EA017999B1

EA017999B1 - Композиция, содержащая пептиды основного белка миелина, ее применение и способ лечения или профилактики рассеянного склероза или оптического неврита

Info

Publication number: EA017999B1
Application number: EA201070541A
Authority: EA
Inventors: Дэвид Рэйт; Хитер Стритер
Original assignee: Эпитоп Текнолоджи (Бристоль) Лимитед
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2013-04-30
Also published as: IL204662A0; MY158800A; WO2009056833A3; CN101848725A; CA2703170A1; AU2008320657A1; US20160263188A1; KR20100036391A; BRPI0818302B1; JP5361895B2; AU2008320657B2; US9381234B2; EP2211892A2; EP2211892B1; CN101848725B; ZA201001748B; WO2009056833A2; MX2010004698A; CA2703170C; JP2011500776A

Abstract

Изобретение относится к композиции, которая содержит следующие пептиды основного белка миелина: MBP 30-44, MBP 83-99, MBP 131-145 и MBP 140-154. Данную композицию можно использовать для лечения заболевания, в частности рассеянного склероза и/или оптического неврита, и данное изобретение также относится к указанному применению и способам.

Description

Изобретение относится к композиции, которая содержит пептиды основного белка миелина. Композицию можно использовать для лечения рассеянного склероза.

Введение

Рассеяный склероз

Рассеянный склероз (М8) является наиболее распространенным инвалидизирующим неврологическим заболеванием, поражающим молодых людей. Около 85000 человек в Великобритании страдают М8.

При рассеянном склерозе (М8) воспаление нервной ткани приводит к потере миелина, жирового вещества, которое выступает в качестве защитной изоляции нервных волокон в головном и спинном мозге. Такая потеря миелина, или демиелинизация, оставляет множественные области рубцовой ткани, или склероза, вдоль нервных клеток. В результате, склероз приводит к множественным неврологическим признакам и симптомам, обычно с рецидивами и ремиссиями.

Обычные симптомы М8 включают снижение или потерю зрения, спотыкание и неровную походку, невнятную речь, а также частое мочеиспускание и недержание мочи. Помимо этого, М8 может приводить к изменениям настроения и депрессии, мышечным спазмам и тяжелому параличу.

В настоящее время считается, что М8 является аутоиммунным заболеванием, опосредованным аутореактивными Т-клетками.

Существующее лечение М8, как правило, направлено на подавление иммунной системы. Например, один из способов лечения включает трансплантацию костного мозга и введение цитостатиков и иммуносупрессивных лекарственных средств. Такое лечение эффективно для части пациентов, но является дорогостоящим и имеет довольно высокие риски осложнений. Кроме того, применение цитостатиков при лечении М8 считается спорным, потому что их эффекты неясны, а возможные побочные эффекты являются тяжелыми.

Лечение интерфероном-бета (ΙΡΝβ) ослабляет симптомы М8 у части пациентов и, вследствие этого, широко используется. Однако механизм действия интерферона-бета неясен, а лечение ΙΡΝβ эффективно не для всех пациентов. Более того, лечение ΙΡΝβ осложняется формированием анти-ΙΡΝβ антител у большинства пациентов (Οίοναηποηί, О., Мипзсйаиег, Ρ. Е., 3тб, и ОсЪспйаттсг, Ρ. (2002). ΝοπίΓαΙίδίηβ αηΐίόοάίοδ 1о т1сг&гоп Ьс1а биттд 111с 1гса1тсп1 οί тиШр1с 8с1сго818. 1 №иго1 №иго8игд РзусЫаРу 73, 465469).

В настоящее время не существует эффективного способа лечения М8. Лечение направлено лишь на уменьшение симптомов заболевания, обычно за счет общего подавления иммунной системы. Таким образом, существует острая необходимость в терапии, которая специфично нацелена на местный иммунный ответ, связанный с началом заболевания и его прогрессированием.

Синтетические пептиды

Мс1х1сг и ^тайй (Ιηΐ. Iттиπο1. 5:1159-1165 (1993)) были первыми исследователями, которые описали использование синтетических пептидов для подавления аутоиммунного ответа на мышиной модели с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЕАЕ), общеизвестной модели М8 ίη νίνο. В этом исследовании пептиды, полученные из МВР, вводили интраназально, и было обнаружено, что уровень супрессии заболевания напрямую связан с антигенным действием использованных пептидов.

Позже, в 1995, Ьш и \УгаН11 (Ιηΐ. Iттиηο1. 7:1255-1263) показали, что также можно вызвать супрессию ЕАЕ у мышей путем внутрибрюшинного введения растворимых пептидов, полученных из МВР. В этом исследовании была достигнута супрессия как ТЫ, так и ТЬ2-ответа, и было показано, что введение пептидов после начала иммунного ответа может приводить к подавлению происходящих иммунных реакций.

Однако было обнаружено, что не все пептиды, способные действовать в качестве Т-клеточных эпитопов, способны вызывать толерантность. Пептид 89-101 основного белка миелина (МВР) после иммунизации представляет собой иммунодоминантный антиген и также является крайне эффективным иммуногеном как с точки зрения праймирования Т-клеточной реактивности, так и индукции ЕАЕ. Однако была показана неэффективность этого пептида для индукции толерантности при введении в растворе (ΑηбсПои и \Угай11 (1998) Еиг. 1. Iттиηο1. 28:1251-1261).

Авторы настоящего изобретения ранее показали, что существует связь между способностью пептида связываться с молекулой МНС Ι или ΙΙ класса и быть презентированным Т-клетке без дополнительного процессинга антигена и его способностью индуцировать толерантность ίη νίνο. Можно ожидать, что пептиды, которые не зависят от процессинга антигена (т.е. не требуют дополнительного процессинга антигена для того, чтобы связаться с МНС), будут вызывать толерантность ίη νίνο. Эти пептиды называют апитопы, от АиН^си Ртоссззтд 1п6срсп6си1 ср1Т0РЕ8.

В \У0 02/16410 описаны следующие апитопы основного белка миелина (МВР): 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 и 133-147.

В \У0 03/064464 в качестве апитопов определены следующие пептиды МВР: 134-148; 135-149; 136150; 137-151; 138-152 и 140-154.

- 1 017999

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что коктейль из четырех пептидов МВР, каждый из которых является апитопом, особенно эффективен для лечения М8. Полагают, что комбинация четырех пептидов может оказывать синергическое действие.

В первом аспекте, таким образом, настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит следующие пептиды основного белка миелина:

МВР 30-44;

МВР 83-99;

МВР 131-145 и

МВР 140-154.

Композиция может состоять преимущественно из МВР 30-44, 83-99, 131-145 и 140-154.

Композицию можно использовать для лечения или профилактики заболевания, в частности, рассеянного склероза.

Композицию можно использовать для лечения или профилактики оптического неврита, в частности, оптического неврита, обусловленного рассеянным склерозом.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики рассеянного склероза и/или оптического неврита путем введения пациенту композиции по первому аспекту изобретения.

В способе второго аспекта по изобретению композицию можно вводить, следуя протоколу с увеличением дозы.

Обнаружено, что два пептида в коктейле связываются с НЬА-Эрб (МВР 30-44 и 131-145), а два - с ΗΕΑ-ΌΒ2 (МВР 140-154 и 83-99). Комбинированное использование этих апитопов обеспечивает более широкий охват различных гаплотипов главного комплекса гистосовместимости (МНС), наблюдаемых у пациентов с М8, чем при терапии одним пептидом.

Способ второго аспекта по изобретению может включать введение композиции НЪА-Орб или НЬАГОК2-положительным пациентам.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к набору, который включает следующие пептиды основного белка миелина:

МВР 30-44;

МВР 83-99;

МВР 131-145 и

МВР 140-154 для совместного, раздельного или последовательного введения.

Введение к фигурам

Фиг. 1 - презентация МВР 30-44 посредством НкАГОрб Т-клеточному клону М8 49:Ό3;

фиг. 2 - презентация МВР 130-144 посредством НкАГОрб Т-клеточному клону М8 17:А2;

фиг. 3 - презентация МВР 139-153 посредством Ь-клеток, трансфецированных НЪА-ОВ2а и НЬАΌΡ26. Т-клеточному клону N5:19;

фиг. 4 - пролиферативный ответ клеток лимфоузла после толеризации Апитопом М8б;

фиг. 5 - пролиферация спленоцитов в ответ на Апитоп М87. Спленоциты получены от мышей, которых лечили посредством интраназального введения либо РВ8, либо Апитопа М87 (83-99);

фиг. б - пролиферация спленоцитов в ответ на Апитоп М87. Спленоциты получены от мышей, которых лечили посредством подкожного/чрезкожного введения либо РВ8, либо Апитопа М87 (83-99);

фиг. 7 - выработка ΙΡΝγ и 1Ь-2 спленоцитами, полученными от мышей, которых лечили посредством подкожного/чрезкожного введения либо РВ8, либо Апитопа М87 (83-99) фиг. 8 - пример таблицы Шеллена;

фиг. 9 - ответы РВМС пациентов на основной белок миелина человека (МВР);

фиг. 10 - ответы РВМС пациентов на АТХ-М8-14 б7;

фиг. 11 - сравнение пролиферативного ответа Т-клеток на МВР до (визит 1) и после (визит 8) лечения с помощью АТХ-М8-14б7.

Подробное описание

Первый аспект изобретения относится к композиции, которая содержит несколько пептидов основного белка миелина.

Основной белок миелина

Основной белок миелина (МВР) представляет собой белок массой 18,5 кДа, который может быть выделен из белого вещества головного мозга человека. Зрелый белок содержит 170 аминокислот, и его последовательность широко доступна в литературе (см. например: Сбои е! а1. (198б) ί. №игосйет. 4б:4753, фигура 1; КатЬок е! а1. (198б), Рт§ 83:49б2-49бб, фигура 2; патент США № 5817 б2 9, 8Ер ΙΌ ΝΟ: 1; Ко1й е! а1. (1987), I. №игоксг Век. 17:321-328, фигура 4; Мебеуес/ку е! а1. (200б), РЕВ8 Ьейетк 580:545552, фигура 3В).

Пептиды МВР

Термин пептид используется в обычном значении и обозначает серию остатков, как правило, Ь

- 2 017999 аминокислот, соединенных один с другим обычно посредством пептидных связей между α-амино и карбоксильной группами соседних аминокислот. Термин включает модифицированные пептиды и синтетические аналоги пептидов.

Пептиды, использованные в композиции и наборе по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием химических способов (Рерббе Сйет181гу, А ргасбса1 ТеХЬоок. М1ко§ Вобапзку, 8ргшдег-Уег1ад, Вег1ш.). Например, пептиды могут быть синтезированы твердофазными методами (ВоЬегде 1Υ е! а1. (1995) 8с1еисе 269: 202-204), гидролизованы на ионообменной смоле и очищены посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, ОгещЫоп (1983) Рго1е1И8 81гис1иге8 Апб Мо1еси1аг Рг1пс1р1е5. \УН Ргеетап и Со, Ыете Υо^к ΝΥ). Автоматический синтез может быть осуществлен, например, с использованием АВ1 43 1 А Рерббе 8уи1йе51/ег (Регкш Е1тег) в соответствии с инструкциями производителя.

Пептид может альтернативно быть получен рекомбинантными методами или посредством выщепления из более длинного полипептида. Например, пептид может быть получен выщеплением из полноразмерного МВР. Состав пептида может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием (например, методом деградации по Эдману).

Пептиды, использованные в композициях и наборах по настоящему изобретению, представлены ниже:

МВР 30-44:

Η-Р^о-А^д-Η^8-А^д-А8р-Тй^-С1у-I1е-^еи-А8р-8е^-I1е-С1у-А^д-Рйе-NΗ₂

МВР 83-99:

Η-С1и-А8И-Р^о-Vа1-Vа1-Η^8-Рйе-Рйе-^у8-А8И-I1е-Vа1-Тй^-Р^о-А^д-Тй^-Р^о-NΗ₂

МВР 131-145:

Η-А1а-8е^-А8р-Ту^-^у8-8е^-А1а-Η^8-^у8-С1у-Рйе-^у8-С1у-Vа1-А8р-NΗ₂

МВР 140-154:

Н-61у-Рйе-Еу8-61у-Уа1-А8р-А1а-61и-61у-Тйг-Ееи-8ег-Еу8-11е-Рйе^Н₂

Термины МВР 30-44, МВР 83-99, МВР 131-145 и МВР 140-154 включают модифицированные пептиды. Например, пептиды могут быть мутированы посредством аминокислотной вставки, делеции или замены, при условии, что сохраняется МНС-связывающая специфичность немодифицированного пептида вместе с его способностью быть презентированным Т-клетке. Пептид может иметь, например, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 мутаций по сравнению с немодифицированной последовательностью.

