CN115298195A - 一种包含s-阻遏蛋白肽的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其包含衍生自S‑阻遏蛋白(视网膜阻遏蛋白,S‑抗原,S‑Ag)的肽。所述组合物或肽可用于防止和/或抑制S‑Ag自身免疫性，可用于治疗和/或预防葡萄膜炎。

Description

一种包含S-阻遏蛋白肽的组合物
技术领域
本发明涉及一种组合物，其包含衍生自S-阻遏蛋白(视网膜阻遏蛋白,S-抗原,S-Ag)的肽。该组合物或肽可用于防止和/或抑制S-Ag自身免疫性，能够用于治疗和/或预防葡萄膜炎。
背景技术
葡萄膜炎是指一组与葡萄膜的炎症有关的疾病。葡萄膜是位于巩膜和视网膜之间的眼睛区域，包括虹膜、睫状体和脉络膜。葡萄膜为视网膜提供大部分血液供应。相关疾病不仅限于直接影响葡萄膜的疾病，葡萄膜的临床表现还可以影响视网膜、视神经、晶状体、玻璃体和巩膜等邻近结构。
所有形式的葡萄膜炎都以炎症细胞浸润为特征，通常通过生物显微镜观察。2010年，约有2.85亿人视力受损；其中有3900万人失明，大约10％的病例是由葡萄膜炎引起的(Global data on visual impairments,The World Health Report,WHO(2010)http:// www.who.int/blindness/GLOBALDATAFINALforweb.pdf)。
目前治疗葡萄膜炎的方法包括使用糖皮质激素和其他免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤。
然而，在现有技术中仍存在对葡萄膜炎进行替代治疗的需要。本发明解决了这种需要。
发明概述
本发明人发现三种S-Ag肽的“混合物”在体外抑制或防止S-Ag特异性T细胞活化方面特别有效。
因此，本发明的第一方面提供了一种组合物，其包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽。
KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)本文中也称为9K1K。KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)本文中也称为17JK。KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)本文中也称为15N3K。
根据本发明的组合物可以用于本文所述的本发明的治疗方面。
在第二个方面，本发明提供了如本文所述的本发明的组合物，其用于在受试者中治疗和/或预防葡萄膜炎。
在第三个方面，本发明涉及如本文所述的本发明的组合物在制备用于治疗和/或预防葡萄膜炎的药物中的用途。
在第四个方面，本发明涉及在受试者中治疗葡萄膜炎的方法，包括以下步骤：向受试者给药完整或部分的SEQ ID NO:1的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽，和/或完整或部分的SEQ ID NO:2的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽，和/或或完整或部分的SEQ ID NO:3的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽。
在一个方面，本发明涉及以下组合：完整或部分的SEQ ID NO:1的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽，与完整或部分的SEQ ID NO:2的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽。
在一个方面，本发明涉及以下组合：完整或部分的SEQ ID NO:2的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽，与完整或部分的SEQ ID NO:3的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽。
在一个方面，本发明涉及以下组合：完整或部分的SEQ ID NO:1的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽，与完整或部分的SEQ ID NO:3的肽或与其具有至少60％的序列同一性的肽。
根据本发明的肽组合物可以包含如本文所述的根据本发明的氨基酸序列。在一个方面，肽组合物仅包含如本文所述的根据本发明的氨基酸序列。
受试者可为HLA-DR3。受试者可为HLA-DR2。
如本文所定义的本发明的肽或本发明的组合物可以按照剂量递增方案给药。
在第五个方面，本发明涉及包含以下S-Ag肽的试剂盒，以用于同时、单独或顺序给药：
氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或该序列的一部分或与SEQ IDNO:1具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分；和/或
氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或该序列的一部分或与SEQID NO:2具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分；和/或
氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或该序列的一部分或与SEQID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分。
该试剂盒可用于治疗葡萄膜炎。
附图说明
图1：肽9K1K在体内被正确负载到MHC II类上。显示了肽特异性CD4+T细胞对体内负载在树突细胞上的肽的应答。向HLA-DR2转基因小鼠皮下注射100μg9K1K肽。注射后2小时，解剖脾脏并分离CD11c+细胞(树突细胞)。这些CD11c+细胞与肽特异性CD4+细胞在37℃下共培养72小时。在这些培养物的上清液中测量IFNγ以评估CD4+T细胞对肽的应答。(*p<0.05Mann-Whitney U检验)
图2：肽17JK在体内被正确负载到MHC II类上。显示了肽特异性CD4+T细胞对体内负载在树突细胞上的肽的应答。向HLA-DR3转基因小鼠皮下注射100μg17JK肽。注射后2小时，解剖脾脏并分离CD11c+细胞(树突细胞)。这些CD11c+细胞与肽特异性CD4+细胞在37℃下共培养72小时。在这些培养物的上清液中测量IFNγ以评估CD4+T细胞对肽的应答。(***p<0.001Mann-Whitney U检验)
图3：肽15N3K在体内被正确负载到MHC II类上。显示了肽特异性CD4+T细胞对被体内结合在树突细胞上的肽的反应。向HLA-DR3转基因小鼠皮下注射100μg 15N3K肽。注射后2小时，解剖脾脏并分离CD11c+细胞(树突细胞)。这些CD11c+细胞与肽特异性CD4+细胞在37℃下共培养72小时。在这些培养物的上清液中测量IFNγ以评估CD4+T细胞对肽的应答。(***p<0.001Mann-Whitney U检验)
图4：9K1K单独诱导DR2tg小鼠对S-Ag蛋白的耐受性。在第-15、-13和-11天向小鼠的侧腹皮下注射0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml 9K1K，然后在第-8、-6和-4天注射3次100μg/ml(剂量递增方案)。在第0天，用抗原/CFA在尾根部对小鼠进行皮下免疫。免疫后10天处死小鼠以测量S-Ag再刺激后LN细胞和脾细胞的活化。测量培养上清液中的IFNγ浓度作为细胞活化的指标。数据表示PBS处理的小鼠(黑线)和9K1K处理的小鼠(灰线)的IFNγ浓度的平均值±SEM。使用双向方差分析测量对T细胞活化的整体处理效果。使用了Dunnett的多重比较检验，图中显示出显著差异(**p<0.01；****p<0.0001)。图中显示了与对照组相比对IFNγ产量的抑制百分比。(A)LN中对S-Ag的耐受性。以IFNγ浓度(pg/ml)表示IFNγ产量。(B)脾脏中对S-Ag的耐受性。以IFNγ浓度(pg/ml)表示IFNγ产量。LN为淋巴结。数据代表3个独立实验。
图5：17JK单独诱导DR3tg小鼠对S-Ag蛋白的耐受性。在第-15、-13和-11天向小鼠的侧腹皮下注射0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml 17JK，然后在第-8、-6和-4天注射3次100μg/ml(剂量递增方案)。在第0天，用抗原/CFA在尾根部对小鼠进行皮下免疫。免疫后10天处死小鼠以测量S-Ag再刺激后LN细胞和脾细胞的活化。测量培养上清液中的IFNγ浓度作为细胞活化的指标。数据表示PBS处理的小鼠(黑线)和17JK处理的小鼠(灰线)的IFNγ浓度的平均值±SEM。使用双向方差分析测量对T细胞活化的整体处理效果。使用了Dunnett的多重比较检验，图中显示出显著差异(**p<0.01；****p<0.001)。图中显示了与对照组相比对IFNγ产量的抑制百分比。(A)LN中对S-Ag的耐受性。以IFNγ浓度(pg/ml)表示IFNγ产量。(B)脾脏中对S-Ag的耐受性。以IFNγ浓度(pg/ml)表示IFNγ产量。LN为淋巴结。数据代表3个独立实验。
图6：15N3K单独诱导DR3tg小鼠对S-Ag蛋白的耐受性。在第-15、-13和-11天向小鼠的侧腹皮下注射0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml 15N3K，然后在第-8、-6和-4天注射3次100μg/ml(剂量递增方案)。在第0天，用抗原/CFA在尾根部对小鼠进行皮下免疫。免疫后10天处死小鼠以测量S-Ag再刺激后LN细胞和脾细胞的活化。测量培养上清液中的IFNγ浓度作为细胞活化的指标。数据表示PBS处理的小鼠(黑线)和15N3K处理的小鼠(灰线)的IFNγ浓度的平均值±SEM。使用双向方差分析测量对T细胞活化的整体处理效果。使用了Dunnett的多重比较检验，图中显示出显著差异(**p<0.05；****p<0.0001)。图中显示了与对照组相比对IFNγ产量的抑制百分比。(A)LN中对S-Ag的耐受性。以IFNγ浓度(pg/ml)表示IFNγ产量。(B)脾脏中对S-Ag的耐受性。以IFNγ浓度(pg/ml)表示IFNγ产量。LN为淋巴结。数据代表3个独立实验。
图7：与单独使用17JK或15N3K治疗相比，用肽混合物ATX975处理能够更有效地降低DR3tg小鼠中S-Ag诱导的免疫细胞活化。在第-15、-13和-11天分别在小鼠侧腹皮下注射0.015nmol、0.15nmol和1.5nmol肽，然后在第-8、-6和-4天注射3次15nmol肽(剂量递增方案)。对于用含有3种肽的混合物(ATX975)进行的处理，这些剂量是按每种肽给药的(达到45nmol肽的总最高剂量)。在第0天，用抗原/CFA在尾根部对小鼠进行皮下免疫。免疫后10天处死小鼠以测量S-Ag再刺激后脾细胞的活化。数据表示PBS处理的小鼠(黑线)和肽处理的小鼠(灰线)的IFNγ浓度的平均值±SEM。使用双向方差分析测量对T细胞活化的整体处理效果。使用了Dunnett的多重比较检验，图中显示出显著差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001，与对照组相比；#p<0.05，####p<0.0001，与ATX975组相比)。图中显示了与对照组相比对IFNγ产量的抑制百分比。(A)脾脏中对S-Ag的耐受性。以IFN-γ浓度(pg/ml)表示IFN-γ产量。(B)脾脏中对S-Ag的耐受性。以IFN-γ浓度(pg/ml)表示IFN-γ产量。
图8：与单独使用9K1K治疗相比，用肽混合物ATX975处理能够更有效地降低DR2tg小鼠中S-Ag诱导的免疫细胞活化。在第-15、-13和-11天分别在小鼠侧腹皮下注射0.015nmol、0.15nmol和1.5nmol肽，然后在第-8、-6和-4天注射3次15nmol肽(剂量递增方案)。对于用含有3种肽的混合物(ATX975)进行的处理，这些剂量是按每种肽给药的(达到45nmol肽的总最高剂量)。在第0天，用抗原/CFA在尾根部对小鼠进行皮下免疫。免疫后10天处死小鼠以测量S-Ag再刺激后脾细胞的活化。数据表示PBS处理的小鼠(黑线)和肽处理的小鼠(灰线)的IFNγ浓度的平均值±SEM。使用双向方差分析测量对T细胞活化的整体处理效果。使用了Dunnett的多重比较检验，图中显示出显著差异(*p<0.05；**p<0.01)。图中显示了与对照组相比对IFNγ产量的抑制百分比。脾脏中对S-Ag的耐受性。以IFN-γ浓度(pg/ml)表示IFN-γ产量。
图9：肽9K1、17JK和15N3K的体外肽-MHC II结合的不同模式。对肽9K1、17JK和15N3K与重组HLA-DRA1*0101、DRB1*0101(DR1)、DRB1*1501(DR2)、DRB1*0301(DR3)、DRB1*0401(DR4)、DRB1*1101(DR11)、DRB1*0405(DR4*05)和DRB1*0901(DR9)的结合在体外进行了评估。显示了每种HLA-DR分子的IC50值(μM)并以颜色编码。低值(绿色)表示强结合，高值(红色)表示弱(或相对较弱)的结合。
图10：肽15N3K的变体为apitope。使用APIPS测定法测试了15N3K肽变体作为apitope的能力(即与MHCII分子结合并由抗原呈递细胞呈递给T细胞而不进行抗原加工)。用SAg免疫DR3tg小鼠并产生杂交瘤。将5*104个SAg特异性杂交瘤细胞与5*104个新鲜或固定的商售APC(VAVY)细胞一起培养。如图所示，用10或25μg/ml肽刺激培养物。48小时后收集上清液，通过IL-2ELISA测量T细胞活化。该图表示重复测量的平均值±SEM。
发明详述
本发明提供了一种用于治疗和/或预防葡萄膜炎的新的替代治疗选择。如本申请中所证明的，SEQ ID NO:1、2和3的肽的组合在HLA-DR转基因小鼠的耐受模型中诱导了对S-Ag的耐受。
因此，本发明的第一方面涉及一种组合物，该组合物包含多种来自S-Ag的肽，即本文定义的本发明的肽，优选SEQ ID NO:1、2和/或3的肽。
S-阻遏蛋白
S-阻遏蛋白(也被称为视网膜阻遏蛋白,S-抗原或S-Ag)是一种在视网膜和松果体中表达的可溶性光受体蛋白。已知它参与光活化转导级联的脱敏，并从其与活化的视紫红质的结合中被首次分离出来。晶体结构显示了由铰链区连接的两个反平行β-折叠结构域以及氨基末端折叠后部的短α-螺旋。
视觉色素视紫红质(RhhhoG)的光激活形式与视网膜G蛋白转导素相互作用，从而在转导素的α亚基上启动GDP分子与GTP的交换。在其GTP结合形式中，转导素与Rh*解离，并通过与其两个抑制性亚基PDEγ结合来激活环状GMP磷酸二酯酶(PDE)。结果是内部传递素环状GMP的浓度迅速下降。因为Rh*和转导素的相互作用只需要大约1ms，因此单个Rh*可以随后与数百个转导素分子相互作用。PDE的周转率可以是每秒每PDE几千个水解cGMP。因此，为了限制光反应以及快速恢复，在激活过多的PDE分子之前，必须快速有效地消除Rh*。Rh*的这种失活分两个步骤完成：Rh*的磷酸化降低了其催化转导素核苷酸交换的能力，随后阻遏蛋白与P-Rh*的结合完全屏蔽了它与转导素的进一步相互作用。
成熟的人类S-Ag的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:4)。
UniProt数据库，P10523(https://www.uniprot.org/)
Figure BDA0003710240870000071
葡萄膜炎
临床上，葡萄膜炎通常根据其主要影响的眼睛部位被分为以下类别：前部葡萄膜炎、中部葡萄膜炎、后部葡萄膜炎或全葡萄膜炎。
前部葡萄膜炎是最常见的葡萄膜炎形式，包括虹膜睫状体炎和虹膜炎。虹膜炎是前房和虹膜的炎症，而虹膜睫状体炎包括睫状体的炎症。
中部葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)通常是指玻璃体炎——玻璃体腔内细胞的炎症，与炎性物质在睫状体扁平部上的沉积有关。
后部葡萄膜炎(脉络膜视网膜炎)为视网膜和脉络膜区域的炎症。
全葡萄膜炎泛指影响葡萄膜所有层级的炎症。
葡萄膜炎也可被分为传染性的或非传染性的，在发达国家，与自身免疫性疾病相关的葡萄膜炎(即主要是非传染性的)更为常见。通常用于研究葡萄膜炎的动物模型也是由自身免疫性引发，两者之间具有清楚的联系。预计25-30％的葡萄膜炎与全身性资深免疫性疾病或自身炎症性疾病有关。
在本发明的一个方面，葡萄膜炎为非传染性葡萄膜炎。
耐受性
T细胞表位在对任何抗原(无论是自身抗原还是外来抗原)的适应性免疫反应中都发挥着核心作用。T细胞表位在过敏性疾病(包括过敏和移植排斥)中发挥的核心作用已通过使用实验模型得到证实。通过注射合成肽(基于T细胞表位的结构)结合佐剂，可以诱导自身免疫或过敏性疾病。
相对的，已显示通过给药可溶形式的肽表位来诱导对特定抗原的免疫原性耐受性。可溶性肽的给药已被证明是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE-多发性硬化症(MS)模型)(Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165；Liu和Wraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263；Anderton和Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28:1251-1261)；和关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜炎的实验模型(如上所述在Anderton和Wraith(1998)中进行了综述)中抑制疾病的有效手段。这也已被证明是治疗EAE中进行性疾病的一种方法(Anderton和Wraith(1998)，如上)。
耐受性是对抗原的应答失败。对自身抗原的耐受性是免疫系统的一个基本特征，当这种耐受性丧失时，就会导致自身免疫性疾病。适应性免疫系统必须保持对多种感染因子作出应答应的能力，同时避免对自身组织中包含的自身抗原的自身免疫攻击。这在很大程度上是通过胸腺中高亲和力T淋巴细胞的负选择来控制的(中枢耐受性)。然而，并非所有自身抗原都在胸腺中表达，因此自身反应性胸腺细胞的死亡仍然不完整。因此，外周组织中成熟的自身反应性T淋巴细胞也可以通过某些机制获得耐受性(外周耐受性)。Anderton etal(1999)Immunological Reviews 169:123-137中给出了中枢和外周耐受机制的综述。另见Wraith(2016)Nature 530:422-423。
现有数据表明，葡萄膜炎可由包括S-Ag在内的视网膜蛋白产生的自身活性的T细胞导致，从而引起炎症且造成慢性疾病。本发明的组合物能够诱导对自身抗原如S-Ag的耐受性，使得当向受试者给药时，它可以恢复对S-Ag蛋白的耐受性并减少病原性免疫反应。
Apitope
在适应性免疫应答中，T淋巴细胞能够识别蛋白质抗原的表位。抗原呈递细胞(APC)吸收蛋白抗原并将它们降解成短的肽片段。肽可与细胞内的主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子结合并被转运至细胞表面。当与MHC分子一起被呈递至细胞表面时，该肽可被T细胞识别(通过T细胞受体(TCR))，在这种情况下该肽为T细胞表位。
因此，表位是源自抗原的肽，其能够结合到MHC分子的肽结合槽并被T细胞识别。
最小表位是衍生自表位的最短片段，它能够与MHC I类或II类分子的肽结合槽结合并被T细胞识别。对于给定的免疫原性区域，通常可以生成一组“嵌套的”重叠肽作为表位，所有这些肽都包含最小表位，但它们的侧翼区域不同。
出于同样的原因，可以通过测量对截短肽的应答来鉴定特定MHC分子的最小表位:T细胞的结合。例如，如果对重叠文库中包含残基1-15的肽产生响应，则在两端截短的组(即1-14、1-13、1-12等和2-15、3-15、4-15等)可用于鉴定最小表位。
本发明人先前已经确定，肽与MHC分子结合并在没有进一步加工的情况下被呈递给T细胞的能力与肽在体内诱导耐受性的能力之间存在联系(WO 02/16410)。如果肽太长而无法在没有进一步处理(例如剪切)的情况下结合MHC分子的肽结合槽，或者以不适当的构象结合，那么它在体内不会是致耐受性的。另一方面，如果肽具有合适的大小和构象以直接结合MHC肽结合槽并被呈递给T细胞，则可以预期该肽可用于诱导耐受性。
因此，可以通过研究肽是否可以与MHC分子结合并在体外无需进一步抗原加工而被呈递给T细胞来研究肽的致耐受能力。
S-Ag apitope(不依赖抗原加工的表位)能够与MHC II类分子结合并刺激S-Ag特异性T细胞的反应，而无需进一步的抗原加工。根据WO 02/16410中描述的基于规则的方法，可以预期此类apitope会导致对S-Ag的耐受性。
与MHC I类分子结合的肽的长度通常为7到13个、更常见的是8到10个氨基酸。通过肽主链中的原子与所有MHC I类分子的肽结合槽中的不变位点之间的接触，在肽的两端稳定了其结合。在槽的两端存在结合肽的氨基和羧基末端的不变位点。肽长度的变化通过肽骨架中的扭结来调节，通常在带来柔性的脯氨酸或甘氨酸残基处发生。
与MHC II类分子结合的肽的长度通常在8到20个氨基酸之间，更通常在10到17个氨基酸之间，并且可以更长(例如最多40个氨基酸)。这些肽位于沿MHC II肽结合槽的延伸构象中，该槽(与MHC I类肽结合槽不同)在两端都是开放的。肽主要通过主链原子与排列在肽结合槽内的保守残基接触而被保持在原位。
在一个优选的实施方案中，衍生自S-Ag的肽能够与MHC II类分子结合而无需进一步加工。
肽
术语“肽”根据其标准含义是用来指一系列彼此相连的残基(通常为L-氨基酸)，通常通过相邻氨基酸的a-氨基和羧基之间的肽键彼此相连。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。
本发明的肽可以使用化学方法制备(Peptide Chemistry,A utilityTextbook.Mikos Bodansky,Springer-Verlag,Berlin.)。例如，肽可以通过固相技术合成(Roberge JY等人(1995)Science 269:202-204)，从树脂上裂解，并通过制备型高效液相色谱法纯化(例如，Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles,WHFreeman and Co,New York NY)。例如，可以根据制造商提供的说明使用ABI 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现自动化合成。
肽可替代地通过重组方式或通过从更长的多肽裂解来制备。例如，可以通过从S-抗原蛋白裂解、随后对一端或两端进行修饰来获得肽。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解程序)来确认。
出于实践目的，肽可显示出各种其他特征。例如，重要的是肽在体内足够稳定以可用于治疗。肽的体内半衰期可以是至少10分钟、30分钟、4小时或24小时。
本发明所用的肽如下所示：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽。
根据本发明的肽可包含或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:1、2或3的肽具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一个方面，肽与SEQ ID NO:1、2或3具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽:
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列的全部或一部分的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的序列的全部或一部分的肽和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的序列的全部或一部分的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的肽.
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的序列的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含以下S-Ag肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)的肽；和/或
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列的肽。
在优选的方面，所述肽包含SEQ ID NO:1、2和/或3。在进一步的方面，所述肽由SEQID NO:1、2和/或3组成。
可以通过任何方便的方法来评估序列同一性。然而，为了确定序列之间的序列同一性程度，对序列进行多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson etal.,(1994)Nucleic Acids Res.,22:4673-4680)。对序列对进行比较和比对的程序，如ALIGN(Myers et al.,(1988)CABIOS,4:1-17),FASTA(Pearson et al.,(1988)PNAS,85:2444-2448；Pearson(1990))、Methods Enzymol.,183:63-98)和gapped BLAST(Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供了基于结构的蛋白质序列比对(Holm(1993)J.Mol.Biol.,233：123-38；Holm(1995)Trends Biochem.Sci.,20：478-480；Holm(1998)Nucleic Acid Res.,26：316-9)。
多序列比对和同一性百分比计算可以使用标准BLAST参数确定(使用来自所有可用生物的序列，矩阵Blosum 62，缺口成本：存在11，扩展1)。
或者，可以使用以下程序和参数：程序：Align Plus 4,version 4.10(Sci EdCentral Clone Manager Professional Suite)。DNA比较：全局比较，标准线性评分矩阵，错配罚分＝2，开放空位罚分＝4，扩展空位罚分＝1。氨基酸比较：全局比较，BLOSUM 62评分矩阵。
因此，本发明的范围包括所述或给定序列的变体，只要该变体保留亲本肽的功能活性，即变体在功能上是等同的，换言之，它们具有或表现出本文定义的亲本肽的活性。此类变体可包含亲本序列的氨基酸发生例如一个或多个氨基酸(例如1到14个氨基酸)的取代、添加或缺失(包括一端或两端的截短)。
还包括了功能等同的衍生物，其中一种或多种氨基酸是化学衍生的，例如被化学基团取代的氨基酸。
因此，本发明的肽可以包含SEQ ID NO:1-3的部分、区域或片段，只要该肽保留所需的活性。SEQ ID NO:1-3的部分、区域或片段的长度可以是例如6到14个残基，例如长度为6、7、8、9、10、11、12或13个残基。
本发明的肽可包含8至30个氨基酸，例如8至25个氨基酸、8至20个氨基酸、8至15个氨基酸或8至12个氨基酸。在一个方面，本发明的肽因此可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长度。
部分
本发明的肽可包含如SEQ ID NO:1、2和/或3所示的S-Ag衍生肽的全部或部分。
术语“部分”是指衍生自SEQ ID NO:1-3并且包含该肽的至少一个最小表位的肽。
这种肽可以包含一个或多个突变，通常是S-Ag衍生序列内的氨基酸取代。氨基酸可以被如甘氨酸、赖氨酸或谷氨酸的氨基酸所取代。所述肽可包含来自S-Ag衍生序列的最多三个、最多两个或一个氨基酸取代。
这样的肽可以在一个或两个末端包含非S-Ag序列衍生的氨基酸。例如，所述肽可以在一端或两端具有一个或多个甘氨酸和/或赖氨酸和/或谷氨酸残基
包括非S-Ag衍生的氨基酸的所述肽是一种apitope，即能够在体外和体内与MHC分子结合，并在没有抗原加工的情况下被呈递给T细胞。
溶解度
在肽介导的耐受性诱导中，溶解度可以是一个重要的考虑因素。
溶解度可以通过在N和C末端添加额外的氨基酸(可以是甘氨酸(G)、赖氨酸(K)和/或谷氨酸(E))而被提高。
在一个方面，根据本发明的肽可在N和/或C末端具有例如一个、两个或三个额外的氨基酸。所述额外的氨基酸可选自甘氨酸(G)、赖氨酸(K)和/或谷氨酸(E)。可将这些氨基酸的不同组合添加到根据本发明的肽中。
例如，根据本发明的肽可在N和C末端具有一个、两个或三个赖氨酸(K)残基。
根据本发明的肽可在N和C末端具有一个、两个或三个甘氨酸(G)残基。
根据本发明的肽可在N和C末端具有一个、两个或三个谷氨酸(E)残基。
在一个方面，根据本发明的肽可在N和C末端具有一个甘氨酸和一个赖氨酸残基。
在一个方面，根据本发明的肽可在N和C末端具有一个甘氨酸和两个赖氨酸残基。
在一个方面，根据本发明的肽可在N和C末端具有一个谷氨酸和一个赖氨酸残基。
在一个方面，根据本发明的肽可在N和C末端具有一个谷氨酸和两个赖氨酸残基。
例如，所述额外的氨基酸可在一端或两端包含甘氨酸或赖氨酸间隔子，后接氨基酸对KK、KE、EK或EE。
在一个方面，所述肽可在两端具有甘氨酸间隔子，在N和C末端接上两个额外的氨基酸的组合，所述额外的氨基酸可为赖氨酸(K)和/或谷氨酸(E)。因此，给定末端的可能的组合可为GKK、GKE、GEK或GEE。
所述肽可具有以下通式：
XXG-亲本肽-GXX
在一个方面，根据本发明的肽可在N和C末端具有三个额外的赖氨酸(K)残基。
根据本发明的修饰肽可因此相对于亲本肽具有6个额外的氨基酸(每个末端3个)。
或者，本发明的肽也可具有以下通式：
KKK–亲本肽–KKK
KK–亲本肽–KK
K–亲本肽–K
GK–亲本肽–KG
GKK–亲本肽–KKG
KKG-亲本肽-GKK
EK–亲本肽–KE
EKK–亲本肽–KKE
GKE–亲本肽–EKG
GEK–亲本肽–KEG
修饰肽可比亲本(未修饰的)肽更易溶解。所述修饰肽可具有相比于亲本肽2倍、3倍、4倍或5倍的溶解度。所述肽可以以高达0.5mg/ml、1mg/ml或5mg/ml的浓度溶解。
如本文所讨论的，本发明的修饰肽可以相比于亲本肽具有2、4或6个额外的氨基酸(每端1、2或3个)。
在最优选的方面，所述修饰是在N和C末端都包含KKK。
修饰肽可比亲本(未修饰的)肽更易溶解。所述修饰肽可具有相比于亲本肽2倍、3倍、4倍或5倍的溶解度。所述肽可以在高达0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml或更高的浓度下溶解，例如8mg/ml。在一个方面，修饰肽可以以4mg/ml的浓度溶解。
组合物
S-Ag肽可以是组合物的形式，优选药物组合物。
根据本发明的肽组合物可以包含如本文所述的根据本发明的氨基酸序列。在一个方面，所述肽组合物仅包含如本文所述的根据本发明的氨基酸序列，即它不包含除根据本发明的肽以外的其他肽。
在本文讨论的本发明的一个方面，第一步先确定患有葡萄膜炎或具有发展处葡萄膜炎风险的受试者。
根据本发明的肽或组合物可用于预防性或治疗性用途。
当为预防性用途而给药时，所述肽或组合物可以降低或防止产生对S-Ag的免疫应答。免疫应答的水平低于受试者在未用该组合物治疗时获得的水平。术语“降低”表示观察到免疫应答的部分降低，例如相对于受试者未接受所述组合物治疗时将观察到的应答(或在同一时间段内未治疗的受试者中观察到的应答)降低了50％、60％、70％、80％或90％。术语“防止”表示未观察到对S-Ag的明显免疫应答。
当为治疗性用途而给药时，肽或组合物可以抑制已经发生的对S-Ag的免疫应答。术语“抑制”表示与使用肽治疗前的水平或如果不给予治疗将在同一时间点观察到的水平相比，已经发生的免疫应答水平降低。
用本发明的组合物治疗可导致以下任何或所有水平的降低：
i)S-Ag自身抗体；
ii)S-Ag特异性促炎性CD4+T细胞；
iii)分泌S-Ag自身抗体的B细胞。
可以通过本领域已知的技术进行所有因子的检测，例如ELISA、流式细胞术等。
用本发明的肽或组合物进行的治疗也可以或可替代地引起S-Ag特异性CD4+T细胞的无反应性。可以通过例如随后在体外用S-Ag攻击来检测所述无反应性。
制剂
所述组合物可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他药物活性化合物。这种制剂可以是例如适合于皮内或皮下给药的形式。
所述组合物可以制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备为适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。或者，所述肽可被封装在载体中或结合到载体例如纳米颗粒的表面。活性成分可以与药学上可接受的且可与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如是水、盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、右旋糖、甘油或乙醇等以及它们的组合。
此外，如果需要，所述组合物可以包含少量的辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐。盐酸和/或氢氧化钠可用于调节pH。为了稳定，可以使用二糖，例如蔗糖或海藻糖。
在组合物中，肽的相对比例可以是大约1:1:1。或者，可以改变每种肽的相对比例，例如，如果发现一种肽在特定HLA类型中比其他肽更有效。
配制后，可以将组合物置于无菌容器中，然后将其密封并在低温例如4℃下储存，或者可以将其冷冻干燥。
方便地，将该组合物制备为冻干(冷冻干燥的)粉末。冻干允许以稳定的形式长期储存。冻干程序在本领域是众所周知的，参见例如http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html。通常在冷冻干燥之前使用填充剂，例如甘露醇、葡聚糖或甘氨酸。
组合物可以以方便的方式给药，例如通过口服、静脉内、肌内、皮下、舌下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)。
组合物可优选通过鼻内、皮下或皮内途径给药。在一个方面，可以通过透皮贴剂给药。
本文所述的肽或组合物通常以“有效量”施用；即，有效引起任何一种或多种治疗性或预防性效果的量。本领域技术人员将能够通过常规实验确定包含在药物组合物中或为了期望结果而给药的有效、无毒的用量。一般而言，如本文所公开的肽或组合物可以以与给药途径和接受者的生理特征(包括健康状况)相容的方式并且以它引发所需效果(即治疗有效和/或保护性的)的方式给药。例如，组合物的合适剂量可取决于多种因素，包括但不限于受试者的生理特征(例如年龄、体重、性别)和本领域技术人员可识别的其他因素。Gennaro讨论了在确定例如组合物的合适剂量时需要考虑的常见考虑因素的其它示例性实例(2000,"Remington：The Science and Practice of Pharmacy",20th edition,Lippincott,Williams,&Wilkins；and Gilman et al.,(Eds),(1990),"Goodman AndGilman's：The Pharmacological Bases of Therapeutics",Pergamon Press)。
本发明的肽和组合物可用于治疗人类受试者。受试者可患有葡萄膜炎。受试者可具有S-Ag自身反应性T细胞。
受试者可表达HLA单倍型，该单倍型与产生过量S-Ag特异性T细胞的倾向有关。用于确定个体的HLA单倍型的方法是本领域已知的。在一个方面，受试者具有选自以下的HLA基因：A29、B51、B27、DR8、DR4、DP5、DR4、DQA3、DR3、DR2、DR51和DR17(参见Mattapallil etal.J Immunol 2011,187:1977-1985)。
剂量递增方案
在一个优选的实施方案中，可以使用“剂量递增”方案向受试者给药本发明的肽或组合物，其中以递增的浓度给予受试者多个剂量。这种方法已用于例如磷脂酶A2肽在针对蜂毒过敏的免疫治疗应用中(Müller et al(1998)J.Allergy Clin Immunol.101:747-754以及Akdis et al(1998)J.Clin.Invest.102:98-106)。
在一个方面，所述剂量递增方案可包括以以下剂量向受试者给药致耐受性肽：
第1天：第一剂量，约15至约40μg；
第14天±7天：第二剂量，约35-65μg；
第28天±7天：第三剂量，约80-120μg；
第42天±7天：第四剂量，约300-500μg；
第56天±7天：第五剂量，约300-1800μg；
第70天±7天：第六剂量，约300-1800μg；
第84天±7天：第七剂量，约300-1800μg；
第98天±7天：第八剂量，约300-1800μg；
第112天±7天：第九剂量，约300-1800μg；and
第126天±7天：第十剂量，约300-1800μg。
在本文描述的本发明的一个方面，第五至第十剂量可为约600-1500μg。
“±7天”是指规定日期(即以第一次给药肽作为第1天后的规定日期)，其中的给药可以发生在最多7天之前(包括7天)，或在规定日期之后最多7天(包括7天)。因此，可以在规定日期前7、6、5、4、3、2或1天，或在规定日期后1、2、3、4、5、6或7天进行给药。
在本文描述的本发明的一个方面，“±7天”优选±3天。也就是说，给药可以在规定日期之前最多三天(包括三天)进行，或者可以在规定日期之后最多三天(包括三天)进行。因此，给药可以在规定日期前3、2或1天，或在规定日期后1、2或3天进行。
所述肽可以以下剂量给药：
第1天：第一剂量，约25μg；
第14天：第二剂量，约50μg；
第28天：第三剂量，约100μg；
第42天：第四剂量，约400μg；
第56天：第五剂量，约800μg；
第70天：第六剂量，约800μg；
第84天：第七剂量，约800μg；
第98天：第八剂量，约800μg；
第112天：第九剂量，约800μg；和
第126天：第十剂量，约800μg。
在一个方面，第五至第十剂量也可为约400μg。
在一个替代性的方面，第五至第十剂量也可为约1600μg。
因此，所述肽可以以下剂量给药：
第1天：第一剂量，约25μg；
第14天：第二剂量，约50μg；
第28天：第三剂量，约100μg；
第42天：第四剂量，约400μg；
第56天：第五剂量，约400μg；
第70天：第六剂量，约400μg；
第84天：第七剂量，约400μg；
第98天：第八剂量，约400μg；
第112天：第九剂量，约400μg；和
第126天：第十剂量，约400μg。
或者，所述肽可以以下剂量给药：
第1天：第一剂量，约25μg；
第14天：第二剂量，约50μg；
第28天：第三剂量，约100μg；
第42天：第四剂量，约400μg；
第56天：第五剂量，约1600μg；
第70天：第六剂量，约1600μg；
第84天：第七剂量，约1600μg；
第98天：第八剂量，约1600μg；
第112天：第九剂量，约1600μg；和
第126天：第十剂量，约1600μg。
在如本文所述的本发明的另一方面中，约300-1800μg、优选约600-1500μg、优选约1200μg、更优选约400、800或1600μg的第十一剂量在第140天±7天、优选第140天±3天、更优选第140天给药。在优选的方面中所述剂量为约800μg。
在更优选的方面，约300-1800μg、优选约600-1500μg、优选约1200μg、更优选约400、800或1600μg的第十二剂量在第154天±7天、优选第154天±3天、更优选第154天给药。在优选的方面中所述剂量为约800μg。
在进一步优选的方面，约300-1800μg、优选约600-1500μg、优选约1200μg、更优选约400、800或1600μg的第十三剂量在第168天±7天、优选第168天±3天、更优选第168天给药。在优选的方面中所述剂量为约800μg。
在进一步优选的方面，约300-1800μg、优选约600-1500μg、优选约1200μg、更优选约400、800或1600μg的第十四剂量在第182天±7天、优选第182天±3天、更优选第182天给药。在优选的方面中所述剂量为约800μg。
如上所述的额外剂量可以根据需要给予例如一个月至二十年的时间，例如一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年、十一年、十二年、十三年、十四年、十五年、十六年、十七年、十八年、十九年或二十年的时间。
本文中关于本发明的“方法”的任何教导同样适用于本发明所涵盖的“用途”。
试剂盒
衍生自S-Ag的肽可以以混合组合物或混合物的形式一起给药。然而，在某些情况下，优选以试剂盒的形式单独提供肽，以用于同时、单独、顺序或联合给药。
例如，所述试剂盒可将肽包含在单独的容器中。在给药前可以合并也可以不合并容器的内容物。
所述试剂盒还可以包含混合和/或给药装置(例如用于鼻内给药的蒸发器；或用于皮下/皮内给药的注射器和针头或其他医疗装置)。该试剂盒还可以包括使用说明。
本发明的药物组合物或试剂盒可用于治疗和/或预防疾病，例如本文讨论的葡萄膜炎。
特别地，所述组合物/试剂盒可用于抑制或预防体内S-Ag特异性CD4+T细胞(或S-Ag自身抗体)的产生。所述组合物/试剂盒可用于在受试者中治疗和/或预防葡萄膜炎。
实施例
实施例1–肽9K1K、17JK和15N3K在体内被正确负载到树突细胞上的MHC II分子上。
当将100μg肽9K1K注射到DR2tg小鼠中或将肽17JK或15N3K注射到DR3tg小鼠中时，可以在注射后2小时在这些小鼠脾脏中的树突细胞(CD11c+细胞)上检测到这些肽。将分离的CD11c+细胞对肽特异性CD4+T细胞的活化(产生IFNγ)用作读数。
在图1、图2和图3中，可以清楚地看出，与注射PBS的对照小鼠脾脏中的CD11c+细胞相比，分别从注射9K1K、17JK或15N3K的小鼠脾脏中分离出的CD11c+细胞诱导了显著的CD4+T细胞活化。这些结果表明肽9K1K、17JK和15N3K到达了次级淋巴器官中的树突细胞。此外，这些肽以正确的构象与这些树突细胞上的MHC II分子结合。因此，这些肽能够诱导耐受性。
实施例2–单肽处理诱导S-Ag特异性T细胞耐受性
我们之前证明了单肽9K1K、17JK和15N3K的致耐受性作用，这些结果在这些实验中得到证实。根据剂量递增方案单独使用一种肽治疗HLA-DR转基因小鼠。
在第一个实验(图4)中，如方法部分所述，DR2tg小鼠接受9K1K肽或PBS。用这种修饰的apitope预处理使淋巴结(图4A)和脾脏(图4B)中S-Ag诱导的细胞活化分别降低了77％和70％。
为了确认17JK的致耐受性能力，用这种修饰的apitope或PBS处理DR3tg小鼠。该实验表明，用17JK预处理可使淋巴结(图5A)和脾脏(图5B)中S-Ag诱导的细胞活化分别降低78％和84％。
与用PBS处理的对照小鼠相比，用肽15N3K预处理DR3tg小鼠导致淋巴结(图6A)和脾脏(图6B)中S-Ag诱导的细胞活化分别减少61％和72％。
实施例3–组合肽处理诱导S-Ag特异性T细胞耐受性
用单独的肽9K1K、17JK或15N3K进行肽处理可降低DRtg小鼠中S-Ag特异性免疫激活的研究结果，引出了将肽作为混合物给药的联合治疗是否也可以降低S-Ag特异性应答的研究。根据剂量递增方案用ATX975处理DR3tg和DR2tg小鼠，并用在CFA中含有所有三种抗原的乳液免疫。DR3tg和DR2tg小鼠的结果分别显示在图7和图8中。
在对DR3tg小鼠进行ATX975处理后(图7)，在两个独立实验中，脾脏中S-Ag诱导的细胞活化降低了95％和89％。与单独用肽17JK(在两个独立实验中脾脏中S-Ag诱导的细胞活化减少80％和52％)或单独用肽15N3K(脾脏中S-Ag诱导的细胞活化减少74％)诱导的耐受性相比，ATX975诱导的耐受性更明显。
当用ATX975处理DR2tg小鼠(图8)时，与对照小鼠相比，被处理的小鼠脾脏中S-Ag诱导的细胞活化减少了78％。这种耐受性诱导比单独用9K1K处理后S-Ag诱导的细胞活化减少的51％更明显。
这些数据清楚地表明当在DRtg小鼠中组合成肽混合物进行处理时，单肽的累加效应。
实施例4–在体外肽-MHC II结合试验中，肽9K1K、17JK和15N3K表现出不同的结合模式
图9描述了肽9K1K、17JK和15N3K与所示HLA-DR分子结合并与已知竞争肽竞争的IC50(μM)值。该值应仅在每个HLA-DR分子内进行比较。低IC50值(绿色)表示每个HLA-DR分子最强的结合剂。每个HLA-DR分子的最高值(红色)表示该HLA-DR分子的最低结合剂。中间值以橙色表示。这些结果表明3种肽9K1K、17JK和15N3K对所研究的HLA-DR分子具有不同的结合谱。因此，将这些肽组合成一种鸡尾酒疗法，可以使得治疗不被限制于某种HLA-DR类型。
总结
我们已经鉴定了肽混合物ATX975，它可包含来自S-Ag蛋白的3种肽，并且能够在HLA-DR转基因小鼠中诱导对S-Ag的耐受性。
实施例5–肽15N3K的变体作为apitope
Apitope(不依赖抗原加工的表位)能够与MHCII分子结合并刺激SAg特异性T细胞的反应，而无需进一步的抗原加工。在体外抗原加工独立呈递系统(APIPS)试验中测试了肽15N3K(SEQ ID NO：3)的变体结合MHCII分子并呈递给T细胞杂交瘤而无需进一步抗原加工的能力。换言之，测试了由肽15N3K的部分组成的肽和与肽15N3K具有不同程度的序列同一性的肽作为apitope的能力。
测试的肽被示于下表中：
Figure BDA0003710240870000231
Figure BDA0003710240870000241
通过IL-2分泌测量的T细胞对APIPS试验中每种肽的反应如图10所示。除了三种肽之外，所有肽都是apitope。
材料与方法
小鼠
在整个肽鉴定和表位开发过程中，使用HLA-DR转基因小鼠以确保肽-MHC II类结合基序是对葡萄膜炎患者的耐受治疗所需的疗法。
DR3tg小鼠在特定的无病原体条件下在Charles River,UK或Innoser,Belgium通过外部机构饲养。DR3tg株最初由Strauss等人建立(Strauss等人,1994,Immunogenetics3,104-108)。简而言之，使用的基因组构建体是pUC 13中HLA-DRA基因组克隆的6kb NdeI片段和cos 4.1的24kb ClaIxSalI片段，cos 4.1是一种含有DRB1*0301的B基因的粘粒(pTCF)。将含有1-2μg/mL每种构建体的溶液用于共同注射到与C57BL/6雄性交配的(C57BL/6x DBA/2)F1供体的受精卵中。后代随后被培育成缺少小鼠MHC II类分子表达的IA-beta敲除C57BL/6遗传背景(AB0小鼠)。这些DR3tg小鼠表达HLA-DRB1*0301分子，但不表达小鼠MHC-II分子。通过回交到C57BL/6和B10.Q来维持小鼠。通过对用EcoRI消化的尾部DNA进行Southern blot分析、并用DRA cDNA的1.35kb BamHI片段和DRB1*0301cDNA的1.25kb BamHI片段进行探测来鉴定转基因小鼠。
DR2tg小鼠在特定的无病原体条件下在Charles River,UK或Innoser,Belgium通过外部机构饲养。HLA-DR2转基因(DR2tg)小鼠最初是从Lars Fugger(Madsen et al.,1999)获得的。简而言之，使用含有小鼠MHCII启动子的pDOI-5表达载体表达DRα和DRβ链cDNA(DRA*0101和DRB1*1501)。将构建体注射到来自(DBA/2xC57BL/6)F1交配的受精卵中。将小鼠回交到缺乏小鼠MHC II类分子表达的IA-beta敲除C57BL/6遗传背景(AB0小鼠)中。DR2tg小鼠表达HLA-DRB1*1501分子，但不表达小鼠MHC分子。
动物研究得到Hasselt大学“动物实验伦理委员会”(ECD)的批准，并在无病原体设施中以最高标准的护理进行。
抗原
所有单肽均由Genscript(Piscataway,USA)合成，并在-80℃下储存在20mg/ml的DMSO(Sigma-Aldrich)或4mg/ml的PBS(Lonza)储备溶液中。用N端游离胺和C端酰胺合成肽。人S-Ag(S-阻遏蛋白)在HEK293F细胞(QBiologicals,Eurofins Amatsigroup,Ghent,Belgium)中产生。
体内MHC II类加载试验
在DR3tg或DR2tg小鼠的侧腹皮下(s.c.)注射100μl PBS中的100μg肽。对照动物接受100μl PBS的皮下注射。2小时后，收获脾脏并制备单细胞悬液。根据制造商的说明(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，使用CD11c微珠正选择CD11c+细胞。达到了>92％的平均纯度。在X-vivo 15培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素；Lonza和50mMβ-巯基乙醇；Gibco)中在圆底96孔板中与1x105 CD4+细胞一起共培养1x105 CD11c+细胞。这些CD4+细胞分离自DR3tg或DR2tg小鼠，这些小鼠在尾根部用50μg在CFA中乳化的肽(肽/CFA)进行皮下免疫。免疫后十天，收获引流淋巴结(LN)和脾脏。分离LN细胞和脾细胞，并根据制造商的说明，使用Magnisort小鼠CD4分离试剂盒(ThermoFisherScientific)通过负选择来分离CD4+T细胞。72小时后，收集这些共培养物的上清液并通过IFNγELISA(R&D Systems,Abingdon,UK)分析CD4+T细胞活化。在平行实验中评估了CD4+T细胞对体外添加的肽的反应，以确保T细胞识别CD11c+细胞呈递的肽。
离体耐受实验
DR3tg或DR2tg小鼠在第-15、-13和-11天分别在侧腹区域皮下注射0.015nmol、0.15nmol和1.5nmol肽(剂量递增时间表)，然后在第-8、-6和-4天注射3次15nmol肽。指示剂量用于单肽治疗，对于使用包含在ATX975的3种肽的混合物进行的治疗，这些剂量是按每种肽进行给药(达到45nmol肽的总最高剂量)。对照小鼠接受相同剂量的能够结合HLA-DR2或HLA-DR3的非相关肽，这取决于所使用的小鼠品系。在第0天，用在CFA中乳化的150μg抗原(含有各自表位的每个30-mer肽50μg)(肽/CFA)在尾根部对小鼠进行皮下免疫。免疫后十天，收获引流淋巴结(LN)和脾脏。分离LN细胞和脾细胞，并在X-vivo 15培养基(补充有2mML-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素；Lonza和50mMβ-巯基乙醇；Gibco)中在圆底96孔板中培养。为了研究抗原诱导的细胞活化，将0.5x106个细胞/孔(200μl/孔)与不同的抗原浓度(0-25μg/ml)或12.5μg/ml纯化蛋白衍生物(PPD；引发对照)一起培养72小时；AJ疫苗，哥本哈根，丹麦)。72小时后，收集上清液并储存在-80℃直至进一步分析。通过细胞因子ELISA(R&D Systems,Abingdon,UK)评估上清液中的IFN-γ浓度并测量细胞活化。
肽序列
肽 序列 SEQ ID NO:
9K1K KKKAFVEQVANVVLKKK SEQ ID NO:1
17JK KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK SEQ ID NO:2
15N3K KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK SEQ ID NO:3
肽-MHC II类结合试验
肽9K1、17JK和15N3K与重组HLA-DRA1*0101、DRB1*0101(DR1)、DRB1*1501(DR2)、DRB1*0301(DR3)、DRB1*0401(DR4)、DRB1*1101(DR11)、DRB1*0405(DR4*05)和DRB1*0901(DR9)的结合由ProImmune(Oxford,UK)使用他们的无细胞MHC II类REVEAL结合试验进行。
抗原加工独立呈递系统(APIPS)试验
测试了抗原特异性杂交瘤克隆对固定或非固定(新鲜)细胞(APC)呈递的肽的反应性。用10μg/ml和25μg/ml肽和5x104固定或新鲜APC培养5x104个细胞。为了固定APC，将细胞在室温(RT)下与0.5％多聚甲醛(Merck,Darmstadt,Germany)(pH7)一起孵育5分钟。通过添加0.4M甘氨酸(Sigma-Aldrich)并在RPMI-10％FCS中洗涤细胞来停止固定反应。48小时后，通过ELISA(R&D Systems，Abingdon，UK)测量抗原诱导的IL-2的产生。

Claims (20)

1.一种组合物，其包含以下S-阻遏蛋白(S-Ag)肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的全部或一部分的肽。
2.一种组合物，其包含以下S-阻遏蛋白(S-Ag)肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少70％、至少80％或至少90％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的序列的全部或一部分的肽；和
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的序列的全部或一部分的肽。
3.根据权利要求1的组合物，其包含以下S-阻遏蛋白(S-Ag)肽：
包含氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)或与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的序列的肽；和
包含氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)或与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的序列的肽；和
包含氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有至少60％序列同一性的序列的肽。
4.根据权利要求1至3中任一项的组合物，其包含以下S-阻遏蛋白(S-Ag)肽：
由氨基酸序列KKKAFVEQVANVVLKKK(SEQ ID NO:1)组成的肽；和
由氨基酸序列KKKLTFRRDLYFSRVQVYKKK(SEQ ID NO:2)组成的肽；和
由氨基酸序列KKKVIFKKISRDKSVTIYLGKKK(SEQ ID NO:3)组成的肽。
5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述肽能够在体外结合至MHC细胞并被呈递给T细胞而无需抗原加工。
6.根据权利要求1至5中任一项的组合物，其用于治疗。
7.根据权利要求1至5中任一项的组合物，其用于在受试者中治疗和/或预防葡萄膜炎。
8.根据权利要求1至5中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防葡萄膜炎的药物中的用途。
9.在受试者中治疗葡萄膜炎的方法，包括向受试者给药根据权利要求1至5中任一项的组合物的步骤。
10.用于根据权利要求6或7所述的用途的组合物、根据权利要求8所述的用途或根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为但不限于HLA-DR3。
11.用于根据权利要求6或7所述的用途的组合物、根据权利要求8所述的用途或根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为但不限于HLA-DR2。
12.用于根据权利要求6至11中任一项所述的用途的组合物、用途或方法，其中所述组合物以剂量递增方案给药。
13.用于根据权利要求12所述的用途的组合物、用途或方法，其中所述剂量递增方案包含以下剂量：
第1天：第一剂量，约15至约40μg；
第14天±7天：第二剂量，约35-65μg；
第28天±7天：第三剂量，约80-120μg；
第42天±7天：第四剂量，约300-500μg；
第56天±7天：第五剂量，约600-1500μg；
第70天±7天：第六剂量，约600-1500μg；
第84天±7天：第七剂量，约600-1500μg；
第98天±7天：第八剂量，约600-1500μg；
第112天±7天：第九剂量，约600-1500μg；和
第126天±7天：第十剂量，约600-1500μg。
14.用于根据权利要求13所述的用途的组合物、用途或方法，
其中所述第一剂量为约25μg；和/或
其中所述第二剂量为约50μg；和/或
其中所述第三剂量为约100μg；和/或
其中所述第四剂量为约400μg。
15.用于根据权利要求13或14所述的用途的组合物、用途或方法，
其中在第140天±7天给药约600-1500μg的第十一剂量；和/或
其中在第154天±7天给药约600-1500μg的第十二剂量；和/或
其中在第168天±7天给药约600-1500μg的第十三剂量。
16.用于根据权利要求13至15任一项所述的用途的组合物、用途或方法，其中第五、第六、第七、第八、第九和第十、以及任选的第十一、第十二和第十三剂量各自为约800μg。
17.用于根据权利要求6至16任一项所述的用途的组合物、用途或方法，其中所述化合物通过皮内给药。
18.用于根据权利要求6至17任一项所述的用途的组合物、用途或方法，其中所述组合物给药至人类。
19.一种试剂盒，其包含权利要求1至5中任一项定义的S-Ag肽。
20.权利要求19的试剂盒，用于通过同时、单独或顺序给药来预防或治疗葡萄膜炎。
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