CN101848725B - 组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含下述髓磷脂碱性蛋白肽的组合物：MBP 30-44；MBP83-99；MBP 131-145；和MBP 140-154。所述组合物可用于治疗疾病，特别是多发性硬化和/或视神经炎，并且本发明还涉及这样的用途和方法。

Description

组合物
本发明涉及包含髓磷脂碱性蛋白肽的组合物。组合物可以用于治疗多发性硬化。
简介
多发性硬化
多发性硬化(MS)是最常见的影响青年成年人的致残性(disabling)神经病症。英国约85000人患有MS。
在多发性硬化(MS)中，神经组织的炎症导致髓磷脂损失，髓磷脂是一种脂肪材料，可作为大脑和脊髓中神经纤维的保护绝缘体。髓磷脂的损失，或脱髓鞘，沿神经细胞留下多个区域的瘢痕组织或硬化。由此，硬化导致多种不同的神经学体征和症状，通常伴有反复的复发和好转。
MS的常见症状包括视觉降低或丧失，行走障碍和步履踉跄，声音含混，以及尿频和失禁。此外，MS能引起情绪变化和抑郁，肌肉痉挛和神经麻痹。
现在普遍接受的观点是MS是由自反应性T细胞介导的自身免疫疾病。
当前对于MS的治疗通常抑制神经系统。例如，一种治疗包括骨髓移植，同时施用细胞抑制剂和免疫抑制药物。这种治疗对于一些患者有效，但是昂贵而且相对风险较高。此外，在治疗MS中施用细胞抑制剂尚有争议，因为其效果不明，而潜在的副作用严重。
用干扰素-β(IFNβ)治疗可以在一些患者中减轻MS的症状，并且因此广泛应用。然而，干扰素-β的作用机制不清楚，而且IFNβ治疗对于很多患者无效。此外，由于大多数患者中抗-IFNβ抗体的产生，用IFNβ的治疗变得复杂(Giovannoni，G.，Munschauer，F.E.，3rd和Deisenhammer，F.(2002).Neutralising antibodies to interferon beta during the treatment of multiple sclerosis.J Neurol Neurosurg Psychiatry 73，465-469)。
目前，不存在MS的有效治疗。治疗通常通过一般地抑制免疫系统，仅仅集中于减轻其症状。因此急需可以特异性靶向与疾病发作和进展有关的局部免疫响应的疗法。
合成肽
Metzler和Wraith(Int.Immunol.5：1159-1165(1993))是首先描述使用合成肽诱导小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型(一种常用的MS体内模型)中自免疫响应抑制的研究者。在这项研究中，通过鼻内途径施用衍生自MBP的肽，并且发现，疾病抑制水平与使用的肽的抗原强度相关联。
后来，在1995年，Liu和Wraith(Int.Immunol.7：1255-1263)显示也可能通过源自可溶性MBP的肽的腹膜内给药而诱导小鼠中EAE的抑制。在这项研究中，实现了对Th1和Th2相应两者的抑制，并且显示，免疫响应开始后施用肽能导致正在发生的(on-going)免疫反应的抑制。
然而，发现不是所有能作为T-细胞表位的肽都能诱导耐受。髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽89-101是免疫后的免疫显性抗原，并且在引发T细胞反应性和诱导EAE方面都是非常有效的免疫原。然而，已经显示，当在溶液中施用时，此肽在诱导耐受性上效果不好(Anderton和Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28：1251-1261)。
本发明人先前已经显示，肽结合MHC I类或II类分子并无需进一步抗原加工而呈递于T细胞的能力和其体内诱导耐受性的能力之间存在联系。可以预测与抗原加工无关的肽(即无需进一步抗原加工即与MHC结合)在体内是致耐受性的。这些肽已经称为“apitope”，表示与抗原加工无关的表位。
WO 02/16410描述了来自髓磷脂碱性蛋白(MBP)的下述apitope：30-44、80-94、83-99、81-95、82-96、83-97、84-98、110-124、130-144、131-145、132-146和133-147。
WO 03/064464将下述MBP肽鉴定为apitope：134-148；135-149；136-150；137-151；138-152和140-154。
发明概述
本发明人现在发现，四种MBP肽的“混合物/鸡尾酒(cocktail)”，其全部为apitope，在治疗MS中特别有效。认为这四种肽可在组合时产生协同作用。
在第一方面，本发明涉及包含下述髓磷脂碱性蛋白肽的组合物：
MBP 30-44；
MBP 83-99；
MBP 131-145；和
MBP 140-154。
组合物可以基本由MBP 30-44、83-99、131-145和140-154组成。
组合物可以用于治疗或预防疾病，特别是多发性硬化。
组合物可以用于治疗或预防视神经炎，特别是与多发性硬化有关的视神经炎。
在第二个方面，本发明涉及通过对受试者施用根据本发明第一方面的组合物而治疗或预防多发性硬化和/或视神经炎的方法。
在本发明的第二方面的方法中，组合物可以按照剂量递增(dose-escalation)方案施用。
已经发现混合物中的两种肽结合HLA-DQ6(MBP 30-44和131-145)，另两种结合HLA-DR2(MBP 140-154和83-99)。这些apitope的组合使用与用单个肽的疗法相比，更广泛地覆盖MS患者中所见的不同的主要组织相容性复合体(MHC)单体型。
本发明的第二方面的方法可以涉及对HLA-DQ6或HLA-DR2阳性受试者施用组合物。
在第三方面，本发明提供包含下述髓磷脂碱性蛋白肽的试剂盒：
MBP 30-44；
MBP 83-99；
MBP 131-145；和
MBP 140-154
用于同时、分别或顺序施用。
附图说明
图1：MBP 30-44由HLA-DQ6呈递于T细胞克隆MS 49:D3
图2：MBP 130-144由HLA-DQ6呈递于T细胞克隆MS 17:A2
图3：MBP 139-153由HLA-DR2a和HLA-DR2b转染的L-细胞呈递于T细胞克隆N5:19
图4：用Apitope MS6耐受化后淋巴结细胞的增殖响应
图5：响应Apitope MS7的脾细胞增殖。通过鼻内施用PBS或Apitope MS7(83-99)而处理获得自小鼠的脾细胞
图6：响应Apitope MS7的脾细胞增殖。通过皮下/皮内施用PBS或ApitopeMS7(83-99)而处理获得自小鼠的脾细胞
图7：由皮下/皮内施用PBS或Apitope MS7(83-99)而处理的获得自小鼠的脾细胞产生IFNγ和IL-2
图8：Snellens表的实例
图9：患者对人髓磷脂碱性蛋白(MBP)的PBMC响应
图10：患者对ATX-MS-1467的PBMC响应
图11：在用ATX-MS-1467处理之前(就诊1)和之后(就诊8)，T细胞对MBP的增殖响应的比较
详述
本发明的第一方面涉及包含来自髓磷脂碱性蛋白的多个肽的组合物。
髓磷脂碱性蛋白
髓磷脂碱性蛋白(MBP)是可从人脑白质分离的18.5kDa蛋白。成熟蛋白具有170个氨基酸，并且序列在文献中广泛提供(参见例如：Chou等(1986)J.Neurochem.46：47-53，图1；Kamholz等(1986)，PNAS 83：4962-4966，图2；美国专利No.5,817,629，SEQ ID NO：1；Roth等(1987)，J.Neurosci.Res.17：321-328，图4；Medeveczky等(2006)，FEBS Letters 580：545-552，图3B)。
MBP肽
术语“肽”在正常意义下用于表示一系列残基，通常是L-氨基酸，通常通过α-氨基和邻近氨基酸的羧基之间的肽键彼此相连。术语包括修饰肽和合成肽类似物。
在本发明的组合物和试剂盒中使用的肽可以使用化学方法制成(PeptideChemistry，A practical Textbook.Mikos Bodansky，Springer-Verlag，Berlin)。例如，可以通过固相技术(Roberge JY等(1995)Science 269：202-204)合成肽，从树脂切除，并通过制备型高效液相色谱纯化(例如，Creighton(1983)ProteinsStructures And Molecular Principles，WH Freeman and Co，New York NY)。可以实现自动合成，例如，使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)，按照生产商提供的说明进行。
或者可以通过重组方法或通过从更长的多肽切除而生成肽。例如，可以通过从全长MBP切除而获得肽。可以通过氨基酸分析或测序(例如，Edman降解过程)确定肽的组成。
本发明的组合物和试剂盒中使用的肽如下：
MBP 30-44：
H-Pro-Arg-His-Arg-Asp-Thr-Gly-Ile-Leu-Asp-Ser-Ile-Gly-Arg-Phe-NH2
MBP 83-99：
H-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-NH2
MBP 131-145：
H-Ala-Ser-Asp-Tyr-Lys-Ser-Ala-His-Lys-Gly-Phe-Lys-Gly-Val-Asp-NH2
MBP 140-154：
H-Gly-Phe-Lys-Gly-Val-Asp-Ala-Gln-Gly-Thr-Leu-Ser-Lys-Ile-Phe-NH2
术语“MBP 30-44”、“MBP 83-99”、“MBP 131-145”和“MBP 140-154”包括修饰的肽。例如肽可以通过氨基酸插入、缺失或取代而突变，只要保持未修饰肽的MHC结合特异性，以及其呈递于T细胞的能力。肽可以，例如，与未修饰序列相比具有5、4、3、2、1或0个突变。
或者(或此外)，可进行修饰而不改变肽的氨基酸序列。例如，可以包括D-氨基酸或其它非天然氨基酸，正常的酰胺键可以由酯或烷基骨架键取代，可以包括N或C-烷基取代、侧链修饰和约束如二硫桥和侧链酰胺或酯连接。这些变化可能导致肽的体内稳定性更高，和生物学寿命更长。
可基于使用由K.Parker(NIH)设计的程序“Peptide Binding Predictions(肽结合预测)”得到的更有效的T细胞诱导的预测进行表位修饰，所述程序可以在http://www-bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform找到(也参见Parker，K.C等1994.J.Immunol.152：163)。
MBP肽可以配制成中性或盐形式的组合物。医药可接受的盐包括酸加成盐(与肽的自由氨基形成)，并且其与无机酸如盐酸或磷酸，或这样的有机酸如乙酸、草酸、酒石酸和顺丁烯二酸形成。与自由羧基形成的盐也可以源自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基胺基乙醇、组氨酸和普鲁卡因(procaine)。
组合物
本发明的组合物可以用于预防或治疗用途。
组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备成在注射前适合溶解或悬浮于液体之中的固体形式。也可将制备物乳化，或将肽包囊入脂质体中。活性成分可以与药学上可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水、盐水(例如，磷酸盐-缓冲的盐水)、右旋糖、甘油、乙醇等和它们的组合。
此外，必要时，组合物可以包含少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐。可以使用盐酸和/或氢氧化钠调节pH。为了稳定化，可以使用二糖如蔗糖或海藻糖。
在组合物中，肽的相对比例(MBP 30-44∶MBP 83-99∶MBP 131-145∶MBP140-154)可以为约1∶1∶1∶1。或者，每种肽的相对比例可以改变，例如，以集中于在自身反应性T细胞的特定子集上的致耐受性响应或者发现一种肽是否在特定HLA类型中表现优于其它。
配制后，组合物可以装入无菌容器，然后将所述容器密封，并在低温保存，例如4℃，或者可以冷冻干燥。
方便地，将组合物制备为冻干(冷冻干燥)粉末。冻干允许以稳定形式长期保存。冻干方法在本领域中公知，参见例如http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html。通常在冷冻干燥之前使用膨胀剂，如甘露醇、右旋糖酐或甘氨酸。
组合物可以以便利的方式施用，如通过口服、静脉内(对于水溶性组合物)、肌内、皮下、舌下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)。
有利地，组合物可以通过鼻内、皮下或皮内途径施用。
本发明的方法和药物组合物可以用于治疗人类受试者。通常地，医生将确定对于个体受试者最合适的实际剂量，并且该剂量随特定患者的年龄、体重和反应而不同。
在优选的实施方案中，可以根据“剂量递增”方案进行，其中以渐增的浓度给予患者多个剂量。这种方法已经用于，例如，针对蜂毒过敏的免疫治疗应用中的磷脂A2肽(Müller等(1998)J.Allergy Clin Immunol.101：747-754和Akdis等(1998)J.Clin.Invest.102：98-106)。
试剂盒
方便地，四种MBP肽可以以混合组合物或鸡尾酒的形式一起施用。然而，可以有这样的情况，其中优选以试剂盒的形式分别提供肽，用于同时、分别、顺序或组合施用。
例如，试剂盒可以包括单独包装的四种肽，或包装于两个容器中，每个容器包含两种肽。容器的内容物可以或者可以不在施用前合并。
试剂盒也可以包括混合和/或施用装置(例如用于鼻内施用的蒸发器；或用于皮下/皮内给药的注射器和针)。试剂盒还可以包括使用说明。
本发明的药物组合物或试剂盒可以用于治疗和/或预防疾病。
具体地，组合物/试剂盒可以用于治疗和/或预防多发性硬化和/或视神经炎。
多发性硬化
多发性硬化(MS)是年轻人(20至40岁)中最常见的神经疾病，在欧洲影响约385000人，而在美国影响约300000人。这是一种中枢神经系统的慢性退行性疾病，其中髓磷脂的逐渐破坏发生在遍及大脑和/或脊髓的部分中，干扰神经连接并引起肌肉无力，丧失协调性和语言与视觉障碍。
10年后，发现原来诊断为复发缓解型MS(RRMS)的个体中约一半人的复发频率降低，但是残疾增加。这称为继发进展性MS(SPMS)。有人估计在25年内，约90％患RRMS的人将发展成继发进展类型。同RRMS一样，继发进展性MS能有各种变化。对于有些患者，残疾的增加或进展是非常渐进的，而对其他患者则能发生得更快。然而，通常，从发作中恢复变得越来越不彻底，并且症状往往增加并且残疾增长。临床发作变得不太显著，而缓解往往消失，但是现在已经破坏了更多CNS组织，并且累积损伤在MRI上更明显。
本发明的组合物可用于治疗患新发作MS、RRMS或SPMS的患者。
本发明的组合物可以减轻或改善MS的一种或多种症状，所述症状包括视觉降低或丧失，行走障碍和步履踉跄，发音含混，尿频和失禁，情绪变化和抑郁。SPMS与肌肉痉挛和严重的麻痹有关。
具体地，组合物可以改善视神经炎。
视神经炎
视神经炎(ON)是服务眼睛视网膜的视神经的炎症，伴随脱髓鞘。这是一种多变的病症，并可表现出下述任何症状：视觉模糊，视敏度损失，一些或全部色彩视觉损失，完全或部分失明和眼后疼痛。
视神经炎是多发性硬化出现最多的症状，并且是MS发作时最常见的症状。然而，ON能引起MS以外的疾病，如缺血性视神经病变。
ON在70％的病例中表现为单方面的(仅在一只眼睛中患病)。
最通常地，视神经炎首先影响年龄为15-50岁的人。在这个年龄组中，研究表明超过50％的患者将在15年之内转变成为多发性硬化。同MS一样，女性患ON的可能是男性的两倍，并且白种人中的比例高于其它人种组。
视神经炎的主要症状为：
●视敏度损失(视觉模糊)。
●眼痛。
●色觉障碍(色觉减弱)。
●移动和声音光幻视(由对侧眼睛移动或声音而产生的闪视)。
●Uhthoff症状，遇热或疲劳时症状加重。
用根据本发明的组合物治疗ON可以预防、减轻或改善任何这些症状。为了监控ON的进展，可以使用Snellens表方便地测定视敏度。
实施例
下述实施例用于阐述本发明，但是不应理解为对其的限制。本发明具体涉及这些实施例中所述的具体实施方案。
就实施例而言，下述名称可用于MBP肽：
Figure GPA00001122790700081
四种肽的组合物称作ATX-MS-1467
实施例1  HLA-DQ6限制性髓磷脂碱性蛋白T-细胞表位的鉴定
MHC II类基因赋予对多发性硬化的易感性(Nepom和Ehrlich(1991)Ann.Rev.Immunol.9：493-525)。在中北欧、澳大利亚和北美的白种人中，与MHC分子HLA-DR2(DR2a[DRB5*0101]和DR2b[DRB1*1501](Haines等(1998)Human Mol.Genet.7：1229-1234)有关。尽管在不同基因座都发现了MHC的DR2和DQ6等位基因，但是两个等位基因之间存在显著的连锁不平衡。两个等位基因之间的一致性为99％，远高于等位基因随机再相关时的期望值。因此，某些与MS有关的T-细胞表位可能是HLA-DQ6限制性的，而不是HLA-DR2限制性的。
本研究的目的是鉴定人MBP T-细胞表位是否由HLA-DQ6分子呈递于由HLA-DR2阳性MS患者分离的T-细胞克隆。使用[3H]-胸苷掺入，由T-细胞增殖来测定T-细胞活化。
肽抗原
使用L-氨基酸和标准F-moc化学，在Abimed AMS 422多肽合成仪上合成MBP肽30-44、130-144和139-153。
抗原呈递细胞
使用由HLA-DQ6、HLA-DR2a或HLA-DR2b转染的L-细胞，或表达HLA-DQ、DP和DR的Mgar细胞(EACC，Porton Down，UK)作为APC。
T-细胞克隆
由MS患者产生T-细胞克隆MS 49:D3和MS 17:A2，并由正常个体产生克隆N5:19。全部三个克隆分离自DR2阳性个体。
抗原呈递测定法
将抗原呈递细胞与各种浓度的肽和合适的T-细胞一起温育。通过[3H]-胸苷掺入测定T-细胞的增殖及由此而来的活化，并表示为刺激指数(SI＝修正的计数每分钟(ccpm)包含肽的培养物/ccpm无肽培养物)。
结果
当通过用HLA-DQ6转染的L细胞呈递肽MBP 30-44时，在最高的肽浓度，T-细胞克隆MS49:D3产生非常强的增殖响应(是Mgar对照细胞的1.5倍)(图1)。当通过用HLA-DQ6转染的L细胞呈递MBP 130-144时，在MS 17:A2T-细胞中诱导出甚至更强的响应(其增殖是Mgar对照细胞的3.24倍-图2)。
分离自DR2个体N5:19的第三个T-细胞克隆对主要表位MBP140-154和跨越此区域(138-156)的一系列重叠的15聚体肽产生响应。当由HLA-DR2a转染的L-细胞呈递时，肽139-153刺激N5:19 T-细胞克隆的增殖，但是用HLA-DR2b转染的L-细胞呈递时则并非如此(图3)。
结论
分离自HLA-DR2阳性个体的T-细胞克隆对HLA-DQ6限制性MBP T-细胞表位产生响应。这暗示HLA-DR2与多发性硬化之间的关联不限于MBP T-细胞表位的DR2限制，而是也可以是DQ6限制性的。
在本发明的MBP组合物中，两种肽是HLA-DQ6结合性的(MBP 30-44和131-145)，两种是HLA-DR2结合性的(MBP 140-154和83-99)。因此，用这些Apitope的肽疗法可以涉及HLA-DR2或HLA-DQ6个体。
实施例2-在HLA:DR2转基因小鼠中用Apitope MS6诱导耐受性
本研究经过设计以证明在由MHC II类分子呈递时，apitope(Apitope MS6)能诱导多发性硬化的人源化小鼠模型中的免疫耐受性。Apitope MS6是选自对应于MBP 140-154的MBP的T-细胞表位中的apitope，并且由MHC II类在抗原呈递细胞上呈递，并且能无需处理而刺激T-细胞(参见WO 03/064464)。使用的小鼠模型对于人MHC分子HLA:DR2(DRB1*1501)是转基因的(Madsen等(1999)Nature Genetics 23：343-347)。
可以通过用抗原体内侵染时T-细胞增殖的降低而监控施用apitope后在小鼠中CD4+T-细胞群中无反应性的诱导或改变。
肽合成
使用L-氨基酸和标准F-moc化学，在Abimed AMS 422多肽合成仪上合成Apitope MS6(MBP肽140-154)。
小鼠和耐受性诱导
研究中使用8-12周龄的HLA:DR2转基因小鼠。用25μl磷酸样缓冲的盐水(PBS)中的100μg Apitope MS6或单独使用25μl PBS，通过在第0天免疫前的-8、-6和-4天鼻内施用而预处理，使小鼠耐受化。
耐受化后，用包含等体积的完全Freund佐剂(CFA)和PBS的100μl乳液经皮下使小鼠免疫，其中PBS包含200μg Apitope MS6和400μg热灭活的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculasis)。将先前用PBS鼻内耐受化的小鼠对照组用无肽的乳液免疫。
在皮下免疫后10天，去除引流腘和(draining pipliteal)腹股沟淋巴结(inguinal lymph node)，并通过测定T-细胞的增殖对各种浓度Apitope MS6的响应而评价T-细胞活化。通过[3H]-胸苷掺入测定增殖，并表示为刺激指数(SI＝修正的计数每分钟(ccpm)包含肽的培养物/ccpm无肽培养物)。
结果
在以剂量依赖方式用Apitope MS6再侵染时，用PBS耐受化然后用Apitope MS6免疫的A组小鼠对抗原刺激产生响应(图4)。随着肽浓度的增加，SI的中值从2.5增加至10。这组中的所有小鼠都证明，鼻内施用PBS不能诱导对Apitope MS6的耐受性。
相反，用Apitope MS6鼻内预处理对用这种肽刺激的淋巴细胞的增殖响应具有显著的影响。来自B组小鼠的淋巴细胞不能产生任何显著程度的响应，即使在150μg/ml的高肽浓度(SI中值3，图4)。这些数据表明Apitope MS6诱导了来自HLA-DR2小鼠的淋巴细胞中的耐受性。
由已经用PBS预处理并免疫的小鼠提取的淋巴细胞不能显示对ApitopeMS6的任何响应(图4)。C组中对肽没有响应证实了A组中见到的增殖响应确实是对用Apitope MS6免疫的响应。
结论
这些数据支持如下假设：不需要处理并可与HLA:DR2 MHC II类分子结合的MBP肽(Apitope MS6)在鼻内施用时能诱导耐受性。
实施例3-用Apitope MS7(MBP 83-99)在HLA:DR2和T-细胞受体(MBP) 82-100双转基因小鼠中诱导耐受性
本研究调查Apitope MS7(MBP肽83-99)在双转基因小鼠中诱导耐受性的能力，所述小鼠表达HLA:DR2连同与HLA:DR2结合的髓磷脂碱性蛋白(MBP)82-100肽的T-细胞受体。
来自这些双转基因动物的脾细胞响应于Apitope MS7而体外增殖。在体内反复施用后，对apitope的体外脾细胞响应的降低或消除，表明已经实现了耐受状态。
已经使用鼻内和皮下/皮内途径施用apitope而尝试了耐受性诱导。
耐受性诱导
使用6或7组年龄(8-12周)和性别匹配的双转基因小鼠组。在第一次实验中，将一组用100μg Apitope MS7的25μl PBS溶液，以一定的间隔历时三周，鼻内处理十次。对照组只接受PBS。在第二次实验中，通过皮下/皮内在100μl PBS中施用同样量的肽。对照组接受相同体积的PBS。
增殖测定法
最后一次施用肽或PBS后三天，收获脾并制备细胞悬浮液。将脾细胞与0.5或5μg/ml Apitope MS7温育，并在培养48、72和96小时后通过[3H]-胸苷掺入而评价增殖。结果表示为刺激指数(SI＝计数每分钟(cpm)包含抗原的培养物/计数每分钟无抗原培养物)。
细胞因子测定
在第二次实验中，在通过皮下/皮内途径诱导耐受性时，在培养的48和72小时收集来自脾细胞的细胞培养上清，并使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)评价是否存在IFN-γ和白介素-2(IL-2)。
结果
在研究的全部三个时间点，来自用PBS通过鼻内和皮下/皮内途径处理的小鼠的脾细胞表现出对Apitope MS7的强增殖，响应的幅度随肽浓度而增加。在来自通过两种施用途径用Apitope MS7处理的小鼠脾细胞培养物中观察到了增殖的显著降低。如图5所示，72小时后，用包含5μg/ml Apitope MS7的培养物观察到的平均SI在用Apitope MS7鼻内处理的对照小鼠中为17。在来自用PBS处理的对照小鼠的对应培养物中，观察到的平均SI为89。相似地，如图6所示，通过皮下/皮内途径施用Apitope MS7导致PBS处理的动物中的平均SI从124降至用Apitope MS7处理的动物中的49。
在来自48小时培养物的培养上清液中检测到的IFNγ和IL-2水平如图7所示。用肽在体内反复处理使两种细胞因子的分泌均显著降低，与增殖响应的降低相似。
结论
这些结果表明能成功地在经设计以模拟人系统的小鼠模型中诱导对Apitope MS7的耐受性，并且可能用于多发性硬化治疗。此外，在通过皮下/皮内途径(对于人的优选途径)施用时，可以保持其效果。
尽管已经证明了Apitope MS6和MS7的体内效果，但是目前还不可能证明Apitope MS1和MS4的效果。这是因为缺少表达HLA-DQ6分子的转基因小鼠。已经产生了表达该分子的小鼠，但是发现它们不能在胸腺中产生CD4 T-细胞，并且因此不能在HLA-DQ6的背景中产生对抗原的免疫响应。
实施例4-用四种MBP肽的组合物进行的剂量递增研究
在患有继发-进展性多发性硬化的患者中，在ATX-MS-1467的标签公开的剂量递增研究中使用四种肽(MBP 30-44、131-145、140-154和83-99)的组合。
在最后的研究剂量后四周和三个月，监测患者的视敏度(即，视神经炎的降低)、免疫参数和CNS中的炎症。
实施例4A-监测视敏度
视神经炎(ON)是服务眼睛的视网膜的视神经的炎症，伴有脱髓鞘。ON是多发性硬化最常出现的症状，并且是MS发作的最常见症状。
ON的通常症状包括：视觉模糊、视敏度损失、一些或全部彩色视觉损失、完全或部分失明和眼后疼痛。
研究了用ATX-MS-1467的治疗对MS中涉及的神经发炎过程所导致的视神经炎的效果。按照上述剂量递增方案施用ATX-MS-1467，然后在治疗后一个月，使用标准Snellens表测试患者的视敏度(图8)。
结果显示治疗后一个月视敏度有临床上显著的改善。这在筛选时初始视敏度检查结果与测试后一个月的结果相比的分析中可以得到证明。初始筛选视力测定为6/24和6/9(分别为右眼和左眼)，治疗后改善为6/9(右眼)和6/6(左眼)。患者的视力在过去两年中先前未发生变化。
实施例4B-监测免疫参数
如上所解释的，研究了用包含来自髓磷脂碱性蛋白(ATX-MS-1467)的四种ApitopeTM肽的鸡尾酒进行肽疗法对MS患者的效果。在第一剂(就诊1)之前多至14天，每名患者在进入试验时均经过筛选。在就诊2时施用第一剂的25μg ATX-MS-1467，就诊3时为50μg，就诊4时为100μg，就诊5时为400μg，并且就诊6和7时均为800μg。跟踪一个月和三个月时进行了进一步检查(就诊8和9)。下表总结了方案并显示每名患者就诊的次数，以及肽和血液样本的剂量。
表1
  就诊次数  ATX-MS-1467剂量(μg)   注释
  1  -   筛选前就诊。收集50ml血液样本用于免疫学。
  2  25   未收集免疫学样本
  3  50   50ml血液样本用于免疫学
  4  100   50ml血液样本用于免疫学
  5   400   50ml血液样本用于免疫学
  6   800   50ml血液样本用于免疫学
  7   800   50ml血液样本用于免疫学
  8   -   就诊7后4周取50ml血液样本用于免疫学
在就诊1和就诊3至9收集血液样本，并测试对各种抗原的免疫响应，包括作为阳性对照的结核分枝杆菌的纯化蛋白衍生物(PPD)，纯化的人髓磷脂碱性蛋白(MBP)和ATX-MS-1467。待测定的免疫响应包括体外T-细胞增殖、向组织培养物上清中分泌细胞因子和细胞因子RNA的产生。
结果
见到了对MBP的显著响应，就诊3时增殖出现峰值(图9)。这与干扰素γ分泌的峰值相关。然而，重要的是，干扰素γ分泌水平在第三次就诊后下降，并到就诊8时达到背景水平。IL-10水平直至就诊7才发生显著变化，此时这种细胞因子的分泌有显著增加。在所有时间点，响应于MBP，IL-4、IL-5和TNFα的水平接近于背景。
没有观察到对于ATX-MS-1467的增殖响应或者增加的细胞因子响应(图10)。
结论
在第三次就诊观察到对MBP的响应，证明IL-1和干扰素γ的分泌增加，其与这个时间点增殖中的峰值相关。响应的增加被认为归因于肽的施用。
然而，重要的是，细胞因子分泌的瞬时增加后恢复干扰素γ的基线水平。在以最高剂量第二次施用ATX-MS-1467后IL-10分泌也出现显著增加。先前已经报道，在动物模型中，用合成肽的特异性免疫疗法是有效的，并且导致IL-10分泌调节T细胞的诱导。IL-10分泌调节T细胞在小鼠中的诱导包括以低水平分泌干扰素γ时对肽的瞬时响应(Burkhart等，1999 Int Immunol 11：1625-1634；Sundstedt等，2003J Immunol 170：1240-1248)。然后干扰素γ降低，并且伴有IL-10的增加。细胞因子分泌的动力学显示，在用ATX-MS-1467处理后可有效重现先前在实验小鼠中观察到的模式，表明ATX-MS-1467可以诱导IL-10分泌调节T细胞。
实施例4C-通过用ATX-MS-1467处理将对MBP的响应显著下调
根据实施例4B中给出的剂量递增方案，招募六名患有继发进展性多发性硬化(SPMS)的患者参加并完成I/IIa期临床试验。
HLA-基因分型显示，招募参加试验的六名患者代表各种HLA单体型，包括与MS有关的HLA-DR15单体型。本试验招募的患者所代表的广泛的HLA-DRB 1分布暗示，ATX-MS-1467是安全的，并且在MS患者中是良好耐受的，而无论它们的HLA-DR基因型。
用ATX-MS-1467治疗患者不产生抗肽抗体。这表明ATX-MS-1467的使用是安全的，并且与缺少注射位点并发症或与试验有关的过敏表现相关联。
对T细胞响应的完整分析显示：
a)用ATX-MS-1467治疗不具有非特异性的免疫抑制作用。这可由对纯化的蛋白衍生物(来自肺炎分枝杆菌的抗原)的免疫响应得到维持的事实清楚地显示(数据未示出)。
b)使用本方案，用ATX-MS-1467治疗对ATX-MS-1467或髓磷脂碱性蛋白不产生侵略性免疫响应(数据未示出)。
c)在用ATX-MS-1467处理之前(就诊1)和之后(就诊8)对T细胞增殖响应的比较表明，对于髓磷脂碱性蛋白的响应显著降低(图11)。在V1对MBP产生响应的三名个体到V8时全部显示对蛋白的响应降低。将所有患者一起考虑，证明从V1到V8对MBP的响应显著降低(P＝0.0313)。
材料与方法
制剂与剂量
使用固相肽合成，根据合同独立生成四种肽中的每一种，并使用HPLC纯化。将它们冻干保存。
ATX-MS-1467是Apitope MS1、MS4、MS6和MS7在磷酸盐缓冲盐水中的1∶1∶1∶1混合物，用于皮内施用。
制备两种浓度的ATX-MS-1467，命名为ATX-MS-1467A和ATX-MS-1467B，分别包含4mg/ml和0.5mg/ml肽，以允许剂量递增。方案使用五种剂量递增的注射液(25、50、100、400和800μg总剂量)，间隔7至14天施用。然后患者在第一次800μg剂量后7至14天接受第二次800μg剂量。
接受研究治疗的全部六个剂量后，在最后一次研究剂量后四周和3个月评价患者情况。
视敏度测试
使用用于在6米进行测试的标准大小Snellens表，背光照明，并且患者坐在6米远处(图8)。
分别检查每只眼睛，确定患者能读出的表上最低一行。然后表示为视敏度＝6/(患者读出的行)。
免疫测定法
i)T-细胞增殖：
将冻存的PBMC制成在48孔组织培养板(Nunc International，Costar，Corning Inc.New York USA)中的α-MEM中包含1.5x106个细胞的1ml培养物。在10天的期间内监测对各种浓度的MBP和肽抗原的响应。对照孔不含抗原。在培养20小时或2、4、6、8和10天后，从每个1ml培养物中移出细胞悬浮液的100μl等分试样一式两份，通过[3H]胸苷的摄入而测定响应于抗原的增殖。
ii)分泌的细胞因子(IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN)的测定：
细胞计数珠阵列测定法：
按照生产商(Becton Dickenson Biosciences，Cowley，Oxford，UK)的说明，使用细胞计数珠测定法确定培养物上清细胞因子水平。在使用FAC Calibur(BD Biosciences)获取样本数据后，使用BD CBA软件以图和表格的形式生成结果。细胞因子的最小可定量水平如下：IL-2和IL-4为2.6pgml-1，IL-5为2.4pgml-1，IL-10和TNF-α为2.8pgml-1，IFN-γ为7.1pgml-1。
定量实时PCR测定细胞因子(IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α)的RNA
为了分析IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α，在含有如下物质的20μl终体积中进行PCR反应：cDNA、PCR缓冲液、6.25mM MgCl2、0.4mM dNTP混合物、正向和反向引物(正向引物浓度：IL-2 300nM，IL-10 600nM，IFN-γ600nM，TNF-α600nM，反向引物浓度：IL-2 600nM，IL-10 900nM，IFN-γ900nM，TNF-α600nM)、200nM FAM-TAMRA探针和0.05Uμl-1 Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)。循环条件如下：94℃30秒的初始变性步骤，然后是94℃15秒和60℃1分钟的35个循环。对于β-2微球蛋白，向上述PCR混合物中补加0.1uM正向和反向引物和3mM MgCl2，并用SYBR Green I(Molecular Probes Inc.，保存液的X30000稀释物)定量。在95℃1分钟的变性步骤后，以94℃15秒、61℃1分钟和72℃1分钟的35个循环继续扩增。在Opticon 2系统(MJ Research，USA)上进行PCR反应和产生的扩增物的荧光检测。通过从循环1至10进行测定而建立基线荧光值。通过确定荧光超出基线标准偏差8-10倍的点而计算Ct值。对样本一式两份进行测定并对于每种靶标DNA由标准曲线计算拷贝数。通过将细胞因子表达归一化为β-2微球蛋白的表达而修正RNA输入拷贝数和cDNA合成中的差异。
HLA分型
通过标准的单链构象多态性，对由外周血白血球提取的DNA用聚合酶链式反应技术进行HLA基因表达的分析。将每名患者的HLA-类型用于解释免疫测定法的结果。
血清抗肽抗体测定法
用1-10μg/ml每种Apitope MS1、MS4、MS6或MS7在pH 9.6在4℃过夜涂布96孔板。用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2，0.05％Tween(PBS-Tween)将板洗涤四次，并用5％FCS的PBS溶液将孔在室温封装1小时。将血清以1∶100稀释于PBS-Tween中，并在一式两个孔中在室温温育一小时。4次洗涤后，向每个孔加入在PBS中以1∶12000稀释的羊抗人IgG-辣根过氧化物酶缀合物(Sigma)，并在室温温育板一小时。4次洗涤后，加入0.4mg/ml对苯二胺二盐酸盐(Sigma)加30％过氧化氢，并在室温温育15-20分钟。用2.0M H2SO4(50μl)停止显色，并用ELISA读板仪在490nm测定光密度值(OD)。将1∶100稀释的血清的OD报告为结果。
MRI扫描
使用钆-增强的MRI扫描研究CNS中的炎症。检查增强损伤的体积和数量，并与基线扫描比较。
在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明所述方法和系统的各种修改和变型对于本领域的技术人员是显而易见的。尽管已经与特定的优选实施方案一起描述了本发明，但是应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于这些具体实施方案。事实上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于化学或生物学或相关领域中的技术人员是显而易见的，其意欲由本发明所涵盖。上面的说明书中提及的所有出版物通过提述并入本文。

Claims (6)

1.包含下述髓磷脂碱性蛋白肽的组合物：
P-R-H-R-D-T-G-I-L-D-S-I-G-R-F；
E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P；
A-S-D-Y-K-S-A-H-K-G-F-K-G-V-D；和
G-F-K-G-V-D-A-Q-G-T-L-S-K-I-F。
2.根据权利要求1的组合物，其用于治疗或预防多发性硬化。
3.根据权利要求1的组合物，其用于治疗或预防与多发性硬化有关的视神经炎。
4.根据权利要求1的组合物在制备用于治疗多发性硬化的药物中的用途。
5.根据权利要求1的组合物在制备用于治疗与多发性硬化有关的视神经炎的药物中的用途。
6.包含下述髓磷脂碱性蛋白肽的试剂盒：
P-R-H-R-D-T-G-I-L-D-S-I-G-R-F；
E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P；
A-S-D-Y-K-S-A-H-K-G-F-K-G-V-D；和
G-F-K-G-V-D-A-Q-G-T-L-S-K-I-F。
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