Альтернативно (или кроме того) модификации могут быть проведены без изменения аминокислотной последовательности пептида. Например, могут быть введены Ό-аминокислоты или другие неприродные аминокислоты, обычная амидная связь может быть замещена связями сложноэфирного или алкильного остова, могут быть включены Ν- или С-алкильные заместители, модификации боковой цепи и ограничительные связи, такие как дисульфидные мостики и связи амида боковой цепи или сложноэфирные. Такие изменения могут давать лучшую стабильность пептида ίη у1уо и увеличивать биологическое время жизни.

Модификации эпитопов могут быть сделаны, основываясь на прогнозировании для более эффективной Т-клеточной индукции, полученных с использованием программы Рерббе Вшбшд Ргебкбопк, разработанной К. Рагкег (ΝΙΗ), которую можно найти по адресу 1и1р:/Лу\\л\-Ыта5.бсг1.ш11.доу/сщЬш/то1Ью/кеп_рагкег_сотЬо£огт (см. также Рагкег, К. С е! а1. 1994. 1.1ттипо1. 152:163).

Пептиды МВР могут быть введены в композицию в нейтральной форме и в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают кислые соли присоединения (образованные с помощью свободных аминогрупп пептида) и те, которые образованы с помощью неорганических кислот, таких как, например, хлористо-водородная или фосфорная кислоты, или органических кислот, таких как уксусная, щавелевая, винная и малеиновая. Соли, образованные с помощью свободных карбоксильных групп, могут также быть производными неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2этиламиноэтанол, гистидин и прокаин.

Композиция

Композиция по настоящему изобретению может использоваться для профилактического или терапевтического применения.

Композиция может быть получена в подходящей для инъекции форме, в виде раствора жидкости или суспензии; может также быть получена в виде твердой формы, подходящей для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат может также быть в виде эмульсии, или пептиды инкапсулированы в липосомы. Активные ингредиенты могут быть смешаны с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Удобными эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор (например, фосфатно-солевой буфер), декстроза, глицерин, этанол, или подобные им, и их сочетания.

Кроме того, при желании, композиция может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие реагенты и/или рН-буферные вещества. Буферные соли включают фосфат, цитрат, ацетат. Хлористо-водородную кислоту и/или гидроксид натрия

- 3 017999 можно использовать для корректирования рН. Для стабилизации можно использовать дисахариды, такие как сахароза или трегалоза.

В композиции относительное соотношение пептидов (МВР 30-44:МВР 83-99:МВР 131-145:МВР 140-154) может быть приблизительно 1:1:1:1. Альтернативно, относительное соотношение каждого пептида может быть изменено, например, для того, чтобы сфокусироваться на толерогенном ответе определенной субпопуляции аутореактивных Т-клеток или, если обнаружено, что один пептид работает лучше, чем остальные у определенных типов НЬЛ.

После получения, композиция может быть помещена в стерильный контейнер, который затем запаивается и хранится при низкой температуре, например 4°С, или композиция может быть высушена сублимацией.

Удобно, если композицию получают в виде лиофилизованной (высушенной сублимацией) пудры. Лиофилизация обеспечивает возможность долгосрочного хранения в стабилизированной форме. Методы лиофилизации хорошо известны в данной области, см., например, 1ι11ρ://\ν\ν\ν.άονίοο1ίη1<. сот/|уШ/агс1иус/97/01/006.1ит1. Наполнители, такие как маннит, декстран или глицин, широко используются перед лиофилизацией.

Композицию можно вводить удобным способом, таким как пероральный, внутривенный (в случае водорастворимой), внутримышечный, подкожный, сублингвальный, интраназальный, чрезкожный или в виде суппозиториев или имплантов (например, с использованием молекул медленного высвобождения).

Композиция может преимущественно вводиться интраназальным, подкожным или чрезкожным путем.

Способ и фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать для лечения человека. Обычно, лечащий врач определяет фактическую дозу, которая наиболее подходит для отдельного пациента и которая может варьировать в зависимости от возраста, веса и ответа конкретного пациента.

В предпочтительном варианте осуществления можно следовать протоколу увеличения дозы, когда совокупность доз дается пациенту в возрастающей концентрации. Такой подход был использован, например, для пептидов фосфолипазы А2 в иммунотерапии аллергии к пчелиному яду (Ми11ет е! а1. (1998) 1. А11егду Οΐίη 1ттипо1. 101:747-754 и Акй18 е! а1. (1998) 1. С1ш. 1пуей. 102:98-106).

Наборы

Удобно, когда четыре пептида МВР можно вводить вместе в форме смешанной композиции или коктейля. Однако в некоторых случаях, при которых предпочтительнее предоставлять пептиды раздельно в виде набора для совместного, раздельного, последовательного или комбинированного введения.

Например, набор может включать четыре пептида в раздельных контейнерах, или два контейнера, содержащие по два пептида каждый. Содержимое контейнеров можно комбинировать или не комбинировать перед введением.

Набор может также включать устройства для смешивания и/или для введения (например, распылитель для интраназального введения; или шприц и иглу для подкожной/чрезкожной дозы). Набор может также включать инструкции по использованию.

Фармацевтическую композицию или набор по изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики заболевания.

В частности, композицию/набор можно использовать для лечения и/или профилактики рассеянного склероза и/или оптического неврита.

Рассеянный склероз

Рассеянный склероз (М8) является наиболее распространенным неврологическим нарушением среди молодых людей (в возрасте от 20 до 40 лет), поражая около 385000 человек в Европе и 300000 в США. Это хроническое дегенеративное заболевание центральной нервной системы, при котором происходит постепенное очаговое разрушение миелина во всех областях головного и/или спинного мозга, что препятствует нервной связи и вызывает мышечную слабость, потерю координации, речевые и зрительные нарушения.

Через 10 лет приблизительно половина пациентов, которым изначально был поставлен диагноз возвратно-ремиттирующий М8 (РКМ8), отмечает снижение частоты обострений, но усиление нарушения функций. Это состояние известно как вторичный прогрессирующий М8 (8РМ8). По некоторым оценкам, в течение 25 лет приблизительно у 90% больных ККМ8 переходит во вторичный прогрессирующий тип. Как и ККМ8, тяжесть вторичного прогрессирующего М8 может изменяться. Для некоторых пациентов возрастание и прогрессирование нарушения функций происходит постепенно, у других это случается более быстро. В основном, однако, восстановление после обострений становится все менее и менее полным, симптомы имеют тенденцию к усилению, и нарушение функций растет. Клинически атаки становятся менее выраженными, и имеется тенденция к исчезновению ремиссий, но большая часть ткани ЦНС в данный момент не разрушена, и накопление повреждений более выражено на ЯМР.

Композицию по изобретению можно использовать для лечения пациентов с недавно начавшимся М8, ККМ8 или 8РМ8.

Композиция по настоящему изобретению может ослаблять или улучшать один или несколько симптомов М8, которые включают снижение или потерю зрения, спотыкание и неровную походку, невнят

- 4 017999 ную речь, частое мочеиспускание и недержание мочи, изменения настроения и депрессию. 8РМ8 может сопровождаться мышечными спазмами и тяжелым параличом.

В частности, композиция может улучшать оптический неврит.

Оптический неврит

Оптический неврит (ОН) представляет собой воспаление с сопутствующей демиелинизацией оптического нерва, обслуживающего сетчатку глаза. Это переменное состояние, и может проявляться любым из следующих симптомов: нечеткость зрения, потеря остроты зрения, частичная или полная потеря цветового зрения, полная или частичная слепота и боль за глазом.

Оптический неврит является одним из наиболее часто проявляющихся в настоящее время симптомов рассеянного склероза и одним из наиболее распространенных симптомов в начале развития М8. ОН может, однако, быть проявлением другого заболевания, а не М8, такого как ишемическая оптическая невропатия.

В 70% случаев ОН присутствует унилатерально (только на одном глазу).

Чаще всего, оптический неврит изначально поражает людей в возрасте от 15 до 50 лет. Исследования показывают, что в этой возрастной группе, более чем у 50% пациентов развивается рассеянный склероз в течение 15 лет. Как и в случае М8, у женщин вероятность появления ОН приблизительно в два раза выше, чем у мужчин, и распространенность ОН у европеоидов выше, чем в других расовых группах.

Основными симптомами оптического неврита являются:

потеря остроты зрения (нечеткость зрения);

глазная боль;

дисхроматопсия (снижение цветового зрения);

двигательные и звуковые фосфены (зрительные ощущения вспышек, вызванные движением глаз из стороны в сторону или звуком);

симптом Утхофа, ухудшение симптомов с повышением температуры или упадком сил.

Лечение ОН с помощью композиции по настоящему изобретению может предотвращать, ослаблять или улучшать любые из этих симптомов. Для наблюдения за прогрессированием ОН острота зрения может быть удобно измерена с использованием таблицы Шеллена.

Примеры

Следующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения, но не являются ограничивающими. Изобретение относится, в частности, к специфическим вариантам осуществления, описанным в данных примерах.

В целях примеров следующие названия можно использовать для пептидов МВР:

Пептид МВР	Названия в примерах (взаимозаменяемые)
30-44	АТХ-МЗ-01	Апитоп М31
83-99	АТХ-МЗ-07	Апитоп М37
131-145	АТХ-МЗ-04	Апитоп М34
140-154	АТХ-МЗ-06	Апитоп М3б

Композиция четырех пептидов называется АТХ-М8-1467

Пример 1. Идентификация ограниченных по НЬА-Эрб Т-клеточных эпитопов основного белка миелина.

Гены МНС класса II передают восприимчивость к рассеянному склерозу (Ыерот и Ейгйей (1991) Апп. Кеу. 1шшипо1. 9: 493-525). Среди европеоидов средней и центральной Европы, Австралии и Северной Америки ассоциация связана с молекулой МНС НЕА-ЭК2 (ЭК2а [ΌΡΒ5*0101] и ЭК2Ъ [ΌΡΒ1*1501], Нашез е! а1. (1998) Нитап Мо1. Сепе!. 7: 1229-1234). Хотя 1Ж2 и Ό66 аллели МНС находятся в различных локусах, существует значительное неравновесие по сцеплению между этими двумя аллелями. Конкордантность между этими двумя аллелями составляет 99%, гораздо выше ожидаемого, в случае если бы аллели были ассоциированы случайным образом. Таким образом, увеличивается возможность того, что определенные Т-клеточные эпитопы, связанные с М8, могут быть скорее ограничены по ΗΕΑ-Ό66, чем по НЬА-РК2.

Целью данного исследования было установить, презентируются ли Т-клеточные эпитопы МВР человека с помощью молекулы ΗΕΑ-Ό66 Т-клеточным клонам, выделенным от НЕА-ЭКЛ-положительных пациентов с М8. Т-клеточную активацию измеряли посредством Т-клеточной пролиферации с использованием инкорпорации [³Н]-тимидина.

Пептидные антигены

Пептиды МВР 30-44, 130-144 и 139-153 были синтезированы с использованием Е-аминокислот и стандартной Е-тое химии на синтезаторе пептидов АЫтеб АМ8 422.

Антигенпрезентирующие клетки

В качестве антигенпрезентирующих клеток были использованы Е-клетки, трансфецированные НЕА-ЭР6, НЕА-ЭК2а или НЕА-ЭКЗЪ, или клетки Мдаг (ЕАСС, Рог!оп 1)о\уп, ЦК), которые экспресси

- 5 017999 руют НЬЛ-ΌΟ. ΌΡ и ΌΚ.

Т-клеточные клоны

Т-клеточные клоны М8 49:Ό3 и М8 17:А2 были получены от пациентов с М8, и клон N5:19 был получен от здорового человека. Все три клона были выделены у ПК2-положительных индивидуумов.

Анализ презентации антигена

Антигенпрезентирующие клетки инкубировали с различными концентрациями пептида и соответствующими Т-клетками.

Пролиферацию и, таким образом, активацию Т-клеток измеряли посредством инкорпорации [³Н]тимидина и выражали в виде индекса стимуляции (81 = корректированное число импульсов в минуту (ссрт) от культуры, содержащей пептиды/серпа от культуры без пептидов).

Результаты

Когда пептид МВР 30-44 презентировался Ь-клетками, трансфецированными НЬА-Эрб, Тклеточный клон М8 49:Ό3 давал очень сильный пролиферативный ответ (в 1,5 раза больше по сравнению с контрольными клетками Мдаг) при самой высокой концентрации пептида (фиг. 1). Когда МВР 130-144 презентировался Ь-клетками, трансфецированными НЬА-Эрб, еще более сильный ответ был индуцирован у М8 17:А2 Т-клеток (увеличение пролиферации в 3,24 раза по сравнению с контрольными клетками Мдаг - фиг. 2).

Третий Т-клеточный клон N5:19, выделенный от индивидуума с ΌΚ2, ответил на основной эпитоп МВР 140-154 и на серию перекрывающихся 15-мерных пептидов, покрывающих этот регион (138-156). Пептид 139-153 стимулировал пролиферацию Т-клеточного клона N5:19, когда он был презентирован Ьклетками, трансфецированными НЬА-ЭВ2а, но не в случае Ь-клеток, трансфецированных НЬА-ЭВ2Ь (фигура 3).

Вывод

Т-клеточные клоны, выделенные от НЬА-ЭК2-положительных индивидуумов, отвечают на ограниченные по НЬА-ЭСб МВР Т-клеточные эпитопы. Это означает, что ассоциация НЬА-ЭВ2 с рассеянным склерозом не ограничивается ΌΚ2 МВР Т-клеточными эпитопами, но может быть также ограничена по ΌΡ6.

В композиции МВР по настоящему изобретению два пептида связываются с НЬА-ЭОб (МВР 30-44 и 131-145) и два связываются с НЬА-ЭВ2 (МВР 140-154 и 83-99). Таким образом, терапия пептидами с помощью этих апитопов может быть направлена на НЬА-ЭВ2 или НЬА-ЭЦб индивидуумов.

Пример 2. Индукция толерантности с помощью Апитопа М8б у НЬА:ЭВ2 трансгенной мыши.

Это исследование было спланировано для того, чтобы показать, что апитоп (Апитоп М8б), когда он презентируется молекулой МНС класса II, может вызывать иммунологическую толерантность на гуманизированной мышиной модели рассеянного склероза. Апитоп М8б является апитопом, выбранным из Тклеточных эпитопов МВР, представляет собой МВР 140-154, презентируется посредством МНС класса II на антигенпредставляющих клетках и может стимулировать Т-клетки без процессинга (см. νθ 03/0б44б4). Была использована мышиная модель, трансгенная по молекуле МНС человека НЬА:ЭВ2 (ϋΚΒ1*1501) (Мабзеп е1 а1. (1999) ХаИие СепеИсз 23:343-347).

Индукцию толерантности или изменения в популяции СЭ4+ Т-клеток у мыши после введения апитопа можно проконтролировать по снижению Т-клеточной пролиферации после стимуляции антигеном 1п νίνο.

Пептидный синтез

Апитоп М8б (пептид МВР 140-154) был синтезирован с использованием Ь-аминокислот и стандартной Б-тос химии на синтезаторе пептидов АЫтеб АМ8 422.

Мыши и индукция толерантности

В исследовании были использованы НЬА:ЭВ2 трансгенные мыши в возрасте 8-12 недель. У мышей вызывали толерантность посредством предварительного введения 100 мкг Апитопа М8б в 25 мкл фосфатно-солевого буфера (РВ8) или 25 мкл РВ8 в чистом виде, путем интраназального введения на -8, -б и -4 дни перед иммунизацией в день 0.

Вслед за толеризацией, мыши были иммунизированы подкожно 100 мкл эмульсии, содержащей равные объемы полного адъюванта Фрейнда (СБА), РВ8, содержащего 200 мкг Апитопа М8б и 400 мкг МусоЬас1ег1ит ЩЬегси1о818, убитой нагреванием. Контрольная группа мышей, предварительно толеризованная посредством РВ8 интраназально, была иммунизирована без пептида.

Через 10 дней после подкожной иммунизации подколенные и паховые лимфоузлы удаляли и оценивали Т-клеточную активацию, анализируя пролиферацию Т-клеток в ответ на различные концентрации Апитопа М8б. Пролиферацию измеряли посредством инкорпорации [³Н]-тимидина и выражали в виде индекса стимуляции = корректированное число импульсов в минуту (ссрт) от культуры, содержащей пептиды/ссрт от культуры без пептидов).

Результаты

Мыши группы А, которые были толеризованы РВ8 и затем иммунизированы Апитопом М8б, ответили на антигенную стимуляцию, когда она была проведена повторно с Апитопом М8б дозозависимым способом (фиг. 4). С увеличением концентрации пептида 8I увеличился по медиане от 2,5 до 10. Все мыши в этой группе продемонстрировали, что введение РВ8 интраназально не может вызвать толерантность к Апитопу М86.

Напротив, интраназальное предварительное введение Апитопа М86 оказывает серьезное воздействие на пролиферативный ответ лимфоцитов, стимулированных этим пептидом. Лимфоциты мышей из группы В были неспособны к ответу в какой-либо значительной степени, даже при высокой концентрации пептида - 150 мкг/мл (медиана 81 - 3, фигура 4). Эти данные подтверждают, что Апитоп М86 вызывает толерантность у лимфоцитов от НЬА-0К2 мышей.

Лимфоциты, выделенные у мыщей, которым предварительно вводили РВ8 и иммунизировали РВ8 (Группа С), не показали никакого ответа на Апитоп М86 (фигура 4). Отсутствие ответа на пептид у Группы С подтверждает, что пролиферативный ответ, наблюдаемый в группе А, действительно был ответом на иммунизацию Апитопом М86.

Вывод

Эти данные подтверждают гипотезу, что пептид МВР (Апитоп М86), который не требует процессинга и связывается с молекулой МНС класса II НБА:ЭВ2. может вызывать толерантность при введении интраназально.

Пример 3. Индукция толерантности с помощью Апитопа М87 (МВР 83-99) у мышей, трансгенных по двум генам (НБА:ЭВ2 и Т-клеточный рецептор (МВР) 82-100).

Данное исследование изучает способность Апитопа М87 (пептида МВР 83-99) вызывать толерантность у мышей, трансгенных по двум генам и экспрессирующих НБА:ЭВ2 вместе с Т-клеточным рецептором для связанного с НБА:ЭВ2 пептида основного белка миелина (МВР) 82-100.

Спленоциты от данных животных, трансгенных по двум генам, пролиферируют ίη νίίτο в ответ на Апитоп М87. Снижение или исчезновение ίη νίίτο ответа спленоцитов на апитоп, вслед за его повторным введением ίη νίνο, указывает на то, что состояние толерантности достигнуто.

Вызывать толерантность пробовали с использованием как интраназального, так и подкожного/чрезкожного путей введения апитопа.

Индукция толерантности

Были использованы группы из 6 или 7 сопоставимых по возрасту (8-12 недель) и полу мышей, трансгенных по двум генам. В первом эксперименте одной группе вводили 10 раз интраназально 100 мкг Апитопа М87 в 25 мкл РВ8 через одинаковые интервалы в течение трех недель. Контрольная группа получала чистый РВ8. Во втором эксперименте такое же количество пептида давали посредством подкожного/чрезкожного введения в 100 мкл РВ8. Контрольная группа получила такой же объем РВ8.

Анализ пролиферации

Через три дня после последнего введения пептида или РВ8, удаляли селезенки и готовили клеточные суспензии. Спленоциты инкубировали с 0,5 или 5 мкг/мл Апитопа М87, и оценивали пролиферацию с помощью инкорпорации [³Н]-тимидина после 48, 72 и 96 часов культивирования. Результаты выражены в виде индекса стимуляции (81 = число импульсов в минуту (срт) от культуры, содержащей антиген/число импульсов в минуту без антигена).

Измерение цитокинов

Во втором эксперименте, где толерантность была индуцирована через подкожный/чрезкожный путь введения, собирали супернатанты клеточной культуры спленоцитов через 48 и 72 ч культивирования и анализировали на наличие ΙΡΝγ и интерлейкина-2 (1Ь-2) с использованием иммуноферментного анализа (ЕЫ8А).

Результаты

Во всех трех исследованных временных точках спленоциты мышей, которым вводился РВ8, как при интраназальном, так и при подкожном/чрезкожном путях введения, показали сильную пролиферацию в ответ на Апитоп М87; сила ответа повышалась с увеличением концентрации пептида. Поразительное снижение пролиферации наблюдали в культуре спленоцитов мышей, получавших Апитоп М87 посредством обоих путей введения. Как показано на фиг. 5, после 72 ч средний 8Ι, наблюдаемый в культурах, содержащих 5 мкг/мл Апитопа М87, был 17 у мышей, получавших интраназально Апитоп М87. В соответствующих культурах от контрольных мышей, получавших РВ8, средний наблюдаемый 8Ι был 89. Аналогично, как показано на фигуре 6, введение Апитопа М87 посредством подкожного/чрезкожного пути привело к снижению 8Ι в среднем от 124 у животных, получавших РВ8, до 49 у животных, получавших Апитоп М87.

Уровни ΙΡΝν и 1Ь-2, определенные в супернатантах культур после 48 часов культивирования, показаны на фигуре 7. Видно, что повторное лечение пептидом ίη νίνο вызывает впечатляющее снижение секреции обоих цитокинов, параллельно со снижением пролиферативного ответа.

Вывод

Данные результаты показывают, что толерантность к Апитопу М87 может быть успешно вызвана на мышиной модели, созданной для имитации человеческой системы, и поддерживают возможность его использования в терапии рассеянного склероза. Кроме того, его эффективность сохраняется при введении посредством подкожного/чрескожного пути, т.е. предпочтительного пути введения для людей.

Несмотря на то что эффективность Апитопов М86 и М87 была показана ίη νίνο, в настоящее время

- 7 017999 не представляется возможным продемонстрировать эффективность Апитопов М81 и М84. Это связано с неудачей в отношении трансгенных мышей, зкспрессирующих молекулу НБЛ-Эр6. Мыши, экспрессирующие молекулу, были созданы, но было обнаружено, что они не способны производить СЭ4 Т-клетки в тимусе и не могут, таким образом, повышать иммунный ответ на антиген в контексте НЬЛ-Эрб.

Пример 4. Исследование с увеличением дозы с композицией из четырех пептидов МВР.

Комбинация из четырех пептидов (МВР 30-44, 131-145, 140-154 и 83-99) была использована в открытом исследовании с увеличением дозы ЛТХ-М8-1467 у пациентов с вторичным прогрессирующим рассеянным склерозом.

У пациентов контролировали остроту зрения (т.е. снижение оптического неврита), иммунологические параметры и воспаление в ЦНС через четыре недели и через три месяца после приема финальной дозы.

Пример 4А. Контроль остроты зрения.

Оптический неврит (ОН) представляет собой воспаление с сопутствующей демиелинизацией оптического нерва, обслуживающего сетчатку глаза.

Оптический неврит является одним из наиболее часто проявляющихся в настоящее время симптомов рассеянного склероза и одним из наиболее распространенных симптомов в начале М8. Обычные симптомы ОН включают: нечеткость зрения, потерю остроты зрения, частичную или полную потерю цветового зрения, полную или частичную слепоту и боль за глазом.

Был исследован эффект лечения при помощи ЛТХ-М8-1467 оптического неврита, который развился в результате нейровоспалительного процесса при М8. ЛТХ-М8-1467 давали согласно протоколу увеличения дозы, отмеченному выше, затем через месяц после лечения проверяли остроту зрения пациента с использованием стандартной таблицы Шеллена (фиг. 8).

Результаты показали клинически значимое улучшение остроты зрения через один месяц после лечения. Это было продемонстрировано в анализе исследования остроты зрения при начальном скрининге в сравнении с последующим тестом через один месяц. Начальные показатели зрения при скрининге 6/24 и 6/9 (на правом и левом глазу, соответственно) улучшились после лечения до 6/9 (правый глаз) и 6/6 (левый глаз). Зрение пациентов ранее оставалось неизменным в течение последних двух лет.

Пример 4В. Контроль иммунологических параметров. Как объяснялось выше, действие пептидной терапии с коктейлем, содержащим апитоп™ пептиды из основного белка миелина (ЛТХ-М8-1467), исследовали на пациентах с М8. Каждого пациента отбирали перед началом исследования вплоть до 14 дней перед первой дозой (визит 1). Первую дозу в количестве 25 мкг ЛТХ-М8-1467 давали на визите 2, 50 мкг на визите 3, 100 мкг на визите 4, 400 мкг на визите 5 и 800 мкг на визитах 6 и 7. Дальнейшие обследования проводили через один месяц и через три месяца последующего наблюдения (визиты 8 и 9). Следующая таблица обобщает протокол и показывает количество визитов в клинику, сделанные каждым пациентом, вместе с дозой пептида и образцом крови.

Таблица 1

НОМЕР	ДОЗА ΑΤΧ-Μ3-1467	КОММЕНТАРИЙ
ВИЗИТА	(мкг)
1	—	Предварительный визит. Образец крови для иммунологии (50 мл)
2	25	Образцы для иммунологии не собирали
3	50	Образец крови для иммунологии (50 мл)
4	юо	Образец крови для иммунологии (50 мл)
5	400	Образец крови для иммунологии (50 мл)
6	800	Образец крови для иммунологии (50 мл)
7	800	Образец крови для иммунологии (5 0 мл)
8		Образец крови для иммунологии (50 мл) взят через 4 недели после визита 7

- 8 017999

Образцы крови забирали на визите 1, и визитах с 3 до 9, и тестировали на иммунный ответ к различным антигенам, включая очищенное белковое производное (ΡΡΌ) МуеоЬасЗспит 1иЬегси1о818, в качестве позитивного контроля, очищенный основной белок миелина (ΜΒΡ) человека и АТХ-МБ-1467. Иммунный ответ оценивали, учитывая Т-клеточную пролиферацию ίη νίίτο, секрецию цитокинов в супернатантах тканевой культуры и выработку РНК цитокинов.

Результаты

Наблюдали значительный ответ на ΜΒΡ, с пиком пролиферации к визиту 3 (фиг. 9). Это коррелировало с пиком секреции интерферона гамма. Важно, однако, что уровень секреции интерферона гамма снижался после третьего визита и был на фоновом уровне к визиту 8. Уровни ΣΗ-10 не изменялись существенно до визита 7, после которого происходило значительное увеличение секреции данного цитокина. Уровни 1Ь-4, 1Ь-5 и ΤΝΡ альфа были близки к фоновым в ответ на ΜΒΡ во всех временных точках.

Никакого пролиферативного ответа или увеличенного цитокинового ответа не наблюдали для АТХМБ-1467 (фиг. 10).

Вывод

Ответ на ΜΒΡ, наблюдаемый к визиту 3, демонстрирует повышенную секрецию 1Ь-2 и интерферона гамма, которая коррелирует с пиком пролиферации в данной временной точке. Предполагается, что такое усиление ответа обусловлено введением пептидов.

Важно, однако, что за временным увеличением цитокиновой секреции следует возвращение интерферона гамма к исходным уровням. Было также значительное увеличение секреции 1Б-10 после второго введения АТХ^Б-14 67 в самой высокой дозе. Ранее было показано на животных моделях, что специфическая иммунотерапия синтетическими пептидами эффективна и приводит к индукции регуляторных Т-клеток, секретирующих 1Б-10. Индукция регуляторных Т-клеток, секретирующих 1Б-10, у мышей, подразумевает временный ответ на пептиды с секрецией интерферона гамма на низком уровне (ЕигкИаП е1 а1., 1999 Ιηΐ 1ттипо1 11: 1625-1634; БипбНеб! е1 а1., 2003 I 1ттипо1 170:1240-1248). За этим следует снижение интерферона гамма и сопутствующее увеличение ΙΗ-10. Кинетика секреции цитокинов, выявленная после лечения с помощью АΤX-ΜБ-1467, фактически воспроизводит паттерн, ранее наблюдавшийся у экспериментальных мышей, подтверждая, что ΑΤΧ4Μ3-1467 может индуцировать регуляторные Т-клетки, секретирующие 1Б-10.

Пример 4С. Ответ на ΜΒΡ значительно снижается в результате лечения с помощью ΑΤΧ4Μ3-1467.

Шесть пациентов с вторичным прогрессирующим рассеянным склерозом (БΡΜБ) были внесены в список и завершили фазу клинического испытания 1/11а, выполненную по протоколу увеличения дозы, изложенному в примере 4В.

НЬА-генотипирование показало, что шесть пациентов демонстрируют широкий спектр гаплотипов НЬА, включая 5 гаплотипов НЬА-ИК.15, ассоциированных с ΜБ. Широкое распределение НЬА-ИВШ у пациентов, вовлеченных в данное исследование, означает, что ΑΤX-ΜБ-1467 будет безопасен и хорошо переносим пациентами с ΜБ, независимо от их НЬА-ИВ генотипа.

Лечение пациентов с помощью ΑΤX-ΜБ-1467 не вызывает выработку антипептидных антител. Это указывает на то, что использование ΑΤX-ΜБ-1467 безопасно и коррелирует с отсутствием осложнений в месте инъекции или проявлениями аллергии, связанными с исследованием.

Тщательный анализ Т-клеточного ответа показал, что:

a) лечение ΑΤX-ΜБ-1467 не имеет неспецифического иммуносупрессивного действия. Это ясно продемонстрировано фактом сохранения иммунного ответа на очищенное белковое производное, антиген из микобактерии туберкулеза (данные не показаны);

b) лечение ΑΤX-ΜБ-1467, с использованием данного протокола, не приводит к агрессивному иммунному ответу на ΑΤX-ΜБ-1467 или основной белок миелина (данные не показаны);

c) сравнение Т-клеточного пролиферативного ответа до (визит 1) и после (визит 8) лечения АТХΜБ-1467 выявило значительное снижение ответа на основной белок миелина (фиг. 11). Все три индивидуума, которые отвечали на ΜΒΡ при визите 1, показали снижение ответа на белок на визите 8. Если брать всех пациентов вместе, то имеются указания на значительное снижение ответа на МВР от визита 1 к визиту 8 (Р=0,0313).

Материалы и методы Составы и дозы

Каждый из четырех пептидов производят независимо по контракту с использованием твердофазного пептидного синтеза и очищен с использованием ВЭЖХ. Пептиды хранят в лиофилизованном виде.

ΑΤX-ΜБ-1467 представляет собой 1:1:1:1 смесь Апитопов ΜБ1, ΜБ4, ΜБ6 и ΜБ7 в фосфатносолевом буфере для чрезкожного введения.

Две концентрации ΑΤX-ΜБ-1467, обозначенные ΑΤX-ΜБ-1467Α и ΑΤX-ΜБ-1467Β и содержащие 4 мг/мл и 0,5 мг/мл пептида, соответственно, были приготовлены для того, чтобы сделать возможным увеличение дозы. Режим использует пять инъекций с увеличением дозы (общая доза - 25, 50, 100, 400 и 800 мкг), которые даются от 7 до 14 дней раздельно. Пациенты затем получают вторую дозу 800 мкг в период от с 7 до 14 дня после первой дозы в 800 мкг.

После получения всех шести доз исследуемого препарата пациента оценивали через четыре недели

- 9 017999 и через 3 месяца после финальной дозы.

Проверка остроты зрения

Использовали таблицу Шеллена стандартного размера для проверки на расстоянии 6 метров с подсветкой сзади, пациент сидит на расстоянии 6 м (фиг. 8).

Каждый глаз исследовали раздельно для самой нижней строчки в таблице, которую пациент может прочитать. Результаты затем обозначали как Острота зрения = 6/ (строка, которую пациент прочел).

Иммуноанализ

ί) Т-клеточная пролиферация.

Криоконсервированные РВМС высаживают в 1 мл культур, содержащих 1,5х10⁶ клеток в α-МЕМ, в 48-луночные планшеты для культивирования тканей (Мтс 1п1сгпа11опа1. Со51аг. Согтпд 1пс. Νον Уотк И8А). Ответ на МВР и пептидные антигены в различных концентрациях контролируют на протяжении периода в 10 дней. Контрольные лунки не содержат антиген. После 20 ч или 2, 4, 6, 8 и 10 дней культивирования две аликвоты клеточной суспензии по 100 мкл отбирают из каждой культуры в 1 мл для измерения пролиферации в ответ на антиген по захвату [³Н] тимидина.

ίί) Измерение секретируемых цитокинов (1Ь-2 и 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-10, ΤΝΡ-α и ΙΡΝ): Оу1отс1пс Веаб Аггау анализ.

Уровни цитокинов в супернатанте культуры определяют с использованием Су1оте1пс Веаб Аккау (ВесЮп Шскепкоп Вюкшепсек, СоШеу, ОхГогб, иК) согласно инструкциям производителя. После сбора данных по образцам, с использованием РАС8 СайЬит (ВЦ Вюкаепсек), результаты генерируются в виде графиков и таблиц с помощью программного обеспечения ВЭ СВА. Минимальные уровни цитокинов, поддающиеся количественному определению, следующие: 1Ь-2 и 1Ь-4 - 2,6 пг/мл, 1Ь-5 - 2,4 пг/мл, 1Ь-10 и ΤΝΡ-α - 2,8 пг/мл, ΙΡΝγ - 7,1 пг/мл.

Количественная ПЦР в реальном времени для измерения РНК цитокинов (1Ь-2, 1Ь-10, ΙΡΝγ и ΤΝΡа)

Для анализа 1Ь-2, 1Ь-10, ΙΡΝγ и ΤΝΡ-α, проводили ПЦР в конечном объеме 20 мкл, содержащем кДНК, ПЦР буфер, 6,25 мМ МдС1₂, 0,4 мМ смесь 6ΝΤΡ, прямой и обратный праймеры (концентрации прямого праймера: 1Ь-2 - 300 нМ, 1Ь-10 - 600 нМ, ΙΡΝγ - 600 нМ, ΤΝΡ-α - 600 нМ, концентрации обратного праймера: Ш-2 - 600 нМ, Ш-10 - 900 нМ ΙΡΝ-γ - 900 нМ, ΤΝΡ-α - 600 нМ), 200 нМ зонда ВАМΤΛΜΡΛ и 0,05 и/мкл Р1айпит Τа^-полимеразы Цпуйтодеп). Условия циклов представлены ниже: начальная денатурация при 94°С в течение 30 с, затем 35 циклов по 15 с при 94°С и 1 мин при 60°С. Для β2 микроглобулина смесь для ПЦР, описанную выше, дополняли 0,1 мкМ прямого и обратного праймеров, 3 мМ МдС1₂ и производили количественный анализ с использованием 8УВР Огееп Ι (Мо1еси1аг РгоЬек Шс., Х30000 разведение исходного раствора). После денатурации в течение 1 мин при 95°С амплификация продолжалась 35 циклов - 15 с при 94°С, 1 мин при 61°С и 1 мин при 72°С. ПЦР реакции и флюоресцентную детекцию полученных ампликонов проводили на Орйсоп 2 (М1 Кекеатсй, И8А). Исходный уровень флюоресценции устанавливали с использованием измерений от цикла 1 до цикла 10. Величины 0'1 рассчитывали, определяя точку, в которой флюоресценция в 8-10 раз превышает стандартное отклонение от базового уровня. Образцы были продублированы, и количество копий рассчитывали по стандартной кривой для каждой ДНК-мишени. Различия в числе внесенных копий РНК и синтезе кДНК корректировались посредством нормализации экспрессии цитокина к экспрессии β-2 микроглобулина.

ИЬА типирование

Анализ экспрессии гена НЬА выполняли с помощью стандартной техники конформационного полиморфизма однонитевой ДНК с использованием полимеразной цепной реакции на ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови. НЬА-тип каждого пациента использовали для интерпретации результатов иммунологических анализов.

Анализ сывороточных анти-пептидных антител

96-луночные плашки покрывают 1-10 мкг/мл каждого апитопа М81, М84, М86 или М87 при рН 9,6 в течение ночи при 4°С. Плашки промывают четыре раза фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, 0,05% Шсееп (РВЗ-Уетееп), и лунки блокируют с помощью 5% ВС8 в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Сыворотку разводят 1:100 в РВЗ-Бгееп и инкубируют в продублированных лунках в течение одного часа при комнатной температуре. После 4 промываний козлиные антитела против человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (81дта) и разведенные 1:12000 в РВ8, добавляли в каждую лунку и инкубировали плашки в течение одного часа при комнатной температуре. После 4 промываний 0,4 мг/мл о-фенилендиамин дигидрохлоридом (81дта) добавляли 30% пероксид водорода и инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Окрашивание останавливали с помощью 2,0 М Н₂8О₄(50 мкл) и измеряли величину оптической плотности (ОЭ) при 490 нм с помощью спектрофотометра для чтения планшетов с ЕЫ8А. Результаты представлены в виде ОЭ для сыворотки, разведенной 1:100.

ЯМР-сканирование

Воспаление в ЦНС исследовали ЯМР-сканированием с использованием контрастирования с гадолинием. Исследовали объем и количество увеличившихся бляшек и сравнивали с исходным сканирова

- 10 017999 нием.

Различные модификации и вариации описанных способов и методов по изобретению будут ясны специалистам в данной области в пределах объема и сущности изобретения. Хотя данное изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не ограничено данными конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые общеизвестны специалистам в области химии или биологии или в смежных областях, охватываются настоящим изобретением. Все публикации, упомянутые в вышеизложенном описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Композиция для лечения или профилактики рассеянного склероза или оптического неврита, которая содержит следующие пептиды основного белка миелина:

МВР 30-44,

МВР 83-99,

МВР 131-145 и

МВР 140-154, в приблизительном соотношении 1:1:1:1.
2. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.
3. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства для лечения оптического неврита.
4. Способ лечения или профилактики рассеянного склероза у пациента, который включает стадию введения композиции по п. 1 пациенту.
5. Способ лечения или профилактики оптического неврита у пациента, который включает стадию введения композиции по п. 1 пациенту.
6. Способ по п.4 или 5, в котором композицию вводят согласно протоколу с увеличением дозы.
7. Способ по любому из пп.4-6, где композицию вводят НБА-Ирб или НЕА-ИК2-положительным пациентам.
8. Набор для получения композиции по п.1, который включает следующие пептиды основного белка миелина: