CN1356341A - 抗独特型微抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于人源化基因工程抗体领域,涉及一种人源化的抗独特型微抗体,包括抗独特型抗体的轻链可变区,重链可变区,免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区,其特征是:抗独特型抗体的轻链可变区和重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区,分为(VL+VH)型和(VH+VL)型;中等分子量,既保持了一定的穿透力,又延长了在体内的半衰期;融合了人免疫球蛋白分子,降低了鼠源性,进一步人源化;其为双价二聚体,结构稳定,模拟抗原的能力增强,增加了免疫原性;不需要免疫佐剂就可引起足够强的免疫反应。该人源化的抗独特型微抗体可作为肿瘤抗原或肿瘤疫苗广泛应用于肿瘤的诊断、治疗或预防。

Description

抗独特型微抗体及其制备方法和应用

技术领域：本发明属于人源化基因工程抗体领域

背景技术：恶性肿瘤是危及人类生命的主要因素之一。近十年来常规治疗手段(手术、化疗和放疗)虽不断改进，但多数病人最终还是出现复发与耐药，对此，临床医师常常束手无策。

卵巢癌发病率在妇科恶性肿瘤中占第二位，而死亡率居首位。其起病隐匿，初诊时约70～80％已属晚期(III～IV期)，5年生存率仅30％左右。常规治疗方法难以治愈；即使暂时缓解，亦常在2～3年后复发；反复手术和化疗严重影响患者生活质量。因此，迫切需要寻找新的治疗手段，提高卵巢癌的生存率，改善病人的生活质量。

随着生物学技术和免疫学技术的发展，一种有效的生物治疗方法是目前解决恶性肿瘤治疗的重要途径之一。

目前，已广泛利用基因工程抗体技术研制和开发用于肿瘤检测、治疗的抗体。在人体内，完整的抗体由四条链组成，两条轻链和两条重链组成，见图4。单链抗体scFv(single chain Fv)，见图3。大多数单克隆抗体均为鼠源性，作为异源性蛋白，可在人体内诱发免疫反应而限制了其在人体内的应用。因此，从80年代中期人们就开始研究用基因工程的方法对鼠单抗进行改造或人源化。其中小分子抗体是重要的方法之一。由于小分子抗体具有分子量小，穿透性强，抗原性低，可在原核系统表达，以及易于在基因水平上进行操作等优点而倍受重视。小分子抗体种类繁多，如Fab段，Fv段，ScFv，DsFv，以及diabody和minibody等。研究最多的是单链抗体(ScFv)，而后三者均是在ScFv的基础上发展出来的性能更为优越的小分子抗体。1990年Gillies和Wesolowski证实了抗体的CH2区删除后仍然保留其抗原的结合功能。并且能够形成二聚体。在体内具有抗体的诊断和治疗的作用。1993年，意大利学者Pessi首先在其文章中使用了微抗体(minibody)一词，来命名一种人工合成的仅有61个残基，但又具有结合金属活性的抗体。1996年Shi-zhen Hu等报道了一种新的基因工程抗CEA小分子抗体(VL-VH-CH3)，并将其也称为minibody。有作者在荷瘤小鼠比较完整Ig，F(ab’)₂，ScFv，diabody，和minibody的免疫显像效果和治疗效果，结果发现minibody和diabody的显像效果最好，而在治疗效果中以完整Ig和minibody为佳。

但上述还属于肿瘤抗体范畴，只能作为肿瘤抗体用于肿瘤的检测和治疗，而不能作为肿瘤抗原或肿瘤疫苗用于肿瘤的诊断、治疗和预防。

利用基因工程抗体技术研制和开发具有模拟卵巢癌抗原作用的抗独特型疫苗，配合手术和化疗治疗晚期卵巢癌，可杀灭和/或控制经手术和化疗后残余的微小癌灶，提高治愈率，推迟或减少复发，延长患者的生存时间，同时提高患者的生存质量。

根据免疫网络学说(获1976年诺贝尔医学奖)，抗独特型抗体(anti-Id或Ab2)中的Ab2β具有模拟原始抗原的作用。对Ab2β模拟抗原的机制研究表明，Ab2β可以通过模拟抗原的序列或结构，激活特异的细胞克隆，从而扩大对特定抗原的体液免疫反应。此外，机体还可将Ab2β以抗独特型肽的形式提呈给T细胞，使CD₄ ⁺T细胞大量增殖，参与细胞免疫，有实验表明此种反应有可能不受MHC限制。因此Ab2β不仅具有模拟抗原的作用，同时又是重要的免疫调节因子，参与免疫反应的调节。由于目前已发现的肿瘤抗原极少，且难以大量制备，纯化，因而利用Ab2β的特性制备肿瘤疫苗倍受重视，称为“抗独特型疫苗”。目前国外已制备了能模拟结肠癌，恶性黑色素瘤，淋巴瘤，肾癌及卵巢癌等多种肿瘤相关抗原的抗独特型抗体，部分已进入临床I，II期研究，用来治疗一些晚期肿瘤病人，取得了一定疗效。Wagner等用抗独特型抗体ACA125作为疫苗治疗了16例晚期或复发的上皮性卵巢癌。这些患者接受了3-9次的ACA125免疫治疗，其中9例患者诱导产生了Ab3和特异性的细胞免疫反应，3例患者IFN-γ升高。这些患者的平均无进展生存期为11个月，而Ab3阴性组为8个月。Reinartz等用ACA125对45例晚期或复发的卵巢癌患者进行主动免疫治疗，患者外周血T淋巴细胞内IFN-r，IL-2，IL-4增加。国内亦有制备鼻咽癌抗独特型疫苗，并用于临床治疗晚期鼻咽癌的报道。

但以下原因限制了肿瘤抗独特型疫苗的临床应用：1)一般肿瘤抗独特型抗体为鼠源性，人体内应用可产生抗体反应，使其灭活或排出体外，难以发挥作用；2)缺乏有效并适合于人体应用的免疫佐剂，难以引起足够强的免疫反应。

目前关于微抗体的制备国内外均仅见个别报道，抗独特型微抗体尚未见报道。

发明内容：

发明目的：本发明的目的是提供一种抗独特型微抗体，使其人源化，能够降低鼠源性，增加免疫原性。

本发明的目的还在于提供一种人源化的卵巢癌抗独特型微抗体，可诱导产生特异性抗卵巢癌体液免疫和细胞免疫反应，作为抗原或疫苗用于卵巢癌的诊断、治疗或预防。

本发明的目的还在于提供一种制备上述抗独特型微抗体的方法。

技术方案：

本发明的抗独特型微抗体，包括抗独特型抗体的轻链可变区，重链可变区，免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区，抗独特型抗体的轻链可变区和重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区，分为(VL+VH)型和(VH+VL)型。

所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的轻链可变区连接重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区、免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VL+VH+Hinge+CH3。

所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的轻链可变区连接重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区、氨基酸连接和CH3，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VL+VH+Hinge+氨基酸连接+CH3。

所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，可以包括两个单链结构，其第一个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VL+VH+Hinge+CH3；第二个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VL+VH+Hinge+CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，可以包括两个单链结构，其第一个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的重链可变区连接轻链可变区，融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VH+VL+Hinge+CH3。

所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的重链可变区连接轻链可变区，融合免疫球蛋白分子的铰链区、氨基酸连接和CH3，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区、氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VH+VL+Hinge+氨基酸连接+CH3。

所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，可以包括两个单链结构，其第一个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，可以包括两个单链结构，其第一个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

本发明所述氨基酸连接由甘氨酸和丝氨酸构成。

本发明所述抗独特型抗体为卵巢癌抗独特型抗体6B11，免疫球蛋白分子为人IgG。

本发明所述抗独特型抗体也可为卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFV，免疫球蛋白分子为人IgG。

本发明的制备抗独特型微抗体的方法，其步骤包括

1)构建抗独特型微抗体

提供一个含有抗独特型抗体的重链和轻链可变区的单链抗体；

融合上述单链抗体和免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区；

2)产生抗独特型微抗体

用含有抗独特型微抗体基因的核酸序列的表达载体转化宿主细胞；

培养转化的宿主细胞，其中可在上述宿主细胞表达抗独特型微抗体的融合基因。

上述抗独特型抗体卵巢为癌抗独特型抗体6B11，免疫球蛋白分子为人IgG。

上述抗独特型抗体也可为卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFV。

所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

本发明的抗独特型微抗体可作为肿瘤抗原或肿瘤疫苗用于肿瘤的诊断、治疗或预防。

发明的积极效果：

10年前，本发明发明人用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB/c小鼠制备了抗卵巢癌单克隆抗体COC166-9，免疫组化研究表明约80％卵巢癌表达OC166-9抗原。随后在应用单抗对卵巢癌患者进行放射免疫显像(RII)时发现，体内注射过单抗行RII患者的三年生存率比未行RII患者有明显的提高，分别为63.5％和25％。推测生存率的差异与Ab2β产生相关。用COC166-9免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备出一株Ab2β型抗独特型抗体6B11，并证实其可模拟卵巢癌相关抗原OC166-9。动物体内外实验证实，6B11可诱导产生特异性抗卵巢癌体液免疫和细胞免疫反应，可作为疫苗用于卵巢癌的治疗。

本发明应用基因工程抗体技术克隆并高效表达出6B11的单链可变区基因(ScFv)(检索EMBL Gene Bank，证实为国际上新发现的基因序列；在-NationalCenter for Biotechnology Information的gene bank上的登录号为VH：D85524、VL：D85749)。分子量仅为完整抗体的1/6，使其小型化，以减少体内抗鼠抗体反应。DNA序列分析表明该抗体轻、重链可变区基因均符合小鼠IgG特性。

然后应用DNA重组技术构建6B11ScFv和人GM-CSF融合蛋白基因(6B11GM)，并获得高效表达(占菌体蛋白的30％)。实验证实6B11GM融合蛋白既具有6B11模拟卵巢癌抗原的免疫活性，又具有支持人GM-CSF依赖细胞株生长的功能。体外实验证实6B11GM融合蛋白能够诱导抗原特异性的细胞免疫反应。动物体内免疫时，不用佐剂就可诱导出有效的免疫反应。

本发明为双价的抗独特型微抗体(anti-idiotype minibody)，见图1、图2，进一步人源化，增加6B11scFv的免疫原性，提高分子量，降低鼠源性。

本发明的优点如下：1.本发明抗独特型微抗体为中等分子量，与小分子单链抗体ScFv相比，增大

了其分子量，既保持了一定的穿透力，又延长了在体内的半衰期；2.本发明的抗独特型微抗体融合了人免疫球蛋白分子，降低了鼠源性，进一

步人源化；3.本发明的抗独特型微抗体为双价二聚体，结构稳定，模拟抗原的能力增强，

增加了免疫原性；4.本发明的抗独特型微抗体不需要免疫佐剂就可引起足够强的免疫反应。

附图说明：

图1本发明(VH-VL)型抗独特型抗体结构示意图

图2本发明(VL-VH)型抗独特型抗体结构示意图

图3单链抗体scFv结构示意图

图4完整人体抗体结构示意图

图5原核表达载体pET30a6B11VHVLhC微抗体构建技术路线图

图6原核表达载体pET306B11VLVHhC微抗体构建技术路线图

实施方案：

实施例1(VH+VL+Hinge+CH3)型抗独特型微抗体制备(如基因序列表四所示)

技术路线如图5所示一、重叠PCR扩增人IgG1hinge+CH3 regionPCR引物设计及铰链区加CH3区基因的扩增根据铰链区加CH3区基因序列(如基因序列表一所示)设计5’和3’三对引物。在5’引物5’端加上BanH I酶切位点；在铰链区及CH3区的连接处加上XhoI酶切位点；在3’引物的5’端加上EcoRI酶切位点。引物：F1CGGGATCCGAGTCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCACTCGAGGGGCAGCCCCGAGF2ACTCGAGGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACF3GAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAR1CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGGTGCAGAGCCTCATGCATCACGGAGCR2GCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAR3GCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCAGCTCATCCC二、重叠PCR扩增人IgG1铰链区和CH3区的融合基因的条件1、链伸长反应F2 R3    Frag.I-(1)SolutionF4 R1    Frag.II-(1)Solution变性温度94℃    变性时间    5分钟  退火温度55℃    退火时间    5分钟延伸温度72℃    延伸时间    5分钟2、PCR反应(1)第一步PCR反应F1、R2、Frag.I-(1)Solution    Frag.I-(2)SolutionF3、R1、Frag.II-(1)Solution   Frag.II-(2)Solution(2)第二步PCR反应F1、R1、Frag.I-(2)Solution、Frag.II-(2)Solution得到PCR Frag.

两步PCR的反应条件均为：变性温度94℃    变性时间    30秒退火温度55℃    退火时间    30秒延伸温度72℃    延伸时间    30秒循环数30PCR产物经BamH I、EcoR I酶切分别定向克隆到pUC18中，挑选两个片段大小相符的克隆测序。三、表达载体的构建

对载体pET30a(+)6B11mGM用BamH I、EcoR I酶切回收大片段6B11VH-VL(如

基因序列表二)，测序正确的pUC18hC同样用BamH I、EcoR I酶切回收小片段，

然后通过T4DNA连接酶构建成所要得重组表达载体。四、诱导表达

重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆。分别不同浓度IPTG不同诱导时间37℃诱导表达，得到的包涵体进行裂解复性后经纯化得到目的蛋白。五、活性的测定1、Western Blot：主要步骤为SDS-PAGE，转膜及免疫杂交。

(1)SDS-PAGE分离样品，溴酚蓝接近凝胶底边时停止电泳。

(2)电转移法转膜：取出凝胶，修剪胶块，切10张与凝胶同

样大小的滤纸及硝酸纤维素膜(NC)于电转移缓冲液中浸泡5min；依次将5张滤纸、凝胶、NC及5张滤纸精确对齐，玻璃棒排尽气泡，凝胶置于阴极一侧；0.65mA/cm2电转移2-3小时；转移完毕后用丽春红染色，观察转移效果，标出分子量标准的位置，然后进行杂交。(3)免疫杂交：用5％脱脂奶粉在室温下缓慢摇动封闭2小时后，依次用双蒸水、PBS、PBS-T，每次10分；加稀释COC166-9(1∶10)37℃摇床上温育1小时后，4℃过夜后依次用漂洗液II、PBS-T洗三遍，每次10min；加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，37℃摇床上温育1小时，依次漂洗液II、PBS-T和PBS洗，每次10min；加DAB显色。2.ELISA检测纯化微抗体的活性(1)直接ELISA法：包被不同浓度纯化抗独特型微抗体的蛋白及阳性(卵巢浆液性囊腺癌抗原OC166-9)与阴性对照，100ul/孔，4℃过夜。PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃温育1小时，弃孔内液，PBS-T洗三次后加酶标(HRP)COC166-9(1∶1000)，100ul/孔，37℃反应2小时，PBS-T洗三次，每次三分钟，OPD显色，2M H₂SO₄终止反应，测OD₄₉₀值。(2)ELISA竞争抑制法：包被卵巢癌抗原OC166-9(2ug/ml)，100ul/孔，4℃过夜，PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃封闭1小时后PBS-T洗三次，加入不同稀释度纯化表达蛋白与稀释HRP-COC166-9(1∶1000)混合液(预先在室温下反应30-40分钟)，以只加COC166-9孔为阳性孔，37℃反应2小时，PBS-T洗三次，每次三分钟，OPD显色，测OD₄₉₀值，计算抑制率，作竞争抑制曲线。同时检测6B11单克隆抗体，将其与6B11微抗体进行比较。实施例2(VL+VH+Hinge+CH3)型抗独特型微抗体的制备(如基因序列表五)技术路线如图6所示一、重叠PCR扩增卵巢癌抗独特型单链抗体6B11VL-VH(如基因序列表三所示)卵巢癌抗独特型单链抗体6B11VL-VH基因的扩增重叠PCR引物(使6B11scFv的轻重链颠倒)F1CGGAATTCCCATGGGAGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGAF2AAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGF3TACATTGGRACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACATAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAF4CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGTCAAACTGCAGGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGF5GGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGCTTTCACTGCACACTTATGGTATAGGAGTAF6ACACTTATGGTATAGGAGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACTTTTGGTGGAATR1CGGGATCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCCCAGACATCGAAGTACCACGCTATR2ACATCGAAGTACCACGCTATTTTCGTAGTAATAAGGGCTATTCGAGCACAGTAGTATGTGGCAGTATCTGR3GTAGTATGTGGCAGTATCTGCAGTGTCCACACTGGCGATGTTGAGGAATACCTGGTTGTTGGAGGCGTCCTTGGAGACAGR4GGAGGCGTCCTTGGAGACAGTGAGCCGGCTCTTCAGGGCTGTGTTATAGTACTTATTATTATTCCACCAAATGTGTGCCAR5GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAAATR6TCCGAACGTGTACGGAAAATGTGTACTCTGAGAGCAGAAATAAACTCCCAGATCATCAGCCTCCACTCTGCTGATCTTGAR7CTCCACTCTGCTGATCTTGAGTGTGAAATCTGTCCCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCCAGAAAATCGGT扩增的片段为780bp。二、重叠PCR扩增人6B11VLVH条件1、链伸长反应F3 R7                    Frag.I-(1)SolutionF6 R4                    Frag.II-(1)Solution变性温度94℃             变性时间    5分钟退火温度55℃             退火时间    5分钟延伸温度72℃             延伸时间    5分钟

2、PCR反应(1)第一步PCR反应F2、R6、Frag.I-(1)Solution                  Frag.I-(2)SolutionF5、R3、Frag.II-(1)Solution                 Frag.II-(2)Solution(2)第二步PCR反应F2、R5、Frag.I-(2)Solution                  Frag.I-(3)SolutionF4、R2、Frag.II-(2)Solution                 Frag.II-(3)Solution(3)第三步PCR反应F1、R1、Frag.I-(3)Solution、Frag.II-(3)Solution得到PCR Frag.变性温度94℃                    变性时间    30秒退火温度55℃                    退火时间    30秒延伸温度72℃                    延伸时间    30秒循环数30PCR产物经Noc I、BamH I酶切分别定向克隆到pUC18中，挑选两个片段大小相符的克隆测序。三、表达载体的构建对载体pET30a(+)6B11VHVLhC用Noc I、BamH酶切回收大片段，测序正确的pUC186B11scFv(VL-VH)同样用Noc I、BamH酶切回收小片段，然后通过T4DNA连接酶构建成所要得重组表达载体。四、诱导表达重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆。分别不同浓度IPTG不同诱导时间37℃诱导表达得到的包涵体进行裂解复性后经纯化得到目的蛋白。五、活性的测定1、Western Blot：主要步骤为SDS-PAGE，转膜及免疫杂交。(1)SDS-PAGE分离样品，溴酚蓝接近凝胶底边时停止电泳。(2)电转移法转膜：取出凝胶，修剪胶块，切10张与凝胶同样大小的滤纸及硝酸纤维素膜(NC)于电转移缓冲液中浸泡5min；依次将5张滤纸、凝胶、NC及5张滤纸精确对齐，玻璃棒排尽气泡，凝胶置于阴极一侧；0.65mA/cm2电转移2-3小时；转移完毕后用丽春红染色，观察转移效果，标出分子量标准的位置，然后进行杂交。(3)免疫杂交：用5％脱脂奶粉在室温下缓慢摇动封闭2小时后，依次用双蒸水、PBS、PBS-T，每次10分；加稀释COC166-9(1∶10)37℃摇床上温育1小时后，4℃过夜后依次用漂洗液II、PBS-T洗三遍，每次10min；加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，37℃摇床上温育1小时，依次漂洗液II、PBS-T和PBS洗，每次10min；加DAB显色。2.ELISA检测纯化微抗体的活性(1)直接ELISA法：包被不同浓度纯化抗独特型微抗体的蛋白及阳性(卵巢浆液性囊腺癌抗原OC166-9)与阴性对照，100ul/孔，4℃过夜。PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃温育1小时，弃孔内液，PBS-T洗三次后加酶标(HRP)COC166-9(1∶1000)，100ul/孔，37℃反应2小时，PBS-T洗三次，每次三分钟，OPD显色，2M H₂SO₄终止反应，测OD₄₉₀值。(2)ELISA竞争抑制法：包被卵巢癌抗原OC166-9(2ug/ml)，100ul/孔，4℃过夜，PBS-T洗三次，加含1％BSA的PBS 100ul/孔，37℃封闭1小时后PBS-T洗三次，加入不同稀释度纯化表达蛋白与稀释HRP-COC166-9(1∶1000)混合液(预先在室温下反应30-40分钟)，以只加COC166-9孔为阳性孔，37℃反应2小时，PBS-T洗三次，每次三分钟，OPD显色，测OD₄₉₀值，计算抑制率，作竞争抑制曲线。同时检测6B11单克隆抗体，将其与6B11微抗体进行比较。基因序列表一(人IgG1 hinge+CH3基因序列)gga tcc gag tcc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ctc gag ggg cag ccc cgagaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgcctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aactac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gacaag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tacacg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga gaa ttcG S ESKSCDKTHTCPPCPLEGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.EF基因序列表二(6B11VHVL基因序列)atg gga cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg acttgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gta ggc tgg att cgt cag cct tca ggg aagggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aag tac tat aac aca gcc ctg aag agc cggctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctc aac atc gcc agt gtg gac act gca gat actgcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaa ata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caaggc acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcggac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc agatct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tctcca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tcaggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct cagagt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cggMGQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLHTYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKR基因序列表三(6B11VLVH基因序列)atg gga gac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atctct tgc aga tct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag ccaggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggcagt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgctct cag agt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg ggt gga ggcggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg atattg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gtaggc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aagtac tat aac aca gcc ctg aag agc cgg ctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctcaac atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaaata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggc acc acg gtc acc gtc tcc tcaMGDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLHTYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWY FDVWGQGTTVTVSS基因序列表四(6B11VHVLhC基因序列)atg gga cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg acttgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gta ggc tgg att cgt cag cct tca ggg aagggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aag tac tat aac aca gcc ctg aag agc cggctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctc aac atc gcc agt gtg gac act gca gat actgcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaa ata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caaggc acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcggac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc agatct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tctcca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tcaggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct cagagt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg gga tcc gag tcc aaatct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ctc gag ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tacacc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttctat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cctccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cagcag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctctcc ctg tct ccg ggt aaa tga gaa ttcMGQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLHTYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKRG S ESKSCDKTHTCPPCPLEGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.EF基因序列表五(6B11VLVHhC基因序列)atg gga gac atc gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atctct tgc aga tct agt cag aac ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag ccaggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac ata gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggcagt gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gat gat ctg gga gtt tat ttc tgctct cag agt aca cat ttt ccg tac acg ttc gga ggg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg ggt gga ggcggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg cag gtc aaa ctg cag gag tct ggc cct ggg atattg cag ccc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ctt tca ctg cac act tat ggt ata gga gtaggc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tgg tgg aat aat aat aagtac tat aac aca gcc ctg aag agc cgg ctc act gtc tcc aag gac gcc tcc aac aac cag gta ttc ctcaac atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac tgt gct cga ata gcc ctt att act acg aaaata gcg tgg tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggc acc acg gtc acc gtc tcc tca gga tcc gag tcc aaatct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ctc gag ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tacacc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttctat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cctccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cagcag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctctcc ctg tct ccg ggt aaa tga gaa ttcMGDIELTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYIVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEADDLGVYFCSQSTHFPYTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVKLQESGPGILQPSQTLSLTCSFSGLSLH TYGIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNNNKYYNTALKSRLTVSKDASNNQVFLNIASVDTADTATYYCARIALITTKIAWY FDVWGQGTTVTVSSG S ESKSCDKTHTCPPCPLEGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.EF

Claims (17)

1.一种抗独特型微抗体，包括抗独特型抗体的轻链可变区，重链可变区，免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区，其特征抗独特型抗体的轻链可变区和重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区，分为(VL+VH)型和(VH+VL)型。

2.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的轻链可变区连接重链可变区，融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区、免疫球蛋白分子的亚单位CH3。

3.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的轻链可变区连接重链可变区，融合免疫球蛋白分子的铰链区、氨基酸连接和CH3，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3，即VL+VH+Hinge+氨基酸连接+CH3。

4.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VL+VH)型抗独特型微抗体包括两个单链结构，其第一个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

5.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VL+VH)型抗独特型微抗体，可以包括两个单链结构，其第一个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由轻链可变区连接重链可变区，其序列为，抗独特型抗体轻链可变区、重链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

6.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的重链可变区连接轻链可变区，融合免疫球蛋白分子的铰链区和CH3，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3。

7.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，由抗独特型抗体的重链可变区连接轻链可变区，融合免疫球蛋白分子的铰链区、氨基酸连接和CH3，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区、免疫球蛋白分子的铰链区、氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3。

8.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，包括两个单链结构，其第一个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

9.如权利要求1所述的抗独特型微抗体，其特征在于所述(VH+VL)型抗独特型微抗体，包括两个单链结构，其第一个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第二个单链结构由重链可变区连接轻链可变区，其序列为，抗独特型抗体重链可变区、轻链可变区融合免疫球蛋白分子的铰链区，氨基酸连接和免疫球蛋白分子的亚单位CH3；第一条链和第二条链由铰链区的二硫键相连接。

10.如权利要求1-9任一所述之抗独特型微抗体，其特征在于所述氨基酸连接由甘氨酸和丝氨酸构成。

11.如权利要求1-9任一所述之抗独特型微抗体，其特征在于所述抗独特型抗体为卵巢癌抗独特型抗体6B11，免疫球蛋白分子为人IgG。

12.如权利要求1-9任一所述之抗独特型微抗体，其特征在于所述抗独特型抗体也可为卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFV，免疫球蛋白分子为人IgG。

13.一种制备权利要求1所述抗独特型微抗体的方法，其步骤包括

1)构建抗独特型微抗体

提供一个含有抗独特型抗体的重链和轻链可变区的单链抗体；

融合上述单链抗体和免疫球蛋白分子的铰链区和CH3区；

2)产生抗独特型微抗体

用含抗独特型微抗体基因的核酸序列的表达载体转化宿主细胞；

培养转化的宿主细胞，其中可在上述宿主细胞表达抗独特型微抗体的融合基因。

14.如权利要求13所述的制备抗独特型微抗体的方法，其特征在于所述抗独特型抗体为卵巢癌抗独特型抗体6B11，免疫球蛋白分子为人IgG。

15.如权利要求13所述的制备抗独特型微抗体的方法，其特征在于上述抗独特型抗体也可为卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFV。

16.如权利要求13所述的制备抗独特型微抗体的方法，其特征在于所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

17.一种如权利要求1所述抗独特型微抗体的应用，其特征在于可作为肿瘤抗原或肿瘤疫苗用于肿瘤的诊断、治疗或预防。

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