HU229489B1 - Tolerogén peptidek - Google Patents

Description

Yolerogén peptidek

A találmány tolerogén peptidek szelekciójára szolgáló eljárásra vonatkozik, továbbá az eljárással azonosított peptidre és a peptid alkalmazására betegség kezelésében és/vagy megelőzésében. A találmány tárgyát képezi továbbá egy gyógyszerkészítmény, amely az Ilyen tolerogén peptidek sokaságát tartalmazza.

Az adaptív immunválasz során a T-limfociták képesek felismerni a fehérje antigén belső epitópjaít, As antigént prezentáló (bemutató) sejtek felveszik a fehérje antigéneket és rövid peptid. fragmensekre bontják le őket. A peptid egy 1 vagy 11 osztályú fő hisztokompatifoilítási génkomplex (major hístocompatibility complex - MBC) molekulához kötődhet a sejten belül, majd a sejt felszínére szállltődik. Amikor· a sejt felszínén bemutatásra kerül az MHC molekulával együtt, a peptidet a T-sejt felismerheti (a T-sejt receptoron (TCR) keresztül), amely esetben a peptid egy T-sejt epitőp.

A T-sejt epitópok központi szerepet játszanak az antigénekkel szembeni adaptív immunválaszban, akár saját, akár idegen antigénről legyen szó. A T-sejt epitópok központi szerepét a túlérzékenységi betegségekben (így az allergia, autoimmun betegségek és transzplantációs kilökődés) kísérleti modellek alkalmazásán keresztül mutatják be. Gyulladásos vagy allergiás betegségek indukálhatok szintetikus peptidek. (a T-sejt epitópok szerkezetét alapul véve) adjuvánssal együtt történő beinjektálással,

76,217/SM «

X Φ

Ezzel ellentétben azt ismertették, hogy immunológiai tolerancia indukálható a sajátos peptid epitópokkal szemben az oldható formájú peptid epitópok beadásával. Az oldható peptid antigének beadását a betegség gátlásának hatékony eszközeként szemléltetik kísérleti autoimmun agyveiö- és gerincvelő gyulladás (enkefalomieiitisz (EAE) - szklerőzís multiplex (MS) modell) (Metzler és Wraith (1993) int. Immunoi. 5:.1159-1165; Liu és

Wraith (1935) Int. Immunoi, 7:1255-1263; Anderton és Wraith (1998) Eur. h. Immunoi. 28:1251-1261); és az arthritis, cukorbetegség és szemideghártya-gyuiladás kísérleti modelljeiben (az előzőekben megadott Anderton és Wraith (1998) cikke szerinti áttekintés) . Ezt az előrehaladott EAE betegség kezelésének eszközeként Is ismertetik (Anderton és Wraith (1998) az előzőeknek megfelelően).

A toierogén peptidek betegség kezelésére vagy megelőzésére történő alkalmazása a figyelem középpontjába került. Ennek egyik oka az, hogy bizonyos toierogén epitőpokrői kimutatták, hogy képesek aluiszabályozni a T-sejtek ugyanazon szöveten belüli különböző antigénekre adott válaszait. Ez a jelenség, amely „bystander szupressziő^f'-ként ismert, azt jelenti, begy egy sajátos toierogén peptid alkalmazásával lehetőség nyílik egy adott antigénen belül egynél több epitóppal (előnyösen az összes epitóppal) és egy adott betegséggel kapcsolatos egynél· több antigénnel szembeni, tolerancia kialakulására (Anderton és Wraith (1998), az előzőeknek megfelelően). Ez elkerüli annak szükségességét, hogy azonosítani kelljen egy sajátos betegség összes patogén antigénjét.

76.217/SM

X X

Φ Φ Φ ΦΦΦΦ φ Φ » * « Χ Φ ♦ * * * « Φ Α « φ

Azért is előnyös a peptidek választása a terápiához, inivei viszonylag alacsony az előállítási költségük, és az a tény is mellettük szól, hogy a peptid analógok módosított .immunológiai tulajdonságokkal állíthatók elő. A peptidek ily módon úgy módosíthatók, hogy megváltozzanak a peptidek és az MHC vagy a TCR közötti kölcsönhatások.

As egyik lehetséges probléma ezzel a megközelítéssel az, hogy a T-sejt epítópokként működő peptidek nem mindegyikéről mutatták ki, hogy képesek toleranciát indukálni. A mieiin bázikus fehérje (MBP) 89-101 aminosavai által meghatározott peptid az immunizálás után immundomináns antigénnek bizonyul, továbbá nagyon hatékony immunogén a T-sejt reaktivitás beindításának és az EAE indukáciőjának szempontjából. Azonban a pepiidről kimutatták, hogy amikor oldatban adják be, hatástalan a tolerancia índukálásában (Anderton és Wraith (1998) , lásd fent.) .

Számos magyarázat született a T-sejt epítőpok tolerancia indukáló képességének megfigyelt szerveződésére (Anderton és Wraith (1998), lásd fent). Részletesebben, felvetették, hogy kapcsolat van a peptid MHC-vel szembeni affinitása és a tolerogén jelleg között (Liu és Wraith (1995), lásd fent), de ez nincs összhangban néhány megfigyeléssel. Például az MBP[89-101] peptid, amely nem tolerogén, viszonylag erős affinitással kötődik az I-A?-hez. Ebből tehát nem következik egyenesen, hogy melyik peptid fog toleranciát indukálni.

Ha létezik ésszerű magyarázat, hogy miért csak a peptid epitópok egy része képes toleranciát indukálni, akkor az megkönnyítené a túlérzékenységi rendellenességek kezelésében és

76.217/SM * *« φφ φ * φ φ φ + φ .* 4

Φ X Φ ««§ φ * ίφψ φ φ « φ φφφφ φ

ΦΦΦ φφ φφ * ΦΦΧ megelőzésében használható tolerogén peptidek kiválasztásátMeglepő módon ezt találtuk# hogy he egy peptid epitőp -megfelelő méretű ahhoz# hogy egy éretlen APC bemutassa azt egy T~ sejtnek az antigén feldolgozása nélkül, akkor az epitőp immunológiai toleranciát képen indukálni, Az a megfigyelés# hogy néhány T-sejt epitőp tolerogén és mások képtelenek toleranciát indukálni# következésképpen azzal a ténnyel magyarázható# hogy néhány epitőp további feldolgozást igényel# mielőtt képesek lennének arra# hogy az MHC molekula segítségével bemutatásra kerüljenek a T-sejteknekx Azok az epitópok# amelyek további feldolgozást igényeinek nem indukálnak toleranciát# amikor oldható formában adjuk be# annak ellenére# hogy betegség indukálására képesek# amikor adjnvánseal kombináltan injektáljukAzok az epitópok# amelyek további feldolgozást nem igényeinek tolerancia indukálására képesek és ##apitőpoknak^?í (antigén feldolgozástól független epitópok# Antigén Processing Independent epíTOFES) nevezzük Őket,

Ez a felismerés egy szabály-alapú eljárást biztosit a tolerogén T-sejt epitópok szelekciójára# amely megkerüli annak szükségességét# hogy in vivő vizsgáljuk egy peptid tolerogén képességét. Ez különösen előnyös olyan, betegségek kezelési és megelőzési stratégiáinak kifejlesztésében# amelyeknél megfelelő állatmodellek nem férhetők hozzá- Sőt még azoknál a betegségeknél is# ahol létezik állatmodeil# a szelekciós eljárás egyszerűbbé és biztonságosabbá teheti a tolerancia Indukáló készítmények kifejlesztését# mivel olyan mechanizmust biztosit# miáltal a peptid tolerancia indukáló képessége az in vivő alkalmazásukat

76.2I7/SM megelőzően in vitro vizsgálható a humán T~sejtokon (az antigén felismerése a humán MHC molekulákkal közösen).

Első megközelítésben, tehát a találmány tárgya eljárás tolerógán peptid szelekciójára, amely további feldolgozás nélkül az MHC 1 vagy IX osztályú molekulához kötődni képes peptid szelekciós lépéséből áll.

Az előnyös kiviteli alakban a peptid további feldolgozás nélkül egy MHC 11 osztályú molekulához képes kötődni.

Számos eljárás ismert a szakterületen olyan peptidek szkrinelésére, amelyek egy adott antigén esetében T~sejé epitöpokkénf képesek működni. Általában tehát az eljárást egy toierogén peptid kiválasztására alkalmazzuk a T-sejt epitópot tartalmazó peptidek sokaságából.

Ahhoz, hogy megvizsgáljuk vajon egy peptid képes-e további feldolgozás nélkül egy MHCI vagy MHCIT molekulához kötődni, először tanulmányozni kell a peptidek MHCI vagy MHCII molekulához történő kötődésének képességét egy antigén, feldolgozásától független prezentációs rendszer (APIPS) alkalmazásával. Egy előnyös kiviteli alakban tehát az eljárás a következő lépéseket tártálrassza:

(i) egy APXPS-rendszert egy pepiiddel kezelünk; majd (il) vizsgáljuk a peptid MHCI vagy MHCII molekulákhoz történő kötődését az AbltS rendszerben.

Második mag köze ütésben a találmány tárgya az első megközelítés szerinti eljárással szelektált peptid.

A peptid egy betegség kezelésében és/vagy megelőzésében használható, közelebbről a peptid olyan betegség kezelésében

7S.2177SM és/vagy megelőzésében használható, amelyet autoreaktív T-sejtek közvetítenek. A túlérzékenységi reakciók kezelésére/megelőzésére különösen alkalmas a találmány szerinti peptid alkalmazása, ilyenek például az allergia, autoimmunitás és a transzplantátum kilökődése.

Azonosítottunk továbbá számos mielin bázikus fehérje apitópot, amelyek autoantigénként működnek a. szklerőzis multiplex betegségben. Egy különösen előnyös kiviteli alakban, következésképpen a találmány szerinti peptidek használhatók a szklerózis multiplex kezelésében és/vagy megelőzésében.

ismert, hogy néhány peptid képes toleranciát indukálni ugyanabból az antigénből származó más epitőpokkai szemben Is, vagy akár egy eltérő antigénből származó más epitőpokkai szemben ís (ez a jelenség bystander szuppresszióként ismert) . Azonban, úgy gondoljuk, hogy az összes autoreaktív T-sejt megfelelő szupresszálása érdekében előnyös lehet a sajátos betegség kezelése/megelőzése céljából a betegnek beadandó különféle apitöpok kombinálása. Következésképpen a harmadik megközelítésben a találmány tárgya egy olyan gyógyszerkészítmény, amely a találmány második megközelítése szerinti peptidek sokaságát tartalmazza, ahol mindegyik peptid egy T-sejt epitopon alapul.

Negyedik megközelítésben a találmány tárgya eljárás betegség kezelésére és/vagy megelőzésére egy alanyban, amely eljárás a találmány második megközelítése szerinti peptid betegnek történő beadásából áll.

Egy betegség betegben történő kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló általános stratégia a következő lépéseket tartalmaz'M.217/SM

íi) azonosítjuk a betegségre jellemző antigént (ii} azonosítjuk az antigén apitőpját; és {iii) beadjuk az apitópot a betegnek.

Az 1, ábra mutatja a Mycobacteríum tufoercuJosís—ből tisztított. fehérje származék (PPQ; és az MBP kinetikus profiljának jellegzetes példáját szkierozis multiplexben (MS) szenvedő betegekben és egészséges egyénekben. MS betegből· (A) és egészséges egyénből (B) izolált perifériás vér mononukleáris sejteket ÍPBMC) vizsgálunk, hogy képesek-e PPD és a teljes MBP jelenlétében proliterelődni; az MBP-re adott prolíferativ válasz kinetikus profilját összehasonlítjuk a PPD másodlagos antigén kinetikus profiljával,

A 2, ábra egy táblázat, amely összefoglalja az MBP-re és a peptidjeire az MS betegekben adott PBMC válaszokat. Bizonyos egyéneket három külnböző időpontban vizsgáljuk úgy, hogy az egyes időpontok között körülbelül 4-7 hónap legyen,

A. 3. ábra egy táblázat, amely összefoglalja az MBP-re és az MBP-peptidőkre az egészséges egyénekben adott PBMC válaszokat, 4 és 7 hónap közötti idő telik el az egyes időpontok között.

