KR20030062321A - 펩티드 선별 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에는, 추가 프로세싱 없이 I 또는 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는 펩티드를 선별하여, 관용원성 펩티드를 선별하는 방법이 제공된다. 또한, 이러한 방법에 의해 선별된 펩티드, 약제학적 조성물중의 이의 용도, 및 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 관용원성(tolerogenic) 펩티드를 선별하는 방법, 이러한 방법에 의해 동정된 펩티드, 및 질환을 치료 및/또는 예방하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다수의 이러한 관용원성 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
후천적(adaptive) 면역 반응에서, T 림프구는 단백질 항원의 내부 에피토프를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포(APC)는 단백질 항원을 섭취하여 이들을 짧은 펩티드 단편으로 분해시킨다. 펩티드는 세포내에서 I형 또는 II형의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합될 수 있고 세포 표면으로 운반될 수 있다. MHC 분자와 결합되어 세포 표면에 제시되는 경우, 당해 펩티드는 T 세포(T 세포 수용체(TCR)를 통해)에 의해 인식될 수 있으며, 이 경우에 당해 펩티드는 T 세포 에피토프이다.
T 세포 에피토프는, 자가 또는 외래 이든 모든 항원에 대한 후천적 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 과민성 질환(알레르기, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함)에서 T 세포 에피토프에 의해 발휘되는 중추적 역할은 실험적 모델을 통해 입증되었다. 합성 펩티드(T 세포 에피토프의 구조를 토대로 합성)를 애주번트와 함께 주사하여 염증성 또는 알레르기성 질환을 유도할 수 있다.
대조적으로, 가용성 형태의 펩티드 에피토프를 투여하여 특정 펩티드 에피토프에 대한 면역 관용을 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 가용성 펩티드 항원의 투여는, 실험상의 자가면역 뇌척수염(EAE-다발성 경화증(MS)의 모델)[참조 문헌: Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5: 1159-1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261]; 관절염, 당뇨병 및 포도막망막염(uverotinitis)의 실험상의 모델[상기 문헌 참조: Anderton and Wraith (1998)]에서 질환을 억제하는 효과적인 수단으로서 입증되었다. 이는 또한 EAE에서 진행중인 질환을 치료하는 수단으로서 입증되었다[상기 문헌 참조: Anderton and Wraith (1998)].
질환을 치료 또는 예방하는데 관용원성 펩티드를 사용하는 것이 상당한 주의를 끌었다. 이중 한가지 이유는, 특정 관용원성 에피토프가 동일한 조직내에서 별개의 항원에 대한 T 세포의 반응을 하향-조절할 수 있다는 것이 밝혀졌기 때문이다. "방관자 억제(bystander suppression)"로서 공지된 이러한 현상은, 특정 관용원성 펩티드를 사용하여, 주어진 항원내의 하나 이상의 에피토프(바람직하게는 모든 에피토프), 및 주어진 질환에 대한 하나 이상의 항원에 대해 관용(tolerance)을 유도할 수 있어야 함을 의미한다[상기 문헌 참조: Anderton and Wraith (1998)]. 이는 특정 질환내의 모든 병원성 항원을 동정하는 것을 필요없게 한다.
또한, 펩티드는, 비교적 비용이 저렴하고 변형된 면역학적 특성을 지닌 펩티드 동족체가 제조될 수 있기 때문에, 치료를 위한 바람직한 선택이다. 따라서, 펩티드를 변형시켜, 이들과 MHC 또는 TCR과의 상호작용을 변형시킬 수 있다.
이러한 시도에 따른 한가지 가능한 문제점은, T 세포 에피토프로서 작용하는 모든 펩티드가 관용을 유도할 수 있는 것은 아니라는 것이 밝혀졌다는 점이다. 미엘린 염기성 단백질(MBP) 펩티드 89-101은 면역화 후의 면역우위(immunodominant) 항원이고, 또한 EAE의 T 세포 반응성 및 유도를 위한 프라이밍(priming)의 관점에서 매우 효과적인 면역원이다. 그러나, 이러한 펩티드는 용액으로서 투여되는 경우 관용을 유도하는데 비효과적이라는 것이 밝혀졌다[상기 문헌 참조: Anderton and Wraith (1998)].
관용을 유도하는 T 세포 에피토프의 능력에서 관찰된 위계(hierarchy)에 관한 설명이 많이 제안되었다[상기 문헌 참조: Anderton and Wraith (1998)]. 특히, MHC에 대한 펩티드의 친화성과 관용원성 사이에 상관관계가 있으나[상기 문헌 참조: Liu and Wraith (1995)], 이것은 몇몇 상기 관찰과 일치하지 않는다. 예를 들면, 관용원성이 아닌 MBP[89-101]은 I-AS와 비교적 높은 친화성으로 결합한다. 따라서, 어느 펩티드가 관용을 유도하는 지를 예견하는 것은 수월하지 않다.
일정 비율의 펩티드 에피토프만이 관용을 유도할 수 있는 이유에 관한 합리적인 설명이 존재한다면, 이것이 과민성 질환의 치료 및 예방에 유용한 관용원성 펩티드의 선별을 용이하게 할 것이다.
발명의 개요
본원의 발명자는, 펩티드 항원이 항원 프로세싱이 수반되지 않은 미성숙 APC에 의해 제시되는 적당한 크기인 경우, 당해 펩티드 항원이 면역학적 관용을 유도할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 몇몇 T 세포 에피토프는 관용원성이고 나머지는 관용을 유도할 수 없다는 관찰은, 몇몇 에피토프가 MHC 분자에 의해 제시될 수 있기 전에 추가의 프로세싱을 요구한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 추가의 프로세싱을 요구하는 이들 에피토프는, 애주번트와 함께 주사하는 경우 질환을 유발할 수 있음에도 불구하고, 가용성 형태로 투여되는 경우 관용을 유도하지 않는다.
추가의 프로세싱을 요구하지 않는 에피토프는 관용을 유도할 수 있으며, 본원의 발명자에 의해 "아피토프(apitope: Antigen Processing Independent epiTOPES(항원 프로세싱 독립적 에피토프))"로서 명명되었다.
이러한 발견은, 생체내에서 펩티드의 관용원성 능력의 연구를 불필요하게 하는 관용원성 T 세포 에피토프의 선별을 위한 규칙적인 방법을 제공한다. 이는 동물 모델이 이용될 수 없는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 개발하는데 특히 유리하다. 동물 모델이 있는 경우에도, 당해 선별 방법은 보다 간편하고 보다 안전하게 관용-유도 조성물을 개발할 수 있도록 해주는데, 그 이유는 당해 선별 방법이, 펩티드의 관용 유도능을 이들을 생체내에서 사용하기 전에 시험관내에서 (사람 MHC 분자와 함께 항원을 인식하는) 사람 T 세포에 관해 시험할 수 있도록 해주는 기전을 제공하기 때문이다.
따라서, 제1 양태로, 본 발명은, 추가 프로세싱 없이 I 또는 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는 펩티드를 선별하는 단계를 포함하여, 관용원성 펩티드를 선별하는 방법을 제공한다.
바람직한 태양에서, 펩티드는 추가 프로세싱 없이 II형 MHC 분자에 결합할 수 있다.
주어진 항원에 대해 T 세포 에피토프로서 작용할 수 있는 펩티드를 스크리닝하는 수 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 일반적으로, 당해 방법이, 각각 T 세포 에피토프를 포함하는 다수의 펩티드로 부터 관용원성 펩티드를 선별하는데 사용될 것이다.
펩티드가 추가 프로세싱 없이 I 또는 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는지를 조사하기 위하여, 항원 프로세싱 독립적 제시 시스템(APIPS)을 사용하여 당해 펩티드가 I 또는 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는 능력을 연구할 수 있다. 따라서, 바람직한 태양에서, 당해 방법은 아래의 단계를 포함한다:
(i) APIPS를 펩티드로 처리하는 단계; 및
(ii) APIPS내에서 당해 펩티드가 I 또는 II형 MHC 분자에 결합하는 것을 분석하는 단계.
제2 양태로, 본 발명은 제1 양태의 본 발명의 방법에 의해 선별된 펩티드를 제공한다.
당해 펩티드는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다. 특히, 당해 펩티드는 자가반응성 T 세포에 의해 매개되는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용할 수있다. 과민성 반응, 예를 들면 알레르기, 자가면역 및 이식 거부가 본 발명의 펩티드를 사용한 치료/예방에 특히 적절하다.
이미 본원의 발명자들은 다발성 경화증에서 자가항원인 미엘린 염기성 단백질에 대한 다수의 아피토프를 동정하였다. 따라서, 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 펩티드는 다발성 경화증의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
몇몇 펩티드가, 동일한 항원으로 부터의 다른 에피토프는 물론, 별개의 항원으로 부터의 다른 에피토프에 대해 관용을 유도할 수 있다(방관자 억제로서 공지된 현상에 의함)는 것이 공지되었다. 그러나, 본원의 발명자들은, 모든 자가반응성 T 세포를 적절히 억제하기 위하여, 각종 아피토프의 조합물을 환자에게 투여하여 특정 질환을 치료/예방하는 것이 유익할 것임을 예상하고 있다. 따라서, 제3 양태로, 본 발명은 제2 양태의 본 발명에 따른 다수의 펩티드(각각 펩티드는 T 세포 에피토프를 기초로 한다)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제4 양태로, 본 발명은, 제2 양태의 본 발명에 따른 펩티드를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
피험자의 질환을 치료 및/또는 예방하는 일반적인 방법은 아래의 단계를 포함한다:
(i) 질환에 대한 항원을 동정하는 단계,
(ii) 항원에 대한 아피토프를 동정하는 단계, 및
(iii) 당해 아피토프를 피험자에게 투여하는 단계.
도 1은 다발성 경화증(MS) 환자 및 건강한 개인으로 부터의 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 정제된 단백질 유도체(PPD) 및 MBP에 대한 반응속도론적 프로파일의 전형적인 예를 보여준다. MS 환자(A) 및 정상 개인(B)으로 부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 PPD 및 완전한 MBP의 존재하에 증식할 수 있는 이들의 능력에 대해 시험한다; MBP에 대한 증식 반응의 반응속도론 프로파일을 제2 항원 PPD의 것과 비교한다.
도 2는 MS 환자에서 MBP 및 이의 펩티드에 대한 PBMC 반응을 요약한 표이다. 특정 개인을 각 시점마다 약 4 내지 7개월의 기간을 두고 3회에 걸쳐 분석한다.
도 3은 건강한 개인에서 MBP 및 MBP-펩티드에 대한 PBMC 반응을 요약한 표이다. 각 시점 마다 4 내지 7개월이 경과한다.
도 4는 2회의 상이한 시점에서 수 개의 펩티드에 대해 반응하는 MS 환자(MS 49)의 예를 보여주나, 이 환자의 경우 4개월 후에 측정된 제2 시점 동안의 인식 프로파일은 상당히 상이하다. MBP 및 전체 길이의 MBP중의 일부인 일단의 펩티드의 존재하에 PBMC를 배양하고, 3H-티미딘 흡수를 기준으로 증식을 측정하였다. 제1 시점에서 관찰된 광범위한 T 세포 증식 반응은 7개월 후(제2 시점)에 측정된 반응과 상당히 상이하였다.
도 5는 광범위한 에피토프 반응(제1 시점)이 복귀되고(제2 시점) 12개월에 걸쳐 재현되는(제3 시점) 환자의 예를 보여준다.
도 6은, MS 환자 및 건강한 개인으로 부터 생성된 TCC의 사용을 통해 수득된 반응속도론 반응 분석에서 동정된 펩티드 영역의 미세 특이성의 지도를 보여준다. 스크리닝 분석에서 사용된 대부분의 펩티드는 길이가 15량체이지만, 몇몇은 10량체이고, 하나는 17량체이다. 각 TCC의 특이성을 2회 이상 시험한다.
도 7a는 MS 환자로 부터의 T 림프구에 의해 인식되는 미엘린 염기성 단백질내의 T 세포 에피토프의 특징을 보여주는 표이다.
도 7b는 모든 T 세포 에피토프가 고정된 APC에 의해 반드시 제시되는 것은 아니므로, 아피토프가 아니라는 것을 보여주는 표이다.
도 8 및 9는 살아있는 APC 및 고정된 APC에 의한 T 세포 클론에 대한 각종 MBP 펩티드의 제시를 보여준다. 도 8A는 30-44, 도 8B는 110-124, 도 9A는 130-144, 도9B는 156-170 펩티드를 나타낸다.
도 10은 3회의 각각의 시점에서 수득된 MS 환자로 부터의 MBP 및 MBP-펩티드에 대한 피크 자극 지수(SI)를 보여주는 표이다. 제2 시점의 샘플을 제1 시점으로 부터 4 내지 8개월 후 수집하고, 제3 시점의 샘플을 제2 시점으로 부터 3 내지 5개월 후 수득하였다. 백그라운드 cpm을 매일 측정하였고, 80 내지 700cpm으로 달랐다; 양성 반응(굵은 활자)은 SI>3 및 δcpm>1000에 따라 정의되었다(MS19 및 MS67 환자로 부터 3회의 시점 모두에서 샘플을 수집하는 것은 불가능하였다).
도 11은 건강한 개인에서 MBP 및 MBP-펩티드에 대한 피크 자극 지수(SI)를 보여주는 표이다. 백그라운드 cpm을 매일 측정하였고, 80 내지 700cpm으로 달랐다; 양성 반응(굵은 활자)은 SI>3 및 δcpm>1000에 따라 정의되었다.
도 12는, 영역 77-100에서 중첩된(nested) MBP 펩티드의 APC에 의한 제시에 대한 DR2:MBP82-100 유전자전이된(transgenic) 마우스로 부터 분리된 T 세포의 반응을 보여준다.
도 13은, 영역 125-148에서 중첩된 MBP 펩티드의 APC에 의한 제시에 대한 T 세포 클론 MS17:A3의 반응을 보여준다.
도 14는 MBP 89-101 서열내의 T 세포 에피토프 인식을 보여준다. 서열내에 3개의 구별되나 중복되는 T 세포 에피토프가 있다: 89-94, 92-98 및 95-101. 아스파르기닐 엔도에페티다제(AEP)의 작용에 의한 잔기 94와 95사이에서의 잠재적 절단이 도시되어 있다.
도 15는 84 내지 94 에피토프에 대해 반응하는 T 세포에 대한 아피토프로서 작용하는 MBP 펩티드 87-96(A) 및 89-101(B)의 능력을 보여준다.
제1 양태로, 본 발명은 관용원성 펩티드를 선별하는 방법에 관한 것이다.
관용(tolerance)
본원에서 사용된 용어 "관용원성"은 관용을 유도할 수 있는 것을 의미한다.
관용은 항원에 대해 반응하지 않는 것이다. 자기 항원에 대한 관용은 면역계의 필수 특징이며, 이것을 상실하는 경우, 자가면역 질환이 발생할 수 있다. 후천적 면역계는 매우 다양한 감염제에 대해 반응할 수 있는 능력을 유지하면서, 자신의 조직내에 함유된 자기 항원의 자가면역 공격을 피할 수 있어야 한다. 이는 흉선에서 아폽토시스(apoptosis) 세포 사멸은 대한 미성숙 T 림프구의 감수성에 의해 크게 제어된다(중추 관용). 그러나, 모든 자기 항원이 흉선에서 발견되는 것은 아니므로, 자가반응성 흉선세포의 사멸이 불완전한 상태이다. 따라서, 말초 조직에서 성숙한 자가반응성 T 림프구에 의해 관용이 획득될 수 있도록 하는 기전도 존재한다(말초 관용). 중추 관용 및 말초 관용의 기전에 관하여는 문헌[Anderton et al (1999) Immunological Reviews 169:123-137]을 참조한다.
관용은, CD4+ T 세포의 적어도 일부에서 아네르기(anergy)의 유도에 의해 생성되거나 이를 특징으로 한다. T 세포를 활성화시키기 위하여, 펩티드는 T 세포로 두개의 시그날을 전달할 수 있는 "전문(professional)" APC와 결합해야 한다. 제1 시그날(시그날 1)은 APC의 세포 표면상의 MHC-펩티드 복합체에 의해 전달되며 TCR을 통해 T 세포에 의해 수령된다. 제2 시그날(시그날 2)은 APC의 표면상의 공동자극성 분자, 예를 들면 CD 80 및 CD86에 의해 전달되며, T 세포의 표면상의 CD28에 의해 수령된다. T 세포가 시그날 2의 부존재하에 시그날 1을 수령하는 경우, 이는 활성화되지 않으며, 실제로 아네르기 상태가 된다고 생각된다. 아네르기성 T 세포는 후속적 항원성 챌린지(challenge)에 곤란하며, 다른 면역 반응을 억제할 수 있다. 아네르기성 T 세포는 T 세포 관용을 매개하는데 관련되어 있다고 생각된다.
이론에 구애받지 않으면서, 본원의 발명자들은, 펩티드가 MHC 분자와 결합되어 제시되기 전에 프로세싱을 요구하는 펩티드는 관용을 유도하지 못하는데, 그 이유는 이들이 성숙한 항원 제시 세포에 의해 처리되어야 하기 때문이라는 것을 예견하였다. 성숙한 항원 제시 세포(예: 대식구, B 세포 및 수지상 세포)는 항원 프로세싱 능력이 있으면서도, 또한 시그날 1 및 2 둘 모두를 T 세포에 전달하여, T 세포 활성화를 유도한다. 한편, 아피토프는 미성숙한 APC 상의 II형 MHC에 결합할 수 있다. 따라서, 이들은 공동자극없이 T 세포에 제시되어, T 세포 아네르기 및 관용을 유도할 것이다.
물론, 아피토프는 또한 성숙한 APC의 세포 표면의 MHC 분자에 결합할 수 있다. 그러나, 면역계는 성숙한 APC 보다도 미성숙한 APC를 보다 다량으로 함유한다(수지상 세포의 10% 미만이 활성화된다는 것이 제시되었다)[참조 문헌: Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295]. 따라서, 아피토프에 대한 디폴트(default) 위치는 활성화 보다도 아네르기/관용일 것이다.
관용이 펩티드 흡입에 의해 유도되는 경우, 항원-특이적 CD4+ T 세포의 증식 능력이 감소된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이들 세포에 의한 IL-2, IFN-γ 및 IL-4의 생성은 하향조절되지만, IL-10의 생성은 증가된다. 펩티드-유도된 관용 상태의 마우스에서 IL-10를 중화시키는 경우, 질환에 대한 감수성이 완전히 복귀된다는 것이 밝혀졌다. 조절 세포 집단이 관용 상태로 지속되어 IL-10을 생성하고 면역 조절을 매개한다는 것이 제안되었다[참조 문헌: Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634].
따라서, 관용의 유도는,
(a) 펩티드가 생체내에서 표적 에피토프로 작용하는 질환에 걸릴 감수성의 감소;
(b) CD4+ T 세포에서 아네르기의 유도(이는 후속적으로 시험관내에서 항원으로 챌리지함으로써 검출될 수 있다);
(c) (i) 증식의 감소;
(ii) IL-2, IFN-γ 및 IL-4 생성의 하향 조절 및
(iii) IL-10 생성의 증가를 포함한, CD4+ 세포 집단에서의 변화를 포함한, 각종 기법에 의해 모니터할 수 있다.
항원 프로세싱 독립적 에피토프(APITOPE: 아피토프)
본 발명의 방법은, 추가 프로세싱 없이 I 또는 II형 MHC 단백질에 결합할 수 있는 펩티드를 선별하는 단계를 포함한다. 이러한 펩티드는 본원에서 "아피토프"(항원 프로세싱 독립적 에피토프: Antigen Processing Independent epiTOPE)로서 공지되었다.
주어진 항원으로 부터 유래된 펩티드의 세포 표면 제시는 무작위적인 것이 아니고 자주 발생하는 소수의 에피토프가 우위를 차지하는 경향이 있다. 특정 펩티드의 우위는 다수의 요인, 예를 들면 MHC 분자와 결합하는 상대적 친화도, APC내 생성의 공간-시간 위치, 분해에 대한 내성에 따라 결정될 것이다. 항원에 대한 에피토프 위계는 면역 반응의 진행에 따라 변화될 수 있으며, 이는 자가-관용 및 자가면역과 중요한 관련성이 있다. 면역우위 결정기 영역이 우수한 관용원이 될것이다. 따라서, 바람직한 태양에서, 본 발명의 아피토프는 우위 에피토프를 기초로 한다.
그러나, 면역우위 펩티드에 대한 1차 면역 반응 후, 에피토프 "전파(Spreading)"가 하위-우위 결정기에 나타난다[참조 문헌: Lehmann et al(1992) Nature 358: 155-157]. 하위-우위 에피토프의 제시는 자가면역을 유발하는데 중요할 수 있다. 따라서 본 발명의 아피토프는 하위우위 에피토프를 기초로 한다.
임의의 주어진 항원의 경우에, 잠재적(cryptic) 에피토프도 또한 존재할 수 있다. 잠재적 에피토프는, 펩티드로서 투여되는 때에 T 세포 반응을 자극할 수 있지만, 항원 전체로서 투여되는 때에는 이러한 반응을 일으키지 못하는 에피토프이다. APC에서 항원을 펩티드로 프로세싱하는 동안, 잠재적 에피토프가 파괴된다. 본 발명은, 펩티드 92-98이 MBP에 대한 잠재적 에피토프임을 밝혀주었다(실시예 2C). 흥미롭게도, 이러한 펩티드 영역내에 아스파르아기닐 엔도펩티다제에 대한 추정상의 절단 부위가 존재하며, 이는 천연의 프로세싱 동안에, 이러한 영역을 함유하는 펩티드가 APC에 의해 전혀 생성되지 않음을 의미할 수 있다.
잠재적 에피토프는, 시험관내에서 추가 프로세싱 없이 MHC 분자에 결합할 수 있으며, 잠재적 에피토프를 인식하는 T 세포에서 아네르기를 유도할 수 있는 시험관내 아피토프로서 작용할 수 있다. 그러나, 이러한 아피토프는 치료학적으로 유용할 것 같지 않은데, 그 이유는 이러한 아피토프가 천연적으로 프로세싱된 항원의 에피토프를 인식하는 T 세포를 관용화(tolerising)할 수 없어야 하기 때문이다.
항원에 대한 에피토프는, APC에 의해 제시된 경우 전체 항원중의 일부인 중복 펩티드(하기참조)에 대한 T 세포 반응을 측정함으로써 동정될 수 있다. 이러한연구 결과 통상적으로 펩티드의 "중첩(nested) 세트"가 생성되며, 특정 T 세포주/클론에 대한 최소 에피토프는 절두된(truncated) 펩티드에 대한 반응을 측정함으로써 평가될 수 있다.
항원의 최소 에피토프가 아피토프로서 작용할 것이라는 것을 추측할 수 없다. 최소 에피토프를 플랭킹하는 아미노산이 MHC에 대한 최적 결합에 요구될 것이라는 것은 당연하다. 아피토프는, 상이한 T 세포 클론의 최소 에피토프들 사이에 미묘한 차이가 존재할 수 있는 가능성을 포괄하도록 설계되어져야 한다.
모든 에피토프에 대한 아피토프를 동정하는 것이 불가능할 수 있다는 것이 강조되어야 한다. 몇몇 에피토프가 엔도솜내의 MHC-적재(loading)에 의존하여 MHC에 결합하므로, 프로세싱을 요구한다는 명백한 증거가 있다[참조 문헌: Viner et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2214-2218]. 이것이, 각 최소 에피토프가 반드시 아피토프로서 작용할 것이라고 추측할 수 없는 또 다른 이유이다.
T 세포 에피토프를 함유하는 펩티드의 동정
주어진 항원내의 T 세포 에피토프를 동정하는 수 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다.
천연적으로 프로세싱된 에피토프는 항원-적재된 APC로 부터 용출된 펩티드의 질량 분광광도측정 분석에 의해 동정될 수 있다. 이들은, 항원을 취하도록 촉진되어지거나, 또는 적당한 유전자로 형질전환시켜 세포내에서 단백질을 생성하도록 되어진 APC이다. 통상적으로, APC를 용액중의 단백질 또는 APC 세포 표면에 적절히표적화된 단백질과 함께 항온처리한다. 37℃에서 항온처리한 후, 세포를 세제로 용해시키고, II형 단백질을 예를 들면 친화성 크로마토그래피로 정제한다. 정제된 MHC를 적당한 화학적 매질(예를 들면 산성 조건)로 처리하면, MHC로 부터 펩티드가 용출된다. 이러한 펩티드 수집물을 분리하고, 당해 프로파일을 동일한 방법으로 처리한 대조군 APC로 부터의 펩티드와 비교한다. 단백질 발현/공급된 세포에 특유한 피크를 분석하고(예를 들면 질량 분광측정에 의함), 당해 펩티드 단편을 동정한다. 이러한 과정은, 항원 프로세싱에 의해 특정 항원으로 부터 생성된 펩티드(통상적으로 "중첩 세트"로서 발견됨)의 범위에 관한 정보를 제공한다.
에피토프를 동정하는 또 다른 방법은, 시험관내 분석에서 항원의 길이중의 일부이고 중복되는 합성 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 예를 들면, 길이가 15개의 아미노산이고 5 또는 10개의 아미노산이 중복되는 펩티드가 사용될 수 있다. 당해 펩티드를, 항원 제시 세포와 T 세포를 포함하는 항원 제시 시스템에서 시험한다. 예를 들면, 항원 제시 시스템은 쥐 비장세포 제제, 편도선으로 부터의 사람 세포 제제 또는 PBMC 제제일 수 있다. 달리, 항원 제시 시스템은 특정 T 세포주/클론 및/또는 특정 항원 제시 세포 유형을 포함할 수 있다.
T 세포 활성화는 T 세포 증식(예를 들면,3H-티미딘 도입을 이용함) 또는 사이토킨 생성을 통해 측정될 수 있다. TH1-형 CD4+ T 세포의 활성화는, 예를 들면 IFNγ 생성을 통해 검출될 수 있는데, 이는 ELISPOT 분석과 같은 표준 기법에 의해 검출될 수 있다.
통상적으로, 중복 펩티드 연구는 에피토프가 위치하는 항원의 영역을 알려준다. 특정 T 세포에 대한 최소 에피토프는 절두된 펩티드에 대한 반응을 측정하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 중복 라이브러리에서 잔기 1 내지 15를 포함하는 펩티드에 대한 반응이 수득되면, 양쪽 말단이 절단된 셋트(즉, 1-14, 1-13, 1-12 등, 및 2-15, 3-15, 4-15 등)를 사용하여 최소 에피토프를 동정할 수 있다.
본원의 발명자들에 의하면, 시험관내 분석(특히 T 세포주를 사용한 것)을 사용한 항원의 면역우위 영역의 동정이 펩티드 반응성의 편중 패턴을 나타낼 것으로 예견되었다. 실시예에 기술된 MBP 에피토프를 동정하는 연구에서, 이들 발명자는, MS 환자와 건강한 개인으로 부터의 PBMC의 증식을 중복 펩티드 라이브러리에 대해 측정하는 속도론적 반응 분석을 사용한다. 이러한 분석은, 정상 개인과 MS 환자로 부터의 T 세포가 정제된 단백질 항원에 대해 유사하게 반응하지만, 이들이 MBP의 서열을 기초로 한 펩티드에 대해 상이하게 반응한다는 사실의 발견을 토대로 한 것이다. MS 환자로 부터의 T 세포가, 정상의 건강한 공여자의 경우와 비교하여, 펩티드 항원에 대해 보다 다량으로 보다 신속한 속도론으로 반응한다. 이는, 특정 환자에서 특정 시간에 반응하는 에피토프의 스크리닝 및 동정을 가능케한다. 본원에 기술된 연구에서, 이러한 접근법은 표준 기법을 사용하여 동정되지 않은 에피토프-함유 영역을 다수 밝혀내었다. 또한, T 세포 인식이, 일 시점에서 발생하고, 복귀하고, 후에 재발하는 순환적 패턴을 나타냄이 밝혀졌다.
본원의 발명자에 의해 기술된 속도론적 분석은 유용한 도구를 제공하는데, 그 이유는 이를 통해 환자에게서 특정 시점에 반응하는 에피토프를 밝혀낼 수 있기때문이다. 이러한 정보를, (만약 존재한다면) 관련 에피토프에 대한 아피토프를 동정하고 투여하여 특정 환자에 대한 치료학적 아피토프-투여법을 조정하는데 사용할 수 있다. 또한, 이러한 정보를 통해, 질환의 진행에 관한 일반적 패턴을 예견할 수 있으므로, 질환 과정의 일정 단계에 제시될 가능성이 있는 에피토프에 대한 아피토프를 포함하도록 치료학적 조성물을 설계할 수 있다.
항원 프로세싱 독립적 제시 시스템(APIPS)
일단 에피토프가 동정되면, 다음 단계는 이것이 아피토프로서 작용하는 지의 여부를 연구하는 것이다.
아피토프는, 항원 프로세싱할 필요 없이 T 세포에 제시되어져야 한다. T 세포 에피토프를 함유하는 펩티드를 동정하여, 프로세싱 부존재 시스템을 사용하여 아피토프를 동정할 수 있다. 절두된 펩티드 및 펩티드 동족체를, 항원 프로세싱 독립적 제시 시스템(APIPS)를 사용하여 활성화를 대해 시험할 수 있다.
APIPS의 예로는, a) 고정된 APC (CD28에 대한 항체를 포함하거나 포함하지 않음); b) I 또는 II형 MHC 분자를 함유하는 지질 막 (CD28에 대한 항체를 포함하거나 포함하지 않음); 및 c) 플레이트-결합된 형태의 정제된 천연 또는 재조합 MHC (CD28에 대한 항체를 포함하거나 포함하지 않음)가 포함된다.
예를 들면, 폴리펩티드내의 최소 에피토프를 조사하기 위한 연구에서, 절두된 펩티드에 대한 반응을 측정하여 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 고정된 APC를 사용하는 것이 공지되어 있다[참조 문헌: Fairchild et al (1996) Int. Immunol.8: 1035-1043]. APC는, 예를 들면 포름알데히드(통상적으로 파라포름알데히드) 또는 글루타르알데히드를 사용하여 고정할 수 있다.
지질 막(이는 평면 막 또는 리포좀일 수 있다)은, 인공 지질을 사용하여 제조할 수 있거나, APC로 부터의 원형질막/마이크로솜 분획일 수 있다.
사용중에, APIPS를 조직 배양 플레이트의 웰에 적용시킬 수 있다. 이어서, 펩티드 항원을 첨가하고, APIPS의 MHC 부분에 대한 당해 펩티드의 결합을 선별된 T 세포주 또는 클론을 첨가하여 검출한다. T 세포주 또는 클론의 활성화는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면3H-티미딘 도입 또는 사이토킨 분비를 통해 측정될 수 있다.
펩티드
본 발명의 제2 양태는 펩티드에 관한 것이다.
용어 "펩티드"는, 인접 아미노산의 α-아미노 그룹과 카복실 그룹사이의 펩티드 결합에 의해 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 통상적으로 연결된, 전형적으로 L-아미노산의 일련의 잔기를 의미하는 통상적인 의미로 사용된다. 당해 용어는 변형된 펩티드 및 합성 펩티드 동족체를 포함한다.
본 발명의 펩티드는, 추가의 프로세싱 없이 I 또는 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 길이일 수 있다.
I형 MHC 분자에 결합하는 펩티드는 통상적으로 7 내지 13, 보다 통상적으로8 내지 10개의 아미노산 길이를 가진다. 펩티드의 결합은, 펩티드의 주쇄중의 원자들과 모든 I형 MHC 분자의 펩티드-결합 홈내의 불변 부위 사이의 접촉에 의해 이의 두 말단에서 안정화된다. 펩티드의 아미노와 카복시 말단부에 결합하는 상기 홈의 두 말단 모두에 불변 부위가 존재한다. 펩티드 길이의 변화는, 펩티드 주쇄중, 종종 프롤린 또는 글리신 잔기(이들은 요구된 유연성을 허용한다)에서의 비틀림(kinking)에 의해 수용된다.
II형 MHC 분자에 결합하는 펩티드는 전형적으로 8 내지 20개의 아미노산, 보다 전형적으로 10 내지 17개 아미노산 길이를 가지며, 더 길 수도 있다. 이들 펩티드는, 두 말단 모두에서 개방되어 있는 II형 MHC 펩티드-결합 홈(I형 MHC 펩티드-결합 홈과 다름)을 따라 신장된 형태로 존재한다. 당해 펩티드는, 주로, 펩티드-결합 홈에 놓여있는 보존 잔기와 주쇄 원자간의 접촉에 의해 적소에 유지된다.
본 발명의 펩티드는 화학적 방법을 사용하여 제조할 수 있다[참조 문헌: Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin]. 예를 들면, 펩티드는 고체상 기법[참조 문헌: Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204]으로 합성하고, 수지로 부터 잘라내고, 제조용(preparative) 고성능 액체 크로마토그래피로 정제한다[참조 문헌: Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY]. 자동 합성은, 예를 들면 제조자에 의해 제공된 지침에 따라 ABI 43 1 A 펩티드 합성기(Peptide Synthesizer) (Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다.
달리, 펩티드는 재조합 수단에 의해 제조할 수 있거나, 또는 장쇄의 폴리펩티드로 부터 절단하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 당해 펩티드는 표적 항원으로 부터 절단하여 수득할 수 있다. 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석(예: 에드만(Edman) 분해 공정)에 의해 확인될 수 있다.
바람직한 태양으로, 당해 펩티드는 표적 항원으로 부터 유래될 수 있다. 표적 항원은, APC에 의해 프로세싱되고 질환 과정 동안 T 세포에 의해 인식되는 분자(예를 들면 단백질 또는 당단백질)이다. 물론, 표적 항원은 표적 질환에 따라 결정될 것이다. 바람직하게는, 펩티드는 APC에 의한 항원의 천연 프로세싱에 의해 생성되는 항원의 단편으로 부터 유래될 수 있다.
실제 사용하기 위하여는, 펩티드가 보여주어야 하는 여러 다른 특징이 있다. 예를 들면, 펩티드는 생체내에서 이의 사용을 허용하는 농도에서 가용성이어야 한다. 바람직하게는, 당해 펩티드는 0.5mg/ml 이하의 농도에서 가용성이어야 하고, 보다 바람직하게는 1mg/ml 이하의 농도에서 가용성이어야 하고, 가장 바람직하게는 5mg/ml 이하의 농도에서 가용성이어야 한다.
비내 투여의 경우, 현재의 방법을 사용하여 섭취할 수 있는 최대 투여 용량은 외비공 당 약 200㎕이다. 펩티드가 1mg/ml에서 가용성인 경우, 각 외비공에 대해 중복 투여하여 환자에게 800㎍을 투여할 수 있다. 모든 경우에 각각의 투여에서 5mg을 초과하는 것은 통상적인 것은 아니다.
또한, 펩티드가 치료학적으로 유용하도록 생체내에서 충분히 안정한 것도 중요하다. 본원의 발명자들은, 생체내에서 투여 30분 후 시험 펩티드의 총량이 약50%로 저하되고, 투여 4시간 후 총량은 약 30%로 저하되지만, 5일 후에도 펩티드는 여전히 검출될 수 있다(약 5%)는 것을 발견하였다. 생체내에서 펩티드의 반감기는 10분 이상, 바람직하게는 30분 이상, 보다 바람직하게는 4시간 이상, 가장 바람직하게는 24시간 이상이어야 한다.
본원의 발명자들은, 비내 투여 후, 배수 림프절(draining lymph node)에서 펩티드의 양은 투여한지 약 4시간 째에 정점에 이르나, 5일 후에도 펩티드가 검출될 수 있다(약 5% 최대 수준). 바람직하게는, 당해 펩티드가 충분히 안정하여, 치료 효과를 발휘하기에 충분히 장기간 동안 배수 림프절에서 치료학적 활성 농도로 존재할 수 있다.
또한, 당해 펩티드는 생체내에서 양호한 생체이용율을 입증하여야 한다. 당해 펩티드는 생체내에서 형태를 유지하여, 적당한 장애없이 세포 표면상의 MHC 분자에 결합될 수 있다.
표적 질환
일 태양에서, 본 발명의 제2 양상의 펩티드는 질환의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 것이다.
II형 MHC에 대한 아피토프는, CD4+ T 세포 반응에 의해 매개되는 질환에서 특히 유용할 수 있다. 예를 들면, 부적당하거나 과도한 CD4+ T 세포 반응에 의해 확립되거나 유지되는 질환을 들 수 있다.
이러한 펩티드는 과민성 질환의 치료에 특히 유용할 수 있다. 과민성 반응으로는, (i) 무독성 외래 물질에 대한 부적당한 반응으로 부터 비롯되는 알레르기; (ii) 자기 조직 항원에 대한 반응으로 부터 비롯되는 자가면역 질환; 및 (iii) 이식물에 대한 반응으로 부터 비롯되는 이식편 거부반응이 포함된다.
알레르기의 예로는, 건초 열, 외인성 천식, 곤충에 물리거나 쏘임에 의한 알레르기, 음식 및 약물 알레르기, 알레르기성 비염, 기관지 천식 만성 기관지염, 아나팔락시스 증후군, 두드러기, 맥관부종, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 결절홍반, 다형홍반, 스티븐-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 비성결막염, 결막염, 피부괴사세정맥염, 염증성 폐질환 및 물집성 피부 질환이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
자가면역 질환의 예로는, 류마티스성 관절염(RA), 중증근육무력증(MG), 다발성 경화증(MS), 전신성홍반루프스(SLE), 자가면역 갑상선염(하시모토 갑상선염), 그레브(Graves) 질환, 염증성 장 질환, 자가면역 포도막망막염, 다발근육염, 특정 유형의 당뇨병, 전신 맥관염, 다발근육염-피부근육염, 전신 경화증(피부경화증), 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 강직척수염 및 관련 척추관절병증, 류마티스열, 과민성 폐염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 무기물 폐먼지증, 사르코이드증, 자가면역 용혈 빈혈, 면역학적 혈소판 질환, 및 한랭섬유소원혈증과 자가 면역 다발성내분비병증(polyendocrinpathy)과 같은 한랭병증이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
신장, 간, 심장, 폐, 피부, 각막 및 골수를 포함한 각종 조직이 통상적으로 임상 의학에서 이식된다. 현재, 각막과 일부 골수 이식을 제외한 모든 이식은 통상적으로 장기간의 면역억제를 필요로 한다.
이러한 양태의 발명의 일 태양으로, 당해 펩티드는 당뇨병의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 것이다. 이러한 태양에서, 당해 펩티드는 표적 항원 IA2로 부터 유래될 수 있다.
이러한 양태의 또 다른 태양으로, 당해 펩티드는 다발성 경화증(MS)의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 것이다. 다발성 경화증(MS)은, CNS 백색질 전반에 걸쳐 분포되고 다양한 부위 및 시기에 나타나는 다발성 말이집탈락 병소를 특징으로 하는 만성 염증성 질환이다[참조 문헌: McFarlin and McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 and 1246-1251]. MS는 자기반응성 T 세포에 의해 매개된다고 생각된다.
이러한 태양에서, 당해 펩티드는 자가항원, 특히 미엘린 염기성 단백질(MBP) 또는 단백지질(proteolipid) 단백질(PLP)중의 하나로 부터 유래될 수 있다. MBP가 아마도 PLP 보다 더욱 적당한데, 그 이유는 PLP가 고도로 소수성이고, 이로 부터 유래되는 펩티드가 서로 뭉치는 경향이 있기 때문이다. MBP는 면역원이고 MBP-특이적 T 림프구는 동물에서 뇌염원 활성을 가진다[참조 문헌: Segal et al., 1994 J. Neuroimmunol. 51: 7-19; Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol 42: 187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 317: 355-8].
바람직한 태양에서, 당해 펩티드는 MBP의 면역우위 영역, 즉 1-24, 30-54, 75-99, 90-114, 105-129, 120-144, 135-159 및 150-170중의 하나로 부터 유래될 수 있다.
특히 바람직한 태양에서, 당해 펩티드는 본원의 발명자에 의해 아피토프로서 작용하는 것이 밝혀진, 다음의 펩티드를 포함한 MBP 펩티드중의 하나로 부터 선택된다: 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 및 133-147.
I형 MHC에 대한 아피토프는, 예를 들면 관용원 처럼 항-바이러스 CD8+ 반응을 변형시키는데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
본원의 발명자들은, "방관자 억제"에도 불구하고, 관용을 효과적으로 유도하기 위하여 수 많은 상이한 T 세포 클론을 표적화할 필요가 있다는 것을 예견하였다. 따라서, 질환을 예방하거나 치료하기 위하여, 다수의 펩티드를 개인에게 투여할 수 있다.
제3 양태로서, 본 발명은 다수의 아피토프를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은, 예를 들면 2 내지 50개, 바람직하게는 2 내지 15개 아피토프를 포함할 수 있다. 당해 아피토프는 동일하거나 상이한 표적 항원(들)로 부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 아피토프는 추가 프로세싱 없이 모두 I형 MHC에 결합하거나 모두 II형 MHC에 결합할 수 있다. 바람직한 태양에서, 약제학적 조성물중의 모든 아피토프는 추가 프로세싱 없이 I형 또는 II형 MHC에 결합할 수 있다.
약제학적 조성물은, 일부 또는 각각의 아피토프가 동시적, 독립적 또는 연속적 투여를 위해 별도로 제공되어지는 키트 형태 일 수 있다.
달리 (또는 추가로), 약제학적 조성물(또는 임의의 이의 일부)은 수회 투여될 수 있으며, 이때 각 투여량은 개별적으로 패키징될 수 있다.
당해 약제학적 조성물은, 당해 또는 각각의 아피토프의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 포함하고 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물에서, 당해 또는 각각의 아피토프는 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 피복제(들) 또는 가용화제(들)과 혼합될 수 있다.
투여
당해 펩티드는 애주번트의 부존재하에 가용성 형태로 투여되어야 한다.
바람직하게는, 당해 펩티드는 점막 경로로 투여된다.
연구를 통해, 펩티드를 가용성 형태로 복강내(i.p.), 정맥내(i.v.), 비내(i.n.) 또는 경구로 투여하는 경우, 당해 펩티드가 T 세포 관용을 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다[참조 문헌: 상기한 Anderton and Wraith (1998); Liu and Wraith (1995) as above; Metzler and Wraith (1999) Immunology 97: 257-263].
바람직하게는, 당해 펩티드는 비내 투여된다.
마우스에서의 연구를 통해, 관용을 유도하는데 요구되는 펩티드 투여의 지속기간은 수령체에서의 T 세포의 전구체 빈도에 따라 결정될 것이라는 것이 입증되었다[참조 문헌: 상기한 Burkhart et al (1999)]. 다수의 실험적 연구에서, 펩티드의 반복 투여가 관용을 유도하는데 요구된다는 것이 밝혀졌다[참조 문헌: 상기한 Burkhart et al (1999)]. 따라서, 펩티드의 정확한 투여량 및 투여 회수는 개인에 따라 결정될 것이나, 바람직한 태양에서 수회 투여된다.
다수의 펩티드를 동시에 투여하는 경우, 이들은 일회 또는 수회 투여로 투여하기에 적합한 "칵테일"의 형태일 수 있다. 달리, 수회 투여하는 것이 바람직할 수 있으나, 각 투여량 간의 펩티드의 상대 농도는 다를 수 있다.
바람직한 태양에서, "투여량 단계적확대" 프로토콜이 사용될 수 있으며, 이 경우에, 농도를 증가시키면서 환자에게 수회 투여한다. 이러한 접근법은, 예를 들면 벌 독 알레르기에 대한 면역치료학적 적용에서 포스포리파제 A2 펩티드에 대해 사용되었다[참조 문헌: Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101: 747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102: 98-106].
아래의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이나, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니된다. 본 발명은 특히 이들 실시예에 기술된 구체적 태양에 관한 것이다.
실시예 1: MBP에서의 T 세포의 동정
재료 및 방법
항원
사람 MBP를 문헌[Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2: 139]에 기술된 바에 따라 뇌 백색질로 부터 수득하고, 이의 순도를 SDS-PAGE로 분석한다. MBP 및 결핵균-정제된 단백질 유도체(PPD) (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey)를, 앞서 측정된 최적 농도로 증식 분석에서 사용한다: 각 항원에 대한 최적 농도는 50㎍/ml이다. 전체 MBP 분자의 일부인 15량체의 중복 펩티드 일단을, Abimed AMS 422 다중 펩티드 합성기(Abimed, Langenfeld, Germany)에서 표준 F-moc 화학을 사용하여 합성한다. 각 펩티드에서 5개의 아미노산은 교체되고 10개의 아미노산은 중복된다. 본원의 발명자는 3종의 그룹으로 수집된 33개의 펩티드를 수득하고, 수집물을 시험관내에서 각 펩티드가 16.6㎍/ml의 농도로 존재하도록 50㎍/ml의 최적 농도에서 시험한다.
환자 및 대조군 피험자
이러한 연구의 피험자는, 임상적으로 확정적인 MS이거나 실험상 지지된 확정적인 MS[참조 문헌: Poser et al., 1983]인 연령 범위가 29 내지 51세인 12명의 환자로 이루어진다. 12명의 환자중 8명에 대하여는 인터페론-β를 시용했으나, 모든 다른 MS 환자는 당해 연구를 개시하기 전 3개월 이상 동안 코르티코스테로이드 치료를 받지 않았다. 대조군은 연령 범위가 25 내지 55세인 건강한 13명의 개인으로 이루어지고, 혈액을 샘플을 채취하기 전 3개월 이상 동안 아무도 면역억제 치료를받지 않았다.
조직 배양 배지
20mM HEPES (Sigma, Poole, UK), 페니실린(1OOU/ml), 스트렙토마이신 설페이트(100mg/ml), 및 4mM L-글루타민 (모두 스코틀랜드 페이즐리(Paisley)에 소재하는 Life Technologies로 부터 제공됨)이 보충된 RPMI-1640 배지를 조직 배양 배지로서 사용한다. 림프계 세포 및 TCL을 세척하기 위하여, 혈청이 부존재하는 배지를 사용한다. 모든 배양 조건 및 분석을 위하여, 배지에 10% 열 불활성화 자가 혈장을 보충한다.
배양 조건 및 T 세포 증식 분석
고지에 입각한 동의서를 받은 후, 각 피험자로 부터 정맥천자(venepuncture)에 의해 시트레이트화 말초혈(50 내지 100ml)을 채혈한다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를, Histopaque-1077(Sigma, Poole, UK)로 밀도 원심분리에 의해 혈액으로 부터 분리하고, PPD, MBP 또는 MBP의 펩티드를 함유하고 ml당 1 x106개 세포의 농도인 24-웰 조직 배양 플레이트(Nunc International, Costar, Corning Inc. New York, USA)에서 1.5ml 용량으로 배양한다. 당해 플레이트를, 5% CO2/95% 공기의 가습 대기하에서 37℃로 항온처리한다. 5일 내지 14일 사이에, 100㎕의 분액을 각 배양물로 부터 중복하여 회수하여, 96-웰의 환저 미세역가 플레이트에 옮기고, 0.4μCi[3H]-티미딘(Amersham International, Amersham, UK)로 펄스처리한다. 18시간 후, Mach 111 수거기(harvester) 96(Tomtec, Orange, New Jersey, USA)를 사용하여 세포를 수거하여 유리 섬유 매트(LKB-Wallac, Turku, Finland)위에 놓는다. [3H]-티미딘 도입을, 마이크로베타 액체 섬광 계수기(LKB-Wallac)를 사용하여 측정한다. 항원을 함유하는 시험 웰은, δcpm > 1000이고 자극 지수(SI) > 3인 경우에 양성인 것으로 간주된다(이 경우에, SI는 CPM 항원 함유 배양물/항원이 부존재하는 CPM 배양물 이다).
T 세포주 및 T 세포 클론의 생성
MBP-특이적 T 세포주(TCL)를 8명의 MS 환자 및 2명의 건강한 대조군 공여자로 부터 수득한다. 각 피험자로 부터의 PBMC를 상기한 바와 같이 분리하고, MBP(50㎍/ml)의 존재하에 6-웰 플레이트에서 1 x 106개 세포/ml로 플레이팅한다; 각 피험자로 부터의 PBMC 부분을 후속적 재자극을 위해 통상적으로 동결 보관한다. 7일 후, 당해 세포에 2% IL-2(Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK)을 함유하는 신선한 배지를 공급하고, 배양 12일 째에 모든 세포를, 항원 제시 세포(APC)의 공급원으로서 항원, IL-2 및 방사선조사된(2500 Rad) 자가 PBMC로, 1개 T 세포: 5개 APC의 세포 비로 재자극한다. 세포를 3 내지 4일 마다 IL-2에서 증대시키고, 14일 째에 항원, IL-2 및 PBMC로 상기한 바와 같이 재자극한다. 재자극 제1일에, 세포를 MBP에 대한 특이적 증식에 대하여 조사한다. 요약하면, 2x104개 T 세포 및 1x105개 방사선조사된 자가 PBMC를, MBP의 존재하에 96-웰 환저 플레이트에서 3회 배양한다. 세포를 2일간 배양하고, 배양의 최종 18시간 동안에 0.4μCi/웰로 (3H)-티미딘으로 펄스처리한다. 이어서, 세포를 상기한 바와 같이 수거하고, δcpm > 1000이고 SI > 3인 경우에 TCL는 MBP-특이적인 것으로 간주된다.
3회의 재자극/증대 주기 후, TCL을 APC로서 방사선조사된 자가 PBMC의 존재하에서 PHA(Sigma, Poole, Dorset, UK)를 사용하여 클로닝한다. T 세포를 제한 희석 조건하에서 0.1개 세포/웰, 0.3개 세포/웰 및 1개 세포/웰로 플레이팅하고, 1x104개의 방사선조사된 PBMC, 5㎍/ml PHA 및 2% IL-2를 함유하는 Terasaki 플레이트(Nunc International, Costar)에서 배양한다. 10 내지 12일 후, 성장-양성 웰을, 1x105개의 방사선조사된 PBMC, 5㎍/ml PHA 및 IL-2를 사용하여, 96-웰 환저 플레이트상에서 증대시킨다. 3일 후, 웰에 IL-2를 함유하는 신선한 배지를 공급하고, 7일 째에 클론을, 5x105개의 방사선조사된 PBMC, PHA 및 IL-2를 사용하여, 48-웰 플레이트상에서 증대시키고; 이 시점에서 클론을, MBP에 대한 특이적 반응에 관하여 증식 분석에서 시험한다. MBP-특이적 클론을, 1x106개의 방사선조사된 PBMC와 함께 PHA 또는 Dynabead(Dynal, UK) 및 IL-2를 사용하여, 24-웰 플레이트상에서 일주일 후 증대시킨다. 당해 클론을 7 내지 10일의 재자극/증대 주기를 사용하여,본질적으로 상기한 바와 같이 24-웰 플레이트에서 유지시킨다. T 세포 클론(TCC)이 일단의 MBP 펩티드를 인식할 수 있는 능력을 상기한 바와 같이 증식 분석에 의해 시험한다.
결과
MS 환자 및 건강한 개인중에서 MBP-펩티드 인식
본원의 발명자들은, MS 환자 및 건강한 피험자로 부터의 PBMC가 전체 길이의 사람 MBP 중의 일부인 일단의 중복하는 15량체의 합성 펩티드에 반응할 수 있는 능력에 대하여 시험하는 속도론적 반응 분석을 사용한다. 각 배양물로 부터의 PBMC의 증식 반응을 2주의 기간에 걸쳐 5회 시점에서 조사하고, MBP 및 펩티드에 대한 반응의 속도론적 프로파일을 PPD에 대한 반응과 비교하는데, 후자의 반응은 제2 반응/기억 항원을 나타낸다. 인터페론-β를 사용한 환자와 아무런 치료도 받지 않은 환자 사이에서 MBP 및/또는 펩티드에 대한 PBMC 반응에서 어떠한 유의적 차이가 발견되지 않았다(자료는 제시되지 않음). MS 환자와 건강한 대조군 모두에서 MBP에 대한 반응은 PPD에 대한 반응 보다 나중에 정점에 도달하였으므로, 비-회상(recall) 항원에 대한 반응의 속도론적 특징을 따른다. 도 1은 MS 환자 및 건강한 개인에게서 PPD 및 MBP에 대한 속도론적 반응 프로파일의 전형적인 예를 보여준다.
도 2에 도시된 바와 같이, MS 환자에 의해 가장 통상적으로 인식되는 두개의 펩티드는 90-114 및 75-99 (각각 12명의 환자당 6명)이고, 그 다음으로 영역 30-54, 135-159 및 150-170 (12명의 환자당 5명), 및 1-24 및 105-129(12명의 환자당 4명)이 따른다. 3명의 환자는 아미노산 15-39 및 120-144에 반응한다. 두명의 환자는 45-69를 인식하고, MS 환자중 아무도 영역 60-84에 반응하지 않는다.
도 10에 따르면, 환자가 전부 HLA-DR2 양성인 경우에, MS 환자에 의해 가장 통상적으로 인식되는 두개의 펩티드는 90-114 및 75-99 (각각 11명의 환자당 6명)이고, 그 다음으로 영역 120-144, 135-159 및 150-170 (11명의 환자당 5명), 및 1-24, 15-39, 30-54 및 105-129(11명의 환자당 4명)이 따른다. 3명의 환자는 아미노산 45-69에 반응하고, 또한 MS 환자중 아무도 영역 60-84에 반응하지 않는다.
대조적으로, 건강한 개인은 상당히 더 적은 펩티드를 인식하는데, 예컨대 2명의 대조군 피험자만이 2개 이상의 펩티드에 반응한다(C 및 J; 도 3). 대조군 개인 C 및 J 둘만이 상기 그룹의 환자에 의해 제시되지 않은 아미노산 60-84 영역을 인식한다. 흥미롭게도, 이들 개인 둘 모두 DRB1*0701 대립유전자를 발현한다. 영역 45-69 및 105-129는 건강한 공여자 누구에 의해서도 인식되지 않는 반면, 75-99 및 150-170은 4명의 건강한 개인에 의해 인식되며, 135-159는 3명의 건강한 개인에 의해 인식되며, 1-24, 30-54, 60-84 및 120-144는 2명의 건강한 개인에 의해 인식되며, 15-39 및 90-114는 1명의 개인에 의해 인식된다. 종합하여, 8/13명의 건강한 개인은 어떠한 중복 펩티드에도 반응하지 않는 반면, 1/12명의 MS 환자(MS 19)만이 일관되게 MBP 펩티드를 인식하지 못한다. 명백하게, 이러한 환자는 MBP 단백질에 대해 반응하지 않는다는 점에서 특유하다.
또한, 도 11은 MBP 펩티드에 대한 건강한 개인의 반응을 보여준다. 이러한 연구에서, 1명의 대조군 피험자만이 2개 이상의 펩티드와 반응한다(N11). N11은 또한 상기 그룹의 환자에 의해 제시되지 않은 아미노산 60-84 영역을 인식하는 유일한 개인이다. 영역 15-39, 45-69 및 105-129는 건강한 공여자에 누구에 의해서도 인식되지 않는 반면, 120-144 및 135-159는 2명의 건강한 개인에 의해 인식되며, 1-24, 30-54, 60-84, 75-99 및 90-114는 1명의 개인에 의해 인식된다. 종합하여, 9/12명의 건강한 개인은 어떠한 중복 펩티드에도 반응하지 않는다.
종합하면, MBP 및/또는 펩티드에 대한 반응이 정점에 도달한 날은 건강한 개인과 환자 사이에 크게 다르지 않으며, 두 그룹 모두에서의 속도록적 반응은 1차 항원성 반응의 경우와 유사하였다. 또한, MBP 및 펩티드에 대한 반응의 정도는 환자와 건강한 개인 사이에 다르지 않았다.
시간에 따른
MBP-펩티드 인식 변화
MS 환자가 광범위한 MBP 펩티드에 반응한다는 것을 정립한 본원의 발명자들은, 동일한 개인들에서의 PBMC 인식이 약 4 내지 12개월의 과정 동안에 집중되고 안정한지 여부에 대하여 연구하기로 결정했다. 도 2, 10 및 3에 제시된 바와 같이, MS 환자 및 건강한 개인은 모두 동일한 펩티드 인식 패턴을 나타내지 않았다.
도 4는 2회의 상이한 시점에서 다중 펩티드에 반응하는 MS 환자(MS 49)의 예를 보여주지만, 4개월 후 측정된 제2 시점 동안의 인식 프로파일은 현저하게 상이하다. 즉, 제2 반응속도록적 분석에서 아미노산 15-39, 30-54 및 150-170에 대한PBMC 반응은 지속되는 반면, 75-99 및 105-129에 대한 반응은 복귀하고, 영역 90-114 및 135-159로 이동한다.
도 5(MS 60)는, 광범위한 에피토프 반응이 4개월의 기간에 걸친 집중된 반응으로 복귀하는 환자의 예를 보여준다. 제2 시점 부근에서 시험된 건강한 개인은 어떠한 펩티드에도 반응하지 않는다(도 3).
종합하면, MS 환자가 인식 패턴 셋트를 나타내지 않는다는 결과가 입증된다. 각 환자내에서, MS 49 환자에서 보여진 바와 같이, 여러 펩티드에 대한 PBMC 반응이 지속되고, 복귀하고, MBP의 새로운 영역으로 이동할 수 있다.
펩티드 인식의 주기화
펩티드에 대한 PBMC 반응을 12개월의 기간에 걸쳐 3회 이상의 상이한 시점에서 분석하는 경우, 특정 환자에서 에피토프 인식이 새로운 펩티드 영역에 대해 비가역적으로 이동하는 것 보다도 변동하는 것으로 보인다. 예를 들면, 도 2 및 10에 도시된 바와 같이, MS 60 환자는 아미노산 120-144 및 135-159에 대해 인식의 주기적 패턴을 나타낸다; 즉 잔기 120-144 및 135-159는 시험된 제1 시점에서 다수 인식되고, 이들 2개 영역에 대한 반응은 제2 시점에서 복귀하고, 4개월 후 측정된 제3 시점에서 재현된다. 유사하게, MS 41 환자의 반응속도론적 프로파일은, 아미노산 135-199의 인식이 여러 시점에 걸쳐 변동된다는 것을 입증한다(도 2 및 10 참조).
건강한 대조군 그룹(도 3)중에서, 한 개인(M)은 영역 75-99 및 135-199에 대해 변동 반응을 나타내고, 제2 개인(F)은 분석된 3회의 시점중 2회에서 75-99를 인식하는 반면, 제3 피험자(D)는 잔기 15-39에 대해 주기적 반응을 보인다.
MBP에 대한 반응의 세밀한 지도작성
TCC를 8명의 MS 환자 및 2명의 건강한 개인으로 부터 수득하고, 이를 사용하여 속도론적 반응 분석에서 동정된 펩티드 영역의 세밀한 특이성을 명확히한다. 각 TCC의 특이성은, 일단의 15량체 펩티드에 대한 이의 증식 반응에 의해 시험한다. 클론 SD:A7은 영역 1-24를 인식하고, 이 영역내에서 이러한 TCC는 아미노산 5-19에 반응한다. 영역 30-45는 4종의 클론(MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49: B6)에 의해 인식되고, 이 영역내의 에피토프는 30-44이다. MS 환자로 부터의 1종의 클론(MS39:D7)은 펩티드 60-74를 인식하며, 흥미롭게도, 한 명의 건강한 개인이 본 발명의 속도론적 반응 분석에서 상기 영역(60-84)에 반응한다. 5종의 클론(MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8)이 영역 75-99중에 함유된 아미노산 83-99을 인식한다. 한명의 환자는 105-129 수집물내에 함유된 아미노산 110-124(MS60:A2, MS60:B3)에 대해 특이적인 TCC를 생성하며, 동일한 환자로 부터의 또 다른 TCC는 120-144 영역내에서 발견된 130-144((MS60:E1)에 특이적이다. 5명의 개인은 영역 135-159내의 에피토프를 인식하는 클론을 생성하며: MS60:F7, MS60: D1, MS59:F1 및 N5:19는 아미노산 140-154를 인식하며; MS57:A1은 140-149에 특이적이며, TCC MS17:A3는 서열 130-144에 반응한다. 이러한 일단의 클론으로 부터, MBP의 139-159 영역내에 2개 이상의 T 세포 에피토프가 존재함이 분명히 입증된다.최종적으로, 영역 150-170은 아미노산 156-169에 대해 특이적인 2종의 클론에 의해 인식된다. 모든 TCC의 특이성은 도 6에 요약되어 있다.
실시예 2: MBP에서 아피토프의 동정
재료 및 방법
APIPS를 사용한 항원-제시 분석
T 세포 클론에 대한 펩티드의 제시는 증식에 의해 측정한다. APC를 0.5% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰당 1x105개 세포로 플레이팅한다. T 세포 클론을, 다양한 농도의 펩티드의 존재하에 웰당 2x104개 세포로 플레이팅한다. 37℃에서 48시간 동안 항온처리한 후, 증식을 16 내지 20시간에 걸친 [3H]티미딘 도입에 의해 측정한다. 결과를, T 세포가 살아있는 APC에 의해 제시된 에피토프에 반응할 수 있는 능력과 비교한다.
DR2:MBP82-100 유전자전이된(transgenic) 마우스로 부터 분리된 T 세포에 대한 펩티드의 제시는 APC를 웰당 5x105개 세포로 플레이팅하는 점을 제외하고는 상기한 바와 실질적으로 동일하며, T 세포를 웰당 1x105개 세포로 플레이팅하고, [3H]티미딘을 첨가하기 전에 72시간 동안 항온처리를 수행할 수 있다.
결과
상기 실험에서, 앞의 실시예에서 에피토프로서 동정된 펩티드를, APIPS를 사용하여 이들이 제시될 수 있는 능력에 대해 연구한다. 이 결과는 도 7b에 제시된다. 지금까지 연구된 5종의 에피토프중, 4종이 아피토프인 것으로 밝혀졌으며(30-44, 80-94, 110-124 및 130-144), 1종은 에피토프로서 작용하지만, 아피토프가 아닌 것으로 밝혀졌다(156-170).
실시예 2A: MBP 펩티드 30-44, 110-124, 130-144 및 156-170의 연구
각종 MBP 펩티드가 아피토프인지를 연구하기 위하여, 고정된 APC에 의해 T 세포에 대해 제시될 수 있는 이들의 능력을 연구한다. 살아있거나 예비-펄스처리된 Mgar (HLA-DR2+ve) 세포를 혈청중의 펩티드로 또는 혈청 단독으로 3.5시간 동안 예비-펄스처리한다. 이어서, 과잉 펩티드를 세포로 부터 제거하고, 적당한 T 세포 클론을 첨가한다. T 세포 증식 반응은3H-티미딘 흡수에 의해 측정한다.
도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 펩티드 30-44(도 8A), 110-124(도 8B), 및 130-144(도 9A)는 추가 프로세싱 없이 고정된 APC에 의해 제시될 수 있다. 따라서, 이들 펩티드는 아피토프로서 정의된다. 한편, 펩티드 156-170은 T 세포에 제시되기 위하여 추가 프로세싱을 필요로 한다(도 9B). 고정된 APC는 T 세포에 대해 이러한 에피토프를 제시할 수 없으므로, 156-170은 아피토프가 아니다.
실시예 2B: MBP의 영역 77-100 및 125-148내의 아피토프의 동정
임의의 주어진 에피토프에 대하여, 추가 프로세싱 없이 APC에 제시될 수 있는 하나 이상의 아피토프가 존재할 수 있다. MBP의 두 개 영역내의 아피토프의 존재는, 살아있거나 P-포름알데히드-고정된 Mgar(HLA-DR2+ve) 세포를 혈청중의 MBP 영역 77-100(도 12) 및 125-148(도 13)로 부터의 중복 펩티드와 함께 또는 혈청 단독으로 항온처리하여 연구한다. T 세포를 첨가하고, 72시간 후(도 12) 또는 48시간 후(도 13), T 세포 증식 반응을3H-티미딘 흡수로 측정하였다. MBP 77-100에 대해, T 세포를 DR2:MBP 82-100 유전자전이된 마우스로 부터 분리하는 반면, MBP 130-144에 대해, T 세포 클론 MS17:A3을 사용한다.
MBP 영역 77-100에 대해, 아래의 펩티드를 아피토프로서 정의한다:
MBP 83-99 ENPVVHFFKNIVTPRTP
MBP 80-94 TQDENPVVHFFKNIV
MBP 81-95 QDENPVVHFFKNIVT
MBP 82-96 DENPVVHFFKNIVTP
MBP 83-97 ENPVVHFFKNIVTPR
MBP 84-98 MPVVHFFKNIVTPRT
DR2 MBP 82-100 유전자전이된 마우스로 부터의 T 세포에 의해 인식되는 최소 MBP 서열은 영역 85-94이다.
MBP 영역 125-148에 대해, 아래의 펩티드를 아프토프로서 정의한다:
MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV
MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD
MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA
MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ
T-세포 클론 MS17:A3에 의해 인식되는 최소 MBP 서열은 영역 133-144이다.
실시예 2C: MBP의 영역 89-101의 연구
앞서, 본원의 발명자들은, 다른 미엘린 T 세포 에피토프와는 달리, 가용성 형태로 펩티드 89-101을 투여하는 경우, 전체 미엘린 또는 89-101 펩티드 자체로 유도된 쥐의 실험상의 자가면역 뇌척수염(EAE)이 예방되지 않는다는 것을 밝혀내었다[참조 문헌: Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251].
MBP 89-101은 3종의 T 세포 에피토프를 포함한다
MBP의 81-111 영역에 대한 T 세포 반응성을 연구하기 위하여, 81-111로 프라이밍된(primed) 마우스로 부터의 림프절 세포를 시험관내에서 81-111로 자극하고, 이들 세포를 81-111 영역에 포함되면서 2개의 잔기씩 이동되는 중복하는 일단의 10량체 펩티드(즉, 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 및 101-111)를 사용하여 시험한다. 89-101에 이르는 펩티드에 대한 반응 패턴은, 5개의 인접 펩티드(N 말단 87-96 내지 95-104)에 대해 자극 능력을 보여주며, 이는 2개 이상(아마도 3개)의 별개의 에피토프의 존재를 반영한다.
이 영역을 추가로 연구하기 위하여, 3종의 아세포주를 본래의 81-111-반응성T 세포주로 부터 수득하고, 이를 84 내지 106 영역에 포함되고 1개의 잔기씩 이동되는 중복하는 일단의 10량체 펩티드를 사용하여 재시험한다. 이들 결과로 부터, 89-101 서열내에 중복하는, 3종의 별개의 T 세포 에피토프(89-94, 92-98 및 95-101)의 존재가 밝혀졌다(도 14 참조).
MBP 펩티드 92-98은 잠재적(cryptic) 에피토프이다
3종의 에피토프-특이적 T 세포주(TCL)는, 89-101 펩티드 및 전체 재조합 MBP에 대한 반응성에 대해 시험되어진 경우, 흥미로운 차이점을 보여준다. 3종의 TCL는 전부 펩티드(89-101)에 대해 반응하지만, 89-94 및 95-101-특이적 TCL만이 전체 MBP에 반응한다. 이는, 온전한 MBP의 항원 프로세싱이, 92-98을 인식하는 T 세포가 아닌 89-94 및 95-101을 인식하는 T 세포에 대한 리간드를 우선적으로 생성시킨다는 것을 의미한다. 이는, 92-98 에피토프가 잠재성(즉, 고유 항원의 프로세싱에 의해 생성될 수 없는 것)이라는 것을 제안한다. MBP 89-101 펩티드가 MHC 분자와의 3종의 별개의 상호작용에 관여하여, 3종의 별도의 T 세포 집단에 의해 인식되는 펩티드/MHC 리간드가 생성되는 것으로 여겨진다. 그러나, MBP의 프로세싱은 이들 T 세포 집단의 2종에 대한 리간드만을 생성시킨다(도 14 참조).
EAE의 유도는, 온전한 MBP 분해의 결과로서 CNS에서 발현되는 자기항원성 에피토프의 T 세포 인식을 필요로 한다. 앞서 동정된 3종의 T 세포 에피토프중의 하나만을 포함하는 펩티드를 사용한 마우스의 면역화는, 천연적으로 프로세싱된 에피토프(89-94 또는 95-101)을 함유하는 이들만이 EAE를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 이는 또한 92-98이 잠재적 에피토프임을 지지해 준다.
MBP 펩티드 92-98은 MBP 영역 89-101에 대한 우위 에피토프이다
위에서 언급한 바와 같이, 영역 89-101은 중복하는 3종의 별개의 펩티드를 함유한다. 이들 중에서, 펩티드 92-98은 이들 영역에 대해 우위를 나타내는 것으로 보인다. 예를 들면, T 세포 클론이 89-101 펩티드로 프라이밍된 마우스로 부터 생성되는 경우, 생성된 6종의 클론은 모두 92-98에 반응한다. 각각의 위치에서 각각 알라닌 치환을 함유하는 89-101 동족체 펩티드를 사용하여, 위치 92-98중의 어느 하나를 치환하면, 반응의 결여가 초래된다는 것이 밝혀졌으며, 이는 92-98 코어내의 임의의 잔기의 변형이 상기 에피토프의 인식에 전반적인 영향을 미친다는 것을 보여준다.
MBP 펩티드 89-101은 천연적으로 프로세싱된 MBP 에피토프를 인식하는 EAE-관련 T 세포를 관용화하지 못한다
상기 발견을 요약하기 위하여, 본원의 발명자들은, a) 89-101 서열이 3종의 별개의 T 세포 에피토프를 생성시킬 잠재능을 지니며, b) 이들 에피토프중 2개(89-94 및 95-101)만이 온전한 MBP의 항원 프로세싱에 의해 생성되며(시험관내 및 생체내 모두에서), c) 잠재적 에피토프를 함유하는 펩티드가 아닌, 천연적으로 프로세싱된 에피토프를 함유하는 펩티드만이 EAE를 유도하는데 효과적이며, d) 89-101 펩티드는 펩티드 치료 실험에서 EAE로 부터 보호하지 못한다는 것을 밝혀내었다.
이러한 정보는, 펩티드 89-101이 EAE 질환 관련 T 세포를 직접 연관시키지 못하기 때문에 EAE에 대해 관용화하지 못한다는 가설을 연구하기 위한 토대를 제공한다. 상기 가설을 지지하기 위하여, 펩티드(89-101)는 주요 뇌염유발 에피토프에 대해 관용을 유도하지 않아야 하는데, 그 이유는 당해 펩티드가 적절한 형태에서 MHC 제한 요소(I-As)에 직접 결합하지 않을 것이기 때문이다. 환언하면, 89-101은 89-94에 반응하는 T 세포에 대한 아피토프로서 작용하지 않을 것이다.
이러한 가능성을 시험하기 위하여, 89-101 및 87-96 펩티드를 사용하여 관용 실험을 수행한다(도 15 A 및 B). 87-96 펩티드는 EAE를 유도하는데 가장 효과적인 에피토프(89-94)를 함유한다.
방법
0일째에 완전 프로인트(Freund) 애주번트중의 펩티드 100㎍을 투여하기 전, -8, -6 및 -4일 째에 마우스에게 PBS중의 펩티드 200㎍ 또는 PBS 단독으로 복강내 투여하였다. 10일 후, 배수 림프절 세포(6x105/웰)를, 항원을 함유하거나 함유하지 않으며 5x10-5M 2-머캅토에탄올 및 2M L-글루타민이 보충된 X-Vivo 15-배지에서 72시간 동안 배양하였다. 배양물을 최종 16시간 동안 0.5μCi 티미딘을 사용하여 펄스처리하고, 액체 섬광 계수기를 사용하여 이의 도입을 측정하였다. 결과는 3회 중복 배양에서 분당 평균 계수로서 표현한다.
결과
87-96을 사용한 프라이밍은 그 자체에 대해 강한 회상(recall) 반응을 유도하고 89-101에 대해 약한 반응을 유도한다(각각, 도 15 A 및 B □ 및 O). 이는 89-101로 부터 89-94를 생성시키는데 항원 프로세싱이 필요한 것과 일치한다. 87-96으로 프라이밍하기 전에 관용원으로서 87-96를 사용하면, 87-96 및 89-101 둘 모두에 대한 회상 반응이 억제된다(도 15 A ■ 및 ●). 이는, 생체내에서 비반응성이었고, 89-96 또는 89-101로 부터 생성되었던간에 시험관내에서 89-94에 대해 반응하지 못하는 89-94 반응성 T 세포와 적합하다. 그러나, 결정적으로, 87-96을 사용하여 프라이밍하기 전에 89-101을 관용원으로서 사용하면, 87-96 또는 89-101에 대한 회상 반응이 억제되지 않는다(도 15 B A ■ 및 ●). 이들 자료로 부터, 관용원 형태로 펩티드 89-101를 투여하면, 89-94 서열을 기초로 천연적으로 프로세싱된 뇌염유발 에피토프에 대해 관용화되지 않는다는 것이 입증되었다: 89-101 펩티드는 89-94 에피토프에 대해 아피토프로서 작용하지 못한다.
이론에 구애받지 않으면서, 본원의 발명자들은, 상기 관찰이 MHC 펩티드 결합 부위에서 펩티드 89-101의 위치에 의해 설명될 수 있다고 믿었다. 만일 당해 펩티드가 우선적으로 결합하여, 영역 92-98이 펩티드-결합 포켓내에 존재한다면, 이는 MBP 92-98-특이적 T 세포에 의해 인식될 것이다. 이는, 마우스를 MBP 89-101로 프라이밍하는 경우 생성된 모든 T 세포 클론이 MBP 92-98 에피토프를 인식하는 이유를 설명할 것이다. 마찬가지로, 89-101을 사용하여 T 세포를 관용화하는 경우, 이는 MBP 92-98 에피토프를 인식하는 세포를 주로 관용화할 것이다. 만일 MBP92-98이 잠재적 에피토프라면, 이는 전체 항원의 천연 프로세싱에 의해 생성되지 않으며, 이러한 에피토프를 인식하는 T 세포가 아마도 생체내에 존재하지 않을 것이다. MBP 92-98-특이적 T 세포가 생체내에 존재하지 않더라도, 이는 상기 질환과 관련이 없을 것이다. 따라서, 89-101은 전체 MBP에 의해 유도된 EAE를 예방하지 못한다.
실시예 3: MS의 마우스 모델에 대한 펩티드 치료
앞서, 본원의 발명자들은, 복강내[참조 문헌: Liu and Wraith (1995) Int Immunol 8: 1255-1263] 또는 비내[참조 문헌: Metzler and Wraith (1993) 5: 1159-1165] 경로에 의해 전신 투여된 펩티드 항원의 단일 투여가 최대 3개월까지 실험상의 자가면역 뇌척수염(EAE)으로 부터 마우스를 효과적으로 보호할 것이라는 것이 밝혀내었다[참조 문헌: Metzler and Wraith (1999) Immunology 97: 257-263]. EAE-특이적 T 세포 수용체[참조 문헌: Liu et al (1995) Immunity 3: 407-415]를 발현하는 Tg4-유전자전이된 마우스[참조 문헌: Burkhart et al (1999) 11: 1625-1634]에서 관용을 유도하는데는 5회 이상의 펩티드 투여가 요구되었다. 최근의 연구를 통해, 비-유전자전이된 마우스에서는 비내(IN) 경로와 복강내(IP) 경로가 둘다 동일하게 안전하지만, Tg4 마우스에서는 비내(IN) 경로가 복강내(IP) 경로 보다 안전하다는 것이 밝혀졌다.
MBP의 펩티드 83-99를, 적당한 HLA-DR2 II형 MHC 분자 및 상기 펩티드에 대해 특이적인 사람 T 세포 클론으로 부터의 TCR 둘 모두를 발현하는 Fug/D6 유전자전이된 마우스에서 시험한다. 마우스를, Tg4 유전자전이된 마우스의 치료에 사용된 표준 투여(Tg4 프로토콜) 또는 알레르기로 고생하는 환자의 치료에 사용되어온 펩티드 투여의 단계적확대의 탈감작 프로토콜(탈감작 프로토콜)을 수행한 후 펩티드로 치료한다.
Tg4 프로토콜: 마우스 그룹을, 펩티드 83-99(포스페이트-완충 염수(PBS)중의 4mg/ml) 또는 PBS 단독으로 25㎕의 총 용적으로 비내 투여하여, 치료한다. 마우스에게 5주 동안 주중 제1일과 제5일 마다 총 10회 투여한다. 제6주의 초에 각 마우스에게 완전 프로인트 애주번트(CFA)중의 펩티드 83-99를 주사하고, 또한 백일해 독소(200ng)을 제1일 및 제3일째에 복강내 주사로 투여한다. EAE의 진행은 30일 이상 동안 모니터한다.
탈감작 프로토콜: 마우스 그룹을, 단계적으로 확대되는 용량의 펩티드 83-99 또는 PBS 단독으로 25㎕의 총 용적으로 비내 투여하여, 치료한다. 단계적으로 확대되는 용량은 0.1㎍에서 시작하여, 1, 3, 6, 12, 50㎍에 이어 3회의 100㎍으로 계속된다. 마우스에게 5주 동안 주중 제1일과 제5일 마다 총 10회 투여한다. 제6주의 초에 각 마우스에게 완전 프로인트 애주번트(CFA)중의 펩티드 83-99를 주사하고, 또한 백일해 독소(200ng)을 제1일 및 제3일째에 복강내 주사하여 투여한다. EAE의 진행은 30일 이상 동안 모니터한다.
실시예 4: MS 환자에게의 아피토프 칵테일의 비내 투여
MBP 펩티드 30-44, 83-99, 110-124 및 130-144 (즉, 아피토프로서 동정된MBP의 에피토프들중의 일부)를 포함하는 백신을 제조한다. 당해 백신을 Ia/Ib 시험기에 있는 35명의 환자에게 투여한다. 당해 시험은, 환자를 3개월간 치료없이 지내게한 후 펩티드(Ia)를 1회 투여한 단일 교차 시험이다. 이어서, 백신을 1회 투여한 후 환자를 3개월간 모니터하여 안전성을 평가한다. 이때, 치료는 1주에 2회 비내 침착에 의해 투여하는 것으로 이루어진다. 각 환자에 대하여, 임상 활성을 자기 공명 영상화로 1개월마다 분석하고; 면역학적 활성을 증식에 대한 속도론적 반응을 사용하여 모니터하고; 사이토킨 생성은 세포-이용 ELISA를 사용하여 모니터한다.
시험은 초기에는 만성 진행성(CP) 질환으로 고생하는 5명의 환자의 치료에 관한 것이다 이들 환자는 낮은 MRI 활성을 기준으로 선발하여, 우선 가장 많은 용량의 펩티드로 치료한다. 치료는 CP 환자 그룹에서 시작하는데, 그 이유는 이들이 MRI 활성의 증가에 의해 증명되는 임의의 가능한 유해 효과를 가장 잘 입증할 것으로 보이기 때문이다. 재발-이장성(relapsing remitting) 환자의 치료가 일단 시작되고, CP 그룹에서 1회 투여 및 수회 투여 치료가 안전하다는 것이 분명해졌다. 30명의 재발-이장성 환자중 다수의 그룹을, 3개월간의 모니터 동안 이들의 고통 증가 MRI 병소를 기준으로 모집한다. 이들을 3 그룹으로 나누어, 고, 중 또는 저 투여량의 펩티드로 치료한다.
| 치료(월) | 만성 진행성(CP) 환자 | 재발 이장성(RR) 환자 |
| 0 | 1개월의 모니터를 시작함 | |
| 3 | 치료하고 1개월마다 모니터한 후 1 내지 2주째에 MRI를 사용하여 Ia기를 개시함(펩티드의 1회 투여) | |
| 6 | Ib기를 개시(펩티드의 1주에 2회 투여)하고 계속하여 1개월마다 모니터함 | 1개월의 모니터를 시작하고 병소가 증가하는 환자를 모집함 |
| 9 | Ib기를 개시(펩티드의 1주에 2회 투여)하고 계속하여 1개월마다 모니터함 | |
| 12 | 치료를 종료하고 추가로 6개월 동안 계속하여 1개월마다 모니터함 | |
| 15 | 치료를 종료하고 추가로 6개월 동안 계속하여 1개월마다 모니터함 |
약어: APC= 항원 제시 세표; MHC= 주요 조직적합성 복합체; TCR= T 세포 수용체; EAE= 실험상의 자가면역 뇌척수염; APITOPE= 항원 프로세싱 독립적 에피토프; APIPS= 항원 프로세싱 독립적 제시 시스템; aa= 아미노산; MS= 다발성 경화증; MBP= 미엘린 염기성 단백질; PLP= 단백지질 단백질; TCL= T 세포주; TCC= T 세포 클론; PBMC= 말초혈 단핵 세포; PPD= 결핵균-정제된 단백질 유도체; PHA= 식물성 혈구응집소.
본 발명에 관해 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 당업자에게는 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 자명할 것이다. 비록 본 발명이 구체적 바람직한 태양과 관련하여 기술되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이러한 구체적 태양에 전적으로 제한되어서는 아니된다. 실제로, 본 발명을 수행하기 위하여 기술된 방법의 각종 변형이 화학 또는 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게는 분명하므로, 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 명세서에서 언급된 모든 문헌은 본원에서 참조로서 인용된다.
Claims (19)
- 추가의 프로세싱 없이 I 또는 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는 펩티드를 선별하는 단계를 포함하여, 관용원성 펩티드를 선별하는 방법.
- 제1항에 있어서, 펩티드가 추가 프로세싱 없이 II형 MHC 분자에 결합할 수 있는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드를 각각 T 세포 에피토프를 포함하는 다수의 펩티드로 부터 선별하는 방법.
- 제3항에 있어서, 다수의 펩티드를 항원 제시 세포의 II형 MHC 분자로 부터 용출시키는 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 다수의 펩티드중 각각의 펩티드가, 애쥬번트와 함께 피험자에게 투여되는 경우, 피험자의 항원과 관련된 질환을 유도할 수 있는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드를 절두된 펩티드의 중첩 셋트로 부터 선별하는 방법.
- 제1항 내지 제6항중의 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 T 세포 에피토프를 포함하고, T 세포 에피토프의 존재를,i) 질환을 앓고 있는 피험자로 부터의 세포 샘플 및 질환을 앓고 있지 않는 피험자로 부터의 세포 샘플을 당해 펩티드로 처리하고,ii) 세포 샘플들간의 T 세포 반응을 비교하는 방법으로 측정하는 방법.
- 제1항 내지 제7항중의 어느 한 항에 있어서,(i) 항원 프로세싱 독립적 제시 시스템(APIPS)를 펩티드로 처리하고,(ii) 펩티드가 APIPS내의 I 또는 II형 MHC 분자에 결합하는 것을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 펩티드가 I 또는 II형 MHC 분자에 결합하는 것을, T 세포를 가하고 T 세포 활성화를 측정함으로써 분석하는 방법.
- 제8항에 있어서, APIPS가(i) 고정된 항원 제시 세포,(ii) I 또는 II형 MHC 분자를 포함하는 지질막, 또는(iii) 플레이트-결합된 I 또는 II형 MHC 분자를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제10항중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 펩티드.
- 제11항에 있어서, 미엘린 염기성 단백질 펩티드 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 및 133-147중에서 선별되는 펩티드.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 펩티드.
- 제13항에 있어서, 질환이 과민성 질환인 펩티드.
- 각각의 펩티드가 질환에 대한 T 세포 에피토프를 포함하는, 제11항 내지 제14항중의 어느 한 항에 따른 다수의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제11항 내지 제14항중의 어느 한 항에 따른 펩티드를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, 질환의 치료 및/또는 예방이 필요한 피험자에게서 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
- 제16항에 있어서,(i) 질환에 대한 항원을 동정하는 단계;(ii) 항원에 대한 아피토프를 동정하는 단계; 및(iii) 아피토프를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 펩티드 또는 아피토프를 수회 투여(multiple dose)하는 방법.
- 제16항 내지 제18항중의 어느 한 항에 있어서, 펩티드 또는 아피토프를 비내 투여하는 방법.
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