NO330535B1 - Fremgangsmate for a undersoke den tolerogene kapasitet til et peptid og fremgangsmate for selektering av et tolerogent peptid. - Google Patents
Fremgangsmate for a undersoke den tolerogene kapasitet til et peptid og fremgangsmate for selektering av et tolerogent peptid. Download PDFInfo
- Publication number
- NO330535B1 NO330535B1 NO20030790A NO20030790A NO330535B1 NO 330535 B1 NO330535 B1 NO 330535B1 NO 20030790 A NO20030790 A NO 20030790A NO 20030790 A NO20030790 A NO 20030790A NO 330535 B1 NO330535 B1 NO 330535B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- peptide
- cell
- peptides
- antigen
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 292
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 127
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 69
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 69
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 30
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 11
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 claims description 3
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 88
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 28
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 11
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 abstract description 9
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 84
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 84
- 230000004044 response Effects 0.000 description 50
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 27
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 18
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 11
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 8
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 6
- 101001018318 Homo sapiens Myelin basic protein Proteins 0.000 description 5
- 102000054064 human MBP Human genes 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 4
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 4
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 3
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000001712 encephalitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 2
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 1-24 Chemical compound 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010058284 Allergy to arthropod sting Diseases 0.000 description 1
- 229940122450 Altered peptide ligand Drugs 0.000 description 1
- 208000028185 Angioedema Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 102000030431 Asparaginyl endopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 206010006474 Bronchopulmonary aspergillosis allergic Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000033471 Cryofibrinogenaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010013700 Drug hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010015218 Erythema multiforme Diseases 0.000 description 1
- 206010015226 Erythema nodosum Diseases 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 1
- 101000864089 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930802 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000968032 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010042033 Stevens-Johnson syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000168 Stevens-Johnson syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 208000004732 Systemic Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000006778 allergic bronchopulmonary aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 208000002029 allergic contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010055066 asparaginylendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000599 auto-anti-genic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 208000019748 bullous skin disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 208000024711 extrinsic asthma Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 206010035653 pneumoconiosis Diseases 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte å undersøke den tolerogene kapasitet til et peptid og en fremgangsmåte for selektering av et tolerogent peptid. Et peptid identifisert ved en slik fremgangsmåte kan anvendes i behandling og/eller forebygging av en sykdom. Peptidet kan være del av et farmasøytisk preparat omfattende et flertall av slike tolerogene peptider.
I en adaptiv immunrespons er T lymfocytter i stand til å gjenkjenne interne epitoper i
et proteinantigen. Antigenpresenterende celler (APC) tar opp proteinantigener og ned-bryter dem til korte peptidfragmenter. Et peptid kan binde til et "major histocompatability complex" (MHC) klasse I eller II molekyl inne i cellen og bæres til celleoverflaten. Når det presenteres ved celleoverflaten i forbindelse med et MHC-molekyl, kan peptidet gjenkjennes av en T-celle (via T-celle-reseptoren (TCR)), i hvilket tilfellet peptidet er en T-celle-epitop.
T-celle-epitoper spiller en sentral rolle i den adaptive immunrespons på et hvilket som helst antigen, hvorvidt det er eget eller fremmed. Den sentrale rollen som spilles av T-celle-epitoper i hypersensitivitetssykdommer (som inkluderer allergi, autoimmune sykdommer og transplantat-rejeksjon) er blitt vist gjennom anvendelsen av forsøksmodel-ler. Det er mulig å indusere inflammatoriske eller allergiske sykdommer ved injeksjon av syntetiske peptider (basert på strukturen av T-celle-epitoper) i kombinasjon med adjuvans.
I motsetning er det blitt vist at det er mulig å indusere immunologisk toleranse mot spesielle peptidepitoper ved administrering av peptidepitoper i oppløselig form. Administrering av oppløselige peptidantigener har blitt påvist som et effektivt middel for inhibering av sykdom i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE - en modell for multippel sklerose — (MS)) (Metzler og Wraith (1993) Int. Immunol 5:1159-1165; Liu og Wraith (1995) Int. Immunol 7:1255-1265; Anderton og Wraith (1998) Eur.J.Immunol 28:1251-1261); og forsøksmodeller for artritt, diabetes og uveoretinitt (som redegjort for i Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor). Dette er også blitt påvist som et middel for behandling av pågående sykdom i EAE (Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor).
Anvendelsen av tolerogene peptider til å behandle eller forebygge sykdom har vekket betydelig oppmerksomhet. En årsak til dette er at det er blitt vist at visse tolerogene epitoper kan nedregulere responser av T-celler for distinkte antigener innenfor det samme vevet. Dette fenomenet, kjent som "bystander suppression" betyr at det bør være mulig å indusere toleranse til mer enn en epitop (foretrukket alle epitoper) innenfor et gitt antigen, og til mer enn ett antigen for en gitt sykdom, ved anvendelse av et spesielt tolerogent peptid (Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor). Dette ville fjernet behovet for å identifisere alle de patogene antigener innenfor en spesiell sykdom.
Peptider er også et fordelaktig valg for terapi på grunn av deres relativt lave kostnad og det forhold at peptidanaloger kan produseres med endrede immunologisk egenskaper. Peptider kan således modifiseres til å endre deres interaksjoner med enten MHC eller TCR.
Et mulig problem med denne betraktningsmåten er at det er blitt vist at ikke alle peptider som virker som T-celle epitoper er i stand til å indusere toleranse. Myelin-basisprotein (MBP) peptid 89-101 er et immundominant antigen etter immunisering og er også et svært effektivt immunogen både hva angår priming for T-celle-reaktivitet og induksjon av EAE. Det er imidlertid blitt vist at dette peptidet er ineffektivt ved indusering av toleranse når det administreres i oppløsning (Anderton og Wraith (1998), som angitt ovenfor).
Et antall forklaringer for det observerte hierarki i evnen til T-celle-epitoper til å indusere toleranse har blitt foreslått (redegjort for i Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor). Spesielt er det blitt foreslått at der er en korrelasjon mellom affiniteten til peptidet for MHC og tolerogeniteten (Liu og Wraith (1995) som angitt ovenfor), men dette overensstemmer ikke med enkelte av observasjonene. MBP[89-101] som ikke er tolerogent, binder f.eks. til I-A<s>med relativt høy affinitet. Det er således ikke ukompli-sert å forutsi hvilke peptider som vil indusere toleranse.
Hvis der var en rasjonell forklaring på hvorfor kun en andel av peptidepitoper er i stand til å indusere toleranse, ville dette forenkle seleksjonen av tolerogene peptider som er anvendbare i behandling og forebygging av hypersensitivitetssykdommer.
WO 00/11027 vedrører peptidanaloger av humant myelin basisprotein. Peptidanalogen har en lengde på minst 7 aminosyrer og er avledet fra rester 83-99 i humant myelin basisprotein.
US 5 858 980 vedrører fragmenter av humant myelin basisprotein som omfatter aminosyresekvensen ENPWHFFKNIVTPR.
WO 96/32957 vedrører en fremgangsmåte for å forandre cytokin mønsteret til autoreaktive T-celler fra et immunrespons-økende mønster til et immunrespons-regulerende mønster, som omfatter å eksponere T-cellene for en endret peptid ligand.
WO 98/13378 vedrører en fremgangsmåte for å øke opptak av et proteinholdig antigen eller et peptid avledet derfra ved antigenpresenterende celler som har en mannose-reseptor eller tilsvarende reseptor, hvorved antigenet eller peptidet er tilveiebrakt med minst en og foretrukket to mannosegrupper eller en funksjonell ekvivalent derav.
De foreliggende oppfinnere har vist at hvis en peptidepitop er av en passende størrelse til å presenteres ved umoden APC uten antigenbehandling, kan det indusere immunologisk toleranse. Den observasjon at noen T-celle-epitoper er tolerogene og andre er ute av stand til å indusere toleranse kan derfor forklares ved det forhold at noen epitoper krever ytterligere behandling før de er i stand til å presenteres av et MHC molekyl. Disse epitoper som krever ytterligere behandling induserer ikke toleranse når de administreres i en oppløselig form, på tross av deres kapasitet til å indusere sykdom når de injiseres i kombinasjon med adjuvans.
De epitoper som ikke krever ytterligere behandling er i stand til å indusere toleranse, og er blitt betegnet "apitoper" (Antigen Processing Independent epiTOPES) av oppfinnerne.
Dette funnet tilveiebringer en regelbasert metode for seleksjon av tolerogene T-celle-epitoper som fjerner behovet for å undersøke den tolerogene kapasiteten til et peptid in vivo. Dette er spesielt fordelaktig i utviklingen av strategier for å behandle eller forebygge sykdommer som det ikke er noen dyremodeller tilgjengelige for. Selv for sykdommer som har en dyremodell bør seleksjonsmetoden gjøre utviklingen av tole-ranseinduserende sammensetninger enklere og sikrere, fordi den tilveiebringer en mekanisme hvorved toleranseinduksjonskapasiteten til et peptid kan testes på humane T-celler (gjenkjennelse av antigen i forbindelse med humane MHC molekyler) in vitro, før deres anvendelse in vivo.
I et første aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse derfor en fremgangsmåte for å undersøke den tolerogene kapasitet til et peptid in vitro, som omfatter trinnet med å bestemme om peptidet kan binde et MHC klasse I eller II molekyl og presenteres for en T celle uten ytterligere antigenprosessering, hvori peptidets kapasitet til å binde MHC klasse I eller klasse II bestemmes ved: (i) å behandle et antigenprosesseringsuavhengig system (APIPS) med peptidet; og
(ii) å analysere binding av peptidet til MHC klasse I eller II molekyler innen APIPS.
I en foretrukket utførelsesform er peptidet i stand til å binde til et MHC klasse II molekyl uten ytterligere prosessering.
Et antall metoder er kjent i teknikken for screening med hensyn på peptider som er i stand til å virke som T-celle-epitoper for et gitt antigen. Metoden vil derfor i alminne-lighet anvendes til å selektere et tolerogent peptid fra en flerhet av peptider som hver omfatter en T-celle-epitop.
For å undersøke hvorvidt et peptid er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II molekyl uten ytterligere prosessering, kan man undersøke kapasiteten til peptidet til å binde MHC klasse I eller II molekyler ved anvendelse av et "antigen processing independent presentation system" (antigenprosesseringsuavhengig presentasjons-system) (APIPS). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter derfor de følgende trinn:
(i) behandling av et APIPS med et peptid,
(ii) analysering av binding av peptidet til MHC klasse I eller II molekyler innenfor
APIPS.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for selektering av et tolerogent peptid, som omfatter trinnet med å undersøke den tolerogene kapasitet til et peptid ved en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, og selektere et peptid i stand til binding til et MHC klasse I eller II molekyl og presentering for en T celle uten ytterligere antigenprosessering.
Et peptid selektert ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan være anvendbart i behandlingen og/eller forebyggingen av en sykdom. Peptidet kan særlig være anvendbart i behandlingen og/eller forebyggingen av en sykdom som er mediert av autoreaktive T-celler. Hypersensitivitetsreaksjoner er særlig mottagelige for behandling/forebygging ved anvendelse av det tolerogene peptidet, f.eks. allergi, autoimmunitet og transplantat-rejeksjon.
De foreliggende oppfinnere har allerede identifisert et antall apitoper for myelin-basisprotein, som er et autoantigen i multippel sklerose. Peptider selektert ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan derfor være anvendbare i behandlingen og/eller forebyggingen av multippel sklerose.
Det er kjent at noen peptider er i stand til å i indusere toleranse overfor andre epitoper fra det samme antigenet, og selv andre epitoper fra et distinkt antigen (ved fenomenet kjent som "bystander suppression"). De foreliggende oppfinnere forutsier imidlertid at for å tilstrekkelig undertrykke alle de autoreaktive T-celler, ville det være fordelaktig at en kombinasjon av forskjellige apitoper administreres til pasienten for å behandle/forebygge en spesiell sykdom. Peptider selektert ved fremgangsmåten ifølge den forelig gende oppfinnelse kan være en del av et farmasøytisk preparat omfattende flere peptider, idet hvert peptid er basert på en T-celle-epitop.
En generell strategi for behandling og/eller forebygging av en sykdom i et individ kan omfatte de følgende trinn:
(i) identifisering av et antigen for sykdommen
(ii) identifisering av en apitop for antigenet,
(iii) administrering av apitopen til individet.
Figur 1 viser et typisk eksempel på den kinetiske profilen til Mycobacterium tuberculosis renset proteinderivat (purified protein derivative (PPD)) og MBP i multippel sklerose (MS) pasienter og friske individer. Perifert blod-mononukleære celler (PBMC), isolert fra en MS pasient (A) og et normalt individ (B) testes med hensyn på deres evne til å proliferere i nærvær av PPD og helt MBP; den kinetiske profilen av den proliferative responsen på MBP sammenlignes med den av sekundært antigen PPD. Figur 2 er en tabell som oppsummerer PBMC responser på MBP og dets peptider i MS pasienter. Visse individer analyseres på tre separate tidspunkter, med en periode på omtrent 4 til 7 måneder mellom hvert tidspunkt. Figur 3 er en tabell som oppsummerer PBMC responser på MBP og MBP-peptider i friske individer. Mellom 4 og 7 måneder forløp mellom hvert tidspunkt. Figur 4 viser et eksempel på en MS pasient (MS 49) som responderer på multiple peptider ved 2 forskjellige tidspunkter, men for hvem gjenkjennelsesprofilen i løpet av det andre tidspunktet, målt 4 måneder senere, skiller seg betydelig. PBMC ble dyrket i nærvær av MBP og et panel av peptider som spenner over den fulle lengde av MBP, og proliferasjon ble målt ved 3H-thymidin-opptak. Den brede T-celle-proliferative respons observert ved det første tidspunktet var betydelig forskjellig fra responsen målt 7 måneder senere (andre tidspunkt). Figur 5 viser et eksempel på en pasient hvis brede epitoprespons (første tidspunkt) går tilbake (andre tidspunkt) og kommer til syne igjen over en tolv måneders periode (tredje tidspunkt). Figur 6 viser et kart over den fine spesifisiteten av peptidregionene identifisert i den kinetiske responsanalysen som oppnås gjennom anvendelsen av TCC frembrakt fra MS pasienter og friske individer. Mesteparten av peptidene anvendt i screeningsanalyser er 15-mer lange, noen få er imidlertid 10-mer, og 1 peptid er 17-mer. Spesifisiteten av hver TCC testes minst 2 ganger. Figur 7a er en tabell som viser karakteriseringen av T-celle-epitoper innenfor myelin-basisprotein gjenkjent av T lymfocytter fra MS pasienter. Figur 7b er en tabell som viser at alle T-celle-epitoper ikke nødvendigvis presenteres av fikserte APC og derfor ikke apitoper. Figurer 8 og 9 viser presenteringen av forskjellige MBP peptider for T-celle-kloner ved levende og fiksert APC. Fig. 8A-30-44, fig. 8B-110-124, fig. 9A—130-144, fig. 9B-156-170. Figur 10 er en tabell som viser topp-stimuleringsindeks (SI) verdier til MBP og MBP-peptider i MS pasienter oppnådd på tre separate tidspunkter. Prøver for det andre tidspunktet ble samlet 4-8 måneder etter det 1. tidspunktet, og prøver for det 3. tidspunktet ble oppnådd 35 måneder etter det andre tidspunktet. Bakgrunns-cpm ble målt for hver dag og varierte mellom 80-700 cpm; en positiv respons (halvfet skrift) ble definert i overensstemmelse med SI>3 og 8cpm>1000. (Det var ikke mulig å samle prøver for alle tre tidspunktene fra pasienter MS19 og MS67). Figur 11 er en tabell som viser topp-stimuleringsindeks (SI) verdier til MBP og MBP-peptider i friske individer. Bakgrunns-cpm ble målt for hver dag og varierte mellom 80-700 cpm; en positiv respons (halvfet skrift) ble definert i overensstemmelse med SI>3 og dcpm>1000. Figur 12 viser responsen av T-celler isolert fra en DR:2MBP82-100 transgen mus på presentering av nestede MBP peptider i regionen 77-100 ved APC. Figur 13 viser responsen av T-celle klon MS17:A3 på presentering av nestede MBP peptider i regionen 125-148 ved APC. Figur 14 er en illustrering av T-celle epitop-gjenkjennelse innefor MBP 89-101 sekvensen. Der er tre distinkte men overlappende T-celle-epitoper innenfor sekvensen: 89-94, 92-98 og 95-101. Potensialet for spalting mellom rester 94 og 95 ved virkningen av asparginylendopetidase (AEP) er vist. Figur 15 viser kapasiteten til MBP peptider 87-96 (A) og 89-101 (B) til å virke som en apitop for T-celler som responderer på 89-94 epitopen.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for å undersøke den tolerogene kapasitet til et peptid og en fremgangsmåte for selektering av et tolerogent peptid.
Toleranse
Som anvendt heri, betyr betegnelsen "tolerogen(t)" å være i stand til å indusere toleranse.
Toleranse er den manglende evne til å respondere på et antigen. Toleranse overfor selv-antigener er et essensielt trekk ved immunsystemet, når dette tapes kan autoimmun sykdom bli resultatet. Det adaptive immunsystem må opprettholde kapasiteten til å respondere på et enormt mangfold av infeksiøse midler mens det unngår autoimmunt angrep av selv-antigenene inneholdt innenfor sine egne vev. Dette kon-trolleres i stor grad ved sensitiviteten av umodne T lymfocytter overfor apoptotisk celledød i thymus (sentral toleranse). Ikke alle selv-antigener detekteres imidlertid i thymus, slik at død av selv-reaktive thymocytter forblir ufullstendig. Der er således også mekanismer hvorved toleranse kan erverves ved modne selv-reaktive T lymfocytter i de perifere vev (perifer toleranse). En oversikt over mekanismene for sentral og perifer toleranse er gitt i Anderton eta/ (1999) (Immunological Reviews 169:123-137).
Toleranse kan resultere fra eller karakteriseres ved induksjonen av anergi i minst en del av CD4+ T-celler. For å aktivere en T-celle, må et peptid assosiere med en "pro-fesjonell" APC som er i stand til å levere to signaler til T-celler. Det første signalet (signal 1) leveres av MHC-peptid-komplekset på celleoverflaten av APC og mottas av T-cellen via TCR. Det andre signalet (signal 2) leveres av kostimulerende molekyler på overflaten av APC, slik som CD80 og CD86, og mottas av CD28 på overflaten av T-cellen. Det menes at når en T-celle mottar signal 1 i fravær av signal 2, aktiveres den ikke og blir faktisk anergisk. Anergiske T-celler er motstandsdyktige overfor etterfølg-ende antigen stimulering, og kan være i stand til å undertrykke andre immunrespons-er. Anergiske T-celler menes å være involvert i mediering av T-celle-toleranse.
Uten ønske om å bindes av noen teori, forutsier de foreliggende oppfinnere at peptider som krever behandling før de kan presenteres i forbindelse med MHC molekyler ikke induserer toleranse fordi de må håndteres av modne antigenpresenterende celler. Modne antigenpresenterende celler (slik som makrofager, B-celler og dendrittiske celler) er i stand til antigenprosessering, men også levering av begge signaler 1 og 2 til en T-celle, hvilket fører til T-celle-aktivering. Apitoper vil på den annen side være i stand til å binde klasse II MHC på umodne APC. De vil således presenteres overfor T-celler uten kostimulering, hvilket fører til T-celle-anergi og -toleranse.
Apitoper er naturligvis også i stand til å binde til MHC molekyler ved celleoverflaten av modne APC. Immunsystemet inneholder imidlertid en større rikelighet av umodne enn modne APC (det er blitt foreslått at mindre enn 10% av dendrittiske celler aktiveres, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159:285-295). Standardposisjonen til en apitop vil derfor være anergi/toleranse, snarere enn aktivering.
Det er blitt vist at når toleranse induseres ved peptidinhalasjon, reduseres kapasiteten til antigenspesifike CD4+ T-celler til å proliferere. Videre nedreguleres produksjonen av IL-2, IFN-yog IL-4 i disse cellene, men produksjon av IL-10 økes. Nøytralisering av IL-10 i mus i en tilstand av peptidindusert toleranse er blitt vist og fullstendig gjen-opprette mottagelighet overfor sykdom. Det har blitt foreslått at en populasjon av regulerende celler fastholder den tolerante tilstand som produserer IL-10 og medierer immunregulering (Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).
Induksjonen av toleranse kan derfor overvåkes ved hjelp av forskjellige teknikker inkluderende: (a) redusert mottagelighet overfor å pådra seg sykdommen for hvilket peptidet er en
mål-epitop in vivo;
(b) induksjonen av anergi i CD4+ T-celler (som kan detekteres ved etterfølgende
stimulering med antigen in vitro) ;
(c) forandringer i CD4+ T-celle-populasjonen, inkluderende
(i) reduksjon i proliferasjon,
(ii) nedregulering i produksjonen av IL-2, IFN-yog IL4, og
(iii) økning i produksjonen av IL-10.
" Antigen Processing independent Epitopes" ( Antigenprosesseringsuavhengige epitoper)
( APITOPER)
Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter trinnet med selektering av et peptid som er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II protein uten ytterligere behandling. Slike peptider er kjent heri som "apitoper" (Antigen Processing Independent epiTOPES).
Celleoverflatepresentering av peptider avledet fra et gitt antigen er ikke vilkårlig og har en tendens til å domineres av et lite antall av hyppig forekommende epitoper. Domi-nansen av et spesielt peptid vil avhenge av mange faktorer, slik som relativ affinitet for binding av MHC molekylet, rom/tid-frembringelsespunkt innenfor APC og resistens overfor nedbrytning. Epitophierarkiet for et antigen kan forandre seg med progresjon av en immunrespons, som har viktige implikasjoner for selvtoleranse og autoimmunitet. Immundominerende determinante regioner er sannsynligvis gode tolerogener. Apitopen er således foretrukket basert på en dominant epitop.
Etter en primær immunrespons på de immundominante peptider, kan imidlertid epitop-"spredning" forekomme for sub-dominante determinanter (Lehmann et al (1992) Nature 358:155-157). Presentering av sub-dominante epitoper kan være viktig ved utløsning av autoimmunitet. Apitopen kan derfor være basert på en sub-dominant epitop.
For et hvilket som helst gitt antigen kan kryptiske epitoper også foreligge. Kryptiske epitoper er slike som kan stimulere en T-celle-respons når administrert som et peptid men som ikke greier å produsere en slik respons når administrert som et helt antigen. Det kan være at den kryptiske epitop ødelegges under behandling av antigenet til peptidet i APC. De foreliggende oppfinnere har vist at peptid 92-98 er en kryptisk epitop for MBP (eksempel 2C). Det er interessant at der er et antatt spaltingssete for asparaginylendopeptidase innenfor denne peptidregionen, hvilket kan bety at under naturlig behandling blir ingen peptider inneholdende denne regionen dannet ved APC.
Et kryptisk epitop kan virke som en apitop in vitro, ved at den kan være i stand til å binde til et MHC molekyl uten ytterligere behandling, og å indusere anergi i en T-celle som gjenkjenner den kryptiske epitop. Det ville imidlertid ikke være sannsynlig at en slik apitop er terapautisk anvendbar fordi den bør være ute av stand til å indusere toleranse overfor T-celler som gjenkjenner en naturlig behandlet epitop av antigenet.
Epitoper for et antigen kan identifiseres ved å måle T-celle-responsen til overlappende peptider som spenner over hele antigenet (se nedenfor) når presentert av APC. Slike undersøkelser resulterer vanligvis i "nestede sett" av peptider, og den minimale epitop for en spesiell T-celle-linje/klon kan vurderes ved å måle responsen på trunkerte peptider.
Det kan ikke antas at en minimal epitop av et antigen vil oppføre seg som en apitop. Det kan godt være at aminosyrer som flankerer den minimale epitop vil være nød-vendig for optimal binding til MHC. Apitopen bør være utformet til å dekke den mulig-het at der kan være hårfine forskjeller mellom de minimale epitoper av forskjellige T-celle-kloner.
Det skal fremheves at det ikke er sikkert at det er mulig å identifisere en apitop for alle epitoper. Der er tydelige tegn på at noen epitoper binder MHC på en måte som er avhengig av MHC-lasting i endosomer og således krever behandling (Viner et al (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. 92:2214-2218). Dette er en annen årsak til at man ikke kan anta at hver minimal epitop uunngåelig vil oppføre seg som en apitop.
Identifisering av peptider inneholdende T- celle epitoper
Der er et antall metoder som er kjent i teknikken for å identifisere T-celle-epitopene innefor et gitt antigen.
Naturlig prosesserte epitoper kan identifiseres ved masse-spektrofotometerisk analyse av peptider eluert fra antigen-lastet APC. Disse er APC som enten er blitt ansporet til å oppta antigen, eller er blitt tvunget til å produsere proteinet intracellulært ved trans-formasjon med det passende gen. APC inkuberes typisk med protein enten i oppløs-ning eller passende targetert til APC celleoverflaten. Etter inkubering ved 37°C lyseres cellene i detergent og klasse II proteinet renses ved f.eks. affinitetskromatografi. Behandling av det rensede MHC med et passende kjemisk medium (f.eks. sure beting-elser) resulterer i elueringen av peptider fra MHC. Denne oppsamlingen av peptider separeres og profilen sammenlignes med peptid fra kontroll-APC behandlet på den samme måten. Toppene som er unike for de proteinuttrykkende/tilførte celler analyseres (f.eks. ved massespektrometri) og peptidfragmentene identifiseres. Denne prosedyren frembringer vanligvis informasjon om omfanget av peptider (vanligvis funnet i "nestede sett") frembrakt fra et spesielt antigen ved antigenprosessering.
En annen metode for identifisering av epitoper er å screene et syntetisk bibliotek over peptider som overlapper og spenner over lengden av antigenet i en in vitro analyse. Det kan f.eks. anvendes peptider som er 15 aminosyrer lange og som overlapper med 5 eller 10 aminosyrer. Peptidene testes i et antigenpresenteringssystem som omfatter antigenpresenterende celler og T-celler. Antigenpresenteringssystemet kan f.eks. være en murin splenocyttfremstilling, en fremstilling av humane celler fra tonsill eller PBMC. Alternativt, kan antigenpresenteringssystemet omfatte en spesiell T-celle-linje/klon og/eller en spesiell antigenpresenterende celletype.
T-celle aktivering kan måles via T-celle proliferasjon (f.eks. ved anvendelse av<3>H-thymidin-innlemmelse) eller cytokinproduksjon. Aktivering av THl-type CD4<+>T-celler kan f.eks. detekteres via IFNy produksjon som kan detekteres ved hjelp av standard-teknikker, slik som en ELISPOT analyse.
Undersøkelser vedrørende overlappende peptid indikerer vanligvis det området av antigenet hvori en epitop er lokalisert. Den minimale epitop for en spesiell T-celle kan deretter vurderes ved å måle responsen på trunkerte peptider. Hvis det f.eks. oppnås en respons på peptidet omfattende rester 1-15 i overlappingsbiblioteket, kan det anvendes sett som er trunkert i begge ender (dvs. 1-14, 1-13, 1-12 etc. og 2-15, 3-15, 4-15, etc.) til å identifisere den minimale epitop.
Identifiseringen av immundominerende regioner av et antigen ved anvendelse av in vitro analyse (spesielt slike som anvender T-celle-linjer) er av de foreliggende oppfinnere forutsagt å presentere et skjevt mønster av peptidreaktivitet. I undersøkelsen med hensyn på å identifisere MBP epitoper som er beskrevet i eksemplene, anvender de en kinetisk responsanalyse hvori proliferasjonen av PBMC fra MS pasienter og friske individer måles mot et bibliotek over overlappende peptider. Denne analysen er basert på det funnet at selv om T-celler fra normale individer og MS pasienter reponderer på lignende måte på renset proteinantigen, så responderer de på en forskjellig måte på peptider basert på sekvensen av MBP. T-celler fra MS pasienter responderer med høyere størrelsesorden og hurtigere kinetikk på peptidantigener når sammenlignet med normale friske donorer. Dette muliggjør screening for og identifisering av epitopen som den spesielle pasienten responderer på ved et spesielt tidspunkt. I under-søkelsen beskrevet heri har denne fremgangsmåten åpenbart et antall epitop-inneholdende regioner som ikke ble identifisert ved anvendelse av standard-teknikker. Dessuten er det vist at T-celle-gjenkjennelse utviser et cyklisk mønster som viser seg på ett tidspunkt, går tilbake, og kommer deretter til syne igjen på et senere tidspunkt.
Den kinetiske analysen beskrevet av oppfinnerne tilveiebringer et verdifullt verktøy fordi den åpenbarer den epitop som en pasient responderer på ved et spesielt tidspunkt. Denne informasjonen kan anvendes til å spesialtilpasse en fremgangsmåte for administrering av terapautisk apitop for en spesiell pasient ved identifisering og administrering av en apitop for den relevante epitop (hvis der er en). Denne informasjonen kan også gjøre det mulig å trekke opp et generelt mønster for sykdoms-progresjon, slik at det terapeutiske preparatet kan utformes til å inkludere apitoper til epitopene som det er sannsynlig at er tilstede ved et gitt stadium under sykdommen.
" Antigen Processing Independend Presentation Systems"
( Antigenprosesseringsuavhengige presenteringssystemer) ( APIPS)
Sa snart en epitop er blitt identifisert, er det neste trinnet å undersøke hvorvidt den også oppfører seg som en apitop.
En apitop må presenteres for T-celler uten behov for antigenprosessering. Når peptider inneholdende T-celle-epitoper er identifisert, kan apitoper identifiseres ved anvendelse av et behandlingsfritt system. Trunkerte peptider og peptidanaloger kan testes for aktivering ved anvendelse av et antigenprosesseringsuavhengig presenteringssystem (APIPS).
Eksempler på APIPS inkluderer:
a) fiksert APC (med eller uten antistoffer til CD28),
b) Lipid-membraner inneholdende klasse I eller II MHC molekyler (med eller uten antistoffer til CD28), og c) renset naturlig eller rekombinant MHC i plate-bundet form (med eller uten antistoffer til CD28).
Det er kjent å anvende fiksert APC for å undersøke T-celle-responser, f.eks. i studier for å undersøke den minimale epitop innenfor et polypeptid, ved måling av responsen på trunkerte peptider (Fairchild et al (1996) Int. Immunol 8:1035-1043). APC kan fikseres ved anvendelse av f.eks. formaldehyd (vanligvis parpformaldehyd) eller glutaraldehyd.
Lipidmembraner (som kan være plane membraner eller liposomer) kan fremstilles ved anvendelse av kunstige lipider eller kan være plasmamembran/mikrosomale fraksjoner fra APC.
I bruk kan APIPS anvendes i brønnene til en vevskulturplate. Peptidantigener tilsettes deretter og binding av peptidet til MHC-delen av APIPS detekteres ved tilsetning av selekterte T-celle-linjer eller -kloner. Aktivering av T-celle-linjen eller -klonen kan måles ved hjelp av en hvilken som helst av metodene som er kjent i teknikken, f.eks. via 3H-thymidin-innlemmelse eller cytokinutskillelse.
Peptider
Betegnelsen "peptid" anvendes i den normale oppfatning til å bety en serie av rester, typisk L-aminosyrer, forbundet med hverandre typisk gjennom peptidbindinger mellom (x-aminogruppene og karboksylgruppene til nabo-aminosyrer. Betegnelsen inkluderer modifiserte peptider og syntetiske peptidanaloger.
Et peptid selektert ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan ha en hvilken som helst lengde som er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II molekyl uten ytterligere behandling.
Peptider som binder til MHC klasse I molekyler er typisk 7 til 13, mer vanlig 8 til 10 aminosyrer lange. Bindingen av peptidet stabiliseres ved dets to ender ved kontakter mellom atomer i hovedkjeden til peptidet og invariante seter i peptidbindingsgropen til alle MHC klasse I molekyler. Der er invariante seter i begge ender av fordypningen som binder amino- og karboksy- endepunktene til peptidet. Variasjoner i peptidlengde tilpasses ved hjelp av en bukting i peptid-ryggraden, ofte ved prolin- eller glycinrester som tillater den påkrevde fleksibilitet.
Peptider som binder til MHC klasse II molekyler er typisk mellom 8 og 20 aminosyrer lange, mer vanlig mellom 10 og 17 aminosyrer lange, og kan være mye lenger. Disse peptidene ligger i en forlenget konformasjon langs MHC II peptidbindingsgropen som (til forskjell fra MHC klasse I peptidbindingsgropen) er åpen i begge ender. Peptidet holdes på plass hovedsakelig ved hovedkjedeatom-kontakter med bevarte rester som fyller peptidbindingsgropen.
Peptidet kan dannes ved anvendelse av kjemiske metoder (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Peptider kan f.eks. syntetiseres ved hjelp av fastfase-teknikker (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), spaltes fra harpiksen, og renses ved preparativ høyytelsesvæskekromato-grafi (f.eks. Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and CO, New York NY). Automatisert syntese kan oppnås f.eks. ved å anvende ABI 43 1 A Peptide Synthesizer (Perkin Eimer) i overensstemmelse med instruksjonene gitt av produsenten.
Peptidet kan alternativt dannes ved hjelp av rekombinante metoder, eller ved spalting fra et lengre polypeptid. Peptidet kan f.eks. oppnås ved spalting fra target-antigenet. Sammensetningen av et peptid kan bekreftes ved aminosyreanalyse eller sekvensering (f.eks. Edman-nedbrytningsprosedyren).
Peptidet kan foretrukket avledes fra et mål-antigen. Et mål-antigen er et molekyl (f.eks. et protein eller glykoprotein) som prosesseres ved APC og gjenkjennes av T-celler under forløpet av sykdommen. Mål-antigenet vil naturligvis avhenge av målsykdommen. Peptidet kan foretrukket avledes fra et fragment av antigenet som oppstår ved naturlig prosessering av antigenet ved en APC.
For praktiske formål er der forskjellige andre egenskaper som peptidet bør utvise. F.eks. bør peptidet være oppløselig ved en konsentrasjon som tillater dets anvendelse in vivo. Peptidet bør foretrukket være oppløselig ved konsentrasjoner på opptil 0,5 mg/ml, mer foretrukket bør peptidet være oppløselig ved konsentrasjoner opptil 1 mg/ml, og mest foretrukket bør peptidet være oppløselig ved konsentrasjoner opptil 5 mg/ml.
For intranasal administrering er det maksimale volum av dose som kan tas opp ved anvendelse av aktuelle prosedyrer omtrent 200 pl pr. nesebor. Hvis peptidet er opp-løselig ved 1 mg/ml, gjør en dobbelt dose til hvert nesebor det mulig å gi 800 ug til pasienten. Det er uvanlig å gi mer enn 50 mg i en hvilken som helst individuell dose.
Det er også viktig at peptidet er tilstrekkelig stabilt in vivo til å være terapautisk anvendbart. De foreliggende oppfinnere har funnet at in vivo, 30 minutter etter administrering, faller den totale mengde av et testpeptid til omtrent 50%, 4 timer etter administrering faller mengden til omtrent 30%, men at etter 5 døgn er peptidet fremdeles detekterbart (ved omtrent 5%). Halveringstiden av peptidet in vivo bør være minst 10 minutter, foretrukket minst 30 minutter, mer foretrukket minst 4 timer og mest foretrukket minst 24 timer.
De foreliggende oppfinnere har funnet at etter intranasal administrering når mengden av peptid i den drenerende lymfekjertel en topp ved omtrent 4 timer etter administrering, idet peptidet imidlertid fremdeles er detekterbart (ved nivåer på omtrent 5% maksimum) etter 5 døgn. Peptidet er foretrukket tilstrekkelig stabilt til å være tilstede ved en terapautisk aktiv konsentrasjon i den drenerende lymfekjertel lenge nok til å utøve en terapautisk effekt.
Peptidet bør også vise god biotilgjengelighet in vivo. Peptidet bør opprettholde en konformasjon in vivo som gjør det mulig at det kan binde til et MHC molekyl ved celleoverflaten uten ventet hindring.
Målsykdommer
Et peptid selektert ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan være anvendbart i behandling og/eller forebygging av en sykdom.
Det er sannsynlig at en apitop for MHC klasse II er spesielt anvendbar i sykdommer som medieres av CD4+ T-celle-responser, f.eks. sykdommer som er etablert eller opprettholdt av en uhensiktsmessig eller overdreven CD4+T-celle-respons.
Det er sannsynlig at et slikt peptid er spesielt anvendbart i behandlingen av hypersensitivitetssykdommer. Hypersensitivitetssykdommer inkluderer: (i) allergier, som resulterer fra uhensiktsmessige responser på uskadelige fremmedsubstanser, (ii) autoimmune sykdommer, som resulterer fra responser på egne vevs-antigener, og
(iii) graftrejeksjon, som resulterer fra responser på et transplantat.
Eksempler på allergier inkluderer, men er ikke begrenset til: høyfeber, ekstrinsisk astma, insektbitt- og -stikkallergier, mat- og legemiddelallergier, allergisk rhinitt, bronkialastma, kronisk bronkitt, anafylaktiske syndrom, uricaria, angioødem, atopisk dermatitt, allergisk kontakt dermatitt, erythema nodosum, erythema multiforme, Stevens-Johnson Syndrome, rhinokonjunktivitt, konjunktivitt, kutan nekrotiserende venulitt, inflammatorisk lungesykdom og bulløse hudsykdommer.
Eksempler på de autoimmune sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til: rheumatoid artritt (RA), myasthenia gravis (MG), multipple sklerose (MS), systemisk lupus erythematosus (SLE), autoimmune tyroiditt (Hashimotos tyroiditt), Graves sykdom, inflammatorisk tarmsykdom, autoimmun uveoretinitt, polymyositt og visse typer diabetes, systemisk vaskulitt, polymyositt-dermatomyositt, systemisk sklerose (skleroderma), Sjøgrens Syndrom, ankyloserende spondylitt og relaterte spondyl-artropatier, reumatisk feber, hypersensitivitets-pneumonitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose, uorganisk støv-pneumokoniose, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, immunologiske blodplatesykdommer, cryopatier slik som cryofibrinogenemi og autoimmune polyendocrinopatier.
En rekke forskjellige vev transplanteres vanligvis i klinisk medisin, inkluderende nyre, lever, hjerte, lunge, hud, hornhinne og benmarg. Alle transplantater unntatt hornhinne- og noen benmargstransplantater krever vanligvis langvarig tilstedeværelse av immunsuppresjon.
Peptidet kan anvendes i behandlingen og/eller forebyggingen av diabetes. I denne utførelsesformen kan peptidet avledes fra målantigenet IA2.
Peptidet kan anvendes i behandlingen og/eller forebyggingen av multippel sklerose
(MS). Multippel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk sykdom som kjennetegnes ved multiple demyeliniserende lesjoner som er dissiminert gjennom hele den CNS hvite substans og forekommer ved forskjellige steder og tidspunkter (McFarlin og McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 og 1246-1251). MS menes å medieres av autoreaktive T-celler.
Peptidet kan avledes fra ett av autoantigener, særlig myelin-basisprotein (MBP) eller proteolipid-protein (PLP). MBP er muligens mer formålstjenlig enn PLP, fordi PLP er svært hydrofobt og peptider avledet fra dette har en tendens til å klumpe seg sammen. MBP er immunogent og MBP-spesifikke T-lymfocytter har encefalittogenisk aktivitet i dyr (Segal et al, 1994 J. Neuroimmunol 51:7-19, Voskuhl et al, 1993 J. Neuroimmunol 42:187-192, Zamvil etat, 1985 Nature 317:355-8).
Peptidet kan avledes fra en av de immundominerende regioner av MBP, nemlig: 1-24, 30-54, 75-99, 90-114, 105-129, 120-144, 135-159 og 150-170.
Apitoper for MHC klasse I kan f.eks. anvendes til å modifisere anti-virale CD8+responser på en tolerogen måte.
Farmasøytisk preparat
De foreliggende oppfinnere forutsier at det på tross av "bystander suppresjon" kan være nødvendig å targetere et antall forskjellig T-celle-kloner for å indusere toleranse på en effektiv måte. Et flertall peptider kan således administreres til et individ for å forebygge eller behandle en sykdom.
Et peptid selektert ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan derfor være del av et farmasøytisk preparat omfattende et flertall apitoper.
Det farmasøytiske preparatet kan f.eks. omfatte mellom 2 og 50 apitoper, foretrukket mellom 2 og 15 apitoper. Apitopene kan være avledbare fra det (de) samme eller forskjellig(e) målantigen(er). Apitopen er foretrukket enten alle i stand til å binde til MHC klass I, eller alle i stand til å binde MHC klasse II, uten ytterligere behandling. Alle apitopene i det farmasøytiske preparatet er foretrukket enten i stand til å binde til MHC klasse I eller klasse II uten ytterligere behandling.
Det farmasøytiske preparatet kan være i form av et sett, hvori noen eller hver av apitopene er tilveiebrakt separat for samtidig, separat eller sekvensiell administrering.
Alternativt (eller i tillegg) hvis det farmasøytiske preparatet (eller en hvilken som helst del derav) skal administreres i multiple doser, kan hver dose være pakket separat.
Det farmasøytiske preparatet kan omfatte en terapautisk eller profylaktisk effektiv mengde av apitopen eller av hver apitop og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipiens.
I de farmasøytiske preparatene kan apitopen eller hver apitop videre være blandet med hvilket eller hvilke som helst egnede bindemidler, smøremidler, suspensjons-midler, belegningsmidler eller solibiliseringsmidler.
Administrering
Peptidet bør administreres i oppløselig form i fravær av adjuvans.
Peptidet administreres foretrukket ved en mukosal rute.
Studier har vist at et peptid, når det i oppløselig form gis intraperitonealt (i.p.), intra-venøst (i.v.) eller intranasalt (i.n.) eller oralt, kan indusere T-celle-toleranse (Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor; Liu og Wraith (1995) som angitt ovenfor, Metzler og Wraith (1999) Immunology 97:257-263).
Peptidet administreres foretrukket intranasalt.
Studier i mus har vist at varigheten av peptidadministrering som er påkrevet for å indusere toleranse avhenger av forløperhyppigheten av T-celler i recipienten (Burkhart et al (1999) som angitt ovenfor). I mange forsøksstudier er det blitt vist at gjentatte doser av peptid er påkrevet for å indusere toleranse (Burkhart et al (1999) som angitt ovenfor). Den nøyaktige dose og antall doser av peptid vil derfor avhenge av individet, idet et flertall doser imidlertid administreres i en foretrukket utførelsesform.
Hvis et flertall peptider administreres samtidig, kan de være i form av en "cocktail" som er egnet for administrering i enkle eller multiple doser. Alternativt kan det være foretrukket å gi multiple doser men variere de relative konsentrasjoner av peptidene mellom doser.
Foretrukket kan det følges en "doseeskaleringsprosedyre", hvor flere doser gis til pasienten i stigende konsentrasjoner. En slik fremgangsmåte er f.eks. blitt anvendt for fosfolipase A2 peptider i immunterapautiske anvendelser mot biegiftallergi (Muller et al
(1998) J. Allergy Clin Immunol 101:747-754 og Akdis et al (1998) J. Clin Invest 102:98-106).
EKSEMPLER
De etterfølgende eksempler tjener til å belyse den foreliggende oppfinnelse.
EKSEMPEL 1 - identifisering av T-celle-epitoper i MBP
Materialer og metoder
Antigener
Humant MBP fremstilles fra hvit hjernesubstans som beskrevet av Deibler et al.
(Deibler et al, 1972 Preparative Biochemistry 2:139), og dens renhet vurderes ved hjelp av SDS-PAGE. MBP og Mycobacterium tuberculosis renset proteinderivat (PPD, "purified protein derivative") (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) anvendes i proliferative analyser ved tidligere bestemte optimale konsentrasjoner; den optimale konsentrasjonen for hvert antigen er 50 ug/ml. Et panel av 15-mer overlappende peptider som spenner over hele MBP molekylet syntetiseres ved anvendelse av standard F-moc kjemi på en Abimed AMS 422 multippel peptid syntetiseringsinnretning (Abimed, Langenfeld, Tyskland). Hvert peptid deplasseres av 5 aa og overlappes av 10 aa. Det produseres 33 peptider som skal samles i grupper på 3 og samlingene testes ved den optimale konsentrasjonen på 50 ug/ml, slik at hvert peptid in vitro er tilstede ved en konsentrasjon på 16,6 ug/ml.
Pasienter og kontrollindivider
Individene i denne undersøkelsen består av 12 pasienter med klinisk bestemt eller
laboratorieunderstøttet bestemt MS (Poser et al, 1983), med en alder som varierer fra 29-51 år. Åtte av de 12 pasientene er involvert i et forsøk med interferon-p, ellers har alle andre MS pasienter ikke mottatt noen corticosteroidbehandling i de siste 3 måned-ene før igangsettelsen av undersøkelsen. Kontrollgruppen bestod av 13 friske individer med en alder som varierer fra 25-55 år, og ingen hadde mottatt immunundertrykkende terapi i minst 3 måneder før blodprøven ble tatt.
Vevskulturmedium
RPMI-1640 medium supplert med 20 mM HEPES (Sigma, Poole, UK), penicillin (lOOU/ml), streptomycinsulfat (100 mg/ml), og 4 mM L-glutamin (alle fra Life Technologies, Paisley, Scotland), anvendes som vevskulturmediet. Medium uten serum anvendes for vasking av lymfoidceller og TCL. For alle kulturbetingelser og analyser suppleres mediet med 10% varme-inaktivert autologt plasma.
Dyrkinosbetin<g>elser og T- celle- proliferative analyser
Citratbehandlet perifert blod (50-100 ml) samles ved venepunktering fra hvert individ etter opplyst skriftlig samtykke var blitt anskaffet. Perifert blod-mononukleære celler (PBMC) isoleres fra blod ved densitetssentrifugering på Histopaqe-1077 (Sigma, Poole, UK), og dyrkes i 1,5 ml volumer i 24-brønns vevskulturplater (Nunc International, Costar, Corning Inc. New York, USA) ved en konsentrasjon på lxlO<6>celler pr. ml, inneholdende enten PPD, MBP eller peptider av MBP. Platene inkuberes ved 37°C i en fuktet atmosfære av 5% 03^95% luft. Mellom dagene 5 og 14 trekkes duplikate prøvemengder på 100 pl ut fra hver kultur, overføres til en 96-brønns rundbunnet mikrotiter plate og pulseres med 0,4 uCi[<3>H]-Thymidine (Amersham International, Amersham, UK). Etter 18 timer høstes cellene på glassfibermatter (LKB-Wallac, Turku, Finland) ved anvendelse av en Mach 111 høsteinnretning 96 (Tomtec, Orange, New Jersey, USA). [<3>H]-Thymidine-innlemmelse bestemmes ved anvendelse av en mikro-beta væskescintillasjonsteller (LKB-Wallac). Testbrønner inneholdende antigen anses positive når8CPM>1000 og stimuleringsindeksen (SI)>3, hvor SI = CPM antigen-inneholdende kultur/CPM-kultur uten antigen.
Frembringelse av T- celle- linier og T- celle- kloner
MBP-spesifikke T-celle-linjer (TCL) frembringes fra 8 MS-pasienter og 2 friske kontroll-donorer. PBMC fra hvert individ separeres som beskrevet ovenfor og utplates medlxlO<6>celler/ml i 6-brønns plater i nærvær av MBP (50 ug/ml); en porsjon PBMC fra hvert individ nedfryses regelmessig og lagres for senere restimuleringer. Syv dager senere tilføres cellene friskt medium inneholdende 2% IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK), og på dag 12 av dyrkingen restimuleres alle celler med antigen, IL-2 og bestrålte (2500 Rad) autologe PBMC som en kilde for antigenpresenterende celler (APC), ved et celleforhold på lT-celle:5 APC. Celler ekspanderes i IL-2 hver 3-4 dag og restimuleres på dag 14 med antigen, IL-2 og PBMC, som beskrevet ovenfor. På dagen for den første restimuleringen undersøkes cellene med hensyn på spesifikk proliferasjon overfor MBP. I kortere trekk dyrkes 2xl0<4>T-celler og lxlO<5>bestrålte autologe PBMC in triplo, i en 96-brønns rundbunnet plate, i nærvær av MBP. Cellene dyrkes i 2 døgn og pulseres med (<3>H)-Thymidine ved 0,4 uCi/brønn under de siste 18 timene av dyrkingen. Cellene høstes deretter som beskrevet ovenfor, og en TCL anses å være MBP-spesifikk med en 8cpm>1000 og en SI>3.
Etter 3 restimulerings/ekspansjonssykluser klones TCL ved anvendelse av PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK)) i nærvær av autologe bestrålte PBMC som APC. T-celler utplates under begrensende fortynningsbetingelser med 0,1 celle/brønn, 0,3 celle/brønn og 1 celle/brønn og dyrkes i Terasaki-plater (Nunc International, Costar) med lxlO<4>bestrålte PBMC, 5 ug/ml PHA og 2% IL-2. Etter 10-12 dager ble vekstpositive brønner ekspandert på 96-brønns rundbunnede plater, ved anvendelse av lxlO<5>bestrålte PBMC, 5 ug/ml PHA og IL-2. Tre dager senere tilføres brønnene friskt medium inneholdende IL-2, og på dag 7 ekspanderes klonene på 48-brønns plater ved anvendelse av 5xl0<5>bestrålte PBMC, PHA og IL-2; på dette tidspunktet testes kloner i proliferasjonsanalyser med hensyn på spesifikke responser på MBP. MBP-spesifikke kloner ekspanderes en uke senere på 24-brønns plater, ved anvendelse av lxlO<6>bestrålte PBMC med PHA eller Dynabeads (Dynal, UK) og IL-2. Klonene opprettholdes i 24-brønns plater ved anvendelse av en 7-10 dagers restimulering/ekspansjonssyklus, i alt vesentlig som beskrevet ovenfor. T-celle-klonenes (TCC) evne til å gjenkjenne panelet av MBP-peptider testes ved hjelp av proliferasjonsanalyser, som beskrevet ovenfor.
Resultater
MBP- peptid- ojenkiennelse blant MS- pasienter oa friske individer
De foreliggende oppfinnere anvender en kinetisk responsanalyse hvori PBMC fra MS-pasienter og friske individer testes med hensyn på deres evne til å respondere på et
panel av overlappende 15-mer syntetiske peptider som spenner over den fulle lengden av humant MBP. Den proliferative respons av PBMC fra hver kultur undersøkes ved 5 tidspunkter over en periode på 2 uker, og den kinetiske profilen av responsen på MBP og peptider sammenlignes med responsen på PPD, idet sistnevnte representerer et sekundært respons/hukommelse-antigen. Ingen betydelig forskjell finnes i PBMC-responsen på MBP og/eller peptider mellom pasienter som går på Interferon-p og dem som ikke går på noen behandling (data ikke vist). Responsen på MBP i både MS-pasienter og friske kontroller nådde en topp senere enn responsen på PPD, og følger derved de kinetiske karakteristika av responsen på et ikke-recall antigen. Figur 1 viser et typisk eksempel på den kinetiske profilen av PPD og MBP i MS-pasienter og friske individer.
Som vist i figur 2, er de to peptidene som vanligst gjenkjennes ved MS-pasienter 90-114 og 75-99 (6/12 pasienter hver), etterfulgt av regioner 30-54, 135-159 og 150-170 (5/12 pasienter), og 1-24 og 105-129 (4/12 pasienter). Tre pasienter responderer på aa 15-39 og 120-144. To pasienter gjenkjenner 45-69, og ingen av MS-pasientene responderer på region 60-84.
I overensstemmelse med figur 10, hvor alle pasientene er HLA-DR2 positive, er de to peptidene som vanligst gjenkjennes ved MS-pasienter 90-114 og 75-99 (6/11 pasienter hver), etterfulgt av regioner 120-144, 135-159 og 150-170 (5/11 pasienter), og 1-24, 15-39, 30-54 og 105-129 (4/11 pasienter). Tre pasienter responderer på aa 45-69, og igjen responderer ingen av MS-pasientene på region 60-84.
I motsetning gjenkjenner friske individer betydelig færre peptider, idet kun 2 kontrollindivider responderer på mer enn 2 peptider (C og J; figur 3). Kontrollindivider C og J er de to eneste som gjenkjenner aa 60-84, en region som ikke sees hos denne gruppen pasienter. Det er interessant at begge disse individene uttrykker DRB1<*>0701 allelet. Regioner 45-69 og 105-129 gjenkjennes ikke av noen av de friske donorene, mens 75-99 og 150-170 gjenkjennes av 4 friske individer, 135-159 gjenkjennes av tre friske individer, 1-24, 30-54, 60-84 og 120-144 gjenkjennes av to friske individer, og 15-39 og 90-114 gjenkjennes av ett individ. Totalt er det 8/13 friske individer som ikke responderer på noen av de overlappende peptider, mens kun 1/12 MS-pasienter (MS 19) konsistent ikke greier å gjenkjenne MBP peptider. Det bør legges merke til at denne pasienten er unik ved ikke å respondere på MBP-protein.
Figur 11 viser også responsen til friske individer på MBP- peptider. I denne under-søkelsen responderer kun 1 kontrollindivid på mer enn 2 peptider (Nil). Nil er også det eneste individet som gjenkjenner aa 60-84, en region som ikke sees hos denne gruppen pasienter. Regioner 15-39, 45-69 og 105-129 gjenkjennes ikke av noen av de friske donorene, mens 120-144 og 135-159 gjenkjennes av to friske individer, og 1-24,30-54, 60-84, 75-99, 90-114 og 150-170 gjenkjennes av ett individ. Totalt responderer 9/12 friske individer ikke på noen av de overlappende peptider.
Samlet, den dag hvorpå responsen på MBP og/eller peptider nådde en topp skilte seg ikke betydelig mellom friske individer og pasienter, og kinetikken i begge gruppene lignet på kinetikkene for en primær antigenrespons. Størrelsen av responsen på MBP og peptider er i tillegg ikke forskjellige mellom pasienter og friske individer.
Forandrin<g>er over tid av MBP- peptid- oienkjennelse
Etter at det er etablert at pasienter med MS responderer på et bredt spektrum av MBP-peptider, besluttet de foreliggende oppfinnere å undersøke hvorvidt PBMC-gjenkjennelse i de samme individene er fokusert og stabil over et forløp på omtrent 4-12 måneder. Som vist i figurene 2, 10 og 3 utviste hverken MS-pasientene eller de friske individene det samme peptid-gjenkjennelsesmønster. Figur 4 representerer et eksempel på en MS-pasient (MS 49) som responderer på multiple peptider ved 2 forskjellige tidspunkter, men gjenkjennelsesprofilen under det andre tidspunktet, målt 4 måneder senere, avviker betydelig. Det vil si at i den andre kinetiske analysen vedvarer PBMC-responsen på aa 15-39, 30-54 og 150-170, idet responsen på 75-99 og 105-129 imidlertid går tilbake og forskyves til regioner 90-114 og 135-159. Figur 5 (MS 60) belyser et eksempel på en pasient hvis brede epitoprespons gikk tilbake til en fokusert respons over en periode på 4 måneder. De friske individene som testes den andre gangen igjen greier ikke å respondere på noen av peptidene (figur 3).
Samlet viser resultatene at pasienter med MS ikke utviser faste gjenkjennelses-mønstre. Innen hver pasient kan PBMC-responsen på flere peptider vedvare, gå tilbake og forskyves til nye regioner av MBP, som det sees i pasient MS 49.
Cvkliserin<q>av peptid- qjenkiennelse
Når PBMC-responsen på peptider analyseres ved 3 eller flere forskjellige tidspunkter over en periode på 12 måneder, blir det klart at i visse pasienter viser epitop-gjenkjennelse seg å fluktuere snarere enn å forskyves irreversibelt til nye peptidregioner. For eksempel, som vist i figurer 2 og 10, utviser pasient MS 60 et cykliserende gjen-kjennelsesmønster overfor aa 120-144 og 135-159; dvs. at rester 120-144 og 135-159 er blant mange som gjenkjennes ved det første tidspunktet som testes, responsen på disse 2 regioner går tilbake ved det andre tidspunktet og kommer deretter igjen til syne ved det tredje tidspunktet målt 4 måneder senere. Den kinetiske profilen til pasient MS 41 viser likeledes at gjenkjennelse av aa 135-159 fluktuerer over flere tidspunkter (se figurer 2 og 10).
Blant den friske kontrollgruppen (figur 3) utviser et individ (M) en fluktuerende respons på regioner 75-99 og 135-159, et andre individ (F) gjenkjenner 75-99 ved to av de tre tidspunktene som analyseres, mens et tredje individ (D) utviser en cyklisk respons på rest 15-39.
Fin- kartleqqinq av responsen på MBP
TCC frembringes fra 8 MS-pasienter og 2 friske individer, og anvendes til å klarlegge den fine spesifisiteten til peptidregionene identifisert i den kinetiske responsanalysen. Spesifisiteten til hver TCC testes ved dens proliferative respons på panelet av 15-mer peptider. Klon SD:A7 gjenkjente region 1-24, og innenfor denne regionen responderte denne TCC på aa 5-19. Region 30-54 gjenkjennes av 4 kloner (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) og epitopen innenfor denne regionen er 30-44. En klon (MS39:D7) fra en MS-pasient gjenkjenner peptid 60-74, og det er interessant at et friskt individ responderer på denne regionen (60-84) i vår kinetiske responsanalyse. Fem kloner (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) gjenkjenner aa 83-99 som er inneholdt i region 75-99. En pasient produserte TCC som er spesifikk for aa 110-124 (MS60:A2, MS60:B3), inneholdt innenfor 105-129 samlingen, og en annen TCC fra den samme pasienten er spesifikk for 130-144 (MS60:E1), funnet innenfor 120-144 regionen. Fem individer produserer kloner som gjenkjenner epitoper innenfor regionen 135-159:MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 og N5:19 gjenkjenner aa 140-154, MS57:A1 er spesifikk for 140-149 og TCC MS17:A3 responderer på sekvens 130-144. Dette panelet av kloner viser klart tilstedeværelsen av minst 2 T-celle-epitoper innenfor 135-159 regionen av MBP. Til sist gjenkjennes region 150-170 av 2 kloner som er spesifikke for aa 156-169. Spesifisiteten til alle TCC er oppsummert i figur 6.
EKSEMPEL 2 - identifisering av apitoper i MBP
Materialer og metoder
Antiqen- presenterinqsanalyse ved anvendelse av en APIPS
Presentering av peptidene for T-celle-kloner måles ved proliferasjon. APC fikseres i 0,5% paraformaldehyd og utplates med 1 x 10<5>celler pr. brønn i en 96-brønns vev-kulturplate. T-celle-kloner utplates med 2 x IO<4>celler pr. brønn i nærvær av varier-ende konsentrasjoner av peptid. Etter inkubering i 48 timer ved 37°C måles proliferasjon ved [<3>H] thymidin-innlemmelse over 16-20 timer. Resultatene sammenlignes med T-cellers evne til å respondere på epitopen presentert av levende APC.
Presenteringen av peptider for T-celler isolert fra DR2:MBP82-100 transgen mus var i alt vesentlig som beskrevet ovenfor unntatt at APC ble utplatet med 5 x IO<5>celler pr. brønn, T-celler ble utplatet med 1 x 10<5>celler pr. brønn, og inkubering fikk forløpe i 72 timer før tilsetning av [<3>H]-thymidin.
Resultater
I dette forsøket blir peptider som er blitt identifisert som epitoper i det foregående eksemplet undersøkt med hensyn på deres kapasitet til å presenteres ved anvendelse av en APIPS. Resultatene er vist i figur 7b. Av de fem epitopene undersøkt så langt ble fire funnet å være apitoper (30-44, 80-94, 110-124 og 130-144) og en ble funnet å virke som en epitop men ikke en apitop (156-170).
Eksempel 2A - undersøkelse av MBP-peptider 30-44,110-124,130-144 og 156-170
For å undersøke hvorvidt forskjellige MBP-peptider er apitoper, undersøkes deres kapasitet til å presenteres for T-celler ved hjelp av fikserte APC. Levende eller forhånds-pulserte Mgar (HLA-DR2+ve) celler forhånds-pulseres med peptidet i serum, eller serum alene i 3,5 timer. Overskuddspeptid fjernes deretter fra cellene og den passende T-celle-klon tilsettes. Den T-celle-proliferative respons måles ved<3>H-thymidin-opptak.
Som vist i figurer 8 og 9 kan peptider 30-44 (fig. 8A), 110-124 (fig. 8B) og 130-144 (fig. 9A) presenteres ved hjelp av fikserte APC uten ytterligere behandling. Disse peptidene defineres derfor som apitoper. Peptid 156-170 krever på den annen side ytterligere behandling for presentering for T-celler (fig. 9B). Fikserte APC er ute av stand til å presentere denne epitopen for T-celler, slik at 156-170 er ikke en apitop.
Eksempel 2B - identifisering av apitoper innenfor regionene 77-100 og 125-148 av
MBP
For en hvilken som helst gitt epitop kan der foreligge en eller flere apitoper, som er i stand til å presenteres for APC uten ytterligere behandling. Tilstedeværelsen av apitoper innenfor to regioner av MBP undersøkes ved å inkubere levende eller p-formaldehyd-fikserte Mgar (HLA-DR2+ve) celler med overlappende peptider i serum fra MBP-regioner 77-100 (figur 12) og 125-148 (figur 13) eller i serum alene. T-celler ble tilsatt og etter 72 timer (figur 12) eller etter 48 timer (figur 13) ble den T-celle-proliferative respons målt ved 3H-thymidin-opptak. For MBP 77-100 er T-cellene isolert fra en DR2:MBP 82-100 transgen mus, mens for MBP 130-144 anvendes T-celle-klonen MS17:A3.
For MBP-region 77-100 er de følgende peptider definert som apitoper:
Minimum MBP-sekvensen som gjenkjennes av T-celler fra DR2 MBP 82-100 transgen-mus er region 85-94.
For MBP-region 125-148 er de følgende peptider definert som apitoper:
Minimum MBP-sekvensen som gjenkjennes av T-celle-klon MS17:A3 er region 133-144.
Eksempel 2C - undersøkelse av region 89-101 av MBP
De foreliggende oppfinnere har tidligere vist at i motsetning til andre myelin T-celle-epitoper, så hindrer ikke administrering av peptid 89-101 i oppløselig form murin eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) indusert med enten helt myelin eller selve 89-101 peptidet (Anderton og Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251).
MBP 89- 101 omfatter tre T- celle- epitoper
For å undersøke T-celle-reaktivitet overfor 81-111 regionen av MBP, blir lymfekjertelceller fra mus primet med 81-111 stimulert med 81-111 in vitro og disse cellene testes med et panel av overlappende 10-mer peptider med to rest-forskyvninger som dekker 81-111 regionen (nemlig: 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 og 101-111). Responsmønsteret på peptider som dekker 89-101 utviser stimulerende kapasitet for 5 nabo-peptider (N-terminal 87-96 til og med 95-104) som gjenspeiler tilstedeværelse av minst to (og kanskje tre) distinkte epitoper.
For å undersøke denne regionen ytterligere, frembringes tre under-linjer fra den opp-rinnelige 81-111-responderende T-celle-linje, og disse testes på ny med et panel av overlappende 10-mer peptider med en rest-forskyvning som dekker 84-106 regionen. Resultatene åpenbarer forekomsten av tre distinkte men overlappende T-celle-epitoper innenfor 89-101 sekvensen: 89-94, 92-98 og 95-101 (se figur 14).
MBP- peptid 92- 98 er en kryptisk epitop
De tre epitop-spesifikke T-celle-linjer (TCL) utviser interessante forskjeller når de testes med hensyn på reaktivitet overfor 89-101 peptidet og hele det rekombinante MBP. Alle tre TCL responderer på peptidet (89-101) men kun 89-94- og 95-101-spesifikt TCT responderer på hele MBP. Dette indikerer at antigenbehandling av intakt MBP fortrinnsvis frembringer ligander for T-celler som gjenkjenner 89-94 og 95-101 men ikke dem som gjenkjenner 92-98. Dette antyder at 92-98 epitopen er kryptisk (dvs. ikke kan frembringes ved behandling av nativt antigen). Det synes som om MBP 89-101 peptidet tar del i tre distinkte interaksjoner med MHC-molekylet hvilket resulterer i peptid/MHC-ligander som gjenkjennes av tre separate T-celle-populasjoner. Prosessering av MBP frembringer imidlertid ligander for to av disse T-celle-populasjoner (se fig. 14).
Indusering av EAE krever T-celle-gjenkjennelse av autoantigene epitoper uttrykt i CNS som et resultat av nedbrytning av intakt MBP. Immunisering av mus med peptider omfattende kun en av de tre tidligere identifiserte T-celle-epitoper viser at kun dem inneholdende en naturlig behandlet epitop (89-94 eller 95-101) er i stand til å indusere EAE. Dette understøtter ytterligere det funn at 92-98 er en kryptisk epitop.
MBP- peptid 92- 98 er den dominante epitop for MBP- region 89- 101
Som nevnt ovenfor, inneholder regionen 89-101 tre distinkte men overlappende peptider. Av disse viser peptid 92-98 seg å være dominant for denne regionen. Når
for eksempel T-celle-kloner frembringes fra mus primet med 89-101 peptidet, responderer alle seks kloner som ble frembragt på 92-98. Ved anvendelse av 89-101 analog-peptider inneholdende individuelle alanin-substitusjoner ved hver posisjon, er det blitt funnet at substitusjon av hvilken eller hvilke som helst av posisjonene 92-98 fører til
en mangel på responderbarhet, hvilket viser at endring av hvilken eller hvilke som helst rester innenfor 92-98 kjernen har store effekter på gjenkjennelse av denne epitopen.
MBP- peptid 89- 101 klarer ikke å indusere toleranse overfor EAE- relevante T- celler som<g>jenkjenner en naturlig behandlet MBP- epitop
For å oppsummere funnene ovenfor, har de foreliggende oppfinnere funnet at a) 89-101 sekvensen har et potensial til å frembringe 3 distinkte T-celle-epitoper; b) kun to av disse epitopene (89-94 og 95-101) frembringes ved antigenbehandling av intakt MBP (begge in vitro og in vivo); c) kun peptider inneholdende de naturlig behandlede epitoper og ikke dem inneholdende en kryptisk epitop er effektive med hensyn til å indusere EAE; d) 89-101 peptidet klarer ikke å beskytte mot EAE i peptidterapiforsøk.
Denne informasjonen tilveiebringer et grunnlag for undersøkelse av hypotesen om at peptid 89-101 ikke klarer å indusere toleranse overfor EAE gjennom en svikt med hensyn til å direkte ligere de sykdomsrelevante T-celler. For å underbygge hypotesen bør peptidet (89-101) ikke klare å indusere toleranse overfor den større encefalittogene epitop (89-94) siden den ikke vil binde direkte til MHC restriksjonselementet (I-As) i den passende konformasjon. Med andre ord vil ikke 89-101 virke som en apitop for T-celler som responderer på 89-94.
For å teste denne muligheten utføres toleranseforsøk med 89-101 og 87-96 peptider (fig. 15 A & B). 87-96 peptidet inneholder epitopen (89-94) som er mest effektiv med hensyn til å indusere EAE.
Metoder
Mus mottok 200 ug peptid i PBS eller PBS alene intraperitonealt på dager -8, -6 og -4 forut for 100 ug peptid i Freunds komplette adjuvans på dag 0. Etter 10 dager ble drenerende lymfekjertelceller (6 x IO<5>pr. brønn) dyrket i X-Vivo 15 medium supplert med 5 x 10<5>M 2-merkaptoetanol og 2M L-glutamin med eller uten antigen i 72 timer. Kulturer ble pulsert i de siste 16 timene med 0,5 uCi<3>H-thymidin og innlemmelse ble målt ved anvendelse av en væskescintillasjonsteller. Resultater uttrykkes som gjen-nomsnittstellinger pr. minutt for triplikate kulturer.
Resultater
Priming med 87-96 induserte en sterk recall-respons på seg selv og en svakere respons på 89-101 (for henholdsvis fig. 15 A og B □ og o). Dette er overensstem-mende med behovet for antigenbehandling for å frembringe 89-94 fra 89-101. Anvendelsen av 87-96 som et tolerogen forut for priming med 87-96 undertrykket recall-responser på både 87-96 og 89-101 (fig. 15 A ■ og •). Dette passer med 89-94 reaktive T-celler, så snart de er gjort ikke-responderende in vivo, som ikke klarer å respondere in vitro på 89-94 enten de er frembragt fra 89-96 eller 89-101. Det er imidlertid avgjørende at anvendelsen av 89-101 som tolerogenet forut for priming med 87-96 ikke klarte å inhibere recall-responser på hverken 87-96 eller 89-101 (fig. 15 B A ■ og •). Disse dataene viser at administrering av peptid 89-101 i tolerogen form ikke klarer å indusere toleranse overfor den naturlig behandlede encefalittogene epitop basert på 89-94 sekvensen: 89-101 peptidet klarer ikke å oppføre seg som en apitop for 89-94 epitopen.
Uten ønske om å bindes av noen teori, mener de foreliggende oppfinnere at observasjonene kan forklares ved posisjonen av peptid 89-101 i MHC peptid-bindingssetet. Hvis peptidet fortrinnsvis binder slik at regionen 92-98 er i peptid-bindingslommen, da vil det gjenkjennes av MB92-98-spesifikke T-celler. Dette ville forklare hvorfor, når mus er primet med MBP89-101 peptidet, alle de frembragte T-celle-kloner gjenkjenner MBP92-98 epitopen. Likeledes, når 89-101 anvendes til å indusere toleranse overfor T-celler, vil det hovedsakelig indusere toleranse overfor celler som gjenkjenner MBP92-98 epitopen. Hvis MPB92-98 er en kryptisk epitop, frembringes den ikke ved naturlig behandling av hele antigenet og T-celler som gjenkjenner denne epitopen vil sannsynligvis ikke foreligge in vivo. Selv hvis en MBP92-98-spesifikk T-celle ikke forelå in vivo, ville den ikke være relevant for sykdommen. 89-101 klarer således ikke å hindre EAE indusert med helt MBP.
EKSEMPEL 3 - peptidterapi for en musemodell av MS
De foreliggende oppfinnere har tidligere vist at en enkelt dose av peptidantigen administrert systemisk enten ved den intraperitoneale (Liu og Wraith (1995) Int
Immunol 8:1255-1263) eller intranasale (Metzler og Wraith (1993) 5:1159-1165) rute vil effektivt beskytte mus mot eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i opp til tre måneder (Metzler og Wraith (1999) Immunology 97:257-263). Minst 5 doser peptid var nødvendig for å indusere toleranse i den Tg4-transgene mus (Burkhart et al
(1999) 11:1625-1634) som uttrykker en EAE-spesifikkT-celle-reseptor (Liu et al
(1995) Immunity 3:407-415). Nyere arbeider har vist at den intranasale (IN) rute er sikrere enn den intraperitoneale (IP) rute i Tg4 musen, selv om begge fremgangsmåter er like sikre i den ikke-transgene musen.
Peptid 83-99 av MBP testes i den Fug/D6 transgene mus som uttrykker både det passende HLA-DR2 klasse II MHC-molekyl og en TCR fra en human T-celle-klon som er spesifikk for dette peptidet. Musene behandles med peptid etter enten standarddosen anvendt for behandling av den Tg4 transgene mus (Tg4 protokoll) eller desensitivi-seringsprotokollen for peptiddose-eskalering som er blitt anvendt i behandling av pasienter som lider av allergi (desensitivitetsprotokoll).
Tg4 protokoll: Grupper av mus behandles ved intranasal administrering av peptid 83-99 (4 mg/ml i fosfatbufret saltoppløsning (PBS)) eller PBS alene i et totalt volum på 25 pl. Musene behandles hver 1. og 5. dag i uken i 5 uker hvilket gir totalt 10 doser. Ved begynnelsen av uke 6 injiseres hver mus med peptid 83-99 i Freunds komplette adjuvans (CFA) og mottar også en IP-injeksjon av Pertussis Toxin (200 ng) på dag 1 og 3. Progresjonen av EAE overvåkes i minst 30 døgn.
Desensitiviseringsprotokoll: Grupper av mus behandles ved intranasal administrering av en eskalerende dose av peptid 83-99 eller PBS alene i et totalt volum på 25 pl. Doseeskaleringen begynner ved 0,1 ug og fortsetter gjennom 1, 3, 6, 12, 50 og deretter tre ganger 100 ug. Musene behandles hver 1. og 5. dag i uken i 5 uker hvilket gir totalt 10 doser. Ved begynnelsen av uke 6 injiseres hver mus med peptid 83-99 i Freunds komplette adjuvant (CFA) og mottar også en IP-injeksjon av Pertussis Toxin (200 ng) på dag 1 og 3. Progresjonen av EAE overvåkes i minst 30 døgn.
EKSEMPEL 4 - nasal administrering av en apitop-cocktail til MS-pasienter
Det lages en vaksine som omfatter MBP-peptidene 30-44, 83-99, 110-124 og 130-144 (dvs. noen av de epitoper av MBP som er blitt identifisert som apitoper). Vaksinen gis til trettifem pasienter i et fase Ia/Ib-forsøk. Forsøket er en enkelt krysstudie hvori pasientene forblir ubehandlet i tre måneder etterfulgt av en enkelt dose av peptid (Ia). Pasientene overvåkes deretter i tre måneder etter den enkle dosen av vaksine for å vurdere sikkerhet. Behandlingen består deretter av to ukentlige administreringer ved intranasal avlevering. For hver pasient: klinisk aktivitet analyseres månedlig ved magnetisk resonansavbildning, immunologisk aktivitet overvåkes ved anvendelse av en kinetisk responsanalyse for proliferasjon, og cytokinproduksjon overvåkes ved anvendelse av en celle-basert ELISA.
Forsøket innbefatter initialt behandling av 5 pasienter som lider av kronisk progressiv (CP, chronic progressive) sykdom. Disse pasientene er valgt på grunnlag av lav MRI-aktivitet og behandles først med den høyeste dosen av peptidet. Behandlingen startes i CP-pasientgruppen fordi det er mest sannsynlig å fremvise mulige skadelige effekter som vises ved en økning i MRI-aktivitet. Behandling av remitterende pasienter som får tilbakefall begynner så snart det er klart at både enkeltdose- og multippeldose-behandling er sikker i CP-gruppen. En større gruppe av 30 remitterende pasienter som får tilbakefall rekrutteres på grunnlag av at de lider av økende MRI-lesjoner under en overvåkningsperiode på 3 måneder. Disse inndeles i tre grupper som skal behandles med en høy, middels eller lav dose av peptid.
Forkortelser: APC = antigen-presenterende celler, MHC = major histocompatability complex, TCR = T-celle-reseptor, EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, APITOP = antigenprosesseringsuavhengig epitop, APIPS = antigenprosesseringsuavhengig presenteringssystem, aa = aminosyre, MS = multippel sklerose, MBP = myelin-basisprotein, PLP = proteolipid-protein, TCL = T-celle-linje, TCC = T-celle-klon, PBMC = perifert blod-mononukleære celler, PPD = renset proteinderivat av Mycobacterium tuberculosis, PHA = fytohemagglutinin.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for å undersøke den tolerogene kapasitet til et peptid in vitro,karakterisert vedat den omfatter trinnet med å bestemme om peptidet kan binde et MHC klasse I eller II molekyl og presenteres for en T celle uten ytterligere antigenprosessering, hvori peptidets kapasitet til å binde MHC klasse I eller klasse II bestemmes ved: (i) å behandle et antigenprosesseringsuavhengig system (APIPS) med peptidet; og (ii) å analysere binding av peptidet til MHC klasse I eller II molekyler innen APIPS.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori binding av peptidet til MHC klasse I eller II molekyler analyseres ved tilsetning av T celler og måling av T celle aktivering.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, hvori APIPS omfatter: (i) fikserte antigen presenterende celler, (ii) lipidmembraner omfattende MHC klasse I eller II molekyler; eller (iii) plate-bundne MHC klasse I eller II molekyler.
4. Fremgangsmåte for selektering av et tolerogent peptid,
karakterisert vedat den omfatter trinnet med å undersøke den tolerogene kapasitet til et peptid ved en fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, og selektere et peptid i stand til binding til et MHC klasse I eller II molekyl og presentering for en T celle uten ytterligere antigenprosessering.
5. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, som omfatter trinnet med å undersøke om peptidet er i stand til binding til et MHC klasse II molekyl uten ytterligere antigenprosessering.
6. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori peptidet er selektert fra et flertall av peptider som hver omfatter en T celle epitop.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, hvori flertallet av peptider elueres fra MHC klasse II molekylene av en antigenpresenterende celle.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6 eller 7, hvori hvert peptid i flertallet av peptider er i stand til å indusere en sykdom assosiert med antigenet i et individ når administrert til individet sammen med adjuvans.
9. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 5, hvori peptidet selekteres fra et nestet sett av trunkerte peptider.
10. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av de foregående krav, hvori peptidet omfatter en T celle epitop og tilstedeværelse av en T celle epitop bestemmes ved: (i) å behandle: en prøve av celler fra et individ som har sykdommen, og en prøve av celler fra et individ som ikke har sykdommen med peptidet, og (ii) å sammenligne T celle responsene mellom celleprøvene.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0020618A GB0020618D0 (en) | 2000-08-21 | 2000-08-21 | Peptide selection method |
GB0114547A GB0114547D0 (en) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | Peptide selection method |
PCT/GB2001/003702 WO2002016410A2 (en) | 2000-08-21 | 2001-08-17 | Peptide selection method |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20030790D0 NO20030790D0 (no) | 2003-02-19 |
NO20030790L NO20030790L (no) | 2003-04-22 |
NO330535B1 true NO330535B1 (no) | 2011-05-09 |
Family
ID=26244875
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20030790A NO330535B1 (no) | 2000-08-21 | 2003-02-19 | Fremgangsmate for a undersoke den tolerogene kapasitet til et peptid og fremgangsmate for selektering av et tolerogent peptid. |
NO20101441A NO337988B1 (no) | 2000-08-21 | 2010-10-18 | Tolerogent peptid, farmasøytisk preparat som omfatter det samme, samt dets anvendelse. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20101441A NO337988B1 (no) | 2000-08-21 | 2010-10-18 | Tolerogent peptid, farmasøytisk preparat som omfatter det samme, samt dets anvendelse. |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20030191063A1 (no) |
EP (3) | EP1311542B1 (no) |
JP (1) | JP5431628B2 (no) |
KR (1) | KR20030062321A (no) |
CN (4) | CN102764425B (no) |
AT (2) | ATE483729T1 (no) |
AU (2) | AU2001278637B2 (no) |
BR (2) | BRPI0113400B1 (no) |
CA (1) | CA2420949C (no) |
CY (3) | CY1108558T1 (no) |
CZ (1) | CZ307202B6 (no) |
DE (2) | DE60143234D1 (no) |
DK (3) | DK1311542T3 (no) |
ES (3) | ES2310558T3 (no) |
HK (3) | HK1052359B (no) |
HU (3) | HU229377B1 (no) |
IL (1) | IL154089A0 (no) |
MX (1) | MXPA03001606A (no) |
NO (2) | NO330535B1 (no) |
NZ (1) | NZ523841A (no) |
PH (1) | PH12013500208B1 (no) |
PL (4) | PL215187B1 (no) |
PT (3) | PT1918298E (no) |
SI (3) | SI1731912T1 (no) |
WO (1) | WO2002016410A2 (no) |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU229377B1 (hu) * | 2000-08-21 | 2013-11-28 | Apitope Technology Bristol Ltd | Tolerogén humán peptidek |
GB0202399D0 (en) * | 2002-02-01 | 2002-03-20 | Univ Bristol | Peptide |
EP2420833B1 (en) * | 2006-05-05 | 2015-09-02 | Opexa Therapeutics | T-cell vaccine |
GB0710529D0 (en) | 2007-06-01 | 2007-07-11 | Circassia Ltd | Vaccine |
CN101820907B (zh) | 2007-08-15 | 2013-05-01 | 切尔卡西亚有限公司 | 针对过敏原去敏化的肽 |
DK2211892T3 (da) * | 2007-10-31 | 2011-10-31 | Apitope Technology Bristol Ltd | Sammensætninger omfattende myelinbasiske proteinpeptider og medicinske anvendelser deraf |
GB0723712D0 (en) * | 2007-12-04 | 2008-01-16 | Apitope Technology Bristol Ltd | Peptides |
ITMI20080508A1 (it) * | 2008-03-27 | 2009-09-28 | Istituto Nazionale Di Genetica Molecolare | Cellule ematopoietiche esprimenti la proteina krtcap3 e i leganti per la proteina krtcap3 |
ITMI20080865A1 (it) * | 2008-05-13 | 2009-11-14 | Istituto Naz Di Genetica Molecolare Ingm | Cellule ematopoietiche esprimenti la proteina susd3 e i leganti per la proteina susd3 |
US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
GB0908515D0 (en) | 2009-05-18 | 2009-06-24 | Apitope Technology Bristol Ltd | Peptide |
CN102781465A (zh) | 2009-10-12 | 2012-11-14 | 生命生物实验室有限公司 | 用于治疗多发性硬化的组合物 |
RU2448685C2 (ru) * | 2009-11-30 | 2012-04-27 | Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации | Липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза |
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
PT2556171E (pt) | 2010-04-05 | 2015-12-21 | Prognosys Biosciences Inc | Ensaios biológicos codificados espacialmente |
KR200457779Y1 (ko) * | 2010-06-23 | 2012-01-06 | 이준혁 | 샤프펜슬 |
US20120258871A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
PL397623A1 (pl) * | 2011-12-30 | 2013-07-08 | Napco S. Ar.L. | Preparat poprawiajacy pamiec oraz uczenie sie, sposób jego wytwarzania, srodek farmaceutyczny, dodatek zywieniowy oraz jego zastosowanie |
CN104903347B (zh) | 2012-11-12 | 2020-02-21 | 艾匹托普国际股份有限公司 | 肽 |
GB201300684D0 (en) | 2013-01-15 | 2013-02-27 | Apitope Int Nv | Peptide |
CN111233978A (zh) | 2013-03-15 | 2020-06-05 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 用于检测肽/mhc/tcr结合的方法 |
US9879313B2 (en) | 2013-06-25 | 2018-01-30 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
GB201314052D0 (en) | 2013-08-06 | 2013-09-18 | Apitope Int Nv | Peptides |
WO2015070037A2 (en) | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection |
KR101503341B1 (ko) | 2014-03-12 | 2015-03-18 | 국립암센터 | 자가암항원 특이적 cd8+ t 세포의 분리 및 증식방법 |
WO2016103213A1 (en) * | 2014-12-24 | 2016-06-30 | Apitope International Nv | Composition |
CN113186256A (zh) | 2015-04-10 | 2021-07-30 | 空间转录公司 | 生物样本的空间区别、多重核酸分析 |
JP2020503353A (ja) * | 2017-01-04 | 2020-01-30 | アピトープ インターナショナル エヌブイ | 寛容原性ペプチドを用いた治療方法 |
EP3565823A1 (en) | 2017-01-04 | 2019-11-13 | Apitope International NV | S-arrestin peptides and therapeutic uses thereof |
GB201700095D0 (en) * | 2017-01-04 | 2017-02-22 | Apitope Int Nv | Composition |
RU2725811C1 (ru) | 2017-01-06 | 2020-07-06 | Ютайлекс Ко., Лтд. | Антитела против 4-1bb человека и их применение |
GB201909774D0 (en) | 2019-07-08 | 2019-08-21 | Apitope Tech Bristol Limited | Method |
RU2761617C2 (ru) * | 2019-10-04 | 2021-12-13 | Жаудат Гафурович Умеров | Комплекс липидов миелина центральной и периферической нервной системы животных для лечения и профилактики нейродегенеративных демиелинизирующих нарушений и способы его применения |
GB201919222D0 (en) | 2019-12-23 | 2020-02-05 | Apitope Int Nv | Composition |
TR201922305A2 (tr) * | 2019-12-30 | 2021-07-26 | T C Erciyes Ueniversitesi | Multi̇pl skleroz (ms) hastaliğinda beta-kazomorfi̇n pepti̇tleri̇ni̇n kullanilmasi |
US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
US20230172894A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-06-08 | Imcyse Sa | Combination treatment for fumarate-related diseases |
WO2021236929A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1327162C (en) | 1987-04-09 | 1994-02-22 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University (The) | Method for prophylactically treating an individual for an autoimmune disease |
ATE258065T1 (de) | 1987-06-24 | 2004-02-15 | Brigham & Womens Hospital | Behandlung von autoimmun-erkrankungen durch orale verabreichung von autoantigenen |
US5260422A (en) * | 1988-06-23 | 1993-11-09 | Anergen, Inc. | MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
US5858980A (en) * | 1990-03-30 | 1999-01-12 | Autoimmune, Inc. | Peptide fragments of myelin basic protein |
IL165071A (en) * | 1990-03-30 | 2008-06-05 | Autoimmune Inc | A peptide with the ability to stimulate a subset of T cells from multiple sclerosis patients |
US5593698A (en) | 1990-10-31 | 1997-01-14 | Autoimmune, Inc. | Suppression of proliferative response and induction of tolerance with polymorphic class II MHC allopeptides |
US5817629A (en) * | 1991-10-22 | 1998-10-06 | The Governors Of The University Of Alberta | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
US5989565A (en) | 1993-01-29 | 1999-11-23 | University Of Pittsburgh | Elution and identification of T cell epitopes from viable cells |
CA2189990A1 (en) * | 1994-05-10 | 1995-11-16 | Di-Hwei Hsu | Compositions and treatment for multiple sclerosis |
AU7242994A (en) | 1994-05-20 | 1995-12-18 | United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army, The | Model for testing immunogenicity of peptides |
US6379670B1 (en) * | 1994-11-18 | 2002-04-30 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogs of human myelin basic protein |
US6251396B1 (en) * | 1994-11-18 | 2001-06-26 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogs of human myelin basic protein |
US6329499B1 (en) * | 1994-11-18 | 2001-12-11 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Methods for treatment of multiple sclerosis using peptide analogues of human myelin basic protein |
WO1996032957A1 (en) * | 1995-04-20 | 1996-10-24 | Brigham & Women's Hospital | Modulation of cytokine patterns of human autoreactive t-cell clones |
DE69723434T2 (de) * | 1996-04-26 | 2004-05-19 | Rijksuniversiteit Te Leiden | Verfahren zur selektion und produktion von t-zell-peptide epitope und vakzine mit diese epitope |
EP0849275A1 (en) * | 1996-09-26 | 1998-06-24 | Rijksuniversiteit te Leiden | Mannosylated peptides |
WO1999063945A2 (en) | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Vaccination strategy to prevent and treat cancers |
MY129566A (en) * | 1999-01-19 | 2007-04-30 | Nestle Sa | A hypoallergenic composition containing tolerogenic peptides inducing oral tolerance |
HU229377B1 (hu) | 2000-08-21 | 2013-11-28 | Apitope Technology Bristol Ltd | Tolerogén humán peptidek |
GB0202399D0 (en) | 2002-02-01 | 2002-03-20 | Univ Bristol | Peptide |
US8314290B2 (en) | 2004-12-21 | 2012-11-20 | Monsanto Technology Llc | Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs |
DK2211892T3 (da) * | 2007-10-31 | 2011-10-31 | Apitope Technology Bristol Ltd | Sammensætninger omfattende myelinbasiske proteinpeptider og medicinske anvendelser deraf |
GB0723712D0 (en) | 2007-12-04 | 2008-01-16 | Apitope Technology Bristol Ltd | Peptides |
-
2001
- 2001-08-17 HU HU1300357A patent/HU229377B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-08-17 MX MXPA03001606A patent/MXPA03001606A/es active IP Right Grant
- 2001-08-17 EP EP01956718A patent/EP1311542B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 NZ NZ523841A patent/NZ523841A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-08-17 PT PT08002817T patent/PT1918298E/pt unknown
- 2001-08-17 ES ES01956718T patent/ES2310558T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 WO PCT/GB2001/003702 patent/WO2002016410A2/en active Application Filing
- 2001-08-17 AT AT08002817T patent/ATE483729T1/de active
- 2001-08-17 PT PT01956718T patent/PT1311542E/pt unknown
- 2001-08-17 PL PL399137A patent/PL215187B1/pl unknown
- 2001-08-17 EP EP08002817A patent/EP1918298B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 PL PL395781A patent/PL213585B1/pl unknown
- 2001-08-17 HU HU0300814A patent/HU229489B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-08-17 SI SI200131032T patent/SI1731912T1/sl unknown
- 2001-08-17 SI SI200130983T patent/SI1918298T1/sl unknown
- 2001-08-17 CN CN201210156712.3A patent/CN102764425B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-17 AU AU2001278637A patent/AU2001278637B2/en not_active Ceased
- 2001-08-17 AT AT01956718T patent/ATE401343T1/de active
- 2001-08-17 ES ES06014901.0T patent/ES2439899T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 DE DE60143234T patent/DE60143234D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 IL IL15408901A patent/IL154089A0/xx unknown
- 2001-08-17 DK DK01956718T patent/DK1311542T3/da active
- 2001-08-17 HU HU1300358A patent/HU230233B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-08-17 DE DE60134862T patent/DE60134862D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 DK DK08002817.8T patent/DK1918298T3/da active
- 2001-08-17 PT PT60149010T patent/PT1731912E/pt unknown
- 2001-08-17 CN CNA018176828A patent/CN1469883A/zh active Pending
- 2001-08-17 DK DK06014901.0T patent/DK1731912T3/da active
- 2001-08-17 SI SI200130860T patent/SI1311542T1/sl unknown
- 2001-08-17 CA CA2420949A patent/CA2420949C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 BR BRPI0113400-0A patent/BRPI0113400B1/pt unknown
- 2001-08-17 CN CN201210156674.1A patent/CN102784385B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-17 AU AU7863701A patent/AU7863701A/xx active Pending
- 2001-08-17 PL PL364048A patent/PL217929B1/pl unknown
- 2001-08-17 US US10/362,264 patent/US20030191063A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-17 EP EP06014901.0A patent/EP1731912B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 ES ES08002817T patent/ES2353347T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-17 PL PL399138A patent/PL215145B1/pl unknown
- 2001-08-17 KR KR10-2003-7002514A patent/KR20030062321A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-08-17 JP JP2002521505A patent/JP5431628B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-17 BR BR0113400-0A patent/BR0113400A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-08-17 CZ CZ2003-512A patent/CZ307202B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-08-17 CN CN2009101296721A patent/CN101633689B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-02-19 NO NO20030790A patent/NO330535B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-06-26 HK HK03104592.1A patent/HK1052359B/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-31 US US11/979,224 patent/US8343500B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-10-13 CY CY20081101132T patent/CY1108558T1/el unknown
-
2010
- 2010-10-18 NO NO20101441A patent/NO337988B1/no not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-01-04 CY CY20111100017T patent/CY1111079T1/el unknown
-
2012
- 2012-12-06 US US13/706,540 patent/US8961986B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-01-31 PH PH12013500208A patent/PH12013500208B1/en unknown
- 2013-05-03 HK HK13105346.5A patent/HK1178437A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2013-05-16 HK HK13105845.1A patent/HK1178793A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2013-12-18 CY CY20131101143T patent/CY1114808T1/el unknown
-
2018
- 2018-03-20 US US15/926,637 patent/US20180311328A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO330535B1 (no) | Fremgangsmate for a undersoke den tolerogene kapasitet til et peptid og fremgangsmate for selektering av et tolerogent peptid. | |
AU2001278637A1 (en) | Peptide selection method | |
CA2473469C (en) | Tolerogenic peptides from myelin basic protein | |
AU2003202701A1 (en) | Tolerogenic peptides from myelin basic protein | |
AU2006203165B2 (en) | Peptide selection method | |
ZA200300881B (en) | Peptide selection method. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |