BRPI0113400B1 - Método para seleção de peptídeo - Google Patents

Abstract

"método para seleção de peptídio". proporciona-se um método para a seleção de um peptídio tolerogênico, pela seleção de um peptídeo que é capaz de se ligar a uma molécula de mhc de classe i ou ii, sem processamento adicional. proporciona-se também um peptídio selecionado por esse método e o seu uso em uma composição farmacêutica e um método para tratar e/ou prevenir uma doença.

Description

"MÉTODO PARA SELEÇÃO DE PEPTÍDIO".

[1] A presente invenção se refere a um método para selecionar um peptídio tolerogênico, um peptídio identificado por esse método e o seu uso no tratamento e/ou prevenção de uma doença. A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica, que compreende vários desses peptídios tolerogênicos.

ANTECEDENTES

[2] Em uma resposta imune adaptativa, os linfócitos T são capazes de reconhecer os epítopos internos de um antígeno protéico. As células apresentadoras de antígenos (APC) captam os antígenos das proteínas e os degradam em fragmentos de peptídios curtos. Um peptídio pode se ligar a uma molécula do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I ou II no interior da célula e ser conduzido para a superfície da célula. Quando apresentado na superfície da célula, em conjunto com uma molécula de MHC, o peptídio pode ser reconhecido por uma célula T (via o receptor de célula T (TCR)), em cujo caso o peptídio é um epítopo de célula T.

[3] Os epítopos de células T desempenham um papel central na resposta imune adaptativa a qualquer antígeno, se próprio ou estranho. O papel central desempenhado pelos epítopos de células T em doenças de hipersensibilidade (que incluem alergia, doenças auto-imunes e rejeição de transplante) foi demonstrado por uso de modelos experimentais. É possível induzir doenças inflamatórias ou alérgicas (baseadas na estrutura dos epítopos de células T) em combinação com o adjuvante.

[4] Em contraste, mostrou-se ser possível induzir tolerância imunológica para epítopos de peptídios particulares, por administração dos epítopos de peptídios em forma solúvel. A administração de antígenos de peptídios solúveis foi demonstrada como um meio efetivo de inibir a doença em encefalomielite auto-imune experimental (EAE - um modelo para esclerose múltipla (MS)) (Metzler e Wraith (1993) Int. Immunol. 5 : 1159 - 1165; Liu e Wraith (1995) Int. Immunol. 7 : 1255 - 1263; Anderton e Wraith (1998) Eur. J.

Immunol. 28 : 1251 - 1261) e modelos experimentais de artrite, diabete e uveoretinite (revistos por Anderton e Wraith (1998) como mencionado acima). Isso também foi demonstrado como um meio de tratamento de uma doença em curso em EAE (Anderton e Wraith (1998) como mencionado acima).

[5] O uso de peptídios tolerogênicos para tratar ou prevenir a doença atraiu uma atenção considerável. Uma razão para isso é que se mostrou que certos epítopos tolerogênicos podem retro-regular as respostas das células T para antígenos distintos dentro do mesmo tecido. Esse fenômeno, conhecido como "eliminação circunstante" (bystander suppression) significa que deve ser possível induzir tolerância a mais de um epítopo (de preferência, todos os epítopos) em um dado antígeno, e a mais do que um antígeno para uma dada doença, usando um peptídio tolerogênico particular (Anderton e Wraith, 1998, como mencionado acima). Isso preveniría a necessidade de identificar todos os antígenos patogênicos de uma doença particular.

[6] Os peptídios são também uma opção favorável para terapia, por causa dos seus custos relativamente baixos e pelo fato de que peptídios análogos podem ser produzidos com propriedades imunológicas alteradas. Os peptídios podem ser, desse modo, modificados para alterar as suas interações com MHC ou TCR.

[7] Um possível problema com essa abordagem é que se mostrou que nem todos os peptídios, que agem como epítopos de células T, são capazes de induzir tolerância. O peptídio de proteína básica de mielina (MBP) 89-101 é um antígeno imunodominante após imunização, e é também um imunógeno muito efetivo, tanto em termos de iniciação da reatividade de células T quanto para a indução de EAE. No entanto, esse peptídio mostrou ser inefetivo em induzir tolerância, quando administrado em solução (Anderton e Wraith, 1998, como mencionado acima).

[8] Foram propostas várias explicações para a hierarquia observada na capacidade dos epítopos de células T de induzir tolerância (revistos por Anderton e Wraith, 1998, como mencionado acima). Em particular, propôs-se que há uma correlação entre a afinidade do peptídio com o MHC e toleragenicidade (Liu e Wraith, 1995, como mencionado acima), mas isso não está em concordância com algumas das observações. Por exemplo, MBP[89-101], que não é tolerogênica, se liga a l-AS com uma afinidade relativamente alta. Desse modo, não é correto prever quais peptídios vão induzir tolerância.

[9] Se houvesse uma explicação racional porque apenas uma proporção dos epítopos peptídicos são capazes de induzir tolerância, isso facilitaria a seleção de peptídios tolerogênicos úteis no tratamento e na prevenção de distúrbios de hipersensibilidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[10] Mostrou-se na presente invenção que se um epítopo peptídico é de um tamanho apropriado, para ser apresentado por APC imaturo, sem o processamento do antígeno, este pode induzir tolerância imunológica. A observação de que alguns epítopos de células T são tolerogênicos e outros são incapazes de induzir tolerância pode ser, portanto, explicada pelo fato de que alguns epítopos requerem processamento adicional, antes que sejam capazes de serem apresentados por uma molécula de MHC. Esses epítopos, que requerem processamento adicional, não induzem tolerância, quando administrados em uma forma solúvel, apesar da sua capacidade de induzir doença, quando injetados em combinação com adjuvante.

[11] Os epítopos, que não requerem processamento adicional, são capazes de induzir tolerância e foram denominados "apítopos" (epíTOPOS que independem de processamento antigênico - Antigen Processing Independent Epitopes) pelos inventores.

[12] Essa descoberta proporciona um método baseado em regra para a seleção de epítopos de células T, que previnem a necessidade de examinar a capacidade tolerogênica de um peptídio in vivo. Isso é particularmente vantajoso no desenvolvimento de estratégias para tratar ou prevenir doenças para as quais não estão disponíveis modelos animais. Mesmo para doenças que têm um modelo animal, o método de seleção deve realizar o desenvolvimento de composições que induzem tolerância mais simples e mais seguras, porque proporciona um mecanismo, com o qual a capacidade de indução de tolerância de um peptídio pode ser testada em células T humanas (que reconhecem o antígeno em conjunto com moléculas de MHC humanas) in vitro, antes do uso delas in vivo.

[13] Em um primeiro aspecto, portanto, a presente invenção proporciona um método para a seleção de um peptídio tolerogênico, que compreende a etapa de selecionar um peptídio que é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou classe II, sem processamento adicional.

[14] Em uma modalidade preferida, o peptídio é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe II, sem processamento adicional.

[15] Vários métodos são conhecidos na técnica para a triagem de peptídios, que são capazes de agir como epítopos de células T para um dado antígeno. Comumente, portanto, o método vai ser usado para selecionar um peptídio tolerogênico a partir de uma pluralidade de peptídios, cada um compreendendo um epítopo de célula T.

[16] Para investigar se um peptídio é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II, sem processamento adicional, pode-se estudar a capacidade do peptídio de se ligar a moléculas de MHC de classe I ou II, usando um Sistema de Apresentação Independente de Processamento de Antígeno (APIPS). Em uma modalidade preferida, o método compreende, portanto, as seguintes etapas: (i) tratar de um APIPS com um peptídio; e (ii) analisar a ligação do peptídio a moléculas de MHC de classe I ou II no APIPS.

[17] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um peptídio selecionado pelo método do primeiro aspecto da invenção.

[18] O peptídio pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença. Em particular, o peptídio pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença, que é mediada por células T auto-reativas. As reações de hipersensibilidade são particularmente receptivas ao tratamento / prevenção, usando o peptídio da presente invenção, por exemplo, alergia, auto-imunidade e rejeição de transplante.

[19] Foram identificados na presente invenção vários apítopos para proteína básica de mielina, que é um antígeno próprio (self) na esclerose múltipla. Em uma modalidade especialmente preferida, portanto, os peptídios da presente invenção são úteis no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla.

[20] É conhecido que alguns peptídios são capazes de induzir tolerância em outros epítopos do mesmo antígeno e ainda que outros epítopos de um antígeno distinto (pelo fenômeno conhecido como eliminação circunstante). No entanto, na presente invenção se prevê que para eliminar, adequadamente, todas as células T auto-reativas, seria vantajoso que uma combinação de vários apítopos fosse administrada ao paciente para tratar / impedir uma doença particular. Em um terceiro aspecto, portanto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende vários peptídios de acordo com um segundo aspecto da invenção, cada peptídio sendo à base de um epítopo de célula T.

[21] Em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratamento e/ou prevenção de uma doença em um indivíduo, que compreende a etapa de administração de um peptídio de acordo com o segundo aspecto da invenção no indivíduo.

[22] Uma estratégia geral para o tratamento e/ou prevenção de uma doença em um indivíduo pode compreender as seguintes etapas: (i) identificar um antígeno para a doença; (ii) identificar um apítopo para o antígeno; e (iii) administrar o apítopo ao indivíduo.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS

[23] A Figura 1 mostra um exemplo típico do perfil cinético para derivado de proteína purificada (PPD) de M. tuberculosis e de MBP em pacientes com esclerose múltipla (MS) e em indivíduos saudáveis. As células mononucleares de sangue periféricas (PBMC) isoladas de um paciente MS (A) e um indivíduo normal (B) são testadas para as suas capacidades em proliferar na presença de PPD e MBP integral; o perfil cinético da resposta proliferativa para MBP é comparado com aquele do antígeno secundário PPD.

[24] A Figura 2 é uma tabela que resume as respostas das PBMC para MBP e dos seus peptídios em pacientes MS. Certos indivíduos são analisados em três pontos de tempo separados, com um período de aproximadamente 4 a 7 meses entre cada ponto de tempo.

[25] A Figura 3 é uma tabela que resume as respostas das PBMC para MBP e peptídios de MBP em indivíduos saudáveis. Entre 4 e 7 meses foram decorridos entre cada ponto de tempo.

[26] A Figura 4 mostra um exemplo de um paciente MS (MS 49), que responde a múltiplos peptídios em 2 diferentes pontos de tempo, mas para o qual o perfil de reconhecimento durante o segundo ponto de tempo, medido 4 meses depois, difere significativamente. As PBMC foram cultivadas na presença de MBP e de um grupo de peptídios varrendo todo o comprimento da MBP, e a proliferação foi medida por absorção de 3H-timidina. A ampla resposta proliferativa de célula T observada no primeiro ponto de tempo foi significativamente diferente para a resposta medida 7 meses depois (segundo ponto de tempo).

[27] A Figura 5 mostra um exemplo de um paciente cuja ampla resposta a epítopos (primeiro ponto de tempo) regride (segundo ponto de tempo) e reaparece em um período de doze meses (terceiro ponto de tempo).

[28] A Figura 6 mostra um mapa da especificidade fina das regiões dos peptídios identificadas no ensaio de resposta cinética, que é obtida pelo uso de TCC gerado de paciente MS e indivíduos saudáveis. A maior parte dos peptídios usados nos testes de triagem são de comprimento 15-mer, embora uns poucos são de 10-mer e um peptídio seja de 17-mer. A especificidade de cada TCC é testada pelo menos duas vezes.

[29] A Figura 7a é uma tabela mostrando a caracterização dos epítopos de células T dentro de cada proteína básica de mielina reconhecida pelos linfócitos T de pacientes MS.

[30] A Figura 7b é uma tabela mostrando que todos os epítopos de células T não são necessariamente apresentados por APC fixa e, portanto, não apítopos.

[31] As Figuras 8 e 9 mostram a apresentação dos vários peptídios MBP aos clones de células T por APC viva e fixa. a Figura 8A - 30 - 44, Figura 8B -110 -124, Figura 9A -130 -144, Figura 9B - 156 - 170.

[32] A Figura 10 é uma tabela que mostra os valores do pico do índice de Estimulação (SI) para MBP e peptídios MBP em pacientes MS obtidos em três diferentes pontos de tempo. As amostras para o segundo ponto de tempo foram coletadas 4-8 meses após o primeiro ponto de tempo e as amostras para o terceiro ponto de tempo foram obtidas 3 a 5 meses depois do segundo ponto de tempo. O cpm de fundo foi medido para cada dia e variou entre 80 -700 cpm; uma resposta positiva (negrito) foi definida de acordo com SI > 3 e ôcpm > 1.000. (Não foi possível coletar amostras para todos os três pontos de tempo dos pacientes MS 19 e MS 67).

[33] A Figura 11 é uma tabela que mostra os valores do pico do índice de Estimulação (SI) para MBP e peptídios MBP em indivíduos saudáveis. O cpm de fundo foi medido para cada dia e variou entre 80 - 700 cpm; uma resposta positiva (negrito) foi definida de acordo com SI > 3 e dcpm > 1.000.

[34] A Figura 12 mostra a resposta de células T isoladas de um camundongo transgênico DR2 : MBP82 -100 para a apresentação de peptídios MBP aninhados na região 77-100 por APC.

[35] A Figura 13 mostra a resposta de clone de célula T MS17 : A3 à apresentação de peptídios MBP aninhados na região 125 -148 por APC.

[36] A Figura 14 é uma ilustração de um reconhecimento de epítopo de célula T dentro da seqüência de MBP 89-101. Há três epítopos de células T distintos mas sobrepostos dentro da seqüência: 89 - 94, 92 - 98 e 95 -101. O potencial para divagem entre os resíduos 94 e 95 pela ação de asparginil endopeptidase (AEP) é mostrado.

[37] A Figura 15 mostra a capacidade dos peptídios MBP 87 - 96 (A) e 89-101 (B) em agir como um apítopo para as células T respondendo ao epítopo 89 - 94.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[38] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para selecionar um peptídio tolerogênico.

Tolerância [39] Como aqui usado, o termo "tolerogênico" significa capaz de induzir tolerância.

[40] Tolerância é a falha em responder a um antígeno. A tolerância a antígenos próprios (self) é um aspecto essencial do sistema imune, quando esse é perdido, pode resultar em uma doença auto-imune. O sistema imune adaptativo deve manter a capacidade de responder a uma variedade enorme de agentes infecciosos, enquanto evita o ataque auto-imune dos antígenos próprios contidos dentro dos seus próprios tecidos. Isso é controlado em grande parte pela sensibilidade de linfócitos T imaturos à morte celular apoptótica no timo (tolerância central). No entanto, nem todos os antígenos próprios são detectados no timo, de modo que a morte dos timócitos auto-reativos se mantém incompleta. Há também, desse modo, mecanismos por meio dos quais a tolerância pode ser adquirida por linfócitos T auto-reativos nos tecidos periféricos (tolerância periférica). Uma revisão dos mecanismos de tolerâncias central e periférica é dada por Anderton et al. (1999) (Immunological Reviews 169 : 123 -137).

[41] A tolerância pode resultar da, ou ser caracterizada pela indução de anergia em pelo menos uma parte das células T CD4+. Para ativar uma célula T, um peptídio deve se associar a uma APC "profissional", capaz de enviar dois sinais para as células T. O primeiro sinal (sinal 1) é enviado pelo complexo MHC - peptídio na superfície da célula APC e é recebido pela célula T, via TCR. O segundo sinal (sinal 2) é liberado pelas moléculas co-estimulatórias na superfície da APC, tal como CD80 e CD86, e recebido por CD28 na superfície da célula T. Imagina-se que quando uma célula T recebe o sinal 1 na ausência do sinal 2, não é ativada e, de fato, fica anérgica. As células T anérgicas são refratárias ao desafio antigênico subseqüente, e podem ser capazes de suprimir outras respostas imunes. As células T anérgicas são imaginadas como estando envolvidas na mediação da tolerância de células T.

[42] Sem se querer estar ligado à teoria, os presentes inventores prevêem que os peptídios, que requerem processamento antes que possam ser apresentados ligados às moléculas do MHC, não induzem tolerância, porque têm que ser tratados por células apresentadoras de antígenos maduras. As células apresentadoras de antígenos maduras (tais como macrófagos, células B e células dendríticas) são capazes de processar antígenos, mas também de enviam ambos os sinais 1 e 2 a uma célula T, levando a uma ativação de célula T. Os apítopos, por outro lado, vão ser capazes de se ligarem a MHC da classe II em APC imaturas. Desse modo, vão ser apresentados às células T sem co-estimulação, levando a anergia e tolerância das células T.

[43] Certamente, os apítopos também são capazes de se ligarem às moléculas de MHC na superfície da célula APC madura. No entanto, o sistema imune contém uma maior abundância de APC imaturas do que maduras (sugeriu-se que menos do que 10% das células dendríticas são ativadas, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159 : 285 - 295). A posição padrão para um apítopo vai ser, portanto de anergia / tolerância em vez de ativação.

[44] Mostrou-se que, quando a tolerância é induzida por inalação de peptídios, a capacidade das células T CD4+ antígeno-específicas de proliferar é reduzida. Também, a produção de IL-2, IFN^y e IL-4 por essas células é retro- regulada, mas a produção de IL-10 é aumentada. A neutralização de IL-10 em camundongos em um estado de tolerância induzida por peptídios mostrou restaurar completamente a susceptibilidade à doença. Propôs-se que uma população de células reguladoras persiste no estado de tolerância, que produzem IL-10 e mediam a regulação imune (Burkhart et al. (1999) Int. Immunol. 11 : 1625-1634).

[45] A indução de tolerância pode ser, portanto, monitorada por várias técnicas, incluindo: (a) susceptibilidade reduzida para contrair a doença para a qual o peptídio é um epítopo alvo in vivo; (b) a indução de anergia em células T CD4+ (que podem ser detectadas por desafio subseqüente com antígeno in vitro); e (c) variações na população de células T CD4+, incluindo: (i) redução na proliferação; (ii) retro-regulação na produção de IL-2, IFN^y e IL-4; e (iii) aumento na produção de 11-10.

Epítopos que independem de processamento antigênico (APÍTOPOS) [46] O método da presente invenção compreende a etapa de selecionar um peptídio, que é capaz de se ligar a uma proteína da classe I ou II de MHC sem processamento adicional. Esses peptídios são conhecidos aqui como "apítopos" (epíTOPOS que independem de processamento antigênico).

[47] A apresentação de peptídios em superfícies celulares derivados de um dado antígeno não é aleatória e tende a ser dominada por um pequeno número de epítopos que ocorrem freqüentemente. A dominância de um peptídio particular vai depender de muitos fatores, tal como afinidade relativa à ligação da molécula de MHC, o ponto espaço - tempo de geração dentro das APC e resistência à degradação. A hierarquia do epítopo para um antígeno pode variar com a progressão de uma resposta imune, que tem implicações importantes para auto-tolerância e auto-imunidade. As regiões determinantes imunodominantes são propensas a serem bons agentes tolerogênicos. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, o apítopo da presente invenção é baseado em um epítopo dominante.

[48] No entanto, após uma resposta imune primária aos peptídios imunodominantes, o "espalhamento" do epítopo pode ocorrer para os determinantes subdominantes (Lehmann et al., 1992, Nature 358 : 155 - 157). A apresentação de epítopos subdominantes pode ser importante em disparar a auto-imunidade. O apítopo da presente invenção pode ser, no entanto, baseado em um epítopo subdominante.

[49] Para qualquer dado antígeno, podem também existir epítopos crípticos. Os epítopos crípticos são aqueles que podem estimular uma resposta de célula T, quando administrados como um peptídio, mas que falham em produzir essa resposta, quando administrados como um antígeno integral. Pode ser que durante o processamento do antígeno em peptídios nas APC, o epítopo críptico seja destruído. Mostrou-se na presente invenção que o peptídio 92 - 98 é um epítopo críptico para MBP (Exemplo 2C). Significativamente, há um sítio de divagem putativo para asparaginil endopeptidase dentro dessa região de peptídios, o que pode significar que durante o processamento natural, nenhum peptídio contendo essa região seja gerado pelas APCs.

[50] Um epítopo críptico pode agir como um apítopo in vitro, pelo fato de que pode ser capaz de se ligar a uma molécula do MHC, sem processamento adicional, e induzir anergia a uma célula T, que reconhece o epítopo críptico. No entanto, esse apítopo seria improvável de ser terapeuticamente útil, porque deve ser incapaz de toleralizar as células T que reconhecem um epítopo processado naturalmente do antígeno.

[51] Os epítopos para um antígeno podem ser identificados pela medida da resposta das células T à sobreposição de peptídios varrendo todo o antígeno (consultar abaixo), quando apresentados pelas APC. Esses estudos em "conjuntos aninhados" de peptídios, e o epítopo mínimo para uma linhagem / clone de células T particular pode ser determinado por medida da resposta aos peptídios truncados.

[52] Não se pode considerar que um epítopo mínimo de um antígeno vai se comportar como um epítopo. Pode ser conveniente que os aminoácidos adjacentes ao epítopo mínimo vão ser necessários para ligação ótima ao MHC. O apítopo deve ser elaborado para cobrir a possibilidade de haver diferenças sutis entre os epítopos mínimos de diferentes clones de células T.

[53] Deve-se enfatizar que pode não ser possível identificar um apítopo para todos os epítopos. Há uma evidência clara que alguns epítopos se ligam à MHC, de um modo que é dependente da carga de MHC nos endossomas e, por conseguinte, requerem processamento (Viner et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. 92 : 2214 - 2218). Essa é uma outra razão por que não se pode assumir que cada epítopo mínimo vai se comportar inevitavelmente como um apítopo.

Identificação de peptídios contendo epítopos de células T

[54] Há vários métodos conhecidos na técnica para identificar os epítopos de células T dentro em um dado antígeno.

[55] Os epítopos naturalmente processados podem ser identificados por análise espectrofotométrica de massa dos peptídios eluídos de APC carregadas com antígenos. Essas são APC que foram encorajadas a absorver antígeno ou foram forçadas a produzir a proteína intracelularmente por transformação com o gene apropriado. Tipicamente, as APC são incubadas com proteína em solução ou adequadamente alvejadas a superfície celular das APC. Após incubação a 37°C, as células são lisadas em detergente e a proteína de classe II purificada por, por exemplo, cromatografia de afinidade. O tratamento do MHC purificado com um meio químico adequado (por exemplo, condições ácidas) resulta na eluição de peptídios do MHC. Esse pool de peptídios é separado e o perfil comparado com o peptídio das APC controle tratadas do mesmo modo. Os picos únicos para as proteínas expressas / células alimentadas são analisadas (por exemplo, por espectrometria de massa) e os fragmentos de peptídios identificados. Esse procedimento gera, usualmente, informações sobre a gama de peptídios (encontrados usualmente em "conjuntos aninhados"), gerados de um antígeno particular por processamento de antígenos.

[56] Outro método para identificar epítopos é a realização de uma triagem em uma biblioteca sintética de peptídios, que se sobrepõem e transpõem o comprimento do antígeno em um ensaio in vitro. Por exemplo, os peptídios que apresentam 15 aminoácidos de comprimento e que se sobrepõem por 5 ou 10 aminoácidos podem ser usados. Os peptídios são testados em um sistema de apresentação de antígeno, que compreende células apresentadoras de antígenos e células T. Por exemplo, o sistema de apresentação de antígenos pode ser uma preparação de esplenócitos murinos, uma preparação de células humanas da tonsila ou PBMC. Alternativamente, o sistema de apresentação de antígenos pode compreender uma linhagem / clone de células T e/ou um tipo particular de célula apresentadora de antígenos.

[57] A ativação das células T pode ser medida via proliferação de células T (usando, por exemplo, incorporação de 3H - timidina) ou produção de citocina. A ativação de células T CD4+ do tipo TH1 pode ser, por exemplo, detectada via produção de IFN^y, que pode ser detectada por técnicas usuais, tal como um ensaio ELISPOT.

[58] Os estudos de peptídios sobrepostos indicam, usualmente, a área do antígeno na qual um epítopo está localizado. O epítopo mínimo para uma célula T particular pode ser depois determinado por medida da resposta a peptídios truncados. Por exemplo, se uma resposta é obtida ao peptídio compreendendo os resíduos 1 -15 na biblioteca sobreposta, conjuntos que são truncados em ambas as extremidades (isto é, 1 -14, 1 -13, 1 -12, etc e 2 -15, 3 -15, 4 -15, etc) podem ser usados para identificar o epítopo mínimo.

[59] A identificação de regiões imunodominantes de um antígeno, usando ensaios in vitro (especialmente aqueles usando linhagens de células T) é prevista para apresentar um padrão assimétrico da reatividade dos peptídios pelos presentes inventores. No estudo para identificar epítopos MBP, que é descrito nos exemplos, usa-se um ensaio de resposta cinética, na qual a proliferação de PBMC dos pacientes MS e de indivíduos saudáveis é medida contra uma biblioteca de peptídios sobreposta. Esse ensaio é baseado na descoberta de que, embora as células T de indivíduos normais e de pacientes MS respondam de um modo similar ao antígeno protéico purificado, elas respondem de uma maneira diferente aos peptídios baseados na seqüência da MBP. As células T de pacientes MS respondem com maior magnitude e com cinética mais rápida aos antígenos peptídicos, quando comparados com os doadores saudáveis normais. Isso permite a triagem e a identificação do epítopo para o qual o paciente particular responde em um momento particular. No estudo aqui descrito, essa abordagem revelou várias regiões contendo epítopos que não foram identificadas usando técnicas usuais. Além disso, é mostrado que o reconhecimento de células T apresenta um padrão cíclico, aparecendo em um ponto do tempo, regredindo e, subseqüentemente, reaparecendo em uma data posterior.

[60] O ensaio cinético descrito pelos inventores proporciona uma ferramenta valiosa, porque revela o epítopo para o qual o paciente está respondendo em um momento particular. Essas informações podem ser usada para ajustar uma proposta de administração de apítopos terapêutica para um paciente particular, pela identificação e administração de um apítopo para o epítopo relevante (se houver um). Essa informação pode também propiciar que um modelo geral para deter a progressão da doença, de modo que a composição terapêutica pode ser elaborada para incluir apítopos para os epítopos que provavelmente estão presentes a um dado estágio durante a doença.

Sistemas de Apresentação Independentes de Processamento de Antígenos (APIPS) [61] Uma vez que um epítopo tenha sido identificado, a etapa seguinte é investigar se ele também se comporta como um apítopo.

[62] Um apítopo deve ser apresentado às células T, sem a necessidade de processamento de antígenos. Uma vez que os peptídios contendo epítopos de células T tenham sido identificados, os apítopos podem ser identificados usando um sistema livre de processamento. Os peptídios truncados e os análogos de peptídios podem ser testados para ativação usando um sistema de apresentação independente de processamento de antígeno (APIPS).

[63] Os exemplos de APIPS incluem: a) APC fixadas (com ou sem anticorpos para CD28);

b) Membranas lipídicas contendo moléculas de MHC da Classe I ou II (com ou sem anticorpos para CD28); e c) MHC natural ou recombinante purificado ligado à lâmina (com ou sem anticorpos para CD28).

[64] É conhecido o uso de APC fixadas para investigar as respostas às células T, por exemplo, em estudos para investigar o epítopo mínimo dentro de um polipeptídio, através da medida da resposta aos peptídios truncados (Fairchild et al., (1996), Int. Immunol. 8 : 1035 - 1043). As APC podem ser fixadas usando, por exemplo, formaldeído (usualmente paraformaldeído) ou glutaraldeído.

[65] As membranas lipídicas (que podem ser membranas ou lipossomos planos) podem ser preparadas usando lipídios artificiais ou podem ser frações de membrana de plasma / microssomais de APC.

[66] Em uso, os APIPS podem ser aplicados aos poços de uma placa de cultura de tecidos. Os antígenos peptídicos são depois adicionados e a ligação do peptídio à parte MHC dos APIPS é detectada por adição de linhagens ou clones de células T. A ativação da linhagem ou clone de célula T pode ser medida por quaisquer dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, via incorporação de 3H-timidina ou secreção de citocina.

Peptídios [67] O segundo aspecto da invenção se refere a um peptídio.

[68] O termo "peptídio" é usado no sentido normal para significar uma série de resíduos, tipicamente, L-aminoácidos, conectados entre si tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos α-amino e carboxila dos aminoácidos adjacentes. O termo inclui peptídios modificados e análogos de peptídios sintéticos.

[69] Um peptídio da presente invenção pode ser de qualquer comprimento que seja capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II, sem processamento adicional.

[70] Os peptídios que se ligam às moléculas de MHC de classe I são, tipicamente, de comprimento de 7 a 13, mais usualmente de 8 a 10 aminoácidos de comprimento. A ligação do peptídio é estabilizada nas suas duas extremidades por contatos entre os átomos na cadeia principal do peptídio e dos sítios invariantes no “sulco” de ligação dos peptídios de todas as moléculas de MHC de classe I. Há sítios invariantes em ambas as extremidades do sulco, que ligam os amino- e carbóxi- terminais do peptídio. As variações no comprimento dos peptídios são acomodadas por uma torção no esqueleto dos peptídios, freqüentemente nos resíduos de prolina ou glicina que propiciam a flexibilidade requerida.

[71] Os peptídios que se ligam às moléculas de MHC de classe II são, tipicamente, de um comprimento entre 8 e 20 aminoácidos, mais usualmente, entre 10 e 17 aminoácidos e podem ser mais longos. Esses peptídios se dispõem em uma conformação estendida ao longo do sulco de ligação de peptídios de MHC II que (diferentemente do sulco de ligação de peptídios de MHC classe I) é aberta em ambas as extremidades. O peptídio é mantido no lugar por contatos dos átomos da cadeia principal com os resíduos conservados, que alinham o sulco de ligação de peptídios.

[72] O peptídio da presente invenção pode ser produzido usando processos químicos (Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlim). Por exemplo, os peptídios podem ser sintetizados por técnicas de fase sólida (Roberge JY et al., 1995, Science 269 : 202 - 204), clivados da resina e purificados por cromatografia líquida de alto desempenho preparatória (por exemplo, Creighton, (1983), Proteins Structures and Molecular Principies, WH Freeman and Co, Nova York, NY). A síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o Peptide Synthesizer ABI 43 1 A (Perkin Elmer) de acordo com as instruções proporcionadas pelo fabricante.

[73] O peptídio pode ser produzido, alternativamente, por meio recombinante, ou por divagem a partir de um polipeptídio mais longo. Por exemplo, o peptídio pode ser obtido por divagem do antígeno alvo. A composição de um peptídio pode ser confirmada por análise ou seqüenciamento de aminoácidos (por exemplo, o procedimento de degradação de Edman).

[74] Em uma modalidade preferida, o peptídio é derivável de um antígeno alvo. Um antígeno alvo é uma molécula (por exemplo, uma proteína ou glicoproteína), que é processada por APC, e reconhecida por células T, durante o transcorrer da doença. O antígeno alvo vai depender, naturalmente, da doença alvo. De preferência, o peptídio é derivável de um fragmento do antígeno que provém do processamento natural do antígeno por uma APC.

[75] Por razões práticas, há várias outras características que o peptídio deve mostrar. Por exemplo, o peptídio deve ser solúvel a uma concentração que permita o seu uso in vivo. De preferência, o peptídio deve ser solúvel em concentrações de até 0,5 mg/ml, particularmente, o peptídio deve ser solúvel em concentrações de até 1 mg/ml, especialmente, o peptídio deve ser solúvel em concentrações de até 5 mg/ml.

[76] Para administração intranasal, o volume máximo que pode ser tomado usando os procedimentos atuais é de aproximadamente 200 μΙ por narina. Se o peptídio for solúvel a 1 mg/ml, uma dose dupla para cada narina permite que 800 μς sejam dados ao paciente. É incomum dar mais do que 5 mg em qualquer dose individual.

[77] Também é importante que o peptídio seja suficientemente estável in vivo para ser terapeuticamente útil. Os presentes inventores verificaram que, in vivo, 30 minutos após a administração, a quantidade total de um peptídio de teste cai a cerca de 50%, 4 horas após a administração, a quantidade cai a cerca de 30%, mas que após 5 dias, o peptídio é ainda detectável (a cerca de 5%). A meia-vida do peptídio in vivo deve ser pelo menos de 10 minutos, de preferência, pelo menos 30 minutos, particularmente, pelo menos 4 horas, especialmente, pelo menos 24 horas.

[78] Os presentes inventores verificaram que seguinte após a administração intranasal, a quantidade de peptídio no linfonodo de drenagem atinge um pico em torno de 4 horas após a administração, embora o peptídio seja ainda detectável (em níveis de cerca de 5% máximo) após 5 dias. De preferência, o peptídio é suficientemente estável para estar presente a uma concentração terapeuticamente ativa no linfonodo de drenagem por um tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico.

[79] O peptídio deve também demonstrar boa biodisponibilidade in vivo. O peptídio deve manter uma conformação in vivo que permita que seja ligado a uma molécula de MHC na superfície da célula sem qualquer obstáculo.

Doenças alvo [80] Em uma modalidade, o peptídio do segundo aspecto da invenção é para uso no tratamento e/ou prevenção de uma doença.

[81] Um apítopo para MHC de classe II provavelmente é particularmente útil em doenças que são mediadas por respostas de células T CD4+. Por exemplo, as doenças que são estabelecidas ou mantidas por uma resposta inadequada ou excessiva de células T CD4+.

[82] Esse peptídio é provavelmente particularmente útil no tratamento de distúrbios de hipersensibilidade. As reações de hipersensibilidade incluem: (i) alergias, resultantes de respostas inadequadas a substâncias estranhas inócuas; (ii) doenças autoimunes, resultantes de respostas a antígenos próprios dos tecidos; e (iii) rejeição de enxerto, resultante de respostas a um transplante.

[83] Os exemplos de alergias incluem, mas não são limitados a, febre do feno, asma extrínseca, picada de inseto e alergias a picadas, alergias a alimentos e drogas, rinite alérgica, bronquite crônica, asma brônquica, síndrome anafilática, urticária, angiodema, dermatite atópica, dermatite de contato alérgica, eritema nodoso, eritema multiforme, síndrome de Stevens -Johnson, rinoconjuntivite, conjuntivite, venulite necrosante cutânea, doença inflamatória de pulmão e doenças da pele bolhosa.

[84] Os exemplos de doenças autoimunes incluem, mas não são limitadas a, artrite reumatóide (RA), miastenia gravis (MG), esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite auto-imune (tireoidite de Hashimoto), doença de Graves, doença inflamatória dos intestinos, uveoretinite auto-imune, polimiosite e certos tipos de diabetes, vasculite sistêmica, polimiosite - dermatomiosite, esclerose sistêmica (esclerodermia), síndrome de Sjogren, espondilite ancilosante e espondiloartropatias relacionadas, febre reumática, pneumonite de hipersensibilidade, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumoconioses de pós inorgânicos, sarcoidose, anemia hemolítica auto-imune, distúrbios imunológicos de plaquetas, criopatias tais como criofibrinogenemia e poliendocrinopatias auto-imunes.

[85] Vários tecidos são comumente transplantados em medicina clínica, incluindo rim, fígado, pulmão coração, pele, córnea e tutano do osso.

Todos os enxertos, exceto o da córnea e de alguns enxertos de tutano do osso, requerem, usualmente, atualmente, imunossupressão de longo prazo.

[86] Em uma modalidade desse aspecto da invenção, o peptídio é para uso no tratamento e/ou prevenção de diabetes. Nessa modalidade, o peptídio pode ser derivado do antígeno alvo IA2.

[87] Em uma outra modalidade desse aspecto da invenção, o peptídio é para uso no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS). A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória crônica caracterizada por lesões desmielinizantes múltiplas disseminadas pelo matéria branca do CNS e ocorrendo em vários sítios e tempos (McFarlin e McFarland, 1982, New England J. Medicine 307 : 1183 - 1188 e 1246 - 1251). MS é imaginado ser mediado por células T auto-reativas.

[88] Nessa modalidade, o peptídio pode ser derivado de um dos auto-antígenos, em particular proteínas básica de mielina (MBP) ou proteína de proteolipídio (PLP). A MBP é possivelmente mais apropriada do que a PLP, porque a PLP é altamente hidrofóbica e os peptídios derivados dela tendem a formar torrões entre si. A MBP é imunogênica e os linfócitos T específicos para MBP têm atividade encefalitogênica em animais (Segai et al., 1994, J. Neuroimmunol. 51 : 7 - 19; Voskuhl et al., 1993, J. Neuroimmunol 42 : 187 -192; Zamvil et al., 1985, Nature 317 : 355 - 8).

[89] Em uma modalidade preferida, o peptídio é derivado de uma das regiões imunodominantes da MBP, isto é: 1 - 24, 30 - 54, 75 - 99, 90 -114, 105 -129, 120 - 144, 135 -159 e 150 -170.

[90] Em uma modalidade especialmente preferida, o peptídio é selecionado de um dos peptídios de MBP, mostrando-se agindo como apítopos pelos presentes inventores, que incluem os seguintes peptídios: 30 -44, 80-94, 83 -99, 81 -95, 82 -96, 83-97, 84-98, 110- 124, 130- 144, 131 -145, 132 -146 e 133-147.

[91] Os apítopos para MHC de classe I podem ser usados, por exemplo, para modificar as respostas antivirais de CD8+ em um modo tolerogênico.

Composição farmacêutica [92] Os presentes inventores prevêem que, embora a “eliminação circunstante”, pode ser necessário alvejar vários diferentes clones de células T, para induzir, efetivamente, tolerância. Por conseguinte, vários peptídios podem ser administrados a um indivíduo para impedir ou tratar uma doença.

[93] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica, que compreende vários apítopos.

[94] A composição farmacêutica pode compreender, por exemplo, entre 2 e 50 apítopos, de preferência, entre 2 e 15 apítopos. Os apítopos podem ser derivados dos mesmos ou de diferentes antígenos alvo. De preferência, os apítopos são todos capazes de se ligarem a MHC da classe I ou são todos capazes de se ligarem a MHC da classe II, sem processamento adicional. Em uma modalidade preferida, todos os apítopos na composição farmacêutica são capazes de se ligarem a MHC da classe I ou da classe II sem processamento adicional.

[95] A composição farmacêutica pode ser na forma de um kit, no qual alguns ou todos os apítopos são proporcionados separadamente para administração simultânea, separada ou seqüencial.

[96] Alternativamente (ou em adição), se a composição farmacêutica (ou qualquer parte dela) vai ser administrada em doses múltiplas, cada dose pode ser embalada separadamente.

[97] A composição farmacêutica pode compreender uma quantidade terapêuticamente ou profilaticamente efetiva do ou de cada apítopo e, opcionalmente, um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[98] Também, nas composições farmacêuticas da presente invenção, o ou cada apítopo pode ser misturado com quaisquer aglutinantes, lubrificantes, agentes suspensores, agentes de revestimento ou agentes solubilizantes.

Administração [99] O peptídio deve ser administrado na forma solúvel na ausência de adjuvante.

[100] De preferência, o peptídio é administrado por uma rota de mucosa.

[101] Os estudos mostraram que o peptídio, quando dado em forma solúvel intraperitonealmente (i.p.), intravenosamente (i.v.) ou intranasalmente (i.n.) ou oralmente pode induzir tolerância de células T (Anderton e Wraith, (1998) , como mencionado acima; Liu e Wraith, (1995), como mencionado acima; Metzler e Wraith, (1999), Immunology 97 : 257 -263).

[102] De preferência, o peptídio é administrado intranasalmente.

[103] Os estudos em camundongos demonstraram que a duração da administração de peptídios necessária para induzir tolerância depende da freqüência do precursor das células T no recipiente (Burkhart et al., 1999, como mencionado acima). Em muitos estudos experimentais, mostrou-se que doses repetidas de peptídio são necessárias para induzir tolerância (Burkhart et al., (1999) , como mencionado acima). A dose exata e o número de doses de peptídio vão, portanto, depender do indivíduo, embora, em uma modalidade preferida várias doses sejam administradas.

[104] Se vários peptídios são administrados simultaneamente, eles podem estar na forma de um "coquetel", que é adequado para administração em doses únicas ou múltiplas. Alternativamente, pode ser preferido dar doses múltiplas, mas variar as concentrações relativas dos peptídios entre as doses.

[105] Em uma modalidade preferida, um protocolo de "escala de dose" pode ser seguido, quando várias doses são dadas ao paciente em concentrações ascendentes. Essa abordagem foi usada, por exemplo, para os peptídios de fosfolipase A2 em aplicações imunoterapêuticas contra alergia a veneno de abelha (Müller et al., (1998), J. Allergy Clin. Immunol. 101 : 747 -754 e Akdis et al., 1998, J. Clin. Invest. 102 : 98 -106).

EXEMPLOS

[106] Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente invenção, mas não devem ser considerados como uma limitação dela. A invenção se refere, particularmente, às modalidades específicas descritas nesses exemplos.

EXEMPLO 1 - Identificação de epítopos de células T em MBP

Materiais e métodos Antígenos [107] MBP humana é preparada a partir de matéria branca do cérebro, como descrito por Deibler et al. (Deibler et al., 1972, Preparative Biochemistry 2 : 139) e a sua pureza determinada por SDS-PAGE. MBP e derivado de proteína purificada (PPD) de tuberculose de M. tuberculosis (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) são usados em ensaios proliferativos em concentrações ótimas previamente determinadas; a concentração ótima para cada antígeno é de 50 μg/ml. Um painel de peptídios sobrepostos de 15-mer varrendo toda a molécula de MBP é sintetizado usando química F-moc padrão em um sintetizador de peptídios múltiplos AMS 422 da Abimed (Abimed, Langenfeld, Alemanha). Cada peptídio é deslocado por 5 aa e sobreposto por 10 aa. São produzidos 33 peptídios que são reunidos em grupos de 3 e os grupos são testados na concentração ótima de 50 μg/ml, de modo que, in vitro, cada peptídio esteja presente a uma concentração de 16,6 μg/ml.

Pacientes e indivíduos de controle [108] Os indivíduos desse estudo consistem de 12 pacientes com MS definida clinicamente ou definida com suporte de laboratório (Poser et al., 1983), com uma faixa etária de 29 - 51 anos. Oito dos 12 pacientes são envolvidos em um ensaio de interferon-β, de outro modo, todos os outros pacientes MS não receberam tratamento com corticoesteróide por pelo menos 3 meses, antes do início do estudo. O grupo controle consistiu de 13 indivíduos saudáveis com uma faixa etária de 25 - 55 anos, e nenhum recebeu terapia imunossupresiva por pelo menos 3 meses antes de ser obtida amostra de sangue.

Meio de cultura do tecido [109] O meio RPMI-1640 suplementado com HEPES 20 mM (Sigma, Poole, Reino Unido), penicilina (100 U/ml), sulfato de estreptomicina (100 mg/ml) e L-glutamina 4 mM (todos da Life Technologies, Paisley, Escócia) é usado como o meio de cultura do tecido. O meio sem soro é usado para a lavagem de células linfóides e TCL. Para todas as condições de cultura e ensaios, o meio é suplementado com 10% de plasma autólogo inativado termicamente.

Condições da cultura e ensaios proliferativos de células T

[110] Sangue periférico citrado (50 - 100 ml) é coletado por punção venosa de cada indivíduo, após ter sido obtido consentimento escrito informado. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são isoladas do sangue por centrifugação por densidade em Histopaque-1077 (Sigma, Poole, Reino Unido) e cultivadas em volumes de 1,5 ml em placas de cultura de tecido de 24 poços (Nunc International, Costar, Corning Inc., Nova York, EUA) a uma concentração de 1 x 106 células por ml, contendo PPD, MBP ou peptídios de MBP. As placas são incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de C02 / 95% de ar. Entre os dias 5 e 14, alíquotas duplicadas de 100 μΙ são retiradas de cada cultura, transferidas para uma lâmina de microtítulo de fundo redondo de 96 poços e pulsadas com 0,4 μΰϊ [3H]-Timidina (Amersham International, Amersham, UK). Após 18 horas, as células são colhidas em mantas de fibra de vidro (LKB-Wallac, Turbu, Finlândia) usando um coletor 96 Mach 111 (Tomtec, Orange, Nova Jersey, EUA). A incorporação de [3H]-timidina é determinada usando um contador de cintilação de líquido Microbeta (LKB-Wallac). Os poços de teste contendo antígeno são considerados positivos, quando o ôcpm > 1.000 e o índice de Simulação (SI) > 3, em que SI = cultura contendo antígeno de CPM / cultura sem antígeno de CPM.

Geração de linhagens de células T e clones de células T

[111] As linhagens de células T específicas para MBP (TLC) são geradas de 8 pacientes MS e 2 doadores controle saudáveis. As PBMC de cada indivíduo são separadas, como descrito acima, e plaqueadas em 1 x 106 células / ml em placas de 6 poços, na presença de MBP (50 pg/ml); uma parte das PBMC de cada indivíduo é regularmente congelada e armazenada para reestimulações subseqüentes. Sete dias depois das células terem sido alimentadas com meio fresco contendo 2% de IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, Reino Unido) e no 12° dia da cultura, todas as células são reestimuladas com antígeno, IL-2 e irradiadas PBMC autólogas irradiadas (2.500 Rad), como uma fonte de células apresentadoras de antígenos (APC), a uma relação celular de 1 célula T : 5 APC. As células são expandidas em IL-2 a cada 3-4 dias e no dia 14 são reestimuladas com antígeno, IL-2 e PBMC, como descrito acima. No dia da primeira reestimulação, as células são examinadas para proliferação específica em MBP. Sucintamente, 2 x 104 células T e 1 x 105 PBMC autólogas irradiadas são cultivadas em triplicata em placas de fundo redondo de 96 poços, na presença de MBP. As células são cultivadas por 2 dias e pulsadas com [3H]-timidina a 0,4 μΰί/ poço, durante as últimas 18 horas da cultura. As células são depois colhidas como descrito acima e as TCL são consideradas como específicas para MBP com um ôcpm > 1.000 e um SI > 3.

[112] Após 3 ciclos de reestimulação / expansão, as TCL são clonadas usando PHA (Sigma, Poole, Dorset, Reino Unido), na presença de PBMC irradiadas autólogas como APC. As células T são plaqueadas sob condições de diluição limitantes a 0,1 célula / reservatório, 0,3 célula /poço e 1 célula / poço e cultivadas em placas Terasaki (Nunc International, Costar) com 1 x 104 PBMC irradiadas, 5 pg/ml de PHA e 2% de IL-2. Após 10-12 dias, os poços positivos para crescimento são expandidos em placas de fundo redondo de 96 poços, usando 1 x 105 PBMC irradiadas, 5 pg/ml de PHA e IL-2. Três dias depois, os poços são alimentados com meio fresco contendo IL-2 e no 7o dia, os clones são expandidos em placas de 48 poços usando 5 x 105 PBMC irradiadas, PHA e IL-2; nesse ponto, os clones são testados em ensaios de proliferação para as respostas específicas a MBP. Os clones específicos para MBP são expandidos uma semana depois em placas de 24 poços, usando 1 x 106 PBMC irradiadas com PHA ou Dynabeads (Dynal, Reino Unido) e IL-2. Os clones são mantidos em placas de 24 poços usando um ciclo de reestimulação / expansão de 7 a 10 dias, essencialmente como descrito acima. A capacidade dos clones de células T (TCC) em reconhecer o painel de peptídios de MBP é testada por ensaios de proliferação, como descrito acima.

Resultados Reconhecimento de peptídios de MBP contra pacientes MS e indivíduos saudáveis [113] Os presentes inventores usam um ensaio de resposta cinética no qual as PBMC de pacientes MS e de indivíduos saudáveis são testadas para as suas capacidades em responder a um painel de peptídios sintéticos de 15-mer sobrepostos varrendo o comprimento integral de MBP humana. A resposta proliferativa das PBMC de cada cultura é examinada em 5 pontos de tempo por um período de 2 semanas e o perfil cinético da resposta à MBP e aos peptídios é comparado com a resposta para PPD, a última representando um antígeno de resposta / memória secundária. Nenhuma diferença significativa é encontrada na resposta às PBMC para MBP e/ou aos peptídios entre os pacientes em tratamento com lnterferon-β e aqueles sem tratamento (dados não apresentados). A resposta à MBP em ambos os pacientes MS e os controles saudáveis atingiu um pico após à resposta ao PPD, seguindo, desse modo, as características cinéticas da resposta a um antígeno não recordado. A

Figura 1 mostra um exemplo típico do perfil cinético para PPD e MBP em pacientes MS e indivíduos saudáveis.

[114] Como mostrado na Figura 2, os dois peptídios mais comumente reconhecidos pelos pacientes MS são 90 -114 e 75 - 99 (6/12 pacientes cada), seguidas pelas regiões 30-54, 135 -159 e 150 -170 (5/12 pacientes) e 1 - 24 e 105 - 129 (4/12 pacientes). Três pacientes respondem a aa 15 - 39 e 120 -144. Dois pacientes reconhecem 45 - 69 e nenhum dos pacientes MS responde à região 60 - 84.

[115] De acordo com a Figura 10, quando todos os pacientes são HLA-DR2 positivos, os dois peptídios mais comumente reconhecidos pelos pacientes MS são 90 - 114 e 75 - 99 (6/11 pacientes cada), seguidos pelas regiões 120-144, 135 -159 e 150 -170 (5/11 pacientes) e 1 -24, 15-39,30-54 e 105 - 129 (4/11 pacientes). Três pacientes respondem a aa 45 - 69 e de novo nenhum dos pacientes MS responde à região 60 - 84.

[116] Em contraste, os indivíduos saudáveis reconhecem significativamente menos peptídios, com apenas 2 indivíduos controle respondendo a mais do que 2 peptídios (C e J; Figura 3). Os indivíduos controle C e J são os únicos dois que reconhecem aa 60 - 84, uma região não observada por esse grupo de pacientes. Significativamente, ambos essas indivíduos expressam o alelo DRB1* 0701. As regiões 45 - 69 e 105 - 129 não são reconhecidas por quaisquer dos doadores saudáveis, enquanto que 75 - 99 e 150 - 170 são reconhecidas por 4 indivíduos saudáveis; a 135 - 159 é reconhecida por três indivíduos saudáveis; a 1 - 24, 30 - 54, 60 - 84 e 120 -144 são reconhecidas por dois indivíduos saudáveis; e as 15 - 39 e 90 - 114 são reconhecidas por um indivíduo. No total, 8/13 indivíduos saudáveis não respondem a quaisquer dos peptídios sobrepostos, enquanto que apenas 1/12 pacientes MS (MS 19) falham, consistentemente, em reconhecer os peptídios de MBP. Notavelmente, esse paciente é único em não responder à proteína MBP.

[117] A Figura 11 também mostra a resposta de indivíduos saudáveis aos peptídios de MBP. Nesse estudo, apenas 1 indivíduo controle responde a mais do que 2 peptídios (N11). N11 é também o único indivíduo que reconhece aa 60 - 84, uma região não observada por esse grupo de pacientes. As regiões 15 - 39, 45 - 69 e 105 - 129 não são reconhecidas por quaisquer dos doadores saudáveis, enquanto que 120 - 144 e 135 - 159 são reconhecidas por dois indivíduos saudáveis; e 1 - 24, 30 - 54, 60 - 84, 75 - 99, 90 - 114 e 150 - 170 são reconhecidas por um indivíduo. No total, 9/12 indivíduos saudáveis não respondem a quaisquer dos peptídios sobrepostos.

[118] No todo, o dia no qual a resposta à MBP e/ou aos peptídios de pico não diferiram significativamente entre os indivíduos saudáveis e os pacientes, e a cinética em ambos os grupos lembrou aquela de uma resposta antigênica primária. Além disso, a magnitude da resposta à MBP e aos peptídios não diferiram entre os pacientes e os indivíduos saudáveis.

Variações de reconhecimento de peptídios de MBP com o tempo [119] Tendo sido estabelecido que os pacientes com MS respondem a um amplo espectro de peptídios de MBP , os presentes inventores decidiram examinar se o reconhecimento das PBMC nos mesmos indivíduos é focada e estável durante o período aproximadamente de 4 - 12 meses. Como mostrado nas Figuras 2, 10 e 3, nem os pacientes MS nem os indivíduos saudáveis apresentaram o mesmo padrão de reconhecimento de peptídios.

[120] A Figura 4 representa um exemplo de um paciente MS (MS 49), que responde a múltiplos peptídios em 2 diferentes pontos de tempo, mas o perfil de reconhecimento durante o segundo ponto de tempo, medido 4 meses depois, difere significativamente. Isto é, no segundo ensaio cinético, a resposta às PBMC para as regiões aa 15 - 39, 30 - 54 e 150 - 170 persiste, embora a resposta para as 75 - 99 e 105 -129 regrida e se desloque para as regiões 90 -114 e 135-159.

[121] A Figura 5 (MS 60) ilustra um exemplo de um paciente cuja resposta ampla a epítopos regrediu a uma resposta focada pelo período de 4 meses. Os indivíduos saudáveis, que são testados pela segunda vez, falham redondamente em responder a quaisquer dos peptídios (Figura 3).

[122] No geral, os resultados demonstram que os pacientes com MS não apresentam padrões determinados de reconhecimento. Dentro de cada paciente, a resposta à PBMC aos vários peptídios pode persistir, regredir e serem deslocadas para as novas regiões da MBP, como observado no paciente MS 49.

Ciclização do reconhecimento de peptídios [123] Quando a resposta das PBMC aos peptídios é analisada em 3 ou mais pontos de tempo diferentes, por um período de 12 meses, fica claro que em certos pacientes, o reconhecimento de epítopos parece flutuar, em vez de se deslocar irreversivelmente para as novas regiões de peptídios. Por exemplo, como mostrado nas Figuras 2 e 10, o paciente MS 60 apresenta um padrão de ciclização de reconhecimento para aa 120 -144 e 135 -159, isto é, os resíduos 120 - 144 e 135 - 159 são entre muitos reconhecidos no primeiro ponto de tempo testado, a resposta a essas 2 regiões regride pelo segundo ponto de tempo e depois reaparece no terceiro ponto de tempo medido 4 meses depois. O perfil cinético do paciente MS demonstra, similarmente, que o reconhecimento de aa 135 - 150 flutua por vários pontos de tempo (consultar as Figuras 2 e 10).

[124] No meio do grupo de controle saudável (Figura 3), um indivíduo (M) apresenta uma resposta flutuante às regiões 75 - 99 e 135 - 159, um segundo indivíduo (F) reconhece 75 - 99 em dois dos três pontos de tempo analisados, enquanto um terceiro indivíduo (D) mostra uma resposta cíclica ao resíduo 15-39.

Mapeamento fino da resposta à MBP

[125] Os TCC são gerados de 8 pacientes MS e 2 indivíduos saudáveis e usadas para clarificar a especificidade fina das regiões dos peptídios identificadas no ensaio de resposta cinética. A especificidade de cada TCC é testada por sua resposta proliferativa ao painel de peptídios de 15-mer. O clone SD:A7 reconheceu a região 1-24 e dentro dessa região esse TCC respondeu à aa 5 - 19. A região 30 - 54 é reconhecida por 4 clones (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) e o epítopo dentro dessa região é 30 - 44. Um clone (MS39:D7) de um paciente MS reconhece o peptídio 60 - 74 e, interessantemente, um indivíduo saudável responde a essa região (60 - 84) em nosso ensaio de resposta cinética. Cinco clones (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) reconhecem uma aa 83 - 99, que está contida na região 75 - 99. Um paciente produziu TCC específico para aa 110 - 124 (MS60:A2, MS60:B3) contida dentro do pool 105 - 129, e outro TCC do mesmo paciente é específico para 130 - 144 (MS60:E1), encontrado dentro da região 120 - 144. Cinco indivíduos produzem clones que reconhecem epítopos dentro da região 135 - 159: MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 e N5:19, reconhece aa 140 - 154; MS57:A1 é específica para 140 - 149, e TCC MS17:A3 responde à seqüência 130 - 144. Esse painel de clones demonstra claramente a presença de pelo menos 2 epítopos de células T dentro da região 135 -159 da MBP. Por fim, a região 150 - 170 é reconhecida por 2 clones específicos para aa 156 -169. A especificidade de todos os TCC é resumida na Figura 6.

EXEMPLO 2 - Identificação de apítopos em MBP

Materiais e métodos Ensaio de apresentação de antígenos usando um APIPS

[126] A apresentação dos peptídios aos clones de células T é medida por proliferação. As APC são fixadas em paraformaldeído 0,5% e plaqueadas a 1 x 105 células por poço de uma placa de cultura de tecido de 96 poços. Os clones de células T são plaqueados a 2 x 104 células por poço, na presença de concentrações variáveis de peptídio. Após incubação por 48 h a 37°C, a proliferação é medida por incorporação de [3H]-timidina por 16 - 20 h. Os resultados são comparados com a capacidade das células T em responder ao epítopo apresentado por APC vivas.

[127] A apresentação dos peptídios às células T isoladas do camundongo transgênico DR2:MBP82-100 foi essencialmente como descrito acima, exceto que as APC foram plaqueadas a 5 x 105 células por poço, as células T foram plaqueadas a 1 x 105 células por poço e procedeu-se a incubação por 72 h antes da adição de [3H]-timidina.

Resultados [128] Neste experimento, os peptídios, que foram identificados como epítopos no exemplo prévio, são examinados para as suas capacidades de serem apresentados usando uma APIPS. Os resultados são mostrados na Figura 7b. Dos cinco epítopos examinados até aqui, quatro foram verificados como sendo apítopos (30 - 44, 80 - 94, 110 - 124 e 130 - 144) e um foi verificado como agindo como um epítopo, mas não um apítopo (156 -170).

Exemplo 2A - Investigação de peptídios de MBP 30-44, 110 -124, 130 - 144e 156-170 [129] Para investigar se os vários peptídios de MBP são apítopos, suas capacidades em serem apresentados às células T por APC fixas é investigada. As células Mgar (HLA-DR2+ve) vivas ou pré-pulsadas são com o peptídio em soro, ou soro apenas por 3,5 horas. O excesso de peptídio é depois removido das células, e, o clone de célula T adequado é adicionado. A resposta proliferativa de célula T é medida por absorção de [3H]-timidina.

[130] Como mostrado nas Figuras 8 e 9, os peptídios 30 - 44 (Figura 8A), 110-124 (Figura 8B) e 130 -144 (Figura 9A) podem ser apresentados por APC fixas sem processamento adicional. Esses peptídios são, portanto, definidos como apítopos. O peptídio 156 - 170, por outro lado, requer processamento adicional para apresentação às células T (Figura 9B). As APC fixas são incapazes de apresentarem esse epítopo às células T, de modo que 156-170 não é um apítopo.

Exemplo 2B - Identificação de apítopos dentro das regiões 77 - 100 e 125-148 da MBP

[131] Para qualquer dado epítopo, pode existir um ou mais apítopos, capazes de serem apresentados às APC sem processamento adicional. A presença de apítopos dentro das duas regiões da MBP é investigada por incubação de células de Mgar (HLA-DR2+ve) vivas ou fixadas em p-formaldeído, com os peptídios sobrepostos em soro das regiões da MBP 77 -100 (Figura 12) e 125 - 148 (Figura 13) ou em soro apenas. As células T foram adicionadas e depois de 72 h (Figura 12) ou após 48 h (Figura 13), a resposta proliferativa de célula T foi medida por absorção de [3H]-timidina. Para a MBP 77 - 100, as células T são isoladas de um camundongo transgênico DR2:MBP 82 - 100, enquanto que para a MBP 130 - 144, o clone de célula T MS17:A3 é usado.

[132] Para a região da MBP 77 - 100, os seguintes peptídios são definidos como apítopos: MBP 83-99ENPVVHFFKNIVTPRTP MBP 80-94TQDENPVVHFFKNIV MBP 81-95QDENPVVHFFKNIVT MBP 82 -96DENPVVHFFKNIVTP MBP 83-97 ENPVVHFFKNIVTPR MBP 84-98MPVVHFFKNIVTPRT

[133] A seqüência da MBP mínima reconhecida pelas células T do camundongo transgênico DR2 MBP 82 -100 é a região 85 - 94.

[134] Para a região MBP 125 - 148, os seguintes peptídios são definidos como apítopos: MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV MBP 131 -145ASDYKSAHKGFKGVD MBP 132 -146 SDYKSAHKGFKGVDA MBP 133 -147 DYKSAHKGFKGVDAQ

[135] A seqüência da MBP mínima reconhecida pelo clone de célula T MS17:A3 é a região 133 -144.

Exemplo 2C - Investigação da região 89-101 da MBP

[136] Os presentes inventores mostraram previamente que, em contraste com outros epítopos de células T da mielina, a administração do peptídio 89-101 em forma solúvel não impede a encefalomielite auto-imune experimental (EAE) de murina induzida tanto com mielina integral ou o próprio peptídio 89 -101 (Anderton e Wraith, 1998, Eur. J. Immunol. 28 : 1251).

MBP 89-101 compreende três epítopos de célula T

[137] Para investigar a reatividade da célula T para a região 81 -111 da MBP, as células de linfonodos de camundongos primados com 81 - 111 são estimuladas com 81 - 111 in vitro e essas células são testadas com um painel de peptídios de 10-mer sobrepostos com duas modificações de resíduo cobrindo a região 81 -111 (isto é: 81 - 90, 83 - 92, 85 - 94, 87 - 96, 89 - 98, 91 -100, 93 - 102, 95 - 104, 97 - 106, 99 - 108 e 101 - 111). O padrão de resposta para os peptídios cobrindo a 89 - 101 mostra uma capacidade estimulatória para os 5 peptídios adjacentes (N-terminal 87 - 96 a 95 - 104), refletindo a presença de pelo menos dois (e talvez três) epítopos distintos.

[138] Para investigar essa região ainda mais, três sublinhagens são geradas a partir da linhagem de células T responsiva à região 81 -111 original e essas são testadas de novo com um painel de peptídio de 10-mer sobrepostos com uma modificação de resíduo cobrindo a região 84 - 106. Os resultados revelam a existência de três epítopos de células T distintos mas sobrepostos dentro da seqüência 89 - 101: 89 - 94, 92 - 98 e 95 - 101 (consultar a Figura 14).

Peptídio de MBP 92 - 98 é um epítopo críptico [139] As três linhagens de células T (TLC) específicas para o epítopo mostram diferenças interessantes, quando testadas para a reatividade para o peptídio 89-101 e a MBP recombinante integral. Todas as três TCL respondem ao peptídio (89 -101), mas apenas as TCL específicas das regiões 89 - 94 e 95 -101 respondem à MBP integral. Isso indica que o processamento de antígenos da MBP intacta gera, de preferência, os ligantes para as células T reconhecendo as regiões 89 - 94 e 95 - 101, mas não aqueles reconhecendo 92 - 98. Isso sugere que o epítopo 92 - 98 é críptico (isto é, não pode ser gerado por processamento de antígeno nativo). Parece que o peptídio de MBP 89-101 pode participar em três interações distintas com a molécula de MHC resultando em ligantes de peptídio / MHC, que são reconhecidos por três populações de células T separadas. O processamento da MBP gera apenas os ligantes para duas dessas populações de células T (consultar a Figura 14).

[140] A indução de EAE requer reconhecimento de célula T de epítopos auto-antigênicos expressos no SNS, em conseqüência da degradação de MBP intacta. A imunização de camundongos com os peptídios compreendendo apenas um dos três epítopos de células T identificados previamente, mostra que apenas aqueles contendo um epítopo processado naturalmente (89 - 94 ou 95-101) são capazes de induzir EAE. Isso suporta mais ainda a descoberta de que 92 - 98 é um epítopo críptico.

[141] Peptídio de MBP 92 - 98 é o epítopo dominante para a região da MBP 89-101 [142] Como mencionado acima, a região 89-101 contém três peptídios distintos mas sobrepostos. Desses, o peptídio 92 - 98 parece ser dominante para essa região. Por exemplo, quando os clones de células T são gerados a partir de camundongos primados com o peptídio 89-101, todos os seis clones que foram gerados respondem ao 92 - 98. Usando peptídios análogos a 89 -101 contendo substituições individuais de alanina em cada posição, verificou-se que a substituição de quaisquer das posições 92 - 98 acarreta uma falta de sensibilidade, mostrando que a alteração de quaisquer resíduos dentro do núcleo 92 - 98 tem efeitos significativos no reconhecimento desse epítopo.

[143] Peptídio de MBP 89 - 101 falha em toleralizar as células T relevantes para EAE, que reconhecem um epítopo de MBP processado naturalmente [144] Para resumir as descobertas mencionadas acima, os presentes inventores verificaram que: a) a seqüência 89-101 tem o potencial de gerar 3 distintos epítopos de células T; b) apenas dois desses epítopos (89 - 94 e 95 -101) são gerados por processamento de antígeno de MBP intacto (tanto in vitro quanto in vivo); c) apenas os peptídios contendo os epítopos processados naturalmente e não contendo um epítopo críptico são efetivos em induzir EAE; e d) o peptídio 89-101 falha em proteger contra EAE nos experimentos de terapia com peptídios.

[145] Essas informações proporcionam uma base para investigação da hipótese de que o peptídio 89-101 falha em toleralizar contra EAE, por meio de uma falha, para ligar, diretamente, as células T relevantes da doença. Para suportar a hipótese, o peptídio (89 - 101) deve falhar em induzir tolerância ao epítopo encefalitogênico majoritário (89 - 94), uma vez que não vai se ligar diretamente ao elemento de restrição do MHC (l-As) na conformação apropriada. Em outras palavras, 89-101 não vai agir como um apítopo para as células T que respondem a 89 - 94.

[146] Para testar essa possibilidade, experimentos de tolerância são conduzidos com os peptídios 89-101 e 87 - 96 (Figuras 15 A & B). O peptídio 87 - 96 contém o epítopo (89 - 94) mais efetivo para induzir EAE. Métodos [147] Os camundongos receberam 200 μg de peptídio em PBS ou PBS apenas intraperitonealmente nos dias -8, -6 e -4 antes dos 100 pg de peptídio em adjuvante completo de Freund no dia 0. Após 10 dias, as células dos linfonodos drenantes (6 x 105 por poço) foram cultivadas em meio X-Vivo 15, suplementado com 2-mercaptoetanol 5 x 10-5 M e L-glutamina 2 M, com ou sem antígeno por 72 horas. As culturas foram pulsadas nas 16 horas finais com 0,5 μΟί de 3H-timidina e a incorporação medida usando um contador de cintilação de líquido. Os resultados são expressos como contagens médias por minuto para culturas em triplicata.

Resultados [148] Após serem primados com 87 - 96, induziu-se uma forte resposta de memória para ele próprio e uma resposta mais fraca para o 89 - 101 (Figuras 15 A e B, □ e o, respectivamente). Isso é consistente com a necessidade do processamento do antígeno para gerar 89 - 94 e 89 - 101. O uso de 87 - 96 como um tolerogênico, antes da primar com 87 - 96, eliminou as respostas de memória para ambos os 87 - 96 e 89 - 101 (Figura 15A, ve·, respectivamente). Isso se adapta às células T reativas 89 - 94, uma vez tornadas não- responsivas in vivo, falhando em responder in vitro ao 89 - 94, se são geradas a partir de 89 - 96 ou 89 -101. Crucialmente, no entanto, o uso de 89-101 como o tolerogênico, antes de primar com 87 - 96 falhou em inibir as respostas de memória para 87 - 96 ou 89-101 (Figuras 15 B e A, v e ·, respectivamente). Esses dados demonstram que a administração do peptídio 89-101 em forma tolerogênica falha em toleralizar o epítopo encefalitogênico processado naturalmente, com base na seqüência 89 - 94: o peptídio 89-101 falha em se comportar como um apítopo para o epítopo 89 - 94.

[149] Sem desejar estar ligado à teoria, os presentes inventores acreditam que as observações podem ser explicadas pela posição do peptídio 89-101 no sítio de ligação do peptídio no MFIC. Se o peptídio se liga de preferência de modo que a região 92 - 98 esteja na bolsa de ligação do peptídio, então vai ser reconhecido pelas células T específicas de MBP 92 - 98. Isso explicaria por que, quando os camundongos são primados com o peptídio MBP 89 - 101, todos os clones de células T gerados reconhecem o epítopo MBP 92 - 98. Igualmente, quando o 89 -101 é usado para toleralizar as células T, ele irá toleralizar, basicamente, as células que reconhecem o epítopo MBP 92 - 98. Se o MBP 92 - 98 é um epítopo críptico, ele não é gerado por processamento natural do antígeno integral e as células T que reconhecem esse epítopo não vão provavelmente existir in vivo. Mesmo se as células T específicas para MBP 92 - 98 não existissem in vivo, não seriam relevantes para a doença. Por conseguinte, o 89 -101 falha em impedir EAE induzida com MBP integral. EXEMPLO 3 - Terapia por peptídio para um modelo de camundongo de MS

[150] Os presentes inventores mostraram anteriormente que uma dose única de antígeno de peptídio, administrada tanto sistemicamente quanto por rota intraperitoneal (Liu e Wraith, (1995), Int. Immunol. 8 : 1255 - 1263) ou intranasal (Metzler e Wraith, (1993), 5 : 1159 - 1165), vai proteger, efetivamente, os camundongos de encefalomielite auto-imune experimental (EAE) por até três meses (Metzler e Wraith, (1999), Immunology 97 : 257 -263). Pelo menos 5 doses de peptídio foram necessárias para induzir tolerância no camundongo transgênico Tg-4 (Burkhart et al., (1999), 11 : 1625 - 1634) expressando um receptor de células T específico para EAE (Liu et al., 1995, Immunity 3 : 407 - 415). Trabalho recente mostrou que a rota intranasal (IN) é mais segura do que a rota intraperitoneal (IP) no camundongo Tg4, ainda que ambas as abordagens sejam igualmente seguras no camundongo não transgênico.

[151] O peptídio 83 - 99 de MBP é testado no camundongo transgênico Fug/D6, que expressa ambas uma molécula de MHC classe II HLA-DR2 e um TCR de um clone de célula T humana específico para esse peptídio. Os camundongos são tratados com peptídio, seguinte ou à dose padrão usada para o tratamento do camundongo transgênico Tg4 (protocolo Tg4) ou o protocolo de dessensibilização em escalada de dose de peptídio, que foi usada no tratamento de pacientes que sofrem de alergia (protocolo de dessensibilização).

[152] Protocolo Tg4: Grupos de camundongos são tratados por administração intranasal do peptídio 83 - 99 (4 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) ou apenas PBS em um volume total de 25 μΙ. Os camundongos são tratados a cada 1o e 5o dias da semana por 5 semanas, dando um total de 10 doses. No início da 6a semana, cada camundongo recebe uma injeção com peptídio 83 - 99 em adjuvante completo de Freund (CFA) e também recebe uma injeção IP de toxina de coqueluche (200 ng) nos 1° e 3° dias. A progressão de EAE é monitorada por pelo menos 30 dias.

[153] Protocolo de Dessensibilização: Grupos de camundongos são tratados por administração intranasal de uma dose em escalada do peptídio 83 - 99 ou apenas PBS em um volume total de 25 μΙ. O escalonamento de dose começa a 0,1 μς e prossegue por 1, 3, 6, 12, 50, e depois três vezes 100 μς. Os camundongos são tratados a cada 1o e 5o dias da semana por 5 semanas, dando um total de 10 doses. No início da 6a semana, cada camundongo recebe uma injeção com peptídio 83 - 99 em adjuvante completo de Freunds (CFA) e também recebe uma injeção IP de toxina de coqueluche (200 ng) nos 1° e 3° dias. A progressão de EAE é monitorada por pelo menos 30 dias. EXEMPLO 4 - Administração nasal de um coquetel de apítopos em pacientes MS

[154] Uma vacina é produzida compreendendo os peptídios de MBP 30 - 44, 83 - 99, 110 - 124 e 130 - 144 (isto é, alguns daqueles epítopos de MBP que foram identificados como apítopos). A vacina é dada a trinta e cinco pacientes em um ensaio de fases Ia / Ib. O ensaio é um ensaio de cruzamento único no qual os pacientes permanecem não tratados por três meses, seguida por uma dose única de peptídio (Ia). Os pacientes são depois monitorados por três meses seguintes à dose única da vacina, para determinar a segurança. O tratamento consiste depois de administração duas vezes por semana por deposição intranasal. Para cada paciente: a atividade clínica é analisada mensalmente por imagem de ressonância magnética; a atividade imunológica é monitorada usando um ensaio de resposta cinética para proliferação; e a produção de citocina é monitorada usando ELISA baseado em células.

[155] O ensaio envolve inicialmente o tratamento de 5 pacientes sofrendo de doença progressiva crônica (CP). Esses pacientes são selecionados com base na baixa atividade MRI e são tratados primeiramente com a dose mais alta de peptídios. O tratamento é iniciado no grupo de pacientes CP, porque esses são mais prováveis de demonstrar quaisquer possíveis efeitos nocivos, como evidenciado por um aumento na atividade MRI. O tratamento de pacientes remetendo à recorrência começa uma vez que esteja claro que ambos os tratamentos com dose única e com doses múltiplas são seguros no grupo CP. Um grupo maior de 30 pacientes remetendo à recorrência é recrutado com base melhora no sofrimento de lesões de MRI deles, durante um período de monitoramento de 3 meses. Esses são divididos em três grupos a serem tratados com uma dose alta, média ou baixa de peptídio.

Abreviações: APC = células apresentadoras de antígenos; MHC = complexo histocompatibilidade principal; TCR = receptor de célula T; EAE = encefalomielite auto-imune experimental; APÍTOPO = epítopo que não dependente de processamento de antígeno; APIPS = sistema de apresentação independente de processamento de antígeno; aa = aminoácido; MS = esclerose múltipla; MBP = proteína básica de mielina; PLP = proteína proteolipídica; TCL = linhagem de células T; TCC = clone de célula T; PBMC = células mononucleares de sangue periférico; PPD = derivado de proteína purificada de M. tuberculosis; PHA = fitoemaglutina.

[156] Várias modificações e variações dos métodos e sistema da invenção descritos vão ser evidentes para aqueles versados na técnica, sem que se afaste dos âmbito e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades preferidas específicas, deve-se entender que a invenção, como reivindicada, não deve ser indevidamente limitada a essas modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para conduzir a invenção, que são óbvias para aqueles versados em química e biologia ou em campos relacionados, são intencionadas para serem cobertas pela presente invenção. Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo mencionado acima são aqui incorporadas por referência.

REIVINDICAÇÕES

Claims (7)

1. Método in vitro para selecionar um peptídio capaz de induzir tolerância a um antígeno alvo in vivo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) tratar um sistema de apresentação de antígeno independente de processamento (APIPS) com uma pluralidade de peptídios, cada um compreendendo um epítopo de célula T, em que o APIPS compreende: (i) células apresentadoras de antígenos fixas; (ii) membranas lipídicas compreendendo moléculas de MHC de classe I ou II; ou (iii) moléculas de MHC de classe I ou II ligadas à placa. (b) analisar a ligação do peptídio às moléculas de MHC de classe I ou II no APIPS pela adição de células T e medição da ativação das células T; e (c) identificar um peptídio que é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II, sem processamento adicional, como sendo um peptídio que é capaz de induzir tolerância a um antígeno alvo in vivo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídio é capaz de se ligar a uma molécula de MHC da classe II, sem processamento adicional.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de peptídios é eluída das moléculas de MHC da classe II de uma célula apresentadora de antígeno.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídio é selecionado de um conjunto aninhado de peptídios truncados.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que cada peptídio da pluralidade de peptídios é capaz de induzir um distúrbio de hipersensibilidade associado com o antígeno em um indivíduo, quando administrado ao indivíduo com um adjuvante.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a presença de um epítopo de célula T é determinada por: (i) tratar: uma amostra de células de um indivíduo tendo o distúrbio de hipersensibilidade; e uma amostra de células de um indivíduo não tendo o distúrbio de hipersensibilidade com o peptídio; e (ii) comparar as respostas das células T entre as amostras de células.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o distúrbio de hipersensibilidade é uma alergia, doença autoimune ou rejeição a enxerto.