PT1731912E

PT1731912E - Método de seleção de péptidos

Info

Publication number: PT1731912E
Application number: PT60149010T
Authority: PT
Inventors: David Cameron Wraith; Heather Barbara Streeter; Stephen Mark Anderton; Graziella Mazza; Mary Ponsford
Original assignee: Apitope Technology Bristol Ltd
Priority date: 2000-08-21
Filing date: 2001-08-17
Publication date: 2013-12-17
Also published as: CY1111079T1; DE60134862D1; NO337988B1; WO2002016410A2; PH12013500208B1; PT1311542E; SI1731912T1; BRPI0113400B1; US20180311328A1; CN102764425A; ES2353347T3; PH12013500208A1; US20130156798A1; EP1731912A3; CA2420949C; DK1918298T3; US8961986B2; CN1469883A; SI1311542T1; CN102784385B

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE SELEÇÃO DE PÉPTIDOS" A presente invenção refere-se a um método para selecionar um péptido tolerogénico, péptido esse que pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença.

ANTECEDENTES

Numa resposta imunológica adaptativa, os linfócitos T são capazes de reconhecer epítopos internos de um antigénio proteico. As células apresentadoras de antigénio (APC) captam os antigénios proteicos e degradam-nos em fragmentos peptidicos curtos. Um péptido pode ligar-se a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I ou II dentro da célula e ser transportado para a superfície celular. Quando apresentado na superfície celular em conjunto com uma molécula de MHC, o péptido pode ser reconhecido por uma célula T (através do recetor de células T (TCR) ) , em cujo caso o péptido é um epítopo de células T.

Os epítopos de células T desempenham um papel central na resposta imunológica adaptativa a qualquer antigénio, seja do próprio ou estranho. 0 papel central desempenhado pelos epítopos de células T em doenças de hipersensibilidade (as quais incluem alergia, doenças autoimunes e rejeição de transplante) foi demonstrado através da utilização de modelos experimentais. É possível induzir doenças inflamatórias ou alérgicas por injeção de péptidos sintéticos (com base na estrutura de epítopos de células T) em associação com adjuvante. 2

Em contraste, foi demonstrado que é possível induzir tolerância imunológica a epítopos peptídicos particulares através da administração de epítopos peptídicos na forma solúvel. Foi demonstrado que a administração de antigénios peptídicos solúveis é um meio eficaz para inibir a doença na encefalomielite autoimune experimental (EAE - um modelo para a esclerose múltipla (MS)) (Metzler e Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu e Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton e Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); e em modelos experimentais de artrite, diabetes e uveoretinite (revisto em Anderton e Wraith (1998) como acima). Esta foi também demonstrada como um meio de tratamento de uma doença em curso na EAE (Anderton e Wraith (1998) como acima). A utilização de péptidos tolerogénicos para tratar ou prevenir uma doença tem atraído atenção considerável. Uma razão para tal é que foi demonstrado que certos epítopos tolerogénicos podem regular negativamente as respostas de células T para antigénios distintos dentro do mesmo tecido. Este fenómeno, conhecido como "supressão próxima" significa que deve ser possível induzir tolerância a mais do que um epítopo (preferencialmente, todos os epítopos) dentro de um determinado antigénio, e a mais do que um antigénio para uma dada doença, utilizando um péptido tolerogénico particular (Anderton e Wraith (1998) como acima). Isto obviaria a necessidade de identificar todos os antigénios patogénicos dentro de uma doença particular.

Os péptidos são também uma opção favorável para terapia devido ao seu custo relativamente baixo e ao facto de poderem ser produzidos análogos de péptidos com propriedades imunológicas alteradas. Deste modo, os péptidos podem ser modificados para alterar as suas interações com o MHC ou TCR. 3

Um possível problema com esta abordagem é que foi demonstrado que nem todos os péptidos que atuam como epítopos de células T são capazes de induzir tolerância. 0 péptido 89-101 da proteína básica de mielina (MBP) é um antigénio imunodominante após imunização e é também um imunogénio muito eficaz tanto em termos de preparação para a reatividade de células T como de indução de EAE. No entanto, foi demonstrado que este péptido é ineficaz para induzir tolerância quando administrado em solução (Anderton e Wraith (1998), como acima).

Foi proposto um número de explicações para a hierarquia observada na aptidão dos epítopos de células T para induzir tolerância (revistas em Anderton e Wraith (1998) como acima) . Em particular, foi proposto que existe uma correlação entre a afinidade do péptido para o MHC e a tolerogenicidade (Liu e Wraith (1995) como acima), mas isto não é concordante com algumas observações. Por exemplo, o MBP [89-101], o qual não é tolerogénico, liga-se a I-As com afinidade relativamente alta. Assim, não é fácil de prever que péptidos induzirão a tolerância.

Wicker et al. (1996) J. Clin. Invest. 98: 2597-2603, divulgam um método para identificar epítopos peptídicos de ligação a classe II de antigénios relacionados com doença autoimune no desenvolvimento de terapia de modulação imune específica para o antigénio.

Fairchild et al. (1996), International Immunity, 8: 1035-1043, descrevem a utilização de um sistema de apresentação de antigénio isento de processamento para investigar o efeito do aumento do comprimento do péptido para além do epítopo de células T mínimo. 4

Se houvesse uma explicação racional por que é que apenas uma proporção dos epítopos peptídicos são capazes de induzir tolerância, isto facilitaria a seleção de péptidos toleroqénicos úteis no tratamento e prevenção de distúrbios de hipersensibilidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os atuais inventores demonstraram que se um epitopo peptidico é de um tamanho apropriado para ser apresentado por APC imaturas sem processamento de antigénio, ele pode induzir tolerância imunológica. Portanto, a observação de que alguns epitopos de células T são tolerogénicos e outros são incapazes de induzir tolerância pode ser explicada pelo facto de alguns epitopos requererem processamento adicional antes de poderem ser apresentados por uma molécula de MHC. Estes epitopos que requerem processamento adicional não induzem tolerância quando administrados numa forma solúvel, apesar da sua capacidade para induzir doença quando injetados em associação com adjuvante.

Os epitopos que não requerem processamento adicional são capazes de induzir tolerância e foram designados "apitopos" (epíTOPOS Independentes de Processamento de Antigénio) pelos inventores.

Esta constatação proporciona um método baseado em regras para a seleção de epitopos de células T tolerogénicos que obviam a necessidade de examinar a capacidade tolerogénica de um péptido in vivo. Isto é particularmente vantajoso no desenvolvimento de estratégias para tratar ou prevenir doenças para as quais não estão disponíveis quaisquer modelos animais. Mesmo para doenças que têm um modelo animal, o método de seleção deve tornar o desenvolvimento de composições indutoras de tolerância mais simples e 5 seguro, porque proporciona um mecanismo pelo qual pode ser testada a capacidade de indução de tolerância de um péptido em células T humanas (reconhecimento do antigénio em conjunto com moléculas de MHC humanas) in vitro, antes da sua utilização in vivo.

Por conseguinte, num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona um método in vitro para selecionar um péptido que é útil na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio de hipersensibilidade mediado por células T que reconhecem o antigénio alvo, o qual compreende os seguintes passos: (i) tratar um sistema de apresentação de antigénio isento de processamento com uma multiplicidade de péptidos, compreendendo, cada, um epitopo de células T do antigénio alvo; (ii) analisar a ligação dos péptidos a moléculas de MHC de classe I ou II no sistema, adicionando células T e medindo a ativação das células T; (iii) identificar um péptido que é capaz de ligar uma molécula de MHC de classe I ou II no sistema de apresentação isento de processamento e ser apresentado a uma célula T como sendo um péptido capaz de induzir tolerância ao antigénio alvo in vivo quando administrado a um individuo, o qual é útil na prevenção e/ou tratamento do distúrbio de hipersensibilidade; e (iv) selecionar um péptido que é identificado como sendo capaz de ligar um molécula de MHC de classe I ou II no sistema de apresentação isento de processamento e ser apresentado a uma célula T no passo (iii) .

Numa forma de realização preferida, o método compreende o passo de investigar se o péptido é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe II no sistema de apresentação isento de processamento e ser apresentado a uma célula T. 6 0 péptido selecionado pelo método da invenção pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença. Em particular, o péptido pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença que é mediada por células T autorreativas. As reações de hipersensibilidade são particularmente adequadas para tratamento/prevenção utilizando o péptido da presente invenção, por exemplo, alergia, autoimunidade e rejeição de transplante.

Os atuais inventores já identificaram um número de apitopos para a proteína básica de mielina, a qual é um autoantigénio na esclerose múltipla. Por conseguinte, numa forma de realização especialmente preferida, os péptidos selecionados pelo método da presente invenção são úteis no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla.

Sabe-se que alguns péptidos são capazes de induzir tolerância a outros epítopos do mesmo antigénio e até mesmo a outros epítopos de um antigénio distinto (pelo fenómeno conhecido como supressão próxima). No entanto, os atuais inventores preveem que para suprimir adequadamente todas as células T autorreativas, seria vantajoso administrar ao doente uma associação de vários apitopos para tratar/prevenir uma doença particular. Assim, pode utilizar-se uma multiplicidade de péptidos numa composição farmacêutica, baseando-se cada péptido num epítopo de células T.

Um péptido selecionado pelo método da presente invenção pode ser utilizado num método de tratamento e/ou prevenção de uma doença num indivíduo.

Uma estratégia geral para tratar e/ou prevenir uma doença num indivíduo pode compreender os seguintes passos: (i) identificar um antigénio para a doença 7 (ii) identificar um apitopo para o antigénio; e (iii) administrar o apitopo ao indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra um exemplo típico do perfil cinético para o derivado proteico purificado (PPD) de Mycobacterium tuberculosis e MBP em doentes com Esclerose Múltipla (MS) e indivíduos saudáveis. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) isoladas de um doente com MS (A) e indivíduo normal (B) são testadas quanto à sua aptidão para proliferar na presença de PPD e MBP inteira; o perfil cinético da resposta proliferativa à MBP é comparado com o do antigénio secundário PPD. A Figura 2 é um quadro que resume as respostas das PBMC à MBP e seus péptidos em doentes com MS. Certos indivíduos são analisados em três pontos no tempo separados, com um período de aproximadamente 4 a 7 meses entre cada ponto no tempo. A Figura 3 é um quadro que resume as respostas das PBMC à MBP e péptidos de MBP em indivíduos saudáveis. Decorreram entre 4 e 7 meses entre cada ponto no tempo. A Figura 4 mostra um exemplo de um doente com MS (MS 4 9) que responde a péptidos múltiplos em 2 pontos no tempo diferentes, mas para o qual o perfil de reconhecimento durante o sequndo ponto no tempo, medido 4 meses mais tarde, difere significativamente. As PBMC foram cultivadas na presença de MBP e de um painel de péptidos que varre a totalidade da MBP, e a proliferação foi medida pela captação de 3H-timidina. A extensa resposta proliferativa de células T observada no primeiro ponto no tempo foi 8 significativamente diferente da resposta medida 7 meses mais tarde (segundo ponto no tempo). A Figura 5 mostra um exemplo de um doente cuja resposta ao epitopo extensa (primeiro ponto no tempo) regride (segundo ponto no tempo) e reaparece ao longo de um período de doze meses (terceiro ponto no tempo). A Figura 6 mostra um mapa da especificidade detalhada das regiões do péptido identificadas no ensaio de resposta cinética que é obtido através da utilização de TCC gerados de doentes com MS e indivíduos saudáveis. A maioria dos péptidos utilizados nos ensaios de rastreio são 15-meros em comprimento, contudo, alguns são 10-meros e 1 péptido é 17-mero. A especificidade de cada TCC é testada pelo menos duas vezes. A Figura 7a é um quadro que mostra a caracterização de epítopos de células T na proteína básica de mielina, reconhecidos por linfócitos T de doentes com MS. A Figura 7b é um quadro que mostra que todos os epítopos de células T não são necessariamente apresentados por APC fixas e, por conseguinte, não são apítopos.

As Figuras 8 e 9 mostram a apresentação de vários péptidos de MBP a clones de células T por APC vivas e fixas. Fig. 8A- 30-44, Fig. 8B - 110-124, Fig. 9A-130-144, Fig. 9B -156-170. A Figura 10 é um quadro que mostra os valores do índice de Estimulação (SI) máxima para a MBP e os péptidos de MBP em doentes com MS, obtidos em três pontos no tempo separados. As amostras para o segundo ponto no tempo foram recolhidas 4-8 meses após o Io ponto no tempo e as amostras para o 3o 9 ponto no tempo foram obtidas 3-5 meses após o segundo ponto no tempo. Foi medida a cpm de fundo para cada dia e variou entre 80-700 cpm; uma resposta positiva (a negrito) foi definida de acordo com SI>3 e õcpm>1000. (Não foi possível recolher amostras para todos os três pontos no tempo dos doentes MS 19 e MS 67). A Figura 11 é um quadro que mostra os valores do índice de Estimulação (SI) máxima para a MBP e os péptidos de MBP em indivíduos saudáveis. Foi mediada a cpm de fundo para cada dia e variou entre 80-700 cpm; uma resposta positiva (a negrito) foi definida de acordo com SI>3 e dcpm> 1000. A Figura 12 mostra a resposta de células T isoladas de um rato transgénico DR2:MBP82-100 à apresentação de péptidos de MBP contidos na região 77-100 pelas APC. A Figura 13 mostra a resposta do clone de células T MS 17:A3 à apresentação de péptidos de MBP contidos na região 125-148 pelas APC. A Figura 14 é uma ilustração do reconhecimento do epítopo de células T na sequência 89-101 da MBP. Existem três epitopos de células T, distintos mas sobrepostos, nas sequências: 89-94, 92-98 e 95-101. É mostrado o potencial de dissociação entre os resíduos 94 e 95 pela ação da asparginil-endoepetidase (AEP). A Figura 15 mostra a capacidade dos péptidos de MBP 87-96 (A) e 89-101 (B) para atuar como um apítopo para células T que respondem ao epítopo 89-94. 10

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para selecionar um péptido tolerogénico.

Tolerância

Como aqui utilizado, o termo "tolerogénico" significa capaz de induzir tolerância. A tolerância é a incapacidade de responder a um antigénio. A tolerância aos antigénios próprios é uma caracteristica essencial do sistema imunitário e, quando esta é perdida, pode resultar em doença autoimune. O sistema imunitário adaptativo deve manter a capacidade para responder a uma variedade muito grande de agentes infecciosos, evitando ao mesmo tempo o ataque autoimune dos antigénios próprios contidos nos seus próprios tecidos. Isto é controlado, em grande medida, pela sensibilidade de linfócitos T imaturos à morte celular apoptótica no timo (tolerância central). No entanto, nem todos os antigénios próprios são detetados no timo, pelo que a morte de timócitos autorreativos permanece incompleta. Assim, existem também mecanismos através dos quais pode ser adquirida tolerância pelos linfócitos T autorreativos maduros nos tecidos periféricos (tolerância periférica). Uma revisão dos mecanismos de tolerância central e periférica é proporcionada em Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169:123-137). A tolerância pode resultar ou ser caracterizada pela indução de anergia em pelo menos uma porção de células T CD4+. A fim de ativar uma célula T, um péptido tem de se associar com uma APC "profissional" capaz de fornecer dois sinais às células T. O primeiro sinal (sinal 1) é fornecido pelo complexo MHC-péptido na superfície celular da APC e é 11 recebido pela célula T através do TCR. 0 segundo sinal (sinal 2) é fornecido por moléculas coestimuladoras na superfície da APC, tais como CD80 e CD86, e recebido pela CD28 na superfície das células T. Julga-se que, quando uma célula T recebe o sinal 1 na ausência do sinal 2, ela não é ativada e torna-se, de facto, anérgica. As células T anérgicas são refratárias ao desafio antigénico subsequente e podem ser capazes de suprimir outras respostas imunológicas. Julga-se que as células T anérgicas estão envolvidas na mediação da tolerância das células T.

Sem pretender ficar limitado pela teoria, os atuais inventores preveem que os péptidos que requerem processamento, antes de poderem ser apresentados em conjunto com as moléculas de MHC, não induzem tolerância porque têm de ser manuseados pelas células apresentadoras de antigénio maduras. As células apresentadoras de antigénio maduras (tais como macrófagos, células B e células dendríticas) são capazes de processar o antigénio, mas também de fornecer ambos os sinais, 1 e 2, a uma célula T, conduzindo à ativação das células T. Por outro lado, os apítopos serão capazes de se ligarem à MHC de classe II nas APC imaturas. Assim, eles serão apresentados às células T sem coestimulação, levando à anergia e tolerância das células T.

Evidentemente, os apítopos são também capazes de se ligarem a moléculas de MHC na superfície celular de APC maduras. No entanto, o sistema imunitário contém uma maior abundância de APC imaturas do que maduras (foi sugerido que são ativadas menos de 10% das células dendríticas, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). A posição por defeito em relação a um apítopo será, por conseguinte, de anergia/tolerância, em vez de ativação. 12

Foi demonstrado que, quando a tolerância é induzida pela inalação de péptidos, a capacidade das células T CD4+ especificas para um antigénio para proliferar é reduzida. De igual modo, a produção de IL-2, IFN-γ e a produção de IL-4 por estas células está regulada negativamente, mas a produção de IL-10 está aumentada. Foi demonstrado que a neutralização de IL-10 em ratos num estado de tolerância induzida por péptidos restabelece completamente a suscetibilidade à doença. Foi proposto que permanece uma população de células reguladoras no estado tolerante, as quais produzem IL-10 e medeiam a regulação imune (Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).

Portanto, a indução de tolerância pode ser seguida por várias técnicas incluindo: (a) suscetibilidade reduzida para contrair a doença para a qual o péptido é um epítopo alvo in vivo; (b) a indução de anergia em células T CD4+ (a qual pode ser detetada por desafio subsequente com antigénio in vitro); (c) alterações na população de células T CD4+, incluindo (i) redução da proliferação; (ii) regulação negativa da produção de IL-2, IFN-γ e IL-4; e (iii) aumento da produção de IL-10.

Epítopos Independentes do Processamento de Antigénio (APÍ TOPOS) 0 método da presente invenção compreende o passo de selecionar um péptido que é capaz de se ligar a uma Proteína de MHC de classe I ou II sem processamento adicional. Esses péptidos são aqui conhecidos como "apítopos" (EpíTOPOS Independentes do Processamento de Antigénio) . 13 A apresentação na superfície celular de péptidos derivados de um dado antigénio não é aleatória e tende a ser dominada por um pequeno número de epítopos de ocorrência frequente. 0 predomínio de um péptido particular dependerá de muitos fatores, tais como a afinidade relativa de ligação à molécula de MHC, o ponto espácio-temporal de geração dentro da APC e a resistência à degradação. A hierarquia de epítopos para um antigénio pode mudar com a progressão de uma resposta imunológica, o que tem implicações importantes para a auto-tolerância e autoimunidade. As regiões determinantes imunodominantes são provavelmente bons tolerogénios. Assim, numa forma de realização preferida, o apítopo da presente invenção baseia-se num epítopo dominante.

No entanto, após uma resposta imunológica primária aos péptidos imunodominantes pode ocorrer a "disseminação" do epítopo para determinantes subdominantes (Lehmann et al (1992) Nature 358:155-157). A apresentação de epítopos subdominantes pode ser importante no desencadear da autoimunidade. Consequentemente, o apítopo da presente invenção pode basear-se num epítopo subdominante.

Podem existir também epítopos crípticos para qualquer determinado antigénio. Os epítopos crípticos são aqueles que podem estimular uma resposta de células T quando administrados como um péptido mas que são incapazes de produzir essa resposta quando administrados como um antigénio inteiro. Pode ser que o epítopo críptico seja destruído durante o processamento do antigénio em péptidos nas APC. Os atuais inventores mostraram que o péptido 92-98 é um epítopo críptico para a MBP (Exemplo 2C) . Curiosamente, existe um sítio de dissociação putativo para a asparaginil-endopeptidase nesta região do péptido, o que 14 pode significar que durante o processamento natural não são gerados quaisquer péptidos contendo esta região pelas APC.

Um epitopo criptico pode atuar como um apítopo in vitro, na medida em que pode ser capaz de ligar-se a um molécula de MHC sem processamento adicional e induzir anergia numa célula T que reconheça o epitopo criptico. No entanto, seria improvável que esse apítopo fosse terapeuticamente útil, porque deveria ser incapaz de tornar tolerantes as células T que reconhecem um epitopo do antigénio processado naturalmente.

Os epítopos para um antigénio podem ser identificados medindo a resposta de células T a péptidos sobrepostos que abrangem o antigénio inteiro (ver abaixo) quando apresentados pelas APC. Estes estudos resultam geralmente em "conjuntos internos" de péptidos e o epitopo mínimo para uma linha/clone de células T particular pode ser avaliado medindo a resposta a péptidos truncados. Não se pode assumir que um epitopo mínimo de um antigénio se comportará como um apítopo. Pode muito bem suceder que sejam necessários aminoácidos a flanquear o epitopo mínimo para ligação ótima ao MHC. 0 apítopo deve ser concebido de forma a cobrir a possibilidade de que possam existir diferenças subtis entre os epítopos mínimos de diferentes clones de células T.

Deve salientar-se que pode não ser possível identificar um apítopo para todos os epítopos. Existe evidência clara de que alguns epítopos ligam o MHC de uma maneira que é dependente da carga de MHC nos endossomas e, por este motivo, requerem processamento (Viner et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. 92:2214-2218). Esta é outra razão pela 15 qual não se pode assumir que cada epítopo mínimo se vá comportar inevitavelmente como um apítopo.

Identificação de péptidos contendo epitopos de células T

Existe um número de métodos conhecidos na técnica para identificar os epitopos de células T num dado antiqénio.

Os epitopos processados naturalmente podem ser identificados por análise espetrofotométrica de massa de péptidos eluídos a partir de APC carregadas com antigénio. Estas são APC que foram estimuladas a incorporar antigénio ou foram forçadas a produzir a proteína intracelularmente por transformação com o gene apropriado. Tipicamente, as APC são incubadas com a proteína em solução ou direcionadas adequadamente para a superfície celular das APC. Após incubação a 37°C, as células são sujeitas a lise em detergente e a proteína de classe II é purificada, por exemplo, por cromatografia de afinidade. 0 tratamento do MHC purificado com um meio químico adequado (por exemplo, condições ácidas) resulta na eluição de péptidos a partir do MHC. Este conjunto de péptidos é separado e o perfil comparado com o péptido de APC de controlo tratadas da mesma maneira. Os picos únicos para as células que expressam/fornecidas com proteína são analisados (por exemplo, por espetrometria de massa) e identificados os fragmentos peptídicos. Este procedimento produz, geralmente, informação sobre a gama de péptidos (geralmente encontrados em "conjuntos internos") gerada a partir de um antigénio particular pelo processamento de antigénio.

Outro método para identificar epitopos consiste no rastreio de uma biblioteca de péptidos sintéticos, os quais se sobrepõem e abrangem o comprimento do antigénio num ensaio in vitro. Por exemplo, podem ser utilizados péptidos que 16 têm 15 aminoácidos de comprimento e que se sobrepõem em 5 ou 10 aminoácidos. Os péptidos são testados num sistema de apresentação de antigénio que compreende células apresentadoras de antigénio e células T. Por exemplo, o sistema de apresentação de antigénio pode ser uma preparação de esplenócitos murídeos, uma preparação de células humanas da amígdala ou PBMC. Alternativamente, o sistema de apresentação de antigénio pode compreender uma linha/clone de células T particular e/ou um tipo particular de célula apresentadora de antigénio. A ativação das células T pode ser medida pela proliferação de células T (por exemplo, utilizando a incorporação de 3H-timidina) ou produção de citocina. Por exemplo, a ativação de células T CD4+ de tipo TH1 pode ser detetada pela produção de IFNy, o qual pode ser detetado por técnicas correntes, tal como um ensaio ELISPOT.

Os estudos de péptidos sobrepostos indicam geralmente a área do antigénio, na qual está localizado um epítopo. O epítopo mínimo para uma célula T particular pode ser depois avaliado medindo a resposta a péptidos truncados. Por exemplo, se é obtida uma resposta ao péptido compreendendo os resíduos 1-15 na biblioteca de sobreposição, podem ser utilizados conjuntos que estão truncados em ambas as extremidades (isto é, 1-14, 1-13, 1-12 etc. e 2-15, 3-15, 4-15 etc.) para identificar o epítopo mínimo.

Os atuais inventores preveem que a identificação das regiões imunodominantes de um antigénio utilizando ensaios in vitro (especialmente aqueles que utilizam linhas de células T) apresente um padrão distorcido de reatividade peptídica. No estudo de identificação de epítopos de MBP que é descrito nos exemplos, eles utilizam um ensaio de resposta cinética, no qual é medida a proliferação de PBMC 17 de doentes com MS e indivíduos saudáveis contra uma biblioteca de péptidos sobrepostos. Este ensaio baseia-se na constatação de que, embora as células T de indivíduos normais e doentes com MS respondam de uma maneira semelhante ao antigénio proteico purificado, elas respondem de uma maneira diferente a péptidos baseados na sequência de MBP. As células T de doentes com MS respondem com maior magnitude e com uma cinética mais rápida aos antigénios peptídicos quando comparadas com dadores saudáveis normais. Isto permite o rastreio e identificação do epítopo ao qual um doente particular responde num momento particular. No estudo aqui descrito, esta abordagem revelou um número de regiões contendo epítopos que não foram identificadas utilizando técnicas correntes. Além do mais, demonstra-se que o reconhecimento de células T exibe um padrão ciclico, que surge num ponto no tempo, regride e reaparece subsequentemente num momento posterior. 0 ensaio cinético descrito pelos inventores proporciona uma ferramenta valiosa, porque revela o epítopo ao qual um doente está a responder num momento particular. Esta informação pode ser utilizada para conceber uma abordagem terapêutica de administração de apítopo a um doente particular, identificando e administrando um apítopo para o epítopo relevante (se existir um) . Esta informação pode permitir também que seja esboçado um padrão geral para a progressão da doença, de maneira que a composição terapêutica possa ser concebida para incluir apítopos para os epítopos que estão provavelmente presentes numa determinada fase durante a doença.

Sistemas de Apresentação Independentes do Processamento de Antigénio (APIPS) 18

Uma vez identificado um epitopo, o passo seguinte consiste em investigar se ele também se comporta como um apitopo.

Um apitopo tem de ser apresentado às células T sem necessidade de processamento do antigénio. Uma vez identificados péptidos contendo epítopos de células T, os apitopos podem ser identificados utilizando um sistema isento de processamento. Os péptidos truncados e os análogos de péptidos podem ser testados em relação à ativação utilizando um sistema de apresentação independente de processamento de antigénio (APIPS).

Os exemplos de APIPS incluem: a) APC fixas (com ou sem anticorpos contra CD28); b) Membranas lipidicas contendo moléculas de MHC de Classe I ou II (com ou sem anticorpos contra CD28); e c) MHC natural ou recombinante purificado na forma ligada a placas (com ou sem anticorpos contra CD28). É conhecida a utilização de APC fixas para investigar as respostas de células T, por exemplo, em estudos para investigar o epitopo mínimo dentro de um polipéptido, medindo a resposta a péptidos truncados (Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8:1035-1043). As APC podem ser fixas utilizando, por exemplo, formaldeído (normalmente, paraformaldeído) ou glutaraldeído.

As membranas lipidicas (as quais podem ser membranas planares ou lipossomas) podem ser preparadas utilizando lípidos artificiais ou podem ser frações da membrana plasmática/microssómica de APC.

Na utilização, o APIPS pode ser aplicado aos poços de uma placa de cultura de tecidos. Em seguida são adicionados antigénios peptídicos e a ligação do péptido à porção MHC 19 do APIPS é detetada por adição de linhas ou clones de células T selecionadas. A ativação da linha ou clone de células T pode ser medida por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, através da incorporação de 3H-timidina ou secreção de citocina. Péptidos A presente invenção refere-se a um método in vitro para selecionar um péptido. 0 termo "péptido" é utilizado no sentido normal para significar uma série de residuos, tipicamente L-aminoácidos, ligados uns aos outros tipicamente através de ligações peptídicas entre os grupos α-amino e carboxilo de aminoácidos adjacentes. 0 termo inclui péptidos modificados e análogos de péptidos sintéticos.

Um péptido da presente invenção pode ter qualquer comprimento que seja capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II sem processamento adicional.

Os péptidos que se ligam a moléculas de MHC de classe I têm tipicamente 7 a 13, mais geralmente 8 a 10 aminoácidos de comprimento. A ligação do péptido é estabilizada nas suas duas extremidades através de contactos entre átomos na cadeia principal do péptido e sitios invariantes na reentrância de ligação ao péptido de todas as moléculas de MHC de classe I. Existem sitios invariantes em ambas as extremidades da reentrância que se ligam às extremidades amino e carboxilo do péptido. As variações no comprimento do péptido são acomodadas através de uma dobra na estrutura do péptido, frequentemente nos residuos de prolina ou glicina que permitem a flexibilidade necessária. 20

Os péptidos que se ligam a moléculas de MHC de classe II têm tipicamente entre 8 e 20 aminoácidos de comprimento, mais geralmente entre 10 e 17 aminoácidos de comprimento e podem ser muito mais longos. Estes péptidos permanecem numa conformação estendida ao longo da reentrância de ligação ao péptido do MHC II, a qual (ao contrário da reentrância de ligação ao péptido do MHC de classe I) é aberta em ambas as extremidades. O péptido é mantido no lugar principalmente por contactos de átomos da cadeia principal com resíduos conservados que contornam a reentrância de ligação ao péptido. 0 péptido selecionado pelo método da presente invenção pode ser preparado utilizando métodos químicos (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlim.). Por exemplo, os péptidos podem ser sintetizados por técnicas em fase sólida (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), dissociados da resina e purificados por cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (por exemplo, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principies, WH Freeman and Co, New York NY). Pode ser realizada síntese automatizada utilizando, por exemplo, o Sintetizador de Péptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer), de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

Alternativamente, o péptido pode ser preparado por meios recombinantes ou por dissociação a partir de um polipéptido mais comprido. Por exemplo, o péptido pode ser obtido por dissociação a partir do antigénio alvo. A composição de um péptido pode ser confirmada por análise ou sequenciação dos aminoácidos (por exemplo, o procedimento de degradação de Edman). 21

Numa forma de realização preferida o péptido pode ser derivado de um antigénio alvo. Um antigénio alvo é uma molécula (por exemplo, uma proteína ou glicoproteína) que é processada pelas APC e reconhecida pelas células T durante o curso da doença. Evidentemente, o antigénio alvo dependerá da doença alvo. Preferencialmente, o péptido pode ser derivado de um fragmento do antigénio que resulte do processamento natural do antigénio por uma APC.

Para fins práticos, existem várias outras características que o péptido deve apresentar. Por exemplo, o péptido deve ser solúvel numa concentração que permita a sua utilização in vivo. Preferencialmente, o péptido deve ser solúvel em concentrações de até 0,5 mg/mL, mais preferencialmente o péptido deve ser solúvel em concentrações de até 1 mg/mL, muito preferencialmente o péptido deve ser solúvel em concentrações de até 5 mg/mL.

Para administração intranasal, o volume máximo da dose que pode ser administrada utilizando os procedimentos atuais é de, aproximadamente, 200yL por narina. Se o péptido for solúvel a 1 mg/mL, um dose dupla em cada narina permite que sejam administrados 800yg ao doente. Não é habitual a administração de mais do que 5mg em qualquer dose individual. É também importante que o péptido seja suficientemente estável in vivo para ser terapeuticamente útil. Os atuais inventores determinaram que, in vivo, 30 minutos após a administração, a quantidade total de um péptido de ensaio cai para cerca de 50%, 4 horas após a administração, a quantidade cai para cerca de 30%, mas que após 5 dias o péptido é ainda detetável (a cerca de 5%) . A semivida do péptido in vivo deve ser pelo menos de 10 minutos, preferencialmente pelo menos 30 minutos, mais 22 preferencialmente pelo menos 4 horas, muito preferencialmente pelo menos 24 horas.

Os atuais inventores determinaram que após administração intranasal, a quantidade de péptido nos qânqlios linfáticos de drenagem atinge um máximo em cerca de 4 h após a administração, contudo o péptido é ainda detetável (em niveis de cerca de 5% do máximo) após 5 dias.

Preferencialmente, o péptido é suficientemente estável para estar presente numa concentração terapeuticamente ativa nos gânglios linfáticos de drenagem durante um tempo suficiente para exercer um efeito terapêutico. 0 péptido deve demonstrar também uma boa biodisponibilidade in vivo. 0 péptido deve manter uma conformação in vivo que permita que se ligue a uma molécula de MHC na superfície celular, sem impedimento devido.

Doenças alvo

Um péptido selecionado pelo método da presente invenção pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de uma doença. É provável que um apítopo para o MHC de classe II seja particularmente útil em doenças que são mediadas por respostas de células T CD4+. Por exemplo, doenças que são estabelecidas ou mantidas por uma resposta de células T CD4+ inapropriada ou excessiva. É provável que esse péptido seja particularmente útil no tratamento de distúrbios de hipersensibilidade. As reações de hipersensibilidade incluem: (i) alergias, resultantes de respostas inapropriadas a substâncias estranhas inócuas; 23 (ii) doenças autoimunes, resultantes de respostas contra antigénios do próprio tecido; e (iii) rejeição de enxerto, resultante de respostas a um transplante.

Os exemplos de alergias incluem, mas não se limitam a: febre dos fenos, asma extrínseca, alergias a picada e ferrão de insetos, alergias a alimentos e fármacos, rinite alérgica, asma brônquica bronquite crónica, sindrome anafilática, urticária, angioedema, dermatite atópica, dermatite alérgica de contacto, eritema nodoso, eritema multiforme, sindrome de Stevens-Johnson, rinoconjuntivite, conjuntivite, venulite necrosante cutânea, doença pulmonar inflamatória e doenças bolhosas da pele.

Os exemplos das doenças autoimunes incluem, mas não se limitam a: artrite reumatoide (RA), miastenia grave (MG), esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso disseminado (SLE), tiroidite autoimune (tiroidite de Hashimoto), doença de Graves, doença inflamatória do intestino, uveoretinite autoimune, polimiosite e certos tipos de diabetes, vasculite sistémica, polimiosite-dermatomiosite, esclerose sistémica (esclerodermia), sindrome de Sjogren, espondilite anquilosante e espondilartropatias relacionadas, febre reumática, pneumonite de hipersensibilidade, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumoconioses de poeiras inorgânicas, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune, distúrbios imunológicos das plaquetas, criopatias tais como criofibrinogenemia e autoimune poliendocrinopatias.

Uma variedade de tecidos são geralmente transplantados em medicina clinica, incluindo rim, figado, coração pulmão, pele, córnea e medula óssea. No presente, todos os enxertos, à exceção dos enxertos da córnea e alguns enxertos da medula óssea, requerem geralmente imunossupressão de longa duração.

Por exemplo, o péptido pode ser útil no tratamento e/ou prevenção da diabetes. Nesta forma de realização, o péptido pode ser derivado do antigénio alvo IA2.

Alternativamente, o péptido pode ser útil no tratamento e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS) . A Esclerose Múltipla (MS) é uma doença inflamatória crónica caracterizada por lesões desmielinizantes múltiplas disseminadas ao longo da matéria branca do SNC e que ocorre em vários sitios e momentos (McFarlin e McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 e 1246-1251). Julga-se que a MS é mediada por células T autorreativas. O péptido pode ser derivado de um dos autoantigénios, em particular da proteina básica de mielina (MBP) ou proteína proteolipídica (PLP). A MBP é provavelmente mais apropriada do que a PLP, já que a PLP é extremamente hidrófoba e os péptidos derivados da mesma tendem a aglutinarem-se. A MBP é imunogénica e os linfócitos T específicos para a MBP têm atividade encefalitogénica em animais (Segai et al. , 1994 J. Neuroimmunol. 51:7-19; Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol 42:187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 317:355-8). das regiões 30-54, 75-99, O péptido pode ser derivado de uma imunodominantes da MBP, nomeadamente: 1-24, 90-114, 105-129, 120-144, 135-159 e 150-170.

Os apítopos para o MHC de classe I podem ser utilizados, por exemplo, para modificar respostas CD8+ antivirais de uma maneira tolerogénica. 25

Composição farmacêutica

Os atuais inventores preveem que, apesar da "supressão próxima" pode ser necessário visar um número de clones de células T diferentes, para induzir eficazmente a tolerância. Assim, pode administrar-se uma multiplicidade de péptidos a um indivíduo para prevenir ou tratar uma doença.

Os péptidos selecionados por um método de acordo com a presente invenção podem ser utilizados numa composição farmacêutica compreendendo uma multiplicidade de apítopos.

Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender entre 2 e 50 apítopos, preferencialmente entre 2 e 15 apítopos. Os apítopos podem ser derivados de antigénio(s) alvo(s) iguais ou diferentes. Preferencialmente, os apítopos são todos capazes de se ligar a MHC de classe I ou são todos capazes de se ligar a MHC classe II, sem processamento adicional. Preferencialmente, todos os apítopos na composição farmacêutica são capazes de se ligar a MHC de classe I ou classe II, sem processamento adicional. A composição farmacêutica pode estar na forma de um kit, no qual alguns ou cada um dos apítopos são proporcionados separadamente para administração simultânea, separada ou sequencial.

Alternativamente (ou adicionalmente), se a composição farmacêutica (ou qualquer parte da mesma) é para ser administrada em doses múltiplas, cada dose pode ser embalada separadamente. 26 A composição farmacêutica pode compreender uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do, ou de cada, apitopo e, opcionalmente, um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Do mesmo modo, na composição farmacêutica o, ou cada, apitopo pode ser misturado com qualquer/quaisquer aglutinante(s), lubrificante (s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento ou solubilizante(s) adequado(s).

Administração 0 péptido deve ser administrado na forma solúvel, na ausência de adjuvante.

Preferencialmente, o péptido é administrado por uma via mucosal.

Estudos demonstraram que o péptido, quando administrado por via intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.) ou intranasal (i.n.) ou por via oral, numa forma solúvel, pode induzir a tolerância das células T (Anderton e Wraith (1998) como acima; Liu e Wraith (1995) como acima; Metzler e Wraith (1999) Immunology 97:257-263).

Preferencialmente, o péptido é administrado por via intranasal.

Estudos em ratos têm demonstraram que a duração de administração do péptido, necessária para induzir tolerância, depende da frequência do precursor de células T no destinatário (Burkhart et al (1999) como acima) . Em muitos estudos experimentais, foi demonstrado que são necessárias doses repetidas de péptido para induzir a tolerância (Burkhart et al (1999) como acima) . Por 27 conseguinte, a dose exata e número de doses de péptido dependerão do indivíduo, contudo, numa forma de realização preferida é administrada uma multiplicidade de doses.

Se for administrada simultaneamente uma multiplicidade de péptidos, estes podem estar na forma de um "cocktail," o qual é adequado para administração em doses únicas ou múltiplas. Alternativamente, pode ser preferido administrar doses múltiplas, mas variar as concentrações relativas dos péptidos entre doses.

Numa forma de realização preferida, pode ser seguido um protocolo de "intensificação de dose", no qual é administrada ao doente uma multiplicidade de doses em concentrações crescentes. Uma abordagem deste tipo tem sido utilizada, por exemplo, para péptidos de fosfolipase A2 em aplicações imunoterapêuticas contra a alergia ao veneno de abelha (Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 e Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106) .

EXEMPLOS descritas

Os exemplos seguintes servem para ilustrar a presente invenção, mas não devem ser interpretados como uma limitação da mesma. A invenção refere-se, em particular, às formas de realização específicas, descritas nestes exemplos. 28

EXEMPLO 1 - Identificação de epitopos de células T em MBP

Materiais e Métodos Antigénios A MBP humana é preparada a partir da matéria branca do cérebro como descrito por Deibler et al. (Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2:139) e a sua pureza é avaliada por SDS-PAGE. São utilizados a MBP e o derivado proteico purificado (PPD) de Mycobacterium tuberculosis (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) em ensaios proliferativos, em concentrações ótimas determinadas previamente; a concentração ótima para cada antigénio é de 50 yg/mL. É sintetizado um painel de péptidos 15-meros sobrepostos que abrangem toda a molécula de MBP utilizando quimica F-moc padrão num sintetizador de múltiplos péptidos Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Alemanha). Cada péptido está deslocado de 5 aa e sobreposto em 10 aa. Foram produzidos 33 péptidos que são combinados em grupos de 3 e os conjuntos são testados à concentração ótima de 50 yg/mL, de tal forma que cada péptido está presente in vitro a uma concentração de 16,6 yg/mL.

Doentes e indivíduos de controlo

Os indivíduos deste estudo consistem em 12 doentes com MS clinicamente evidente ou definida por confirmação laboratorial (Poser et al. , 1983), com uma gama de idades de 29-51 anos. Oito dos 12 doentes estão envolvidos num ensaio com interferão-β, fora disso todos os outros doentes com MS não receberam qualquer tratamento com corticosteróides durante pelo menos 3 meses antes do inicio do estudo. O grupo de controlo consistiu em 13 indivíduos 29 saudáveis com uma gama de idades de 25-55 anos e nenhum recebeu terapia imunossupressora durante pelo menos 3 meses antes de ser obtida a amostra de sangue.

Meio de cultura de tecidos É utilizado meio RPMI-1640 suplementado com HEPES 20mM (Sigma, Poole, UK) , penicilina (lOOU/mL), sulfato de estreptomicina (100 mg/mL) e L-glutamina 4 mM (todos de Life Technologies, Paisley, Escócia), como o meio de cultura de tecidos. É utilizado meio isento de soro para lavar as células linfoides e as TCL. O meio é suplementado com 10 % de plasma autólogo inativado termicamente, para todas as condições de cultura e ensaios.

Condições de cultura e ensaios proliferativos de células T É recolhido sangue periférico citrado (50-100 mL) de cada indivíduo por venipuntura, depois de ter sido obtido consentimento escrito informado. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) são isoladas a partir do sangue por centrifugação de densidade em Histopaque-1077 (Sigma, Poole, UK) e cultivadas em volumes de 1,5 mL em placas de cultura de tecidos de 24 poços (Nunc International, Costar, Corning Inc. New York, EUA) a uma concentração de lxlO6 células por mL, contendo PPD, MBP ou péptidos de MBP. As placas são incubadas a 37°C numa atmosfera humidificada de 5% de CC>2/95% de ar. Entre os dias 5 e 14, são retiradas aliquotas de 100 pL em duplicado de cada cultura, transferidas para uma placa microtítulo de 96 poços de fundo redondo e pulsadas com 0,4 pCi de [3H]-Timidina (Amersham International, Amersham, UK) . Após 18 horas, as células são colhidas para tapetes de fibra de vidro (LKB-Wallac, Turku, Finlândia) utilizando um Mach 111 harvester 30 96 (Tomtec, Orange, New Jersey, EUA) . A incorporação de [3H]-timidina é determinada utilizando um contador de cintilação liquida Microbeta (LKB-Wallac). Os poços de ensaio contendo antigénio são considerados positivos quando o õcpm >1000 e o índice de Estimulação (SI) >3, em que SI = CPM da cultura contendo antigénio/CPM da cultura sem antigénio.

Geração de linhas de células T e clones de células T São geradas linhas de células T (TCL) especificas para a MBP a partir de 8 doentes com MS e 2 dadores saudáveis de controlo. As PBMC de cada indivíduo são separadas como descrito acima e aplicadas a lxlO6 células/mL em placas de 6 poços na presença de MBP (50 yg/mL); uma porção das PBMC de cada indivíduo é regularmente congelada e conservada para re-estimulações subsequentes. Sete dias depois, as células são alimentadas com meio fresco contendo 2% de IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK) e no 12° dia de cultura todas as células são re-estimuladas com antigénio, IL-2 e PBMC autólogas irradiadas (2500 Rad) como uma fonte de células apresentadoras de antigénio (APC), numa proporção celular de 1 célula T:5 APC. As células são expandidas em IL-2 a cada 3-4 dias e no dia 14 são re- estimuladas com antigénio, IL-2 e PBMC, como descrito acima. No dia da primeira re-estimulação, as células são examinadas quanto à proliferação específica para a MBP. Resumidamente, 2xl04 células T e lxlO5 PBMC autólogas irradiadas são cultivadas em triplicado, em placas de 96 poços de fundo redondo, na presença de MBP. As células são cultivadas durante 2 dias e pulsadas com (3H)-Timidina a 0,4 yCi/poço durante as últimas 18 horas da cultura. As células são em seguida colhidas como descrito acima, e uma 31 TCL é considerada específica para a MBP com uma õcpm >1000 e um SI>3.

Após 3 ciclos de re-estimulação/expansão, as TCL são clonadas utilizando PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK) na presença de PBMC autólogas irradiadas como APC. As células T são aplicadas sob condições de diluição limitante a 0,1 células/poço, 0,3 células/poço e 1 célula/poço e cultivadas em placas de Terasaki (Nunc International, Costar) com lxlO4 PBMC irradiadas, 5pg/mL de PHA e 2% de IL-2. Após 10-12 dias, os poços com crescimento positivo são expandidos em placas de 96 poços de fundo redondo, utilizando lxlO5 PBMC irradiadas, 5pg/mL de PHA e IL-2. Três dias depois, os poços são alimentados com meio fresco contendo IL-2 e no dia 7 os clones são expandidos em placas de 48 poços utilizando 5xl05 PBMC irradiadas, PHA e IL-2; nesta altura os clones são testados em ensaios de proliferação em relação a respostas específicas para a MBP. Os clones específicos para MBP são expandidos uma semana depois, em placas de 24 poços, utilizando lxlO6 PBMC irradiadas com PHA ou Dynabeads (Dynal, UK) e IL-2. Os clones são mantidos em placas de 24 poços utilizando um ciclo de re-estimulação/expansão de 7-10 dias, essencialmente como descrito acima. A aptidão dos clones de células T (TCC) para reconhecerem o painel de péptidos de MBP é testada por ensaios de proliferação, como descrito acima.

Resultados

Reconhecimento de péptidos de MBP entre doentes com MS e indivíduos saudáveis

Os atuais inventores utilizam um ensaio de resposta cinética, no qual são testadas PBMC de doentes com MS e 32 indivíduos saudáveis quanto à sua aptidão para responder a um painel de péptidos sintéticos 15-meros sobrepostos, que abranqem a totalidade da MBP humana. A resposta proliferativa das PBMC de cada cultura é examinada em 5 pontos no tempo ao longo de um período de 2 semanas e o perfil cinético da resposta a MBP e aos péptidos é comparado com a resposta ao PPD, representando o último uma resposta secundária/antigénio de memória. Não é encontrada qualquer diferença significativa na resposta das PBMC à MBP e/ou aos péptidos entre doentes com Interferão-β e aqueles sem qualquer tratamento (dados não apresentados). A resposta a MBP tanto em doentes com MS como em controlos saudáveis subiu mais tarde do que a resposta ao PPD, seguindo, desse modo, as características cinéticas da resposta a um antigénio de não-memória. A Figura 1 mostra um exemplo típico do perfil cinético para o PPD e a MBP em doentes com MS e indivíduos saudáveis.

Como se mostra na Figura 2, os dois péptidos mais frequentemente reconhecidos por doentes com MS são 90-114 e 75-99 (6/12 doentes cada), seguidos das regiões 30-54, 135-159 e 150-170 (5/12 doentes), e 1-24 e 105-129 (4/12 doentes). Três doentes respondem aos aa 15-39 e 120-144. Dois doentes reconhecem a 45-69 e nenhum dos doentes com MS responde à região 60-84.

De acordo com a Figura 10, quando todos os doentes são positivos para HLA-DR2, os dois péptidos mais frequentemente reconhecidos por doentes com MS são 90-114 e 75-99 (6/11 doentes cada), seguidos das regiões 120-144, 135-159 e 150-170 (5/11 doentes), e 1-24, 15-39, 30-54 e 105-129 (4/11 doentes). Três doentes respondem aos aa 45-69 e, novamente, nenhum dos doentes com MS responde à região 60-84. 33

Em contraste, os indivíduos saudáveis reconhecem significativamente menos péptidos, com apenas 2 indivíduos de controlo a responderem a mais do que 2 péptidos (C e J; Figura 3) . Os indivíduos de controlo C e J são os únicos dois que reconhecem os aa 60-84, uma região não detetada por este grupo de doentes. Curiosamente, ambos os indivíduos expressam o alelo DRB1* 0701. As regiões 45-69 e 105-129 não são reconhecidas por qualquer um dos dadores saudáveis, enquanto que as 75-99 e 150-170 são reconhecidas por 4 indivíduos saudáveis; a 135-159 é reconhecida por três indivíduos saudáveis; as 1-24, 30-54, 60-84 e 120-144 são reconhecidas por dois indivíduos saudáveis; e as 15-39 e 90-114 são reconhecidas por um indivíduo. Globalmente, 8/13 indivíduos saudáveis não respondem a qualquer um dos péptidos sobrepostos, enquanto apenas 1/12 doentes com MS (MS 19) foi consistentemente incapaz de reconhecer os péptidos de MBP. Notavelmente, este doente é único por não responder à proteína MBP. A Figura 11 mostra também a resposta de indivíduos saudáveis a péptidos de MBP. Neste estudo, apenas 1 indivíduo de controlo responde a mais do que 2 péptidos (Nll). O Nll é também o único indivíduo que reconhece os aa 60-84, uma região não detetada por este grupo de doentes. As regiões 15-39, 45-69 e 105-129 não são reconhecidas por qualquer um dos dadores saudáveis, enquanto as 120-144 e 135-159 são reconhecidas por dois indivíduos saudáveis; e as 1-24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-114 e 150-170 são reconhecidas por um indivíduo. Globalmente, 9/12 indivíduos saudáveis não respondem a qualquer um dos péptidos sobrepostos.

Globalmente, o dia em que a resposta a MBP e/ou a péptidos atingiu o máximo não diferiu significativamente entre indivíduos saudáveis e doentes, e a cinética em ambos os 34 grupos foi semelhante à de uma resposta antigénica primária. Além disso, a intensidade da resposta a MBP e péptidos não diferiu entre doentes e indivíduos saudáveis.

Alteração do reconhecimento dos péptidos de MBP ao longo do tempo

Uma vez estabelecido que os doentes com MS respondem a um largo espetro de péptidos de MBP, os atuais inventores decidiram examinar se o reconhecimento pelas PBMC nos mesmos indivíduos é consistente e estável ao longo do curso de, aproximadamente, 4-12 meses. Como se mostra nas Figuras 2, 10 e 3, nem os doentes com MS nem os indivíduos saudáveis exibiram o mesmo padrão de reconhecimento de péptidos. A Figura 4 representa um exemplo de um doente com MS (MS 49) que responde a múltiplos péptidos em 2 pontos no tempo diferentes, mas o perfil de reconhecimento durante o segundo ponto no tempo, medido 4 meses depois, difere significativamente. Isto é, no segundo ensaio cinético, a resposta das PBMC aos aa 15-39, 30-54 e 150-170 permanece, contudo a resposta aos 75-99 e 105-129 regride e desloca-se para as regiões 90-114 e 135-159. A Figura 5 (MS 60) ilustra um exemplo de um doente cuja resposta ao epítopo extensa regrediu para uma resposta focada, ao longo do período de 4 meses. Os indivíduos saudáveis que são testados uma segunda vez, não conseguem responder a qualquer um dos péptidos (Figura 3).

Globalmente, os resultados demonstram que os doentes com MS não exibem padrões fixos de reconhecimento. Dentro de cada doente, a resposta das PBMC aos vários péptidos pode 35 permanecer, regredir e deslocar-se para novas regiões da MBP, como se observa para o doente MS 49.

Ciclos de reconhecimento de péptidos

Quando a resposta das PBMC a péptidos é analisada em 3 ou mais pontos no tempo diferentes, ao longo de um periodo de 12 meses, torna-se evidente que, em certos doentes, o reconhecimento de epitopos parece mais flutuar do que deslocar-se de modo irreversível para novas regiões do péptido. Por exemplo, como se mostra nas Figuras 2 e 10, o doente MS 60 exibe um padrão de ciclos de reconhecimento dos aa 120-144 e 135-159; isto é, os resíduos 120-144 e 135-159 estão entre os muitos reconhecidos no primeiro ponto no tempo testado, a resposta a estas 2 regiões regride no segundo ponto no tempo e, em seguida, reaparece no terceiro ponto no tempo medido 4 meses mais tarde. Analogamente, o perfil cinético do doente MS 41 demonstra que o reconhecimento dos aa 135-159 flutua ao longo dos vários pontos no tempo (ver Figuras 2 e 10).

Entre o grupo de controlo saudável (Figura 3), um individual (M) exibe uma resposta flutuante às regiões 75-99 e 135-159, um segundo indivíduo (F) reconhece a 75-99 em dois dos três pontos no tempo analisados, enquanto que um terceiro indivíduo (D) exibe uma resposta cíclica ao resíduo 15-39.

Mapeamento detalhado da resposta a MBP São gerados TCC a partir de 8 doentes com MS e 2 indivíduos saudáveis, e utilizado para esclarecer a especificidade detalhada das regiões do péptido identificadas no ensaio de resposta cinética. A especificidade de cada TCC é testada pela sua resposta proliferativa ao painel de péptidos 15- 36 meros. 0 clone SD:A7 reconheceu a região 1-24 e, dentro desta região, este TCC respondeu aos aa 5-19. A região 30-54 é reconhecida por 4 clones (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) e o epítopo dentro desta região é 30-44. Um clone (MS39:D7) de um doente com MS reconhece o péptido 60-74 e, curiosamente, um individuo saudável responde a esta região (60-84) no nosso ensaio de resposta cinética. Cinco clones (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) reconhecem os aa 83-99, os quais estão contidos na região 75-99. Um doente produziu um TCC especifico para os aa 110-124 (MS60:A2, MS60:B3), contidos dentro do conjunto 105-129 e outro TCC do mesmo doente é especifico para 130-144 (MS60:E1), presente dentro da região 120-144. Cinco indivíduos produzem clones que reconhecem epítopos dentro da região 135-159: os MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 e N5:19 reconhecem os aa 140-154; o MS57:A1 é específico para 140-149 e o TCC MS17:A3 responde à sequência 130-144. Este painel de clones demonstra claramente a presença de pelo menos 2 epítopos de células T dentro da região 135-159 da MBP. Por fim, a região 150-170 é reconhecida por 2 clones específicos para os aa 156-169. A especificidade de todos os TCC é resumida na Figura 6.

EXEMPLO 2 - Identificação de apítopos na MBP

Materiais e métodos

Ensaio de apresentação de antigénio utilizando um APIPS A apresentação dos péptidos aos clones de células T é medida pela proliferação. As APC são fixas em paraformaldeído a 0,5% e aplicadas a 1 χ 105 células por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Os clones de células T são aplicados a 2 χ 104 células por 37 poço na presença de várias concentrações de péptido. Depois de incubar durante 48 h a 37°C, a proliferação é medida pela incorporação de [3H]-timidina ao longo de 16-20h. Os resultados são comparados com a aptidão das células T para responderem ao epítopo apresentado pelas APC vivas. A apresentação dos péptidos a células T isoladas a partir do rato transgénico DR2:MBP82-100 foi essencialmente como descrita acima, à exceção de que as APC foram aplicadas a 5 x 105 células por poço, as células T foram aplicadas a 1 x 105 células por poço e a incubação foi deixada prosseguir durante 72h, antes da adição de [3H]-timidina.

Resultados

Nesta experiência, os péptidos que foram identificados como epitopos no exemplo anterior são examinados quanto à sua capacidade para serem apresentados utilizando um APIPS. Os resultados são mostrados na Figura 7b. Dos cinco epitopos examinados até agora, quatro mostraram ser apítopos (30-44, 80-94, 110-124 e 130-144) e um mostrou atuar como um epitopo mas não como um apítopo (156-170) .

Exemplo 2A - Investigação dos péptidos de MBP 30-44, 110-124, 130-144 e 156-170 A fim de investigar se os vários péptidos de MBP são apitopos, é investigada a sua capacidade para serem apresentados a células T por APC fixas. Células Mgar (HLA-DR2+ve) vivas ou pré-pulsadas são pré-pulsadas com o péptido em soro ou soro sozinho durante 3,5 horas. O excesso de péptido é em seguida removido das células e adicionado o clone de células T apropriado. A resposta 38 proliferativa de células T é medida pela incorporação de 3H-timidina.

Como se mostra nas Figuras 8 e 9, os péptidos 30-44 (Fig 8A) , 110-124 (Fig 8B) e 130-144 (Fig 9A) podem ser apresentados por APC fixas, sem processamento adicional. Portanto, estes péptidos são definidos como apítopos. Por outro lado, o péptido 156-170 requer processamento adicional para apresentação a células T (Fig 9B) . As APC fixas são incapazes de apresentar este epítopo às células T, pelo que o 156-170 não é um apitopo.

Exemplo 2B - Identificação de apitopos dentro das regiões 77-100 e 125-148 da MBP

Para qualquer epitopo em particular, podem existir um ou mais apitopos, capazes de serem apresentados a APC, sem processamento adicional. A presença de apitopos dentro de duas regiões da MBP é investigada incubando células Mgar (HLA-DR2+ve) vivas ou fixas com p-formaldeido em soro com péptidos sobrepostos das regiões de MBP 77-100 (Figura 12) e 125-148 (Figura 13) ou em soro sozinho. As células T foram adicionada e após 72h (Figura 12) ou após 48h (Figura 13) foi medida a resposta proliferativa das células T por incorporação de 3H-timidina. Para a MBP 77-100, as células T são isoladas de um rato transgénico DR2:MBP 82-100, enquanto que para a MBP 130-144 é utilizado um clone de células T MS17:A3.

Para a região 77-100 da MBP, são definidos os seguintes péptidos como apitopos:

MBP 83-99 ENPVVHFFKNIVTPRTP MBP 80-94 TQDENPVVHFFKNIV 39

ΜΒΡ 81-95 QDENPVVHFFKNIVT ΜΒΡ 82-96 DENPVVHFFKNIVTP ΜΒΡ 83-97 ENPVVHFFKNIVTPR ΜΒΡ 84-98 MPVVHFFKNIVTPRT A sequência mínima da MBP reconhecida pelas células T do rato transgénico DR2 MBP 82-100 é a região 85-94.

Para a região 125-148 da MBP, são definidos os seguintes péptidos como apítopos:

MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ A sequência mínima da MBP reconhecida pelo clone de células T MS17:A3 é a região 133-144.

Exemplo 2C - Investigação da região 89-101 da MBP

Os atuais inventores mostraram anteriormente que, ao contrário de outros epítopos de células T para a mielina, a administração de péptido 89-101 na forma solúvel não previne a encefalomielite autoimune experimental murídea (EAE) induzida com mielina inteira ou com o próprio péptido 89-101 (Anderton e Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251).

A MBP 89-101 compreende três epítopos de células T A fim de investigar a reatividade das células T para a região 81-111 da MBP, células dos gânglios linfáticos de ratos preparadas com 81-111 são estimuladas com 81-111 in vitro e estas células são testadas com um painel de péptidos 10-meros sobrepostos, com dois deslocamentos de resíduos a abranger a região 81-111 (nomeadamente: 81-90, 40 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 e 101-111). O padrão de resposta a péptidos que abrangem a 89-101 mostra capacidade estimuladora para 5 péptidos adjacentes (87-96 até 95-104 da extremidade N terminal) refletindo a presença de pelo menos dois (e, eventualmente, três) epítopos distintos. A fim de investigar adicionalmente esta região, são geradas três sub-linhas a partir da linha de células T original, sensível a 81-111 e estas são novamente testadas com um painel de péptidos 10-meros sobrepostos com um deslocamento de um resíduo a abranger a região 84-106. Os resultados revelam a existência de três epítopos de células T, distintos mas sobrepostos, dentro da sequência 89-101: 89-94, 92-98 e 95-101 (ver Figura 14). O péptido 92-98 da MBP é um epítopo críptico

As três linhas de células T (TCL) específicas para um epítopo mostram diferenças interessantes quando testadas em relação à reatividade para o péptido 89-101 e para a MBP recombinante inteira. Todas as três TCL respondem ao péptido (89-101) mas apenas as TCL específicas para 89-94 e 95-101 respondem à MBP inteira. Isto indica que o processamento do antigénio da MBP intacta gera preferencialmente ligandos para células T que reconhecem os 89-94 e 95-101, mas não para aquelas que reconhecem o 92-98. Isto sugere que o epítopo 92-98 é críptico (isto é, não pode ser gerado por processamento do antigénio nativo). Parece que o péptido MBP 89-101 pode participar em três interações distintas com a molécula de MHC, resultando em ligandos péptido/MHC que são reconhecidos por três populações de células T diferentes. No entanto, o processamento da MBP gera apenas ligandos para duas destas populações de células T (ver Fig 14). 41 A indução de EAE requer o reconhecimento pelas células T de epitopos autoantigénicos expressos no SNC em consequência da degradação de MBP intacta. A imunização de ratos com péptidos compreendendo apenas um dos três epitopos de células T anteriormente identificados mostra que apenas aqueles que contêm um epitopo processado naturalmente (89-94 ou 95-101) são capazes de induzir EAE. Isto suporta ainda mais a constatação de que o 92-98 é um epitopo críptico.

0 péptido 92-98 da MBP é o epitopo dominante para a região 89-101 da MBP

Como mencionado acima, a região 89-101 contém três péptidos distintos mas sobrepostos. Destes, o péptido 92-98 parece ser dominante para esta região. Por exemplo, quando os clones de células T são gerados a partir de ratos condicionados com o péptido 89-101, todos os seis clones que foram gerados respondem ao 92-98. Utilizando péptidos análogos de 89-101 contendo substituições de alanina particulares em cada posição, determinou-se que a substituição de qualquer das posições 92-98 origina uma falta de sensibilidade, o que mostra que a alteração de quaisquer resíduos dentro do núcleo 92-98 tem efeitos acentuados no reconhecimento deste epitopo. O péptido 89-101 da MBP não consegue tornar tolerantes células T relevantes para a EAE que reconhecem um epitopo de MBP processado naturalmente.

Para resumir as observações acima, os atuais inventores determinaram que a) a sequência 89-101 tem o potencial para gerar 3 epitopos de células T distintos; b) apenas dois destes epitopos (89-94 e 95-101) são gerados por processamento do antigénio da MBP intacta (tanto in vitro 42 como in vivo); c) apenas os péptidos que contêm os epítopos processados naturalmente, e não os que contêm um epítopo críptico, são eficazes na indução de EAE; d) o péptido 89-101 não consegue proteger contra EAE em experiências de terapias com péptidos.

Esta informação proporciona uma base para investigar a hipótese de que o péptido 89-101 não consegue induzir tolerância contra a EAE, devido à incapacidade de ligar diretamente as células T relevantes para a doença. A fim de suportar a hipótese, o péptido (89-101) não deveria conseguir induzir tolerância ao epítopo encefalitogénico principal (89-94), uma vez que aquele não se ligará diretamente ao elemento de restrição do MHC (I-As) na conformação apropriada. Por outras palavras, o 89-101 não atuará como um apítopo para as células T que respondem ao 89-94. A fim de testar esta possibilidade, são realizadas experiências de tolerância com os péptidos 89-101 e 87-96 (Fig 15 A e B) . O péptido 87-96 contém o epítopo (89-94) mais eficaz na indução de EAE. Métodos

Os ratos receberam 200 yg de péptido em PBS ou PBS sozinho por via intraperitoneal nos dias -8, -6 e -4, antes de 100 yg de péptido em adjuvante completo de Freund no dia 0. Após 10 dias, as células dos gânglios linfáticos de drenagem (6 x 105 por poço) foram cultivadas em meio X-Vivo 15, suplementado com 2-mercaptoetanol 5 x 10“5M e L-glutamina 2M com ou sem antigénio durante 72 horas. As culturas foram pulsadas com 0,5 yCi de 3H-timidina durante as 16 horas finais e a incorporação medida utilizando um 43 43 Os resultados são minuto para culturas contador de cintilação liquida, exprimidos como contagens médias por em triplicado.

Resultados 0 condicionamento com o 87-96 induziu uma forte resposta de memória a ele próprio e uma resposta mais fraca ao 89-101 (Fig 15 A e B □ e o, respetivamente). Isto é coerente com a necessidade de processamento do antigénio para gerar 89-94 a partir de 89-101. A utilização de 87-96 como um tolerogénio antes do condicionamento com 87-96 suprimiu as respostas de memória tanto ao 87-96 como ao 89-101 (Fig 15 A e ·). Isto ajusta-se a células T reativas para o 89-94 que, uma vez tornadas insensiveis in vivo, não conseguem responder ao 89-94 in vitro, quer sejam geradas a partir de 89-96 ou 89-101. No entanto, de forma crucial, a utilização de 89-101 como tolerogénio antes do condicionamento com 87-96 não conseguiu inibir as respostas de memória ao 87-96 ou 89-101 (Fig 15 B A e ·) . Estes dados demonstram que a administração do péptido 89-101 na forma tolerogénica não consegue induzir tolerância ao epítopo encefalitogénico processado naturalmente com base na sequência 89-94: o péptido 89-101 não consegue comportar-se como um apitopo para o epítopo 89-94.

Sem pretender ficar limitado pela teoria, os atuais inventores acreditam que as observações podem ser explicadas pela posição do péptido 89-101 no sítio de ligação ao péptido de MHC. Se o péptido se ligar preferencialmente de modo que a região 92-98 se situe na cavidade de ligação do péptido, então ele será reconhecido pelas células T específicas para ο MBP92-98. Isto explicaria por que razão todos os clones de células T gerados reconhecem o epítopo MBP92-98, quando os ratos são condicionados com o péptido MBP89-101. Do mesmo modo, 44 quando é utilizado o 89-101 para tornar as células T tolerantes, este tornará tolerantes, principalmente, células que reconhecem o epitopo MBP92-98. Se ο MBP92-98 for um epitopo críptico, ele não é gerado pelo processamento natural do antigénio inteiro e, provavelmente, as células T que reconhecem este epitopo não existirão in vivo. Mesmo que existissem células T especificas para MBP92-98 in vivo, isto não seria relevante para a doença. Assim, o 89-101 não consegue prevenir a EAE induzida com a MBP inteira. EXEMPLO 3 - Terapia de péptidos para um modelo de MS em rato

Os atuais inventores mostraram anteriormente que uma dose única do antigénio peptidico administrada sistemicamente por via intraperitoneal (Liu e Wraith (1995) Int Immunol 8:1255-1263) ou intranasal (Metzler e Wraith (1993) 5:1159-1165) protegeria eficazmente os ratos da encefalomielite autoimune experimental (EAE) durante até três meses (Metzler e Wraith (1999) Immunology 97:257-263). Foram necessárias, pelo menos, 5 doses de péptido para induzir tolerância no rato transgénico Tg4 (Burkhart et al (1999) 11:1625-1634) que expressa um recetor de células T especifico para EAE (Liu et al (1995) Immunity 3:407-415). Trabalho recente demonstrou que a via intranasal (IN) é mais segura do que a via intraperitoneal (IP) no rato Tg4, ainda que ambas as abordagens sejam igualmente seguras no rato não transgénico. O péptido 83-99 da MBP é testado no rato transgénico Fug/D6, o qual expressa a molécula de MHC de classe II, HLA-DR2, apropriada e um TCR de um clone de células T humanas especificas para este péptido. Os ratos são 45 tratados com o péptido seguindo a dose padrão utilizada para o tratamento do rato transgénico Tg4 (protocolo Tg4) ou o protocolo de dessensibilização de intensificação da dose de péptido que foi utilizado no tratamento de doentes que sofrem de alergia (Protocolo de dessensibilização).

Protocolo Tg4: Os grupos de ratos são tratados por administração intranasal do péptido 83-99 (4mg/mL em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)) ou PBS sozinho num volume total de 25 yL. Os ratos são tratados em todos os Io e 5o dias da semana durante 5 semanas, dando um total de 10 doses. No início da semana 6, cada rato é injetado com o péptido 83-99 em Adjuvante Completo de Freund (CFA) e recebe também uma injeção IP de Toxina da Tosse Convulsa (200 ng) nos dias 1 e 3. A progressão da EAE é seguida durante pelo menos 30 dias.

Protocolo de dessensibilização: Os grupos de ratos são tratados por administração intranasal de uma dose crescente do péptido 83-99 ou PBS sozinho num volume total de 25 yL. A intensificação da dose começa a 0,1 yg e progride ao longo de 1, 3, 6, 12, 50 e, em seguida, três vezes 100 yg. Os ratos são tratados todos os Io e 5o dias da semana durante 5 semanas, dando um total de 10 doses. No inicio da semana 6, cada rato é injetado com o péptido 83-99 em Adjuvante Completo de Freund (CFA) e recebe também uma injeção IP de Toxina da Tosse Convulsa (200 ng) nos dias 1 e 3. A progressão da EAE é seguida durante pelo menos 30 dias. 46

EXEMPLO 4 - Administração nasal de um cocktail de apitopos a doentes com MS É preparada uma vacina compreendendo os péptidos 30-44, 83-99, 110-124 e 130-144 da MBP (isto é, alguns dos epitopos de MBP que foram identificados como apitopos). A vacina é administrada a trinta e cinco doentes num ensaio de fase Ia/Ib. O ensaio é um ensaio de cruzamento único, no qual os doentes permanecem sem tratamento durante três meses, seguindo-se uma dose única de péptido (Ia). Os doentes são, então, seguidos durante três meses após a dose única de vacina, para avaliar a segurança. Em seguida, o tratamento consiste em administração bissemanal por deposição intranasal. Para cada doente: a atividade clinica é analisada mensalmente por imagiologia de ressonância magnética; a atividade imunológica é seguida utilizando um ensaio de resposta cinética para a proliferação; e a produção de citocinas é seguida utilizando um ELISA baseado em células. O ensaio envolve inicialmente o tratamento de 5 doentes que sofrem de doença progressiva crónica (CP). Estes doentes são selecionados com base na baixa atividade em MRI e são tratados inicialmente com a dose mais elevada de péptidos. 0 tratamento é iniciado no grupo dos doentes com CP, porque são os que têm maior probabilidade de demonstrar quaisquer possiveis efeitos prejudiciais como evidenciado por um aumento da atividade na MRI. O tratamento de doentes remitentes recidivantes é iniciado assim que seja evidente que o tratamento de dose única e múltipla é seguro no grupo CP. É recrutado um grupo maior de 30 doentes remitentes recidivantes com base no facto de sofrerem de lesões intensificadas na MRI durante um periodo de acompanhamento 47 de 3 meses. Estes são divididos em três grupos a serem tratados com uma dose alta, média ou baixa do péptido. PONTO NO TEMPO (MESES) DOENTES PROGRESSIVOS CRÓNICOS (CP) DOENTES REMITENTES RECIDlVANTES (RR) 0 Inicio do acompanhamento mensal 3 Inicio da fase Ia (dose única de péptido) com MRI às 1-2 semanas após tratamento e acompanhamento mensal 6 Inicio da fase Ib (dose Inicio do de péptido duas vezes acompanhamento mensal e por semana) e recrutamento de doentes continuação do acompanhamento mensal com lesões crescentes 9 Inicio da fase Ib (dose de péptido duas vezes por semana) e continuação do acompanhamento mensal 12 Fim do tratamento e continuação do acompanhamento mensal durante mais 6 meses 15 Fim do tratamento e continuação do acompanhamento mensal durante mais 6 meses

MHC

Abreviaturas: APC = células apresentadoras de antigénio; = complexo principal de histocompatibilidade; TCR = 48 recetor de células T; EAE = encefalomielite autoimune experimental; APÍTOPO = epítopo independente do processamento de antigénio; APIPS = sistema de apresentação independente do processamento de antigénio; aa = aminoácido; MS = Esclerose Múltipla; MBP = proteina básica de mielina; PLP = proteina proteolipídica; TCL = linha de células T; TCC = clone de células T; PBMC = células mononucleares de sangue periférico; PPD = derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis; PHA = fito-hemaglutinina 49 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Universidade de Bristol

<120> MÉTODO DE SELEÇÃO DE PÉPTIDOS <130> P9611WO LCH <140> PCT/GB01/03702 <141> 2001-08-17 <150> 0020618.5 <151> 2000-08-21 <150> 0114547.3 <151> 2001-06-14 <160> 11 <17 0> Patentln versão <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1

Arg Thr 15

Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro 15 10

Pro

<210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens 50 <400> 2

Thr Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai 15 10 15

<210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Gin Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr 15 10 15

<210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Asp Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro 15 10 15

<210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Glu Asn Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg 15 10 15

<210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens 51 <4 Ο Ο> 6

Met Pro Vai Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr 15 10 15

<210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai 15 10 15

<210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai Asp 15 10 15

<210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai Asp Ala 15 10 15

<210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens 52 <4 Ο 0> 10

Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Vai Asp Ala Gin 15 10 15

<210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11

Vai His Phe Phe Lys Asn Ile Vai Thr Pro Arg Thr Pro 15 10

Lisboa, 11 de Dezembro de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para selecionar um péptido que é útil na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio de hipersensibilidade mediado por células T que reconhecem o antigénio alvo, o qual compreende os seguintes passos: (i) tratar um sistema de apresentação de antigénio isento de processamento com uma multiplicidade de péptidos, compreendendo, cada, um epitopo de células T do antigénio alvo; (ii) analisar a ligação dos péptidos a moléculas de MHC de classe I ou II no sistema, adicionando células T e medindo a ativação das células T; (iii) identificar um péptido que é capaz de ligar uma molécula de MHC de classe I ou II no sistema de apresentação isento de processamento e ser apresentado a uma célula T como sendo um péptido capaz de induzir tolerância ao antigénio alvo in vivo quando administrado a um indivíduo, o qual é útil na prevenção e/ou tratamento do distúrbio de hipersensibilidade; e (iv) selecionar um péptido que é identificado como sendo capaz de ligar uma molécula de MHC de classe I ou II no sistema de apresentação isento de processamento e ser apresentado a uma célula T no passo (iii).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o sistema de apresentação de antigénio compreende: (i) células apresentadoras de antigénio fixas (ii) membranas lipídicas compreendendo moléculas de MHC de classe I ou II; ou 2 (iii) moléculas de MHC de classe I ou II ligadas em placas.

3. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, o qual compreende o passo de investigar se o péptido é capaz de se ligar a uma molécula de MHC de classe II no sistema de apresentação isento de processamento e ser apresentado a uma célula T.

4. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a multiplicidade de péptidos é eluida das moléculas de MHC de classe II de uma célula apresentadora de antigénio.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o péptido é selecionado de um conjunto interno de péptidos truncados.

6. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a presença de um epitopo de células T no péptido é determinada por: (i) tratamento de: uma amostra de células de um indivíduo que tem a doença, e uma amostra de células de um indivíduo que não tem a doença com o péptido; e (ii) comparação das respostas de células T entre as amostras celulares.

7. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o distúrbio de hipersensibilidade é uma alergia, doença autoimune ou rejeição de enxerto. Lisboa, 11 de Dezembro de 2013