JP2011500776A - 組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(多発性硬化症)
多発性硬化症(MS)は、最もよく見られる身体障害を引き起こす神経学的状態であり、若い成人に発症する。英国では、およそ8万5千人がMSにかかっている。
MetzlerおよびWraith(非特許文献2)は、一般に用いられるMSのインビボモデルであるマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて自己免疫反応の抑制を誘導するために、合成ペプチドを使用することを述べた最初の研究者であった。この研究では、MBP由来のペプチドが鼻孔内経路により投与され、疾患抑制のレベルは用いられたペプチドの抗原強度と相関関係にあることが見出された。
MBP30−44;
MBP83−99;
MBP131−145および
MBP140−154
を含む、組成物に関する。
MBP30−44;
MBP83−99;
MBP131−145および
MBP140−154
を含む、キットを提供する。
本発明の第1の局面は、ミエリン塩基性タンパク質由来の複数のペプチドを含む組成物に関する。
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、ヒトの脳白質より単離可能な18.5kDaのタンパク質である。この成熟タンパク質は、170個のアミノ酸を有し、その配列は文献にて広く入手可能である(例えば、以下を参照:Chou et al (1986)J.Neurochem.46:47−53,Figure 1;Kamholz et al (1986),PNAS 83:4962−4966,Figure 2;US Patent No.5,817,629,SEQ ID NO:1;Roth et al (1987),J.Neurosci.Res.17:321−328,Figure 4;Medeveczky et al (2006),FEBS Letters 580:545−552,Figure 3B)。
用語「ペプチド」は、代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに結合した、一連の残基(代表的には、L−アミノ酸)を表す通常の意味で使用される。この用語は、変性ペプチドおよび合成ペプチド類似物を含む。
本発明の組成物は、予防または治療の用途のものでもよい。
好都合に、4つのMBPペプチドは、混合組成物またはカクテルの形態で、一緒に投与されてもよい。しかしながら、同時投与、別個投与、逐次投与または併用投与のために、キットの形態でペプチドを別個に提供することが好ましい場合もある。
多発性硬化症(MS)は、若い成人(20〜40歳)に最もよく見られる神経性疾患であり、ヨーロッパではおよそ38万5千人、アメリカではおよそ30万人がかかっている。それは、中枢神経系の慢性変性疾患であり、この疾患では、脳および/または脊髄の所々でミエリンが徐々に破壊され、それによって神経連結性が妨げられ、筋力低下、協調の欠如、および言語もしくは視覚障害を引き起こす。
視神経炎(ON)は、眼の網膜に仕える視神経の、脱髄を伴う炎症である。それは、可変性の疾患であり、以下の症状のいずれかを呈し得る:視野のかすみ;視力の低下;一部またはすべての色覚の異常;全盲または半盲目;および眼の奥の痛み。
・視力の低下(視野のかすみ)
・眼の痛み
・色弱(色覚低下)
・運動・音眼内閃光(左右の眼の動きや音により引き起こされる視覚的な閃光感覚)
・ウートホフ症状、熱または極度の疲労により症状は悪化する。
MHCクラスII遺伝子は、多発性硬化症に感受性を付与する(Nepom and Ehrlich(1991)Ann.Rev.Immunol.9:493−525)。北欧および中欧、オーストラリアならびに北米の白人種では、その関連性は、MHC分子HLA−DR2に結びつけられる(DR2a [DRB5*0101]およびDR2b [DRB1*1501]、Haines et al (1998)Human MoI.Genet.7:1229−1234)。MHCの対立遺伝子DR2およびDQ6は、異なる遺伝子座で見られるが、この2つの対立遺伝子間には有意な連鎖不平衡が存在する。この2つの対立遺伝子間の一致は99%であり、これら対立遺伝子をランダムに再対合させた場合に予想されるよりはるかに大きい。したがって、MSに関連づけられる特定のT細胞エピトープが、HLA−DR2拘束性ではなくHLA−DQ6拘束性であり得る可能性が生じる。
MBPペプチドの30−44、130−144および139−153を、L−アミノ酸および標準的なF−moc化学反応法を用いて、アビメド社(Abimed)製AMS422マルチプルペプチドシンセサイザで合成した。
HLA−DQ6、HLA−DR2aまたはHLA−DR2bのいずれかでトランスフェクトされたL−細胞、またはHLA−DQ、DPおよびDRを発現するMgar細胞(EACC,Porton Down,UK)を、抗原提示細胞(APC)として用いた。
T細胞クローンMS49:D3およびMS17:A2をMS患者から生成し、クローンN5:19を健常個体から生成した。3つすべてのクローンをDR2陽性個体から単離した。
抗原提示細胞を、様々な濃度のペプチドおよび適切なT細胞とともにインキュベートした。T細胞の増殖つまり活性を、[3H]−チミジン取り込み法を用いて測定し、刺激指数(SI=(ペプチドを含む培養物の1分間の修正されたカウント数(ccpm))/(ペプチドを含まない培養物のccpm))として表した。
HLA−DQ6でトランスフェクトされたL細胞によりペプチドMBP30−44が提示された場合に、T細胞クローンMS49:D3は、最も高いペプチド濃度で、非常に強い増殖応答(コントロール用のMgar細胞の1.5倍大きい)を示した(図1)。HLA−DQ6でトランスフェクトされたL細胞によりMBP130−144が提示された場合、より強い応答が、MS17:A2T細胞に誘発された(コントロール用のMgar細胞と比べて、増殖が3.24倍に増大した−図2)。
HLA−DR2陽性個体から単離されたT細胞クローンは、HLA−DQ6拘束性MBP T細胞エピトープに応答する。これは、HLA−DR2の多発性硬化症との関連がMBP T細胞エピトープのDR2拘束性のものに限定されておらず、DQ6拘束性とされていてもよいことを示す。
本研究は、アピトープ(アピトープMS6)が、MHCクラスII分子により提示された場合に、多発性硬化症のヒト化マウスモデルで免疫寛容を誘発し得ることを証明するために設計された。アピトープMS6は、MBP140−154に対応するMBPのT細胞エピトープから選択されるアピトープであり、MHCクラスIIにより抗原提示細胞に提示され、プロセシングされずにT細胞を刺激し得る(国際公開第03/064464号参照)。用いられたマウスモデルは、ヒトMHC分子HLA:DR2(DRB1*1501)を遺伝子導入したものである(Madsen et al(1999)Nature Genetics 23:343−347)。
アピトープMS6(MBPペプチド140−154)を、L−アミノ酸および標準的なF−moc化学反応法を用いて、アビメド社(Abimed)製AMS422マルチプルペプチドシンセサイザで合成した。
8〜12週齢のHLA:DR2トランスジェニックマウスを、この研究に用いた。これらのマウスを、0日目での免疫前の−8日目、−6日目および−4日目に、25μlのリン酸緩衝食塩水(PBS)中の100μgのアピトープMS6、または25μlのPBS単独の鼻腔内投与による事前処置によって、寛容化させた。
PBSを用いて寛容化させた後にアピトープMS6を用いて免疫させたA群のマウスは、用量に依存する様式でアピトープMS6を用いて再び攻撃した場合、抗原刺激に応答した(図4)。ペプチド濃度の上昇とともに、SIは中央値である2.5から10へ上昇した。この群のすべてのマウスは、鼻腔内投与したPBSがアピトープMS6に対する寛容を誘発することができなかったことを示した。
これらのデータは、プロセッシングを必要とせずHLA:DR2 MHCクラスII分子に結合するMBPペプチド(アピトープMS6)が、鼻腔内投与された場合、寛容を誘発し得るという仮説を裏付けている。
本研究では、HLA:DR2結合ミエリン塩基性タンパク質(MBP)82−100ペプチドのためのT細胞受容体とともにHLA:DR2を発現しているダブルトランスジェニックマウスでの寛容を誘発するアピトープMS7(MBPペプチド83−99)の能力を調べる。
6または7匹の年齢(8〜12週齢)および性別が一致するダブルトランスジェニックマウスの群を用いた。第1の実験では、1つの群を、3週間にわたって同じ間隔で、25μlのPBS中の100μgのアピトープMS7を用いて鼻腔内に10回処置をした。コントロール群には、PBSを単独で与えた。第2の実験では、同量のペプチドを、100μlのPBSで皮下/皮内投与により与えた。コントロール群には、同量のPBSを与えた。
ペプチドまたはPBSの最後の投与から3日目に、脾臓を摘出し、細胞懸濁液を調製した。脾細胞を、0.5μg/mlまたは5μg/mlのアピトープMS7とともにインキュベートし、48時間、72時間、および96時間の培養後に[3H]−チミジン取り込み法によって増殖を評価した。結果を刺激指数(SI=(抗原を含む培養物の1分間のカウント(cpm))/(抗原を含まない培養物の1分間のカウント))として表した。
第2の実験では、皮下/皮内経路を介して寛容誘発が引き起こされており、脾細胞からの細胞培養液の上澄みを48時間および72時間の培養時に回収し、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を用いて、IFN−γとインターロイキン−2(IL−2)の存在について検定した。
調査が行われた3つのすべての時点で、鼻腔内経路および皮下/皮内経路の両方を介してPBSで処置されたマウス由来の脾細胞は、アピトープMS7に対して強い増殖を示し、その応答の大きさもペプチド濃度とともに上昇した。増殖の急激な低下が、両経路の投与によりアピトープMS7で処置されたマウスからの脾細胞培養物で観察された。図5に示すように、72時間後、5μg/mlのアピトープMS7を含む培養物で観察された平均SIは、アピトープMS7で鼻腔内処置したマウスでは17であった。PBS処置したコントロールマウスからの対応する培養物では、平均SIとして89が観察された。同様に、図6に示すように、皮下/皮内経路によるアピトープMS7の投与により、平均SIが、PBS処置した動物の124からアピトープMS7処置した動物の49へと低下した。
これらの結果は、アピトープMS7に対する寛容をヒトの系に模倣して設計されたマウスモデルにおいてうまく誘発することができ、この寛容が多発性硬化症治療での使用のその可能性を裏付けていることを示している。さらに、ヒトに対して好まれて利用される経路である皮下/皮内経路により投与された場合でも、その効力は維持される。
4つのペプチドの組合わせ(MBPの30−44、131−145、140−154および83−99)を、二次性進行型多発性硬化症の患者でのATX−MS−1467の非盲検の用量漸増研究に用いた。
視神経炎(ON)は、眼の網膜に仕える視神経の、脱髄を伴う炎症である。ONは、多発性硬化症の最も頻繁に見られる症状の1つであり、MSの発症時に最もよくある症状である。
上記で説明したように、ミエリン塩基性タンパク質(ATX−MS−1467)由来の4つのアピトープTMペプチドを含むカクテルを用いたペプチド治療法の効果を、MS患者に対して調査した。試験への移行時に、最初の投与前に最大14日間かけて、各患者をスクリーニングした(来診1)。25μgのATX−MS−1467の最初の投与を来診2で行い、来診3で50μg、来診4で100μg、来診5で400μg、来診6および7の両方で800μgをそれぞれ投与した。さらなる検査を、1ヶ月後と3ヶ月後の経過観察(来診8および来診9)にて行った。以下の表にて、プロトコルの概要を示し、ペプチド投与および血液採取とともに各患者によりなされた臨床ための来診の回数を示す。
MBPに対する有意な応答が見られ、来診3で増殖のピークがあった(図9)。これは、インターフェロンγの分泌のピークと相関関係にあった。しかしながら、重要なことに、インターフェロンγの分泌レベルは3回目の来診後低下し、来診8までにバックグラウンドレベルとなった。IL−10濃度は来診7までは大きな変化はなかったが、そこからこのサイトカインの分泌は有意に増加した。IL−4、IL−5、およびTNFαの濃度は、すべての時点でMBPに応じてバックグランドに近かった。
MBPに対する応答が、来診3で観察され、そこでIL−2とインターフェロンγの分泌が高まったことが示され、これはこの時点での増殖のピークと相関関係にあった。この応答の増大はペプチド投与に起因すると考えられる。
二次性進行型多発性硬化症(SPMS)の患者6名を、実施例4Bで示された用量漸増プロトコルに従うフェーズI/IIaの臨床試験に参加させ、完了させた。
a)ATX−MS−1467による処置は、非特異性の免疫抑制効果を有しなかった。これは、精製タンパク質誘導体である、Mycobacterium tuberculosis由来の抗原に対する免疫応答が維持されたという事実(データを示さず)によりはっきりと示されている。
b)プロトコルを用いたATX−MS−1467による処置は、ATX−MS−1467もしくはミエリン塩基性タンパク質のいずれに対しても攻撃的な免疫応答を引き起こさなかった(データを示さず)。
c)ATX−MS−1467による処置の前(来診1)と後(来診8)のT細胞増殖応答の比較により、ミエリン塩基性タンパク質に対する応答が有意に低下したことが示された(図11)。V1でMBPに対して応答した3名の個体はすべて、V8までにこのタンパク質に対する応答が低下したことを示した。すべての患者をまとめると、V1からV8まででMBPに対する応答が有意に低下したことが明らかになった(P=0.0313)。
(製剤化および投与量)
4つのペプチドのそれぞれは、固相ペプチド合成を用いて契約のもと別個に製造され、HPLCを用いて精製される。それらは、凍結乾燥状態で保存される。
6メートルでの検査のための標準サイズのスネレン視力表を用い、それはバックライト照明を備えており、患者は6メートル離れて座る(図8)。
i)T細胞増殖
凍結保存PBMCを、48ウェル組織培養プレート(Nunc International,Costar,Corning Inc.New York USA)中のα−MEM中の1.5×106個の細胞を含む1mlの培養液内に準備する。様々な濃度のMBPおよびペプチド抗原に対する応答を10日間にわたって観察する。コントロールウェルは、抗原を含まない。20時間、または、2日間、4日間、6日間、8日間および10日間の培養後、細胞懸濁液の100μlアリコートを各1ml培養液から二連で取り出し、[3H]−チミジン取り込み法により抗原に応答した増幅を測定する。
Cytometric Bead Array Assay:
培養液上澄みのサイトカイン濃度を、Cytometric Bead Assay(Becton Dickenson Biosciences,Cowley,Oxford,UK)を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、測定する。FACS Calibur(BD Biosciences)を用いて検体データを得た後、BD CBAソフトウェアを用いて、結果を図および表のかたちで作成する。サイトカインの最小定量可能濃度は、以下のとおりである。すなわち、IL−2およびIL−4が、2.6pgml−1であり、IL−5が、2.4ρgml−1であり、IL−10およびTNF−αが、2.8pgml−1であり、そして、IFN−γが、7.1pgml−1である。
IL−2、IL−10、IFN−γ、およびTNF−αの分析のために、PCR反応を、cDNA、PCR緩衝液、6.25mMのMgCl2、0.4mMのdNTP混合液、フォワードプライマーおよびリバースプライマー(フォワードプライマー濃度:IL−2 300nM、IL−10 600nM、IFN−γ 600nM、TNF−α 600nM、リバースプライマー濃度:IL−2 600nM、IL−10 900nM、IFN−γ 900nM、TNF−α 600nM)、200nMのFAM−TAMRAプローブならびに0.05UμlのプラチナTaqポリメラーゼ(Invitrogen)を含む最終容積20μlで行う。繰り返し条件は、以下のとおりである。すなわち、94℃で30秒間の初期変性工程の後、94℃で15秒間および60℃で1分間のサイクルを35回行う。β−2ミクログロブリンでは、上記のPCR混合液を、0.1μMのフォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに3mMのMgCl2とともに加え、SYBR Green I(Molecular Probes Inc.、ストックの×30000希釈)を用いて定量化する。95℃で1分間の変性工程の後、増幅を94℃で15秒間、61℃で1分間および72℃で1分間のサイクルを35回行いつつ続ける。PCR反応と生成されたアンプリコンの蛍光検出を、Opticon2システム(MJ Research,USA)で行う。ベースライン蛍光を、サイクル1から10までの測定を行うことにより確立させる。Ct値を、蛍光がベースラインの標準偏差を8〜10回超えた時点を測定することによって計算する。試料を、二連でアッセイし、そして、コピー数を、各ターゲットDNAの標準曲線より計算する。RNAインプットコピー数およびcDNA合成の差を、サイトカイン発現をβ−2ミクログロブリンの発現に対して標準化することによって修正する。
HLA遺伝子発現の分析を、標準的な単一鎖コンフォメーションポリモルフィズムポリメラーゼ連鎖反応技術により、末梢血白血球から抽出されたDNAに対して行う。各患者のHLAの型を、免疫学的アッセイの結果の解釈のために用いる。
96ウェルプレートを、1−10μg/mlの各アピトープMS1、MS4、MS6またはMS7で、pH9.6で一晩、4℃にてコーティングする。pH7、2.05%のリン酸緩衝食塩水−Tween(PBS−Tween)でプレートを4回洗浄し、PBS中の5%FCSで、室温にて1時間ウェルをブロックする。血清をPBS−Tweenで1:100で希釈し、複製ウェル内で室温にて1時間インキュベートする。4回の洗浄後、PBSで1:12000で希釈したヤギ抗ヒトIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Sigma)を各ウェルに加え、室温にて1時間プレートをインキュベートする。4回の洗浄後、30%過酸化水素を加えた0.4mg/mlのフェニレンジアミン二塩酸塩(Sigma)を加え、室温にて15〜20分間インキュベートする。2.0MのH2SO4(50μl)を用いて発色を止め、ELISAプレートリーダーを用いて490nmにて吸光度値(OD)を測定する。結果を、1:100希釈血清のODとして報告する。
CNSの炎症を、ガドリニウム増強MRIスキャンを用いて検査する。増強病変の体積と数を調べ、ベースラインスキャンと比較する。
Claims (12)
- 組成物であって、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、
MBP30−44;
MBP83−99;
MBP131−145;
およびMBP140−154
を含む、組成物。 - 請求項1に記載の組成物であって、本質的には、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、
MBP30−44;
MBP83−99;
MBP131−145;および
MBP140−154
からなる、組成物。 - 疾患を処置または予防するための請求項1または2に記載の組成物。
- 多発性硬化症を処置または予防するための請求項1または2に記載の組成物。
- 視神経炎を処置または予防するための請求項1または2に記載の組成物。
- 多発性硬化症の処置のための薬剤の製造における、請求項1または2に記載の組成物の使用。
- 視神経炎の処置のための薬剤の製造における、請求項1または2に記載の組成物の使用。
- 多発性硬化症を処置または予防することを必要とする被験体における多発性硬化症を処置または予防する方法であって、
請求項1または2に記載の組成物を該被験体に投与する工程
を含む、方法。 - 視神経炎を処置または予防することを必要とする被験体における視神経炎を処置または予防する方法であって、
請求項1または2に記載の組成物を該被験体に投与する工程
を含む、方法。 - 前記組成物は用量漸増プロトコルに従って投与される、請求項8または9に記載の方法。
- 前記組成物は、HLA−DQ6またはHLA−DR2が陽性である被験体に投与される、請求項8から10までのいずれかに記載の方法。
- 同時投与、個別投与、または逐次投与のためのキットであって、以下のミエリン塩基性タンパク質のペプチド、
MBP30−44;
MBP83−99;
MBP131−145;および
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