JP2004506921A - ペプチド選択方法 - Google Patents

Abstract

【課題】過敏症疾患等の免疫系疾患の予防及び治療に有効な免疫寛容原性ペプチドの選択を容易にする。
【解決手段】促進処理することなく、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるペプチドを選択することによって、免疫寛容原性ペプチドを選択する方法を提供する。ここで選択されたペプチドは、免疫系疾患を治療及び予防する。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫寛容原性ペプチドの選択方法、この方法によるペプチドの同定、及びこの方法を用いて病気を治療する及び／又は予防することに関する。本発明はまた、このような免疫寛容原性ペプチドの複数からなる薬学化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
適応免疫反応において、Ｔ型リンパ細胞は、タンパク質抗原の内部エピトープを認識できる。抗原細胞（ＡＰＣ）は、タンパク質抗原を取り上げ（ｔａｋｅ ｕｐ）、短いペプチドの断片に減成する。ペプチドは、細胞内の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はＩＩ分子に結合し、細胞表面に運ばれる。ＭＨＣ分子と合接する細胞表面が存在すると、ペプチドは、Ｔ細胞（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して）によって認識される。この場合、ペプチドがＴ細胞のエピトープである。
【０００３】
Ｔ細胞エピトープは、侵入した抗原に対してであろうと、体内の抗原に対してであろうと、あらゆる抗原に対する適合免疫反応において主力（ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ）として働く。過敏症（アレルギー、自己免疫性疾患、移植拒絶反応を含む）において、Ｔ細胞によってなされるセントラルロールとしての役割が実験的モデルを使用することによって照明されつつある。（Ｔ細胞エピトープの構造に基づく）合成ペプチドをアジュバンド（補助薬）と組み合わせて投与することで、炎症やアレルギー疾患を誘発することができる。
【０００４】
これとは対照に、可溶性のペプチドエピトープを投与することによって、特定のペプチドエピトープに対して免疫寛容性を誘発できることが証明されている。可溶性ペプチド抗原を投与することは、経験的な自己免疫疾患の脳脊髄炎（ＥＡＥ−多発性硬化症（ＭＳ）のモデル）（Ｍｅｔｚｌｅｒ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９３） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５： １１５９−１１６５； Ｌｉｕ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９５） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７： １２５５−１２６３； Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８： １２５１−１２６１）、経験的な関節炎、糖尿病、ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ（上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８）に記載されている。）において疾患を抑制する効果的な手法として示されている。これはまた、進行性のＥＡＥ疾患に対する治療手法として示されている（上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８））。
【０００５】
免疫寛容原性ペプチドを病気の予防や治療に使用することは、大いに注目すべき点である。その理由は、特定の免疫寛容原性エピトープが同一組織内の個々の抗原に対するＴ細胞の応答を抑制できることが示されたことである。この現象は、「バイスタンダ抑制（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」として知られている。このバイスタンダ抑制とは、特定の免疫寛容原性ペプチド（上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８）に示される。）を用いることによって、与えられた抗原に対して少なくとも１つ以上のエピトープ（好ましくは全てのエピトープ）、及び与えられた疾患に対して少なくとも１つ以上の抗原に寛容を誘発することができることを意味している。これは、特定の疾患において全ての病原性抗原を識別する必要性を不要にするものである。
【０００６】
ペプチドはまた、比較的低コストである点、及びペプチド類似物から免疫学的属性を変更したものを生産することができる点で、治療の有用なオプションである。このようにペプチドは、相互作用を変化させるために、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）とＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のどちらが変更されてもよい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この研究において考えられる問題点の１つは、全てのペプチドが寛容を誘発できるＴ細胞エピトープとして作用するわけではないことが説明されていることである。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド８９−１０１は、免疫化の後の優性免疫抗原であって、またＴ細胞の反応性を発現及びＥＡＥの誘導に対して非常に効果的な免疫原である。ところが、このペプチドは、溶液にて投与した場合、寛容を誘導する効果がないことが証明されている（上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８）に示されている）。
【０００８】
寛容を誘発するＴ細胞の機能に関して、観察されたヒエラルキーに基づく多くの説明がなされている（例えば、上記Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８）に記載されている。）。特に、ＭＨＣに対するペプチドの類似性と免疫寛容原性（上記Ｌｉｕ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９５）に記載されている。）との相関関係があることが説明されている。しかし、観察結果の中には、一致しないものもある。例えば、ＭＢＰ［８９−１０１］は、免疫寛容原性ではないが、比較的高い親和性をもってＩ−Ａ^ｓに結合する。このように、ペプチドが免疫寛容原性を誘発するとは直接的に予測できない。
【０００９】
仮に、一部のペプチドエピトープのみが寛容を誘発できることについて合理的な説明があれば、過敏症疾患の予防及び治療に有効な免疫寛容原性ペプチドの選択方法が容易になる。
【００１０】
そこで、本発明に係るペプチド選択方法は、過敏症疾患等の免疫系疾患の予防及び治療に有効な免疫寛容原性ペプチドの選択を容易にすることを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ペプチドのエピトープが抗原処理することなく未熟なＡＰＣによって提示されるような適切なサイズであるか否かを示している。それが免疫寛容原性を誘発することができる。Ｔ細胞エピトープが免疫寛容原性であって他は寛容を誘発できない点は、エピトープの中には、ＭＨＣ分子によって提示され得る以前に促進処理が必要なものもあるという事実によって説明されるこれら促進処理が必要なエピトープは、溶液状態にて投与されたとき、寛容を誘発できないにもかかわらず、エピトープは、免疫助成剤とともに投与されると疾患を誘発することができる。
【００１２】
促進処理を必要としないエピトープは、寛容を誘発することができ、これは本発明者によって「アピトープ」と表される（抗原提示独立エピトープ；ＡＰＩＴＯＰＥＳ（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉＴＯＰＥＳ））。
【００１３】
この知見は、生体内におけるペプチドの寛容能力を検査する必要性を不要にする免疫寛容原性Ｔ細胞エピトープを規則に基づいて選択する方法を提供するものである。これは、特に、動物モデルが対応できない疾患を予防する又は治療するたの方法の発展に有益である。生体内に用いられる前に試験管内にてヒトＴ細胞（ヒトＭＨＣ分子に結合する抗原を認識する。）を使ってペプチドの寛容誘導能がテストされメカニズムが提供されるため、動物モデルをもつ疾患があるが、その選択方法は、寛容性誘導構造を単純かつ安全に発展される。
【００１４】
第１の見地は、本発明者は、促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるペプチドを選択するステップを含む免疫寛容原性ペプチドを選択する方法を提供する。好ましい例としては、ペプチドは、促進処理することなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる。
【００１５】
抗原に与えられるＴ細胞エピトープとして作用できるペプチドを分類する技術には、多くの方法が知られている。共通なのは、この方法がＴ細胞エピトープからなる複数のペプチドの中から免疫寛容原性ペプチド選択することに用いられる点である。
【００１６】
ペプチドが促進処理なくしてＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるが否かを調べるために、ペプチドのＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に対する結合能を抗原処理独立提示システム（ＡＰＩＰＳ）を用いて調べることができる。好ましくは、（ｉ）ペプチドを含むＡＰＩＰＳを扱う。（ｉｉ）ＡＰＩＰＳ内のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子へのペプチドの結合を解析する。
【００１７】
第２の見地としては、本発明により、第１の見地の方法によって選択されたペプチドを供給することである。
【００１８】
ペプチドは、疾患の予防及び／又は治療に有用である。特に、ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞によって媒介される疾患の予防及び／又は治療に有用である。例えば、アレルギー、自己免疫疾患及び移植による拒絶反応のような過敏症反応に対しては、特に本発明のペプチドを用いて治療／予防するとよい。
【００１９】
本発明者は、ミエリン塩基性タンパク質に対する多くのアピトープを既に同定した。これは、多発性硬化症における自己抗原でもある。特に好ましい例としては、本発明に係るペプチドは、多発性硬化症の予防及び／又は治療に有用である。
【００２０】
幾つかのペプチドは、同一抗原由来の他のエピトープ及び異なる抗原由来の他のエピトープに対して寛容を誘発できると知られている（バイスタンダ抑制として知られている減少によって）。
【００２１】
しかし、本発明者は、全ての自己反応性Ｔ細胞を十分に抑制するためには、種々のアピトープを組み合わせて疾患の治療／予防のために患者に投与することが有効であろうことを予測した。
【００２２】
第３の見地としては、本発明者は、発明の第２の見地による複数のペプチドからなる製薬構造体を提供するものである。ここで、各々のペプチドは、Ｔ細胞エピトープに基づいている。
【００２３】
第４の見地としては、本発明者は、発明の第２の見地に基づいて被験者にペプチドを投与するステップを含み、被験者の疾患を予防及び／又は治療する方法を提供する。
【００２４】
予防及び／又は治療のための一般的な方法は、以下のステップを含む。すなわち（ｉ）疾患に対する抗原を同定する。（ｉｉ）抗原に対するアピトープを同定する。（ｉｉｉ）対象にアピトープを投与する。
【００２５】
【発明の実施の形態】
最初の見地として、本発明は、免疫寛容原性ペプチドを選択する方法に関する。
【００２６】
・免疫寛容原性（Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）
ここでは、「免疫寛容原性」を免疫寛容原性を誘発することができる、との意味として用いる。
【００２７】
免疫寛容原性とは、抗原の応答できないことである。自己抗原への免疫寛容原性は、免疫系の特徴としては不可欠であって、この自己抗原が失われると自己免疫疾患が起こる。適応免疫系は、自身の組織内に含まれる自己抗原の自己免疫攻撃を避ける一方で、膨大な種類の伝染病媒介物に対する適応性を維持しなければならない。これは、胸腺（免疫寛容原性の中核（Ｃｅｎｔｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ））でのプログラム細胞死（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）への早熟なＴ細胞の感応性によってほとんど制御されている。ところが、全ての自己抗原が胸腺にて検出されるわけではないため、自己反応胸腺細胞の細胞死は、不完全のままである。そのため、末梢組織（末梢免疫寛容）において、成熟した自己反応Ｔ細胞によって獲得された免疫寛容原性のメカニズムがある。中核及び末梢の免疫寛容のメカニズムに関する報告がアンダーソン等により与えられている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６９：１２３−１３７）。
【００２８】
免疫寛容原性は、少なくともＣＤ４＋Ｔ細胞の一部でのアネルギー誘発によって生じ、また特徴付けられる。Ｔ細胞を活性化するために、ペプチドは、Ｔ細胞に対して２つの信号を送達できる「プロフェッショナル」ＡＰＣに関連付けられる。第１の信号（シグナル１）は、ＡＰＣ表面のＭＨＣペプチド複合体によって送達される。第２の信号（シグナル２）は、ＡＰＣ表面のＣＤ８０、ＣＤ８６のような共刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）によって送達され、Ｔ細胞表面のＣＤ２８によって受け取られる。Ｔ細胞がシグナル２を受けることなくシグナル１を受け取ったときＴ細胞は活性化されず、アネルギーな状態になる。アネルギーなＴ細胞は、連続的な抗原投与（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対して免疫性があり、他の免疫反応を抑制できる可能性がある。アネルギーなＴ細胞は、Ｔ細胞の免疫寛容原性の介在に関与していると考えられる。
【００２９】
理論に縛られることなく、本願発明の発明者は、ペプチドは、成熟した抗原提示細胞によって操られるべきものであるから、ペプチドがＭＨＣ分子に結合された状態になる前に要求する処理は免疫寛容原性を誘発しないと予測している。成熟した抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞）は、抗原処理できるが、シグナル１及びシグナル２がＴ細胞に送達してＴ細胞を活性化することはできない。一方、エピトープは、未熟なＡＰＣ表面にあるクラスＩＩのＭＨＣに結合することができる。このように、エピトープは、共刺激分子なしでＴ細胞に与えられ、アネルギーなＴ細胞及び免疫寛容原性を誘発する。
【００３０】
エピトープはまた、成熟したＡＰＣの細胞表面のＭＨＣ分子に結合できるが、免疫系は、成熟したＡＰＣ以上に大量の未熟なＡＰＣを含んでいる（樹状細胞の１０％以下が活性化されている点がＳｕｍｍｅｒｓらにより示唆されている（（２００１） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５９： ２８５−２９５）。）。しかし、エピトープの初期状態（ｄｅｆａｕｌｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、活性化というよりは、アネルギー又は寛容である。
【００３１】
寛容がペプチドの吸引によって誘発されるとき、特定ＣＤ４＋抗原の増殖が減少される。また、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γの生成及びこれら細胞によるＩＬ−４の生成は抑制されるが、ＩＬ−１０の生成は増加する。ペプチド移入されて寛容状態にあるハツカネズミにおけるＩＬ−１０の中立（不顕性？）（ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）は、病気に対する感受性を完全に回復することが示されている。調節細胞の個数は、ＩＬ−１０及び中間免疫制御を生じる寛容状態によることが示されている（Ｂｕｒｋｈａｒｔらによる。（（１９９９） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１： １６２５−１６３４））。
【００３２】
寛容性の誘発は、
（ａ）生体内にてペプチドがターゲットエピトープとなっている疾患を生じさせるために感受性を低下させる
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギーの誘発（体外にて抗原を連続投与することによって検出される。）
（ｃ）以下、ｉ，ｉｉ，ｉｉｉによってＣＤ４＋Ｔ細胞の個数を変化させる。
（ｉ）培養における減数
（ｉｉ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の生成におけるダウンレギュレーション
（ｉｉｉ）ＩＬ−１０産生の増加
を含む種々の手法によって観察することができる。
エピトープに依存しない抗原処理（ＡＰＩＴＯＰＥＳと記す。）
【００３３】
本発明の方法は、促進処理を行うことなく、ＭＨＣのクラスＩ又はＩＩに結合することができるペプチドを選択するステップからなる。このようなペプチドは、本具体例では、「アピトープ（ａｐｉｔｏｐｅｓ）」（エピトープ（ｅｐｉＴＯＰＥＳ）に依存しない抗原処理）として記す。
【００３４】
与えられた抗原から送達されるペプチドの細胞表面提示は不規則ではなく、頻繁に生じる少量のエピトープによって支配されている傾向がある。特異なペプチドの優性は、多くの因子、例えば、ＭＨＣ分子を結合するための相対親和度、ＡＰＣ内におけるジェネレーションの空間的時間的位置、及び分解耐性に依存する。抗原のためのエピトープヒエラルキ−は、免疫反応の進行とともに変化し得る。そして、このエピトープヒエラルキ−の変化は、自己寛容性及び自己免疫性に対して重要な影響を及ぼす。免疫優性決定領域は、良好な免疫寛容原であると思料される。したがって、本具体例において、本発明に係るアピトープは、優性エピトープに基づいている。
【００３５】
しかし、免疫優性ペプチドに対する初期免疫反応の後、エピトープの「拡散」が亞優性決定基を生じる（Ｌｅｈｍａｎｎらによって示されている。（（１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５８： １５５−１５７））。亞優性エピトープの提示は、自己免疫性のトリガとして重要である。本発明に係るアピトープは、副優性エピトープに基づいてもよい。
【００３６】
与えられる如何なる抗原に対して、陰性アピトープが存在していてもよい。陰性エピトープは、全ての抗原として管理されたときには、Ｔ細胞反応を生成することができないが、ペプチドとして管理されたときには、Ｔ細胞反応を刺激することができる。ＡＰＣ内のペプチド中の抗原の処理中に、陰性エピトープが分解される。本願の発明者は、ペプチド９２−９８がＭＢＰ（例２Ｃに示す。）の陰性エピトープであることを証明している。興味深いことには、このペプチド領域内にアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）による推定上の分割位置があり、天然の処理中にて生じたことを示しており、この部位を含んだペプチドは、ＡＰＣによって生成されない。
【００３７】
陰性エピトープは、生体外にてエピトープとして働き、促進処理することなくＭＨＣ分子に結合でき、さらに陰性エピトープを認識するＴ細胞にアネルギーを誘発する。しかし、このようなアピトープは、天然で処理された抗原のエピトープを認識し免疫寛容性がないＴ細胞でなくてはならないため、治療には使用できない。
【００３８】
抗原に対するエピトープは、ＡＰＣによって提示されるとき、全抗原（下記参照。）に亘って重複するペプチドに対するＴ細胞反応を測定することによって確認されてもよい。この研究により、ペプチドの「入れ子型対（ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｔｓ）」が明らかになる。また、特定のＴ細胞系及びＴ細胞分枝系（Ｔ細胞クローン）に対する僅かなエピトープは、先端が欠損したペプチド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の反応を測定することによって評価できる。
【００３９】
抗原における僅かなエピトープがアピトープのように作用するとは仮定できない。僅かなエピトープのアミノ酸側面がＭＨＣへの最適な結合のためには必要であると思われる。アピトープは、異なるＴ細胞分枝系の僅かなエピトープ間に微妙な相違があってもよいように設計されている必要がある。
【００４０】
全てのエピトープに対応するアピトープを認識することはできない点は、強調すべきである。エピトープの中には、エンドゾームに付加したＭＨＣに付随する方法でＭＨＣに結合するものもあるという明確な証拠がある。したがって、Ｖｉｎｅｒらによって示されたプロセスを必要とする（（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ２２１４−２２１８））。これが、僅かなエピトープの個々が必然的にアピトープのように作用すると一般的に仮定することができないもう１つの理由である。
【００４１】
Ｔ細胞エピトープに含まれるペプチドの同定
与えられた抗原に含まれるＴ細胞エピトープを同定する技術には、多くの方法が知られている。
【００４２】
天然にて処理されたエピトープは、抗原含有ＡＰＣから溶離されたペプチドの重量分光光度分析によって同定される。ＡＰＣは、特定遺伝子を転換することによって抗原を取り上げ（ｔａｋｅ ｕｐ）ることを促進させるか、又は細胞内タンパク質を生成させる。典型的なＡＰＣは、溶液中又はＡＰＣ細胞表面に対して十分にターゲットされたタンパク質とともに培養される（温置される）。３７℃での温置の後、細胞を洗浄し、クラスＩＩタンパク質は、例えば、親和クロマトグラフィにより精製される。最適な化学的培地（例えば、酸性雰囲気下）を用いてＭＨＣを精製操作すると、ＭＨＣからペプチドが溶出する。このペプチド給源を分離し、同様に処理されたコントロールＡＰＣ由来のペプチドと性質を比較する。タンパク質を表す又はタンパク質から与えられる（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ／ｆｅｄ）細胞の特徴ピークを（例えば、重量分光測定により）解析し、ペプチド断片を同定する。この手法により、通常、抗原処理によって特定の抗原から得られるペプチドの部位（通常、「入れ子型対（ｎｅｓｔｅｄ ｓｅｔｓ）」として確認される）についての情報が得られる。
【００４３】
エピトープの他の同定方法には、試験管試験（生体外試験）にて、ペプチドの抗原鎖との重複と分布の分類を合成し測定する方法がある。例えば、ペプチド鎖内には１５のアミノ酸があり、５又は１０のアミノ酸が重複して使用されている。ペプチドは、抗原提示細胞及びＴ細胞を含む抗原提示系にてテストされる。例えば、抗原提示系は、ラットの脾細胞（ｍｕｒｉｎｅ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）から用意し、ヒト細胞はＰＢＭＣ又は扁桃腺から用意する。若しくは、抗原提示系は、特定のＴ細胞系又はＴ細胞分枝系、及び／又は特定の抗原提示細胞タイプを含む。
【００４４】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞培養（例えば、^３Ｈ−チミジン取込）又はサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）産生を媒介として測定される。ＴＨ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ試験のような一般的な手法によって検出されるＩＦＮγ産生を介して測定される。
【００４５】
重複するペプチドを調べることは、通常、エピトープが検出された抗原部位を示している。特定のＴ細胞に対する僅かなエピトープは、先端が欠損したペプチド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）への反応を測定することによって評価できる。例えば、重複ライブラリの中で１、１５の残基を含むタンパク質が得られれば、僅かなエピトープの同定に用いることのできる両端が欠損している（例えば、１と１４、１と１３、１と１２、２と１５、３と１５、４と１５等）。
【００４６】
試験管内試験により用いられた抗原の免疫優位残基の同定（特に、Ｔ細胞系を用いるもの）は、本発明によるペプチドの好反応性結果の非対称性を導くものと予測される。実例に示されたＭＢＰエピトープを同定する実験では、ＭＳ患者由来のＰＢＭＣの培養における動的反応性を分析し、健康な固体は重複ペプチドのライブラリに対して測定される。この試験は、健康な固体を形成するＴ細胞及びＭＳ患者のＴ細胞は精製されたタンパク質抗原に類似した種類に応答するが、異なった方法でＭＢＰ配列に基づいたペプチドとは異なる方法で応答するとの知見に基づいている。ＭＳ患者由来のＴ細胞は、正常で健康な被験者と比較して、かなりの量が、ペプチド抗原に対してより急激に動的に応答する。これは、特定患者が特定時期に応答するエピトープの同定及びエピトープの検出を可能たらしめる。ここで示した実験では、この手法によって、基本的な手法を用いて同定されないエピトープ含有残基の数を明らかにしている。そしてまた、Ｔ細胞の認識がある時点に現れて退行し、その後再度現れるという周期的パターンを示すことが明らかになった。
【００４７】
患者が特定時期に応答しているエピトープを明らかにするため、本発明者が提案する反応速度測定は、非常に貴重な手段である。この情報は、関連性のあるエピトープ（１つでもあれば。）に対するアピトープを同定し管理することによって、治療のためのアピトープ管理方法を個々の患者に適応させることに役立つ。また、この情報によれば、疾患の進行に対する一般的なパターンが作成できるため、治療合成薬は、疾患の進行段階に適合すると考えられるエピトープにアピトープを含んで調製することができる。
【００４８】
提示系から独立した抗原処理（ＡＰＩＰＳ）
一旦エピトープが同定されれば、次の段階はこのエピトープがアピトープとして作用するか否かを調べることである。
【００４９】
アピトープは、抗原処理に対する必要性をもたないＴ細胞に用意されていなくてはならない。アピトープは、Ｔ細胞エピトープを含む同定されたペプチドをもち、処理自由系を用いて同定されてもよい。先端が欠落したペプチド及びペプチド類似体は、提示系から独立した抗原処理（ＡＰＩＰＳ）を使って活性化がテストされる。
【００５０】
ＡＰＩＰＳには、以下の例が含まれる。すなわち、
ａ）固定ＡＰＣ（ＣＤ２８に対する抗体をもつもの又はもたないもの）。
ｂ）ＭＨＣ分子のクラスＩ又はＩＩを含む脂質膜（ＣＤ２８に対する抗体をもつもの又はもたないもの）。
ｃ）平面結合構造にある精製された天然又は組換型のＭＨＣ（ＣＤ２８に対する抗体をもつもの又はもたないもの）。
【００５１】
例えば、ポリペプチド内の僅かなエピトープを調査する研究（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８： １０３５−１０４３）において、先端が欠落したペプチドへの応答を測定することによってＴ細胞の応答を調べるために固定ＡＰＣを使用することは知られている。ＡＰＣは、例えば、ホルムアルデヒド（通常パラホルムアルデヒド）又はグルタルアルデヒドを用いて固定される。
【００５２】
脂質膜（平面膜又はリポソーム）としては人工脂質を用いるか、又はＡＰＣ由来の形質膜／ミクロソーム断片を用いる。
【００５３】
使用に際してＡＰＩＰＳは、組織培養プレートの培養床に適用されてもよい。ペプチド抗原は、選択されたＴ細胞系又はＴ細胞分枝系の付加によって検出されるＡＰＩＰＳのＭＨＣ部にペプチドを付加されるとともに結合している。Ｔ細胞系又はＴ細胞分枝系の活性化は、例えば、^３Ｈ−チミジン取込又はサイトカイン分泌を介するような、既知の如何なる方法によって測定されてもよい。
【００５４】
ペプチド
ペプチドに関する発明の第２の様相
「ペプチド」という語は、典型的なＬ−アミノ酸や、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とα−アミノ酸との間のペプチド結合によって典型的に互いに結合した一連の残基を表す通常の意味で使用されている。また、この語は、変性ペプチド及び合成ペプチド類似物を含む。
【００５５】
本発明に係るペプチドは、促進処理することなくＭＨＣのクラスＩ又はＩＩに結合できれば、如何なる長さであってもよい。
【００５６】
ＭＨＣのクラスＩ又はＩＩ分子の分子長は、典型的には７〜１３のアミノ酸からなり、より一般的なものは８〜１０のアミノ酸からなる。ペプチド結合は、全ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝において、ペプチド主鎖の原子と不変部位との間の接触によって両端にて安定化されている。ペプチドのカルボキシ末端とアミノ末端との結合溝の両端には不変部位がある。ペプチド長の変動は、ペプチド骨格において起こる縺れ、またしばしば要求される柔軟性を許容するプロリン又はグリシン残基にて起こる縺れによって決まる。
【００５７】
ＭＨＣのクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、典型的には８〜２０個のアミノ酸長であり、より一般的なのは１０及び１７個のアミノ酸長であるが、これより長くもなり得る。これらのペプチドは、両端がオープンになったＭＨＣＩＩペプチド結合溝にそって伸張された構造になっている（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝とは異なる。）ペプチドは、主に、ペプチド結合溝に沿った保護残基に接した主鎖原子によって規制されている。
【００５８】
本発明に係るペプチドは、化学的方法を用いて生成されてもよい（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ． Ｍｉｋｏｓ Ｂｏｄａｎｓｋｙ ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ．）。例えば、ペプチドは、固相法によって合成することができ（Ｒｏｂｅｒｇｅ ＪＹ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２−２０４）、樹脂から割削され、高性能液体クロマトグラフィによって精製できる（ｅ． ｇ．， Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。例えば、ＡＢＩ ４３ １ Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造業者から提供された指示にしたがって自動的に合成してもよい。
【００５９】
また若しくは、ペプチドは、組み換えによって、またはより長鎖のポリペプチドからの分裂によって生成されるものであってもよい。例えば、ペプチドは、標的抗原からの分裂によって得られる。ペプチドの合成は、アミノ酸解析又は配列決定法により確立されている。
【００６０】
好ましい実施の形態において、ペプチドは、標的抗原から誘導される。標的抗原は、疾患が生じている間、ＡＰＣによって処理される分子（例えば、タンパク質又は糖タンパク質）及びＴ細胞によって認識される分子である。当然のことながら、標的抗原は、標的疾患に依存する。好ましくは、ペプチドは、ＡＰＣによる抗原の天然処理によって生じた抗原の断片から誘導される。
【００６１】
実際には、ペプチドには様々な他の特性もある。例えば、ペプチドは、生体における許容濃度で可溶でなくてはならない。好ましくは、ペプチドは、最高でも０．５ｍｇ／ｍｌの濃度にて可溶でなくてはならない。より好ましくは、ペプチドは、最高でも１ｍｇ／ｍｌの濃度にて可溶でなくてはならない。また、最も好ましくは、ペプチドは、最高でも５ｍｇ／ｍｌの濃度にて可溶でなくてはならない。
【００６２】
鼻腔投与における服用量の最大値は、最新の方法では、鼻腔あたり約２００ｐｌである。仮にペプチドが１ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶であれば、各鼻腔に２服することで８００μｇが患者に投与される。一回の服用が５ｍｇを超えることは、例外的である。
【００６３】
また、ペプチドが治療に有効であるためには、体内で十分に安定していることも重要である。本発明者は、体内で投与後３０分経過して、試験ペプチドの全量が５０％に低下し、投与後４時間経過して、ペプチド量が約３０％に低下することが判った。しかし、５日経過後にも依然として検出可能な程度含まれる（約５％）ことが判った。体内におけるペプチドの半減期は、少なくとも１０分程度は必要であり、好ましくは３０分、より好ましくは４時間、さらに好ましくは２４時間である。
【００６４】
本発明者は、ペプチドを鼻腔内へ投与すると流出するリンパ節が投与後約４時間経過後に最大値となるが、５日経過後もペプチドが依然として検出される（最大約５％程度のレベルで）ことを見出した。ペプチドは、流出するリンパ節に長期間に亘って治療効果を発揮できる治療活性濃度で十分に安定していることが好ましい。
【００６５】
ペプチドはまた、体内で良好な生物学的利用能を示さなくてはならない。ペプチドは、体内で、障害なく細胞表面にてＭＨＣ分子に結合できる構造を保持しなくてはならない。
【００６６】
標的疾患
一具体例において、本発明を第２の知見から視たペプチドは、疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【００６７】
ＭＨＣクラスＩＩに対するアピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が介在する疾患に対して特に有用であると思われる。例えば、異常な又は過剰なＣＤ４＋Ｔ細胞応答によって引き起こされる又は継続される疾患に対して有用である。
【００６８】
このようなペプチドは、特に過敏症疾患の治療に有用である。過敏症反応には、以下のものを含む。
（ｉ）無害な体外異物に対する異常反応により生じるアレルギー
（ｉｉ）自己組織抗原に対する反応から生じる自己免疫疾患
（ｉｉｉ）移植に対する反応から生じる移植片拒絶反応
【００６９】
アレルギーの例としては、枯草熱（ｈａｙ ｆｅｖｅｒ）、外因性喘息（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ａｓｔｈｍａ）、昆虫刺症及び毒針アレルギー（ｉｎｓｅｃｔ ｂｉｔｅ ａｎｄ ｓｔｉｎｇ ａｌｌｅｒｇｉｅｓ）、食品及び薬物アレルギー（ｆｏｏｄ ａｎｄ ｄｒｕｇ ａｌｌｅｒｇｉｅｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、気管支喘息慢性気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、アナフィラキシー症候群（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、血管神経性浮腫（蕁麻疹）（ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、アレルギー性接触皮膚炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、結節性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｎｏｄｏｓｕｍ）、多形性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、スティーブンズ−ジョンソン症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、鼻腔性結膜炎（ｒｈｉｎｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、結膜炎（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、皮膚壊死性ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）、炎症性肺疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、水疱瘡性皮膚疾患（ｂｕｌｌｏｕｓ ｓｋｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ）等がある。ただし、この例に限定されない。
【００７０】
自己免疫疾患の例としては、リウマチ様関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ （ＲＡ））、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ （ＭＧ））、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ （ＭＳ））、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ （ＳＬＥ））、自己免疫性甲状腺炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ（橋本甲状腺炎）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ））、Ｇｒａｖｅｓ’ｄｉｓｅａｓｅ、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫性ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、多発性筋炎及び糖尿病の特定種（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、全身性脈管炎（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、多発性筋炎及び皮膚筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ−ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（強皮症）（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ））、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強直性脊椎炎及びｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ関連症（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、リウマチ熱（ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｆｅｖｅｒ）、過敏症肺臓炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、無機ダスト塵肺症（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｄｕｓｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｎｉｏｓｅｓ）、サルコイドーシス（ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、自己免疫溶血性貧血（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、免疫性血小板障害（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、クリオフィブリノーゲン血症のような寒冷症（ｃｒｙｏｐａｔｈｉｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｒｙｏｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｅｍｉａ）、自己免疫多線性内分泌障害（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）等がある。ただし、この例に限定されない。
【００７１】
臨床医学では、腎臓、肝臓、心臓肺、皮膚、角膜、骨髄を含む種々の組織は、一般的に移植される。現在では、角膜及び一部の骨髄を除く全ての移植片は、通常長期に亘って免疫抑制する必要がある。
【００７２】
本発明をこの知見から視た一具体例では、ペプチドは、糖尿病の予防及び／又は治療に有用である。この例では、ペプチドは、標的抗原ＩＡ２から誘導される。
【００７３】
本発明の他の具体例として、ペプチドは、多発性硬化症（ＭＳ）の予防及び治療に有用である。多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳ白質に散在的に播種された多発性脱髄性障害によって特徴付けされる慢性の炎症性疾患であって、あらゆる部位及び時点にて発症する（ＭｃＦａｒｌｉｎ ａｎｄ ＭｃＦａｒｌａｎｄ， １９８２ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０７： １１８３−１１８８ ａｎｄ １２４６−１２５１）。ＭＳは、自己反応性Ｔ細胞によって引き起こされると考えられる。
【００７４】
本具体例では、ペプチドは、特に、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又はプロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）のような自己抗原の１つから誘導される。ＰＬＰは高疎水性を有するため、ＭＢＰは、ＰＬＰ以上にペプチドを誘導することができると思われる。ペプチドは互い団塊を形成する傾向にあるＭＢＰから誘導されるため、動物において、ＭＢＰは、免疫原性であり、ＭＢＰ特性Ｔリンパ球は、脳炎誘発性活性をもっている（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ５１： ７−１９；Ｖｏｓｋｕｈｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ４２： １８７−１９２； Ｚａｍｖｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１７： ３５５−８）。
【００７５】
好ましい例としては、ペプチドは、ＭＢＰの免疫優性残基、すなわち１−２４、３０−５４、７５−９９、９０−１１４、１０５−１２９、１２０−１４４、１３５−１５９、１５０−１７０の中の１つから誘導される。
【００７６】
特に好ましくは、ペプチドは、本発明者によってアピトープとして作用することが確認されたＭＢＰペプチド、すなわち、３０−４４、８０−９４、８３−９９、８１−９５、８２−９６、８３−９７、８４−９８、１１０−１２４、１３０−１４４、１３１−１４５、１３２−１４６、３３−４７の１つから選択される。
【００７７】
ＭＨＣクラスＩに対するアピトープは、例えば、免疫寛容原性型にて、抗ウイルス性ＣＤ８＋応答を変化させるために用いられる。
【００７８】
製薬組成
本発明者は、寛容を効果的に誘導するために、「バイスタンダ抑制（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」にも関わらず、多くの異なるＴ細胞分枝系を標的にすることが必要であると予測した。
【００７９】
第３の知見では、本発明は、複数のアピトープを含む製薬組成に関する。
【００８０】
製薬組成は、例えば、２〜５０のアピトープからなることが好ましい。より好ましくは、２〜１５のアピトープからなる。アピトープは、同一又は異なる標的抗原から誘導されるのがよい。アピトープは、促進処理することなく、全てがＭＨＣクラスＩに結合できること、又は全てがＭＨＣクラスＩＩに結合できることが好ましい。好ましい例では、製薬組成中の全アピトープは、促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩに結合できる。
【００８１】
製薬組成は、キット形式であってもよい。個々のエピトープ又はエピトープの幾つかが同時に作用するように、分割又は一連の投与にて分割して供給される。
【００８２】
若しくは、製薬組成（又はそのあらゆる部位）は、多回服用にて投与されるべきものであるが、各服用分は、別々にパックされていてもよい。
【００８３】
製薬組成は、治療上又は予防上効果的なアピトープ量からなっていてもよく、また、少なくとも１つのアピトープは、選択的に、希釈液又は賦形剤等の製薬上許容できる担体に含まれている。
【００８４】
また、本発明に係る製薬組成において、少なくとも１つのアピトープは、最適な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、又は可溶化剤と混合されてもよい。
【００８５】
投与
ペプチドは、補助剤がない場合、可溶状態で投与されなくてはならない。
【００８６】
ペプチドは、粘膜経由で投与されることが好ましい。
【００８７】
研究は、ペプチドが可溶状態にて与えられれば、腹膜内に（ｉ．ｐ．）、静脈内に（ｉ．ｖ．）、鼻腔内に（ｉ．ｎ．）、又は経口にてＴ細胞寛容を誘導できる（Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８） ａｓ ａｂｏｖｅ； Ｌｉｕ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９５） ａｓ ａｂｏｖｅ； Ｍｅｔｚｌｅｒ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９７： ２５７−２６３）ということを示している。
ペプチドは、鼻腔内に投与されることが好ましい。
【００８８】
ハツカネズミによる研究では、寛容を誘導するために要求されるペプチドの継続投与が、受容体中のＴ細胞の前駆体頻度に依存することが示されている（Ｂｕｒｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９９９） ａｓ ａｂｏｖｅ）。また、多くの研究にて、ペプチドの反復投与が寛容を誘導することが証明されてきている（Ｂｕｒｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９９９） ａｓ ａｂｏｖｅ）。ペプチドの服用回数と適切な服用とは、個体個体に依存するものであるが、好ましい具体例では、多回服用にて投与されている。
【００８９】
仮に、ペプチドの大多数が同時に投与されるのであるなら、ペプチドは、単一又は多回服用にて投与するために適切な「混合薬」の形態でなくてはならない。また、ペプチドは、多回服用にて与えられることが好ましいが、各服用間の相対的なペプチド濃度を変更してもよい。
【００９０】
好ましい例として、濃度を段階的に上昇させて患者に多回服用させる「服用量の段階的増加（ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）」プロトコルが挙げられる。このような用例としては、例えば、蜂毒針アレルギーに対する免疫療法用途としてホスホリパーゼＡ↓２ペプチドが使用される（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０１： ７４７−７５４ ａｎｄ Ａｋｄｉｓ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０２： ９８−１０６）。
【００９１】
【実施例】
以下の例は、本発明の実例を説明するのに役立つが、これらに限定されるものではない。本発明は、特にこれらの例にて説明される詳細な実施例に関連付けられる。
【００９２】
例１−ＭＢＰにおけるＴ細胞エピトープの同定
物質及び方法
【００９３】
抗原
ヒトＭＢＰは、Ｄｅｉｂｌｅｒらによって示された方法によって脳白質から抽出し（Ｄｅｉｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７２ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２： １３９）し、この純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価する。ＭＢＰ及びヒト型結核菌精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（ＵＫ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｓｕｒｒｅｙ）は、予め決定された最適濃度での増殖定量法に使用される。すなわち、各抗原に対する最適濃度は５０ｐｇ／ｍｌである。ＭＢＰ分子全体に拡がる重複したペプチドのＡ ｐａｎｅｌ ｏｆ １５ｍｅｒは、Ａｂｉｍｅｄ　ＡＭＳ４２２多重ペプチド合成装置（Ａｂｉｍｅｄ， Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）にて標準的なＦ−ｍｏｃ化学を用いて合成される。各ペプチドは、５ａａ及び重複する１０ａａによって置換される。発明者らは、３つのグループに分けてプールされた３３個のペプチドを生成し、各プールは、５０ｐｇ／ｍｌの最適濃度にて検査される。各ペプチドは、試験管内にて１６．６μｇ／ｍｌの濃度に調製される。
【００９４】
患者及び被験対象
この研究の被験者は、臨床的に明白若しくは研究室的にも明白にＭＳであると認められ（Ｐｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３）、２９歳〜５１歳の年齢幅がある１２人の患者からなる。１２人のうち８人は、インターフェロン−βの試験中であるが、ほかのＭＳ患者は、研究開始以前の少なくとも３ヶ月間は、コルチコステロイド治療を行っていない。また、対象群は、２５歳〜５５歳の年齢幅のある１３人の健康な個人を含んでおり、血液サンプルを得る以前の少なくとも３ヶ月間は免疫抑制療法を受けていない。
【００９５】
組織培養基
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）を含むＲＰＭＩ−１６４０基、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸エステル（１００ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（以上は全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を組織培養基として用いる。血清を除いた培養基は、リンパ系細胞及びＴＣＬを洗浄するために使用する。培養組織の調節及び評価分析のために、培養基は、１０％を熱不活性化された自己由来の血漿にて補う。
【００９６】
培養組織の調製及びＴ細胞の増殖性評価
クエン酸塩添加血（５０〜１００ｍｌ）は、書面による情報開示に基づいて同意を得た後、静脈穿刺により各被験者から収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ社製， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）による密度遠心分離にて血液から分離され、２４床組織培養プレート（Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃｏｓｔａｒ， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ）にＰＰＤ、ＭＢＰ又はＭＢＰのペプチドを含む１×１０^６細胞／ｍｌを１．５体積ｍｌ用いて培養される。培養床は、湿度５％、ＣＯ_２濃度９５％、３７℃の温度調節装置内で培養される。５日乃至１４日の間に各培養組織から１００μｌの部分標本を一対ずつ回収し、９６培養床あるマイクロタイタープレートの底部周辺に移し、０．４μＣｉにて^３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 社製， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）を律動的に送り込む。１８時間経過後、細胞は、Ｍａｃｈ １１１ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６（Ｔｏｍｔｅｃ社製， Ｏｒａｎｇｅ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）を用いたガラス繊維マット（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ社製， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）から回収される。^３Ｈ−チミジン取込は、マクロベータ液体シンチレーションカウンタ（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ）を用いて検出される。抗原を含む試験床は、δｃｐｍ＞１０００、刺激指数（ＳＩ）＞３、であれば陽性とされる。ここで、ＳＩは、（培養組織に含まれるＣＰＭ抗原）／（抗原を除く培養組織ＣＰＭ）である。
【００９７】
Ｔ細胞系及びＴ細胞分枝系の生成
ＭＢＰ特異性Ｔ細胞系（ＴＣＬ）は、８人のＭＳ患者及び２人の健康な被験者から生成する。各被験者からのＰＢＭＣを上述のように分離し、ＭＢＰ（５０μｇ／ｍｌ）を用意した６つの培養床に１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍｌを塗布する。各被験者からのＰＢＭＣの一部は、完全に凍結され引き続き行われる再刺激（ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）のために保管される。７日後、細胞は、２％のＩＬ−２（Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−ＨＴ ； Ｂｉｏｔｅｓｔ ＬＴＤ．社製，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＵＫ）の新鮮な培地に移され、このときに全培養組織のうち１２個を抗原と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源としてのＩＬ−２及び放射線処理された自己由来のＰＭＢＣ（２５００Ｒｅｄ）とを、Ｔ細胞：ＡＰＣ＝１：５の割合にて再刺激（ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｅ）される。最初の再刺激（ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）のときに、ＭＢＰに対する細胞の特異的な増殖を調べる。すなわち、このＭＢＰにおいて、２×１０^４個のＴ細胞及び１×１０^５個の放射線処理された自己由来のＰＢＭＣは、９６培養床の底部にて約３倍に培養される。細胞は、２日間培養され、培養の最後の１８時間をかけて、^３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 社製， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）を０．４μＣｉにて律動的に送り込む。この後、細胞は、上述したように回収される。ＴＣＬは、δｃｐｍ＞１０００、及びＳＩ＞３でＭＢＰ特異性に対して陽性とされる。
【００９８】
続く、再刺激（ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）と展開の３サイクルにて、ＴＣＬは、ＡＰＣとして自己由来の放射線照射処理されたこのＰＢＭＣにおいて、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ社製， Ｐｏｏｌｅ， Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）を用いて分枝される。Ｔ細胞は、０．１（細胞／床）（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、０．３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、及び１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌにて希釈条件を制限され、１×１０^４の放射線処理されたＰＢＭＣ、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ、及び２％ ＩＬ−２とともに寺崎プレート（Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃｏｓｔａｒ）を用いて培養される。１０〜１２日後、成熟陽性の床は、１×１０^５放射線照射処理ＰＭＢＣ、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ、ＩＬ−２を用いて９６培養床のプレート底部周辺に塗布される。３日経過した培養床は、ＩＬ−２を含む新鮮な培地に移され、このとき、７つの分枝系は、５×１０^５ 放射線照射処理ＰＭＢＣ、ＰＨＡ及びＩＬ−２を用いて４８培養床プレートに塗布される。ここで、分枝系は、ＭＢＰに対する特異的な応答のための増殖試験が行われる。ＭＢＰ特異性分枝系は、１週間後、ＰＨＡ又はダイナベッヅ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（Ｄｙｎａｌ社製， ＵＫ）と、ＩＬ−２とともに１×１０^６ 放射線照射処理ＰＭＢＣを用いて２４培養床プレートに塗布される。分枝系は、２４培養床プレート内にて、基本的には上述した７〜１０日間の再刺激／展開サイクルが継続して行われる。ＭＢＰペプチドのパネルを認識するためのＴ細胞分枝系（ＴＣＣ）の機能は、上述した増殖試験によって確認される。
【００９９】
結果
ＭＳ患者と健康な個体との間のＭＢＰペプチド評価
本発明者は、ヒトＭＢＰの最長長さで拡がっている１５ｍｅｒの合成ペプチドに重複するパネルに対する応答能について調べられる健康体及びＭＳ患者由来のＰＢＭＣに対して動的反応性試験を行う。各培養組織から得たＰＢＭＣの増殖反応は、２週間の間の５時点にて調べられ、ＭＢＰ及びペプチドに対する応答の動的プロファイルは、ＰＰＤに対する応答と比較され、後者は、２次応答／記憶抗原を示している。インターフェロン−βを使用している患者と使用してない患者との間には、ＰＢＭＣのＭＢＰ及び／又はペプチドに対する応答において、大きな相違は見受けられない（データは示さない。）。ＭＳ患者と健康な被験者におけるＭＢＰへの応答の最大値は、ＰＰＤに対する応答以上に遅い。以下に、非リコール抗原に対する応答の動的指標を示す。図１は、ＭＳ患者及び健康体におけるＰＰＤ及びＭＢＰの動的評価の典型例を示している。
【０１００】
図２に示すように、ＭＳ患者に最も一般的に認められる２つのペプチドが９０−１１４と７５−９９（１２人の患者のうち６人に認められる。）であり、残基３０−５４、１３５−１５９、１５０−１７０（１２人の患者のうち５人に認められる。）、１−２４、１０５−１２９（１２人の患者のうち４人に認められる。）と続いている。３人の患者は、ａａ１５−３９と１２０−１４４に応答している。また、２人の患者には、４５−６９が認められる。また、残基６０−８４に応答したＭＳ患者はいない。
【０１０１】
図１０によれば、ここで全患者は、ＨＬＡ−ＤＲ２陽性であり、ＭＳ患者に最も一般的に認められる２つのペプチドは、９０−１１４と７５−９９であり（１１人の患者のうち６人に認められる。）、次いで残基１２−１４４、１３５−１５９、１５０−１７０（１１人の患者のうち５人に認められる。）であり、次いで１−２４、１５−３９、３０−５４、１０５−１２９（１１人の患者のうち４人に認められる。）となっている。
【０１０２】
対照的に、健康な被験者は、僅か２人の被験者が２以上のペプチド（図３におけるＣとＪ）に応答している点で極僅かなペプチドに重要性が認められる。ａａ６０−８４が認められたのは、被験者Ｃ及びＪの僅か２人であって、この患者群では残基は確認されない。興味深いことに、３人の被験者は何れも、ＤＲＢ１^＊０７０１対立因子（対立遺伝子）を示している。４５−６９及び１０５−１２９は、どの健康な被験者にも認められないが、７５−９９及び１５０−１７０は、４人の健康体に認められ、１３５−１５９は、３人の健康体に認められ、１２４、３０−５４、６０−８４及び１２０―１４４は、２人の健康体に認められ、１５−３９及び９０−１１４は、１人の健康体に認められている。全体として、１３人の健康体のうち８人は、重複したペプチドの何れにも応答していないが、１２人のＭＳ患者のうち１人（ＭＳ１９）は、一貫してＭＢＰペプチドが確認されていない。
【０１０３】
図１１には、健康な被験者のＭＢＰペプチドに対する応答が示されている。この研究では、唯一１人の被験者が２つ以上のペプチドに応答している（Ｎ１１）。Ｎ１１はまた、この患者群によって確認されていない残基であるａａ６０−８４に応答した唯一の被験者である。１５−３９、４５−６９、及び１０５−１２９は、何れの健康な被験者にも確認されていないが、１２０−１４４及び１３５−１５９は、２人の健康な被験者に認められている。また、１−２４、３０−５４、６０−８４、７５−９９、９０−１４４、及び１５０−１７０は、１人の被験者に認められる。全体として、１２人の健康な被験者のうち９人は、何れの重複するペプチドにも応答していない。
【０１０４】
全体として、ＭＢＰ及び／又はペプチドへの応答が最大値を迎えた日は、健康な被験者と患者との間で大きな相違はなく、両グループにおける動的反応性は、これらの初期抗原応答に類似していた。加えて、ＭＢＰ及びペプチドに対する応答の度合いは、患者と健康な被験者とでは相違なかった。
【０１０５】
ＭＢＰペプチド認識性の時間変化
ＭＳ患者は、ＭＢＰペプチドの幅広のスペクトルに応答することが確認されているが、本発明者は、同一の被験者におけるＰＢＭＣ認識性がほぼ４〜１２ヶ月間に集中され安定しているか否かを調べようとした。図２、図１０及び図３には、ＭＳ患者と健康な被験者の何れも同一のペプチド認識パターンを呈示しないことが示されている。
【０１０６】
図４には、２つの異なる時点で複数のペプチドに応答したＭＳ患者（ＭＳ４９）の例を示しているが、２番目の時点における認識結果は、４ヶ月後に測定したものであるが、著しく異なっている。これは、２番目の動的試験において、ＰＢＭＣのａａ１５−３９、３０−５４、及び１５０−１７０に対する応答が残存したものであるが、７５−９９及び１０５−１２９に対する応答が継続し、９０−１１４及び１３５−１５９の部位にシフトしたものである。
【０１０７】
図５に示す（ＭＳ６０）は、幅広のエピトープ応答が４ヶ月間以上に亘って応答が集中して継続した患者の例である。２巡目に検査された健康な個体では、何れのペプチドに対する応答もみられなかった（図３）。
【０１０８】
全体として、この結果は、ＭＳ患者が認識のセットパターンを呈示していないことを示している。各患者において、ＰＢＭＣは、患者ＭＳ４９の例が示すように、幾つかのペプチドに対するＰＢＭＣの応答は、残存し、退行し、ＭＢＰの新しい部位にシフトしている。
【０１０９】
ペプチド認識の周期性
１２ヶ月間に亘って３若しくはそれ以上の異なる時点にて、ペプチドに対するＰＢＭＣの応答を解析すると、ある患者では、エピトープ応答が変動するというよりむしろ新たなペプチド部位に不可逆的にシフトしていることを表しているということが明らかになっている。例えば、図２及び１０に示されるように、患者ＭＳ６０は、ａａ１２０−１４４及び１３５−１５９の認識が周期的なパターンを示しているが、これは、残基１２０−１４４及び１３５−１５９が最初の検査時点にてほとんど認識され、これら２部位に対する応答が２番目の検査時点によって退行し、４ヶ月後に測定された３番目の検査時点で再び現れたものである。患者ＭＳ４１の動的プロファイルは、ａａ１３５−１５９の認識が幾つかの時点で変動していることを近似的に示している（図２及び１０参照）。
【０１１０】
健康な被験者のグループ（図３）では、ある被験者（Ｍ）は、部位７５−９９及び１３５−１５９に対する応答が変動していることを示しており、被験者（Ｆ）は、３つの時点のうち２時点の解析にて７５−９９が認められ、被験者（Ｄ）は、残基１５−３９に対して周期的な応答を示している。
【０１１１】
ＭＢＰに対する応答の最適なマッピング
ＴＣＣは、８人のＭＳ患者及び２人の健康な被験者から生成され、動的応答性試験にて同定されたペプチド基の最適な特異性を明確にするのに用いられる。各ＴＣＣの特異性は、１５ｍｅｒペプチドのパネルに対する増殖応答性によって調べられる。分枝系ＳＤ：Ａ７は、１−２４にて確認され、この部位内にてこのＴＣＣは、ａａ５−１９に対する応答を示した。部位３０−５４は、４つの分枝系（ＭＳ４９：Ｄ３、ＭＳ４９：Ｃ８、ＭＳ４９：Ａ８、ＭＳ４９：Ｂ６）及び部位３０−４４内のエピトープによって認識される。ＭＳ患者由来の分枝系（ＭＳ３９：Ｄ７）は、ペプチド６０−７４を認識し、興味深いことに、ある健康な被験者は、我々の動的応答性試験において、この部位６０−８４に対して応答している。５つの分枝系（ＭＳ４３：Ａ７、ＭＳ４１：Ｂ６、ＭＳ４１：Ａ２、ＭＳ４１：Ｃ６、Ｎ５：８）は、部位７５−９９に含まれるａａ８３−９９を認識する。ある患者は、１０５−１２９内に含まれるａａ１１０−１２４（ＭＳ６０：Ａ２、ＭＳ６０：Ｂ３）、に対して特異的なＴＣＣを生成し、同一患者由来の他のＴＣＣは、１２０−１４４部位内の１３０−１４４（ＭＳ６０：Ｅ１）に対して特異的である。５人の被験者は、部位１３５−１５９内の認識エピトープであるＭＳ６０：Ｆ７、ＭＳ６０：Ｄ１、ＭＳ５９：Ｆ１及びＮ５：１９がａａ１４０−１５４を認識し、ＭＳ５７：Ａ１が１４０−１４９に対して特異的であるという分枝系を生成し、ＭＳ１７：Ａ３は、１３０−１４４のシーケンスに対して応答する。この分枝系のパネルは、ＭＢＰの１３５−１５９内に少なくとも２つのＴ細胞エピトープが存在することを明確にしている。最後に部位１５０−２７０は、ａａ１５６−１６９に対して特異的な２つの分枝系によって認識される。全ＴＣＣの特異性は、図６に要約されている。
【０１１２】
例２−ＭＢＰ中のアピトープの同定
物質と方法
【０１１３】
ＡＰＩＰＳを用いた抗原提示試験
ペプチドのＴ細胞分枝系に対する提示は、培養にて測定する。ＡＰＣは、０．５％パラホルムアルデヒドにて定着され、９６培養床組織培養プレートの１培養床あたり１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌにて塗布される。Ｔ細胞分枝系は、種々のペプチド濃度にて２×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで塗布される。３７℃にて４８時間温置した後、１６〜２０時間に亘って^３Ｈ−チミジン取込を行い、増殖を測定する。結果は、活性なＡＰＣによって示されるエピトープに応答するためのＴ細胞の機能と比較される。
【０１１４】
ＤＲ２：ＭＢＰ８２−１００の遺伝子導入マウスから分離されたＴ細胞に対するペプチドの提示は、ＡＰＣが５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌにて塗布され、Ｔ細胞が１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌにて塗布され、^３Ｈ−チミジンの添加に先立って７２時間の温置が行われることを除いては、基本的には上述したように行われる。
【０１１５】
結果
この実験において、先の例にてエピトープとして同定されたペプチドは、ＡＰＩＰＳを用いてその適応性が検査される。結果を図７ｂに示す。これまで検査された５つのエピトープのうち、４つのエピトープがアピトープであり（３０−４４、８０−９４、１１０−１２４、及び１３０−１４０）、１つはアピトープではないがエピトープとして作用することが明らかになった（１５６−１７０）。
【０１１６】
例２Ａ−ＭＢＰペプチド３０−４４、１１０−１２４、１３０−１４４、及び１５６−１７０に関する調査
種々のＭＢＰペプチドがアピトープであるか否かを調査するために、定着されたＡＰＣによってＴ細胞に示される適応性を調査した。活性化された又は予めＭｇａｒ（ＨＬＡ−ＤＲ２＋ｖｅ）にて前処理された細胞は、ペプチドを含む血清中又は血清単独中にて３．５時間前処理される。過剰なペプチドを細胞から取り除き、適切なＴ細胞分枝系を添加する。Ｔ細胞増殖応答は、３Ｈ−チミジンを加えて測定する。
【０１１７】
図８及び図９に示されるように、ペプチド３０−４４（図８Ａ）、１１０−１２４（図８Ｂ）、及び１３０−１４４（図９Ａ）は、促進処理することなく定着されたＡＰＣによって用意できる。したがって、これらのペプチドは、アピトープとして定義される。一方、ペプチド１５６−１７０は、Ｔ細胞に対して提示するために促進処理を必要とする（図９Ｂ）。定着されたＡＰＣは、このエピトープをＴ細胞に提示することができない。それゆえ、１５６−１７０は、アピトープではない。
【０１１８】
例２Ｂ−ＭＢＰの部位７７−１００及び１２５−１４８内のアピトープの同定
与えられた全エピトープに対して、１又は１以上のアピトープが存在し、これらは、促進処理することなくＡＰＣに対して提示される。ＭＢＰの２部位内のアピトープの提示は、活性の細胞又はＭＢＰ部位７７−１００（図１２）及び１２５−１４８（図１３）から得た血清中又は単独の血清中にて重複するペプチドとともに培養されパラホルムアルデヒド固定されたＭｇａｒ（ＨＬＡ−ＤＲ２）細胞を培養することによって調べられる。Ｔ細胞を付加し、７２時間後（図１２）又は４８時間後（図１３）にＴ細胞増殖応答を３Ｈ−チミジン取込によって調べた。ＭＢＰ７７−１００に関して、Ｔ細胞は、ＤＲ２：ＭＢＰ８２−１００遺伝子導入マウスから分離されるのに対して、ＭＢＰ１３０−１４４については、Ｔ細胞分枝系ＭＳ１７：Ａ３が用いられる。
【０１１９】
ＭＢＰ部位７７−１００に対して、以下のペプチドがアピトープとして定義される。
ＭＢＰ ８３−９９ ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰ
ＭＢＰ ８０−９４ ＴＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶ
ＭＢＰ ８１−９５ ＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴ
ＭＢＰ ８２−９６ ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰ
ＭＢＰ ８３−９７ ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ
ＭＢＰ ８４−９８ ＭＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴ
ＤＲ２ ＭＢＰ ８２−１００遺伝子導入マウス由来のＴ細胞によって認識される最小のＭＢＰシーケンスは、部位８５−９４である。
【０１２０】
ＭＢＰ部位１２５−１４８に関して、以下のペプチドがアピトープがアピトープとして定義される。
ＭＢＰ １３０−１４４ ＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶ
ＭＢＰ １３１−１４５ ＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤ
ＭＢＰ １３２−１４６ ＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤＡ
ＭＢＰ １３３−１４７ ＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤＡＱ
Ｔ細胞分枝系ＭＳ１７：Ａ３によって認識される最小のＭＢＰシーケンスは、部位１３３−１４４である。
【０１２１】
例２Ｃ−ＭＢＰ部位８９−１０１の調査
本発明者は、予め、他のミエリンＴ細胞エピトープと比べ、溶液状態にてペプチド８９−１０１を投与しても全ミエリン又は８９−１０１ペプチド自体の何れかを導入してもマウス試験免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を予防できない（Ａｎｄｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８： １２５１）ということを示している。
【０１２２】
３つのＴ細胞エピトープを備えるＭＢＰ８９−１０１
ＭＢＰの部位８１−１１１に対するＴ細胞反応性を調べるために８１−１１１を備えたマウス由来のリンパ節細胞を試験管内で８１−１１１にて刺激する。これらの細胞は、８１−１１１部位をカバーする２残基をもった１０ｍｅｒペプチドのパネルにて試験される（すなわち、８１−９０、８３−９２、８５−９４、８７−９６、８９−９８、９１−１００、９３−１０２、９５−１０４、９７−１０６、９９−１０８、及び１０−１１１）。８９−１０１をカバーするペプチドに対する応答パターンは、エピトープとは異なる少なくとも２つ（及び３）の提示を示す５つの隣接するペプチド（８７−９６から９５−１０４までのＮ末端）を刺激することを示している。
【０１２３】
さらにこの部位を調べるために、元の８１−１１１反応Ｔ細胞系から３つの副系を生成し、シフトして８４−１０６部位をカバーしている１つの残基をもつ重複する１０ｍｅｒペプチドのパネルで再試験した。結果は、８９−１０１シーケンスの中に、重複しない８９−９４、９２−９８、及び９５−１０１の３つの異なる部位が存在することが明らかになった（図１４参照）。
【０１２４】
ＭＢＰペプチド９３−９８は、陰性エピトープである。
３つのエピトープ特異性Ｔ細胞系（ＴＣＬ）は、全組換型ＭＢＰ及び８９−１０１ペプチドに対する反応性をテストしたとき、興味深い相違点を示す。８９−９４及び９５−１０１特異性ＴＣＬは、全ＭＢＰに対して応答するのみであるが、３つのＴＣＬは全てペプチド（８９−１０１）に対して応答するこれは、完全なＭＢＰの抗原処理は、９２−９８を認識しないが８９−９４及び９５−１０１を認識するＴ細胞に対するリガンドを優先的に生成することを示唆している。これは、９２−９８のエピトープが陰性であることを示している（すなわち、天然の抗原の処理によって生成され得ない）。ＭＢＰ８９−１０１ペプチドが３つの分離したＴ細胞集団によって認識されるペプチド又はＭＨＣリガンドに帰するＭＨＣ分子とともに３つの異なった相互作用に関与できるものと思われる。しかし、ＭＢＰの処理は、これらのＴ細胞集団うち２つに対してリガンドを生成するのみである（図１４参照）。
【０１２５】
ＥＡＥの導入は、完全なＭＢＰの減少の結果として生じるＣＮＳにおいて現れる自己抗原エピトープのＴ細胞認識性を要求する。上記同定された３つのＴ細胞エピトープのうち１つでも含んだペプチドによるマウスの免疫化は、天然に処理されたエピトープ（８９−９４又は９５−１０１）を含んでいるペプチドのみがＥＡＥを誘導できることを示している。これは、９２−９８が陰性エピトープであることの知見を指示するものである。ＭＢＰペプチド９２−９８は、ＭＢＰ９８−１０１に対して優性なエピトープである。
【０１２６】
部位８９−１０１は、上述したように、３つの異なった重複しないペプチドを含んでいる。これらのうち、ペプチド９２−９８は、この部位に対して優性種であると思われる。例えば、Ｔ細胞分子系が８９−１０１ペプチドにて初回抗原刺激を受けたマウスから生成されると、全６つの分子系は９２−９８に対して応答性をもつようになる。それぞれの位置に単一のアラニン置換体を含んだ８９−１０１類似のペプチドを用いると、９２−９８位置の何れかの置換基が応答性の欠陥を導き、９２−９８核内の何れの残基が変更されていることがこのエピトープを認識する効果を高めることが判る。ＭＢＰペプチド８９−１０１は、天然処理されたＭＢＰエピトープを認識するＥＡＥに関係したＴ細胞を寛容化することができない。
【０１２７】
上述した知見を要約するために、本発明者は、ａ）８９−１０１シーケンスは、３つの異なるＴ細胞エピトープを生成する可能性をもち、ｂ）これらのエピトープのうち２つ（８９−９４及び９５−１０１）だけが（生体内及び試験管内の両方で）完全なＭＢＰの抗原処理によって生成され、ｃ）天然処理されたエピトープを含むペプチド及び陰性エピトープを含まないペプチドがＥＡＥの誘導に効果的であり、ｄ）ペプチド治療試験において８９−１０１ペプチドは、ＥＡＥから保護することができない、ということを見出した。
【０１２８】
この情報は、Ｔ細胞と関係のある疾患を直接結紮することができないことからペプチド８９−１０１が、ＥＡＥに対して寛容化できないという仮説を研究するための基本を与えるものである。この仮説によれば、適切な構造にてＭＨＣ抑制因子（Ｉ−Ａ^ｓ）に直接結合できないであろうから、ペプチド（８９−１０１）は、主要な脳炎誘発性エピトープ（８９−９４）に対して寛容を誘発できない。言い換えれば、８９−１０１は、８９−９４に対するＴ細胞のアピトープとして作用しない。
【０１２９】
この可能性を確かめるために、寛容性試験は、８９−１０１及び８７−９６ペプチド（図１５Ａ及びＢ）を用いて行われる。８７−９６ペプチドは、ＥＡＥを誘導するに最も効果的なエピトープ（８９−９４）を含んでいる。
【０１３０】
方法
マウスは、０日上でフロインド完全アジュバンドであって、１００ｐｇのペプチドを投与されるに先立つこと８日、６日、４日に２００ｐｇのペプチドを含むＰＢＳ又はＰＢＳを単独で投与された。１０日後、リンパ節細胞（１床あたり６×１０^５）は、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地に５×１０^−５Ｍの２メルカプトメタノール及び２ＭのＬ−グルタミンを入れ、抗原を加えたものと加えないものとを用意し、７２時間培養された。培養組織は、最後の１６時間をかけて０．５μＣｉにて^３Ｈ−チミジンを律動的に送り込まれた。^３Ｈ−チミジン取込は、液体シンチレーションカウンタにて測定された。結果は、培養組織が３倍になるまで分毎にカウントする方法で表される。
【０１３１】
結果
８７−９６による準備刺激は、それ自体に対して強い想起応答を誘導し、８９−１０１に対して弱い応答を誘導した。（図１５Ａ及びＢにおける□及び○の各々）これは、８９−１０１から８９−９４を生成する抗原処理の必要性と関係している。８７−９６による準備刺激に先立って寛容原として８７−９６を使用することで、８７−９６及び８９−１０１（図１５Ａにおける■及び●）に対する想起応答が抑制された。この８９−９４による活性化はＴ細胞に反発し、一旦体内にて反応しなくなれば、８９−９６又は８９−１０１から生成されたものであっても、試験管内では８９−９４に対して反応できない。しかし、最終的に８７−９６による準備刺激に先立って寛容原として８９−１０１を用いても、８７−０６又は８９−１０１の何れに対しての想起応答をも抑制できなかった（図１５Ａ及びＢにおける■と●）。これらの結果は、免疫寛容原性型におけるペプチド８９−１０１の投与が８９−９４シーケンスに基づく天然処理された脳髄炎誘発性エピトープを寛容化できないことを示している。すなわち、８９−１０１ペプチドは、８９−９４エピトープに対するアピトープとして作用することはできない。
【０１３２】
理論的には結合することは望めないが、本発明者は、実験結果が、ＭＨＣペプチドの結合側面におけるペプチド８９−１０１の位置によって説明できるものと確信している。仮に、部位９２−９８がペプチド結合ポケット内にあるためにペプチドが優先的に結合するのであるならば、ＭＢＰ９２−９８特異性Ｔ細胞によって認識されるはずである。これが、なぜ、マウスがＭＢＰ８９−１０１ペプチドによる初回抗原刺激を受けると、生成される全Ｔ細胞分枝系がＭＢＰ９２−９８を認識するか、また同様に、８９−１０１が寛容化Ｔ細胞として用いられると、ＭＢＰ９２−９８エピトープを認識する細胞を主に寛容化するか、を説明している。仮に、ＭＢＰ９２−９８が陰性エピトープであるならば、全抗原の天然処理からは生成されず、Ｔ細胞が認識するエピトープは、生体内にはおそらく存在しないことになる。たとえ、ＭＢＰ９２−９８特異性Ｔ細胞が生体内に存在したとしても疾患に関係ない。それゆえ、８９−１０１は、全ＭＢＰにおいてＥＡＥ起因性を防ぐことができない。
【０１３３】
例３−ＭＳ型マウスのペプチド治療
本発明者は、腹腔経由（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９５） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８： １２５５−１２６３）、又は鼻腔経由（Ｍｅｔｚｌｅｒ ａｎｄ Ｗｒａｉｔｈ （１９９３） ５： １１５９−１１６５）の何れかの方法にて全身に投与された１用量のペプチド抗原は、３ヶ月間は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）から効果的にマウスを守ることを予め示した。少なくとも５用量のペプチドは、ＥＡＥ特異性Ｔ細胞受容体を（Ｌｉｕらによる。 （１９９５） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３： ４０７−４１５）表すＴｇ４遺伝子導入マウス（Ｂｕｒｋｈａｒｔらにより示されている。（１９９９） １１： １６２５−１６３４）に寛容を誘発することが要求された最近の研究は、両投与方法は、遺伝子非導入マウスでは等しく安全であるが、Ｔｇ４マウスにおいては、鼻腔（ＩＮ）経由が腹腔（ＩＰ）経由よりも安全であることを示している。
【０１３４】
ＭＢＰの８３−９９ペプチドは、適切なＨＬＡ−ＤＲ２クラスＩＩＭＨＣ分子及びこのペプチドに特異的なヒトＴ細胞分枝系由来のＴＣＲの両方を表すＦｕｇ／Ｄ６遺伝子導入マウスにて検査される。マウスは、Ｔｇ４遺伝子導入マウスの治療に用いた標準的な１用量（Ｔｇ４プロトコル）、又はアレルギー患者の治療に用いられるように投与用量を段階的に増大するペプチドの減感プロトコル（減感プロトコル）の何れかのペプチドにて治療される。
【０１３５】
Ｔｇ４プロトコル：マウス群は、ペプチド８３−９９（リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に４ｍｇ／ｍｌ混合する）又はＰＢＳ単独の合計２５μｌを鼻腔投与にて治療される。マウスは、５週間、週の初日から５日目まで毎日、合計１０用量が与えられて治療される。週のはじめには、６匹のマウスの各々は、フロインド完全アジュバンドにてペプチド８３−９９を投与され、また、１日に１及び３回の百日咳毒素（２００ｎｇ）ＩＰ射出を受ける。少なくとも３０日間、ＥＡＥの進行を監視する。
【０１３６】
減感プロトコル：マウス群は、ペプチド８３−９９又はＰＢＳ単独の合計２５μｌを鼻腔投与にて段階的に投与量を増大させて治療される。用量の段階変化は、０．１ｐｇから始めて１μｇ，３μｇ，６μｇ，１２μｇ，５０μｇと続けられ、１００μｇは、３回投与される。マウスは、５週間、週の初日から５日目まで毎日、合計１０用量が与えられて治療される。週のはじめには、６匹のマウスの各々は、フロインド完全アジュバンドにてペプチド８３−９９を投与され、また、１日に１及び３回の百日咳毒素（２００ｎｇ）ＩＰ射出を受ける。少なくとも３０日間、ＥＡＥの進行を監視する。
【０１３７】
例４−ＭＳ患者に対するアピトープ複合薬の鼻腔投与
ワクチンは、ＭＢＰペプチド３０−４４、８３−９９、１１０−１２４及び１３０−１４４（すなわち、アピトープとして同定されるＭＢＰエピトープのうちの幾つか。）からなる。ワクチンは、フェイズＩａ／Ｉｂ試験において、３５人の患者から得られる。試験は、患者にペプチド（Ｉａ）を１用量投与し、３ヶ月間は何もしないシングルクロスオーバ試験である。患者は、安全性を評価するためにワクチンの１用量投与後の３ヶ月間監視される。治療は、鼻腔堆積による週２回の投与からなる。各患者に対して：臨床的な活性は、毎月磁気共鳴画像によって解析され、免疫学的活性は、増殖のために動的応答性試験を用いて監視される。また、サイトカイン産生は細胞に基づくＥＬＩＳＡを用いて監視される。
【０１３８】
試験は、慢性進行性（ＣＰ）疾患をもつ５人の患者に対する治療を含んでいる。これらの患者は、低いＭＲＩ活性に基づいて選択され、最初に高い用量のペプチドに治療する。ＣＰ患者群は、ＭＲＩ活性の増加によって顕著となる如何なる危険な影響を示しそうなため、治療はＣＰ患者群にて開始される。回帰熱が小康状態にある患者の治療を一旦開始すれば、単一及び複合投与治療の両方ともがＣＰ群に対して安全であるということは明らかである。回帰熱が小康状態にある患者３０人からなるグループは、３ヶ月の監視期間中にＭＲＩ損傷が酷くなることに基づいて集められた。これらは、高用量のペプチド、中程度の用量のペプチド、低用量のペプチドにて治療される３つのグループに分けられる。
【０１３９】
【表１】

【０１４０】
また、以下に略号を示す。
ＡＰＣ ＝ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ； ＭＨＣ ＝ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ； ＴＣＲ ＝ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＥＡＥ ＝ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ； ＡＰＩＴＯＰＥ ＝ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ； ＡＰＩＰＳ ＝ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； ａａ ＝ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ； ＭＳ ＝ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ； ＭＢＰ ＝ ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＰＬＰ ＝ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＴＣＬ ＝ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ； ＴＣＣ ＝ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ； ＰＢＭＣ ＝ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ； ＰＰＤ ＝ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ； ＰＨＡ ＝ ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ
【０１４１】
発明のシステム及び方法には、種々の変形例があって、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。また、特に好ましい実施例に関して説明されているが、請求された発明はこの特定の実施例に過度に制限されない。発明を実現するために記述された様々な変形例は、化学、生物学、又は本発明が含まれる関連分野では熟練されたものであることは明白である。上記詳細な説明にて言及した全ての刊行物は、ここでは参考として全て含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、多発性硬化症（ＭＳ）の患者及び健康な個体における結核菌精製ツベルクリン蛋白体（ＰＰＤ）及びＭＢＰに対する運動性のプロフィールの代表的な例を示すグラフである。ＭＳ患者（Ａ）及び正常個体（Ｂ）から分離された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＰＰＤ及び全部のＭＢＰの存在のもとでの増殖能力に対して試験し、ＭＢＰに対する増殖反応の運動性のプロフィールを、二次性抗原ＰＰＤのそれと比較したものである。
【図２】図２は、ＭＳ患者におけるＭＢＰ及びそのペプチドに対するＰＢＭＣ反応を示す表である。特定の個体を、約４〜７ヵ月の間隔で３回分析した。
【図３】図３は、健康な個体におけるＭＢＰ及びＭＢＰペプチドに対するＰＢＭＣ反応を示す表である。各分析時点は、４〜７ヶ月離れている。
【図４】図４は、２つの異なる時点のおける複合ペプチドに反応するＭＳ患者（ＭＳ４９）の例を示すグラフであり、４ヵ月後に測られた第２の時点間のプロフィールは、かなり異なることが認識された。ＰＢＭＣは、ＭＢＰの完全長に及んでいるペプチドのＭＢＰ及びパネルの存在のもとに培養され、増殖は、^３Ｈ−チミジン取込によって測られた。第１の時点で観察された幅広のＴ細胞増殖反応は、７ヵ月後の第２の時点で測られた反応とかなり異なっている。
【図５】図５は、エピトープ反応が広がり（第１の時点）、退行し（第２の時点）、１２ヵ月の期間経過後（第３の時点）に再び現れた患者の例を示すグラフである。
【図６】図６は、ＭＳ患者及び健康な個体から生成されるＴＣＣのを使用して得られる運動性の反応分析評価で確認されたペプチド部位の微細特異性のマップを示すずである。スクリーニング分析評価で使われる殆どのペプチドは、長さが１５−ｍｅｒあるが、少しのペプチドは１０−ｍｅｒであり、１ペプチドは、１７−ｍｅｒである。各ＴＣＣの特異性は、少なくとも２回試験される。
【図７】図７ａは、ＭＳ患者からのＴリンパ球によって認められるミエリン塩基性蛋白質内におけるＴ細胞エピトープの特性を示す表である。図７ｂは、全てのＴ細胞エピトープが凝固したＡＰＣよって必ずしも示されるというわけでなく、したがって、アピトープではない。
【図８】図８は、活性の及び定着したＡＰＣによるＴ細胞分枝系に対する様々なＭＢＰペプチドの現れ方を示す図である。図８Ａは、ペプチドが３０〜４４であり、図８Ｂは、ペプチドが１１０〜１２４である。
【図９】図９は、活性の及び定着したＡＰＣによるＴ細胞分枝系に対する様々なＭＢＰペプチドの現れ方を示す図である。図９Ａは、ペプチドが１３０〜１４４であり、図９Ｂはペプチドが１５６〜１７０である。
【図１０】図１０は、３つの離れた時点において得られるＭＳ患者のＭＢＰ及びＭＢＰペプチドに対するピーク刺激指数（ＳＩ）を示す表である。第２の時点のサンプルは、第１の時点の４〜８ヶ月後に、第３の時点のサンプルは、第２の時点の３〜５後に収集された。バックグラウンドｃｐｍは、各日毎に測定され、８０〜７００ｃｍｐ間を変化し、ＳＩ＞３、δｃｐｍ＞１０００によって陽性と定義した。（患者ＭＳ１９及びＭＳ６７から全ての３の時点に対するサンプルを集めることできなかった）。
【図１１】図１１は、健康な個体におけるＭＢＰ及びＭＢＰペプチドに対するピーク刺激指数（ＳＩ）値を示す表である。バックグラウンドｃｐｍは、各日毎に測定され、８０〜７０００ ｃｐｍ間を変化し、ＳＩ＞３、δｃｐｍ＞１０００によって陽性と定義した。
【図１２】図１２は、ＡＰＣによる部位７７〜１００における入れ子型ＭＢＰペプチドに対するＤＲ２：ＭＢＰ８２〜１００の遺伝子導入マウスから分離されたＴ細胞の反応を示す図である。
【図１３】図１３は、ＡＰＣによる部位１２５〜１４８におけるＭＢＰペプチドの存在に対するＴ細胞分枝系ＭＳ１７：Ａ３の反応を示す図である。
【図１４】図１４は、ＭＢＰ８９〜１０１の配列内におけるＴ細胞エピトープ認識を示す図である。配列：８９〜９４、９２〜９８及び９５〜１０１内には、異なるが、重なり合った３つのＴ細胞エピトープがある。アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）の作用による残基９４及び９５間の分割に対する潜在性は示される。
【図１５】図１５は、８９〜９４エピトープに反応するＴ細胞に対して、アピトープとして働くＭＢＰペプチド８７〜９６（Ａ）及び８９〜１０１（Ｂ）の吸収力を示す図である。

Claims (19)

1. 促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合可能なペプチドを選択するステップを含む免疫寛容原性ペプチドの選択方法。
2. ペプチドは、促進処理することなくＭＨＣクラスＩＩ分子に結合可能であることを特徴とする請求項１記載のペプチド選択方法。
3. ペプチドは、Ｔ細胞エピトープからなる複数のペプチドから選択されることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド選択方法。
4. 複数のペプチドは、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子から溶離されることを特徴とする請求項３記載のペプチド選択方法。
5. 複数のペプチドのうちの各ペプチドは、免疫助成剤を有する被験対象に投与されると被験対象内にて抗原と結合される疾患を誘発可能であることを特徴とする請求項３又は４記載のペプチド選択方法。
6. ペプチドは、先端が欠落したペプチドの入れ子型対から選択されることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド選択方法。
7. Ｔ細胞エピトープ及び以下によって決定されるＴ細胞エピトープからなるペプチドである
   （ｉ）治療：疾患をもった被験対象からの標本細胞を治療する、及び疾患をもたない被験対象からの標本細胞を治療する、
   （ｉｉ）標本細胞間のＴ細胞応答を比較する
   ことを特徴とする上記全請求項に記載のペプチド選択方法。
8. 以下のステップ
   （ｉ）ペプチドを含みペプチドの提示システムから独立する抗原処理（ＡＰＩＰＳ）にて扱うステップと、
   （ｉｉ）ＡＰＩＰＳ内のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩに対するペプチドの結合性を解析するステップと、
   を有することを特徴とする上記全請求項に記載のペプチド選択方法。
9. Ｔ細胞付加及びＴ細胞活性化を測定することによってペプチドがＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩに結合することが解析されることを特徴とする請求項８記載のペプチド選択方法。
10. ＡＰＩＰＳは、
    （ｉ）定着された抗原提示細胞
    （ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子からなる脂質膜
    （ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子の平面結合
    を備えることを特徴とする請求項８記載のペプチド選択方法。
11. 促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合されることを特徴とする上記ペプチド選択方法によって選択されるペプチド。
12. ペプチドは、ミエリン塩基性タンパク質：３０−４４、８０−９４、８３−９９、８１−９５、８２−９６、８３−９７、８４−９８、１１０−１２４、１３０−１４４、１３１−１４５、１３２−１４６、及び１３３−１４７から選択されることことを特徴とする請求項１１記載の上記ペプチド選択方法によって選択されるペプチド。
13. 上記ペプチドは、疾患の予防及び／又は治療に用いられることを特徴とする請求項１１又は１２記載の上記ペプチド選択方法によって選択されるペプチド。
14. 上記疾患は、過敏症疾患であることを特徴とする請求項１３記載の上記ペプチド選択方法によって選択されるペプチド。
15. 請求項１１乃至請求項１４に関する複数のペプチドからなる製薬構造体であって、各ペプチドは、疾患に対するＴ細胞エピトープを有することを特徴とする製薬構造体。
16. 請求項１１乃至請求項１４に関するペプチドを投与するステップを含み被験対象における疾患の予防及び／又は治療方法。
17. （ｉ）疾患に対する抗原を同定するステップ、
    （ｉｉ）抗原に対するアピトープを同定するステップ、
    （ｉｉｉ）被験対象にアピトープを投与するステップ
    とを含むことを特徴とする請求項１６記載の疾患の予防及び／又は治療方法。
18. ペプチド又はアピトープは、複合用量にて投与されることを特徴とする請求項１６又は１７記載の疾患の予防及び／又は治療方法。
19. ペプチド又はアピトープは、鼻腔投与されることを特徴とする請求項１６乃至１８記載の疾患の予防及び／又は治療方法。