SK66998A3 - Tumour vaccine and process for the preparation thereof - Google Patents
Tumour vaccine and process for the preparation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- SK66998A3 SK66998A3 SK669-98A SK66998A SK66998A3 SK 66998 A3 SK66998 A3 SK 66998A3 SK 66998 A SK66998 A SK 66998A SK 66998 A3 SK66998 A3 SK 66998A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- tumor
- cells
- patient
- vaccine
- peptide
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 119
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 220
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 148
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 124
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 104
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 72
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 69
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 47
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 22
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 16
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 16
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 7
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 2
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 claims 6
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 claims 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 10
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 9
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 9
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N Ala-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CKLDHDOIYBVUNP-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 3
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 3
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100030525 Gap junction alpha-4 protein Human genes 0.000 description 2
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N Gly-Phe-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IBYOLNARKHMLBG-WHOFXGATSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N Phe-Phe-Ile Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FENSZYFJQOFSQR-FIRPJDEBSA-N 0.000 description 2
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 108010015408 connexin 37 Proteins 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 108010072094 gp100(280-288) melanoma antigen peptide Proteins 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound CN=C(N)NN=O DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001467 Envelope glycoprotein E2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N Glu-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O LJLPOZGRPLORTF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N Glu-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O ZGXGVBYEJGVJMV-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010014597 HLA-B44 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000997835 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK1 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010080632 MUT 1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010081053 MUT 2 peptide Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033438 Tyrosine-protein kinase JAK1 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 101150025202 hapX gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 108700008272 transferrin-polylysine conjugate Proteins 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
- A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Protinádorová vakcína obsahuje nádorové bunky, z kto< rých prinajmenšom časť nesie na svojom povrchu hapX, lotyp MHC-I pacienta, a ktoré boli spojené s jedným alebo viacerými peptidmi viažucimi sa na molekulu MHC-I tak, aby nádorové bunky v kontexte s peptidmi boli rozpoznané imunitným systémom pacienta ako cudzie a aby vyvolali bunkovú imunitnú odpoveď. Spojenie sa uskutočňuje v prítomnosti polykatiónu ako je napríklad polylyzín.
7/ζ
-1 . .
Protinádorová vakcína, spôsob jej prípravy a jej použitie
Oblasť techniky
Vynález sa týka protinádorovej vakcíny, spôsobu jej prípravy a jej použitie.
Doterajší stav techniky
Vývoj terapeutickej vakcíny na báze nádorových buniek spočíva v podstate na nasledujúcich predpokladoch: medzi nádorovými a normálnymi bunkami existujú kvalitatívne alebo kvantitatívne rozdiely; imunitný systém je principiálne schopný tieto rozdiely rozpoznať; imunitný systém sa môže - aktívnou špecifickou imunizáciou vakcínami - stimulovať k tomu, aby na základe týchto rozdielov nádorové bunky rozpoznal a eliminoval.
Na uskutočnenie protinádorovej odpovede musia byť splnené aspoň dva predpoklady: po prvé, nádorové bunky musia exprimovať antigény alebo neo-epitopy, ktoré sa na normálnych bunkách nevyskytujú. Po druhé, imunitný systém sa musí zodpovedajúcim spôsobom aktivovať, aby mohol na tieto antigény reagovať. Dôležitou prekážkou pri imunoterapii nádorov je ich nízka imunogenita, predovšetkým u človeka. Je to preto prekvapujúce, lebo by sa dalo očakávať, že veľký počet genetických zmien v malígnych bunkách by mal viesť ku vzniku peptidových neoepitopov, ktoré sú v kontexte s molekulami MHC-I rozpoznávané cytotoxickými Tlymfocytmi.
Nedávno boli objavené s nádormi asociované a nádoroVo špecifické antigény, ktoré sú takýmito neo-epitopmi a tým by mali predstavovať potenciálny cieľ pre zásah imunitného systému. To, že sa imunitnému systému nedarí eliminovať nádory, ktoré tieto neo-epitopy exprimujú, nespočíva zrejme v chýbaní neo-epitopov, ale v tom, že imunitná odpoveď je na tieto neo-antigény nedostačujúca.
Pre imunoterapiu rakoviny na bunkovom základe boli vyvinuté dve všeobecné stratégie: na jednej strane je to adoptívna imunoterapia, ktorá využíva in vitro expanziu nádorovo reaktívnych T-lymfocytov a ich opätovné zavedenie do
-2pacienta; na strane druhej je to aktívna imunoterapia, ktorá aplikuje nádorové bunky v očakávaní, že sa tým voči nádorovým antigénom vyvolajú buď nové alebo zosilnené imunitné reakcie, ktoré povedú k systémovej protinádorovej odpovedi.
Protinádorové vakcíny na báze aktívnej imunoterapie sa pripravovali rôznymi spôsobmi; príkladom sú ožiarené nádorové bunky, ktoré sa nahrádzajú imunostimulujúcimi adjuvantnými činidlami, ako je napríklad Corynebacterium parvum alebo Bacillus Calmette Guerin (BCG) s cieľom vyvolať imunitnú reakciu voči nádorovým antigénom (Oettgen a Old, 1991).
V posledných rokoch sa na aktívnu imunoterapiu proti rakovine použili predovšetkým geneticky modifikované nádorové bunky, ktoré sa dajú rozdeliť do troch kategórií:
Jedna z nich využíva geneticky modifikované nádorové bunky, aby produkovali cytokíny. Lokálna koincidencia nádorových buniek a cytokínového signálu vytvárajú stimul, ktorý vyvoláva protinádorovú imunitu. Prehľad aplikácií tejto stratégie bol publikovaný autormi Pardoll, 1993, Zatloukal a spol., 1993, a Dranoff a Mulligan, 1995.
O nádorových bunkách, ktoré boli geneticky zmenené, aby sekretovali cytokíny ako napríklad IL-2, GM-CSF alebo lFN-γ, alebo aby exprimovali ko-stimulujúce molekuly, sa v experimentálnych zvieracích modeloch ukázalo, že generujú mocnú protinádorovú imunitu (Dranoff a spol., 1993; Zatloukal a spol., 1995). U človeka, ktorý už má značne veľkú nádorovú masu a voči tomuto nádoru sa uňho vyvinula tolerancia, je však podstatne obtiažnejšie úplne pochopiť kaskádu komplexných vzájomných vzťahov tak, aby sa mohla uskutočniť účinná protinádorová reakcia. Skutočná účinnosť protinádorových vakcín sekretujúcich cytokíny na aplikovanie u človeka sa ešte nepreukázala.
Ďalšia kategória génov, pomocou ktorých sa nádorové bunky dajú meniť tak, aby sa mohli použiť ako protinádorová vakcína, kóduje takzvané doplnkové proteíny („accessory proteins“); cieľom tejto aplikácie je prefunkcionovať nádorové bunky na bunky prezentujúce antigény („neo-APCs'j, aby sa nechali priamo generovať nádorovo špecifické T-lymfocyty. Príklad takej aplikácie opísal OstrandRosenberg, 1994.
-3Identifikácia a izolovanie nádorových antigénov, prípadne od nich odvodených peptidov (opísali ich napr. autori Wólfel a spol., 1994a) a 1994b), Carrel a spol., 1993, Lehmann a spol., 1989, Tibbets a spol., 1993, alebo boli opísané v uverejnených medzinárodných prihláškach WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159) boli predpokladom pre to, aby sa použili nádorové antigény ako imunogény do protinádorových vakcín, a to síce ako vo forme proteínov, tak aj vo forme peptidov. Protinádorová vakcína vo forme nádorových antigénov ako takých však nie je dostatočne imunogénna na to, aby vyvolala bunkovú imunitnú odpoveď, ako by to bolo potrebné na eliminovanie nádorových buniek nesúcich nádorové antigény; a aj spoločná aplikácia adjuvantných činidiel poskytuje iba obmedzené možnosti na zosilnenie imunitnej odpovede (Oettgen a Old, 1991).
Treťou stratégiou aktívnej imunoterapie na zvýšenie účinnosti protinádorových vakcín spočíva na autológnych nádorových bunkách, ktoré boli xenogenizované (urobené cudzími). Podstatou tejto koncepcie je predpoklad, že imunitný systém reaguje na nádorové bunky, ktoré exprimujú cudzí proteín, a že spolu s touto reakciou sa vyvolá aj imunitná odpoveď voči tým nádorovým antigénom, ktoré sú prezentované nádorovými bunkami vakcíny.
Prehľad týchto rôznych aplikácií, pri ktorých sa nádorové bunky vzhľadom na zosilnenú imunogenitu urobili cudzími zavedením rôznych génov, publikovali Zatloukal a spol., 1993.
Ústrednú úlohu pri regulovaní špecifickej imunitnej odpovede hrá trojmolekulový komplex pozostávajúci z receptoru antigénu T-buniek, MHC-molekuly („major histocompatibility complex“ - hlavný imunohistokompatibilný komplex) a ich ligandu, ktorý je peptidový fragment odvodený od proteinu.
MHC-l-molekuly (prípadne zodpovedajúce ľudské molekuly, HLA) sú peptidové receptory, ktoré pri prísnej špecifickosti umožňujú väzbu miliónov rôznych ligandov. Predpokladom k tomu sú alelicky špecifické peptidové motívy, ktoré sa vyznačujú nasledovnými kritériami špecifickosti: peptidy majú, v závislosti od MHC-I haplotypu, definovanú dĺžku, spravidla osem až desať aminokyselinových zvyškov. V typickom prípade dve z aminokyselinových pozícií predstavujú tzv. „kotvy“, ktoré sa môžu obsadiť iba jedinou konkrétnou aminokyselinou alebo ami
-4nokyselinovým zvyškom s blízko príbuznými bočnými reťazcami. Presná poloha týchto aminokyselín v peptide a požiadavky na ich vlastnosti sa menia s MHC-I haplotypmi. C-terminálový koniec peptidových ligandov je často alifatický alebo naviazaný zvyšok. Také alelicky špecifické MHC-I peptidové ligandové motívy sú zatiaľ známe okrem iných pre H-2Kd, Kb, Kk, Kkm1, Db, HLA-A*0201, A*0205 a B*2705.
V rámci obratu proteínov v bunke sa regulárne, zmenené a cudzie génové produkty, napríklad vírusové proteíny alebo nádorové antigény rozložia do malých peptidov; niektoré z nich sú potencionálnymi ligandmi pre MHC-I molekuly. Tým je splnený predpoklad pre ich prezentáciu prostredníctvom molekúl MHC a následne pre vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede, pričom sa zatiaľ nevie celkom presne, ako sa peptidy ako MHC-I ligandy v bunke produkujú.
Jeden z postupov, ktorý využíva tento mechanizmus na xenogenizovanie nádorových buniek vzhľadom na zosilnenie imunitnej odpovede, spočíva v tom, že nádorové bunky sa vystavia účinkom mutagénnych chemikálií, ako je napríklad Nmetyl-N‘-nitrózoguanidín. Toto má viesť k tomu, aby nádorové bunky prezentovali neo-antigény odvodené od zmutovaných variantov bunkových proteínov, ktoré predstavujú cudzie génové produkty (Van Pel a Boon, 1982). Nakoľko však výsledky mutačného procesu sú rozdelené po celom genóme náhodne a okrem toho sa dá očakávať, že jednotlivé bunky budú v dôsledku rôznych udalostí v mutačnom procese prezentovať aj rôzne neo-antigény, tento spôsob sa kvalitatívne aj kvantitatívne dá len ťažko kontrolovať.
Ďalší spôsob xenogenizuje nádorové bunky tak, že sa transfekujú s génmi jedného alebo viacerých cudzích proteínov, napr. s génom cudzej MHC-I molekuly alebo MHC proteínu odlišného haplotypu, ktorý sa potom prejaví na povrchu bunky (EP-A2 0 569 678; Plautz a spol., 1993, Nabel a spol., 1993). Tento spôsob spočíva na horeuvedenej predstave, že nádorové bunky, ak sa podávajú vo forme celobunkovej vakcíny, sa vďaka exprimovanému proteínu, prípadne od neho odvodenému peptidu, sa rozpoznajú ako cudzie, alebo že, v prípade expresie autológnych MHC-I molekúl, v dôsledku zvýšeného počtu MHC-I molekúl na povrchu bunky sa prezentácia nádorových antigénov optimalizuje. Zmena nádorových bu
-5niek pomocou cudzieho proteínu môže viesť k tomu, že bunky budú prezentovať peptidy odvodené od cudzieho proteínu v kontexte MHC a zmena z „vlastného na „cudzie sa odohrá v rámci rozpoznávania komplexu MHC-peptid. Rozpoznanie proteínu alebo peptidu ako cudzieho má za následok, že v priebehu imunitného rozpoznávania sa vyvolá imunitná odpoveď nielen proti cudziemu proteínu, ale aj proti nádorovým antigénom vlastným pre nádorové bunky. Počas tohto procesu sa aktivujú antigén prezentujúce bunky (antigén presenting celíš, APCs), ktoré proteíny vyskytujúce sa v nádorovej bunke vakcíny (vrátane nádorových antigénov) spracujú na peptidy a použijú ich ako ligandy pre svoje vlastne MHC-I a MHC-II molekuly. Aktivované, o peptidy obohatené bunky prezentujúce antigény sa presunú do lymfatických uzlín, kde niekoľko málo intaktných T-lymfocytov rozpozná na povrchu antigén prezentujúcich buniek peptidy pochádzajúce z nádorových antigénov a môžu ich použiť ako stimul ku klonálnej expanzii - inými slovami, ku generovaniu nádorovo špecifických CTL a pomocných T-buniek.
Predkladaný vynález si dal za úlohu pripraviť novú protinádorovú vakcínu na základe xenogenizovaných nádorových buniek, pomocou ktorých bude možné vyvolať účinnú bunkovú protinádorovú reakciu.
Pri riešení vytýčenej úlohy sa vychádzalo z nasledovných predpokladov: kým imunitný systém nemaligne, normálne bunky tela toleruje, reaguje telo na normálnu bunku, ak napríklad v dôsledku vírusovej infekcie syntetizuje cudzie proteiny, imunitnou odpoveďou. Dôvodom je to, že MHC-I molekuly prezentujú cudzie peptidy, ktoré pochádzajú z cudzích proteinov. V dôsledku toho imunitný systém registruje, že s touto bunkou sa stalo niečo nežiadúce, cudzie. Bunka sa eliminuje, APCs sa zaktivujú a proti bunkám exprimujúcim cudzie proteiny sa vygeneruje nová, špecifická imunita.
Nádorové bunky síce obsahujú príslušné nádorovo špecifické nádorové antigény, avšak ako také sú nedostatočnou vakcínou, pretože v dôsledku svojej nepatrnej imunogenity ich imunitný systém ignoruje. Ak sa, v protiklade so známymi predpokladmi, na nádorovú bunku neumiestni cudzí proteín, ale cudzí peptid, potom okrem cudzích peptidov aj nádorové antigény vlastné pre túto bunku budú identifikované ako cudzie. Xenogenizáciou pomocou peptidu sa má dať dosiahnuť
-βίο, aby sa cudzím peptidom vyvolaná bunková imunitná reakcia nasmerovala proti nádorovým antigénom.
Príčinou nízkej imunogenity nádorových buniek nebude asi kvalitatívny, ale kvantitatívny problém. Pre peptid odvodený od nádorového antigénu to môže znamenať, že bude síce prezentovaný MHC-I molekulami, avšak v takej koncentrácii, ktorá je príliš nízka na to, aby vyvolala bunkovú, nádorovo špecifickú imunitnú reakciu. Zvýšenie počtu nádorovo špecifických peptidov na nádorovej bunke by malo tým spôsobiť zároveň aj xenogenizáciu nádorovej bunky, čo povedie k vyvolaniu bunkovej imunitnej odpovede. V protiklade s predpokladmi, podľa ktorých nádorový antigén, prípadne peptid od neho odvodený, bude na povrchu bunky prezentovaný tým, že bude transfekovaný pomocou DNA kódujúcej príslušný proteín alebo peptid, ako to bolo opísané v medzinárodných prihláškach WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 a WO 95/00159, ak by sa mala pripraviť vakcína, ktorá pri jednoduchšej príprave vyvolá účinnú imunitnú odpoveď.
Von Mandelboim a spol. (1994 a 1995) navrhli, aby sa bunky RMA-S inkubovali s peptidmi odvodenými od nádorových antigénov, aby sa tým vyvolala bunková imunitná reakcia proti príslušným nádorovým antigénom pacienta. O bunkách označovaných ako RMA-S (Kärre a spol., 1986), ktoré von Mandelboim a spol. navrhovali využiť na protinádorovú vakcináciu, sa predpokladá, že môžu vykonávať funkcie antigén prezentujúcich buniek (APCs). Majú takú zvláštnosť, že ich povrchové HLA molekuly pre defekt v bunkovom TAP mechanizme („transport of antigenic peptides“; zodpovedný za spracovanie peptidov a ich naviazanie na HLA molekuly) sú prázdne. Tým sú bunky pripravené pre naviazanie peptidu, a fungujú zároveň aj ako nosič pre tento zvonka ponúknutý peptid. Ďosiahnutý protinádorový účinok spočíva vo vyvolaní imunitnej odpovede proti peptidu prezentovanom na povrchu bunky, ktorý sa ponúkne imunitnému systému bez bezprostredného kontextu s antigénovým repertoárom nádorovej bunky.
-7Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je protinádorová vakcína podávaná pacientovi, pozostávajúca z nádorových buniek, ktoré v HLA kontexte zo seba prezentujú peptidy odvodené od nádorových antigénov, a z ktorých aspoň časť má na svojom povrchu prinajmenšom jeden MHC-I haplotyp pacienta, a na ktoré bol umiestnený jeden alebo viaceré peptidy a) a/alebo b) tak, aby boli nádorové bunky v kontexte s peptidmi rozpoznané ako cudzie a aby vyvolali bunkovú imunitnú odpoveď, pričom peptidy
a) fungujú ako ligandy pre MHC-I haplotyp, ktorý je spoločný pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny, a odlišujú sa peptidmi odvodenými od proteínov, ktoré sú exprimované bunkami pacienta, alebo
b) fungujú ako ligandy pre MHC-I haplotyp, ktorý je spoločný pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny, a sú odvodené od nádorových antigénov, ktoré exprimujú bunky pacienta a sú prítomné na nádorových bunkách vakcíny v takej koncentrácii, ktorá je vyššia ako je koncentrácia peptidu odvodeného od toho istého antigénu ako je exprimovaný na nádorových bunkách pacienta.
Ľudské MHC molekuly sú v ďalšom označované podľa medzinárodných zvyklosti aj ako „HLA“ („human leucocyte antigén).
Pod pojmom „bunková imunitná odpoveď“ sa rozumie cytotoxická imunita T-buniek, ktorá v dôsledku generovania nádorovo špecifických cytotoxických CD8-pozitívnych T-buniek a CD4-pozitívnych pomocných (helper) T-buniek spôsobuje elimináciu nádorových buniek.
Účinok vakcíny z nádorových buniek podľa tohto vynálezu spočíva predovšetkým v tom, že imunogénny účinok súboru nádorových antigénov prítomných na povrchu nádorových buniek sa prostredníctvom peptidu zosilní.
Peptidy typu a) sú v ďalšom označované ako „cudzie peptidy“ alebo „xenopeptidy“.
V jednej forme realizácie vynálezu sú nádorové bunky vakcíny autológne. Ide pritom o bunky odoberané pacientovi, ktorý má byť liečený, ošetria sa ex vivo
-8peptidom (peptidmi) typu a) a/alebo b), prípadne sa inaktivujú a potom sa opäť podajú pacientovi. (Spôsoby prípravy autológnych proti nádorových vakcín sú opísané vo vynáleze WO 94/21808, na závery ktorého sa tu odvoláva).
V ďalšej forme realizácie vynálezu sú nádorové bunky alogénne, čiže nepochádzajú od pacienta, ktorý má byť liečený. Použitiu alogénnych buniek sa dáva prednosť v tom prípade, keď aj pracovne-ekonomické hľadiská hrajú určitú úlohu; príprava individuálnych vakcín pre jednotlivých pacientov je náročné na prácu a náklady, okrem toho pri jednotlivých pacientoch sa vyskytujú ťažkosti pri kultivácii nádorových buniek ex vivo, takže nádorové bunky sa nedajú získať v dostatočne veľkom počte na to, aby sa z nich dala pripraviť vakcína. Pri alogénnych nádorových bunkách je potrebné pamätať na to, aby ich HLA podtyp súhlasil s HLA podtypom pacienta. V prípade použitia cudzích peptidov kategórie a) pri alogénnych nádorových bunkách ide o bunky jednej alebo viacerých bunkových línií, z ktorých aspoň jedna bunková línia exprimuje prinajmenšom jeden, výhodne viaceré nádorové antigény identické s nádorovými antigénmi liečeného pacienta, čiže protinádorová vakcína sa zosúladí s nádorovou indikáciou pacienta. Tým sa dosiahne, že imunitná odpoveď vyvolaná na povrchu nádorových buniek vakcíny cudzími peptidmi prezentovanými prostredníctvom MHC-I, ktorá vedie k expanzii nádorovo špecifických CTL a T-pomocných buniek, sa nasmeruje aj proti nádorovým bunkám pacienta, pretože tieto exprimujú tie isté nádorové antigény ako bunky vakcíny.
Ak sa napríklad protinádorovou vakcínou podľa tohto vynálezu ošetrí pacientka, ktorá má metastázy karcinómu prsníka, ktoré nesú mutáciu Her2/neu (Allred a spol., 1992; Peopoles a spol., 1994; Yoshino a spol., 1994a; Stein a spol., 1994; Yoshino a spol., 1994b; Fisk a spol., 1995; Han a spol., 1995), nasadia sa jej ako vakcína alogénne nádorové bunky s HLA haplotypom identickým s jej vlastným haplotypom, ktoré tak isto exprimujú mutovaný Her2/neu ako nádorový antigén. V nedávnej dobe boli izolované početné nádorové antigény a bola stanovená ich súvislosť s jedným alebo viacerými nádorovými ochoreniami. Ďalšími príkladmi takých nádorových antigénov sú ras (Fenton a spol., 1993; Gedde Dahl a spol., 1992; Jung a spol., 1991; Morishita a spol., 1993; Peace s spol., 1991; Skip
-9per a spol., 1993) nádorové antigény MAGE (Boon a spol., 1994; Slingluff a spol., 1994; van der Bruggen a spol., 1994; WO 92/20356); okrem toho prehľad rôznych nádorových antigénov publikovali aj Carrel a spol., 1993.
V tabuľke uvádzame prehľad známych a v rámci vynálezu použiteľných nádorových antigénov a od nich odvodených peptidov.
Nádorové antigény pacienta sa vo všeobecnosti určujú v priebehu stanovovania diagnózy a terapeutického plánu pomocou štandardných metód, napríklad pomocou testov na základe CTL so špecificitou pre nádorový antigén, ktorý sa má stanoviť. Také testy opísali okrem iných Hérin a spol., 1987; Coulie a spol., 1993; Cox a spol., 1994; Rivoltini a spol., 1995; Kawakami a spol., 1995; Kawakami a spol., 1995; ako aj WO 94/14459; z týchto literárnych prameňov sa dajú získať aj rôzne nádorové antigény, prípadne od nich odvodené peptidové epitopy. Nádorové antigény vyskytujúce sa na bunkovom povrchu možno dokázať aj pomocou imunoanalýz na základe protilátok. Ak sú nádorovými antigénmi enzýmy, napríklad tyrozinázy, možno ich dokázať pomocou enzýmových analýz.
V ďalšej forme realizácie vynálezu možno pre vakcínu použiť zmes autológnych a alogénnych nádorových buniek ako východzí materiál. Táto forma realizácie vynálezu sa používa zvlášť vtedy, ak sú pacientom exprimované nádorové antigény neznáme alebo len nedostatočne charakterizované a/alebo keď alogénne nádorové bunky exprimujú iba časť nádorových antigénov pacienta. Primiešaním autológnych, cudzím peptidom ošetrených nádorových buniek sa dosiahne, že aspoň časť nádorových buniek vakcíny bude obsahovať podľa možnosti čo najviac nádorových antigénov vlastných pacientovi. Pri alogénnych nádorových bunkách ide o také bunky, ktoré v jednom alebo viacerých MHC-I haplotypoch súhlasia s pacientom.
Peptidy typu a) a b) sa definujú podľa požiadavky byť naviazané na molekulu MHC-I vzhľadom na ich sekvenciu prostredníctvom HLA podtypu pacienta, ktorému má byť vakcína podaná. Určenie HLA podtypu pacienta predstavuje tak jeden z podstatných predpokladov pre výber prípadne zostrojenie vhodného peptidu.
- 10Pri použití protinádorovej vakcíny podľa tohto vynálezu vo forme autológnych nádorových buniek HLA podtyp vyplýva automaticky cez geneticky determinovanú špecificitu HLA molekuly pacienta. HLA podtyp pacienta možno určiť štandardnými spôsobmi, ako je napríklad mikrotest na lymfotoxicitu (MLC test, mixed
I lymphocyte culture) (Practical Immúnol., 1989). MLC test spočíva na princípe zmiešania lymfocytov izolovaných z krvi pacienta najprv antisérom alebo monoklonálnou protilátkou proti určitej HLA molekule v prítomnosti králičieho komplementu (C). Pozitívne bunky sa lyžujú a prijímajú indikátorové farbivo, kým nepoškodené bunky ostanú nezafarbené.
Na určenie HLA haplotypu pacienta možno použiť aj RT-PCR (Curr. Prot. Mol. Biol., kapitoly 2 a 15). Okrem toho sa pacientovi zoberie krv a vyizoluje sa z nej RNA. Táto RNA sa najprv podrobí reverznej transkripcii, čím sa získa cDNA pacienta. Táto cDNA slúži ako matrica pre polymerázovú reťazovú reakciu s pármi prób, ktoré špecifickým spôsobom amplifikujú DNA fragment predstavujúci určitý HLA haplotyp. Ak sa po agarózovej elektroforéze objaví DNA prúžok, potom pacient exprimuje príslušnú molekulu HLA. Ak sa tento prúžok neobjaví, potom je pacient pre takúto molekulu negatívny. Pre každého pacienta sa očakávajú aspoň dva prúžky.
Pri použití vynálezu vo forme alogénnej vakcíny sa použijú bunky, z ktorých aspoň časť má identický HLA podtyp s pacientom. Vzhľadom na možnú širokú použiteľnosť vakcíny pripravenej podľa tohto vynálezu bude účelné vyjsť zo zmesi rôznych bunkových línií, ktoré exprimujú dva alebo tri najčastejšie sa vyskytujúce rôzne HLA podtypy, pričom sa zohľadňujú zvlášť haplotypy HLA-A1 a HLA-A2. S vakcínou na báze zmesi alogénnych nádorových buniek, ktoré tieto haplotypy exprimujú, sa môže zachytiť široká populácia pacientov; tým možno pokryť približne 70% európskeho obyvateľstva (Mackiewicz a spol., 1995).
Definovanie peptidov použitých podľa tohto vynálezu prostredníctvom HLA podtypu určuje tieto peptidy ohľadne ich „kotvových“ aminokyselín a ich dĺžky; definované pozície „kotvy“ a dĺžka zabezpečujú, aby peptidy zapadli do peptidového väzbového miesta príslušnej HLA molekuly, aby sa na bunkovom povrchu nádorových buniek tvoriacich vakcínu prezentovali tým spôsobom, aby bunky boli roz
- 11 poznané ako cudzie. Dôsledkom toho je to, že imunitný systém sa tým stimuluje a bunková imunitná reakcia sa zameria aj proti nádorovým bunkám pacienta.
Peptidy, ktoré v rámci tohto vynálezu sú podľa kategórie a) vhodnými cudzími peptidmi, sú prítomné vo veľkom rozpätí prúžkov. Ich sekvenciu možno odvodiť od prirodzene sa vyskytujúcich imunogénnych proteínov, prípadne ich bunkových metabolitov, napríklad od vírusových alebo bakteriálnych peptidov, alebo od nádorových antigénov, ktoré sú pre pacienta cudzie.
Vhodné cudzie peptidy si možno vybrať napríklad na základe sekvencií peptidov známych z literatúry; napríklad na základe sekvencií opísaných autormi Rammensee a spol., 1993, Falk a spol., 1991, pre rôzne HLA motívy, na základe peptidov odvodených od imunogénnych proteínov rôzneho pôvodu, ktoré zapadnú do väzbového miesta molekúl príslušného HLA podtypu. Pre peptidy ktoré majú čiastočne sekvenciu proteínu s imunogénnym účinkom, možno na základe už známych alebo prípadne ešte len v budúcnosti stanovených sekvencií polypeptidov určiť prostredníctvom odlišností v sekvenciách, pri zohľadnení HLA špecifických požiadaviek, ktoré peptidy sú vhodnými kandidátmi.. Príklady vhodných peptidov možno nájsť napríklad v prácach autorov Rammensee a spol., 1993, Falk a spol., 1991, a Rammensee, 1995, ako aj v patentovej prihláške WO 91/09869 (peptidy HIV); peptidy odvodené od nádorových antigénov boli okrem iných opísané aj vo zverejnených medzinárodných patentových prihláškach WO 95/00159, WO 94/05304. Závery týchto literárnych údajov a v nich citovaných článkov v súvislosti s peptidmi sú tu zohľadnené.
Výhodnými kandidátmi xenopeptidov sú peptidy, ktorých imunogenicita už bola dokázaná, teda peptidy, ktoré boli odvodené od známych imunogénov, napríklad od vírusových alebo bakteriálnych proteínov. V MLC teste také peptidy vykazujú na základe svojej imunogenicity prudkú reakciu.
Namiesto použitia pôvodných peptidov, teda peptidov, ktoré sú odvodené od prirodzených proteínov bezo zmeny, možno - vychádzajúc z minimálnych požiadaviek daných pôvodnými sekvenciami peptidov ohľadne pozícií „kotvy“ a dĺžky - použiť ľubovoľné variácie, v tomto prípade sa použijú podľa vynálezu aj umelé peptidy, ktoré boli navrhnuté v súlade s požiadavkami na MHC-I ligand. Tak na
- 12 príklad, vychádzajúc z ligandu H2-Kd Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle (LFEAIEGFI), možno zmeniť tie aminokyseliny, ktoré nie sú „kotvovými“ aminokyselinami, aby sa získal peptid so sekvenciou Phe Phe lle Gly Ala Leu Glu Glu lle (FFIGALEEI); okrem toho možno „kotvovú“ aminokyselinu lle v polohe 9 nahradiť aminokyselinou Leu.
Peptidy, ktoré sú odvodené od nádorových antigénov, teda od proteínov, ktoré sú exprimované v nádorovej bunke a ktoré v zodpovedajúcej netransformovanej bunke sa nevyskytujú alebo sú prítomné v oveľa nižšej koncentrácii, možno použiť v rámci tohto vynálezu ako peptidy typu a) a/alebo typu b).
Dĺžka peptidu zodpovedá výhodne prípadnej minimálnej sekvencii 8 až 10 aminokyselín s požadovanými „kotvovými“ aminokyselinami, ktorá je potrebná pre väzbu na MHC-I molekulu. V danom prípade možno peptid na C- a/alebo Nterminálovom konci predĺžiť, pokiaľ toto predĺženie neovplyvní väzbovú schopnosť, prípadne pokiaľ predĺžený peptid možno celulárne spracovať na minimálnu sekvenciu.
V ďalšej forme realizácie vynálezu možno peptid s negatívne nabitými aminokyselinami predĺžiť, alebo možno negatívne nabité aminokyseliny zabudovať do peptidu, a síce v iných pozíciách než sú pozície „kotvových“ aminokyselín, aby sa tým získala elektrostatická väzba peptidu na polykatión ako je napríklad polylyzín.
Pod pojem „peptidy“ spadajú v rámci tohto vynálezu podľa definície aj väčšie proteínové fragmenty, pripadne celé proteíny, o ktorých je zaručené, že po aplikácii APC budú spracované na peptidy, ktoré budú pre MHC molekulu vhodné.
V tejto forme realizácie sa tak antigén neaplikuje vo forme peptidu, ale ako proteín alebo proteínový fragment, prípadne ako zmes proteínov alebo proteínových fragmentov. Proteín predstavuje antigén, prípadne nádorový antigén, od ktorých sú odvodené zlomky získané po spracovaní. Proteíny prípadne proteínové fragmenty prijaté bunkami sa spracujú a v MHC kontexte môžu byť potom prezentované imunitným efektorovým bunkám. Tým možno vyvolať prípadne zosilniť imunitnú reakciu (Braciale a Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski a Rock, 1995; York a Rock, 1996).
V prípade použitia proteínov alebo proteínových fragmentov možno identitu spracovaných finálnych produktov dokázať prostredníctvom chemickej analýzy (rozklad podľa Edmana alebo hmotnostná spektrometria spracovaných fragmentov; porovnaj s prehľadným článkom autorov Rammensee a spol., 1995, ako aj s tam citovanou pôvodnou literatúrou) alebo biologických analýz (schopnosť APC stimulovať T-bunky špecifické pre spracované fragmenty).
Výber peptidových kandidátov ohľadne ich vhodnosti ako cudzích peptidov sa uskutočňuje v podstate vo viacerých krokoch: vo všeobecnosti sú kandidáti, výhodne v sériových pokusoch, najprv otestovaní vo väzbovom teste na ich schopnosť viazať sa na MHC-I molekulu.
Vhodnou vyšetrovacou metódou je napríklad FACS analýza spočívajúca na princípe prietokovej cytometrie (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage™ User’s Guide, 1994; CELL Quest™ User’s Guide, 1994). Pri tejto metóde sa peptid označí fluorescenčným farbivom napríklad FITC (fluoresceín izotiokyanát) a nanesie sa na povrch nádorových buniek, ktoré exprimujú príslušnú MHC-I molekulu. V prietoku sa jednotlivé bunky excitujú laserom určitej vlnovej dĺžky; emitovaná fluorescencia sa odmeria, a tá je priamo úmerná množstvu peptidov naviazaných na bunkách.
Ďalším spôsobom na stanovenie naviazaného množstva peptidov je Scatchardova analýza. Používa sa k tomu peptid značený jódom 125l alebo iónmi vzácnych kovov (napríklad európia). Bunky sa značia pri 4°C rôznymi, definovanými koncentráciami peptidu po dobu 30 až 240 minút. Na stanovenie nešpecifickej vzájomnej interakcie medzi peptidom a bunkami sa k niekoľkým vzorkám v nadbytku pridá neznačený peptid, ktorý znemožní špecifickú interakciu značeného peptidu. Napokon sa bunky premyjú, aby sa odstránil nešpecifický, s bunkami asociovaný materiál. Množstvo peptidov naviazaných na bunky sa potom vyjadrí buď v scintilačnom počítači na základe emitovanej rádioaktivity, alebo pomocou fotometra vhodného na meranie dlhodobej fluorescencie. Vyhodnotenie takto získaných údajov sa uskutoční podľa štandardných spôsobov.
V druhom kroku sa kandidáti s dobrými väzbovými vlastnosťami otestujú na imunogenicitu.
- 14Imunogenicita xenopeptidov odvodených od proteínov, ktorých imunogénne účinky nie sú známe, sa môže otestovať napríklad v MLC teste. Pre tento vynález sú vhodné peptidy, ktoré v tomto teste, ktorý sa výhodne uskutoční v sérii s rôznymi peptidmi, pričom ako štandard sa výhodne použije peptid so známym imunogénnym účinkom, vyvolávajú zvlášť prudkú reakciu.
Ďalšou možnosťou pre testovanie imunogenicity peptidových kandidátov viažucich MHC-I spočíva vo vyšetrení väzby peptidov na T2 bunky. Taký test spočíva vo zvláštnosti T2 buniek (Alexander a spol., 1989) alebo RMA-S buniek (Kärre a spol., 1986), a síce že sú defektné v transportnom mechanizme TAP peptidu a že prezentujú stabilné MHC-I molekuly až vtedy, keď sa na ne nanesú peptidy, ktoré sa prezentujú v MHC-I kontexte. Pre test sa použijú napríklad T2 bunky alebo RMA-S bunky, ktoré sú stabilne transfekované nejakým HLA génom, napríklad génom HLA-A1 a/alebo HLA-A2. Ak sa bunky obohatia o peptidy, ktoré sú dobrými MHC-I ligandmi, pokiaľ sú v MHC-I kontexte prezentované tak, že ich imunitný systém môže rozpoznať ako cudzie, také peptidy spôsobujú, že HLA molekuly sa na bunkovom povrchu objavujú vo väčšom množstve. .Dôkaz HLA na bunkovom povrchu, napríklad prostredníctvom monoklonálnych protilátok, dovoľuje identifikáciu vhodných peptidov (Malnati a spol., 1995; Sykulev a spol., 1994). Aj tu je výhodné použiť štandardný peptid so známou dobrou väzbovou schopnosťou na HLA prípadne MHC.
V ďalšej forme realizácie vynálezu môže autológna alebo alogénna nádorová bunka vakcíny niesť viaceré xenopeptidy s rôznymi sekvenciami. Použité peptidy sa môžu v tomto prípade do tej miery vzájomne líšiť, že sa budú viazať na rozličné HLA podtypy. Týmto sa dá dosiahnuť, že sa obsiahnú viaceré, prípadne všetky HLA podtypy pacienta alebo väčšej skupiny pacientov. Vakcína sa podáva v ožiarenej podobe.
Ďalšia, pripadne doplnková variabilita ohľadne xenopeptidov prezentovaných na nádorovej bunke môže spočívať v tom, že peptidy, ktoré sa viažu na konkrétny HLA podtyp, sa odlišujú v sekvencii, ktorá pre viazanie sa na HLA nie je dôležitá, nakoľko sú odvodené napríklad od proteínov rôzneho pôvodu, napríklad od vírusových a/alebo bakteriálnych proteínov. Od takej variability, ktorá vakcino-15 vanému organizmu poskytuje väčší rozsah xenogenizácie, možno očakávať zosilnenie stimulácie imunitnej odpovede.
V ďalšej forme realizácie vynálezu, pri ktorej protinádorová vakcína pozostáva zo zmesi alogénnych nádorových buniek pochádzajúcich z rôznych bunkových línií, ako aj prípadne ešte aj z autológnych nádorových buniek, môžu byť všetky nádorové bunky ošetrené s tým istým peptidom/peptidmi, pripadne nádorové bunky rôzneho pôvodu môžu aj vykazovať rozličné xenopeptidy.
V pokusoch uskutočnených v rámci tohto vynálezu sa použil ako cudzí peptid typu a) vírusový peptid so sekvenciou Leu Phe Glu Ala lle Glu Gly Phe lle. ktorý sa odvádza od hemaglutininu vírusu chrípky a je ligandom H2-Kd; „kotvové“ aminokyseliny sú podtrhnuté.
Pomocou tohto prirodzene sa vyskytujúceho vírusového peptidu ako cudzieho peptidu sa pripravila protinádorová vakcína, ktorá bola otestovaná vo zvieracom modeli (melanóm a karcinóm hrubého čreva).
Na prípravu protinádorovej vakcíny sa použil ďalší vírusový peptid so sekvenciou Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met, ktorý je odvodený od nukleoproteínua je ligandom HLA-1 haplotypu H2-Kb (Rammensee a spol., 1993; „kotvové aminokyseliny sú podčiarknuté); ochranný účinok vakcíny bol potvrdený v ďalšom melanómovom modeli.
Pripravila sa ďalšia vakcína tak, že nádorové bunky boli xenogenizované cudzím peptidom, ktorého sekvencia bola Phe Phe lle Gly Ala Leu Glu Glu lle (FFIGALEEI). V tomto prípade ide o syntetický, v prírode doteraz neznámy peptid. Pri výbere sekvencie sa dávalo pozor na to, aby sa splnili podmienky ohľadne vhodnosti ako ligandu pre MHC-I molekulu typu H2-Kd. Schopnosť peptidu vyvolať protinádorovú imunitu podľa plánu aktívnej imunoterapie sa potvrdila na myšom karcinóme hrubého čreva CT-26 (ktorý je syngénny s myším kmeňom Balb/c).
V ďalšej forme realizácie vynálezu môže protinádorová vakcína okrem toho obsahovať autológne a/alebo alogénne nádorové bunky a/alebo fibroblasty, ktoré sú transfekované génmi pre cytokíny. V patentovej prihláške WO 94/21808, ako aj Schmidt a spol. (1995) (odkazuje sa tu na toto zverejnenie) opísali účinné nádorové vakcíny, ktoré boli pomocou spôsobu na transport DNA označovaného ako „transferová infekcia“ vyrobené s exprimačným vektorom IL-2 (tento spôsob spočíva na endocytóze sprostredkovanej receptormi, a využíva bunkový ligand konjugovaný s polykatiónom, ako je polylyzín , obzvlášť transferín, na kompletovanie DNA, ako aj endosomolyticky účinné činidlo ako je adenovírus).
Výhodne sa peptidom ošetrené nádorové bunky a cytokín exprimujúce bunky zmiešajú v pomere 1:1. Ak sa napríklad vakcína IL-2, ktorá produkuje 4000 jednotiek IL-2 na 1X106 buniek, zmieša s 1X106 nádorovými bunkami ošetrenými peptidom, možno takto získanú vakcínu použiť na dve ošetrenia, pričom za optimálnu dávku sa považuje 1000 až 2000 jednotiek IL-2 (Schmidt a spol., 1995).
Kombináciou cytokínovej vakcíny s nádorovými bunkami ošetrenými peptidom možno výhodne zjednotiť účinky oboch týchto vakcín.
Úprava buniek ako aj formulovanie vakcíny podľa vynálezu sa uskutočňuje bežným spôsobom, ako to bolo opísané napríklad v Biológie Therapy of Cancer, 1991, alebo v WO 94/21808.
Vynález sa v ďalšom aspekte týka spôsobu prípravy protinádorovej vakcíny pozostávajúcej z nádorových buniek na podávanie pacientovi.
Spôsob sa podľa vynálezu vyznačuje tým, že nádorové bunky, ktoré zo seba prezentujú v HLA kontexte peptidy odvodené od nádorových antigénov, a aspoň časť ktorých exprimuje aspoň jeden MHC-I haplotyp pacienta, sa ošetria jedným alebo viacerými peptidmi, ktoré
a) fungujú ako ligandy pre MHC-l haplotyp, ktorý je pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny spoločný, a odlišujú sa v peptidoch, ktoré boli odvodené od proteínov exprimovaných bunkami pacienta, alebo ktoré • b) fungujú ako ligandy pre MHC-l haplotyp, ktorý je pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny spoločný, a sú odvodené od nádorových antigénov exprimovaných bunkami pacienta, pričom sa nádorové bunky inkubujú s jedným alebo viacerými peptidmi a) a/alebo b) tak dlho a v takom množstve v prítomnosti organického polykatiónu, až kým sa peptidy na nádorové bunky nenaviažu tak, aby v kontexte s nádorovými bunkami boli imunitným systémom pacienta rozpoznávané ako cudzie a aby vyvolali bunkovú imunitnú odpoveď.
-17Množstvo peptidu je výhodne približne 50 pg až 160 pg na 1X105 až 2X107 buniek. V prípade použitia peptidu kategórie b) môže byť koncentrácia aj vyššia. Pre tieto peptidy je dôležité, aby ich koncentrácia na nádorových bunkách vakcíny, v porovnaní s koncentráciou peptidu na nádorových bunkách pacienta, odvodeného od toho istého nádorového antigénu, bola zvýšená tak, aby nádorové bunky vakcíny boli rozpoznané ako cudzie a aby vyvolali bunkovú imunitnú odpoveď.
Medzi vhodné polykatióny patria homologické organické polykatióny ako je napríklad polylyzín, polyarginín, polyornitín, alebo heterológne polykatióny s dvomi alebo viacerými odlišnými, kladne nabitými aminokyselinami, pričom tieto polykatióny môžu mať rôzny dĺžku reťazcov, ďalej to môžu byť nepeptidické syntetické polykatióny, ako sú napríklad polyetylénimíny, prirodzené DNA viažuce proteíny polykatiónového charakteru, ako sú históny alebo protamíny, prípadne ich analógy alebo fragmenty, ako aj spermin alebo spermidín. V rámci predkladaného vynálezu medzi vhodné organické polykatióny patria aj polykatiónové lipidy (Felgner a spol., 1994; Loeffler a spol., 1993; Remy a spol., 1994; Behr, 1994), ktoré sú, okrem iných, dostupne aj komerčne, ako napríklad Transfectam, Lipofectamin alebo Lipofectin.
Ako polykatión sa dá výhodne použiť polylyzín (pL) s dĺžkou reťazca asi 30 až 300 lyži nových zvyškov.
Potrebné množstvo polykatiónu v pomere k peptidu možno v jednotlivých prípadoch určiť empiricky. V prípade použitia polylyzínu a xenopeptidov kategórie a) je pomer hmotnosti pL : polypeptid výhodne asi 1:4 až asi 1:12.
Trvanie inkubácie je obvykle 30 minút až 4 hodiny. Závisí to od toho, v ktorom časovom bode sa dosiahne maximálne naviazanie peptidu; stupeň naviazanosti možno sledovať pomocou FACS analýzou a týmto spôsobom sa dá zistiť potrebný inkubačný čas.
V ďalšej forme realizácie vynálezu sa polylyzín použije aspoň čiastočne v konjugovanej forme. Výhodne je časť polylyzínu v konjugovanej forme s transferínom (Tf) (konjugát transferín-polylyzín, TfpL; ohľadne tohto sa berú do úvahy aj závery patentu WO 94/21808), pričom hmotnostný pomer pL : TfpL je výhodne približne 1:1.
- 18Namiesto transferínu možno polylyzín konjugovať aj s inými proteínmi, napríklad s bunkovými ligandmi opísanými v WO 94/21808 ako internalizačné faktory:
V danom prípade sa ošetrenie nádorových buniek odohráva okrem toho v prítomnosti DNA. DNA je vhodne plazmid, výhodne ako plazmid, ktorý neobsahuje sekvencie kódujúce funkčné eukaryotické proteíny, teda ako prázdny vektor. Ako DNA možno použiť v podstate akýkoľvek bežný, funkčne dostupný plazmid.
Množstvo DNA v pomere k polykatiónu, ktorý je v danom prípade čiastočne konjugovaný s proteínom, napríklad k pL, TfpL, alebo ku zmesi pL s TfpL, je výhodne asi 1:2 až asi 1:5.
Trvanie inkubácie, množstvo a druh polykatiónu v pomere k počtu nádorových buniek a/alebo k množstvu peptidu, či, a prípadne s akým podielom, prípadne s ktorým proteínom je polykatión výhodne konjugovaný, podiel prítomnosti DNA, prípadne jej množstvo, možno empiricky stanoviť. Pre tento účel sa jednotlivé parametre obmieňajú a peptidy sa naviažu na nádorové bunky za inak identických podmienok a otestuje sa, s akou účinnosťou sa peptidy na nádorové bunky naviazali. Vhodnou metódou pre tento účel je FACS analýza.
Spôsob podľa tohto vynálezu je vhodný popri ošetrení nádorových buniek aj na ošetrenie iných buniek.
Namiesto na nádorové bunky možno aj na autológne, teda pacientovi vlastné fibroblasty, alebo na bunky z bunkových línií fibroblastov, ktoré súhlasia buď s HLA podtypom pacienta, alebo ktoré boli transfekované so zodpovedajúcim MHC-I génom, podľa spôsobu tohto vynálezu naviazať jeden alebo viaceré peptidy, ktoré sú odvodené od nádorových antigénov exprimovaných nádorovými bunkami pacienta. Takto ošetrené a ožiarené fibroblasty buď ako také alebo v zmesi s nádorovými bunkami ošetrenými peptidom možno použiť ako protinádorovú vakcínu.
V ďalšej forme realizácie možno namiesto fibroblastov ošetriť podľa tohto vynálezu dendritické bunky. Dendritické bunky sú APCs kože; môžu byť podľa voľby naviazané in vitro, t. j. bunky izolované z pacienta sa in vitro zmiešajú jedným alebo viacerými peptidmi, pričom tieto peptidy sú odvodené od nádorových
- 19antigénov pacienta a naviažu sa na molekulu MHC-I alebo MHC-II pacienta. V ďalšej forme realizácie možno na tieto bunky naviazať peptid aj in vivo. Pre tento účel sa injikujú komplexy z peptidu, polykatiónu a v danom prípade z DNA, výhodne vnútrokožne, pretože v koži sa dendritické bunky vyskytujú obzvlášť hojne.
V rámci tohto vynálezu sa peptid s TfpL alebo pL komplexuje pre prenos v CT-26 bunkách, a s TfpL a s jedným nefunkčným plazmidom (prázdnym vektorom) pre prenos v bunkách M-3. V systéme CT-26 sa zistilo, že peptidom xenogenizovaná, ožiarená protinádorová vakcína vyvolala účinnú protinádorovú imunitu: 75% naočkovaných myší eliminovalo dávku nádorových buniek, ktorá u všetkých kontrolných zvierat, ktoré buď nedostali žiadnu vakcínu, alebo dostali vakcínu bez xenopeptidu, viedla ku vzniku nádoru. V systéme M-3 bol v experimentálnej zostave testovaný ten istý xenopeptid za podmienok, ktoré boli pre organizmus ohľadne vzniku nádorov ešte prísnejšie. Táto zostava napodobovala situáciu u človeka. Myši v metastatickom štádiu boli naočkované xenopeptidizovanými, ožiarenými bunkami M-3. 87,5% takto naočkovaných myší metastázy eliminovalo, kým všetky neošetrené myši a 7 z 8 zvierat spomedzi tých myši dostali nádor, ktorým bola podaná vakcína bez xenopeptidu.
Okrem toho sa zistilo, že rozsah systémovej imunitnej odpovede protinádorovej vakcíny závisí od spôsobu, ktorým sa peptid naväzuje na nádorové bunky. Ak sa peptid podáva bunkám prostredníctvom polylyzínu/transferínu, účinok bol jasne výraznejší ako keď sa bunky inkubovali 24 hodín s peptidom („pulzy“). Aj adjuvantné primiešanie peptidu k ožiarenej vakcíne bolo málo účinné. Prostredníctvom transferovej infekcie by sa mohol dosiahnuť buď účinnejší vstup peptidu do buniek, alebo naviazanie polylyzínu/transferínu spôsobuje, že peptid ostane na bunkovej membráne zachytený, tým sa privedie do blízkosti MHC-I molekúl, a môže sa potom na ne naviazať, pričom na základe svojej silnej afinity môže bunkové peptidy, ktoré sú slabšie viazané, vytlačiť.
-20Prehľad obrázkov na výkresoch
Na Obr. 1a až 1 c je znázornená FACS analýza buniek M-3 ošetrených cudzím peptidom.
Na Obr. 1d je uvedená mikrofotografia buniek M-3 ošetrených FITC-peptidom.
Na Obr. 2a, b je znázornená závislosť vyliečenia myší kmeňa DBA/2 z metastáz melanómu M-3 pomocou vakcíny z buniek M-3 s naviazaným cudzím peptidom.
Na Obr. 3a je znázornená titrácia cudzieho peptidu na prípravu protinádorovej vakcíny.
Na Obr. 3b je porovnanie protinádorovej vakcíny z nádorových buniek, na ktoré je naviazaný cudzí peptid, s protinádorovou vakcínou sekretujúcou IL-2.
Na Obr. 4a je znázornená ochrana myší kmeňa Balb/c predchádzajúcou imunizáciou vakcínou z buniek karcinómu hrubého čreva, na ktoré bol naviazaný cudzí peptid
Na Obr. 4b je znázornené vyšetrenie účasti T-buniek na systémovej imunite.
Na Obr. 5 je znázornená ochrana myší kmeňa C57BL/6 predchádzajúcou imunizáciou vakcínou z buniek melanómu, na ktoré bol naviazaný cudzí peptid.
Príklady uskutočnenia vynálezu
V ďalších príkladoch, pokiaľ to nie je uvedené inak, boli použité nasledovné materiály a postupy:
Myšia melanómová bunková línia Cloudman S91 (klón M-3; ATCC č. CCL 53.1) bola získaná z ATCC.
Melanómová bunková línia B16-F10 (Fidler a spol., 1975) bola získaná z NIH DCT Tumor Depository.
Príprava konjugátov transferín-polylyzín, transfekčných komplexov obsahujúcich DNA sa uskutočnila ako to bolo opísané v WO 94/21808.
-21 Peptidy LFEAIEGFI, FFIGALEEI, LPEAIEGFG a ASNENMETM boli syntetizované na syntetizátore peptidov (model 433 A s feedback-monitorom, Applied Biosystems, Foster City, Kanada) s použitím TentaGel S PHB (Rapp, Tubingen) ako tuhej fázy podľa spôsobu Fmoc (HBTU aktivácia, Fastmoc™, mierka 0:25 mmol). Peptidy boli rozpustené v 1 M TEAA, pH 7,3, a purifikované pomocou reverznej chromatografie na kolóne Vydac C 18. Sekvencie boli potvrdené pomocou hmotnostnej spektrometrie na prístroji MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Kanada).
Testovanie účinnosti protinádorovej vakcíny na ich ochranné pôsobenie proti tvorbe metastáz („terapeutický myší model“), ako aj testovanie v profylaktickom myšom modeli sa uskutočnilo podľa protokolu opísaného v WO 94/21808, pričom ako myší model bol použitý model DBA/2 a Balb/c.
Príklad 1
Porovnávacia FACS analýza buniek M-3, ktoré boli ošetrené cudzími peptidmi pomocou rôznych postupov
Pre toto vyšetrenie, ktoré je znázornené na obr. 1, sa xenopeptid LFEAIEGFI naviazal na M-3 bunky raz pomocou komplexu TfpL/DNA („transloading“; obr. 1a), raz sa bunky s peptidom inkubovali („pulzy“; obr. 1b), a raz sa peptid adjuvantne primiešal k bunkám (obr. 1c).
Pre transloading sa zmiešalo 160 pg xenopeptidu LFEAIEGFI značeného FITC, prípadne neznačeného kontrolného peptidu, s 3 pg transferín-polylyzínu (TfpL), 10 pg pL a 6 pg psp65 (Boehringer Mannheim, bez LPS) v 500 pl HBS pufru. Po 30 minútach pri izbovej teplote sa horeuvedený roztok umiestnil do kultivačnej nádoby T 75 s 1,5X 106 buniek M-3 v 20 ml média DMEM (10% fetálneho hovädzieho séra [FCS], 20 mM glukózy) a inkuboval sa pri 37°C. Po 3 hodinách sa bunky dvakrát premyli s PBS, uvoľnili sa pomocou PBS/2 mM EDTA, a pre FACS analýzu sa resuspendovali v 1 ml PBS/5 % FCS.
-22Pulzovanie buniek s peptidom sa uskutočnilo sa uskutočnilo pomocou 1 až 2X106 buniek v 20 ml DMEM so 450 pg peptidu (značeného FITC, prípadne neznačeného) po dobu 3 hodín pri 37°C.
Pre adjuvantné primiešanie sa pred FACS analýzou inkubovalo 106 buniek uvoľnených z kultivačnej fľaše so 100 pg peptidu značeného FITC v 1 ml PBS/5% FCS po dobu 30 minút pri izbovej teplote. Bunky sa po výmene PBS/5% FCS premyli a ešte raz boli analyzované. FACS analýza sa uskutočnila pomocou prístroja FACS Vantage (Becton Dickinson) vybaveného jedným 5 W argónovým laserom nastaveným na 100 mW pri 488 nm, podľa inštrukcií výrobcu. Výsledok FACS analýzy je uvedený na obr. 1a až 1c. Na obr. 1d sú mikrofotografie cytocentrifugovaných buniek M-3: horný obrázok ukazuje bunky, ktoré dostali peptid prostredníctvom komplexu („transloading“), dolný obrázok ukazuje bunky, ktoré boli s peptidom inkubované („pulzy). Na kontrastné farbenie jadra sa použilo DAPI.
Bunky M-3, na ktoré sa naviazal komplex obsahujúci peptid, ukázali posun vo fluorescencii o takmer 2 rády v porovnaní s neošetrenými bunkami alebo s bunkami ošetrenými iba polylyzinom, čo poukazuje na účinný prenos peptidu na bunky prostredníctvom komplexu TfpL/DNA (obr. 1a). Inkubácia s peptidom (pulzy) bola menej účinná, čo sa vyjadrilo v posune fluorescencie iba o jeden rád, čo sa vo fluorescenčnom mikroskope prakticky nedalo dokázať (obr. 1d). V prípade adjuvantného primiešania sa peptid po premývacom kroku stratil (obr. 1c), čo poukazuje na to, že väzba peptidu bola veľmi slabá.
Príklad 2
Vyliečenie myší DBA/2 s metastázami melanómu vakcínou z melanómových buniek s naviazanými cudzími peptidmi („terapeutický myši model“)
a) Príprava protinádorovej vakcíny z buniek M-3
-23160 pg xenopeptidu LFEAIEGFI sa zmiešalo s 3 pg transferín-polylyzínu (TfpL), 10 pg pL a 6 pg psp65 (bez LPS) v 500 pl HBS pufru. Po 30 minútach pri izbovej teplote sa horeuvedený roztok umiestnil do kultivačnej fľaše T 75 s 1,5X10® buniek M-3 v 20 ml média DMEM (10% FCS, 20 mM glukózy) a inkuboval sa pri 37°C. Po 3 hodinách sa bunky zmiešali s 15 ml čerstvého média a inkubovali sa cez noc pri 37°C a v 5% CO2. Štyri hodiny pred aplikáciou boli bunky ožiarené s 20 Gy. Príprava vakcíny sa realizovala ako to bolo opísané v WO 94/21808.
b) Účinnosť protinádorovej vakcíny
Myši kmeňa DBA/2 staré 6 až 12 týždňov s päťdňovou metastázou (vyvolanou podkožnou injekciou 104 živých buniek M-3) boli dvakrát s odstupom 1 týždňa ošetrené protinádorovou vakcínou vo forme podkožnej injekcie (dávka: 105 buniek/myš). V experimente bolo 8 myší. Výsledok pokusov je uvedený na obr. 2a; ukázalo sa, že po podaní vakcíny, ktorá obsahovala na nádorových bunkách peptid naviazaný pomocou komplexu Tfpl/DNA, 7 zvierat z ôsmich sa vyliečilo. V porovnávacích pokusoch sa použila vakcína, v ktorej sa na buky naviazal peptid LFEAIEGFI (400 pg alebo 4 mg) inkubovaním (3 hodiny pri 37°C; „pulzy“). Spomedzi 8 zvierat, ktoré dostali vakcínu so 400 pg peptidu, ostali bez nádoru 3, kým vakcína z buniek ošetrených 4 mg peptidu vyliečila len 1 z 8 zvierat. Kontroly boli len ožiarené bunky M-3, ako aj bunky, na ktoré boli naviazané komplexy bez peptidu (vždy 1/8 zvierat ostalo bez nádoru). V skupine kontrolných zvierat, ktoré nedostali nijaké ošetrenie, všetky myši dostali nádory.
Na zistenie relevantnosti jednak spôsobu prípravy vakcíny a jednak sekvencie peptidu sa vykonala ďalšia séria pokusov; v týchto experimentoch sa použila vysoko tumorigénny variant a buniek M-3. V pokusoch, v ktorých sa testoval význam spôsobu ošetrenia, boli pripravené vakcíny, v ktorých sa peptid nenaviazal na bunky pomocou polylyzín-transferínu, ale bunky boli iba adjuvantne primiešané. Na kontrolu ohľadne sekvencie peptidu boli „kotvové“ aminokyseliny peptidu
-24v polohách 2 a 9, čiže fenylalanín a izoleucín, nahradené prolínom prípadne glycínom, čím vznikol peptid Leu Pro Glu Ala lle Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG); tomuto peptidu chýba schopnosť viazať sa k H2-Kd. Vznik metastáz bol kontrolovaný aspoň raz za týždeň. Výsledok týchto pokusov je uvedený na obr. 2b. Vakcína pripravená naviazaním LFEAIEGFI na bunky pomocou komplexu TfpL/DNA vyliečila 6 z ôsmich zvierat. Naproti tomu nádory sa vyvinuli u 7 z ôsmich zvierat, ktoré dostali takú vakcínu, kde peptid LFEAIEGFI bol iba primiešaný, prípadne pozostávala z buniek, na ktoré pomocou komplexu TfpL/DNA sa naviazal zmenený, nie na HLA motív sa viažuci peptid LPEAIEGFG. V kontrolnej skupine, ktorá bola ošetrená iba ožiarenými bunkami M-3, prípadne nedostala nijaké ošetrenie, u všetkých zvierat sa vyvinuli nádory.
c) Testovanie vplyvu množstva peptidu vo vakcíne
Pripravili sa komplexy obsahujúce peptid, ako to oblo opísané v bode a), ktoré obsahovali buď 50, 5 alebo 0,5 pg účinného peptidu LFEAIEGFI, a tieto sa naviazali na bunky M-3. Ako kontrola slúžila vakcína s IL-2, ktorá sekretovala optimálnu dávku IL-2 (pozri Príklad 3). Touto vakcínou sa naočkovali myši kmeňa DBA/2, ktoré mali päťdňovú metastázu. Vakcína s 50 pg peptidu vyliečila 6 myší z ôsmich, vakcína s 5 pg vyliečila 4 myši z ôsmich, tak ako aj vakcína s IL-2, kým vakcína obsahujúca 0,5 pg vyliečila iba 2 z ôsmich myší. Tento pokus je uvedený na obr. 3a.
Príklad 3
Porovnanie vakcíny obsahujúcej cudzí peptid s protinádorovou vakcínou pozostávajúcou z nádorových buniek sekretujúcich IL-2 v profylaktickom myšom modeli
V kontrolných pokusoch boli dve skupiny pokusných zvierat (po 8 myší) dvakrát predimunizované jednak vakcínou opísanou v príklade 2a), jednak vakcínou z buniek M-3 sekretujúcich IL-2 (pripravenou podľa protokolu opísaného
-25v WO 94/21808, dávka IL-2 bola 2000 jednotiek na myš) s odstupom 1 týždňa. Týždeň po poslednej vakcinácii boli pri stúpajúcom počte nádorových buniek implantované kontralaterálne nádory („challenge“; dávka je uvedená na obr. 3b). Ukázalo sa, že predimunizácia protinádorovou vakcínou podľa tohto vynálezu bola lepšia než ošetrenie vakcínou IL-2: intaktné myši naočkované vakcínou obsahujúcou IL-2 boli chránené len proti dávke 105 živých, vysoko tumorigénnych buniek (M-3-W). Schopnosť tejto vakcíny bola však pri dávke buniek 3X105 buniek vyčerpaná, kým nádorové zaťaženie tohto rozsahu u zvierat, ktoré boli predimunizované nádorovými bunkami, na ktoré boli naviazané cudzie peptidy, bolo úspešne zvládnuté.
Príklad 4
Ochrana myší kmeňa Balb/c predimunizáciou vakcínou z buniek karcinómu hrubého čreva, na ktoré boli naviazané cudzie peptidy („profylaktický myší model“)
a) Príprava vakcíny CT-26
160 pg xenopeptidu LFEAIEGFI, prípadne FFIGALEEI, sa zmiešalo s 12 pg pL, prípadne s 3 pg transferín-polylyzínu plus 10 pg polylyzínu, a komplexovalo sa 30 minút pri izbovej teplote v 500 pl HBS pufru, potom sa zmes preniesla do kultivačnej fľaše T 75 s 1,5X 106 buniek CT-26 v 4 ml média DMEM (10% FCS, 20 mM glukózy), bunky sa potom inkubovali pri 37°C a v 5% CO2. Po 4 hodinách sa bunky premyli s PBS, premiešali sa s 15 ml čerstvého média, a inkubovali sa cez noc pri 37°C a v 5% CO2. Štyri hodiny pred aplikáciou boli bunky ožiarené so 100 Gy. Príprava vakcíny sa uskutočnila ako to bolo uvedené v WO 94/21808.
b) Testovanie účinnosti protinádorovej vakcíny na jej ochranné pôsobenie proti dávke nádorových buniek CT-26
-26 Myši kmeňa Balb/c staré 6 až 12 týždňov boli vakcinované dvakrát s týždňovým odstupom podkožnou injekciou (dávka buniek: 105 buniek/myš).
V experimente bolo 8 myší na skupinu (prípadne 7 myši v pokuse, v ktorom sa použil pL na naviazanie na bunky). Týždeň po poslednej vakcinácii sa implantovali kontralaterálne nádory obsahujúce 5X104 parentálnych buniek CT-26. Porovnávacie pokusy, v ktorých vakcína bola pripravená iným spôsobom ako prostredníctvom komplexov TfpL/DNA, ako aj kontroly boli urobené ako to bolo opísané v Príklade 2. Rast nádorov bol kontrolovaný aspoň raz týždenne. Výsledok pre peptid LFEAIEGFI je uvedený na obr. 4a; z ôsmich zvierat bolo chránených 6.
V prípade peptidu FFIGALEEI (na obr. 4a neuvedené, chránené boli 4 zvieratá z ôsmich).
c) Účasť T-buniek na účinku protinádorovej vakcíny
Na dokázanie účasti T-buniek na systémovej imunite vyvolanej vakcínou obsahujúcou bunky CT-26 sa v ďalšom pokuse 24 hodín pred vakcináciou odstránili CD4+ bunky vnútrožilovou injekciou obsahujúcou 500 pg monoklonálnych protilátok GK1.5 (ATCC TIB 207), a CD8+ bunky vnútrožilovou injekciou obsahujúcou 500 pg monoklonálnych protilátok 2.43 (ATCC TIB 210). Pozitívna kontrolná skupina dostala vakcínu bez odstránenia CD4+ a CD8+ buniek. Výsledok pokusov je uvedený na obr. 4b: účasť T-buniek sa ukazuje v tom, že u všetkých zvierat, ktorým sa T-bunky odstránili, sa vytvorili nádory.
Príklad 5
Ochrana myší kmeňa C57BL/6J predchádzajúcou imunizáciou pomocou vakcíny z melanómových buniek s naviazaným cudzím peptidom („profylaktický myší model)
V tomto príklade sa ako pokusné zvieratá použili myši kmeňa C57BL/6J (po 8 zvierat v skupine). Ako melanómové bunky sa použili bunky B16-F10 (NIH DCT Tumor Depository; Fidler a spol., 1975) syngénne s použitým kmeňom myší.
Zvieratá vo všetkých pokusných skupinách boli dvakrát, s týždňovým odstupom, vakcinované podkožnou injekciou obsahujúcou 105 buniek B16-F10 na myš:
V jednej sérii pokusov bola pripravená vakcína, v ktorej na ožiarené bunky B16-F10 bol naviazaný peptid so sekvenciou ASNENMETM, ako to bolo opísané v Príklade 2 pre vakcínu z buniek M-3.
V paralelných pokusoch sa bunky B16-F10 sekretujúce IL—2 prípadne GMCSF (pripravené podľa protokolu opísaného vWO 94/21808) použili ako vakcína na predimunizáciu; vakcína produkovala 1000 jednotiek IL—2 prípadne 200 ng GM-CSF na zviera.
Kontrolná skupina dostala na predimunizáciu ožiarené a inak neošetrené bunky B16-F10.
Týždeň po poslednej vakcinácii sa pokusným zvieratám implantovalo 1X104 živých, ožiarených nádorových buniek B16-F10 a sledoval sa potom rast nádoru.
Výsledok pokusov je uvedený na obr. 5; nádorové bunky s naviazaným cudzím peptidom poskytovali proti nádorovému rastu najlepšiu ochranu.
Tabuľka
| Sekvencia peptidu | MHC haplotvp | Antisén | Citácia |
| SPSYVYHQF | Ld | gp70, endogénny MuLV | Huang a Pardoll, 1996 |
| FEQNTAQA | Kb | Connexin37 | Mandelboim a spol., 1994 |
| FEQNTAQP | Kb | Connexin37 | Mandelboim a spol., 1994 |
| SYFPEITHI | Kd | JAK1 | Rammensee a spol., 1995 |
| EADPTGHSY | HLA-A1 | MAGE-1 | Rammensee a spol., 1995 |
| EVDPIGHLY | HLA-A1 | MAGE-3 | Rammensee a spol., 1995 |
| YMNGTMSQV | HLA-A2+ | Tyrozináza | Rammensee a spol., 1995 |
| HLA-AO201 | |||
| MLLALLYCL | HĽA-AO201 | Tyrozináza | Rammensee a spol., 1995 |
| AAGIGILTV | HLA-AO201 | Melan A/Martl | Rammensee a spol., 1995 |
| YLEPGPVTA | HLA-AO201 | pniel 17/gpl 00 | Rammensee a spol., 1995 |
| ILDGTATLRL | HLA-AO201 | pmell7/gpl00 | Rammensee a spol., 1995 |
| SYLDSGIHF | HLA-A24 | β-Catenin | Robbins a spol., 1996 |
| AINNYAQKL CKGVNKEYL QGINNLDNL NLDNLRDYL | Db | SV-40 veľký T-antigén | Lill a spol., 1992 |
| EEKLIVVLF | HLA-B44 | MUM-1 | Coulie a spol., 1995 |
| ACDPHSGHFV | HLA-A2 | mutovaný CDK4 | Wolfel a spol., 1995 |
| AYGLDFYIL | HLA-A24 | p 15, neznáma funkcia | Robbins a spol., 1995 |
| KTWGQYWQV YLEPGPVTA | HLA-A2 | gplOO | Kawakami aRosenberg, 1995 |
| HMTEVVRHC | HLA-A2 | mutovaný p53 | Houbiers a spol., 1993 |
| KYICNSSCM | K“ | mutovaný p53 | Noguchi a spol., 1994 |
| GLAPPQHEI LLGRNSEEM | HLA-A2 | mutovaný p53 | Stuber a spol., 1994 |
| LLPENNVLSPL RMPEAAPPV LLGRNSFEV | HLA-A2 | divý typ p53 | Theobald a spol., 1995 |
| LLGRDSFEV | HLA-A2 | mutovaný p53 | Theobald a spol., 1995 |
-29Literatúra
Alexander, J. a spol., 1989, Immunogenetics 29, 380
Allred, D. C. a spol., 1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599-605
Behr, J. P., 1994, Bioconjug-Chem., sept.-okt., 5 (5), 382-9
Biológie Therapy of Cancer, Editors: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., Vyd. J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown
Boon, T., 1993, Spektrum der Wissenschaft (máj), 58-66
Boon, T. a spol., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 337-65
Braciale, T. J. a Braciale, V. L., 1991, Immunol. Today 12, 124-129
Carrel, S. a Johnson, J. P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389
Coligan, J. E., Kruisbeek, A. M., Margulies, D. H., Shevach, Falk, K. a spol., 1991, Náture 351, 290-296
Coulie, P. G. a spol., 1992, Int. J. Cancer, 50, 289-297
Coulie, P. G., Lehmann, F., Lethe, B., Herman, J., Lurquin, C., Andrawiss, M., a Boon, T., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7976-80
Cox, A. L. a spol., 1994, Science 264, 5159, 716-9
Current Protocols in Molecular Biology, 1995, vyd. Ausubel F. M. a spol., John Wiley & Sons, Inc.
Dranoff, G. a spol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543
Dranoff, G. a Mulligan, R. C., 1995, Advances in Immunology 58, 417
Falk, K. a spol., 1991, Náture 351, 290-296
Felgner, J. H. a spol., 1994, J. Biol. Chem. 169, 2550-2561
Fenton, R. G. a spol., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-302
Fisk, B. a spol., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117
Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Celí Biology, 1989, Vol. 33, vyd. Darzynkiewicz, Z. a Crissman, H. A.
Gedde Dahl, T. a spol., 1992, Hum. Immunol. 33, 4, 266-74
Guarini, A. a spol., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64
Han, X. K. a spol., 1995, PNAS 92, 9747-9751
-30Hérin M. a spol., 1987, Int. J. Cancer, 39, 390
Hock, H. a spol., 1993, Cancer Research 53, 714-716
Houbiers, J. G., Nijman, H. W., van der Burg, S. H., Drijfhout, J. W., Kenemans, P., van de Velde, C. J., Brand, A., Momburg, F,, Kást, W. M.·, a Melief, C. J. (1993). Eur. J. Immunol 23, 2072-7
Huang, A. Y. C., a Pardoll, D. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-5
Jung, S. a spol., 1991, J. Exp. Med. 173, 1, 273-6
Kawakami, Y. a spol., 1995, The Journal of Immunol. 154, 3961-3968
Kärre, K. a spol., 1986, Náture 319, 20. feb., 675
Kovacsovics Bankowski, M. a Rock, K. L., 1995, Science 267, 243-246
Lehmann, J. M. a spol., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895
Lethe, B. a spol., 1992, Eur. J. Immunol. 22, 2283-2288
Lill, N. L., Tevethia, M. J., Hendrickson, W. G., a Tevethia, S. S., 1992, J. Exp. Med. 176, 449-57
Loeffler, J.-P. a spol., 1993, Methods Enzymol., 217, 599-618
Mackiewicz, A. a spol., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811
Malnati, M. S. a spol., 1995, Science 267, 1016-1018
Mandelboim, O. a spol., 1994, Náture 369, 5. máj, 67-71
Mandelboim, O. a spol., 1995, Náture Medicíne 1,11, 1179-1183
Morishita, R. a spol., 1993, J. Clin. Invest., 91, 6, 2580-5
Nabel, G. J. a spol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311
Noguchi, Y., Chen, Y. T., a Old, L. J., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 31713175
Oettgen, H. F. a Old, L. J., 1991, Biológie Therapy of Cancer, vyd. DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., vyd. J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87-119
Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727
Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310
Peace, D. J. a spol., 1991, J. Immunol. 146, 6, 2059-65
Peoples, G. E. a spol., 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-9
Plautz, G. E. a spol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649
-31 Practical Immunology, vyd. Leslie Hudson a Frank C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne
Príručka: FACS Vantage™ User’s Guide, apríl 1994, Becton Dickinson
Príručka: CELL Quest™ Software User’s guide, jún 1994, Becton Dickinson
Rammensee, H. G. a spol., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 35^44
Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 85-96
Rammensee, H. G., Friede, T., a Stepvanovic, S., 1995, Immunogenetics 41, 178— 228
Remy, J. S. a spol., 1994, Bioconjug-Chem., nov.-dec., 5 (6), 647-54
Rivoltini, L. a spol., 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265
Robbins, P. F., el Gamil, M., Li, Y. F., Topalian, S. L., Rivoltini, L., Sakaguchi, K., Appella, E., Kawakami, Y., a Rosenberg, S. A., 1995, J. Immunol. 154, 5944-50
Robbins a Rosenberg, 1996, J. Exp. Med. 183, 1185-92
Schmidt, W. a spol., máj 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4711—4714
Skipper, J., a Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8
Slingluff, C. L. a spol., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740
Stein, D. a spol., 1994, EMBO-Journal, 13, 6, 1331—40
Stuber, G., Leder, G. H., Storkus, W. T., Lotze, M. T., Modrow, S., Szekely, L., Wolf, H., Klein, E., Karre, K., a Klein, G., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 765768
Sykulev, Y. a spol., 1994, Immunity 1, 15-22
Theobald, M., Levine, A. J., a Sherman, L. A., 1995, PNAS 92, 11993-7
Tibbets, L. M. a spol., 1993, Cancer, jan. 15, Vol. 71, 2, 315-321 van der Bruggen, P. a spol., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 9, 2134-40 ISSN: 00142980
Van Pel, A. a Boon, T., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722
Wólfel, T. a spol., 1994 a), Int. J. Cancer 57, 413-418
Wôlfel, T. a spol., 1994 b), Eur. J. Immunol. 24, 759-764
-32Wôlfel, T., Hauer, M., Schneider, J., Serrano, M., Wolfel, C., Klehmann Hieb, E., De Plaen, E., Hankeln, T., Meyer zum Buschenfelde, K. H., a Beach, D., 1995, Science 269, 1281-4
York, I. A., a Rock, K. L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396
Yoshino, I., a spol., 1994 a), J. Immunol. 152, 5, 2393-400
Yoshino, I., a spol., 1994 b), Cancer Res. 54, 13, 3387-90
Zatloukal, K. a spol., 1993, Gene 135, 199-20
Zatloukal, K. a spol., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419 c/<f
Claims (5)
1 /9
Impulzy Impulzy . impulzy
10 60 80 100 0 40 80 120 160 200 O 60 120 180 240 300
Obr. 1 B
Obr. 1 C
Obr. 1 A ľ/
1. Protinádorová vakcína na podávanie pacientovi, vyznačujúca sa t ý m, že obsahuje nádorové bunky, ktoré v HLA kontexte prezentujú zo seba peptidy odvodené od nádorových antigénov, a z ktorých aspoň časť má na svojom bunkovom povrchu aspoň jeden MHC-I haplotyp pacienta, a na ktoré bol naviazaný jeden alebo viaceré peptidy a) a/alebo b) tak, aby nádorové bunky v kontexte s peptidmi imunitného systému pacienta boli rozpoznané ako cudzie a aby vyvolali imunitnú odpoveď, pričom peptidy
a) fungujú ako ligandy pre MHC-I haplotyp, ktorý je pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny spoločný, a odlišujú sa v peptidoch odvodených od proteínov, ktoré sú exprimované bunkami pacienta, alebo
b) fungujú ako ligandy pre MHC-I haplotyp, ktorý je pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny spoločný, a sú odvodené od nádorových antigénov exprimovaných bunkami pacienta a sú prítomné na nádorových bunkách vakcíny v takej koncentrácii, ktorá je vyššia ako koncentrácia peptidu odvodeného od toho istého nádorového antigénu ako je peptid exprimovaný na nádorových bunkách pacienta.
2/?
Obr. 1 D
Peptid 101 FITC pLys
Kontrola
7/ g&j 3/9
Obr. 2 A (%) mopeu zaq bibjqia^
100
7/ - 7%
100 ό
Týždne po vzniku metastáz (%) ruopeu zaq bjbjsiaz
7/
2. Protinádorová vakcína podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že obsahuje autológne nádorové bunky.
3. Protinádorová vakcína podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že obsahuje alogénne nádorové bunky.
4. Protinádorová vakcína podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že alogénne nádorové bunky sú z jednej alebo z viacerých bunkových línií, z ktorých aspoň jedna bunková línia exprimuje aspoň jeden, výhodne viaceré nádorové antigény, ktoré sú identické s nádorovými antigénmi liečeného pacienta.
5. Protinádorová vakcína podľa jedného z nárokov 1 až 4, vyznačujúc a sa t ý m, že pozostáva zo zmesi autológnych a alogénnych buniek.
-346. Protinádorová vakcína podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že peptid a) je odvodený od prirodzene sa vyskytujúceho imunogénneho proteínu, prípadne od bunkového produktu rozpadu.
7. Protinádorová vakcína podľa nároku 6, vyznačujúca peptid a) je odvodený od vírusového proteínu.
8. Protinádorová vakcína podľa nároku 7, vyznačujúca peptid je odvodený od proteínu vírusu chrípky.
9. Protinádorová vakcína podľa nároku 6, vyznačujúca t ý m, že t ý m, že t ý m, že peptid a) je odvodený od bakteriálneho proteínu.
10. Protinádorová vakcína podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že peptid a) je odvodený od nádorového antigénu, ktorý je pacientovi cudzí.
11. Protinádorová vakcína podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že peptid a) je syntetický peptid.
12. Protinádorová vakcína podľa jedného z nárokov 1 až 11,vyznačujú c a s a t ý m, že nádorové bunky boli ošetrené viacerými peptidmi s rôznou sekvenciou.
13. Protinádorová vakcína podľa nároku 12, v y z n a č u j ú c a sa tým, že peptidy sa odlišujú tým, že sa viažu na odlišné HI_A podtypy.
14. Protinádorová vakcína podľa nároku 13, v y z n a č u j ú c a sa tým, že peptidy sa odlišujú svojou sekvenciou, ktorá pre HLA viazanie nie je rozhodujúca.
15. Protinádorová vakcína podľa jedného z nárokov 1 až 14, v y z n a č u j ú -c a sa t ý m, že okrem toho obsahuje nádorové bunky a/alebo fibroblasty, ktoré sú transfekované cytokínovým génom.
16. Protinádorová vakcína podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že cytokin je IL-2 a/alebo IFN-γ.
17. Protinádorová vakcína podľa jedného z nárokov 1 až 16, vyznačuj ú -c a sa t ý m, že okrem toho obsahuje fibroblasty, na ktoré bol naviazaný jeden alebo viaceré peptidy odvodené od nádorových antigénov exprimovaných pacientom.
18. Protinádorová vakcína podľa jedného z nárokov 1 až 17, v y z n a č u j ú -c a sa t ý m, že okrem toho obsahuje dendritické bunky, na ktoré je naviazaný jeden alebo viaceré peptidy odvodené od nádorových antigénov, ktoré pacient exprimuje a ktoré sa viažu na molekulu MHC-I alebo MHC-II.
19. Spôsob prípravy protinádorovej vakcíny obsahujúcej nádorové bunky na podávanie pacientovi, vyznačujúci sa tým, že nádorové bunky, ktoré zo seba v HLA kontexte prezentujú peptidy odvodené od nádorových antigénov a z ktorých aspoň časť exprimuje aspoň jeden MHC-I haplotyp pacienta, sa ošetria jedným alebo viacerými peptidmi, ktoré
a) fungujú ako ligandy pre MHC-I haplotyp, ktorý je pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny spoločný, a odlišujú sa v peptidoch odvodených od proteínov, ktoré sú exprimované bunkami pacienta, alebo ktoré
b) fungujú ako ligandy pre MHC-I haplotyp, ktorý je pre pacienta a pre nádorové bunky vakcíny spoločný, a sú odvodené od nádorových antigénov, ktoré sú exprimované bunkami pacienta, pričom sa nádorové bunky inkubujú s jedným alebo s viacerými peptidmi a) a/alebo b) tak dlho a v takom množstve v prítomnosti organického polykatiónu, kým sa peptidy nenaviažu na nádorové bunky tak, aby v kontexte s nádorovými
-36bunkami boli imunitným systémom pacienta rozpoznané ako cudzie a aby vyvolali bunkovú imunitnú odpoveď.
20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že okrem toho sa dendritické bunky ošetria v prítomnosti organického polykatiónu jedným alebo viacerými peptidmi odvodenými od nádorových antigénov, ktoré sú pacientom exprimované a ktoré sa viažu na molekulu MHC-I alebo MHC-II, a že sa dendritické bunky zmiešajú s nádorovými bunkami.
21. Spôsob podľa nároku 19 alebo 20, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že ako polykatión sa použije polylyzín.
22. Spôsob podľa nároku 21, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že sa použije polylyzín s dĺžkou reťazca asi 30 až 300 lyzínových zvyškov.
23. Spôsob podľa jedného z nárokov 19 až 22, vyznačujúci sa tý m, že sa polykatión použije aspoň čiastočne v konjugovanej forme.
24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že polykatión je konjugovaný s transferínom.
25. Spôsob podľa jedného z nárokov 19 až 23, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že bunky sa okrem toho ošetria v prítomnosti DNA.
26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že DNA je plazmid.
27. Spôsob podľa nároku 25 alebo 26, vyznačujúci sa tým, že pomer DNA k polykatiónu, ktorý je v danom prípade čiastočne konjugovaný s proteínom, je asi 1:2 až asi 1:5.
28. Spôsob podľa jedného z nárokov 25 až 27, vyznačujúci sa tý m, že nádorové bunky sú bunky melanómu.
29. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že peptid a) a/alebo b) sa použije v množstve asi 50 pg až asi 160 pg na 1X105 až 2X107 buniek.
30. Použitie spôsobu podľa jedného z nárokov 19, 21 až 27 a 29 na fibroblasty, pričom sa použije jeden alebo viaceré peptidy odvodené od nádorových antigénov exprimovaných pacientom.
31. Použitie spôsobu podľa jedného z nárokov 19, 21 až 27 a 29 na dendritické bunky, pričom sa použije jeden alebo viaceré peptidy odvodené od nádorových antigénov a ktoré sa viažu na molekulu MHC-I alebo MHC-II.
5/9
Obr. 3 A
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19543649A DE19543649C2 (de) | 1995-11-23 | 1995-11-23 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19607044A DE19607044A1 (de) | 1996-02-24 | 1996-02-24 | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| PCT/EP1996/005126 WO1997019169A1 (de) | 1995-11-23 | 1996-11-21 | Tumorvakzine und verfahren zu ihrer herstellung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK66998A3 true SK66998A3 (en) | 1998-12-02 |
Family
ID=26020603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK669-98A SK66998A3 (en) | 1995-11-23 | 1996-11-21 | Tumour vaccine and process for the preparation thereof |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020085997A1 (sk) |
| EP (1) | EP0866851A1 (sk) |
| JP (1) | JP2000502052A (sk) |
| KR (1) | KR19990067653A (sk) |
| CN (1) | CN1202931A (sk) |
| AR (1) | AR004341A1 (sk) |
| AU (1) | AU720131B2 (sk) |
| BG (1) | BG62999B1 (sk) |
| BR (1) | BR9611466A (sk) |
| CA (1) | CA2238176A1 (sk) |
| CO (1) | CO4520254A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ158998A3 (sk) |
| EE (1) | EE03778B1 (sk) |
| HU (1) | HUP0000318A3 (sk) |
| NO (1) | NO982329D0 (sk) |
| NZ (1) | NZ322910A (sk) |
| PL (1) | PL188537B1 (sk) |
| RO (1) | RO115275B1 (sk) |
| RU (1) | RU2206329C2 (sk) |
| SK (1) | SK66998A3 (sk) |
| TR (1) | TR199800912T2 (sk) |
| TW (1) | TW514530B (sk) |
| UY (2) | UY24367A1 (sk) |
| WO (1) | WO1997019169A1 (sk) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RS50101B (sr) † | 1996-02-24 | 2009-01-22 | Boehringer Ingelheim International Gmbh., | Farmaceutski preparati za imunomodulaciju |
| EP1012240B1 (en) | 1997-01-31 | 2008-03-19 | Edward P. Cohen | Cancer immunotherapy with semi-allogeneic cells |
| ES2232845T3 (es) * | 1997-08-22 | 2005-06-01 | Science Park Raf S.P.A. | Vacunacion tumoral mediante la utilizacion de celulas autologas o celulas presentadoras de antigeno (apc) relacionadas con hla transducidas con un antigeno tumoral y un antigeno ajeno capaz de producir una reaccion inmune. |
| EP1064390A4 (en) * | 1998-03-20 | 2002-06-12 | Genzyme Corp | IMPROVED ANTI-TUMOR IMMUNITY |
| US7014848B1 (en) | 1998-03-20 | 2006-03-21 | Genzyme Corporation | Enhanced anti-tumor immunity |
| FR2807661A1 (fr) * | 2000-04-14 | 2001-10-19 | Univ Nantes | Agent et procede pour la simulation de lymphocytes t specifiques et lymphocytes t obtenus |
| US20060035291A1 (en) * | 2001-09-18 | 2006-02-16 | Kyogo Itoh | Method of detecting cellular immunity and application thereof to drugs |
| GB0209896D0 (en) | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| CN1315536C (zh) * | 2002-09-13 | 2007-05-16 | 李进 | 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物 |
| GB0224442D0 (en) | 2002-10-21 | 2002-11-27 | Molmed Spa | A delivery system |
| DK1667711T3 (da) * | 2003-08-25 | 2010-11-22 | Univax Llc | Forebyggende cancervaccine baseret på BORIS (Brother of Regulator of Imprinted Sites)-molekyle |
| US7674456B2 (en) * | 2004-06-14 | 2010-03-09 | Charles Wiseman | Breast cancer cell lines and uses thereof |
| US20090214494A1 (en) * | 2005-03-29 | 2009-08-27 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi | Cancer Vaccines and Therapeutic Methods |
| DE602005020047D1 (de) * | 2005-09-05 | 2010-04-29 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Tumor-assoziierte Peptide, welche an unterschiedliche menschliche Leukozytenantigene der Klasse II binden |
| US20090004213A1 (en) * | 2007-03-26 | 2009-01-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Combination therapy using active immunotherapy |
| WO2011101465A1 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Intercell Ag | Ic31 nanoparticles |
| EP3511425A1 (en) * | 2012-07-12 | 2019-07-17 | Persimmune, Inc. | Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies |
| CN109072227A (zh) | 2016-03-15 | 2018-12-21 | 组库创世纪株式会社 | 用于免疫治疗的监测和诊断及治疗剂的设计 |
| CA3062591A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Gritstone Oncology, Inc. | Alphavirus neoantigen vectors |
| JP7457733B2 (ja) | 2019-05-30 | 2024-03-28 | グリットストーン バイオ インコーポレイテッド | 改変アデノウイルス |
| WO2022032196A2 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Gritstone Bio, Inc. | Multiepitope vaccine cassettes |
| US20240156869A1 (en) * | 2021-03-12 | 2024-05-16 | T-Cure Bioscience, Inc. | Methods of enhancing diversity of hla haplotype expression in tumors to broaden tumor cell susceptibility to tcr-t therapy |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
| EP0569678A3 (en) * | 1992-03-13 | 1994-10-26 | Yeda Res & Dev | Double transfectants of MHC genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis. |
-
1996
- 1996-11-19 UY UY24367A patent/UY24367A1/es not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 AU AU76947/96A patent/AU720131B2/en not_active Ceased
- 1996-11-21 CZ CZ981589A patent/CZ158998A3/cs unknown
- 1996-11-21 TR TR1998/00912T patent/TR199800912T2/xx unknown
- 1996-11-21 CN CN96198493A patent/CN1202931A/zh active Pending
- 1996-11-21 WO PCT/EP1996/005126 patent/WO1997019169A1/de not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 EE EE9800161A patent/EE03778B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 SK SK669-98A patent/SK66998A3/sk unknown
- 1996-11-21 KR KR1019980703681A patent/KR19990067653A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 US US09/077,214 patent/US20020085997A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 RO RO98-00985A patent/RO115275B1/ro unknown
- 1996-11-21 RU RU98111622/14A patent/RU2206329C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 HU HU0000318A patent/HUP0000318A3/hu unknown
- 1996-11-21 NZ NZ322910A patent/NZ322910A/xx unknown
- 1996-11-21 JP JP9519395A patent/JP2000502052A/ja not_active Abandoned
- 1996-11-21 CA CA002238176A patent/CA2238176A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-21 PL PL96326756A patent/PL188537B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 BR BR9611466A patent/BR9611466A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-21 EP EP96939870A patent/EP0866851A1/de not_active Withdrawn
- 1996-11-22 CO CO96061701A patent/CO4520254A1/es unknown
- 1996-11-22 AR ARP960105291A patent/AR004341A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-11-23 TW TW085114455A patent/TW514530B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-01-03 UY UY24430A patent/UY24430A1/es not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-05-08 BG BG102439A patent/BG62999B1/bg unknown
- 1998-05-22 NO NO982329A patent/NO982329D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TR199800912T2 (xx) | 1998-08-21 |
| RO115275B1 (ro) | 1999-12-30 |
| JP2000502052A (ja) | 2000-02-22 |
| CN1202931A (zh) | 1998-12-23 |
| PL188537B1 (pl) | 2005-02-28 |
| WO1997019169A1 (de) | 1997-05-29 |
| TW514530B (en) | 2002-12-21 |
| UY24430A1 (es) | 1997-07-01 |
| BG102439A (en) | 1999-01-29 |
| BG62999B1 (bg) | 2001-01-31 |
| AU7694796A (en) | 1997-06-11 |
| NZ322910A (en) | 2000-05-26 |
| AR004341A1 (es) | 1998-11-04 |
| CO4520254A1 (es) | 1997-10-15 |
| AU720131B2 (en) | 2000-05-25 |
| CZ158998A3 (cs) | 1999-06-16 |
| EE9800161A (et) | 1998-12-15 |
| BR9611466A (pt) | 1999-05-18 |
| HUP0000318A2 (hu) | 2000-06-28 |
| US20020085997A1 (en) | 2002-07-04 |
| EE03778B1 (et) | 2002-06-17 |
| HUP0000318A3 (en) | 2002-02-28 |
| UY24367A1 (es) | 2000-10-31 |
| PL326756A1 (en) | 1998-10-26 |
| KR19990067653A (ko) | 1999-08-25 |
| CA2238176A1 (en) | 1997-05-29 |
| EP0866851A1 (de) | 1998-09-30 |
| RU2206329C2 (ru) | 2003-06-20 |
| NO982329D0 (no) | 1998-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK66998A3 (en) | Tumour vaccine and process for the preparation thereof | |
| CA2243559C (en) | Pharmaceutical composition for immunomodulation | |
| Bakker et al. | Analogues of CTL epitopes with improved MHC class‐I binding capacity elicit anti‐melanoma CTL recognizing the wild‐type epitope | |
| US9907842B2 (en) | Cytotoxic T lymphocyte inducing immunogens for prevention treatment and diagnosis of cancer | |
| Speiser et al. | Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy, and protective T cell immunity | |
| US20050069982A1 (en) | Method of epitope discovery | |
| WO1999063945A2 (en) | Vaccination strategy to prevent and treat cancers | |
| Minev | Melanoma vaccines | |
| van Elsas et al. | Transfection of IL-2 augments CTL response to human melanoma cells in vitro: immunological characterization of a melanoma vaccine | |
| JP3840268B2 (ja) | 細胞傷害性ｔリンパ球 | |
| MXPA98003930A (en) | Vaccines against tumors and procedure for your producc | |
| DE19543649C2 (de) | Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| Jonasch | Melanoma vaccination: state-of-the-art and experimental approaches | |
| Watkins | Inducing immunity to haematological malignancies with DNA vaccines | |
| Walden | Tumor Antigens | |
| Yang et al. | Peptide Vaccines | |
| AU4111999A (en) | Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes |