JPH06507168A - 自己免疫性を改善せしめるうえで有用なｍｈｃコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫性を改善せしめるうえで有用なＭＨＣコンジュゲート発明の背景 本発明は、例えば自己免疫障害、アレルギ一応答、移植片拒絶及びその他の免疫 学的障害の処置におけるＴ細胞機能の調節のための方法及び組成物に関する。詳 しくは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）垢タンパク質と、かかる障害に関連す る抗原のフラグメントに相当するペプチドとの複合体を利用することによる、ヘ ルパーＴ細胞を標的とする複合体に関する。これらの複合体は診断目的のために ラジオアイソトープもしくはその他のラベルに、又は該複合体を治療的に有用に する毒素もしくはその他の物質に更に複合化せしめることができる。

望ましくないＴ細胞の活性化を包括する数多くの病理学的応答が知られている。

例えば、数多くのアレルギー障害は特定のＭＨＣ対立遺伝子に関連しているか、 又は自己免疫成分を有することが推測されている。

その他の有害なＴ細胞仲介応答には、同種異系宿主に由来するグラフト又は移植 片として故意に身体に導入した外来細胞の破壊が含まれる。「同種異系移植片拒 絶ｊとして知られるこのプロセスは宿主のＴ細胞と外来ＭＨＣ分子との相互作用 を包括している。しばしばよく、幅広い範囲のＭＨＣ対立遺伝子が、同種異系移 植片に対する宿主の応答に関与している。

自己免疫障害は特に重要な有害な免疫応答の種類である。自己免疫障害において 、自己寛容は失われてしまい、そして免疫系は「自己」の組織をあたかもそれが 外来標的であるかのように攻撃する。

これには、重症筋無力症（ＭＧ）及び多発性硬化症（ＭＳ）を含む、公衆の注目 を浴びた数多くのものが含まれる。

自己免疫障害及びその他の免疫病理を処理する大雑把な手法は一般に免疫抑制で ある。これは免疫応答を上昇せしめることを必要とする真のガ来物質に対する対 象体の能力を失わせる明らかなる欠点を有する。はんのわずかに洗練された手法 は、標的組織に関与する抗体又は免疫複合体の排除を基礎とする。これも有害な 副作用を存し、そして成し遂げることが困難である。下記に詳細する本発明の手 法は、「クロノタイプ」試薬、即ち、自己抗原に対して応答性である免疫系の細 胞のみを攻撃する試薬を基礎とする。

免疫応答を説明するのにここで考慮している一般例において、紹介する特異的抗 原は、１９５９年にＢｕｒｎｅｔによって初めて提案されたクローン増殖に由来 する。このシナリオに従うと、特定の対象体は数１０万のＴ及びＢ細胞を存し、 それぞれは様々な抗原決定基に結合するレセプターを保有しうる。抗原への暴露 により、この抗原はその他を無視して、それが含んでいる抗原決定基に対する適 当なレセプターを抱える細胞に特異的に結合する。この結合は数千の娘細胞のク ローン集団（それぞれは同一のレセプターにより担われる）をもたらす、クロノ タイプ試薬は、対象の抗原にとって適切であるＴ及びＢ細胞のサブセットのみに 影響する。本発明の組成物においては、この抗原決定基は通常自己免疫障害に関 連するものである。

本発明のクロノタイプ試薬組成物はＴヘルパー細胞を標的とするために特にデザ インされており、これは自己免疫障害により影響される組織の抗原決定基に特異 的なりローンを代表する。Ｔヘルパー細胞はＭｌ（Ｃタンパク質と一緒のときに のみ決定基を認識する；本発明の複合体は従ってこのＭＨＣタンパク質の有効領 域を含んでいる。

最近、特異的な抗原に対する免疫応答を妨害することを試むいくつかの関連の手 法がある０例えば、自己抗原チログロブリンかりシンＡとコンジュゲートされて おり、そしてこのコンジュゲートはこの抗原に通常応答するリンパ球のインビト ロ抗体応答を特異的に抑制することが示されている。かかる免疫毒素は自己抗体 −分泌性リンパ球クローンを特異的に排除することが推測されている（Ｒｅｎｎ ｉｅ。

てダウノマイシンをハプテン（この場合はオバルブミン）にコンジュゲートせし めることによる、リンパ球機能の抗原特異性抑制を生しせしめる化合物の構築を 提唱している。このコンジュゲートはインビトロ及びインビボでのＢリンパ球に よる抗体分泌のハプテン−特異的阻害を生じせしめている。ダウノマイシンの、 ’ｌ胞に特異的なモノクローナル抗体とのコンジュゲート（酸感受性スペーサー による）はコンカナバリンＡに対するＴリンパ球による応答も排除した。　５ｔ ｅｅｒｚ、　Ｒ，に、Ｍ、らＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８５）　１３４　：　 ８４１　８４６は毒素コンジュゲートにおける毒素因子として放射物を利用して いる。ラットに、コールドレセプターを注射する前に、電気魚に由来する放射性 ラベルした精製レセプターを投与している。このレセプターによる注射は実験的 な自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）を誘発する標準的な手法である。障害を誘 発せしめるレセプターの投与前に、コールドレセプター又は放射性ラベルアルブ ミンのいづれかのみの事前注射を受けたコントロールラットはＥＡＭＧの症状を 示した；放射性ラベルレセプターで予備処置したものは軽い症状を示した。ラベ ルされた、それ故破壊性のレセプターは免疫競合細胞を特異的に排除することが 予測された。予備処置のためのりシン／レセプターコンジュゲートを利用する似 たような研究がＫ１１ｌｅｎ、　Ｊ、Ａ、らのＪ、Ｉｓｕ＋ｕｎｏｌ（１９８４ ）　１３３　：　２５４９−２５５３に報告されている。

一般にＴ細胞の破壊をもたらす消極的な手法は、Ｈｉｘｓｏｎ＋　Ｊ、Ｒ，。

Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｒｉｂｕｎｅ　（１９８８年１月２８日）４−５に報告され ているルー２／毒素のコンジュゲートによる処置である。反対に、しかし関連す る手法として、Ｌｉｕ、　Ｍ、Ａ、ら５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２３９　 ：　３９５−３９７は、細胞毒性、Ｔ細胞特異性を無視して、所望の標的と細胞 毒性Ｔ細胞との「リンクアップ（連結）」法を報告している。この手法において 、使用するホルモンがメラノサイト刺激ホルモンのとき、普遍性細胞毒性Ｔリン パ球に特異的な抗体はヒト黒色腫細胞を破壊する。

免疫性の現状のモデルは、抗原が、主要組織適合性複合体（ＭＢＣ）における遺 伝子によりコードされるクラス■の糖タンパク質を表層上に含んでいる抗原表示 細胞（ＡＰＣ）により摂取されることによって、免疫応答を動員せしめることを 少なくともある程度は条件としている。この抗原は、次に表層結合型ＦＩＨＣ塘 タンパク質に関連して特異的なＴヘルパー細胞へと供され、そして、この抗原特 異性Ｔ細胞レセプターと抗原−ＭＨＣ複合体との相互作用により、このＴヘルパ ー細胞は、細胞毒素Ｔ細胞機能の誘発、Ｂ細胞機能の誘発、並びにこの応答を補 助する及び扇動する数多くの因子の分泌を含む、抗原特異的免疫応答の仲介を刺 激する。

自己免疫障害におけるＭＨＣクラス■タンパク質の関与は動物モデルにおいて示 されている。ＭＨＣクラス■タンパク質自体に対する抗体、又はＭＨＣクラス■ 遺伝子の発現を誘発する物質に対する抗体の投与は、これらのモデル系における 自己免疫症状の発症をはばむ。

ヘルパーＴ細胞Ｔ胞の役割も、抗ＣＤ、モノクローナル抗体を用いてこの自己免 疫系を妨げることにより、これらのモデルにおいて実証されている；　ＣＤ、は 特徴的なヘルパーＴ＄［！Ｉ胞レセプターである（Ｓｈｉｚｕｒｕ。

Ｊ、Ａ、ら５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４０　：　６５９−６６２　）。

最近の実験は、一定の環境のもとでは、アネルギー又は非応答性が自己反応性リ ンパ球の中で誘発されうろことを示している（Ｓｃｈｗａｒｒｚ＋　Ｃｅ旦（１ ９８９）　１０７３−１０８１を参照のこと；これは引用して本明細書に組入れ る）。インビトロ実験は、共刺激シグナルの非存在下において、ＭＨＣクラス■ 分子による抗原表示は、繁殖的な非応答性状態を同系移植細胞において誘発せし めることを示唆する（Ｑｕｉｌｌ　ら、Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏｌ　（１９８７）　１ ３８　：３７０４　３７１２これは引用して本明細書に組入れる）。しかしなが ら、これらの報告は、インビボでのアネルギーの誘発が可能であるか、又は自己 免疫障害がこの状態で有効に処置されうるかの明確な証拠を提供していない。

発明の概要 本発明は、自己免疫性のような所望されない自己応答の原因である免疫系の状況 を同定、且つ、阻止するのに利用できる方法及び組成物に向けられている６本発 明の組成物及び方法は、ＭＨＣによりコードされる糖タンパク質と一緒に特定の 抗原を認識するヘルパーＴ細胞を標的とするようにデザインされている０本発明 の複合体はＴ細胞レセプターに結合し、そして標的リンパ球及びその他の細胞に おいて免疫系の非応答性をもたらす。

本発明は、免疫反応を起こさせるように抗原自体により触発される相互作用と類 似の状況で免疫系と相互作用する抗原の形態を提供する。本発明の組成物は、（ １）　ＭＨＣコード化抗原表示糖タンパク質の有効領域；及び（２）抗原の有効 領域；の精製化＝成分複合体である。これらの二成分は共有又は非共有連結によ って結合している。インビトロ及びインビボ実験の両者に由来する証拠は、かか る複合体が同系移植Ｔ細胞における慢性アネルギーを誘発せしめることを確立す る。

その他の観点において、本発明は薬理学的組成物に向けられ、ここで本発明の複 合体が活性成分である。この組成物は自己免疫障害のような免疫応答に関連する 特定の抗原との免疫系反応の一部を下降制御するのに用いることができる。

図面の簡単な説明 図１は本発明の典型的な複合体の図解である。

図２はヒ）　１（ＬＡ−Ａ２抗原（クラスＩ）の三次元構造を示す。

図３は改良クラスＩＩ　ＭＨＣコード化糖タンパク質の活性領域の図式図４は好 ましい第二世代ＭＨＣタンパク質のデザインを示す。

図５は抗原表示細胞の表層を擬態した、ＭＨＣ？！タンパク質を含む平面膜二重 層の図解である。

回６はアセチルコリンレセプタータンパク質のアルファーサブユニットに関する アミノ酸配列及びコードＭＲＮ＾を示す。

図７はミニリン塩基性タンパク質のアミノ酸配列を示す。

図８はＩ−Ａ’−ベーター鎖をコードするヌクレオチド配列を示す。

図９はＩ−Ａｂ−ベーター鎖をコードするヌクレオチド配列を示す。

図１Ｏはヒトにおける０口１０Ｒハブロクイブ及び関連の自己免疫障害のリスト である。

図１１は自己免疫障害の診断及び／又は処置のための本発明の複合体の利用に適 するプロトコールを示す。

図１２はＮＤ　−４０可溶性膜抽出物を含むＩ−ＡＫの製造のための計画を示す 。

図１３Ａは１０−２．１６モノクローナル抗体のアフィニティー精製及びＣＮＢ 、活性化セファロース４Ｂへのその結合についての計画である。

図１３Ｂは図１３Ａにおける計画によって精製した１０−２．１６モノクローナ ル抗体の純度を示すゲルのコピーである。

図１４はＩ−ＡＫの精製のための方法を示す。

図１５は図１４における計画により精製したＩ−ＡＫの純度を示すポリアクリル アミドゲルである。

図１６はＩ−ＡＫ及びＭＢＰ　（１−１３）を含む複合体による増殖の阻止に基 づく８種の試験結果を示す棒グラフである。

図１７はＭＢＰ　（１−１３）での免疫に由来するマウスにおけるＥＡＥの発症 を示すグラフである。

図１８はＭＢＰ　（１−１１）で免疫した後のマウスのＢＩＯＡ（４Ｒ）株から 獲得したＴ細胞クローン４Ｒ３，４によるＥＡＥの養子移入を示すグラフである 。

図１９Ａ−ＣはＰＢＳのみ（１９ａ　）　、ｌ−Ａ３／ＭＢｐ　１−１４　（非 起脳炎ペプチド）（１９ｂ）及びｌ−Ａｓ／ＭＢｐ　９ｌ−１０３（１９Ｃ）を 用イタマウスにおける受動誘発型ＥＡＥの処置を示す。

圓２０は、本発明の複合体が凝集体として存在していることを示し、なぜなら、 それらはボイドボリュームでカラムを通過し、従って６００．０００以上の分子 量を有するからである。

図２１は本発明の複合体（Ｍ）ＩＣＩＩ　：　ＡＣｈＲα１００−１１６）がラ ットにおけるＭＧの処置において有効であることを示す。

図２２Ａ及び２２ＢはＴ細胞におけるアネルギーの誘発に細胞死が追尾すること を示している。

図２３Ａ及び２３Ｂはア不ルギーを誘発するのに必要な本発明の複合体のモル濃 度が、ペプチドのみよりもはるかに低いことを示す。

好ましい態様の説明 本発明はＴ細胞機能を調節するのに利用できる複合体を提供する。

例えば、該複合体は有害なＴ細胞仲介型免疫応答、例えばアレルギ一応答、同種 異系移植片拒絶及び自己免疫障害を阻止するのに利用できる。更に、本発明の複 合体は免疫応答を助長するために利用でき、従ってワクチンとして利用できる。

この態様において、ＭＨＣ成分Ｃクラス■又はクラス■の両方）は、典型的には 共刺激性シグナルに関与するリガンドを抱える競合抗原表示細胞への連結が可能 となるように改質される。他方、この複合体をＴ細胞増殖を誘発する単離化共刺 激性リガンドに連結させてよい。従って、Ｔ細胞はこの複合体により表示される 抗原性ペプチドに応答し、そして免疫応答が触発されるであろう。

本発明の複合体は少なくとも２種の成分を含む：自己抗原を表示するペプチド又 は免疫系に関連の影響を及ぼす効果を有するその他の抗原性配列、及び抗原表示 に関与するＭＨＣコード化糖タンパク質の有効領域。ＭＨＣＩｉタンパク質の有 効領域は、抗原結合性部位及び適当なＴａ１ｌ胞レセプターによりこの？ＩＨＣ ペプチド複合体が認識されるために必要な配列を含んで成る。このＭ）ＩＣ成分 はクラスＩ又はクラス■分子のいづれでもよい。ペプチド抗原とＭＨＣタンパク 質の抗原結合部位との連結は共有又は非共有結合でよい。

他の態様において、該複合体は一般に毒素又はラベルであるエフェクター成分を 含んでよい。このエフェクター頭域はＭＨＣコード化糖タンパク質又は自己抗原 性ペプチドのいづれかにコンジュゲートされていてよい。エフエフクー成分を含 む複合体は同時係属出願１１、ｓ、ｓ、Ｎ、０７／３６７．７５１号（１９８９ 年７月２１日出願、前掲）に開示され、請求の範囲となっている。

この系の成分それぞれは下記にそれぞれ説明する；それに、これらの後金を製造 する、評価する及び利用する方法の説明が続く。

ＭＨＣ誘導化成分 ＭＨＣによりコードされる塘タンパク質はヒト及びネズミの系の両方でかなり研 究されている。一般にそれらは、全ての細胞の表層上で見い出され、且つ、主と して細胞毒性Ｔ細胞により認識されるクラスＩＩ！タンパク質；及びマクロファ ージのようなアクセサリ−細胞を含むいくつかの細胞の表層上に見い出され、且 つ、ヘルパーＴ細胞への抗原の表示に関与するクラス■として分類されている０ 組織適合性クンバク質のうちのいくつかは単離、且つ、特性化されている。ＭＨ ＣＷＶタンパク質の構造及び機能の一般的な報告については、Ｆｕｎｄａｍｅｎ 田１１ｍｍｕｎｏｌｏ　、第２版、　Ｗ、Ｅ、Ｐａｕ１編＋　Ｒａｖｅｎｓ　Ｐ ｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ。

１９８９を参照のこと（これは引用して本明細書に組入れる）。本明細書で用い る「単離ＭＨＣ成分」とは、ＭＨＣｔ４！タンパク質、又はＭｌ（Ｃ糖タンパク 質の有効領域（即ち、抗原結合性部位、又は適当なＴ細胞レセプターにより認識 されるために必要な部位及び配列を含んで成るもの）を意味し、これはその天然 状態以外の状態、例えばＭＨＣを通常発現する細胞の細胞膜と結合していない状 態にある。下記に詳細する通り、該Ｍ）ＩＣ成分は組換的に生産でき、適当な細 胞起源から可溶化されるか、又はリポソームと結合していてよい。ヒ）　ＭＨＣ 分子のためには、ヒトリンパ芽球症細胞が特に好ましい。

ぶズミ［−Ａ（クラス■）！ｌｌ織適合性タンパク質を精製するための方法はＴ ｕｒｋｅｗｉＬｚ　Ａ、Ｐ、らＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｎｕｎｕｎｏｌｏ　（１ ９８３）　２０　：　１１３９−１１４７（引用することで本明細書に組入れる ）に開示されている。

クラス１分子にとっても適切であるこれらの方法は、非イオン性清浄剤、例えば ＮＰ　−４０、ツイーン８０等を用いての、所望のＭＨＣ分子を含む細胞からの 可溶性膜抽出物の調製を包含する。次にＭｌ（Ｃ分子を、所望のＭ）ＩＣ分子に 対して発生せしめた抗体を含むカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィ ーにより精製する。溶離バンファーの中に０．０２％のツイーン８０を利用する ことは精製分子の凝集を排除するのに役立つ。

１−Ａ及びＩ−Ｅサブ領域によりコードされる単離抗原は２つの非共有結合ペプ チド鎖、即ち、３２〜３８ｋｄのアルファー鎖と２６〜２９ｋＤのベーター鎖よ り成ることが示されている。第３の不変の３１ｋｄのペプチドがこの２つのペプ チドに非共有的に結合しているが、しかしそれは多形態ではなく、そして細胞表 層上の抗原の成分であることが認められていない（Ｓｅｋａｌｙ、　Ｒ，Ｐ、の ムｈＬ厘ム（１９８６）　１６４　：１４９０〜１５０４　（引用することで本 明細書に組入れる））、１−Ａｉｉｌ域の７つの対立遺伝子変種のアルファー及 びベーター鎖がクローンされ、且つ、配列化されている（Ｅｓｔｅｅｎ、’Ｔ　 ｃｅｌｌ　Ｃ１ｏｎｅｓ　Ｊ　３−１９）。

ヒトクラス１タンパク質も研究されている。染色体６上のヒトのＭ）ＩＣ（）Ｉ ＬＡ）は３つの遺伝子座、）ＩＬ＾−、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃを有し、その 最初の２つは同種異系抗原をコードする大量の対立遺伝子を有する。これらは４ ４ｋｄのサブユニット及び１２ｋｄのヘーター２−マイクログロブリンサブユニ ットより成ることが見い出され、これは全ての抗原特異性に共通している。これ らの清浄剤可溶性ＨＬ＾抗原の単離は、全て引用することで本明細書に組入れる 、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ。

Ａ、らＰｒｏｃ、　Ｎａｃｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７６） 　７３　：　２４８１−２４８５　；ＣＩｅｍｅｎｔｓｏｎ＋　Ｋ、Ｊ、ら’Ｍ ｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＪＡｚｚｉ、　Ａ、＆ｉ　；　Ｂｊｏｒｋ Ｉｌｌａｎ。

Ｐ、、　Ｐｈ、Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ　ｔｌａｒｖａｒｄ　（１９８４）に記載さ れている。

更なる研究が、クラスＩヒト抗原である）ＩＬＡ　−Ａ２の３次元構造の詳細絵 図によりもたらされている（Ｂｊｏｒｋｍａｎ、　Ｐ、Ｊ　ら、Ｎａ　Ｌｕｒｅ （１９８７）努コニ　５０６−５１２．５１２−５１８　；これは引用すること で本明細書に組入れる）。この絵図において、β２−マイクログロブリンと重鎮 のアルファー３セグメントが結合している；重鎖のアルファー１及びアルファー ２領域はペプチドが結合する抗原結合性部位を形成しているものと認められる（ Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９Ｂ？）　２３８　：　６１３−６１４　；引用すること で本明細書に組入れる；　Ｂｊｏｒｋｍａｎ、　Ｐ、ＪらＮａｔｕｒｅ　（前掲 ））、可溶性１（ＬＡ　−Ａ２は、引用することで全てを本明細書に組入れるＴ ｕｒｎｅｒ＋　Ｍ、Ｊ、らＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、（１９７７）　２５２　： 　７５５５　７５６７に記載の通り、ホモ接合ヒトリンパ芽球症細胞系Ｊ−Ｙか らの原形質膜のパパイン消化の後に精製できる。パパインはトランスメンプラン 領域付近の４４ｋｄの鎖を切断して、アルファー１、アルファー２、アルファー ３及びβ２マイクログロブリンを含んで成る分子をもたらす。

クラスＩ　ＨＬＡ−Ａ２抗原の推定三次元構造の代表を図２に示す。

クラスｎ　ＭＨＣ抗原の三次元構造は詳しく知られていないが、クラス■糖タン パク質はクラス■と似たように、抗原結合性部位を含むドメイン構造を有すると 考えられている。これは膜二重層から伸びた、２本のクラス重鎖のＮ−末端ドメ イン領域より成る。一方の鎖のＮ−末端領域は、ＭｌｌＣクラス■抗原のアルフ ァー１及びアルファー２の領域と相同性の２つのドメインを有する。クラス■遺 伝子のクローニング（Ｅｓｔｅｅｓ前掲に記載）は、下記に記載のようなりラス ｎ　ＭＨＣ結合性ドメインの取扱いを可能とする。

本発明の複合体のＭＨＣＷタンパク質領域は、リンパ球からの単離により獲得で き、そして所望のペプチド抗原に結合する能力についてスクリーンされうる。こ れらのリンパ球は該複合体で処置すべき個体の種に由来する。例えば、それらは 標的自己免疫障害に苦しむ個体に由来するヒ）Ｂ細胞から単離でき、当業界に知 られる技法を利用して、複製欠陥ニブスティン−バーウィルスによる形質転換に よって不死化せしめる。

Ｍ）ＩＣ＄１！タンパク質は、パパインによる処理、３ＭのＭＣＩによる処理及 び清浄剤による処理での可溶化を含む様々な技法を用いて多数の細胞から単離さ れる。好ましい方法においては、リンパ球からのクラス■タンパク質の清浄剤抽 出、それに続くアフィニティー精製が利用される。次に清浄剤は透析により、又 は選択結合性ビーズ、例えばＢｉｏ　Ｂｅａｄｓによって除去できる。

他方、多数のクラス■タンパク質のそれぞれのアミノ酸配列が知られ、そしてそ の遺伝子がクローンされており、従って組換法によってタンパク質を作ることが できる。第１世代合成ＭＨＣタンパク質において、重（アルファー）及び軽（ベ ーター）鎖は、疎水性ドメインの欠落を及ぼすカルボキシ末端切除を利用して合 成され、そしてこのカルボキシ末端は毒素又はラベルのコンジュゲーションを助 長するために任意的に選択できる。例えば、図３に示すＭＨＣタンパク質におい ては、リジン残基が導入されている。更に、この鎖のジスルフィド結合を形成せ しめる手段を担うためにカルボキシ末端付近にシスティン残基が含まされている 。この合成遺伝子は発現ベクターの中への挿入及び８領体をコードするための遺 伝子配列の操作に役立つ制限部位を含ませることもできる９次にこのアルファー 及びベーター鎖を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主例えばＥ、１’）　（ Ｅ、ｃｏｌｉ）又はその他の適切な細胞の中で個別に発現させ、次いで獲得でき た組換タンパク質をペプチド抗原の存在下で組換える。

遺伝子の多様性は配列の容易な操作を可能とするため、好ましい構築体の第２世 代は図４に示すようにバイブリドなりラスＩとクラス■の特徴を含み、ここでク ラスｎ　ＭＨＣのアルファー■とベーター１のドメインは柔軟性領域を通じて連 結され、これはこれらのドメイン間での分子内皿量化を可能とし、端から端にわ たるヘーターシート接触をもたらしめる。次に二のベーク−１セグメントをクラ スＩのアルファー２ドメインと融合させ、ここでこの複合体を安定化せしめるた めにヘーター２マイクログロブリンは共発現される。クラスＩ遺伝子のトランス メンプラン及び細胞内ドメインも誘発させることができるが、しかしながら該複 合体を輸送するためにリポソームを利用しない限り、それを行う意味はないであ ろう、より簡単なバージョンはアルファー１及びベーターｌドメインと、毒素コ ンジュゲーションのためのＣ末端リシンとを有する（図４）。

適当なりＮＡ配列からの発現ベクターの構築及び組換体の製造は本質的に当業界 に知られる方法によって実施される０発現は原核系又は真核系の中で行うことが できる。原核系はたいていＬユ■の様々な株で代表される。しかしながら、その 他の微生物株、例えばバチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）、例えばバチルス　７　（ Ｂ　ａ　ｃ　ｉ　ｌ　１　ｕ　５ｓｕｂｉｔｉｌｓ）　、シュードモナス（Ｐｓ ｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ）の様々な種、又はその他の細菌株を利用することもでき る。ががる原核系において、宿主と適合する種に由来する複製起点及びコントロ ール配列を含むプラスミドが利用される。例えば、Ｅ、コリは一般に、Ｅ、コリ の種に由来するプラスミドであるρＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される （Ｂｏｌｉｖａｒ　ら、Ｇｅｎｅ　（１９７７）　２　：　９５）　、一般に利 用され、本明細書で規定する原核コントロール配列には、転写開始のためのプロ モーター、任意的にオペレーターを、リポソーム結合部位配列と一緒に含み、そ れには、一般に用いられているプロモーター、例えばベーターラククマーゼ（ペ ニシリナーゼ）及びラクトース（Ｉａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら、Ｎ ａｔｕｔｅ　（１９７７）　１９Ｂ　：　１０５６）及びトリプトファン（ｔｒ ｐ　）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら、Ｎａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ。

（１９８０）　８　：　４０５７）　、並びにラムグー誘導Ｐｒプロモーター及 びＮ−遺伝子リポソーム結合部位（ＳｈｉｍａＬａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ　（１ ９８１）　２９２　：１２８）が含まれる。上記又は下記の全ての文献は引用す ることで本明細書に組入れる。

真核系宿主において有用な発現系は適当な原核系遺伝子に由来するプロモーター を含んで成る。例えば酵母において有用なプロモーターのクラスには、３−ホス ホグリセラードキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、 　（１９８０）　２５５　：　２０７３）についてのプロモーターを含む、解糖 酵素の合成のだめのプロモーターが含まれる。その他のプロモーターには、エノ ラーゼ遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ＋　Ｍ、Ｊ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋＋＋、　（１９８１）　２５６　：　１３８５）又はＹＥｐ１３から獲 得したＬｅｕ　２遺伝子（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、らＧｅｎｅ　（１９７８）　８ 　：　１２１　）に由来するものが挙げられる。

適切な哺乳類系プロモーターにはＳＶ４０由来の初期及び後期プロモーター（Ｅ ｉｅｒｓ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７３　：　１１３　）　、又は ポリオーマ、アデノウィルス■、ウシパピロマウィルスもしくは鳥類サルコマウ ィルスに由来するようなその他のウィルス性プロモーターが含まれる。適当なウ ィルス及び哺乳類系エンハンサ−は上記に記載されている。

発現系は、当業界によく知られている標準のリゲーション及び制限技法を採用す る標準方法により、ＭＨＣ配列に作動連結すべき上記のコントロール因子から構 築される。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成オリゴヌクレオチドを切断 し、仕立て、そして所望の形態に再すゲートさせる。

部位特異的ＤＮＡ切断は、適当な制限酵素で、当業界によく知られ、且つ、これ らの市販の制限酵素の製造業者により特定された条件のもとで処理することによ り実施される。例えばＮｅＩＩＥｎｇＩａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの製品カタログ を参照のこと。一般には、約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列を約２０μｌの バッファー溶液の中で一単位の酵素で切断せしめる；木明細書の実施例において は、典型的には、ＤＮＡ基質の完全な消化を確実とするために過剰の制限酵素を 用いている。約３７°Ｃで杓１ｈｒ〜２ｈｒのインキュヘーション時間が有用で あるが、その変更は寛容される。各インキュベーションの後、クンバク質をフェ ノール／クロロホルム抽出によって除去し、次いでエーテル抽出を続けてよく、 そして核酸は水性画分から、エタノールによる沈殿、それに続し）てセファデン クスＧ−５０スピンカラムに付することによって回収できる。所望するならば、 切断フラグメントのサイズ分離を標準の技術を用いてポリアクリルアミドゲル又 はアガロースゲル電気泳動により実施してよい、サイズ分離の一般的な詳細はＭ ｅｔｈｏｄｓ亘」旦バ鎖■（１９８０）　６５：　４９９−５６０に見い出せる 。

制限切断フラグメントは、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ■の大きなフラグメント （フレノウ）により、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在 下において、約１５〜２５分のインキュヘーション時間を利用し、２０〜２５° Ｃで、５０ｍＭのトリスｐＨ１，６，５０ｍＭのＮａＣ１，６１のＭｇＣ１ｚ　 、６ｍＭのＤＴＴ及び５〜１０μＭのｄＮＴＰの中で処理することによってプラ ント末端化してよい。このフレノウフラグメントは５′接着末端を補完するが、 しかしながら突出し３′−末鎖を、たとえ４種のｄＮＴＰが存在していたとして も傷つけてしまう。所望するなら、接着末端の性質により示される制限内で、１ 種のみの、又は特定のｄＮＴＰを供給することによって選択修復を行ってよい。

フレノウによる処理の後、その混合物をフェノール／クロロホルム及びエタノー ルで抽出し、続いてセファデックスＧ−５０スピンカラムに付する。

合成オリゴヌクレオチドは市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製 される。アニーリング前又はラベリングのための一本鎖のリン酸化は、過剰の、 例えば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼをＯ，ｌｎｍｄｅの基質に対して 、５０＋ＩＩＭのトリス、ｐ）１７．６．１０＋ａＭのＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭの ジチオスレイトール、１〜２ｍＭのＡＴＰ、　１．７ｐｍｏｌｅの３２Ｐ−へＴ Ｐ　（２，９＋ａＣｉ　／ｍｍｏｌｅ）、　０．１ｍＭのスペルジミン、０．１ ｄのＥ［ｌＴＡの存在下で用いることによって達せられる。

リゲーションは１５〜３０μｌの容量の中で、下記の標準条件及び温度のもとで 行った：　２０ｍＭのトリス−）ｔＣｌ、ρ）１７．５．１０ｍＭのＭｇＣｌ　 Ｋ、１ｈＭのＤＴＴ、３３　μｇ　／ｍｌのＢＳ＾、　１０ｍＭ〜５０ｍＭのＮ ａＣ１、及びｏ　”ｃで４０μＭの＾ＴＰ、０．０１〜０．０２　（Ｗｅｉｓｓ ）単位のＴ４ＤＮＡ　リガーゼ（「接着末端」リゲーションのため）又は１４° Ｃで１ｍＭのＡＴＰ、　０．３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ　）単位のＴ４ＤＮＡ　 リガーゼ（「プラント末端」リゲーションのため）。分子内「接着末端」ゾゲー ションは通常３３〜１００　ｕ　ｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５〜１００μＭの最 終濃度）で行った０分子内「プラント末端」リゲーション（通常、１０〜３０倍 の過剰量のリンカ−を利用する）は１１ＩＭの総量終濃度で行う。

「ベクターフラグメント」を利用するベクターの構築において、ベクターフラグ メントは通常５′リン酸を除くため及びベクターの再すゲーンヨンを防ぐために 細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理する。ＢＡＰ消化はｐＨ８にて 約１５０ｍＭのトリスの中で、Ｎａ’及びＭｇ”の存在下において、ベクターの μｇ当り約１単位のＢＡＰを用いて、６０°Ｃで約１ｈｒ行う。核酸フラグメン トを回収するため、その調製品をフェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿 で抽出し、そしてセファデックＧ−５０スピンカラムへの適用によって脱塩する 。

他方、再すゲーションは、不要のフラグメントの追加の制限酵素消化により二重 消化せしめたベクターにおいては防がれうる。

配列改質を必要とするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来のベクターの領域に関して 、部位特異的プライマー誘発化突然変異誘発が利用できる。

これは所望の突然変異を提供する、一定の誤対合を除いて突然変異すべき一本鎖 ファージＤＮＡに相補性であるプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いること によって行われる。ば単に述べると、ファージに相補性な鎖の合成を誘導するプ ライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用い、そして得られる二本鎖ＤＮＡを ファージ保持宿主細菌へと形質転換させる。形質転換細菌の培養物をトップアガ ーにおいてプレートして、ファージが抱える単一細胞がらプラークを形成させる 。

理論的には、新しいプラークの５０％が、一本積として突然変異形態を有するフ ァージを含み；５０％はもとの配列を有するであろう。

得られるプラークをリン酸化合成プライマーと、ある温度であって正しい対合を 可能とするが、ただしもとの鎖との誤対合はハイブリダイゼーシヨンを妨げるの に十分であるような温度でハイブリダイズさせる。次にプーブとハイブリダイズ するプラークを拾い、培養し、次いでＤＮＡを回収する。

しかしながら、本発明のクンバク質において、合成遺伝子を好適に利用できる。

遺伝子のデザインは制限部位を含んでよく、これはコート配列領域を、類似体を コードするこれらで置き換える遺伝子の容易な操作を可能とする。

プラスミドの構築のための正しいリゲーションは、Ｅ、コリＧｅｎｅｔｉｃ　。

５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　ＣＧＳＣ＃６１３５より獲得できるＥ、コリ株Ｍ Ｍ２９４又はその他の適当な宿主をこのリゲーション混合物でまず形質転換する ことによって確認できる。有効な形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリ ンもしくはその他の抗生物質耐性により、又は当業界に知られるプラスミド構築 の手法に応じたその他のマーカーを用いて選ばれうる。この形質転換体に由来す るプラスミドを次にＣｌｅｗｅｌｌ＋Ｄ、Ｂ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９６９）　６２　：　１１５９、の方法、任 意的にクロラムフェニコール増幅（Ｃ１ｅｉｖｅ１１．　Ｄ、Ｂ、　Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１１０　：　６６７　）を続けて用意する。この単離 ＤＮＡを制限により分析するか、及び／又はＳａｎｇｅｒ、　Ｆ、らＰｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９７７）　７４　：　５４６ ３、更にはＭｅｓｓｉｎｇ　らＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８ １）　９　：３０９のジデオキシ法、又はＭａｘａｍらＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｄｏｇｙ　（１９８０）６５　：　４９９の方法により配列化する。

構築したベクターを次にタンパク質の製造のために適当な宿主の中に導入する。

用いる宿主細胞に応じて、形質転換はかかる細胞に適する標準技術を用いて行う 。Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

５ｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７２）　６９　：　２１１０に記載の塩化カルシウム を用いるカルシウム処理、又はＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ１ｅｃａｌａｒ　Ｃ１ｏ ｎｉｎ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ　（１９Ｂ２）　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　頁２５４に記載のＲｂＣ１法が、 原核系又は実質的な細胞壁バリヤーを含むその他の細胞にとって利用される。か かる細胞壁を有さない哺乳動物細胞にとっては、Ｇｒａｈａｍとｖａｎ　ｄｅｒ 　Ｅｂ、　の■工１」は（１９７Ｂ）　５２　：　５４６のリン酸カルシウム沈 殿法又はエレクトロポレーションが好ましい、酵母への形質転換はＶａｎ　Ｓｏ ｌｉｎｇｎｅｎ、　Ｐ、らＪ、　Ｂａｃｔｅｒ、　（１９７７）　１３０　：　 ９４６及びＩ（ｓｉａｏ。

Ｃ，Ｌ、らＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７ ９）　７６　：　３８２９の方法に従って実施する。

次にこの形質転換細胞を、ＭＨＣ配列の発現にとって好ましい条件で培養し、次 いで組換生産タンパク質をこの培養物から回収する。

抗原性ペプチド 数多くの自己免疫障害に関する自己抗原性タンパク質又は組織が知られている。

例えば、実験的誘発型自己免疫障害において、病理に関与する抗原が特性化され ている：ラント及びマウスの関節炎において、天然の■型コラーゲンがコラーゲ ン誘発型関節炎において同定され、そしてミコハクテリアーヒートションクタン パク質がアジュバント関節炎において同定されている（Ｓｔｕａｒｔら（１９８ ４）　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２　＋　１９９　２１８　；ｖａｎ　Ｅｄｅｎら（１ ９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３１　：１７１−１７３．）　；チログロブリンが マウスにおける実験的アレルギー性甲状腺炎（ＥＡＴ）において同定されている （Ｍａｒｏｎら（１９８８）、　Ｊ。

Ｉ且−八ｅｄ、　１５２　：　１１１５　１１２０）　；実験的アレルギー性重 症筋無力症（ＥＡ？ＩＧ）においてはアセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）　 （Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）　Ａｄｖ、　Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．４２：　 ２３３　２８４）　；そしてマウス及びラットにおける実験的アレルギー性起脳 炎（ＥＡＥ　）においてはミニリン塩基性タンパク’ｌ　（ＭＢＰ）　（Ａｃｈ ａ　−０ｒｂｅａら、前掲を参照のこと）、更に、例えば標的抗原がヒトにおい て同定されている：ヒトリウマチ型関節炎における■型コラーゲン（Ｈｏｌｏｓ ｈｉｔｚ　ら（１９８６）　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｔ　：３０５−３０９）　；及び 重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプター（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９ ８８）前掲）、上記の全ての文献は引用することで本明細書に組入れる。

抗原表示細胞（ＡＰＣｓ）の表層上のＭＨＣ［タンパク質による抗原の゛表示は 、抗原性タンパク質の小さなペプチド単位への加水分解に続いて起こると信じら れている。抗原性タンパク質におけるこれら小さめのセグメントの位置は実験的 に決定できる。これらのセグメントは長さにおいて１８残基数であり、そしてア グレトープ（ＭＨＣ分子により認識）及びエピトープ（Ｔヘルパー細胞上のＴ細 胞レセプターにより認＃ｈ）の両方を含むと考えられている。このエピトープ自 体は５〜６個のアミノ酸の連続又は非連続配列であり、これはＴヘルパー細胞の 抗原特異的レセプターを認識する。アグレトープは、ペプチドとＭＨＣｌｉタン パク譬との結合にとって重要な連続又は非連続配列である。

関連の８〜１８個のアミノ酸のサブユニットの決定の実験プロセスは、骨格筋の アセチルコリンレセプターのアルファーサブユニットを利用して例示している。

重症筋無力症（ＭＧ）において、自己免疫応答はこのサブユニットの領域に向け られている。神経筋接合部のシナプス後部膜上でのアセチルコリンレセプターの 欠失はＭＧ痛症状原因となる。

ＭＧζこおいて、アセチルコリンレセプター（ＡＣｈｌ？）のアルファーサブユ ニットに対する自己抗体は、＾ＣｈＲに向けられた自己免疫応答に関連する。Ｍ Ｇ患者のうちの８５％がアルファーサブユニットに反応性な自己抗体を有する。

これらのうち、６０％が残基６０及び８０の間に位１している主免疫原領域（Ｍ ＩＲ）と呼ばれるアルファーサブユニットのペプチドセグメントに結合する抗体 を有する（ＴｚａｒｔｏｓとＬｒｎｄｓｔｒｏｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８０）　７７　：　７５５）、自己反応性 ヒトＴ細胞により認識されるペプチドセグメントはアルファーサブユニット上に も位置している（Ｈｏｈｆ　１ｅｌｄらＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８７））。これらのＴ細胞により認識されるエピトープ は残基１−３０．　１２５−１４７．１６９−１８１．２５７−２７１及び３５ １−３６８にある。更に、ヒトにおいてＡＣｈＲペプチド１９５−２１２及び２ ５７−２６９が、ＨＬＡ　−ＯＲ５及び）ＩＬＡ　−ＤＲ３のＤＱｗ２　ＭＨＣ ハブロタイブの重症筋無力症患者のそれぞれにおけるニブトープとして一部特性 化されている（Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ　（１９８９）前掲を参照のこと）。

このレセプターのアルファーサブユニットに関連するエピトープの表示が可能で ある、アレルー性を抱えるペプチドは容易に決定される。例えば、マウスのモデ ルにおける適切なペプチドの決定は以下の通りに実施される。

トルベトカリホルニカス（Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）　ＡＣ ｈＲで免疫したときにヒト重症筋無力症の数多くの特徴を有する障害を発症する マウスの株をモデルとして用いた。ＭＨＣクラスＩｌ［タンパク質をレクチン及 びモノクローナル抗体アフィニティー支持体を用いてこの株のマウスの肺臓細胞 が単離した。この精製Ｍ）ＩＣクラス■タンパク質を清浄剤透析によってリン脂 質小胞の中に含ませた。得られる小胞を次に清浄なガラス力ハースリンプに融合 させて、図５に示すようなそれぞれの上にＭｌ（Ｃ分子を含む平らな脂質二重層 を作った（Ｂｒｉａｎ　ａｎｄ　ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８４）　ＦＪＩ　：６１５９、これは引用する ことで本明細書に組入れる）。

付着平面脂質膜の中に包埋されたＭＨＣクラス■分子を含む一枚のカバースリッ プを数枚の２４穴培養プレートの各ウェルの中に入れた。

アルファーサブユニット配列に相当し、且つ、ｌ又は複数の放射性ラベル化アミ ノ酸残基（下記の通りに調製）を含む約４０種の重複２０残基合成ペプチドのそ れぞれをカバースリップ及びＰＢＳと一緒にウェルの中に入れ、そして数日イン キュベートした０ＭＨＣクラス■糖タンパク質抗原結合部位におけるペプチドの 結合の程度は、カバースリップ上のＦＩＨＣクラス■一平面脂質膜、対、平面脂 質膜のみ、の中に一体化された放射活性の値により決定した。放射活性の特異的 な一体化は、結合ペプチドが、平面脂質膜の中に存在している複数の種のＭＨＣ クラス■分子のうちの一つのアグレトープ（ＭＨＣクラス■ペプチド結合部位） を含むことを示唆する。これにより、ＡＣｈＲのアルファーサブユニットのため の一連のアグレトープを、ＡＣｈＲ又は精製アルファーサブユニットによる免疫 に基づいてＭＧ痛症状示すマウス株について規定する。

次に、アグレトープを含む各アルファーサブユニット合成ペプチドセグメントを 再びカバースリップ上の平面脂質膜に包埋されている単離ＭＨＣクラス■タンパ ク質の抗原結合部位の中に含ませる。一枚のカバースリップを２４穴培養プレー トの各ウェルに加え、次いでこの各ウェルにＡＣｈＲに対して免疫されたマウス （及び付着性ＭＨＣクラス■タンパク質が単離された株）に由来する肺臓細胞を 加えた。

ＤＮＡへのトリチウム化チミジンの取込みにより決定されるＴ細胞ハイブリドー マ増殖は、Ｔ細胞への結合のためのアグレトープ及びエピトープの両者をＭ）Ｉ Ｃクラス■タンパク質結合ペプチドが含むことを示唆する。Ｔ細胞クローンの活 性化はＩＬ〜３生産を測定することによって決定される（Ｑｕｉｌｌ　ら、前掲 を参照のこと）。

ベドカリホルニカスＡＣｈｌ？のアルファーサブユニット由来の重複（１０残基 が重複）２０残基ペプチドのセットの構成員を合成するよう、迅速多重ペプチド 合成（ＲＡＭＰＳ）のためのＤｕｐｏｎの装置及び技術を利用した。このペプチ ドの配列は知られ、そして図６に示す、ｌ又は複数の放射活性アミノ酸が各合成 ペプチドの中に一体化されている。

ペプチドを合成するために側鎖保護型ＦＭＯＣアミノ酸のペンタフルオロフェニ ル活性エステルを利用し、標準の逐次固相ペプチド合成法、それに続（標準の側 鎖脱保護及び固相支持体からのペプチドの同時遊離を利用した。

他方、抗原性タンパク質、例えばアセチルコリンレセプタータンパク質の８〜１ ８個のアミノ酸の推定セグメントを含む重複配列が、Ｇｅｙｓｅｎ　）１．Ｍ、 らＪ、　Ｉｍ＋ｗｕｎ、　Ｍｅｔｈ、　（１９８７）　１０２：２７４　（引用 することで本明細書に組入れる）の方法で合成できる。合成した放射性ラベル化 ペプチドを、それぞれ（プレート上で）、前記の通り脂質膜の中へと配合せしめ た精製Ｍ）ＩＣタンパク質とインキュベートすることにより試験した。

中枢神経系におけるミニリン鞘の破壊をもたらす多発性硬化症（ＭＳ）　！こお いては、ミニリンの主要タンパク質成分が主な自己抗原である。ＭＢＰタンパク 質の適切なセグメントは、ウシミニリン塩基性クンバク質で免疫したときに実験 的アレルギー性起脳炎（ＥＡＧ　）を発症するマウスの株を用いて実験的に決定 することもでき、ＭＢＰの配列は図７に示す。

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は複雑な症候であるが、しかしこれは赤血球 に対する自己免疫応答に由来する。この障害の抗原性エフェクターであるペプチ ドは赤血球の表層上のタンパク質の中に認められる。

りうマチ型関節炎（ＲＡ）は、滑液の中で見い出せるタンパク質に対する免疫応 答に由来する慢性炎症障害である。

インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インスリンの分泌にとって重要な ランゲルハンス島内のベーター細胞の自己免疫攻撃に由来する。島細胞表層抗原 及びインスリンに対する循環抗体はＩＤＤＭに先行することが知られている。Ｉ ＤＤＭにおける免疫応答を排除するうえで重要なペプチドはインスリン配列及び ベーター細胞膜表層タンパク質の一部であると信じられている。

関連の抗原性ペプチドサブユニットはそれらが比較的短いため、ペプチド合成に とっての標準の自動化方法を用いて容易に合成できる。他方、それらは単離又は 合成りＮＡを用いて組換的に作製されうるが、これはこの長さのペプチドにとっ ての最も効率的な手法ではない。

従って、まとめると、一連のラベル化試験ペプチドを用意し、そしてＭＨＣタン パク質を含む平面脂質膜の中のＭＨＣと結合するものがアグレトープを含んでい ることが示される。

同定したペプチドを次に常用の固相合成で調製し、そして障害誘発性ヘルパーＴ 細胞クローンについてのエピトープを含むサブセットを、ネズミ抗原表示細胞（ ＡＰＣ）を有する（又は単離ＭＨＣ複合体を有する）候補のペプチドと、全長タ ンパク質で免疫したマウスに由来する肺臓又はリンパ腺のＴ細胞とのインキュベ ーションによって決定した。有用な候補はこの系においてＴ細胞の増殖を刺激す るであろう。この第２の小さなサブセットは適当なペプチド成分を代表する。

複合体の形成 該複合体の因子は当業界に知られる標準の手段により連結させることができる。

この抗原性ペプチドは、ＭＩＩＣＩＣタンパク質ット領域に、例えば二〇二成分 を混合することによって非共有的に連結させることができる。過剰のペプチドは 数多くの標準的な手順のいづれか、例えば限外濾過又は透析によって除去できる 。このペプチドは標準の手順を用いて、例えば光アフィニティーラベル化によっ て共有結合させることができる（例えばＨａｌｌら、旦匹抑廚王匡Ｌ２４　：ｓ ７ｏ２−ｓ７ｍ　（１９８５）を参照のこと、これは引用することで本明細書に 組入れる）。

例えば、ＡＣｈＲペプチド１９５−２１５（これはヒト及びマウスにおけるＭＧ のエピトープとして特性化されている）は、ＭＧに関連するＭＨＣ抗原に由来の ポリペプチドのＮ末端抗原結合部位に連結させることができる。−文字アミノ酸 コードにおけるＡＣｈｒペプチドのアミノ酸配列は ［ＩＴＰＹＬＤＪＴＹｌｌＦＩＭＱＲＩＰＬＹＦＶである。咳ペプチドをコード するオリゴヌクレオチドはアミノ酸にとっての既知のコドンを利用して合成され 、好ましくは発現のために利用する生物において好ましく利用されるコドンをオ リゴヌクレオチドのデザインにおいて利用する。例えばもしＥ、コリで発現させ るなら、ＡＣｈＲ１９５−２１５をコードする適切なオリゴヌクレオチドは５′ ＧＡＣＡＣＣＣＣＧ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＴＴＣＡ ＴＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＡＴＣＣＣＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＴＴＣＣＴＧ　３ 　’でありうる。

次にこの配列を当業界に知られる技法を利用してＭＨＣ抗原に由来するペプチド をコードする配列に一体化せしめる。この一体化部位は、この分子が発現されて 折りたたまれたとき、このＡＣｈＲペプチド抗原が標的Ｔ細胞にとってのエピト ープとして有用となるであろうようになる。

あるプロトコールにおいて、ＡＣｈＲ１９５−２１５ペプチドを適当なＭＨＣ分 子のＮ−末端に連結させる。もしＭｉ換換金合体マウスにおいて用いるなら、例 えば、このＡＣｈＲペプチドをＩ−Ａゝ−アルファー又は１−Ａｈ−ベーター鎖 のいづれかをコードする配列の中に一体化せしめてよい。これらの鎖をコードす る配列は知られており、そして図８（アルファー鎖）及び図９（ベーター鎖）に 示し；更に、この鎖の制限酵素部位及び有意義なドメインをこの図に示す。もし ＡＣｈＲペプチド′をベーター鎖の中に一体化させるなら、例えばオリゴヌクレ オチドをリーダーペプチドの代替物として挿入してよい。ポリオリゴヌクレオチ ド内で配列を置き換える方法は当業界に知られ、その例はプラスミドの構築の章 に説明しである。

ＡＣｈＲペプチドの、適当なヒトＨＬＡ抗原に由来するペプチドをコートする配 列への一体化のために類似のプロトコールが利用できる。

例えば、ヒトにおいて、ハブロタイブＤＲ，Ｉｄ２がＭＧに関与する。それ故、 ＡＣｈＲペプチドを例えばＤＲ，対立遺伝子のベーター鎖をコードする配列の中 に一体化させることができる。数多くのＤＲハブロタイブに由来する）ＩＬＡ　 −ＤＲ−ベーク−鎖をコードする配列と同様に、主要血清学特異性ＤＰＩ−９に とってのＯＲサブ領域における構造ベースが知られている。例えばＢｅ１ｌら（ １９Ｂ？）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ前述した 通り、自己免疫抗原ペプチドとＭ）ＩＣ成分とはペプチド結合を介して連結させ てよい。しかしながら、連結のその他の態様が当業者に自明であり、そして例え ばアルファー及び／又はベーター鎖の炭水化物成分等を含む糖タンパク質上の炭 水化物基を介する連結が含まれうる。

複合体の評価 本発明の複合体はインビトロ系を用いて、又はインビボモデルを用いてアッセイ できる。インビトロ系においては、該複合体を、該複合体のペプチドに関与する 症状の原因であるタンパク質又は抗原によって免疫された、又はそれらに対する 免疫性を示す対象体由来の末梢血液Ｔ細胞とインキュベートする。この有用な複 合体は同系Ｔ細胞においてアネルギーを誘発し、そして追加の抗原による刺激に よってさえもＴ細胞の増殖を防ぐ。

インビボ系においては、ＡＰＣの存在下において、単離エピトープ又は全長抗原 に対する応答で増殖するＴ細胞をクローンする。これらのクローンは、自己免疫 障害を誘発させるために免疫化していない＆ｌ１ｗ１適合性動物に注射した。関 連の複合体に関連する症状は軽減されるか、又はこの障害の症状は消えるであろ う。

いづれかのタイプの複合体、即ち、エフェクター成分を有するもの又は存さない ものが利用できる。ある態様において、その処置は２重である。個体を、抗原の 有効領域を含む？ＩＨＣ−コード化抗原表示糖タンパク質の複合体で処理して免 疫系を下降制御する。更なる下降制御は、Ｍ）ＩＣコード化抗原表示糖タンパク 質、処置すべき自己免疫障害に特異的な抗原の有効領域及びエフェクター成分を 含む三成分複合体による処理によって達せられる。更に、複合体のパネルを処置 のために利用できうる。例えば、複数の抗原のペプチドが自己免疫応答に関与す ることが予測されるとき、及び／又は複数の抗原が関与することが予測されると き、個体を、適当なＭＩＩＣコード化抗原表示ポリペプチド及び抗原の有効領域 を含むパネルから選ばれた複数の複合体で処置してよい；これらはエフェクター 成分を有しても有していなくてもよい。

ラベル化複合体の投与は診断用途において、障害に関与する免疫系のかかる領域 の同定を可能にする。

治療及び／又は診断のためのＭＭＣ複合体の選択自己免疫障についての個体の診 断又は処置において用いるべき本発明のｈ＋＋ｃ　ＩＭ合体を選ぶため、自己抗 原の表示に関与するタイプのＭＨＣ抗原を同定する。

特異的な自己免疫機能不全は特定のＭＨＣのタイプに関連する。ヒトにおけるＤ ｌｌｌ／ＤＲハブロタイブ及び関連の自己免疫障害のリストを図１Ｏに示す。ど の対立遺伝子、従ってどのＭＨＣコード化ポリペプチドが自己免疫障害に結びつ いているかを同定する方法は当業界に知られている。ＥＰ２８６４４７に記載の 方法が適切である。本性において、いくつかの工程を行った。まず、ＭＨＣ抗原 と自己免疫障害との関連を遺伝的研究を基礎として決定する。この研究を実施す るための方法は当業者に周知であり、そしてヒトに関連する全ての既知のＨＬ＾ 障害についての情報はコペンハーゲンのＨＬＡ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅ ｇｉｓｔｒｙに保存されている。この障害に関連するポリペプチドをコードする 遺伝子座がこの障害との最大の関連性を有するものである（図１０参暉）。

第二に、障害関連ＭＢＣ抗原／ポリペプチドをコードする特定の対立遺伝子を同 定する。この対立遺伝子の同定において、影響を受け易い対立遺伝子が有力であ ると仮定される。対立遺伝子の同定は特定のサブタイプと障害との強力な陽性関 係を決定することによって達成される。これは数多くの方法で達成されることが でき、全て当業者に知られている。例えば、サブタイピングは複合型リンパ球応 答（！ＩＬＲ）タイピング及びプライム化リンパ球試験（ＰＬ７）によって達成 されうる。両方の方法はＷｅｉｒとＢｌａｃｋｗｅｌｌ　ｋｌ＋、Ｈａｎｄｂｏ ｏｋ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（引用して本明細 書に組入れる）に記載されている。これは、検査すべきＭＨＣ遺伝子座に特異的 なプローブを用いてＤＮＡ制限制限フラグメン条長多形態ＦＬＰ）を分析するこ とによって達成されうる。例えば、Ｎｅｐｏｍ（１９８６）　Ａｎｎａｌｓ　Ｎ 、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

４７５、　１．ＭＨＣ遺伝子座についてのプローブを用意する方法は当業Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　５９６６　；　Ｗｅｉｓｓｗａｎら、Ｍｅ ｄｉｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　：ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ 　ｏｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏ ｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅ、Ｐ、　ＣｏｈｅｎＷ　１９８１）を参照のこと（こ れらは引用して本明細書に組入れる）。

障害感受性を授けるサブタイプの最も完璧な同定は、遺伝子座のゲノムＤＮ＾又 はこの遺伝子座内でコードされる＋ａＲＮＡに至るｃＤＮＡのシーケンシングに よって達せられる。所望の領域を増幅するための、プローブによる特に所望され るＤＮＡを同定するため技術は当業界に知られ、そして例えばポリメラーゼ連鎖 反応（ＰＣＲ）技術が含まれる。

特定の自己免疫障害に対する感受性を授ける対立遺伝子が同定されたら、この対 立遺伝子内でコードされるポリペプチドも同定できる。即ち、ポリペプチド配列 はそれをコードする対立遺伝子内のＤＮＡの配列より推定できる。診断及び／又 は治療のために用いる本発明のＭＩＩＣ抗原複合体は自己免疫障害症状に関連す るＭ）Ｉｃ抗原の有効領域及び同し障害症状に関連する自己免疫抗原に由来する 。

例えば、リウマチ型関節炎患者のうちの９０％以上がＤＲ４（０ｗ４）。

ＤＲ４（Ｄｉｙ１４）又は［１Ｒ１のハブロタイブを存する（図１０参照）、ヒ トリウマチ型関節炎における標的抗原は■型コラーゲンであることも知られてい る。それ故、リウマチ型関節炎を有する個体の処置又は診断のために用いる本発 明の複合体には、■型コラーゲンの有効領域と複合した、障害誘発に関する抗原 表示の可能な、又は障害抑制に関する抗原表示の可能でないＤＲ４（０ｗ４　） 　、　ＤＲＩ及び／又はＤＲ４（Ｄｗ１４）に由来のポリペプチドを含むものが 挙げられる。

自己免疫障害の診断及び／又は処置のための本発明の複合体の利用に適しうるプ ロトコールを図１１に示す。箇潔すると、自己免疫障害を有する（又はそれに感 受性である）個体を同定し、そして自己免疫機能不全を同定する。同定は症候学 的に、及び／又は家族履歴の調査によることができる。個体のＭ）ＩＣタイプは 当業界に知られる１又は複数の方法、例えばＭＬＲ、血清学アンセイ及びＤＮＡ 分析（ＲＦＬＰ及びＰＣＲ技法を含む）による細胞タイピングを含む方法により 決定される。個体のＴ細胞はインビトロで、自己反応性Ｔ細胞により認識される 自己ペプチドを決定するために検査される；これは先に説明した本発明のラベル 化複合体を利用することで達せられ、これは弐Ｘ’−ＭＨＣ”−ペプチド（ここ でＸはラベル成分である）で表わされる。どの複合体がＴ細胞を標的とするかを 決定した後、個体を、特異的な自己反応性Ｔ細胞複製を抑制することのできる本 発明の複合体、及び／又は自己反応性Ｔ細胞を殺すことのできるもので処置する 。これらはそれぞれ、タイプＭＨＣ”−ペプチド、及びＸ′−ＭＨＣ”−ペプチ ド（ここでＸはＴ細胞を殺すことのできる成分である）の複合体である。治療（ 残留自己反応性Ｔ細胞により決定）は、前述した本発明のラベル化複合体を用い るＴ細胞結合研究によりモニターされる。

本明細書で用いている語「個体」は、基本的に同等なＭｔＩｃ系を保有する全て の哺乳類及び全てのを椎動物を包括する。

インヒポ試験のためのモデル系 下記は自己免疫障害に関するモデル系であり、これらはかかる症状に対する本発 明の効果を評価するために利用できる。

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ） 自己免疫ニューシーラントブラック（ＮＺＢ　）マウス及び表現型が正常なニュ ーシーラントホワイト（ＮＺＷ）マウス株のＦ、バイブリドは、親のＮ２８株よ りもより急性に重症な全身性自己免疫障害を発症した。

これらのマウスは、ヒトにおけるＳＬＥとめざましく類似な核抗原に対する抗体 及びそれに続く雌に優性な致死的免疫複合仲介型糸球体腎炎の発症を含むいくつ かの異常を示した。引用することで本明細書に組入れるＫｎｉｇｈｔら１．Ｌニ レ１２工０よ（１９７８）　１４７　：　１６５３゜ヒト及びネズミの障害の形 態の両方において、ＭＨＣ遺伝子生産物との強い関連性が報告されている。　Ｈ ＬＡ−ＯＲ２とＨＬＡ−ＯＲ３の個体はＳＬＥを発症する一般の集団よりも高い 危険性にあり（Ｒｅｉｎｅｒｔｓｅｎら、し」」１ユＬ」閃（１９７０）医用： 　５１５）、他方、ＮＺＢ／Ｗ　Ｆ＋マウス（Ｈ−２””）においては、ＮＺ− の親に由来するｈ−２”　／＼プロタイプに連結した遺伝子が狼癒様腎炎の発症 に寄与する。

本発明の効果は生存率、並びに尿タンパク質及び抗ＤＮＡ抗体の出現のような徴 候の発症の進行により決定できる。

尿タンパク質はＵｒｉｓＬｉｘ　（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　 Ｉｎｃ、、　Ｅｌｋｈａｒｔ。

ＩＮ）の利用によりカロリー計算的に決定でき、下記のおよその尿タンパク質が 表示される：微量、Ｌｏｎｇ／ｄｉ　；　１　＋、　３０ｏ＋ｇ／ｄｌ　；　３ 　＋。

３００ｍｇ／ｄｌ　；そして４　＋、　１０００ｍｇ／ｄ１．高い度合いの尿タ フ）＜り質は複合体によるマウスの処置によって顕著に遅延する。

ＮＺＢ／Ｗ　Ｆ、マウスにおける抗−ＤＮＡ特異的抗体の存在は、Ｚｏｕａ　ｌ 　ｉと５ｔｏｌｌｅｒのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８６） 　９０　：　１０５（引用することで本明細書に組入れる）に記載の結合化免疫 収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の改良型を利用して決定される。

重症筋無力症（ＭＧ） 重症筋無力症はＩＩＬＡ−Ｄに結びついているいくつかのヒト自己免疫障害の一 つである。　Ｓａｆｅｎｂｅｒｇ　ら、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉ　ｅｎｓ（１９ ７８）１２　：１３６　；　ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ａｒｔｈ、　Ｒｈｅｕｍ、　 （１９７７）　２０　：　５９　（これらは引用することで本明細書に組入れる ）。ＭＧにおいて、アセチルコリンレセプター（＾ｃＣｈｏＲ）に対する抗体が 、シナプス後方膜におけるＡｃＣｈｏＲの仲介損失によって筋神経伝達を損傷せ しめる。

Ｓ几／　Ｊ　哩マウスはヒトＭＧにとってのモデル系である。これらの動物にお いて、実験的自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）は、マウスを他の種に由来する 可溶性ＡｃＣｈｏＲタンパク質で免疫することによって誘発される。ＥＡＭＧに 対する感受性はＭＨＣにある程度結びついており、そしてＨ−２内の領域まで地 図化されている。Ｃｈｒｉｓｔａｄｏｓｓ　ら、ムＩｍｍｕｎｏ１．　（１９７ ９）　１２３　：　２５４０゜ＡｃＣｈｏＲタンパク質を、引用する一ａｌｄｏ ｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　（１９８３）　８０　：　２７１３の方法に従ってトルベト　力リ ホルニカより精製し、そしてアッセイした。完全フロインドアジュバント中の乳 濁ＡｃＣｈｏＲ１５μｇを背中、後足及び尾の根もとの６箇所にわたって皮肉注 射した。動物を同じ方法で４週間後に再び免疫した。

評価は抗ＡｃＣｈｏＲ抗体の測定によってなされることができ、抗ＡｃＣｈｏＲ 抗体のレヘルはＷａ　Ｉｄｏｒら、前掲に記載のマイクロリッターＥＬＩＳＡに よって測定される。この標準の試薬容量はウェル当り５０μｌである。

試薬は通常ウェルの中でＲＴで２ｈｒインキユベートする。炭酸水素バフファー ｐＨ９，６で希釈した５μｇのＡｃＣｈｏＲを各ウェルに加える。

ＡｃＣｈｏＲとインキュベートした後、これらのプレートを、０．０５％のツイ ーン及び０．０５％のＮａＮｉを含むリン酸緩衝食塩水より成る洗浄液で４回す すく。マウス血清を０．ＯＩＭのＰＢＳ　（ｐＨ７，２）、１．５ｍｆｒのＭｇ Ｃ＋　、　。

２．０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０５％のツイーン８０．０．０５ ％の１Ｊａｋ：＋（Ｐ−ツイーンバッファー）に希釈し、そしてプレート上でイ ンキュベートした。このプレートを洗った後、Ｐ−ツイーンバッファーに希釈し たヘーターガラクトシダーゼコンジュゲート化ヒツジ抗マウス抗体を各ウェルに 加えた。最終洗浄の後、酵素基質ｐ　−ニトロフェニルガラクトピラノシドをプ レートに加え、そして基質触媒の程度をｌｈｒ後の４０５ｎｍでの吸収により決 定した。

非免疫化マウスと比べて、抗−ＡｃＣｈｏＯＲ抗体がＡｃＣｈｏＲで免疫したマ ウスの中に存在していることが予測される。複合体による処置は免疫化マウスに おける抗ＡｃＣｈｏＲ抗体の力価を有意義に低下せしめるものと予測される。

臨床ＥＡＭＧに対する複合体による処置の効果を評価できる。重症筋無力症は、 頭及び首のうなだれを伴う丸し）姿勢、背中の過大な弓なり、ゆがんだ（ｓｐｌ ａｙｅｄ）手足、異常な歩行及び筆甚己の困難さの特徴を含む。複合体の投与に より、抗体力価が低下した後の期間の後に軽い症状が標準試験の後に見られ、従 って改善されたのであろう。

リウマチ型関節炎（ＲＡ） ヒトにおいて、リウマチ型関節炎に対する感受性ＣよＨＬＡ　Ｄ／ＤＲに関連す る。マウスにおける天然■型コラーゲンに対する免疫応答しよ、ヒ）ＲＡを擬態 する数多くの組織学的及び病理学的特徴を有する関ｉ！負炎についての実験モデ ルを確立するために利用されてしする。マウスにおけるコラーゲン誘発型関節炎 （ＣＩＡ）に対する感受性ＧよＨ−２１領域、詩にＩ−Ａサブ領域に地図化され て１７）る、　Ｈｕｓｅら、Ｆｅｄ。

なｏｃ、　（１９８４）邦：　１８２０゜感受性株ＤＢＡ−１由来のマウスは、 向ｏ１ｅｙとＬｕｔｈｒａのム」μ咀賎Ｌ（１９８５）　１３４　：　２３６６ 　（引用することで本明細書Ｇこ組入れる）に記載の技術を利用してマウスを天 然■型コラーゲンで処置することによってＣＩＡ　を有すようにさせる。

別のモデルにおいて、ラットにおけるアジュノくント関ｉ口炎力（ヒト関節炎及 び細菌抗原により誘発される自己免疫応答のブロトタイフ。

４、ｍト−、テノ実験−Ｅ−テ／Ｌ／となるＨｏ１ｏｓｃｈｉｔｚら、Ｐｒｏｓ 　ｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）　（１９８６）　；　 Ｐｅａｒｓｏｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕ＋ｎ、　（１９６４）　７　： 　８０゜この障害は細胞仲介型免疫応答の結果であり、これＧよアジュバント（ ＭＴ）に対して反応性であるＴ細胞のクローンＧこよるその（云達性によって証 明される；同しクローン化細胞による研究Ｇこ基づき、この障害における標的自 己抗原は軟骨のプロテオク゛リカン分子の−＠じであることが認められた。

ラットにおけるアジュバント障害は、Ｐｅａｒｓｏｎ　、前掲に記載の通り、即 ち、複数の貯蔵部位、好ましくは皮肉的に、又は足にもしくは尾の根もとに付与 するフロインドアジュバント（殺菌した結核菌又はその化学画分、鉱物油及び乳 化剤）の単一注射により発生する。

このアジュバントは他の抗原なしで付与する。

障害の出現の複合体処置の効果をモニターした。この出現は組織学的であり、そ して、滑膜被覆細胞の増殖を伴う急性及び半急性滑膜炎、接続組織パンヌスによ る骨及び関節軟骨の浸潤、並びに特に冒された接合部の近くでの骨膜新前形成が 含まれる。重症又は慢性の場合、骨性硬直と同じような崩壊的変化が生ずる。こ れらの組織学的症候はフロインドアジュバントに対する感化の約１２日後にコン トロール動物において認められるものと予測される。

インスリン　、■ＤＤＭ ＩＤＤＭＬよ、膵臓のランゲルハンス島のインスリン分泌細胞の選択的破壊の結 果として観察される。この病気における免疫系の関与は、単核細胞によるランゲ ルハンス島の早期浸潤の形態学的証拠、抗ランゲルハンス島細胞抗体の検出、Ｉ Ｄ０Ｍ母集団における対立遺伝子ＨＬＡ　−ＯＲ３および−ＤＲ４の高頻度およ びＩＤＤＭと各種の自己免疫病との間の臨床的関連によって示唆される。自発性 ＩＤＤＭと甲状腺炎の動物モデルはＢＢクラット発現した。ヒトと同様に、ラッ トの病気は１１８ｃ抗原をコートする遺伝子によって部分的にコントロールし、 島の浸潤を特徴とし、抗島抗体の存在と関連する。Ｉ−Ｅと等価のクラスＩＴ　 ＭＨＣ抗原は、ＢＢクラットおける自己免疫病の発現に関与するものと思われる 。ビオタートら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）＋　（１ ９８５）＋数、　６６２７゜ 形態学的評価では、インスリン炎は、島内に単核炎症細胞が存在することを特徴 とする。甲状腺炎は、最低基準として甲状腺内における病巣の間質リンパ球浸潤 液を特徴とする。最も重症の場合は、散在性の多量なリンパ球浸潤液、小胞の破 壊、線維症、および病巣のヒュルトレ細胞の変化を示す、ビオタートら、同上を 参照されたい。

８Ｂラツトの本発明の複合体での治療は、ＩＤＤＭおよび甲状腺炎に関連した臨 床的および形態学的症状の発現を改善しまたは防止することが期待される。

もう一つのモデルでは、ＮＯＤマウス種（Ｈ−２に’Ｄｂ）は、自己免疫ＩＤＤ Ｍのネズミでのモデルである。これらの動物における病気は、抗島細胞抗体、重 症リンスリン炎、β細胞の自己免疫破壊の証拠を特徴とする。カナザワら、肚吐 蛙妙副ｉａ、　（１９８４）、釘、　１１３　、この病気は、リンパ球によって 受動的に転位し、サイクロスポリン−Ａで処理することによって防止することが できる（イケハラら、ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、（１９８ ５）、　８２．７７４３　；モリら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏ　１ａ（１９８６）、 　２９．２４４゜未処理の動物は、深いグルコース不耐性およびケトン症を発現 し、および病気の徴候から数週間以内に死亡する。

雌性動物の９０％および雄性動物の２０〜３０％が、誕生から６か月以内に糖尿 病を発現する。飼育の研究は、罹病率に関する少なくとも２個の遺伝的配座を定 義し、その内の一つはＭＨＣに配置されている。

血清学的および分子の水準でのＮＯＤクラス■抗原の特徴決定は、自己免疫病の 罹病率はＩ−Ａに関連することを示している。アチャーオーヘアおよびマノクデ ビノト、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　（１９８７）。

氾、２３５゜ ＋１ＪＮＯＤマウスを複合体で処理すると、糖尿病の徴候を示す以前の時間が長 くなりおよび／またはこの病気を改善または防止することが期待される。

・アレルギー　〜　；゛（ＥＡＥ 実験的アレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）は、多くの点で多発性硬化症（ＭＳ　） のヒトの病気に類似している中枢神経系の誘発された自己免疫症である。この病 気は、マウスおよびラットのような多くの種で誘発させることができる。

この病気は麻痺が急に起こることを特徴とする。ＣＮＳにおける単核細胞による 脈管周囲の浸潤が、マウスとラットのいずれにも観察される。この病気を誘発す る方法と症状学は、アランマン（１９８５）Ｔｈｅ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　Ｄ ｉｓｅａｓｅｓ（ローゼおよびマンカイ監修、アカデミツクプレス・インコーポ レーテド）３９９〜４２７頁およびアチャーオーヘアら、　（１９８９）、八ｎ ｎ　Ｒｅｖ　ｒｍｍ、７．　３７７〜４０５　。

遺伝子が媒介する罹病性の一つは、Ｍ）ＩＣクラスＩＩ　ＳＪ［域に配置されて いる（ムーアら（１９８０）　Ｊ　［ｍｍｕｎｏｌ、　１２４．　１８１５〜１ ８２０）　、最も良好に解析された脳を髄炎発症タン白質はミニリン塩基性タン 白質（ＭＢＰ）であるが、他の脳を髄炎発症抗原が脳に見出されている。免疫原 性エピトープが配置されている（アチャーオーベアら、同上）。

ＰＬマウス種（Ｈ−２’）では、ＭＢＰ中における２個の脳を髄炎発症ペプチド である、ＭＢＰペプチド２３５〜４７　（ＭＢＰ３５〜４７）およびアセチル化 ＭＯＰ　ｐ　１〜９　（ＭＢＰ　１〜９）が特性決定された。

ＥＡＥが誘発された個体における病状の改善に対する本発明の複合体の効果は、 生存率、および症状の発現の新工場鏡によって測定することができる。

処方及び投与 もしＭＨＣサブユニットのトランメンプラン領域を含ませるなら、本発明の複合 体は脂質単層又は二重層に含ませた後に投与することが好ましい。典型的には、 この目的のためにリポソームが利用されるが、しかしながらあらゆる形態の脂質 膜、例えば平面脂質膜又は細胞（例えば赤血球細胞）の細胞膜が利用されうる。

下記の実施例に示すデーターは、二量体ＭＨＣ分子を含んで成るＭＭＣ−ペプチ ド複合体が主として凝集体として存在していることを示す。

リポソームは下記の標準方法に従って調製できる。しかしながら、もしトランス メンプラン領域を削除したら、この複合体はペプチド含有薬品にとって常用に利 用されている手法で投与されうる。

投与は全身的とし、そして注射、好ましくは静脈内により行われ、従って投与の 注射ルートに適合する製剤が利用できる。適切な処方はＲｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ 　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐ＾、第１７版（ １９８５）　（引用することで本明細書に組入れる）に見い出せる。本発明の複 合体及び薬理学的に有効な担体を含んで成る様々な薬理組成物が調製できる。該 薬理組成物は様々な薬剤デリバリ−システムに適切である。薬剤デリバリ−の現 在の方法の簡単な参考については、Ｌａｎｇｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　 ：　１５２７−１５３３　（１９９０）（引用することで本明細書に組入れる） を参照のこと。

本発明の薬理組成物を調製するうえで、その薬物速度論及び生体分布性について 変えるために本発明の複合体を改質することがしばしば所望される。薬物速度論 の一般的詳細については、ムＬ」山匪ｊＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ、前掲、第３７〜３９章を参照のこと。薬物速度論及び生体分布性を 変える数多くの方法が当業者に知られている（例えば、Ｌａｎｇｅｒ前掲を参照 のこと）。例えば、複合体の血清半減期を上昇させるのに適切な方法には、血流 からの複合体の排除に関与する炭水化物の除去の処理が含まれる。好ましくは、 実質的に全ての炭水化物がこの処理により除去される。炭水化物成分の少なくと も７５％、好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約９９％が除去されたら 、実質的に全ての炭水化物が除去されたといえる。可溶性巨大分子、例えばタン パク質、多糖類又は合成ポリマー、例えばポリエチレングリコールへのコンジュ ゲーションも有効である。その他の方法には、タンパク質、脂質（例えばリポソ ーム）、炭水化物又は合成ポリマーのような物質より成る小胞の中での該複合体 の保護が含まれる。

本発明の１１ポソームは典型的には、この複合体がＴ＄１胞レセプターと相互作 用しうるような状態でリポソームの上に位置しているＭ）Ｉｃ−ヘブチド複合体 を含む、そのトランスメンプラン領域は通常は、膜の形成時に膜の中にまず一体 化せしめる。このリポソームは特定の自己反応性Ｔ細胞を薬剤（例えば毒素又は 化学治療薬）が標的とするために利用できる。他方、リポソームの中に包埋され た複合体を標的細胞におけるアネルギーの誘発のために利用できる。

リポソームの電荷は血液からのリポソームの排除において重要な決定要素であり 、負荷電リポソームは網内細胞系によってより迅速に取り込まれ（Ｊｕｌｉａｎ ｏ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗμリュ６３ ：６５１　（１９７５））　、従って血流の中で短めの半減期を有する。長い循 環半減期を有するリポソームが治療及び診断用途のために一般に所望される。例 えば、血流の中で８．１０．１２又は２４時間まで維持されうるリポソームが好 ましい。

典型的には、リポソームは約５〜１５モル％の負荷電リン脂質、例えばホスファ チジルグリセロール、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールに よって調製する。加えた負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロールは 、自発性リポソーム凝集を防くにも働き、それ故所望されないリポソーム凝集形 成の危険性を小さくする。少なくとも約５０モル％の濃度での膜硬北側、例えば スフィンゴミエリン又は飽和中性リン脂質及び５〜１５モル％のモノシアリルガ ングリオシドが、血流におけるリポソーム調製物の循環を高めるのに担う（これ は、引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，８３７．０２８号に記載 されている）。

更に、リポソーム懸濁物は、脂質をフリーラジカル及び保存に基づく脂質−過酸 化的損傷から守る脂質保護剤を含みうる。親油性フリーラジカルクエンチャ−１ 例えばα−トコフェロール及び水溶性鉄特異的キシート剤、例えばフェリオキシ アニンが好ましい。

例えば５ｚｏｋａ　ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｂｉｏｅｎ　 、９　：　４６７　（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５ ０１，７２８号及び第４，８３７，０２８号（全て引用することで本明細書に組 入れる）に記載の通り、様々な方法がリポソームを調製するのに有用である。一 方法は不均質なサイズの多重板状小胞をもたらす。この方法においては、小胞形 成脂質を適当な有機溶媒又は溶媒系の中に溶かし１次いで真空又は不活性ガスの もとで乾かして薄い脂質フィルムを形成せしめている。所望するなら、フィルム を適当な溶媒、例えば菓三ブタノールの中に再溶解させ、次いで凍結乾燥させて 、より容易に水和される粉末状形態にあるより均質な脂質混合物を形成せしめる 。このフィルムを標的化薬剤及び標的用成分の水性溶液で覆って、典型的には撹 拌しながら１５〜６０分にわたって水和させる。得られる多重板状小胞のサイズ 分布は、より強い攪拌条件のもとての脂質の水和により、又は清浄剤、例えばデ オキシコレートの添加により小さめのサイズにシフトさせることができる。

水和媒質は標的化薬剤を、最終リポソーム懸濁物中のリポソームの内部容量の中 で所望される濃度で含む。典型的な薬剤溶液は緩衝食塩水？８液の中にｌＯ〜１ ００　ｍｇ／ｍｌの複合体を含む。

リポソームの調製に続いて、所望のサイズ範囲及び比較的狭いリポソームサイズ の分布を得るためにリポソームはサイズ分別されうる。ある好ましいサイズ範囲 は約０．２〜０．４　ミクロンであり、これは典型的には０．２２ミクロンのフ ィルターである常用のフィルターでの濾過によってリポソーム懸濁物を滅菌する ことを可能とする。このフィルター濾過法は、もしリポソームが約０．２〜０． ４　ミクロンまでにサイズ分別されたなら、高仕組ベースで実施できる。

リポソームを所望のサイズへとサイズ分別するのにい（っがの技法が有用である 。あるサイズ分別法は引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，７３７ ，３２３号に記載されている。リポソーム懸濁物をハス又はプローブ音波処理の いづれかにより音波処理することは、サイズが約０．５ミクロン以下である小さ な単板小胞に至る多大なサイズ縮小をもたらす。ホモシネ−ジョンは大きなリポ ソームを小さめのものへと砕断するためにエネルギーを与えることを基礎とする 別の方法である。典型的なホモシネ−ジョン手順において、多重板状小胞を標準 のエマルションホモジナイザーを介して特定のリポソームサイズ、典型的には約 ０．１〜０．５　ミクロンのサイズが認められるまで再循環させる。両方の方法 において、粒径分布は常用のレーザービーム粒径識別によりモニターできる。

小孔ポリカーボネート膜又は非対称性セラミック膜を介するリポソームの押出し も、リポソームのサイズを比較的よく規定されたサイズ分布へと小さくする有効 な方法である。典型的には、懸濁物を、所望のリポソームサイズ分布が得られる まで１又は数回にわたって膜を介して循環させる。リポソームサイズにおける段 階的縮小を得るためにリポソームを順次小さめの多孔膜を介して押出してよい。

最も効率的な封入法のもとでさえも、最初にサイズ分げしたリポソーム懸濁物は 遊離（封入されていない）形態における複合体を５０％以上含みうる。

リポソーム懸濁物から捕捉されていない化合物を除くためのい（つかの方法が有 用である。一方法において、懸濁物を高速遠心によりペレット化して、上清液の 中に遊離化合物及び非常に小さなリポソームを残させる。別の方法は、懸濁物を 限外濾過により濃縮し、次いで交換媒質の中にこの濃縮リポソームを再懸濁させ ることを包括する。他方、溶質分子から大きめのリポソーム粒子を分けるために ゲル濾過が利用されうる。

上記の処理に続いて、リポソーム懸濁物を静脈内投与において有用な所望濃度に する。これは、例えば遠心もしくは限外濾過によってリポソームが濃縮された場 合はリポソームを適当な容量の注射媒質に再懸濁する、又は薬剤除去工程が全懸 濁物容量を増加させた場合はこの懸濁物を濃縮することを包括しうる。次にこの 懸濁物を前記のｉｌｌりに濾過により滅菌する。　Ｍ）ＩＣ−ペプチド複合体を 含んで成るリポソームは、投与の手法、導入すべき薬剤、処置すべき特定の障害 、等に従って変わる投与量において、非経口的又は局所的に投与されうる。

ミセルは非極性領域を有する分子の溶解度を高めるために当業界において一般に 利用されている。従って当業者はミセルが本発明の組成物において有用であるこ とを認識するであろう。本発明の複合体を含んで成るミセルは当業界によく知ら れる方法に従って調製できる（例えば匡髭コぷｎ’ｓ力ｙ１嬰狸辻坦りと止匹並 、前掲、第２０章を参照のこと）。本発明の複合体を含んで成るミセルは標準の 界面活性剤又は清浄剤を用いて一般に調製される。

ミセルは水性溶液中で界面活性剤（疎水性ａＪＡと、１又は複数のイオン性、又 はそうでなければ強力な親水性基とを含む分子）により形成される。固形界面活 性剤の濃度が増えるにつれ、大気／水又はガラス／水の界面に収着した単層は、 更なる占拠がこの２枚の単層の中に既にある界面活性剤分子の多大な圧縮を必要 にせしめるほどに密に充填される。この濃度を超えるような溶解界面活性におけ る量の更なる増分は、ミセルへと凝集する新たな分子の量に相当する。この過程 はいわゆる「臨界ミセル濃度」と呼ばれる特徴的な濃度で始まる。

希薄な界面活性剤溶液の中で形成されるミセルの形はほぼ球形である。界面活性 剤分子の極性頭部基は外部球形殻に並んでおり、ここでその炭化水素鎖は中心に 向って配向して、ミセルにとっての球形中核を形成している。この炭化水素鎖は ランダムコイルとなり、且つ、からみ合っており、そしてミセルの内部は非極性 の液状特性を有している。ポリオキシエチル化非イオン性清浄剤のミセルにおい ては、このポリオキシエチレン成分は外を向いており、そして水により浸入され る。この配備はエネルギー的に好ましく、なぜなら親水性頭部蒸水と接触し、そ して炭化水素成分は水性媒質がら除がれており、且つ、極性頭部基によって水と の接触が遮蔽されているからである。ミセルの内部に位置する界面活性剤分子の 炭化水素尾部は弱いファンデルワールス力によって互いと相互作用している。

ミセルのサイズ又はその凝集体の数は幾何学的要因により大いに支配されている 。炭化水素中核の半径は界面活性剤分子の伸びきった炭化水素鎖の長さを超える ことはできない。従って、鎖長を長くすること、又は同族列を増やすことは球形 ミセルの凝集数を増やす。

炭化水素領域が単独の通常のアルキル鎖である界面活性剤にとっては、球形を構 成する最大凝集数はＣｓ、Ｃ１゜、ｃ１□、Ｃ１４及びＣＩ４のそれぞれにとっ て約２７．３９．５４．７２及び９２である。もし界面活性剤の濃度を数％上げ る、そしてもし電解質を加える（イオン性界面活性剤のケース）又は温度を高め たら（非イオン界面活性剤のケース）、ミセルのサイズは大きくなる。このよう な条件のもとでは、ミセルは球形を維持するのに大きくなりすぎてしまい、形が 楕円形、円筒形又は最終的に板状となってしまう。

一般の界面活性剤は当業者によく知られ、そして本発明のミセルに利用できる。

適当な界面活性剤にはラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル 硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレングリコールモノドデシルエーテル、オク トキシノール９及びＰＬＵＲＯＮＩＣＦ−１２７°　（ＷｙａｎｄｏＬｔｅ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏｒｐ、）が含まれる。好ましい界面活性剤はＩＶ注射に 適合する非イオン系ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレン清浄剤であり 、例えばＴＷＥＥＮ　−８０°。

ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ−６８＠、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等であ る。更に、リポソームの調製において用いるのに説明したリン脂質もミセル形成 に利用できる。

本発明のＭＨＣサブユニットは親油性トランスメンプラン領域及び比較的親水性 な細外胞ドメインを含んで成るため、一般の界面活性剤又はリン脂質及びこのサ ブユニットの存在下において複合ミセルが形成される。本発明の複合ミセルはサ ブユニ・ノド、リン脂質及び／又は界面活性剤の任意の組合せを含んで成りうる 。従って、該ミセルはサブユニットと清浄剤、リン脂質及び清浄剤の両方と組合 せたサブユニット、又はサブユニットとリン脂質を含んで成りうる。

本発明の複合体を含んで成る薬理組成物に関して、その投与量は例えば特定の複 合体、投与の方法、処置すべき特定の障害及びその重症度、患者の総合的な健康 状態及び症状、並びにかかりっけの医師の判断に応して変わりうる。ネズミ対象 体にとっての投与量レヘルは一般に約１０μｇ〜約５００μｇである。約５０μ ｇ〜約３００μｇの総投与量が好ましい。例えば、障害の経過にわたって施す処 置において、２５μｇ又は１００μｇの３回の投与が有効である。総投与量は約 ０．０１５〜約１５μｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１５〜約１０μｇ／ｋｇに範 囲する。

薬理組成物は予防的及び／又は治療的処置のため、非経口的、局所的、経口的又 は局部的（例えばエロゾールによる）又は経皮的投与を目的とする。この薬理組 成物は投与の方法に応じて様々な単位投与形態で投与されうる。例えば、経口投 与に適する単位投与形態には粉末、錠剤、ビル及びカプセルが含まれる。

好ましくは、該薬理組成物は静脈内投与される。従って、本発明は、許容される 担体、好ましくは水性担体に溶解又は懸濁された複合体の溶液を含んで成る静脈 内投与のための組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、０．４ ％の食塩水等が利用されうる。例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が本発明の 可溶性複合体の投与のために特に適切である。好ましい製剤は０．０２％のツイ ーン−８０を含むＰＢＳである。この組成物は常用のよく知られている滅菌技法 により滅菌するか、又は滅菌濾過してよい。得られる水性溶液は使用されるため に包装されるか、又は凍結乾燥されてよく、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水性 溶液と合わせられる。この組成物は、適当な生理学的条件のために必要な薬理学 的に許容される補助物質、例えばｐＨ調節及び緩衝剤、等張性調節剤、湿潤剤等 例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化 カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、他 を含むことができる。

該複合体の濃度は広範囲にわたり、即ち、約０．０５重量％以下、通常は少なく とも約１重量％から、１０〜３０重量％はどに変えることができ、そして選ばれ た投与の特定態様に従って、主として流体容量、粘度等によって選ばれるであろ う。静脈内投与のために好ましい濃度はＰＢＳ中で約０，０２％〜約０．１％又 はそれ以上である。

固形組成物に関しては、常用の非毒性固形担体が利用でき、これには例えば薬理 縁のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカ リンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネ シウム等が含まれる。経口投与のためには、薬理学的に許容される非毒性組成物 は、通常利用されている賦形剤、例えば既に挙げたような担体のいづれかを含ま せることにより作られることができ、そして一般には活性成分の１０〜９５％に する。

エロゾール投与のためには、該複合体は界面活性剤及び噴射剤と一緒に、微細分 割形態において供せられるのが好ましい。この界面活性剤はむろん無毒でなくて はならず、そして噴射剤に可溶性であることが好ましい。代表的なかかる試薬は 、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステル又は半エステル、例えばカプロ ン酸、オクタノン酸、ラウリン酸、バルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、 リルニン酸、オレステアリン酸及びオレイン酸と、脂肪多価アルコール又はその 環状無水物、例えばエチレングリコール、グリセロール、エリスリトール、アラ ビトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトールに由来するヘキシトール 無水物、とのエステル、並びにこれらのエステルのポリオキシエチレン及びポリ オキシプロピレン誘導体である。複合エステル、例えば複合又は天然グリセリド が利用できる。この界面活性剤は該組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０ ．２５〜５重量％を構成しうる。この組成物の残りは通常噴射剤である。液化噴 射剤は一般に周囲条件でガスであり、そして加圧のもとて＆Ｅ縮する。適当な液 化噴射剤は、５個まで炭素を含む低級アルカン、例えばブタン及びプロパンであ り、そして好ましくはフッ素化又はフルオロ塩素化アルカンである。前記した混 合物も利用できる。エロゾールの製造において、適当なバルブの付いた容器に、 微細に分割した化合物及び界面活性剤を含む適当な噴射剤を充填する。この成分 は従ってバルブの作動により放出されるまで高い圧力に維持される。

該複合体を含む組成物は治療的、予防的又は診断的用途のために投与できる。治 療的用途においては、組成物を、前記した障害に既に苦しんでいる患者に、この 障害の症状及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に軽減するのに十分な量 で投与する。これを成し遂げるのに適切な量を「治療的に有効な投与量」と定義 する。これに有効な量は障害の重症度並びに患者の体重及び一般的状態に依存す るであろう。前述した通り、これは典型的には約０．５ａ＋ｇ／ｋｇ〜約２５ｍ ｇ／ｋｇ、好ましくは約３〜約１５ｓ＋ｇ／ｋｇであろう。

予防的用途においては、本発明の複合体を含む組成物を、特定の障害に対して感 受性である、又はその危険性を有する患者に投与する。かかる量は「予防的に有 効な投与量」と定義する。この用途において、その正確な量はここでも患者の健 康状態及び体重に依存する。その投与量は一般に前記した範囲であろう。

診断用途において、適切な複合体又はそのカクテルを含む組成物を、自己免疫障 害症状を有すると予測される患者に投与して、この障害に関連する自己反応性Ｔ 細胞の存在を決定する。他方、特定の処置の効力をモニターすることができる。

これを成し遂げるのに十分な量は「診断的に有効な投与量」と定義する、この用 途において、その正確な量は患者の健康状態等に依存するが、一般には投与当り ０．０１〜１０００ｍｇ、特に患者当り約１０〜約１０ｋｇの範囲であろう。

治療的又は診断的用途のためのキットを供することもできる。従って、本発明の 課題の組成物は通常容器中の凍結乾燥状態で供される。ラベルもしくは毒素にコ ンジュゲートされた、又はコンジュゲートしていない複合体をキットの中に、バ ッファー、例えば、トリス、リン酸塩、炭酸塩等、安定剤、殺生物剤、不活性タ ンパク質、例えば血清アルブミン等、更には使用のための仕様書のセントと一緒 に含ませてよい。一般に、これらの材料は複合体の量に基づいて約５重量％以下 、そして通常はタンパク質濃度に基づいて少なくとも０．００１重量％の量で存 在するであろう、しばしば、活性成分を希釈する不活性増量剤又は賦形剤を含ま せることが所望され、この賦形剤は全組成物の約１〜９９重量％において存在し うる。アッセイにおいてこの複合体に結合することのできる抗体を使用するとき 、これは別個々のバイヤルの中に通常存在するであろう。この抗体は当業界に知 られる技術に従ってラベルにコンジュゲートされ、そして処方されるのが典型的 である。

下記の実施例によって本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。

実施例１ マウスｋＡ’及びラットＭＢＰペプチドの複合体によるインビトロでのＴ細胞の 下陣制御 ヒト多発性硬化症を凝態する障害モデルであるマウスにおける実験的アレルギー 性起脳炎を誘発することで知られるミニリン塩基性タンパク譬（ＭＢＰ）に対し て向けられたＴ細胞クローンにおける非応答性又はア不ルギーの誘発におけるク ラスＩｆ　ＭｔｌＣ−ペプチド複合体の効果を下記に示す。

スタッフォード大学のＰａｔ　、Ｉｏｎｅｓ博士から、ラットＭＢＰペプチド（ １−１１）に対するマウスの免疫によって調製し、そして抗原特異性について特 性化されたＴ細胞クローンＡＪ１．２及び４Ｒ３，４を獲得した。

ラットＮＳＦペプチドを有するＩ−Ａ’１合体を、精製マウス■−Ａ’及び合成 ラットＭＢＰペプチド（１−１３）を利用して作り、このペプチドの配列は周知 であり（Ｚａｍｖｉｌら（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２４　：　。

２５８２６０）　、そして Ａｃ−ＡＳＱＫＲＰＳＱＲＩＩＧＳＫ である。

マウスＩ−Ａ”をＴｕｒｋｅｗｉｔｚ　ら、前掲に基づく改良方法により精製し た。基本的には、Ｉ−Ａ’を含む細胞の可溶性膜抽出物を、１０−２．１６抗体 （これはプロティンＡでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、 且つ、ＣＮＢｒ活性化セファロース４ｂに結合されている）を含むカラムを用い るアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。　ＮＰ−４０可溶性膜抽 出物、１０．２１６ＭＡｂの精製及びそのＣｎＢｒ活性化セファロース４Ｂへの 結合、並びにＩ−Ａｋの精製の調製計画をそれぞれ図１２．１３ａ並びに１４に 示す。図１３ｂは精製した１０−２．１６抗体の純度を示すポリアクリルアミド ゲルのコピーである。Ｉ−Ａ”の純度（これはポリアクリルアミドゲル分析によ りモニター）を図１５に示す。

１−Ａ’とラソ）　ＭＢＰペプチドの複合体を作るため、３０ｍＭのオクチルグ ルコシドを含むＰＢＳ中の１０ａｇのアフィニティー精製１−Ａｋと５０倍過剰 量のＨＰＬＣ精製ＭＢＰペプチドとを１２５μｌの全容量で混ぜ合わせた。サン プルを３７°Ｃで１６時間、定常に攪拌しながらインキュベートし、次いでリポ ソームの１！備のためにＧ−２４セフアデツクス脱塩によりペプチドから分離さ せるか、又は細胞研究のためにＰＢＳ、続いてＲＰ旧培地に対して４°Ｃで３６ 時間透析した。

リポソームへのｌ−Ａ’−ＭＢＰペプチド複合体の導入は下記の通りである。２ ５ニア５：２のモル比でコレステロール：ジパルミトイルホスファチジルコリン （ＤＰＰＣ）　ニジバルミトイルホスファチジルエタノールアミン−フルオレセ イン（ＤＰＰＥＦ　）より成る脂質溶液を３０１Ｍのオクチルグルコシド（ＯＧ ）を含むクロロホルム中で調製した。脂質を真空のもとで乾かし、そして１７ｎ ＋ＭのＯＧを含む予め作っておいたＰＢＳ中のＩ−Ａ’−ペプチド複合体を乾燥 脂質と５　：　１　（Ｗ／Ｗ）の比で混ぜ合わせた。この混合物を２−３分間ポ ルテックスに付し、４°Ｃに冷やし、そして最後にＰＢＳ　、続いてＲＰＭＩ倍 地に信地て４°Ｃで３６時間透析した。（１２５−１）−ラベル化Ｉ−Ａ’を用 いる実験においては、脂質混合物の中に蛍光化脂質は含ませず、そしてリポソー ムの中へのＩ−Ａｋの一体化をシンチグラフィーにより決定した。

平面脂質膜を滅菌１２１Ｉ１ｗｌガラスカバースリップの上に、アフィニティー 精製１−Ａ’単独又は精製Ｉ　−Ａ”　＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポソーム ５０〜１００μｌを用いて、Ｗａｔｔｓ　らの（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：　５４８０　５４８４　（引用するこ とで本明細書に組入れる）の方法によって１！備した。平面膜におけるＩ−Ａｋ の存在は、蛍光抗１−Ａ’抗体による染色の後での蛍光顕微鏡によりｉ認した。

ハックグランド以上の蛍光は、蛍光抗Ｉ−Ａ’により染色に基づいて認められな かった。

ＭＢＰペプチド刺激の６〜８日後に獲得したＡＪｌ、２及び４　Ｒ３，４細胞を ２回洗い、そして４Ｘ１０’の細胞を平面膜に付加した。このプレートを３７゛ Ｃで５％のＣＯ□の中で４８〜７２時間インキュベートし、次いでコロニーの形 成について目視検査した。

清浄側可溶化クラス■分子の効果を、ｌＸｌ０’のＡＪｌ、２又は４　Ｒ３，４ を、５０〜１００μｌの精製１−Ａ”単独、精製１−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３） 、及び借地単独と、３７°Ｃで５％のＣＯ２の中で５時間培養することにより調 べた。このインキュベーションの後、これらの細胞を９００μｍに希釈し、そし て増殖アッセイにおける抗原表示細胞（ＡＰＣ）及び抗原（ＭＢＰ（１−１３） 　）に対するそれらの応答能力について試験した。細胞増殖の表示として３−　 （４，５−ジメチル−チアゾール−２−７’）−２，５−ジフェニルテトラゾリ ウムプロミド（ＭＴＴ　）の取込みを利用した。通常は１Ｈ−チミジン取込みに よってモニターされるＤＮＡ合成と、ＭＴＴ取込みにより測定されるミトコンド リアの活性は別々の細胞機能であるが、肺臓細胞培養の刺激の開始から３日後に モニターしたこれら２通りの活性は互いと非常によく似ていた（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｕｍｂｅ ｒ　０１１　Ａ。

１９８８年２月９日）。

データーは、信地のみで培養した細胞に比してのクラスＩ＋Ａｇとインキュベー トした細胞増殖の％抑制として示し、そして次式により計算した： （０，Ｄ、）５７０　（Ｔ細胞、十肺臓細胞＋ＭＢＰ（１−１１）　）−（０， Ｄ、）５７０　（Ｔ細胞、十肺臓細胞〕（０，Ｄ、）５７０　（Ｔ細胞。十肺臓 細胞＋ＭＢＰ（１−１３）　〕−（０，Ｄ、）５７０　（Ｔ細胞。十肺臓細胞〕 （式中、 Ｔ細胞、　＝　Ｉ　−Ａ”　−ＭＢＰ（１−１３）複合体と予備インキュベート したＴ細胞 Ｔ細胞、　＝　［−Ａ’　−ＭＢＰ（１−１３）のみと予備インキュベートした Ｔ細胞 Ｔ細胞。−信地と予備インキュベートしたＴ細胞である）。

クラスＩＩ　ＭＨＣのみの存在下で培養した細胞の増殖は、はとんどの研究にお いて信地のみで培養した細胞と一般に等しいため、この後者の数を％抑制を得る うえで利用した。トリプリケートウェルの標準偏差は大半の実験で〈１０％であ った。

まず２通りの定量的研究を、Ｉ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポソームか ら調製した平面膜へのＴ細胞クローンの結合を、１−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３） での予備処置が変更するであろうかを決定するために行った。ＡＪｌ、２細胞を これらの研究のために用い、なぜならこれらはＭＢＰ（１−１３）のみの存在下 において、即ち、抗原表示細胞（ＡＰＣ）なしで平面膜上に特徴的なコロニーを 形成するからである。　ＡＪｌ、２細胞とＩ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）との５ 時間にわたるインキュベーションは、Ｉ−Ａｋ又は借地単独とインキュベートし た細胞に比して、平面膜上に形成されるコロニーの数を阻害した。第２の実験に おいて、ＡＪｌ、２細胞をＩ　−Ａ’　＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポソーム と、又はＩ−Ａ’のみと５時間にわたってインキュベートし、そして平面膜を前 記の通りに調製した。清浄剤可溶化１−　Ａ’　ＭＢＰ（１−１３）について前 述した通り、細胞をＩ　−Ａ”　＋ＭＢＰ（１−１３）を含むリポソームと一緒 に培養することは、Ｉ−Ａ”のみを含むリポソームとインキュベートした細胞に 比して、コロニーの数を減少させた。コロニーは正確に測定できなかったが、そ の数におけるはっきりとした差が認められた。

これらの研究はＴ細胞クローンの機能に対するＩ　−Ａ’　＋ＭＢＰ（１−１３ ）の効果の定量を可能としなかったため、我りはＡＰＣ及びＭＢＰ（１−１３） の存在下における４Ｒ３，４又はＡＪｌ、２細胞の増殖に対するこの複合体の予 備インキュベーションの効果を調べた。従って、４Ｒ３，，４又は＾Ｊ、１細胞 を５０〜１００μｍのＴ−Ａｋ＋ＭＢＰ（１−１３）、１−Ａ’、又は借地のみ と３７°Ｃで５時間にわたり予備インキユベーシヨンした。これらの細胞を適当 な濃度へと希釈し、そしてＡＰＣに加えた。抗原［ＭＢＰ（１−１３）　）を１ ３．３　ｕ　ｍ　〜５３．２　ｔｔ　ｍに範囲する最終濃度となるように加えた 。

本研究において用いた八ＰＣは雌のＡ／Ｊマウスの肺臓から調製した。簡潔する と、肺臓を取出し、そして個別の細胞懸濁物を、滅菌顕微鏡スライドの急冷先端 の間で緩やかに裂くことによって用意した。赤血球を低張ショックで溶解させた 。残留細胞を抗生物質を含むＲＰＭＩで２回洗い、そして１０μｇ／ｍ＋のミド マイシンＣと３７°Ｃで１時間インキュベートした。このインキュベーションに 続いて、肺臓細胞を抗生物質を含むＲＰＭＩで５回洗い、計測し、そしてＡＰＣ として用いた。細胞とＡＰＣ及びＭＢＰ（１−１３）の７２時間インキュベージ テンの後、増殖の程度をＭＴＴ取込みを用いて定量した。研究１．３及び４にお いては、４　Ｒ３，４細胞を上記の通りにインキュベートした。

研究２においては、４Ｒ３，４細胞を、Ｉ−Ａ’十台ＢＰ（１−１３）又は１− Ａ”のみを含むリポソームと予備インキュベートした０次にＴ細胞を１０％のフ ィコール溶液を通じて遠心により未結合リポソームから分け、洗い、そして増殖 アッセイに利用した。研究５〜８はクローンＡＪ１．２なしで実施した。Ｉ−Ａ ｋのみとインキュベートさせた細胞は借地中で培養した細胞と同程度に増殖した 。この方法で予備インキュベートさせたＴ細胞クローンはＡＰＣの非存在下で増 殖しなかった。

上記で示すデーターは、クラスｎ　ＭｌｌＣ＋ＭＢＰ（１−１３）の複合体か、 ＭＢＰ（１−１１）に特異的なＴ細胞クローンにおける劇的な非応答性を誘発す ることを示した。更に、このデーターが示すには、この複合体はＭＢＰ−刺激型 Ｔ細胞クローンと免疫学的に反応性であり、それ故それに結合する。

ヒトＨＬＡ−ＤＲ２−ＭＢＰ複合体の調製及び安定性ＨＬＡ　−ＯＲ２に対する ヒトＭＢＰ　（８３−１０２）ペプチドの最大結合のための最ａｐＨはｐＨ７と 決定された。ホモ接合リンパ珠芽球症細胞由来のアフィニティー精製ＤＲ２を１ ０倍過剰量の放射性ヨウ素化ＭＢＰ　（８３−１０２）ペプチドと３７°Ｃで４ ８時間にわたり、様々なｐＨでインキュベートせしめた。未結合のペプチドを透 析により除去し、次いで結合ペプチドの量をシリカゲルＴＬＣアンセイから計算 した。サンプルを還元及び非還元ポリアクリルアミドゲルで分析もした。バンド を切り出し、計測し、そして結合ペプチドの量を比活性より計算した。

ヒトＤＲ２−ＭＢＰ（８３−１０２）複合体の安定性も４°Ｃで調べた。ＯＲ２ と１２５１−　ＭＢＰ　（８３−１０２）との複合体を前記の通りに調製し、そ して４°Ｃで保存した。毎週、ｌμｌのアリコートをトリプリケートでシリカゲ ルＴＬＣプレート上に適用した。プレートを流し、展開し、そして％解離を計算 した。４２日間にわたり、この複合体の有意な解離は認められなかった。

実施例２ 自己免疫機能不全を有する個体からのＢ細胞のＥＢＶ形賞転換自己免疫機能不全 を有する個体由来の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＧ　）を、全血又はバッフイー を滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、　ｐＨ７，２でｌ；１に希釈し、この懸濁 物をフイコールーヒパンクの上に載せ、次いで卓上型遠心器で１８００〜２００ ０ＲＰＭにて２０分間遠心することにより単離した。フィコールーヒバンクとＰ ＢＳ−血漿の界面のノくンドにあるＰＢＭＮＣをピベントで回収し、そしてＰＢ Ｓで２回洗った。細胞を１０％の胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭ１１６４０の 中で５Ｘ１０’細胞／ｍｌに再懸濁し、ポリスチレンフラスコの中でプレートし 、そして３７°Ｃで１時間インキュベートして単球を除去した。非付着細胞を集 め、遠心でペレット化し、そしてＣａ＋＋　Ｍｇ″＋を含まず、１５％のＦＢＳ を含むダルへ、コＰＢＳの中でｌ０ＸＩＯ６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＡＥＴ −５ＲＢＣ（２％ｖ　／　ｖ　）をＰＢＭＣと１＝１で混合し、この混合物を１ １００Ｘで２０分間遠心し、次いで氷上で１時間インキュベートした。このベレ ットを緩やかに再懸濁し、そしてこの懸濁物を先に記載の通りフィコール−ヒバ ツクを介して遠心した。Ｂ細胞及び残留単球を含むノ＼゛ントを回収した。

Ｂ細胞の形質転換はＢ９５−８細胞系（Ｗａｌｌｓ　ｌｌ！：ｃｒｏｗｆｏｒｄ のしｙ＊ｐｈｏｃｙｔｅｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ　（ Ｇ、Ｃ，Ｂ、Ｋｌｕａｓｍ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）で行った。Ｂ９５−８細胞 を借地の中に１：３で希釈し、そして３７°Ｃで５日間培養した。この上清液を 集め、２５０Ｘｇで１５分間遠心し、そして０．４５ミクロンのミリポアフィル タ−で濾過した０次にＥＢＶを１０、ＯＯＯＲＰＭで２時間、４°Ｃで遠心によ り濃縮し、そしてウィルスを含むベレットを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ　１６ ４０の中にもとの容量１％で懸濁した。

Ｂ細胞を形質転換させるため、このウィルスストックを２Ｘ１０’の細胞を含む 培養借地で１＝９に希釈した。４°Ｃで１〜２時間ウィルスを細胞に吸収させた 後、この細胞を２５０Ｘｇで遠心した。得られる細胞ベレットを約０．７　Ｘ　 １０’〜７．ＯＸ　１０’細胞／ｍｌで、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ　１６ ４０に懸濁した。形質転換細胞を標準方法によりクローンした。

この手順で作った形質転換Ｂ細胞はヒトＭＨＣＩ！タンパク質の単離のために適 切である。

実施例３ マウスにおけるＥＡＥの誘発 Ｔ細胞クローンＡＪｌ、２及び４Ｒ３，４の養子移入並びにＭＢＰ（１−１３） によるマウスの免疫化はマウスがＥＡＥを発症する原因となる。

ＥＡＥを、完全ＭＢＰによるマウスにおけるＥＡＥの誘発に関する方法を利用し てペプチドで誘発させた。簡潔すると、ＭＢＰ（１−１３）をＰＢＳの中に溶か し、次いで完全ツウインドアジュバントと強く混合して厚みのある乳濁物を形成 せしめた。雌のＡ／Ｊマウスに１００μｇのこの混合物をわき腹に４箇所で注射 した。２４及び７２時間後、４００ｎｇの百日咳毒素を静脈内注射した。ＥＡＨ の発症及び死亡率について２種の個体によりマウスを毎日観察した０図１７にお ける結果は、ＭＢＰ（１−１３）による免疫化に由来するマウスにおけるＥＡＥ の発症を示す。

ＥＡＥの養子移入のため、ＭＢＰ（１−１１）による免疫後のマウスＢＩＯＡ（ ４Ｒ）株から獲得したＴ細胞クローン４Ｒ３，４を用いた。

Ｂ１０Ａ（４Ｒ）マウスに３５０ｒａｄの全身放射量を付し、次いで４００μｇ の百日咳毒素を静脈内注射した。２〜３時間後、３日前にＭＢＰ（１−１３）で 刺激せしめた１０　Ｘ　１０’の４　Ｒ３，４細胞を静脈内注射した。　ＥＡＥ の重症及び死亡率についてこれらの動物を１日２回観察した。この研究の結果を 図１８にまとめた。

実施例４ １−Ａ”−ＭＢＰ（９１−１０３）複合体によるＥＡＨの下降制御本実施例は、 本発明の複合体によるインビボ治療が受動誘発型ＥＡＥの予防をもたらすことを 実証する。更に、この治療は処置動物の死亡率及び病的状態を有意に下げる。

１−Ａ’　／ＭＢＰ（９１−１０３）による処置がＴ細胞の活性化に従うＥＡＥ の発症を防ぐであろうことを実証するため、ＳＪＬマウスにインビボでＭＢＰ　 （９１−１０３）反応性Ｔ細胞ブラストを注射した。簡潔すると、生後ｌＯ〜１ ２週目のＳＪＬマウスに完全フロインドアジュバント中の４００μｇのＭＢＰ（ ９１−１０３）　（＾ｃ　−ＦＦＫＮＩＶＴＰＲＰＰＰ−アミド、純度〉９５％ ）を背中で免疫した。１０〜１２日後、局所的漏出リンパ腺細胞を集め、そして ２４穴プレー）　（Ｆａｌｃｏｎ）の中で、１０％の胎児中血清、１％のぺのＲ Ｐ旧１６４０倍地中で６Ｘ１０’細胞／ウエルの濃度で培養した。４日間のイン ビトロ刺激に続いて、ＭＢＰ　（９１−１０３）反応性Ｔｔａ胞プラストをフィ コール−ヒバツク勾配（Ｈｙｐａｑｕｅ　１０７７、　Ｓｉｇｍａ、　ＭＯ）を 介して集め、そして標準技法に従ってＰＢＳで２回洗った。約１．３〜１．５× １０７の細胞を各マウスに注射した。

起脳炎ＭＢＰ　（９１−１０３）反応性Ｔ細胞を受容したマウスに、次に１００ μ１ＯＰＢＳ中の１００μｇの可溶性１−Ａ’　／ＭＢＰ（９１−１０３）複合 体、１００μｍのＰＢＳ中の１００μｇのＩ　−Ａ　’　／？’１ＢＰ（１−１ ４）　（Ｓ、ＪＬマウスにおいて起脳炎性でないペプチド）、又はＰＢＳのみの いづれかを、０．３及び７日目にて受容させた（全投与量は３００μｇ　）　、 　ＥＡＥの臨床的徴候について動物を毎日観察して等縁付けした２１級、尾の色 調の欠失；２級、後足の弱体化；３級、後足の麻痺；４級、ひん列状態；５級、 死亡。動物取扱い協会の規則に従い、自分自身で食事を取ることのできないマウ スは殺した。

１−Ａ’　／ＭＢＰ（９１−１０３）複合体を受容した７匹のマウスのうちの１ 匹のみが１６日目に臨床的ＥＡＥを発症した（図１９）。他方、Ｉ　−Ａ”／Ｍ ＢＰ　１−１４を受容した４匹の動物全て及びＰＢＳを受容した７匹の動物のう ちの６匹に麻痺が生じた。前者のグループにおいて、障害の発生の平均は９．７ 日目であり、そして後者のグループにおいては９．０日目であり、平均重症度（ ｍｅａｎ　５ｅｖｅｒｉｔｙ）はそれぞれ２．３及び２．７であった。

１−Ａ“対立遺伝子により表示されるその他の自己抗原が障害誘発を阻止できな いことも実証する。ＳＪＬマウスを、完全ソロインドアジュバント中のプロテオ リポタンパク質（ＰＬＰ　）のペプチド１３９−１５１で免疫してＥＡＥを誘発 せしめた。ＳＪＬマウスは、ＰＢＳに溶がし、次いで４ｍｇ／ｍｌのミオバクテ リア　チューバキュロシス（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ）Ｈ３７Ｒａを含む完全フロインドアジュバントとｌ：１の比で混合したペ プチドで免疫した。動物に１５２μｇのペプチドを両わき腹において皮下注射し 、この投与量は１００％の動物にＥＡＥを誘発せしめることが見い出されている 量である。同し日及び４８時間後に、全ての動物に４００μｇの百日咳毒素を静 脈内的に付与した。マウスを前述の通りに免疫後１．４及び７日目にＰＢＳ。

１５μｇのｌ−Ａ’のみ、又は１５μｇのＩ　−Ａ”　＋ＰＬＰ　（１３９−１ ５１）で処置した。

表１に示す通り、適当す［−Ａ’　／ＰＬＰ　（１３９−１５１）へ７”チＦ複 合体を受容した動物は、アジュバント中のペプチドでの免疫により誘発される重 症な急性麻Ｐｔｌ！害から守られていた。Ｉ−Ａ’／ＰＩ、Ｐペプチド処置グル ープにおいて死亡は認められなかった。６匹の動物に麻痺が生したが、麻痺した 動物の平均重症度は２．２であり、そして発症日は１０．６であった。他方、Ｉ −Ａ”複合体のみを受容した６匹の動物全ては死亡し、発症の平均日は８．２日 であった。５匹の動物が１１日目に死亡し、そして１匹の動物が２１日目に死亡 した。食塩水を受容した、又は処置されていない動物は８７％の死亡率であり、 そして発症の平均日は９．７　（Ｐ　＜０．０００１　１−　Ａ龜／ＰＬＰ　（ １３９−１５１）ンであった。

表１ なし又は食塩水　１５／１５　４．７　８７％　８１−Ａ’複合体のみ　６／６ 　５　１００％　７我／７（７）観察が示唆すルニは、Ｉ　−Ａ　’　／ＭＢＰ 　（９１−１０３）　？！会合体３００μｇ）；こよるインビボ治療は受動誘発 型ＥＡＥの予防をもたらす。更に、４５μｇのＩ　−Ａ”　／ＰＬＰ　（１３９ −１５１）による治療は、この治療を受けた動物の死亡率及び病的状態を有意に 下げた。

本発明の複合体を、マウスにおけるＥＡＥの再発を防止する能力についても試験 した。これらの実験において、ＳＪＬマウスは０日目にて１．２ｘｌＯ’　ｐ９ １−１０３反応性Ｔ細胞を腹腔内的に受容した。８〜１２日目の日日初期麻痺徴 候が発症し、そして全ての動物は２２日目ま−で少なくとも２級の臨床級にまで 回復した。マウスは２７．３７及び４７日目（：５０μｇのＭＨＣ複合体（同系 のペプチドを有する及び有さない）、又はＰＢＳを静脈内的に受容した。実験１ においては、７ウスを１０２日間にわたって観察し、そして実験２においては、 それらを１１２日間にわたって観察した。結果は、同系ペプチドを有する複合体 は再発を防ぐうえでコントロールよりも有意により有効であることを示唆した。

実施例５ ＭＨＣＩＩ　−Ｈ３Ｐ　（１８０−１８８）複合体によるＲＡの下降制御ルイス ラットは、不完全フロインドアジュバント中に乳濁せしめたミオバクテリア　チ ューバキュロシスの皮下注射に応答して、関節炎、通称アジュバント関節炎の状 態を発症する。この関節炎のモデルは、リウマチ型関節炎の処置のために開発さ れる薬剤の薬効を評価するのに必要な数多くの評価を可能とする。＆Ｉ織の病理 性、並びに単球及びリンパ球細胞の浸潤は強力なＴ細胞仲介応答を示唆する。こ こで説明する実験は、ペプチド−Ｍ）ＩＣクラス■複合体を認識し、且つ、結合 するペプチド−特異的Ｔ細胞をアネルギー化する技術を利用する。この研究は、 この障害の誘発のすぐ後での可溶性ＭＨＣクラス■−ペプチド複合体によるイン ビボ処置を包括する。この結果は、食塩水処置を受けたグループに比しての、Ｍ ＨＣクラス■−ペプチド処置ラットにおける前退化の有意な低下を示した。

ルイスラットＭＨＣクラスｎＲＴＩＢ及びＲＴＩＤ分子を、セファロース４Ｂカ ラムに結合させた０Ｘ−６及び０Ｘ−１７モノクローナル抗体により、肺臓細胞 膜のＮＰ　−４０抽出物からアフィニティー精製した。

ＲＴＩＢ、対、ＲＴＩＤの相対収率は１：２であった。Ｍ）ＩＣクラス■分子に このペプチドを、５６μｇのＲＴＩＢ及び１１３μｇのＲＴＩＤ分子を５０倍モ ル過剰量のヒートションクタンパク質（ＨＳＰ）ペプチド、ｐ（１８０−１８８ ）を３７°Ｃで４８時間にわたり、１％のオクチルグルコシドを含む全容量１ｍ ｌのリン酸ハンファーｐＨ７，５の中で混合することによって負荷せしめた。未 結合ペプチドを、４°ＣでＰＢＳバッファーに対してこのサンプルを長い間透析 することによって除去した。この最終複合体濃度は１７０μｇ／ａｔであり、そ して−ｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ。

Ｉｎｃ、により記載のリムルス　アメポサイト（Ｌｉｓ＋ｕｌｕｓ　ａｍｅｂｏ ｃｙｔｅ）リゼート手順により試験した通り、エンドトキシンを有さなかった。

６匹の磯のルイスラット（生後７７日目）に、関節炎を誘発するために両後足に 、不完全フロインドアジュバント中の１ｍｇのミコバクテリア　チューバキュロ シスを注射した。３匹のラットは、障害の誘発から１，４及び７日後にＭＨＣク ラスＩＩ　＋　Ｈ３Ｐ　１８０−１８８複合体を静脈内的に処置した。他の３匹 のラットには上記の通りに食塩水を与えた。関節炎指数を全体外観により決定し 、そして以下の基準に従った二〇）変化なし；ｌ）指の接合部に若干の変化；２ ）若干から軽い足の水腫又は２本以上の指の膨らみ；３）若干のかさぶたを伴う 足の膨らみ、足の指及び爪の軽い硬化；４）足のひどい膨らみ、著しいかさぶた 、及び著しい足の指及び爪の硬化。

１１＋＋ｃクラス■ペプチド又は食塩水で処置したラットは２０日目にそれらの ほとんどの足に、４の関節炎指数の膨らみを有していた。何匹かのラットの足に おいて見られる膨らみの相違は注射したＭＴＯ量に反映するようである。しかし ながら、障害の誘発から３５日後に足のラジオグラフを得たとき、ＭＨＣクラス ■ペプチド処置と食塩水処置グループとの間に有意な差は認められなかった。

第２の実験において、１８匹の動物を５週間にわたって障害の進行中に処置した 。表２に示す通り、本発明のＨＣ−ペプチドで処置した動物は大いに低められた 関節炎指数及び有意に低められた接合部の膨らみを、食塩水処置グループに比し て有していた。動物は４゜８及び１２日目に２５μｇのＭＨＣペプチドを受容し た。

表２ 炎症及び障害の重症度の低下 処置　ラットの数　厚　み　関節炎 （−■±ＳＤ）　指数 食塩水　４　１０．５±０．６　４±ＯＭＨＣのみ　４　９．０±０．７°　３ ．２５±０．５正常　５　５．５５±０．３６　００ １食塩水処置と比較した、統計学的有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントし一 検定） ３５日目に、全ての動物の足根骨接合物をノギスを用いて測定した。

測定値は両後足の厚みの合計を示す。

実施例６ 複合体の血清半減期の上昇 本実施例は該複合体の様々な改質が血清半減期の上昇をもたらすというデーター を示す。

これらの研究のためのプロトコールは一般に下記の通りである：アフィニティー 精製した可溶性ＭＨＣ分子をヨードビーズ法（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、＋　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）により　１２５１でラベルした。過剰の １２５１は０．１％の中性清浄剤を含むＰＢＳに対する透析により除去した。ラ ベル化タンパク質の性状をｙｉ層クロマトグラフィー、セルロースアセテート電 気泳動及びポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。マウスにＭＨＣ糊 タンパク質を尾静脈注射により投与し、このマウスは注射の少なくとも一日前に 飲料水中のルゴール溶液を付しである。様々な時点で血液サンプルを採血した。

注目の器官を得るためにこれらの動物を殺した。血液及び器官のサンプルにおけ る放射活性を標準技術に従ってガンマ−ウェルカウンターで検出しＡ、血清半減 期に対するアンアロレツインの効果ＩＡ’をラベルし、そして前記の通りにマウ スに投与した。

これらのマウスを３通りのセットに分けた：　（１）Ｉ−Ａ’　（１０μｇ静脈 内）；　（２）Ｉ−Ａ’　（１０μｇ静脈内）＋アシアルツイン（１０ｍｇ静脈 内）＋アンアロレツイン（１００Ｂ腹腔内）；及び（３）Ｉ−Ａ’　（１０μｇ 静脈内）＋アシアロレツイン（１０ｍｇ腹腔内）。血流を様々な時点で抜き取り 、そして血液中に保持された注射投与量の％を計算した。

３通りのラットの平均血清半減期は下記の通りであった：Ｂ、血清半減期に対す るリポソームの効果１−Ａ’を前記の通りラベルした。このラベル化１−Ａ’分 子を標準の技術によってリポソームの内側に捕捉させた（例え番ホむμ四匹並、 前掲を参照のこと）。前述の通りに１０匹のマウスに１０μｇのｌ−Ａ’を注射 し、そして４通りのセ・ノドに分けた；　（１）１−Ａ’のみ；　（２）リポソ ームＩ−Ａ”　；　（３）ブランクリポソームを一緒に注射するリポソームＩ− Ａ’　；及び（４）フ゛ランクＩＪポソーム＋、１０分後にブランクリポソーム と一緒に注射する＋Ｊポ゛ノームｌ−Ａ’、注射後様々な時点で血液サンプルを 採取し、そして血液中に保持されたｌ−Ａ’の注射投与量の％を計算した。

３通りのセットの血清平均半減期は下記の通りであった：セット３−１０分。

セット４−６０分。

Ｃ１血清半減期に対する過ヨウ素酸／シアノポロハイドライド処理の効果 ３Ｉｌ１Ｍのタウロデオキシコレートを含むリン酸バッファー、　ｐＨ７，５中 のＩ−Ａｋを前述の通りにラベルした。このラベル化分子を過ヨウ素酸及びシア ノボロハイドライド還元に４°Ｃで５又は２１時間、０．１Ｍの酢酸バッファー 、　ｐＨ５，５中での２０ＩＩＭの過ヨウ素酸ナトリウム及び４０ｍＭのシアノ ボロハイドライド（最終濃度）を用いて処理した。

この反応をエチレングリコール（最終濃度０．７％）の添加により止めた。処理 したＩ−Ａ”を透析により精製し、次いで前述の通りにマウスに投与した（１０ μｇ静脈内）。９匹のマウスを３通りのセットに分けた：　（１）Ｉ−Ａ’　（ 未処理）　；　（２）　Ｉ　−Ａ”　（５ｈｒ。

処理）；及び（３）　Ｔ　−Ａ’　（２１ｈｒ、処理）。様々な時点で血液サン プルを獲得し、そして血液中に保持された注射投与量の％を計算した。

３通りのセットの血清半減期は下記の通りであった：実施例７ 以下に紹介する結果は、本発明のＭＨＣペプチド複合体が清浄剤なしでは凝集体 として主に存在していることを示している。

＋２Ｓ［でラベルされたＩＡ’−Ｐ複合体を前述の通りに調製した。

この複合体（１，５ｍｇ／ｎ＋Ｉ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して長く 透析して清浄剤を除去し、そして６　ｍｌｂ、ν、のセファデックス−６２００ カラムに載せた（分画サイズ５０００〜６００．０００）。図２０に示す結果は 、凝集した複合体がカラムをボイドボリュームにて通過することを示し、従って これは６００，０００より大きい分子量を有することになる。

同様に透析したＩＡ”複合体（１，５ｍｇ／ｍｌ）も遠心し、そしてそのベレッ トを計測した。これを行うため、２００ｍ１の複合体（３００μｇ）を５ｍｌの ＰＢＳに希釈し、そして固定角度ローターで１００，０ＯＯＸ　ｇで６０分間遠 心し、た、この結果を下記の表３に示す。

表３−高速回転による複合体凝集体の検出１　５１４．５７６　３１７．７１？ 　２０５，７９７　６０．６Ｂ２　５１９．３４０　３２１，３０４　２０９． １０８　６０．５７クロマトグラフイー及び遠心実験の両方の結果は、１１１（ Ｃ−ペプチド複合体が凝集又はミセル状でほとんど存在していることを示す。

これらの結果は、本発明の単一サブユニット複合体も、清浄剤なしでは凝集又は ミセル状にあることを強く示唆している。

実施例８ 本実施例は、可溶化ｉＨＣクラス■−＾ｃｈＲのαペプチド１００−１１６複合 体の投与がＡｃｈＲ−反応性Ｔ細胞の機能を変更し、そしてこのことにより、Ｅ ＡｌＩＧ、すなわち、抗体に仲介されるがＴ細胞依存性の自己免疫疾告の経過を 調節する。

八ｃｈＲ及びＡｃｈＲペプチド トルベト　カリホルニ力（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｍａｒｉｎｅ））由来のエレ クトロプラクスＭｉ織をホモナイズし、そしてその膜分画を界面活性剤（２％の Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００．１０Ｏｎ＋ＭのＮａＣｌ、　１０ｍＭのＭＯＰＳ、 　０．１ｍＨのＥＤＴＡ。

０．０２％のＮａＮｔ）により可溶化した。抗−ＡｃｈＲモノクロナール抗体ｍ Ａｂ　３５を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーによりこの可ン容化膜 からＡｃｈＲを単離し、そして１．０％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコビラノット 　（ＯＧ）　／ＰＢＳに対し透析した。

トルベトＡｃｈＲサブユニット・ペプチド１００−１１６（ＹＡＩＶＨｌｏｏ− １１６（ＹＡＩＶＨを、標準的な手順を使用して、固相９〜フルオレニルメトキ シカルボニル（ＦＭＯＣ）手順により合成した。このペプチドを、逆相）ＩＰＬ ｃにより精製し、そしてＨＰＬＣ及び質量分析法により特徴付けした。

ラフ）ＭＨＣｎの精製及びペプチド装填ラットのクラスＩｆ　ＲＴｌ、Ｂ及びＲ Ｔｌ、０分子を、均一化した肺臓から、界面活性剤（０，５％のＮＰ−４０，１ ０ｍＭのＴｒｉｓ　ＦＩＣＩ　ｐＨ８，３，１ｗＨのＰＭＳＦ。

０．０２％のＮａＮ５）により可溶化し、そしてモノクロナール抗体ＯＸ６＆び Ｏχ７を用いたアフィニー・クロマトグラフィーにより精製した。

このｌ？Ｔ１．Ｂ／Ｄ混合物を、３７°Ｃで、２４時間、５０倍のモル数過剰の ペプチドＡｃｈＲα１００−１１６と共にインキュベートし、次に、未結合のペ プチドを除去するために、０．１％のＯＧ／ＰＢＳに対し、４°Ｃでの透析を２ ４時間行った。ニトロセルロース・フィルター結合及びＴＬＣによる分析（Ｂ、 Ｎａｇら（１９９１）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　１４２　：　１ ０５）により、１？Ｔ１．Ｂの７０〜８０％及びＲＴｌ、Ｄの９０〜１００％が ペプチドＡｃｈＲａ　１００−１１６に結合したことが明らかとなった。この複 合体は、４°Ｃで、少なくとも８遇間安定であった。

ＦＡＩ’ｌＧの誘発及び可溶化ＭＨＣＩＩ　：　ＡｃｈＲα１００　１１６によ る治療誰のＬ６ｗｉｓラット（生後８〜１２週間）に、完全ｆｒｅｕｎｄのアジ ュバント中で乳化したＴｃ　ＡｃｈＲを、両方の後ろ足に、そして腹膜中に６０ ０ｎｇの百日咳毒を注射した。病気（臨床段階１〜３）のラットを、湿った食べ 物で飼養し、そして歯を、−週間おきに切り取った。

ＡｃｈＲ免疫化後、１，４及び７日目に、個々のラットに、生理食塩水、２５μ ｇのＭＨＣＩＩ単独（ＭＨＣＩＩ　：　０）　、又は２５μｇのＴ、ｃ、Ａｃｈ Ｒｃｒペプチド１００−１１６と複合体化したＭＨＣＩＩ　（ＭＨＣＩＩ　：　 ＡｃｈＲｃｒ　１００−１１６）を、静脈中に投与した。Ｔ細胞を、ＡｃｈＲ免 疫化後９日目に日日窩のリンパ節から精製し、そして抗原のパネルに対する増殖 についてテストした。

Ｔ細胞増殖検定 末梢リンパ節由来のＴ細胞を、ナイロン・ウール・クロマトグラフィーにより単 離した。２Ｘ１０’のＴ細胞及び３Ｘ１０’の照射された同系の肺臓細胞を、０ ．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ　１６４０．１０％のＦＢＳ。

１０ＩＩＩＭのＨＥＰＥＳ、　５　Ｘｌ０−’Ｍの２−ＭＥ、１００Ｕ／ｍのペ ニシリン、１００Ｕ　／　ｍのストレプトマイシン）中で、ペプチド又は全抗原 と共に、３日間３７°Ｃ，５％ＣＯ□の下で、インキュベートし、１μＣｉのｓ Ｈ−チミジンにより１８時間、パルス照射し、そしてカウントした。

Ｌｅｗｉｓ　ラットにおけるＥＡＭＧの時間経過Ｔ、ｃ、ＡｃｈＲによる１６ｗ １ｓラツトの免疫化は、予め予期できる時間経過を伴って体重の減少及び筋肉の 弱体化の進行を引き起こす抗−ＡｃｈＲ抗体を誘導する。免疫化後−週間内の体 重の減少は、単核細胞による神経筋接合への浸潤が原因の°°急性期°′と同時 に起こる。第二の、持続性の体重減少は、３３〜４０日目に始日日、これは、ヒ ト患者における′ＩＧに似た臨床的症状を伴った“′慢性期°゛である。個々の ラットの体重の変化を、病気の始まり、進行、そして死期の範囲（横座標との交 差により示される）を説明するために示す。

段階ｌにおいては、抗−ＡｃｈＲ抗体は、ＡｃｈＲのエンドサイト−シスを引き 起こす。神経筋接合での闇値以下のレベルのＡｃｈＲは、特に後方の筋肉におい て、筋肉の収縮を減少させる。弱い背中及び後ろ足の筋肉は、特徴的なネコ背を 引き起こす０段階２においては、首の筋肉における弱さにより頭が支えられない 状態での頻繁な休眠期間を引き起こす進行した弱さを特徴とする０段１１１３に おいては、横隔膜及び肋間の筋肉が弱り、苦しみながらの呼吸を引き起こす。下 顎骨の筋肉の衰退は、過大な歯の成長を導（。

可溶化ＭＨＣＩ　：ＡｃｈＲα１００−１１６の治療的効果をテストするために 、臨床的な症状が上記の慢性期において現れた後に、ラットを治療した。

可溶化ＭＨＣＵ　：　ＡｃｈＲα１００−１１６により誘発される抗原特異的な 非応答性 生理食塩水処理ラットにおいて、Ｔｉ１ｌ胞のＡｃｈＲαペプチド１００−１１ ６に対する応答は、ＡｃｈＲ（α２βγδ）（図２１）に対する応答の３０％に 等しく、１００−１１６がＡｃｈＲに応答性のＴ細胞内の主要なエピトープであ るという文献報告を確信させるものである。ＭＨＣ：Ｏ処理ラット由来のＴ細胞 は、生理食塩水処理ラット由来のＴ細胞同じようなレベルで、それぞれの抗原に 対し応答する。

ＭＨＣＵ　：　ＡｃｈＲα１００−１１６処理ラツトの全Ｔｃ　ＡｃｈＲ及びＡ ｃｈＲａｌｏｏ−１１６に対するＴ細胞応答は、生理食塩水処理ラットのＴ細胞 増殖レベル（図２１）のそれぞれ、２２％及び２０％であった。百日咳毒に対し ての、Ｍ）ＩＣＩＩ　：ＡｃｈＲα１００−１１６処理ラツト由来のＴ細胞の増 殖は、生理食塩水及びＭ）Ｉｃ　ＩＩ　：　Ｏ処理ラット由来のＴ細胞と同じで あり、このことは、Ｔ細胞の不活性化が抗原特異的であるということを示してい る（図２１）。

可溶化ＭＨＣＩＩ　：ＡｃｈＲｃｒ　１００−１１６の治療効果臨床段階ｌのＥ ＡＭＧ　（接種後約４２〜５６日日）のラットのランダム群に、静脈中に、５週 間間隔で、生理食塩水、２５μｇのＭＨＣＩＩ　：　ＨＳＰ１８０−１８８（無 関係のヒートショ・ツクペプチドを含むｌ’ｌＨｃ　ＩＩ）　、　２５μｇのＭ ）ＩＣＩｔ単独（Ｍ）ＩＣｆｌ　：　０）　、又は５μｇのＡｃｈＲｃｒ　１０ ０　１１６単独（０：ＡｃｈＲα１００−１１６）を、注射した０体重及び臨床 的な症状を観察した。

Ｍ）ＩＣＩＩ　：　ＡｃｈＲα１００　１１６による臨床段階１のＥＡＭＧのラ ットの治療は、誘発後、１４０日目に６７％の生存率を生じさせた。これに反し 、その対照群内の最大生存率は、２０％（１６，７％の生理食塩水、０％の丁ｃ 　ＡｃｈＲａ　１００　１１６単独、２０％のＭＨＣＩＩ単独、２０％のＭＨＣ ＩＩ　：　Ｈ３Ｐ１８０−１８８）であった。それぞれの治療群における代表う ・ノドについてのＥＡＭＧの時間経過を、表４に示す。

４匹の生存ＭＨＣＵ　：ＡｃｈＲα１００−１１６処理ラントは、比較的重症の ＥＡＭＧ　（最大値２．０．２．５　、２．５及び３．０）を、その後の、最初 の治療的注射後約３週間口の緩解傾向を示した。

表４ 堕μｔＤ■トλ町敗 ＞ｏ！　６１　１２３　２２４ ＭＨＣ［１：　ＡｃｈＲα１００−１１６　２゜５　０．０　０．０ＭｌＩＣ（ １：１（Ｓｐ　１８０−１８８　３．０　３．０　死（１３８日目）ＭＨＣ［１ ・０　３．０　死（６６日目）０　：　ＡｃｈＲ１００−１１６２，５死（６６ 日目）生理食塩水　３．０　死（８２日目） そ７′１５ぞれの処理群からの代表ラットを、ＡｃｈＲ免疫化によるＥＡＭＧ誘 発後６１．１２３及び２２４日目について示す。それぞれのラットの臨床段階を 示す。１２３日目までに、上記のＭＨＣＩＩ　：ＡｃｈＲαｔｏｏ−１１６処理 ラノ１−は、ＭＨＣＥｌ　：Ｈ５Ｐ　１８０−１８８により治療された上記の長 く生存したラットに比べ、回復した動作及び姿勢を示している。

これらの結果は、ＥＡＭＧ誘発の初期に注射された可溶化ＭＩＩＣＩｔ　：Ａｃ ｈＲａ　１００−１１６複合体がＡｃｈＲｃｒペプチド１００−１１６にそして 全ＡｃｈＲに対し応答するＴ細胞を有意に減少させることを示している。

可溶化ＭＩＩＣＩＩ　：　ＡｃｈＲα１０１１１６複合体の効果は、抗原特異的 である、なせなら、この複合体は、無関係の抗原である百日咳毒に対するＴ細胞 に影響を与えないからである。ＥＡＭＧの慢性期の間の可溶化ＭＨＣＩＩ　：＾ ｃｈＲα１００−１１６複合体による治療は、この病気の死亡率及び臨床的な症 状を減少させる。

実施例９ 本実施例は、本発明の複合体が重症筋無力症（ＭＧ）に関連するヒトＴ細胞にお けるアネルギーを誘導する能力を示す。

本実験におけるＴ細胞は、若い初期ＭＧ患者の胸腺由来のものであった。それら は、残基１３８−１６７のＡｃｈＲαサブユニットを認識し、そしてＤＲ４Ｄｗ ４により制限される。本実験においては、２Ｘ１０’のＴ細胞を、各種の時間の 間、複合体（ＤＲ４：　ｐ１３８−１６７）、ＤＲ４単独、又はペプチド単独の いずれかと共に、予めインキュベートした。異なった抗原によりパルス照射され た抗原表示細胞（ＡＰＣ）を次に添加し、そしてそのＴ細胞の増殖を先に記載し たようにトリチウム含有チミジンを使用して測定した。上記の刺激性抗原は、Ｐ ２Ｓ５−’１６７及びｒ　３７−１８１と名付けられた組み換えにより製造され たＡｃｈＲαサブユニット・ポリペプチドを含み、これは、Ｂｅｅｓｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ９　：　２１０１−２１０６　（１９９０）及びＢｅｅ ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ。

１７　：　２１９−２２０（１９８９）（これらの両方が引用により本明細書中 に取り込まれる）の中に記載されているように調製された。

Ｔ細胞とｌＯμｇｍ／ｍｌの複合体との一夜の前インキュベーションは、次に抗 原を存在させたときに、このＴ細胞において非応答性を導く。

低濃度での且つより短い時間でのインキュベーションは、アネルギーを誘導する ときには、効果的でなかった。

アフルギー化細胞の生育能力を、トリバンブルーによりテストした。Ｔ！！ｌ胞 を、培地、又は５μｇ／ｍ１の複合体、及び各種時間にカウントするために取り 出された部分と共にインキュベートした。細胞を、生きているもの又は死んでい るもののどちらかとして、生存細胞におけるトリパンブルー排除に基づきカウン トした。結果を囲２２Ａ及び２２Ｂ中に表す。培地とインキュベートした細胞に おいては、細胞の全数は徐々に増加したが、一方、死細胞の数は同じに残存した 。複合体とインキュベートした細胞においては、細胞の全数は最初の６時間の間 は急激にそしてその後はよりゆっくりと減少した。

死細胞の全数は、徐々に増加したので、インキュベーション数日後には、細胞の ほとんど９０％が死滅した。これらの結果は、細胞の死がＴ細胞におけるアネル ギー誘導の結果として起こる。

上記複合体とＴ細胞との相互作用の特異性をテストするために、Ｔ細胞（Ｉ　Ｘ ＩＯ’）を、各種形態の複合体と共にインキュベートした。

これらは、関連複合体ＤＲ４：　ｐ１３８−１６７　、　ＤＲ４単独、等モル（ 比例）量であるが一緒に結合しない“可溶化ＤＲ４及び見せ掛けの（ｓｈａｍ） 　”　ｐ１３８−１６７　、並びにＤＲ４：　ＭＢＰ　Ｐ　１−１４複合体であ った。見せ掛けのペプチドを、可溶化ｐ１３８−１６７単独が上記複合体と同し 効果があることを示した先の実験のように使用した。見せ掛シナのρ１３８−１ ６７は、透析、そしてそれ故に上記複合体から放出されることができるいくつか の可溶化ペプチドの効果について制御する二上を含むような上記複合体としての 調製に供されたｐ１３８−１６７のサンプルであった。−夜の前インキュベート 後、照射ＰＢＬ（２ｘ　１０’）及び刺激性抗原を添加した。

無関係の複合体とペプチドとの等価な濃度は、アネルギーを誘導体しなかっｆ二 。培地との一夜のインキュベーション及びその後のｒｅｃα３７−１８１による 刺激は、良好な増殖応答を生しさせた。ＤＲ４：ρ１３８−１６７との前インキ ュベーションは、実質的に次の増殖を減少させた。しかしながら、他の物質のい ずれかとの前インキュベーションは、培地との前インキュベーションに比べて、 増殖に対して全く効果を及ぼさなかった。

各種の複合体との前インキュベーションの効果に加えて、各種抗体を細胞表面マ ーカーに添加する効果、又はＩＩ２０．５％をＤＲ４：Ｐ２Ｓ５−１６７　との 前インキュベーション時に添加する効果を研究した。

抗−ＴＣＲＡｂ　（抗−ＴＡＣ−７８６）の添加は、上記複合体により引き起こ されたバンクグランド刺激を抑制し、いかなる抗原誘導応答をも抑制し、そして 前インキュベーション後のＩＩ２による刺激に対する応答をも部分的に抑制した 。抗−ＤＲＡｂ（Ｌ１２３）は、複合体との前インキュベーションにより誘導体 された抗原誘導応答に対して全く効果を及ぼさなかった。抗−ＴＡＣと抗−ＯＲ との組合せは、バンクグランド増殖を減少させたが、抗原誘導増殖はＩＩ２−誘 導増殖に対して全く効果を及ぼさなかった。上記Ｔ細胞の０．５％のＩＩ２の存 在中での複合体との前インキュベーションは、その複合体の抑制効果を減少させ なかった。

同様に、上記複合体の、非−ＤＲ４、非−ＡｃｈＲＴ細胞系に対する非特異的効 果を同定するために実験を計画した。ＫＬＨ又は破傷風毒素に対して作られた系 由来の細胞（２Ｘ１０’）を、上記複合体と共に一夜、前インキュベートした。

次にそれらを、照射ＰＢＬ（２ＸＩＯ’）及び抗原により刺激を与えられた。上 記複合体との前インキュベーションは、特異的抗原に対するバックグランド増殖 応答に対するどんな効果ももっていなかった。従って、この複合体は、無関係の 細胞系に対する、どんな非特異的な刺激性の又は抑制的な効果ももっていないよ うである。

最後に、図２３Ａ及び２３Ｂは、アネルギーを誘導するのに必要な複合体のモル 濃度がペプチド単独のものよりもはるかに低いことを示している。図から分かる 通り、１．７Ｘ１０−ＩＩを超える濃度でのｐ　１３８−１６７　とのＴ細胞の 前インキュベーションは、組み換えに対する応答において残少をもたらした。低 濃度での前インキュベーションは、培地との予備インキュベーション（はるか左 ）に比べて、背景増殖における増加を引き起こした。　１．７Ｘ１０−’の濃度 に達するまでは、増殖応答は、背景レベルまで低下しなかった。

１．７Ｘ１０−”　より高い濃度でのＤＲ４：　ｐ１３８−１６７とのＴ細胞の 前インキュベーションは、抗原誘導増殖応答を抑制した。　１．７Ｘ１０−”ヲ 超よる濃、度では、この抗原誘導増殖は、ハックグランドレベルまで低下した。

使用された複合体の最も低い濃度、　１．７Ｘ１０−”　は、抗原誘導増殖にお ける増加を、背景増殖における増加を、そしてｒＬ２に対する増殖応答における 増加をもたらした。

このように、複合体及びｐ１３８−１６７単独の両方が、幾つかの刺激を引き起 こす。より高い濃度において、両者は、抗原特異的応答を抑制する。しかしなが ら、相対的な抑制（すなわち、バンクグランド刺激のレベルに対する）のために 必要なｐｔ３ｓ−１６７の量は、ＤＩ？４　：　ｐ１３８−１６７のものの約１ ０００倍（モル数）であった。

先の例中に記載した結果は、本発明の複合体がインビボにおける自己免疫疾患を 治療する能力を示している。これらのデータは、ア名ルギーの誘導を示すインビ トロにおけるデータと一緒になって、請求する複合体の効果を確立している。本 発明は、明確さと理解の目的のγこめに上記の例中で幾分詳細に記載されたが、 添付した請求項の範囲内で、特定の変更及び修正をすることができることは言う までもない。

φ Ｆ工ＧＵＲＥ　１ ＦＩＧ　２ａ。

第１世代横築 ＦＩＧＵＲＥ　３ 第２世代構築 ＦＩＧＵＲＥ　４ ＦＩＧＵＲＥ　５ ニーρ　６アルフアー コーカサストのＤＱ／ＤＲハブロタイブゝ１巳騙ｊ”　ＪＬ　囚社　囚Ｍ１　− １編　隠思　ユ　関遭陣害４Ｙ″　Ｅ：暮：：：　：’；　：：　１　ｗ　−ｗ 　−１）　ｍｏｖ（ｌｌＪｍ（’ｌｆｋゝ：　”　ｌ：：　：　：　：：：※　 ミｉ：　三　；ｑ　−−−−−・・豐　マ　−像・ｌ　Ｗａ ＋１．　１１　＋＠（ｗ）ｌ　ｊ、１　１　１　ｍ　５１　ｗｌＪ　の０１＋ｌ ’ｐｌ　（多数）、ａａＱ多ｔｊｌ、ｃｘｓＩ！、　６５　−傳＊ｌ　Ｗ＠　？ 　＠　ｗｒ　カ　−１５：：、　ＩＩ　（：：：：：；　：：：　“Ｕ８　川１ １−−・ｗｌｌ（１１ｊＯｕ　−勧 ＦＩＧＬ＋ＲＥ　１０ ＦＩＧＵＲＥ　１１ ＮＰ−４０可溶性膜抽出物の調製 土浦液 （総タシバク質−１！１４３　ｍｔｌ ↓ Ｆ工ＧＵＲＥ　１３　Ａ １−Ａ″″の精製 ↓ （４℃で一夜循環） ↓ １０容因の０．５％のＤＯＣバッファーｐｔ（で洗浄↓ ↓ 各１ｍｌの画分とＩＭの酢酸１２ｕ１で中和↓ プールしたピークを真窄透析で濃縮（５〜１０１品）↓ 総Ｉ・Ａｋ　＝　２００−３００μｇ（５刈０９牌臓細胞より）１０％のＰＡＧ Ｅ、それに続く銀染色で分析ＦＩＧＵＲＥ　１４ Ｉ−Ａ”の−次元ポリアクリルアミドゲル分析ＦＩＧＵＲＥ　１５ ＩＡＫ＋ＭＢＰ　（１−１３）による増殖の阻害インビボＥＡＥ インビボＥＡＥ 日数 Ｆ工ＧＵＲＥ　１８ 日数 日数 ワｒｆ＆’７ 画分 Ｆｉｇ、　２０ Ｆｉｇ、　２１ （千） 培地を伴うインキュベーション時間 ＋総細胞数　−一死細胞数 （千） ＯＲ４：　ｐ　１３Ｂ−１６７を伴うインキュベーション−総細胞数　−死細胞 数 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ５，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、Ｍ Ｇ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ （７２）発明者　ラーチ、パーナート　エル。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４３０３゜パロアルト、コリナ　ウェイ　 ３８８９

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構成 され、ここでこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位と連結されている、実質的 に純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体。
2. ２．前記のペプチドが前記の抗原結合部位に非共有的に連結している、請求項１ に記載の複合体。
3. ３．前記ＭＨＣ成分が可溶性である、請求項１に記載の複合体。
4. ４．前記ペプチドが約８〜約１８個のアミノ酸である、請求項１に記載の複合体 。
5. ５．前記ペプチドが自己免疫障害に関連する自己抗原性ペプチドである請求項１ に記載の複合体。
6. ６．前記ペプチド上のエピトープが、多発性硬化症、リウマチ型関節炎又は重症 筋無力症に関連する自己反応性Ｔ細胞である、請求項１に記載の複合体。
7. ７．前記ペプチドが、ヒトＡｃｈＲαサブユニットのうちの残基１３８〜１６７ 、ヒトＭＢＰのうちの残基８４〜１０２、又はヒトＭＢＰのうちの残基１４８〜 １６２を含んで成る、請求項１に記載の複合体。
8. ８．前記ＭＨＣ成分がクラスＩＩＭＨＣである、請求項１に記載の複合体。
9. ９．前記ＭＨＣ成分がヒトＢリンパ繊維芽細胞より単離されたものである、請求 項１に記載の複合体。
10. １０．薬理学的に許容される担体及び請求項１に記載のＭＨＣ−ペプチド複合体 を含んで成る薬理組成物。
11. １１．前記複合体がリポソームの中に包埋されている、請求項１０に記載の薬理 組成物。
12. １２．前記複合体が炭水化物成分を実質的に有さない、請求項１０に記載の薬理 組成物。
13. １３．前記複合体の濃度が約０．０２重量％〜約１重量％である、請求項１０に 記載の薬理組成物。
14. １４．前記薬理学的に許容される担体がリン酸緩衝食塩水である、請求項１０に 記載の薬理組成物。
15. １５．哺乳類における標的Ｔ細胞におけるアネルギーを誘発せしめる方法であっ て、哺乳類に、抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本 質的に構成され、ここでこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位に連結されてい る複合体を治療的に有効な投与量で投与することを含んで成る方法。
16. １６．前記ＭＨＣ成分がクラスＩＩＭＨＣである、請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記複合体が脂質膜の中に包埋されている請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記標的Ｔ細胞が自己免疫障害に関連している請求項１５に記載の方法。
19. １９．前記自己免疫障害が多発性硬化症、リウマチ型関節炎又は重症筋無力症で ある、請求項１５に記載の方法。
20. ２０．哺乳類における自己免疫障害を処置する方法であって、哺乳類に、薬理学 的に許容される担体、及び自己抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する単離ＭＨ Ｃ成分とより本質的に構成され、ここでこの抗原性ペプチドがこの抗原結合部位 に連結されている純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成る薬理組成物を治療 的に有効な量で投与することを含んで成る方法。
21. ２１．前記薬理組成物を静脈内投与する、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記の有効投与量が、体重のｋｇ当り約０．０１５μｇのＭＨＣ−ペプチ ド複合体〜体重のｋｇ当り約１５μｇのＭＨＣ−ペプチド複合体である、請求項 ２０に記載の方法。
23. ２３．前記の有効投与量が、体重のｋｇ当り約０．１５μｇのＭＨＣ−ペプチド 複合体〜体重のｋｇ当り約１０μｇのＭＨＣ−ペプチド複合体である、請求項２ ０に記載の方法。
24. ２４．自己免疫障害がリウマチ型関節炎又は多発性硬化症である、請求項２０に 記載の方法。
25. ２５．抗原性ペプチドと抗原結合部位を有する単離ＭＨＣ成分とより本質的に構 成される複合体を製造するための方法であって：前記ＭＨＣ成分を生産する細胞 からこの成分を単離し；このＭＨＣ成分をペプチドと接触させてこのペプチドが その抗原結合部位と結合するようにさせ；そして この抗原結合部位に結合していない過剰のペプチドを除去すること、 を含んで成る方法。
26. ２６．前記の過剰なペプチドを除去する段階を、限外濾過で行う、請求項２５に 記載の方法。
27. ２７．前記の複合体を脂質の存在下で透析してリポソームを形成する段階を更に 含んで成る、請求項２５に記載の方法。
28. ２８．前記のペプチドが前記の抗原結合部位に非共有結合している、請求項２５ に記載の方法。
29. ２９．前記のＭＨＣ成分が主要組織適合性複合体のクラスＩＩ糖タンパク質であ る、請求項２５に記載の方法。
30. ３０．前記ペプチドがＭＢＰのうちのアミノ酸１〜１４を含んで成る、請求項２ ５に記載の方法。