JPH09502086A - 完全mage1遺伝子のクローニング及び特性決定 - Google Patents
完全mage1遺伝子のクローニング及び特性決定Info
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Abstract
(57)【要約】
ヒトMAGE-1抗原の完全ヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。C末端の残基由来のペプチドを、MAGE-1抗原に対する HLA−制限型細胞障害性Tリンパ球活性を刺激するエピトープを規定するために用いられる。このペプチドはメラノーマに関連するMAGE-1抗原に対する個体の免疫応答を刺激するための方法において極めて有用である。
Description
【発明の詳細な説明】
完全 MAGE1遺伝子のクローニング及び特性決定
発明の背景
腫瘍細胞は、その正常な細胞性対応物上には存在していない又は少量でしか存
在していない一定の抗原を発現する。その大半は分化抗原であり、腫瘍及び様々
な胎芽細胞により共有される。十分なる特異性を有すると思われる一部の抗原は
治療剤にとっての可能性のある標的として働きうる。
40種以上のメラノーマ抗原がモノクローナル抗体により特定され、免疫学的及
び生物学的に異なる特徴を有するいくつかの主要抗原ファミリーがもたらされて
いる。これらのファミリーは:(1)高分子量腫瘍胎児性タンパク質;(2)ガ
ングリオシド;(3)成長因子、例えばEGF,PDGF,TGF−アルファー及び TGF−
ベーター並びに神経成長因子にとってのレセプター;(4)カチオンの輸送及び
結合タンパク質、例えばp97;(5) HLAクラスII抗原;(6)色素沈着関連抗
原;更には(7)細胞外マトリックスタンパク質;である。 Herlyn and Kopros
ki,Ann.Rev.Immunol. 6:283-308 (1988)。
このような様々な抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を基礎とする治療
及び診断による事前の研究が奨励されてはいるが、より優れた試薬及び抗原性標
的が同定されうるという期待のうえで研究はくじけることなく続けられている。
皮膚の悪性メラノーマの有病率が驚くほどの速さで、特に米国において増大して
いる。
より近年、新しい抗原のファミリーがメラノーマ腫瘍に基づいて述べられてい
る。現在「メラノーマ抗原」又はMAGE抗原ファミリー
と呼ばれているこれらの抗原は自己の細胞障害性Tリンパ球(「CTLs」)のパネ
ルにより溶解されるメラノーマ細胞系において同定された。MAGEタイプ抗原を発
現しない細胞は CTLによっては殺傷されず、そしてこのような「抗原欠失」変異
体を選別することにより、6種の独立の抗原が同定された。 Van den Eyndeら、Int.J.Cancer
,44:634 (1989)。MZ2-E(「E」)と呼ばれる一の抗原をコードす
る遺伝子がクローニング及び配列決定されている。 Van der Bruggenら、Scienc e
254:1643(1991)。この配列はGen Bankに寄託され(受託番号M77481)、そ
して「MAGE-1」と呼ばれるヌクレオチド配列と比べて、Gen Bankを含むデーター
バンクにおけるどの配列とも有意義な相同性を示さない。2つの更なる非同一な
cDNAも見つかり(MAGE-2及びMAGE-3)、それらはMAGE-1に対してよりも互いとの
方に近縁していたが、しかしこれら3種はほぼ同等に発現された。
小さなMAGE-1遺伝子領域がクローニングされ、そして細胞の中にトランスフェ
クションされている。これらのトランスフェクト体は抗 E CTLにより認識される
抗原を発現する。即ち、この遺伝子は抗原をコードする遺伝子を更に活性化する
タンパク質をコードしないようである。Van der Bruggen 前掲。抗原性ペプチド
をコードする配列はセグメント同志の重複領域内にあると推測される。Traversa
riら、J.Exp.Med. 176:1453-1457 (1992)を参照のこと。MAGE-2及びMAGE-3のcD
NAはトランスフェクション実験において抗原Eの発現を移入することができなか
った。E抗原に関する表示分子はHLA-A1と考えられた。
MAGE遺伝子ファミリーは、 Van der Bruggenら前掲により、多種多様な腫瘍に
より発現されることが示され、そしてメラノーマに限られないが、それらはほと
んどの正常な細胞によっては発現されなかった。即ち、MAGE抗原は癌の免疫療法
にとって重要な意義を有し
うる。MAGE-1遺伝子の配列は正常組織及び腫瘍の両者において同一であると考え
られていた。
当業界に何が必要であるかというと、MAGE抗原の免疫原性腫瘍拒絶性エピトー
プのより徹底的な理解である。イムノドミナントエピトープが同定できたら、そ
の HLA制限と共に、より有効な治療プロトコールが計画できる。本発明はこれら
及びその他の関連の要望を満たす。
発明の概要
本発明はある程度、ヒトMAGE-1タンパク質をコードする従来報告されている遺
伝子がC末端において更に58個のアミノ酸をコードするという新規、且つ予測し
得なかった観察に基づいている。完全ヒトMAGE-1タンパク質及びそのペプチドは
組換又は合成手段により製造でき、且つその意図する用途に応じて天然MAGE-1抗
原の生物活性を有しても有してなくてもよい。従って、完全ヒトMAGE-1タンパク
質をコードする単離された、且つ精製されたポリヌクレオチドを述べる。全長ヒ
トMAGE-1タンパク質をコードする DNAは組換 DNAベクターの中に組込むことがで
き、その中においてそれらは適当な宿主を形質転換するのに利用でき、このcDNA
を含むベクターで形質転換した宿主細胞は全長ヒトMAGE-1タンパク質を発現でき
、そしてこの全長ヒトMAGE-1タンパク質は回収できうる。
本発明は更に CTL活性を誘導するMAGE-1タンパク質のC末端由来のMAGE-1免疫
原ペプチドに関する。本発明の免疫原性ペプチドは、様々な MHCクラスIアレル
についての係属中の米国特許出願S.N.07/926,666 号及びS.N.08/027,146 号に
記載のモチーフを用いて同定できうる。即ち、MAGE-1 CTL誘導性抗原決定基を免
疫学的に擬態する小型の合成又は組換ペプチドを調製できる。本発明の CTL誘導
性MAGE-1ペプチドは、例えば、適当な MHC表示分子との関連において、対応のMA
GE決定基を発現する腫瘍に対する免疫学的応答を誘導するために治療的に利用で
きうる。このようにして腫瘍細胞は殺傷又は阻害されうる。 CTLの誘導はin viv o
又はex vivo で達成されうる。即ち、本明細書記載のMAGE-1ペプチドは、特に
MAGE-1決定基を発現する腫瘍を発症すると予測される又は既に冒されている個体
において免疫学的応答を誘導するために用いるとき、薬理組成物として処方して
投与してもよい。
更なる別の態様において、本発明は診断のための方法であって、本発明のペプ
チドを個体におけるMAGE-1抗原に対して細胞障害性T細胞応答可能なリンパ球の
存在を決定するために用いる方法に関する。一般にリンパ球は末梢血液リンパ球
であり、そして対象の個体はMAGE抗原が関与する腫瘍に冒しむ。この診断方法及
び組成物はMAGE関連障害の治療手法、そして特に悪性メラノーマの処置との関連
で使用できうる。
図面の簡単な説明
図1は全長ヒトMAGE-1タンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
図2は全長ヒトMAGE-1タンパク質の新たに発見されたC末端部分のヌクレオチ
ド及びアミノ酸配列である。
図3はヒトMAGE-1タンパク質のC末端部分に由来する一定の新たに同定された
ペプチドに特異的な CTL応答を示す。
特定の態様の説明
「MAGE」と称されるメラノーマ抗原が CTL誘導抗原との関係で同定された。こ
のMAGE抗原は様々な腫瘍細胞により発現される近縁抗
原のファミリーであるものとして発見された。本発明はヒトMAGE-1抗原及びその
完全アミノ酸配列をコードする完全ヌクレオチド配列を提供し、これにより完全
MAGE-1タンパク質及び免疫活性を有する新たなMAGE-1ペプチドの究極的な発現を
提供する。組換 DNA発現系及び化学合成法は大量の組換ヒトMAGE-1及びそのペプ
チドフラグメントを比較的純粋な状態で獲得するための簡便な手段を提供する。
好適な態様において、本発明のペプチドは、 Seq.ID No.1に示している通りの
、MAGE-1抗原のC−末端の58個のアミノ酸領域に由来する:
Seq.ID No.1
Arg-Gln-Val-Pro-Asp-Ser-Asp-Pro-Ala-Arg-Tyr-Glu-Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Ar
g-Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val-Leu-Glu-Tyr-Val-Ile-Lys-Val-Se
r-Ala-Arg-Val-Arg-Phe-Phe-Phe-Pro-Ser-Leu-Arg-Glu-Ala-Ala-Leu-Arg-Glu-Gl
u-Glu-Glu-Gly-Val
この Seq.ID No.1の領域から選ばれるペプチドはMAGE発現細胞に対する MHC H
LAクラスI制限型 CTL応答を誘導する。リンホカイン(例えばガンマーインター
フェロン)を分泌し、且つ感染された自己細胞又はトランスフェクション細胞に
おけるウィルス複製を細胞殺傷を伴って又は伴わないで阻害する生成物(例えば
セリンエステラーゼの如くのタンパク質分解酵素)を遊離するこの刺激化 CTLは
、MAGE発現腫瘍細胞の増殖を妨害又は実質的に阻止することができる。数多くの
状況において、特定の腫瘍抗原に対する有効な細胞障害性T細胞応答及び防御抗
体応答はMAGE関連腫瘍の処置のために好適であろう。
本明細書に記載のより好適な態様において、 Seq.ID No.1の領域由来の免疫誘
導性ペプチドは少なくとも7個のアミノ酸を有し、ここでこのペプチドのアミノ
酸の過半数は、天然MAGE-1配列の対応の
部分を構成するアミノ酸と対比させたときに同一又は実質的に相同性であろう。
この領域の代表的なペプチドを以下の表1において、 MHC制限を表示しながら示
す。
このペプチドは、所望するなら、N−及びC−末端の一方又は両方において、
MAGE配列、特にMAGE-1由来のアミノ酸、連結を助長するためのアミノ酸、その他
のN−及びC−末端改変のためのアミノ酸、担体への連結のためのアミノ酸、等
により、隣接及び/又は改変されていてよく、このことは本明細書において更に
説明する。このペプチドは CTL応答を誘導し、これは少なくとも表示の MHCクラ
スI分子により媒介される。
「ペプチド」なる語は、一連の残基、一般にはL−アミノ酸であって互いと一
般に隣接し合うアミノ酸のアルファーアミノ基及びカルボニル基間でのペプチド
結合により連結し合っている残基を意味するために、本明細書において「オリゴ
ペプチド」と同義語として用いている。本発明のオリゴペプチドは長さにおいて
約15残基以下、そして通常は約8〜約11個の残基、好ましくは9又は10個の残基
より成る。
本発明の「免疫原性ペプチド」とはペプチドであって、そのペプチドが MHCア
レルと結合でき、且つ CTL応答を誘導できるようにするようなアレル特異的モチ
ーフを含んで成るペプチドを意味する。本発明の免疫原性ペプチドはMAGE-1抗原
のC末端の58個のアミノ酸残基の特定のエピトープ領域に由来する。この免疫原
性ペプチドは適当なクラスI MHC分子に結合して、免疫原性ペプチドが由来する
MAGE抗原に対する細胞障害性T細胞応答を誘導できる。
「保存領域」とはアミノ酸であって、ペプチドのモチーフにおける特定の位置
において、ランダム分布により予測し得る頻度よりも有意に高い頻度で見い出せ
るアミノ酸をいう。一般に保存残基とは
、そこで免疫原ペプチドが MHC分子との接点を担いうるような残基をいう。規定
の長さのペプチド内の1〜3、好ましくは2個の保存残基が免疫原性ペプチドの
モチーフを規定する。これらの残基は一般にペプチド結合性グループと密着して
おり、その側鎖はこのグループ自体の特定のポケットの中に埋没する。一般に、
免疫原性ペプチドは3個までの保存残基を、より通常には2個の保存残基を含ん
で成るであろう。
本明細書において用いている「ネガティブな結合性残基」とは、アミノ酸であ
って、所定の位置に存在しているとそのペプチドをノンバインダー又は弱バイン
ダーにし、そしてペプチド内の適切な保存残基の存在にもかかわらず CTL応答を
誘導しないアミノ酸をいう。
「モチーフ」なる語は、特定の MHCアレルにより認識される規定の長さのペプ
チド、通常は約8〜約11個のアミノ酸の長さのペプチド残基のパターンを意味す
る。このペプチドモチーフは一般に各ヒト MHCアレルとは異なり、そして高度保
存残基のパターンにおいて相違する。
アレルについての結合性モチーフは精度の上昇に伴って規定できる。あるケー
スにおいては、保存残基全てがペプチドの中で適正な位置にあり、そしてネガテ
ィブな結合性残基が存在していない。
「単離された」又は「生物学的に純粋」なる表現は、天然状態において通常付
随している成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。即ち、本発明
のペプチドはin situ 環境において通常結合している物質、例えば抗原表示細胞
上のMHC I分子を含まない。たとえタンパク質が均質又はドミナントなバンドに
まで単離されたとしても、所望のタンパク質と一緒に精製されてしまう5〜10%
の範囲における天然タンパク質の微量な夾雑物があるものである。
本発明の単離されたペプチドはかかる内因性の共精製タンパク質を含まない。
「残基」なる語はアミド結合又は擬似アミド結合によってオリゴペプチドの中
に組込まれているアミノ酸又は擬似アミノ酸を意味する。
CTLエピトープを含んで成るペプチドを合成し、そして適当な MHC分子に結合
する能力を、例えば精製したクラスI分子及び放射性ラベル化ペプチド及び/又
はエンプティ(空虚の)クラスI分子を発現する細胞を用いるアッセイにおいて
、例えば免疫蛍光染色及びフロー・マイクロフルオロリメトリー、ペプチド−依
存性クラスI集成アッセイ、並びにペプチド競合による CTL認識の阻害により決
定する。クラスI分子に結合するペプチドを、冒されている個体由来の CTLにと
っての標的としてそれらが寄与する能力、並びに治療剤として腫瘍細胞と反応で
きる CTL集団を生起させうる一次in vitro又はin vivo CTL応答を誘導できる能
力について更に選別にかける。アレル特異的ペプチド及びペプチドモチーフを決
定するための方法は係属中の共有出願USSN 027,146及びUSSN 027,746号に記載さ
れ、それらは引用することで本明細書に組入れる。
このペプチド又はオリゴペプチドは本明細書において以降に記載されている通
り「合成的に」又は組換 DNA工学により調製できうる。このペプチドはその他の
天然ヒトタンパク質及びそのフラグメントを実質的に含まないのが好ましいであ
ろうが、ある状況においては、このペプチドは抗腫瘍免疫応答に直接又は間接的
に寄与するその他のMAGEフラグメント又はその他のタンパク質もしくはペプチド
とコンジュゲーションされていてよい。ペプチド又はオリゴペプチドなる語は、
一連のアミノ酸であって互いと、隣接し合うアミノ酸のアルファーアミノ基及び
アルファーカルボキシ基間でのペプチド
結合により連結し合ったアミノ酸を意味するために、ポリペプチドと同義語とし
て用いている。このポリペプチド又はペプチドは様々な長さであってよく、中性
(非帯電)形態又は塩の形態のいづれでもよく、そしてグリコシル化、側鎖酸化
もしくはリン酸化の如くの修飾をされていなくても、又はこれらの修飾をされて
いてもよく、ただしその修飾は本明細書記載のポリペプチドの生物活性を破綻し
ないことを条件とする。
所望するには、このペプチドは可能な限り小さく、しかも大型ペプチドの生物
活性を実質的に全て維持している。可能なら、本発明のペプチドを9又は10個の
アミノ酸残基の長さに最適化することが所望されることがあり、細胞表層上の M
HCクラスI分子に結合しているプロセスを受けたペプチドのサイズと均り合わせ
る。一般には、SchumacherらNature 350:703-706 (1991); Van BleekらNature
348:213-216 (1990); RotzschkeらNature 348:252-254 (1990);及び Falk
et al.,Nature 351:290-296 (1991)を参照のこと。これらは引用することで本
明細書に組入れる。生物活性とは、適当な MHC分子に結合する能力を意味し、そ
して CTL応答を刺激するのに有用なペプチドの場合、MAGE抗原又は擬似抗原に対
する CTL応答を誘導する。ペプチド類似拮抗因子の場合、この類似体は、もしそ
れが MHC分子に対する結合についてこのペプチドと競合し、そして天然ペプチド
に比べて CTL応答を刺激する実質的に弱められた能力を有するなら、それは生物
活性を有するものであろう。 CTL応答とは、対象のMAGE抗原、例えばMAGE抗原フ
ァミリーの構成員に対して特異的な CD8+ T リンパ球応答を意味し、ここで CD8+
,MHC クラスI制限型Tリンパ球は活性化される。前述の通り、この活性化T
リンパ球は腫瘍細胞の複製を阻害し、且つ適当なMAGE抗原決定基を発現する腫瘍
細胞又はその他のトランスフェクション細胞を殺傷す
る又はしない様々な生成物を分泌するであろう。
本明細書において用いている「相同性」「実質的に相同性」及び「実質的に相
同」なる語は、ある配列を対照のアミノ酸配列と比較したときに50%以上の同一
性を有するアミノ酸配列を意味する。この配列同一性又は相同性のパーセンテー
ジは、一の配列を別の配列と、対照の配列の対応の部分に対して整合させて比較
することにより計算する。
本発明のペプチド又は CTL刺激活性を有するその類似性は上昇した血清半減期
以外の所望の寄与を担うように改良してよい。例えば、 CTL活性を誘導するペプ
チドの能力は、Tヘルパー細胞応答を誘導できる少なくとも一のエピトープを含
む配列に対する結合により高まりうる。特に好適な免疫原性ペプチド/Tヘルパ
ーコンジュゲートはスペーサー分子により連結する。このスペーサーは一般に比
較的小型の中性分子、例えばアミノ酸又は擬似アミノ酸を含んで成り、それらは
生理条件下では実質的に非帯電型である。これらのスペーサーは一般に例えばAl
a,Gly、又はその他の非極性アミノ酸もしくは中性アミノ酸の天然スペーサーか
ら選ばれる。任意的に存在するスペーサーは同一の残基を含んで成るものである
必要はなく、そしてそれ故ヘテロ−又はホモ−ポリマーでありうる。存在してい
るとき、このスペーサーは通常少なくとも1又は2個の残基、より通常には3〜
6個の残基であろう。他方、この CTペプチドはスペーサー抜きでTヘルパーペ
プチドに連結してよい。
ある態様において、本発明の薬理組成物の中に CTLをプライミング(感作)す
るのに役立つ少なくとも一種の成分を含ませることが所望されうる。脂質は所定
の抗原に対する CTLをin vitroでプライミングするのに役立つことができる。例
えば、パルミチン酸残基を Lys残基のアルファー及びエプシロンアミノ基に付加
させてよく、
次いで例えば Gly,Gly-Gly-,Ser,Ser-Ser等の如くの1又は複数の連結残基を
介して、免疫原ペプチドに連結させることができる。次いで脂質付加ペプチドは
リポソームの中に組込んでミセル形態で、又は、アジュバンド、例えば不完全フ
ロインドアジュバントの中で乳化させて直接注射してよい。好適な態様において
、極めて有効な免疫原は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に Ser-Serの如くの連
結基を介して付加された Lysのアルファー及びエプシロンアミノ基に付加されて
いるパルミチン酸を含んで成る。
CTL応答の脂質プライミングの別の例として、E.コリ(E.coli)リポタンパ
ク質、例えばトリパルミトイル−S−グリセリルシステインセリル−セリン(P3C
SS) が、適当なペプチドに共有付加されているとき、特異的な CTLをプライミン
グするのに利用できうる。例えば、 Deresら、Nature 342:561-564 (1989)を参
照のこと。これは引用することで本明細書に組入れる。本発明のペプチドを例え
ば P3CSSにカップリングし、そしてそのリポペプチドを個体に、標的抗原に対す
る CTL応答を特異的にプライミングするために投与してよい。更に、中和抗体の
誘導は適当なエピトープを表示するペプチドにコンジュゲートされた P3CSSによ
りプライミングされもするため、これらの2種の組成物はMAGE抗原に対する体液
性及び細胞媒介型応答の両者をより効率的に誘引させるために組合せてよい。
前述の如く、オリゴペプチド又はペプチドの末端に更なるアミノ酸を、ペプチ
ド同志の連結のし易さのため、担体、支持体もしくは大型のペプチドに対するカ
ップリングのため、本明細書において論じている理由のため、このペプチド又は
オリゴペプチドの物理的もしくは化学的特性を改変する等のために付加してよい
。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸等の如くの
アミノ酸をこのペプチド又はオリゴペプチドのC−又はN−末端に
導入してよい。更に、このペプチド又はオリゴペプチド配列は、末端−NH2 アシ
ル化、例えばアルカノール(C1 −C20)もしくはチオグリコリルアセチル化、
末端カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンによるアミド化等に
よって改変させることにより、天然配列と相違してよい。ある状況において、こ
れらの改変は支持体又はその他の分子に対する連結のための部位を司りうる。
本発明のペプチド又は CTL及び/もしくはTヘルパー刺激活性を有するその類
似体は、その他の所望の寄与、例えば向上した薬理学特性を、未改変のペプチド
の生物活性を増強させながら、又は少なくとも実質的に完全に維持しながら供す
るように改変してよい。例えば、このペプチドは、例えば本明細書において開示
する配列由来のペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のいづれか又はその両
者でのアミノ酸の付加又は欠失により、そのペプチドのアミノ酸配列において伸
長、短縮する又は置換することにより改変できうる。課題のペプチドの CTL活性
は、上記に説明した通り、Tヘルパー細胞応答を誘導できる少なくとも一のエピ
トープを含む配列に対する連結により高めることができる。
本発明において採用するペプチドは、課題の化合物が適当な MHC分子に結合で
き、そしてMAGE抗原を発現する細胞に対する細胞障害性Tリンパ球活性又はTヘ
ルパー活性を司る限り、上記に例示したペプチド又は特定のMAGEもしくはMAGE-1
タンパク質配列と同一である必要はない。従って、このペプチドは様々な改変、
例えば挿入、欠失及び保存的又は非保存的置換にかけてよく、ここでかかる改変
はその用途において一定の利点を供しうる。保存的置換とは、アミノ酸残基を、
生物学的及び/又は化学的に類似の別の残基に置き換えること、例えばある疎水
性残基を別のものに、又はある極性残基を別のものに置き換えることを意味する
。この置換には、Gly,Ala
;Val,Ile,Leu ;Asp,Glu;Asn,Gln;Ser,Thr;Lys,Arg;及びPhe,Tyrの
如くの組合せが含まれる。通常、MAGE CTL又はTヘルパー刺激性エピトープを実
質的に擬態することを意図する配列部分は、追加のアミノ酸を例えば連結又はカ
ップリングのし易さ等のためにペプチドの物理的又は化学的性質を改変する目的
でいづれかの末端に付加している場合を除き、MAGEファミリーの少なくとも一の
構成員の配列から約20%以上相違しないものであろう。ペプチド配列の領域がMA
GE抗原間で多形態であることが見い出されている状況において、種々のMAGE抗原
の異なる細胞障害性T−リンパ球又はTヘルパーエピトープをより効率的に擬態
させるために1又は複数個の特定のアミノ酸を変えることが所望されうる。
本明細書記載の方法を用い、特定の領域から異なる又は重複する CTL又はTヘ
ルパーエピトープを規定する2種以上のペプチドが同定されうる。例えば、本明
細書記載の方法を用い、2種以上のペプチドは特定の領域、例えばMAGE-1のC末
端又は別の領域のペプチド領域から異なる又は重複する CTL又はTヘルパーエピ
トープを規定することができ、これらのペプチドは CTL又はTヘルパー媒介型応
答についての高められた免疫原性を供する「カクテル」において組合せることが
できる。一の領域のペプチドは異なる MHC制限要素を有するペプチドと組合せて
もよい。この組成物は、治療、ワクチン又は診断方法並びに本発明の組成物によ
り供される免疫学的適用範囲を、様々な民族間で有効に広げるのに利用できうる
。これらのペプチドを共有又は非共有的手段により連結するとき、その連結は連
結されたグループが前述の如く機能する、例えばMAGE細胞障害性T細胞決定基又
はMAGE Tヘルパー決定基として機能することを実質的に妨害すべきでないことが
理解されるであろう。
別の観点において、本発明のペプチドはMAGE Tヘルパー細胞エピ
トープを供するその他のペプチド、即ち、MAGEタンパク質又はその他の免疫原タ
ンパク質もしくはその誘導体に由来するTヘルパーエピトープを含む6〜30個の
アミノ酸を含んで成るTヘルパーペプチドと組合せる又はカップリングして、例
えばMAGE決定基に対する CTL応答におけるMAGE抗原に対する免疫応答の誘導にお
いて協力するT細胞を刺激することができる。このT−ヘルパー細胞は例えばT
−ヘルパー1又はT−ヘルパー2表現型のいづれかであってよい。従って、T−
ヘルパーペプチド及び CTLペプチドの組成物は、MAGE抗原に対する細胞媒介型免
疫力及び防御抗体を担うことにより個別の免疫力を高める。Tヘルパーエピトー
プは例えばGln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu(QYIKA
NSKFIGITE)〔Seq.ID No.18〕の配列を有するヘビ毒830-843 ;マラリアサーカ
ムスポロゾイト382-398 Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Va
l-Val-Asn-Ser(KIAKMEKASSVFNVVNS)〔Seq.ID No.19〕;マラリアサーカムスポ
ロゾイト378-398 Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-
Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)〔Seq.ID No.20〕;オブア
ルブミン323-336 Ile-Ser-Gln-Ala-Val-His-Ala-Ala-His-Ala-Glu-Ile-Asn-Glu
〔Seq.ID No.21〕、インレンザエピトープ307-319 Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-As
n-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr 〔Seq.IDNo.22〕他である。
好適な態様において、本発明の CTL誘導体ペプチドはTヘルパーペプチドに共
有結合している。特に好適な CTL誘導性ペプチド/Tヘルパーコンジュゲートは
スペーサー分子により連結されている。他方、この CTLペプチドはスペーサー抜
きでTヘルパーペプチドに連結されていてよい。このTヘルパーペプチドは CTL
ペプチドにコンジュゲートされ、好ましくはTヘルパーペプチドはアミノ末端に
配置させる。このペプチドは中性リンカー、例えば Ala-Ala-Ala等により連結さ
れていてよく、そして好ましくはパルミチン酸の如くの脂質残基を更に含み、こ
れは Lys残基((PAM)2Lys) のアルファー及びエプシロンアミノ基に付加され、こ
の Lys残基は一般に Ser-Ser結合等を介してペプチドコンジュゲートのアミノ末
端に付加されている。
本発明のペプチドは様々な方法で調製できる。その比較的短いサイズにより、
このペプチドは慣用技術に従って溶液中で、又は固相支持体上で合成できる。様
々な自動合成装置が市販され、そして公知のプロトコールに従って利用できる。
例えば、 Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis 、第2版、Pier
ce Chemical Co.(1984); Tamら、J.Am.Chem.Soc. 105:6442(1983);Merrif
ield,Science 232:341-347 (1986);及び Barany and Merrifield,The Pept ides
,Gross and Meienhofer,eds.,Academic Press,New York,pp.1-284(19
79)を参照のこと。それぞれ引用することで本明細書に組入れる。
他方、組換 DNA技術を採用してよく、それにおいては課題の CTLペプチド及び
/又はTヘルパーペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターの中に
挿入し、適当な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションし、そして発現に
とって適当な条件下で培養する。これらの手順は一般に、例えば開示内容を引用
することで本明細書に組入れるSambrookらMolecular Cloning,A Laboratory Ma nual
,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York(1982)及び
Ausubelら(編)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and S
ons,Ins.,New York (1987)並びに米国特許第 4,237,224、 4,273,875、 4,431
,739、 4,363,877及び 4,428,941号に記載されている。従って、本発明の1又は
複数のペプチ
ド配列を含んで成る融合タンパク質はMAGE-1 CTL決定基を提供するのに利用でき
る。例えば、 CTL応答を刺激するように、本明細書に記載のペプチド領域のエピ
トープをより効率的に供するようにアミノ酸配列を改変した組換MAGE抗原ポリペ
プチドを調製する。
ここで考えられる長さのペプチドについてのコード配列は化学技術、例えば M
atteucciらJ.Am.Chem.Soc. 103:3185(1981)のホスホトリエステル法により合
成できるため、改変は単に天然のペプチド配列をコードする適当な塩基を置換す
ることにより施すことができうる。これにより、コード配列に適当なリンカーを
施し、そして当業界において一般に入手できる発現ベクターにライゲーションし
、そして所望の融合タンパク質を生成するためにそのベクターを適当な宿主を形
質転換するのに用いる。数多くのかかるベクター及び適切な宿主系が現在入手で
きる。発現のため、このコード配列には作動的に連結された開始及び停止コドン
、プロモーター及びターミネーター領域、並びに通常は所望の細胞性宿主の中で
の発現のための発現ベクターを担う複製系が施されているであろう。むろん、細
菌、酵母又は哺乳動物細胞宿主を、適当なベクター及びコントロール配列を採用
しながら用いてよい。
本明細書記載のMAGE-1タンパク質のC末端の58個のアミノ酸をコードする完全
MAGE-1 DNA配列又はフラグメントは培養哺乳動物細胞の中に、当業者に理解され
ている通り様々な手段を介して導入できうる。例えば、リン酸カルシウム媒介型
トランスフェクション (WiglerらCell 14 :725,1978 ; Corsaro and Pearson
,Somatic Cell Genetics 7:603,1981 ; Graham and Van der Eb,Virology
52 :456,1973)、エレクトロポレーション(NeumannらEMBO J.1 :841-845,1
982)又はDEAE−デキストラン媒介型トランスフェクション(Ausubelら(ed.) Curr ent Protocols in Molecular Biology
,
John Wiley and Sons,Inc.,NY (1987),incorporated herein by reference)
が好都合でありうる。クローニング DNAが安定的に組込まれた細胞を同定するた
め、一般に課題の遺伝子又はcDNAと共に選択マーカーを細胞に導入する。培養哺
乳動物細胞において利用するのに好適な選択マーカーには、ネオマイシン、ヒグ
ロマイシン及びメトトレキセートの如くの薬剤に対する耐性を授ける遺伝子が含
まれる。更に、選択マーカーは増幅性選択マーカーであってよく、そして好適な
増幅性選択マーカーにはDHFR遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子が含まれる。選
択マーカーはThilly(Mammalian Cell Technology ,Butterworth Publishers,
Stoneham,MA)により論じられている。これは引用することで本明細書に組入れ
る。
トランスフェクションした哺乳動物細胞を、課題のMAGE-1 DNA配列の発現を開
始させるために一定期間、一般には1〜2日間増殖させる。次いで安定な状態で
選択マーカーを発現する細胞の増殖を選別するために薬剤選択を適用する。増幅
性の選択マーカーでトランスフェクションされた細胞に関し、クローニング配列
の増大していくコピー数、それ故発現レベルの増大を選択するために薬剤濃度を
段階式に増大させていってよい。
植物、鳥類及び昆虫細胞にヒトMAGE-1の如くの外来タンパク質をコードする発
現ベクターを導入するためのプロモーター、ターミネター及び方法も当業界にお
いて公知である。菌類を形質転換するための技術が論文において公知となってお
り、そして例えば Beggs(Nature 275:104-108 (1987))、Hinnenら (Proc.Nat l.Acad.Sci.USA
75:1929-1933,1978)、Yeltonら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81: 1740-1747,1984)、Russell(Nature 301:167-169,1983)及び米国特許
第 4,935,349号に記載されている。これらは引用することで本明細書に組入れる
。本発明において利用するための適切な
酵母ベクターは一般に選択マーカーを含むものであろう。これはドミナント表現
型を示す数多くの遺伝子の一つであってよく、そのための表現型アッセイが形質
転換体を選択することを可能とするように存在している。
本発明の完全MAGE-1タンパク質又はそのC末端フラグメントをコードする DNA
構築体を含む宿主細胞を次にこのタンパク質又はペプチドを生成するために培養
する。これらの細胞は選定の宿主細胞の増殖にとって必要な栄養素を含む培養培
地の中で標準の方法に従って培養する。様々な適当な培地が当業界において公知
である。この増殖培地は一般に、 DNA構築体を含む細胞を、例えば薬剤選択、又
はこの DNA構築体上にあるもしくはこの DNA構築体と共にトランスフェクション
された選択マーカーにより補完される必須栄養素の欠如により選択するであろう
。使用する特定の細胞系にとって適当な培地の選択は通常の当業者の技術常識に
属する。培養した哺乳動物細胞は一般に市販の血清含有又は無血清培地の中で培
養する。
本発明に従って作った完全MAGE-1タンパク質及びそのC末端フラグメントは、
例えば、対応のMAGEエピトープに対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナ
ル抗体を用いる抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製
し得る。更なる精製は、慣用の化学精製手段、例えばとりわけ液体クロマトグラ
フィー、勾配遠心及びゲル電気泳動により達成し得る。タンパク質の精製方法は
当業界に公知であり(一般には、Scopes R.のProtein Purification,Springer
-Verlag,NY (1982)を参照のこと;これは引用することで本明細書に組入れる)
、そして本明細書に記載の組換ヒトMAGE-1の精製に応用できうる。薬理用途にと
っては、好ましくは約50%以上、より好ましくは少なくとも約70〜80%、そして
最も好ましくは95〜99%以上の均質性の実質的に純粋な組換ヒトMAGE-1が好まし
い。所望通りに部分的又は均質となるまで一旦精製できたら、この組換ヒトMAGE
は本明細書に記載の通りに診断、治療等に利用できうる。
本発明のペプチド並びにその薬理及びワクチン組成物はMAGE抗原の発現に関係
する腫瘍を処置及び/又は予防するためにヒトを含む哺乳動物に投与するのに有
用である。
薬理組成物に関して、このペプチド、即ち、上記の如くの CTLもしくはTヘル
パーペプチド又は CTL/TヘルパーペプチドコンジュゲートはMAGE関連腫瘍に既
に苦しむ個体に投与されるであろう。腫瘍発達の早期段階にある者は適宜その他
の処置とは独立して、又はそれと一緒にこの免疫原ペプチドで処置できうる。治
療的用途において、組成物を、MAGE担持腫瘍に対して有効な CTL応答を誘発する
のに、且つその症状及び/又は合併症を治癒又は少なくともある程度緩和するの
に十分な量で患者に投与する。これを成し遂げるのに適度な量を「治療的に有効
な投与量」と定義する。この用途にとって有効な量は、例えばペプチドの組成、
投与方法、処置する病気のステージ及び症度、患者の体重及び一般健康状態、並
びにかかりつけの医師の診断に依存するであろうが、しかしながら、70kgの患者
にとって約 1.0μg〜約 500μgの初期感作(これは治療又は予防投与のため)
の一般レンジ、それに続く患者の血液中の CTL比活性を測定することによる患者
の応答及び状態に依存して数週間から数ヶ月にわたるブースティング療法に応じ
る約 1.0〜約 100μgのブースティング投与量とする。本発明のペプチド及び組
成物は一般に重症な病気の状態、即ち、生命の脅されている状況又は潜在的に生
命の脅されている状況において採用できうることを念頭におかねばならない。か
かるケースにおいて、外生物質の最少限化及びこのペプチドの相対的な無毒性の
観点において、処置医により実質的に過
剰量のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、且つ所望されるこ
とがある。
この組成物の一回又は複数回の投与を、処置医により選定される投与量レベル
及びパターンにより実施できる。いかなる状況においても、この薬理製剤は患者
を有効に処置するに足りる量の本発明の CTL又はTヘルパー刺激性ペプチドを供
すべきである。
個体は、腫瘍の発達の早期段階の際の CTL又はTヘルパー応答の不十分さ(又
は欠如)のためにMAGE関連腫瘍を発症しうるため、免疫強化量のペプチドを製剤
に供すること及び CTL又はTヘルパー細胞応答を有効に刺激するのを満足せしめ
る投与方法を供することが重要である。投与は、臨床症状又は研究室のインジケ
ーターが、その腫瘍が消失した、又はその進行が実質的に緩和したことを示すま
で、及びその後の一定期間、続ける。確立されたインターバル、例えば1〜4週
間でのインターバルでの免疫投与、それに続くブースティング投与が、腫瘍を解
消するのに必要なとき、可能としては長期にわたって必要とされうる。
治療処置のための薬理組成物は非経口、局所、経口又は局部服用を意図する。
好ましくは、この薬理組成物は非経口的に、例えば静脈内的に、皮下的に、皮内
的に、又は筋肉内的に投与する。従って、本発明は非経口投与用組成物を提供し
、これは許容の担体、好ましくは水性担体の中に溶解又は懸濁された CTL又はT
ヘルパー刺激性ペプチドの溶液を含んで成る。様々な水性担体、例えば水、緩衝
水、 0.4%の食塩水、 0.3%のグリシン、ヒアルロン酸等を使用してよい。これ
らの組成物は慣用の公知の除菌技術によって除菌するか、又は除菌濾過してよい
。得られる水性溶液はそのまま利用するように包装するか、又は凍結乾燥してよ
く、凍結乾燥製剤は投与前に除菌溶液と合わせる。この組成物は生理条件に近づ
けるのに必要
な薬理学的に許容される補助剤、例えばpH調節剤及び緩衝剤、等張性調節剤、湿
潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエ
ート等を含みうる。
一定の態様において、薬理組成物の中に CTLをプライミングする少なくとも一
の成分を含ませることが所望されうる。一定の脂質は CTL応答をin vivo でプラ
イミングでき、例えばパルミチン酸残基は Lys残基のアルファー及びエプシロン
アミノ基に付加させることができ、次いでクラスI制限型 CTLエピトープを含ん
で成る合成ペプチドに連結させることができる。本明細書に更に説明する通り、
脂質付加ペプチドはアジュバント、例えば不完全フロインドアジュバントの中に
乳化せしめたリポソームの中に組込むことができる。 CTL誘導性ペプチド/Tヘ
ルパーペプチド/脂質を含んで成るコンジュゲートの成分の配置は変えてよい。
あるケースにおいて、この脂質成分は CTL誘導性ペプチドのアミノ末端に連結し
てよく、そのペプチドはTヘルパーペプチドにそのカルボキシ末端で連結できう
る。別のケースにおいて、この脂質はTヘルパーペプチドのアミノ末端に連結し
、このペプチドをそのカルボキシ末端において CTL誘導性ペプチドに連結する。
各ケースにおいて、スペーサー分子、例えば Lys-Ser-Serを、脂質成分と CTL又
はTヘルパーペプチドとの間に、及びTヘルパーと CTL誘導性ペプチドとの間に
選択的に挿入できる。
薬理製剤中の本発明の CTL刺激性ペプチドの濃度は幅広く変えてよく、即ち約
1重量%未満から、通常は少なくとも約10重量%に至るまで、そして20〜50重量
%又はそれより多くに至るまで変えてよく、そしてそれは主として流体の容量、
粘度等により、選定した特定の投与態様に従って選定されるであろう。即ち、静
脈内点滴用の
典型的な薬理組成物は 250mlの除菌リンガー溶液及び 100mgのペプチドを含むよ
うに調製できうる。非経口投与用化合物を調製するための実際の方法は当業者に
とって公知且つ自明であり、そして例えば引用することで本明細書に組入れるRe mington's Pharmaceutical Sciences
、第17版、Mack Publishing Company,Eas
ton,PA (1985)に詳しく記載してある。
本発明のペプチドはリポソームを介して投与することもできうる。エマルショ
ン、フォーム、ミセル、不溶性単層、リン脂質分散体、多重層等が含まれるリポ
ソームは、ペプチドが特定の組織、例えばリンパ組織又は腫瘍細胞を担いうちす
るためのビヒクルとして、及びペプチド組成物の半減期を増大させることを担い
うる。これらの製剤において、このペプチドはリポソームの一部として、単独で
、又は例えばリンパ球又は腫瘍細胞において広がるレセプターに結合する分子、
例えばモノクローナル抗体と共に、又はその他の治療もしくは免疫原組成物と共
に輸送される。様々な方法がリポソームを調製するのに有用であり、それは例え
ば引用することで本明細書に組入れる米国特許第 4,837,028及び 5,019,369号に
記載されている。
別の観点において、本発明は本明細書に記載の免疫学的に有効な量の CTL刺激
性ペプチドを活性成分として含むワクチンに関する。このペプチドはそれ自体の
担体に連結された状態で、又は活性ペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロ
ポリマーとしてヒトを含むホストに導入されうる。かかるポリマーは増強した免
疫学的反応の長所を有し、そしてポリマーを作成するのに異なるペプチドを利用
するとき、MAGEタンパク質の異なる抗原決定基と反応する抗体及び/又は細胞障
害性T細胞を誘導する更なる能力を有する。有用な担体は当業界に公知であり、
そして例えばチログロブリン、アルブミ
ン、例えばヒト血清アルブミン、ヘビ毒、ポリアミノ酸、例えばポリ(D−リジ
ン:D−グルタミン酸)、インフレンザ、B型肝炎ウィルスコアタンパク質等が
含まれる。これらのワクチンは生理学的に寛容される(許容される)希釈剤、例
えば水、リン酸緩衝食塩水、又は食塩水を含んでもよく、そして更に一般にはア
ジュバントを含む。アジュバント、例えば不完全フロインドアジュバント、リン
酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバンが当業界に公知の材料であ
る。本明細書に記載のペプチド組成物による注射、エアゾール、経口、経皮又は
その他のルートを介する免疫により、そのホストの免疫系はMAGE抗原に対する大
量の CTL特異体を生成することによりワクチンに応答し、そしてこのホストはMA
GE担持腫瘍に対して少なくともある程度は免疫される、又はかかる腫瘍に対して
耐性となる。
本発明のペプチドを含むワクチン組成物はMAGE関連腫瘍、例えばメラノーマが
発達し易い又は発達する危険性のある患者に、その患者自身の免疫応答能を高め
るために投与する。かかる量は「免疫学的に有効な投与量」と定義する。この用
途において、ここでもその正確な量は患者の健康状態及び体重、投与方法、製剤
の種類等に依存するが、一般には70kgの患者当り約 1.0μg〜約 500μg、より
一般には70kgの患者当り約50μg〜約 100μgに範囲する。 CTL誘導性ペプチド
は適当な HLAタイプの個体に投与する。ある状況においては、本発明のペプチド
ワクチンを、例えばp97腫瘍抗原の如くの腫瘍抗原に対して中和性の細胞又は抗
体応答を誘導するワクチンと組合せることが所望されうる。
治療又は免疫の目的のため、本発明のペプチドを虚弱化ウィルスホスト、例え
ば痘疹又は鶏痘によって発現させてもよい。この手法は、本発明のペプチド又は
コンジュゲートをコードするヌクレオチ
ドを発現させるためのベクターとしての痘疹ウィルスの利用を包括する。ホスト
への導入により、この組換痘疹ウィルスはMAGEペプチドを発現し、それ故腫瘍細
胞上のMAGE抗原に対するホストの CTL又はTヘルパー応答を誘引する。免疫プロ
トコールにおいて有用な痘疹ベクター及び方法は例えば引用することで本明細書
に組入れる米国特許第 4,722,848号に記載されている。本発明のペプチドの治療
的投与又は免疫にとって有用な多種多様なその他のベクターが、本明細書の記載
より当業者にとって明らかとなるであろう。
本発明の免疫原性ペプチドは CTLをex vivo で誘引するのに用いることができ
うる。得られる CTLはその他の慣用の治療形式に応答しない、又はペプチドワク
チン治療手法に応答しないであろう患者の腫瘍を処置するのに利用できうる。MA
GE発現性腫瘍に対するex vivo CTL応答は、組織培養物の中で、患者の CTL前駆
細胞(CTLp)を抗原表示細胞(APC) の起源及び適当な免疫原性ペプチドと共にイ
ンキュベートすることにより誘導される。CTLpが活性化され、そして成熟してエ
フェクター CTLへと発展する適当なインキュベーション時間(一般に1〜4週間
)の後、この細胞を患者に戻し、そこでそれらは標的の腫瘍細胞を阻害又は殺傷
するであろう。
このペプチドは診断試薬としての用途も有しうる。例えば、本発明のペプチド
は、このペプチド又は近縁のペプチドを採用する処置療法に対する特定の個体の
感受性を決定するのに利用でき、それ故現存の処置プロトコールを改良するうえ
で、又は冒された個体の予後を調べるうえで有用でありうる。更に、これらのペ
プチドはMAGE関連腫瘍が発症するかなりの危険性のあるであろう個体を予測する
のにも利用できうる。
以下の実施例は例示のためであり、限定を目的として提供するわけではない。
実施例1 全長MAGE DNAのクローニング
MAGE-1の推定コード領域を、bp 605〜622 及び bp 1459〜1476に位置するプラ
イマーを用いる PCR増幅により、MAGE-1陽性細胞系 938から合成した第一鎖cDNA
よりクローニングした。増幅は高電場熱安定性ポリメラーゼ Pfuを用い、95℃で
2分、50℃で2分及び73℃で2分の30回のサイクルにより実施した。これらの条
件はMAGE-1について推定されるサイズと一致した 870bpのフラグメントの増幅を
もたらした。この増幅フラグメントを更なる特性決定のためにベクター pRc/RS
V (Invitrogen)の中にサブクローニングした。
このクローニングしたフラグメントをシーケナーゼ(v 2.0,USB)及びMAGE-1特
異的プライマーを用いて配列決定した。クローニングしたフラグメントの配列の
特性決定はヌクレオチド1377に挿入されたシチジンを見い出した。この挿入は配
列のすぐ3′側にある。
PCR増幅の際にこの挿入が導入されたかどうかを決定するため、オリジナル細
胞系由来の及び4人の個々の正常個体由来のMAGE-1のゲノム配列を決定した。ゲ
ノム DNAを単離し、そしてMAGE-1遺伝子をオリジナルのクローニングにおいて利
用したのと同じ条件を利用して増幅させた。この増幅フラグメントをヌクレオチ
ド1427−1448に対応するアンチセンスプライマーを用いてサイクル配列決定した
。
ゲノム DNAの単離:MAGE-1発現性細胞系由来の細胞を組織培養ストックから直
接採取した。個体からのゲノム DNAの単離のための手順は以下の通りである:15
mlのヘパリン処理全血を15mlの RPMI 1640培地と混合し、そして20mlのリンパ球
分離用媒体の上にかぶせ、そして 400×gで15分、製造者のプロトコール(Ficol
l-Paque,Pharmacia) に従って遠心した。この細胞層を集め、そして RPMI 1640
培地で2回洗った。そのリンパ球を数、90%の胎児牛血清の中で4×106 細胞/
mlで再懸濁し、そして更なる処理まで液体窒素の中で保存した。
解凍した細胞ペレットを 400μlの溶解バッファー(4.2Mのグアニジンチオシ
アネート、25.5mMの酢酸ナトリウム、 122mMのβ−メルカプトエタノール) の中
で溶解させた。このリゼートを等容量のフェノール/クロロホルムで、次いで等
容量のクロロホルムで一回抽出した。酢酸ナトリウムを 0.3Mの最終濃度になる
まで加え、次いで DNAを2容量のエタノールで沈殿させた。精製したゲノム DNA
を 200μlの H2Oの中に再懸濁した。 DNA濃度はフルオロメトリーにより、製造
者により供された仕様書に従って決定した(TKO 100フルオロメーター、Hoeffer)
。DNA増幅
0.5μgのゲノム DNA、 0.5μMづつの増幅プライマー(プライマーは上記の
通り)、10mMのトリス−HCl(pH 8.8) 、50mMの KCl、1.5mMの MgCl2、 0.001%
(w/v)のゼラチン、 500μMづつの4種全てのデオキシリボヌクレオチド三
リン酸(dNTP)を含む 100μlの反応混合物を調製し、1.25単位の Taq DNAポリ
メラーゼ(Stratagene)を加えた。利用した条件は:95℃で2分、50℃で2分、
72℃で2分の30サイクルとした。PCR DNAフラグメントの精製
:
100μlの反応混合物を、10μg/mlの臭化エチジウム、40mMのトリス−酢酸
、1mMのEDTAを含む1%のアガロース(SeaKem Agarose,FMC Inc.)ゲルによる
電気泳動により分画した。所望の DNAフラグメントを含むゲルスライス (MAGE-1
増幅フラグメントについて870bp)をUV照射の際に切り出した。 DNAをガラスビー
ズ精製キット(Qiaex,Qiagen) を用いて精製し、そして20μlの H2Oの中で溶出
させた。DNA配列決定
:
溶出させた DNAを全て、市販のサイクル配列決定用キット(ΔTaq Cycle-Sequ
encing Kit,United States Biochemical)の製造者により推奨されている〔35S
〕dCTP組込みプロトコールの後に適当なプライマー(MAGE-1増幅フラグメントの
49ヌクレオチド下流)により配列決定した。この配列決定用反応は8%のポリア
クリルアミドゲル(0.4mmの厚さ) による電気泳動によって分画した。このポリア
クリルアミドゲルを乾かし、そしてX線フィルム(XAR-5,Kodak)に16〜48時間
曝露した。
5種のMAGE 1遺伝子はそれぞれGen Bankエントリーにおける配列と対比したと
き、ヌクレオチド1377でのシチジン挿入を含んでいた。この挿入は有意義であり
、なぜならこれは遺伝子のリーディングフレームをシフトさせ、25個のC末端の
アミノ酸を変え、そして更に33個のアミノ酸についてのタンパク質にも及ぶから
である。このヒトMAGE-1タンパク質の全長 DNA及びアミノ酸配列を図1に示す。
図2はヒトMAGE-1タンパク質について新たに発見されたC末端部分のヌクレオチ
ド及びアミノ酸配列を示す。
実施例2 C末端由来のMAGE免疫原性ペプチドの同定
様々な MHCクラスIアレルのモチーフを利用し、MAGEタンパク質のC末端をモ
チーフの存在について分析した。
HLA-A3.2のモチーフはN末端からC末端に至るまで、2位においてL,M,I
,V,S,A,T及びFの第一保存残基を、そしてC末端においてK,R又はY
の第二保存残基を含んで成る。その他の第一保存残基はC,G又はD、そして他
にEである。その他の第二保存残基はH又はFである。この第一及び第二保存残
基は6〜7個
の残基により隔てられている。
HLA-A1のモチーフはN末端からC末端に至るまで、T,S又はMの第一保存残
基を、D又はEの第二保存残基を、そしてYの第三保存残基を含んで成る。その
他の第二保存残基はA,S又はTである。この第一及び第二保存残基は隣り合っ
ており、そして好ましくは6〜7残基で第三保存残基と隔てられている。第二保
存残基はE又はDの第一保存残基及びYの第二保存残基より成り、ここでこの第
一及び第二保存残基は5〜6残基で隔てられている。
HLA-A11のモチーフはN末端からC末端に至るまで2位においてT又はVの第
一保存残基を、そしてKのC末端保存残基を含んで成る。この第一及び第二保存
残基は好ましくは6又は7残基で隔てられている。
HLA-A24.1のモチーフはN末端からC末端に至るまで2位においてY,F又は
Wの第一保存残基を、そしてF,I,W,M又はLのC末端保存残基を含んで成
る。この第一と第二保存残基とは好ましくは6〜7残基で隔てられている。
9量体のペプチドのHLA-A2.1のモチーフはL及びV位においてアミノ酸I,V
,A及びTのいづれかを、そして9位においてL,I,A及びMのいづれかを含
む。1位には酸性アミノ酸もPもない。3位においては1個のアミノ酸のみがあ
り、そして塩基性アミノ酸は見い出せなかった。6及び7位は帯電残基を示さな
かった。しかしながら、酸性アミノ酸が8位においてしばしば見い出され、A2.1
モチーフの我々の定義に従うと、そこでそれらは寛容される。従って、天然的に
プロセスを受けたペプチドの配列の分析は、>90%のペプチドが完全モチーフの
規定の法則に従っていた。
10量体のペプチドのHLA-A2.1のモチーフは2位においてアミノ酸L,M,I,
V,A及びTのいづれか、そして10位においてV,I
,L,A及びMのいづれかを含む。例えば1位において、ここでもP残基及び酸
性アミノ酸は10量体において寛容されなかった。更に、10量体における1位にお
いて、芳香族残基がA2.lバインダーの中でしばしば認められた。3位において、
酸性アミノ酸はしばしば9量体及び10量体の両者の弱い結合能に関連していた。
しかしながら、興味深いことに、9量体では3位の芳香族残基が好ましいが、10
量体では脂肪族残基(L,V,I,M)が好ましかった。
これらのモチーフを利用して同定した長さが約9及び10個のアミノ酸の免疫原
性ペプチドを表1に記載した。
次にこれらのペプチドを、引用することで本明細書に組入れる係属中の共有出
願 USSN 08/027,746 号に記載の特異的結合アッセイを利用して、適当なクラス
I分子に結合するその能力について評価した。結合アッセイの結果を表2に示す
。
強力及び中程度のバインダーである免疫原性ペプチドをin vitro CTL応答を誘
導するその能力について試験した。
このアッセイは下記の通りに実施した。
CTLエピトープを同定するため、 CTLを APCとして SAC-I活性化PBMCにより刺
激した。それにおいてはβ−2ミクログロブリンが不安定となる MHCの低温発現
を、PBMC APCを作製するために、酸ストリッピングに加えて利用した。
完全培養培地。この研究において利用した組織培養培地は、2mMのL−グルタ
ミン(Irvine Seientific) 、 0.5mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco) 、100U/
100μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(Irvine)及び5%の熱不活性
化AB型ヒト血清(RPMI/5% HS ;Gemini Bioproducts)の添加された Hepes抜
きのRPMI 1640(Biowhittaker) より成る。 EBV形質転換化系の増殖において用い
た培養培地はヒト血清の代わりに10%の熱不活性化胎児牛血清(RPMI/10%の F
CS、Irvine)を含んだ。
サイトカイン。Sandozより組換ヒトインターロイキン−2(rIL-2) 及びインタ
ーロイキン−4(rIL-4) を入手し、そしてそれぞれ10μg/ml及び10μg/mlの
最終濃度で使用した。ヒトインターフェロン−γ(IFN-γ)及び組換ヒトインタ
ーロイキン−7(rIL-7) は Genzymeより入手し、そしてそれぞれ20U/ml及び10
ng/mlで使用した。
ペプチド。ペプチドは自動合成装置で合成し、そして表1に記載してある。ペ
プチドを 100%のDMSOの中に20mg/mlに通常通りに希釈し、小分けし、そして−
70℃で保存した。クラスI結合能において5倍以上相違しないペプチドのプール
を2〜3種のペプチド/プールで試験した(もしプールが特異的ペプチドについ
て考えられないのなら、個別のペプチドを試験した)。
細胞系。JY,Steinlin,EHM,BVR及びKT3はそれぞれ HLA A2.1,A1,A3,A11
及び A24を発現するホモ接合ヒト EBV形質転換化B細胞系である。これらはRPMI
/10% FCSの中で増殖させる。RPMI/10% FCSの中で増殖させたK562,NK細胞感
受性エリトプラストーマ細胞系をバックグランド殺傷の低下のために用いた。
末梢血液単核細胞(PBMC)の単離。全血をヘパリン含有シリンジの中に集め、
そして50ccのチューブの中で1600RPM(Beckman GS-6KR) で15分遠心した。血漿層
を取り除き、そして10mlのバッフィーコートをピペットにより円運動を利用して
集めた(チューブの底から更に2mlを10mlの中に含ませた)。このバッフィーコ
ートをよく混合し、そして等容量のRPMIで希釈した。このバッフィーコート(30
ml)を20mlのフィコール−パック(Pharmacia) の上に載せ、そして1850RPM(400
g)で20分、25℃で、ブレーキをオフにして遠心した。フィコールとPBMC含有血
漿との間の界面を分注ピペットで回収し(50mlのチューブ当り2界面)、そして
50mlのRPMI(1700,1500及び 1300RPMで10分)で3回洗った。細胞を10〜20mlの
培養培地に再懸濁し、計測し、そして適当な濃度に調整した。
PBMCの凍結。3000万個の細胞/チューブ(90%の FCS/10% DMSO;Sigma)をイ
ソプロパノール(Fisher)を含むNalgene Cryo 1℃フリージング・コンテナーの
中に入れ、そして−70℃で4hr(最短)〜一夜(最長)置いた。イソプロパノー
ルは5分毎に交換した。チューブを液体窒素に長期保存のために移した。解凍の
ため、PBMCを37℃の湯浴の中で、最後の結晶がほぼ解凍するまで連続振盪した(
チューブは常に湯浴又は室温において静置しないようにさせた)。細胞を無血清
RPMIに希釈し、そして2回洗った。
APCとして SAC-I活性化PBMCを用いる一次 CTLの誘導
a. APCの調製:PBMCを標準のフィコール・パックプロトコール
を利用して精製し、そして 0.005%の Pansorbin細胞(プロテインAを発現する
SAC-I細胞;Calbiochem)、20μg/mlのイムノビーズ (ウサギ抗ヒト IgM;Bi
o Red)及び20ng/mlのヒト rIL-4を含むRPMI/5% FCSの中で1×106 /mlに再
懸濁した。ウェル当り2mlの細胞を24穴プレート(Falcon,Becton Dickinson)
の中でプレート培養し、そして37℃で培養した。3日後、この培地を除去し、そ
して細胞を3回洗い、そしてRPMI/10% HS を加えた。細胞はRPMI/10% HS の
中で更に2日間培養した後に用いた。
b. APCの表層上でのエンプティークラスI分子の発現及び APCのペプチド負 荷
1.低温インキュベーション:
a. APCにおけるエンプティー MHCの発現: APCを、10ng/mlの rIL-4、20U
/mlのヒトIFN-γ及び3μg/mlのβ−ミクログロブリン(β2m)を含む完全培
養培地(セクション#1)の中で2×106 /mlの濃度に調整した。次いで細胞を
5%の CO2の存在下で26℃で一夜インキュベートした。これらの細胞はほんのわ
ずかなクラスI分子を空虚な(empty) 状態で発現する(〜10%)。
b. APC刺激性細胞のペプチド負荷:エンプティークラスI発現性 APCを無血
清RPMI (+L−グルタミン及びHepes)で1〜2回洗い、そして全部で50μg/ml
のペプチドプール(即ち、3プールにおいては16.7μg/mlづつ;2プールにお
いては25μg/mlづつ;そして個々のプールにおいては50μg/ml)、30μg/
mlの DNAse及び3μg/mlのβ2mを含む無血清RPMIの中で1×107 において再懸
濁した。20℃で4時間のインキュベーション後、これらの細胞を6100radで照射
し(5×106 /ml;2500万細胞/チューブ)、洗い、そして誘導培養に添加する
のに適当な濃度に調整した(以下参照)。
2.酸ストリッピング:これは APCの表層上でエンプティー MHCを作るための
別の方法として利用した。 SAC-I活性化PBMCを1%の BSAを含む低温の 0.9%の
食塩水(J.T.Baker) の中で一回洗った。これらの細胞を1%の BSA及び3μg/
mlのβ2mを含む低温クエン酸−リン酸バッファー(0.13MのL−アスコルビン酸
〔J.T.Baker 〕,0.06Mのリン酸ナトリウムモノベース〔Sigma 〕、pH3)の中
で 107/mlに再懸濁した。2分後、1%の BSA、3μg/mlのβ2m及び10μg/
mlのペプチドを含む5容量の低温の0.15Mのリン酸ナトリウムモノベースバッフ
ァー、pH 7.5(中和バッファー#1)を加え、そしてこの細胞を 1500RPMで4℃
で5分遠心した。この細胞を1%の BSA、30μg/mlの DNase、3μg/mlのβ2
ミクログロブリン及び50μg/mlのペプチドを含む1mlの低温PBS(中和バッフ
ァー#2) の中に再懸濁し、そして20℃で4時間インキュベートした。上記の通
りにして、20℃で4時間のインキュベーション後、その細胞を 6100radで照射し
(5×106 /ml;2500万細胞/チューブ)、洗い、次いで誘導培地に加えるため
に適当な濃度に調整した(以下参照)。
c.CD4+の枯渇したPBMCレスポンダー細胞集団の調製(AISフラスコを用いるリ ンパ球サブ集団の枯渇)
AISマイクロコレクター T-150フラスコ(CD4+ T細胞の枯渇のための製品;Men
lo Park,CA)を25mlの PBS/1mMのEDTAを加えることによりプライミングし、
表面全体が湿るようにゆらし、次いで結合表層を室温にまで下げて1hインキュ
ベートした。インキュベーション後、フラスコを強く30秒間振盪し、 PBS/EDTA
で1回洗い、更に PBSで2回洗い、次いで25mlの培養培地と15分インキュベート
した。PBMCを30μg/mlの DNAseを含む無血清RPMI (+L−グルタミン+Hepes)
の中で解凍し、そして培養培地の中で15分インキュベ
ートした。フラスコから培養培地のアスピレーションした後、 18000万個のPBMC
を30μg/mlの DNAseを含む25mlの培養培地に加えた。室温で1時間後、このフ
ラスコを10秒間ゆっくりとゆらして非接着細胞を再懸濁した。CD8+ T細胞を含む
この非接着細胞懸濁物を集め、そしてフラスコを PBSで2回洗った。CD4+ T細胞
枯渇PBMCを遠心し、そして誘導培地への添加のために計測した。CD4+枯渇細胞集
団のCD4+及びCD8+表現型をFACS分析により決定した(以下参照)。一般に、この
技術はCD8+ T細胞を2倍濃縮し、平均してCD4+ T細胞を枯渇を経て約40〜50%の
CD8+ T細胞及び15〜20%の残基CD4+ T細胞となった。
d.一次 CTLの誘導。刺激性 APCの4時間のペプチド負荷の際、レスポンダー
集団として利用するCD4+枯渇PBMCを、CD4+ T細胞を枯渇(上記)を通じてCD8+ T
細胞を選択するために AISフラスコを利用して調製した。このレスポンダー細胞
を1mlの容量(24穴プレート)の中で3×106 /mlでプレート培養し、そしてペ
プチド負荷刺激性 APCが調製されるまで37℃に置いた。照射を付したペプチド負
荷 APCを無血清RPMI (+Lグルタミン及びHepes)で1回洗い、完全培地の中で適
当な濃度に調整し、そして24穴プレートに1ml/プレートでプレート培養した:
PBMCに関して、1×106 の刺激性細胞(1mlの容量)をレスポンダー細胞含有ウ
ェルの中でプレート培養した。 SAC-I活性化PBMC及び PHAブラストについては、
1mlの3×105 /mlの刺激性細胞を各ウェルの中でプレート培養した。最終濃度
が10μg/mlの更なるペプチドを、10ng/mlの最終濃度のrIL-7(全部で2mlの容
量)の他に加えた。この細胞を12日間培養した。(「パルスのみ」の誘導プロト
コールについては、培地に追加の10μg/mlの可溶性ペプチドは加えなかった)
。12日目、その培養物をペプチドでパルスした接着細胞で再刺激し、そして7日
後に細胞溶解
活性について試験した(以下)。
接着性 APCを利用する一次 CTLの再刺激についてのプロトコール。PBMCを30μ
g/mlの DNAseを含む無血清RPMI (+Lグルタミン及びHepes)の中で解凍し、2
回洗い、そして DNAseを含む培養培地の中で5×106 /mlに調整した。PBMC(25
00細胞/5mlのチューブ)を 6100Rで照射した。1回の洗浄後、このPBMCを培養
培地に再懸濁し、そして4×106 /mlに調整した。1mlの照射PBMCを24穴プレー
トのウェル当りに加えた。このPBMCを37℃で2時間インキュベートし、非接着細
胞を除くために3回洗い、そして 0.5mlの容量の中に加えた20μg/mlの総ペプ
チド及び3μg/mlのβ2 ミクログロブリンを含む培地の中で培養し、そして再
び37℃で2時間インキュベートした。このペプチドをアスピレートし、そして培
養培地の中に再懸濁した 1.5×106 のレスポンダー細胞を1mlの容量に加えた。
2日後、20U/mlの rIL-2を含む1mlの培養培地を加えた。
FACS分析。 100万個の細胞/チューブを遠心し、チューブ当り 100μlの PBS
/ 0.1%の BSA/0.02%のアジ化ナトリウム(Sigma) とチューブ当り10μlの直
接コンジュゲーション型抗体(Becton Dickinson)の中に再懸濁し、そして15〜
20分インキュベートした。次いで細胞を PBS/ 0.1%の BSA/0.02%のアジ化ナ
トリウムで2回洗い、そして PBSの中で再懸濁して FACScanで分析した(Becton
Dickinson)。1〜2日以内にサンプルを分析することができないとき、細胞を
1%のパラホルムアルデヒド(Fisher)を含む PBSで固定し、そして1週間以内
に分析した。
細胞障害性アッセイ
a.標的細胞の調製。 CTLアッセイの約16〜20時間前、標的細胞(クラスIマ
ッチ EBV形質転換化系)を1回洗い、そして10μg/mlの全ペプチドの存在下又
は非存在下でRPMI/5% FCSの中で3×
105 /mlで10mlの容量において再懸濁した。
b.標的細胞のラベリング:標的細胞を遠心し、そして 200μl/チューブの
ナトリウム51Crクロメート(NEN) に再懸濁し、次いで37℃で1時間シェーカー上
でインキュベートした。標的をRPMI/10% FCSで3回洗い(10ml/洗浄)、そし
て10mlに再懸濁した(ラベルの効率を調べるため、50μl/標的をMicromedic自
動ガンマーカウンターで計測した)。
c. CTLアッセイ。標的細胞を2×105 /mlに調整し、そして50μlの細胞培
養物をU底96穴プレート(Costor Corp.)の各ウェルに1×104 /ウェルの最終
濃度となるように加えた。K562細胞を1回洗い、4×106 /mlに再懸濁し、そし
て50μl/ウェルを2×105 /ウェルとなるように加えた(低K562、対、標的の
比は20:1とした)。レスポンダー細胞を1回洗い、9×106 /mlに再懸濁し、
そして90:1,30:1,10:1及び3:1のエフェクター、対、標的の比とする
ために3倍系列希釈を実施した。レスポンダー細胞をデュプリケートのウェルの
中で 100μlの容量で加えた。自発的遊離のため、50μl/ウェルのラベル化標
的細胞、50μl/ウェルのK562及び 100μl/ウェルの培地を加えた。最大遊離
のため、50μl/ウェルの標的、50μl/ウェルのK562及び 100μl/ウェルの
0.1%のトリトン−X100(Sigma) を加えた。プレートを 1200rpmで5分遠心した
。37℃で5時間のインキュベーション後、プレートを再び 1200rpmで5分遠心し
、そして 100μl/ウェルの上清液を回収した。標準ガンマー計測技術(Microm
edic自動ガンマーカウンター; 0.5分/チューブ)を次の式に従って%比溶解を
決定するために用いた:%比溶解= cpm実験値− cpm自発遊離/ cpm最大遊離−
cpm自発遊離×100 。 CTLアッセイは、最も高い2つのエフェクター、対、標的
(E:T)比で特異的なペプチドで感作した標的の C
TLによる溶解力がコントロール標的(即ち、ペプチド抜きの標的細胞)の溶解力
よりも15%高いとき、陽性と考えられる。細胞障害性活性は、最も高い2つのE
:Tの比で特異的ペプチドにより感作した標的の CTLによる溶解力がコントロー
ル標的の溶解力よりも6%高いときにボーダーラインであると考えられる。表示
のアレルに結合する63種のMAGEペプチドのうち、12が一次 CTL応答を誘導した。
本発明を例示の目的で詳しく説明してきたが、一定の変更及び改良を本発明の
範囲を逸脱することなく施せることが理解されるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C12P 21/02 8517−4H C07K 14/46
// A61K 48/00 9281−4B C12N 5/00 E
C07K 14/46 9051−4C A61K 37/02 ADU
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD),AM,AT,
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Z,DE,DK,ES,FI,GB,GE,HU,JP
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LV,MD,MG,MN,MW,NL,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SI,SK,TJ
,TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 セット,アレッサンドロ ディー.
アメリカ合衆国,カリフォルニア 92037,
ラ ジョラ,リンダ ローザ アベニュ
5551
(72)発明者 シドニー,ジョン シー.
アメリカ合衆国,カリフォルニア 92037,
ラ ジョラ,ビラ ラ ジョラ ドライブ
8541ディー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.約9〜10個のアミノ酸を含んで成る免疫原性ペプチドであって、 Seq.ID No.1のC末端の58個のアミノ酸に由来するペプチド。 2.HLA-A1/11結合性モチーフを有し、ここで前記免疫原性ペプチドが 274 MAGE1N Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val-Leu-Glu-Tyr,(A01/11) 〔Seq.ID No.2 〕;及び 275 MAGE1N Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val-Leu-Glu-Tyr,(A01/11) 〔Seq.ID No. 3 〕; より成る群から選ばれる、請求項1記載の免疫原性ペプチド。 3.HLA-A2結合性モチーフを有し、ここで前記免疫原性ペプチドが 279 MAGE1N Lys-Val-Leu-Glu-Tyr-Val-Ile-Lys-Val,(A02) 〔Seq.ID No.4 〕 ; 265 MAGE1N Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Ala,(A02) 〔Seq.ID No.5 〕 ; 302 MAGE1N Ala-Leu-Arg-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Val,A02 〔Seq.ID No.6 〕; 271 MAGE1N Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val,A02 〔Seq.ID No.7 〕 ; 283 MAGE1N Tyr-Val-Ile-Lys-Val-Ser-Ala-Arg-Val,(A02) 〔Seq.ID No.8 〕 ;及び 270 MAGE1N Arg-Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val,(A02) 〔Seq.ID No.9 〕 ; より成る群から選ばれる、請求項1記載の免疫原性ペプチド。 4.HLA A3/A11結合性モチーフを有し、ここで前記ペプチドが 275 MAGE1N Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val-Leu-Glu-Tyr, (AA03/11) 〔Seq.ID N o.10〕; 290 MAGE1N Arg-Val-Arg-Phe-Phe-Phe-Pro-Ser-Leu-Arg,(A03/11) 〔Seq.ID No.11〕; 271 MAGE1N Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val-Lys, A03/11 〔Seq.I D No.12〕; 270 MAGE1N Arg-Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys,(A03/11) 〔Seq.ID No.13〕; 242 MAGE1N Asp-Leu-Val-Gln-Glu-Lys-Tyr-Leu-Glu-Tyr,(A03) 〔Seq.ID No. 14〕; 283 MAGE1N Tyr-Val-Ile-Lys-Val-Ser-Ala-Arg-Val-Arg,(A03) 〔Seq.ID No. 15〕;又は 243 MAGE1N Leu-Val-Gln-Glu-Lys-Tyr-Leu-Glu-Tyr,(A11) 〔Seq.ID No.16〕 ; より成る群から選ばれる、請求項1記載の免疫原性ペプチド。 5.HLA-A24結合性モチーフを有し、ここで前記免疫原性ペプチドが: 276 MAGE1N Ser-Tyr-Val-Lys-Val-Leu-Glu-Tyr-Val-Ile,(A24) 〔Seq.ID No. 17〕 である、請求項1記載の免疫原性ペプチド。 6.Seq.ID No.1のC末端の58個のアミノ酸から選ばれた免疫原性ペプチドを コードする単離された DNA。 7.Seq.ID No.1のC末端の58個のアミノ酸から選ばれた免疫原性ペプチドを コードする DNAを含んで成るベクター。 8.請求項6記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
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