CN1315536C

CN1315536C - 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物

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Publication number: CN1315536C
Application number: CNB021369658A
Authority: CN
Inventors: 李进
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2022-09-13
Also published as: WO2004024181A1; AU2003264319A1; CN1481899A

Abstract

本发明公开了一种新的肿瘤抗原疫苗，它包含来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列和免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述两个序列相互连接。本发明还公开了编码该肿瘤抗原疫苗的DNA序列，其制备方法和含有该肿瘤抗原疫苗的疫苗组合物。本发明疫苗分子量比抗原抗体复合物小许多倍，易被树突状细胞吞噬，产生很强的免疫反应。

Description

肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物

技术领域

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地说，本发明涉及一种新的肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物。

发明背景

肿瘤至今仍是人类的主要死亡原因之一。尽管近年来在肿瘤的诊断和治疗方面的水平不断得到改进和提高，化疗和放疗的方案也在不断地改进，但最终大部分病人仍难以逃脱死亡的厄运。近年来，分子生物学的进展和对免疫系统功能的进一步的了解使得的研制和开发生物治疗方法进入了一个飞速发展的阶段。肿瘤疫苗的研制是目前肿瘤生物治疗的最主要的方向之一[1-3]。

尽管体液免疫系统可能产生一定的抗肿瘤免疫反应，但研究表明细胞毒(CD8+)和辅助(CD4+)T-细胞在肿瘤排斥反应中起了关键的作用[4，5]。因此，大多数肿瘤疫苗的目标都致力于诱导细胞的特异性的T-细胞反应。T-细胞抗原受体(TCR)识别抗原的方式仅仅涉及到位子靶细胞表面并嵌于主要组织相容复合物(MHC)I类和II类分子的多肽片断[6]。I类MHC分子提呈内源性蛋白分解所产生的多肽。肿瘤细胞在合成肿瘤抗原的过程中，分解的多肽通过MHC I类分子被提呈致肿瘤细胞表面激活CD8+T-细胞。II类分子为CD4+T-细胞所识别，主要位于特殊的抗原提呈细胞(APCs)表面，包括树突状细胞，B-细胞和巨噬细胞。肿瘤细胞分泌或肿瘤溶解释放外源性蛋白被APCs俘获。在APC内，抗原被加工成多肽片断并由II类MHC提呈给CD4+细胞。CD4+T-细胞与体液的细胞的免疫反应密切相关，通过与B-细胞的直接相互作用刺激抗体的产生并通过分泌的细胞因子刺激扩增CD8+T-细胞反应。激活的抗原特异性CD8+细胞最终成为细胞毒T细胞并溶解肿瘤细胞[7]。APCs也能加工多肽并通过MHCI类分子提呈给CD8+T-细胞。

理想的肿瘤-特异的抗原应具有免疫原性，为肿瘤细胞所表达但不表达于正常的细胞。不幸的是，大多数肿瘤抗原都没有足够的免疫原性以诱导有效的免疫反应，而且，许多肿瘤抗原在某种程度上表达于正常的组织，因此，这些抗原只是肿瘤相关的而不是真正的肿瘤特异的抗原。所设计的肿瘤疫苗就必须要克服机体的免疫耐受障碍。

肿瘤疫苗主要分为全细胞疫苗、蛋白分子疫苗、多肽疫苗、重组分子疫苗和树突状细胞疫苗。而DNA疫苗和RNA疫苗实际上仍属于分子疫苗，只是采用了不同的表达系统。

细胞疫苗：过去，对肿瘤抗原与其临床的相关性方面并不十分清楚，采用全细胞作为肿瘤疫苗，可以提供那些未知的肿瘤抗原来激活免疫系统肿瘤抗原。小鼠肿瘤模型中，通常使用照射的肿瘤细胞免疫小鼠，以保护小鼠免受接种的肿瘤的侵袭[8]。但当肿瘤细胞疫苗使用的时间推迟到接种肿瘤细胞后一周时，疫苗就失去了保护小鼠的能力。肿瘤细胞疫苗的临床治疗反应比较差，仅仅适用于无特殊肿瘤抗原的肿瘤病人的预防复发。对于进展期病人在临床研究方面很少获得良好效果[9]。近年来，由于在识别分析肿瘤抗原方面的进展，特别是T细胞识别抗原的机制的深入了解，肿瘤抗原疫苗已基本取代细胞疫苗被用于肿瘤的免疫治疗。

多肽和蛋白疫苗：T-细胞识别MHC分子表面的抗原多肽表位一般为7-12个氨基酸，因此，抗原多肽可以与免疫佐剂混合应用以达到在体内装载于空虚的MHC分子的目的。到目前为止，几乎所有的以多肽为基础的疫苗都是MHC I类抗原限制性多肽。当小鼠研究证实了其有效性后[10，11]，多肽疫苗开始进入了临床研究。Marchandetal[12]进行了I临床试验，12例表达MAGE-3，III或IV期黑色素细胞瘤病人，连续三个月给予合成的MAGE-3多肽。虽然有三例病人有部分肿瘤退缩，但没有检测到细胞毒T-细胞反应的证据[13]。Rosenberg等[14]用合成的A2-限制性gp100多肽免疫黑色素细胞瘤病人，11个接受了福氏完全佐剂的病人中有10例病人对多肽产生了反应，部分病人出现了肿瘤反应的T-细胞，但未发现明显临床效果。19例联合全身应用IL-2的病人，3例病人出现多肽-反应性T-细胞反应，7例病人有明显的临床效应，包括一例完全退缩，而单独应用IL-2的临床反应率为17％[8]。多肽疫苗应用有一些限制。所应用的多肽疫苗必需与病人的MHC I类抗原分子相匹配，即所谓的个体化，不同的病人MHC I类分子的亚型不同，所使用的肿瘤抗原多肽的序列也不同，这给肿瘤抗原多肽的临床应用带来很大的困难。

重组分子疫苗：肿瘤抗原蛋白疫苗的应用可以克服这种困难，但是单纯使用蛋白并不能激活机体的免疫反应。灵长类动物试验研究证实最佳的免疫效果需要将肿瘤蛋白与强免疫原性蛋白相绞联[15]。弱抗原要诱导出有效的免疫反应，就必须联合使用免疫佐剂，提供一个非特异性的信号以激活免疫系统，许多免疫佐剂都有一定的毒性而不能应用于临床，所以抗原蛋白疫苗大都是以重组形式出现的。

用重组形式增强肿瘤蛋白的免疫原性的方法就是将肿瘤抗原与细胞因子，如GM-CSF，白细胞介素等重组形成融合蛋白[16，17]。肿瘤弱抗原与细菌或病毒抗原、毒素如白喉毒素、假单胞菌毒素等的重组可以明显提高肿瘤抗原的抗原性，促进DC对肿瘤抗原的吞噬提呈，取得了一定的效果。但肿瘤抗原与毒素的单独重组的方法到目前为止仍然还没有达到理想的效果。

树突状细胞疫苗：对于有效的T-细胞介导的免疫反应，T-细胞需要抗原被提呈并致敏原始T-细胞，致敏的T-淋巴细胞获得再刺激。要启动有效的T-细胞介导的肿瘤免疫，来源于体内任何部位的肿瘤抗原多肽必须被循环的T-细胞所识别。肿瘤细胞表面缺乏MHC分子和共刺激分子，无法激活T-细胞免疫。因此，抗原的提呈是获得有效免疫反应的关键性步骤。疫苗刺激的免疫反应主要依赖于有效的APC对抗原的初加工和进一步的提呈。树突状细胞(DC)是最有效的APC[19]。现在，越来越多的证据表明，DCs能够使免疫系统克服这一障碍。DCs目前可以从CD34+造血干细胞的或外周血单个核淋巴细胞的分离中大量获得。DCs在大多数组织内以未成熟状态存在，不能直接刺激T-细胞但具有特殊的俘获和加工抗原的能力。这些被俘获的抗原在DCs细胞内通过I类和II类MHC分子被有效地提呈致细胞表面。抗原的俘获作为刺激信号促进细胞成熟并向局部淋巴结迁移。这些成熟的DCs的细胞表面还高表达共刺激分子和粘附分子，具有强大的激活T-淋巴细胞的功能[20-22]。在体外大量产生的DCs用肿瘤抗原进行冲击制备的疫苗已经进入临床试验[23]，采用肿瘤细胞溶解物，肿瘤抗原蛋白，肿瘤抗原多肽等冲击的树突状细胞疫苗的临床研究获得了比较理想的效果[24]。采用自身的肿瘤细胞与DCs融合的细胞疫苗治疗转移性肾癌也取得了一定的效果，17例病人中有7例有确切的临床反应，其中包括4例完全退缩[25]。

因此，就目前的研究结果看，DCs为基础的疫苗是所有方案中最理想的疫苗。但是，DC的体外分离和培养需要很高的技术要求和费用，如果能在体内有效地完成向DC递送肿瘤抗原并激活DC则可大大降低治疗费用。

通过抗原抗体复合物向DC递送抗原是一个可行的方案，因为免疫球蛋白的Fc段与DC细胞表面的Fc受体结合可以促进DC对抗原抗体复合物的吞噬[26，27]。用重组DNA疫苗的方式也证实免疫球蛋白的Fc段可以促进对B型肝炎病毒的免疫反应，可以提高免疫活性细胞干扰素的产生水平，并在一定程度上提高CD8+的活性[27]，这种DNA疫苗是否能在动物试验中得到满意的治疗肝炎的效果至今未有相关报道。由于肝炎病人的大部分肝细胞都不同程度被感染，如果这种DNA疫苗有很好的效果的话，将会导致免疫细胞对所有受感染的肝细胞的攻击，最终导致肝坏死，因此，此方法并不可取。总体来说，采用抗原抗体复合物的方式激活DC可以获得有效地免疫预防作用[28，29]。但抗原抗体复合物的方式激活DC也有其缺陷，首先要分别实行抗原的制备和抗体的制备，特别是人源性抗体的制备目前仍是相当困难。第二，DC的激活同时需要炎症因子的参与(即危险信号)，在缺乏炎症因子的情况下，DC的激活就会受到很大的影响。第三，抗原与抗体的结合是不牢固的，在一定因素的影响下，抗原会脱离抗体从而影响抗原递送效果。

因此，为了改进肿瘤抗原的递送方式，提高肿瘤抗原的递送水平，克服机体的免疫抑制状态，从根本上治愈肿瘤，本领域中需要开发出新的肿瘤抗原疫苗。

发明内容

本发明的一个目的是提供新的肿瘤抗原疫苗。

本发明的另一个目的是提供编码该肿瘤抗原疫苗的核苷酸序列。

本发明还有一个目的是提供含有该肿瘤抗原疫苗的疫苗组合物。

本发明还有一个目的是提供该肿瘤抗原疫苗的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明第一方面涉及一种分离的肿瘤抗原疫苗，该肿瘤抗原疫苗包含来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列和含有免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述两个序列相互连接。

本发明第二方面涉及一种DNA分子，该DNA分子含有编码上述肿瘤抗原疫苗的核苷酸序列。

本发明第三方面涉及一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含肿瘤抗原疫苗和药学上可接受的载体。

本发明第四方面涉及一种制备上述肿瘤抗原疫苗的方法，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有编码上述肿瘤抗原疫苗的核苷酸序列以及与该核苷酸序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞：

c)在适合表达所述肿瘤抗原疫苗的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)分离纯化获得所表达出的肿瘤抗原疫苗。

本发明的肿瘤抗原疫苗是通过将肿瘤抗原或其多肽与免疫球蛋白CH3部分在DNA水平重组而表达获得的。该肿瘤抗原疫苗能通过其CH3部分与DC表面的Fc受体结合，从而促进融合蛋白所携带的肿瘤抗原的内源化并刺激DC成熟，刺激DC对该抗原的提呈并激活T淋巴细胞。由于CH3介导的抗原内源化所提呈的多肽主要与I类MHC分子相结合，激活CD8+细胞毒T细胞，因此能够针对表达该抗原的肿瘤细胞产生强大的免疫攻击，并杀灭这类肿瘤细胞。

与抗原抗体复合物相比较，本发明方法简便，省略了制备特殊抗体这一非常复杂的步骤，抗原与CH3为重组的蛋白，结合牢固。而抗原抗体复合物易脱离。本发明疫苗的分子量比抗原抗体复合物小许多倍，易被树突状细胞吞噬，产生很强的免疫反应。尤其是在另外连入毒素后，可使肿瘤抗原的抗原性有更明显的提高，T细胞激活效应可进一步提高2倍。

发明详述

本发明提供了一种分离的肿瘤抗原疫苗，该肿瘤抗原疫苗包含来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列和含有免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述两个序列相互连接。

本文所用的术语“分离的”在用于蛋白质时，表示该蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。

本发明的肿瘤抗原疫苗含有两个氨基酸序列。第一个氨基酸序列是来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的多肽序列。本文所用的术语“多肽”和“蛋白”可以互换，其包括7个或7个以上具有任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即肿瘤抗原本身)，其中氨基酸残基间通过共价肽键连接。在这里，术语“肿瘤抗原”的含义是本领域技术人员所熟知的。在本发明的一个较佳实施方案中，所述肿瘤抗原宜选自任意能被T细胞识别的与肿瘤有关的抗原。在一个更佳的实施方案中，所述肿瘤抗原宜选自：707-AP、AFP、ART-4、BAGEB、β-catenin/m、bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、ETS、G250、GAGE、GnT-V、GP100、HAGE、HER-2/NEU、HLA-A^*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、GDP-Lfucose、MAGE、MART-1/Melan-A、MCIR、Myosin/m、MUCI、MUM-1，-2，-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190、P53、Pm1/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RAS、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2、WT1。如本领域技术人员所熟知的，肿瘤抗原仅需7个或7个以上氨基酸多肽序列就能为抗原递呈细胞所递呈(CAP-1为来源于CEA的氨基酸序列为YLSGANLNL[30]，VISNDVCAQV为来源于PSA的氨基酸序列[31]，KIFGSLAFL为来源于HER2/neu的氨基酸序列[32])。另外，上述肿瘤抗原多肽序列中可有一个或多个氨基酸缺失、置换或增加，如此产生的变体也包括在本发明的术语“肿瘤抗原”范围内，只要所述变体保留了该肿瘤抗原多肽序列的抗原性。

本发明的肿瘤抗原疫苗中所含的第二个氨基酸序列是含有免疫球蛋白CH3部分的氨基酸序列。本发明者发现，免疫球蛋白Fc片段中的CH3部分是导致免疫球蛋白Fc片段与DC细胞表面Fc受体结合的关键序列。因此，预计含有免疫球蛋白CH3部分的任何氨基酸序列均能与DC细胞表面Fc受体结合。CH3的氨基酸序列和DNA序列分别示于序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中。然而，CH3氨基酸序列中一个或多个氨基酸缺失、置换或增加而产生的CH3变体也包括在本发明的术语“CH3部分”范围内，只要该变体保留了与DC细胞表面Fc受体结合的能力。所述“CH3变体”与CH3序列的相同性宜在约80％以上，更佳的约95％以上。其中常见的置换是保守性氨基酸置换，例如脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的相互置换；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln之间的置换；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳族残基Phe和Tyr之间的置换。缺失或增加包括对CH3结合DC细胞表面Fc受体能力影响很小的氨基酸缺失或增加。所述“含有免疫球蛋白CH3部分的氨基酸序列”可以单单是CH3氨基酸序列。在另一个实施方案中，它可以是含有该CH3氨基酸序列的免疫球蛋白Fc片段。

上述两个氨基酸序列只需相连即可，而无前后顺序。所述连接可以直接连接(即其中没有介入的氨基酸)或可通过不会显著影响的肿瘤抗原多肽序列抗原性的接头序列连接。

在本发明的一个较佳实施方案中，本发明的肿瘤抗原疫苗中还包括毒素。所述毒素可以是任意细菌或病毒及其它生物毒素，例如白喉菌毒素、百日咳菌毒素、假单胞菌毒素、炭疽菌毒素、破伤风毒素等。所述毒素可以以任意30个氨基酸以上的毒素片段与肿瘤抗原疫苗串联连接，其中毒素片段可以连接在上述肿瘤抗原多肽片段和CH3片段前后以及之间的任何位置。

本发明还提供了一种DNA分子，该DNA分子含有编码本发明肿瘤抗原疫苗的核苷酸序列。例如，编码各种肿瘤抗原多肽序列的核苷酸序列是本领域技术人员已知的，可从基因库中检索得到。编码CH3部分的核苷酸序列例如显示在SEQ ID NO：2中。然而，本领域技术人员也可利用本领域中熟知的遗传密码的简并性获得编码上述氨基酸序列的所有其它核酸序列。

本发明的肿瘤抗原疫苗可通过以下方法来获得。

首先，根据本发明公开的信息，用本领域技术人员熟知的常规手段，如人工合成或用PCR法扩增分别得到编码肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列的核苷酸序列以及编码含有免疫球蛋白的CH3部分的核苷酸序列。然后，可用本领域熟知的各种方法，如基因工程方法，将上述序列用任选的接头序列将肿瘤抗原多肽编码序列、CH3编码序列连接入合适的表达载体中，并与表达调控序列操作性相连。在另一任选的操作步骤中，还可利用基因工程方法将毒素(如白喉毒素)的编码序列也连接入该表达载体中。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。本发明中所用的表达载体可采用本领域技术人员已知的各种市售的表达载体。

然后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明的一个较佳实施方案中，宜采用哺乳动物细胞系来作为宿主细胞，更佳的可采用市售的无限增殖细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)等。

本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电穿孔；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。

最后，在适合本发明肿瘤抗原疫苗表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用细胞裂解缓冲液裂解细胞，再用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析和亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的肿瘤抗原疫苗。

本发明还提供了一种疫苗组合物，它含有药效上有效量的本发明肿瘤抗原疫苗和药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的肿瘤抗原疫苗相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低疫苗组合物的效果。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。

本发明的疫苗组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。传统方法是从肠胃外(皮下、肌内、或透皮/经皮肤)途径通过注射给予。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂或免疫佐剂一起给予。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：MUC1肿瘤抗原疫苗

MUC1全序列可从基因库(NM…002456)检索获得。用Invitrogene公司反转录试剂盒，根据生产商说明书操作，通过mRNA反转录方法从X-108胃癌细胞株(手术标本来源的胃癌细胞株)合成cDNA，获得MUC1的DNA。

同样，用Invitrogene公司反转录试剂盒根据生产商说明书操作，从人B淋巴细胞mRNA反转录合成cDNA获得CH3的DNA。CH3的DNA序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。

以上述获得的MUC1的DNA为模板PCR方法合成MUC1(5′PCR引物序列AACCCGGTACCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC(SEQ ID NO：3)，3′PCR引物序列AACCCCTCGAGGGGGGCGGTGGAGCCCGGGGCC(SEQ ID NO：4))。用限制性内切酶Kpn I/Xho I将MUC1克隆入pcDNA3.1载体(购自Invitrogene公司)内的多克隆位点内。同样，以上述获得的CH3的DNA为模板用PCR方法合成免疫球蛋白Fc的CH3片段(5′PCR引物序列AACCCCTCGAGGGCAGCCCCGAGAACCAC(SEQ IDNO：5)，3′PCR引物序列AACCCTCTAGATCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID NO：6))。用限制性内切酶Xho I/Xba I将CH3片段克隆入pcDNA3.1载体内相应的位点内，使之与MUC1串联连接。

pcDNA3.1在DH-5α(购自Invitragene公司)内扩增后用Miniprep试剂盒纯化质粒DNA。取5-10ug消化后的DNA，用Superfectine试剂盒(Qiagene公司)将其转导入CHO细胞(购自美国ATCC)中，经G418筛选，单克隆化。

扩增克隆化的细胞，用溶解细胞缓冲液(20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，10mMDTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，10微克/毫升抑酶肽，10微克/毫升亮抑酶肽，5微克/毫升胃抑酶肽)收获溶解CHO细胞。

用Western印迹法检测融合蛋白的表达，一抗为鼠抗人MUC1单克隆抗体，二抗为兔抗鼠IgG，试剂盒为美国vector公司产品。结果提示在大约23000分子量处可测出融合蛋白。

如下所述检测融合蛋白功能。用2毫克纯化的融合蛋白免疫C57/BL6小鼠，每周一次共三次，取小鼠脾细胞1×10⁷以20∶1的比例与照射过(8000钴源拉得)的MC38细胞(来源于美国NIH)混合培养5天，再以不同效靶比的浓度与野生型MC38混合培养测定脾细胞对MC38的杀伤活性。结果发现，以1∶20效靶比在四小时内可杀灭80％的MC38细胞。而用以上方法免疫过的小鼠可得到100％的免疫保护，排斥高达1×10⁶的MC38肿瘤细胞的攻击。其治疗效果与普通的抗原抗体复合物相比高5-10倍。

实施例2：CEA肿瘤抗原疫苗(CAP-1)

首先，用Invitrogene公司反转录试剂盒根据生产商说明书操作，从人B淋巴细胞mRNA反转录合成cDNA获得Fc段的DNA。Fc段的DNA序列如序列表SEQ IDNO：7所示。

CAP-1的DNA编码序列已知为TACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCC(SEQ ID NO：8)，以上述获得的Fc段cDNA为模板用PCR方法合成CAP-1-Fc重组蛋白的DNA(5′PCR引物序列AACCCGGTACCATGTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGA(SEQ ID NO：9)，3′PCR引物序列AACCCTCTAGATTATCATTTACCCGGAGA(SEQ ID NO：10))。用限制性内切酶XhoI/XbaI将CAP-1-Fc克隆入pcDNA3.1载体内相应的位点内，使CAP-1与Fc串联连接。

pcDNA3.1在DH-5α(购自Invitragene公司)内扩增后用Miniprep试剂盒纯化质粒DNA。取5-10ug消化后的DNA，用Superfectine试剂盒(Qiagene公司)转导入CHO细胞(购自美国ATCC)，经G418筛选，单克隆化。

Western印迹法检测融合蛋白的表达，一抗为鼠抗人CH3单克隆抗体，二抗为兔抗鼠IgG，试剂盒为美国vector公司产品。结果提示在大约30000分子量处可测出融合蛋白单体。

分离纯化该融合蛋白，冻干、分装。

实施例3：P53肿瘤抗原疫苗

人P53全序列可从基因库(M14695)检索获得。含有P53基因的质粒可以从美国ATCC购得，其氨基酸的全序列如SEQ ID NO：11所示。同样，用Invitrogene公司反转录试剂盒根据生产商说明书操作，从人B淋巴细胞mRNA反转录合成cDNA获得CH3的DNA。

以上述获得的P53的DNA为模板用PCR方法合成P53(5′PCR引物序列AACCCGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT(SEQ ID NO：12)，3′PCR引物序列AACCCCTCGAGGTCTGAGTCAGGCCCTTC(SEQ ID NO：13))。用限制性内切酶KpnI/XhoI将P53克隆入pcDNA3.1载体(购自Invitrogene公司)内的多克隆位点内。同样，以上述获得的CH3的DNA为模板用PCR方法合成免疫球蛋白Fc的CH3片段(5′PCR引物序列AACCCCTCGAGGGCAGCCCCGAGAACCAC(SEQ ID NO：5)，3′PCR引物序列AACCCTCTAGATCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID NO：6))。用限制性内切酶XhoI/XbaI将CH3片段克隆入pcDNA3.1载体内相应的位点内，使之与P53串联连接。

用PCR方法合成白喉毒素的部分DNA序列(可从基因库检索其全长序列A04646)(SEQ ID NO：14)(5′PCR引物序列为AACCCGGTACCAACTTTTCTTCGTACCACG(SEQ ID NO：15)，3′PCR引物序列为AACCCGGTACCACTATAAAACCCTTTCCAA(SEQ ID NO：16))。利用限制性内切酶Kpn I将毒素序列串联连接于P53的前端，排列顺序为毒素-P53-CH3。

Western印迹法检测融合蛋白的表达，一抗为鼠抗人P53单克隆抗体，二抗为兔抗鼠IgG，试剂盒为美国vector公司产品。结果提示在大约60000分子量处可测出融合蛋白。

如下所述检测本实施例制得的融合蛋白功能。用2毫克纯化的融合蛋白免疫C57/BL6小鼠，每周一次共三次，取小鼠脾细胞1×10⁷以20∶1的比例与照射过(8000钴源拉得)的L002细胞(人P53转基因细胞)混合培养5天，再以不同效靶比的浓度与野生型L002混合培养测定脾细胞对L002的杀伤活性。结果发现，以1∶20效靶比在四小时内可杀灭95％的L002细胞，比未加入毒素的P53-CH3疫苗高约20％。

实施例4：Her2/neu肿瘤抗原疫苗

Her2/neu全序列可从基因库(M11730)检索获得。含有该基因的质粒可从美国ATCC获得。以上述获得的Her2/neu DNA为模板用PCR方法合成Her2/neu的部分DNA(5′PCR引物序列AACCCGGTACCAGCACCCAAGTGTGCACC(SEQ ID NO：17)，3′PCR引物序列AACCCCTCGAGTTGGTTGTGCAGGGGGCA(SEQ ID NO：18))。用限制性内切酶KpnI/XhoI将Her2/neu的部分DNA克隆入pcDNA3.1载体(购自Invitrogene公司)内的多克隆位点内。同样，用Invitrogene公司反转录试剂盒根据生产商说明书操作，从人B淋巴细胞mRNA反转录合成cDNA获得Fc段的DNA(SEQID NO：7)。

同样，以上述获得的Fc的DNA为模板用PCR方法合成免疫球蛋白Fc的片段(5′PCR引物序列AACCCCTCGAGGCAGAGCCCAAATCTTGTGA(SEQ ID NO：8)，3′引物序列AACCCTCTAGATCATTTACCCGGAGACAG(SEQ ID NO：9))。用限制性内切酶XhoI/XbaI将Fc段克隆入pcDNA3.1载体内相应的位点内，使之与Her2/neu串联连接。

用PCR方法合成假单胞菌毒素的部分DNA序列GCCGCCGGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCAC(SEQ ID NO：19)(其全长序列可从基因库检索到M23348)(5′PCR引物序列为AACCCGGTACCGCCGCCGGTGAATGCGCG(SEQ ID NO：20)，3′PCR引物序列为AACCCGGTACCGTGCGCCTGGAGCAGCCG(SEQ ID NO：21))。用限制性内切酶KpnI将毒素序列串联连接于P53的前端，排列顺序为毒素-Her2/neu-Fc。

Western印迹法检测融合蛋白的表达，一抗为鼠抗人Her2/neu单克隆抗体，二抗为兔抗鼠IgG，试剂盒为美国vector公司产品。结果提示在大约66000分子量处可测出该融合蛋白。

用人Her2/neu转基因的小鼠肿瘤细胞接种于C57/BL小鼠，七天后，皮下注射纯化的融合蛋白2mg，每三天一次，共五次。Her2/neu-Fc与毒素-Her2/neu-Fc均有明显的抗肿瘤作用，而以毒素-Her2/neu-Fc融合蛋白最明显，二十天后，可清除所有肿瘤。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

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序列表

<110>李进

<120>新的肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物

<130>025214

<160>21

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>106

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

1 5 10 15

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

20 25 30

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

35 40 45

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

50 55 60

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

65 70 75 80

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

85 90 95

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>2

<211>321

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 60

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 120

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 180

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 240

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 300

tccctgtccc cgggtaaatga 321

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

aacccggtac cacaggttct ggtcatgcaa gc 32

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

aacccctcga ggggggcggt ggagcccggg gcc 33

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

aacccctcga gggcagcccc gagaaccac 29

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

aaccctctag atcatttacc cggggacag 29

<210>7

<211>705

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

gcagagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 60

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 120

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 180

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 240

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 300

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 360

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 705

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

tacctttcgg gagcgaacct caacctctcc 30

<210>9

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

aacccggtac catgtacctt tcgggagcga acctcaacct ctccgcagag cccaaatctt 60

gtga 64

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

aaccctctag attatcattt acccggaga 29

<210>11

<211>393

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln

1 5 10 15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu

20 25 30

Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp

35 40 45

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro

50 55 60

Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser

85 90 95

Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly

100 105 110

Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro

115 120 125

Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln

130 135 140

Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys

165 170 175

Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln

180 185 190

His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp

195 200 205

Arg Ash Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu

210 215 220

Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser

225 230 235 240

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr

245 250 255

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val

260 265 270

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

275 280 285

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr

290 295 300

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys

305 310 315 320

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

325 330 335

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

340 345 350

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His

355 360 365

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met

370 375 380

Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

385 390

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

aacccggtac catggaggag ccgcagtcag at 32

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

aacccctcga ggtctgagtc aggcccttc 29

<210>14

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的DNA

<400>14

aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 60

caaaagccaa aatctggtac acaacgaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 120

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

aacccggtac caactttt cttcgtaccacg 30

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

aacccggtac cactataaaa cccttt ccaa 30

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

aacccggtac cagcacccaa gtgtgcacc 29

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

aacccctcga gttggttgtg cagggggca 29

<210>19

<211>156

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的DNA

<400>19

gccgccggtg aatgcgcggg cccggcggac agcggcgacg ccctgctgga gcgcaactat 60

cccactggcg cggagttcct cggcgacggc ggcgacgtca gcttcagcac ccgcggcacg 120

cagaactgga cggtggagcg gctgctccag gcgcac 156

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

aacccggtac cgccgccggtgaa tgcgcg 29

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>21

aacccggtac cgtgcgcctg gagcagccg 29

Claims

1.一种分离的肿瘤抗原疫苗，其特征在于，它由(a)来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列和(b)免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列组成，上述两个序列相互连接。

2.根据权利要求1所述的肿瘤抗原疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原选自707-AP、AFP、ART-4、BAGE B、β-catenin/m、bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、ETS、G250、GAGE、GnT-V、GP100、HAGE、HER-2/NEU、HLA-A*0201-R170I、HPV-E6、HPV-E7、EBNA、HSP70-2M、HST-2、hTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、GDP-Lfucose、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、Myosin/m、MUC1、MUM-1，-2，-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190、P53、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RAS、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2、和WT1。

3.一种分离的肿瘤抗原疫苗，其特征在于，它由(a)来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列、(b)免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列和(c)毒素片段组成，其中来自肿瘤抗原的7个或7个以上氨基酸的序列与免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列相互连接。

4.根据权利要求3所述的肿瘤抗原疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原选自707-AP、AFP、ART-4、BAGE B、β-catenin/m、bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、ETS、G250、GAGE、GnT-V、GP100、HAGE、HER-2/NEU、HLA-A*0201-R170I、HPV-E6、HPV-E7、EBNA、HSP70-2M、HST-2、hTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、GDP-Lfucose、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、Myosin/m、MUC1、MUM-1，-2，-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190、P53、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RAS、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2、和WT1。

5.根据权利要求3所述的肿瘤抗原疫苗，其特征在于，所述毒素片段是选自白喉菌毒素、百日咳菌毒素、假单胞菌毒素、炭疽菌毒素和破伤风毒素的毒素片段。

6.一种DNA分子，其特征在于，它含有编码权利要求1或3所述的肿瘤抗原疫苗的核苷酸序列。

7.一种疫苗组合物，它含有药效上有效量的权利要求1或3所述的肿瘤抗原疫苗和药学上可接受的载体。

8.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的DNA分子。

9.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求8所述的表达载体转化。

10.一种制备权利要求1或3所述的肿瘤抗原疫苗的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有编码权利要求1或3所述的肿瘤抗原疫苗的核苷酸序列以及与该核苷酸序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；

d)分离纯化获得所表达出的肿瘤抗原疫苗。