PT1918298E - Péptido - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO rr

"PÉPTIDO A presente invenção refere-se a um péptido e à sua utilização no tratamento e/ou na prevenção da esclerose múltipla. A presente invenção refere-se, também, a uma composição farmacêutica compreendendo uma pluralidade desses péptidos tolerogénicos.

ANTECEDENTES

Numa resposta imunitária adaptativa, os linfócitos T são capazes de reconhecer epitopos internos de um antigénio proteico. As células apresentadoras de antigénio (APC) incorporam antigénios proteicos e degradam-nos em fragmentos peptídicos curtos. Um péptido pode-se ligar a uma molécula da classe I ou II do complexo de histocompatibilidade maior (MHC) no interior da célula e ser transportado até a superfície celular. Quando apresentado na superfície celular, em conjunto com uma molécula de MHC, o péptido pode ser reconhecido por uma célula T (através do receptor das células T (TCR)), caso em que péptido é um epitopo de células T.

Os epitopos das células T desempenham um papel central na resposta imunitária adaptativa a qualquer antigénio, seja ele próprio ou exógeno. 0 papel central, desempenhado pelos epitopos de células T em doenças de hipersensibilidade (as quais incluem 1 alergia, doenças auto-imunes e rejeição de transplantes), foi demonstrado pela utilização de modelos experimentais. É possivel induzir doenças inflamatórias ou alérgicas pela injecção de péptidos sintéticos (baseados na estrutura dos epitopos de células T), em combinação com adjuvante.

Pelo contrário, foi demonstrado ser possivel induzir tolerância imunológica em relação a epitopos peptídicos particulares, pela administração de epitopos peptídicos sob a forma solúvel. A administração de antigénios peptídicos solúveis revelou-se um meio eficaz para inibir a doença da encefalomielite auto-imune experimental (EAE - um modelo para a esclerose múltipla (MS)) (Metzler e Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu e Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton e Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261); e modelos experimentais para a artrite, diabetes e uveorretinite (revisto em Anderton e Wraith (1998), como acima). Esta revelou-se, também, como um meio para tratar uma doença estabelecida na EAE (Anderton e Wraith (1998), como acima). A utilização de péptidos tolerogénicos para tratar ou prevenir doenças atraiu uma atenção considerável. Uma razão para tal é que foi demonstrado que determinados epitopos tolerogénicos podem regular negativamente respostas de células T para antigénios distintos, dentro do mesmo tecido. Este fenómeno, conhecido como "supressão próxima", significa que deverá ser possível induzir tolerância a mais de um epitopo (de um modo preferido, a todos os epitopos), dentro de um determinado antigénio e a mais de um antigénio de uma determinada doença, utilizando um péptido tolerogénico particular (Anderton e Wraith (1998), como acima). Isto deverá 2 obviar a necessidade de identificar todos os antigénios patogénicos, dentro de uma doença particular.

Os péptidos são, também, uma opção favorável para terapia, devido ao seu preço relativamente baixo e ao facto dos análogos de péptidos poderem ser produzidos com propriedades imunológicas alteradas. Os péptidos podem ser, deste modo, modificados para alterar as suas interacções com o MHC ou com o TCR.

Um problema possivel com esta abordagem é que foi demonstrado que nem todos os péptidos que actuam como epitopos das células T são capazes de induzir tolerância. 0 péptido 89-101 da proteína básica da mielina (MBP) é um antigénio imunodominante após imunização e é, também, um imunogénio muito eficaz, em termos de iniciação da reactividade das células T e da indução da EAE. No entanto, este péptido revelou-se ineficaz na indução de tolerância quando administrado em solução (Anderton e Wraith (1998), como acima). Têm sido propostas várias explicações para a hierarquia observada na capacidade dos epitopos de células T induzirem tolerância (revisto em Anderton e Wraith (1998), como acima). Em particular, foi proposto que existe uma correlação entre a afinidade do péptido para o MHC e a tolerogenicidade (Liu e Wraith (1995), como acima), mas isto não corresponde a algumas das observações. Por exemplo, a MBP[89-101], a qual não é tolerogénica, liga-se a I-As, com uma afinidade relativamente elevada. Deste modo, não é simples prever quais os péptidos que irão induzir tolerância.

Se houvesse uma explicação racional para a razão pela qual apenas uma parte dos epitopos peptídicos é capaz de induzir 3 tolerância, tolerogénicos úteis múltipla. isto a selecção de péptidos no tratamento e na prevenção de esclerose facilitaria

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente requerente demonstrou que, se um epitopo peptidico for de um tamanho adequado a ser apresentado por APC imaturas, sem processamento do antigénio, este pode induzir tolerância imunológica. A observação de que alguns epitopos de células T são tolerogénicos e de que outros são incapazes de induzir tolerância pode, consequentemente, ser explicada pelo facto de alguns epitopos requererem processamento adicional antes destes poderem ser apresentados por uma molécula do MHC. Estes epitopos, os quais requerem processamento adicional, não induzem tolerância quando administrados sob uma forma solúvel, apesar da sua capacidade para induzir a doença, quando injectados em combinação com adjuvante.

Os epitopos que não requerem processamento adicional, são capazes de induzir tolerância e foram denominados "apitopos" (EpiTOPOS Independentes do Processamento do Antigénio), pela requerente.

Esta verificação proporciona um método, baseado em regras, para a selecção de epitopos de células T tolerogénicos, os quais obviam a necessidade de examinar a capacidade tolerogénica de um péptido, in vivo. Isto é particularmente vantajoso no desenvolvimento de estratégias para tratar ou prevenir doenças, para as quais não estejam disponíveis quaisquer modelos animais. Mesmo para doenças que têm um modelo animal, o método de 4 selecção deve tornar mais simples e mais seguro o desenvolvimento de composições indutoras de tolerância, uma vez que este proporciona um mecanismo através do qual pode ser testada a capacidade de indução de tolerância de um péptido em células T humanas (que reconhecem o antigénio, em conjunto com moléculas do mhc humano), in vitro, antes da sua utilização in vivo.

Num primeiro aspecto, deste modo, a presente invenção proporciona um péptido tolerogénico humano, capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II, sem processamento adicional de antigénio, para utilização no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla, em que o péptido é seleccionado dos seguintes péptidos da proteína básica da mielina (MBP): 83-99 e 131-145. São conhecidos vários métodos na técnica para o rastreio de péptidos que sejam capazes de actuar como epitopos de células T, para um determinado antigénio. Normalmente, consequentemente, o método será utilizado para seleccionar um péptido tolerogénico, a partir de uma pluralidade de péptidos compreendendo, cada, epitopo de células T.

Para averiguar se um péptido é capaz de se ligar a uma molécula de MHC da classe I ou II sem processamento adicional, é possível estudar a capacidade do péptido para se ligar a moléculas de MHC da classe I ou II, utilizando um sistema de apresentação de antigénio independente do processamento (APIPS). Num aspecto preferido, consequentemente, o método compreende os passos seguintes: (i) tratar um APIPS com um péptido; e 5 (ii) analisar a ligação do péptido a moléculas da classe I ou II do MHC no APIPS. A presente requerente identificou vários apitopos para a proteína básica da mielina, a qual é um autoantigénio na esclerose múltipla.

É conhecido que alguns péptidos são capazes de induzir tolerância a outros epitopos do mesmo antigénio e mesmo a outros epitopos de um antigénio distinto (pelo fenómeno conhecido como supressão próxima). No entanto, a presente requerente prevê que, para suprimir adequadamente todas as células de T autorreactivas, seria vantajoso ser administrada uma combinação de vários apitopos ao doente, para tratar/prevenir a esclerose múltipla. Consequentemente, num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma pluralidade de péptidos de acordo com o primeiro aspecto da invenção, sendo cada péptido baseado num epitopo de célula T.

Uma estratégia geral para o tratamento e/ou prevenção de uma doença num indivíduo pode compreender os seguintes passos: (i) identificação de um antigénio para a doença (ii) identificação de um apitopo para o antigénio; e (iii) administração do apitopo ao indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra um exemplo típico do perfil cinético do derivado de proteína purificada de Mycobacterium tuberculosis (PPD) e MBP em doentes com Esclerose Múltipla 6 (MS) e indivíduos saudáveis. São testadas células mononucleares do sangue periférico (PBMC), isoladas de um doente com MS (A) e de um indivíduo normal (B), para a sua capacidade para proliferar na presença de PPD e MBP completa; é comparado o perfil cinético da resposta proliferativa à MBP com o do antigénio secundário PPD. A Figura 2 é uma tabela que resume as respostas das PBMC à MBP e aos seus péptidos, em doentes com MS. São analisados alguns indivíduos em três pontos temporais separados, com um período de, aproximadamente, 4 a 7 meses entre cada ponto temporal. A Figura 3 é uma tabela que resume as respostas das PBMC a MBP e péptidos MBP, em indivíduos saudáveis. Passaram entre 4 e 7 meses entre cada ponto temporal. A Figura 4 mostra um exemplo de um doente com MS (MS 49), o qual responde a péptidos múltiplos em 2 pontos temporais diferentes, mas para o qual o perfil de reconhecimento durante o segundo ponto temporal, medido após 4 meses, difere significativamente. As PBMC foram cultivadas na presença da MBP e de um painel de péptidos abrangendo todo o comprimento da MBP e a proliferação foi medida pela incorporação de 3H-timidina. A ampla resposta proliferativa significativa das células T, observada no primeiro ponto temporal foi, significativamente, diferente da resposta medida após 7 meses (segundo ponto temporal). A Figura 5 mostra um exemplo de um doente, cuja ampla resposta do epitopo (primeiro ponto temporal) regride 7 (segundo ponto temporal) e reaparece ao longo de um período de doze meses (terceiro ponto temporal). A Figura 6 mostra um mapa da especificidade fina das regiões peptídicas identificadas no ensaio de resposta cinética, o qual é obtido pela utilização de TCC produzido a partir de doentes com MS e indivíduos saudáveis. A maioria dos péptidos utilizados nos ensaios de rastreio são 15-meros em comprimento, no entanto, alguns são 10-meros e 1 péptido é 17-mero. A especificidade de cada TCC é testada, pelo menos, duas vezes. A Figura 7a é uma tabela mostrando a caracterização de epitopos de células T, dentro da proteína básica da mielina, reconhecidos por linfócitos T de doentes com MS. A Figura 7b é uma tabela mostrando que todos os epitopos de células T não são necessariamente apresentados por APC fixas e que, consequentemente, não apitopos.

As Figuras 8 e 9 mostram a apresentação de vários péptidos MBP a clones de células T, por APC vivas e fixas. Fig. 8A -30-44, Fig. 8B - 110-124, Fig. 9A-130-144, Fig. 9B - 156- 170 . A Figura 10 é uma tabela que mostra os valores do índice de Estímulo máximo (SI) para MBP e para os péptidos de MBP, em doentes com MS, obtidos em três pontos temporais separados. As amostras para o segundo ponto temporal foram recolhidas 4-8 meses após o Io ponto temporal e as amostras para o 3o ponto temporal foram obtidas 3-5 meses após o segundo ponto temporal. Foi medida a cpm de fundo para cada dia e variou 8 entre 80-700 cpm; uma resposta positiva (a cheio) foi definida de acordo com SI > 3 e 5cpm > 1000. (Não foi possível recolher amostras para os três pontos temporais dos doentes MS 19 e MS 67). A Figura 11 é uma tabela que mostra os valores do índice de Estímulo máximo (SI) para MBP e os péptidos MBP, em indivíduos saudáveis. A cpm de fundo foi medida para cada dia e variou entre 80-700 cpm; uma resposta positiva (a cheio) foi definida de acordo com SI > 3 e dcpm > 1000. A Figura 12 mostra a resposta de células T, isoladas de um murganho transgénico DR2:MBP82-100, à apresentação de péptidos MBP contidos na região 77-100, por APC. A Figura 13 mostra a resposta do clone MS17:A3 de células T a apresentação de péptidos MBP contidos na região 125-148, por APC. A Figura 14 é uma ilustração do reconhecimento do epitopo de células T dentro da sequência 89-101 de MBP. Existem três epitopos de células T, distintos mas sobrepostos, dentro da sequência: 89-94, 92-98 e 95-101. É mostrado o potencial para a quebra entre os resíduos 94 e 95, pela acção da endoepetidase do asparginilo (AEP). A Figura 15 mostra a capacidade dos péptidos MBP 87-96 (A) e 89-101 (B) para actuarem como um apitopo para células T que respondem ao epitopo 89-94. 9

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para seleccionar um péptido tolerogénico.

Tolerância

Como aqui utilizado, o termo "tolerogénico" significa capaz de induzir tolerância. A tolerância é a incapacidade para responder a um antigénio. Tolerância aos antigénios próprios é uma característica essencial do sistema imunitário e, quando esta é perdida, pode resultar em doença auto-imune. 0 sistema imunitário adaptativo deve manter a capacidade para responder a uma grande variedade de agentes infecciosos, evitando ataques auto-imunes de antigénios próprios, contidos dentro dos seus próprios tecidos. Isto é controlado, em grande medida, pela sensibilidade dos linfócitos T imaturos à morte celular apoptótica no timo (tolerância central). No entanto, nem todos os antigénios próprios são detectados no timo, portanto, a morte dos timócitos autorreactivos permanece incompleta. Deste modo, existem, também, mecanismos pelos quais pode ser adquirida tolerância pelos linfócitos T maduros autorreactivos nos tecidos periféricos (tolerância periférica). Em Anderton et al., (1999) (Imunological Reviews 169:123-137) é proporcionada uma revisão dos mecanismos da tolerância central e periférica. A tolerância pode resultar ou ser caracterizada pela indução de anergia em, pelo menos, uma parte das células T CD4+. Para activar uma célula T, um péptido deve associar-se com uma 10 APC "profissional", capaz de distribuir dois sinais a células T. 0 primeiro sinal (sinal 1) é distribuído pelo complexo MHC-péptido na superfície celular da APC e é recebido pela célula T através do TCR. 0 segundo sinal (sinal 2) é distribuído por moléculas co-estimulantes na superfície da APC, tais como CD80 e CD86 e recebido pela CD28 na superfície da célula T. Pensa-se que, quando uma célula T recebe o sinal 1 na ausência do sinal 2, esta não é activada e fica, de facto, anérgica. As células T anérgicas são refractárias ao desafio antigénico subsequente e podem ser capazes de suprimir outras respostas imunitárias. Pensa-se que as células T anérgicas estejam envolvidas na mediação da tolerância das células T.

Sem se pretender ser limitado pela teoria, a presente requerente prevê que os péptidos que requeiram processamento, antes destes poderem ser apresentados em conjunto com moléculas de MHC, não induzem tolerância, dado que estes têm que ser manipulados pelas células apresentadoras de antigénio maduras. As células apresentadoras de antigénio maduras (tais como macrófagos, células B e células dendriticas) têm capacidade de processamento do antigénio, mas, também, de distribuição de ambos os sinais, 1 e 2, a uma célula T, originando a activação das células T. Por outro lado, os apitopos terão capacidade para se ligarem à MHC de classe II, em APC imaturas. Deste modo, estes serão apresentados às células T sem co-estimulação, originando anergia e tolerância das células T.

Obviamente, os apitopos são, também, capazes se ligarem a moléculas de MHC na superfície celular de APC maduras. No entanto, o sistema imunitário contém uma maior abundância de APC imaturas do que de maduras (foi sugerido que sejam activadas menos de 10% das células dendriticas, Summers et al., (2001) Am. 11 J. Pathol. 159:285-295). Por omissão, o comportamento em relação a um apitopo será, consequentemente, de anergia/tolerância em vez de activação.

Foi demonstrado que, quando a tolerância é induzida pela inalação de péptidos, a capacidade de proliferação de células τ CD4+ especificas para um antigénio é reduzida. De igual modo, a produção de IL-2, IFN-γ e a produção de IL-4 por estas células está regulada negativamente, mas a produção de IL-10 está aumentada. A neutralização de IL-10 em murganhos, num estado tolerância induzida por péptidos, revelou restaurar, completamente, a susceptibilidade à doença. Foi proposto que persiste uma população de células reguladoras no estado tolerante, as quais produzem IL-10 e medeiam a regulação imunitária (Burkhart et al. (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).

Consequentemente, indução da tolerância pode ser controlada por várias técnicas, incluindo: (a) susceptibilidade reduzida para contrair a doença para a qual o péptido é um epitopo alvo in vivo; (b) indução de anergia em células T CD4+ (a qual pode ser detectada pelo desafio subsequente com o antigénio, in vitro) ; (c) alterações na população de células T CD4+, incluindo (i) redução da proliferação; (ii) regulação negativa na produção de IL-2, IFN-γ e IL-4; e 12 (iii) aumento da produção de IL-10.

Epitopos Independentes do Processamento do Antigénio (APITOPOS) 0 método da presente divulgação compreende o passo de seleccionar um péptido, o qual é capaz de se ligar a uma proteína de MHC de classe I ou II sem processamento adicional. Esses péptidos são conhecidos aqui como "apitopos" (EpiTOPOS Independentes do Processamento do Antigénio). A apresentação à superfície celular de péptidos derivados de um determinado antigénio não é aleatória e tende a ser dominada por um pequeno número de epitopos de ocorrência frequente. A dominância de um péptido em particular irá depender de muitos factores, tais como a afinidade relativa de ligação à molécula de MHC, o ponto espacio-temporal de produção dentro da APC e a resistência à degradação. A hierarquia dos epitopos para um antigénio pode alterar-se com a progressão de uma resposta imunitária, a qual tem implicações importantes para a auto-tolerância e para a auto-imunidade. As regiões determinantes imunodominantes serão, provavelmente, bons tolerogénios. Assim, numa forma de realização preferida, o apitopo da presente invenção é baseado num epitopo dominante.

No entanto, após uma resposta imunitária primária aos péptidos imunodominantes, pode ocorrer o "alastramento" do epitopo para determinantes sub-dominantes (Lehmann et al., (1992) Nature 358:155-157). A apresentação de epitopos sub-dominantes pode ser importante no desencadear da 13 auto-imunidade. 0 apitopo da presente invenção pode ser, consequentemente, baseado num epitopo subdominante.

Podem existir também epitopos crípticos, para qualquer determinado antigénio. Os epitopos crípticos são aqueles que podem estimular uma resposta de células T, quando administrados como um péptido, mas que não conseguem produzir essa resposta quando administrados como um antigénio completo. Pode suceder que o epitopo críptico seja destruído, durante o processamento do antigénio em péptidos, na APC. A presente requerente demonstrou que o péptido 92-98 é um epitopo críptico para MBP (Exemplo 2C) . De uma forma interessante, está presente um local de quebra putativo da endopeptidase do asparaginilo, dentro desta região peptídica, o que pode significar que, durante o processamento natural, não é produzido pela APC qualquer péptido contendo esta região.

Um epitopo críptico pode actuar, in vitro, como um apitopo, por poder ter capacidade de ligação a uma molécula de MHC sem processamento adicional e de induzir anergia numa célula T, a qual reconhece o epitopo críptico. No entanto, seria pouco provável que esse apitopo fosse terapeuticamente útil, uma vez que este deveria ser incapaz de tornar tolerantes as células T que reconhecem um epitopo do antigénio processado naturalmente.

Os epitopos para um antigénio podem ser identificados por medição da resposta das células T a péptidos sobrepostos, abrangendo o antigénio completo (ver abaixo), quando apresentados por APC. Esses estudos resultam, normalmente, em "conjuntos internos" de péptidos e o epitopo mínimo para uma linha/clone de células T em particular pode ser avaliado, medindo a resposta a péptidos truncados. 14 Não pode ser assumido que um epitopo mínimo de um antigénio se vá comportar como um apitopo. Pode suceder que sejam necessários aminoácidos que flanqueiam o epitopo mínimo, para uma ligação óptima ao MHC. 0 apitopo deve ser concebido de forma a abranger a possibilidade de que possam existir diferenças subtis entre os epitopos mínimos de diferentes clones de células T.

Deve ser salientado que poderá não ser possível identificar um apitopo para todos os epitopos. Existem indícios evidentes de que alguns epitopos se ligam ao MHC por uma via que está dependente da carga em MHC nos endosomas e que, por este motivo, requeiram processamento (Viner et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. 92:2214-2218). Isto constitui outra razão para não ser possível assumir que cada epitopo mínimo se vá comportar, inevitavelmente, como um apitopo.

Identificação de péptidos contendo epitopos de células T

Existem vários métodos conhecidos na técnica, para identificar os epitopos das células T dentro de um determinado antigénio.

Os epitopos processados naturalmente podem ser identificados por análise espectrofotométrica de massa, de péptidos eluídos a partir de APC carregadas com antigénio. Estas são APC que foram estimuladas a incorporar antigénio ou forçadas a produzir a proteína, intracelularmente, por transformação com o gene adequado. Tipicamente, as APC são incubadas com a proteína em solução ou adequadamente direccionadas para a superfície celular das APC. Após incubação a 37 °C, as células 15 são lisadas em detergente e a proteína da classe II é purificada, por exemplo, por cromatografia de afinidade. 0 tratamento do MHC purificado, com um meio químico adequado (por exemplo, condições ácidas), resulta na eluição de péptidos a partir do MHC. Este conjunto de péptidos é separado e o perfil é comparado com o péptido das APC de controlo, tratadas do mesmo modo. São analisados os máximos, únicos das células que expressam/fornecidas com proteína (por exemplo, por espectrometria de massa) e são identificados os fragmentos peptídicos. Este processo produz, normalmente, informação sobre a gama de péptidos (normalmente encontrados em "conjuntos contidos") produzida a partir de um antigénio particular, pelo processamento do antigénio.

Um outro método para identificar epitopos, consiste no rastreio de uma biblioteca de péptidos sintéticos, os quais se sobrepõem e abrangem o comprimento do antigénio, num ensaio in vitro. Por exemplo, podem ser utilizados péptidos que têm 15 aminoácidos de comprimento e que se sobrepõem em 5 ou 10 aminoácidos. Os péptidos são testados num sistema de apresentação de antigénio que compreende células apresentadoras de antigénio e células T. Por exemplo, o sistema de apresentação de antigénio pode ser uma preparação de esplenócitos murinos, uma preparação de células humanas da amígdala ou PBMC. Alternativamente, o sistema de apresentação do antigénio pode compreender uma linha/clone de células T em particular e/ou um tipo celular apresentador de antigénio em particular. A activação das células τ pode ser medida pela proliferação das células T (utilizando, por exemplo, a incorporação de 3H-timidina) ou da produção de citocina. A activação das células T CD4+ do tipo THl- pode ser, por exemplo, detectada, através da 16 produção de IFNy o qual pode ser detectado por técnicas padrão, tal como um ensaio ELISPOT.

Os estudos dos péptidos sobrepostos indicam, normalmente, a área do antigénio, na qual um epitopo se localiza. 0 epitopo mínimo para uma célula T em particular pode ser, então, avaliado, por medição da resposta a péptidos truncados. Por exemplo, se é obtida uma resposta ao péptido compreendendo os resíduos 1-15 da biblioteca de sobreposição, podem ser utilizados conjuntos que estão truncados em ambas as extremidades (i. e., 1-14, 1-13, 1-12 etc. e 2-15, 3-15, 4-15 etc.) para identificar o epitopo mínimo. É previsto, pela presente requerente, que a identificação de regiões imunodominantes de um antigénio, utilizando ensaios in vitro (especialmente, os que utilizam linhas de células T), apresente um padrão enviesado da reactividade peptídica. No estudo de identificação de epitopos MBP que é descrito nos exemplos, estes utilizam um ensaio de resposta cinética, no qual é medida a proliferação das PBMC de doentes com MS e de indivíduos saudáveis, contra uma biblioteca de péptidos sobrepostos. Este ensaio é baseado na verificação de que, embora as células T de indivíduos normais e de doentes com MS respondam de uma forma semelhante ao antigénio proteico purificado, estas respondem de um modo diferente a péptidos baseados na sequência de MBP. As células T de doentes com MS respondem aos antigénios peptídicos com maior magnitude e com uma cinética mais rápida, em comparação com dadores saudáveis normais. Isto permite o rastreio e a identificação do epitopo ao qual o doente em particular responde, num momento em particular. No estudo aqui descrito, esta abordagem revelou várias regiões contendo epitopos que não foram identificadas utilizando técnicas padrão. 17

Além disso, é demonstrado que o reconhecimento de células T apresenta um padrão cíclico, aparecendo num ponto temporal, regredindo e, posteriormente, reaparecendo numa fase posterior. 0 ensaio cinético descrito pela requerente proporciona um instrumento valioso, dado que este revela o epitopo ao qual um doente está a responder num momento particular. Esta informação pode ser utilizada para conceber uma abordagem terapêutica de administração de apitopo, para um doente em particular, pela identificação e administração de um apitopo para o epitopo relevante (se existir) . Esta informação pode, também, permitir que seja concebido um padrão geral para a progressão da doença, de forma a que a composição terapêutica possa ser concebida para incluir apitopos para os epitopos que, provavelmente, estarão presentes numa determinada etapa durante a doença.

Sistemas de Apresentação Independentes do Processamento do Antigénio (APIPS)

Uma vez identificado um epitopo, o passo seguinte deve investigar se este se comporta, também, como um apitopo.

Um apitopo deve ser apresentado a células T sem necessidade de processamento do antigénio. Estando identificados péptidos contendo epitopos das células T, podem ser identificados os apitopos, utilizando um sistema sem processamento. Os péptidos truncados e os análogos de péptidos podem ser testados para a activação, utilizando um sistema de apresentação de antigénio independente do processamento (APIPS). 18

Os exemplos de APIPS incluem: a) APC fixas (com ou sem anticorpos contra CD28); b) membranas lipídicas contendo moléculas de MHC de Classe I ou li (com ou sem anticorpos contra CD28); e c) MHC natural ou recombinante purificada, sob a forma ligada à placa (com ou sem anticorpos contra CD28). É conhecida a utilização de APC fixas para investigar as respostas de células T, por exemplo, em estudos para investigar o epitopo mínimo dentro de um polipéptido, pela medição da resposta a péptidos truncados (Fairchild et al. (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043). A APC pode ser fixa, utilizando, por exemplo, formaldeído (normalmente, paraformaldeído) ou glutaraldeído.

As membranas lipídicas (as quais podem ser membranas planares ou lipossomas) podem ser preparadas utilizando lípidos artificiais ou podem ser fracções da membrana plasmática/microssomais de APC.

Em utilização, o APIPS pode ser aplicado aos poços de uma placa de cultura de tecidos. São, então, adicionados antigénios peptídicos e a ligação do péptido à parte MHC do APIPS é detectada pela adição de linhas ou de clones de células T seleccionados. A activação da linha ou do clone de células T pode ser medida por qualquer dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através da incorporação de 3H-timidina ou secreção de citocina. 19 Péptidos A invenção refere-se a um peptide para utilização na prevenção e/ou tratamento de esclerose múltipla. 0 termo "péptido" é utilizado no sentido normal para significar uma série de residuos, tipicamente L-aminoácidos, ligados uns aos outros tipicamente através de ligações peptídicas entre os grupos α-amino e carboxilo dos aminoácidos adjacentes. 0 termo inclui péptidos modificados análogos de péptidos sintéticos.

Um péptido para utilização na prevenção e/ou tratamento de esclerose múltipla pode ter qualquer comprimento capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II sem processamento adicional.

Os péptidos que se ligam a moléculas de MHC de classe I têm tipicamente 7 a 13, mais normalmente 8 a 10 aminoácidos de comprimento. A ligação do péptido é estabilizada nas suas duas extremidades através de contactos entre átomos na cadeia principal do péptido e sitios invariantes no sulco de ligação ao péptido de todas as moléculas de MHC de classe I. Existem sitios invariantes em ambas as extremidades do sulco que se ligam aos terminais amino e carboxilo do péptido. As variações no comprimento do péptido são acomodadas através de uma dobra na estrutura do péptido, frequentemente nos residuos de prolina ou glicina que permitem a flexibilidade necessária.

Os péptidos que se ligam a moléculas de MHC de classe II estão tipicamente entre 8 e 20 aminoácidos de comprimento, mais normalmente entre 10 e 17 aminoácidos de comprimento e podem ser muito mais longos. Estes péptidos residem numa conformação 20 estendida ao longo do sulco de ligação ao péptido de MHC II que (ao contrário do sulco de ligação ao péptido de MHC de classe I) é aberto em ambas as extremidades. 0 péptido é mantido no lugar através, principalmente, de contactos de átomos da cadeia principal com resíduos conservados que contornam o sulco de ligação ao péptido. 0 péptido para utilização na presente invenção pode ser preparado, utilizando métodos químicos (Péptido Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlim.). Por exemplo, os péptidos podem ser sintetizados por técnicas em fase sólida (Roberge JY et al. (1995) Science 269:202-204), quebra a partir da resina e purificação por cromatografia liquida de elevado desempenho preparativa (e. g., Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principies, WH Freeman and Co, Nova Iorque NI). Pode ser realizada síntese automatizada, utilizando, por exemplo, o Sintetizador de Péptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer), de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. O péptido pode, alternativamente, ser preparado por meios recombinantes ou pela clivagem de um polipéptido mais longo. Por exemplo, o péptido pode ser obtido pela clivagem do antigénio alvo. A composição de um péptido pode ser confirmada pela análise ou sequenciação dos aminoácidos (e. g., processo de degradação de Edman).

Numa forma de realização preferida o péptido é derivado de um antigénio alvo. Um antigénio alvo é uma molécula (por exemplo, uma proteína ou uma glicoproteína) que é processada por APC e reconhecida por células T, durante o curso da doença. O antigénio alvo irá depender, naturalmente, da doença alvo. De um 21 modo preferido, o péptido é derivado de um fragmento do antigénio, que surja do processamento natural do antigénio por uma APC.

Para finalidades práticas, existem várias outras caracteristicas que o péptido deve apresentar. Por exemplo, o péptido deve ser solúvel numa concentração que permita a sua utilização in vivo. De um modo preferido, o péptido deve ser solúvel em concentrações de até 0,5 mg/mL, de um modo mais preferido, o péptido deve ser solúvel em concentrações de até 1 mg/mL, de um modo muito preferido, o péptido deve ser solúvel em concentrações de até 5 mg/mL.

Para administração intranasal, o volume máximo da dose que pode ser tomada, utilizando processos actuais é de, aproximadamente, 200 pL por narina. Se o péptido for solúvel a 1 mg/mL, uma dose dupla em cada narina permite que sejam administradas 800 pg ao doente. Não é comum a administração de mais de 5 mg em qualquer dose individual. É, também, importante que o péptido seja suficientemente estável in vivo, para que seja útil terapeuticamente. A presente requerente verificou que, in vivo, 30 minutos após a administração, a quantidade total de um péptido de teste desce para cerca de 50%, 4 horas após a administração, a quantidade desce para cerca de 30%, mas que, após 5 dias, o péptido é, ainda, detectável (em cerca de 5%) . A semi-vida do péptido, in vivo, deve ser, pelo menos, de 10 minutos, de um modo preferido, pelo menos, 30 minutos, de um modo mais preferido, pelo menos, 4 horas, de um modo muito preferido, pelo menos, 24 horas. 22 A presente requerente verificou que, após a administração intranasal, a quantidade de péptido no nódulo linfático drenante, atinge um máximo em cerca de 4 horas após a administração, no entanto o péptido é, ainda, detectável (em níveis de cerca de 5% do máximo) após 5 dias. De um modo preferido, o péptido é suficientemente estável para estar presente numa concentração terapeuticamente activa no nódulo linfático drenante, durante tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico. 0 péptido deve, também, apresentar uma boa biodisponibilidade in vivo. 0 péptido deve manter uma conformação in vivo que lhe permita a ligação a uma molécula de MHC na superfície celular, sem o impedimento esperado.

Um apitopo de MHC de classe II será, provavelmente, particularmente, útil em doenças que sejam mediadas por respostas das células T CD4+. Por exemplo, doenças que sejam estabelecidas ou mantidas por uma resposta inadequada ou excessiva de células T CD4+. 0 péptido é para utilização no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS). A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória crónica, caracterizada por lesões múltiplas desmielinizantes, disseminadas por toda a matéria branca do SNC e ocorrendo em várias localizações e tempos (McFarlin e McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 e 1246-1251). Pensa-se que a MS seja mediada por células T autorreactivas. O péptido pode ser derivado de um dos autoantigénios em partículas a proteína básica da mielina (MBP) ou proteína 23 protolipidica (PLP). A MBP é, possivelmente, mais adequada do que a PLP, uma vez que a PLP é altamente hidrofóbica e os péptidos derivados desta tendem a formar aglomerados. A MBP é imunogénica e os linfócitos T específicos para a MBP têm actividade encefalitogénica em animais (Segai et al., 1994 J. Neuroimmunol. 51:7-19; Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol 42:187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 317:355-8).

Os apitopos de MHC da classe I podem ser utilizados, por exemplo, na modificação de respostas CD8+ anti-virais, de uma forma tolerogénica.

Composição farmacêutica A presente requerente prevê que, apesar da "supressão próxima" poderá ser necessário visar vários clones diferentes de células T, para induzir eficazmente a tolerância. Deste modo, pode ser administrada uma pluralidade de péptidos a um indivíduo, para prevenir ou tratar uma doença.

Num segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para tratar/prevenir esclerose múltipla, compreendendo uma pluralidade de apitopos, em que, pelo menos, um dos péptidos é o péptido de MBP 83-89 ou o péptido MBP 131-145. A composição farmacêutica pode, por exemplo, compreender entre 2 e 50 apitopos, de um modo preferido, entre 2 e 15 apitopos. Os apitopos podem ser derivados do(s) mesmo(s) antigénio(s) alvo ou diferente (s) . de um modo preferido ou são todos capazes de se ligar a MHC de classe I, ou são todos capazes de se ligar a MHC de classe II, sem processamento adicional. Numa forma de realização preferida todos os apitopos 24 na composição farmacêutica são capazes de se ligar a MHC de classe I ou classe II sem processamento adicional. A composição farmacêutica pode estar sob a forma de um kit, no qual, alguns ou cada um dos apitopos são proporcionados separadamente, para administração simultânea, separada ou sequencial.

Alternativamente (ou adicionalmente) se a composição farmacêutica (ou qualquer das suas partes) é para ser administrada em doses múltiplas, cada dose pode ser embalada separadamente. A composição farmacêutica pode compreender uma quantidade terapeuticamente ou profilacticamente eficaz do, ou de cada, apitopo e, opcionalmente, um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Do mesmo modo, nas composições farmacêuticas da presente invenção o, ou cada apitopo, pode ser misturado com qual(quais)quer ligante(s), lubrificante (s), agente (s) de suspensão, agente (s) de revestimento ou agente (s) solubilizante (s) adequado(s).

Administração 0 péptido deve ser administrado sob a forma solúvel, na ausência do adjuvante.

De um modo preferido, o péptido é administrado por uma via mucosal. 25

Estudos demonstraram que o péptido, quando administrado intraperitonealmente (i. p.), intravenosamente (i. v.) ou intranasalmente (i. n.) ou oralmente, sob uma forma solúvel, pode induzir a tolerância das células T (Anderton e Wraith (1998), como acima; Liu e Wraith (1995), como acima; Metzler e Wraith (1999) Imunology 97:257-263).

De um modo preferido, o péptido é administrado intranasalmente.

Estudos em murganhos demonstraram que a duração da administração do péptido, necessária para induzir tolerância, depende da frequência do precursor das células T no destinatário (Burkhart et al. (1999), como acima). Foi demonstrado que são necessárias doses repetidas do péptido, em muitos estudos experimentais, para induzir tolerância (Burkhart et al. (1999), como acima) . A dose exacta e o número de doses do péptido irão, consequentemente, depender do indivíduo, no entanto, numa forma de realização preferida, são administradas várias doses.

Se forem administrados simultaneamente vários péptidos, estes podem estar sob a forma de um "cocktail", o qual é adequado para a administração em doses únicas ou múltiplas. Alternativamente, pode ser preferido administrar doses múltiplas, mas modificar as concentrações relativas dos péptidos, entre doses.

Numa forma de realização preferida, pode ser seguido um protocolo de "intensificação de dose", em que é administrada uma pluralidade de doses ao doente em concentrações ascendentes. Essa abordagem foi utilizada, por exemplo, para péptidos da fosfolipase A2, em aplicações imunoterapêuticas contra a alergia 26 ao veneno de abelha (Muller et al. (1998) J. Alergy Clin Immunol. 101:747-754 e Akdis et al. (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106) .

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes servem para ilustrar a presente invenção, mas não devem ser interpretados como uma sua limitação. A invenção em refere-se, particularmente, às formas de realização específicas, descritas nestes exemplos.

EXEMPLO 1 - Identificação de epitopos de células T em MBP

Materials e Métodos

Antigénios E preparada MBP humana, a partir da matéria branca cerebral, como descrito por Deibler et al. (Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2:139) e a sua pureza é avaliada por SDS-PAGE. São utilizados a MBP e o derivado proteico purificado (PPD) de Micobacterium tuberculosis (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey), em ensaios proliferativos, em concentrações óptimas determinadas anteriormente; a concentração óptima para cada antigénio é de 50 pg/mL. É sintetizado um painel de péptidos 15-meros sobrepostos, abrangendo a totalidade da molécula da MBP, utilizando química F-moc padrão num sintetizador de péptidos múltiplos Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Alemanha) . Cada péptido é deslocado em 5 aa e é sobreposto em 10 aa. Foram produzidos 33 péptidos que são 27 reunidos em grupos de 3 e os conjuntos são testados na concentração óptima de 50 pg/mL, de forma a que cada péptido esteja presente, in vitro, numa concentração de 16,6 pg/mL.

Doentes e indivíduos de controlo

Os indivíduos deste estudo consistem em 12 doentes com MS clinicamente definida ou definida por confirmação em laboratório (Poser et al.r 1983), com uma gama de idades de 29-51 anos. Oito dos 12 doentes estão envolvidos numa prova com interferão-β, de outra forma, todos outros doentes com MS não receberam qualquer tratamento com corticosteróide durante, pelo menos, 3 meses antes do início do estudo. O grupo de controlo consistiu em 13 indivíduos saudáveis com uma gama de idade de 25-55 anos e nenhum recebeu terapia imunorepressora durante, pelo menos, 3 meses antes de ser obtida a amostra de sangue.

Meio de cultura de tecidos É utilizado meio RPMI-1640 suplementado com HEPES 20 mM (Sigma, Poole, RU), penicilina (100 U/mL), sulfato de estreptomicina (100 mg/mL) e L-glutamina 4 mM (todos de Life Technologies, Paisley, Escócia), como o meio de cultura de tecidos. É utilizado meio isento de soro para lavar as células linfóides e TCL. O meio é suplementado com plasma autólogo, inactivado por calor, a 10%, para todas as condições de cultura e de ensaio. 28

Condições de cultura e ensaios proliferativos de células T É recolhido sangue periférico citrado (50-100 mL), por venopunctura, a partir de cada indivíduo, após ter sido obtido consentimento escrito informado. São isoladas células mononucleares do sangue periférico (PBMC), a partir de sangue, por centrifugação de densidade em Histopaque-1077 (Sigma, Poole, RU) e são cultivadas em volumes de 1,5 mL em placas de cultura de tecido de 24 poços (Nunc Internacional, Costar, Corning Inc. Nova Iorque, EUA) numa concentração de 1 χ 106 células por mL, contendo PPD, MBP ou péptidos de MBP. As placas são incubadas a 37 °C, numa atmosfera humedecida de C02 a 5%/ar a 95%. São recolhidas alíquotas de 100 pL em duplicado, a partir de cada cultura, entre os dias 5 e 14, são transferidas para uma placa de microtitulação de fundo redondo de 96 poços e pulsadas com 0,4 pCi de [3H]-Timidina (Amersham Internacional, Amersham, RU). Após 18 horas, as células são recolhidas para esteiras de fibra de vidro (LKB-Wallac, Turku, Finlândia), utilizando um Mach 111 harvester 96 (Tomtec, Nova Jérsei, EUA). A incorporação de [3H] — timidina é determinada, utilizando um contador de cintilação líquida Microbeta (LKB-Wallac). Os poços de teste contendo antigénio são considerados positivos quando õcpm > 1000 e o índice de Estímulo (SI) >3, em que SI = CPM da cultura contendo antigénio/CPM da cultura sem antigénio.

Produção de linhas de células T e clones de células T São produzidas linhas células τ (TCL) específicas para a MBP, a partir de 8 doentes com MS e 2 dadores saudáveis de controlo. São separadas PBMC a partir de cada indivíduo, como descrito acima e são plaqueadas em 1 χ 106 células/mL em placas 29 de 6 poços, na presença de MBP (50 pg/mL) ; é regularmente congelada e armazenada uma parte de PBMC de cada indivíduo, para re-estimulações subsequentes. Após sete dias, é fornecido meio fresco às células, contendo IL-2 a 2% (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, RU) e, no 12° dia da cultura, todas as células são re-estimuladas com antigénio, IL-2 e são irradiadas (2500 Rad) , com PBMC autólogas como uma fonte de células apresentadoras de antigénio (APC), numa proporção celular de 1 célula T:5 APC. As células são expandidas em IL-2 cada 3-4 dias e no 14° dia são re-estimuladas com antigénio, IL-2 e PBMC, como descrito acima. As células são examinadas para a proliferação específica para a MBP, no dia do primeiro re-estímulo.

Resumidamente, são cultivadas, em triplicado, 2 x 104 células T e 1 x 105 PBMC autólogas irradiadas, em placas de fundo redondo de 96 poços, na presença da MBP. As células são cultivadas durante 2 dias e são pulsadas com (3H)-Timidina em 0,4pCi/poço, durante as 18 últimas horas da cultura. As células são, então, recolhidas como descrito acima e uma TCL é considerada especifica para a MBP com um õcpm > 1000 e um SI > 3.

Após 3 ciclos de re-estímulação/expansão, as TCL são clonadas, utilizando PHA (Sigma, Poole, Dorset, RU), na presença de PBMC autólogas irradiadas como APC. As células T são plaqueadas sob condições de diluição limitante em 0,1 células/poço, 0,3 células/poço e 1 célula/poço e são cultivadas em placas de Terasaki (Nunc International, Costar) com 1 x 104 PBMC irradiadas, PHA 5 pg/mL e IL-2 a 2%. Após 10-12 dias, os poços com crescimento positivo são expandidos para placas de fundo redondo de 96 poços, utilizando 1 χ 105 PBMC irradiadas, PHA 5 pg/mL e IL-2. Após três dias é administrado

meio fresco aos poços contendo IL-2 e, no dia 7, os clones são expandidos para placas de 48 poços, utilizando 5 χ 105 PBMC 30 irradiadas, PHA e IL-2; neste ponto os clones são testados em ensaios de proliferação para respostas especificas para a MBP. Após uma semana, os clones específicos para a MBP são expandidos para placas de 24 poços, utilizando 1 x 106 PBMC irradiadas com PHA ou Dynabeads (Dynal, RU) e IL-2. Os clones são mantidos em placas de 24 poços, utilizando um ciclo de re-estímulo/expansão de 7-10 dias, essencialmente, como descrito acima. A capacidade dos clones de células T (TCC) para reconhecerem o painel de péptidos MBP é testada por ensaios de proliferação, como descrito acima.

Resultados

Reconhecimento dos péptidos MBP entre doentes com MS e indivíduos saudáveis A presente requerente utiliza um ensaio de resposta cinética, no qual são testadas PBMC de doentes com MS e indivíduos saudáveis, para a sua capacidade para responder a um painel de péptidos sintéticos 15-meros sobrepostos, abrangendo todo o comprimento da MBP humana. A resposta proliferativa das PBMC de cada cultura é examinada em 5 pontos temporais, ao longo de um periodo de 2 semanas e o perfil cinético da resposta a MBP e aos péptidos é comparado com a resposta ao PPD, representando, este último, uma resposta secundária/antigénio de memória. Não é encontrada qualquer diferença significativa na resposta das PBMC à MBP e/ou a péptidos entre doentes com Interferão-β e os sem qualquer tratamento (dados não apresentados). A resposta à MBP, tanto em doentes com MS, como em controlos saudáveis, atingiu o máximo mais tarde do que a resposta ao PPD, seguindo, deste modo, as caracteristicas cinéticas da resposta a um antigénio de 31 não-memória. A Figura 1 mostra um exemplo tipico do perfil cinético para PPD e MBP, em doentes com MS e indivíduos saudáveis.

Como mostrado na Figura 2, os dois péptidos mais frequentemente reconhecidos por doentes com MS têm 90-114 e 75-99 (6/12 doentes cada), seguidos pelas regiões 30-54, 135-159 e 150-170 (5/12 doentes) e 1-24 e 105-129 (4/12 doentes) . Três doentes respondem aos aa 15-39 e 120-144. Dois doentes reconhecem 45-69 e nenhum dos doentes com MS responde à região 60-84.

De acordo com a Figura 10, onde todos os doentes são positivos para HLA-DR2, os dois péptidos mais frequentemente reconhecidos por doentes com MS têm 90-114 e 75-99 (6/11 doentes cada), seguidos pelas regiões 120-144, 135-159 e 150-170 (5/11 doentes) e 1-24, 15-39, 30-54 e 105-129 (4/11 doentes). Três doentes respondem aos aa 45-69 e, novamente, nenhum dos doentes com MS responde à região 60-84.

Pelo contrário, os indivíduos saudáveis reconhecem, significativamente, menos péptidos, com, apenas, 2 indivíduos de controlo respondendo a mais de 2 péptidos (C e J; Figura 3) . Os indivíduos C e J, de controlo, são os únicos dois que reconhecem os aa 60-84, uma região não detectada por este grupo de doentes. De uma forma interessante, ambos os indivíduos expressam o alelo DRBl* 0701. As regiões 45-69 e 105-129 não são reconhecidas por qualquer um dos dadores saudáveis, enquanto que as 75-99 e 150-170 são reconhecidas por 4 indivíduos saudáveis; a 135-159 é reconhecida por três indivíduos saudáveis; as 1-24, 30-54, 60-84 e 120-144 são reconhecidas por dois indivíduos saudáveis; e as 15-39 e 90-114 são reconhecidas por um indivíduo. Globalmente, 32 8/13 indivíduos saudáveis não respondem a qualquer um dos péptidos sobrepostos, enquanto que apenas 1/12 doentes com MS (MS 19) são, consistentemente, incapazes de reconhecer os péptidos MBP. Significativamente, este doente é único por não responder à proteína MBP. A Figura 11 mostra, também, a resposta de indivíduos saudáveis a péptidos MBP. Neste estudo, apenas 1 indivíduo de controlo responde a mais de 2 péptidos (Nll). 0 Nll é, também, o único indivíduo que reconhece os aa 60-84, uma região não detectada por este grupo de doentes. As regiões 15-39, 45-69 e 105-129 não são reconhecidas por qualquer um dos dadores saudáveis, enquanto que as 120-144 e 135-159 são reconhecidas por dois indivíduos saudáveis; e as 1-24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-114 e 150-170 são reconhecidas por um indivíduo. Globalmente, 9/12 indivíduos saudáveis não respondem a qualquer um dos péptidos sobrepostos.

Globalmente, o dia em que a resposta à MBP e/ou aos péptidos atingiu o máximo não diferiu, significativamente, entre indivíduos saudáveis e doentes e a cinética em ambos os grupos foi semelhante à de uma resposta antigénica primária. Além disso, a magnitude da resposta a MBP e aos péptidos não diferiu entre doentes e indivíduos saudáveis.

Alteração do reconhecimento dos péptidos da MBP ao longo do tempo

Tendo sido estabelecido que os doentes com MS respondem a um largo espectro de péptidos de MBP, a presente requerente decidiu examinar se o reconhecimento pelas PBMC, nos mesmos 33 indivíduos, é focado e estável ao longo de, aproximadamente, 4-12 meses. Como mostrado nas Figuras 2, 10 e 3, nem os doentes com MS, nem os indivíduos saudáveis, apresentaram o mesmo padrão de reconhecimento dos péptidos. A Figura 4 representa um exemplo de um doente com MS (MS 49) que responde a vários péptidos, em 2 pontos temporais diferentes, mas em que o perfil de reconhecimento durante o segundo ponto temporal, medido após 4 meses, difere significativamente. Ou seja, no segundo ensaio cinético a resposta das PBMC aos aa 15-39, 30-54 e 150-170 persiste, no entanto, a resposta aos 75-99 e 105-129 regride e desloca-se para as regiões 90-114 e 135-159. A Figura 5 (MS 60) ilustra um exemplo de um doente, cuja resposta abrangente ao epitopo regrediu para uma resposta focada, ao longo do período de 4 meses. Os indivíduos saudáveis que são testados uma segunda vez, não conseguem responder a qualquer um dos péptidos (Figura 3).

Globalmente, os resultados demonstram que doentes com MS não apresentam padrões fixos de reconhecimento. Dentro de cada doente, a resposta das PBMC a vários péptidos pode persistir, regredir e deslocar-se para novas regiões de MBP, como observado no doente MS 49.

Ciclos de reconhecimento do péptidos

Quando a resposta das PBMC a péptidos é analisada em 3 ou mais pontos temporais diferentes, ao longo de um período de 12 meses, fica evidente que, em alguns doentes, o reconhecimento do 34 epitopo parece mais flutuar do que deslocar-se irreversivelmente para novas regiões dos péptidos. Por exemplo, como mostrado nas Figuras 2 e 10, o doente MS 60 apresenta um padrão de ciclos do reconhecimento dos aa 120-144 e 135-159; ou seja, os resíduos 120-144 e 135-159 estão entre os vários reconhecidos no primeiro ponto temporal testado, a resposta a estas 2 regiões regride no segundo ponto temporal e, seguidamente, reaparece no terceiro ponto temporal, medida 4 meses mais tarde. O perfil cinético do doente MS 41 demonstra, de um modo semelhante, que o reconhecimento dos aa 135-159 flutua ao longo de vários pontos temporais (ver Figuras 2 e 10) .

Entre o grupo de controlo saudável (Figura 3), um indivíduo (M) apresenta uma resposta flutuante às regiões 75-99 e 135-159, um segundo indivíduo (F) reconhece a 75-99 em dois dos três pontos temporais analisados, enquanto que um terceiro indivíduo (D), apresenta uma resposta cíclica ao resíduo 15-39.

Mapeamento detalhado da resposta à MBP São produzidos TCC a partir de 8 doentes com MS e 2 indivíduos saudáveis e utilizados para esclarecer a especificidade fina das regiões peptídicas identificadas no ensaio de resposta cinética. A especificidade de cada TCC é testada pela sua resposta proliferativa em relação ao painel de péptidos 15-meros. O clone SD:A7 reconheceu a região 1-24 e, dentro desta região, este TCC respondeu aos aa 5-19. A região 30-54 é reconhecida por 4 clones (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) e o epitopo dentro desta região é 30-44. Um clone (MS39:D7) de um doente com MS reconhece o péptido 60-74 e, de uma forma interessante, um indivíduo saudável responde a esta 35 região (60-84) no ensaio de resposta cinética dos requerentes. Cinco clones (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) reconhecem os aa 83-99, os quais são contidos na região 75-99. Um doente produziu um TCC especifico para os aa 110-124 (MS60:A2, MS60:B3), contidos dentro do conjunto 105-129 e outro TCC do mesmo doente, é específico para 130-144 (MS60:El), encontrado dentro da região 120-144. Cinco indivíduos produzem clones que reconhecem epitopos dentro da região 135-159: MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 e N5:19 reconhecem os aa 140-154; MS57:Al é específico para 140-149 e TCC MS17:A3 responde à sequência 130-144. Este painel de clones demonstra, claramente, a presença de, pelo menos, 2 epitopos de células T dentro da região 135-159 da MBP. Por fim, a região 150-170 é reconhecida por 2 clones específicos para os aa 156-169. A especificidade de todos os TCC é resumida na Figura 6.

EXEMPLO 2 - Identificação de apitopos na MBP

Materiais e métodos

Ensaio de apresentação de antigénio utilizando um APIPS A apresentação dos péptidos aos clones de células T é medida pela proliferação. As APC são fixas em paraformaldeído a 0,5% e plaqueadas a 1 x 105 células por poço numa placa de cultura de tecido de 96 poços. Os clones de células T são plaqueados a 2 x 104 células por poço, na presença de várias concentrações do péptido. Após incubação de 48 h, a 37 °C, a proliferação é medida pela incorporação de [3H]-timidina, ao longo de 16-20 h. Os resultados são comparados com a capacidade das células T responderem ao epitopo apresentado por APC vivas. 36 A apresentação dos péptidos a células T isoladas a partir do murganho transgénico DR2:MBP82-100 foi, essencialmente, como descrito acima, excepto por as APC terem sido plaqueadas a 5 x 105 células por poço, as células T terem sido plaqueadas a 1 x 105 células por poço e ter sido permitido que a incubação decorresse durante 72 h, antes da adição de [3h] -timidina.

Resultados

Nesta experiência, os péptidos que foram identificados como epitopos no exemplo anterior são examinados para a sua capacidade para serem apresentados, utilizando um APIPS. Os resultados são mostrados na Figura 7b. Dos cinco epitopos examinados até ao momento, quatro revelaram ser apitopos (30-44, 80-94, 110-124 e 130-144) e um revelou actuar como um epitopo, mas não como um apitopo (156-170).

Exemplo 2A - Investigação dos péptidos MBP 30-44, 110-124, 130-144 e 156-170

Para investigar se vários péptidos da MBP são apitopos, é investigada a sua capacidade para serem apresentados a células T por APC fixas. São pré-pulsadas células Mgar (HLA-DR2+ve), vivas ou pré-pulsadas, com o péptido em soro ou apenas soro, durante 3,5 horas. O excesso de péptido é, então, removido das células e é adicionado o clone de células T adequado. A resposta proliferativa das células τ é medida pela incorporação de 3H-timidina. 37

Como mostrado nas Figuras 8 e 9, os péptidos 30-44 (Fig. 8A), 110-124 (Fig. 8B) e 130-144 (Fig. 9A) podem ser apresentados por APC fixas, sem processamento adicional. Estes péptidos são, consequentemente, definidos como apitopos. Por outro lado, o péptido 156-170, requer processamento adicional, para apresentação a células τ (Fig. 9B) . As APC fixas são incapazes de apresentar este epitopo a células T, consequentemente, 156-170 não é um apitopo.

Exemplo 2B - Identificação de apitopos dentro das regiões 77-100 e 125-148 de MBP

Para qualquer determinado epitopo, pode existir um ou mais apitopos, capazes de serem apresentados a APC, sem processamento adicional. A presença de apitopos dentro de duas regiões da MBP é investigada, por incubação de células Mgar (HLA-DR2+ve), vivas ou fixas em p-formaldeido, com péptidos sobrepostos no soro das regiões 77-100 da MBP, (Figura 12) e 125-148 (Figura 13) ou com, apenas, soro. Foram adicionadas células T e, após 72 h (Figura 12) ou após 48 h (Figura 13), foi medida a resposta proliferativa a células T, pela incorporação de 3H-timidina. Para a MBP 77-100, as células T são isoladas de um murganho transgénico DR2:MBP 82-100, enquanto que, para a MBP 130-144, é utilizado o clone MS17:A3 de células T.

Para a região 77-100 da MBP, são definidos os péptidos seguintes como apitopos:

MBP 83-99 ENPWHFFKNIVTPRTP

MBP 80-94 TQDENPWHFFKNIV 38

ΜΒΡ 81-95 QDENPVVHFFKNIVT

ΜΒΡ 82-96 DENPWHFFKNIVTP ΜΒΡ 83-97 ENPWHFFKNIVTPR ΜΒΡ 84-98 MPWHFFKNIVTPRT A sequência mínima da MBP, reconhecida por células T de murganho transgénico DR2 MBP 82-100, é a região 85-94.

Para a região MBP 125-148, são definidos os péptidos seguintes como apitopos:

MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV

MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD

MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA

MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ A sequência mínima da MBP, reconhecida pelo clone MS17:A3 de células T, é a região 133-144.

Exemplo 2C - Investigação da região 89-101 da MBP A presente requerente mostrou anteriormente que, ao contrário de outros epitopos de células T para a mielina, a administração do péptido 89-101, sob a forma solúvel, não previne a encefalomielite auto-imune experimental murina (EAE), 39 induzida com mielina total ou com o próprio péptido 89-101 (Anderton e Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251).

A MBP 89-101 compreende três epitopos de células T

Para investigar a reactividade das células T à região 81-111 de MBP, células dos nódulos linfáticos de murganhos iniciadas com 81-111, são estimuladas com 81-111 in vitro e estas células são testadas com um painel de péptidos 10-meros sobrepostos, com dois deslocamentos de resíduos abrangendo a região 81-111 (nomeadamente: 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91- 100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 e 101-111). O padrão de resposta a péptidos abrangendo a 89-101 mostra capacidade estimuladora para 5 péptidos adjacentes (87-96 até 95-104 do terminal N), reflectindo a presença de, pelo menos, dois (e, possivelmente, três) epitopos distintos.

Para investigar, adicionalmente, esta região, são produzidas três sub-linhas a partir da linha de células T original, respondente a 81-111 e estas são novamente testadas com um painel de péptidos 10-meros sobrepostos, com um deslocamento de resíduos abrangendo a região 84-106. Os resultados revelam a existência de três epitopos de células T distintos, mas sobrepostos, dentro da sequência 89-101: 89-94, 92- 98 e 95-101 (ver Figura 14). O péptido 92-98 da MBP é um epitopo críptico

As três linhas células T (TCL) especificas para um epitopo, mostram diferenças interessantes, quando testadas para a 40 reactividade com o péptido 89-101 e com a MBP recombinante completa. A totalidade das três TCL respondem ao péptido (89-101) mas apenas as TCL específicas para 89-94 e 95-101 respondem à MBP completa. Isto indica que o processamento do antigénio da MBP intacta produz, de um modo preferido, ligandos de células τ que reconhecem 89-94 e 95-101, mas não os que reconhecem 92-98. Isto sugere que o epitopo 92-98 seja críptico (i. e., não pode ser produzido por processamento de antigénio nativo). Aparentemente, o péptido 89-101 da MBP pode participar em três interacções distintas com a molécula de mhc, resultando em ligandos péptido/MHC que são reconhecidos por três populações de células T distintas. No entanto, o processamento da MBP produz, apenas, ligandos para duas destas populações de células T (ver Fig. 14). A indução da EAE requer o reconhecimento de epitopos autoantigénicos, expressos no CNS, em consequência da degradação da MBP intacta, por células T. A imunização de murganhos com péptidos, compreendendo, apenas, um dos três epitopos de células T anteriormente identificados mostra que, apenas, os que contêm um epitopo processado naturalmente (89-94 ou 95-101) são capazes de induzir EAE. Isto suporta, adicionalmente, a verificação de que o 92-98 é um epitopo críptico.

O péptido 92-98 da MBP é o epitopo dominante da região 89-101 da MBP

Como referido acima, a região 89-101 contém três péptidos distintos, mas sobrepostos. Dentro destes, o péptido 92-98 parece ser dominante para esta região. Por exemplo, quando os clones de células T são produzidos a partir de murganhos 41 iniciados com o péptido 89-101, a totalidade dos seis clones que foram produzidos respondem ao 92-98. Foi verificado que a substituição de qualquer das posições 92-98 origina uma ausência de sensibilidade, utilizando análogos do péptido 89-101, contendo substituições individuais de alanina em cada posição, mostrando que a alteração de qualquer residuo dentro do núcleo 92-98 tem efeitos significativos sobre o reconhecimento deste epitopo. O péptido da MBP 89-101 não consegue tornar tolerantes células T relevantes para a EAE que reconhecem um epitopo MBP processado naturalmente.

Para sumariar as verificações acima, a presente requerente verificou que a) a sequência 89-101 tem potencial para produzir 3 epitopos de células T distintos; b) apenas dois destes epitopos (89-94 e 95-101) são produzidos pelo processamento do antigénio da MBP intacta (tanto in vitro, como in vivo); c) apenas os péptidos contendo os epitopos processados naturalmente e não os contendo um epitopo críptico, são eficazes na indução da EAE; d) o péptido 89-101 não consegue proteger contra EAE em experiências de terapia com péptidos.

Esta informação proporciona uma base para investigar a hipótese de o péptido 89-101 não conseguir tolerar contra a EAE, devido a uma deficiência para ligar, directamente, as células T relevantes para a doença. Para suportar a hipótese, o péptido (89-101) deve não conseguir induzir tolerância ao principal epitopo encefalitogénico (89-94), uma vez que este não se irá ligar, directamente, ao elemento de restrição do MHC (I-As) na 42 conformação adequada. Por outras palavras, o 89-101 não irá actuar como um apitopo para células T respondentes a 89-94.

Para testar esta possibilidade, são realizadas experiências de tolerância com os péptidos 89-101 e 87-96 (Fig. 15 A e B) . O péptido 87-96 contém o epitopo (89-94, o mais eficaz na indução da EAE. Métodos

Os murganhos receberam 200 pg do péptido em PBS ou apenas PBS apenas, intraperitonealmente, nos dias -8, -6 e -4, antes de 100 pg do péptido em adjuvante completo de Freund, no dia 0. Após 10 dias, as células dos nódulos linfáticos drenantes (6 x 105 por poço) foram cultivadas em meio X-Vivo 15, suplementado com 2-mercaptoetanol 5 x 10”5 M e L-glutamina 2 M, com ou sem antigénio, durante 72 horas. As culturas foram pulsadas durante as 16 horas finais, com 0,5 pCi de 3H-timidina e foi medida a incorporação utilizando um contador de cintilação liquida. Os resultados são expressos como contagens médias por minuto, para culturas em triplicado.

Resultados A iniciação com o 87-96 induziu uma forte resposta de memória a este mesmo e uma resposta mais fraca ao 89-101 (respectivamente, Fig. 15 A e B □ e o). Isto é consistente com a necessidade de processamento do antigénio, para produzir 89-94 a partir do 89-101. A utilização de 87-96 como um tolerogénio, antes de iniciação com 87-96, suprimiu as respostas de memória, 43 tanto ao 87-96 como ao 89-101 (Fig. 15 A e ·) . Isto está de acordo com células T reactivas ao 89-94, uma vez tornadas não-respondentes in vivo, não conseguindo responder in vitro ao 89-94, se estas forem produzidas, a partir de 89-96 ou 89-101. No entanto, de um modo muito importante, a utilização de 89-101 como tolerogénio, antes da iniciação com 87-96, não conseguiu inibir a respostas de memória, quer ao 87-96, quer ao 89-101 (Fig. 15 B A e ·). Estes dados demonstram que a administração do péptido 89-101 na forma tolerogénica não consegue tolerizar para o epitopo encefalitogénico, processado naturalmente, baseado na sequência 89-94: o péptido 89-101 não consegue comportar-se como um apitopo para o epitopo 89-94.

Sem pretender ser limitado pela teoria, a presente requerente acredita que as observações podem ser explicadas pela posição do péptido 89-101 no local de ligação ao péptido do MHC. Se o péptido se ligar, de um modo preferido, de forma a que a região 92-98 se situe na bolsa de ligação do péptido, então este será reconhecido por células T específicas para MBP92-98. Isto poderia explicar por que motivo todos os clones de células T produzidos reconhecem o epitopo MBP92-98, quando os murganhos são iniciados com o péptido MBP89-101. Do mesmo modo, quando é utilizado 89-101 para tornar tolerantes células T, este irá tornar tolerantes, principalmente, células que reconhecem o epitopo MBP92-98. Se MBP92-98 for um epitopo críptico, este não é produzido pelo processamento natural do antigénio completo e as células T que reconhecem este epitopo não estarão, provavelmente, presentes in vivo. Mesmo se estiverem presentes células T específicas para MBP92-98, in vivo, isto não seria relevante para a doença. Deste modo, 89-101 não consegue prevenir a EAE induzida com a MBP completa. 44

EXEMPLO 3 - Terapia peptídica para um modelo murino da MS A presente requerente mostrou, anteriormente, que uma dose única do antigénio peptídico, administrada sistemicamente, por via intraperitoneal (Liu e Wraith (1995) Int Immunol 8:1255-1263) ou intranasal (Metzler e Wraith (1993) 5:1159-1165) irá proteger, eficazmente, os murganhos da encefalomielite auto-imune experimental (EAE), durante até três meses (Metzler e Wraith (1999) Imunology 97:257-263). São necessárias, pelo menos, 5 doses de péptido para induzir tolerância no murganho transgénico tg4 (Burkhart et al. (1999) 11:1625-1634), expressando um receptor de células T, especifico para EAE (Liu et al. (1995) Immunity 3:407-415). Trabalho recente demonstrou que a via intranasal (IN) é mais segura do que a via intraperitoneal (IP) no murganho Tg4, embora ambas as abordagens sejam igualmente seguras no murganho não transgénico. O péptido 83-99 de MBP é testado no murganho transgénico Fug/D6, o qual expressa a molécula HLADR2 de MHC de classe II adequada e um TCR de um clone de células T humanas, específico para este péptido. Os murganhos são tratados com o péptido, após a dose padrão utilizada para o tratamento do murganho transgénico Tg4 (protocolo Tg4), ou o protocolo de dessensibilização da intensificação da dose de péptido, o qual foi utilizado no tratamento de doentes sofrendo de alergia (protocolo de dessensibilização).

Protocolo Tg4: São tratados grupos de murganhos por administração intranasal do péptido 83-99 (4 mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)) ou PBS, apenas, num volume total de 25 pL. 45

Os murganhos são tratados em cada Io e 5o dia da semana,

durante 5 semanas, originando um total de 10 doses. No inicio da semana 6, cada murganho é injectado com o péptido 83-99, em Adjuvante Completo de Freund (CFA) e recebe, também, uma injecção IP de Toxina Pertussis (200 ng) nos dias 1 e 3. . A progressão da EAE é monitorizada durante, pelo menos, 30 dias.

Protocolo de dessensibilização: São tratados grupos de murganhos por administração intranasal de uma dose intensificadora do péptido 83-99 ou pbs apenas, num volume total de 25 pL. A intensificação da dose inicia-se nas 0,1 pg e progride para 1, 3, 6, 12, 50 e, seguidamente, três vezes 100 pg. Os murganhos são tratados em cada Io e 5o dia da semana, durante 5 semanas, originando um total de 10 doses. No inicio da semana 6, cada murganho é injectado com o péptido 83-99, em Adjuvante Completo de Freund (CFA) e recebe, também, uma injecção IP de Toxina Pertussis (200 ng) nos dias 1 e 3. A progressão da EAE é monitorizada durante, pelo menos, 30 dias.

EXEMPLO 4 - Administração nasal de um cocktail de apitopo a doentes com MS É preparada uma vacina, compreendendo os péptidos 30-44, 83-99, 110-124 e 130-144 da MBP (i. e., alguns desses epitopos da MBP que foram identificados como apitopos). A vacina é administrada a trinta e cinco doentes num teste da Fase Ia/Ib. O teste é um teste de intersecção única, no qual os doentes permanecem não tratados durante três meses, seguindo-se uma dose única do péptido (Ia). Os doentes são, então, monitorizados durante três meses após a dose única da vacina, para avaliar a segurança. O tratamento consiste, então, na administração duas vezes por semana, por deposição intranasal. Para cada doente: a actividade clínica é analisada, mensalmente, por visualização por ressonância magnética; é monitorizada a actividade imunológica, utilizando um ensaio de resposta cinética para a proliferação; e a produção de citocina é monitorizada, utilizando elisa baseada em células. 0 teste envolve, inicialmente, o tratamento de 5 doentes sofrendo de doença progressiva crónica (CP). Estes doentes são seleccionados com base na baixa actividade em mri e são tratados, inicialmente, com a dose mais elevada de péptidos. 0 tratamento inicia-se no grupo dos doentes CP, uma vez que estes têm maior probabilidade de evidenciar qualquer possível efeito nocivo, como evidenciado por um aumento da actividade em mri . 0 tratamento de doentes com recaída e remissão inicia-se logo que seja evidente que o tratamento, com uma dose única e múltipla é seguro no grupo CP. É recrutado um grupo maior de 30 doentes com recaída e remissão, com base em sofrerem de lesões intensificadas em MRI, durante um período de monitorização de 3 meses. Estes são divididos em três grupos, a serem tratados com uma dose elevada, média ou baixa do péptido. 47 PONTOS TEMPORAIS (MESES) DOENTES PROGRESSIVOS CRÓNICOS (CP) DOENTES COM RECAÍDA E REMISSÃO (RR) 0 Início da monitorização mensal 3 Início da fase Ia (dose única de péptido) com MRI às 1-2 semanas após tratamento e monitorização mensal 6 Início da fase Ib (dose do péptido duas vezes por semana) e continuação da monitorização mensal Início da monitorização mensal e recrutamento de doentes com lesões a aumentar 9 Início da fase Ib (dose do péptido duas vezes por semana) e continuação da monitorização mensal 12 Fim do tratamento e continuação da monitorização mensal, durante 6 meses adicionais 15 Fim do tratamento e continuação da monitorização mensal, durante 6 meses adicionais

Abreviaturas: APC = células apresentadoras de antigénio; MHC = complexo de histocompatibilidade maior; TCR = receptor das células T; EAE = encefalomielite auto-imune experimental; APITOPO = epitopo independente do processamento do antigénio; APIPS = sistema de apresentação de antigénio independente do processamento; aa = aminoácido; MS = Esclerose múltipla; MBP = proteína básica da mielina; PLP = proteína proteolipídica; TCL = linha de células T; TCC = clone de células T; PBMC = células mononucleares do sangue periférico; PPD = derivado proteico purificado de Micobacterium tuberculosis; PHA = fito-hemaglutinina 48 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Universidade de Bristol

<120> MÉTODO DE SELECÇÃO DE PÉPTIDOS

<130> P9611WO LCH <140> PCT/GB01/03702 <141> 2001-08-17 <150> 0020618.5 <151> 2000-08-21 <150> 0114547.3 <151> 2001-06-14 <16 0> 11 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr 15 10 15

Pro 49 < 210 > 2

<211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens 50 < 4 Ο Ο > 5

Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai 15 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 8

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai Asp

1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT 51 <213> Homo sapiens <400> 9

Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai Asp Ala 15 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai Asp Ala Gin 1 5 10 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro 1 5 10

Lisboa, 30 de Novembro de 2010 52

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Péptido tolerogénico humano, capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II sem processamento adicional de antigénio, para utilização no tratamento e/ou na prevenção da esclerose múltipla, em que o péptido é seleccionado dos seguintes péptidos da proteína básica da mielina (MBP): 83-99 e 131-145.
2. 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla, que é MBP 83-99.
3. 3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla, que é MBP 131-145 .
4. 4. Composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla compreendendo um péptido de acordo com qualquer reivindicação anterior.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4 para utilização no tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla, compreendendo uma pluralidade de péptidos tolerogénicos de MPB humana.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 para utilização no tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla, compreendendo entre 2 e 15 péptidos tolerogénicos de MPB humana. 1 Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 6, para utilização no tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla, sob a forma de um kit, em que alguns ou cada um dos péptidos são proporcionados separadamente para administração simultânea, separada ou sequencial. Péptido ou composição farmacêutica de acordo com qualquer reivindicação anterior para utilização no tratamento e/ou prevenção da esclerose múltipla, para administração intranasal. Lisboa, 30 de Novembro de 2010