WO1997018232A2 - Peptides derives de la proteine oncogene bcr-abl exprimes par des cellules leucemiques et leur utilisation pour la therapie des leucemies humaines - Google Patents

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WO1997018232A2
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Pierre Langlade-Demoyen
Jean-Pierre Abastado
Philippe Kourilsky
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Institut Pasteur
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Definitions

  • the invention relates to the immunotherapy of leukemias associated with the Phi translocation, in particular chronic myeloid leukemias (CML) and acute lymphoblastic leukemias. It relates to new peptides derived from the oncogenic protein BCR-ABL expressed by leukemia cells and their uses.
  • CML chronic myeloid leukemias
  • BCR-ABL oncogenic protein BCR-ABL expressed by leukemia cells and their uses.
  • DNA damage is a common feature of malignant changes.
  • the immune system functioning normally by distinguishing the "self” from the "non-self", any protein resulting from the expression of an altered DNA will present a sequence foreign to the organism and will therefore be a potential immunogen (neoepitope ).
  • Knowledge of the sequence of genes involved in cancerization processes offers the possibility of verifying whether the corresponding proteins, or some of their peptides, are immunogenic for the host, and therefore, potentially useful for immunotherapy protocols.
  • Chronic myeloid leukemia (CML) is a typical example of malignant transformation linked to DNA damage.
  • the coding regions of BCR-ABL are fused in phase and are transcribed into an mRNA coding for a functional chimeric protein of 190 or 210 kDa, consisting of 1004 amino acids originating from ABL and, according to the BCR cleavage site, of 902 or 927 amino acids, encoded by this gene.
  • a functional chimeric protein of 190 or 210 kDa consisting of 1004 amino acids originating from ABL and, according to the BCR cleavage site, of 902 or 927 amino acids, encoded by this gene.
  • Each of these two protein forms has a protein kinase enzyme activity (8,9).
  • T helper helper T cells
  • CTL cytotoxic lymphocytes
  • CTLs are indeed powerful cellular effectors of the immune system, which, when effectively induced by a tumor-specific antigen, can cause long-term protective immunity.
  • the CTLs recognize peptides of 8 to 14 amino acids presented on the surface of the cell in association with molecules of class I of the Major Histocompatibility Complex (MHC), after having undergone an intracellular maturation (15).
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • MHC peptide / molecule complex is present IN VIVO on the surface of cancer cells, in sufficient quantities to allow specific T cells to recognize these cells.
  • T cell clones capable of recognizing the peptide / MHC molecule complex on tumor cells, for the peptide to be presented under conditions which allow the induction of these clones. specific and that there is no cross-reactivity with normal cells of the organism.
  • junction zone between BCR and ABL codes for a part of p210 which is foreign to the normal organism, it is a preferred candidate for constituting an antigen specific for SMCs.
  • Several studies have therefore targeted the potentials offered by this region, without however being able to demonstrate that particular antigens of this region were presented IN VIVO by leukemic cells nor to demonstrate a response of specific human CTL to the against cells expressing these antigens.
  • previous work carried out in mice has shown that several peptides selected on the junction zone, were immunogenic, the most interesting being a neoepitope constituted by 6 amino acids of BCR, a fusion amino acid and 5 amino acids of ABL (16).
  • T helper helper T cell response
  • cytotoxic T lymphocytes which are capable of specifically recognizing malignant cells, present in patients suffering from leukemia and which can therefore be used IN VIVO to treat leukemia.
  • two particular peptide fragments of BCR-ABL are capable of binding to HLA B8 molecules on the surface of human presenting cells. The potential of these sequences to induce a tumor-specific T response has not, however, been analyzed.
  • the authors of the present invention have sought to identify antigenic peptides presented by HLA class I molecules on the surface of cells of patients with CML, which are specifically recognized by cytotoxic T lymphocytes. These have now demonstrated that peptides derived from the BCR-ABL junction zone were capable of binding to HLA-A2.1 molecules and of inducing, from normal peripheral blood lymphocytes (PBL) or leukemia patients, restricted HLA-A2.1 CTLs. Surprisingly, the inventors have also shown that these CTLs thus activated can lyse HLA-A2.1 tumor cells expressing p210, thus demonstrating the existence of a common epitope between these peptides. individuals and antigens expressed by leukemia cells.
  • the present invention therefore aims to provide means for the prevention or therapy of human leukemias associated with the BCR-ABL translocation.
  • the subject of the invention is peptides which comprise an amino acid sequence chosen from the following sequences:
  • KQSSKALQRPV (residue 924 to 934 of p210), or any sequence derived from one of the preceding ones, capable of inducing a response of human HLA-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL) specifically directed against cells expressing the BCR-ABL fusion protein (p210).
  • the term “derivative” designates any sequence obtained by mutation, deletion, substitution or chemical modification of one or more amino acids, as well as any isoform sequence, that is to say a sequence identical to one of the four sequences SEQ ID n '1 to 4, containing one or more residues, in the form of D-enantiomer
  • These peptides according to the invention can in particular be prepared by conventional chemical synthesis or by any other synthesis technique known to those skilled in the art, including genetic engineering techniques.
  • the peptides according to the invention are capable of inducing a response of CD8 "T lymphocytes, restricted by HLA class I antigens, in particular HLA-A2.1 antigens.
  • a limit to immunotherapy based on a T cell response directed against specific antigens is linked to the phenomenon of restriction by the molecules of the major histocompatibility complex. Indeed, for a given antigen, the epitopes which will be presented to the T cells and / or the effectiveness of this presentation by the HLA molecules of the presenting cells, will be dependent on the HLA typing of these presenting cells. It is therefore conceivable that peptides which can be effectively presented by a commonly encountered HLA molecule will be of particular interest from a therapeutic point of view, since they will be able to trigger a response of restricted T lymphocytes in a majority of individuals.
  • the HLA-A2 allele is precisely one of the most frequent HLA class I antigens, especially among Caucasoid populations. This allele is in fact expressed in more than 50% of individuals, among which at least 90% have the HLA-A2.1 motif. Therefore, any tumor antigen capable of binding to HLA-A2.1 molecules and of generating a specific T response, will constitute a new therapeutic approach for specific anti-tumor immunization, applicable in a large number of patients .
  • the peptides of the invention also have the particularity of not containing the "canonical” motif as described by Ramensee et al. (21), which is generally Lately present in peptide sequences capable of binding to HLA-A2.1 molecules.
  • This motif within a peptide is generally considered to be an indicator of the ability of this peptide to bind to the HLA- molecule.
  • the property of the peptides according to the invention to bind to HLA-A2.1 molecules and to provoke a specific T lymphocyte response therefore constitutes a surprising result compared to the knowledge of a person skilled in the art on the subject.
  • the peptides according to the invention have at least one common epitope with antigens specifically expressed by leukemic cells having the translocation Phi, said epitope being capable of being specifically recognized by human cytotoxic T lymphocytes and / or to induce a response of human cytotoxic T lymphocytes.
  • this characteristic corresponds to one of the particularly important criteria which a peptide derived from an oncogenic molecule must satisfy in order to be qualified as a potentially immunotherapeutic agent.
  • cells specifically activated IN VITRO by such an epitope will also be able to recognize IN VIVO this same epitope on the surface of cancer cells.
  • the invention also relates to a method for obtaining a population of human cytotoxic T lymphocytes (CTL) capable of specifically lysing cells expressing the BCR-ABL fusion protein, characterized in that:
  • Human lymphocytes from peripheral blood are cultivated, preferably enriched in CD8 * T lymphocytes, in a medium containing a effective amount of at least one peptide as defined above, and of presenting cells capable of presenting to T lymphocytes the said peptide (s) in association with their HLA class I molecules, and - the number and the specificity of
  • the populations of human CTLs obtained by the above method also form part of the invention.
  • CTLs are advantageously capable of specifically lysing leukemia cells possessing the BCR-ABL translocation, and more particularly leukemia cells of an HLA-A2.1 patient.
  • the invention also relates to the use of at least one of the peptides as described above or of CTLs specifically recognizing these peptides, for the manufacture of pharmaceutical compositions for the treatment or prevention of leukemias associated with BCR-ABL translocation .
  • compositions comprising at least one peptide as defined above as active principle, with any pharmaceutically acceptable vehicle, adjuvant, excipient or diluent, also form part of the invention.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle, adjuvant, excipient or diluent also form part of the invention.
  • it is associated with a lipid, in the form of a lipopeptide, grafted to a carrier molecule (carrier) according to methods used in known immunization protocols , or inserted in any non-replicative system (tetanus toxoid for example).
  • compositions comprise as active principle at least one peptide according to the invention associated with HLA class I molecules, said peptide being capable of being specific. only recognized by CTLs restricted by the HLA molecules with which it is associated.
  • At least one of the peptides of the invention is associated with HLA class I molecules expressed on the surface of human HLA non-tumor cells compatible with CTL capable of specifically recognizing it.
  • these human cells are autologous presenting cells of said CTLs.
  • the association of the peptide with the HLA molecules of the presenting cells can be carried out by the "stripping" method described by Langlade-Demoyen et al. (22) which makes it possible to obtain a higher density of peptide associated with the HLA molecules on the surface of the presenting cells.
  • the cells presenting the peptide are for example "professional" presenting cells, such as dendritic cells, or other types of cells such as spleen cells or B lymphocytes.
  • the cells presenting the peptide may also be drosophila cells in culture, transfected with the genes of the HLA molecules, as described in application WO-A-93 17 095 published on September 2, 1993.
  • the peptides in the compositions according to the invention are associated with soluble HLA molecules fixed on synthetic biocompatible and bioassimilable supports. These supports are for example constituted by plastic beads or other bioassimilable polymer on which the extracytoplasmic regions are fixed. HLA molecules.
  • the peptides can also be associated with HLA molecules anchored in synthetic supports of the "pseudo-membrane" type, such as in particular liposomes and any other model membrane system known to those skilled in the art.
  • the typing of the HLA molecules associated with the peptides is compatible with that of the patient for whom they are intended.
  • compositions for the treatment or prevention of leukemias associated with BCR-ABL translocation comprising as active principle human CTLs CD8 * which specifically recognize at least one peptide derived from the junction region of the BCR-ABL protein comprising one of the amino acid sequences n '1 to 4 or derived, as previously defined.
  • the CTLs of said compositions are HLA compatible with the cells of the patient for whom these compositions are intended and are restricted by an HLA allele class I of said patient capable of associating with at least one peptide specific for BCR-ABL.
  • these CTLs are autologous cells of the patient.
  • compositions can be administered according to several modes of administration, which a person skilled in the art can determine according to the type of composition concerned.
  • compositions comprising a peptide as active ingredient can be administered systemically, preferably intravenously, intramuscularly, intradermally or orally.
  • compositions comprising CTL as active ingredient are preferably administered by the intravenous or intraperitoneal route.
  • Another type of composition also subject of the present invention, comprises, as active principle, "mini-genes", composed of the nucleotide sequences coding for at least one peptide having one of the amino acid sequences n '1 to 4 or a sequence derivative, placed under the control of signals necessary for the expression of the corresponding peptide (s).
  • the nucleotide sequences are inserted into an expression vector to be expressed in a cell host, the choice of the expression vector being a function of the cell host used.
  • the cell host is chosen from the cells of the patient to whom the composition is to be administered.
  • these cells are lymphocyte or myeloid cells.
  • the expression vector is chosen in this case from the vectors used, for example, in methods of gene therapy when a specific nucleotide sequence is integrated into the genetic material of a cell to compensate for a defect or dysfunction.
  • a specific nucleotide sequence is integrated into the genetic material of a cell to compensate for a defect or dysfunction.
  • particular genetic gene or among viral systems in general used in vaccination protocols (vaccinia, canarypox, etc.).
  • compositions can be administered according to the modes of administration used for vaccine preparations (subcutaneous, intramuscular, oral, nasal, etc.).
  • the cell host used is a bacteria naturally present in the body, such as E. coli as well as bacteria of the BCG type, or salmonella, etc.
  • the expression vector is in this case a prokaryotic expression vector, obtained from commercially available plasmids and commonly used by those skilled in the art in techniques of genetic recombination of bacteria.
  • the administrator tion of these compositions is preferably done subcutaneously, this type of administration is not, however, exclusive.
  • the nucleotide sequences contained in the compositions according to the invention are in the form of "naked" DNA, that is to say that they are inserted into sequences of plasmid type containing the elements of regulation necessary for their expression. These sequences are in solution in an injectable saline medium, in particular in the muscle or the skin, by appropriate means of administration.
  • compositions covered by the present invention can be used in combination with other pharmaceutical compositions, administered simultaneously or sequentially, with a view to adding or synergizing the effects produced therapeutically.
  • these additional compositions contain activators of T lymphocytes, such as IL2, IL7, IL12, IL12, interferon, etc.
  • the invention thus makes it possible to carry out a method of therapeutic treatment comprising the administration of at least one of the pharmaceutical compositions as previously described to a patient suffering from leukemia associated with the BCR-ABL translocation.
  • the optimal modes of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a therapeutic treatment adapted to a patient, such as, for example, the patient's age or body weight. , the severity of his general condition, the tolerance to treatment and the side effects observed, etc.
  • the peptides according to the present invention are also useful for applications in the field of IN VITRO diagnosis of leukemias associated with BCR-ABL translocation. They can in particular be used in IN VITRO tests based on reactivity of specific CTLs to diagnose CML or to follow the evolution of the response of specific CTLs during a therapeutic treatment of leukemia associated with BCR- translocation.
  • a preferred variant consists in searching for CTLs specific for cells expressing BCR-ABL in a patient according to the steps consisting in:
  • the HLA molecules presenting the peptide are advantageously expressed on the surface of HLA cells compatible with the patient's T lymphocytes. These are preferably normal or leukemic autologous cells of the patient, and more particularly cells expressing HLA-A2.1 molecules on their surface.
  • the PBLs tested can be enriched in T cells prior to their cultivation in the presence of the peptide of the invention, for example by a positive selection of CD ⁇ * cells according to methods used routinely by the skilled person.
  • the presenting cells Prior to their cultivation with the patient's lymphocytes for which specific CTLs are sought, are advantageously loaded with specific peptide, for example according to the "stripping" method described by Langlade-Demoyen (22).
  • the immunoreactivity of the CTLs sought is evaluated for example by an increase in the production of factors specifically produced by activated T lymphocytes (IL2, TNF, etc.). This production of factors is for example measured by methods such as ELISA or PCR.
  • the cytotoxicity of the CTLs towards the target cells having on their surface the specific peptide associated with their HLA class I molecules is evaluated as a function of the amount of chromium 51 Cr released by these cells during their lysis, a commonly used method. used in cellular immunology. Also conventionally used by those skilled in the art, short-term mixed cell culture methods and techniques based on ELISA or PCR.
  • the effectiveness of the peptides described in Table I to stabilize the HLA-A2.1 molecules expressed on the surface of T2 cells is studied as described below in Materials and Methods.
  • the mean fluorescence observed using an anti-HLA-A monoclonal antibody (W6 / 32) is expressed in arbitrary units.
  • Antigen-specific CTLs from ten HLA-A2.1 positive patients were induced and cultured. After three stimulation cycles with autologous cells loaded with peptide as stimulators, the reactivity of the CTLs against T2 cells loaded with peptide was evaluated. The percentage of specific lysis is indicated for two effector / target cell ratios of 30/1 (white bars) and 10/1 (gray bars).
  • Unmarked (cold) target cells were added at different concentrations ranging from
  • the cold target cells were covered with BCR-ABL peptide or with a peptide from the influenza virus used as a control, known for its ability to bind to the molecule HLA-A2.1 (flu).
  • the PBLs are recovered after 20 minutes of centrifugation on a Ficoll Paque solution at 600 g (Pharmacia Uppsala, Sweden) at room temperature. All cells are kept in liquid nitrogen. Cell viability and lymphocyte functions are preserved.
  • T2 cells are cultured for 48 hours at 26 ° C in a serum-free medium. 3.10 5 cells are then placed at 37 'for 15 hours in the presence of 20 ⁇ M of the peptide tested.
  • the expression of HLA- A2.1 is then measured by flow cytometry using the W6 / 32 monoclonal antibody directed against the set of molecules HLA-A (23) and a cytofluorometer from the brand Becton Dickinson.
  • the peptide is loaded on the surface of the presenting cells is carried out in 0.5 ml of loading buffer ("stripping buffer") containing: 0.13M citric acid, Na 2 HP0 4 66 mM, 150 mM NaCl and phenol red at 17 mg / ml according to the protocol described by Langlade-Demoyen et al. (22).
  • loading buffer 0.13M citric acid, Na 2 HP0 4 66 mM, 150 mM NaCl and phenol red at 17 mg / ml according to the protocol described by Langlade-Demoyen et al. (22).
  • CTL induction is carried out as previously described (22, 27). Briefly, the PBLs from healthy donors or from HLA-A2.1 patients with CML are collected by gentle centrifugation at the interface of an Easter Ficoll, the cells are washed and then incubated either with concanavalin A and 1 ' Recombinant IL-2 to obtain activated T lymphblasts, either with the bacterium Staphylococcus aureus Cowan I,
  • lymphoblasts are then subjected to the "stripping peptide" method as described previously and recharged with BCR-ABL peptides according to the invention.
  • the peptide-loaded lymphoblasts are irradiated and placed in the presence of PBL enriched in CD8 + lymphocytes from the same donor in a culture medium for T cells containing IL-2 recombinant (10 U / ml) of IL1- ⁇ (5 U / ml) and of recombinant IL-7 (20 U / ml).
  • IL-2 recombinant 10 U / ml
  • IL1- ⁇ 5 U / ml
  • IL-7 20 U / ml
  • the T cells are then maintained by weekly restimulations with autologous monocytes loaded with peptides and recombinant IL-2 (10 U / ml) and IL-7 (10 U / ml).
  • CML Cell-mediated cytolytic activity
  • K562 cells transfected with HLA-A2.1 or T2 cells are loaded for 6 h with a peptide at a concentration of 100 ⁇ g / ml. The cells are then washed to remove the unbound peptide. Before incubation with the labeled target cells, the effector cells are incubated with a serial dilution of unlabeled competitor cells for 2 h at 37 ° C. The supernatant is recovered after 4 h of incubation at 37 '.
  • LDA Limit dilution method
  • the relative frequencies of CTL precursors (CTL P ) specific for BCR-ABL are determined for different lymphocyte populations by limit dilution analysis.
  • the cytotoxicity of samples containing between 50 and 10,000 lymphocytes is evaluated on target cells labeled with 51 Cr in a final volume of 200 ⁇ l. Each dilution tested is replicated in 24 wells. The supernatants are removed after 9 h of incubation at 37 ° C. A well is considered positive if the release of 51 Cr exceeds by 3 standard deviations the average of the control wells containing the target cells alone.
  • the frequency of effector cells is estimated by a Poisson distribution analysis (24,25).
  • EXAMPLE 1 Synthetic peptides corresponding to the BCR-ABL junction zone of the p210 protein stabilize the HLA-A.2.1 thermolabile molecules of T2 cells.
  • T2 cells are deficient in genes coding for transporters of TAPI and TAP2 peptides (26). As a result, they have a surface expression of MHC class I molecules which is reduced at a temperature of 37 ° C. The expression of MHC class I endogenous to the cell surface can be restored by culturing at 26 ° C, but these molecules are thermolabile as they are not stabilized by the binding of an exogenous peptide. Using this assay, 4 of the 7 peptides tested were found to be capable of inducing significant stabilization of the HLA-A2.1 molecules on the cell surface (FIG. 1).
  • PBLs were taken from 10 HLA-A2.1 patients with CML. Five of these ten samples (2,5,8,9,10) were able to generate specific CTLs against the peptide p926-934 after a second stimulation cycle, using a) autologous blast cells loaded with peptide according to the stripping method previously described for the initial simulation and b) autologous adherent cells for the second stimulation. For four other patients (1,3,4,7), several additional stimulation cycles were necessary to detect a specific CTL activity, suggesting that the frequency of precursors
  • Specific circulating CTLs can be detected in three out of ten patients.
  • Limit dilution analyzes have been performed to quantify specific circulating CTLs in patients with CML. A high frequency of specific CTL was found in several patients (3 out of 10). These CTLs were able to lyse T2 cells coated with the P926 / 934 peptide as well as K562 HLA-A2.1 cells (Table II).
  • CTL. CTL Frequency of precursor CTL (CTL.,) In patients with CML and in healthy donors.
  • the BCL-ABL specific CTLs are obtained by microcultures under limiting dilution conditions and detected by a 51 Cr release test by T cells after 18 hours.
  • the CTL p are counted after 10 days of culture. * ND: not detectable DISCUSSION
  • the present results demonstrate that the same specific reactivity of CTL towards a peptide of the BCR-ABL junction region can be observed in certain patients with CML and that a specific response of CTL CD8 + can be observed IN VITRO from PBL from healthy donors and patients with CML.
  • This T cell response is specifically directed against a peptide of the junction region comprising 9 to 12 amino acid residues capable of binding IN VITRO to the HLA-A2.1 molecule.
  • None of the peptides according to the invention shows the specific canonical motif of the HLA-A2.1 molecule. This therefore shows that a search for antigenic peptides should not be limited to only peptides which have this canonical motif.
  • the protein BCR-ABL (p210) can undergo a process of maturation by tumor cells
  • the most immunogenic peptide is a neopeptide composed of 2 amino acids from BCR, an amino acid from the fusion region and six amino acids from ABL.
  • Adoptive transfer therapy should therefore be selective in order to minimize the likelihood of autoimmune toxicity.
  • the destruction of the malignant clones should not affect normal hematopoiesis, since normal precursors of the bone marrow normally coexist with the malignant clones in the bone marrow of leukemia patients.
  • the BCR-ABL peptides according to the invention are preferred candidates for vaccination and immunotherapy adoptive from T cells is that unlike other translocations associated with other pathologies, the BCR-ABL protein is a common antigen in 95% of patients with CML and 15% of patients with lymphoblastic leukemia acute (15).
  • the BCR-ABL protein is intimately associated with malignant transformation as well as with the maintenance of the malignant phenotype (30,31).
  • Patients with CML undergo monoclonal extension of a single aberrant pluripotent cell (32) and it is likely that the BCR-ABL protein is present in the earliest malignant progenitor (31,32). It is only very rarely that CML cells positive for Phi translocation become PHI negative and it is also very rare that CML Phi positive cells lose detectable transcrips during the progression of the disease (33).
  • negative variants for the antigen which could grow following immunization should not have a malignant phenotype.
  • T cells in CML are almost always Phi negative, at least during the chronic phase.
  • an expansion of specific CTLs with respect to the IN VITRO tumor and reinjection into patients with CML combined with specific vaccination with a minimum essential epitope can be envisaged.
  • the properties described for the present invention can be applied to the evaluation immunogenicity of the same BCR-ABL junction region in other individuals carrying HLA alleles and proteins expressed by other genes having undergone translocation commonly associated with leukemias and lymphomas.
  • Antigenic peptides such as those of the present invention can be useful for developing IN VIVO and / or EX VIVO immunotherapy protocols.

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Abstract

Cette invention a pour objet des peptides capables d'induire une réponse de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) humains spécifiquement dirigée contre des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL.

Description

Peptides dérivés de la protéine oncogène BCR-ABL exprimés par des cellules leucémiques et leur utilisa¬ tion pour la thérapie des leucémies humaines
L'invention se rapporte à l'immunothérapie des leucémies associées à la translocation Phi, notamment les leucémies myéloïdes chroniques (CML) et les leucémies lymphoblastiques aiguës. Elle concerne de nouveaux peptides dérivés de la protéine oncogène BCR-ABL exprimée par les cellules leucémiques et leurs utilisations.
Les altérations de l'ADN sont une caractéris¬ tique fréquente des transformations malignes. Le système immunitaire fonctionnant normalement en distinguant le "soi" du "non-soi", toute protéine résultant de l'expres¬ sion d'un ADN altéré présentera une séquence étrangère à l'organisme et sera de ce fait un immunogène potentiel (néoépitope) . La connaissance de la séquence des gènes impliqués dans les processus de cancérisation, offre la possibilité de vérifier si les protéines correspondantes, ou certains de leurs peptides, sont immunogéniques pour l'hôte, et donc, potentiellement utiles pour des protoco¬ les d'immunothérapie. Les leucémies myéloïdes chroniques (CML) sont un exemple type de transformation maligne liée à une altération de l'ADN. Celles-ci sont associées dans plus de 95 % des cas (1) à la présence d'un marqueur chromoso¬ mique, le chromosome Philadelphia (Phi) , qui est le résultat de deux coupures sur les chromosomes 9 et 22, avec une translocation réciproque des deux fragments distaux respectifs, t(9 ; 22) (q34 ; qil) .
De nombreuses données soutiennent aujourd'hui l'idée que la translocation Phi se produit chez des cellules souches pluripotentes, et on a pu montrer que des cellules appartenant à différentes lignées hémato- poïétiques possédaient le chromosome Philadelphia durant la phase chronique de la maladie. La translocation du protooncogène ABL porté par le chromosome 9 sur la région de coupure ("Breakpoint cluster région" ou BCR) du chromosome 22, forme un gène de fusion dénommé BCR-ABL (2,7) . Il résulte de cette fusion une altération dans la structure et une activation de l'oncogène ABL qui code pour une tyrosine kinase. La coupure au niveau de BCR peut se produire à deux en¬ droits: soit entre les exons 2 et 3, soit entre les exons 3 et 4. L'ARN messager (ARNm) correspondant aura alors une taille différente, en fonction de la présence ou l'absence dans sa séquence de celle correspondant à 1 ' exon 3.
Quel que soit le lieu de coupure, les régions codantes de BCR-ABL sont fusionnées en phase et sont transcrites en un ARNm codant pour une protéine chiméri¬ que fonctionnelle de 190 ou 210 kDa, constituée de 1004 acides aminés provenant de ABL et, selon le site de coupure BCR, de 902 ou 927 acides aminés, codés par ce gène. Chacune de ces deux formes proteiques présente une activité enzymatique de protéine kinase (8,9) .
On a pu montrer dans des modèles animaux de leucémie, que les lymphocytes T auxiliaires (T helper) et les lymphocytes cytotoxiques (CTL) (10,11) pouvaient participer à la réaction de rejet de tumeur. Ceci a été notamment observé dans le cas de tumeurs induites par le virus de la leucémie murine (MuLV) . Par ailleurs, des expériences in vivo ont également montré que des antigè- nés de MuLV exprimés par des fibroblastes transfectés, étaient capables de provoquer une immunité tumorale et de permettre un rejet accéléré de la tumeur (12) . Enfin, également chez la souris, on a mis en évidence qu'un transfert adoptif de CTL reconnaissant spécifiquement des antigènes associés à des leucémies codés par des rétrovi- rus permettaient d'éradiquer des leucémies disséminées (13,14) .
L'absence d'antigènes bien caractérisés dans des leucémies humaines, qui soient en outre uniquement exprimés sur les cellules malignes et reconnaissables par des cellules T spécifiques, a jusqu'à présent limité le développement de thérapies basées sur des réactions de lymphocytes T dirigées contre les cellules tumorales.
Or, compte tenu des potentialités des cellules du système immunitaire, il est indéniable que la mise au point de nouvelles méthodes immunothérapeuti¬ ques utilisant des populations de lymphocytes spécifiques constituerait un progrès important pour la thérapie anti- cancéreuse. Les CTL sont en effet de puissants effecteurs cellulaires du système immunitaire, qui, lorsqu'ils sont efficacement induits par un antigène spécifique d'une tumeur, peuvent provoquer une immunité protectrice à long terme. Les CTL reconnaissent des peptides de 8 à 14 acides aminés présentés à la surface de la cellule en association avec les molécules de classe I du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH), après avoir subi une maturation intracellulaire (15) .
Plusieurs critères doivent être pris en compte pour qualifier d'agent potentiellement immuno- thérapeutique un peptide dérivé du produit d'un protoon- cogène particulier.
On peut vérifier tout d'abord que, non seulement le peptide est capable de se fixer à une molécule de classe I ou II du CMH, mais également qu'il possède des propriétés immunogeniques, car la fixation d'un antigène sur des molécules du CMH n'implique pas nécessairement l'effet immunogène spécifique recherché.
Il est en outre particulièrement important que le complexe peptide/molécule du CMH soit présent IN VIVO à la surface des cellules cancéreuses, et ceci en quantités suffisantes pour permettre à des lymphocytes T spécifiques de reconnaître ces cellules.
Il est enfin nécessaire que le répertoire T des patients permette l'émergence de clones de cellules T capables de reconnaître le complexe peptide/molécule du CMH sur les cellules tumorales, que le peptide soit présenté dans des conditions qui permettent l'induction de ces clones spécifiques et qu'il n'existe aucune réactivité croisée avec des cellules normales de l'orga¬ nisme.
La CML et l'expression de la protéine BCR-ABL (p210) qui lui est associée, constituent un exemple caractéristique d'antigène spécifique de tumeur dans le système hématopoïétique. L'expression de la protéine p210 constituant un marqueur des cellules ayant subi la translocation, une mise en évidence d'antigènes de p210 exprimés uniquement à la surface des cellules leucémiques et capables d'induire une réponse cellulaire T cytotoxi- que, offre donc une nouvelle approche pour traiter cette pathologie.
Compte tenu du fait que la zone de jonction entre BCR et ABL code pour une partie de p210 qui est étrangère à l'organisme normal, celle-ci est un candidat privilégié pour constituer un antigène spécifique des CML. Plusieurs études ont de ce fait ciblé les potentia¬ lités offertes par cette région, sans pouvoir toutefois démontrer que des antigènes particuliers de cette région étaient présentés IN VIVO par les cellules leucémiques ni mettre en évidence une réponse de CTL humains spécifi¬ ques à l' encontre des cellules exprimant ces antigènes. Ainsi, des travaux antérieurs réalisés chez la souris ont montré que plusieurs peptides sélectionnés sur la zone de jonction, étaient immunogènes, le plus intéressant étant un néoépitope constitué par 6 acides aminés de BCR, un acide aminé de fusion et 5 acides aminés de ABL (16) . D'autres études antérieures ont également établi que ces peptides pouvaient provoquer des réponses anticorps dirigées contre BCR-ABL (17,18) et étaient capables de se fixer sur des molécules du CMH de classe II murines et induire une réponse de cellules T auxiliaires ( "T helper") spécifiques chez la souris (16) et chez l'homme (19) . Aucune démonstration n'a toutefois été faite quant à la propriété des peptides décrits d'induire chez l'homme une réponse de lymphocytes T cytotoxiques qui soient capables de reconnaître spécifiquement des cellules malignes, présentes chez des patients atteints de leucémie et qui puissent donc être utilisés IN VIVO pour traiter les leucémies. D'autres études récentes ont montré que deux fragments peptidiques particuliers de BCR-ABL étaient capables de se fixer sur des molécules HLA B8 à la surface de cellules présentatrices humaines. Les poten¬ tialités de ces séquences à induire une réponse T spécifique des tumeurs n'a toutefois pas été analysée
(20) .
Les auteurs de la présente invention ont cherché à identifier des peptides antigèniques présentés par des molécules HLA de classe I à la surface de cellules de patients atteints de CML, qui soient spécifi¬ quement reconnus par des lymphocytes T cytotoxiques . Ceux-ci ont à présent mis en évidence que des peptides dérivés de la zone de jonction BCR-ABL étaient capables de se fixer sur des molécules HLA-A2.1 et d'induire, à partir de lymphocytes du sang périphérique (PBL) normaux ou de patients leucémiques, des CTL HLA-A2.1 restreints. De façon surprenante, les inventeurs ont également montré que ces CTL ainsi activés pouvaient lyser des cellules tumorales HLA-A2.1 exprimant p210, démontrant ainsi l'existence d'un épitope commun entre ces peptides particuliers et les antigènes exprimés par des cellules leucémiques. En outre, des CTL directement prélevés chez certains patients atteints de CML se sont avérés capables de lyser des cellules présentant les peptides identifiés par les inventeurs. Ceci indique qu'une immunisation naturelle existe IN VIVO chez certains patients, et que ces peptides spécifiques ont des propriétés immuno¬ geniques leur permettant d'être utilisés pour développer des protocoles d'immunothérapie. La présente invention vise donc à fournir des moyens pour la prévention ou la thérapie des leucémies humaines associées à la translocation BCR-ABL.
L'invention a pour objet des peptides qui comprennent une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes :
- SEQ ID N' l : S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 927 à 934 de p210)
- SEQ ID N° 2 : S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 926 à 934 de p210)
- SEQ ID N° 3 : Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 925 à 934 de p210)
- SEQ ID N° 4 : K-Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 924 à 934 de p210), ou toute séquence dérivée de l'une des précédentes, capable d'induire une réponse de lymphocytes T cytotoxi- ques (CTL) humains HLA-restreinte spécifiquement dirigée contre des cellules exprimant la protéine de fusion BCR- ABL (p210) .
Au sens de la présente invention, le terme "dérivé" désigne toute séquence obtenue par mutation, délétion, substitution ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, ainsi que toute séquence isofor¬ me, c'est-à-dire une séquence identique à l'une des quatre séquences SEQ ID n' 1 à 4, contenant un ou plu¬ sieurs résidus, sous la forme d' énantiomère D. Ces peptides selon l'invention peuvent être notamment préparés par synthèse chimique classique ou par toute autre technique de synthèse connue de l'homme de l'art, y compris les techniques de génie génétique. Avantageusement, les peptides selon l'inven¬ tion sont capables d'induire une réponse de lymphocytes T CD8", restreints par des antigènes HLA de classe I, en particulier des antigènes HLA-A2.1
Une limite à l'immunothérapie basée sur une réponse cellulaire T dirigée contre des antigènes spécifiques, est liée au phénomène de restriction par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilite. En effet, pour un antigène donné, les épitopes qui seront présentés aux cellules T et/ou l'efficacité de cette présentation par les molécules HLA des cellules présenta¬ trices, seront dépendants du typage HLA de ces cellules présentatrices. On conçoit donc que des peptides qui pourront être efficacement être présentés par une molécule HLA couramment rencontrée seront particulière- ment intéressants d'un point de vue thérapeutique, puisqu'ils pourront déclencher une réponse de lymphocytes T restreints chez une majorité d'individus.
Or, l'allèle HLA-A2 fait précisément partie des antigènes HLA de classe I les plus fréquents, notam- ment parmi les populations caucasoïdes. Cet allèle est en effet exprimé chez plus de 50 % des individus, parmi lesquels 90 % au moins possèdent le motif HLA-A2.1. De ce fait, tout antigène de tumeur capable de se fixer sur des molécules HLA-A2.1 et de générer une réponse T spécifique, constituera une nouvelle approche thérapeuti¬ que pour une immunisation spécifique anti-tumorale, applicable chez un grand nombre de patients.
Les peptides de l'invention ont par ailleurs la particularité de ne pas contenir le motif "canonique" tel que décrit par Ramensee et al. (21) , qui est généra- lement présent dans les séquences peptidiques capables de se fixer sur les molécules HLA-A2.1.
La présence de ce motif au sein d'un peptide est en général considérée comme un indicateur de la capacité de ce peptide à se fixer sur la molécule HLA-
A2.1, si ce n'est comme élément indispensable à cette fixation.
La propriété des peptides selon l'invention de se fixer sur les molécules HLA-A2.1 et de provoquer une réponse lymphocytaire T spécifique constitue donc un résultat surprenant par rapport aux connaissances de l'homme du métier sur le sujet.
Selon une autre propriété avantageuse, les peptides selon l'invention possèdent au moins un épitope commun avec des antigènes spécifiquement exprimés par des cellules leucémiques possédant la translocation Phi, ledit épitope étant capable d'être spécifiquement reconnu par des lymphocytes T cytotoxiques humains et/ou d'in¬ duire une réponse de lymphocytes T cytotoxiques humains . Comme cela l'a été indiqué précédemment, cette caractéristique correspond à l'un des critères particulièrement importants auxquels doit satisfaire un peptide dérivé d'une molécule oncogénique pour être qualifié d'agent potentiellement immunothérapeutique. En effet, des cellules spécifiquement activées IN VITRO par un tel épitope pourront également reconnaître IN VIVO ce même épitope à la surface de cellules cancéreuses.
Selon un autre aspect, l'invention vise également une méthode pour obtenir une population de lymphocytes T cytotoxiques humains (CTL) capables de lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL, caractérisée en ce que :
- on cultive des lymphocytes humains prove¬ nant du sang périphérique, préférentiellement enrichis en lymphocytes T CD8*, dans un milieu contenant une quantité efficace d'au moins un peptide tel que précé¬ demment défini, et des cellules présentatrices aptes à présenter aux lymphocytes T le ou lesdits peptide(s) en association avec leurs molécules HLA de classe I, et - on augmente le nombre et la spécificité des
CTL par une ou plusieurs restimulations par le ou lesdits peptides prcédemment décrit (s) associé(s) aux molécules HLA de classe I des cellules présentatrices.
Les populations de CTL humains obtenus par la méthode précédente font également partie de l'invention.
Ces CTL sont avantageusement capables de lyser spécifiquement des cellules leucémiques possédant la translocation BCR-ABL, et plus particulièrement des cellules leucémiques d'un patient HLA-A2.1. L'invention vise également l'utilisation d'au moins l'un des peptides tels que décrits précédemment ou des CTL reconnaissant spécifiquement ces peptides, pour la fabrication de compositions pharmaceutiques pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL.
Les compositions pharmaceutiques comprenant au moins un peptide tel que précédemment défini comme principe actif, avec tout véhicule, adjuvant, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable, font également partie de l'invention. Selon une variante avantageuse, qui vise à augmenter l' immunogénicité du peptide, celui- ci est associé à un lipide, sous forme d'un lipopeptide, greffé à une molécule porteuse (carrier) selon des méthodes utilisées dans les protocoles d'immunisation connues, ou inséré dans tout système non réplicatif (anatoxine tétanique par exemple) .
Suivant un mode de réalisation préféré, ces compositions comprennent comme principe actif au moins un peptide selon l'invention associé à des molécules HLA de classe I, ledit peptide étant capable d'être spécifi- quement reconnu par des CTL restreints par les molécules HLA auxquelles il est associé.
Avantageusement, l'un au moins des peptides de l'invention est associé à des molécules HLA de classe I exprimées à la surface de cellules humaines non tumorales HLA compatibles avec des CTL capables de le reconnaître spécifiquement.
Préférentiellement, ces cellules humaines sont des cellules présentatrices autologues desdits CTL. Selon une variante préférée, 1 'association du peptide aux molécules HLA des cellules présentatrices peut être réalisée par la méthode de "stripping" décrite par Langlade-Demoyen et al. (22) qui permet d'obtenir une plus forte densité de peptide associé aux molécules HLA à la surface des cellules présentatrices.
Les cellules présentant le peptide sont par exemple des cellules présentatrices "professionnelles", telles que les cellules dendritiques, ou d'autres types de cellules comme les cellules spléniques ou les lympho- cytes B.
Lorsque les compositions sont uniquement destinées à activer IN VITRO des CTL capables de recon¬ naître spécifiquement l'un au moins des peptides de l'invention, les cellules présentatrices du peptide peu- vent être en outre des cellules de drosophile en culture, transfectées avec les gènes des molécules HLA, comme décrit dans la demande WO-A-93 17 095 publiée le 2 septembre 1993.
Selon d'autres modes de réalisation, les peptides dans les compositions selon l'invention sont associés à des molécules HLA solubles fixées sur des supports synthétiques biocompatibles et bioassimilables. Ces supports sont par exemple constitués par des billes de plastique ou autre polymère bioassimilable sur lesquelles sont fixées les régions extracytoplasmiques des molécules HLA. Les peptides peuvent également être associés à des molécules HLA ancrées dans des supports synthétiques de type "pseudo-membranaire" , tels notamment les liposomes et tout autre système de membrane modèle connu de l'homme de l'art.
Dans toutes ces compositions, le typage des molécules HLA associées aux peptides est compatible avec celui du patient auquel celles-ci sont destinées.
Font également partie de l'invention des com¬ positions pharmaceutiques pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant comme principe actif des CTL humains CD8* qui reconnaissent spécifiquement au moins un peptide dérivé de la région de jonction de la protéine BCR-ABL comprenant l'une des séquences d'acides aminés n' 1 à 4 ou dérivée, comme précédemment définies. Les CTL desdites compositions sont HLA compatibles avec les cellules du patient auquel ces compositions sont destinées et sont restreints par un allèle HLA de classe I dudit patient capable de s'associer avec au moins un peptide spécifique de BCR-ABL. Préférentiellement, ces CTL sont des cellules autologues du patient.
Ces différentes compositions peuvent être administrées selon plusieurs modes d'administration, que l'homme du métier pourra déterminer en fonction du type de composition concernée.
Les compositions comprenant un peptide comme principe actif peuvent être administrées par voie systémique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Les compositions comprenant des CTL comme principe actif sont préférentiellement administrées par voie intraveineuse ou intrapéritonéale. Un autre type de composition, également objet de la présente invention, comprend, à titre de principe actif, des "mini-gènes", composés des séquences nucleoti¬ diques codant pour au moins un peptide ayant l'une des séquences d'acides aminés n' 1 à 4 ou une séquence dérivée, placées sous le contrôle de signaux nécessaires à l'expression du ou des peptides correspondants.
Selon un premier mode de réalisation, les séquences nucleotidiques sont insérées dans un vecteur d'expression pour être exprimées dans un hôte cellulaire, le choix du vecteur d'expression étant fonction de l'hôte cellulaire utilisé.
Avantageusement, l'hôte cellulaire est choisi parmi les cellules du patient auquel la composition doit être administrée. Préférentiellement, ces cellules sont des cellules lymphocytaires ou myéloïdes.
Le vecteur d'expression est choisi dans ce cas parmi les vecteurs utilisés par exemple dans des mé¬ thodes de thérapie génique lorsqu'une séquence nucleoti¬ dique spécifique est intégrée dans le matériel génétique d'une cellule pour palier un défaut ou un dysfonctionne¬ ment génétique particulier, ou parmi les systèmes viraux en général utilisés dans des protocoles de vaccination (vaccine, canarypox... ) .
De telles compositions peuvent être adminis- trées selon les modes d'administration utilisés pour des préparations vaccinales (voie sous-cutanée, intra-muscu- laire, orale, nasale, etc) .
Dans une variante, l'hôte cellulaire utilisé est une bactérie naturellement présent dans l'organisme, telle E. coli ainsi que des bactéries du type BCG, ou des salmonelles, etc. Le vecteur d'expression est dans ce cas un vecteur d'expression procaryote, obtenu à partir de plasmides disponibles dans le commerce et utilisés de façon courante par l'homme du métier dans des techniques de recombinaison génétique des bactéries. L'administra- tion de ces compositions se fait de préférence par voie sous-cutanée, ce type d'administration n'étant cependant pas exclusif.
Selon un second mode de réalisation, les séquences nucleotidiques contenues dans les compositions selon l'invention sont sous forme d'ADN "nu", c'est-à- dire qu'elles sont insérées dans des séquences de type plasmidique contenant les éléments de régulation néces¬ saires à leur expression. Ces séquences sont en solution dans un milieu salin injectable, notamment dans le muscle ou la peau, par des moyens d'administration appropriés.
Les différentes compositions couvertes par la présente invention peuvent être utilisées en association avec d'autres compositions pharmaceutiques, administrées de façon simultanée ou séquentielle, en vue d'une addition ou synergie des effets produits au plan théra¬ peutique. A titre d'exemple non limitatif, ces composi¬ tions additionnelles contiennent des agents activateurs de lymphocytes T, tels 1 ' IL2 , 1 ' IL7, 1 ' IL12, 1 ' interfé- ron, etc.
L'invention permet ainsi la réalisation d'une méthode de traitement thérapeutique comprenant l'adminis¬ tration d'au moins l'une des compositions pharmaceutiques telles que précédemment décrites à un patient atteint d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL. Les modes d'administration, les posologies et formes galéni¬ ques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
Les peptides selon la présente invention sont également utiles pour des applications dans le domaine du diagnostic IN VITRO des leucémies associées à la translocation BCR-ABL. Ils peuvent notamment être utilisés dans des tests IN VITRO basés sur une réactivité de CTL spécifiques pour diagnostiquer une CML ou pour suivre l'évolution de la réponse de CTL spécifiques au cours d'un traitement thérapeutique d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL et/ou mesurer l'effi¬ cacité d'un peptide selon l'invention à générer une réponse de CTL spécifique à l'encontre de cellules exprimant BCR-ABL. Une variante préférée consiste à rechercher des CTL spécifiques des cellules exprimant BCR-ABL chez un patient selon les étapes consistant à :
- mettre en culture les PBL de ce patient, avec au moins un peptide de l'invention associé à des molécules HLA compatibles avec les cellules T du patient; observer la stimulation spécifique de lymphocytes T par le peptide associé aux molécules HLA.
Les molécules HLA présentant le peptide sont avantageusement exprimées à la surface de cellules HLA compatibles avec les lymphocytes T du patient. Ce sont préférentiellement des cellules autologues normales ou leucémiques du patient, et plus particulièrement des cellules exprimant à leur surface des molécules HLA-A2.1. Selon d'autres modes de réalisation, les PBL testés peuvent être enrichis en cellules T préalablement à leur mise en culture en présence du peptide de l'inven¬ tion, par exemple par une sélection positive des cellules CDβ* selon des méthodes utilisées en routine par l'homme du métier. Préalablement à leur mise en culture avec les lymphocytes du patient dont on recherche des CTL spécifi¬ ques, les cellules présentatrices sont avantageusement chargées en peptide spécifique, par exemple selon le procédé de "stripping" décrit par Langlade-Demoyen (22) . L' immunoréactivité des CTL recherchés est évaluée par exemple par une augmentation de la production de facteurs spécifiquement produits par des lymphocytes T activés (IL2, TNF...) . Cette production de facteurs est par exemple mesurée par des méthodes telles que l'ELISA ou la PCR. Alternativement, la cytotoxicité des CTL envers les cellules cibles présentant à leur surface le peptide spécifique associé à leurs molécules HLA de classe I, est évaluée en fonction de la quantité de chrome 51Cr libéré par ces cellules au cours de leur lyse, méthode couramment mise en oeuvre en immunologie cellulaire. Sont également classiquement utilisées par l'homme du métier, les méthodes de cultures cellulaires mixtes à court terme et les techniques basées sur l'ELISA ou la PCR.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
LEGENDE DES FIGURES
- Figure 1 : Fixation du peptide sur HLA-
A2.1.
L'efficacité des peptides décrits dans le tableau I à stabiliser les molécules HLA-A2.1 exprimées à la surface des cellules T2 est étudiée comme décrit ci- après dans Matériel et Méthodes. La fluorescence moyenne observée en utilisant un anticorps monoclonal anti HLA-A (W6/32) est exprimée en unités arbitraires.
- Figure 2a : CTL primaires spécifiques obtenus à partir des PBL de donneurs sains HLA-A2.1. La réactivité envers BCR-ABL de CTL provenant de donneurs sains a été mesurée en utilisant des cellules cibles chargées en peptide. Les CTL spécifiques provenant des PBL dédits donneurs ont été testés après un second cycle de stimulation IN VITRO. Le pourcentage de lyse spécifique est indiqué pour les deux rapports cellules effectrices/cellules cibles de 30/1 (barres blanches) et de 10/1 (barres grises) .
- Figure 2b : Analyse de la spécificité et de la restriction par le CMH de CTL réactifs envers BCR-ABL.
Des CTL primaires spécifiques de BCR-ABL provenant de donneurs HLA-A2.1 ont été testés contre des cellules K562 (exprimant p210 BCR-ABL) transfectées avec les gènes des molécules HLA-A2.1 et non transfectées.
- Figure 3a : Induction de CTL spécifiques primaires chez des patients atteints de CML.
Des CTL antigène -spécifiques provenant de dix patients HLA-A2.1 positifs ont été induits et cultivés. Après trois cycles de stimulation avec des cellules autologues chargées en peptide en tant que stimulateurs, on a évalué la réactivité des CTL à 1 ' encontre de cellules T2 chargées en peptide. Le pourcentage de lyse spécifique est indiqué pour deux rapports cellules effectrices/cellules cibles de 30/1 (barres blanches) et de 10/1 (barres grises) .
- Figure 3b : Test d'inhibition de CTL spécifiques de BCR-ABL par des cellules cibles froides.
Des cellules cibles non marquées (froides) ont été ajoutées à différentes concentrations allant de
2.106 à 2.108 c'est-à-dire correspondant à des rapports cellules froides/cellules cibles chaudes allant de 0,5/1 à 20/1. Le même essai est réalisé trois fois. En 1 'ab- 8232 PCI7FR96/01799
17 sence de cellules cibles froides, la cytotoxicité spécifique correspond à 80 % de 51Cr libéré. Les cellules cibles froides ont été recouvertes avec du peptide BCR- ABL ou avec un peptide provenant du virus de l'influenza utilisé à titre de contrôle, connu pour sa capacité à se fixer à la molécule HLA-A2.1 (flu) .
MATERIELS ET METHODES
- Cellules et lignées cellulaires utilisées Les cellules utilisées dans ces études com¬ prennent des cellules B lymphoblastoïdes transformées par le virus d'Epstein-Barr (EBV) de la lignée JY (HLA-A2- B7) , la lignée cellulaire mutante CEMx721.174 (T2) et les cellules K562 cotransfectées avec le gène de la molécule HLA-A2.1 et le gène de la résistance à la puromycine. Toutes ces lignées cellulaires sont cultivées de façon continue dans du milieu RPMI (Gibco) supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal.
- Lymphocytes et leucocytes
Les PBL sont récupérés après 20 mn de centri¬ fugation sur une solution de Ficoll Paque à 600 g (Pharmacia Uppsala, Suède) à température ambiante. Toutes les cellules sont conservées en azote liquide. La viabilité cellulaire et les fonctions lymphocytaires sont préservées .
Typage : les antigènes de transplantation HLA
(haplotypes) sont identifiés de façon sérologique au laboratoire de typage cellulaire de l'Hôpital Salpétriè- re. Les donneurs et les patients sont sélectionnés en fonction de l'expression de la molécule HLA-A2.1.
- Peptides utilisés
Les peptides synthétiques (tableau I) utilisés dans cette étude ont été synthétisés par la société NEOSYSTEM à Strasbourg et purifiés par HPLC par le fabricant. Le peptide 58-66 (GILGFVFTL) de la matrice du virus de l'influenza (flu) est utilisé comme contrôle.
TABLEAU I
Séquences d'acides aminés des peptides de la zone BCR- ABL
Peptide Résidus Séquence
BCR3-ABL2 927-934 SKALQRPV
BCR3-ABL2 926-934 SSKALQRPV
BCR3-ABL2 925-934 QSSKALQRPV
BCR3-ABL2 924-934 KQSSKALQRPV
BCR3-ABL2 923-934 FKQSSKALQRPV
BCR3-ABL2 922-934 GFKQSSKALQRPV
BCR3-ABL2 921-934 TGFKQSSKALQRPV
- Mesure de la fixation du peptide
Les cellules T2 sont cultivées pendant 48 heures à 26 'C dans un milieu sans sérum. 3.105 cellules sont ensuite placées à 37' pendant 15 heures en présence de 20 μM du peptide testé. L'expression de HLA- A2.1 est ensuite mesurée par cytométrie de flux en utilisant l'anticorps monoclonal W6/32 dirigé contre l'ensemble de molécules HLA-A (23) et un cytofluoromètre de la marque Becton Dickinson.
Chargement du peptide ( "peptide stripping" )
Le chargement du peptide à la surface des cellules présentatrices est réalisé dans 0,5 ml de tampon de chargement ("stripping buffer") contenant : de l'acide citrique 0,13M, du Na2HP04 66 mM, du NaCl 150 mM et du rouge de phénol à 17 mg/ml selon le protocole décrit par Langlade-Demoyen et al . (22) .
Induction d'une réponse CTL IN VITRO
L'induction de CTL est réalisée comme cela a été précédemment décrit (22, 27) . Brièvement, les PBL de donneurs sains ou de patients HLA-A2.1 atteints de CML, sont collectés par centrifugation douce à l'interface d'un Ficoll paque, les cellules sont lavées puis incubées soit avec de la concanavaline A et de 1 ' IL- 2 recombinante pour obtenir des lymphblastes T activés, soit avec la bactérie Staphylococcus aureus Cowan I, des
IgM de lapin anti-homme couplées à une phase solide et de l'IL-4 humaine recombinante pour induire des lympho- blastes B.
Ces lymphoblastes sont ensuite soumis à la méthode de "peptide stripping" comme décrit précé¬ demment et rechargés avec des peptides de BCR-ABL selon l'invention. Ultérieurement, les lymphoblastes chargés en peptides sont irradiés et mis en présence de PBL enrichis en lymphocytes CD8+ du même donneur dans un milieu de culture pour cellules T contenant de l'IL-2 recombinante (10 U/ml) de l'ILl-β (5 U/ml) et de l'IL-7 recombinante (20 U/ml) . En fonction des donneurs, (fréquence des précurseurs CTL spécifiques) les cellules effectrices peuvent nécessiter un temps de prolifération IN VITRO plus long avant qu'une activité de lyse spécifi¬ que puisse être détectée. Les cellules T sont ensuite entretenues par des restimulations hebdomadaires avec des monocytes autologues chargés en peptides et de 1 ' IL-2 recombinantes (10 U/ml) et de l'IL-7 (10 U/ml) .
- Mesure de la cytoxicité par libéra- tion de 51Cr
L'activité cytolytique à médiation cellulaire (CML) dans des cultures est évaluée dans un essai de mesure de libération de 51Cr de 6 heures. Le pourcentage de lyse spécifique de 10 000 cellules cibles marquées au 51Cr dans un volume de 200 μl est déterminé pour différents rapports lymphocytes/cellules cibles. La libération spontanée de 51Cr varie entre 6 et 20 % du marquage incorporé total .
- Tests de compétition de cytotoxicité à l'aide de cibles froides
Des cellules K562 transfectées avec HLA-A2.1 ou des cellules T2 sont chargées pendant 6 h avec un peptide à une concentration de 100 μg/ml. Les cellules sont ensuite lavées pour éliminer le peptide non lié. Avant incubation avec les cellules cibles marquées, les cellules effectrices sont incubées avec une dilution en série de cellules compétitrices non marquées pendant 2 h à 37 'C. Le surnageant est récupéré après 4 h d'incu¬ bation à 37 ' . - Méthode de dilution limite (LDA) Les fréquences relatives de précur¬ seurs de CTL (CTLP) spécifiques pour BCR-ABL sont déterminées pour différentes populations lymphocytaires par l'analyse en dilution limite. La cytotoxicité d'échantillons contenant entre 50 et 10 000 lymphocytes est évaluée sur des cellules cibles marquées au 51Cr dans un volume final de 200 μl . Chaque dilution testée est répliquée dans 24 puits. Les surnageants sont prélevés après 9 h d'incubation à 37 'C. Un puits est considéré comme positif si la libération de 51Cr excède de 3 écart- types la moyenne des puits contrôle contenant les cellules cibles seules. La fréquence de cellules effec¬ trices est estimée par une analyse de distribution de Poisson (24,25) .
EXEMPLES
EXEMPLE 1 Des peptides synthétiques correspon¬ dant à la zone de jonction BCR-ABL de la protéine p210 stabilisent les molécules thermolabiles HLA-A.2.1 de cellules T2.
Sept peptides correspondant à la région de fusion de la protéine chimérique p210 (tableau I) sont évalués pour leur capacité à se fixer aux molécules HLa-A2.1 en utilisant des cellules T2 selon un test de thermostabilisation précédemment décrit (26) . Les cellules T2 sont déficientes pour les gènes codant pour les transporteurs de peptides TAPI et TAP2 (26) . De ce fait, elles ont une expression de surface des molécules du CMH de classe I qui est réduite à une température de 37 'C. L'expression des molécules du CMH de classe I endogènes à la surface cellulaire peut être restaurée par une mise en culture à 26*C, mais ces molécules sont thermolabiles tant qu'elles ne sont pas stabilisées par la fixation d'un peptide exogène. En utilisant cet essai, 4 des 7 peptides testés se sont avérés capables d'induire une stabilisation significative des molécules HLA-A2.1 à la surface cellulaire (figure 1) .
EXEMPLE 2 :
Induction de CTL CD8+ spécifiques à partir de PBL de donneurs sains HLA-A2.1
Les auteurs de la présente invention ont décrit précédemment que des CTL primaires spécifiques de peptides pouvaient être générés IN VITRO contre diffé¬ rents peptides chez la souris et chez l'homme (22,27) . Dans les expériences illustrant la présente invention, les auteurs ont utilisé 2 protocoles différents pour vérifier si des CTL primaires spécifiques de peptides de BCR-ABL pouvaient être activés IN VITRO. En utilisant le peptide p926/p934 des CTL spécifiques primaires peuvent être induits à partir de PBL de plusieurs donneurs HLA-
A2.1 (figure 2a) . Ces CTL reconnaissent non seulement des cellules cibles chargées en peptide (figure 2a) mais également des cellules tumorales K562 transfectées avec HLA-A2.1 exprimant la protéine chimérique (figure 3a) . Ces CTL classiques sont restreints par HLA-A2.1 puisque les cellules parentes K562 HLA-A2.1 négatives et pHl positives ne sont pas lysées (figure 2b) et l'anticorps monoclonal W6/32 spécifique des molécules HLA inhibe l'activité lytique. Ces données démontrent que de courts peptides dérivés de BCR-ABL obtenus après maturation intracellulaire de la protéine de fusion peuvent être présentés en association avec HLA-A2.1 à une concen¬ tration suffisament élevée pour être reconnus par des CTL spécifiques. Le peptide 926-934 est choisi pour les études décrites ci-après.
EXEMPLE 3
CTL CD8'" spécifiques de BCR-ABL obtenus IN VITRO à partir de PBL provenant des patients atteints de CML
Des PBL ont été prélevés chez 10 patients HLA-A2.1 atteints de CML. Cinq de ces dix échantillons (2,5,8,9,10) ont pu générer des CTL spécifi¬ ques contre le peptide p926-934 après un second cycle de stimulation, en utilisant a) des cellules blastiques autologues chargées en peptide selon la méthode de "stripping" précédemment décrite pour la simulation initiale et b) des cellules adhérentes autologues pour la seconde stimulation. Pour quatre autres patients (1,3,4,7) , plusieurs cycles de stimulation supplémentai¬ res ont été nécessaires pour détecter une activité CTL spécifique, suggérant que la fréquence de précurseurs
(CTLP) était plus faible (figure 3a) chez ces individus. Pour confirmer que les CTL reconnaissaient un épitope naturel associé avec HLA-A2. sur des cellules leucémi¬ ques, les différentes populations de CTL ont été testées avec des cellules tumorales provenant du même patient. Trois parmi les cinq patients (8,9,10) avaient des CTL qui lysaient leurs cellules tumorales autologues IN VITRO. Il est important de noter que, la toxicité étant fortement diminuée dans un test d'inhibition par cible froide dans lequel des cellules compétitrices étaient chargées avec le peptide, ceci démontre que le peptide présenté était identique à celui qui était reconnu sur la cellule tumorale par une majorité de cellules spécifi¬ ques (figure 3b) . Ces résultats dans leur ensemble établissent donc que des CTL réactifs pour BCR-ABL peuvent être induits pour reconnaître un épitope commun sur les cellules leucémiques.
EXEMPLE 4
Des CTL circulants spécifiques peuvent être détectées chez trois patients sur dix.
Des analyses en dilution limite ont été réalisées pour quantifier des CTL circulant spécifi¬ ques chez des patients atteints de CML. Une haute fréquence de CTL spécifiques a été trouvée chez plusieurs patients (3 sur 10) . Ces CTL étaient capables de lyser des cellules T2 recouvertes avec le peptide P926/934 aussi bien que des cellules K562 HLA-A2.1 (tableau II) .
Ce résultat indique que certains patients atteints de CML peuvent spontanément développer une réponse immunitaire contre le produit de transloca¬ tion BCR-ABL. TABLEAU II
Fréquence des CTL précurseurs (CTL.,) chez des patients atteints de CML et chez des donneurs sains.
Figure imgf000027_0001
Les CTL spécifiques de BCR-ABL sont obtenus par microcultures dans des conditions de dilution limite et détectés par un test de libération de 51Cr par des cellules T au bout de 18 heures. Les CTLp sont comptés après 10 jours de culture. * N.D. : non détectable DISCUSSION
Les présents résultats démontrent que la même réactivité spécifique de CTL envers un peptide de la région de jonction BCR-ABL peut s'observer chez certains patients atteints de CML et qu'une réponse spécifique de CTL CD8+ peut être observée IN VITRO à partir de PBL provenant de donneurs sains et de patients atteints de CML. Cette réponse de cellules T est dirigée de manière spécifique contre un peptide de la région de jonction comprenant 9 à 12 résidus d'acides aminés capables de se fixer IN VITRO sur la molécule HLA-A2.1.
Aucun des peptides selon l' invention ne montre le motif canonique spécifique de la molécule HLA-A2.1. Ceci montre donc qu'une recherche de peptides antigéniques ne doit pas se limiter aux seuls peptides qui possèdent ce motif canonique.
Des CTL CD8+ spécifiques de BCR-ABL ont été testés sur des cellules K562 transfectées avec HLA- A2.1 et des cellules cibles tumorales autologues. Chacune de ces cibles cellulaires ont été lysées par des CTL spécifiques ce qui démontre donc :
1. que la protéine BCR-ABL (p210) peut subir un processus de maturation par les cellules tumorales, et que
2. des CTL spécifiques générés IN VITRO peuvent reconnaître le peptide endogène.
Le peptide le plus immunogène est un néopeptide composé de 2 acides aminés provenant de BCR, un acide aminé de la région de fusion et six acides aminés provenant de ABL.
Chez certains patients, des cycles de stimulation supplémentaires ont été nécessaires pour révéler une activité CTLP ce qui suggère que la fréquence de leur CTL spécifiques était plus faible comparée à celle de donneurs normaux.
Une interprétation est que cette fréquence plus faible serait due à une élimination de CTL de haute affinité par une surstimulation de réponses CTL causant une anergie ou une délétion (28,29) .
Bien qu'un plus grand nombre de patients ait besoin d'être évalués pour des conclusions définitives, chez trois sur dix patients leucémiques, une activité CTL spécifique a été directement détectée suggérant une surveillance immunitaire spécifique active contre le produit de translocation BCR-ABL.
Toutefois, les patients leucémiques sont incapables de se débarrasser eux-mêmes de leur tumeur même en présence de cellules T spécifiques de cette tumeur détectables dans leur sang.
Pour ces raisons, une immunothérapie adoptive à partir de cellules T et des vaccins IN VIVO conçus à partir de peptides, constituent de nouvelles approches thérapeutiques prometteuses. De façon signifi- cative, ces CTL circulants chez des patients ne montrent pas de toxicité détectable IN VIVO à l' encontre des tissus normaux, ce qui suggère que l' antigénicité des protéines BCR-ABL est principalement limitée à la région de jonction exprimée seulement par les cellules malignes ou les cellules prémalignes subissant une transformation.
Une thérapie de transfert adoptif doit être donc sélective de façon à minimiser les probabilités d'une toxicité auto-immune. En d'autres termes, la destruction des clones malins ne doit pas affecter 1'hématopoïèse normale, car des précurseurs normaux de la moelle osseuse coexistent normalement avec les clones malins dans la moelle osseuse de patients leucémiques.
Une autre raison pour laquelle les peptides BCR-ABL selon l'invention sont des candidats privilégiés pour une vaccination et une immunothérapie adoptive à partir de cellules T est que contrairement aux autres translocations associées avec d'autres patholo¬ gies, la protéine BCR-ABL est un antigène commun chez 95 % .des patients atteints de CML et 15 % des patients atteints d'une leucémie lymphoblastique aiguë (15) .
Par ailleurs, la protéine BCR-ABL est associée de façon intime avec une transformation maligne aussi bien qu'avec la maintenance du phénotype malin (30,31) . Des patients atteints de CML subissent une extension monoclonale d'une seule cellule pluripo- tente aberrante (32) et il est probable que la protéine BCR-ABL est présente chez le progéniteur malin le plus précoce (31,32) . C'est seulement très rarement que des cellules CML positives pour la translocation Phi devien¬ nent PHI négatives et il est également très rare que des cellules CML Phi positives perdent des transcrips détectables durant la progression de la maladie (33) .
Donc, des variants négatifs pour l'antigène qui pourraient pousser suite à une immunisa¬ tion ne devraient pas avoir un phénotype malin.
Les cellules T dans les CML sont presque toujours Phi négatives, au moins durant la phase chronique. De ce fait, une expansion de CTL spécifiques vis à vis de la tumeur IN VITRO et une réinjection chez des patients atteints de CML combinée avec une vaccina¬ tion spécifique avec un épitope essentiel minimum peut être envisagée.
Cette étude démontre que la protéine chimérique BCR-ABL exprimée par les CML associée à la translocation Phi est immunogénique chez des individus HLA-A2.1 à cause de la séquence d'acides aminés de l'unique région de jonction entre BCR et ABL.
Les propriétés décrites pour la présente invention peuvent être appliquées à l'évaluation de 1 ' immunogénicité de la même région de jonction BCR-ABL chez d'autres individus porteurs d'allèles HLA et de protéines exprimées par d'autres gènes ayant subi une translocation communément associés avec les leucémies et les lymphomes .
Les peptides antigéniques tels ceux de la présente invention peuvent être utiles pour développer IN VIVO et/ou EX VIVO des protocoles d'immunothérapie.
B I B L I O G R A P H I E
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Peptides comprenant une séquence d ' acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : - SEQ ID N° 1 : S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 927 à 934 de p210)
- SEQ ID N° 2 : S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 926 à 934 de p210)
- SEQ ID N° 3 : Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 925 à 934 de p210)
- SEQ ID N° 4 : K-Q-S-S-K-A-L-Q-R-P-V (résidu 924 à 934 de p210), ou toute séquence dérivée de l'une des précédentes, capable d'induire une réponse de lymphocytes T cytotoxi¬ ques (CTL) humains HLA-A2.1 restreinte spécifiquement dirigée contre des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL (p210) .
2. Méthode pour obtenir une population de lymphocytes T cytotoxiques humains (CTL) capables de lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL, caractérisée en ce que :
- on cultive des lymphocytes humains prove¬ nant du sang périphérique, préférentiellement enrichis en lymphocytes T CD8+, dans un milieu contenant une quantité efficace d'au moins un peptide selon la reven¬ dication 1, et des cellules présentatrices aptes à présenter aux lymphocytes T le ou lesdits peptide(s) en association avec leurs molécules HLA de classe I, et
- on augmente le nombre et la spécificité des CTL par une ou plusieurs restimulations par le ou lesdits peptide(s) précédemment décrit (s) associé(s) aux molécu¬ les HLA de classe I des cellules présentatrices.
3. Population de lymphocytes T cytotoxiques humains obtenue par la méthode selon la revendication 2.
4. Composition pharmaceutique pour le traite- ment ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant au moins un peptide selon la revendication 1 comme principe actif avec tout véhicule, adjuvant, excipient ou diluant pharmaceutique¬ ment acceptable.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés à des molécules HLA.
6. Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés à des molécules HLA de classe I de cellules humaines non tumorales présentatrices.
7. Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que le ou les peptides sont associés à des molécules HLA de classe I fixées ou ancrées dans des supports biocompatibles et bioassimilables.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, destinée à être administrée à un patient, caractérisée en ce que le typage des molécules HLA est compatible avec celui dudit patient.
9. Composition pharmaceutique pour le traite¬ ment ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant comme principe actif une population de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) selon la revendication 3.
10. Composition selon la revendication 9 destinée à être administrée à un patient, caractérisée en ce que les CTL sont HLA compatibles avec les cellules dudit patient.
11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que les lymphocytes T de la composition sont restreints par un allèle HLA de classe I du patient.
12. Composition selon la revendication 6 ou la revendication 11, caractérisée en ce que les cellules présentatrices ou les lymphocytes T sont des cellules autologues dudit patient.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 12 , destinée à être administrée à un patient porteur de l'haplotype HLA-A2.1.
14. Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL comprenant comme principe actif des séquences nucleotidiques codant pour l'un au moins des peptides selon la revendication 1, placées sous le contrôle de signaux permettant leur expression.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que les séquences nucleotidiques sont exprimées dans un hôte cellulaire transfecté par un vecteur d'expression approprié contenant lesdites séquen¬ ces, ledit hôte cellulaire étant choisi parmi des cellu¬ les naturellement présentes dans l'organisme.
16. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que les séquences nucleotidiques sont sous forme d'ADN nu.
17. Utilisation d'un peptide selon la revendication 1 pour activer IN VITRO des lymphocytes T cytotoxiques capables de lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine de fusion BCR-ABL.
18. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que les lymphocytes T cytotoxiques sont restreints par HLA-A2.1.
19. Utilisation d'un ou plusieurs peptides selon la revendication 1 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention des leucémies associées à la translocation BCR-ABL .
20. Méthode de diagnostic IN VITRO d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL chez un patient, caractérisée en ce que l'on recherche des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques des cellules BCR- ABL chez ledit patient selon les étapes consistant à :
- mettre en culture les lymphocytes du sang périphérique de ce patient, avec au moins un peptide de l'invention associé à des molécules HLA compatibles avec les cellules T du patient ; observer la stimulation spécifique de lymphocytes T par le peptide présenté en association avec les molécules HLA.
21. Méthode selon la revendication 20 pour le diagnostic d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABL chez un patient HLA A2.1.
22. Méthode de traitement thérapeutique comprenant l'administration à un patient atteint d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABC d'une dose thérapeutiquement efficace d'un peptide selon la revendi¬ cation 1.
23. Méthode de traitement thérapeutique comprenant l'administration à un patient atteint d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABC d'une population de lymphocytes T cytotoxiques obtenue par une méthode selon la revendication 2.
24. Méthode de traitement thérapeutique comprenant l'administration à un patient atteint d'une leucémie associée à la translocation BCR-ABC d'une composition selon la revendication 14.
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