HU229377B1 - Tolerogén humán peptidek - Google Patents

Description

A TECHNIKA ÁLLASA

Az adaptív immunválasz során a T--límíocíták képesek felismerni a fehérje antigén belső epítépjalt. Az antigént prezentáló (bemutató) sejtek felveszik a fehérje antigéneket és rövid peptíd fragmensekre bontják le őket. A pepiid egy I vagy 11 osztályú fő hísztokompatibiiitási genkomplez (major histocompa-tíbílity complex - HKC) molekulához kötődhet, a sejten .beiül., majd a sejt. felszínére felszínén bemutatásra kerül az szállitődik. Amikor a sejt HHC molekulával együtt , a •eceptoron (TCR?

neotidet a T-sejt felismerheti (a T-sejt keresztül) , amely esetben a peptid egy T-sejt epitőp..

A T-sejt epitópok központi szerepet játszanak az· antigénekkel szembeni adaptív immunválaszban, akár saját, akár idegen antigénről legyen .szó. A T-sejt epitópok központi szerepet a túlérzékenységi betegségekben (igy az allergia, autoimmun betegségek és transzplantációs kilökődés) kísérleti modellek alkalmazásán keresztül mutatják be. Gyulladásos vagy allergiás betegségek indukálhatők szintetikus peptidek (a T-sejt epltőpok szerkezetét alapul véve) adjuvánssal együtt történő beinjektálással.

Ezzel ellentétben azt ismertették , hogy immunológiai tolerancia indukálható a sajátos pepiid epítöpokkai szemben az oldható formájú pepiid epltőpok beadásával. Az oldható peptíö antigének 'beadását a betegség gátlásának hatékony eszközeként szemléltetik kísérleti autoimmun agyveló- és gerincvelő gyulladás (e.nk.efal.omielitisz (ΕΆΕ) - sz'klerőzis multiplex (MS) modell) (Metzler és Wraith {1993? Int. immunoi. 5:1159-1165? Liu és Wraith (1355) Int. Immunoi. 7c 1255-1263; Anderton és Wraith (1338) Sur. J. Immunoi. 28:1251-1261)? és az arthritis, cukorbetegség és szemideghártya-gyulladás kísérleti modelljeiben (az előzőekben megadott Anderton és Wraith (1998} cikke szerinti áttekintés). Ezt az cxoie haladott EAE betegség kezelésének kuionoozo ,,by.standét eszközeként is ismertetik (Anderton és Wraith (1998) az előzőeknek megfelelően).

A tolerogén pép ti.de k betegség kezelésére vagy megelőzésére, történő alkalmazása a figyelem középpontjába került. Ennek egyik oka az., hogy bizonyos tolerogén epitőpokről kimutatták, hogy képesek alulszabályozni a T~ sejtek ugyanazon szöveten belüli vtigénekre adott válaszait. Sz a jelenség., amely szupresszió-ként ismert, azt jelenti, hogy egy sajátos tolerogén pepiid alkalmazásával lehetőség nyílik agy adott antigénen belül egynél több epitóppai (előnyösen, sz összes •api toppal} és egy adott betegséggel kapcsolatos egynél több antigénnel szembeni tolerancia kialakulására (Anderton és Wraith (.1998), az előzőeknek megfelelően) - Sz elkerüli annak szükségességét:, hogy azonosítani kelljen egy sajátos betegség összes patogén antigénjét.

Azért .Is előnyös a peotidek választása a terápiához, mivel mellettük szól, hogy a peptid analógok, módosított immunológiai tűiajdonságofcksl állíthatók elő. A peptidek ily módon úgy módosíthatók, hogy megváltozzanak a peptidek és az M'HC vagy a

TCR közötti kölcsönhatások.

Az egyik lehetséges probléma ezzel a megközelítéssel az, hogy a 7-sejt epitöpokként működő peptidek nem mindegyikéről mutatták ki, hogy képesek toleranciát indukálni. A mielin bázikus: fehérje (MBP) '8:9-101 aminosavai által meghatározott peptid az immunizálás után immundomináns antigénnek bizonyul, továbbá nagyon .hatékony immunogén a T-sejfe reaktivitás beindításának és az SAS indukáciőj ának szempontjából. Azonban a pepiidről kimutatták, hogy amikor oldatban adják he, hatástalan a tolerancia indukálásában (Anderton és Wraith (199:8) , lásd fent).

Számos magyarázat született, a T-sejfe epitópok tolerancia indukáló képességének megfigyelt szerveződésére (Anderton és Wxsith (1998), lásd fent). Részletesebben, felvetették, hogy kapcsolat van a. peptid MHC-vel szembeni affinitása és a tolerogén jelleg között (kin és Wraith (1995), lásd fant), de ez nincs összhangban néhány megfigyeléssel. Például az MBP[89-1011 peptid, amely nem tolerogén, viszonylag erős affinitással kötődik az I-A^-hez. Ebből tehát nem következik egyenesen, hogy melyik peptid fog toleranciát indukálni.

Ha létezik ésszerű	magyarázat, hogy	miért csak	a pép	trd
epitópok egy része ke	•pes t oleranc i á t	indukálni,	akkor
megkönnyítené a túlérzékenységi rendellenességek kezel	.étében	és
raege1őzéseben ha s zná Ih at <	3 toierogén peptide	: κ k x.v a r & s z t a
A TALÁLMÁNY ISMERTETÉSE
Meglepő módon art	találtuk, hogy i	ia egy pept	iá epi	j- A y\
megfelelő méretű ahhoz.	hogy egy éretlen	H 3?C bSJttU uás s	;£í :3-2 i	egy

T~sejtnek az antigén feldolgozása nélkül., akkor az epitóp immunológiai toleranciát képes indukálni. Az a megfigyelés, hogy néhány T-sejt epitőp toierogén és mások képtelenek toleranciát indukálni, következésképpen azzal néhány epitőp további feldolgozá lennének arra, hogy az MHC molekula segítségével bemutatásra kerüljenek a T-sejteknek. Azok az epitopok, amelyek további feldolgozást igényelnek nem indukálnak toleranciát.. amikor oldható formában adjuk be, annak ellenére,· hogy betegség amikor a ténnyel magyarázható, hogy st igényel, mielőtt képesek indukálására képesek, injektáljuk.

Azok az epitópok, amelyek adjuvánssál kombináltas további feldolgozást nem. igényelnek tolerancia indukálására képesek és „apitópoknak” (antigén feldolgozástól független epitópok, Antigén. .Processing Independent epiTOPES) nevezzük őket.

Ez a. felismerés egy szábály-aiapű eljárást biztosit a toierogén T-sejt epitópok szelekciójára, amely megkerüli annak szükségességét, hogy in vivő vizsgáljuk egy peptid toierogén képességét. Ez különösen előnyös olyan beteusé kezelés:

megelőzési stratégiáinak kifejlesztésében, amelyeknél mecfelelő nem állatmodelisk nem férhetők hozzá. Sőt még azoknál a betegségeknél is, ahol létezik állatmodell, a szelekciós eljárás egyszerűbbé és biztonságosabbá teheti a tolerancia indukálckészítmények kifejlesztését, mivel olyan mechanizmust biztosít, miáltal a peptid tolerancia, indukáló képessége az ín vivő alkalmazásukat megelőzően ín vitro vizsgálható a humán Tsej teken (az antigén felismerése a humán MH.C molekulákkal közösen).

Első meckőzolitésfoen, tehát a találmány tárgya tolerogén humán peptidek ~ amelyek további, feldolgozás nélkül képesek az és/vagy megelőzésében történő alkalmazásra., ahol a peptidet a mielin bázikus fehérje (MBP) Kővetkező peptitíjei Közül vaiaszjuk; 83-53 és 131-145.

Számos eljárás ismert a szakterületen olyan peptidek sakrínelésére, amelyek egy adott antigén esetében T-sejt epitőpokként képesek működni. Általában tehát az eljárást egy tolerogén peptid kiválasztására alkalmazzuk a T-sejt epitöpot tartalmazó- peptidek sokaságából.

Ahhoz, hogy megvizsgáljuk vajon egy peptid képes-e további feldolgozás nélkül eov MHCi vagy MH.CIX molekulához kő előszór tanulmányozni kell a peptidek MECX vagy MHC1.I molekulához történő kötődésének képességét egy antigén feldolgozásától független prezentációs rendszer (APlFSj alkalmazásával. Egy előnyös kiviteli alakban, tehát az eljárás a következő lépéseket tartalmazza;

(i) egy APXPS-rendszert egy peptiddel kezelünk,- majd.

ό (ii) vizsgáljuk a pepiid HHC'l vagy MHC1I molekulákhoztörténő kötődését as APIPS rendszerben,

Azonosítottunk továbbá, számos mielín bázikus fehérje apitőpot, amelyek autósatigénként működnek a szkl.erózls multiplex betegségben.

Ismert, hogy néhány pepiid képes toleranciát indukálni ugyanabból az antigénből származó más epitópokkal szemben is, vagy akár egy eltérő antigénből származó más epitópokkal szemben is (ez a jelenség bystauder ssuppresszióként ismert), Azonban úgy gondoljuk, hogy az összes autoreaktív T~sejt megfelelő szupresszálása érdekében előnyös lehet a sajátos betegség kezelése/megelőzése céljából a betegnek beadandó különféle •apitópo-k kombinálása, Következésképpen a második megközelítésben a találmány tárgya egy olyan gyógyszerkészítményamely a találmány első megközelítése szerinti pepii dek sokaságát tartalmazza, ahol mindegyik pepiid egy T--sejt epitopon alapul,

Sgy betegség betegben történő kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló általános stratégia a következő lépéseket tartalmazhatja:

(i) azonosítjuk a betegségre jellemző antigént (ií) azonosítjuk az antigén apitópját; és (iii) beadjuk az apitápot a betegnek,

AS ÁBRÁK RÉSZLETES LEÍRÁSA .Az 1. ábra mutatja a áíycoba cte.rium tuberculosís-foól tisztított fehérje származék (RED) és az MSP kinetikus profiljának jellegzetes példáját szklerőzis multiplexben (MS) szenvedő betegekben, és egészséges egyénekben, MS betegből (A; és egészséges egyénből (3) izolált perifériás vér mononukreans sejteket (PBMü) vizsgálunk, hogy képesek-e PPD és a teljes MBP jelenlétében proliferálődni; az MSP-re adott proliferativ válasz kinetikus profilját összehasonlítjuk a PPD másodlagos antigén kinetikus profiljával..

A 2. ábra egy táblázat, amely összefoglalja az MBP~re és a peptidjeíre az MS betegekben adott PBMC válaszokat. Bizonyos egyéneket három külnböző időpontban vizsgáljuk ügy, hogy az egyes időpontok között körülbelül 4-7 hónap legyen.

A 3. ábra egy táblázat, amely összefoglalja az 'MBP-re és az MBP-pepfcldekre az egészséges- egyénekben adott BBMC válaszokat. 4 és 7 hőnap közötti idő telik -el az egyes időpontok között.

A 1. ábra egy MS beteg (MS 49) példáját mutatja, aki két különböző .időpontban több pepiidre ad választ·, de akinek a felismerési profilja a 4 hónappal később mért második, időpont alkalmával jelentősen eltér. A ?SHC-t MBP és az MSP teljes hosszát lefedő péptidek mátrixának jelenlétében, tenyésztjük és

3H~t indáin felvétellel mérjük a proliferácíőt.

áz első pcntnar megfigyelt átfogó T-sejt proliferativ válasz jelentősen eltér a 7 hónappal később (második időpont) mért választói.

Az 5. ábra. mutatja annak a betegnek a példáját, akinek, az epitőpra adott átfogó válaszreakciója (első időpont) visszafej lődik. (második időpont) és ti zen két-hónap múlva újra megjelenik (harmadik időpont) .

A a. ábra mutatja a péptid régiók kinetikus válaszreakcióvizsgálatban azonosított finomított spéciiáfásának térképét, amelyet MS betegekből és egészséges egyénekből származó ICC s

) alkalmazásával kapunk. A szkríneiési vizsgálatban alkalmazott legtöbb peptid 15 aminosav hosszúságú (15-mer) azonban egy pár peptid 10 aminosav hosszúságú (10-mer), illetve egyikük 17 aminosav hosszúságú (I7~mer) . Mindegyik TCC specif itását legalább kétszer vizsgáljuk.

A 7a. ábra egy táblázat, amely az .MS betegekből száfmazó T~ limfociták által felismert mi el. in. bázikus fehérjében lévő T-sejt epitöpok jellemzését mutatja.

A 7b. ábra egy táblásat, amely az összes olyan T-sejt epltópot mutatja, amelyeket nem szükségszerűen a rögzített A3C mutat be, következésképpen ae® .apitőpok.

A 8 és 3. ábrák mutatják az élő és rögzített APC által a különféle MSP peptidek bemutatását a T-sejt klónak számára. 3A. ábra - 30-44 peptid, SS. ábra - 110-124 peptid, 9A. ábra - 130144 peptid, SB-. ábra - 156-170 peptid,

A. 10. ábra egy táblázat, amely az MS betegekben három különböző időpontban az MSP-re és- az MBP-pept időkre kapott stimulációé index (SÍ) értékek csúcsát mutatja, A második időpontnak megfelelő mintákat az első időpont után 4-8-. hónappal, míg a harmadik időpontnak megfelelő- mintákat a második időpont után 3-5 hónappal gyűjtjük össze. A háttérértékeket minden nap lemérjük és ez 80-700 cpm (beütésszára/pere) között változik; pozitív válasznak (félkövér kiemeléssel) tekintjük azokat, amelyekre igaz, hogy az SX>3 és 5epm>1000. (Az MSÍ9 és MSS7 betegekből nem sikerült mindhárom időpontban mintát venni).

A 11, ábra egy táblázat, amely egészséges egyénekben az MBPre és az MSF-peptidekre kapott .stimulációé: index (SÍ) értékek csúcsát mutatda. A háttérér kékeket minden nap lemérjük és ez 80700 cpm között változik; pozitív válasznak (félkövér kiemeléssel) tekintjük azokat, amelyekre igaz, hogy az SÍ>3 és .& /-> r^-.rf! ^s> Π Λΐ Q

A 12, ábra mutatja a DR2:MBP82-10ő transzgenikus egérből izolált T~sejtek válaszát az MBP 77-100 régiójába illeszkedő pepfcidjeinek APC általi bemutatásáraA 13. ábra mutatja az MS17;A3 T-sejt klón válaszát az MBP 125-143 régiójába illeszkedő peptidek APC általi bemutatására .

A 14. ábra mutatja a T-sejt epitép felismerését EíBP 89-101 szekvenciáján belüli epitopokra. Ezen. a szekvencián belül három eltérő, de átlapoló T-sejt epitép létezik; 89-94, 32-98 és 95101, A.z ábrán bemutatjuk a lehetséges hasítás folyamatát a 94 és 35 aminosavafc között az aszparaginil-endoepetidáz (AEP) ensim ha kására,

A 15, ábra mutatja a 87-9S (A) és 8:9-131 (B) MBP peptidek azon képességét, hogy apitópként működnek a 89-34 epítöpra adott T- sej t válászreakcióban, meg tő z e x 11 e s óé n találmány toierogén pepiidre vonatkozik.

Tΰΐerancra

A leírásban, a „tolerogén* kifejezés azt jelenti, hogy egy anyag a tolerancia indukálására képes,

A tolerancia az antigénre adott válasz hiánya. A saját antigénekkel szembeni tolerancia az immunrendszer alapvető tulajdonsága és amikor elveszti ezt a tulajdonságát, az iö autoimmun betegséget eredményezhet.. Az adaptív immunrendszernek fenn kell tartania az igen. sokféle fertőző anyaggal szembeni válaszadó képességét, miközben, el kell hárítania a saját szövetben levő saját antigénjeinek aütoímmnn támadásait. Ezt igen nagy mértékben szabályozza az éretlen T-.limfociták csecsemőmirigyben, végbemenő a-poptotikus sejthalállal szembeni érzékenysége (központi tolerancia). Azonban nerc minden saját antigént ismer fel a csecsemőmirigy., így az őnreaktív tímocíták elpusztulása befejezetlen marad. Létezik továbbá olyan mechanizmus is.-, amellyel a tolerancia az érett őnreaktív Tlimfociták által a. környéki szövetekben szerezhető meg (környéki tolerancia). A központi és környéki tolerancia mechanizmusairól Anderton és munkatársai (ímmunologicai Reviews 169:123-137 (1999)) adnak áttekintést.

A tolerancia a CD-4+ T~ sejtek legalább egy részében kialakult válaszképtelenség' indukálásának eredménye lehet, vagy ezzel jellemezhető. A T-sejt aktiválása érdekében egy pepiidnek egy APC-hez kell kapcsolódnia., amely két szállítani a T-s-ejthes. Az első jelet {1-es jel) .az APC sej'tfelúletén lévő MHC-peptíd komplex szállítja és a T-sejt a- TCR-en keresztül ismeri fel, A második jelet <2-es jel) az ARC felületén lévő kostímulációs molekulák, például a CD8Q ás CD86 szállítják és a T-seji olyan „professzionális zelec képes gondolják, hogy amikor a jel híánvában, akkor .srceri te.;., ügy

Γ-sejt felismeri az 1-es. jelet a 2-es az nem aktiválódik és valójában válaszképtelenné válik, A válaszképtelen T sejtek szembeszálinak az azt követő antigén támadással és képesek lehetnek más immunválaszok elnyomására. A válaszképtelen T~ sejtekről azt gondolják, hogy reszt vesznek a T-sejt tolerancia közvetítéséhen.

Anélkül, hogy egy konkrét elmélethez ragaszkodnánk arra számítunk, hogy azok a peptidek, amelyek mielőtt az MHC molekulákkal együtt bemutathatőak lennének feldolgozást igényelnek, nem indukálnak' toleranciát, mivel ezeket a peptideket érett antigén

5rezentaló sej beknek kel feldolgozniuk. Az érett antigén prezentáló sejtek (például a makrofágok, S~sejtek és dendritikus sejtek) képesek feldolgozni, az antigént, továbbá képesek az 1-es és 2-es jelet is a Tsejthez szállítani, amely a T-s-ejt aktiválásához vezet. Másrészt az apítópok képesek az éretlen APC MHCII molekuláihoz kötődni, így az apitőpokat kosfeimuláoió nélkül mutatják be a T~sejteknek, amely a T-sejfc válaszképtelenségéhez és toleranciához vezet.

Természetesen az apitópok is képesek az érett APC a lévő. MHC molekulákhoz kötődni. Azonban 32 immunrendszer nagyobb mennyiségben tartalmaz éretlen APC-t, mint érett APC-t (felvetették, hogy 10 %-nál kevesebb dendritikus sejt aktiválódik, Summers és mtsai., (2001) Am. J. Pathol. 153;: 285-2955. így tehát az apitóp alaphelyzetben inkább válaszképtelenséget/toleranciát okoz, mintsem aktiválást.

Kimutatták, hogy amikor tolerancia indukálódik a peptid belélegzésekor, az antigén-specifikus CDit T-sejtek proliferácíós: képessége csökken. Továbbá e sejtek 1L-2, l'FN-y és XL-4. termelését alulszabályozzák, de az Tű-1.0 termelését növelik. A peptid által indukált tolerancia állapotában lévő **>

-egerekben az IL-lö semlegesítéséről. kimutatták, hogy a betegségre való- hajlamot teljesen visszaállítja.. Erre olyan toleráns- állapotban lévő szabályosó sejtek populációját javasolták, amelyek IL-lÖ-et termelnek és immunszabályozást közvetítenek (Burkhart és mtsaí. (1995) Int. Immunoi. 11:16251634) .

A -tolerancia, indukálása 'következésképpen különféle technikák segítségével követhető nyomon, amelyek magukban foglalják a kő v e t későkét:

(a) kisebb érzékenység egy olyan betegség elkapására, amelynek kialakulásához a peptid egy ín vívó- oéiepitőp;

(b) váiasssképtelenség indukálása a -CD4+ T~sejtekben (amely ezután antigénnel történő in vífcro immunizálással mutatható ki) ;

(c) a CD4+ T-ssjt populációban bekövetkező' változások, beleértve:

(i) a proliferáciö csökkenését;

ííi) az 1L-2. IFN-v és IL-4 termelésének alulszabályozása; és (ül) az IL-10 termelésének fokozása.

Antigén feldolgozástól független epí tőpok fAPTTÓPOA)

A találmány szerinti eljárás olyan pepfcidek szelekciós lépeséből áll, amelyek további feldolgozás nélkül képesek az MHCI vagy MHÜI.I fehérjéhez kötődni. Ezeket a peptideket hívjuk, „apitőpok™nak a leírásban, (antigén feldolgozástól független

Egy adott antigénből származó peptidek sejtfelszíni bemutatása nem véletlenszerű és a folyamat során kevés, gyakran * 1 előforduló epitőp dominál. Bgy sajátos peptid dominanciája számos tényezőtől, például az MHC molekulára vonatkozó viszonylagos kötődési affinitásától, keletkezésének. térbeli és időbeli pontjától érzékenységétől függ. Az immunválasz előrehaladottságával változhat, jelentősége van a saját anyagokkal szembeni

a.uto immunitás esetében. Az immundominanciát antigén epitőp

APC~n	belüli
a lebomlás	ra való
hierarchia	ija az
amelynek	f ,·’'' ΓΪ j~ ζ·', Ο;
tolerancia	és az
eghatárózó	régiók

sgy ezonyoi valószínűleg jó toleroqénnek bizonyulnak. Ennélfogva kiviteli alakban a találmány szerinti apitóp a domináns építópokon a1apui.

Azonban az immun-domináns peptidekre adott elsődleges immunválasz után az epitőp „terjedés aidomináns determinánsokat eredményezhet (Lehmanh és ifitsál., (1992) Natúré 358:155-157). Az aldomináns epitópok bemutatása fontos lehet az autoimmun!tás előidézésében, A találmány szerinti apitóp következésképpen egy aldomináns epitópon alapul.

Bármely adott antigén esetében léteznek rejtett epitópok is, A. rejtett epitópok pepiidként beadva képesek T-sejt választ stimulálni, de képtelenek ilyen választ előidézni, amikor teljes artxgénként adjuK ne őket. EnneK az lenet az oks, nogy az A2Cben az antigén peptidőkké történő feldolgozása során a rejtett epitőp megsemmisül. Kimutattuk, hogy az MSP 92-98 aminosavaiból álló peptid. egy rejtett epitőp (2C. példa) , Meglepő módon a peptíd régióban létezik egy vélhető hasítási hely az aszparaginil-endopeptidáz számára, amely azt jelentheti, hogy a sermészetes feldolgozás során nem keletkezik olyan peptid az

AP-C-ben, amely ezt a régiót tartalmazza.

A rejtett epitóp in vitro apitópkéitt viselkedhet., amennyiben további földolgozás nélkül kötődhet az MHC molekulához és képes 'válaszképtelenséget indukálni az olyan T-sejtben, amely felismeri a rejtett epitópot. Azonban az ilyen apitép valószínűleg terápiásán hasznos lehet, mivel nem képes toleranciát előidézni azokban. a !-se.jtekben, amelyek .felismerik az antigén természetes úton feldolgozott epicópiát.

Az antigén epitópiaí a teljes antigént lefedő átlapoló peptidek (lásd későbbi APC által történő bemutatására adott Tsejt válasz, mérésével azonosíthatók. Az ilyen vizsgálatok rendszerint a peptidek „mátrixait* 'eredményezik és a sajátos Tsejtvonalra. vagy T-sejt klórra jellemző minimális epitóp a csonka peptídekre adott válasz mérésével becsülhető meg.

Nem tételezhető fel ugyanakkor az, hogy az antigén minimális epitóp ja api topként viselkedik. Jóllehet a minimális epitóp oldalsó· sminosavaira szükség van az MHC molekulához történő optimális kötődéshez. Az apitópot úgy kell megtervezni, hogy lefedje annak lehetőségét, hogy apró különbségek lehetnek a különböző T-sejt kiónok minimális epitopjai között.

Szeretnénk kihangsúlyozni, hogy nem lehetséges az összes epitőpra apitópot azonosítani. Nyilvánvaló, hogy néhány epitóp oly módon kötődik az MHC molekulához, amely függ az MHC terhelhetőségétől az endoszémákban és ennélfogva feldolgozást igényel (Viner és mtsai., (1995) Proc. Natl. Aoad, Sói. 92:22142'218>. Ez egy másik ok arra, hogy miért nem feltételezhető·, hogy minden minimális epitóp feltétlenül apitopként viselkedik.

A. T-sejt epitőpokat tartalmazó pepti-dek az-ono^Xtasa

A szakterületen számos eljárás ismert egy adott antigénen belül lévő T-sejt epítópok azonosítására.

A természetes úton feldolgozott epitöpok az antigénnel

töltött ARC-bői	einait	pépt ide k	tömegspektro:
vizsgálatával azor	iosf t hatók.	Ezek olyan	APC-k, amely
elősegítjük az	antigén	felvételét f	tvuyrf' x Z'· ! vo'
intracellulárís te	jrmeiésére )	késztetjük, :	amelyet a mec
transzformálásával	kapunk.	Jellemzően	az ARC-t
fehérjével inkubá	r j uk, v agy	úgy inkubáljuk, hogy
megfelelő módon az ARC sej	tfelszínéhez	jusson el.
történő inkubálést	1 követően	a sejteket	de tergensben

oldatban •f ρηΟ'Γ·*·: Λ és az MHC II fehérjét például affinitás kromatográriával tisztítjuk. A tisztított MH'C megfelelő kémiai közeggel (például savas körülmények között) történő kezelése a peptidek eluálását eredményezi az MHC molekulából. A peptldek összességét szétválasztjuk, majd a profilt összehasonlítjuk a hasonló módon kezelt kontrol ARC-böl származó pepiiddel. A fehérje expresszíöra/botáplált sejtekre jellemző csúcsokat megvizsgáljuk (például tömegspektrometriával), majd azonosítjuk a peptid íragmenseket. Sz as eljárás általában, egy sajátos antigén antigén-feldolgozásából keletkezett peptidak (rendszerint a peptíd-mátríxban megtalálható) tartományáról ad információt.

Az epítópok azonosítására szolgáló másik eljárás az átlapoló és az antigén teljes hosszúságát lefedő peptidek szintetikus könyvtárának szkrínelése egy ín vitro vizsgálatban. Például. 15 aminosav hosszúságú és 5 vagy 10 amínosav hosszúságban átlapoló ló peptidek alkalmazhatók. A peptideket egy antigén bemutató rendszerben vizsgáljuk, amely antigén prezentáló sejteket és Tsejteket tartalmaz. Például az antigén bemutató rendszer egy egér splenocifca készítmény, humán mandulákból nyert sejtek készítménye vagy PBMC lehet. Másik lehetőségként az antigén bemutató rendszer egy sajátos T-sej tvonalat/kión.t és/vagy egy sajátos antigén prezentáló sejttípust tartalmazhat,

A T-sejt aktiválás T-sejt prolifsráción {például ^H-timidín beépítésével) vagy cihokin-termelésen keresztül mérhető. A Túltípusú CD4+ T-sejtek aktiválása például az IFIT/-termelésével mutatható ki, amely szabványos technikákkal, például bljspöt vizsgálattal mutatható ki.

Az átlapoló peptidekre vonatkozó vizsgálatok általában az antigén azon területeit jelzik, amelyekben epitőp helyezkedik el. Egy sajátos T-sejt minimális epitőpja ezt követően a csonka peptidekre adott válasz mérésével állapítható meg. Például ha az 1-15 aminosavakat tartalmazó· pepiid immunválaszt indukál az átlapoló könyvtárban, akkor azok a peptidek alkalmazhatok a minimális epitöp azonosítására, amelyek mindkét végükön csonkák (azaz 1-14, 1-13, 1-1.2 stb, és 2-13,. 3-15, 4-15 stb.

aminosavak).

Az antigén immundomináns régióinak in vitro vizsgálatok (különösen T-.se jtvonalakat alkalmazó eljárások) alkalmazásával történő azonosítása a peptíd reaktivitás aszimmetrikus mintázatát mutatja. Az MSP epitöpok azonosítására szolgáló vizsgálatban, amelyet a példákban ismertetünk, olyan kinetikus válaszreakció vizsgálati módszert alkalmazunk, amelyben az MS betegekből és egészséges egyénekből származó PBMC prolii«rációját mérjük egy átlapoló peptid könyv tárral -szemben. Sz a vizsgálati módszer azon a felfedezésen alapul, hogy habár az egészséges egyénekből és MS betegekből származó T-sejtek hasonló módon reagálnak a. tisztított fehérje antigénre, mégis különböző módon reagálnak az MBS szekvenciáján alapuló peptidekre. Az MS betegekből származó T-sejtek nagyobb mértékben és gyorsabb kinetikával reagálnak a peptid antigénekre az egészséges donorokhoz képest. Ez lehetővé teszi az epitóp szkrinelését és azonosítását, amelyre a beteg konkrét időpontban inaaunreakciőval válaszol. A leírásban ismertetett vizsgálatban az említett megoldás számos olyan epítőpot tartalmazó régiót tár fel, amelyeket szabványos technikák alkalmazásával nem azonosítottak. Ezen felöl bemutatjuk, hogy a T-sejt felismerése ciklikus mintázatot mutat, amely az egyik időpontban megjelenik, visszafejlődik, majd ezt követően egy későbbi időpontban újra megjelenik.

Az általunk ismertetett kinetikus vizsgálati módszer értékes eszközt biztosit, mivel felismeri azt az epi.tópot, amelyre a beteg egy konkrét időpontban immunreakcióval válaszol. Ez az információ egy konkrét betegre szabott terápiás apitópalkalmazási megoldáshoz használható fel a releváns epitóp apítópjának azonosításával és beadásával (feltéve, hogy létezik ilyen), Az információ segítségével egy általános mintázat is felvázolható a betegség előrehaladása esetében, oly .módon, hogy a betegség egy adott pontján valószínűleg meglévő epitőpokra. jellemző apitopokat tartalmazó gyógyszerkészítmény legyen.

terveznetó.

Antigén feldolgozástól független bemutató rendszerek c'AefFS?

Mihelyt azonosítjuk as epitópot a következő lépés az, hogy megvizsgáljuk vajon apiképként viselkedik-e.

Az apitopot ügy kell a T-sejteknek bemutatni, hogy ne legyen szükség az antigén feldolgozására. A T-sejt epitópokat tartalmazó pept ide k. azonosítását követően az api tépek olyan rendszer alkalmazásával azonosíthatók, amelyekben nem történik feldolgozás. A csonka pepfcídek és peptid analógok aktiválóképessége antigén feldolgozástői független bemutató rendszer (.APIPS) alkalmazásával vizsgálható.

As APlPS-ra példák a következők:

a) rögzített APC (CD2S elleni antitestekkel vagy anélkül);

b) MHCI vagy MHCII molekulákat tartalmazó lipid. membránok (CD28 elleni antitestekkel vagy anélkül); és

c) tisztított, természetes vagy rek-ombináns MHC lemezhez kötött formában (CD2S elleni antitestekkel vagy anélkül).

A rögzített APC alkalmazása jói ismert, a T-sejt válaszok

megfigyelésére, például	egy polipeptíde-n belül
epitőp megfigyelésére	vonatkozó	vizsgáié t okb<
peptidekre adott válasz	mérésével	(Fairchild és
Int. Immunoi. 8:1035·	-1043). Az	APC példán:
(rendszerint paraformalc	lehid) vagy	glutáraldehid
*· ·ΐ

osonna

A lipid membránok -(-amelyek plenáris membránok vagy Iiposzómák lehetnek) mesterséges Iipidek alkalmazásával állíthatók elé vacv APC-bői -származó plazmamenibxán/míkroszómális frakciók lehetnek.

Az alkalmazás -során az APIPS egy szövettenyésztő lemez lyukaiba vihető- fel. Ehhez adjuk, a pepiid antigéneket és a pepiid APIP5 MKC részéhez történő kötődését a kiválasztott Tsejtvonal vagy T-sejt klónak hozzáadásával mutatjuk í'v.X > ú*>.

sejtvonai vagy T~sejt klón. aktiválódása bármely a szakterületen jől ismert eljárással mérhető, így például hl-ti:midin beépítéssel vagy citokín kiválasztással.

Péptidek

A találmány egy peptid szklerőzis multiplex kezelésében és/vagy megelőzésében történő alkalmazására vonatkozik.

A „peptid kifejesést a hagyományos értelmében használjuk és jellemzően az L-aminosav maradékok olyan sorozatát jelenti, amelyek -egymáshoz peptid kötéssel kapcsolódnak a szomszédos aminosavak a-amino és karboxíl-csoportjai között, A kifejezés magában foglalja a módosított peptideket és a szintetikus peptid is.

A találmány szerinti peptid bármilyen hosszú lehet, amennyiben feldolgozás nélkül képes egy MHCI vagy MHCII molekulához kötődni..

Az MHCI molekulákhoz kötődő peptidek jellemzően ?-13, előnyösebben 8-10- aminosav hosszúságúak. A peptid kötődése a peptid két végénél stabilizálódik a peptidvázban lévő atomok és az MHCI molekulák peptid-kötő helyén lévő állandó helyek közötti kapcsolódások segítségével. A peptid-kötő hely mindkét végén található egy állandó hely, amely a peptid amino- és karboxivégeihez kötődik, A különböző hosszúságú peptidek a peptidváz

2Ö behajlásával. illeszkednek., .ami gyakran a szökságes rugalmasságot lehetővé tevő- prolin vagy glicin maradékoknál történik.

Az MHC1I molekulákhoz kötődő peptídek jellemzően 8-20 aminosav hosszúságúak, előnyösebben 10-17 .aminosav hosszúságúak, de lehetnek hosszabbak is. Ezek a peptídek kinyújtott konformációban nyúlnak végig az MHCII molekula peptid-kötő helye mentén (amely különbözik as MHCi molekula peptid-kötő· helyétől) amely mindkét végén nyitott. A peptidet elsősorban az egész peptidváz és az MHC molekula peptid-kötő helyén lévő konzervatív aminosavak között kialakuló kölcsönhatások tartják a helyén,

A találmány szerinti alkalmazásra kerülő peptid kémiai eljárások segítségével állítható elő (keptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Boöansky, Springer-Verlag, Berlin). A peptídek például szilárdfázisü technikák .segítségével állíthatók elő (Roberge 1Ύ és mtsai,, (1935; Science 269: 202-204), a gyantáról lehasíthatok., majd prepára ti v nagy hatékonyságú £ ο Xvadé kk roma toorá £i a -(preparatív HPLC) segítségével egy hosszabb előállítható.

kínverhető, tisztíthatok (például Crsighton (1883) Proteíns Structűrés And Molecular Prineiples, WH Freeman and Ce>, New York NY) . Automatizált előállítás is kivitelezhető például az Aöl 43 I A típusú peptid-színtetizálö készülék (Perkin Elmer) alkalmazásával a gyártő által megadott utasításoknak meg fele lően..

A peptid másik lehetőségként rekombináns eszközökkel vagy polipeptídből történő kivágás segítségévei is A peptid például a. célantígénfeöi kivágva is peptidkészítméh.y aminossv-vizsgálattal vagy > i s z e k v e n a i. a s s a.

eljárással).

ellenőrizheti ipérbaut

Bdman-lebontási

Az előnyös kiviteli alakban a peptid egy célantigénböl szármáztadható. A célantigén egy olyan molekula (például egy fehérje vagy glikoprotein), amelyet a betegség lefolyása során az APC dolgoz fel és a T-sejtek ismerik fel. A -cél ant igén természetesen a célbatagságtól függ. A peptid előnyösen az antigén elvan fraqmenséből származtatható, amelv az antigén A?Cben történő természetes feldolgozásából keletkezik.

Gyakorlati célokra több más jellemző létezik, amelyet a pepiidnek mutatnia kell. A pep-tidnek például oldhatónak kell lennie olyan koncentrációban, amely lehetővé teszi az in vivő alkalmazásukat. A pepiidnek előnyösen 0,5 mg/ml koncentrációig, előnyösen. 1 mg/ml koncentrációig, legelőnyösebben 5 mg/ml koncentrációig kell oldhatónak lennie.

Az íntranazális beadáshoz a dózis maximális mennyisége, amely a jelenlegi eljárások alkalmazásával felvehető, körülbelül 2öö μΐ./orrlyuk. Ha a peptid X mg/ml koncentrációban oldható, akkor a dupla dózis mindegyik orrlyukba lehetővé teszi SCO ug .beadását a betegnek. Bármilyen egyedi dózist alkalmazva az 5 mgnál nagyobb mennyiség beadása, meglehetősen szokatlan.

Fontos továbbá, hogy a pep-tidnek ín vívó elegendően .stabilnak kell lennie ahhoz, hogy terápiásán használható legyen. Azt találtuk, hogy ín víw a beadás után 10 perccel a vizsgált peptid teljes mennyisége 50 %-ra csökkent 4 órával a beadás után a 30 %-ra csökken, de a beadás után 5 nappal a peptid. még mindig kimutatható (körülbelül a teljes mennyiség 5 %-ában). A peptid

7·*>

# > — *·.

vívó felezési ideiének legalább 10 p-ercne k, előnyösen órának és legalább '30 nercnek, előnyösebben legalább 4 legelőnyösebben legalább 24 órának kell lennie.

Azt találtuk, hogy intranazális beadást követően a pepiid mennyisége a kiürülő nyirokcsomóban a beadást követő 4 óra múlva érte el a csúcsot, azonban a peptid 5 nappal később is kimutatható (körülbelül S l-o-s maximális értéken) . A terápiásán aktív koncentrációjú peptid előnyösen hosszú ideig elegendően stabil a kiürüld nyirokcsomóban ahhoz, hogy terápiás hatást fejtsen ki.

A peptidnek in vívó jő biológiai hozzáférhetőséget is kell mutatnia. A peptidnek in. vivő olyan konformációban kell maradnia, amely lehetővé teszi számára, hogy akadálytalanul tudjon a sejtfelszínen az MHC molekulához kötődni.

Az MHCIX molekula api top j a különösen a.zokban. a be tegségekben használható, amelyeket CD4+ T-sejt immunválaszok közvetítenek. Ilyenek például azok a betegségek, amelyek a nem megfelelő vagy túlzott CD4* T-sejt válaszon alapulnak vagy az így kialakult válaszreakciók tartják fenn.

A peptid a ssklexősis multiplex (MS) kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazásra. A szklerőzís multiplex (MS) egy olyan krónikus gyulladásos betegség, amelyet a központ idegrendszer velő-állományában elszórtan előforduló, a többrétegű míelin-hüvely megszűnésével járó sérülések jellemzik és különféle helyeken és időkben. fordulnak elő (Mcfarlin és

McParland, 1982 X4ew Bngland J. Hédi ciné 307:1183-1188 és 12451251). Az .MS-röl azt tartják, hogy autor-eaktiv T™ sejtek

19;	Voski	ihl és
és ΓΓ	tís s s i Λ	, 198 5
	Az	MHCX

közvetítik.

A peptid az autoantigének egyikéből, különösen a raielin. bázikus fehérjéből -(MSP) vagy a proteoiipid fehérjéből (PLP) származtatható. Az MSE valószínűleg alkalmasabb, mint a PL?, mivel a PLP erősen hidroföb és a belőle származó pepi lelek hajlamosak egymás-sal összetapadni. Az ME? ímmnnogén fehérje és az MSP-specifikus T-limfociták agyvelőgyulladás kialakítására képesek állatokban (Sega! és mtsai., 1994 J. Heuroimmuno 1. 51;?19; Voskuhl és ®tsai., 1993 u. Neuroímmunol 42:197-192; Zamvil , 1985· Natúré 317:355-8).

MHCX molekulához kapcsolódó apitőpok alkalmazhatók például a vírus elleni CuSt válaszok tolerogsn módon történő módos 11 ás á ra, éyögys z erkés s £ tmény

Feltételezzük, hogy a „bystander szupresszió ellenére szükség lehet több különböző T-sejt kiónt megcélozni a tolerancia hatékony indukálása érdekében. Ennélfogva a peptidek sokasága adható be egy egyénnek, hogy megelőzzünk vagy kezeljünk egy betegséget.

A második megközelítésben a találmány tárgya szklerőzis multiplex hezeiésére/megelőzésére alkalmazható gyógyszerkészítmény, amely az apítópok sokaságát tartalmazza, ahol a peptidek legalább egyike MSP peptid 83-99 vagy MSP peptid 131145.

~5ö apitopot, <	előnyösen 2-15
ugyanabból a	cé1antigenbő1
ármaztathatók.	Az apitöpok

előnyösen további feldolgozás nélkül vagy mind az MKC'T molekulákhoz képesek kötődni, vagy mind az MHC1X molekulákhoz képesek kötődni. Egy előnyös kiviteli alakban a gyógyszerkészítményben lévő összes apitöp további feldolgozás nélkül vagy az MHCI vagy az MHC11 molekulákhoz képes kötődni.

A gyógyszerkészítmény készlet alakban fordulhat elő, amely az apitőpok némelyikét vagy az összes apifcőpot egyszerre, különállóan., vagy egymás utáni beadás céljából külön-külön biztosítja.

Másik lehetőségként (vagy ezen felül) ha a győgyszerkészítményt (vagy annak bármely részét} több dózisban adjuk be, a dózisok mindegyike külön csomagolható,

A gyógyszerkészítmény terápiásán vagy prof Hektikusan hatékony mennyiségű apitópot vagy apitópokat és adott esetben győgyászatilag elfogadható hordozóanyagot. oldószert vagy köt ö anyagot tartalmazhat.

Továbbá a találmány szerinti gyógyszerkészítményekben az apitőp vagy apitőpok bármilyen alkalmas kötőanyaggal, kenőanyaggal, szuszpendálő szerrel, bevonőanyaggal vagy oldódást segítő anyaggal keverhető össze.

Adagolás

A pepiidet oldható formában adjuváns nélkül kell beadni.

A pepiidet előnyösen a nyálkahártyán keresztül adjuk be.

A tanulmányok azt mutatják, hogy az intraperitoneálisan {i.p.}, intravénásán (i.v.) vagy intranazálisan (i.n.) vagy orálisan oldható formában beadott pepiid T-sejt toleranciát képes indukálni (Amdérton és Wraith <1998}; Liu és óraibb (1995} előzőekben megadott; Metzler és Wraith {1999) Immt v<T >

A pepiidet előnyösen íntranasaiisan adjuk be.

Az egereken végzett vizsgálatok azt mutat jak, .hogy a tolerancia indukálásához szükséges pepiid adagolás időtartama a T-sejtek prekurzor gyakoriságától függ a 'befogadó egerekben (Burkhart és mtsai., (1999) az előzőekben megadott). Számos kísérletben bemutatták, hogy a pepiid ismételt dózisa szükséges a tolerancia indukálásához (Burkhart és mtsai., (1999? az előzőekben megadott). A pepiid pontos dózisa és a dózisok száma tehát az egyéntől függ, azonban az előnyös kiviteli alakban több dózist adunk be.

Ha a peptidek sokaságát egyidejűleg adjuk be, akkor „koktél formájában lehetnek,· amely egysegnózisban vagy több dózisban adható be. Másik lehetőségként előnyös lehet több dózis beadása, de a peptidek relatív koncentrációja váltózhat a dózisok között.

Egy előnyös kiviteli alakban „növekvő dőzísű protokoll követhetünk, ahol növekvő koncentrációjú dózisok sokaságát adjuk be a betegnek. Ilyen megoldást alkalmasnak például a foszfolipáz peptidek esetében a. méhcsípés allergiával szembeni ímmunterápíás alkalmazásokban (Műller és mtsai., (1998) db Allergy din Immunoi.. 101:747-754 és Akdis és mtsai., (1998/ hb

Clin, Invest. 182:93-106).

PÉLDÁK

A következő példák a találmány bemutatását szolgálják, és semmi módon nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, A találmány előnyösen a példákban ismertetett sajátos kiviteli

ί.

alakokra vonatkozik.

1. példa - Az HBP-hen lévő T-sejt epitopok azonosítása

Anyaook és módszerek'

Antigének

A humán MBP-t az agy velő-állományából állítjuk elő- Delhier és mtsai., által ismertetettek szerint (Deíbier és mtsai., 1972

Freparative Bicchemistry 2:133) és a tisztaságát SDS-PAGE segítségévei állapítjuk meg. Az MBP-t és a élycobaeteríum tuberculosisból tisztított fehérie származékot (PPD)(ÜK Central «etennary Laboratory

Surrev} me g t atározott optimális koncentrációkban alkalmazzuk a prol iterációs vizsgálati módszerekben? ahol az optimális koncentráció mindegyik antigén esetében 50 pg/ml. Szabványos F~moc kémiai szintézist Abimed AbS 422 típusú, több pepiid előállítására képes 3zintetízálŐ~kéS2'üléken (Abimed, Langenfeld, Németország) alkalmazva állítjuk elő a teljes bS?--t lefedő lö-mer átlapoló ideket tartalmazó lemezt. Mindegyik peptidet S aminosavval helyettesítjük és 10 aminosavval átlapoljuk. 33 pepiidet készítünk le, amelyeket 3-as csoportokba gyűjtünk és a készleteket 50 pg./mi optimális koncentrációban vizsgáljuk, oly módon, hogy ín ráérő mindegyik peptid 16,6 pg/ml koncentrációban legyen jelen.

Betegek é-s kontrol alanyok

A vizsgálat alanyai klínikailag pontosan leírt vagy laboratórium által alátámasztott, pontosan leírt MS-ben (Poser és ffitsai., 1363) szenvedő-, 23-51 év közötti 12 beteg. A 12 beteg közül nyolc vesz részt. interferon-S vizsgálatban, eoyebként az.

összes többi MS beteg nem kap kortikosztsroid kezelést a vizsgálat megkezdése előtt legalább 3 hónapig. A kontrol csoport egészséges egvénbő) akik. 25-55 évesek és egyikük se® kap immunszuppresszív kezelést a vérminta levételét megelőzően sgalább három hónapig.

Szövettenyésztő közeg

A 20 mM KERES-szel {Sigma, Poole, Egyesült Királyság). penicillinnel (100 U/ml) , sztreptomicin-szulfáttal (100 mg/ml) és 4 mM L-glutamixmal (mindegyiket a Life Technologies, Paisley, Skócia cégtől kapható) kiegészített RRHI-1540 táptalajt alkalmazzuk szövéttenvésztő közegként. A szérammentes közeget használjuk a limf.oid sejtek és a mosására. Az összes tenyésztéshez használt körülmény és vizsgálat esetében a közeget lö % hővel inaktivált autológ plazmával egészítjük ki.

A tenyésztési körülmények és a T-sejt proliferáeiós vizsgálatok

Citráttal kezelt perifériás vért (50-180 ml) gyűjtőnk érbeszúrás segítségével minden alanyból, miután írásos beleegyezésüket adják a vizsgálatokhoz. Perifériás vér izolálunk a vérből súruségkülőnbségen alapuló centrifugálással Hístopa.gue-1077 berendezésben (Sigma, Poole, Egyesült Királyság), majd. a PPD-t, W-t vagy MER peptídeket tartalmazó 1,5 ml térfogatú 24-lyukú szövettenyésztő lemezekben (bűne International, Costar, Corning mononukleáris séd te két (PSMC mc i'ikssv

York, tenyésztjük őkel sej t/ml koncentrációban. A lemezeket 37‘C-on ihkubáljuk S % CO_:í / 55 % levegőt tartalmazó nedvesített légkörben. Az 5.

iaook kozott kei .00 ni~ss alikvótot veszünk ki mindegyik tenyészetből, majd 96-lyukú gömbölyű fenekű mikrotitsr lemezekbe visszük át őket és 0,4 μ€ί pK}-tímidínt (Amersham International,

Amersham, UK) adunk hozzájuk. IS órával később sejteket gyűjtünk üvegszálas alátétekre (LKS-Wallae, Turku, Finnország) Mach 111 harvester 96 készülék (Tomtec, Orange, New Jersey, USA) -alkalmazásával. .A pH]-tímidin beépülését klícrobeta folyadékszeintilláciös számlálóval (LKB-Wallac) határozzuk meg. Az antigént tartalmazó vizsgálati lyukakat -akkor tekintjük pozitívnak, amikor a ócpm >1000 és a stimulációé index (Sí) >3, ahol az Sí ~ az antigént tartalmazó tenyészet beütésszáma/'az antigént nem tartalmazó tenyészet beütésszáma,

A T-sejtvonal és a T-sejt kiónok előállítása

Az M3F~specifikus T-sejtvo-nalakat (TCL) 8 MS betegből és 2 egészséges kontrol donorból állítjuk elő. Az. alanyokból származó PBMC~t az előzőekben ismertetetteknek megfelelően különítjük el és 1x10° sejt/ml mennyiségben S-lyukú lemezekbe heyezzük őket MSP (50 ug/'ml) jelenlétében; az alanyból származó PSMC adagját szabályosan lefagyasztjuk és ezt követő újbóli stimulálás céljából tároljuk. Hét nappal később a sejtekhez 2 % IL-2 (Lympbocult-HT; Biotest ATD. , Birmingham, Egyesült Királyság) tartalmú friss közeget adunk és a tenyésztés 12. napján az összes sejtet az antigén prezentáló sejtek (APC) forrásaként újra antigénnel, IL-2-vel és- besugárzott (2500 Rád) autóiÓg PBMC-vel stimuláljuk 1 T-sejt:5 A?C sejt.arányban. A sejteket 3-4 naponta IL-2-ben szaporítjuk és a 14. napon újra antigénnel, IL2-vei és PBMC-vel stimuláljuk az előzőekben ismertetetteknek megfelelően, Az első üjrastímulálás napján a sejteket az MS-P-vel

	zsgálj	uk. Röviden	(V J. v
ög Pí	IMC-1	tenyésztünk	három
ölvü		ü lemezekbe	... \.«'«A TV A A ** A X** i.

~ r-, A.f <£. pi U- \λ	·-?
gyűjtünk	és	a
>1000 és	SÍ	> 3

párhuzamos mérésben, 9β~lyukú gömbölyű jelenlétében. A sejteket 2 napig tenyésztjük, majd a tenyésztés utolsó IS órájában [³H]-t.imidi.nt adagolunk 0,4 uCi/lyuk értékben.

előzőekben ismertetetteknek megfelelően sejteket akkor tekintjük MBP-specífikusúak, ha ocpm

A következő 3 újrastínulálás-Znővekedés ciklus után a TCl~t PHA (sigma., Poole, Dorset, Egyesült Királyság) alkalmazásával .ABC-ként autolőg besugárzott PB'MC jelenlétében klónozzuk. A Τη© jt eket ö,l sejt/ lyuk, 0,3 sejt/.lyuk és 1 sejt/lyuk hat.árh£g.ításos körülmények között lemezekre visszük fel, majd Ixlö'¹ besugárzott PBMC~t, 5 pg/ml PHA-t és 2 % IL--2-t tartalmazó Terasaki lemezekben (Nunc International, Costar) tenyésztjük őket, 10-12 nap múlva egy 96-lyukú gömbölyű fenekű lemezen 'ix.lö^b ug/ml FKA és XL~2 alkalmazásával tovább a lyukaknak a tartalmát, amelyekben növekedés tapasztalható. Káron nappal később a lyukakba 11,-2 ~t tartalmazó^ friss közeget adunk, majd a 7. napon a klónokat 48lyukú lemezeken SkXO⁵ besugárzott PBMC, PHA és IL-2 segítségével szaporítjuk; ennél a pontnál a. klónokat proliferácíós vizsgálati módszerekben a.z MBP-re adott specifikus immunválaszokra vizsgáljuk, Az. MBP-specifikus klónokat egy héttel később 24lyukú lemezeken IxlO⁶ besugárzott PBMC, PK& vagy Dynabeads (Dynal, Egyesült Királyság) és 1L--2 alkalmazásával szaporítjuk. A klónokat 24-lvukű lemezekben tartjuk fenn 7-10 napos besugárzott PBMC, 5 szaporítjuk azoknak

3δ újrastimülálás/nóvekedés ciklus alkalmazásával lényegében az előzőekben ismertetetteknek megfelelően. Az előzőekben ismertetetteknek megfelelően proliferáciős vizsgálati módszerekkel vizsgáljuk a T-sejt. kiónok azon képességét, hogy felismerik az MSP peptidek mátrixát.

Eredmények

Az MBP-peptid felismerése az MS-betegek. és az egészséges egyének xösött

Olyan kinetikus immunválasz vizsgálati módszert, alkalmazunk, amelyben az MS-betegekbol és egészséges alanyokból származó PSMC-t vizsgálunk abból a célból, hogy meghatározzuk vajon képesek-e a humán MBP teljes hosszát, lefedő, átlapoló 15-mer szintetikus peptidek mátrixára immunválaszt adni. A tenyészet ékből származó PBMC prolíferatív válaszát, vizsgáljuk 2 hét alatt 5 időpillanatban, és összehasonlítjuk az MBP-re és a peptídekre adott immunválasz kinetikus profilját a PPD-re adott immunválasz kinetikus profiljával, ahol az utóbbi egy másodlagos immunvál?

felelős/memória antigént jelöl. Nem találtunk jelentős különbséget az. MBP-re és/vagy peptídekre adott PBMC immunválaszokban az Interferon-β kezelést kapó betegek és azok között, akik nem kapnak ilyen kezelést (az adatokat nem mutatjuk), A MBP-re adott immunválasz az MS-betegekben és az egészséges kontrolokban is később éri el a csúcsát, dint a PPDre adott immunválasz, ezáltal a nem jó memőriájü antigénre adott immunválasz kinetikus tulajdonságait követi. Az 1. ábra a PPb-re és az MBP-re adott immunválaszok kinetikus profiljainak jellegzetes példáit, mutatja az MS-betegekben és egészséges egyénekben.

Amint az a 2. ábrából látszik az- MS betegek által leginkább felismert két peptid a 30-:114 és 75-99 (6/12 (12-ből 6) beteg esetében), amelyet a 30-54, 135-159 és 150-170 (5/12 beteg esetében) és 1-24, 105-129 (4/12 beteg esetében) peptidek követnek. Három betegnél tapasztalható immunválasz a 15-3.9 és 120-144 peptidekre. Két beteg ismeri fel a 45-63 peptiáefc és a 60-84 régióra egyik MS-beteg sem reagál.

A 10. ábrának, megfelelően,, ahol az összes beteg HLA-UR2 pozitív,· az MS-betegek által leginkább felismert két peptid a 90-114 és 75-99 (6/11 beteg esetében), amelyet a 120-144, 135159 és 150-170 régiók (5/11 beteg esetében) és az: 1-24, 15-33,

30-54 és 105-129 régiók (4/11 beteg esetében) követnek. Három beteg reagál a 45-63 régióra., és a 60-84 régióra szintén nem reagál egyik beteg se®.

Ezzel ellentétben az egészséges egyének jóval kevesebb pepiidet ismernek fel, azaz csak két. kontrol alanynál sntid. felismerése (C és J.- 3.. ábra) . A

tapaszt	<>«4> -“i·. λ. xGv ty ít*	-nél több
SS u	kontrol	egyének
régióra.	nem bánásztalhaó
Meglepő	módon a	két egyé;
63 és	105-129 :	régiókat
míg a	75-33 és	150-170

régiót három egyén; az 1-24, 30-54, Sö-84 és 120-144 régiókat két egészséges egyén? és a 15-39 és 90-1.14 régiókat egy egyén ismeri .fel. Összességében a 13-ból 8 egészséges egyén nem válaszol az átlapoló peptidek egyikére sem, míg 12-ből 1 beteg <V'\ •(MS 13) következetesen nem képes felismerni az MSP peptideket. Megjegyzésképpen sz a beteg az egyetlen, aki nem ad imunválasst sz MBP fehérjére.

A ll. ábra szintén az egészséges egyének KB? peptidekre adott immunválaszait mutatja. Ebben a vizsgálatban csak 1 kontrol alany adott immunválaszt 2~nél több pepiidre (MII). Az Síi alany az egyetlen, aki a 60 --84 régiót felismeri, amely régióra nem tapasztalható immunválasz a betegek e csoportjában. A 15-39, 45-69 és 10:5-129 régiókat az egészséges donorok egyike sem ismeri fel,, míg a 120-144 és 135-159 régiókat két egészséges egyén; és az 1-24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-114 és 150-170 régiókat egy egyén ismeri fel. Összességében 12-ből 9 egészséges egyén nem ad immunválaszt az átlapoló peptidek egyikére sem.

Összességében	az.	MBP-re	és/vagy	a	peptidekre adott
immunvá 1 a s-z. - ®ax í műm	elérésének	napja nem	tér	el jelentősen az
egészséges egyének	és	betegek	között.	és	a csoportokban a

kinetikák az elsődleges antigén immunválaszhoz hasonlítanak. Továbbá, az MB'P-re. és a peptidekre adott immunválasz mértéke nem különbözik a betegek és az egészséges egyének között.

Az MBP-peptiö felismerésének idő függvényében történő változása

Az MBP peptidek széles spektrumára, immunválaszt adó MS-ben szenvedő betegeket alapul véve elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk vajon a PBMC felismerés ugyanazokban, az egyénekben a körülbelül 4-12 hónapos időtartamra összpontosul-e, illetve ezen idő alatt stabil-e. Amint a 2, 1.0 és 3. ábra mutatja sem az M'S-betegek, sem az egészséges egyének nem mutatják ugyanazt a peptid felismerő mintázatot.

A 4. ábra. egy MS beteg (k49j példáját mutatja be, ki több pepiidre is 2 különböző időpontban ad immunválaszt, de 4 hónappal később mért második időpontban a felismerési profil elentőssn eltér. Azaz a második kinetikai vizsgálatban a 15--39,

30-54 és 150-170 régióra adott PBMC válasz tovább tart, azonban a 75-SS és 105-129 régiókra adott válasz visszaesik és a 90-114 és 135-559 régiók irányába változik.

Az 5. ábra egy beteg (MS 00) példáját mutatja, akinek a széles- epitóp immunválasza egv koncentrált immunválasszá fejlődik vissza .a 4 hónapos vizsgálatban, A második immunválasz időpontjára vizsgált egészséges egyének, egyik, peptidre sem reagálnak -a második körben (3. ábra).

Összességében as eredmények azt mutatják, hogy az M'S-ben szenvedő betegek nem matatnak szabályos mintázató felismerést. A betegekben a több peptidre adott PBMC válasz képes tovább fennmaradni, visszafejlődni és at MBP új régiói irányába eltolódni, amint azt az MS 49 betegnél láttuk.

;ld felismerésének ciklusos váltakozása

Amikor a oeotidekre adott PBlkC választ 3 vaoy több különböző depómban vizscráliuk hónapos periódusban, nyilvánvalóvá válik, hogy bizonyos betegekben az epítőpok felismerése inkább ingadozni látszik mintsem, hogy irreverzíbilisen eltolódna űj peptidrégiók irányába. Amint azt a 2 és 10, ábrák mutatják, például as M.S 60 beteg a 120-144 és 135-159 régiók felismerésének ciklikus mintázatát mutatja? azaz a 120-144 és 135-159 maradékok azok között vannak, amelyeket az első vizsgált időpontban felismernek, a második időpontnál a 2 rációra adott immunválasz vxsszateglödk, maid a 4 nőnappal későcö mért harmadik időpontnál újra megjelenik. Az MS 41 beteg kinetikus profilja hasonló módon art mutatja, hogy a. 135-159 régió felismerése több időpontban ingadozik (lásd 2 és 10. ábrák).

Az egészséges csoportban Í3. ábra) az egyik egyén CM) a 7599 és 135-153 régiókra ingadozó immunválaszt mutat, egy második egyén (F) a vizsgált három időpontból kettőben ismeri fel a 7599 régiót, míg egy harmadik alany (D) a 15-3.9 maradékra adott ciklikus immunválaszt mutat.

Az MBP-re adott immunválasz finomtérképezése

MS-betegbŐi és 2 egészséges egyénből T-sejt klőnokat (TCC) nyerünk ki., majd a kinetikus válasz vizsgálatokban azonosított peptidrégiók finomított spécifitásának tisztázása érdekében használjuk fel őket. A TCC-k specifikusságát a 15-mer peptidek mátrixára adott proliferativ válaszuk segítségével vizsgáljuk. Az SD:A7 klón az 1-24 régiót ismeri fel és ezen régión beiül a TCC az 5-19 pepiidre ad immunválaszt. A 30-54 régiót 4 klón (M'S43:D3, MS49rC8, MS49;A3, NS49iBS) ismeri fel és a régióban a 30-44 aminosavnak megfelelő epitőp található. Az MS-betégből származó egyik klón (M39.:D7> a 50-74 pepiidet ismeri fel és meglepő módon egy egészséges egyén ad immunválaszt erre a régióra (50-84) a kinetikus immunválasz vizsgálatunkban, öt klón. {.MS43:A7, MS41;BS, MS41.:A2, MS41:CS, NS:S) ismeri, fel a 83-99 pepiidet, amelyet a 75-93 régió tartalmazza.. Egy beteg hoz létre TCC specifikus választ a 110-124 pepiid <MS5C:A2, MB50:B3) esetében, amely a 105-129 készletből származik és ugyanabból a betegből származó másik TC€ specifikus a 130-144 <MSSÖ:S1) pepiidre, amely a 120-144 régióban található meg, öt egyén termeit olyan kiónokat, amelyek a 135-159 régión belüli epítőpokat ismerik fele az MSSOcF, MSSOcDl, MSSOIEI és N5:10 a 140-154 peptidet ismeri fel; az MS57;A1 a 140-149 pepiidre specifikus és az MS17:A3 T-sejt klón a 130-144 szekvenciára ad Immunválaszt. A kiónok e sorozata világosan mutatja legalább 2 T-sejt epitöp meglétét az MBP 135-153 régióján belül. Végül a 150-170 régiót a 155-109 pepiidre specifikus 2 klón ismeri fel. Az összes T-sejt klón specifikusságát a S. ábrán összegezzük.

2. Példa - az MBP-ben lévő apitópok azonosítása

Anyagok, és módszerek

APiPS-t alkalma zó an t i gén --.bemutató vizsgálat

A peptidek T-sejt klónoknak történd bemutatását pro!iteráció segítségével mérjük. Az APC-t 0,5 %-o.s para formaldehidben rögzítjük és lyukanként lxl0^s sejtet helyezünk 96-lyukú szövet tenyésztő: lemezre. Ezekhez T-sejt kiónokat adunk lyukanként 2x10'· sejt mennyiségben a peptidek különböző koncentrációjával együtt. 48 őrás 37°C~on történő inkubálás után a [Ül]-timídin 16-20 órán keresztüli beépülésével mérjük a prolíferáciőt, Az eredményeket összehasonlítjuk a T-sejtek élő APC által bemutatott epitoppal szembeni válaszadó képessége szempontjából.

A peptidek DR2xMBP-82-100 transzcenikns egérből izolált T~ sejteknek történő bemutatása lényegében ugyanaz, mint az előzőekben Ismertetettek, kivéve, hogy az APC-t lyukanként 5xlQ^s sejt mennyiségben rögzítjük, a T-sejbeket lyukanként 1x10“ sejt mennyiségben adjuk a lemezhez, majd 72 órát hagyjuk inkubálni a pH)-timidin hozzáadása előtt.

S'z*edmények

Ebben a kísérletben a korábbi példában epitápként azonosított peptídeket vizsgáljuk azon képességükkel kapcsolatban, hogy az APIPS segítségévei bemutatásra, kerülnek-e. Az eredményeket a 7b. ábrán mutatjuk be. Ennek megfelelően öt epitópof vizsgálva, négyről azt találtuk, hogy apítöpok (30-44, •«λ· vb .Λ,

80-94, 110-124

-14 4j es eövről azt tsz hogy spítopként működik, de apitópként nem (156-170}.

2A példa - A 30-44, 110-124, 130-144 és 156-170 MBP peptidek vizsgálata

Annak vizsgálata érdekében, hogy vajon a különféle MBP peptidek apitöpok-e, megvizsgáljuk, hogy a rögzített ABC hogyan, képes bemutatni a peptídeket a T-sej beknek. Élő és korábban pulzált Mgar (HLA-DR2vvej sejteket szérumban siőpuizáiunk a peptiddel vagy magát a szérumot pulzáljuk 3,5. órát. Ezután eltávolítjuk a peptid-ielesieget a sejtekből, majd hozzáadjuk a megfelelő T-sejt kiönt. A T-sejt proliferáciős választ a ³H~ fcímidin felvételével mérjük.

Amint a 8 és 9. ábrák mutatják, a 3-0-44: (8A. ábra), 110-124 (8B. ábra) és 130-144 (9A, ábra) peptídeket a rögzített APC feldolgozás nélkül képes bemutatni.. Ezeket a peptidek emiatt apitőpokkénfc határozzuk meg. Másrészt a 156-170 peptidnek további feldolgozásra van szüksége a T-sejteknek történő bemutatásához (9B. ábra). A rögzített ABC képtelen bemutatni ezt az epitöp-ot a T-sejteknek, így a 156-170 peptídet nem tekintjük * *

77-100 és 125-148 régióin belül lévő apitőpok után (13 apitépnek,

2B. példa - Az azonosítása

Bármely adott epitőp esetében létezhet egy vagy több apitőp, amelyet az APC további feldolgozás nélkül képes bemutatni. Az MBP két régióján belül lévő apitőpok meglétét az élő vagy p£ormaidébadben rögzített Mgar (.HLA-DR2+ve) sejtek MSP 77-100 (12. ábra) és 125-148 (13. ábra) régióiból származó átlapoló peptidekkel szérumban vagy a sej inkübálásával vizsgáljuk. 72 óra után ábra) T~sejteket adunk

- ^3ti-timidin fe sejteket DR2 régió esetében MS17:A3 Tsejfc kiónt alkalmazunk.

Az MBF 77-1:00 régiója esetében apitöpként definiáljuk a

szérűi	mb-an	történő
ábra)	vagy	4 8 óra
3. j ΓΠ3	j o a	T-sejt
Ilei m	érjük.	Az MBP
82-100	t ranszgénikus

egérből izoláljuk, mig az M3P 130-144

köve	ítkező	Ρ'θΡC i G Θ:KÖ Ü. '
MSP	83- 99	SMPWHFFKNZVTPBTP
MBP	30-94	TQDFMPWHFFKNIV
MSP	31-95	QDSHRWHFFKN1VT
MSP	82-9 6	DENBWRFFKNTVTP
MSP	83-97	EHPWHFFKNIVTPR
MSP	34-98	NPWHFFKNIVTPRT
	A DR2 MSP 82-100 transzgeni

s egérből származó T-sejtek által felismert minimális MB'P szekvencia a 85-94 .régió.

Az MBP 125-148 régiója -esetében ap-itőpként definiáljuk a kővetkező oe-otideket:

’íS

MSP	130-	144	RASSYKSAHKGFKGV
MS?	131-	145	ASDYKSAKKGFKGVD
MSP	— z	146	SSYKSAHKGPKÖVFA
MS?	133-	147	SYKSAHKGFKGVDAQ
	Az	MS	17;A3 T-sejt klón

felismert minimális Mf szekvencia a 133-144 régió.

2C« példa - Az MSP 89-101 régiójának vizsgálata

Koránban, bemutattuk, hogy ellentétben más mielin T-sejt

epitoppal	az oldható formájú	8?-:	löl j	jept id	beadása n	eia gátolja
az egér	teljes mielinnel	vagy	magával	a 89-101	peptiddel
indukált	k í s é r 1 e t e s au tói mis	rcr.	agy-	és	gerincvelő-gyulladást

(SAS) (Andantén és Wraíth (.1998) Eur. J. Immunoi... 28:1251}.

.Az MSP 8.9-101 régió három T - sejt epitópot tarts Ima z

A T-sejt MBP 81-111 régiójával szembeni reaktivitásának vizsgálata érdekében 81-111 peptiddel immunizált egér nyirokcsomó sejteket in víc.ro 81-111 peptiddel stimuláljuk es a sejteket a 81-111 régiót lefedő két aminosav eltolást tartalmazó lö-mer átlapoló peptidek sorozatával vizsgáljuk (nevezetesen; 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 9710S, 99-108 és 101-111} . A 89-101 régiót lefedő peptidekre. adott válassmintázat sfeimulátor képességet mutat az 5 .szomszédos peptid esetében (N-terminális 37-36 pepiidtől a 35-104-ig5, amely legalább két (talán három) eltérő epitőp meglétét tükrözi. Ahhoz, hogy ezt a régiót tovább vizsgáljuk, három sejtvonalat hozunk' létre az eredeti 81-111 peptidre válasz képes Tsejfcvonalbői, majd ezeket újból levizsgáljuk a 84-106 régiót lefedő egy aminosav eltolást tartalmazó 18-mer átlapoló pepfcídek sorozatával. Az eredmények három eltérő, de átlapoló ?~sejt epitőp meglétét tárják fel a 89-102. szekvencián belül: ezek a 89-94, 92-98 és 95-101 peptidek (lásd 14. ábra).

Az_ 92-98 peptid egy rejtett epitőp

A három epitőp-spéciiikus T-sejtvonal (TCL) érdekes különbségeket mutat, amikor a 89-101 pepiidhez: és a teljes rekombínáns MBP-he2 képest vizsgáljuk a reaktivitásukat. Mindhárom TCL reagál a pepiidre (89-101), de csak a 89-94 és 95löl specifikus TCL reagál a teljes MBP-re. Sz azt jelenti, hogy az: ép MBP antigén- feldolgozás előnyösen olyan lígandumokat hoz létre a T-sejtek számára, amelyek felismerik a 89-94 és 95-101 peptideket.. de nem ismerik fel a 9.2-98 pepiidet. Ez azt sugallja, hogy a 92-98 epitőp rejtve marad (azaz nem hozható létre az eredeti antigén feldolgozásával)- Ügy tűnik, hogy az MBP 89-101 peptid képes 32 MHC molekulával három különböző kölcsönhatásban részt venni, amely olyan peptid/MHC lígandumofcat eredményez, amelyeket három különböző T-sejt populáció ismer fel. Az MBP feldolgozása azonban csak ezek közül két T-sejt populációnak megfelelő ligandumokat hoz létre (lásd 14. ábra).

Az EAE indukálásához olyan autoantigén epitöpok T-sejt felismerésére van szükség, amelyek az ép MBP lebomlásának eredményeként expresszálödnak a központi idegrendszerben. Az egerek immunizálása a három korábban azonosított T-sejt epitöpok csak egyikét tartalmazó peptídekkel azt mutatja, hogy csak a természetes úton feldolgozott spi.tőpct (89-94 vagy 95-101) tartalmazó peptídek képesek EAE-fc indukálni. Ez is azt a felfedezést támasztja alá, hogy a 92-98 régió egy rejtett epitőp.

Az MBP 92-98 pepiid az MBP 8.9-101 régió domináns apitőp ja

Amint az. előzőekben említett ük a 89-101. régió három eltérő, de átlapoló pepiidet tartalmaz. Ezek közül a 92-98 pepiid tűnik dominánsnak e régióban, Például amikor T-sejt klőnokat hozunk létre 89-101 pepiiddel immunizált egerekből, mind a hat létrehozott klón reagál a 92-98 pepiidre. A minden helyzetben egyedi alanin helyettesítéseket tartalmazó 89-101 analóg peptidek alkalmazásával azt találtuk, hogy a 92-98 helyzetek bármilyikének helyettesítése a válaszképesség hiányához vezet, ami azt mutatja, hogy a 92.-98 magon belül bármely maradék módosítása jelentős hatással van ennek az epitopnak a felismerésére.

Az.........MBP_________89-101 pepiid........képtelen toleranciát.........kialakítani__a természetes úton...... feldolgozott MSP epítópot .felismerő ΞΑΕreleváns T-sej bekben.

As előző felfedezések összegzéseként azt találtuk, hogy a) a 89-101 szekvencia 3 eltérő T-sejt epitőp létrehozásának lehetőségével rendelkezik; b) ezek közül csak két epitőp (89-94 és 95-101} jön létre az ép MBP antigén feldolgozása során (akár ín vítrc, akár ín vivő); c) csak a természetes ütőn feldolgozott epitőpokat tartalmazó peptidek hatékonyak az EAE indukálásában és a rejtett epitőpot tartalmazók nem; d) a 89-101 pepiid képtelen védelmet biztosítani az EAE-vel szemben, a pepiid kezelési kísérletekben,

Ez az információ szolgál alapul ahhoz a vizsgálathoz, amelyben megvizsgáljuk azt a hipotézist, hogy a 89-101 pepiid képtelen toleranciát kialakítani az EAE ellen, mivel nem képes közvetlenül lekötni a betegségben releváns T~sej teker. A nzpotezis' arátámasstass. erdekeben a pepiid (89-101,! nem kéri, hogy toleranciát indukáljon a fő enkefaiifogén epitóppal szemben, mivel az nem kötődik közvetlenül az MHC restrikciós elemhez (Σ-AÚ a megfelelő konformációban. Másszóval 89-101 peptid nem működik apítópként a 8 9-94 peptídre adott T-sejt válasz esetében.

E lehetőség vizsgálata érdekében tolerancia kísérleteket végzünk 89-1öl és 8.7-98 pept.ide.kk.el (15 A és B ábrák) . A. 87-98 peptid tartalmazza az SAS indukálásánál leghatékonyabb epítópot (89-94} .

&-JL 7

Egereknek RBS-ben lévő 200 gg pepiidet vagy csak PBS-t adunk intraperítoneállísan 8, 6 és 4 nappal azelőtt, hogy komplett

Freuad-f.éle adjuvánsban lévő 100 pg pepiidet adnánk. 10 nappal később kiürülő nyirokcsomó sejteket (őxlO'/lyuk) 7

AyS : eny é s s. t j ük S χ. 10

2-merkaptcetanollal és 2M L-giutaminnal kiegészített X-Vivo IS közegben antigénnel vagy antigén nélkül. A tenyészeteket 1.8 órát 0,5 pCi 'E--t írni dinnel telítjük, majd folyadék szcintillációs számláló segítségével mérjük a beépülést. .Az eredményeket a három párhuzamos tenyészet beütésszám/pere értékében fejezzük ki,

Eredmények

A 87-96 pepiiddel történő immunizálás erős emlékező (vagyis ezzel a petfíddel már találkozott az immunrendszer) immunválaszt ¢42 indukál önmagára és gyenge. immunválaszt indukál a 89-101 eptiure fu> Ά át illetve o). Ez összhangban azzal.

hogy a 89-84 peptid 89-101 régióból történő előállításához antigén feldolgozásra van szükség. A 87-95 peptidet a 87-96 peptiddei való inanuni2álást megelőzően tolerogén anyagként alkalmazva elnyomja a 87-96 és a 89-101 pepiidre adott emlékező immunválaszokat (Γ5 A ábra, M illetve ·) . Ezt 89-94 reaktív Tsejtekkel ellátva,: amelyék már egyszer in vivő válaszképtelennek bizonyultak, azok nem képesek a 83-94 peptidre választ indukálni ín vitrcs akár a 89-96-ből, akár a 89-101-böl hozzuk létre a peptidet. Döntően azonban a 89-101 peptid tolerogénként történő alkalmazása a 87-96 peptiddei való immunizálás előtt nem képes visszaemlékező immunválaszokat indukálni a 87-96 vagy 89-101 peptidekre (15 B és A ábrák, illetve ·} . Ezek az adatok azt mutatják, hogy a 83-101 pepiid tolerogén formában történő beadása nem képes toleranciát indukálni a 83-94 szekvencián alapuló- természetes módon feldolgozott enkefalitogén. epítőppai szemben: a 89-101 peptid képtelen apitöpként viselkedni a 85-94 epitóp esetében.

Anélkül, 'hogy egy elmélethez .ragaszkodnánk, úgy hisszük, hogy a megfigyelések a 89-101 peptid MHC p-eptidkötő helyében lévő elhelyezkedésével magyarázható.. Ha a pepiid előnyösen oly módon kötődik, hogy a 92-98 régió a peptid-kötő zsebben helyezkedik, el, akkor azt felismerik az MBP92-98-specifikus T~ sejtek. Ez megmagyarázza, hogy amikor az egereket MBP&9-1G1 pepiiddel immunizáljuk, miért ismeri fel az MB.P92-.98 epitópot. a. keletkezett T-sejt klórok mindegyike. Shhez hasonlóan, amikor

83-101 pepiidet használunk a T-sejtek toleranciájának indukálására, .akkor az legfőképp azokban a sejtekben indukál toleranciát, amelyek felismerik az MBP.92-9S epitópot. Ha az antrgen ípitőpot

Μ3?92-38 peptid egy rejtett epitöp, akkor a teljes természetes feldolgozása során nem képződik és az felismerő T-sejtek valószínűleg in vivő nem fordulnak elő. Még ha az MBP32-98 specifikus T-sejtek léteznek is in vivő, akkor sem fontosak a betegségben. Ennélfogva a 33-101 peptid nem képes gátolni a teljes MSP-vei indukált SAS-t.

3.. példa ~ Az MS egér ©odelben alkalmazott peptid terápia

Korábban ismertettük, hogy a szisztémásán, akár intraperitoneálísan (hiú és Wraith (1995) Int Immunoi 8:12531263}-, akár intranazálissn (Metzler és Wraith (1393) 5:11591165} beadott peptid antigén egyszeri dózisa védi egészen 3 hónapig hatékonyan az egereket a kísérletes autoimmun agy- és gsrincveiőgyulladsssal szemben (Metzler és Wraith (1359} Immunology 97:257-263). Legalább 5 dózis pept.idre van szükség tolerancia indukálására Tg4~transzgenikus egérben (Burkhart és mtsai., {1999} 11:1525-1634), amely SAH-specifikus T-sejt receptort expresszál (Lin és mtsaí., (1935) Immuntfcy 3:407-415}·. A legújabb munkák azt ismertetik, hogy a Tg4 egemen az mint az antranazaxís vISF) ufó biztonságosabb , intraperitoneálís (IP) útvonal még akkor is, ha mindkét megoldás egyaránt biztonságos a nem. transzgenikus egérben.

Az MSP 83-92 peptidjét Fug/D'6 transzgenikus egérben vizsgáljuk, amely a megfelelő HLA-DR2 MHCII molekulát és erre a pepiidre specifikus humán T-sejt kiónból származó TCR-fc is expresszál Az egereket & pepiiddel kezeljük vagy a Tg 4 transzg-enikus egér kezelésére alkalmazott szabványos dóz protokoll_; vagy a pepiid dózis kiterjesztését alkalmazó des-zenzitizáló protokolfc követve, amelyet az allergiában szenvedő betegek kezelésére 'használnak (deszenzítizáló protokol).

Tg4 protokol: egerek egy csoportját 25 pl teljes mennyiségű 83-99 peptid < foszfát-puf fsro.lt sóoldatban (PBS) lévő 4 mg/ml peptid) vagy csak PBS intranazális beadásával kezeljük.. Az egereket a hét első és ötödik napján kezeljük 5 hétig összesen 10 dózist adagolva. A 6'. hét elején mindegyik egeret Komplett Fr-eund-f-éle Adjutánsban (GBA) lévő 83-99 pepiiddel injektáljuk, majd az egerek Pertussis Toxin (200 ng) Íntraperitoneális injektálást is kapnak az első és a harmadik napon. Legalább 30 napig figyeljük az SAS kifejlődését.

Deszenzitizáló protokol; egerek egy csoportját 25 pl teljes mennyiségű 83-99 peptid folyamatosan növekvő dózisának vagy csak PBS-ne k. intranazális beadásával kezeljük. A növekvő dózis 0,1 pg-rcl indul és l, 3, 5_f 12, 5.0, majd 100 yg-ig folytatjuk, Az egereket minden hét első és ötödik napján kezelj ük 5 hétig összesen 10 dózist adagolva. A 6, hét elején mindegyik egeret Komplett Freund-íéle- Ad j uvánsban (CFA) lévő 8-3-99 pepiiddel injektáljuk, majd az egerek Pertussís Toxin (200 ng) Íntraperitoneális injektálást is kapnak az első és a harmadik napon. Legalább 30 .napig figyeljük az. SAE kifejlődését.

é, példa - Apitőp koktél nazális beadása MS betegeknek

Vakcinát készítünk, -amely a következő MBP pepti-deket

Vizsgalatban >	A vx z sgá tat eg: y betegeket három
s 1 a t, a	hol a
id egyszeri	dózisát adjuk be
Ijük a	betegeket a vakcina
t QP rv	hogy	megállapítsuk a
heti	két szí	srí intranasális
setében	havonta vizsgáljuk a

tartalmazza:. 30-44,. 83-99,. 110-124 és 13.0-144 (azaz azokat az

MSP peptideket,- amelyeket apitőpként azonosítunk). A vakcinát 3 5 betegnek adjuk be la/lb fokozaté egyszerű keresztosztályozás! vis hónapig nem kezeljük, majd a peptid egyszeri (la) . Ezután három hónapig fíc egyszeri dózisának beadását ki biztonságát. A kezelés· ezutár beadásból áll. Mindegyik beteg klinikai aktivitást mágnesrezonancíán alapuló képalkotással; figyeljük az immunológiai aktivitást a proliierációs kinetikai immunválasz vizsgálati módszerét alkalmazva; és figyeljük a citokin termelést sejt-alapú ELISA segítségével.

A vizsgálat kezdetben 5 krónikus súlyosbodó (CP) betegségben szenvedd beteg kezelését foglalta magában.. A betegeket az alacsony MRI aktivitás alapján választjuk ki és először a peptidek legmagasabb- dózisával, kezeljük őket. A kezelést a CP csoportban kezdjük el, mivel náluk legvalószínűbb, hogy bármilyen lehetséges káros hatást mutatnak, amelyet az MRI sasban ne követ,te zd ükeoéí

70..

csillapodó betegek kezelését ah	;kor ke z d j ük meg,	amikor
bizonyossá válik, hogy az egyszer	ri és a többszöri	dózissal
történő kezelés biztonságos a CP	csoportban. A 30	visszaeső
csillapodó beteg nagyobb csoportját	az alapján toboroz	zuk., hogy
mennyire .szenvednek a fokozódó P	SRI sérülések a 3	hónapos
megfiove^ési periódus során. A	betegeket három	κ·β se 1 endo

söpört ra osztjuk a peptidek magas, közepes vagy alacsony dózisa mellett.

Időpont	Krónikus súlyosbodó (CP)	Visszaeső csillapodó (R.R.)
(hőnap)	betegek	betegek
9	Elkezdj ült a havi; megfigyelést
3	Elkezdjük az la fázist (a: peptid egyszeri dózisa) MRI-vei 1-2 héttel a kezelés után és havonta megfigyeljük
S	Elkezdjük az Ib fázist (a	Elkezdjük a havi
	.peptid heti kétszeri	megfigyelést és a fokozódó
	dózisa) és folytatjuk a	sérülésekkel rendelkező
	havi megfigyelést	betegeket toborozunk
9		Elkezdjük az Ib fázist (a peptid heti kétszeri
		dózisa) és folytatjuk a havi megfigyelést
12	Befejezzük a kezelést és további 6 hónapig folytatjuk a havi megfigyelést
15		Befejezzük a kezelést és további S hónapig folytatjuk a hav i ί megf igyelést

Rövidítések: APC kisst©kompatibilitási kísérletes autoimmur antigén prezentáló sejtek; MHC ~ 'komplex; TCR = T-sejt receptor? SAE agy- és gerinovelőgyuliadás;

antigén. feldolgozástól független epitóp? feldolgozástól független bemutató rendszer? szklerczís multiplex? MSP ~ miéi in bázik proteolipíd fehérje? TCL - T-sejtvonal; ’TCC

APIPS - antigén aa = aminosav; tóS ~ :us fehérje; PLP ~

T-sejf klón; PBMC = perifériás vér tubercu.los.is -bői £i toheoagglutinin.

mononukleáris sej tek ?

tisztított fehérje

PPD ~ Mycobacterxum származék; P.HA *

SZEKVENCIA LISTA

<I10>	The University of	Bristol
<12 ö>	PEPIID SZELEKCIÓS	MÓDSZER
<13 0 >	P9611WO LCH
<140>	PCI/<3301/037 02
<141 >	2001-08-17
<15Q>	0020618.5
<151>	2000-08-22.
<160 >	.1 .L
<17 0>	Patentln version '	5.0
< Z10 '>	1
<211 >	17
<212 >	PÉT
<213>	Homo Sapiens
<4 00 >	1
Gin Asn Pro Val Val Kis
'5:	5
Pro
<2I0>	2
< 2 r 1>	15
< < j. 2	PÉT
< X X X >	Homo Sapiens
<400>	·-·>
Thr G’	In Asp ölu Asn Pro	Vhx Vsiá
1	5
<2I0>	-j
<211>	15
< 2 r 2 >	PÉT
<213 >	Homo Sapiens

Asn lle Val Thr Pro Arg Thx 2.0 15 ys .Asn Ile Val 15 <4 00> 3

Gin Asp Glu Asn Pro

His he Lys Asn <210> 4 <211> 15 <212> PR?

<2I3> Homo sapiens <4 00> 4

Asp Glu. Asn Pro Val Val. Hí. 1 5

Phe Phe H/s Asxx

Ile Val Thr Pro η e;

<210>	s
<21X>	xs
<212>	PRT
<213>	Homo

:40· zaj

Val ''S

Mii

Phe Phe lys Asn 10

Vcu

Pro Arg 15

<210>	C1
<211>	15
<212>	PRT
<213 >	HoO’
	r*
<4 0 0‘>	O

Heh Pro Val Val Hís Phe Phe Lys Asn ile Val Thr Pro Ara 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PR?

Homo Sapiens :400>

Arg Alá Ser Asp Tyr Lvs

Ser Alá H.s Lys £3iy 10 >he Lys- Oly Val 15 >.JÍ50

<210>	8
<211>	15
<212 >	RS.T
<213 >	Homo Sáp i e ns
<4 0Ű>	8
Ara. S<	gr Asp Tyr Lys
1	s
<21C>	9
<211>	15
X x .x /»	FRT
< 2: .13 >	Homo Sapiens
< 4 0 0 >	9
Ser A:	sp Tyr Lys Ser
r	5
<210>	10
<2il>	15
<212>	RRT
<213>	Homo Sáp1 en s
< 4 0 0 >	10
Asp Tyi* Lys Ser Alá
X	5
< 210 >	11
<211>	13
<212 >	LRT
<213>	Homo Sapiens
<400>	11
Var H	is Fhe Phe Lys
1

Ser Alá

Alá. μ i s ny;

H)

Asn rle Vaj

Gly ^;ns

Thr

Giy Fhe Lys Giy 10

Asp IS

Phe Lys Giy Vai Asp Alá 10 15

03.1 rn .P:?O AifCí Τ'ΡιΤ Ρ·£Ό Ί Π

u. V·

Claims (7)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy tolerogén humán peptid - amely további feldolgozás nélkül képes az MHCI vagy MHCII molekulához kötődni szklerózis multiplex kezelésében és/vagy megelőzésében történő alkalmazásra, ahol a peptidet a mielin bázikus fehérje (MBP) következő peptidjei közül válasziuk; 83--99 és 13.1-145.
2. 2. Az i. igénypont szerinti peptid szklerózis multiplex kezelésében vagy megelőzésében történő alkalmazásra, ahol a peptid MB? 83--99.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti peptid szklerózis multiplex kezelésében vagy megelőzésében történő alkalmazásra, ahol a peptid MBP 131-145.
4. 4. Gyógyszerkészítmény szklerózis multiplex kezelésére/megeiőzésére, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti peptidet tartalmazza.
5. 5. A 4, igénypont szerinti gyógyszerkészítmény szklerózis multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazásra, mely gyógyszerkészítmény tolerogén humán MBP peptidek .sokaságát tartalmazza.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény szklerózis multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazásra, mely gyógyszerkészítmény 2 és 15 közötti tolerogén humán MBP peptidet tartalmaz.
7. 7. Az 5-6.. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény kit formában szklerózis multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazásra, ahol a kit néhány vagy mindegyik pepiidet szeparáltan, egyidejű, szeparált vagy egymás utáni alkalmazásra megfelelő formában tartalmazza.

   3. Az előző igénypontok bármelyike szerinti pepiid vagy gyógyszerkészítmény szklerőzis multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére történő íntranazális alkalmazásra.

   a megnatarmaz zott