KR19990067653A - 종양 백신 및 그의 제조 방법 - Google Patents
종양 백신 및 그의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR19990067653A KR19990067653A KR1019980703681A KR19980703681A KR19990067653A KR 19990067653 A KR19990067653 A KR 19990067653A KR 1019980703681 A KR1019980703681 A KR 1019980703681A KR 19980703681 A KR19980703681 A KR 19980703681A KR 19990067653 A KR19990067653 A KR 19990067653A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tumor
- cells
- peptide
- vaccine
- peptides
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 151
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 223
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 153
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 125
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 111
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 66
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 64
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 47
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 24
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 14
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 7
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N Ala-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 claims description 3
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N Gly-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N 0.000 claims description 3
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims description 3
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims description 3
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 claims description 3
- FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N Phe-Phe-Ile Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N 0.000 claims description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 claims description 3
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N 0.000 claims description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 2
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 claims 7
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 13
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 9
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound CN=C(N)NN=O DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003359 CD4-positive helper T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 rare earth metal ions Chemical class 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 종양 백신 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 종양 백신은 그의 일부가 세포 표면에 적어도 하나의 환자의 MHC-I-하플로타입을 함유하고, 종양 세포가 펩티드의 측면에서 환자의 면역계에 의해 이물질로서 인식되어 면역 반응을 유발하는 방식으로 MHC-I 분자에 결합된 하나 이상의 펩티드로 하전된 종양 세포를 포함한다. 대전은 폴리라이신 등의 폴리양이온의 존재하에서 수행된다.
Description
종양 세포에 기초한 치료용 백신의 개발은 본질적으로 다음의 조건에 의존하고 있다: 종양 세포 및 정상 세포 사이에는 정성적 및 정량적 차이가 있다; 면역계는 근본적으로 이들 차이를 인식할 수 있다; 면역계는 백신을 사용한 특이적 능동 면역에 의해 자극되어 이들 차이의 수단에 의해 종양 세포를 인식하고 이들이 거부되도록 유발한다.
항종양 반응을 성취하기 위하여, 적어도 두가지 조건이 만족되어야 한다: 먼저, 종양 세포는 정상 세포에서는 발생하지 않는 항원 또는 네오-에피토프를 발현해야 한다. 두번째, 따라서 면역계는 이들 항원에 반응하기 위해서 활성화되어야 한다. 종양의 면역 요법에 있어서 심각한 장애는 특히 인간에 있어서 이들의 낮은 면역원성에 있다. 이것은 악성 세포에 있어서 많은 수의 유전적 변화가 세포독성 T-임파구의 MHC-1 분자와 관련하여 인식될 수 있는 펩티드 네오-에피토프의 형성을 초래하는 것으로 예상할 수 있을 정도로 놀라운 것이다.
최근에, 그러한 네오-에피토프로 구성되고 따라서 면역계에 의한 공격에 대한 잠재적인 표적을 구성하는 종양 관련 및 종양 특이성 항원들이 발견되었다. 그럼에도 불구하고 면역계가 이들 네오-에피토프를 발현하는 종양을 제거하는데 있어서 성공하고 있지 못하다는 사실은 네오-에피토프의 부재에 기인하는 것이 아니라 이들 네오-항원에 대한 면역학적 반응이 부적절하다는 사실에 기인하는 것이 명백할 것이다.
세포의 토대 위에서 암의 면역요법에 대하여, 두가지의 일반적인 전략이 개발되었다; 한편으로는, 종양 반응성 T-임파구의 in vitro 팽창 및 이들의 환자 내로의 재도입을 이용하는 입양(adoptive) 면역요법이고; 다른 한편으로는, 이것이 종양 항원에 대한 새로운 또는 보다 강력한 면역 반응을 중 하나를 일으켜 전신계의 종양 반응을 초래할 것을 기대하며 종양 세포를 사용하는 능동 면역요법이다.
능동 면역요법에 기초한 종양 백신은 다양한 방식으로 제조되어 왔는데; 그 한 예는 종양 항원에 대해 면역 반응을 일으키기 위하여 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 또는 바실러스 칼메테 구에린(Bacillus Calmette Guerin, BCG) 등의 면역촉진 보조제와 혼합된, 조사된 종양 세포로 이루어진다(참조: Oettgen and Old, 1991).
최근에, 특히 유전적으로 변형된 종양 세포가 암에 대한 능동 면역요법에 사용되었는데, 종양 세포 내로 도입된 외래 유전자는 다음의 3개의 부류에 속한다.
이들 중 하나는 사이토카인을 생성하기 위하여 유전적으로 변형된 종양 세포를 사용한다. 종양 세포와 사이토카인 신호의 국부적 일치는 항-종양 면역을 유발하는 자극을 제공하는 것으로 추정된다. 이 방법의 응용에 대한 고찰은 문헌 [Pardoll, 1993, Zatloukal et al., 1993 and Dranoff and Mulligan, 1995]에 제공되어 있다.
IL-2, GM-CSF 또는 IFN-γ 등의 사이토카인을 분비하기 위하여 또는 동시 자극하는 분자를 발현시키기 위하여 유전학적으로 변형된 종양세포는 실험 동물에서 강력한 항종양 면역을 나타내는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1995]. 그러나, 이미 실질적인 종양을 가지고, 종양에 대한 관용성을 전개한 인간에 있어서, 유효한 항종양 반응이 일어나기 위하여 복합한 상호 작용의 반응메카니즘을 탐지하는 것은 실질적으로 더욱 어렵다. 인간에 사용하기 위한 사이토카인 분비 종양 백신의 실질적인 유효성은 아직까지 입증되지 못하고 있다.
종양 세포가 종양 백신으로 사용되도록 변형된 유전자의 다른 범주는 소위 보조(accessory) 단백질을 코드하는 것으로서; 이 접근 방식의 목적은 이들이 종양 특이성 T-임파구를 직접적으로 생성시키도록 하기 위하여 종양 세포를 항원 제시 세포(neo-APCs)로 전환시키는 것이다. 이러한 종유의 접근 방식의 예는 문헌 [Ostrand-Rosenberg, 1994]에 기술되어 있다.
예를 들면, 문헌 [Wolfel et al., 1994 a) 및 1994 b); Carrel et al., 1993, Lehmann et al., 1989, Tibbets et al., 1993] 또는 공개된 국제 출원 WO 92/20356호, WO 94/05304호, WO 94/23031호, WO 95/00159호에 개시된 바와 같이, 종양 항원(TAs) 또는 이들로부터 유도된 펩티드의 동정 및 단리는 단백질의 형태 또는 펩티드의 형태 모두로 종양 백신에 대한 면역원으로서 종양 항원을 사용하기 위한 선행요건이었다. 그러나, 그러한 종양 항원의 형태의 종양 백신은 종양 항원을 운반하는 종양 세포를 제거하기에 필요한 세포성 면역 반응을 유발하기에 충분히 면역원성을 가지지 못하였으며; 보조제의 동시투여는 면역 반응을 동정하기 위한 제한된 가능성만을 제시한다 [Oettgen and Old, 1991].
종양 백신의 효율을 증가시키기 위한 세번째 능동 면역 전략은 이종발생시킨[xenogenized, 이물질화시킨(alienised)] 자가조직의 종양 세포에 기초한다. 이 개념은 면역계가 외래 단백질을 발현하는 종양 세포와 반응을 하고, 이 반응의 과정에서, 면역 반응이 또한 백신의 종양 세포에 의해 제시되는 이들 종양 항원에 대하여 유발된다는 가정에 기초한다.
종양 세포를 다양한 유전자의 도입에 의해 더욱 큰 면역원성을 목적으로 이물질화시키는(alienised) 이들 여러 가지 접근 방식의 요약은 문헌 [Zatloukal et al., 1993]에 나타나 있다.
T-세포 항원 수용체의 성분들, MHC(주요 조직적합성 복합체) 분자 및 단백질로부터 유도된 펩티드 단편인 그의 리간드로 구성된 삼분자 복합체에 의한 특이적 면역 반응에 의한 조절이 중추적인 역할을 하였다.
MHC-I 분자 (또는 대응 인간 분자, HLAs)는 긴축 특이성을 가진, 수백만의 상이한 리간드의 결합을 허용하는 펩티드 수용체들이다. 이에 대한 선행 요건은 다음의 특이성 규준을 가지는 대립형질-특이성 펩티드 모티브에 의해 제공되는데: 이 페티드는 MHC-I 하플로타입에 따라서 규정된 길이를 가지며, 이 길이는 일반적으로 8 내지 10의 아미노산기이다. 대표적으로, 2개의 아미노산 위치는 소위 "앵커"로서 단일 아미노산 또는 밀접하게 관련된 측쇄를 가진 아미노산 그룹에 의해서만 점유될 수 있다. 펩티드에서 앵커 아미노산의 정확한 위치 및 이들의 특성 상에서 행해지는 요건은 MHC-I-하플로타입에 따라 다양하다. 펩티드 리간드의 C-말단은 빈번히 지방족이거나 하전된 기이다. 그러한 대립인자-특이성 MHC-I-펩티드-리간드 모티브는 지금까지, 그 중에서도 H-2Kd, Kb, Kk, Kkm1, Db, HLA-A*0201, A*0205 및 B*2705로 알려져 있다.
세포내의 단백질 전환의 범위 내에서, 정상적인, 축퇴의 및 외래의 유전자 산물, 예컨대 바이러스 단백질 또는 종양 항원은 작은 펩티드들로 분해되고; 이들 중 일부는 MHC-I 분자에 대한 잠재적인 리간드들을 구성한다. 이는 MHC 분자에 의한 이들의 제시에 대한 선행요건을 제공하고 그 결과로서, 펩티드들이 세포에서 어떻게 MHC-I 리간드로서 생성되는지는 아직까지 명확히 설명되지는 않지만, 세포성 면역 반응을 유발한다.
면역 반응을 동정하기 위하여 종양 세포의 이물질화에 대해 이 메카니즘을 이용하는 한 접근법은 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 등의 돌연변이유발 화합물질로 종양 세포를 처리하는 것으로 된다. 이는 종양 세포가 외래 유전자 산물을 구성하는 세포성 단백질의 돌연변이된 변이체로부터 유도된 네오-항원을 제시하도록 유발하는 것으로 생각된다[Van Pel and Boon, 1982]. 그러나, 돌연변이유발 이벤트는게놈 상에 무작위적으로 분포되며, 추가로 일부의 세포는 상이한 돌연변이유발 이벤트의 결과로서 상이한 네오-항원을 제시하는 것으로 예견되기 때문에, 이 공정은 정성적 및 정량적 관점에서 제어하기 힘들다.
또다른 접근법은 종양 세포들을 하나 이상의 외래 단백질의 유전자, 예컨대 외래 MHC-I 분자 또는 상이한 하플로타입의 MHC 단백질의 것으로 형질감염시킴으로서 종양 세포를 이물질화시켜 이것이 세포 표면에서 형태로 나타나게 하는 것이다 [EP-A2 0 569 678; Plautz et al., 1993; Nabel et al., 1993]. 이 접근법은 종양 세포가, 전세포 백신의 형태로 투여될, 때 발현된 단백질 또는 이들로부터 유도된 펩티드의 수단에 의해 이물질로서 인식된다는 상기한 바의 착상 또는, 자가조직의 MHC-I 분자의 발현의 이벤트에 있어서, 종양 항원의 제시가 세포 표면 상의 증가된 MHC-I 분자의 수에 의해 최적화되는 것에 기초하고 있다. 외래 단백질을 사용한 종양 세포의 수식은 세포로 하여금 MHC의 면에서 외래 단백질로부터 유래된 단백질을 제시하도록 유발할 수 있고, "자신"에서 "외래"로의 변형은 MHC-단백질 복합체 인식의 범위 내에서 일어난다. 단백질 또는 펩티드의 이물질로서의 인식은, 면역 인식의 과정에 있어서, 면역 반응이 외래 단백질에 대해서 뿐만 아니라 종양 세포에 속하는 종양 항원에 대해서도 생성됨을 의미한다. 이 반응의 과정에 있어서, 항원 제시 세포(APCs)는 활성화되고; 이들은 백신의 종양 세포에서 일어나는 (TAs를 포함한) 단백질을 소유하여 펩티드를 형성하며 이들을 그들 자신의 MHC-I 및 MHC-II 분자에 대한 리간드로서 사용한다. 활성화된, 펩티드-하전된 APCs는 림프절로 이동하고, 여기서 다수의 미성숙 T-임파구가 APCs상에서 TA로부터 유래한 펩티드를 인식하고 이들을 콜로날 팽창-다시 말해서 특이성 CTLs 및 T-헬퍼 세포를 생성시키기 위한 자극으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 목적은 유효량의 세포성 항종양 면역 반응이 개시될 수 있는 수단에 의해 이물질화된 종양 세포에 기초한 신규한 종양 백신을 제공하는 것이다.
이 문제를 해결하는데 있어서, 다음의 사항을 기본적인 전제로서 고려하였다: 비악성인 정상 체세포는 면역계에 의해 허용되는 반면, 이 세포가, 예컨대 바이러스 감염의 결과로서 신체에 대해 외래성인 단백질을 합성할 경우, 신체는 면역 반응의 수단에 의해 정상 세포에 반응한다. 이에 대한 이유는 MHC-I 분자가 외래 단백질로부터 유래한 외래 펩티드를 제시한다는 것이다. 결과적으로, 면역계는 어떤 바람직하지 못한 외래물질이 세포에 존재하였음을 기록한다. 이 세포는 제거되고, APCs는 활성화되고 새로운 특이성 면역이 외래 단백질을 발현하는 세포에 대하여 발생된다.
종양 세포는 문제의 종양 특이성 종양 항원을 함유하는 것이 허용되지만 그 자체로 유효하지 않은 백신인데, 이들은 이들의 낮은 면역원성의 결과로서 면역계에 의해 무시되기 때문이다. 만일, 공지된 접근법과는 대조적으로, 종양 세포를 외래 단백질이 아니고 외래 펩티드로 하전시킨다면, 외래 펩티드 이외에 세포 자신의 종양 항원은 이 세포에 의해 이물질로서 인식될 것이다. 펩티드를 사용하여 이물질화시키는 취지는 종양 항원에 대한 외래 펩티드에 의해 유발되는 세포성 면역 반응을 지시하는 것이다.
종양 세포의 낮은 면역원성에 대한 이유는 정성적인 문제가 아니고 정량적인 문제일 수 있다. 종양 항원으로부터 유도된 펩티드에 대하여, 이는 이는 참으로 MHC-I 분자에 의해 제시되지만 농도에 있어서는 세포성 종양 특이성 면역 반응을 유발하기에는 너무 낮음을 의미할 수도 있다. 따라서, 종양 세포 상의 종양 특이성 펩티드의 수에 있어서 증가는 종양 세포의 이물질화를 초래하여 세포성 면역 반응을 유발하는 결과를 가져올 수 있다. 종양 항원 또는 이것으로부터 유도된 펩티드가 국제 공개 제WO 92/20356호, 제WO 94/05304호, 제WO 94/23031호 및 제WO 95/00159호에 기재된 바와 같이, 이것이 문제의 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA로 형질감염되었다는 사실에 비추어 세포 표면에서 제시되는 접근법과는 반대로, 본 취지는 제조 방법이 단순하면서도 효율적인 면역 반응을 유발시키는 백신을 제공하는 것이다.
문헌[Mandelboim et al., 1994 및 1995]는 환자에 고유한 대응 종양 항원에 대한 세포성 면역 반응을 유발하기 위해 RMA-S 세포를 종양 항원으로부터 유도된 펩티드로 인큐베이션시키는 것을 제안하고 있다. 만델보임 등에 의해 종양 백신처리에 대해 제시된 RMA-S[Karre et al., 1986]로서 알려진 세포는 APCs로서 반응할 수 있는 것으로 추정된다. 이들은 이들의 세포 표면 상의 HLA 분자가 세포의 TAP 메카니즘(펩티드의 가공 및 HLA 분자에 대한 이들의 결합에 관여하는 항원성 펩티드의 운송)에 있어서 결함으로 인하여 비어있다는 특징을 가진다. 결과적으로, 세포는 펩티드를 사용한 대전에 대해 유용하고, 따라서 외부로부터 제공되는 펩티드에 대한 제시 비히클(presenting vehicle)로서 동시적으로 기능한다. 성취된 항종양 효과는 세포상에 제시되는 펩티드에 대한 면역 반응의 유발에 기초하며, 이는 종양 세포의 항원성 레퍼터리(repertoire)룰 사용한 어떠한 직접적인 배경이 없이 면역계에 제공되는 것이다.
본원 발명은 이들 스스로 HLA 측면에서 종양 항원으로부터 유도된 펩티드를 제시하는 종양 세포로 이루어지고, 이들의 적어도 일부는 세포 표면 상에서 환자의 MHC-I 하플로타입을 하나 이상 가지며, 이들은 종양 세포가 환자의 면역계에 의해 펩티드의 측면에서 이물질로서 인식되어 세포성 면역 반응을 유발하는 방식으로 하나 이상의 펩티드 a) 및(또는) b)로 하전되고, 이들 펩티드들은
a) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 단백질로부터 유도되는 펩티드와는 상이한 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하거나, 또는
b) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 종양 항원으로부터 유도되고, 환자의 종양 세포 상에서 발현되는 것과 동일한 종양 항원으로부터 유도된 펩티드의 농도보다 더 높은 백신의 종양 세포 상의 농도로 존재하는 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하는 것인
환자에 투여하기 위한 종양 백신에 관한 것이다.
이하, 인간 MHC 분자는 국제 규약에 따라서 또한 HLA(인간 백혈구 항원)으로도 언급한다.
용어 "세포성 면역 반응"은 종양 특이성 세포독성 CD8-양성 T-세포 및 CD4-양성 헬퍼-T-세포의 발생의 결과로서 종양 세포의 파괴를 일으키는 세포독성 T-세포 면역을 의미한다.
종양 세포로부터 얻어진 본 발명에 따른 백신의 유용성은 종양 세포에 존재하는 종양 항원의 공급의 면역원성 활성이 펩티드에 의해 강화되는 사실에 의해 주로 기초한다.
이하, 타입 a)의 펩티드는 또한 "외래 펩티드" 또는 "제노펩티드(xenopeptide, 이종발생성펩티드)"로서도 언급한다.
본원 발명의 한 실시태양에 있어서, 백신의 종양 세포는 자가조직성이다. 이들은 치료를 받는 환자로부터 취한 세포들이며, 이 세포들은 펩티드 또는 펩티드들 a) 및(또는) b)로서 생체외 처리되고, 임의로 불활성되고 이어서 환자에 재투여된다(자가조직성 종양 백신을 생산하는 방법은 WO/94/21808에 기술되었고, 그 내용은 본원에서 참고로 인용한다).
본원 발명의 한 실시태양에 있어서, 종양 세포는 동종이계의, 즉 이들은 치료받는 환자로부터 유래되지 않는 것이다. 동종이계의 세포의 사용은 경제적 고려가 수반될 경우 특히 바람직하며; 개별 환자에 대한 개별 백신의 생산은 노동 집약적이고 값이 비싸고 더욱이 종양 세포의 체외 배양에 있어서 개별 환자에서 문제가 일어나, 종양 세포가 백신의 제조에 필요한 만큼 충분히 많은 수로 얻어지지 않는 결과가 초래된다. 이 동종이계의 종양 세포를 사용할 때, 이들은 환자의 HLA 서브타입에 부합되어야 함을 염두에 두어야 한다.
부류 a)의 외래 펩티드를 사용할 경우, 동종이계의 종양 세포의 경우에 있어서, 이들은 하나 이상의 세포주의 세포이며 그중 적어도 한 세포주는 적어도 하나 및 바람직하게는 하나 이상의, 치료되는 환자의 종양 항원과 동일한 종양 항원을 발현하며, 즉 종양 백신은 환자의 종양 동정에 부합된다. 이로서 종양 특이성 CTL 및 헬퍼 T-세포의 팽창을 초래하는, 백신의 종양 세포에 대한 MHC-I-제시 외래 펩티드에 의해 유발되는 세포성 면역 반응이 또한 이들이 백신의 세포와 동일한 종양 항원을 발현함에 따라 종양 세포에 대하여 환자에서 유도됨이 확인된다.
만일, 예컨대, 본원 발명에 따른 종양 백신이 Her2/neu-돌연변이를 나타내는 유방암 전이 [참조문헌: Allred et al., 1992; Peopoles et al., 1994; Yoshino et al., 1994 a); Stein et al., 1994; Yoshino et al., 1994 b); Fisk et al., 1995; Han et al., 1995] 로부터 고통을 겪는 환자를 치료하는데 사용된다면, 사용되는 백신은 종양 항원으로서 돌연변이된 Her/neu도 발현시키는 환자의 HLA-하플로타입에 대해 부합되는 동종이계의 종양 세포로 이루어질 것이다. 최근에, 수많은 종양 항원이 단리되고 하나 이상의 다른 암과의 이들의 관계가 해명되었다. 그러한 종양 항원의 기타의 예로는 ras[Fenton et al., 1993; Gedde Dahl et al., 1992; Jung et al., 1991; Morishita et al., 1993; Peace et al., 1991; Skipper et al., 1993], MAGE-종양 항원 [Boon et al., 1994; WO92/20356]이 있고, 다양한 종양 항원의 고찰은 문헌[Carrel et al., 1993]에 의해 제공되었다.
본 발명의 범위 내에서 사용되어도 좋은 공지의 종양 항원 및 이들로부터 유도된 펩티드들은 표에 요약하였다.
환자의 종양 항원은 일반적으로 예컨대, 검출되는 종양 항원에 대해 특이성을 가진 CTLs에 기초한 분석법을 사용하는 표준 방법에 의한 진단 및 치료 계획의 설정(drawing up)의 과정에서 일반적으로 결정된다. 이들 분석법은, 예를 들면 문헌[Herin et al., 1987; Coulie et al., 1993; Cox et al., 1994; Rivoltini et al., 1995; Kawakami et al., 1995]에 개시되어 있고, WO 94/14459호에 기재되어 있는데; 이들 참고 문헌은 또한 다양한 종양 항원 및 이들로부터 유도된 펩티드 에피토프를 개시하고 있다. 세포 표면에서 발생하는 종양 항원은 또한 항체에 기초한 면역분석법에 의해 검출될 수 있다. 종양 항원이 효소, 예컨대 티로시나아제라면, 이들은 효소분석법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에 있어서, 자가조직성 및 동종이계성 종양 세포의 혼합물이 백신의 출발물질로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이 실시태양은 환자에 의해 발현되는 종양 항원이 알려지지 않았거나 또는 단지 부분적으로 특성화되어 있거나 및(또는) 동종이계의 종양 세포가 환자의 종양 항원의 단지 일부만을 발현하는 경우에 특히 사용된다. 외래 펩티드로 처리된 자가 조직의 종양 세포를 첨가함으로써 백신 중의 종양 세포의 적어도 일부가 환자에 고유한 종양 항원의 최대 가능한 수를 포함하는 것을 확보하는 것이 가능하다. 동종이계의 종양 세포들은 하나 이상의 MHC-I-하플로타입에서 환자와 부합되는 것들이다.
타입 a) 및 b)의 펩티드들은 이들의 서열 면에 있어서 백신이 주입되는 환자의 HLA 서브타입에 의해 MHC-I-분자에 결합되는 요건에 따라서 정의된다. 따라서 환자의 HLA-서브타입을 결정하는 것은 적절한 펩티드의 선택 또는 설계에 대한 가장 중요한 선행 요건 중의 하나를 구성한다.
본 발명에 따른 종양 백신이 자가 조직의 종양 세포의 형태로 사용될 경우, HLA-서브타입은 환자에서 유전적으로 결정되는 HLA 분자의 특이성의 결과로서 자동적으로 얻어진다. 환자의 HLA 서브타입은 마이크로임파독성 시험(MCL 시험, 혼합 임파구 배양물)(Practical Immunol., 1989) 등의 표준 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 이 MCL 시험은 환자의 혈액으로부터 단리한 임파구를 먼저 토끼 보체 (C)의 존재하에 특이성 HLA 분자에 대한 항혈청 또는 단일클론 항체와 혼합시키는 원리에 기초한다. 양성의 세포는 용해되어 지시염료에 흡착되는 반며, 무손상 세포는 염색되지 않고 남아 있는다.
RT-PCT도 또한 환자의 HLA-하플로타입을 결정하는데 사용될 수 있다[Curr. Prot. Mol. Biol. Chapters 2 and 15]. 이를 행하기 위해서는, 혈액을 한자로부터 채취하고 이것으로 부터 RNA 를 단리한다. 이 RNA를 먼저 역전사시키면 환자로부터의 cDNA가 형성된다. cDNA는 특정 HLA-하플로타입을 나타내는 DNA 단편의 증폭을 특이적으로 일으키는 프라이머쌍을 사용한 중합효소 사슬 반응을 위한 기질로서 사용된다. 아카로스 겔 전기영동을 행한 후, DNA 밴드가 나타나면, 환자는 대응하는 HLA 분자를 발현시킨다. 밴드가 나타나지 않으면, 환자는 이것에 대해 음성이다. 적어도 2 개의 밴드가 각 환자에서 예상될 수 있다.
본 발명을 동종이계의 백신의 형성에 적용할 경우, 적어도 일부가 환자의 적어도 하나의 HLA-서브타입에 부합되는 세포들을 사용한다. 본 발명에 따른 백신의 가장 가능한 넓은 적용을 얻기 위하여, 가장 빈번히 발견되는 HLA-서브타입 중 두 개 또는 세 개의 상이한 것들을 발현하고 특히 하플로타입 HLA-A1 및 HLA-A2를 고려하여 상이한 세포주의 혼합물을 출발 물질로서 사용하는 것이 바람직하다. 이들 하플로타입을 발현하는 동종이계의 종양 세포의 혼합물에 기초한 백신을 사용함으로써 환자의 거대 집단을 스크리닝하는 것이 가능한데; 이 방식으로 유럽 인구의 약 70%를 커버할 수 있다[Machiewicz et al., 1995].
HLA-서브타입의 수단에 의해 본 발명에서 사용된 펩티드의 정의는 이들을 이들의 앵커 아미노산 및 이들의 길이로 정의되며; 규정된 앵커 위치 및 길이로서 펩티드들이 문제의 HLA 분자의 펩티드 결합 포크 내로 적합하게 되고 이들 세포가 외래 물질로서 인식되는 방식으로 백신을 형성하는 종양 세포의 세포 표면에 존재함을 확인할 수 있다. 이는 면역계가 자극되어 환자의 종양 세포에 대하여 세포성 면역 반응이 유발될 것임을 의미한다.
본 발명의 목적을 위하여 a) 부류의 외래 펩티드로서 적합한 펩티드는 광범위하게 입수 가능하다. 이들의 서열은 자연 발생 면역원성 단백질 또는 이들의 세포성 분해 산물, 예컨대 바이러스 또는 세균성 펩티드로 부터 또는 환자에 대한 외부의 종양 항원으로부터 유도할 수 있다.
적합한 외래 펩티드들은 예를 들면, 문헌 [Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991]에 기술된 상이한 HLA 모티브에 대하여 다양한 HLA-서브타입의 분자의 결합 부위에 맞는 다양한 기원의 면역원성 단백질로부터 유도된 펩티드인 펩티드들의 수단에 의해, 공지된 서열을 근거로 하여 선택할 수 있다. 면역원성 활성을 가진 단백질의 부분적인 서열을 가지는 펩티드에 대하여, 이미 알려지거나 또는 설정하려는 폴리펩티드의 수단에 의하여 HLA-특이성 요건을 고려한 서열 비교에 의해 어느 펩티드가 적합한 후보 물질인가를 설정하는 것이 가능하다. 펩티드의 적합한 예로는, 예컨대 문헌 [Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991, 및 Rammensee, 1995 및 WO 91/09869 (HIV 펩티드)에서 발견되며; 종양 항원으로부터 유도된 펩티드들은 그 중에서도 공개된 국제 출원 제WO 95/00159호 및 제WO 94/05304호에 개시되어 있다. 이들 참고 문헌 및 펩티드와 관련하여 여기에 인용된 문헌을 참고로 인용한다.
제노펩니드들에 대한 바람직한 후보 물질은 면역원성이 이미 입증된 펩티드, 즉 바이러스 또는 세균성 단백질 등의 공지의 면역원들로부터 유도된 펩티드들이다. 이 종류의 펩티드는 이들의 면역원성을 고려하여 MLC 시험에 있어서 격렬한 반응을 나타낸다.
원래의 펩티드, 즉 천연 단백질로부터 변화시키지 않고 유도된 펩티드를 사용하는 대신에, 원래의 펩티드 서열을 근거로 구체화된 앵커 위치 및 길이에 관련된 최소 요건을 사용하여 필요에 따라 변이를 수행하는 것이 가능하며; 따라서 이 경우에, 합성 펩티드가 MHC-I 리간드에 관련된 요건에 따라 설계된 본 발명에 따라 사용된다. 따라서, 예를 들면, H2-Kd-리간드 Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI)로부터 출발하여 앵커 아미노산이 아닌 아미노산을 서열 Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI)의 펩티드를 얻는 방식으로 변화시키는 것이 가능하다; 더욱이, 위치 9의 앵커 아미노산 Ile는 Leu로 치환할 수 있다.
종양 항원으로부터, 즉, 종양 세포로부터 발현되고, 대응하는 비형질전환된 세포에서는 나타나지 않거나 또는 상당히 낮은 농도에서만 나타나는 단백질로부터 유도된 펩티드들은 타입 a) 및(또는) b)의 펩티드로서 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다.
펩티드의 길이는 필요한 앵커 아미노산과 함께 MHC-I 분자에 결합에 필요한 8 내지 10 아미노산의 최소 서열에 대응하는 것이 바람직하다. 필요시, 펩티드들은 이들의 길이연장이 결합 능력을 방해하지 않는다면, 즉, 연장된 펩티드가 최소 서열 이하로 세포 수준에서 처리되는 한, C- 및(또는) N-말단에서 길이 연장을 시킬 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에 있어서, 펩티드는 폴리라이신 등의 폴리양이온에 대한 펩티드의 정전 결합을 얻기 위해 음으로 하전된 아미노산으로 연장시킬 수 있거나, 또는 음으로 하전된 아미노산은 앵커 아미노산 이외의 위치에서 펩티드로 혼입시켜도 좋다.
본 발명의 목적을 위하여 용어 "펩티드"는 의미상 APCs의 적용후, MHC 분자에 맞는 펩티드로 가공되는 것이 보장되는 큰 단백질 단편 또는 전체의 단백질들을 포함한다.
이 실시태양에 있어서, 따라서 항원은 펩티드의 형태가 아니라 단백질 또는 단백질 단편 또는 단백질 또는 단백질 단편의 혼합물로서 사용된다. 이 단백질은 프로세싱 후 얻어지는 단편이 유도되는 항원 또는 종양 항원을 구성한다. 세포에 주입되는 단백질들 또는 단백질 단편들은 MHC 측면에서 면역 효과기 세포에 제시될 수 있고 따라서 면역 반응을 유발하거나 또는 증대시킨다[Braciale and Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski and Rock, 1995; York and Rock, 1996].
단백질 또는 단백질 단편을 사용할 때, 프로세싱된 최종 생성물의 실체는 화학적 분석법 [프로세싱된 단편들의 에드만 분해 또는 질량 분광계, 참조: Rammensee et al., 1995의 고찰 및 여기에서 인용된 최초 문헌] 또는 생물학적 분석법[프로세싱된 단편에 대해 특이적인 T-세포를 자극하는 APCs의 능력]에 의해 입증할 수 있다.
원칙적으로, 펩티드 후보물질은 외래 펩티드로서의 이들의 적합성을 몇가지 전략으로 선택하는데: 일반적으로, 후보물질을 먼저 이들의 MHC-I 분자에 결합하는 능력에 대하여 펩티드 결합 시험으로, 바람직하기로는 일련의 시험들에 의해 시험한다.
연구의 적합한 한 방법은, 예를 들면 플로우 사이토메트리에 기초한 FACS 분석 [Flow Cytometry, 1989; FACS VantageTMUser's Guide, 1994; CELL QuestTMUser's Guide, 1994]이 있다. 이 펩티드는 형광 염료, 즉 FITC(프루오레신 이소티오시아네이트)로 표지시키고, MHC-I 분자를 발현하는 종양 세포에 적용시킨다. 플로우에 있어서, 개별 세포들을 특정 파장의 레이저로 여기시키는데; 방출된 형광이 측정되고 세포에 결합되는 펩티드의 양에 의존한다.
결합된 펩티드의 양을 결정하는 또다른 방법은 스카챠드 블롯(Scatchard blot)이다. I125또는 희토류 금속 이온(예, 유로피움(europium)으로 표지된 펩티드를 이 목적으로 사용한다. 세포들을 4℃에서 다양한 규정된 농도의 펩티드로 30 내지 240분 동안 하전시킨다. 펩티드와 세포의 비특이성 상호작용을 결정하기 위하여, 과량의 비표지된 펩티드를 일부의 시료에 첨가하여 표지된 펩티드의 특이적 상호작용을 방지한다. 이어서 세포들을 세척하여 임의의 비특이성 세포-연관 물질을 제거한다. 이어서, 세포 결합된 펩티드의 양은 방출된 방사성을 사용하여 섬광 계수기로 또는 오래 존속한 형광의 측정에 적합한 광도계로 측정한다. 이와 같이 얻은 데이터는 표준 방법으로 평가한다.
두 번째 단계에서, 양호한 결합 성능을 갖는 후보물질을 이들의 면역원성에 대하여 시험한다.
그의 면역원성 활성이 알려지지 않은 단백질로부터 유도된 제노펩티드의 면역원성은 예를 들면 MLC 시험법에 의해 시험할 수 있다. 또한 바람직하게는 공지의 면역원성 활성을 가진 펩티드를 표준으로서 사용하여 상이한 펩티드로 연속적으로 수행한 시험에서 특히 격렬한 반응을 유발하는 펩티드는 본원 발명의 목적에 적합하다.
MHC-I-결합 펩티드 후보물질의 이들의 면역원성에 대한 시험을 위한 다른 가능한 방법은 펩티드의 T2 세포에 대한 결합을 연구하는 것으로 이루어진다. 한 그러한 시험은 이들이 TAP 펩티드 운반 메카니즘에서 결함이 있고 이들이 MHC-I 측면에서 존재하는 펩티드에 가해질 때 안정된 MHC-I 분자로만 존재한다는 T2 세포 [Alexander et al., 1989] 또는 RAM-S-세포[Karre et al., 1986]의 특이한 성질에 기초한다. HLA 유전자, 예컨대 HLA-AI 및(또는) HLA-A2 유전자로 안정되게 형질감염된 T2 세포 또는 RMA-S 세포를 이 시험에 사용한다. 세포가 양호한 MHC-I 리간드인 펩티드에 의해서, 면역계에 의해 이물질로서 인식되는 방식으로 MHC-I 측면에서 존재함으로서 작용할 경우, 이들 펩티드들은 HLA 분자가 세포 표면 상에 상당한 양으로 나타나게 한다. 예를 들면, 단일클론 항체의 수단에 의해 세포 표면 상에서 HLAs의 검출은 적합한 펩티드의 동정을 가능케한다 [Malnati et al., 1995; Sykulev et al., 1994]. 여기서, 다시 양호한 HLA- 또는 MHC 결합 성능을 가진 것으로 알려진 표준 펩티드가 바람직하게 사용된다.
본 발명의 한 실시태양에 있어서, 백신의 자가조직의 또는 동종이계의 종양 세포는 상이한 서열을 가진 다수의 제노펩티드를 가질 수 있다. 이 경우, 사용되는 펩티드는 한편으로는 이들이 상이한 HLA 서브타입에 결합한다는 점에서 서로 상이할 수 있다. 이러한 방식으로, 환자 또는 거대한 환자 군의 일부 또는 모든 HLA 서브타입을 검출하는 것이 가능하다.
종양 세포 상에 존재하는 제노펩티드에 관련된 또다른 가능한 추가의 변이성은 특정의 HLA에 결합하는 펩티드가 예컨대 상이한 기원의 단백질, 즉 바이러스 및(또는) 세균의 단백질로부터 유도된, HLA 결합에 중요하지 않은 그들의 서열에 있어서 상이하다 점으로 이루어진다. 백신처리된 생물체에 넓은 범위의 이물질화를 제공하는 이러한 종류의 변이성은 면역 반응의 자극을 강화시키는 것으로 예측된다.
종양 백신이 다양한 세포주의 동종이계의 종양 세포의 혼합물 및 가능하게는 추가의 자가 조직의 종양 세포로 이루어진 본원 발명의 실시태양에 있어서, 모든 종양 세포는 동일한 펩티드 또는 펩티드들로 처리되거나 또는 상이한 기원의 종양 세포는 상이한 제노펩티드를 가질 수도 있다.
본 발명의 범위 내에서 수행된 실험에 있어서, 인풀루엔자 바이러스 해마글루티닌으로부터 유도되고 H2-Kd-리간드인 서열 LeuPheGlu Ala Ile Glu Gly PheIle의 바이러스 펩티드를 타입 a)의 외래 펩티드로서 사용하였고; 앵커 아미노산은 밑줄 그었다.
종양 백신은 외래 펩티드로서 이 자연 발생 바이러스 펩티드로 생산되었으며 이것은 동물 모델(멜라노마 모델 및 결장암 모델)로 시험하였다.
인플루엔자 바이러스의 핵단백질로부터 유도되고 HLA-1-하플로타입 H2-Kb의 리간드인 서열 Ala Ser Asn GluAsnMet Glu ThrMet의 다른 바이러스 펩티드 [Rammensee et al., 1993](앵커 아미노산은 밑줄 그음)를 종양 백신을 생산하는데 사용하였고; 백신의 예방 효과는 다른 멜라노마 모델로 확인하였다.
또다른 백신은 종양 세포를 서열 Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI) 외래 펩티드를 사용하여 이물질화시킴으로써 생성시켰다. 이는 지금까지 자연 상태에서 발견된 적이 없는 합성 펩티드이다. 서열을 선택할 때, 타입 H2-Kd의 MHC-I 분자에 대한 리간드로서의 적합성에 관련된 요건을 만족시키는지에 대하여 주의를 요하였다. 능동 면역요법의 개념에 따라 항종양 면역을 생성하기 위한 펩티드의 적합성은 쥐 결장암 CT-26(마우스 계통 Balb/c와 동계임)에서 확인하였다.
본 발명의 다른 실시태양에 있어서, 종양 백신은 또한 자가 조직의 및(또는) 동종이계의 종양 세포 및(또는) 사이토카인 유전자로 형질감염된 섬유아세포를 포함해도 좋다. 문헌 [WO 94/21808 및 Schmidt et al., 1995(참고로 인용함)은 IL-2 발현 벡터를 사용한 "트랜스페린펙션"으로 알려진 DNA 운반 방법의 수단에 의해 생성된 효율적인 종양 백신을 개시하고 있다[이 방법은 수용체 매개된 내식작용에 기초하며, 세포성 리간드, 특히 DNA를 아데노바이러스 등의 엔도솜 분해에 활성인 동인과 복합화하기 위한, 폴리라이신 등의 폴리양이온으로 공액된 트랜스페린을 사용한다.
바람직하게는 펩티드 처리된 종양 세포 및 사이토카인 발현 세포를 1:1의 비율로 혼합한다. 만일, 예컨대 1 x 106세포 당 IL-2를 4,000 단위로 생성하는 IL-2 백신을 1 x 106의 펩티드 처리된 종양 세포와 혼합한다면, 이와 같이 얻어진 백신은 IL-2의 최적 투여량이 1,000 내지 2,000임을 가정할 때 2회의 치료에 사용될 수 있다 [Schmidt et al., 1995].
사이토카인 백신을 펩티드 처리된 종양 백신과 혼합시킴으로써 유리하게는 백신의 이들 두 형태의 효과를 혼합시키는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 세포의 후처리 및 백신의 형성은 문헌 [Biologic Therapy of Cancer, 1991] 또는 WO 94/21808에 기술된 바와 같은 통상이 방법으로 수행한다.
본 발명에 따른 방법은
이들 스스로 HLA 측면에서 종양 항원으로부터 유도된 펩티드를 제시하고, 이들의 적어도 일부는 환자의 적어도 하나의 MHC-I 하플로타입을 발현하는 종양 세포를
a) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 단백질로부터 유도되는 펩티드와는 상이한 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하거나, 또는
b) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 종양 항원으로부터 유도되는 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하는 것인 하나 이상의 펩티드로 처리하고,
종양 세포를 유기 폴리양이온의 존재하에서 환자의 면역계에 의해 이물질로서 인식되는 방식으로 펩티드가 종양 세포에 결합되기에 충분한 시간 및 양의 하나 이상의 펩티드 a) 및(또는) b)로 인큐베이션시켜서 세포성 면역 반응을 유발하는 것을 특징으로 한다.
펩티드의 양은 바람직하게는 약 50 ㎍ 내지 160 ㎍/ 1 x 105내지 2 x 107세포이다. b) 부류의 펩티드가 사용될 경우 농도는 또한 더 높을 수 있다. 이들 펩티드에 대하여, 백신의 종양 세포 상의 이들의 농도는 백신의 종양 세포가 이물질로서 인식되어 세포성 면역 반응을 유발하는 정도로, 동일한 종양 항원으로부터 유도된, 환자의 종양 세포 상의 펩티드의 농도 보다 높아야 한다.
적합한 폴리양이온은 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴 등의 상동성 유기 폴리양이온 또는 두 개 이상의 상이한 양으로 하전된 아미노산을 갖는 이종의 폴리양이온을 들 수 있는 반면, 이들 폴리양이온은 상이한 사슬 길이를 가져도 좋으며, 뿐만 아니라 폴리에킬렌이민류 등의 비펩티드성 합성 폴리양이온, 히스톤 등의 폴리양이온성의 천연 DNA 결합 단백질 또는 프로타민 또는 이들의 유사체, 또는 이들의 단편 및 스페르민 또는 스페르미딘을 들 수 있다. 본원 발명의 목적에 적합한 유기 폴리양이온은 상업상 입수가능한 폴리양이온성 지질, 그중에서도 트랜스펙탐, 리포펙탐 또는 리포펙틴을 포함한다[Felgner et al., 1994; Loeffler et al., 1993; Remy et al., 1994; Behr, 1994].
대략 30 내지 300 리신기의 사슬 길이를 가진 폴리리신(pL)이 폴리양이온으로서 적합하게 사용된다.
펩티드에 관련하여 필요한 폴리양이온의 양은 경험적으로 결정할 수 있다. 만일 a) 부류의 폴리라이신 및 제노펩티드가 사용된다면, pL:펩티드의 질량 비는 약 1:4 내지 약 1:12가 바람직하다.
인큐베이션 기간은 일반적으로 30 분 내지 4 시간이다. 이는 펩티드의 최대 하전이 도달하는 시간에 의존되며; 대전도는 FACS 분석에 의해 관찰되며 이 방식으로 필요한 인큐베이션 기간을 결정할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에 있어서, 폴리라이신은 적어도 부분적으로 공액된 형태로 사용된다. 바람직하게는, 폴리라이신의 일부는 트랜스페린 (Tf)로 공액된 형태(즉, 트랜스페린-폴리라이신 공액 TfpL, WO 94/21808의 개시내용을 참고로 인용함)인 것이 좋고, pL:TfpL의 질량비는 약 1:1이 바람직하다.
트랜스페린과 공액되는 대신에, 폴리라이신은 다른 단백질, 예컨대 WO 94/21080에서 내부화 인자(internalising factor)로서 기재된 세포성 리간드로 공액시킬 수 있다.
종양 세포의 처리는 필요시 DNA의 존재하에 수행해도 좋다. DNA는 플라스미드, 바람직하게는 기능성 진핵성 단백질을 코드하는 서열이 없는, 즉 빈 벡터의 형태인 플라스미드의 형태가 바람직하다. 이론상, 임의의 통용되는, 기능적으로 얻을 수 있는 플라스미드를 DNA로서 사용해도 좋다.
임의로 단백질과 부분적으로 공액되는 폴리양이온과 관련하여, 즉 pL, TfpL 또는 pL 및 TfpL의 혼합물에 관련하여 DNA의 양은 약 1:2 내지 약 1:5가 바람직하다.
종양 세포의 수에 관련하여 폴리양이온의 인큐베이션 기간, 양 및 성질 및(또는) 펩티드의 양, 어느 것 및 어떤 비율의 폴리양이온을 공액시키는가 또는 어느 단백질과 가장 잘 공액되는가 하는 문제, DNA의 존재의 이점 및 그의 양은 경험적으로 결정할 수 있다. 이를 위해서, 공정의 개별 매개 변수들은 다양할 수 있으며 펩티드들은 다른 동일한 조건하게서 종양 세포에 가해지며, 얼마나 효율적으로 펩티드들이 종양 세포에 결합하였는가를 검사하여 알아본다. 이를 위한 한 적합한 방법은 FACS 분석법이다.
본 발명에 따른 방법은 종양 세포를 치료하는데 뿐만 아니라 다른 세포를 치료하는데에도 적합하다.
종양 세포 대신에, 자가조직의 섬유아세포, 즉 환자에 고유한 것, 또는 환자의 HLA-서브타입에 부합되거나 또는 대응 MHC-I 유전자로 형질감염된 것 중 어느 하나인 섬유아세포 세포로부터의 세포를 본 발명의 방법에 따라 환자의 종양 세포에 의해 발현된 종양 항원으로부터 유도된 하나 이상의 펩티드로 하전시킬 수 있다. 이와 같이 처리되고 조사된 섬유아세포를 그대로 또는 종양 백신으로서 펩티드-처리된 종양 세포와 혼합하여 사용할 수 있다.
다른 실시태양에 있어서, 섬유아세포 대신에 수상 세포를 본 발명에 따른 방법에 의해 처리해도 좋다. 수상 세포는 피부의 APCs인데; 이들은 필요시 시험관내에서 하전시키며, 환자로부터 단리된 세포를, 즉 환자의 종양 항원으로부터 유도되고 환자의 MHC-I 또는 MHC-II 분자와 결합되는, 하나 이상의 펩티드와 혼합한다. 또다른 실시태양에 있어서, 이들 세포는 시험관내에서 펩티드로 하전시켜도 좋다. 이를 수행하기 위하여, 펩티드, 폴리양이온 및 임의의 DNA의 혼합체를 수상 세포가 피부에서 특히 빈번히 발견되기 때문에 피부내 주사하는 것이 바람직하다.
본 발명의 범위 내에서, 펩티드는 CT-26 세포 내로 이동하기 위하여 TfpL 또는 pL과 복합체를 형성시키거나 또는 M-3 세포 내로 이동시키기 위해 TfpL 및 비기능성 플라스미드(빈 벡터)와 복합체를 형성시킨다. CT-26 시스템에서 펩티드로 이물질화시킨, 조사된 종양 백신이 효율적인 항종양 면역을 일으켰는데: 백신 처리한 마우스의 75%가 백신 처리하지 않거나 또는 제노펩티드가 없는 백신을 주입한 모든 대조 동물에 있어서 종양 형성을 초래한 종양 첼린지를 제거할 수 있었다. M-3 시스템에서, 동일한 제노펩티드를 종양 형성의 면에서 생물체에 보다 더욱 긴축된 조건하에서 인간에 있어서 상황에 맞도록 적응시킨 실험 장치에서 시험하였다. 전이부를 가진 마우스들을 제노펩티드화시킨 조사된 M-3 세포로 백신처리하였다. 이와 같이 백신처리된 마우스의 85%는 전이부를 제거할 수 있었던 반면, 모든 미처리 마우스 및 제노펩티드가 없는 백신으로 주입시킨 7/8 마우스는 종양으로 병을 앓게 되었다.
본 발명자들은 또한 종양 백신의 전신계 면역 반응의 정도는 펩티드를 종양 세포에 가하는 방법에 의존됨을 발견하였다. 이 펩티드를 폴리라이신/트랜스페린에 의해 세포에 투여했을 때, 세포들을 펩티드로 24 시간 동안 인큐베이션시켰을 때("펄스화") 보다도 효과가 상당히 더 현저하였다. 펩티드의 조사된 백신과의 면역보조제 혼합은 또한 불충분하였다. 트랜스페린펙션은 세포 내에서 펩티드의 보다 효율적인 수용을 보장하거나 또는 폴리라이신/트랜스페린과의 대전이 펩티드가 세포막에 고착되게 남게하여 MHC-I 분자에 물리적으로 밀접하게 존재하게 하여 이것에 결합가능하도록 유발하는 것으로 보인는데, 그의 강한 친화도에 기인하여 약하게 결합되는 세포의 펩티드를 치환시킬 가능성이 있다.
도면의 요약
도 1a-c: 외래 펩티드로 처리된 M-3 세포의 FACS-분석
도 1d: FITC 펩티드로 처리된 M-3 세포의 현미경 사진
도 2a,b; 외래 펩티드로 하전된 M-3 세포의 백신을 사용하여 M-3 멜라노마 전이부를 가진 DBA/2 마우스의 치유
도 3a: 종양 백신의 생산을 위한 외래 펩티드의 적정
도 3b: 외래 펩티드로 하전된 종양 세포의 종양 백신과 IL-2 분비 종양 백신의 비교
도 4a: 외래 단백질로 하전된 결장암 세포로부터의 백신을 사용한 예비면역화에 의한 Balb/c 마우스의 예방
도 4b: 전신계 면역에 있어서 T-세포의 참여에 대한 연구
도 5: : 외래 펩티드로 하전된 멜라노마 세포의 백신을 사용한 예비면역화에 의한 C57BL/6J 마우스의 예방
후속되는 실시예에 있어서, 달리 설명하지 않는 한 다음의 재료 및 방법들을 사용하였다:
쥐의 멜라노마 세포주 클라우드만(Cloudman) S91(클론 M-3; ATCC No.: 53.1)를 ATCC로 부터 입수하였다.
멜라노마 세포주 B16-F10 (Fidler et al., 1975)는 NIH DCT 종양 기탁소로부터 입수하였다.
DNA를 포함하는 형질감염 복합체로부터의 트랜스페린-폴리라이신-공액체의 제조는 WO 94/21808호에 개시된 바와 같이 수행하였다.
펩티드, LFEAIEGFI, FFIGALEEI, LPEAIEGFG 및 ASNENMETM은 고상으로서 TentaGel S PHB (Rapp, Tubbingen)를 사용하여 Fmoc 방법 (HBTU 활성화, FastmocTM, 스케일 0:25 밀리몰)을 이용하여 단백질 합성기 [피이드백 모니터가 구비된 모델 433A, Applied Biosystems, foster City, Canada]에서 합성하였다. 펩티드들을 1 M TEAA, pH 7.3 중에 용해시키고, Vydac C 18 칼럼 상에서 역 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 서열들은 MAT 레이저맷(Finnigan, San Jose, Cananda) 상에서 비행 시간 시간 질량 분광계에 의해 확인하였다.
전이부 형성에 대한 이들의 방어 효과("치료 마우스 모델")에 대한 암 백신의 유효성의 시험 및 예방 마우스 모델에서의 시험은 마우스 모델로서 DBA/2 모델 및 Balb/c 모델을 사용하여 WO 94/21808호에 개시된 바와 같이 수행하였다.
실시예 1
다양한 방법에 의해 외래 펩티드로 처리된 M-3 세포의 비교 FACS 분석
도 1에 나타낸 이 연구를 위해, 제노펩티드 LFEAEGFI를 TfpL/DNA 복합체를 가진 M-3 세포에 먼저 가하고(트랜스로딩(transloading); 도 1a), 다른 경우에는 세포들을 펩티드로 인큐베이션시켰고(펄스화, 1b), 마지막으로는 펩티드를 면역 보조제로서 세포에 가하였다(도 1c).
트랜스로딩을 위해 FITC-표지된 제노펩티드 LFEAEIGFI 또는 비표지된 대조군 펩티드 160 ㎍을 HBS 완충액 500 ㎕ 중의 트랜스페린-폴리라이신 (TfpL) 3 ㎍, pL 10 ㎍ 및 psp65(베링거 만하임사, LPS 없음) 6 ㎍과 혼합하였다. 주위 온도에서 30 분후, 상기 용액을 DMEM 배지 (10% FCS, 20 mM 글루코오스) 20 ㎖ 중의 1.5 x 106M-3 세포를 포함하는 T75 세포 배양 플라스크에 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 3 시간 후 세포들을 PBS로 2회 세척하고, PBS/2 mM EDTA를 사용하여 분리시키고 FACS 분석을 위해 PBS/5% FCS 1 ml 중에 재현탁시켰다.
펩티드를 사용한 펄스화는 펩티드 (FITC 표지 또는 비표지됨) 450 ㎍과 DMEM 20 ml 중의 1-2 x 106세포를 사용하여 37℃에서 3 시간 동안 수행하였다.
면역 보조제 혼합을 위해, FACS 분석에 앞서, 배양 플라스크로부터 분리한 106세포들을 PBS/5% FCS 1 ml 중의 FITC 표지된 펩티드 100 ㎍로 실온에서 30 분 동안 배양시켰다. PBS/5% FCS 교체 후, 세포들을 세척하고 재차 분석하였다. FACS 분석을 5 W 아르곤 레이저가 구비된 FACS 밴티지 장치(Becton Dickinson)을 사용하여 제조원의 지시에 따라 488 nm에서 100 mW로 설정하여 수행하였다. FACS 분석의 결과는 도 1a 내지 1c에 나타냈다. 도 1d는 세포 원심분리된 M-3 세포의 현미경 사진을 나타내는데: 윗부분의 도면은 복합체의 수단에 의해 펩티드를 주입한(트랜스로딩) 세포를 나타내고 아래의 도면은 펩티드로 인큐베이션시킨(펄스화) 세포를 나타낸다. DAPI는 핵을 역염색하기 위해 사용하였다.
펩티드를 함유하는 복합체로 하전된 M-3 세포는 미처리 세포 또는 폴리라이신 단독으로 처리한 세포에 비하여 거의 10의 3제곱의 형광에 있어서 이동을 나타냈는데 이는 TfpL/DNA 복합체의 수단에 의한 펩티드의 효율적인 전사를 나타낸다(도 1a). 펩타이드를 사용한 인큐베이션(펄스화)는 단지 10의 1제곱의 형광에 있어서 이동에의해 나타나는 바와 같이 덜 효과적이었는데, 이는 형광 현미경에 의해 실질적으로 검출할 수 없었다(도 1d). 보조제 혼합의 경우에 있어서, 펩티드는 세척 단계 후에 사라졌는데(도 1d) 이는 펩티드 결합이 거의 무시할 수 있는 정도이었음을 나타낸다.
실시예 2
외래 펩티드 하전된 멜라노마 세포의 백신을 사용한 멜라노마 전이부를 가진 DBA/2 마우스의 치유(치료 마우스 모델)
a) M-3 세포로부터의 종양 백신의 제조
제노펩티드 LFEAIEGFI 160 ㎍을 HBS 완충액 500 ㎕ 중의 트랜스페린-폴리라이신 (TfpL) 3 ㎍, pL 10 ㎍ 및 psp65 (LPS 없음) 6㎍과 혼합하였다. 주위 온도에서 30 분후, 상기 용액을 DMEM 배지 (10 FCS, 20 mM 글루코오스) 20 ㎖ 중의 1.5 x 106M-3 세포를 포함하는 T75 세포 배양 플라스크에 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 3 시간 후 세포들을 새로운 배지 15 ml과 혼합하고 5% CO2하에 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 투여한 지 4 시간 후에, 세포들을 20 Gy로 조사시켰다. 백신은 WO94/21808에 기술된 바와 같이 제조하였다.
b) 종양 백신의 유효성
5일 전이된(104생 M-3 세포의 피하 주사에 의해 생성시킴) 6-12 주령의 DBA/2 마우스를 종양 백신의 피하 주사(투여량: 105세포/동물)에 의해 일주일의 주기로 2회 처리하였다. 실험에는 8 마리의 마우스가 수반되었다. 실험의 결과는 도 2a에 나타냈는데; 8 마리 중 7 마리가 하전된 펩티드를 함유한 백신의 TfpL/DNA 복합체의 수단에 의해 종양 세포로의 투여 후 치료되었음이 명백하다. 비교 실험에서, 펩티드 LFEAIEGFI (400 ㎍ 또는 4 mg)을 인큐베이션(37℃에서 3 시간, "펄스화")에 의해 세포내로 가한 백신을 사용하였다. 펩티드 400 ㎍을 사용한 백신을 주입한 동물 중에 8 마리 중 3 마리가 종양이 없었고; 펩티드 4 mg으로 처리된 세포로 이루어진 백신은 8 마리 동물 중 한 마리만이 치유되었다. 대조군은 이들 자신에 조사된 M-3 세포 및 펩티드 없이 복합체로만 하전된 세포로 구성되었다 (각 경우에 1/8 동물만이 종양이 없었다). 어떠한 종류의 처리도 받지 않은 동물들의 군에 있어서, 모든 동물들은 종양이 발전되었다.
한편으로는 백신을 생산하는 방법 및 다른 한편으로는 펩티드 서열의 관계를 조사하기 위하여, 다른 일련의 실험을 수행하였는데; 이들 실험에 있어서, M-3 세포의 고도의 종양유발성 변이체를 사용하였다. 처리의 방법의 중요성을 시험한 실험에 있어서, 펩티드를 폴리라이신-트랜스페린을 사용하여 세포상에 하전시키지 않고 다만 보조제로서 세포와 혼합시킨 백신들을 생성하였다. 펩티드 서열에 대한 대조군으로서, 위치 2 및 9의 펩티드의 앵커 아미노산, 즉 페닐알라닌 및 이소류신을 각각 프롤린 및 글리신으로 대체시켜, 펩티드 Leu Pro Glu Ala Ile Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG)를 얻었는데; 이 펩티드는 H2-Kd에 결합하는 능력이 결여되어 있다. 전이 형성은 적어도 일주일에 1회 관찰하였다. 이들 시험의 결과는 도 2b에 나타냈다. 세포를 TfpL/DNA 복합체를 사용하여 LFEAIEGFG로 세포를 하전시킴으로써 제조한 백신은 8 마리 중 6 마리가 치유되었다. 다른 한편, 펩티드 LFEAIEGFG를 세포와 단순히 혼합시키거나 또는 HLA 모티브에 결합하지 않았던 변형 펩티드 LPEAIEGFG를 가진 TfpL/DNA 복합체의 수단에 의해 TfpL/DNA 복합체의 수단에 의해 하전시킨 세포로 이루어진 백신을 주입한 8 마리 중 7 마리에서 종양이 발전되었다. 조사된 M-3 세포만으로 처리하거나 또는 전혀 처리를 받지 못한 모든 대조군에서, 모든 동물들에서 종양이 발전되었다.
c) 백신 중의 펩티드의 양의 효과에 대한 연구
a)에 기술된 바와 같이, 유효 펩티드 LFEAIEGFI 50, 5 또는 0.5 ㎍ 중 하나를 함유한 펩티드 함유 복합체들을 제조하고, M-3 세포를 이들로 하전시켰다. 최적 투여량의 IL-2(d 참조)를 분비한 IL-2 백신을 비교용으로 사용하였다. 이 백신을 사용하여 5일 전이시킨 DBA/2 마우스들을 면역시켰다. 펩티드 50 ㎍을 포함한 백신은 8 마리 중 6 마리를 치유하였고, 5 ㎍을 함유한 것은 IL-2 백신과 마찬가지로 8 마리 중 4 마리를 치유한 반면, 0.5 ㎍을 함유한 백신은 8 마리 중 2 마리를 치유시켰다. 이 실험은 도 3a에 나타냈다.
실시예 3
예방 마우스 모델에서 외래 펩티드를 함유하는 백신과 IL-2 분비 종양 세포로부터의 종양 백신과의 비교
비교 시험에 있어서, 2 그룹의 실험 동물(각 그룹은 8마리임)을 한편으로는 실시예 2a)에 기술된 백신으로, 다른 한편으로는 IL-2 분비 M-3 세포의 백신 (WO 94/21808호에 기술된 절차에 따라서 제조됨, IL-2 투여량: 2,000 세포/동물)로 일주일의 주기로 2회 예비면역시켰다. 최종 백신처리 일주일후에, 대측성의 종양을 종양 세포의 수가 증가하도록 설정하였다("첼린지", 투여량은 도 3b)에 구체적으로 나타냄). 본 발명에 따른 종양 백신을 사용한 예비면역화는 IL-2 백신의 처리에 비해 월등하였고; IL-2 백신으로 백신 처리된 나이브 마우스는 105의 살아있는, 고도의 종양 유발성 세포(M-3-W)의 세포 투려량에 대해서만 방어하였다. 그러나, 이 백신의 능력은 3 x 105세포의 첼린지에 의해 소모된 반면, 이 정도의 종양 부하량은 외래 펩티드로 하전된 종양 세포의 백신으로 예비 면역시킨 동물에 의해 성공적으로 극복되었다.
실시예 4
외래 펩티드로 하전된 결장암 세포의 백신을 사용한 예비면역화에 의한 Balb/c 마우스의 방어(치료 마우스 모델)
a) CT 26 백신의 제조
제노펩티드 LFEAIEGFI 또는 FFIGALEEI 160 ㎍을 pL 10 ㎍으로 또는 트랜스페린-폴리라이신 3 ㎍ + 폴리라이신 10 ㎍과 혼합하고 HBS 완충액 500 ㎕ 중에서 주위 온도에서 30 분 동안 복합체를 형성시키고 이어서 DMEM 배지 (10% FCS, 20 mM 글루코오스) 4 ㎖ 중의 1.5 x 106CT-26 세포를 포함하는 T 75 세포 배양 플라스크로 이동시키고, 5% CO2하에 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 4 시간 후에, 세포들을 PBS로 세척하고, 새로운 배지 15ml과 혼합시키고, 5% CO2하에 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 투여한지 4 시간 후에, 세포들을 100 Gy로 조사시켰다. 백신은 WO 94/21808에 기술된 바와 같이 제조하였다.
b) CT-26 첼린지에 대한 그의 예방 효과에 대한 암 백신의 유효성에 대한 시험
6-12 주령의 Balb/c 마우스를 피하 주사(투여량: 105세포/동물)에 의해 일주일의 주기로 2회 백신처리시켰다. 실험에는 8 마리의 마우스가 동원되었다(또는 pL을 세포를 하전시키는데 사용한 실험에서는 7 마리임). 최종 백신처리 1 주일 후, 대측성의 종양을 5 x 104모 CT-26 세포를 사용하여 가하였다. 백신이 TfpL/DNA의 복합체 뿐만 아니라 대조군을 사용한 것 이외의 방법에 의해 제조된 비교 시험은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 종양 첼리지의 성장은 적어도 일주일에 1회 점검하였다. 펩티드 LFEAIEGFI에 대한 결과는 도 4a에 나타냈는데; 8 마리중 6 마리가 예방되었다. 펩티드 FFIGALEEI를 사용한 경우에(도 4a)에 나타내지 않음), 8 마리 중 4가 예방되었다.
c) 종양 백신 활성에 있어서 T-세포 참여
CT-26 백신에 의해 야기된 전신계 면역에 있어서 T-세포의 참여를 탐지하기 위하여, 또다른 실험으로, 백신처리 24 시간 전에, CD4+세포들을 단일클론 항체 GK1.5(ATCC TIB 207) 500㎍의 정맥내 주사에 의해 제거하고, CD8+세포들을 단일클론 항체 2.43 (ATCC TIB 210) 500㎍의 정맥내 주사에 의해 제거하였다. 양성의 대조군은 CD4+세포 및 CD8+세포들을 제거하지않은 백신들을 주입시켰다. 이 시험의 결과는 도4b에 나타내었다. T-세포의 참가는 T-세포가 제거된 모든 동물들이 종양을 발병한 사실에 의해 나타난다.
실시예 5
외래 펩티드로 하전된 멜라노마 세포의 백신을 사용한 C57BL/6J 마우스의 예방("예방 마우스 모델")
이 실시예에 있어서, 계통 C57BL/6J의 마우스들을 실험 동물로서 사용하였다(각 군은 8 마리임). 사용된 멜라노마 세포는 사용된 마우스 계통과 동계의 B16-F110 세포(NIH DCT 종양 기탁소; Fidler et al., 1975)이었다.
모든 실험 군의 동물들을 105B16-F10 세포/마우스의 피하 주사에 의해 일주일 간격으로 2회 백신처리시켰다.
한 시험 시리즈에 있어서, 백신은 M-3 세포로부터의 백신에 대하여 실시예 2에 기술한 바와 같이 서열 ASNENMETM의 펩티드로, 조사된 B16-F10 세포를 하전시킴으로써 생성하였다.
평행 시험에 있어서, IL-2 또는 GM-CSF를 분비하는 B16-F10 세포(WO 94/21808호에 기술된 바와 같은 절차에 의해 제조함)를 예비 면역화용 백신으로서 사용하였는데; 이 백신은 동물 당 IL-2 1,000 단위 또는 GM-CSF 200 ng을 생산하였다.
최종 백신처리한지 일주일 후에, 종양들은 1 x 104의 생, 조사된 B16-F10 세포를 사용하여 실험동물에서 설정하고 이어서 종양 성장을 관찰하였다.
이들 실험 결과는 도 5에 나타냈는데; 외래 펩티드로 하전된 종양 세포들은 종양 형성에 대하여 최대의 예방 효과를 나타냈다.
<표>
Claims (35)
- 이들 스스로 HLA 측면에서 종양 항원으로부터 유도된 펩티드를 제시하는 종양 세포로 이루어지고, 이들의 적어도 일부는 세포 표면 상에서 환자의 MHC-I 하플로타입을 하나 이상 가지며, 이들은 종양 세포가 환자의 면역계에 의해 펩티드의 측면에서 이물질로서 인식되어 세포성 면역 반응을 유발하는 방식으로 하나 이상의 펩티드 a) 및(또는) b)로 하전되고, 이들 펩티드들은a) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 단백질로부터 유도되는 펩티드와는 상이한 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하거나, 또는b) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 종양 항원으로부터 유도되고, 환자의 종양 세포 상에서 발현되는 것과 동일한 종양 항원으로부터 유도된 펩티드의 농도보다 더 높은 백신의 종양 세포 상의 농도로 존재하는 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하는 것인환자에 투여하기 위한 종양 백신
- 제1항에 있어서, 자가조직의 종양 세포를 포함함을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항에 있어서, 동종이계의 종양 세포를 포함함을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제3항에 있어서, 동종이계의 종양 세포는, 적어도 하나의 세포주가 치료되는 환자의 종양 항원과 동일한 적어도 하나의, 바람직하게는 몇 개의 종양 항원을 발현하는, 하나 이상의 세포임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 자가조직 및 동종이계 세포의 혼합물로 이루어짐을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항에 있어서, 펩티드 a) 또는 b)가 H2-Kd-리간드임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항에 있어서, 펩티드 a) 또는 b)가 H2-Kb-리간드임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항, 제6항 또는 7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 a)가 자연 발생 면역원성 단백질 또는 그의 세포 분해 산물임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제8항에 있어서, 펩티드 a)가 바이러스성 단백질임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제9항에 있어서, 펩티드가 인플루엔자 바이러스 단백질임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제10항에 있어서, 펩티드가 서열 Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile을 가짐을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제10항에 있어서, 펩티드가 서열 Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met을 가짐을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제10항에 있어서, 펩티드 a)가 세균성 단백질임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항에 있어서, 펩티드 a)가 환자에 대해 외래 종양 항원으로부터 유도됨을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항에 있어서, 펩티드 a)가 합성 펩티드임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제15항에 있어서, 펩티드가 서열 Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile를 가짐을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항 내지 제16항 어느 한 항에 있어서, 종양 세포가 다수의 상이한 서열의 펩티드로 처리된 것임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제17항에 있어서, 펩티드가 상이한 HLA-서브타입에 결합되는 점에서 상이한 것임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제17항에 있어서, 펩티드가 HLA-결합에 중요하지 않은 이들의 서열의 면에서 서로 상이한 것임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 유전자로 형질감염된 종양 세포를 함유함을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제20항에 있어서, 사이토카인이 IL-2 및(또는) IFN-γ임을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 펩티드 b)로 처리된 섬유아세포를 함유함을 특징으로 하는 종양 백신.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 펩티드 b) 및(또는) MHC-II 분자에 결합된 펩티드로 처리된 수상 세포를 함유함을 특징으로 하는 종양 백신.
- 이들 스스로 HLA 측면에서 종양 항원으로부터 유도된 펩티드를 제시하고, 이들의 적어도 일부는 환자의 적어도 하나의 MHC-I 하플로타입을 발현하는 종양 세포를a) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 단백질로부터 유도되는 펩티드와는 상이한 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하거나, 또는b) 환자 및 백신의 종양 세포에 대해 공통적이고, 환자의 세포에 의해 발현되는 종양 항원으로부터 유도되는 MHC-I-하플로타입에 대한 리간드로서 작용하는 것인 하나 이상의 펩티드로 처리하고,종양 세포를 유기 폴리양이온의 존재하에서 환자의 면역계에 의해 이물질로서 인식되는 방식으로 펩티드가 종양 세포에 결합되기에 충분한 시간 및 양의 하나 이상의 펩티드 a) 및(또는) b)로 인큐베이션시켜서 세포성 면역 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는환자에 투여하기 위한 종양 백신을 함유하는 종양 백신의 제조 방법.
- 제24항에 있어서, 폴리라이신이 폴리양이온으로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 약 30 내지 약 300개의 라이신 기를 가진 폴리라이신이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리라이신이 적어도 부분적으로 공액된 형태로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 폴리라이신이 트랜스페린과 공액된 것임을 특징으로 하는방법.
- 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 또한 DNA의 존재하에서 처리하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, DNA가 플라스미드임을 특징으로 하는 방법.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, DNA 대 임의로 부분적으로 단백질과 공액되는 폴리양이온의 비가 약 1:2 내지 약 1:5임을 특징으로 하는 방법.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 멜라노마 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 펩티드 a) 및(또는) b)가 약 50 ㎍ 내지 약 160 ㎍/ 1 x 105내지 2 x 107세포임을 특징으로 하는 방법.
- 환자의 종양 항원으로부터 유도된 펩티드 b)를 펩티드로서 사용하는 것인 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법의 섬유아세포에의 적용.
- 환자의 종양 항원으로부터 유도된 펩티드 b) 및(또는) 환자의 MHC-II 분자에 결합되는 펩티드를 펩티드로 사용하는 것인 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법의 수상 세포에의 적용.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19543649A DE19543649C2 (de) | 1995-11-23 | 1995-11-23 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19543649.0 | 1995-11-23 | ||
| DE19607044A DE19607044A1 (de) | 1996-02-24 | 1996-02-24 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19607044.9 | 1996-02-24 | ||
| PCT/EP1996/005126 WO1997019169A1 (de) | 1995-11-23 | 1996-11-21 | Tumorvakzine und verfahren zu ihrer herstellung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990067653A true KR19990067653A (ko) | 1999-08-25 |
Family
ID=26020603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019980703681A KR19990067653A (ko) | 1995-11-23 | 1996-11-21 | 종양 백신 및 그의 제조 방법 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020085997A1 (ko) |
| EP (1) | EP0866851A1 (ko) |
| JP (1) | JP2000502052A (ko) |
| KR (1) | KR19990067653A (ko) |
| CN (1) | CN1202931A (ko) |
| AR (1) | AR004341A1 (ko) |
| AU (1) | AU720131B2 (ko) |
| BG (1) | BG62999B1 (ko) |
| BR (1) | BR9611466A (ko) |
| CA (1) | CA2238176A1 (ko) |
| CO (1) | CO4520254A1 (ko) |
| CZ (1) | CZ158998A3 (ko) |
| EE (1) | EE03778B1 (ko) |
| HU (1) | HUP0000318A3 (ko) |
| NO (1) | NO982329D0 (ko) |
| NZ (1) | NZ322910A (ko) |
| PL (1) | PL188537B1 (ko) |
| RO (1) | RO115275B1 (ko) |
| RU (1) | RU2206329C2 (ko) |
| SK (1) | SK66998A3 (ko) |
| TR (1) | TR199800912T2 (ko) |
| TW (1) | TW514530B (ko) |
| UY (2) | UY24367A1 (ko) |
| WO (1) | WO1997019169A1 (ko) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RS50101B (sr) † | 1996-02-24 | 2009-01-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh., | Farmaceutski preparati za imunomodulaciju |
| CA2278678A1 (en) * | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Research Corporation Technologies, Inc. | Cancer immunotherapy with semi-allogeneic cells |
| DK0904786T3 (da) * | 1997-08-22 | 2005-03-21 | Science Park Raf S P A | Tumorvaccination under anvendelse af autologe eller HLA-relaterede antigenpræsenterende celler (APC) transduceret med et tumorantigen og et fremmed antigen, som kan fremkalde en immunreaktion |
| US7014848B1 (en) | 1998-03-20 | 2006-03-21 | Genzyme Corporation | Enhanced anti-tumor immunity |
| EP1064390A4 (en) * | 1998-03-20 | 2002-06-12 | Genzyme Corp | IMPROVED ANTI-TUMOR IMMUNITY |
| FR2807661A1 (fr) * | 2000-04-14 | 2001-10-19 | Univ Nantes | Agent et procede pour la simulation de lymphocytes t specifiques et lymphocytes t obtenus |
| CA2476995A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Kyogo Itoh | Method of detecting cellular immunity and application thereof to drugs |
| GB0209896D0 (en) | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| CN1315536C (zh) * | 2002-09-13 | 2007-05-16 | 李进 | 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物 |
| GB0224442D0 (en) | 2002-10-21 | 2002-11-27 | Molmed Spa | A delivery system |
| ATE475430T1 (de) * | 2003-08-25 | 2010-08-15 | Univax Llc | Präventive krebsvakzine auf basis des boris (brother of regulator of imprinted sites) moleküls |
| US7674456B2 (en) * | 2004-06-14 | 2010-03-09 | Charles Wiseman | Breast cancer cell lines and uses thereof |
| WO2006105255A2 (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Cancer vaccines and therapeutic methods |
| ES2341802T3 (es) * | 2005-09-05 | 2010-06-28 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase ii. |
| US20090004213A1 (en) | 2007-03-26 | 2009-01-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Combination therapy using active immunotherapy |
| WO2011101465A1 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Intercell Ag | Ic31 nanoparticles |
| CA2879024A1 (en) * | 2012-07-12 | 2014-01-16 | Persimmune, Inc. | Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies |
| EP3431595A4 (en) | 2016-03-15 | 2019-11-20 | Repertoire Genesis Incorporation | MONITORING AND DIAGNOSIS FOR IMMUNOTHERAPY AND DESIGN FOR THERAPEUTICS |
| BR112019023477A2 (pt) | 2017-05-08 | 2020-06-30 | Gritstone Oncology, Inc. | vetores de neoantígeno de alfavírus |
| SG11202113187WA (en) | 2019-05-30 | 2021-12-30 | Gritstone Bio Inc | Modified adenoviruses |
| IL300026A (en) | 2020-08-06 | 2023-03-01 | Gritstone Bio Inc | Multiepitope vaccine cassettes |
| CN117222418A (zh) * | 2021-03-12 | 2023-12-12 | T-Cure生物科学公司 | 增强肿瘤中的hla单倍型表达多样性以扩大肿瘤细胞对tcr-t疗法的敏感性的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
| EP0569678A3 (en) * | 1992-03-13 | 1994-10-26 | Yeda Res & Dev | Double transfectants of MHC genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis. |
-
1996
- 1996-11-19 UY UY24367A patent/UY24367A1/es not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 CN CN96198493A patent/CN1202931A/zh active Pending
- 1996-11-21 RU RU98111622/14A patent/RU2206329C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 CZ CZ981589A patent/CZ158998A3/cs unknown
- 1996-11-21 SK SK669-98A patent/SK66998A3/sk unknown
- 1996-11-21 CA CA002238176A patent/CA2238176A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 AU AU76947/96A patent/AU720131B2/en not_active Ceased
- 1996-11-21 NZ NZ322910A patent/NZ322910A/xx unknown
- 1996-11-21 JP JP9519395A patent/JP2000502052A/ja not_active Abandoned
- 1996-11-21 RO RO98-00985A patent/RO115275B1/ro unknown
- 1996-11-21 EP EP96939870A patent/EP0866851A1/de not_active Withdrawn
- 1996-11-21 BR BR9611466A patent/BR9611466A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 PL PL96326756A patent/PL188537B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 EE EE9800161A patent/EE03778B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 TR TR1998/00912T patent/TR199800912T2/xx unknown
- 1996-11-21 US US09/077,214 patent/US20020085997A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 WO PCT/EP1996/005126 patent/WO1997019169A1/de not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 KR KR1019980703681A patent/KR19990067653A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 HU HU0000318A patent/HUP0000318A3/hu unknown
- 1996-11-22 CO CO96061701A patent/CO4520254A1/es unknown
- 1996-11-22 AR ARP960105291A patent/AR004341A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-11-23 TW TW085114455A patent/TW514530B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-01-03 UY UY24430A patent/UY24430A1/es not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-05-08 BG BG102439A patent/BG62999B1/bg unknown
- 1998-05-22 NO NO982329A patent/NO982329D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UY24430A1 (es) | 1997-07-01 |
| RU2206329C2 (ru) | 2003-06-20 |
| TW514530B (en) | 2002-12-21 |
| WO1997019169A1 (de) | 1997-05-29 |
| PL326756A1 (en) | 1998-10-26 |
| JP2000502052A (ja) | 2000-02-22 |
| NZ322910A (en) | 2000-05-26 |
| HUP0000318A3 (en) | 2002-02-28 |
| EE03778B1 (et) | 2002-06-17 |
| RO115275B1 (ro) | 1999-12-30 |
| CZ158998A3 (cs) | 1999-06-16 |
| EP0866851A1 (de) | 1998-09-30 |
| BR9611466A (pt) | 1999-05-18 |
| SK66998A3 (en) | 1998-12-02 |
| EE9800161A (et) | 1998-12-15 |
| BG62999B1 (bg) | 2001-01-31 |
| CO4520254A1 (es) | 1997-10-15 |
| NO982329D0 (no) | 1998-05-22 |
| AR004341A1 (es) | 1998-11-04 |
| BG102439A (en) | 1999-01-29 |
| AU7694796A (en) | 1997-06-11 |
| PL188537B1 (pl) | 2005-02-28 |
| UY24367A1 (es) | 2000-10-31 |
| HUP0000318A2 (hu) | 2000-06-28 |
| AU720131B2 (en) | 2000-05-25 |
| CN1202931A (zh) | 1998-12-23 |
| US20020085997A1 (en) | 2002-07-04 |
| CA2238176A1 (en) | 1997-05-29 |
| TR199800912T2 (xx) | 1998-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR19990067653A (ko) | 종양 백신 및 그의 제조 방법 | |
| KR100457647B1 (ko) | 펩티드및애쥬번트에기초한면역조절용약제학적조성물 | |
| Porgador et al. | Induction of antitumor immunity using bone marrow-generated dendritic cells. | |
| US7892828B2 (en) | Method of identifying a MHC class I restricted T cell response | |
| Minev et al. | Insertion signal sequence fused to minimal peptides elicits specific CD8+ T-cell responses and prolongs survival of thymoma-bearing mice | |
| CA2715488C (en) | Immunogenic control of tumours and tumour cells | |
| EP2249864B1 (en) | Strategies to prevent and/or treat immune responses to soluble allofactors | |
| JPH09502086A (ja) | 完全ｍａｇｅ１遺伝子のクローニング及び特性決定 | |
| US20240092843A1 (en) | Peptides and methods for the treatment of diabetes | |
| US20210401976A1 (en) | Immunogenic peptides with improved oxidoreductase motifs | |
| Borges et al. | Efficacy of synthetic vaccines in the induction of cytotoxic T lymphocytes comparison of the costimulating support provided by helper T cells and lipoamino acid | |
| Dakappagari et al. | Intracellular delivery of a novel multiepitope peptide vaccine by an amphipathic peptide carrier enhances cytotoxic T‐cell responses in HLA‐A* 201 mice | |
| CN113906046A (zh) | 具有包含经修饰半胱氨酸的氧化还原酶基序的免疫原性肽 | |
| MXPA98003930A (en) | Vaccines against tumors and procedure for your producc | |
| AU2016202443A1 (en) | Immunogenic control of tumours and tumour cells | |
| AU2013270496A1 (en) | Immunogenic control of tumours and tumour cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |