CZ307202B6 - Způsob in vitro pro identifikaci peptidů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Současný vynález se týká způsobu in vitro pro identifikaci peptidu, který je vhodný pro prevenci a/nebo pro léčení poruch z přecitlivělosti, zprostředkovaných T-buňkami, které rozpoznávají cílový antigen.

Dosavadní stav techniky

Při adaptivní imunitní odezvě jsou T lymfocyty schopné rozeznávat vnitřní epitopy proteinového antigenu. Buňky prezentující antigen (APC) pohlcují antigeny proteinů a rozkládají je na krátké peptidové fragmenty. Peptid se může vázat na molekulu hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) třídy I nebo II, který se vyskytuje uvnitř buněk a je vynášen na povrch buňky. Když se dostane na povrch buňky a je ve spojení s molekulou MHC, může být peptid rozeznáván T buňkou (prostřednictvím receptoru T buňky (TCR)), v tomto případě je peptid epitopem buňky T.

Epitopy buňky T mají důležitou úlohu při adaptivní imunitní odezvě na antigen, ať už na vlastní nebo cizorodý antigen. V experimentálních modelech se demonstrovala důležitá úloha, kterou vykazují epitopy buněk T při hypersenzitivních onemocněních (které zahrnují alergii, autoimunitní onemocnění a odmítnutí transplantátů). Jestliže se injekcí aplikují syntetické peptidy spolu s adjuvans, je možné vyvolat zánětlivé nebo alergické onemocnění (založené na struktuře epitopů buňky T).

Ukázalo se naopak, že je možné vyvolat imunologickou toleranci vůči epitopům určitých peptidů v rozpustné formě. Aplikace rozpustných peptidových antigenů se demonstrovala jako účinný způsob inhibice onemocnění při experimentální autoimunitní encefalomyelitidě (EAE, model pro onemocnění roztroušená skleróza (MS)) (Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5: 1159— 1165, Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263, Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261) a v experimentálních modelech artritidy, cukrovky a uveoretinitidy (popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261). Aplikace rozpustných peptidových antigenů se také demonstrovala jako způsob léčby následných onemocnění v případě EAE (popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261).

Pozornost budí použití tolerogenních peptidů při léčbě a prevenci onemocnění. Jedním důvodem je, že se prokázalo, že jisté tolerogenní epitopy mohou zeslabovat odezvy T buněk vůči odlišným antigenům ve stejné tkáni. Tento jev, který se nazývá náhodná suprese znamená, že by mělo být možné vyvolat toleranci vůči více jak jednomu epitopu (s výhodou proti všem epitopům) v daném antigenu. V případě, že u daného onemocnění je podstatný více než jeden antigen, použije se jeden určitý tolerogenní peptid (popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261). Není pak nutné při určitém onemocnění identifikovat všechny patogenní antigeny.

Peptidy jsou také, vzhledem k minimálním nákladům a ke skutečnosti, že se mohou připravovat analogy peptidu se změněnými imunologickými vlastnostmi, vhodné pro léčbu. Peptidy se mohou upravit tak, že se změní jejich interakce buď MHC nebo TCR.

Jeden možný problém v tomto přístupu je, že se ukázalo, že ne všechny peptidy, které působí jako epitopy buněk T jsou schopny vyvolat toleranci. Základní peptid proteinu myelin 89-101 (MBP) je po imunizaci imunodominantní antigen a je také velmi účinným imunogenem při vyvolání reaktivity buněk T a EAE. Ukázalo se, že tento peptid není účinný při vyvolání

- 1 CZ 307202 B6 tolerance, když se aplikuje v roztoku (popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261).

Vyslovila se řada vysvětlení pro pozorovanou posloupnost při schopnosti epitopů T buněk vyvolat toleranci (popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261). Předpokládá se, že existuje vzájemná souvislost mezi afinitou peptidu vůči MHC a vyvolání tolerovatelnosti (popisuje se v Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263), ale tyto skutečnosti neodpovídají některým pozorováním. Například MBP, který není tolerogenní, se váže na I-A^s s relativně vysokou afinitou. Není proto zcela samozřejmé předpovědět, které peptidy budou vyvolávat toleranci.

Jestliže se najde racionální vysvětlení, proč pouze část epitopů peptidu je schopna vyvolat toleranci, pak bude možné vybrat tolerogenní peptidy, které je možné použít při léčbě a prevenci poruch založených na přecitlivělosti.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob in vitro pro identifikaci peptidu, který je vhodný pro prevenci a/nebo pro léčení poruch z přecitlivělosti, zprostředkovaných T buňkami, které rozpoznávají cílový antigen, který zahrnuje následující kroky:

(i) na prezentační systém, nezávislý na úpravě antigenů se působí řadou peptidů, z nichž každý obsahuje epitop cílového antigenů T buňky, (ii) analyzuje se vazba těchto peptidů na molekuly MHC třídy I nebo II v systému přidáním T buněk a měřením aktivace T buněk;

(iii) identifikuje se peptid, který je schopný se vázat na molekuly MHC třídy I nebo II v prezentačním systému, nezávislém na úpravě antigenů a je prezentován T buňce jako peptid, schopný indukovat toleranci na cílový antigen in vivo při podání jedinci, a vhodný pro prevenci a/nebo léčení poruchy z přecitlivělosti; a (iv) identifikuje se peptid, který je schopný se vázat na molekuly MHC třídy I nebo II v prezentačním systému, nezávislém na úpravě antigenů a je prezentován T buňkám jako schopný indukovat toleranci.

V jednom z výhodných provedení prezentační systém, nezávislý na úpravě antigenů zahrnuje (i) buňky, prezentující fixovaný antigen, (ii) lipidové membrány, obsahující molekuly MHC třídy I nebo II nebo (iii) molekuly MHC třídy I nebo II, vázané na destičky.

Podle dalšího možného provedení tento postup zahrnuje stupeň, v němž se prokazuje, zda je uvedený peptid schopný se vázat na molekuly MHC třídy I nebo II v prezentačním systému, nezávislém na úpravě antigenů a je prezentován T buňce.

Přítomnost epitopů buňky T je možno stanovit tak, že se (i) uvedeným peptidem působí na vzorek buněk, který pochází z jedince, trpícího onemocněním a na vzorek buněk, který pochází z jedince, který tímto onemocněním netrpí; a (ii) srovnává se odezva T buněk u těchto vzorků buněk.

-2CZ 307202 B6

Vynález dále popisuje peptid vybraný způsobem, který tvoří první předmětnou věc vynálezu.

Peptid je možné použít při léčbě a/nebo prevenci onemocnění. Zvláště je možné peptid použít při léčbě a/nebo prevenci onemocnění, které zprostředkovávají autoreaktivní T buňky. Hypersenzitivní reakce (například alergie, poruchy autoimunity a odmítnutí transplantace) se odstraňují léčbou/prevencí za použití peptidu podle vynálezu.

V případě základního proteinu myelinu se zjistila řada apitopů, které působí jako autoantigen v případě roztroušené sklerózy. Ve zvláště výhodných provedeních vynálezu je možné proto při léčbě a/nebo prevenci onemocnění roztroušená skleróza použít peptidy podle vynálezu.

Je známo, že některé peptidy jsou schopny vyvolat toleranci vůči jiným epitopům ze stejného antigenu a dokonce vůči jiným epitopům z odlišného antigenu (pomocí jevu, který se nazývá náhodná suprese). Předpokládá se však, že za účelem adekvátně potlačit všechny autoreaktivní T buňky, bude výhodné pacientům při léčbě a/nebo prevenci určitého onemocnění aplikovat kombinace různých apitopů. Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek zahrnující velké množství peptidu podle vynálezu, přičemž každý peptid je založen na epitopů T buňky.

Vynález dále popisuje způsob léčby a/nebo prevence onemocnění, který zahrnuje aplikaci peptidu podle vynálezu subjektu.

Obecná strategie léčby a/nebo prevence onemocnění subjektu může zahrnovat (i) identifikaciantigenu v případě určitého onemocnění (ii) identifikaci apitopů v případě určitého antigenu a (iii) aplikaci apitopů subjektu.

Vynález popisuje způsob selekce tolerogenního peptidu.

Tolerance

Termín tolerogenní peptid znamená schopnost vyvolat toleranci. Tolerance je neschopnost vyvolat odezvu na antigen. Tolerance vůči vlastnímu antigenu je v podstatě rys imunitního systému, kdy v případě, že se ztratí, může dojít k vytvoření autoimunitního onemocnění. Adaptivní imunitní systém musí udržovat kapacitu odpovídat na řadu různých infekčních činidel, zatímco se brání autoimunitnímu ataku vlastních antigenů obsažených ve své vlastní tkáni. To je řízeno ve velkém rozsahu citlivostí nezralých T lymfocytů vůči odumírání krvetvorných buněk v brzlíku (centrální tolerance). Ne všechny vlastní antigeny jsou však detekovány v brzlíku a tak odumírání samoreaktivních thymocytů zůstává neúplné. Existují také mechanizmy, kterými tolerance může být získávána zralými samo reaktivními T lymfocyty v periferních tkáních (periferní tolerance). Mechanizmy centrální a periferní tolerance se popisuje v publikaci Anderton et al., (1999) (immunological Reviews 169: 123-137).

Tolerance může vznikat z vyvolání anergie v alespoň části T buněk CD4+. Za účelem aktivovat T buňku, se musí peptid spojit s profesionálním APC schopným zavést dva signály do T buněk. První signál (signál 1) se zavádí pomocí komplexu MHC-peptid na buněčném povrchu APC a je přijímán T buňkou prostřednictvím TCR. Druhý signál (signál 2) se zavádí kostimulačními molekulami na povrchu APC, jako je CD80 a CD86 a je přijímán pomocí CD28 na povrchu T buňky. Uvažuje se, že v případě, že buňka T obdržela signál 1 v nepřítomnosti signálu 2, není aktivována a ve skutečnosti se stává anergickou. Anergické buňky T jsou odolné vůči následným antigenním změnám a mohou být schopny potlačit další imunitní odezvy. Anergické buňky T jsou zahrnuty do tolerance zprostředkované buňkou T.