A 4. ábra egy MS beteg {MS 49} példáját mutatja, aki két különböző időpontban több pepiidre ad választ, de akinek a felismerési profilja a 4 hónappal később mért második időpont alkalmával jelentősen eltér, A PBMC-t MBP és az MBP teljes hosszát lefedő peptidek mátrixának jelenlétében tenyésztjük és 3Htimídin felvétellel mérjük a proliterációt. Az első pontnál megfigyelt átfogó T-sejt prolíferativ válasz jelentősen eltér a 7

u.

217/SM » bú « ϊ⁴”* * φ ί * Φ » Φ X ΦΦΦ Φ φ X φ ΦΦΧΦ φ hónappal később (második időpont) mért választól.

Az 5. ábra mutatja annak a betegnek a példáját, akinek az epitőpra adott átfogó válaszreakciója (első időpont) visszafejlődik (második időpont) és tizenkét-hónap múlva újra megjelenik, (harmadik időporit) .

A 6, ábra mutatja a peptid régiók kinetikus válaszreakció vizsgálatban azonosított finomított specifitásának térképét, amelyet MS betegekből és egészséges egyénekből származó TCC alkalmazásával kapunk. A szkrinelési vizsgálatban alkalmazott legtöbb peptid 15 aminosav hosszúságú (15-mer), azonban egy pár peptid 10 aminosav hosszúságú (10-mer), illetve egyikük 17 aminosav hosszúságú (17-mer). Mindegyik TCC specifitását legalább kétszer vizsgáljuk.

A 7a. ábra egy táblázat, amely az M8 betegekből származó Tlimfociták által felismert mieiin bázikus fehérjében lévő T-sejt epitöpok jellemzését mutatja.

A 7b. ábra egy táblázat, amely az összes olyan T-sejt epítópot mutatja, amelyeket nem szükségszerűen a rögzített APC mutat be, következésképpen nem apitópok.

A δ és 9. ábrák mutatják az élő és rögzített APC által a különféle MSP peptidek bemutatását a T-sejt kiónok számára. 8A. ábra - 30-44 peptid, 38. ábra - 110-124 peptid, 9A. ábra - 130144 peptid, 9B. ábra - 156-170 peptid.

A 10. ábra egy táblázat, amely az MS betegekben három különbőzé időpontban az MfíP-re és az MBP-peptidekre kapott stimulációs index (SÍ) értékek csúcsát mutatja. A második időpontnak megfelelő mintákat az első időpont után 4-8 hónappal, mig a barma76,217/SM

X φ Φ •*5 r** $

dák időpontnak megfelelő mintákat a második időpont után 3-5 hónappal gyűjtjük össze. A háttérértékeket minden nap lemérjük és et 80-700 cpm (beütésszám/perc) között változik; pozitív válasznak (félkövér kiemeléssel) tekintjük azokat, amelyekre igaz, hogy .az SI>3 és öcpmhlOOO. (Az MS19 és MS07 betegekből, nem sikerült mindhárom időpontban mintát venni) <.

A 11. ábra egy táblázat, amely egészséges egyénekben az MBPrs és az MBP-peptídekre kapott stimulációé index (Sí) értékek csúcsát mutatja. A háttérértékeket minden nap lemérjük és ez 80700 cpm között változik; pozitív válasznak (félkövér kiemeléssel) tekintjük azokat, amelyekre igaz, hogy az Sl>3 és óepm>1000.

A 12. ábra mutatja a DR2;MBP82~100 transzgenikus egérből izolált T-sejtvfc válaszát az MSP 77-100 régiójába illeszkedő peptidjeinek A PC általi, bemutatására.

A 13. ábra mutatja az MS17;A3 T-sejt klón válaszát az MBP 125-140 régiójába illeszkedő peptidek APC általi bemutatására,

A 14. ábra mutatja a T-sejt epltőp felismerését MBP 88--101 szekvenciáján belüli epitópokra. Ezen a szekvencián belül három eltérő, de átlapoló T-sejt epltóp létezik: 89-94, 92-98 és 95101. Az ábrán bemutatjuk a lehetséges hasítás folyamatát a 94 és 95 aminosavak között az aszparaginil-endoepetidáz (ASP) enzim ha f a s a r a.

A 15, ábra mutatja a 87-96 (A) és 89-101 (B) MBP peptidek azon képességét, hogy apítőpként működnek a 89-94 epitópra adott T-sejt válaszreakcióban..

Blső megközeütésben a találmány tcierogén pepiid szelekciós /6,217/SM * ·$-: <·» « .· χ ^χ <· X· · * $ Φ * * * * X* •X χ χ V λ·Χ·Λ» ΐ

·. *« *·Χ X ·.· XX v eljárására vonatkozik.

Tolerancia

A. leírásban a „tolerogén* kifejezés azt jelenti, hogy egy anyag a tolerancia indukálásárs képes,

A tolerancia az antigénre adott válást hiánya. A saját antigénekkel szembeni tolerancia az immunrendszer alapvető tulajdonsága és amikor elveszti est a tulajdonságát, az autoimmun betegséget eredményezhet. As adaptív immunrendszernek fenn kell tartania az igen sokféle fertőző anyaggal szembeni válássadő képességet, mi késben el kell hárítania a saját szövetben lévő saját antigénjeinek autoimmun támadásait. Ezt igen nagy mértékben szabályozza az éretlen T-límfooiták csecsemőmirigyben végbemenő apeptctikus sejthalállal szembeni érzékenysége (központi tolerancia? . Azonban nem minden saját antigént ismer fel a. csecsemőmirigy, Így as önreaktiv timooiták elpusztulása befejezetlen marad. Létesik továbbá olyan mechanizmus is, amellyel a tolerancia az érett önreaktiv T-Iimfociták által a környéki szövetekben szerezhető meg (kornyéki tolerancia) , A központi ée környéki tolerancia mechanizmusairól Anderton és munkatársai (Immunologicsl

Reviess 169:123-137 (1399)) adnak áttekintést.

A tolerancia a CDit T-sejtek legalább egy részében kialakult válsszképteleoség indukálásának eredménye lehet, vagy eszel jellemezhető, A T-sejt aktiválása érdekében egy peptidnek egy olyan „professzionális* AéC-hes kell kapcsolódnia, amely két jelet képes szállitanl a T-aejthes, Az első jelet (1-es jelé az AAC aejtfeldiefcén lévő HAC-péptid komplex szállítja és a T-sejt a TCk-en keresztül ismeri fel. A második jelet (2-es jel) az AAC ?S„217/SM ií

Χν ♦ <ί·* felületén lévő kostimuláciős molekulák, például a CD80 és CD86 szállítják és a T-sejt felszínén lévő CD28 ismeri fel. Úgy gondolják, hogy amikor a T-sejt felismeri az 1-es jelet a 2-es jel hiányában, akkor az nem aktiválódik és valójában válaszképteien™ né válik. A válaszképtelen ϊ sejtek szembeszállnak az azt követő antigén támadással és képesek lehetnek más immunválaszok elnyomására. A válaszképteien T-sejtekröl azt gondolják, .hogy részt vesznek a T-sejt tolerancia közvetítésében.

Anélkül, hogy egy konkrét elmélethez ragaszkodnánk arra számítunk, hogy azok a peptidek, amelyek mielőtt az MHC molekulákkal együtt bemutathatőak lennének feldolgozást igényelnek, nem indukálnak toleranciát, isivel ezeket a peptídeket érett antigén prezentáló sejteknek kell feldolgozniuk. Az érett antigén prezentáló sejtek (például a makrofágok, B-sejtek és dendritikus sejtek) képesek feldolgozni az antigént, továbbá képesek az 1-es és 2-es jelet is a T-sejthez szállítani, amely a T-sejt aktiválásához vezet. Másrészt az apitöpok képesek az éretlen A2C MHCli molekuláihoz kötődni. Így az apitőpoket kostimul.áció nélkül mutatják be a T-sejteknek, amely a T-sejt válaszképtelenségéhez és toleranciához vezet.

Természetesen az apitopok is képesek az érett APC sejtfeiszínén lévő MHC molekulákhoz kötődni. Azonban az immunrendszer nagyobb mennyiségben tartalmaz éretlen ABG-t, mint érett AkC-t {felvetették, hogy 10 %-nál kevesebb dendritikus sejt aktiválódik'., Snmmera éemásai·.·, {21811) Am. 01 lat hol. 159; 285-295). így tehát ém apitőp alaghelyzefben inkább vaiasaképteienséc ?t TcmeuK >a\ ehet, adatnom a\i ir.ó. is

76.217/SM

Kimutatták, hogy amikor tolerancia indukálódik a pepiid belélegzésekor,· 32 antigén-specifikus CDit T-sejtek proliterácíös képessége csökken. Továbbá e sejtek 1L-2, IFN-y és 1L-4 termelését alulszabályozzák, de az IL-10 termelését növelik. A pepiid által indukált tolerancia állapotában lévő egerekben az IL-10 semlegesítéséről kimutatták, hogy a betegségre való hajlamot teljesen visszaállítja. Erre olyan toleráns állapotban lévé szabályozó sejtek populációját javasolták, amelyek IL-10-et termelnek és immunszabályozást közvetítenek (Burkhart és mtsai. (1999) int. Immunoi. 11:1625-1634}.

A tolerancia indakálása következésképpen különféle technikák segítségével követhető nyomon, amelyek magukban foglalják a következőket :

(a) kisebb érzékenység egy olyan betegség elkapására, amelynek kialakulásához a pepiid egy in vivő célepitőp;

(b) válás^képtelenség índukálása a CD4* ΐ-sejtekben (amely ezután antigénnel történő in vitro immunizálással mutatható ki);

(o) a CDi-·- τ-sejt populációban bekövetkező változások, beleértve :

(i) a proliteráció csökkenését;

(ííj az IL-2, IFN-y és IL-4 termelésének alulszabályozása; és (ííi) az IL-10 termelésének fokozása.

Antigén feldolgozástól független epitöpok fAPlTöPOáp

A találmány szerinti eljárás olyan peptidek szelekciós lépéséből áll, amelyek további feldolgozás nélkül képesek az MHC1 vagy MHC11 fehérjéhez kötődni. Ezeket a peptideket hívjuk

76.2U/ŐE * * Φ * * »6 * φ Φ Φ φ Φ X Φ φ ΦΦΧ

„apit-épok^-nak a leírásban (antigén feldolgozástól független epitőpok),

Egy adott antigénből származó peptidek sejtfelszíni bemutatása nem véletlenszerű és a folyamat során kevés, gyakran előforduló epitőp dominál. Egy sajátos peptid dominanciaja számos tényezőtől, például az MHC molekulára vonatkozó viszonylagos kötődési affinífásától, az APC-n belüli keletkezésének térbeli és Időbeli pontjától és a lebomlásra való érzékenységétől függ. Az antigén epitőp hierarchiája az immunválasz előrehaladottságával változhat, amelynek fontos jelentősége van a saját anyagokkal szembeni tolerancia és sz autoimmunitás esetében. Az immundominancíát meghatározó régiók valószínűleg jó tolerogénnek bizonyulnak, Ennélfogva egy előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti apitőp a domináns epitépőkon alapul.

Azonban az immundomináns peptidekre adott elsődleges immunválasz után az epitőp „terjedés a1domináns determinánsokat eredményezhet (Lehmann és mtsai., (1992) Pátere 358:155-157). Az aldomináns epitőpok bemutatása fontos lehet az autoimmunitás előidézésében. A találmány szerinti apitőp következésképpen egy aidomináns epitöpon alapul.

Bármely adott antigén esetében léteznek rejtett epitőpok is. A rejtett epitőpok pepiidként beadva képesek T-sejt választ stimulálni, de képtelenek ilyen választ előidézni, amikor teljes antigénként adjuk be őket. Ennek az lehet az oka, hogy az APCben az antigén peptidekké történő feldolgozása során a rejtett epitőp megsemmisül., kimutattuk, hogy az EBE 82-58. aminosavaibői álló peptid egy rejtett epitőp (2C„ példa). Meglepő módon a fcfcfc* fc fc fc X X Φ fc •ί φ fc fcfcfc fc' φ fc fc φ fc φ fc X fc fc X fc peptid régióban létezik egy vélhető hasítási hely az aszparaginil-endopeptidáz számára, amely azt jelentheti, hogy a természetes feldolgozás során nem keletkezik olyan peptid az

ArC-ben, amely ezt a régiót tartalmazza.

A. rejtett epitóp in vit.ro apitópként viselkedhet, amennyiben további feldolgozás nélkül kötődhet az HhC molekulához ás képes válaszképtelenséget indukálni az olyan T-sejtbon, amely felismeri a rejtett epitópot. Azonban, az ilyen apitép valőszinöieg terápiásán hasznos lehet, mivel nem képes toleranciát előidézni azokban a T-sejtökben, amelyek felismerik az antigén természetes úton teldolgozott, epitőpját.

Az antigén, epitőpjai a teljes antigént lefedd átlapoló peptidek (lásd később) APC által történd bemutatására adott Tsejt válasz mérésével azonosíthatók. Az ilyen vizsgálatok rendszerint a peptidek „mátrixait eredményezik és a sajátos Tsejtvonalra vagy T--sejt klánra jellemző minimális epitőp a csonka peptidekre adott válasz mérésével becsülhető meg, bem tételezhető fel ugyanakkor az, hegy az antigén minimális epitőpja apitöpkönt viselkedik. Jóllehet a minimális epitőp oldalsó aminosavaira szükség van az MHC molekulához történő optimális kötődéshez. Az apitőpot úgy kell megtervezni, hogy lefedje annak lehetőségét, hogy apró különbségek lehetnek a. különböző Tsejt kiónok minimális epitőpjai között.

Szeretnénk kihangsúlyozni, hogy nem lehetséges az összes epitöpra apitőpot azonosítani, hyilvárvslö, hogy néhány epitőp oly módon kötődik az MhC molekulához, »ly függ az MAC terhelhetőségétől. az endoszömákbán ás ennélfogva feldolgozást igényel

75.2'17/SM <· * * * (Viner és mtsai., (1995) Proc. Nati. Acad. Sci, 92:2214-2213). Sz egy másik ok arra, hogy miért nem feltételezhető, hogy minden minimális epitóp feltétlenül apitöpként viselkedik.

A T-~sejt epitopokat tartalmazó peptídek azonosítása

A szakterületen számos eljárás ismert egy adott antigénen belül lévő T-sejt epitőpok azonosítására.

A természetes úton feldolgozott epitőpok az antigénnel töltött APC-böl eluált peptídek tömegspektrofotometriás vizsgálatával azonosíthatok. Ezek olyan APC-k, amelyeknél vagy elősegítjük az antigén felvételét, vagy olyan fehérje íntraceliuláris termelésére késztetjük, amelyet a megfelelő gén transzformálásával kapunk. Jellemzően az APC-t oldatban fehérjével inkubáljuk, vagy úgy inkubáljuk, hogy a fehérje megfelelő módon az APC sejtfelszínéhez jusson e'1. A SV^C-on történő inkubálást. követően a sejteket detergensben roncsoljuk és az MKC.T.I fehérjét például affinitás kromatográfiával tisztítjuk. A tisztított MHC megfelelő kémiai közeggel {például savas körülmények között) történő kezelése a peptidek eluálását eredményezi az PiHC molekulából. A peptídek összességét szétválasztjuk, majd a profilt összehasonlítjuk a hasonló módon kezeit kontrol APC-ből származó peptiddei. A fehérje expressziöra/betáplált sejtekre jellemző csúcsokat megvizsgáljuk (például tömegspektrometriával), majd azonosítjuk a peptid fragmenseket. Ez az eljárás általában egy sajátos antigén antígén-feidolgozásából keletkezett peptidek rendszerint a peptid-mátrixban megtalálható) tartományáról ad információt,

Az epitőpok azonosítására szolgáló másik eljárás az átlapoló

76.217 / q ΐ A »»««.««>

.· *· -1 ^{Λ ν}· » β φ. *»Φ X φ ΦΦΦ φ * φ φ «ί φ φ φ φ κ « φ Φ » ΦΦ» « ΦΦΦ és az antigén teljes hosszúságát lefedő peptidek szintetikus könyvtárának szkrínelése egy ín vitro vizsgálatban. Például 15 aminosav hosszúságú és 5 vagy 10 aminosav hosszúságban átlapoló peptidek alkalmazhatók. A peptídeket egy antigén bemutató rendszerben vizsgáljuk, amely antigén prezentáló sejteket és Tsejteket tartalmaz. Például az antigén bemutató rendszer egy eqér splenocita készítmény, humán mandulákból nyert sejtek készítménye vagy PBMC lehet. Másik lehetőségként az antigén bemutató rendszer egy sajátos T-sejtvonalat/kiónt és/vagy egy sajátos antigén prezentáló sejttípust tartalmazhat.

A T-sejt aktiválás T-sejt proliferáción (például ⁴H~timídin beépítésével) vagy citokin-termelésen keresztül mérhető. A TH1típusú CD4+ T-sejtek aktiválása például az IFNy-termelésévei mutatható ki, amely szabványos technikákkal, például ELISPOT vizsgálattal mutatható ki.

Az átlapoló peptidekre vonatkozó vizsgálatok általában az antigén azon területeit jelzik, amelyekben epitóp helyezkedik el. Egy sajátos T-sejt minimális epifópja ezt követően a csonka peptidekre adott válasz mérésével állapítható meg. Például ha az

1-15 aminosavakat tartalmazó peptid immunválaszt indukál az átlapoló könyvtárban, akkor azok a peptidek alkalmazhatók a minimális epitóp azonosítására, amelyek mindkét végükön csonkák (azaz 1-14, 1-13, 1-12 stb. és 2-15, 3-15, 4-15 stb. aminosavak).

Az antigén immundomináns régióinak ín vitro vizsgálatok (különösen T-sejtvonalakat alkalmazó eljárások) alkalmazásával történő azonosítása a peptid reaktivitás aszimmetrikus mintázatát mutatja. Az MBP epitópok azonosítására szolgáló vizsgálatban,

76.217/SM

amelyet a példákban ismertetünk.,· olyan kinetikus válaszreakció vizsgálati módszert alkalmazunk, amelyben az MS betegekből és egészséges egyénekből származó PBMC proliferációját mérjük egy átlapoló peptid könyvtárral szemben. Sz a vizsgálati módszer azon a felfedezésen alapul, hogy habár az egészséges egyénekből és MS betegekből származó T-sejtek hasonló módon reagálnak a tisztított fehérje antigénre, mégis különböző módon reagálnak az MBP szekvenciáján alapuló peptídekre. Az MS betegekből származó T-sejtek nagyobb mértékben és gyorsabb kinetikával reagálnak a peptid antigénekre az egészséges donorokhoz képest. Ez lehetővé teszi az epitóp szkrinelését és azonosítását, amelyre a beteg konkrét időpontban immunreakcióval válaszol. A leírásban ismertetett vizsgálatban az említett megoldás számos olyan epitópot tartalmazó régiót tár fel, amelyeket szabványos technikák alkalmazásával nem azonosítottak. Ezen. felül bemutatjuk, hogy a Tsejt felismerése ciklikus mintázatot mutat, amely az egyik időpontban megjelenik, visszafejlődik, majd ezt követően egy későbbi időpontban újra megjelenik.

Az általunk ismertetett kinetikus vizsgálati módszer értékes eszközt biztosít, mivel felismeri azt az epitópot, amelyre a beteg egy konkrét időpontban immunreakcióval válaszol, Sz az információ egy konkrét betegre szabott terápiás apitóp-alkalmazásí megoldáshoz használható fel a releváns epitóp apitopjának azonosításával és beadásával (feltéve, hogy létezik ilyen;, Az információ segitségével egy általános mintázat is felvázolható a betegség előrehaladása esetében, oly módon, hogy a betegség egy adott pontján valószínűleg meglévő epítöpokra jellemző

76.217/SM

Ο φφ Φ φ *

Φ Φ s s φφ-φ φ ❖ Φ*φί apítópokat tartalmazó gyógyszerkészítmény legyen tervezhető. Antigén reidoigosántél független hemutató rendszerek (A.PfüS)

Mihelyt azonosítjuk az epítópot a következő lépés az, hogy megvizsgáljuk vajon apitöpként viselkedik-e.

Az «pitőpot úgy kell a T-sejtoknak bemutatni, hogy ne legyen szükség az antigén feldolgozáséra. A T-sejt epitőpokat tartalmazó peptidek azonosítását követően az apitőpok olyan rendszer alkalmazásával azonosíthatók, amelyekben nem történik feldolgozás. A csonka peptidek és peptid analógok aktivélő képessége antigén feldolgozástól független bemutató rendszer (APIPS) alkalmazásával vizsgálható.

Az APIPS-ra példák a következők:

a) rögzített APC (CD2S elleni antitestekkel vagy anélkül);

b) MHCX vagy MHCXX molekulákat tartalmazó lipid membránok (CD28 elleni antitestekkel vagy anélkül)? és cí tisztított, természetes vagy rekombináns MHC lemezhez kötött formában (CD29 elleni antitestekkel vagy anélkül).

A rögzített APC alkalmazása jói ismert a T-sejt válaszok megfigyelésére, például egy polipeptiden belül lévő minimális apitép megfigyelésére vonatkozó vizsgálatokban a csonka peptídekre adott válasz mérésével (Faírchíld és mtsai., (1996) Int. Immunoi. 8:1035-1043). Az AFC .például formaldehid (rendszerint parafozmaldehid) vagy glutáraldehid alkalmazásával rögzíthető »

A lipid membránok - (amelyek plenáris membránok vagy liposzdmák iohoteek) mesterséges l inidek alkalmaaáaáwl éllitha^ tok Old vagy AK'-bM plávmamotbran cukroskőmális er^k7G217/SM ❖ * ί* ciők lehetnek,

As alkalmazás során, az AFIPS egy szövettenyésztö lemez lyukaiba vihető fel. Ehhez adjuk a peptid antigéneket és a peptid APXPS MHC részéhez történő kötődését a kiválasztott T-sejtvonal vagy T-sejt klőno-k hozzáadásával mutatjuk ki, A T-sejtvonal vagy T-sejt klón aktiválódása bármely a szakterületen jót ismert eljárással mérhető, igy például 'Ή-tímidin beépítéssel vagy citokin kiválasztással.

Pepiidek

A találmány második megközelítése egy pepiidre vonatkozik.

A „peptid kifejezést a hagyományos értelmében használjuk és jellemzően az L-aminosav max'adékok olyan sorozatát jelenti, amelyek egymáshoz peptid kötéssel kapcsolódnak a szomszédos aminosavak o-amino és karfooxil-csoportjai között. A kifejezés magában foglalja a módosított peptideket és a szintetikus peptid analógokat is.

A találmány szerinti peptid bármilyen hosszú lehet, amennyiben feldolgozás nélkül képes egy MHCI vagy MhCli molekulához kötődni .

Az MhC’l molekulákhoz kötödő peptidek jellemzően '7-13, előnyösebben 3-10 aainosav hosszúságúak. A peptid kötődése a pepiid két végénél stabilizálódik, a peptídvázhan lévő atomok és az MHCI molekulák peptíd-kötő helyén lévő állandó helyek közötti kapcsolódások segítségével, A peptid-kötő hely mindkét végén található egy állandó hely, amely a peptid amino- és karboxi-végeihez kötődik. A különböző hosszúságú peptidek a peptidváz behajlásával illeszkednek, ami gyakran a szükséges rugalmasságot lehetővé te76.2177SM vő prolin. vagy glicin maradékoknál történik.

Az MHC11 molekulákhoz kötődő peptidek jellemzően 8-20 aminosav hosszúságúak, előnyösebben 10-17 aminosav hosszúságúak, de lehetnek hosszabbak is. Ezek a peptidek kinyújtott konformációban nyúlnak végig az MHCX'Í molekula peptid-kötö helye mentén (amely különbözik az dKCl molekula peptid-kötö helyétől), amely mindkét végén nyitott, A peptidet elsősorban az egész peptidváz és az MHC molekula peptid-kötö helyén lévő konzervatív aminosavak között kialakuló kölcsönhatások tartják a helyén.

A találmány szerinti peptid kémiai eljárások segítségével állítható elő (Pepiibe Chemistry, A practicai Textbook. Mikes Sodansky, Springer-Verlag, Berlin), A peptidek például szilárdfázisú technikák segítségével állíthatók elő (Roberge ÚY és mtsai,, (1995) Science 259: 202-204), a gyantáról lehasithatök, majd preparativ nagy hatékonyságú foiyadékkromatográfia (preparativ HPLC) segítségévei tiszfitháfcék (például Creighton (1983) Proteiné Streetüres And boiecuiar Príncipies, WK Preeman and Co, bee York bY) , Automatizált előállítás is kivitelezhető például az ABI 43 1 A típusú peptid-szintetizálő készülék (Perkin elmer) alkalmazásával a gyártó által megadott utasításoknak megfelelően,

A peptid másik lehetőségként rekombináns eszközökkel vagy egy hosszabb polipeptidböi történő kivágás segítségévei is előállítható. A peptid például a célantigénböl kivágva is kinyerhető. A peptIdkészitmény aminosav-vizsgálattal vagy szefcvenálássai ellenőrizhető (például Bdman-lebontási eljárással).

Az előnyös kiviteli alakban a peptid egy célantigénböl szár76.217/SM

2S § φφ ί φ ·» > φ φ i : : ” ί*'* ¥

maztatható. A célantigén egy olyan molekula (például egy fehérje vagy giikoprotein)# amelyet a betegség lefolyása során az A PC dolgoz fel és a T-sejtek ismerik fel, A célantigén természetesen a célbetegségtől függ. A peptid előnyösen az antigén olyan fragmensebéi származtatható# amely az antigén APC-ben történő természetes feldolgozásából keletkezik.

Gyakorlati célokra több más jellemző létezik# amelyet a pepiidnek mutatnia kell. A pepiidnek például oldhatónak kell lennie olyan koncent rációban# amely lehetővé teszi az i.n vivő alkalmazásukat. A pepiidnek előnyösen 0#S mg/ml koncentrációig# előnyösen 1 mg/ml koncentrációig, legelőnyösebben 5 mg/ml koncentrációig kell oldhatónak lennie.

Az intranazális beadáshoz a dózis maximális mennyisége# amely a jelenlegi, eljárások alkalmazásával felvehető# körülbelül 200 μ'1/orrlyuk. Ha a peptid 1 mg/ml koncentrációban oldható# akkor a dupla dózis mindegyik orrlyukba lehetővé teszi 800 pg beadását a betegnek. Bármilyen egyedi dózist alkalmazva az 5 mgnál nagyobb mennyiség beadása meglehetősen szokatlan.

Pontos továbbá# hogy a pepiidnek in vivő elegendően stabilnak kell lennie ahhoz# hogy terápiásán használható legyen. Azt találtuk# hogy in vivő a beadás után 30 perccel a vizsgált pepiid teljes mennyisége 50 %-ra csökkent 4 órával a beadás után a 30 %-ra csekken# de a beadás után 5 nappal a peptid még mindig kimutatható (körülbelül a teljes mennyiség 5 %-ában), A peptid in vivő felezési idejének legalább Iö percnek# előnyösen legalább 30 percnek# előnyösebben legalább 4 érának és legelőnyösebben legalább 24 órának kell lennie#

76.217/SM « Φ Φ Φ X Φ « Φ * * Λ X V φ « X ΧΦΦ

X « * φ «.φ « « Φ # * 1 « Φ Φ » Φ Φ Φ «

Azt találtuk', Hogy intranazális beadást követően a peptid mennyisége a kiürüld nyirokcsomóban a beadást követő 4 óra múlva érte el a csúcsot, azonban a peptid 5 nappal később is kimutatható (körülbelül 5 %-os maximális értéken). A terápiásán aktív koncentrációjú peptid előnyösen hosszú ideig elegendően stabil a kiürülő nyirokcsomóban ahhoz, hogy terápiás hatást fejtsen ki.

A peptidnek in vivő jő biológiai hozzáférhetőséget is keli mutatnia. A peptidnek in vivő olyan konformációban keli maradnia, amely lehetővé teszi számára, hogy akadálytalanul tudjon a sejtfeiszinen az MHC molekulához kötődni.

A gyógyítandó betegségei

Az egyrk kiviteli alakban a találmány második megközelítése szerinti peptidet egy betegség kezelésében és/vagy megelőzésében alkalmazzuk.

Az MHC1I molekula apitópja különösen azokban a betegségekben használható, amelyeket CD4+ T-sejt immunválaszok közvetítenek. Ilyenek például azok a betegségek, amelyek a nem megfelelő vagy túlzott CD4+ T-sejt válaszon alapulnak vagy az igy kialakult válaszreakciók tartják fenn.

Az ilyen peptid különösen a túlérzékenységi rendellenességek kezelése során alkalmazható. A túlérzékenységi reakciók a következők:

(i) allergia, amely az ártalmatlan idegen anyagokra adott nem megfelelő válaszok eredménye;

(ií) autoimmun betegségek, amelyek a saját szöveti antigénekre adott válaszok eredménye; és (iii) átültetett szövet kilökődése, amely a

6.217/SM

Φ * ·> .' Λ < X Φ

-ί φ K Φ Φ transzplantátumra adott immunválasz eredménye.

Az allergiás betegségekre példák, nem korlátozó jelleggel a szénanátha, külső tényezők hatására kialakuló asztma, rovarcsípés és szúrás okozta allergiák, élelmiszer- és gyógyszerallergiák, allergiás nátha, hörgőasztma, krónikus hörghurut, aanafilaxiás tünet, csalánkiütés, érvizenyö, atőpiás börgyulladás, allergiás kontakt bőrgyulladás, a bőr szenzibilizáeiós állapotot kisérő göbös beszűrödése, polimorf bőrpir, StevensJohnson szindróma, orrkötőhártya-gyulladás, kötőhártyagyulladás, a bor kis vénájának üszkös gyulladása, tüdőgyulladás és hólyagos bőrbetegségek.

Az autoimmun betegségekre példák, nem korlátozó jelleggel a ízületi csűz (rheumatoid arthritis, RA) , súlyos izomgyengeség (myasthenia gravis, MG), szklerőzís multiplex (MS), szisztémás fcöilagénbetegség (systemic lupus erythematosus, SLE), autoimmun pajzsmirigy-gyulladás (Hashimoto-kór), Graves-betegség, gyulladásos bélbetegség, autoimmun szemideghártya-gyulladás, több izom egyidejű gyulladása és a cukorbetegség bizonyos típusai, szisztémás érgyulladás, a bőr és a mögötte lévő izmok gyulladása, szisztémás szklerőzís (a bőr keményedésével járó az egész szervezetet érintő kői Iagénbetegség) , Sjogren szindróma, izületi merevséget okozó csigolyagyulladás és ezzel rokon csígolyaizületi báirtaiom, reumás láz, túlérzékenységi tüdőgyulladás, a hörgőtüdő allergiás Aspergillus fertőződése, a tüdő szervetlen por belélegzése okozta betegsége, a bőrön csomók, duzzanatok képződésével járó betegség, autoimmun. hemolitikus vérszegénység, immunológiai eredetű vérlemezke rendellenesség, fagyási sérülések,

76.217/3Μ például fagyás okozta fibrinogénvérűség és a belső elválasztásé mirigyek autoiatmun eredetű rendellenes működése,

A szövetek széles körének, átültetése a klinikai orvoslásban mindennapos, ilyen például a vese, máj, szív, tüdő, bőr, szaruhártya és csontvelő. Jelenleg a szaruhártya és némely csontvelő átültetést kivéve az összes átültetett szövetnek szüksége van az immunrendszer hosszú ideig tartó elnyomására.

A taláixaány harmadik megközelítése szerinti kiviteli alakban a peptidet a cukorbetegség kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmazzuk. Ebben a kiviteli alakban a peptid az IA2 célantigenből származtatható.

A találmány e megközelítése szerinti további kiviteli alakban a peptidet a szklerőzis multiplex (MS) kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmazzuk. A szklerőzis multiplex CMS) egy olyan krónikus gyulladásos betegség, amelyet a központ idegrendszer velőálloraányában elszórtan előforduló, a többrétegű mielinhüvely megszűnésével járó sérülések jellemzik és különféle helyeken és időkben fordulnak elő (McFariin és McFarland, 1982 New Engiand J. Medlcine 307:1183-1188 és 1246-1251). Az MS-ről azt tartják, hogy autoreaktív T-sejtek közvetítik.

Ebben a kiviteli alakban a peptid az autoantigének egyikéből, különösen a mlelin bázikus fehérjéből (MBP) vagy a proteolipld fehérjéből (PLP) származtatható. Az MBF valószínűleg alkalmasabb, mint a PLP, mível a PLP erősen, hidroföb és a belőle származó peptidek hajlamosak egymással összetapadni. Az MSP immunogén fehérje es az MBF-specífikus T-limfociták agyvelőgyulladás kialakítására képesek állatokban (Sega! és mtsai., 1994 Ji

76.217/SM

X «

Φ Λ Λ * < ί Φ X φ φ * Φ»» # φ ♦ ϊ»

Φ Φ φ φ X * Φ φ «

Φ Φ Φ Φ X » ί Α Φ Φ X

Neuroimmunoi. 51:7-19; Vosk.uh.1 és mtsai., 1993 J. Neuroimmunoi

42:187-192; Zamvii és mtsai., 1985 Natúré 317:355-8).

Egy előnyös kiviteli alakban a peptid az MBP .Ammundomináns régióinak, nevezetesen at 1-24, 30-54, 75-93, 90-114, 105-129,

120-144, 135-159 és 150-170 peptidek egyikéből származtatható.

Egy különösen előnyös kiviteli alakban a peptidet azon MBP peptidek közül választjuk, amelyekről kimutattuk, hogy apítópként működnek és a következő peptideket foglalják magukban: 30-44, 80-94, 33-99, 81-95, 82-96, 33-97, 34-98, 110-124,

130-144, 131-145, 132-146 éa 133-147.

Az MHCT molekulához kapcsolódó apitópck alkalmazhatők például a vírus elleni CD8+ válaszok tolerogén módon történő módosítására .

dyőgyszerkészítmény

Feltételezzük, hogy a „bystander szupresszió ellenére szükség lehet több különböző T-sejt klónt megcélozni a tolerancia hatékony indukálása érdekében. Ennélfogva a peptidek sokasága adható be egy egyénnek, hogy megelőzzünk, vagy kezeljünk egy betegséget .

A harmadik megközelítésben a találmány tárgya gyógyszerkészítmény, amely az apitőpok sokaságét tartalmazza.

A gyógyszerkészítmény például 2-50 apitópot, előnyösen 2-15 apitópot tartalmazhat. Az apitópok ugyanabból a célantigénből vagy különböző célantigénékböl származtathatók. Az apitópok előnyösen további feldolgozás nélkül vagy mind az MHCT molekulákhoz képesek kötődni, vagy mind az MHCII molekulákhoz képesek kötődni. Egy előnyös kiviteli alakban a gyógyszerkészítményben lévő / t , Z i ? / 5 ÍÜ összes apitóp további feldolgozás nélkül vagy az MHCI vagy az MHCII molekulákhoz képes kötődni.

A gyógyszer készítmény készlet alakban fordulhat elő, amelyben az apitópok némelyikét vagy az összes apitópot egyszerre, különállóan vagy egymás utáni beadás céljából külön-külön biztosítjuk.

Másik lehetőségként (vagy ezen felül; ha a gyógyszerkészítményt (vagy annak bármely részét) több dózisban adjuk be, a dózisok mindegyike külön csomagolható.

A gyógyszerkészítmény terápiásán vagy prof1taktikusan hatékony mennyiségű apitópot vagy apitópokat és adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot, oldószert vagy kötőanyagot tartalmazhat.

Továbbá a találmány szerinti gyógyszerkészítményekben az apitőp vagy apitópok bármilyen alkalmas kötőanyaggal, kenőanyaggal, szuszpendálő szerrel, bevonóanyaggal vagy oldódást segítő anyaggal keverhető össze.

Adagolás

A peptidet oldható formában adjuváns nélkül keli beadni.

A peptidet előnyösen a nyálkahártyán keresztül adjuk be.

A tanulmányok azt mutatják, hogy az intraperítoneálisan (i.p.), intravénásán (i.v.) vagy intranazálisan (i.n.) vagy orálisan oldható formában beadott peptid T-sejt toleranciát képes indukálni (Anderton. és Wraith (1.998) ; Liu és Wraíth (1995) előzőekben megadott; Metzler és Wraith (1999) Immunology 97:257263) .

A peptidet előnyösen intranazálisan adjuk be.

,21Ζ/ΕΜ

Az egereken végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a tolerancia indukálásához szükséges peptid adagolás Időtartama a Tsejtek prekurzor gyakoriságától függ a befogadó egerekben (Burkhart és mtsai., (1393) az előzőekben megadott). Számos kísérletben bemutatták, hogy a peptid ismételt dózisét szükséges a tolerancia indukálásához (Burkhart és mtsai., (1999) az előzőekben megadott). A peptid pontos dózisa és a dózisok száma tehát az egyéntől függ, azonban az előnyös kiviteli alakban több dózist adunk be.

Ha a peptidek sokaságát egyidejűleg adjuk be, akkor „koktél formájában lehetnek, amely egységdózisban vagy több dózisban adható be. Másik lehetőségként előnyös lehet több dózis beadása, de a peptidek relatív koncentrációja változhat a dózisok között.

Egy előnyös kiviteli alakban „növekvő dózisú profokéit követhetünk, ahol növekvő koncentrációjú dózisok sokaságát, adjuk be a betegnek. Ilyen megoldást alkalmaznak például a foszfolipáz A2 peptidek esetében a méhcsipés allergiával szembeni immunterápiás alkalmazásokban (Múller és mtsai., (1998) J. Allergy Ciin

Immunoi, löl:747-754 és Akdis és mtsai., (1998) J, Ciin. Invest,

102:98-106).

PÉLEÁK

A következő példák a találmány bemutatását szolgálják és semmi módon nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, A találmány előnyösen a példákban ismertetett sajátos kiviteli alakokra vonatkozik.

1. példa - Az MBF-ben lévő T-sejt epi topok azonosítása

Anyagok és módszerek

76.217ZSM ΐ # ί V» «Μ » * # X * *«Φ * ,* ** ί * ♦ ΦΦΦ#*

Antigének

A humán MBP~t az agy velőáilományából állítjuk elő Deibler és mtsai., által ismertetettek szerint (Deibler és rntsaí., 1972 f/reparative Biochemistry 2:139} és a tisztaságát SDS-PAGE segítségévei állapítjuk meg. Az MBP-t és a Mycobacteríun? tuberculosisből tisztított fehérje származékot (PPD)(ÜK Central Veterínary Lahoratory, Surrey) az előzőleg meghatározott optimális koncentrációkban alkalmazzuk a proliferáciős vizsgálati módszerekben; ahol az optimális koncentráció mindegyik antigén esetében 50 pg/ml. Szabványos F-moc kémiai szintézist Abimed AMS 422 típusú, több peptid előállítására képes szintetizálókészüléken (Abimed, Langenfeld, Németország) alkalmazva állítjuk elő a teljes MBP-t lefedő 15-mer átlapoló peptideket tartalmazó lemezt. Mindegyik, pépeidét 5 aminosavval helyettesítjük és 10 aroinosavval átlapoljuk, 33 pepiidet készítünk le, amelyeket 3-as csoportokba gyűjtünk és a készleteket 50 pg/ml optimális koncentrációban vizsgáljuk, oly módon, hogy in vltro mindegyik peptid 16,6 pg/ml koncentrációban legyen jelen.

Betegek és kontrol alanyok

A vizsgálat alanyai klinikaiiag pontosan leírt vagy laboratórium által alátámasztott, pontosan leírt MS-ben (Poser és mtsai., 1983} szenvedő, 29-51 év közötti 12 beteg. A 12 beteg közül nyolc vesz részt interferon-β vizsgálatban, egyébként az összes többi MS beteg nem kap kortikoszteroid kezelést a vizsgálat megkezdése előtt legalább 3 hónapig. A kontrol csoport 13 egészséges egyénből áll, akik 25-55 évesek és egyikük sem kap immunszuppresszív kezelést a vérminta levételét megelőzően lég76.217/SM 29 ·· · ;

Φ * o « *««.« *

Ν Φ φ X * Φ » -* Φ #« alább három hónapig.

Szövettenyésztő közeg

A 20 mM HEPES-szel (Sigma, Poole, Egyesült Királyság), penicillinnel (100 ü/ml) , sztreptomicin-szulfáttal (100 mg/ml) és 4 mM L-glutaminnal (mindegyiket a Life Technologies, Paisley, Skócia cégtől kapható) kiegészített HPMI-1640 táptalajt alkalmazzuk szövettenyésztő közegként. A szérummentes közeget használjuk a limfoid sejtek és a TCL mosására. Az összes tenyésztéshez használt körülmény és vizsgálat esetében a közeget 10 % hővel inaktivált autológ plazmával egészítjük ki.

A tenyésztési körülmények és a T-sejt proliferáciös vizsgálatok

Citráttal kezelt perifériás vért (50-100 ml) gyűjtünk érbeszürás segítségévei minden alanyból, miután írásos beleegyezésüket adják a vizsgálatokhoz. Perifériás vér mononukleáris sejteket (PSMC) izolálunk a vérből süröségkülönbségen alapuló centrifugáiással Hístopaqne-1077 berendezésben (Sigma, Poole, Egyesült Királyság), majd a PPD-t, MBP-t vagy MBP peptídeket tartalmazó l,g mi térfogatú zl-lyukú szővettenyésztő lemezekben (Nunc International, Costar, Corning Inc. New York, USA} tenyésztjük Őket 1x10° sejt/mi koncentrációban. A lemezeket 37’C-on inkubáijuk 5 % CO₂ / 95 % levegőt tartalmazó nedvesített légkörben. Az 5. es 14, napok között két 100 qi-es alikvótot veszünk ki mindegyik tenyészetből, majd 96-lyukú gömbölyű fenekű mikrotiter lemezekbe visszük át őket és 0,1 pCÍ [^JH]-timidint (Amersham International, Amersham, OK) adunk hozzájuk, 18 órával később sejteket gyűjtünk üvegszálas alátétekre (LKB-Wailac, Turku, Finnország) Mach 111 harvester 96' készülék (Tomtec,

Φ* φ

76.217/SM

Φ Φ Φ Λ Φ Φ Φ * ¥ « «κ* * * *** φ » φ φ α φ Φ φ φ

Φ» * φ φφ φ φφκ

Orange, New Jersey, USA) alkalmazásával. A pH]-timidin beépülését Microbeta folyadék-szcint í iiáciős számlálóval (LKB-Wailao) határozzuk meg. Az antigént tartalmazó vizsgálati lyukakat akkor tekintjük pozitívnak, amikor a ócpm >1000 és a stímulációs index (Sí) >3, ahol az SÍ - az antigént tartalmazó tenyészet beütésszáma/az antigént nem tartalmazó tenyészet beütésszáma.

A T-sejtvonal és a T-sejt kiónok előállítása

Az MBP-specifikus T-sejtvonalakat (TCL) 8 MS betegből és 2 egészséges kontrol donorból állítjuk elő. Az alanyokból származó

PBMC-t az előzőekben ismertetetteknek megfelelően különítjük el és 1x10'' sejt/ml mennyiségben δ-lyukú lemezekbe tévézzük őket MBP (50 ug/ml) jelenlétében; az alanyból származó PBMC adagját szabályosan lefagyasztjuk és ezt követő újbóli stimuiálás céljából tároljuk. Hét nappal később a sejtekhez 2 % IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, Egyesült Királyság) tartalmú friss közeget adunk és a tenyésztés 12. napján ez összes sejtet az antigén prezentáló sejtek (APC) forrásaként újra antigénnel, IL--2vel és besugárzott (2500 Rád) autolőg PBMC-vei stimuláljuk 1 Tsejt:S APC sejtarányban. A sejteket 3-4 naponta IL-2-ben szaporítjuk és a 14. napon újra antigénnel, IL-2-vei és PBMC-vei stimuláljuk az előzőekben ismertetetteknek megfelelően. Az első üjrastimulálás napján a sejteket az MBP-vel szembeni specifikus proliterácioj okra vizsgáljuk. Röviden 2xI0'^J T-sej tét és Ixlö³ besugárzott autolőg PBMC-t tenyésztünk három párhuzamos mérésben, 96-lyuku gömbölyű fenekű lemezekben MBP jelenlétében. A sejteket 2 napig tenyésztjük, majd a tenyésztés utolsó 18 órájában pH]timidint adagolunk 0,4 uCi/lyuk értékben. Ezután az előzőekben

76.217/3Μ ismertetetteknek megfelelően sejteket gyűjtünk és a TCL-t akkor tekintjük MBP-speci£ikusnak, ha ócpm >1000 és SÍ >3.

A következő 3 űjrastimulálás/növekedés ciklus után a TCL-t PHA (Sigma, Pool.e, Dorset, Egyesült Királyság) alkalmazásával APC-ként autológ besugárzott PBMC jelenlétében klónozzuk. A Τ'sejteket 0,1 sejt/lyuk, 0,3 sejt/lyuk és 1 sejt./lyuk határhígitásos körülmények között lemezekre visszük fel, majd IxlO⁴ besugárzott PBMC-t, 5 pg/ml PHA-t és 2 % IL-2-t tartalmazó Teresaki lemezekben (Nunc International, Costar) tenyésztjük őket. 10-12 nap múlva egy 96-lyukú gömbölyű fenekű lemezen 1x10 besugárzott PBMC, 5 yg/mi PHA és 1L-2 alkalmazásával tovább szaporítjuk azoknak a lyukaknak c-ι tartalmát, amelyekben növekedés tapasztalható. Három nappal később a lyukakba IL-2-t tartalmazó friss közeget adunk, majd a 7. napon a klóhokát 48-iyukü lemezeken 5x10 besugárzott PBMC, PHA és IL-2 segítségévei szaporítjuk; ennél a pontnál a klórokat proliferációs vizsgálati módszerekben az MBPre adott specifikus immunválaszokra vizsgáljuk. Az MBPspecifikus kiónokat egy héttel később 24-lyukú lemezeken .lxlö^b besugárzott PBMC, PHA vagy Dynabeads (Dynai, Egyesült Királyság) és 1L---2 alkalmazásával szaporítjuk. A kiónokat 24-lyukú lemezekben tartjuk fenn 7-10 napos újrastimulálás/növekedés ciklus alkalmazásával lényegében az előzőekben ismertetetteknek megfelelően. Az előzőekben ismertetetteknek megfelelően proliferációs vizsgálati módszerekkel vizsgáljuk a T-sejt kiönok azon képességét, hogy felismerik az MBP peptidek mátrixát.

Eredmények

Az MBP-peptid felismerése az MS-betegek és az egészséges egyének

X

76,217/SM χ ψ«ίί.

¢-. « « ♦ φ « »»« > Φ Φ χ

Κ Ο Ζ. ö tt.

Olyan kinetikus immunválasz vizsgálati módszert alkalmazunk, amelyben az MS-betegekből és egészséges alanyokból származó PBMC-t vizsgálunk abból a célbői, hogy meghatározzuk vajon képesek-e a humán MBP teljes hosszát lefedő, átlapoló 15-mer szintetikus peptidek mátrixára immunválaszt adni, A tenyészetekből származó PBMC proliferativ válaszát vizsgáljuk 2 hét alatt 5 időpillanatban, és összehasonlítjuk az MBP-re és a peptidekre adott immunválasz kinetikus profilját a PPD-re adott immunválasz kinetikus profiljával, ahol az utóbbi egy másodlagos immunválaszéra feleiős/memőria antigént jelöl. Nem találtunk jelentős különbséget az MBP-re és/vagy peptidekre adott PBMC immunválaszokban az Interferőm-β kezelést kapó betegek és azok között, akik nem kapnak ilyen kezelést (az adatokat nem mutatjuk;. A. MBP-re adott immunválasz az M3-betegekben és az egészséges kontrolokban is később éri el a csúcsát, mint a PPD-re adott immunválasz, ezáltal a nem jö memöriájű antigénre adott immunválasz kinetikus tulajdonságait követi. Az 1, ábra a PPD-re és az MBP-re adott immunválaszok kinetikus profiljainak jellegzetes példáit mutatja az MS-betegekben és egészséges egyénekben.

Amint az a 2. ábrából látszik az MS betegek által leginkább felismert két peptid a 90-114 és 75-9S (6/12 (12-bői 6) beteg esetében), amelyet a 30-54, 135-159 és 150-170 (5/12 beteg esetében) és 1-24, 105-129 (4/12 beteg esetében) peptidek követnek. Három betegnél tapasztalható immunválasz a 15-39 és 120-144 peptidekre. Két beteg ismeri fel a 45-69 pépeidét és a 60-84 régióra egyik MS-beteg sem reagál.

17/SM » Φ fc « fc

Φ fc <

fc fc « fc í « «xxfc fc

A 10. ábrának megfelelően, ahol az összes beteg HLA-DR2 pozitív, az MS-betegek által leginkább felismert két peptid a 90Ili és 75-99 (6/11 beteg esetében), amelyet a 120-144, 135-159 és 150-170 régiók (5/11 beteg esetében) és az 1-24, 15-39, 30-54 és 105-129 régiók (4/11 beteg esetében) követnek. Három beteg reagál a 45-69 régióra, és a 60-84 régióra szintén nem reagál egyik beteg sem.

Ezzel ellentétben az egészséges egyének jóval kevesebb peptidet ismernek fel, azaz csak két kontrol alanynál· tapasztalható 2-nél több peptid felismerése. (C és J; 3. ábra) . A C és J kontrol egyenek ismerik csak fel a 60-84 régiót, amely régióra nerc tapasztalható immunválasz a betegek e csoportjában. Meglepő módon a két egyén DR81* 0701 alléit expresszálnak. A 45-69 és 105-129 régiókat egyik egészséges donor sem ismeri fel, mig a 75-99 és 150-170 régiókat 4 egészséges egyén; a 135-159 régiót három egyén; az 1-24, 30-54, 60-34 és 120-144 régiókat két egészséges egyén; és a 15-39 és 90-114 régiókat egy egyén, ismeri tel. összességében a 13-ból 3 egészséges egyén nem. válaszol az átlapoló peptidek egyikére sem, mig 12-fool 1 beteg (MS 19) következetesen nem képes felismerni az MSP peptideket. Megjegyzésképpen ez a beteg az egyetlen, aki nem ad imunválaszt az MSP fehérjére .

A 1.1 , ábra szintén az egészséges egyének MSP peptidekre adott immunválaszait mutatja. Ebben a vizsgálatban csak 1 kontrol alany adott immunválaszt 2-nél több pepiidre (MII.) . Az dli alany az egyetlen, aki a 60-84 régiót felismeri, amely régióra nem tapasztalta tó immunválasz a betegek e csoportjában. A 15-39,

7S.217/3M 34 4 ί*** φ <· « ♦·*»#♦ ♦«*

Φ Φ Φ A *ΧΨΦ * φ'φφ *♦ ♦« Λ Φ*Φ

5-63 és 105-129 régiókat az egészséges donorok egyike sem ismeri fel, mig a 120-144 és 135-153 régiókét két egészséges egyén; és az 1-24, 30-54, 60-09, 75-99, 90-114 és 150-170 régiókét egy egyén ismeri fel. Összességében 12-bői 9 egészséges egyén nem ad immunválaszt a2 átlapoló peptidek egyikére sem.

összességében sz MBB-re és/vagy a peptidekre adott immunválasz-maximum elérésének napja nem tér el jelentésen az egészséges egyének és betegek között, és a. csoportokban a kinetikák az elsődleges antigén iamiun válaszhoz hasonlítanak. Továbbá az MBBre és a peptidekre adott immunválasz mértéke nem különbözik a betegek és az egészséges egyének között.

Az MB B-pép11d fel1a;ye r é s é ne k iné függvényében tört énÖ változása

Az MBr peptidek széles spektrumára immunválaszt adó MB-ben szenvedő betegeket alapul véve elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk vajon a BBMC felismerés ugyanazokban az egyénekben a körülbelül 4-12 hónapos időtartamra összpontoaui-e, illetve ezen idő alatt stabil-e. Amint a 2, 10 és 3. ábra mutatja sem az MS-betegek, sem az egészséges egyének nem mutatják ugyanazt a pepiid felismerő mintázatot,

A 4« ábra egy MS beteg (M49) példáját mutatja be, ki több pepiidre is 2 különböző időpontban ad immunválaszt, de 4 hónappal később mert második időpontban a felismerési profil jelentősen eltér. Azaz a második kinetikai vizsgálatban a 15-39, 30-54 és 150-176 régióra adott FSMC válasz tovább tart, azonban a 7599 és 165-129 régiókra adott válasz visszaesik és a 90-114 és 135-159 régiók irányába változik.

Az 5« ábra egy beteg (MS 66) példáját mutatja, akinek a szó76.217Zsb

SS fc fcX fcfc fc fcfcfcX

Xfc fc .fc X fc fc X fc fc fc * X fc fc fc fc fc fc fcfcfc fc fcfcfcfc fc fcfcfc fcfc fc fc fc fcfcfc les epitőp immunválasza egy koncentrált immunválasszá. fejlődik vissza a 4 hónapos vizsgálatban. A második immunválasz időpontjára vizsgált egészséges egyének egyik peptidre sem reagálnak a második körben (3. ábra).

összességében az eredmények azt mutatják, hogy az MS-ben szenvedő betegek nem mutatnak szabályos mintázatú felismerést. A betegekben a több peptidre adott kBHC válasz képes tovább fennmaradni, visszafej lódul és az KBP űj régiói irányába eltolódni, amint azt az MS 49 betegnél láttuk.

Amikor a peptidekre adott PBHC választ 3 vagy több különböző időpontban vizsgáljuk 12 hőnapos periódusban, nyilvánvalóvá válik, hogy bizonyos betegekben az epitópok felismerése inkább ingadozni látszik mintsem, hogy irreverzibilisen eltolódna űj peptidrégiök irányába. Amint azt a 2 és 10, ábrák mutatják, például az MS fű beteg a '120-144 és 135-159 régiók felismerésének ciklikus mintázatát mutatja; azaz a '120-144 és 135-159 maradékok azok között vannak, amelyeket az első vizsgált időpontban felismernek, a második, időpontnál a 2 régióra adott immunválasz viszszaf ej Idáik, majd a 4 hónappal később mért harmadik időpontnál újra megjelenik. Az bő 41 beteg kinetikus profilja hasonló módon azt mutatja, hogy a 135-159 régió felismerése több időpontban ingadozik (lásd 2 és 10. ábrák).

Az egészséges csoportban (3. ábra) az egyik egyén (b) a 7539 és 135-159 régiókra ingadozó immunválaszt mutat, egy második egyén <F) a vizsgált három időpontból kettőben ismeri fel a 7599 régiót, mig egy harmadik alany (D) a 15-39 maradékra adott

76,217/SM « Λ ciklikus immunválaszt mutat.

Az MBP-re adott, immunválasz finomtérképezése

MS-betegből és 2 egészséges egyénből T-sejt klónokat (TCC>

nyerünk kí, majd a kinetikus válasz vizsgálatokban azonosított peptidrégiók finomított spéciiitásánák tisztázása érdekében használjuk fel őket. A TCC-k specifikusságát a 15•••mer peptidek mátrixára adott proliferatív válaszuk segítségével vizsgáljuk. Az SD:.A7 klón az 1-24 régiót ismeri fel és ezen régión belül a TCC az 5-19 pepiidre ad immunválaszt. A 30-54 régiót 4 klón (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) ismeri fel és a régióban a 30-4 4 aminosavnak megfelelő epitóp található. Az MS-betegből. származó egyik kién (M39:D?) a 60-74 peptidet ismeri fel és meglepő módon egy egészséges egyén ad immunválaszt erre a régióra (60-84) a kinetikus immunválasz vizsgálatunkban. öt klón (MS43;A7, MS41:B6, MS4i:A2, MS4I;C6, N5:8) ismeri fel a 83-99 peptidet, amelyet a 75-99 régió tartalmazza. Egy beteg hoz létre TCC specifikus választ a 110-124 peptid (MS60:A2, MS60:B3) esetében, amely a 105-129 készletből származik és ugyanabból a betegből származó másik TCC specifikus a 130-144 (MS6Ö:E1) peptidre, amely a 120-144 régióban található meg. Öt egyén termeit olyan klónokat, amelyek a 135-159 régión belüli epitőpokat ismerik fel; az MS60:F7, MS6O:D1, MS59;E1 és N5;19 a 140-154 peptidet ismeri fel; az MS5?:A1 a 140-149 peptidre specifikus és az M317:A3 T-sejt klón a 130-144 szekvenciára ad Immunválaszt. A klőnok e sorozata világosan mutatja legalább 2 T-sejt epitóp meglétét az MBÍ? 135-159 régióján belül. Végül a 150-170 régiót a '156-169 peptidre specifikus 2 kién ismeri fel. Az Összes T-sejt

61217/ΕΜ klón specifikusságát a 6, ábrán összegezzük,

2. Példa - ae MBA-ben lévő apitópok azonosítása

Anyagok és módszerek

APIPS-t alkalmazó antigén-bemutató vizsgálat

A peptidek T-sejt kiónoknak történő bemutatását proliferáclő segítségével mérjük. Az APC-t 0., 5 %-os paraformaldehidfoen rögzítjük és lyukanként 1x10' sejtet helyezünk 96-Iyukú szövettenyésztő lemezre. Ezekhez T-sejt kiónokat adunk lyukanként 2x10’ sejt mennyiségben a peptidek különböző koncentrációjával együtt.

órás 37‘C-on történő inkubálás után a ÍH]-timídin 16-20 órán keresztüli beépülésével mérjük a proliferáciőt. Az eredményeket összehasonlítjuk a T-sejtek élő APC áltai bemutatott epitőppal. szembeni válaszadó képessége szempontjából.

A peptidek DR2:MBP82-Iöö transzgeníkus egérből izolált Tsejleknek történő bemutatása lényegében ugyanaz, mint az előzőekben ismertetettek, kivéve, hogy az APC-t lyukanként 5x10° sejt mennyiségben rögzítjük, a T-sejteket lyukanként 1x10 sejt menynyíségben adjuk a lemezhez, majd 72 órát hagyjuk inkubálni a [⁵Hj-timidin hozzáadása előtt,

Eredmények

Ebben a kísérletben a korábbi példában építőnként azonosított peptideket vizsgáljuk azon képességükkel kapcsolatban, hogy az APIPS segítségével bemutatásra kerülnek-e. Az eredményeket a 7b. ábrán mutatjuk be. Ennek megfelelően öt epitőpot vizsgálva, négyről azt találtuk, hogy api tépek (30-4 4, 80-94, 110-124 és

130-144} és egyről azt találtuk, hegy epitópként működik, de apitőpként nem (106-170).

ft ϊ ί Λ Λ ϊ Α * * * ♦ Φ 0 < Μ 0 \ 0 0 0 0 0 0 0 «»*

2Α példa ~~ A 30-44 _f 110-124,, 130--144 és 1S6-17Ö MBP peptidek vizsgálata

Annak vizsgálata érdekében, hogy vajon a különféle MBP peptidek apitópok-e, megvizsgáljuk, hogy a rögzített APC hogyan képes bemutatni a peptideket a T-sejleknek, Elő és korábban pulzált Mgar {HLA-DR2+ve) sejteket szérumban előpulzálunk a relvételével mérjük.

Amint a 8 és 9. ábrák mutatják, a 30-44 (8A. ábra), 110-124 (8B. ábra) és 130-144 (9A. ábra) peptideket a rögzített APC feldolgozás nélkül képes bemutatni. Ezeket a peptidek emiatt api topokként határozzuk meg. Másrészt a 156-170 pepiidnek további feldolgozásra van szüksége a T-sejtöknek történő bemutatásához (98. ábra). A rögzített APC képtelen bemutatni ezt az aprtöpnax.

25. példa - Az azonosítása

77-100 és 125-148 régióín belül lévő apitópok

Bármely adott eoitóp esetében létezhet egy vagv több apitőp, eme.·, vés az an jozas neiKUi Kepes neme

MBP két régiólán belül lévő aoitóook meglétét az élő vagv oM.sora;

φ ? Ο 'ί'ι '? / IV « *« *» * ».*«

V \.· < Λ. _s<. k Φ..·» Λ *· -· ¢. φ φ «ί Λ φ φ «ί φ Φ Φ V X Φ *· φ χ* * * ♦' * Φ Φ * Φ Φ X *

ΦΦΧ <ίφ φ< φ Φ*Κ inkubálásávnl vizsgáljuk, 72 óra után (12. ábra) vagy 48 óra után (13. ábra) T-sejtsket adunk hozzá, majd a ϊ-aejt proliferáciős válaszát a ³H-timidln felvétellel. mérjük, Az MBP 77-100 régió esetében a 1-sejteket DP2;MBP 32-100 transzgenikus egérből izoláljuk, mig az MBP 130-144 régié esetében MS17:A3 Ϊsejt kiónt alkalmazunk.

Az MBP 77-100 régiója esetében apitópként definiáljuk a következő -peptideket;

MBP	83-99	BM P WH FFKM1VTPRT P
MBP	80-84	TQDBMPVVHPPKMIV
MBP	31-95	QDSMPWMPFKMIVT
MBP	82-86	BBMPVVBFPMM1VTP
MBP	3 3-97	BBPWHFFKMIVTPB
MBP	84-83	MPWBFFKMI7TPBT

A DR2 MBP 82-100 transzgenikus egérből származó T-sejtek által felismert minimális MBP szekvencia a 85-94 régió.

Az MBP 125-148 régiója esetében apitópként definiáljuk a követ ke tő pépt ide ke t:

MBP 130-144 BA6DÍKSABKGFKGV

MBP 131-145 ASBÍMSABKGPKGVD

MBP 132-146 SBYKSAHKGFFGVDA

MBP 133-147 DYMSAHKGFKGVDAQ

Az MS17;A3 T-sejt klón által felismert minimális MBP etek~ vennie a 133-144 régió,

SC. példa - te 89-101, régiéjtete viasgélate

Korábban bemutattuk, hogy ellentétben más mielin T-sejt epitóppai az oldható formájú 88-101 peptid beadása nem gátolja

76.2I7/SM az egér teljes mielinnel vagy magával a 89-101 peptiddel indukált kísérletes autoimmun agy- és gerincvelőgyulladást (EAE)(Anderton és Wraith (1998) Eur. J, Immunoi. 28:1251).

Az ihBP 89-101 régió három T-sejt epitópot tartalmaz

A T-sejt MSP 81-111 régiójával szembeni reaktivitásának vizsgálata érdekében 81-111 pepiiddel immunizált egér nyirokcsomó sejteket in vitro 81-111 pepiiddel stimuláljuk és a sejteket a 81-111 régiót lefedő két aminosav eltolást tartalmazó lö-mer átlapoló peptidek sorozatával vizsgáljuk (nevezetesen: 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99108 és 101-111) . A 89-101 régiót lefedő pepiidekre adott válaszmintázat stimulátor képességet mutat az 5 szomszédos peptid esetében (^-terminális 87-96 pepiidtől a 95-104-ig), amely legalább két (talán három) eltérő epitőp meglétét tükrözi. Ahhoz, hogy ezt a régiót tovább vizsgáljuk, három sejtvonalat hozunk létre az eredeti 81-111 pepiidre válaszképes T-sejtvonalbő'l, majd ezeket újból levizsgáljuk a 84-106 régiót lefedő egy aminosav eltolást tartalmazó lö-mer átlapoló peptidek sorozatával. Az eredmények három eltérő, de átlapoló T-sejt epitőp meglétét tárják fel a 83-101 szekvencián belül: ezek a 89-94, 92-98 és 95-101 peptidek (lásd 14. ábra.) .

Az MBP 92-98 peptid egy rejtett epitőp

A három epitőp-specrfikas T-sejtvonai (TCL) érdekes különbségeket mutat, amikor a 89-101 pepiidhez és a teljes rekombináns MBP-hez képest vizsgáljuk a reaktivitásukat. Mindhárom TCL reagál a pepiidre (89-101), de csak a 89-94 és 95-101 specifikus TCL reagál a teljes MBP-re, Ez azt jelenti, hogy az ép MBP anti76.217/Sd gén feldolgozás előnyösen olyan ligandumokat hoz létre a Tsejtek számára, amelyek .felismerik a 89-94 és 95-101 peptídeket, de nem Ismerik fel a 92-98 peptidet. Es azt sugallja, hogy a 92™ 98 epitóp rejtve marad (azaz nem hozható létre sz eredeti antigén feldolgozásával). Ügy tűnik, hogy az MBP 69-101 peptid képes az MHC molekulával három különböző kölcsönhatásban részt venni, amely olyan peptid/MHC ligandumokat eredményez, amelyeket három, különböző T-sejt populáció ismer fel. Az MBP feldolgozása azonban csak ezek közül két T-sejt populációnak megfelelő ligandumokat hoz létre (lásd 14. ábra).

Az EAE redukálásához olyan autoantígén epitőpok T-sejt felismerésére van szükség, amelyek az ép MBP lebomlásának eredményeként expresszálódnak a központi idegrendszerben. Az egerek immunizálása a három korábban azonosított T-sejt epitőpok csak egyikét tartalmazó peptidekkel azt mutatja, hogy csak a természetes úton feldolgozott epitőpok (89-94 vagy 95-101) tartalmazó peptidek képesek EAS-t indukálni. Ez is azt a felfedezést támasztja alá, hogy a 92-98 régió egy rejtett epitóp.

Az MBP 92-98 peptid az MBP 69-101 régió_domináns epitópja

Amint az előzőekben említettük a 89-101 régió hárem eltérő, de átlapoló peptidet tartalmaz. Ezek közül a 92-98 peptid tűnik dominánsnak, e régióban. Például amikor T-sejt kiónokat hozunk létre 89-101 peptiddei immunizált egerekből, mind a hat létrehozott klón reagál a 92-98 pepiidre. A minden helyzetben egyedi alanin helyettesítéseket tartalmazó 89-101 analóg peptidek alkalmazásával azt találtuk, hogy a. 92-98 helyzetek bármilyikének helyettesítése a váiaszképesség hiányához vezet, ami azt mutat76.217/SM ja, hogy a 92-98 magon belül bármely maradék módosítása jelentős hatással van ennek sz epitőpnak a felismerésére.

Az MSP 8 9-101 peptid.....képtelen toleranciát, kialakítani a termeszetes úton feldolgozott MBP epitópotfelismerő EAE-releváns Tsejtekben.

Az előző felfedezések összegzéseként azt találtuk, hogy a) a

89-101 szekvencia 3 eltérő T-sejt epitöp létrehozásának lehetőségével rendelkezik; b) ezek közül csak két epitöp (89-94 és 95101) jön létre az ép MBP antigén, feldolgozása során (akár in vitro, akár in vivő) ; c) csak a természetes úton feldolgozott epitópokat tartalmazó peptidek hatékonyak az EAE indukálásában és a rejtett epitópot tartalmazók nem; d) a 89-101 peptid képtelen védelmet biztosítani az EAE-vei szemben a peptid kezelési kísérletekben.

Ez az információ szolgál alapul ahhoz a vizsgálathoz, amelyben megvizsgáljuk azt a hipotézist, hogy a 89-101 peptid képtelen toleranciát kialakítani az EAE ellen, mivel nem képes közvetlenül lekötni a betegségben releváns ’Γ-sejteket. A hipotézis alátámasztása érdekében a peptid (89-101) nem kell, hogy toleranciát indukáljon a fő enkefa 1.1 bogén epitóppal szemben, mivel az nem kötődik közvetlenül az MHC restrikciós elemhez (I-A“') a megfelelő konformációban. Másszával 89-101 peptid nem működik apitőpként a 89-94 pepiidre adott T-sejt válasz esetében.

E lehetőség vizsgálata érdekében tolerancia kísérleteket végzünk 89-101 és 87-96 peptídekkel. (15 A és 3 ábrák) . A 87-96 peptid tartalmazza az EAE indukálásáná1 leghatékonyabb epitópot (89-94)

76.217/SM £i gárasok

Egereknek PBS-ben levő 200 μη peptidek vagy csak PBS~t adunk intraperitoneállisan 8, 6 és 4 nappal azelőtt, hogy komplett

Freund- -f. é le adjuvánsban lévő 100 gg peptidet adnánk. 10 nappal később kiürülő nyirokcsomó sejteket (6xl0³/lyukg 72 órán át tenyésztjük 5x10^ M 2~merkaptoetanollal és 2M L-glutaminnal kiegészített X-Vivo 15 közegben antigénnel vagy antigén nélkül. A tenyészeteket 16 órát 0,5 güi ^JH-t.imídinnel telítjük, majd folyadék szcintiiláciős számláló segítségével mérjük a beépülést. Az eredményeket a három párhuzamos tenyészet beütésszám/perc értékében fejezzük ki.

eredmények

A 87-96 pepiiddel történő immunizálás erős emlékező (vagyis ezzel a pepiiddel· mái' találkozott az immunrendszer) immunválaszt indukál önmagára és gyenge immunválaszt indukál a 89-101 pepiidre (15 A és 3 ábra, □, illetve o) . Ez összhangban azzal, hogy a 89-94 peptid 89-101 régióból történő előállításához antigén feldolgozásra van szükség. A 87-96 pepiidet a 87-96 pepiiddel való immunizálást megelőzően toierogén anyagként alkalmazva elnyomja a 87-96 és a 89-101 pepiidre adott emlékező immunválaszokat (15 A ábra, illetve »). Ezt 89-94 reaktív T-sejtekkel ellátva, amelyek már egyszer in vivő válaszképtelennek bizonyultak, azok nem képesek a 89-94 pepiidre választ indukálni in vdero akár a 89-96-ből, akár a 89-101-foől hozzuk létre a peptidet. Döntően azonban a 89-löi peptid tolerogénként történő alkalmazása a «7-96 pepiiddel való immunizálás előtt nem képes

78,217/SM «·»' *

Λ -S* visszaemlékező immunválaszokat Indukálni a 87-96 vagy 99-101 peptidekre (15 B és A ábrák, B illetve *} . Szék az adatok azt mutatják, hogy a 89-181 peptid tolerogen formában történő beadása nem képes toleranciát indukálni a 88-94 szekvencián, alapuld természetes módon feldolgozott enkefalitogén. epitóppai szemben; a 89-101 peptid képtelen apitópként viselkedni a 89-94 epitöp esetében.

Anélkül, hogy egy elmélethez ragaszkodnánk, ügy hisszük, hogy a megfigyelések a 89-101 peptid MHC peptidkötö helyében lévő elhelyezkedésével magyarázható. .Ha a peptid előnyösen oly módon kötődik, begy a 92-98 régid a peptid-kötö zsebben helyezkedik el, akkor azt felismerik az MBB92-98-speoif1kus T-sejtek, Ez megmagyarázza, hogy amikor az egereket MBF89-10I pepiiddel immunizáljuk, miért ismeri fel az M8B92-98 epitőpot a keletkezett Tsejt kiének mindegyike. Ehhez hasonlóan, amikor 89-101 peptidet használunk a T-sejtek toleranciájának indakálására, akkor az legfőképp azokban a sejtekben indukál toleranciát, amelyek felismerik az MBF92-98 epitőpot. na az M8B92-98 peptid egy rejtett epitöp, akkor a teljes antigén természetes feldolgozása során nem képződik és az epitőpot felismerő T-sejtek valószínűleg in vivő nem fordulnak elő. Még ha sz MBP82-98 specifikus T-sejtek léteznek is in vivő, akkor sem fontosak a betegségben, Bnnélfog- | va a 89-101 peptid nem képes gátolni a teljes MHB-vel indukált kAB-t.

. példa - Aa ffö égőm WRátelfew álkmlmazokb peptid twápáa korábban Ismertettük, hogy a szisztémásán, akár intraperitoneáiisan <Liu és Wraith (1995) int Immunoi 8:128576,2X7/5(9

X-ó !ÍX

1263), akár intranazálisan (betzler és Araith (1993) 5:1X591165) beadott peptid antigén egyszeri dózisa védi egészen 3 hónapig hatékonyan az egereket a kísérletes autoimmun agy- és gerincvelögyuliadássai szemben (detzler és Wraitb (1999) Immnnology 97:257-263), Legalább 5 dózis pepiidre van szükség tolerancia indákélátása Tg4~transzgenikus egérben (Bnxkhart és rntsai,, (1999) 11:1625-1639), amely EAB-specifikus T-sejt receptort expresszál (Liu és ártsál,, (1995) Immun!ty 3:907--415), A legújabb munkák azt ismertetik, begy a Tgi egérben az intranazálís (XK) útvonal biztonságosabb, mint az intraperifconeélis (19) útvonal még akkor is, ha mindkét megoldás egyaránt biztonságos a nem transzgenikas egérben.

Az MSP 83-99 peptidjét kug/D6 transzgenikas egérben vizsgáljuk, amely a megfelelő HLA-DR2 MHC XI molekulát és erre a pepiidre specifikus humán T-sejt klánból származó TCR-fc is expresszál, Az egereket a peptiddel kezeljük vagy a Tg9 transzgenikas egér kezelésére alkalmazott szabványos dózist (Tg4 protokol), vagy a peptid dózis kiterjesztését alkalmazó deazenzitizáió protökölt követve, amelyet az allergiában szenvedő betegek kezelésére használnak (deszenzitizálé protokol}.

Tg4 protokol: egerek egy csoportját 25 ul teljes mennyiségű 83-99 peptid (fősziét-puíferolt sóoldatban (PB8) lévő 9 mg/ml peptid) vagy csak F.BS intranazálís beadásával kezeljük. Az egereket a hét első és ötödik napján kezeljük 5 hétig összesen 10 dózist adagolva, A 6, hét elején mindegyik egeret Komplett Freand-féle Adjuvánsban (CFA) lévé 83-99 peptiddel injektáljuk, majd az egerek Fertussis Terin (200 ng} intraperitoneáiis injek7 6,21 tálast is kapnak az első és a harmadik napon. Legalább 30 napig figyeljük as EAE kifejlődését.

Deszenzítízálő protokol: egerek egy csoportját 25 pl teljes mennyiségű 83-99 peptid folyamatosan növekvő dózisának vagy csak PBS-nek intranazális beadásával kezeljük. A növekvő dós: is 0,1 yq-rői indul és 1, 3, 6, 12, 50, majd 100 pg-ig folytatjuk. Az egereket minden hét első és ötödik napján kezeljük 5 hétig cszszesen 10 dózist adagolva. A 6. hét elején mindegyik egeret

Komplett Freund-féle Adjuvánsban (CFA) lévő 83-99 pepiiddel injektáljuk, majd az egerek Pertussis Toxin (200 ngs intraperitoneálís injektálást is kapnak az első és a harmadik napon. Legalább 30 napig figyeljük az EAE kifejlődését.

4. példa - Apitop koktél nazális beadása MS betegeknek

Vakcinát, készítünk, amely a következő MBP peptideket tartalmazza: 30-44, 83-99, 110-124 és 130-144 (azaz azokat az MBP peptideket, amelyeket apitöpként azonosítunk). A vakcinát 35 betegnek adjuk be Ia/Ib fokozatú vizsgálatban. A vizsgálat egy egyszerű ke reszto.s ztá 1 yozás i vizsgálat, ahol a betegeket három hónapig nem kezeljük, majd a peptid egyszeri dózisát adjuk be (iag. Ezután három hónapig figyeljük a betegeket a vakcina egyszeri dózisának beadását kővetően, hogy megállapítsuk a biztonságát. A kezelés ezután heti kétszeri intranazális beadásból áll. Mindegyik beteg esetében havonta vizsgáljuk a klinikai aktivitást raágnesrézonancián alapuló képalkotással; figyeljük az immunológiai aktivitást a proliferáciős kinetikai immunválasz vizsgálati módszerét alkalmazva; és figyeljük a citokin termelést sejt-alapú ELISA segítségévei.

?6.217/SM

Φ φφ Χφ φ Φ*φφ *·* * Φ Φ fc ν Φ ? s : ?»ί» **\ ♦ ϊ« «κ »« *

A vizsgálat kezdetben 5 krónikus súlyosbodó (CP) betegségben szenvedő beteg kezelését foglalté magában. A betegeket az alacsony API aktivitás alapján választjók ki és először a peptidek legmagasabb dózisával kezeljük eket. A kezelést a CP csoportban kezdjük el, mivel náluk legvalószínűbb, hogy bármilyen lehetséges káros hatást mutatnak, amelyet az MRI aktivitásban bekövetkező növekedés igazol. A visszaeső csillapodó betegek kezelését akkor kezdjük meg, amikor bizonyossá válik, hogy az egyszeri és a többszöri dózissal történő kezelés biztonságos a CP csoportban. A 30 visszaeső csillapodó beteg nagyobb csoportját az alapján toborozzuk, hogy mennyire szenvednek a fokozódó dpi sérülések a 3 hónapos megfigyelési periódus során. A betegeket három kezelendő csoportra osztjuk a peptidek magas, közepes vagy alacsony dózisa mellett.

Időpont (hónap)	Krónikus súlyosbodó (CP) betegek	Visszaeső csillapodó <RR) betegek
0	Kikezdjük a havi megfigyelést
3	Elkezdjük az la fázist (a peptid egyezer! dózisa) MRl-vel 1-2 héttel a kezelés után és havonta megfigyeljük
a	kikezdjük az 1b fázist (a peptid heti kétszeri dózisa) és folytatjuk a havi.	Elkezdjük a havi megfigyelést és a rotorodé sérülésekkel rendelkező betegeket

76.217/SíM »<c «.

Φ ·> A A * > * * a» * * * * * v « « ·>#« x « « * * β « * Λ * * » Φ * *»» #<i ** -e? »'♦·*

	megfigyeiést	toborozunk
9		Elkezdjük az lb fázist (a peptid heti kétszeri dózisa) és folytatjuk a havi megfigyelést
12	Befejezzük a kezelést és további 6 hónapig folytatjuk a havi megfigyelést
15		Befejezzük a kezelést és további 6 hónapig folytatjuk a havi megfigyelést

Rövidítések: ABC - antigén prezentáló sejtek; MHC - fő hísztokompatibilitási komplex; TCP. - T-sejt receptor; EAS = kísérletes autoimmun agy- és gerincvelőgyulladás; APiTöP - antigén feldolgozástól független epitóp; AP1PS = antigén feldolgozástól független bemutató rendszer; aa = aminosav; MS = szkierózis multiplex; MBP mieiin bázikus fehérje; PLP = proteolipid fehérje; TCL ~ T—sejtvonal; TCC ~ T-sejt klón; PBMC - perifériás vér mononukleáris sejtek; PPD ^::: Mycobacterium tufoercuiosis-bol tisztított fehérje származék; PHA - fitoheroagglutinín.

A találmány szerint ismertetett eljárások és rendszer különféle módosításai és változatai szakember számára nyilvánvalóak anélkül, Hogy a találmány oltalmi körétől és szellemétől eltérnének. Jóllehet a találmányt a sajátos előnyös kiviteli alakokkal kapcsolatban ismertettük, nyilvánvaló, hogy a találmány igénypontokban megadott oltalmi körét nem kívánjuk ok nélkül ezekre a sajátos kiviteli alakokra korlátozni. Sőt a találmány ϊ <

'ΖΟΟέΠΟΚ 1 ΟΠΙΟ rt. ΟΧ θ tl· t rtiőííO ZO fc O Ina k különíé le möcto S 5 fc ás cl ί fc f amelyek a kémiai vagy biológiai vagy rokon szakterületeken jártas szakember számára nyilvánvalóak, szintén a találmány oltalmi körébe tartozónak tekintjük. A leírásban említett összes nubliazokra való

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy tolerogén humán pepiid., myelin bázikus protein (MBP) , mely további antigén feldolgozás nélkül képes egy MHCI vagy MHCII molekulához kötődni, ezklerózíe multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazásra.
2. 2. Gyógyászati készítmény szklerózis multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére, mely készítmény az 1. igénypont szerinti peptidet tartalmazza.
3. 3. A 2. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, mely tolerogén humán MB.P peptidek sokaságát tartalmazza.
4. 4.. A 3, igénypont szerinti gyógyászati készítmény, mely 2 és 15 közötti tolerogén humán MSP pepiidet tartalmaz.
5. 5. A. 4, igénypont szerinti gyógyászati készítmény, mely 4 tolerogén humán MBP peptidet tartalmaz.
6. 6, A 3~5. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény kit formában, ahol a kit néhány vagy mindegyik peptidet szeparáltan, egyidejű, szeparált vagy egymás utáni alkalmazásra megfelelő formában tartalmazza.
7. 7, Az előző igénypontok bármelyike szerinti peptid vagy gyógyszerkészítmény intranazális alkalmazásra.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti peptid alkalmazása, szklerözis multiplex kezelésére és/vagy megelőzésére használható gyógyszerkészítmény előállításában.