inmunology
83190-195), fosfolipasa A2 de veneno de abeja (PLA)
(Akdis et al. (1996) J. Clin. Invest.
98:1676-1683) alérgeno de polen de Abedul Bet v1
(Bauer et al. (1997) Clin. Exp. 107:536-541)
y el alérgeno de césped multiepitópico recombinante rKBG8.3 (Cao
et al. (1997) inmunology 90:46-51). Estos y
otros alérgenos adecuados están disponibles en el mercado y/o se
pueden preparar fácilmente como extractos siguiendo técnicas
conocidas.
Preferiblemente, el segundo alérgeno de
polipéptido se selecciona de la lista de secuencias de alérgenos y
números de acceso de base de datos (números de acceso a NCBI) a
continuación. El NCBI es el Centro Nacional para la Información
Biotecnológica y es una división del Instituto Nacional de Salud de
Estados Unidos. El sitio web del NCBI, a partir del cual se puede
facilitar el acceso, es www.ncbi,nlh.gov/. Las secuencias de
alérgenos y los números de acceso a bases de datos y secuencias de
alérgenos (números de acceso a NCBI):
Una vez que se han formulado las composiciones
de la invención se pueden suministrar a un sujeto in vivo
usando una variedad de vías y técnicas conocidas. Por ejemplo, como
una composición se puede proporcionar como una solución inyectable,
suspensión o emulsión y administrarse por vía parenteral, inyección
subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intraarterial,
intraperitoneal, intravenosa usando una aguja y jeringa
convencionales o usando un sistema de inyección comprimida líquida.
Las composiciones también pueden administrarse por vía tópica a la
piel o tejido mucoso, tal como por vía nasal, intratraqueal,
intestinal, rectal o vaginal o proporcionándose como un
pulverizador finamente dividido adecuado para la administración
respiratoria o pulmonar. Otros modos de administración incluyen
administración oral, supositorios, administración sublingual y
técnicas de suministro transdérmico activas o pasivas.
Cuando un péptido de la invención va ha
administrarse, se prefiere administrar el péptido a un sitio en el
cuerpo en el que tendrá la capacidad de ponerse en contacto con
células presentadoras de antígenos adecuadas, y en el que el mismo,
o los mismos, tendrán la oportunidad de ponerse en contacto con
células T del individuo. Cuando se va a administrar una CPA, se
prefiere administrar la CPA a un sitio en el cuerpo en el que tendrá
la capacidad de ponerse en contacto con y activar células T
adecuadas del individuo.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración de los
péptidos/polipéptidos/células (tales como la composición que
contiene una pluralidad de péptidos) puede ser por cualquier método
adecuado como se describe anteriormente. Las cantidades adecuadas
del péptido se pueden determinar empíricamente, pero típicamente
están en el intervalo proporcionado a continuación. Una única
administración de cada péptido puede ser suficiente para tener
efecto beneficioso para el paciente, pero se apreciará que puede
ser beneficiosa si el péptido se administra más de una vez, en cuyo
caso los regimenes típicos de administración pueden ser, por
ejemplo, una o dos veces por semana durante 2-4
semanas cada 6 meses o una vez al día durante una semana cada de
cuatro a seis meses. Como se apreciará cada péptido o nucleótido o
combinación de péptidos y/o polinucleótidos pueden administrarse a
un paciente solos o en combinación.
Las dosificaciones para la administración
dependerán de varios factores incluyendo la naturaleza de la
composición, la vía de administración y el plan y temporización del
régimen de administración. Las dosis adecuadas de una molécula o
una combinación de moléculas de la invención puede estar en el orden
de hasta 10 \mug, hasta 15 \mug, hasta 20 \mug, hasta 25
\mug, hasta 30 \mug, hasta 35 \mug, hasta 50 \mug, hasta 100
\mug, hasta 500 \mug o más administración. Las dosis adecuadas
pueden ser menores de 15 \mug, pero al menos 1 ng o al menos 2 ng
o al menos 5 ng o al menos 50 ng o al menos 100 ng o al menos 500 ng
o al menos 1 \mug o al menos 10 \mug. Para algunas moléculas o
combinaciones de la invención, la dosis usada puede ser más alta,
por ejemplo hasta 1 mg, hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg, hasta 5
mg o más altas. Dichas dosis se pueden proporcionar en una
formulación líquida, a una concentración adecuada para permitir un
volumen apropiado para la administración por la vía seleccionada.
Se entenderá que las dosis anteriores se refieren a la dosis total
en el caso de una combinación de moléculas. Por ejemplo, "hasta 35
\mug" se refiere a una concen-
tración de péptido total de hasta 35 \mug en una composición que comprende una combinación de más de un péptido.
tración de péptido total de hasta 35 \mug en una composición que comprende una combinación de más de un péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a una
combinación de componentes descritos en el presente documento
adecuada para el uso en el tratamiento de la invención que están
envasados en forma de un kit en un recipiente. Dichos kit
comprenden una serie de componentes para permitir un tratamiento de
la invención. Por ejemplo, un kit puede comprender cuatro o más
péptidos diferentes, polinucleótidos y/o células de la invención o
cuatro o más péptidos, polinucleótidos o células de la invención y
uno o más agentes terapéuticos adicionales adecuados para la
administración simultánea o para la administración secuencial o
separada. El kit puede contener opcionalmente otro reactivo o
reactivos adecuados o instrucciones y similares.
La invención se ilustra por los siguientes
ejemplos.
Se investigaron los siguientes péptidos que
abarcan las secuencias de Fel d1 respecto a su capacidad para
unirse a las nueve moléculas de HLA-DR: DR1, DR3,
DR4, DR7, DR11, DR13, DR15, B4 y B5.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares homocigóticas EBV se usaron
como fuentes de moléculas de HLA de clase II (Tab. 4). Las
moléculas de HLA-DR se purificaron por cromatografía
de afinidad usando el monomórfico Mab L234 (ATTC, Rockville,
Estados Unidos) acoplado a gel de sepharose CL
4B-proteína A (Pharmacia, Francia). En resumen, se
lisaron las células en hielo a 5x10^{8} células/ml en NaCl 150
mM, tampón Tris HCl 10 mM, pH=8,3 que contenía el Nonidet P40 al 1%
(NP40), 10 mg/l de aprotinina, EDTA 5 mM y PMSF 10 mM. Después de la
centrifugación a 100.000 g durante 1 h, se aplicó el sobrenadante a
una columna de sepharose 4B y una de sepharose
4B-proteína A y después a la columna de afinidad
específica. Las moléculas de HLA-DR se eluyeron con
n-dodecil
b-D-maltósido (DM) 1,1 mM, NaCl 500
mM y Na_{2}C0_{3} 500 mM pH=11,5. Las fracciones se
neutralizaron inmediatamente a pH=7 con tampón Tris HCl 2 M pH=6,8
y se dializaron extensamente frente a DM 1 mM, NaCl 150 mM, tampón
fosfato 10 mM pH=7. Para las moléculas de HLA-DR
más allá de número de lote mayor de 40 el DM 1 mM en tampón de
diálisis se sustituyó por NOGP 1 mM.
La moléculas de HLA-DR se
diluyeron en fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, DM 1 mM, citrato 10 mM,
tampón timerosal al 0,003% con un péptido biotinilado apropiado y
diluciones en serie de péptidos competidores. Las condiciones de
unión de cada molécula se detallan en la Tab 4. Las muestras (100
\mul por pocillo) se incubaron en placas de polipropileno de 96
pocillos (Nunc, Dinamarca) a 37ºC durante de 24 h a 72 h. Después de
la neutralización con 50 \mul de Tris HCl 450 mM pH=7,5,
timerosal al 0,003%, BSA al 0,3%, tampón DM 1 mM, se aplicaron las
muestras a placas de ELISA de 96 pocillos maxisorp (Nunc, Dinamarca)
previamente revestidas con 10 mg/ml de L243 Mab y saturadas con
Tris HCl 100 mM pH=7,5, BSA al 0,3%, tampón timerosal al 0,003%. Se
permitió que se unieran a las placas revestidas con anticuerpos
durante 2 h a temperatura de ambiente. El péptido biotinilado unido
se detectó por incubación con conjugado fosfatasa
alcalina-estreptavidina (Amersham, Reino Unido) y
después de lavados, añadiendo sustrato de
4-metilumbeliferil fosfato (Sigma, Francia). La
fluorescencia emitida se midió a 450 nm tras la excitación a 365 nm
en un fluorímetro contador de marcas múltiples Wallac Victor2 1420
(Perkin Elmer). La unión máxima se determinó por incubación del
péptido biotinilado o la molécula de MHC II en ausencia de
competidor. La especificad de unión se evaluó añadiendo un exceso de
péptido no biotinilado. El fondo no fue significativamente
diferente del obtenido por la incubación del péptido biotinilado sin
moléculas de MHC II. Se expresaron los datos como la concentración
de péptido que evitó la unión del 50% del péptido marcado (CI50).
La capacidad de unión se evaluó después en relación con péptidos de
control de unión fuerte (referencia) conocidos. Los péptidos de
referencia adecuados para los alelos de HLA ensayados en estos
experimentos son: DR1 (alelo DRB1*0101); HA 306-318
(PKYVKQNTLKLAT); DR3 (alelo DRB1*0301); MT216 (AKTIAYDEEARRGLE); DR4
(alelo DRB1*0401); HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR7
(alelo DRB 1 *0701); YKL (AAYAAAKAAALAA); DRB1*1101: HA
306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR13 (alelo DRB1* 1301): B1
21-36 (TERVRLVTRHIYNREE); DR15 (alelo DRB1 *1501):
A3 152-166 (EAEQLRRAYLDGTGVE); DRB4 (alelo
DRB4*0101): E2/E7 (AGDLLAIETDKATI), y DRB5 (alelo DRB5*0101): HA
306-318 (PKYVKQNTLKLAT).
Los péptidos que se unían y los que no se unían
se diferenciaron primero basándose en un umbral superior de 1000 nM
como se describe generalmente en la bibliografía (Southwood et
al.(1998). J Immunol 160:3363; Geluk et al. (1998) Proc
Nati Acad Sci USA 95:10797), pero se evalúa adicionalmente por
comparación con péptidos de referencia. Los péptidos de referencia
se seleccionan entre los mejores péptidos de unión de cada molécula
de HLA dada. En relación a los péptidos de referencia, un péptido
presenta una unión débil para una molécula de HLA dada si tiene una
CI50 más de 100 veces menor que el péptido de referencia para la
molécula HLA dada. Un péptido presenta una unión moderada si tiene
una CI50 más de 20 veces menor pero menos de 100 veces menor que el
péptido de referencia para molécula HLA dada. Un péptido presenta
una unión fuerte si tiene una CI50 menos de 20 veces menor que el
péptido de referencia para la molécula de HLA dada.
\global\parskip0.880000\baselineskip
Los nueve alelos de HLA usados para estos
experimentos abarcan una gran proporción de la población caucásica.
(Las frecuencias de referencia de los alelos de HLA en la población
se proporcionan en la Tabla 3 del Ejemplo 2). Por consiguiente se
evaluaron las combinaciones de péptidos para determinar cuál
proporcionaría la cobertura más amplia de diferentes moléculas de
HLA. Los criterios diana para una mezcla se definieron por lo tanto
de la siguiente manera: para una molécula de HLA dada, una mezcla
debe comprender 2 péptidos con unión fuerte y 1 péptido con unión
moderada o 1 péptido con unión fuerte y 3 péptidos con unión
moderada. Las mezclas preferidas cumplen estos criterios para los
nueve tipos de HLA ensayados. Sólo los péptidos con secuencias
correspondientes a las SEC ID Nº: 1 a 12 se consideraron en este
análisis como péptidos con secuencias correspondientes a las SEC ID
Nº: 13 a 16 y se descubrió que eran escasamente solubles. A partir
de las SEC ID Nº: 1 a 12 hay más de 3000 combinaciones posibles de
péptidos que podrían satisfacer potencialmente los criterios diana
expuestos arriba.
Para permitir la visualización de estas
combinaciones se aplicó un sistema de puntuación binario de modo que
para cada tipo de HLA, cuando una combinación de péptidos cumple
uno de los criterios anteriores se introdujo una puntuación de
"1" y cuando los criterios no se cumplieron se introdujo una
puntuación de "0". Las puntuaciones a través de todos los
tipos de HLA se añaden después, de modo que una mezcla que no cumple
los criterios para ninguno de los tipos de HLA tendrá una
puntuación de 0, mientras que una mezcla que cumple los criterios
para los nueve tipos de HLA tendrá una puntuación 9. Las
puntuaciones para cada combinación de péptidos se representan
gráficamente en las Figuras de 2 A a Q. La mayor puntuación de nueve
se consiguió con las 10 mezclas mostradas a continuación:
| Figura 1 A | punto 16 | MLA 01, 02, 03, 04, 05, 12, 14 |
| Figura 1 B | punto 272 | MLA 01, 03, 04, 05, 07, 12, 14 |
| Figura 1 C | punto 472 | MLA 02, 03, 04, 05, 06, 12, 14 |
| Figura 1 C | punto 482 | MLA 02, 03, 04, 05, 07, 12, 14 |
| Figura 1 C | punto 488 | MLA 02, 03, 04, 05, 11, 12, 14 |
| Figura 1 C | punto 494 | MLA 02, 03, 04, 05, 12, 14, 15 |
| Figura 1 C | punto 495 | MLA 02, 03, 04, 05, 12, 14, 16 |
| Figura 1 D | punto 699 | MLA 03, 04, 05, 07, 12, 14, 15 |
| Figura 1 D | punto 700 | MLA 03, 04, 05, 07, 12, 14, 16 |
| Figura 1 G | punto 1271 | HLA 02, 03, 04, 05, 12, 14 |
Por tanto estas mezclas son combinaciones
preferidas de péptidos para su uso en la vacunación.
\vskip1.000000\baselineskip
El fin de este ensayo fue identificar péptidos
individuales que son capaces de activar basófilos sanguíneos (como
un criterio de valoración para los mastocitos tisulares) lo que da
como resultado liberación de histamina que puede dar como resultado
reacciones alérgicas durante la terapia. Los péptidos o
combinaciones de péptidos que inducen la liberación de histamina
frecuentemente se pueden considerar inadecuados para la inclusión en
la vacuna de péptido.
La liberación de histamina requiere el
entrecruzamiento de moléculas de IgE específicas adyacentes en la
superficie de los basófilos. Los péptidos que se evalúan eran
pequeños (de 13 a 17 aminoácidos de tamaño) y no deben, por lo
tanto, tener estructura terciaria significativa que les permitiera
mantener la conformación de un epítopo de unión a IgE de la
molécula total. Adicionalmente, los monómeros de péptidos en
solución, incluso si están unidos por IgE, no deben ser capaces de
entrecruzarse con moléculas adyacentes de IgE. Debe notarse sin
embargo, que algunos de los péptidos contienen de cisteína que
pueden dar como resultado una formación de enlaces de disulfuro
entre péptidos individuales y también entre péptidos diferentes en
una mezcla. Por tanto, pueden generarse dímeros de péptidos que
pueden tener potencial de entrecruzamiento de IgE. En el presente
análisis, no se usó ningún excipiente en la formulación de péptidos
para evitar o reducir la formación de dímeros a través de uniones
de disulfuro.
Se evaluó la liberación de histamina a partir de
sangre periférica total recientemente extraída de sujetos alérgicos
a los gatos. Se usaron basófilos de sangre periférica como criterios
de valoración para mastocitos tisulares cuyo ensayo no fue
práctico. La sangre se incubó in vitro con 9 péptidos
individuales a partir de la secuencia del alérgeno principal de
gato Fel d1 (SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11 y 12). Estos
péptidos se seleccionaron como epítopos de células T potenciales
después de los ensayos de unión de MHC-péptido como
se explica en el Ejemplo 1. Adicionalmente, se analizaron las
respuestas frente a mezclas preferidas de una mezcla de 7 péptidos
identificados en el Ejemplo 1. La mezcla preferida ensayada de 7
péptidos consistió en los péptidos de las SEC ID Nº: 1 a 7. La
liberación de histamina en respuesta a extracto alérgeno de caspa
de gato total actuó como un control positivo.
\global\parskip0.950000\baselineskip
El fin del ensayo de proliferación fue
determinar el porcentaje de la población que respondió a cada
péptido individual/péptido auxiliar y la mezcla preferida de 7
péptidos.
El fin de los ensayos de citocinas fue doble;
(1) determinar el porcentaje de la población que respondió a cada
péptido individual y la mezcla preferida de 7 péptidos y (2)
identificar péptidos individuales que tienen características de
inducción de Th2 (IL-13) intrínsecas que serían
deseables en una vacuna de péptidos para una enfermedad alérgica y
también identificar péptidos individuales que tienen características
de inducción de IL-10 intrínsecas que pueden ser
beneficiosas para una vacuna de péptidos para una enfermedad
alérgica.
Las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) se aislaron de la muestra de sangre heparinizada extraída
del sujeto. Las PBMC se aislaron por separación en gradiente de
densidad Ficoll-Hypaque. Una vez aisladas, las
células se usaron en el ensayo de proliferación celular, en el
ensayo de liberación de histamina y ELISA y en el ensayo de
liberación de citocinas.
Los ensayos se realizaron sobre las PBMC (que
contienen basófilos). Cada péptido y combinación de péptido se
comparó con moléculas de alérgeno total en un ensayo de liberación
de histamina. Las concentraciones de histamina se midieron por
ELISA.
El ensayo requirió 3x10^{6} PBMC por sujeto.
El ensayo se realizó usando el kit de Inmunoensayo de Liberación de
Histamina Inmunotech de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Después del ensayo de liberación de histamina, las
muestras aciladas se ensayaron por ELISA de histamina. El ELISA de
histamina usó 50 \mul de la muestra acidada de 100 \mul
generada por el ensayo de liberación de histamina. Los 50 \mul
restantes de muestra se mantuvieron, por congelación a -20ºC hasta
que la sección de análisis de datos del ELISA se completó. Una vez
que los resultados se habían analizado y el ELISA llevado a cabo de
un modo satisfactorio, se descartaron las muestras.
Se ensayaron los péptidos respecto a su
capacidad de inducir la liberación de histamina en un intervalo de
5 log_{10} (de 10 \mug/ml a 1 ng/ml). El intervalo de
concentraciones ensayadas se seleccionó basándose en las dosis
in vivo teóricas de péptido que pueden conseguirse durante la
terapia. Por ejemplo una dosis de 10 \mug de péptido que entra en
un volumen de sangre de 5 litros, daría como resultado una
concentración de sangre de 2 mg/ml (2x10^{-6} mg/ml), en el
extremo inferior del intervalo de dosis del ensayo de liberación de
histamina. Un extracto de caspa de gato total (C. B. F. LETI) se usó
como control positivo para liberación en todo un intervalo de
concentración ligeramente superior (de 100 \mug a 10 ng/ml). Las
medidas individuales (es decir no duplicadas o triplicadas) se
realizaron para cada dilución. Una muestra de sangre duplicada se
ensayó para liberación de histamina espontánea y el valor medio de
estas muestras se sustrajo a partir de todos los resultados de
péptido/alérgeno.
Después de la finalización del ELISA de
histamina, los niveles de histamina individuales se determinaron por
interpolación en la curva patrón generada por el ensayo de ELISA.
Los resultados de las muestra se ajustaron para permitir cualquier
dilución de las muestras. Cuando dos o más diluciones de una
preparación de péptido/alérgeno provocaron el 10% o más de la
liberación de histamina por encima del fondo o se consiguió cuando
un único valor del 10% o más por encima el fondo a la concentración
más alta ensayada, lo que se consideró una "liberación de
histamina positiva".
El ensayo de proliferación celular se realizó
sobre las PBMC (140x10^{6} células requeridas para todos los
parámetros a ensayar). La proliferación se midió por la
incorporación del compuesto radiomarcado
^{3}H-timidina.
Con más detalle, 100 \mul de la concentración
de péptido o antígeno apropiada se distribuyeron en los pocillos
apropiados de placas de 96 pocillos. Las placas se situaron después
en una incubadora humidificada al 5% de CO_{2} fijada a 37ºC
durante un máximo de 4 horas. Las PBMC aisladas como se describe
anteriormente se prepararon a una concentración de 2x10^{6}
células/ml en un medio completo a temperatura ambiente. Se
distribuyeron después 100 \mul de solución celular en cada uno de
los pocillos de las placas de 96 pocillos que contenían
antígeno/péptido. Las placas se incubaron después durante 6 a 8
días. Los cultivos se pulsaron con solución de timidina tritiada
añadiendo 10 \mul de solución madre de timidina tritiada (1,85
MBq/ml en medio de RPMI libre de suero) a cada pocillo. Las placas
se volvieron a introducir después en la incubadora durante entre 8
y 16 horas. Se recogieron los cultivos después usando un colector de
células FilterMate 196 de Canberra Packard. Las tiras de filtro
secas se recontaron usando un contador de centelleo beta
apropiado.
Los recuentos de los pocillos que contenían
péptidos se compararon estadísticamente con pocillos que contenían
solo medio (12 pocillos por grupo). Se usó el ensayo no paramétrico
de Mann-Whitney. Se usó el mismo ensayo estadístico
para todos los sujetos. Una diferencia estadísticamente
significativa entre los pocillos solo con medio y los pocillos
estimulados por péptido se consideró una estimulación positiva de
las PBMC por el péptido.
Se analizaron los perfiles de secreción de
citocinas de las PBMC en respuesta a la estimulación de péptidos.
Los sobrenadantes del ensayo de liberación de citocinas se ensayaron
para presencia de 3 citocinas, IFN-\gamma,
IL-10 e IL-13, usando ensayos
ELISA.
El ensayo de liberación de citocinas requirió
40x10^{6} PBMC por sujeto. Con más detalle, 250 \mul de una
solución de 200 \mug/ml de concentración de péptido antígeno
apropiada se distribuyeron en los pocillos adecuados de placas de
48 pocillos. Se incubaron las placas en una incubadora humidificada
con CO_{2} al 50% a 37ºC durante un máximo de 4 horas. Se
añadieron después 250 \mul de una suspensión de 5x10^{6}
células/ml de PBMC a cada pocillo y se volvieron a introducir las
placas en la incubadora durante 5 días.
Después de la estimulación, las muestras de
sobrenadante de cultivo se recogieron en 3 alícuotas y se congelaron
hasta que los ensayos ELISA se pudieron realizar. Se ensayó una
alícuota respecto a la presencia de una citocina (por lo tanto las
3 alícuotas requirieron ensayarse respecto a las 3 citocinas). Los
niveles de citocinas de las muestras se terminaron por
interpolación a partir de curvas patrón también generadas en el
ensayo.
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Liberación de histamina a partir de basófilos de
sangre periférica se observó en respuesta tanto a control positivo,
como a péptidos. La Tabla 1 muestra el porcentaje de individuos en
los que se produjo la liberación de histamina (como se define por
los criterios de aceptación). La liberación de histamina frente a
uno o más péptidos individuales se produjo frecuentemente pero lo
mismo poco frecuentemente se tradujo en la liberación de histamina
a partir de la mezcla de 7 péptidos preferidos. Sin embargo, un
total del 5% de individuos presentó la liberación de histamina en
respuesta a la mezcla de péptidos. Los detalles de dosis y números
de dosis consecutivas de mezcla de péptidos que produjeron la
liberación de histamina son relevantes para la interpretación de
estos resultados y se analizan con más detalles a continuación.
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La Tabla 2 muestra el número de individuos en
los que se detectó la liberación de histamina en respuesta a cada
péptido individual. MLA15 y MLA16 más comúnmente liberaron
histamina.
La Figura 3 resume las respuestas proliferativas
frente a péptidos y antígenos. El porcentaje de individuos que
generan una respuesta proliferativa detectable se muestra en las
barras negras. Las barras grises (débil), blancas (moderada) y
reticuladas (intensa) proporcionan un análisis de la calidad a estas
respuestas. La calidad se define arbitrariamente por el Índice de
Estimulación (SI: relación de recuentros en presencia de
antígeno/péptido divididos por recuentos en medio solo). Por tanto
para el péptido 1 (MLA01), el 12% de los sujetos generaron una
respuesta proliferativa y de esos el 92% generó una débil, ninguno
moderada y el 8% generó una alta. Las respuestas proliferativas
frente a péptidos/antígenos individuales fueron variables (barras
negras). El 92% de los sujetos tuvieron respuestas proliferativas
positivas frente al antígeno de control positivo PPD. La mayoría de
estas fueron respuestas intensas (barra reticulada). El 75% de los
sujetos respondieron al extracto de caspa de gato, siendo el 59% de
las respuestas (del 59% al 75%) débiles. La respuesta frente a la
mezcla de 7 péptidos preferidos (SEC ID Nº: 1 a 7) fue
prácticamente idéntica a la del extracto de caspa de gato (CAT).
Los péptidos MLA15 y MLA16 indujeron respuestas más frecuentes que
cuatro de los péptidos preferidos. Sin embargo, MLA15 y MLA16
indujeron las respuestas de liberación de histamina por basófilos
más frecuentes (véase sección 3.1). Pocos péptidos individuales
indujeron respuestas proliferativas intensas como se esperaba
(frecuencia de precursor baja de células T precursoras específicas
de péptido).
La Figura 4 resume el porcentaje de individuos
que generaron una respuesta detectable frente a cada uno de los
péptidos/antígenos por producción de las tres citocinas medidas. Las
barras negras representan la producción de
IFN-\gamma, las barras grises de
IL-13 y las barras blancas de IL-10.
El antígeno de control positivo PPD indujo una producción de
citocinas en casi todos los individuos
(IFN-\gamma: 91%, IL-13: 97% e
IL-10: 96%) El alérgeno de gato total y la mezcla
de los 7 péptidos produjeron una respuesta de citocinas en
aproximadamente el 80% o más de los sujetos. Los péptidos
individuales provocaron respuestas de frecuencia diferente. En
general la producción de citocinas parece ser un método más
sensible de detectar respuestas con un porcentaje mayor de
individuos proporcionando respuestas de citocinas positivas que
respuestas proliferativas. En la mayoría de casos, la secreción de
IL-10 se detectó en el mayor número de sujetos e
IFN-\gamma se detectó menos frecuentemente.
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La tipificación de tejido se realizó para
asegurar que la población del estudio (predominantemente Caucásica)
era representativa de la población caucásica general en la que se
usará la vacuna. Se muestran once familias de alelos de DRB1
comunes. Se muestran las frecuencias alélicas en 102 sujetos se
estudió tipificados, no el porcentaje de individuos que expresan un
alelo, puesto que cada individuo tiene dos alelos de DRB1 y algunos
individuos son homocigotos para alelos particulares. Las frecuencias
alélicas de las poblaciones de referencia también se muestran para
comparación (datos del libro HLA Facts, Parham & Barber). Las
frecuencias de referencia se obtuvieron por análisis de estudios
múltiples indicando frecuencias y las figuras mostradas son valores
medios. Todas las frecuencias detectadas en el análisis actual
estaban dentro de los intervalos indicados en los datos de
referencia. Por tanto la población examinada en el estudio actual es
representativa de la población Caucásica.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se llevaron a cabo un total de 94 ensayos de
liberación de histamina durante el estudio. Entre estos 13 ensayos
se rechazaron principalmente debido a niveles inaceptablemente altos
de liberación espontánea. Los ensayos con liberación de histamina
espontánea del 20% o más de la liberación de histamina total se
rechazaron. Los ensayos con una liberación espontánea de entre el
10% y el 20% se indican en la Tabla 4. Todos los otros ensayos
tuvieron valores de liberación espontánea de menos del 10%.
Aproximadamente el 78% de los sujetos ensayados
demostraron liberación de histamina positiva frente al alérgeno
sensibilizante. La bibliografía existente indica que el
10-20% de individuos alérgicos son resistentes a
liberación de histamina por basófilos inducida por alérgeno.
La liberación de histamina se consideró positiva
si (a) la concentración más alta de péptido solo indujo la
liberación del 10% o más del valor de liberación total o (b) si dos
valores consecutivos eran el 10% o más de la liberación total.
Aproximadamente el 31% (25/81) de los sujetos mostró liberación de
histamina frente a uno o más péptidos indi-
viduales. De estos, 6/81 (7,4%) no tuvieron liberación de control positivo frente al extracto de alérgeno de gato total.
viduales. De estos, 6/81 (7,4%) no tuvieron liberación de control positivo frente al extracto de alérgeno de gato total.
En dos individuos la mezcla de los 7 péptidos
también indujo la liberación de histamina además de determinados
péptidos individuales. En dos individuos adicionales, solo la mezcla
de los 7 péptidos indujo liberación. Por tanto, 4/81 individuos
(~5%) presentaron liberación de histamina con la mezcla de
péptidos.
El sujeto 044 mostró liberación (28% de la
liberación total) a la concentración más alta (10 \mug/ml) de
péptido solo. El sujeto 055 mostró liberación a 0,1 \mug/ml (72%
del total) y 1 \mug/ml (47% del total) solo. El sujeto 056 mostró
liberación a 0,01 \mug (11%), 0,1 \mug/ml (12%), 1,0 \mug/ml
(17%) y 10 \mul/ml (10 \mug/ml). El sujeto 103 mostró
liberación de histamina (33% a la concentración más alta (10
\mug/ml) de péptido solo.
Para el ensayo de proliferación, se analizaron
los datos de proliferación individuales para todos los sujetos y
todas las concentraciones de péptidos. Se resumieron los índices de
estimulación para cada péptido/antígeno para la población total de
100 sujetos.
Los antígenos complejos tales como extracto de
caspa de gato y PPD inducen respuestas proliferativas significativas
en la población como un total. Los péptidos que inducen respuestas
significativas son aquellos que producen respuestas proliferativas
en un porcentaje mayor de la población.
Los índices e estimulación de menos de 1 surgen
cuando los recuentos en los pocillos que contienen péptidos son más
bajos que los que contienen medio de cultivo solo. Dicho efecto
puede atribuirse a ligeros cambios en el pH tras la adición de los
péptidos que se preparan en solución ácida. La ausencia de una
respuesta proliferativa frente al péptido entonces daría como
resultado recuentos ligeramente más pequeños que aquellos en los
pocillos de medio solo.
Las Figuras de 4 a 7 muestran para cada
péptido/antígeno, el porcentaje de individuos que produjeron
respuesta de cualquier magnitud detectable (es decir reducción de
IFN-\gamma, IL-13 o
IL-10 detectables). La intensidad de aquellas
respuestas después se divide en cuatro niveles de producción de
citocinas. Por ejemplo, el 35% de la población de estudio puede
haber producido una respuesta de IFN-\gamma. Del
35% de individuos, la mitad (50%) produjeron una respuesta muy
débil, el 20% una respuesta débil, el 15% una respuesta moderada y
el 15% una respuesta intensa (proporcionando un total del 100% de
respondedores). Los límites de cada nivel de citocinas se asignaron
arbitrariamente basándose en el intervalo de detección del ensayo de
ELISA. Los límites son diferentes entre
IFN-\gamma/IL-10 e
IL-13 puesto que para IFN-\gamma e
IL-10 del intervalo de detección fue
aproximadamente de 1-100 pg/ml mientras que el
intervalo para el ensayo de IL-13 fue
aproximadamente de 0,5-50 pg/ml.
La Figura 5 muestra el porcentaje de individuos
que producen IFN-\gamma y la intensidad de la
respuesta después del cultivo celular con péptido/antígeno. Las
respuestas de IFN-\gamma se detectaron entre
26-44% de sujetos en respuesta a péptido
individuales. Estas respuestas fueron predominantemente de muy bajas
a bajas a moderadas. Los antígenos complejos indujeron respuestas
más frecuentes (mezcla de péptidos el 80%, caspa de gato el 79%,
PPD el 91%). Estas respuestas fueron de bajas a moderadas a altas.
Las respuestas de PPD fueron particularmente altas (89 de las
respuestas de PPD estuvieron por encima de 100 pg/ml).
La Figura 6 demuestra el porcentaje de
individuos que producen IL-13 y la intensidad de la
respuesta después del cultivo celular con péptido/antígeno. Las
respuestas de IL-13 se detectaron entre el
33-68% de los sujetos en respuesta a péptidos
individuales. Estas respuestas fueron predominantemente de muy bajas
a bajas, sin embargo se detectaron un número significativo de
respuestas moderadas. Esto puede reflejar la naturaleza de Th2 de
sensibilización alérgica en estos sujetos. Los antígenos complejos
indujeron respuestas más frecuentes (mezclas de péptidos el 85%,
caspa de gato el 93%, PPD el 97%). Estas respuestas fueron de bajas
a moderada a altas.
La Figura 7 demuestra el porcentaje de
individuos que producen IL-10 y la intensidad de
respuesta después del cultivo celular con péptido/antígeno. Las
respuestas de IL-10 se detectaron entre
46-75% de los sujetos en respuesta a péptidos
individuales. Estas respuestas fueron predominantemente de muy bajas
a bajas. Los complejos de antígeno indujeron respuestas más
frecuentes (mezcla de péptidos 93%, caspa de gato 96%, PPD 96%).
Estas respuestas fueron de bajas a moderadas. Se observaron muy
pocas respuestas de IL-10 "altas".
En la interpretación de los resultados de
liberación de histamina es importante considerar varios puntos en
relación con el diseño del ensayo:
- 1)
- La dosis de sangre estimada de péptidos que se conseguirá durante el tratamiento está hacia el fondo de la curva de respuesta empleada en el ensayo. Por ejemplo, una dosis de 10 \mug de péptido que entra en un volumen en sangre de 5 litros, daría como resultado una concentración de sangre de 2 ng/ml (2x10^{-6} mg/ml; esto asume que no se degrada nada de péptido lo que es poco probable). Esta concentración está justo por encima del límite de dosis inferior del ensayo (1 ng/ml). Las dos concentraciones más bajas de péptido usadas en el ensayo corresponden aproximadamente a dosis inyectadas de 5 \mug (1 ng/ml) y 50 \mug (10 ng/ml). Por tanto, el ensayo se diseña para detectar la liberación de histamina o por encima de dosis del péptido usadas para la terapia, sólo 3 casos estaban asociados con la liberación de histamina con las dos concentraciones más bajas (valores consecutivos por encima del 10%) de péptido. En dos de estos casos los valores fueron menores del 11%. La mezcla de 7 péptidos no mostró ninguna liberación a las dos concentraciones más bajas de péptido. Por tanto, aunque la liberación de histamina en respuesta a péptidos individuales o la mezcla fue relativamente común, no se observó generalmente en las concentraciones de péptido que se alcanzarán durante la terapia.
- 2)
- Por razones de coste y complejidad, sólo los pocillos individuales se ensayaron para cada concentración de péptido. Esto aumenta el riesgo de que uno cualquiera de los valores pueda ser falso. Esto es particularmente relevante para la segunda condición definida para un resultado positivo; que la concentración más alta sola de péptido/antígeno mostró una liberación del 1% o más de la liberación total. Varios casos de liberación de histamina frente a péptidos individuales se asociaron sólo con la concentración más alta individual de péptido y esto también fue válido para 2/4 individuos con liberación de histamina activada por la mezcla de 7 péptidos.
- 3)
- En algunos casos, la liberación de histamina a partir de péptidos no se asoció con liberación de histamina a partir de extracto de caspa de gato (ausencia de control positivo).
- 4)
- Anteriormente se mostró que péptidos con restos de cisteína (MLA01, MLA04, MLA05, MLA12 y MLA15) eran capaces de grados variables de homodimerización. Sin embargo no se cuantificó formalmente, estos péptidos y cuando se mezclaron es probable que también formen heterodímeros (es decir dentro de la mezcla de las SEC ID Nº: 1 a 7). Los dímeros pueden ser suficientes para entrecruzamiento de moléculas de IgE en la superficie de mastocitos y basófilos dando lugar a liberación de histamina. No se usaron excipientes para reducir la formación de enlaces disulfuro entre péptidos homólogos o heterólogos en este estudio. Las preparaciones clínicas de la vacuna contendrán tioglicerol para bloquear la formación de enlaces disulfuro.
Aproximadamente el 78% de los sujetos ensayados
demostraron liberación de histamina positiva frente al alérgeno
sensibilizante. Esto es ligeramente menor que las notificaciones en
la bibliografía que sugieren que el 10-20% de los
individuos alérgicos son resistentes a la liberación de histamina
por basófilos inducida por alérgenos.
El 30,9% de los sujetos mostró liberación de
histamina frente a uno o más péptidos individuales. La liberación
de histamina también se detectó en el 5% de los sujetos (4/81)
frente a la mezcla de 7 péptidos (SEC ID Nº: 1 a 7; probablemente
candidatos a vacuna). Dos de esos cuatro individuos presentaron
liberación frente a péptidos individuales y dos no lo hicieron. En
varios sujetos que muestran liberación de histamina frente a
péptidos individuales (6/81; 7,4%), la liberación sólo se produjo
con el péptido MLA15 o MLA16, que no están incluidos en la mezcla
de las SEC ID Nº: 1 a 7. MLA16 fue el péptido que más frecuentemente
se asoció con la liberación de histamina. El ajuste de los valores
para la liberación de péptido individual para incluir sólo aquellos
péptidos en los 7 candidatos a vacuna
preferidos, el 23,5% de los sujetos presentaron liberación de histamina frente a componentes individuales de la vacuna.
preferidos, el 23,5% de los sujetos presentaron liberación de histamina frente a componentes individuales de la vacuna.
La proliferación de PBMC se ensayó en respuesta
al cultivo con 3 concentraciones de péptidos individuales, una
mezcla de 7 péptidos (seleccionada por ensayos de unión de MHC) y
extracto de alérgeno de caspa de gato total. Las respuestas frente
a PPD a una concentración única se midieron también como un marcador
de una respuesta de recuerdo positiva.
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Respuestas de PPD: el 92% de los sujetos
generaron una respuesta proliferativa detectable frente a PPD. La
respuesta es muy dependiente de la vacunación anterior con BCG. Los
no respondedores pueden proceden países en los que BCG no es
obligatorio (por ejemplo Estados Unidos) o puede que no hayan
recibido la inmunización por otras razones. La mayoría de
respuestas (92%) dieron como resultado un SI de más de 10. Estos se
asignaron arbitrariamente como respuestas "intensas".
Respuestas a extracto de alergeno de caspa de
gato: el 75% de los sujetos generaron una respuesta
proliferativa detectable frente al extracto de alergeno de caspa de
gato. Se detectaron respuestas más frecuentes a través de la medida
de citocinas destacando la importancia de ensayar múltiples
parámetros de activación para determinar la reactividad. La mayoría
de las respuestas fueron débiles (SI 2-5; 59%) sin
embargo se observaron los números significativos de respuestas
moderadas (SI 5-10; 24%) e intensas (SI 10+;
17%).
Mezcla de péptidos
(P1-7): el 71% de los sujetos genera una
respuesta frente a la mezcla de péptidos, similar al extracto de
alergeno de caspa de gato. Un porcentaje similar de respuestas
débiles (52%), moderadas (34%) e intensas (14%) se observaron. Las
respuestas proliferativas frente al extracto de alérgeno de caspa
de gato y mezcla de péptidos se correlacionaron íntimamente
indicando que la mayoría de la reactividad de las células T frente
a las caspa de gato puede explicarse por los epítopos contenidos
dentro de la mezcla de péptidos.
Respuestas a péptidos individuales: La
respuestas proliferativas a péptidos individuales fueron
generalmente de débiles a moderadas. La mayoría de péptidos
generaron el 70-80% de sus respuestas en la
categoría de débiles con el 20-30% en la categoría
de moderado. Pocos péptidos produjeron respuestas intensas. Las
respuestas más débiles frente a péptidos individuales que frente a
antígenos complejos o mezclas de péptidos suponen un hallazgo
esperado y son el resultado de frecuencias del precursor más bajas
de células T específicas para epítopos individuales.
Las respuestas proliferativas más intensas
frente a un péptido individual fueron frente a P12 de la cadena 2
de Fel d1 (43%) y las más débiles frente a P4 de la cadena 1 (6%).
Sin embargo, las respuestas de citocinas frente a todos los
péptidos se detectaron más frecuentemente que en las respuestas
proliferativas.
Se probó que la medida de citocinas era el
método más sensible para medir respuestas frente a los péptidos.
Generalmente un porcentaje más alto de sujetos presentaron respuesta
de citocinas medible en comparación con respuestas proliferativas
medibles. La producción de cada una de las tres citocinas varió
produciéndose IL-10 generalmente por una mayor
proporción de sujetos que IL-13 e
IFN-\gamma. La frecuencia más baja de respuesta
se detectó con IFN-\gamma. El estado alérgico
atópico de estos sujetos es probable que signifique que la
respuesta de células T de memoria frente a Fel d1 y su epítopos será
dominada por respuestas Th2 que pueden explicar la respuesta de Th1
(IFN-\gamma) menos frecuente. La alta frecuencia
de respuestas de IL-10 fue una sorpresa. Se
considera que IL-10 es una citocina de Th2 en el
sistema murino pero no está bien establecida en el sistema humano.
IL-10 generalmente se considera como una citocina
reguladora/inmunosupresora. Las notificaciones anteriores han
sugerido que algunas secuencias de péptidos pueden tener propiedades
de inducción de IL-10 intrínsecas. Dichos péptidos
no se observaron en este estudio. La detección de dichas respuestas
en otros sistemas puede reflejar simplemente la naturaleza de la
sensibilización de células T frente al alergeno total que se
reactiva por cultivo de células T de memoria, con péptido. Por
tanto, la producción de IL-10 puede ser una
respuesta de reactivación en lugar del resultado de las
características de inducción de IL-10 intrínsecas
del péptido.
Ningún péptido individual indujo la producción
preferencial de una citocina particular. Por tanto, ninguno de los
péptidos explorados indujo una respuesta de Th2
(IL-13) particularmente desfavorable que se habría
considerado no deseable para la inclusión en la vacuna de
péptido.
Los resultados de la tipificación de tejido
muestran que una población representativa se ensayó en este
estudio.
Los péptidos individuales indujeron liberación
de histamina en algunos individuos. La mezcla de péptidos preferidos
de las SEC ID Nº: 1 a 7 indujo liberación de histamina en 4
individuos sin embargo en 2 de estos la liberación se detectó en un
único punto (la concentración más alta). MLA16 provocó liberación
más frecuente pero carece de las SEC ID Nº: 1 a 7. Alguna
liberación positiva se observó con péptidos en ausencia de
"liberación de control positivo" a partir de las caspa de gato
completa. El ensayo se diseñó para detectar liberación de histamina
a concentraciones de péptido aproximándose a las dosis de
tratamiento y mayores. La liberación de histamina en
concentraciones de péptido que corresponden a dosis de tratamiento
fue extremadamente poco frecuente (un solo ejemplo claro) y sólo se
produjo con péptidos individuales, no con SEC ID Nº: 1 a 7.
Los resultados del ensayo de liberación de
histamina in vitro probablemente sobrerrepresenten el
potencial de liberación de histamina de la vacuna puesto que no se
realizó ninguna etapa para minimizar la formación de puentes
disulfuro entre péptidos.
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La histamina se liberó por basófilos a partir de
la mayoría de individuos en presencia del extracto de caspa de gato
total. La liberación de histamina se produjo de un modo dependiente
de dosis en muchos sujetos a diferencia de la liberación con
péptidos que frecuentemente se produjo a concentraciones en la mitad
del intervalo de dosificación. En individuos en los que la
histamina se liberó por péptidos, la sensibilidad frente al extracto
de caspa de gato fue normalmente evidente a dosis más bajas de
extracto.
Las respuestas proliferativas frente a péptidos
fueron más débiles que para las mezclas de péptidos o antígenos de
proteínas complejos como se esperaba. La mayoría de péptidos
individuales produjeron respuestas proliferativas en menos del 20%
de los individuos. Se observó considerable una variación
considerable entre péptidos pero ningún péptido individual indujo
de manera errónea respuestas proliferativas en al menos algunos
sujetos, sin embargo uno de los 7 péptidos preferidos MLA04 produjo
una baja inducción de la proliferación. Los péptidos MLA15 y MLA16
fueron más potentes en la inducción de la proliferación que varios
de los 7 péptidos preferidos pero proporcionaron la liberación de
histamina más alta.
La producción de citocinas fue un método más
sensible que la proliferación para detectar respuestas frente a
péptidos en este estudio. No se tuvo evidencia para soportar la idea
de que determinados péptidos pueden tener una capacidad intrínseca
de inducir un patrón particular de producción de citocinas. Ningún
péptido individual produjo preferencialmente una respuesta de Th1,
Th2 o Treg (IL-10). Las respuestas de
IFN-\gamma tendieron a ser menos comunes que las
de IL-13 e IL-10. Los datos de
ensayos de citocinas no indicaron que ninguna de las mezclas de
péptidos preferidas se sustituya ni que ninguno de los péptidos
individuales o la mezcla indujera preferencialmente una respuesta
de Th12 in vivo.
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Se ensayó una mezcla preferida de 7 péptidos que
consistía en los péptidos de SEC ID Nº: 1 a 7 en un ensayo clínico
ciego controlado por placebo aleatorizado. Se evaluó la eficacia de
esta mezcla en la reducción de los síntomas de alergia. El diseño
del estudio del ensayo clínico estuvo de acuerdo con las directrices
de buena práctica clínica.
Las respuestas cutáneas iniciales frente a los
alérgenos de gato para todos los sujetos se establecieron usando
una Exposición Inicial que tuvo lugar entre 6 y 8 días antes de la
administración de la medicación del estudio. Dos inyecciones
intradérmicas de 0,010 HEP unidades (punción equivalente de
histamina) de alérgeno de gato convencional disponible en el
mercado (suministrado por Laboratorios Leti, España) se
administraron, separado por un intervalo de tiempo de 30 minutos,
en la superficie polar del antebrazo izquierdo y derecho
respectivamente. Se evaluaron los sujetos para asegurar que
experimentaban una Respuesta Cutánea de Fase Tardía (LPSR) frente a
alérgeno de gato total y la magnitud de la reacción inicial se
registró de la siguiente manera:
Ocho horas después de cada inyección se dibujó
el perfil de cualquier fase tardía sobre la piel con un bolígrafo.
Se midieron los diámetros más largos y ortogonales y se registraron
para cada respuesta y el área de la respuesta se calculó en cada
brazo. Se calculó el área medio de respuesta en ambos brazos de cada
sujeto después para proporcionar la reacción inicial. Los sujetos
que produjeron una reacción inicial adecuada se asignaron a grupos
de dosificación, se aleatorizaron y se introdujeron en la Fase de
Tratamiento.
La Fase de Tratamiento consistió en un periodo
de 21 días para cada sujeto. Durante este periodo un grupo de
sujetos recibió una inyección intradérmica única de la mezcla
preferida (0,03, 0,3, 3, 12 nmol de cada péptido por dosis) o
placebo diluyente en la Visita de Fase de Tratamiento 1 el día uno.
Una cohorte de 8 sujetos recibió tratamiento a cada nivel de dosis
(6 recibieron la mezcla preferida y 2 placebo). La primera cohorte
del grupo intradérmico recibió 0,03 nmol de cada péptido en la
mezcla y cada cohorte posterior en el grupo recibió el siguiente
nivel de dosis más alto.
Las inyecciones intradérmicas se hicieron en la
superficie flexora del antebrazo izquierdo. El volumen total de la
inyección fue 60 \mul para todas las inyecciones. Después del
tratamiento, los sujetos tuvieron su respuesta cutánea al alérgeno
total reensayada en la Visita de Fase de Tratamiento 2 el día 21
(\pm 3 días). Las respuestas cutáneas frente alérgenos de gatos
se evaluaron por medidas de las respuestas de fase tardía de 8
horas después de la administración intradérmica de 0,010 unidades de
HEP (punción equivalente de histamina) de alérgenos de gato
convencionales disponibles en el mercado (suministrados por
Laboratorios Leti, España) como se describe anteriormente. El área
media de respuesta para ambos brazos de cada sujeto se calculó como
se describe anteriormente.
Este área LPSR medio después del tratamiento se
comparó entonces con el área LPSR inicial para cada sujeto. El
cambio total del área LPSR para los ocho pacientes en cada cohorte
se evaluó después. Los resultados de este análisis se muestran en
la tabla a continuación. Este análisis se realizó sin desenmascarar
los datos.
La Figura 8 es un diagrama representativo que
muestra el área LPSR medio antes y después del tratamiento para los
8 pacientes en la cohorte de 12,0 nmol. En conjunto, estos datos
indican que la mezcla preferida de péptidos es eficaz en la
reducción de LPSR frente al alérgeno total en individuos alérgicos a
los gatos.
Claims (14)
1. Una composición para uso en la prevención o
tratamiento de alergia a los gatos en un individuo por tolerización
que comprende los polipéptidos:
- CPAVKRDVDLFLT (SEC ID Nº: 1)
- EQVAQYKALPVVLENA (SEC ID Nº: 2)
- KALPVVLENARILKNCV (SEC ID Nº: 3)
- RILKNCVDAKMTEEDKE (SEC ID Nº: 4)
- KENALSLLDKIYTSPL (SEC ID Nº: 5)
- TAMKKIQDCYVENGLI (SEC ID Nº: 6)
- SRVLDGLVMTTISSSK (SEC ID Nº: 7)
en la que uno o más de los péptidos se pueden
sustituir por una variante o fragmento del péptido sustituido, en
la que:
- (a)
- la variante es un polipéptido que comprende dos o más sustituciones de aminoácidos conservativos en comparación con el péptido sustituido o
- (b)
- la variante es un polipéptido que tiene al menos el 90% de identidad con el polipéptido sustituido o
- (c)
- el fragmento es un polipéptido derivado por deleción de uno o dos aminoácidos de los extremos N o C terminales o de un aminoácido de los extremos N y C terminales del péptido sustituido,
y en la que (i) dicha variante o fragmento es
capaz de provocar una respuesta inmune que desensibiliza al
individuo frente a la proteína Fel d1 y (ii) ningún otro péptido
está presente en la composición.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La composición para uso de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que uno o más de los polipéptidos tienen
una o más modificaciones seleccionadas de los siguientes:
- (i)
- acetilación en N terminal;
- (ii)
- amidación en C terminal;
- (iii)
- uno o más hidrógenos en las aminas de cadena lateral de arginina y/o lisina sustituida con un grupo metileno;
- (iv)
- glucosilación y
- (v)
- fosforilación.
\vskip1.000000\baselineskip
3. La composición para uso de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2 en la que cada polipéptido tiene una
concentración en el intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml, de 0,3 a 200
nmol/ml o de 10 a 50 nmol/ml.
4. Una composición para uso en la prevención o
tratamiento de la alergia a los gatos por tolerización que consiste
en secuencias de polinucleótidos que cuando se expresan provocan la
producción de una composición como se define en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3.
5. La composición para uso de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que cada secuencia de polinucleótidos capaz
de expresar un polipéptido diferente está presente en los mismos o
en distintos vectores de polinucleótidos.
6. La composición para uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es una
composición farmacéutica que contiene uno o más vehículos o
diluyentes farmacéuticamente aceptables.
7. Un vector de expresión para uso en la
prevención o tratamiento de la alergia a los gatos por tolerización
que consiste en 7 secuencias de polinucleótidos diferentes, en el
que cada secuencia de polinucleótidos codifica uno de los
polipéptidos como se define en la reivindicación 1 y en el que cada
secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a una
secuencia de control proporcionada para la expresión de la secuencia
codificante.
\newpage
8. Un producto para uso en la prevención o
tratamiento de alergia a los gatos por tolerización que consiste en
los polipéptidos como se define en la reivindicación 1, en el que
cada polipéptido diferente es para uso simultáneo, separado o
secuencial en la prevención o tratamiento de una alergia a los gatos
en un ser humano.
9. Un producto para uso en la prevención o
tratamiento de la alergia a los gatos por tolerización que consiste
en polinucleótidos capaces de expresar los polipéptidos diferentes
como se define en la reivindicación 1, en el que cada
polinucleótido diferente es para uso simultáneo, separado o
secuencial en la prevención o tratamiento de la alergia a los gatos
en un ser humano.
10. Una formulación farmacéutica para uso en la
prevención o tratamiento de alergia a los gatos por tolerización
que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5; un vector de acuerdo con la reivindicación
7 o un producto de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente
aceptable.
11. La formulación para uso de acuerdo con la
reivindicación 10 en la que la composición, vector o producto se
formula para administración intradérmica, administración oral,
administración nasal, administración subcutánea, administración
sublingual o para la administración por inhalación o por
inyección.
12. La composición para uso como se define en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o producto como se
define en la reivindicación 8 ó 9, que comprende adicionalmente otro
alérgeno de polipéptido para uso en la tolerización de un individuo
frente al alérgeno de polipéptido adicional, en la que el alérgeno
de polipéptido adicional es diferente de Fel d1.
13. Un método in vitro de determinar si
un individuo tiene o presenta riesgo de una afección en el que la
afección se caracteriza por síntomas alérgicos en respuesta a
un alérgeno de gato, comprendiendo el método el ensayo de si el
individuo tiene células T que respondan frente a una composición
como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, por
lo tanto la determinación de si el individuo tiene o presenta
riesgo de la afección.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13 en el que la respuesta de células T de dicha composición se mide
poniendo en contacto la composición con células T en una muestra
tomada del sujeto, en condiciones que permitan interaccionar a la
composición y las células T y determinar si cualquiera de las
células T está estimulada o no y por lo tanto determinar si está
presente o ausente una respuesta de células T o no.
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