-3CZ 307202 B6

Předpokládá se, že peptidy vyžadují úpravu dříve, než se spojí s molekulami MHC, nevyvolávají toleranci, protože jsou přepravovány zralými buňkami prezentujícími antigen. Zralé buňky prezentující antigen (takové jako jsou makrofágy, buňky B a dendritické buňky) jsou schopny upravit antigen, ale také zavést oba signály (signál 1 a 2) do buňky T, což vede k aktivaci buňky T. Apitopy na druhou stranu budou schopny se vázat na molekuly MHC třídy II na nezralém APC. Tak budou prezentovány na buňkách T bez společné stimulace, což vede k anergii buněk T a k toleranci.

Apitopy jsou samozřejmě také schopné se vázat na molekuly MHC na buněčném povrchu zralých APC. Imunitní systém však obsahuje větší množství nezralých APC ve srovnání se zralými APC (naznačuje se, že se aktivovalo 10 % dendritických buněk, popisuje se v publikaci Summers et al., (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). Výchozí poloha vůči apitopu proto bude anergie/tolerance spíše než aktivace.

Ukázalo se, že když se vyvolá tolerance inhalací peptidu, snižuje se kapacita proliferace buněk T CD4 + specifických pro antigen. Také se snižuje produkce IL—2, IFN—y a IL—4, ale zesiluje se produkce IL—10. Ukázalo se, že neutralizace IL—10 u myší ve stadiu tolerance vyvolané peptidem zcela obnovila náchylnost vůči onemocnění. Předpokládá se, že populace regulačních buněk přetrvává v tolerantním stadiu, které produkuje IL—10 a zprostředkovává imunitní regulaci (popisuje se v publikaci Burkhart et al., (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634).

Vyvolání tolerance se proto může monitorovat různými metodami, které zahrnují (a) snížení náchylnosti k onemocnění, pro které je peptid cílový epitopem in vivo, (b) vyvolání anergie v T buňkách CD4+ (které se mohou detekovat následnou vakcinací antigenem in vitro), (c) změny v populaci T buněk CD4+ zahrnující (i) omezení množení, (ii) zeslabení produkce IL—2, IFN-y a IL 4 a (iii) zesílení produkce IL— 10.

Epitopy nezávislé na úpravě antigenu (APITOPY)

Způsob podle vynálezu zahrnuje selekci peptidu, který je schopný vázat se na molekuly MHC třídy I a II aniž se dále upravuje. Takové peptidy jsou známé jako apitopy (epitopy nezávislé na úpravě antigenu).

Prezentace peptidu odvozených z daného antigenu na buněčném povrchu není náhodná a existuje tendence přednostně prezentovat malý počet často se vyskytujících epitopů. Dominance určitého peptidu bude záviset na řadě faktorů, jako je relativní afinita pro navázání na molekulu MHC, prostorově dočasný bod vytvoření v APC a rezistence k degradaci. Hierarchie epitopů pro antigen se může měnit spolu s postupující imunitní odezvou, která je důležitá při autotoleranci a autoimunitě. Imunodominantní determinantní oblasti jsou pravděpodobně dobrými tolerogeny. Z toho důvodu ve výhodném provedení vynálezu apitop podle vynálezu je založen na dominantním epitopů.

Po primární imunitní odezvě na imunodominantní peptidy se může objevit rozšíření epitopů na subdominantní determinanty (popisuje se v publikaci Lehman et al., (1992) Nátuře 358: 155—

-4CZ 307202 B6

157). Přítomnost subdominantních epitopů může být důležitá při spuštění autoimunity. Apitop podle vynálezu může proto být založen na subdominantním epitopů.

V případě libovolného daného antigenu mohou také existovat skryté epitopy. Skryté epitopy jsou ty, které mohou stimulovat odezvu T buněk, když se aplikují jako peptid, ale které netvoří uvedenou odezvu, když se aplikují jako celý antigen. Může to být způsobeno tím, že během zpracování antigenu na peptidy v APC se poškodí skrytý epitop. Ukázalo se, že peptid 92-98 je skrytý epitop v případě MBP (příklad 2C). Zajímavé je, že existuje putativní místo štěpení v případě asparaginylové endopeptidázy v této peptidové oblasti, které může způsobit, že během přirozeného zpracování APC netvoří žádné peptidy obsahující tuto oblast.

Skrytý epitop může působit jako apitop in vitro a jako takový je schopný se vázat na molekuly MHC, aniž se dále upravuje a vyvolává anergii v T buňce, která rozeznává skrytý epitop. Není pravděpodobné, že takový apitop bude použitelný pro terapeutické účely, protože není schopen tolerovat T buňky, které rozeznávají přirozeně zpracovaný epitop antigenu.

Epitopy vhodné pro antigen prezentované pomocí APC se mohou identifikovat měřením odezvy T buňky vůči přesahujícím peptidům, které pokrývají celý antigen (popisuje se dále v textu). Výsledkem takových studií je sada peptidů a minimální epitop vhodný pro určitou linii/klonů T buněk se může zjistit měřením odezvy vůči zkráceným peptidům.

Nemůžeme se domnívat, že minimální epitop antigenu se bude chovat jako apitop. Je pravděpodobné, že aminokyseliny lemující minimální epitop budou nutné pro optimální navázání na molekulu MHC. Apitop je třeba navrhnout tak, aby pokrýval možnost, že mohou existovat rozdíly mezi minimálními epitopy různých klonů T buňky.

Mělo by se zdůraznit, že nemusí být možné identifikovat apitop všech epitopů. Existuje jasný důkaz, že některé epitopy se váží na molekuly MHC způsobem, který je závislý na vnesení molekul MHC do endosomů a proto vyžadují další zpracování (popisuje se v publikaci Viner et al., (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. 92: 2214-2218). Existuje další důvod, proč není možné předpokládat, že každý minimální epitop se bude nevyhnutelně chovat jako apitop.

Identifikace peptidu obsahujících epitopy T buňky

Existuje řada způsobů pro identifikaci epitopů T buňky v daném antigenu.

Přirozeně upravené epitopy se mohou identifikovat analýzou hmotnostní spektroskopií peptidů eluovaných z APC nesoucích antigen. Jsou to APC, které jsou stimulovány k pohlcení antigenu nebo jsou donuceni k vnitrobuněčné produkci proteinu transformací s vhodným genem.

V typickém případě se APC inkubují s proteinem buď v roztoku, nebo jsou vhodně cíleny na buněčný povrch APC. Po inkubaci při teplotě 37 °C se buňky lyžují v detergentu a protein třídy II se čistí například afinitní chromatografií. Ošetření čištěných MHC vhodným chemickým médiem (například v kyselých podmínkách) vede k eluci peptidů z MHC. Tento soubor peptidů se separuje a profil se porovnává s peptidem z kontrolních APC ošetřených stejným způsobem. Pík charakterizující protein exprimujících buněk se analyzuje (například hmotnostní spektrometrií) a identifikovaly se peptidové fragmenty. Tento postup obvykle vytváří informaci o rozmezí peptidů (které se obvykle nacházejí v sadách) vytvořených z určitého antigenu úpravou antigenu.

Jiný způsob identifikace epitopů je testování syntetické knihovny peptidů, které překrývají a vyplňují celou délku antigenu v testu in vitro. Mohou se například použít peptidy, které obsahují 15 aminokyselin a které překrývají 5 nebo 10 aminokyselin. Peptidy se testují v systému prezentující antigen, který obsahuje buňky prezentující antigen a T buňky. Systém prezentující antigen může být například myší splenocyty, lidské buňky pocházející z mandlí nebo PBMC.

V jiném případě systém prezentující antigen může obsahovat určité linie/klony T buněk a/nebo typ buněk prezentující určitý antigen.

-5CZ 307202 B6

Aktivace T buňky se může měřit pomocí množení T buněk (například použitím začlenění ³Hthymidinu) nebo produkcí cytokinu. Aktivace buněk T CD4+ typu TH1 se detekovala například prostřednictvím produkce IFNy, který se může detekovat standardním způsobem, jako je test ELISPOT.

Studie překrývajících se peptidů obvykle vykazují oblast antigenu, ve kterém se nachází epitop. Minimální epitop pro určitou T buňku se pak může odhadnout měřením odezvy vůči zkráceným peptidům. Jestliže se například získá odezva vůči peptidu obsahujícím zbytky 1 až 15 v přesahující knihovně, sady, které jsou zkráceny na obou koncích (to je 1-14, 1-13, 1-12 atd. a 2-15, 3-15, 4-15 atd.) se mohou použít k identifikaci minimálního epitopu.

Identifikace imunodominantních oblastí antigenu, kde se používají testy in vitro (zvláště ty používající linie buněk T), předpovídá patem peptidové reaktivity. Studium identifikace epitopů MBP, který se popisuje v příkladech, se používají testy kinetické odezvy, ve kterých se stanovuje množení PBMC získaných z pacientů trpících roztroušenou sklerózou a ze zdravých jedinců vzhledem překrývající se peptidové knihovně. Tento test je založen na zjištění, že ačkoliv T buňky získané z normálních jedinců a z pacientů trpících roztroušenou sklerózou odpovídají podobným způsobem na čištěný proteinový antigen, odpovídají rozdílným způsobem na peptidy založené na sekvenci MBP. T buňky pocházející z pacientů trpících roztroušenou sklerózou odpovídají silněji a s rychlejší kinetikou na peptidové antigeny, kdy se porovnávají s normálními zdravými dárci. To umožňuje testování a identifikaci epitopů, na který určitý pacient odpovídá v určitém čase. Ve zde popsané studii tento přístup odhalil počet oblastí obsahující epitop, které se neidentifikovaly použitím standardních metod. Ukázalo se, že rozeznávání T buněk vykazuje cyklický patem objevující se v jednom časovém bodě, pak následuje regrese a následné znovu objevení v pozdějším časovém bodě.

Popsaný kinetický test poskytuje hodnotitelný nástroj, protože vykazuje epitop, na který pacienti odpovídají v určitém čase. Tato informace se používá při terapeutické aplikaci na míru šitého apitopu pomocí identifikace a aplikace apitopu vhodného pro relevantní epitop (jestliže nějaký existuje). Tato informace také umožňuje předpovědění obecného pátému postupu onemocnění tak, že se může navrhnout terapeutický prostředek, aby zahrnoval apitopy vůči epitopům, které se s určitou pravděpodobností vyskytují v určitém stadiu onemocnění.

Systémy prezentace nezávislé na zpracování antigenu (APIPS)

Po té, co se identifikoval epitop, je dalším krokem zjištění, zda se chová jako apitop.

Apitop se musí prezentovat vůči T buňkám, aniž je nutné upravovat antigen. Když jsou k dispozici identifikované peptidy obsahující epitopy buňky T, apitopy se mohou identifikovat použitím systému, který nepotřebuje úpravu. U zkrácených peptidů a analogů peptidů se může testovat aktivace použitím prezentačního systému nezávislého na úpravě antigenu (APIPS).

Příklady takového systému APIPS zahrnují:

a) fixované APC (s protilátkou vůči CD28 nebo bez ní),

b) lipidové membrány obsahující molekuly MHC třídy I nebo II (s protilátkou proti CD28 nebo bez ní) a

c) čištěný přirozený nebo rekombinantní MHC ve formě vázané na destičce (s protilátkou proti CD28 nebo bez ní).

V oboru je známé použití fixovaných APC při zkoumání odezvy T buněk, například při studii zkoumání minimálního epitopu v polypeptidu měřením odezvy zkrácených peptidů (popisuje se

-6CZ 307202 B6 v publikaci Fairchild et al., (1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043). APC se mohou fixovat za použití například formaldehydu (obvykle paraformaldehydu) nebo glutaraldehydu.

Lipidové membrány (které mohou být plošné membrány nebo lipozómy) se mohou připravit použitím umělých lipidů nebo to může být plazmatická membrána/mikrozomální frakce pocházející z APC.

Při použití se může AP1PS aplikovat do prohlubní destiček určených pro kultivaci tkáňových kultur. Pak se přidají peptidové antigeny a navázání peptidu na část molekuly MHC systému APIPS se detekuje přidáním vybraných linií nebo klonů buněk T. Aktivace linie nebo klonu buněk T se měří libovolným způsobem známým v oboru, například prostřednictvím začlenění ³H-thymidinu nebo vylučováním cytokinu.

Peptidy

Vynález dále popisuje peptidy. Termín peptid normálně znamená sérii zbytků, v typickém případě L-aminokyseliny vzájemně spojené peptidovými vazbami mezi a-aminoskupinou a karboxylovou skupinou sousedících aminokyselin. Termín zahrnuje upravené peptidy a syntetické peptidové analogy.

Peptid podle vynálezu může být libovolně dlouhý, pokud je schopný se vázat na molekulu MHC třídy I a II bez další úpravy.

Peptidy, které se váží na molekuly MHC třídy I a II, obsahují v typickém případě 7 až 13, obvykle 8 až 10 aminokyselin. Vazba peptidu se stabilizuje na jeho obou koncích pomocí kontaktů mezi atomy v hlavním řetězci peptidu a místem s žádným stupněm volnosti obsaženým ve žlábku v molekulách MHC třídy I. Místa s žádným stupněm volnosti na obou koncích žlábku, které se vážou na N-konec a C-konec peptidu. Proměnnou je délka peptidu a je doprovázena tvorbou smyček na kostře peptidu často v místech prolinových a glycinových zbytků, které umožňují požadovanou flexibilitu.

Peptidy, které se váží na molekuly MHC třídy II obsahují v typickém případě 8 a 20 aminokyselin, obvykleji mezi 10 a 17 aminokyselinami a mohou také být delší. Tyto peptidy leží v rozšířeném uspořádání podél žlábku obsaženého v molekule MHC II, na který se váže peptid, který (což není pravděpodobné v případě žlábku MHC třídy I) je otevřený na obou koncích. Peptid se udržuje na místě hlavně kontakty atomů v hlavním řetězci s konzervativními zbytky, které tvoří žlábek pro navázání peptidu.

Peptid podle vynálezu se může připravit použitím chemických metod (popisuje se v publikaci Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Peptidy se mohou syntetizovat metodou na pevné fázi (popisuje se v publikaci Roberge JY et al., (1995) Science 269: 202-204) odštěpených z pryskyřice a čištěných preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií (popisuje se například v publikaci Creighton (1983) Proteins structures and molecular principles, WH Freeman and Co, New York NY). Automatizovaná syntéza například probíhá za použití přístroje syntetizéru peptidu ABI 431 A (od firmy Perkin Elmer) podle instrukcí výrobce.

Peptid se v jiném případě může připravit rekombinantním způsobem nebo štěpením z delších peptidů. Peptid se může například získat štěpením z cílového antigenu. Složení peptidu se může potvrdit analýzou aminokyselin nebo sekvenováním (například postupem degradace podle Edmana).

Ve výhodném provedení vynálezu se peptid získal z cílového antigenu. Cílový antigen je molekula (například protein nebo glykoprotein), který se upravil pomocí APC a je rozeznáván buňkami T během průběhu onemocnění. Cílový antigen bude samozřejmě záviset na

-7 CZ 307202 B6 onemocnění. Peptid se s výhodou získal z fragmentu antigenu, který vznikl přirozeným zpracováním antigenu pomocí APC.

Pro praktické účely existují různé jiné charakteristiky, které by měl peptid vykazovat. Peptid by měl být rozpustný v koncentraci, která umožňuje jeho použití in vivo. Je výhodné, když je peptid rozpustný v koncentraci až do 0,5 mg/ml, výhodnější je, když je peptid rozpustný až do koncentrace 1 mg/ml, nej výhodnější je, když je peptid rozpustný v koncentraci až do 5 mg/ml.

V případě intranazální aplikace je možné aplikovat za použití popsaného postupu maximální objem přibližně 200 μΐ do jedné dírky. Jestliže je peptid rozpustný v koncentraci 1 mg/ml, je možné aplikovat pacientovi dvojnásobnou dávku do každé dírky. To znamená 800 pg. Je neobvyklé, aby se v jediné dávce aplikovalo více jak 5 mg.

Dále je důležité, aby peptid byl dostatečně stabilní in vivo, když se používá při terapii. Zjistilo se, že 30 minut po aplikaci kleslo in vivo celkové množství testovaného peptidu na přibližně 50 %. 4 hodiny po aplikaci množství peptidu kleslo o přibližně 30 %, ale po 5 dnech po aplikaci je peptid stále detekovatelný (přibližně 5 %). Poločas rozpadu peptidu in vivo by měl být alespoň 10 minut, s výhodou alespoň 30 minut, výhodnější je alespoň 4 hodiny, nejvýhodněji alespoň 24 hodin.

Zjistilo se, že po intranazální aplikaci, je maximální množství peptidu v lymfatických žlázách po přibližně 4 hodinách po aplikaci. Po 5 dnech je však peptid stále detekovatelný (v množství, které odpovídá přibližně 5 % maximálního množství). Je výhodné, aby byl peptid dostatečně stabilní, aby se mohl vyskytovat v terapeuticky aktivní koncentraci v lymfatické žláze po dobu dostatečně dlouhou, aby se dosáhlo terapeutického účinku.

Peptid s výhodou také vykazuje dobrou biologickou dostupnost in vivo. Peptid by si měl udržovat uspořádání in vivo, které umožňuje vázat se na molekulu MHC na buněčném povrchu, aniž tvoří překážku.

Cílové onemocnění

V jednom provedení vynálezu se peptid používá při léčbě a/nebo prevenci onemocnění.

Je pravděpodobné, že apitop molekuly MHC třídy II je použitelný při onemocnění, která jsou zprostředkována odezvami buněk T CD4+. Onemocnění může být například způsobeno nebo udržováno nevhodnou nebo nadměrnou odezvou buněk T CD4+.

Je pravděpodobné, že takový peptid je možné použít při léčbě přecitlivělosti. Hypersenzitivní reakce zahrnují:

(i) alergie, které jsou výsledkem nevhodné odezvy na neškodné cizorodé látky, (ii) autoimunitní onemocnění, které je výsledkem odezvy na antigeny vlastní tkáně a (iii) odmítnuti štěpů, což je výsledkem odezvy vůči transplantátu.

Příklady alergií zahrnují, ale nejsou omezeny na sennou rýmu, zevní astma, štípnutí hmyzu a reakce na žihadlo, alergie na léky nebo potraviny, alergická rinitida, bronchiální astma, chronická bronchitida, anafylaktický šok, kopřivka, angioedém, atopický ekzém, alergická kontaktní dermatitida, nodózní erytém, multiformní erytém, Stevens-Johnsonův syndrom, zánět spojivek, nekróza podkožních žilek, zánět plic a bulózní onemocnění kůže.

Příklady autoimunitního onemocnění zahrnují, ale nejsou omezeny na revmatickou artritidu (RA), myastenie gravis (MG), roztroušenou sklerózu (MS), systémovou lupénku (SLE),

-8CZ 307202 B6 autoimunitní tyreoiditidu (Hashimotova tyreoiditida), Gravesova nemoc, zánět tlustého střeva, autoimunitní uveoretinitidu, polymyozitidu a jisté typy cukrovky, systémovou vaskulitidu, polymyozitidu-dermatomyozitidu, systémovou sklerózu (skleroderma), Sjogrenův syndrom, ankylozující spondylitidu a příbuznou spondyloartropatii, revmatickou horečku, hypersenzitivní pneumonii, alergickou bronchopulmonámí aspergilózu, pneumokoniózu způsobenou anorganickým prachem, autoimunní hemolytickou anémii, imunologické poruchy krevních destiček, kryopatii, jako je kryofibrinogenemie a autoimunitní polyendokrinopatie.

V klinické medicíně se běžně transplantují různé tkáně. Zahrnují například ledviny, játra, srdce, plíce, kůži, rohovku a kostní dřeň. Při všech transplantacích mimo transplantace rohovky a některé kostní dřeně je nutné dlouhotrvající imunosuprese.

V jednom provedení vynálezu se popisuje použití peptidu při léčbě a/nebo prevenci cukrovky.

V tomto provedení se může peptid odvodit z cílového antigenu IA2.

V dalším provedení vynálezu se popisuje použití při léčbě a/nebo prevenci roztroušené sklerózy (MS). Roztroušená skleróza (MS) je chronické zánětlivé onemocnění charakterizované velkým množstvím demyelinizujícími lézemi roztroušenými v celé bílé hmotě CNS (popisuje se v publikaci McFarlin and McFarland, 1982 New Wngland J. Medicíně 307: 1183-1188 and 1246-1251). Roztroušená skleróza je zprostředkovaná autoreaktivními buňkami T.

V tomto provedení vynálezu se může peptid odvodit z jednoho z autoantigenů v určitém základním proteinu myelinu (MBP) nebo proteolipidového proteinu (PLP). MBP je pravděpodobně vhodnější ve srovnání s PLP, protože PLP je vysoce hydrofóbní a odvozené peptidy mají tendenci tvořit shluky. MBP je imunogenní a lymfocyty T specifické pro MBP vykazují u zvířat encefalitogenní aktivitu (popisuje se v publikaci Segal et al., 1994 J. Neuroimmunol. 51: 7-19, Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol. 42: 187-192, Zamvil et al., 1985 Nátuře 317: 355-8).

Ve výhodném provedení vynálezu se peptid odvodil z jedné imunodominantních oblastí MBP. Jmenovitě z oblastí 1-24, 30-54, 75-99, 90-114, 105-129, 120-144, 135-159 a 150-170.

Specificky výhodné provedení peptidu podle vynálezu se vybralo z peptidu MBP, které působí jako apitopy podle vynálezu a které zahrnují peptidy 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 a 133-147.

Apitopy vhodné pro MHC třídu I se mohou například použít k úpravě antivirové odezvy CD8+ tolerogenním způsobem.

Farmaceutický prostředek

Vynález předpovídá, že navzdory náhodné supresi, může být nezbytné cílit řadu různých klonů T buňky za účelem vyvolat účinnou toleranci. Proto je možné jedincům aplikovat velké množství peptidu za účelem prevence nebo léčby onemocnění.

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující velké množství apitopu.

Farmaceutický prostředek může například obsahovat 2 až 50 apitopu, s výhodou 2 až 15 apitopu. Apitopy se mohou získat ze stejných nebo různých cílených antigenů. Všechny apitopy jsou schopny se vázat buď na MHC třídy I nebo se vážou na MHC třídy II, aniž je nutné je upravovat. Ve výhodném provedení se všechny apitopy ve farmaceutickém prostředku váží buď na MHC třídy I nebo II, aniž je nutné je dále upravovat.

-9CZ 307202 B6

Farmaceutický prostředek se může vyskytovat ve formě sady, ve které některý nebo každý z apitopu se bude vyskytovat odděleně za účelem simultánní, separované nebo po sobě následující aplikace.

V jiném případě (nebo navíc), kdy farmaceutický prostředek (nebo jeho část) se aplikuje ve více dávkách, se může každá dávka balit odděleně.

Farmaceutický prostředek může obsahovat terapeuticky nebo profylakticky účinné množství jednoho apitopu nebo každého apitopu a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo plnidlo.

Ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se může apitop nebo každý apitop smíchat s libovolným vhodným vazebným činidlem, lubrikačním prostředkem, suspendačním činidlem, potahovacím činidlem nebo rozpouštěcím činidlem.

Aplikace

Peptid by se měl aplikovat v rozpustné formě, aniž je přítomné adjuvans.

Peptid se s výhodou aplikuje mukozální cestou.

Studie ukázaly, že peptid, když se aplikuje v rozpustné formě intraperitoneálně (i.p.), intravenózně (i.v.) nebo intranasálně (i.n.) nebo orálně, může vyvolat toleranci T buňky (popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261, Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263, Metzlerand Wraith (1999) Immunology 97: 257-263).

Peptid se s výhodou aplikuje intranazálně.

Studie na myších ukázaly, že trvání aplikace peptidů vyžadovaná pro vyvolání tolerance závisí na prekurzorové frekvenci T buněk v recipientu (popisuje se v publikaci Burkhart et al., (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634). Skutečná dávka a řada dávek peptidu bude proto záviset na jedinci, avšak ve výhodném provedení vynálezu se aplikuje více dávek.

Jestliže se aplikuje velké množství peptidu najednou, mohou se vyskytovat ve formě koktejlu, který je vhodný pro jedinou aplikaci nebo opakovanou aplikaci. V jiném případě je výhodné aplikovat více dávek, ale relativní koncentrace peptidů v jednotlivých dávkách jsou různé.

Ve výhodném provedení vynálezu je vhodné aplikovat zvyšující se dávku, kde se pacientovi aplikuje velké množství dávek obsahující zvyšující se koncentraci aktivní látky. Takový přístup se používá například při imunoterapeutických aplikacích fosfolipázových peptidů A2 při alergii na včelí píchnutí (popisuje se v publikaci Muller et al., (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101: 747-754 a Akdis et al., (1998) J. Clin. Invest. 102: 98-106).

Objasnění výkresů

Obrázek č. 1 zobrazuje typický příklad kinetického profilu čištěného derivátu proteinu bakterie Mycobacterium tuberculosis (PPD) a MBP v případě pacientů trpících roztroušenou sklerózou a zdravých jedinců. U jednojaderných buněk periferní krve (PBMC) izolovaných z pacientů trpících onemocněním roztroušená skleróza (A) a z normálních jedinců (B) se testovala jejich schopnost množit se v přítomnosti PPD a celých MBP. Kinetický profil proliferativní odezvy vůči MBP se porovnává s kinetickým profilem sekundárního antigenu PPD.

Obrázek č. 2 je tabulka, která zobrazuje odezvy PBMC vůči MBP a jejich peptidy u pacientů trpících onemocněním roztroušená skleróza. Určití jedinci se testovali ve třech nezávislých časových bodech s periodou přibližně 4 až 7 měsíců.

- 10CZ 307202 B6

Na obrázku č. 3 je tabulka, která shrnuje odezvy PBMC vůči MBP a MBP-peptidům u zdravých jedinců. Perioda mezi každým časovým bodem testování je 4 až 7 měsíců.

Obrázek č. 4 zobrazuje příklad pacienta trpícího onemocněním roztroušenou sklerózou (MS 49), který odpovídá na řadu peptidů ve dvou různých časových bodech, ale jehož rozeznávací profil během druhého časového bodu, který se měří o čtyři měsíce později, se podstatně liší. PBMC se kultivovaly v přítomnosti MBP a řady peptidů, které pokrývají celou délku MBP. Množení se určilo stanovením pohlceného 3H-thymidinu. Vysoká proliferativní odezva T buněk pozorovaná v prvním časovém bodě se podstatně liší od odezvy měřené o 7 měsíců později (druhý časový bod).

Obrázek č. 5 zobrazuje příklad pacienta, jehož silná odezva na epitop (první časový bod) se zeslabila (druhý časový bod) a znovu se objevila po dvanácti měsících (třetí časový bod).

Obrázek č. 6 zobrazuje mapu jemné specifity oblasti peptidů identifikovaných v testu kinetické odezvy, kterou je možné získat použitím TCC vzniklého u pacientů trpících onemocněním roztroušená skleróza a u zdravých jedinců. Většinu peptidů používaných při testování tvoří 15mery, avšak několik z nich jsou 10-mery a jeden peptid je 17-mer. Specifita každého TCC se testuje nejméně na dvakrát.

Na obrázku č. 7a je tabulka zobrazující charakteristiku epitopů T buněk v základním proteinu myelinu, který je rozeznáván T lymfocyty získanými z pacientů trpících roztroušenou sklerózou.

Na obrázku č. 7b je uvedena tabulka, která zobrazuje, že všechny epitopy buňky T nejsou nezbytně prezentovány fixovanými APC a proto nejsou apitopy.

Na obrázku č. 8 a 9 je zobrazena prezentace různých peptidů MBP vůči klonům T buněk pomocí živých a fixovaných APC. (Obrázek 8A: 30-44, obrázek 8B: 110-124, obrázek č. 9A: 130-144, obrázek č. 9B: 156-170).

Na obrázku č. 10 je tabulka, která zobrazuje maximum hodnot stimulačního indexu (SI) vůči MBP a MBP peptidům u pacientů trpících onemocněním roztroušená skleróza získaných ve třech nezávislých časových bodech. Vzorky ve druhém časovém bodě se sebraly 4 až 8 měsíců po prvním časovém bodě a vzorky ve třetím časovém bodě se získaly 3 až 5 měsíců po druhém časovém bodě. Hodnota cpm pozadí se měřila každý den a kolísala mezi 80 až 700 cpm. Pozitivní odezva (znázorněno tučně) se definovala podle SI>3 a ócpm> 1 000 (u pacientů MS 19 a MS 67 nebylo možné získat vzorky ve všech třech časových bodech).

Na obrázku č. lije tabulka, která zobrazuje maximum hodnot stimulačního indexu (SI) v případě MBP a MBP-peptidů u zdravých jedinců. Každý den se měřila hodnota pozadí uvedená v jednotkách cpm a kolísala mezi 80 až 700 cpm. Pozitivní odezva (znázorněna tučně) se definovala podle SI>3 a ócpm>l 000.

Na obrázku č. 12 je zobrazena odezva T buněk izolovaných z transgenních myší DR2:MBP82100 za účelem prezentace peptidů MBP v oblasti 77-100 pomocí APC.

Na obrázku č. 13 je zobrazena odezva klonu T buňky MS17:A3 za účelem prezentace peptidů MBP v oblasti 125-148 pomocí APC.

Obrázek č. 14 zobrazuje rozeznávání epitopů T buněk v sekvenci MBP 89-101. Existují tři odlišné, ale překrývající se epitopy T buněk v sekvenci 89-94, 92-98 a 95-101. Je zobrazen potenciál pro štěpení mezi zbytky 94 a 95 působením asparginylové endoepetidázy (AEP).

- 11 CZ 307202 B6

Na obrázku č. 15 je zobrazena kapacita peptidu 87-96 (A) a 89-101 (Β) MBP působit jako apitop pro T buňky odpovídající epitopů 89-94.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1: Identifikace epitopů T buňky v MBP

Materiály a metody

Antigeny

Lidský MBP se připravil z mozkové bílé hmoty, jak se popisuje v publikaci Deibler et al., 1972 Prepara Biochemistry 2: 139) a jeho čistota se ověřila pomocí SDS-PAGE. MBP a čištěný protein mikroorganizmu Mycobacterium tuberculosis (PPD) (UK Centrál Veterinary Laboratory, Surrey) se používá při proliferativních testech v dříve stanovených optimálních koncentracích. Optimální koncentrace v případě každého antigenu je 50 pg/ml. Sada překrývajících se peptidů tvořených 15-merem, které pokrývají celou molekulu MBP se syntetizovala za použití standardní chemie F-moc za použití syntetizéru více peptidů Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Německo). Každý peptid vykazuje 15 aminokyselin a přesah 10 aminokyselin. Připravilo se 33 peptidů, které se rozdělily do skupin po třech a skupiny se testovaly v optimální koncentraci 50 pg/ml tak, že každý peptid je in vitro v koncentraci 16,6 pg/ml.

Pacienti a kontrolní jedinci

Tato studie zahrnuje 12 pacientů s klinicky nebo laboratorně definovanou roztroušenou sklerózou (popisuje se v publikaci Poser et al., 1983). Jejich věkové rozmezí je 29 až 51 let. Osm z 12 pacientů je zahrnuto ve studii interferon β. Ostatním pacientům trpícím roztroušenou sklerózou se neaplikovaly kortikoidy alespoň po dobu 3 měsíců před začátkem studie. Kontrolní skupina zahrnovala 13 zdravých jedinců ve věku 25 až 55 let a žádnému z nich se neaplikovaly imunosupresiva po dobu alespoň 3 měsíců, než se odebraly vzorky krve.

Tkáňové kultivační médium

Jako tkáňové kultivační médium se používá RPMI-1640 doplněné 20 mM HEPES (Sigma, Poole Velká Británie), penicilinem v koncentraci 100 jednotek najeden mililitr, sulfátem streptomycinu v koncentraci 100 mg/ml a 4 mM L-glutaminem (všechny uvedené chemikálie pochází z Life Technologies, Paisley, Skotsko). Kultivační médium, které neobsahuje sérum se používá pro promytí lymfoidních buněk a TCL. V případě všech podmínek kultivace a testů se kultivační médium doplní 10 % autologní plazmou deaktivovanou teplem.

Kultivační podmínky a testy proliferace T buněk

Po získání písemného svolení se každému subjektu odebrala punkcí žíly periferní krev upravená citrátem (objem 50 až 100 ml). Jednojademé buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z krve hustotní centrifugací použitím zařízení Histopaque-1077 (od firmy Sigma, Poole, Velká Británie) a kultivovaly se na destičkách s 24 prohlubněmi o objemu 1,5 ml (Nunc Intemational, Costar, Corning lne. New York, USA) v koncentraci lxlO⁶ buněk najeden mililitr, které obsahují buď PPD, MBP nebo peptidy MBP. Destičky se inkubovaly při teplotě 37 °C ve vlhké atmosféře 5 % CO₂ a 95% vzduchu. Mezi dny 5 a 14 se z každé kultury odebraly dva vzorky o objemu 100 μΐ, přenesly se na mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi s kulatým dnem a ozářily se 0,4 pCi [³H]— thymidin (Amersham Intemational, Amersham, Velká Británie). Po 18 hodinách se buňky přenesly na destičku vyrobenou ze skleněných vláken (LKB-Wallec, Turku, Finsko) za použití zařízení Mach 111 harvest 96 (od firmy Tomtec, Orange, New Jersey, USA). Začlenění [³H]_

- 12CZ 307202 B6 thymidinu se stanovilo použitím kapalného scintilačního počítače Microbeta (LKB-Wallac). Testovací prohlubně obsahující antigen se považují za pozitivní v případě, že 5cpm>l 000 a stimulační index (SI) je větší než 3, přičemž SI se vypočte tak, že hodnota CPM kultury obsahující antigen se dělí hodnotou CPM kultury bez antigenu.

Vytvoření linie buněk T a klonů buněk T

Z osmi pacientů trpících roztroušenou sklerózou a 2 zdravých kontrolních donorů se vytvořila linie buněk T specifická pro MBP (TCL). Z každého subjektu se separovaly PBMC, jak se popisuje shora v textu a nanesly se na destičky obsahující 6 prohlubní v koncentraci lxlO⁶ buněk v jednom mililitru v přítomnosti MBP (koncentrace 50 pg/ml). Část PBMC z každého subjektu se zamrazila a uchovávala se pro následnou opětnou stimulaci. O sedm dní později se buňky krmily čerstvým kultivačním médiem obsahujícím 2% IL-2 (Lymphocult-HT, Biotest LTD, Birmingham, Velká Británie) a dvanáctý den se kultura všech buněk opětně stimulovala antigenem, IL-2 a ozářenými (2 500 Rad) autologními PBMC, které tvoří zdroj buněk prezentující antigen (APC) v poměru 1 buňka T ku 5 buňkám APC. Buňky se pomnožily každé 3 až 4 dny v IL-2 a čtrnáctý den se opětně stimulovaly antigenem, IL-2 a PBMC, jak se popisuje shora v textu. V den první opětné stimulace buněk se testovalo specifické množení v případě MBP. 2xl0⁴ buněk T a lxlO⁵ ozářených autologních buněk PBMC se kultivovalo ve třech provedeních na plotnách s 96 prohlubněmi s kulatým dnem v přítomnosti MBP. Buňky se kultivovaly po dobu 2 dní a během posledních 18 hodin kultivace se ozářily (³H)-thymidinem v intenzitě 0,4 pCi na jednu prohlubeň. Buňky se pak sklidily, jak se popisuje shora v textu a uvažuje se, že TCL je specifické pro MBP s hodnotou 8cpm>l 000 a SI>3.

Po 3 cyklech opětné stimulace/pomnožení se TCL klonují za použití PHA (Sigma, Poole, Dorset, Velká Británie) v přítomnosti autologních ozářených PBMC jako APC. Buňky T se nanesly na plotny za podmínek omezených ředěním při koncentraci 0,1 buňky v jedné prohlubni, 0,3 buňky v jedné prohlubni a 1 buňka v jedné prohlubni a kultivovaly se na Terasakiho plotnách (Nunc Intemational, Costar) s ozářenými PBMC v koncentraci lxlO⁴ buněk v jedné prohlubni, PHA v koncentraci 5 pg/ml a 2% IL-2. Po deseti až dvanácti dnech se obsah prohlubní, ve kterých rostou buňky, se přenesou na destičky s 96 prohlubněmi a přidají se ozářené PBMC v koncentraci lxl0⁵ buněk do jedné prohlubně, PHA v koncentraci 5 pg/ml a IL-2. O tři dny později se do prohlubní přidalo čerstvé kultivační médium obsahující IL-2 a v den 7 se klony přenesly na destičky s 48 prohlubněmi a přidaly se ozářené PBMC v koncentraci 5x10⁵ buněk do jedné prohlubně, PHA a IL-2. V tento okamžik se u klonů testovala v proliferačním testu specifická odezva na MBP. Klony specifické pro MBP se pomnožily o týden později na destičkách s 24 prohlubněmi za použití ozářených PBMC v koncentraci lxlO⁶ buněk v jedné prohlubni s PHA nebo Dynabead (Dynal, Velká Británie) a IL-2. Klony se uchovávají na destičkách s 24 prohlubněmi za použití 7 až 10 denního cyklu opětné stimulace/pomnožení, jak se popisuje shora v textu. Schopnost klonů buněk T (TCC) rozeznávat sadu peptidů MBP se testuje v proliferačním testu, jak se popisuje shora v textu.

Výsledky

Rozeznávání MBP-peptidů u pacientů trpících roztroušenou sklerózou a u zdravých jedinců

Používá se test kinetické odpovědi, ve kterém se testuje schopnost PBMC z pacientů trpících roztroušenou sklerózou a zdravých subjektů odpovídat na sadu přesahujících syntetických peptidů, které jsou 15-mery a pokiývají celou délku lidského MBP. Proliferativní odezva PBMC z každé kultury se testovala v 5-ti časových bodech po dobu dvou týdnů a kinetický profil každé odezvy na MBP a peptidy se porovnává s odezvou na PPD, který později reprezentuje antigen pro sekundární odezvu/paměť. Nezjistil se podstatný rozdíl při odezvě PBMC na MBP a/nebo peptidy u pacientů léčených interferonem-beta a pacientů, kteří nebyly léčeni (data nejsou uvedena). Odezva na MBP u obou pacientů trpících roztroušenou sklerózou a zdravých kontrol

- 13 CZ 307202 B6 dosahuje maxima později než odezva na PPD. Obrázek č. 1 zobrazuje typický příklad kinetického profdu odezvy na PPD a MBP u pacientů trpících roztroušeno sklerózou a u zdravých jedinců.

Jak je zobrazeno na obrázku č. 2, nejběžněji rozeznávané dva proteiny u pacientů trpících roztroušenou sklerózou jsou 90-114 a 75-99 (šest z dvanácti pacientů), pak následují oblasti 3054, 135-159 a 150-170 (5 z 12 pacientů) a 1-24 a 105-129 (4 z 12 pacientů). Tři pacienti odpovídají na aminokyseliny 15-39 a 120-144. Dva pacienti rozeznávají oblast 45-69 a žádný pacient nereaguje na oblast 60-84.

Naopak zdraví jedinci rozeznávají podstatně méně peptidu. Pouze 2 kontrolní jedinci odpovídají na více než 2 peptidy (C a J, zobrazeno na obrázku č. 3). Aminokyseliny 60-84 rozeznávají pouze kontrolní jedinci C a J. Je zajímavé, že oba tito jedinci exprimují alelu DRBl*0701. Oblasti 45-69 a 105-129 nejsou rozeznávány žádným jiným zdravým donorem, zatímco oblast 75-99 a 150-170 rozeznávají 4 zdraví jedinci. Oblast 135-159 je rozeznávána třemi zdravými jedinci. Oblast 1-24, 30-54, 60-84 a 120-144 je rozeznávána dvěma zdravými jedinci a 15-39 a 90-114 je rozeznávána jedním jedincem. Osm ze 13 zdravých jedinců nereaguje na libovolný z překrývajících se peptidů, zatímco 1 z 12 pacientů trpících roztroušenou sklerózou (MS 19) nerozeznává peptidy MBP. Je nutné poznamenat, že tento pacient je jedinečný v tom, že neodpovídá na protein MBP.

Na obrázku 11 je také zobrazena odezva zdravých jedinců na peptidy MBP. V této studii pouze jediný kontrolní subjekt odpovídá na více než dva peptidy (Nil). Pacient Nil je také jediný, který odpovídá na aminokyseliny 60-84. Oblasti 15-39, 45-69 a 105-129 nerozeznává žádný ze zdravých donorů, zatímco 120-144 a 135-159 je rozeznáván zdravými jedinci a oblasti 1-24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-114 a 15-170 rozeznává jediné jedinec. Devět z 12 zdravých jedinců neodpovídá na libovolný z překrývajících se peptidu.

Den, kdy se objeví maximální odezva na MBP a/nebo peptidy se podstatně neliší u zdravých jedinců a pacientů a kinetiky v obou skupinách odpovídají primární antigenní odezvě. Navíc síla odezvy na MBP a peptidy se u pacientů a zdravých jedinců neliší.

Časové změny rozeznávání MBP-peptidů

Na základě skutečnosti, že pacienti trpící roztroušenou sklerózou odpovídají na široké spektrum peptidu MBP, se testovala skutečnost, zda rozeznávání PBMC u stejných jedinců je stabilní v průběhu období přibližně 4 až 12 měsíců. Jak je zobrazeno na obrázku č. 2, 10 a 3, ani pacienti trpící roztroušenou sklerózou ani zdraví jedinci nerozeznávají stejné peptidy.

Obrázek č. 4 reprezentuje příklad pacienta trpícího roztroušenou sklerózou (MS 49), který odpovídá na více peptidů ve dvou různých časových bodech, ale profil rozeznávaných peptidů během druhého časového bodu měřený o 4 měsíce později se podstatně liší. To znamená, že v druhém kinetickém testu odezva PBMC na aminokyseliny 15-39, 30-54 a 150-170 přetrvává, avšak odezva na 75-99 a 105-129 ustupuje a přesouvá se na oblasti 90-114 a 135-159.

Obrázek č. 5 (MS 60) ilustruje příklad pacienta, jehož odezva na velké množství epitopů se zužuje během 4 měsíců na fokusovanou odezvu. Zdraví jedinci, kteří se testovali podruhé, neodpovídají na žádný z peptidů (obrázek ě. 3).

Uvedené výsledky demonstruji, že pacienti trpící roztroušenou sklerózou nevykazují sadu patemů odpovědi na peptidy. U každého pacienta může PBMC odezva na několik peptidů přetrvávat, snižovat se a posouvat se do nových oblastí MBP, jak je možné prokázat u pacienta MS 49.

- 14CZ 307202 B6

Cyklizace rozeznávání peptidu

Když se analyzuje PBMC odezva na peptidy ve třech nebo více časových bodech po období 12 měsíců, je zřejmé, že u jistých pacientů rozeznávání epitopů je nestálé spíše než se nevratně posouvá na nové oblasti peptidů. Jak je například zobrazeno na obrázku č. 2 a 10, pacient MS 60 vykazuje cyklický patem rozeznávání aminokyselin 120-144 a 135-159. To znamená, že zbytky 120-144 a 135-159 jsou mezi mnoha rozeznávány v prvním časovém bodě testování, v druhém časovém bodě testování odezva na tyto dvě oblasti klesá a pak se opět objevuje ve třetím testovaném časovém bodě měřeném o 4 měsíce později. Kinetický profil pacienta MS 41 podobně ukazuje, že rozeznávání aminokyselin 135-159 se mění během několika časových bodů (což je zobrazeno na obrázku č. 2 a 10).

Ve skupině obsahující zdravé jedince (zobrazeno na obrázku č. 3) jeden jedinec (M) vykazuje kolísající odezvu na oblasti 75-99 a 135-159 a druhý jedinec (F) rozeznává aminokyseliny 7599 ve dvou ze tří časových bodů, zatímco třetí subjekt (D) vykazuje cyklickou odezvu na zbytek 15-39.

Jemné mapování odezvy na MBP

TCC se vytvořilo z 8 pacientů trpících onemocněním roztroušená skleróza a ze 2 zdravých jedinců a použily se k ověření specifity peptidových oblastí identifikovaných v testu kinetické odezvy. Specifita každého TCC se testovala na základě jeho proliferativní odezvy na sadu peptidů tvořených 15-mery. Klon SD:A7 rozeznává oblast 1-24 a v této oblasti tento TCC odpovídá na aminokyseliny 5-19. Oblast 30-54 je rozeznávána 4 klony (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) a epitop v této oblasti je 30—44. Jeden klon (MS39:D7) z pacienta trpícího roztroušenou sklerózou rozeznává peptid 60-74 a je zajímavé, že jeden zdravý jedinec odpovídá na tuto oblast (60-84) v testu kinetické odpovědi. Pět klonů (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) rozeznává aminokyseliny 83-99, které jsou obsaženy v oblasti 75-99. Jeden pacient produkoval TCC specifický pro aminokyseliny 110-124 (MS60:A2, MS60:B3). Tato oblast je obsažena v oblasti 105-129 a jiný TCC pocházející ze stejného pacienta je specifický pro oblast 130-144 (MS6O:E1), která se nachází v oblasti 120-144. Pět jedinců produkovalo klony, které rozeznávají epitopy v oblasti 135-159. Jsou to MS60:F7, MS6O:D1, MS59:F1. N5:19 rozeznává aminokyseliny 140-154. Tato sada klonů jasně demonstruje přítomnost alespoň 2 epitopů T buněk v oblasti 135-159 MBP. Nakonec oblast 150-170 je rozeznávána 2 klony specifickými pro aminokyseliny 156-169. Specifita všech TCC je zobrazena na obrázku č. 6.

Příklad 2: Identifikace apitopu v MBP Materiál a metody

Test přítomnosti antigenu za použití APIPS

Přítomnost peptidů v klonech buněk T se měří proliferací. APC se fixují na 0,5 % paraformaldehydu a nanesly se na destičky s 96 prohlubněmi v koncentraci lxl 0⁵ buněk do jedné prohlubně. Klony T buněk se nanášejí na destičky v koncentraci 2x10⁴ buněk do jedné prohlubně v přítomnosti různých koncentrací peptidu. Po inkubaci po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C se měří proliferace začleněním [³H]-thymidinu po dobu 16 až 20 hodin. Výsledky se porovnávají se schopností buněk T odpovídat na epitop prezentovaný živými buňkami APC.

Prezentace peptidů buňkám T izolovaných z transgenních myší DR2:MBP82-100 se provedlo v podstatě stejně, jak se popisuje shora v textu. Buňky APC se nanesly v koncentraci 5x10⁵ buněk do jedné prohlubně. Buňky T se nanesly na destičky v koncentraci lxlO⁵ buněk do jedné prohlubně a inkubovaly se po dobu 72 hodin. Pak se přidal [³H]-thymidin.

- 15CZ 307202 B6

Výsledky

V tomto experimentu se u peptidů, které se identifikovaly jako epitopy v dříve uvedených příkladech, testovala jejich kapacita být prezentovány za použití systému APIPS. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 7b. Zjistilo se, že z pěti testovaných epitopů jsou čtyři apitopy (30-44, 8094, 110-124 a 130-144) ajeden působí jako epitop, ale není apitop (156-170).

Příklad 2A: Zkoumání MBP peptidů 30—44, 110-124, 130-144 a 156-170

Za účelem zkoumání, zda různé MBP peptidy jsou apitopy, se zjišťovala jejich kapacita prezentovat se vůči T buňkám pomocí fixovaných APC. Živé a předem upravené buňky Mgar (HLA-DR2+ve) se upravovaly peptidem v séru nebo samotným sérem po dobu 3,5 hodin. Nadbytečný peptid se pak z buněk odstraní a přidá se vhodný klon T buňky. Proliferativní odezva T buňky se pak měří pohlcením ³H-thymidinu.

Jak je zobrazeno na obrázku č. 8 a 9, peptidy 30^14 (obrázek č. 8A), 110-124 (obrázek č. 8B) a 130-144 (obrázek č. 9A) se mohou prezentovat fixovanými APC, aniž je nutné další zpracování. Tyto peptidy se proto definují jako apitopy. Peptid 156-170 na druhé straně vyžaduje za účelem prezentace buňkám T další zpracování (obrázek č. 9B). Fixované APC nejsou schopny prezentovat tento epitop buňkám T, pak peptid 156-170 není apitop.

Příklad 2B: Identifikace apitopu v oblastech 77-100 a 125-148 MBP

Pro libovolný daný epitop musí existovat jeden nebo více apitopu schopných být prezentovány APC aniž jsou dále upravovány. Přítomnost apitopu ve dvou oblastech MBP se zkoumala inkubací živých buněk Mgar nebo buňky Mgar fixované p-formaldehydem (HLA-DR2+ve) se inkubovaly s překrývajícími se peptidy v séru z oblastí MBP 77-100 (obrázek č. 12) a 125-148 (obrázek č. 13) nebo v samotném séru. Přidaly se buňky T a po 72 hodinách (obrázek č. 12) nebo po 48 hodinách (obrázek č. 13) se měřila proliferativní odezva buňky T pohlcením ³H-thymidinu.

V případě MBP 77-100 se buňka T izolovala z transgenní myši DR2:MBP 82-100, zatímco v případě MBP 130-144 se použil klon T buňky MS17.-A3.

V případě MBP oblasti 77-100 jsou následující peptidy definované jako apitopy:

MBP 83-99 ENPVVHFFKNIVIPRTP

MBP 80-94 TQDENPWHFFKNIV

MBP 81-95 QDENPVVHFFKNIVT

MBP 82-96 DENPWHFFKNIVTP

MBP 83-97 ENPVVHFFKNIVTPR

MBP 84-98 MPWHFFKNTVTPRT

Minimální sekvence MBP rozeznávaná buňkami T pocházejícími z transgenní myši DR MBP 82-100 je oblast 85-94.

V případě oblasti MBP 125-148 jsou následující peptidy definovány jako apitopy:

-16CZ 307202 B6

MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV

MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD

MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA

MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ

Minimální sekvence MBP rozeznávána klonem T buňky MS17:A3 je oblast 133-144.

Příklad 2C: Zkoumání oblasti 89-101 MBP

Dříve se ukázalo, že na rozdíl od jiných epitopů proteinu myelin buňky T, aplikace peptidů 89101 v rozpustné formě nezabrání vzniku myší experimentální autoimunitní encefalomyelitidě (EAE) vyvolané buď celým myelinem nebo samotným peptidem 89-101 (Popisuje se v publikaci Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251).

MBP 89-101 obsahuje tri epitopy T buňky

Za účelem zkoumání reaktivity buňky T vůči oblasti 81-111 MBP se buňky pocházející z lymfatických uzlin myši stimulovaly peptidem 81-111 in vitro a tyto buňky se testovaly sadou překrývajících se peptidů 10-merů se dvěma posuny zbytků pokrývající oblast 81-111 (jmenovitě 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 a 101-111). Odezvy na peptidy pokrývající oblast 89-101 vykazuji stimulační kapacitu v případě dalších pěti přilehlých peptidů (A terminální oblast 87-96 až do 95-104), což odráží přítomnost alespoň dvou (a možná tři) odlišných epitopů.

Aby se mohla tato oblast dále zkoumat, vytvořily se tři sub-linie, které pocházejí z linie buněk T odpovídající na oblast 81-111 a tyto buňky se znovu testovaly sadou překrývajících se peptidů 10-merů s jedním posunem zbytků, který pokrývá oblast 84-106. Výsledky ukázaly existenci tří odlišných, ale překrývajících se epitopů buňky T v sekvenci 89-101: 89-94, 92-98 a 95-101 (obrázek č. 14).

MBP peptid 92-98 je skrytý epitop

Tři linie buněk T specifické pro epitop (TCL) vykazují zajímavé rozdíly, když se testuje reaktivita vůči peptidů 89-101 a vůči celému rekombinantnímu MBP. Všechny tři TCL odpovídají na peptid (89-101), ale pouze TCL specifická pro 89-94 a 95-101 odpovídá na celý MBP. To ukazuje, že úprava antigenu neporušeného MBP s výhodou vytváří ligandy pro buňky T rozeznávající oblast 89-94 a 95-101, ale nikoliv pro ty, které rozeznávají oblast 92-98. To naznačuje, že epitop 92-98 je skrytý (to znamená, že se nemůže vytvořit upravením přirozeného antigenu). Zdá se, že peptid MBP 89-101 se může podílet částečně na třech různých interakcích s molekulou MHC, což vede ke vzniku komplexu peptid/MHC ligand, který rozeznávají tři různé populace T buněk. Úprava MBP však může vytvořit Ugandy pouze pro dvě populace buněk T (obrázek č. 14).

Vyvolání EAE vyžaduje, aby buňky T rozeznávaly autoantigenní epitopy exprimované v CNS, jako výsledek degradace neporušeného MBP. Imunizace myší peptidy, které obsahují pouze jeden ze tří dříve identifikovaných epitopů buňky T ukazuje, že pouze tyto peptidy obsahující přirozeně upravený epitop (89-94 nebo 95-101) a jsou schopny vyvolat EAE. Tato skutečnost dále podporuje zjištění, že oblast 92-98 je skrytý epitop.

- 17CZ 307202 B6

MBP peptid 92-98 je dominantní epitop pro oblast MBP 89-101

Jak se uvádí shora v textu, oblast 89-101 obsahuje tři rozdílné, ale překrývající se peptidy. Peptid 92-98 se jeví být pro tuto oblast dominantní. V případě, že se tvoří klony T buňky z myší imunizovaných peptidem 89-101, všech šest klonů, které vznikají, odpovídá na peptid 92-98. Použitím analogových peptidů 89-101, které zahrnují jedinou substituci alaninu v každé poloze, se zjistilo, že substituce libovolných poloh 92-98 má za následek ztrátu odezvy, což ukazuje, že změna libovolných zbytků v jaderném peptidu 92-98 má velký účinek na rozeznávání epitopů.

MBP peptid 89-101 selhává při toleranci rozeznávání EAE relevantních buněk T přirozeně upraveného epitopu MBP

Pro shrnutí skutečností uvedených shora v textu, se uvádí, že

a) sekvence 89-101 má potenciál vytvořit 3 odlišné epitopy buňky T,

b) pouze dva z těchto uvedených epitopů (89-94 a 95-101) se vytvořily úpravou antigenu neporušeného MBP (jak in vitro tak in vivo)

c) při vyvolání EAE jsou účinné pouze peptidy obsahující přirozeně upravené epitopy a nikoliv ty, které obsahují skrytý epitop

d) peptid 89-101 selhává v experimentech peptidové terapie při ochraně proti EAE

Tato informace poskytuje základ pro zkoumání hypotézy, že peptid 89-101 selhává při tolerizaci proti EAE, protože se přímo neváže na T buňky relevantní pro onemocnění. Za účelem podpoření hypotézy peptid (89-101) nevyvolává toleranci vůči hlavnímu encefalitogennímu epitopu (8994), protože se nebude vázat přímo na restrikční element MHC (I—A^s) ve vhodné konformaci. Jinými slovy peptid 89-101 nebude působit jako apitop v případě T buněk odpovídající na peptid 89-94.

Za účelem testovat tuto možnost se provedly experimenty tolerance s peptidem 89-101 a 87-96 (obrázek č. 15 A a B). Peptid 87-96 obsahuje epitop (89-94), který je nejúčinnější při indukci EAE.

Metody

Myším se v den -8, -6 a -4 aplikovalo intraperitoneálně 200 pg peptidu v PBS nebo samotné PBS a pak v den 0 se aplikovalo 100 pg peptidu v úplném Freundově adjuvans. Po 10 dnech hladovění se buňky lymfatických uzlin (6x10⁵ buněk v jedné prohlubni) kultivovaly v kultivačním médiu X-Vivo 15 doplněném 5x10⁵ M 2-merkaptoetanolem a 2 M Lglutaminátem s antigenem nebo bez antigenu po dobu 72 hodin. Kultura se ozářila v posledních 16 hodin 0,5 pCi ³H-thymidinem a začlenění se měřilo použitím kapalného scintilačního počítače. Výsledky se vyjadřují jako průměrný počet za minutu ze třech stanovení.

Výsledky

Imunizace peptidem 87-96 vyvolala silnou odezvu vůči samotnému peptidu 87-96 a slabou odezvu vůči peptidu 89-101 (zobrazeno na obrázku č. 15 A a B, □ respektive o). To odpovídá nutnosti upravovat antigen za vzniku peptidu 89-94, který pochází z peptidu 89-101. Použití peptidu 87-96 jako tolerogenu před imunizací peptidem 87-96 potlačuje vyvolání odezvy na oba peptidy 87-96 a 89-101 (obrázek č. 15 A a ·). To odpovídá buňkám, které reagují s peptidem

- 18CZ 307202 B6

89-94, pokud zůstávají bez odpovědi in vivo, neodpovídají ani na peptid 89-94 in vitro, pokud se vytvořil z peptidu 89-96 nebo 89-101. Jestliže se však jako tolerogenní peptid použije 89-101 před imunizací 87-96, selhává inhibice vyvolané odezvy vůči 87-96 nebo 89-101 (obrázek č. 15 B A B a ·). Tyto data demonstrují, že aplikace peptidu 89-101 v tolerogenní formě má za následek neschopnost tolerovat přirozeně upravený encefalitogenní epitop založený na sekvenci 89-94. Peptid 89-101 se nechová jako apitop v případě epitopů 89-94.

Věří se, že pozorování se může vysvětlit polohou peptidu 89-101 ve vazebném miste peptidu MHC. Jestliže se peptid s výhodou váže tak, že oblast 92-98 se nachází v oblasti určené pro navázání na peptid, pak ho budou rozeznávat T buňky specifické pro MBP92-98. To vysvětluje důvod, proč myš imunizovaná peptidem MBP89-101 produkuje klony T buňky, který všechny rozeznávají epitop MBP92-98. Stejně, když se peptid 89-101 použije k tolerizaci T buněk, bude hlavně tolerizovat buňky, které rozeznávají epitop MBP92-98. V případě, že MBP92-98 je skrytý epitop, nevzniká přirozeným zpracováním celého antigenu a T buňky rozeznávající tento epitop nebudou pravděpodobně existovat in vivo. Dokonce, jestliže buňky T specifické pro MBP92-98 neexistují in vivo, nebudou relevantní pro uvedené onemocněni. Proto peptid 89-101 nebrání vyvolat EAE celým MBP.

Příklad 3: Terapie za použití peptidu v případě myšího modelu pro onemocnění roztroušená skleróza

Už dříve se ukázalo, že jediná dávka peptidového antigenu aplikovaná systémově buď intraperitoneálně (popisuje se v publikaci Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 8: 1255-1263) nebo intranazálně (Metzler and Wraith (1993) 5: 1159-1165) bude účinně bránit myši před experimentální encefalomyelitidou (EAE) až po dobu tří měsíců (popisuje se v publikaci Metzler and Wraith (1999) Immunology 97: 257-263). K vyvolání tolerance u Tg4 transgenních myší, které exprimují receptor T buněk specifický pro EAE (popisuje se v publikaci Lui et al., (1995) Immunity 3: 407—415), bylo nutné aplikovat alespoň 5 dávek (popisuje se v publikaci Burkhart et al., (199) 11: 1625-1634). Určitá studie zobrazuje, že intranazální způsob aplikace (IN) je bezpečnější než intraperitoneální (IP) u myší Tg4, dokonce u netransgenních myší jsou oba způsoby aplikace stejně bezpečné.

Peptid 83-99 MBP se testoval u transgenních myší Fug/D6, který exprimuje obě vhodné molekuly MHC třídy II HLA-DR2 a TCR pocházející z lidského klonu buněk T, který je specifický pro uvedený peptid. Myším se aplikoval peptid, buď ve standardní dávce používané při léčbě Tg4 transgenních myší (protokol Tg4) nebo v dávkách používaných při desenzibilizaci, kdy dávka peptidu roste. Tento protokol se používá při léčbě pacientů trpících alergií.

Protokol Tg4:

Skupině myší se intranazálně aplikoval peptid 83-99 (4 mg/ml) ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS) nebo samotný PBS v celkovém objemu 25 μΐ. Myši se ošetřovaly každý první a pátý den v týdnu po dobu pěti týdnů, což znamená, že se celkem aplikovalo 10 dávek. Na začátku šestého týdne se myším injekci aplikoval peptid 83-99 v úplném Freundově adjuvans (CFA) a také se jim aplikoval intraperitoneálně v den 1 a 3 toxin pertuze (v množství 200 ng). Progrese EAE se monitoruje alespoň dalších 30 dní.

Desenzibilační protokol

Skupiny myší se ošetřily intranazální aplikaci zvyšující se dávky peptidu 83-99 nebo samotným PBS v celkovém objemu 25 μΐ. Zvyšující se dávka má počáteční hodnotu 0,1 pg a zvyšuje se na hodnoty 1, 3, 6, 12 a 50 ng a pak třikrát 100 pg. Myši se ošetřily každý první a pátý den po době pět týdnů, což znamená celkově aplikovat 10 dávek. Na začátku šestého týdne se každé myši aplikoval injekcí peptid 83-99 v úplném Freundově adjuvans (CFA) a myším se také v den 1 a 3

- 19CZ 307202 B6 aplikovalo injekcí IP toxin pertuze v množství 200 ng. Postup EAE se zaznamenává alespoň 30 dní.

Příklad 4: Nazální aplikace koktejlu apitopu pacientům trpících roztroušenou sklerózou

Připravila se vakcína obsahující peptidy MBP 30-44, 83-99, 110-124 a 130-144 (to znamená, že obsahuje některé epitopy MBP, které se identifikovaly jako apitopy). Vakcína se aplikovala 35 pacientům ve fázi studie Ia/Ib. Studie je jednoduchou studií, ve které se pacienti neléčí po dobu tří měsíců, pak následuje jediná dávka peptidu (la). Pacienti se pak sledují po dobu tří měsíců a pak se jim aplikuje jediná dávka vakcíny, aby se posoudila bezpečnost. Léčba zahrnuje intranazální aplikaci dvakrát týdně. V případě každého pacienta se každý měsíc hodnotí klinická aktivita pomocí zobrazení magnetickou rezonancí. Imunologická aktivita se sleduje použitím testu kinetické odezvy v případě proliferace a produkce cytokinu se monitoruje použitím testu ELISA založeného na celých buňkách.

Studie na začátku zahrnuje léčbu pěti pacientů, které trpí chronickým postupujícím onemocněním (CP). Tyto pacienti se vybrali na základě nízké aktivity MRI a nejdříve se jim aplikuje nejvyšší dávka peptidu. Léčba začala ve skupině pacientů trpících CP, protože zde je možné ukázat libovolný možný nežádoucí účinky, jak dokazuje zvýšenou aktivitou MRI. Jestliže už začala léčba recidivujících pacientů ve fázi ustupujícího onemocnění, je zřejmé, že ve skupině CP je bezpečná jak léčba jedinou dávkou tak i léčba, která aplikuje více dávek. Vybrala se větší skupina obsahující alespoň 30 recidivujících pacientů ve fázi ustupujícího onemocnění na základě zvyšujícího se počtu lézí zobrazených MRI během sledování po dobu 3 měsíců. Tito pacienti se rozdělili do tří skupin, které se rozdělily do tří skupin, které se ošetří vysokou, střední nebo nízkou dávkou peptidu.

čas (měsíce)	pacienti trpící chronickým postupujícím onemocněním (CP)	pacienti trpící relapsuj ícím ustupujícím onemocněním
0	začátek měsíčního sledování
3	počáteční fáze la (jediná

-20CZ 307202 B6

	dávka peptidu), 1 až 2 týdny po léčbě se provede MRI a probíhá měsíční sledování
6	počáteční fáze lb (dvakrát týdně se aplikuje dávka peptidu) a pokračuje měsíční sledování	začíná měsíční monitorování a vybírají se pacienti se zvyšujícím se počtem lézí
9		začíná fáze lb (dávka peptidu se aplikuje dvakrát týdně) a pokračuje měsíční pozorováni
12	konec léčby a pokračující měsíční sledování po dobu dalších 6 měsíců
15		konec léčby a pokračuje měsíční sledování po dobu dalších šesti měsíců

Vysvětlivky použitých zkratek:

APC	= buňky prezentující antigen
MHC	= hlavní histokompatibilní komplex
TCR EAE APITOPE APIPS	= receptor buňky T = experimentální autoimunitní encefalomyelitida = epitop nezávislý na úpravě antigenu = prezentační systém nezávislý na úpravě antigenu
aa MS	= aminokyselina = roztroušená skleróza
MBP	= základní protein myelinu
PLP	= proteolipidový protein
TCL	= linie buněk T
TCC	= klon buňky T
PBMC	=jednojademé buňky periferní krve
PPD PHA	= čištěný derivát proteinu mikroorganizmu Mycobacterium tuberculosis = fytohemaglutinin

-21 CZ 307202 B6

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15

Pro (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Horno sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

-22CZ 307202 B6

Gin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

-23 CZ 307202 B6

Met Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

-24CZ 307202 B6

Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala ¹⁵ 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gin 15 1° 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselinových zbytků (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro 15 10

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob in vitro pro identifikaci peptidu, který je vhodný pro prevenci a/nebo pro léčení poruch z přecitlivělosti, zprostředkovaných T buňkami, které rozpoznávají cílový antigen, který zahrnuje následující kroky:

   (i) na prezentační systém, nezávislý na úpravě antigenu se působí řadou peptidu, z nichž každý obsahuje epitop cílového antigenu T buňky, (ii) analyzuje se vazba těchto peptidů na molekuly MHC třídy I nebo II v systému přidáním T buněk a měřením aktivace T buněk;

   -25CZ 307202 B6 (iii) identifikuje se peptid, který je schopný se vázat na molekuly MHC třídy I nebo II v prezentačním systému, nezávislém na úpravě antigenu a je prezentován T buňce jako peptid, schopný indukovat toleranci na cílový antigen in vivo při podání jedinci, a vhodný pro prevenci a/nebo léčení poruchy z přecitlivělosti; a (iv) identifikuje se peptid, který je schopný se vázat na molekuly MHC třídy I nebo II v prezentačním systému, nezávislém na úpravě antigenu a je prezentován T buňkám jako schopný indukovat toleranci.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že prezentační systém, nezávislý na úpravě antigenu zahrnuje (i) buňky, prezentující fixovaný antigen, (ii) lipidové membrány, obsahující molekuly MHC třídy I nebo II nebo (iii) molekuly MHC třídy I nebo II, vázané na destičky.
3. 3. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň, v němž se prokazuje, zda je uvedený peptid schopný se vázat na molekuly MHC třídy I nebo II v prezentačním systému, nezávislém na úpravě antigenů a je prezentován T buňce.
4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se řada peptidů eluuje z molekul třídy I a II z buněk, prezentujících antigen.
5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se peptid volí z vymezené skupiny zkrácených peptidů.
6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že přítomnost epitopu buňky T se stanoví tak, že se (i) uvedeným peptidem působí na vzorek buněk, který pochází z jedince, trpícího onemocněním a na vzorek buněk, který pochází z jedince, který tímto onemocněním netrpí; a (ii) srovnává se odezva T buněk u těchto vzorků buněk.
7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že poruchou typu přecitlivělosti je alergie, autoimunitní onemocnění nebo odmítnutí štěpu.