KR20210082219A - 항-pd-l1/vegf 이중 기능 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-PD-L1/VEGF 이중 특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로, 본 발명은 (a) 항-PD-L1 항체 또는 요소; 및 (b) 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소와 연결되는 항-VEGF 항체 또는 요소를 포함하는 이중 기능 항체를 제공한다. 본 발명의 이중 기능 항체는 VEGF 및 PD-L1에 동시에 결합되어, VEGF 및 PD-L1에 양성인 종양 세포(특히 악성 종양 세포)에 치료 효과를 발휘할 수 있다.

Description

항-PD-L1/VEGF 이중 기능 항체 및 이의 용도
본 발명은 종양 면역학 분야에 속하는 것으로, 구체적으로 항-PD-L1/VEGF 이중 기능 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
종양(tumour)은 새로운 생물의 세포 특성과 인체에 대한 해로움의 정도에 따라 양성 종양과 악성 종양으로 나눌 수 있으며; 그 중 악성 종양 질환은 오늘날 사회에서 인간의 건강을 위협하는 주요 질환이고 치사율이 2위를 차지하며, 일반적인 종양에는 간암, 폐암, 위암, 유방암, 방광암 등이 있다. 보고에 따르면 2018년에는 전 세계적으로 약 1,810만 건의 신규 암 발생과 960만 건의 암 사망 병례가 발생하였는데(비 흑색종 피부암 제외 후 각각 1,700만 건 및 950만 건임), 그 중 새로 증가한 1,810 만 건의 암 병례에서, 아시아가 거의 절반을 차지하고, 960만 건의 암 사망자 중 아시아는 거의 70 %를 차지한다.
악성 종양은 그 개체 차이로 인해 일반적으로 대부분의 환자에게 종합 치료를 진행하며, 즉 종합적으로 수술, 화학 치료, 방사선 치료, 면역 치료, 중의 중약 치료, 중재 치료, 마이크로파 치료 등 수단을 사용하여 치유율을 크게 높이고, 환자의 생활 품질을 개선한다. 그 중 면역 치료(immunotherapy)는 인체 면역 저하 또는 항진의 면역 상태에 대해, 인위적으로 강화하거나 인체의 면역 기능을 억제하여 질병 치료 목적을 달성하는 치료 방법을 의미한다. 많은 질병의 치료에 적합한 면역 치료 방법은 매우 많다. 종양 면역 치료는 인체 면역 시스템을 활성화하여, 자체 면역 기능에 의존하여 암세포와 종양 조직을 죽이는 것으로, 종양을 제어하고 제거하는 치료 방법이다. 종래의 수술, 화학 치료, 방사선 치료 및 표적 치료와 달리, 면역 치료의 표적은 종양 세포 및 조직이 아니라, 인체 자체의 면역 시스템이다. 단클론 항체 면역 체크 포인트 억제제, 치료성 항체, 암 백신, 세포 치료 및 소분자 억제제 등을 포함한다. 최근 몇년 동안, 종양 면역 치료의 희소식이 계속되고 있으며, 현재 흑색종, 비소세포성 폐암, 신장암 및 전립선암 등 고형 종양과 같은 다양한 종양 치료에서 강력한 항 종양 활성을 보여주고 있고, 복수의 종양 면역 치료 약물은 임상에 적용되도록 미국 FDA(Food and Drug Administration, FDA)의 승인을 받았다.
현재 시판되고 있는 항체 약물의 대부분은 단클론 항체로, 치료용 단클론 항체는 암, 자체 면역병, 염증 및 다른 질병을 치료하는데 사용되며, 대부분은 표적에 특이적으로 사용되고 있다. 그러나 단클론 항체 치료를 받는 환자에게 약제 내성 또는 무반응이 나타날 수 있다. 또한 일부 질병은 다양한 신호 경로, 다양한 시토카인 및 수용체 조절 메커니즘을 포함하여 체내에 여러 영향을 미치는 요인을 갖고, 단일 표적 면역 요법은 암세포를 파괴하기에 충분하지 않은 것 같다. 따라서 다양한 약물의 조합 또는 다중 특이적 항체를 사용한 다중 표적화 전략을 통해 구현해야 한다.
이중 기능 항체는 비록 항체 약물 연구 개발의 방향으로 되고 있지만, 임상전 평가 모델, 낮은 발현량, 낮은 안정성, 복잡한 공법, 품질 관리의 큰 차이 등 문제와 같은 다양한 도전에 직면하고 있어, 이중 기능 항체의 연구 개발은 줄곧 어려움이 존재하고 있다.
따라서, 본 기술분야는 특이성이 바람직하고, 치료 효과가 좋으며, 제조하기 쉬운 항 종양 이중 항체를 개발하는 것이 시급하다.
본 발명의 목적은 구조가 안정적이고, 특이성이 바람직하며, 제조하기 쉬운 항 종양 이중 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태로, 이중 기능 항체가 제공되는 바, 상기 이중 기능 항체는,
(a) 항-PD-L1 항체 또는 요소; 및
(b) 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소와 연결되는 항-VEGF 항체 또는 요소를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소와 상기 항-VEGF 항체 또는 요소는 연결 펩티드를 통해 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 연결 펩티드는 항체 불변 영역 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 요소는 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 및 이들의 조합으로부터 선택되는 상기 항-PD-L1의 영역에 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 요소는 상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역의 시작단에 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 요소는 상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역의 말단에 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소는 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 및 이들의 조합으로부터 선택되는 상기 항-VEGF 항체의 영역에 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소는 상기 항-VEGF 항체의 중쇄 가변 영역의 시작단에 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소는 상기 항-VEGF 항체의 중쇄 불변 영역의 말단에 연결된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 요소는 리간드, 수용체 또는 단백질의 세포 외 영역을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체는 나노 항체, 단일 쇄 항체, 2중가닥 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체는 동물 유래 항체(예를 들어, 마우스 유래 항체), 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 인간화 항체는 완전 인간화 항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1의 요소는 PD-L1의 수용체(예를 들어, PD-1) 또는 단백질의 세포 외 영역을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 항체는 나노 항체, 단일 쇄 항체, 2중가닥 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 항체는 동물 유래 항체(예를 들어, 마우스 유래 항체), 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 요소는 VEGF의 수용체(예를 들어, VEGFR) 또는 단백질의 세포 외 영역을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 항체 또는 요소는 1가 형태 또는 다가 형태(예를 들어, 2가 형태)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체에서 상기 항-VEGF 항체 또는 요소는 1 ~ 6개이고, 비교적 바람직하게는, 1 ~ 4개이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 호모다이머이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 N 말단에서 C 말단까지 식 I로 표시되는 구조를 갖고, PD-L1에 결합되는 동시에 VEGF에 결합되는 활성을 갖는다:
Figure pct00001
(I)
상기 식에서,
D는 각각 독립적으로 없거나 항-VEGF 항체 또는 요소이고, 하나 이상의 D는 항-VEGF 항체 또는 요소이고;
L1, L2, L3, L4, L5 및 L6은 각각 독립적으로 펩티드 결합 또는 링커 요소이고;
VL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
CL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
VH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
CH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
"~"는 이황화 결합 또는 공유 결합을 나타내고;
"-"는 펩티드 결합을 나타낸다.
다른 바람직한 예에서, 식 I의 D는 각각 독립적으로 없거나 항-VEGF 요소이고, 하나 이상의 D는 항-VEGF 요소이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 링커 요소는 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 L1, L2, L3, L4, L5 또는 L6은 각각 독립적으로 GS, GGGGS(서열번호 14), GGGGSGGGS(서열번호 15) 및 GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 16)로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 4로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 5로 표시되는 CDR3인 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고/거나;
상기 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 6으로 표시되는 CDR1', 아미노산 서열이 GIS인 CDR2', 및 서열번호 7로 표시되는 CDR3'인 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 1 또는 8로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 2 또는 9로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 요소는 혈관 내피 성장 인자 수용체 1(VEGFR1)의 제2 막외 영역 D2(VEGFR1D2)를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-VEGF 요소는 서열번호 10으로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 2중가닥 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 중쇄(H 쇄) 및 경쇄(L 쇄)를 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체의 H 쇄는 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체의 L 쇄는 서열번호 13으로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 약물 접합체 형태이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 검출 가능한 마커, 표적 마커, 약물, 독소, 시토카인, 방사성 핵종, 효소 또는 이들의 조합을 더 함유한다(바람직하게는 접합됨).
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체에는 종양 표적 마커 접합체가 접합된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 상기 이중 기능 항체의 활성 단편 및/또는 유도체를 더 포함하되, 여기서 상기 활성 단편 및/또는 상기 유도체는 상기 이중 기능 항체의 70 ~ 100 %(예를 들어, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %)의 항-PD-L1 활성과 70 ~ 100 %의 항-VEGF 활성을 보류한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체의 유도체는 본 발명의 항체와 적어도 85 %의 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체의 유도체는 본 발명의 항체가 하나 또는 복수의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환 후 적어도 85 %의 동일성을 유지하는 서열이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체의 유도체는 본 발명의 항체와 적어도 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 서열 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 치환은 보존적 치환이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이중 기능 항체는 N 말단에서 C 말단까지 식 Ia 또는 Ib로 표시되는 구조를 갖고, PD-L1에 결합되는 동시에 VEGF에 결합되는 활성을 갖는다:
Figure pct00002
(Ia);
Figure pct00003
(Ib)
상기 식에서,
D는 항-VEGF 요소이고;
L1은 없거나 링커 요소이고;
VL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
CL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
VH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
CH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
"~"는 이황화 결합을 나타내고;
"-"는 펩티드 결합을 나타낸다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VH는 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 4로 표시되는 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VL은 서열번호 6으로 표시되는 CDR1', 아미노산 서열이 GIS인 CDR2' 및 서열번호 7로 표시되는 CDR3'를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 1 또는 8로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 2 또는 9로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제2 양태로, 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공되는 바, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체를 코딩한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 이중 기능 항체 L 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 이중 기능 항체 H 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에서, L 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 H 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 비율은 1:1이다.
본 발명의 제3 양태로, 벡터가 제공되는 바, 상기 벡터는 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 벡터는 동시에 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드 중 모든 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 벡터는 각각 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드 중 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노 바이러스와 같은 포유 동물 세포 바이러스, 레트로 바이러스 또는 다른 벡터를 포함한다.
본 발명의 제4 양태로, 유전자 조작된 숙주 세포가 제공되는 바, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터 또는 게놈에 통합된 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
본 발명의 제5 양태로, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체를 제조하는 방법이 제공되는 바, 상기 방법은,
(i) 적합한 조건에서, 본 발명의 제4 양태에 따른 숙주 세포를 배양하여, 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체를 함유하는 혼합물을 획득하는 단계; 및
(ii) 단계 (i)에서 획득한 혼합물을 정제 및/또는 분리하여, 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체를 획득하는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 정제는 단백질 A 친화력 컬럼에 의해 정제 및 분리되어 타깃 항체를 획득할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 정제 및 분리된 타깃 항체의 순도는 95 %보다 크고, 96 %보다 크고, 97 %보다 크고, 98 %보다 크고, 99 %보다 크며, 바람직하게는 100 %이다.
본 발명의 제6 양태로, 약학 조성물이 제공되는 바, 상기 약학 조성물은,
(I) 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체; 및
(II) 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학 조성물에는 별도의 항 종양제가 함유된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학 조성물은 단위 투여 형태이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 종양제는 파클리탁셀(Paclitaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 액시티닙(Axitinib), 레바티닙(levatinib), 또는 펨브로리주맙(Pembrolizumab)을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항 종양제는 상기 이중 기능 항체와 독립적인 패키지 내에 별도로 존재할 수 있거나, 상기 항 종양제는 상기 이중 기능 항체와 접합될 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학 조성물의 제형은 위장 투여용 제형 또는 비경구 투여용 제형을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 비경구 투여용 제형은 정맥 주사, 정맥 내 점적 주입, 피하 주사, 국소 주사, 근육 주사, 종양 내 주사, 복강 내 주사, 두개 내 주사, 또는 강 내 주사를 포함한다.
본 발명의 제7 양태로, 면역 접합체가 제공되는 바, 상기 면역 접합체는,
(a) 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체; 및
(b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 시토카인, 방사성 핵종, 효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 접합체 일부는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 스캐닝 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소, 방사성 핵종, 바이오 독소, 시토카인(예를 들어, IL-2 등), 항체, 항체 Fc 단편, 항체 scFv 단편, 또는 금 나노 입자/나노 로드, 바이러스 입자, 리포솜, 자성 나노 입자, 전구 약물 활성화 효소(예를 들어, DT-디아퍼라아제(DT-diaphorase, DTD) 또는 비페닐 가수분해효소 유사 단백질(Biphenyl hydrolase-like protein, BPHL), 화학 치료제(예를 들어, 시스플라틴(cisplatin)) 또는 임의의 형태의 나노 입자 등으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체 일부는 상기 접합 부분과 화학 결합 또는 링커를 통해 접합된다.
본 발명의 제8 양태로, 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역 접합체의 용도가 제공되는 바, (a) 검출 시약 또는 키트를 제조하고/거나; (b) 암 또는 종양을 예방하고/거나 치료하는 약학 조성물을 제조하는데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 혈액 종양, 고형 종양 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 난소암, 결장암, 직장암, 흑색종(예를 들어, 전이성 악성 흑색종), 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 악성 혈액병, 두 경부암, 신경교종, 위암, 비인두암, 후두암, 자궁경부암, 자궁체 종양 및 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 다른 암의 예로는 골암, 췌장암, 피부암, 전립선암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 항문암, 고환암, 나팔관암, 자궁내막암, 질암, 외음암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계통암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병(급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함), 아동 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암, 중추 신경계(CNS) 종양, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 형성, 척추 종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피모양암종, 편평 세포 암종, T 세포 림프종, 석면 유발암을 포함하는 환경 유발암, 및 상기 암의 조합을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 직장암, 비소세포성 폐암, 흑색종, 방광암, 또는 이들의 조합이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 과발현 PD-L1 및/또는 VEGF의 종양이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약물 또는 제제는 PD-L1 및/또는 VEGF(양성 발현)와 관련된 질병을 예방하고/거나 치료하는 약물 또는 제제를 제조하는데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 약물 접합체(ADC) 형태이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시험 시약 또는 키트는 PD-L1 및/또는 VEGF 관련 질병을 진단하는데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시험 시약 또는 키트는 샘플 중 PD-L1 및/또는 VEGF 단백질을 검출하는데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시험 시약은 시험 조각이다.
본 발명의 제9 양태로, CAR 구축물이 제공되는 바, 상기 CAR 구축물의 항원 결합 영역은 PD-L1에 특이적으로 결합된 결합 영역 및 VEGF에 특이적으로 결합된 결합 영역을 포함하고, 상기 PD-L1에 특이적으로 결합된 결합 영역은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서,
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 4로 표시되는 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 CDR3을 포함하고;
상기 VL은 서열번호 6으로 표시되는 CDR1', 아미노산 서열이 GIS인 CDR2' 및 서열번호 7로 표시되는 CDR3'를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합된 결합 영역은 혈관 내피 성장 인자수용체 1(VEGFR1)의 제2 막외 영역 D2(VEGFR1D2)를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합된 결합 영역은 서열번호 10으로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 상기 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 서열을 더 제공한다.
본 발명은 상기 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 서열을 함유한 벡터를 더 제공한다.
본 발명의 제10 양태로, 재조합된 면역 세포가 제공되는 바, 상기 면역 세포는 본 발명의 제9 양태에 따른 외인성 CAR 구축물을 발현한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 세포는 NK 세포, T 세포, NKT 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 세포는 인간 또는 비인간 포유동물(예를 들어, 쥐)로부터 유래된다.
본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 이중 기능 항체, 본 발명의 제6 양태 따른 약학 조성물, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 면역 접합체, 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 면역 세포, 또는 이들의 조합의 안전하고 유효한 양을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 치료 방법을 더 제공한다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징 사이는 모두 서로 조합될 수 있어, 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성한다. 편폭의 제한으로 인해, 여기서 더이상 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 이중 기능 항체 900387 및 900388의 구조 그래프를 도시한다.
도 2는 이중 기능 항체 900387 및 900388의 SDS-PAGE도를 도시한다. 여기서 레인1: 900387 산화형 또는 환원형; 레인2: 900388 산화형 또는 환원형이다.
도 3은 이중 특이적 항체와 비표적 분자의 비특이적 흡착 검출 센서도를 도시한다.
도 4는 세포 밀도(A), 생존율(B), pH(C), 젖산 대사(D), 발현량(E) 및 순도(F)를 포함한 반응기 배양 결과를 도시한다. 223: 간격 공급, 33 ℃까지 냉각; 225: 간격 공급, 31 ℃까지 냉각; 매일 공급, 31 ℃까지 냉각.
도 5는 각 그룹의 동물 종양 부피(A) 및 상대적 종양 부피 변화 추세(B)를 도시한다. 참고: 도면은 각 그룹의 동물 종양 부피 평균값 ± SEM, b.i.w. 일주일 두 번; i.v. 정맥 주사를 도시한다.
도 6은 D32일에 각 그룹의 종양 무게(g)를 도시한다. 참고: 도면은 각 그룹에서 동물 체중 평균값 ± SEM, b.i.w. 일주일 두 번, i.v. 정맥 주사를 도시한다.
본 발명자는 광범위하고 심층적인 연구를 통해 예기치 않게 항-PD-L1 항체와 항-VEGF 나노 항체가 직렬로 형성된 이중 기능 항체를 얻었다. 바람직하게는, 본 발명의 이중 기능 항체는 호모다이머이다. 시험관 내 실험을 통해 본 발명의 이중 기능 항체는 PD-L1과 VEGF에 동시에 결합되어 PD-L1 양성 및/또는 VEGF 종양 세포(특히 악성 종양 세포)에 치료 효과를 발휘할 수 있으며, 따라서 본 발명의 이중 기능 항체는 우수한 치료 효과를 가진 항 종양 약물로 개발될 수 있다. 이를 바탕으로 본 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
용어
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 특정 기술 및 과학 용어가 아래에 구체적으로 정의되어 있다. 본문에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본문에 사용되는 다른 모든 기술 및 과학 용어는 모두 본 발명의 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 발명에서 사용되는 아미노산의 3개 자모 및 1개 자모 코드는 J. biol. chem, 243, p3558(1968)에 기재된 바와 같다.
본문에 사용된 용어 "투여" 및 "처리"는 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 피험자, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용하는 것을 의미한다. "투여" 및 "처리"는 치료, 약물 대사 역학, 진단, 연구 및 실험 방법을 의미할 수 있다. 세포 치료에는 시약과 세포 사이의 접촉, 시약과 유체 사이의 접촉, 유체와 세포 사이의 접촉이 포함된다. "투여" 및 "처리"는 또한 시약, 진단, 결합 조성물, 또는 다른 세포 체외 및 생체외에 의한 처리를 의미한다. "처리"는 인간, 동물 또는 피험자에 적용될 경우, 치료 처리, 예방 또는 예방성 조치, 연구 및 진단을 의미하고; 항-인간 PD-L1 항체와 인간 또는 동물, 피험자, 세포, 조직, 생리학적 구획 또는 생리학적 유체의 접촉을 포함한다.
본문에 사용된 용어 "치료"는 본 발명의 임의의 항-인간 PD-L1 항체 및 이의 조성물을 포함하는 내부 또는 외부 치료제를 하나 이상의 질병 증상을 갖는 환자에게 투여하는 것을 의미하며, 상기 치료제는 이러한 증상에 대해 치료 효과를 갖는다. 일반적으로, 환자에게 하나 이상의 질병의 증상을 완화시키는데 효과적인 치료제의 양(치료 유효량)으로 투여된다.
본문에 사용된 용어 "임의적" 또는 "임의적으로"는 후술하는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생할 필요는 없음을 의미한다. 예를 들어, "임의적으로 1 ~ 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함함"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 있을 수 있지만 반드시 있는 것은 아니며, 1개, 2개 또는 3개일 수 있다.
본 발명에서 "서열 동일성"은 적절한 교체, 삽입 또는 결실과 같은 돌연변이를 갖는 경우에 최적화로 비교하거나 비교할 때, 2개의 핵산 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 정도를 의미한다. 본 발명에 기재된 서열과 그 동일한 서열 사이의 서열 동일성은 적어도 85 %, 90 % 또는 95 %이고, 바람직하게는 적어도 95 % 일 수 있다. 비제한적인 실시예는 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %를 포함한다.
일반적으로, "항체"는 또한 "면역 글로불린"으로 지칭되기도 하고, 이는 천연 또는 통상적인 항체일 수 있으며, 그 중 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결되고 각각의 중쇄와 경쇄는 이황화 결합에 의해 연결된다. 경쇄에는 λ(l) 및 κ(k)의 두 가지 유형이 존재한다. 항체 분자의 기능 활성을 결정하는 중쇄에는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5가지 주요 유형(또는 동형)이 존재한다. 각 쇄는 상이한 서열 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)의 2개의 도메인 또는 영역을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3, CH로 통칭함)의 4 개의 도메인을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 모두 항원의 결합 인식과 특이성을 결정한다. 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 불변 영역(CH)은 항체 쇄 결합, 분비, 태반 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)의 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역 글로불린 Fab 단편의 N-말단 부분이고 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 조성된다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정 구간의 구조적 상보성에 의해 결정된다. 항체 결합 부위는 주로 고도 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)에서 유래된 잔기로 조성된다. 때로, 비 고도 가변 또는 프레임워크 영역(FR)에서 유래된 잔기는 전체 도메인 구조에 영향을 미치며, 따라서 결합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 결합 친화도 및 천연 면역 글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 특이적 아미노산 서열을 공통으로 정의하는 것을 의미한다. 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L 및 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H로 각각 지칭되는 3개의 CDR을 갖는다. 일반 항체 항원 결합 부위는 각각의 중쇄와 경쇄 v 영역에서 유래된 CDR 집합을 포함하여 6개의 CDR을 포함한다.
본문에 사용된 용어 "단일 도메인 항체", "나노 항체"는 동일한 의미를 갖고, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여 단지 하나의 중쇄 가변 영역으로만 조성된 단일 도메인 항체를 구축하는 것을 의미하며, 이는 완전한 기능을 가진 최소 항원 결합 단편이다. 일반적으로 먼저 천연적으로 결실된 경쇄와 중쇄 불변 영역1(CH1)의 항체를 얻은 후, 항체 중쇄의 가변 영역을 다시 클로닝하여, 단지 하나의 중쇄 가변 영역으로만 조성된 단일 도메인 항체를 구축한다.
본문에 사용된 용어 "가변"은 항체 중 가변 영역의 특정 부분의 서열이 다소 상이하다는 것을 의미하며, 이는 다양한 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로 지칭되는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 비교적 보존적인 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 대체적으로 -접힘 구성으로 이루어지고, 연결 링을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우 부분적 -접힘 구조를 형성할 수 있다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역을 통해 서로 밀접하게 배치되고 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No.91-3242, I권, 647-669페이지(1991) 참조바람). 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접 참여하지 않지만, 항체의 항체 의존성 세포 독소에 참여하는 것과 같은 상이한 효과 기능을 나타낸다.
본문에 사용된 용어 "프레임워크 영역"(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열, 즉 단일 종의 상이한 면역 글로불린 사이에서 비교적 보존적인 면역 글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 그러한 부분을 의미한다. 면역 글로불린의 경쇄와 중쇄는 각각 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 지칭되는 4개의 FR을 갖는다. 대응하게, 경쇄 가변 도메인은 이로 인해 (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)로 지칭되고, 중쇄 가변 도메인은 이로 인해 (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)로 나타날 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 FR은 인간 항체 FR 또는 이의 유도체이고, 상기 인간 항체 FR의 유도체는 천연적으로 존재하는 인간 항체 FR과 기본적으로 동일하며, 즉 서열 동일성은 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %에 달한다.
CDR의 아미노산 서열을 알면, 본 기술분야의 기술자는 프레임워크 영역 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및/또는 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H를 쉽게 결정할 수 있다.
본문에 사용된 용어 "인간 프레임워크 영역"은 천연적으로 존재하는 인간 항체의 프레임워크 영역과 기본적으로 동일(약 85 % 또는 더 많거나, 구체적으로 90 %, 95 %, 97 %, 99 % 또는 100 %)한 프레임워크 영역이다.
본문에 사용된 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 특정 항원에 대한, 단일 아미노산으로 조성된 항체 분자를 의미하며, 특정 방법을 통해 상기 항체를 생성해야 하는 것으로 이해되어서는 안된다. 단클론 항체는 B 세포 또는 하이브리도마의 단일 클론에 의해 생성될 수 있지만 재조합, 즉 단백질 공학에 의해 생성될 수도 있다.
본문에 사용된 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 항체 또는 항체 유사 결합 단백질에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 상기 용어는 또한 항원의 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 표적 항원은 하나 또는 복수의 에피토프를 가질 수 있다. 항체 또는 항체 유사 결합 단백질에 의해 인식되는 각 표적 항원에 대해 항체 유사 결합 단백질은 표적 항원을 인식하는 완전한 항체와 경쟁할 수 있다.
본문에 사용된 용어 "친화력"은 이론적으로 완전한 항체와 항원 사이의 균형 잡힌 결합에 의해 정의된다. 본 발명의 이중 항체의 친화력은 KD 값(해리 상수)(또는 기타 측정 방법)을 통해 평가되거나 측정될 수 있으며, 예를 들어, 바이오 레이어 간섭 기술(Bio-layer interferometry, BLI)은 FortebioRed96로 측정하여 결정한다.
본문에 사용된 용어 "링커"는 경쇄 및 중쇄의 도메인에 충분한 이동 가능성을 제공하여 이중 가변 영역 면역 글로불린의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 교환되도록 접기 위해 면역 글로불린 도메인에 삽입하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 링커는 링커 L1, L2, L3 및 L4를 의미하며, 여기서 L1 및 L4 링커는 2개의 항-VEGF 항체를 연결하고, L2는 본 발명의 이중 항-중쇄 항-VEGF 항체 이량체와 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역 VL을 연결하며, L3은 본 발명의 이중 항체 경쇄 항-VEGF 항체 이량체와 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역 CH를 연결한다.
적합한 링커의 구현예는 모노글리신(Gly) 또는 세린(Ser) 잔기를 포함하고, 링커에서 아미노산 잔기의 마커와 서열은 링커에서 구현되어야 하는 2차 구조 요소의 유형에 따라 변화된다. 바람직한 링커는 하기와 같다.
L1, L2, L3, L4, L5 또는 L6은 각각 독립적으로 GS, GGGGS(서열번호 14), GGGGSGGGS(서열번호 15) 및 GGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 16)로부터 선택된다.
항-PD-L1 항체
세포예정사 수용체-1(programmed cell death protein, PD-1)은 최근 몇 년 동안 발견된 음성 공동 자극 분자이고 CD28 면역 글로불린 슈퍼 패밀리에 속한다. PD-1은 일반적으로 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포에서 발현되며, 2개의 천연 리간드, 즉 세포예정사 리간드-1(programmed death ligand 1, PD-L1)과 PD-L2가 있으며, 모두 B7 슈퍼 패밀리에 속하고 항원제시세포에서 모두 발현되며, PD-L1은 다양한 조직에서도 발현된다. 그 중 PD-L1은 PD-1의 중요한 음성 면역 조절 인자로, B7-H1로도 지칭되고, PD-1과의 결합은 T 세포 활성화의 공동 억제 신호를 매개하며 T 세포 활성화 및 증식을 억제하고, CTLA-4의 음성 조절과 유사하게 T 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있다. 또한 연구 보고서에 따르면 종양 미세 환경은 종양 세포를 면역 세포의 파괴로부터 보호하여 종양 세포가 인식될 수 없고 면역 탈출 현상이 발생하도록 한다. 또한 종양 미세 환경은 PD-L1을 지속적으로 발현하여 종양 환자의 면역 기능을 극도로 저하시킨다.
화교 과학자 천레이핑(陳列平)의 실험실은 PD-L1이 종양 조직에서 과발현되고 CD8 T 세포에 침투하는 종양의 기능을 조절한다는 것을 처음으로 발견했다. 따라서, PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 면역 조절은 항 종양에 매우 중요한 의미를 가졌다. 최근 몇년 동안, 종양 면역 치료의 임상 연구에서 다양한 항-PD-1/PD-L1 항체가 빠르게 개발되고 있다. 현재 Pembrolizumab과 Nivolumab은 FDA의 승인을 받아 진행성 흑색종에 사용되며, 최근 Nivolumab도 미국 FDA의 승인을 받아 진행성 편평 비소세포성 폐암 치료에 사용된다. 이밖에, MPDL3280A(항-PD-L1 단일 항체), Avelumab(항-PD-L1 단일 항체) 등도 비소세포성 암종, 흑색종, 방광암 등 복수의 종양을 덮는 진행성 임상 연구에 참여하였다.
본 발명의 항-PD-L1 항체의 서열은 공지 또는 통상의 방법으로 제조되거나 선별을 통해 개발된 항체를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 선별을 통해 얻어지며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 4로 표시되는 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 CDR3을 포함하고; 상기 VL은 서열번호 6으로 표시되는 CDR1', 아미노산 서열이 GIS인 CDR2' 및 서열번호 7로 표시되는 CDR3'를 포함한다.
Figure pct00004
본 기술분야의 기술자는 또한 본 기술분야에 공지된 기술을 통해 본 발명의 항-PD-L1 항체에 대해 수정하거나 개선할 수 있으며, 예를 들어, 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 첨가, 결실 및/또는 치환하는데, 이로써 항-PD-L1의 친화력 또는 구조 안정성을 증가시키고, 일반 측정 방법을 통해 수정되거나 개선된 결과를 얻는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 1 또는 8로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다(밑줄로 라벨링된 것은 순차적으로 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열임).
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYAFTGYTIHWVKQRSGLGLEWLGWFYPGSGTLKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYLELSRLTSEDSAVYFCARHGTGTLMAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTGYTIHWVRQAPGQRLEWMGWFYPGSGTLKYSEKFQGRVTITRDKSLSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGTGTLMAMDYWGQGTLVTVSS(서열번호 8)
다른 바람직한 예에서, 상기 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 2 또는 9로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다(밑줄로 라벨링된 것은 순차적으로 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열임).
DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLANSYGNTYLSWYLHKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPPTFGGGTKLEIK(서열번호 2)
DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLANSYGNTYLSWYLHKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPPTFGQGTKLEIK(서열번호 9)
본 발명의 항-PD-L1 항체 이량체는 HEK293 세포 또는 CHO 세포에 의해 발현되어 획득할 수 있다.
본 발명의 항-PD-L1 항체는 포유 동물 PD-L1과 결합되고, 바람직하게는, 인간 PD-L1과 결합된다.
본 발명의 항-PD-L1 항체와 PD-L1의 결합 친화력은 9.40E-10 M이고, 바람직하게는, 5E-09 M보다 낮지 않다.
다른 바람직한 예에서, 본 발명의 항-PD-L1 항체는 인간화 항체이다.
항-VEGF항체
혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)는 VEGF라고도 한다. VEGF 단백질은 1989년 미국의 두 바이오텍회사의 과학자들에 의해 각각 성공적으로 정제되고 감정되었으며, 그 유전자 서열을 클로닝하고 측정하여 VPF와 VEGF가 동일한 유전자에 의해 코딩된 동일한 단백질임을 입증했다. VEGF에는 VEGF-A, -B, -C, -D 및 -E의 6가지 동형(isoform)이 있으며; 그 분자량은 35 내지 44kDa 범위에 있고, 각 동형은 3가지 "혈관 내피 성장 인자 수용체"(VEGFR-1,-2, 및 -3)의 특정 조합과 특이적으로 결합된다. 그러나, 연구 결과에 따르면, 이러한 수용체는 VEGF 패밀리 분자와의 친화력이 상이하며, 그 중 VEGFR1과 VEGF 패밀리의 친화력은 상대적으로 높다.
VEGF는 고도로 보존적인 호모다이머 당단백질이다. 분자량이 각각 24kDa인 2개의 단일 쇄는 이황화 결합으로 조성되어 이량체를 형성한다. VEGF에 의해 분해된 모노머는 비활성 상태이고 N2 글리코실의 제거는 생물학적 효과에는 영향을 미치지 않지만 세포 분비에 대해서는 역할을 일으킨다. mRNA의 상이한 전단 방법으로 인해 VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF185, VEGF206 등의 적어도 5가지 단백질 형태를 생성하며, 그 중 VEGF121, VEGF145, VEGF165는 혈관 내피 세포에 직접 작용하여 혈관 내피 세포 증식을 촉진하고, 혈관 투과성을 증가시킬 수 있는 분비형 가용성 단백질이다. 1990 년에 미국 하버드 대학의 Folkman 박사는 종양 조직 성장이 반드시 신생 혈관 생성에 의존하여 충족한 산소와 영양 물질을 제공함으로써 유지된다는 유명한 Folkman 이론을 제출하였으며, 따라서 VEGF 임상 응용의 기초로 간주된다. 특허 CN 103319610을 참조하여 발명자는 VEGFR1 제2 막외 영역 D2(Domain2)에 플랭킹 서열을 추가하면 매우 강한 VEGF 결합 활성을 갖고 있음을 발견하여 VEGFR1D2-Fc와 같은 재조합 융합 단백질 약물을 개발하였다.
본 발명의 바람직한 일 예에서, VEGFR1D2를 선택하여 항-VEGF 요소로 사용한다.
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNT(서열번호 10)
바람직하게는, 본 발명의 VEGFR1D2는 항-PD-L1 항체의 어느 말단에 연결되던지 모두 링커로 2개의 동일한 VEGFR1D2를 연결함으로써 이량체 형태로 나타난다.
이중 기능 항체(이중 특이성 항체)
이중 특이성 항체(Bispecific Antibody, bsAb)는 2가지 상이한 항원 또는 단백질을 동시에 표적으로 하여 2가지 상이한 신호 경로를 차단하고 특이성 면역 반응을 자극할 수 있는 비 천연 항체이고, 종양 면역 치료에서 그 특이성 및 이중 기능성의 역할은 점점 더 중요해지고 있고, 오늘날 전 세계적으로 항체 공학 치료 분야에서 연구 이슈로 되었다. 연구에 따르면 이중 특이성 항체는 종양 면역 치료 분야에서 주로 면역 세포에 의한 종양 살해를 매개하고; 이중 표적에 결합하고, 이중 신호 경로를 차단하며, 고유하거나 중첩되는 기능을 발휘하여 약제 내성을 효과적으로 방지할 수 있고; 강한 특이성, 표적성 및 표적 외 독성 감소의 특성을 갖고; 치료 비용을 효과적으로 감소시키는 등 장점을 가지므로(항체 서클에서 추출), 이중 특이성 항체 약물을 사용하여 종양 세포 탈출 가능성을 감소시키고 종양 세포를 제거하여 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
이중 특이성 항체는 이중 하이브리도마 세포, 화학 접합, 재조합 유전자 등 수단을 통해 제조될 수 있고, 여기서 재조합 유전자 기술은 결합 부위 및 생성량 등 분야에서 강한 유연성을 가졌다. 불완전한 통계에 따르면 현재 60가지 이상의 이중 특이성 항체가 있으며, 그 특성 및 구조 차이성에 따라, 이중 특이성 항체 구조는 주로 Fc 단편을 함유한 이중 특이성 항체(Fc 매개의 효과 기능을 가진 IgG-형 이중 특이성 항체)와 Fc 단편을 함유하지 않은 이중 특이성 항체(항원 결합 기능을 통해 작용을 발휘하는, 분자량이 작고, 면역 원성이 낮은 등 장점을 가진 비-IgG-형 이중 특이성 항체) 2가지 구조가 있다. 2014 년 12 월 03 일, 미국 FDA는 급성 림프 아구성 백혈병 치료에 사용되는 Amgen 회사가 개발한 이중 특이성 항체 Blincyto(Blinatumomab)의 출시를 승인하였다. Blinatumomab은 CD19 및 CD3 이중 특이성 항체이고 Blincyto(Blinatumomab)는 미국 FDA에서 승인한 최초의 이중 특이성 항체이다.
본문에 사용된 용어 "이중 특이성 항체", "이중 기능 항체", "본 발명의 항체", "본 발명의 이중 항체", "이중 항체", "이중 기능 융합 항체"는 서로 교환하여 사용할 수 있으며, PD-L1과 VEGF에 동시에 결합되는 항-PD-L1/VEGF 이중 특이성 항체를 의미한다.
본 발명에서, 상기 이중 기능 항체는,
(a) 항-PD-L1 항체 또는 요소; 및
(b) 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소와 연결되는 항-VEGF 항체 또는 요소를 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 이중 기능 항체는 N 말단에서 C 말단까지 식 I로 표시되는 구조를 갖고, PD-L1에 결합되는 동시에 VEGF에 결합되는 활성을 갖는다:
Figure pct00005
(I)
상기 식에서,
D는 각각 독립적으로 없거나 항-VEGF 항체 또는 요소이고, 하나 이상의 D는 항-VEGF 항체 또는 요소이고;
L1, L2, L3, L4, L5 및 L6은 각각 독립적으로 펩티드 결합 또는 링커 요소이고;
VL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
CL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
VH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
CH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
"~"는 이황화 결합 또는 공유 결합을 나타내고;
"-"는 펩티드 결합을 나타낸다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 이중 항체는 PD-L1 항체 및 VEGR1D2의 융합에 의해 형성되며, 서로 대칭되는 두 쌍의 펩티드 쇄를 갖고, 각 쌍의 펩티드 쇄는 경쇄 L 쇄 및 중쇄 H 쇄를 함유하며, 모든 펩티드 쇄는 모두 이황화 결합에 의해 연결되고, 여기서 임의의 한 쌍의 펩티드 쇄는 N 말단에서 C 말단까지 식 Ia 또는 Ib로 표시되는 L 쇄 및 H 쇄 구조를 갖고, 여기서, 상기 이중 기능 항체는 PD-L1에 결합되는 동시에 VEGF에 결합되는 활성을 갖는다:
Figure pct00006
(Ia);
Figure pct00007
(Ib)
상기 식에서,
D는 항-VEGF 요소(VEGR1D2)이고;
L1은 없거나 링커 요소이고;
VL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
CL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
VH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
CH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
"~"는 이황화 결합을 나타내고;
"-"는 펩티드 결합을 나타낸다.
식 Ia 또는 식 Ib에서, 바람직한 H 쇄는 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 바와 같고, 바람직한 L 쇄는 서열번호 13으로 표시되는 바와 같다.
H 쇄: (중쇄 가변 영역에서 VEGR1D2의 아미노산 서열)
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTGGSGGSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTGYTIHWVRQAPGQRLEWMGWFYPGSGTLKYSEKFQGRVTITRDKSLSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGTGTLMAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 11)
H 쇄: (중쇄 불변 영역에서 VEGR1D2의 아미노산 서열)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTGYTIHWVRQAPGQRLEWMGWFYPGSGTLKYSEKFQGRVTITRDKSLSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGTGTLMAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGGSGGSGGSGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNT(서열번호 12)
L 쇄:
DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLANSYGNTYLSWYLHKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 13)
2개의 식 Ia 또는 식 Ib의 구조식에 표시되는 바와 같은 서열은 H 쇄의 이황화 결합을 통해 연결됨으로써, 대칭되는 이중 기능 항체 구조를 형성한다.
본 발명의 이중 항체는 완전한 항체뿐만 아니라 면역 활성을 갖는 항체 단편 또는 항체와 다른 서열에 의해 형성된 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사물질을 더 포함한다. 본문에 사용된 용어 "단편", "유도체" 및 "유사물질"은 본 발명의 항체와 기본적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 단편, 유도체 또는 유사물질은, (i) 하나 또는 복수의 보존적 및 비 보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드이고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않은 것일 수 있거나, (ii) 하나 또는 복수의 아미노산 잔기에 치환기가 있는 폴리펩티드이거나, (iii) 성숙한 폴리펩티드와 다른 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리펩티드의 반감기를 연장하는 화합물)에 융합되어 형성된 폴리펩티드이거나; (iv) 추가된 아미노산 서열이 이 폴리펩티드 서열에 융합되어 형성된 폴리펩티드(리더 서열 또는 분비 서열 또는 이 폴리펩티드를 정제하는 서열 또는 프로테오젠 서열, 또는 6His 태그와 형성된 융합 단백질과 같음)일 수 있다. 본문의 교시에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사물질은 본 기술분야의 기술자에 의해 공지된 범위에 속한다.
본 발명의 이중 항체는 항-PD-L1 및 항-VEGF 활성을 갖고, 2개의 상기 식 I의 구조를 포함하는 항체를 의미한다. 상기 용어는 본 발명의 이중 항체와 동일한 기능을 갖고, 2개의 상기 식 I의 구조를 포함하는 항체의 변이 형태를 더 포함한다. 이러한 변이 형태는 하나 또는 복수(일반적으로 1 - 50개이고, 비교적 바람직하게는 1 - 30개이고, 보다 바람직하게는 1 - 20개이고, 가장 바람직하게는 1 - 10개임)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 또한 C 말단 및/또는 N 말단으로의 하나 또는 복수(일반적으로 20개 이내이고, 비교적 바람직하게는 10개 이내이고, 보다 바람직하게는 5개 이내임)의 아미노산 추가를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이 분야에서 유사하거나 유사한 특성을 가진 아미노산으로 치환할 때 단백질의 기능은 일반적으로 변하지 않는다. 또 예를 들어, 하나 또는 복수의 아미노산을 C 말단 및/또는 N 말단에 추가하는 것도 일반적으로 단백질의 기능을 변화시키기지 않는다. 상기 용어는 본 발명의 이중 항체의 활성 단편 및 활성 유도체를 더 포함한다.
상기 이중 항체의 변이 형태는, 상동성 서열, 보존적 변이체, 대립 유전자 변이체, 천연 돌연변이체, 유도 돌연변이체, 높거나 낮은 엄격한 조건 하에서 본 발명의 항체의 코딩 DNA와 혼성화할 수 있는 DNA에 의해 코딩된 단백질, 및 본 발명의 항체를 저항하는 항혈청을 사용하여 얻은 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.
본 발명에서 "본 발명의 이중 항체의 보존적 변이체"는 본 발명의 이중 항체의 아미노산 서열에 비해, 최대 10개, 바람직하게는 최대 8개, 보다 바람직하게는 최대 5개, 가장 바람직하게는 최대 3개의 아미노산이 성질이 유사하거나 근접한 아미노산에 의해 교체되어 폴리펩티드를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 보존적 변이 폴리펩티드는 표 A에 따른 아미노산 교체에 의해 생성되어야 한다.
[표 A]
Figure pct00008
코딩 핵산 및 발현 벡터
본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 더 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 형태 또는 RNA 형태일 수 있다. DNA의 형태는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성 DNA가 포함된다. DNA는 단일 쇄이거나 이중 쇄일 수 있다. DNA는 코딩 쇄 또는 비 코딩 쇄일 수 있다. 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 성숙 폴리펩티드만 코딩하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드의 코딩 서열 및 다양한 추가 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드의 코딩 서열(및 임의적인 추가 코딩 서열) 및 비 코딩 서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 이 코딩 폴리펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이거나, 추가 코딩 및/또는 비 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 핵산(및 핵산 조합)은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열과 혼성화하고 2개의 서열 사이에 적어도 50 %, 비교적 바람직하게는 적어도 70 %, 보다 바람직하게는 적어도 80 %의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서 "엄격한 조건"은, (1) 0.2xSSC, 0.1 % SDS, 60 ℃와 같은 비교적 낮은 이온 강도 및 비교적 높은 온도에서의 혼성화 및 용리; 또는 (2) 50 %(v/v) 포름아미드, 0.1 % 송아지 혈청/0.1 % Ficoll, 42 ℃와 같은 혼성화할 때 변성제 추가; 또는 (3) 단지 2개의 서열 사이의 동일성이 적어도 90 % 이상이고, 더 바람직하게는 95 % 이상이어야만 혼성화가 발생하는 등을 의미한다. 또한, 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드는 성숙 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 및 활성을 갖는다.
본 발명의 항체의 뉴클레오티드 전체 길이 서열 또는 이의 단편은 일반적으로 PCR 증폭법, 재조합법 또는 인공 합성법으로 획득할 수 있다. 가능한 방법은 특히 단편 길이가 짧은 경우 인공 합성법으로 관련 서열을 합성하는 것이다. 일반적으로 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 다음 연결하여 서열이 매우 긴 단편을 획득할 수 있다. 또한, 중쇄의 코딩 서열과 발현 태그(예를 들어, 6His)를 융합하여 융합 단백질을 형성할 수 있다.
관련 서열이 확보되면 재조합법을 사용하여 관련 서열을 대량으로 획득할 수 있다. 이는 일반적으로 벡터로 클로닝한 다음 세포로 옮기고 일반 방법으로 증식된 숙주 세포에서 관련 서열을 분리하여 획득하는 것이다. 본 발명에 포함되는 생물 분자(핵산, 단백질 등)는 분리된 형태로 존재하는 생물 분자를 포함한다.
현재, 완전히 화학 합성을 통해 본 발명의 단백질(또는 이의 단편 또는 유도체)을 코딩하는 DNA 서열을 획득할 수 있다. 다음, 상기 DNA 서열을 본 기술분야의 공지된 다양한 기존의 DNA 분자(또는 벡터와 같음) 및 세포에 도입할 수 있다. 이밖에, 화학 합성을 통해 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열에 도입할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주 세포를 형질 전환하는데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵 세포이거나; 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포이거나; 포유 동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 대표적인 예는, 대장균, 스트렙토마이세스; Salmonella typhimurium의 세균 세포; 효모와 같은 진균 세포; 초파리 S2 또는 Sf9의 곤충 세포; CHO, COS7 및 293 세포의 동물 세포 등이다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질 전환은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려진 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA의 수용성 세포를 흡수하여 지수 성장기 후에 획득할 수 있으며, CaCl2법으로 처리하고, 사용되는 단계는 본 기술분야에 주지되어 있다. 다른 방법은 MgCl2를 사용하는 것이다. 필요한 경우, 전기 천공법으로 형질 전환을 수행할 수도 있다. 숙주가 진핵 생물인 경우, 인산 칼슘 공침법, 미세 주사, 전기 천공, 리포솜 패키징과 같은 일반 기계 방법과 같은 DNA 형질 감염 방법을 선택하여 사용할 수 있다.
획득된 형질 전환체는 일반 방법으로 배양할 수 있으며, 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 사용되는 숙주 세포에 따라 배양에 사용되는 배지는 다양한 일반 배지 중에서 선택할 수 있다. 숙주 세포의 성장에 적합한 조건에서 배양한다. 숙주 세포가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 적절한 방법(예를 들어, 온도 전환 또는 화학적 유도)으로 선택된 프로모터를 유도하고 세포를 일정 시간 동안 배양한다.
초기 배양 조건에서, 이중 특이성 항체의 발현량은 3.9 g/L에 달할 수 있고, 순도는 모두 97 % 이상이고, 배양 과정에서 젖산이 잘 대사될 수 있다.
상기 방법에서 재조합 폴리펩티드는 세포 내 또는 세포막에서 발현되거나 세포 외로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용하고 다양한 분리 방법을 통해 재조합 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예는, 일반 재생 처리, 단백질 침전제 처리(염석 방법), 원심 분리, 삼투 멸균, 한외 처리, 초 원심 분리, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 흡착층 분석, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기타 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이러한 방법의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 이중 항체는 단독으로 사용되거나, 검출 가능한 마커(진단 목적을 위해), 치료제 또는 이러한 물질의 임의의 조합과 결합되거나 접합될 수 있다.
진단 목적을 위한 검출 가능한 마커는 형광 또는 발광 마커, 방사성 마커, MRI(자기 공명 영상) 또는 CT(전자 컴퓨터 X선 단층 스캐닝 기술) 조영제, 또는 검출 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체와 결합되거나 접합될 수 있는 치료제는 1. 방사성 핵종; 2. 생물 독성; 3. IL-2와 같은 시토카인; 4. 금 나노 입자/나노 로드; 5. 바이러스 입자; 6. 리포솜; 7. 자성 나노 입자; 8. 종양 치료제(예를 들어, 시스플라틴) 또는 임의의 형태의 종양 약물 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
약학 조성물
본 발명은 조성물을 더 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학 조성물로, 본 발명의 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다. 일반적으로, 이러한 물질은 비독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에 배합될 수 있으며, 여기서 pH는 일반적으로 약 5 - 8이고, 비교적 바람직하게는 약 6 - 8이지만, pH 값은 배합된 물질의 성질 및 치료할 병증에 따라 변화될 수 있다. 배합된 약학 조성물은 정맥 주사, 정맥 내 점적 주입, 피하 주사, 국소 주사, 근육 주사, 종양 내 주사, 복강 내 주사(예를 들어, 복막 내), 두개 내 주사, 또는 강 내 주사를 포함하지만 이에 한정되지 않는 일반 방법으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 PD-L1 단백질 분자 또는 PD-L1에 직접 결합하여 종양 치료에 사용될 수 있다. 이밖에, 다른 치료제도 동시에 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안전 유효량(예를 들어, 0.001 - 99wt %, 비교적 바람직하게는 0.01 - 90wt %, 보다 바람직하게는 0.1 - 80wt %)의 본 발명의 상기 나노 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 담체는 염수, 버퍼, 포도당, 물, 글리세린, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 매칭되어야 한다. 본 발명의 약학 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 생리식염수 또는 포도당과 다른 보조제를 함유하는 수용액을 사용하여 일반 방법을 통해 제조할 수 있다. 주사제, 용액과 같은 약학 조성물은 무균 조건에서 제조되어야 한다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이고, 예를 들어, 하루에 약 10 마이크로그램/킬로그램 체중 내지 약 50 밀리그램/킬로그램 체중이다. 이밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에서, 이중 특이성 항체를 단독으로 사용할 수 있고, 투여 수단을 조정하여 가장 바람직한 목적의 반응을 획득하였다. 예를 들어, 단일 투여, 또는 일정 기간에 걸친 다중 투여, 또는 투여량은 치료 상황의 긴급성에 따라 비율적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
약학 조성물을 사용하는 경우, 안전 유효량의 면역 접합체를 포유 동물에게 투여하는데, 여기서 상기 안전 유효량은 일반적으로 적어도 약 10 마이크로그램/킬로그램 체중이고, 대부분 경우 약 50 밀리그램/킬로그램 체중을 초과하지 않으며, 비교적 바람직하게는 상기 조제량은 약 10 마이크로그램/킬로그램 내지 약 10 밀리그램/킬로그램 체중이다. 물론, 구체적인 조제량은 투여 경로, 환자의 건강 상태 등과 같은 요소를 고려하여야 하며, 이는 모두 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있어야 한다.
본 발명은 주로 하기와 같은 장점을 포함한다.
1. 본 발명의 이중 기능 항체는 PD-L1과 VEGF에 동시에 결합될 수 있고, 이중 기능 항체와 결합 표적의 결합 형태를 변함없이 유지할 수 있으며, 분자가 안정적이다.
2. 본 발명의 이중 특이성 항체 HB0025는 재조합 인간 PD-L1 및 재조합 인간 VEGF165(KD는 10-5M보다 작음)에 특이적으로 잘 결합될 수 있고, 비 표적 분자와 비특이적인 정전기 및 소수성 결합을 갖지 않으며; 초기 배양 조건에서, 이중 특이성 항체의 발현량은 3.9 g/L에 달할 수 있고, 순도는 모두 97 % 이상이다.
3. 본 발명의 이중 기능 항체와 결합 표적의 결합 친화력은 높고, 차단 활성이 우수하며 일정한 이중 표적 시너지 효과를 나타내어 종양 세포(특히 PD-L1 및 VEGF 발현이 높은 종양)를 효과적으로 사멸시킬 수 있으며, 이로써 종양 부피와 종양을 현저히 감소시켜 암, 특히 고형 종양을 치료한다.
4. 별도의 항-PD-L1 항체(예를 들어, HB0023) 및 항-VEGF 융합 단백질(예를 들어, HB002.1T)에 비해, 본 발명의 이중 특이성 항체는 PD-L1 및/또는 VEGF와의 결합 활성이 더 높다. 구체적으로, 본 발명의 이중 특이성 항체와 PD-L1의 친화력은 약 1E-10 mol이고, VEGF165와의 친화력은 약 1E-11 mol이다.
5. 본 발명의 제조 방법은 간단하고 실행 가능하다. 본 발명의 항-VEGF/PD-L1 이중 특이성 항체는 양호한 응용 전망을 가졌다.
아래에 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 상세히 설명하지 않은 실험 방법은 Sambrook 등, 분자 클론: 실험실 안내(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따른 조건과 같은 일반 조건을 따르거나, 제조 업체에서 제안한 조건을 따른다. 달리 명시되지 않는 한, 백분율과 부수는 중량 백분율과 중량 부수이다.
특별히 명시되지 않는 한, 실시예에 사용되는 재료 또는 시약은 모두 시판중인 제품이다.
실시예 1. 이중 기능 항체 900387 및 900388 발현 벡터의 구축 및 단백질의 발현 정제
본 발명의 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1-His 단백질로 마우스를 면역시킨 후 선별하여 마우스 단클론 항체(중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 바와 같음)를 얻고, 다시 이를 인간화하여 얻은 인간화 단클론 항체(900339)이다. 여기서 중쇄 서열은 서열번호 8로 표시되는 바와 같고, 경새 서열은 서열번호 9로 표시되는 바와 같다. 인공 합성된 VEGFR1D2(서열은 서열번호 10으로 표시되는 바와 같음)는 링커(GGSGGSGGSGGSGGS, 서열번호 16)를 통해 중쇄 발현 벡터의 5'말단 또는 3'말단에 연결되고, 경쇄 벡터(1:1)와 함께 CHO-S 세포에 공동 형질 감염되며, 37℃, 5 % CO2, 130 rpm/min 조건에서 7일간 배양한 후 원심 분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액을 4000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하고, 0.45μm 필터막으로 여과하여 여과액을 수집하였다. 여과액은 Protein A 친화력 컬럼으로 정제한 후, 항체 900387 및 900388을 얻고, 그 구조 그래프는 도 1을 참조한다. 정제 후 단백질 SEC_UPLC 검출 결과, 순도는 98 %보다 크고, SDS-PAGE로 검출하였으며, SDS-PAGE 환원 또는 비환원 전기영동 검출 결과는 도 2를 참조한다.
900339-VH 서열번호 8(밑줄로 라벨링된 것은 순차적으로 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열임)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTGYTIHWVRQAPGQRLEWMGWFYPGSGTLKYSEKFQGRVTITRDKSLSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGTGTLMAMDYWGQGTLVTVSS
900339-VL 서열번호 9(밑줄로 라벨링된 것은 순차적으로 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열임)
DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLANSYGNTYLSWYLHKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPPTFGQGTKLEIK
VEGFR1D2 서열번호 10
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNT
이중 특이성 항체 900387 및 900388을 제조하였다. 여기서 900387의 단백질 번호는 HB0025이고, 다음 실험의 관련 검출 결과는 모두 HB0025로 발현되고, 그 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 11 및 서열번호 13으로 표시되는 바와 같다.
실시예 2. 이중 특이성 항체의 친화력 검출
본 실시예에서, SPR 방법을 사용하여 항체-항원 결합 동역학 및 친화력을 측정하였다.
재료와 기기:
재조합 인간 PD-L1, Sino Biological, 10084-H08H
재조합 인간 VEGF165, Sino Biological, 11066-HNAH
아미노 접합 키트, GE, BR-1000-50
HBS-EP(10X), GE, BR-1006-69
인간 항체 포획 키트(Human Antibody Captrue Kit), GE, BR-1008-39
S 시리즈 센서 칩(Series S Sensor Chip CM5), GE, BR-1005-30
BIACORE, GE, Biacore 8K
방법: 인간 항체 포획 키트 아미노 접합법에 따라 Anti-Human Capture-CM5 칩을 준비한다. 칩을 실온에서 20 - 30분 동안 평형화하고 Biacore 8K 기기에 넣어; 평형 버퍼로 일시적 단백질을 실험 작업 농도로 희석하며; 평형 버퍼로 항원을 50nM로 희석한 다음 3배 희석도 7개의 농도 구배로 하고, 2개의 0 농도(예를 들어, 평형 버퍼) 및 1개의 반복 농도(일반적으로 최저 농도 반복)를 설정하며; 항체, 항원, 재생의 순서에 따라 10개의 항원 농도(2개의 0 농도, 7개의 구배 농도 및 1개의 반복 농도)를 주기적으로 분석하고, 항원 주입 유속은 30 μL/분이고, 결합 시간은 120초이고, 해리 시간은 600초이고; 분석이 완료된 후 대응되는 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 분석하고 명백한 reference binding이 없는지 확인하고, Kinetics, 1:1 binding model을 사용하여 데이터를 피팅하여 인간 마우스 키메라 항체 및 인간화 항체의 동역학 관련 파라미터 Ka, Kd 및 KD 값을 획득하였다. 이중 특이성 항체 HB0025와 재조합 인간 PD-L1, 재조합 인간 VEGF165의 친화력은 표 1과 표 2에 표시된 바와 같다.
[표 1]
이중 특이성 항체 HB0025와 재조합 인간 PD-L1 친화력
Figure pct00009
[표 2]
이중 특이성 항체 HB0025와 재조합 인간 VEGF165 친화력
Figure pct00010
결과, 이중 특이성 항체 HB0025와 재조합 인간 PD-L1은 비교적 양호한 친화력을 갖고; 이중 특이성 항체 HB0025와 재조합 인간 VEGF165는 비교적 양호한 친화력을 가졌다.
실시예 3. 이중 특이성 항체와 비 표적 분자의 비 특이성 흡착 효과
본 실시예에서, SPR 방법을 사용하여 항체와 비 표적 분자의 비 특이성 흡착 효과를 측정하였다.
재료와 기기:
흰자위 리소자임, Sigma, L3790
대두 췌장 억제제 1-S형, Sigma, T-2327
아미노 접합 키트, GE, BR-1000-50
HBS-EP(10X), GE, BR-1006-69
항-리소자임의 토끼 다클론 항체, ABcam, Ab391
항 트립신 억제제 항체, LifeSpan Biosciences, LS-C76609
0.85 % 인산 용액, ProteOn, 176-2260
50 mM 수산화물, ProteOn, 176-2230
S 시리즈 센서 칩 CM5, GE, BR-1005-30
BIACORE, GE, Biacore 8K
방법: Series S Sensor Chip CM5 칩을 실온에서 20 - 30분 동안 평형화하고 Biacore 8K 기기에 넣었다. 아미노 접합 키트를 사용하여 흰자위 리소자임 및 대두 췌장 억제제 1-S형을 각각 CM5 칩에 고정시켰다. 주입 버퍼는 HBS-EP+1X이고 4개의 평형 주기를 설정하였다. 평형 버퍼로 항-리소자임의 토끼 다클론 항체, 항 트립신 억제제 항체, 인간화 단클론 항체를 1000nM로 희석하고, 유속을 5 μL/min로, 주입 채널 1, 2 및 3, Flow Cell 1 및 2를 설정하였다. 결합 시간은 10 min이고, 해리 시간은 15 min이다. 재생 유속은 50 μL/min이고 먼저 0.85 % 인산으로 60초 동안 재생한 다음 50 mM 수산화나트륨으로 30초 동안 재생시켰다. 이중 특이성 항체 HB0025와 비 표적 분자의 비 특이성 흡착 결과는 표 3에 표시된 바와 같으며, 이중 특이성 항체와 비 표적 분자의 비 특이성 흡착 검출 센서 다이어그램은 도 3에 도시된 바와 같다.
[표 3]
이중 특이성 항체 HB0025와 비 표적 분자의 비 특이성 흡착 검출 결과
Figure pct00011
참고: 일반적으로 Buffer의 영향을 공제한 후 20 RU 미만의 응답값은 약한 상호 작용을 갖고 무시할 수 있고; 20 RU 이상은 현저한 상호 작용을 갖는 것으로 간주되며; 100 RU 이상은 강력한 상호 작용을 갖는 것으로 간주된다.
결과로부터 보아, 버퍼의 배경을 공제한 후, HB0025와 대두 췌장 억제제 1-S형 및 리소자임 결합의 신호는 20보다 작으므로, 4개의 샘플이 비 특이적인 정전기 및 소수성 결합 작용이 없는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 항체가 인체에 주입된 후, 인체에 대한 면역력을 저하시켜 혈관종과 같은 일련의 면역 질환을 유발할 수 있다.
SPR 기술을 사용하여 흰자위 리소자임 및 대두 췌장 억제제 1-S형에 대한 항-리소자임의 토끼 다클론 항체 및 항 트립신 억제제 항체의 품질 관리 결과를 통해, CM5 칩에 접합되어 고정된 후 흰자위 리소자임 및 대두 췌장 억제제 아미노의 활성이 정상적이고, 양호한 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다(예를 들어, 결합된 신호가 20 미만이면, 샘플이 비 특이적인 정전기 및 소수성 결합 작용이 없는 것으로 간주될 수 있음).
실시예 4. 이중 특이성 항체의 체내 약 효과 검출
4.1 이중 특이성 항체 제조
BalanA 배지를 사용하여 일정량의 사료를 첨가하고 배양하며, 도 4에 도시된 바와 같이, 이 CHO-K1 세포주는 젖산 대사가 매우 잘 되고; 세포 성장 상태가 양호하며, 16일에 수확할 때 생존율이 90 % 이상에 달하고; 33 ℃ 및 31 ℃까지 냉각되며, 현저한 발현 차이가 없고, 약 3 g/L이고; 매일 사료 첨가는 세포 밀도와 발현량을 현저하게 향상시킬 수 있고, 최종 3.9 g/L까지 발현되며; 전체 배양 과정에서 순도는 감소하지 않고 약 97 %를 유지하였다.
4.2 체내 약 효과 실험 설계 및 결과
HB0025의 체내 약 효과. hCD34+ 인간화 마우스 오른쪽 겨드랑이에 인간 폐선암 HCC-827 세포를 접종하여 종양이 평균 약 100 - 150 mm3까지 성장했을 때, 48마리의 종양 보유 마우스를 말초 혈액 중 hCD45+의 비율과 종양 부피에 따라 8마리 동물을 한 그룹으로 임의로 6개 그룹으로 나누고, 각각 G1 그룹 PBS, G2 그룹 HB0023(항-PD-L1 단클론 항체, 실시예 1에서 인간화 단클론 항체 900339) 1 mg/kg, G3 그룹 HB0025 1 mg/kg, G4 그룹 HB0025 3 mg/kg, G5 그룹 HB0025 10 mg/kg, G6 그룹 HB002.1T(항-VEGF 융합 단백질, 특허번호 CN103319610B) 1 mg/kg, 2회/주의 조건으로 총 9회 꼬리에 정맥 주사하였다. 2회/주로 종양 부피와 마우스 체중을 측정하였다. 실험 과정에서 어느 그룹 중 동물의 평균 종양 부피가 2000 mm3 초과하거나 실험이 종료되면 동물에 대해 안락사 처리를 수행하고 종양 무게를 칭하였다.
실험 기간에, PBS 용매 대조군(G1) 마우스의 종양 부피는 계속 증가하였는데(도 5 참조), 이는 HCC827 폐암 세포 hCD34+ 인간화 마우스 피하 이식 종양 모델이 성공적으로 구축되었음을 나타낸다. G2 동물에게 HB0023 1 mg/kg을 투여하였고, 투여 후 종양 부피는 상대적으로 느리게 증가하였으며, 같은 시기 용매 대조군에 비해 종양 부피와 상대적 종양 부피는 상대적으로 감소하였으나, 통계학적 차이는 보이지 않았고; D32 테스트가 종료될 때, 용매 대조군에 비해, 종양 무게는 상대적으로 감소했으며(P> 0.05, 도 5, 도 6 참조), 종양 억제율은 17.48 %이었다. G6 동물에게 HB002.1T 1 mg/kg을 투여하였고, 투여 후 종양 부피는 느리게 증가하였으며, 같은 시기 용매 대조군에 비해 종양 부피와 상대적 종양 부피는 현저하게 감소하였고(P<0.05, 도 5 참조); D32 테스트가 종료될 때, 용매 대조군에 비해, 종양 무게는 현저하게 감소하였으며(P<0.05, 도 6 참조), 종양 억제율은 64.08 %이었다.
G3, G4, G5 그룹의 동물에게 각각 HB0025 1, 3, 10 mg/kg을 투여하였고, 투여 후 종양 부피는 느리게 증가하였으며, 종양 부피와 상대적 종양 부피는 같은 시기 용매 대조군에 비해 현저하게 낮았고(p<0.05); D32 테스트가 종료될 때, 용매 대조군 비해, 종양 무게는 현저하게 감소되었으며(P<0.05, 도 6 참조), 종양 억제율은 각각 70.87 %, 84.47 %, 85.44 %이었는데, 이는 HB0025가 hCD34+ 인간화 마우스 HCC827 폐암 피하 이식 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 나타내고, 유효 종양 억제량은 1 mg/kg이다.
1 mg/kg HB0023, HB002.1T 단일 표적 항체/융합 단백질의 투여와 비교하면, 동일한 조제량의 이중 특이성 항체 HB0025를 투여한 동물의 종양 부피, 상대적 종양 부피, 종양 무게는 대응하게 감소되었는데(도 5, 도 6 참조), 이는 일정한 이중 표적 시너지 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 5
본 실시예는 실시예 1에서 제조된 이중 특이성 항체 900388(중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 및 서열번호 13으로 표시되는 바와 같음)의 친화력, 비 표적 분자와의 비 특이성 흡착 효과 및 체내 약 효과에 대해 검출하며, 실험 방법은 실시예 2 내지 4와 동일하고, 그중의 HB0025를 이중 특이성 항체 900388로 교체한다.
[표 4]
이중 특이성 항체 900388과 PD-L1 및 VEGF165의 친화력
Figure pct00012
결과, 이중 특이성 항체 900388과 재조합 인간 PD-L1 및 재조합 인간 VEGF165는 모두 비교적 양호한 친화력을 갖고, 비 특이적인 정전기 및 소수성 결합 작용을 갖지 않아도, 종양을 잘 치료하고, 동물 종양 부피와 종양 무게를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이상 실시예에 따르면, 본 발명의 항-VEGF/PD-L1 이중 특이성 항체는 CHO-K1 세포에서 발현될 수 있고, 또한 친화력 컬럼을 통해 정제될 수 있다. 획득된 이중 특이성 항체는 PD-L1 양성의 세포와 VEGF 양성의 세포를 결합할 수 있다. 이밖에, 상기 항체는 비교적 양호한 친화력을 갖고, 양호한 항-VEGF의 생물학적 활성을 가질 뿐만 아니라, 또한 항-PD-L1 항체의 생물학적 활성을 완벽하게 보류한다. 이로써, 본 발명의 항-VEGF/PD-L1 이중 특이성 항체는 양호한 응용 전망을 가진다.
본 발명에 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 인용되어 참조되는 바와 같이 모두 본 발명에 참조로서 인용된다. 이밖에, 이해해야 할 것은, 본 발명의 상기 교시된 내용을 열독한 후 본 기술분야의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 진행할 수 있으며, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본원 발명에 첨부된 청구범위에 의해 한정된 범위에 포함되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> HUABO BIOPHARM (SHANGHAI) CO., LTD. <120> ANTI-PD-L1/VEGF BIFUNCTIONAL ANTIBODY AND USE THEREOF <130> P2019-0423 <140> PCT/CN2020/082535 <141> 2020-03-31 <150> CN 201910258153.9 <151> 2019-04-01 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Leu Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Leu Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Leu Met Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly 1 5 10 15 Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Gln Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Tyr Ala Phe Thr Gly Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Leu 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Leu Met Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Gln Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Pro Thr 1 5 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 항 PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Leu Lys Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Leu Met Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 항 PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역 <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Gln Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 100 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체1의 제2 막외 영역 <400> 10 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr 100 <210> 11 <211> 564 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 이중 기능 항체의 중쇄 <400> 11 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 130 135 140 Thr Gly Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Leu Lys Tyr Ser 165 170 175 Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Leu Ser 180 185 190 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Leu Met Ala Met Asp Tyr 210 215 220 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 245 250 255 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 260 265 270 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 275 280 285 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 290 295 300 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 305 310 315 320 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 325 330 335 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 340 345 350 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 355 360 365 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 370 375 380 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 385 390 395 400 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 405 410 415 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 420 425 430 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 435 440 445 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 450 455 460 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 465 470 475 480 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 485 490 495 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 500 505 510 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 515 520 525 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 530 535 540 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 545 550 555 560 Leu Ser Pro Gly <210> 12 <211> 564 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 이중 기능 항체의 중쇄 <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Thr Leu Lys Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Thr Gly Thr Leu Met Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 450 455 460 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 465 470 475 480 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 485 490 495 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 500 505 510 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 515 520 525 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 530 535 540 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 545 550 555 560 Gln Thr Asn Thr <210> 13 <211> 219 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 이중 기능 항체의 경쇄 <400> 13 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Gln Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 연결 펩티드 <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 연결 펩티드 <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 연결 펩티드 <400> 16 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (10)

  1. (a) 항-PD-L1 항체 또는 요소; 및
    (b) 상기 항-PD-L1 항체 또는 요소와 연결되는 항-VEGF 항체 또는 요소
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 기능 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이중 기능 항체는 N 말단에서 C 말단까지 하기 식 I로 표시되는 구조를 갖고, PD-L1에 결합되는 동시에 VEGF에 결합되는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 이중 기능 항체:
    Figure pct00013
    (I)
    상기 식에서,
    D는 각각 독립적으로 없거나 항-VEGF 항체 또는 요소이고, 하나 이상의 D는 항-VEGF 항체 또는 요소이고;
    L1, L2, L3, L4, L5 및 L6은 각각 독립적으로 펩티드 결합 또는 링커 요소이고;
    VL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역을 나타내고;
    CL은 항-PD-L1 항체의 경쇄 불변 영역을 나타내고;
    VH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역을 나타내고;
    CH는 항-PD-L1 항체의 중쇄 불변 영역을 나타내고;
    ~는 이황화 결합 또는 공유 결합을 나타내고;
    -는 펩티드 결합을 나타낸다.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역(VH)은 서열번호 3으로 표시되는 CDR1, 서열번호 4로 표시되는 CDR2, 및 서열번호 5로 표시되는 CDR3인 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고/거나;
    상기 항-PD-L1 항체의 경쇄 가변 영역(VL)은 서열번호 6으로 표시되는 CDR1', 아미노산 서열이 GIS인 CDR2', 및 서열번호 7로 표시되는 CDR3'인 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 이중 기능 항체.
  4. 제1항에 따른 이중 기능 항체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 게놈에 통합된 제5항에 따른 벡터 또는 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 숙주 세포.
  7. (i) 적합한 조건에서, 제6항에 따른 숙주 세포를 배양하여, 제1항에 따른 이중 기능 항체를 함유하는 혼합물을 획득하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)에서 획득한 혼합물을 정제 및/또는 분리하여, 제1항에 따른 이중 기능 항체를 획득하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 이중 기능 항체의 제조 방법.
  8. (I) 제1항에 따른 이중 기능 항체; 및
    (II) 약학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. (a) 제1항에 따른 이중 기능 항체; 및
    (b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 시토카인, 방사성 핵종, 효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
  10. (a) 검출 시약 또는 키트를 제조하고/거나;
    (b) 암 또는 종양을 예방하고/거나 치료하기 위한 약학 조성물을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는,
    제1항에 따른 이중 기능 항체 또는 제9항에 따른 면역 접합체의 용도.
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