KR20230162942A - 이중특이성 항 pd-l1/vegf 항체 및 이의 용도 - Google Patents

이중특이성 항 pd-l1/vegf 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중특이성 항-VEGF x PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조 방법, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 이용한 질병 또는 질환의 치료 방법을 제공한다.

Description

이중특이성 항 PD-L1/VEGF 항체 및 이의 용도
우선권주장
본 출원은 2021년 3월 31일에 출원된 국제 출원 PCT/CN2021/084447의 혜택을 주장하며, 이 출원 전체가 참조로 통합되어 있다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 이에 따라 서열 목록의 전체 내용이 참조로 통합된다.
혈관 신생은 종양의 성장과 전이 발생에 필수적이다. 종양 관련 혈관 신생을 제어하는 것은 암 치료를 위한 유망한 전략이다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관 신생의 핵심 매개체이며 다양한 유형의 인간 암에서 검증되었다[1]. 종양 세포는 인근 내피 세포에 결합하는 VEGF와 같은 성장 인자를 방출하여 내피 세포가 분열하고 새로운 혈관을 형성하도록 자극하는 신호 캐스케이드를 시작한다. 수용체 VEGFR을 통한 VEGF 신호는 많은 고형 종양의 혈관 신생과 성장에 중요한 역할을 한다. VEGF 경로를 표적으로 하는 아바스틴(베바시주맙)과 같은 항혈관 신생 약물은 임상에서 성공을 거두었다.
반면에 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1) 또는 그 수용체인 프로그램된 사멸 1(PD-1)과 같은 면역 체크포인트 분자를 표적으로 하는 것은 유망한 임상적 성공을 보여주었다[2, 3]. PD-L1 발현은 다양한 유형의 암에서 불리한 예후와 밀접한 상관관계가 있다. 항 PD-L1 항체는 종양 세포와 종양 침윤 면역 세포에 발현된 PD-L1을 표적으로 삼아 T 세포 표면의 PD-1 및 B7.1과의 결합을 방지하고, T 세포의 활성화는 물론 다른 T 세포를 모집하여 종양을 공격하도록 하여 면역 체계가 여러 유형의 암과 싸울 수 있도록 한다.
항VEGF 요법은 이미 확립된 항혈관 신생 효과에 더하여 VEGF 관련 면역 억제를 억제하고 T세포 종양 침윤을 촉진하며 종양 항원에 대한 T세포 반응의 프라이밍 및 활성화를 가능하게 함으로써 항PD-1/PD-L1 요법의 항암 면역 회복 능력을 더욱 향상시킬 수 있다 [4, 5]. 따라서 항혈관신생 치료와 면역 체크포인트 억제를 함께 결합한 VEGF 및 PD-L1 이중특이성 항체를 개발하면 암 치료에서 유망한 결과를 얻을 수 있다.
VEGF를 표적으로 하고 PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 치료법의 분명한 이점에도 불구하고 여전히 충족되지 않은 요구가 존재한다. 15~20%의 환자는 항 VEGF 치료에 반응하지 않으며, 암 치료에 항 VEGF 제제를 장기간 사용하면 종양 내성이 촉진된다는 증거가 증가하고 있다. 3~9%의 환자에서 치료의 면역원성이 발생한다. 또한 전체 생존기간 연장에 한계가 있고 뼈의 형태 변화, 신장에 염증을 동반한 사구체 병증, 부신에 염증을 동반한 백혈구 감소 등 안전성 문제도 제한적이다. 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 아테졸리주맙(atezolizumab) 등 PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 면역 체크포인트 억제제는 다발성 암 환자의 표준 치료 옵션으로 사용되고 있다. 그러나 이러한 약제는 선별되지 않은 환자군에서 14-23%, PD-L1 발현 종양 환자에서 16-48%의 반응률을 보이며 일부 환자에서 개선된 결과를 제공하지만 모든 환자에게 그렇지는 않다.
따라서 새로운 항 PD-L1/항 VEGF 이중특이성 항체를 개발할 필요성이 매우 높다. 본 발명에서는 인간 PD-L1과 VEGF에 동시에 높은 친화력으로 결합하여 PD-1/PD-L1과 VEGF/VEGFR 신호를 모두 차단하고 우수한 항종양 효능을 나타낼 수 있는 이중특이성 항체를 생성하였다.
이러한 목적 및 기타 목적은 본 발명에 의해 제공되며, 넓은 의미에서 본 발명은 개선된 효능을 갖는 항체를 제공하는 화합물, 방법, 조성물 및 제조물에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 이점은 항체 치료제 및 진단 분야에 광범위하게 적용 가능하며 다양한 표적과 반응하는 항체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 PD-L1 항원 결합 모이어티 및 VEGF 항원 결합 모이어티를 포함하는 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 본 발명은 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공하며, 여기서 PD-L1 항원 결합 모이어티는 VEGF 항원 결합 모이어티와 연관된 PD-L1 항원 결합 모이어티를 포함한다:
상기 PD-L1 항원 결합 모이어티는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3를 포함하는 것; 및
상기 VEGF 항원-결합 모이어티는, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 결합체이다.
본 발명의 특정 실시예에서, PD-L1 항원 결합 모이어티는 scFv이고 VEGF 항원 결합 모이어티는 Fab인 것이다.
본 발명의 특정 실시예에서, PD-L1 항원-결합 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 서열번호 13과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, VEGF 항원-결합 모이어티는 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, PD-L1 항원-결합 모이어티는 VEGF 항원-결합 모이어티의 N 말단에 융합된다. 일부 다른 실시예에서, PD-L1 항원-결합 모이어티는 VEGF 항원-결합 모이어티의 C 말단에 융합된다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, PD-L1 항원-결합 모이어티는 선택적으로 링커를 통해, VEGF 항원-결합 모이어티의 경쇄 또는 중쇄의 N 말단에 작동 가능하게 연결된다. 링커는, 예를 들어, (G4S)2의 1 내지 4 카피의 GGGGS (G4S)로 구성되거나, 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 중쇄는 N-말단으로부터 C-말단까지를 포함한다:
중쇄는, N-말단부터 C-말단까지, scFv-VH-CH1-힌지-Fc에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하며, 여기서, scFv는 PD-L1 항원-결합 모이어티로부터 유래하고, VH-CH1은 VEGF 항원-결합 모이어티로부터 유래한다; 및
경쇄는, N-말단에서 C-말단까지, VL-CL에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하며, 여기서 VL-CL은 VEGF 항원-결합 모이어티로부터 유래한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG Fc 영역, 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 영역 또는 이의 변이체이다. 구체적으로, 이중특이성 항체의 Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A 치환을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 17의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 본원에 개시된 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간화 항체이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 본 개시에 개시된 바와 같이 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제조하는 방법을 제공하는데, 이는 다음의 단계를 포함한다:
- 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자(들) 또는 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포에서 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 발현시키는 단계; 및
- 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 숙주 세포로부터 분리하는 단계.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 대상에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공하는데, 본 개시에 개시된 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 선택적으로 면역 반응은 PD-L1 및/또는 VEGF 관련 면역 반응이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 대상에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 본 개시에 개시된 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 약학적 조성물을 대상에 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 대상에서 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 대상에 유효량의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 암은 PD-L1 및/또는 VEGF와 관련될 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 치료 대상 암은 결장암 또는 결장직장암이다.
본 발명의 특정 실시예에 있어서, 본원에 개시된 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 암 면역 요법에 사용하기 위해 화학요법제, 방사선 및/또는 다른 약제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 다음과 같은 용도로 제공한다:
i) PD-L1 및/또는 VEGF 관련 면역 반응의 조절;
ii) T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 향상; 및/또는
iii) 암세포에 대한 면역 반응 촉진과 같은 면역 반응 또는 기능 자극.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 암의 진단, 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 면역 반응을 조절하거나 대상에서 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 의약품의 제조상의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 암을 진단, 치료 또는 예방하기 위한 의약품의 제조상의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하는 키트를 제공한다. 이 키트는 암과 같은 질병 또는 상태의 검출, 진단, 예후 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
전술한 것은 요약이며, 따라서 필요에 따라 세부 사항의 단순화, 일반화 및 생략을 포함하므로, 당업자는 요약이 예시적인 것일 뿐이며 어떤 방식으로든 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 본원에 기재된 방법, 구성 및/또는 장치 및/또는 기타 주제의 다른 측면, 특징 및 장점은 본원에 기재된 교시에서 명백해질 것이다. 본 요약은 아래의 상세 설명에서 더 자세히 설명되는 일부 개념을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구된 주제의 주요 특징 또는 필수적인 특징을 식별하기 위한 것이 아니며, 청구된 주제의 범위를 결정하는 데 도움을 주기 위한 것이 아니다. 또한, 본 출원서 전체에 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본 출원서에 전체적으로 참조로 통합되어 있다.
구체적인 설명
본 발명은 다양한 형태로 구현될 수 있지만, 본원에 개시된 것은 본 개시의 원리를 예시하는 특정 예시적 실시예이다. 본 발명은 예시된 특정 실시예에 한정되지 않는다는 점을 강조해야 한다. 또한, 본원에 사용된 모든 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며, 설명되는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며 복수 용어는 단수를 포함한다. 보다 구체적으로, 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 복수의 참조항을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 참조는 복수의 단백질을 포함하며, "세포"에 대한 참조는 세포의 혼합물 등을 포함한다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하다"라는 용어의 사용은 "포함하다" 및 "구성하다"와 같은 다른 형태뿐만 아니라 "포함"이라는 용어의 사용도 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 시작점 및 종료점 사이의 모든 지점을 모두 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 명명법이다. 본 개시의 방법 및 기술은 일반적으로 당업자에게 잘 알려진 종래의 방법에 따라 수행되며, 달리 명시되지 않는 한, 본원 전체에서 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 실험실 절차 및 기술은 당업에서 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 위해 관련 용어의 정의 및 설명은 다음과 같다.
본원에서 "항체" 또는 "Ab"라는 용어는 다클론 항체, 단일 특이성 및 다중 특이성 항체(예: 이중특이성 항체)를 포함한 다양한 항체 구조를 포괄하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 네이티브 온전한 항체는 일반적으로 공유 이황화 결합과 비공유 상호 작용에 의해 결합된 두 개의 중쇄(H)와 두 개의 경쇄(L) 폴리펩타이드 사슬로 구성된 Y자형 사량체 단백질이다. 항체의 경쇄는 κ 경쇄와 λ 경쇄로 분류할 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α, ε로 분류할 수 있으며, 각각 항체의 이소타입 항체를 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 경쇄와 중쇄에서 가변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 구성된 "J" 영역을 통해 불변 영역에 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상의 아미노산으로 구성된 "D" 영역으로 추가 구성된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2, CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상대적으로 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)이라고 함)이 간격을 두고 있는 초가변 영역(보완 결정 영역(CDR)이라고 함)으로 더 나눌 수 있다. 각 VH와 VL은 다음과 같은 순서로 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: N-말단에서 C-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항원 결합 부분을 형성한다. 다양한 영역 또는 도메인에서 아미노산의 분포는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)) 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. 196:901-917; Chothia 등, (1989) Nature 342:878-883의 정의를 따른다. 항체는 다른 항체 이소타입(예를 들면, IgG(예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체 등)일 수 있다.
항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 본 출원의 맥락에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 전장 항체의 단편으로 구성된 폴리펩타이드를 의미하며, 전장 항체가 특이적으로 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하거나 동일한 항원에 대한 결합을 위해 전장 항체와 경쟁하는 능력을 보유한다. 일반적으로 기초 면역학, 7장(Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y., 1989)을 참조하며, 모든 목적을 위해 여기에 참조로 통합되어 있다. 항체의 항원 결합 단편은 예를 들어, 단백질 분해 분해 또는 항체 가변 및 선택적으로 일정한 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전공학 기술과 같은 적절한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지 항체 라이브러리 포함) 등으로부터 알려져 있거나 쉽게 구할 수 있거나 합성할 수 있다. DNA는 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 구성으로 배열하거나 코돈 도입, 시스테인 잔기 생성, 아미노산 수정, 추가 또는 결실 등을 위해 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 시퀀싱 및 조작될 수 있다.
항원 결합 단편의 비제한적인 예는 다음과 같다: (i) Fab 단편, (ii) F(ab')2 단편, (iii) Fd 단편, (iv) Fv 단편, (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자, (vi) dAb 단편 및 (vii) 항체의 과변이 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위(예, CDR3 펩타이드와 같은 분리된 상보성 결정 영역(CDR)) 또는 제약된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드). 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 결실 항체, 키메라 항체, CDR 접목 항체, 디아바디, 트리바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈형 면역 의약품(SMIP) 및 샤크(shark) 가변 IgNAR 도메인과 같은 다른 엔지니어링 분자도 본원에서 사용되는 "항원 결합 단편" 표현 내에 포함된다. 특정 실시예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 가변 도메인 및 불변 도메인은 서로 직접 연결되거나 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 사이에 유연 또는 반유연 결합을 초래하는 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 항체와 관련하여 "가변 도메인"이라는 용어는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 가변 영역 또는 그 단편을 지칭한다. 가변 도메인은 온전한 가변 영역(예를 들어, HCVR 또는 LCVR)을 포함할 수도 있지만, 온전한 가변 영역보다 적게 포함하면서도 항원에 결합하거나 항원 결합 부분을 형성하는 능력을 유지할 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"은 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 온전한 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 일반적으로 가변 도메인을 지칭하는 용어 "항원 결합 부분"와는 달리, 항원-결합 모이어티는 가변 도메인 외에 불변 도메인을 포함할 수 있다. 항원 결합 모이어티의 예에는 가변 도메인, 가변 영역, 이중항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화 Fv 단편(dsFv), a(dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화 디아바디(ds 디아바디), 다중특이적 항체, 낙타화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체가 포함된다. 항원 결합 모이어티는 모 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 Fab 단편 또는 VHH 항체일 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 항원 결합 모이어티는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 이식된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 항원 결합 부분의 더 자세한 형식은 Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp.95-106(2015) 및 Brinkman et al., mAbs, 9(2), pp. 182-212 (2017)에 서술되어 있으며, 본원에 전체 내용이 포함된다.
항체와 관련하여 "Fab"은 이황화 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 첫 번째 불변 영역에 결합되는 단일 경쇄(가변 영역 및 불변 영역 모두)로 구성된 항체의 해당 부분을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "ScFv" 또는 "가변 단일쇄(sing-chain) 단편"은 면역글로불린(VH 및 VL)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합 단백질을 의미하며, 일반적으로 짧은 링커 펩타이드(예를 들어, 약 6~25개 길이의 아미노산)에 의해 연결된다. scFv의 작은 크기는 더 높은 로딩 용량과 표적 리간드의 우수한 배향(orientation)을 가능하게 하여 전반적인 효능 개선을 가져오는 것으로 밝혀졌다.
항체와 관련하여 "Fc"(단편, 결정화 가능의 약자)는 이황화 결합을 통해 제 1 중쇄의 제 2(CH2) 및 제 3(CH3) 불변 영역이 제 2 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 영역에 결합된 항체 부분을 지칭한다. Fc 영역을 지칭할 때 문맥에 따라 Fc 영역의 한 사슬 또는 두 사슬 모두를 지칭할 수 있다. 항체의 Fc 부분은 ADCC 및 CDC와 같은 다양한 이펙터 기능을 담당하지만 항원 결합에는 기능하지 않는다. Fc 도메인을 통해 이펙터 기능을 시작하고 조절하는 항체의 능력은 생체 내 보호 활동의 핵심 구성 요소이다. 항체의 중화 활성은 이전에는 Fab-항원 상호 작용의 결과로만 간주되었지만, 생체 내 활성은 이펙터 백혈구 표면에 발현되는 IgG Fc 도메인과 그 인지 수용체인 Fcγ 수용체(FcγR)의 상호 작용에 크게 의존한다는 사실이 밝혀졌다.
프로그램된 사멸 리간드 1이라고도 알려진 "PD-L1"은 면역계의 적응 부위(arm)를 억제하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 추측되는 40kDa 1형 막단백질이다. PD-L1은 골수성, 림프성, 정상 상피 세포 및 암에서 구성적으로 발현되거나 유도될 수 있는 공동 억제 수용체인 프로그램된 사멸 1(PD-1)의 주요 리간드이다. 본원에서 사용되는 "PD-L1"이라는 용어는 PD-L1 단백질의 아미노산 서열을 지칭할 때, 전장 PD-L1 단백질 또는 PD-L1의 세포외 도메인(PD-L1 ECD) 또는 PD-L1 ECD를 포함하는 단편; 예를 들어, 마우스 또는 인간(mFc 또는 hFc)의 IgG Fc와 융합된 단편인 PD-L1 ECD의 융합 단백질도 포함된다. 또한, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, PD-L1 단백질은 생물학적 기능에 영향을 미치지 않고 아미노산 서열의 돌연변이가 자연적 또는 인위적으로 도입(치환, 결실 및/또는 추가를 포함하되 이에 국한되지 않음)된 단백질도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "PD-L1과 결합하는 항체" 또는 "항- PD-L1 항체"라는 용어는 PD-L1을 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 개시의 항체 및 항원 결합 단편은 가용성 PD-L1 단백질 및/또는 세포 표면 발현 PD-L1과 결합할 수 있다. 가용성 PD-L1은 천연 PD-L1 단백질뿐만 아니라 세포막 통과 도메인이 없거나 세포막과 연관되지 않은 재조합 PD-L1 단백질 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "항-PD-L1 항체"는 단일 특이성을 갖는 단일 항체뿐만 아니라, PD-L1과 결합하는 제1 항원 결합 부분 및 제2 (표적) 항원과 결합하는 제2 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이성 항체를 모두 포함하며, 여기서 항-PD-L1 항원 결합 부분은 본원 표 A에 명시된 바와 같이 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 임의의 것을 포함한다. 항-PD-L1 이중특이성 항체의 예는 본원의 다른 부분에 기재되어 있다. "항원-결합 분자"라는 용어는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어 이중특이성 항체를 포함한다.
"혈관 내피 성장 인자"(혈관 내피 성장 인자, VEGF-A라고도 함)는 혈관 형성을 자극하는 세포에서 생성되는 신호 단백질이다. VEGF는 성장 인자의 하위 계열인 혈소판 유래 성장 인자 계열의 시스틴-매듭(cystine-knot) 성장 인자이다. 혈관 형성(배아 순환계의 신생 형성)과 혈관 발생(기존 혈관 구조에서 혈관 성장)에 모두 관여하는 중요한 신호 단백질이다. VEGF 군(family)에는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF(태반 성장 인자), VEGF-E(Orf-VEGF) 및 Trimeresurus flavoviridis　 svVEGF가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 " VEGF 수용체" 또는 "VEGFR"이라는 용어는 혈관내피세포성장인자(VEGF) 수용체를 의미한다. VEGFR에는 1, 2, 3으로 번호가 매겨진 세 가지 주요 하위 유형이 있다. VEGF 수용체는 대체 스플라이싱에 따라 막 결합형 또는 수용성일 수 있다. VEGF 수용체 중 VEGFR-1은 VEGF-A, PlGF 및 VEGF-B와 결합한다.
본 문서에서 사용되는 "이중특이성 항체"는 두 개의 서로 다른 단일 클론 항체에서 파생된 단편이 있고 두 개의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있는 인공 항체를 의미한다. 두 개의 에피토프는 동일한 항원에 존재할 수도 있고 두 개의 다른 항원에 존재할 수도 있다.
"이중특이성 항원 결합 분자"라는 용어는 적어도 제1 항원 결합 도메인(본원에서 제1 항원 결합 부분이라고도 함) 및 제2 항원 결합 도메인(본원에서 제2 항원 결합 부분이라고도 함)을 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 분자 복합체를 의미한다. 본 발명의 일부 실시예에 있어서, "이중특이성 항원-결합 분자"는 "이중특이성 항체"이다. 이중특이성 항체 내의 각 항원 결합 도메인은 단독으로 또는 하나 이상의 추가 CDR 및/또는 FR과 조합하여 특정 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 본 개시의 맥락에서, 제1 항원-결합 부위는 제1 항원(예컨대, PD-L1)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 부위는 제2의 별개의 항원(예컨대, VEGF)에 특이적으로 결합한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "항-PD-L1/항-VEGF 항체", "항-PD-L1/항-VEGF 이중특이성 항체", "PD-L1 및 VEGF에 대한 항체", "항-PD-L1×VEGF 이중특이성 항체", "PD-L1×VEGF 항체"라는 용어는 PD-L1과 VEGF에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체를 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 "단일 클론 항체" 또는 "mAb"라는 용어는 단일 분자 구성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단일 클론 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화력을 나타낸다.
본 문서에서 사용되는 "인간 항체"라는 용어는 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 생식세포 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된 것이다. 또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식선 면역 글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나 본 문서에서 사용되는 "인간 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식선에서 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체를 포함하지 않는다.
"인간화 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식세포에서 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체를 지칭하기 위한 것이다. 인간 프레임워크 서열 내에서 추가적인 프레임워크 영역 변이가 이루어질 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 스페이서 또는 링커를 사용하거나 사용하지 않고 관심 있는 두 개 이상의 생물학적 서열을 의도한 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있는 방식으로 병치된 것을 의미한다. 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 이는 폴리펩타이드 서열이 연결된 제품이 의도한 생물학적 기능을 가질 수 있도록 허용하는 방식으로 연결되어 있음을 의미하기 위한 것이다. 예를 들어, 항체 가변 영역은 항원 결합 활성을 갖는 안정된 제품을 제공하기 위해 불변 영역에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이 용어는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일렌서 서열 등)에 작동 가능하게 연결된 경우, 이는 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드로부터 폴리펩타이드의 조절된 발현을 허용하는 방식으로 연결된 것을 의미하기 위한 것이다. 본원에서 폴리펩타이드를 형성하기 위해 연결된 도메인을 설명하기 위해 사용되는 작동 가능하게 연결된 용어는 "-"로 표시될 수 있으며, 도메인 간의 직접 연결 또는 단일 아미노산 또는 일련의 (G4S)n 링커와 같이 길이가 1 내지 30인 아미노산으로 구성된 링커(n=1내지5 ; 1, 2, 3, 4 또는 5)를 통한 연결을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "Ka"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 결합률을 지칭하기 위한 것이고, 본원에서 사용되는 "Kd"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하기 위한 것이다. 항체의 Kd 값은 당업에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 본원에서 사용되는 "KD "라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하기 위한 것으로서, 이는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지며 몰 농도(M)로 표현된다. 항체의 Kd를 측정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이며, 가급적이면 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이 좋다.
본원에서 사용되는 IgG 항체에 대한 "고친화성"이라는 용어는, KD 가 1 x 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 더욱 바람직하게는 1x10-9 M 이하, 더욱 바람직하게는 5 x 10-10 M 이하, 더욱 바람직하게는 4x10-10 M, 더욱 바람직하게는 3x10-10 M 이하, 더욱 바람직하게는 2x10-10 M 이하, 더욱 바람직하게는 1x10-10 M 이하, 더욱 바람직하게는 5x10-11 M 이하, 및 더욱 바람직하게는 3x10-11 M 이하의 표적 항원에 대한 항체를 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 "EC50 "라는 용어는 "절반 최대 유효 농도(half maximal effective concentration)"라고도 하며, 지정된 노출 시간 후 기준치와 최대치의 중간에서 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독성물질의 농도를 의미한다. 애플리케이션의 맥락에서 EC50 는 "nM" 단위로 표시된다.
본 문서에서 사용되는 "IC50 "라는 용어는 "절반 최대 억제 농도 (half maximal inhibitory concentration)"이라고도 하며, 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 물질의 효능을 측정하는 척도이다. 응용 프로그램의 맥락에서 IC50 는 "nM" 단위로 표시된다.
본원에서 사용되는 "결합 억제" 능력은 항체 또는 항원-결합 단편이 두 분자(예를 들어, 인간 PD-L1 및 PD-1, VEGFR1 및 VEGF)의 결합을 검출 가능한 수준으로 억제하는 능력을 지칭한다. 특정 실시예에서, 두 분자의 결합은 50 nM 이하, 30 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM 이하 또는 그 이하의 IC50 에서 항체에 의해 억제될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "분리"라는 용어는 인위적인 방법으로 자연 상태에서 분리된 상태를 의미한다. 특정 "분리된" 물질 또는 성분이 자연에 존재하는 경우, 이는 자연 환경이 변화하거나 해당 물질이 자연 환경으로부터 분리되었거나 또는 두 가지 모두에 해당하기 때문에 가능할 수 있다. 예를 들어, 특정 분리되지 않은 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 특정 살아있는 동물의 체내에 자연적으로 존재하며, 이러한 자연 상태에서 분리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드라고 한다. "분리된"이라는 용어는 혼합된 인공 또는 합성 물질이나 분리된 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순한 물질을 제외한다.
본원에서 사용되는 "분리된 항체"라는 용어는 항원 특이성이 다른 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하기 위한 것이다(예를 들어, PD-L1/VEGF 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 PD-L1/VEGF 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 항체이다). 그러나 인간 PD-L1/VEGF 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 PD-L1/VEGF 단백질과 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 거의 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 운반체를 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 해당 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 숙주 세포에 형질 주입, 형질전환 또는 형질 감염을 통해 운반된 유전 물질 요소를 숙주 세포에서 발현 할 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체, λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스를 포함하되 이에 국한되지 않는다. 벡터로 사용할 수 있는 동물 바이러스에는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 수두 바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스(예를 들어, SV40)가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하되 이에 국한되지 않는 발현 제어를 위한 여러 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제의 기원을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포"라는 용어는 관심 있는 단백질, 단백질 단편 또는 펩타이드를 생성하도록 조작할 수 있는 세포 시스템을 의미한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 설치류(쥐, 생쥐, 기니피그 또는 햄스터)에서 유래한 포유류 배양 세포(예를 들어, CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0) 또는 인간 조직 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 형질전환 동물 또는 배양 조직 내에 구성된 세포를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 포함한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변이가 발생할 수 있으므로 이러한 자손은 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함된다.
본 문서에서 사용되는 "동일성" 또는 "상동성"이라는 용어는 서열을 정렬하고 비교하여 결정되는 둘 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 간의 관계를 의미한다. '동일성 백분율'은 비교 대상 분자의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 사이에 동일한 잔기가 있는 비율을 의미하며, 비교 대상 분자 중 가장 작은 분자의 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산에서 정렬의 차이(있는 경우)는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")을 통해 해결하는 것이 바람직하다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하는 데 사용할 수 있는 방법에는 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073. 에 설명된 방법이 포함된다.
본 문서에서 사용되는 "면역원성"이라는 용어는 유기체에서 특정 항체 또는 감작된 림프구의 형성을 자극하는 능력을 의미한다. 항원이 특정 면역세포를 자극하여 활성화, 증식 및 분화시켜 최종적으로 항체 및 감작된(sensitized) 림프구와 같은 면역효과물질을 생성할 수 있는 성질을 의미할 뿐만 아니라, 항원으로 생체를 자극한 후 생체의 면역계에서 항체 또는 감작된 T 림프구가 형성될 수 있는 특이적 면역반응을 의미한다. 면역원성은 항원의 가장 중요한 특성이다. 항원이 숙주에서 면역 반응의 생성을 성공적으로 유도할 수 있는지 여부는 항원의 특성, 숙주의 반응성, 면역화 수단의 세 가지 요소에 따라 달라진다.
본 문서에서 사용되는 "형질전환(transfection)"이라는 용어는 핵산이 진핵세포, 특히 포유류 세포에 도입되는 과정을 의미한다. 형질전환을 위한 프로토콜 및 기술에는 지질 형질전환과 전기 천공과 같은 화학적 및 물리적 방법이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 다수의 형질전환 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197. 본 발명의 특정 실시예에 있어서, 인간 PD-L1/VEGF 유전자를 293F 세포에 형질전환시켰다.
본원에서 사용되는 "SPR" 또는 "표면 플라즈몬 공명"이라는 용어는 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변화를 감지하여 실시간 생체 특이적 상호작용을 분석할 수 있는 광학 현상(예를 들어, BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 뉴저지 주 피스카타웨이)을 지칭하고 이를 포함한다. 자세한 설명은 실시예 5 및 Jnsson, ., t l. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jnsson, ., t l. 1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277에 기재되어있다.
본 문서에서 사용되는 "형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting )" 또는 "FACS"라는 용어는 특수한 유형의 유세포 분석법을 지칭한다. 이는 각 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성에 따라 생물학적 세포의 이질적인 혼합물을 한 번에 한 세포씩 두 개 이상의 용기에 분류하는 방법을 제공한다(FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. Retrieved 2017-11-09.). FACS를 수행하기위한 기기는 당업자에게 알려져 있으며 대중에게 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 기기의 예로는 Becton Dickinson (Foster City, Calif.)의 FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 기기, Coulter Epics Division (Hialeah, Fla.)의 Epics C 및 Cytomation (Colorado Springs, Colo.)의 MoFlo가 있다.
"대상"라는 용어에는 인간 또는 비인간 동물이 포함되며, 가급적 사람이 포함된다.
본원에서 사용되는 "암"이란 종양 또는 악성 세포의 성장, 증식 또는 전이를 매개로 하는 고형 종양 및 백혈병과 같은 비고형 종양을 의미하며 의학적 상태를 유발하는 모든 것을 의미한다.
본 문서에서 질병 치료와 관련하여 사용되는 "치료", "치료 중" 또는 "치료된"라는 용어는 일반적으로 인간 또는 동물의 치료 및 요법과 관련되며, 질병의 진행 억제와 같이 원하는 치료 효과가 달성되는 경우, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 질병의 퇴행, 질병의 호전 및 질병의 완치를 포함한다. 암의 경우 "치료"는 종양 또는 악성 세포의 성장, 증식 또는 전이 또는 이들의 조합을 억제하거나 늦추는 것을 의미할 수 있다. 종양의 경우 "치료"에는 종양의 전부 또는 일부 제거, 종양 성장 및 전이 억제 또는 둔화, 종양 발생 예방 또는 지연 또는 이들의 일부 조합이 포함된다.
본 문서에서 질병 예방과 관련하여 사용되는 "예방", "예방법" 또는 "방지"라는 용어는 일반적으로 질병의 발병을 예방 또는 지연시키거나 대상(사람 또는 동물)에서 해당 질병의 임상 또는 무증상 증상의 발현을 방지하는 것을 의미하며, 예를 들어 해당 질병 또는 질병에 걸리기 쉽지만 아직 진단을 받지 않은 대상에서 질병이 발생하지 않도록 예방하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "유효량"이라는 용어는 원하는 치료 요법에 따라 투여될 때 합리적인 유익성/위험성 비율에 상응하는 원하는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 활성 화합물 또는 활성 화합물을 구성하는 물질, 조성물 또는 용량의 양과 관련된다. 예를 들어, '유효량'은 PD-L1/VEGF 관련 질병 또는 상태의 치료와 관련하여 사용될 때, 해당 질병 또는 상태를 치료하는 데 효과적인 양 또는 농도의 항체 또는 항원 결합 부분을 의미한다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 제제, 희석제, 부형제 및/또는 그 염이 제제의 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 호환되고 수용자와 생리적으로 호환된다는 의미이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"라는 용어는 당업자에게 잘 알려진 대상물 및 활성제와 약리학적 및/또는 생리적으로 호환되는 담체 및/또는 부형제를 지칭하며 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), pH 조절제, 계면활성제, 어쥬번트 및 이온 강도 강화제를 포함하되 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액을 포함하되 이에 국한되지 않고, 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제(예를 들어, Tween-80)를 포함하되 이에 국한되지 않으며, 이온 강도 강화제는 염화나트륨을 포함하되 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "어쥬번트(adjuvant)"라는 용어는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 유기체에 미리 전달될 때 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 유기체의 면역 반응 유형을 변화시킬 수 있는 비특이적 면역 증강제를 지칭한다. 알루미늄 어쥬번트(예를 들어, 수산화 알루미늄), 프룬트 어쥬번트(Freund's adjuvant)(예를 들어, 프룬트 완전 어쥬번트 및 프룬트 불완전 어쥬번트), 코린 박테리아 파붐, 리포다당류, 사이토카인 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 어쥬번트가 존재한다. 프룬트 어쥬번트는 현재 동물 실험에서 가장 일반적으로 사용되는 어쥬번트이다. 수산화알루미늄 어쥬번트는 임상시험에서 더 일반적으로 사용된다.
이중특이성 항체 및 이의 항원 결합 부분
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 이중특이성 항체 및 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 본 발명의 일부 일부 실시예에서, 이중특이성 항체 및 이의 항원 결합 부분은 PD-L1에 대한 제1 특이성 및 VEGF에 대한 제2 특이성을 갖는다. 일부 추가적인 실시예에서, 본원에 제공된 항체는 다중 특이적이다.
본 발명의 특정 예시적인 실시예에 따르면, 본 발명은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 모이어티 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 이러한 항체는 예를 들어, 본원에서 "항-VEGF/항-PD-L1" 또는 "항-PD-L1/VEGF" 또는 "항-PD-L1xVEGF" 또는 "PD-L1xVEGF" 이중특이성 항체 또는 기타 유사한 용어로 지칭될 수 있다.
일부 실시예에서, 이중특이성 항체는 항-VEGF 항체에 작동 가능하게 연결된 모 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 결합 모이어티를 포함한다. 일부 다른 실시예에서, 이중특이성 항체는 항-PD-L1 항체에 작동 가능하게 연결된 모 항-VEGF 항체로부터 유래된 VEGF 결합 모이어티를 포함한다. 일부 다른 실시예에서, 이중특이성 항체는 모 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 결합 모이어티와 모 항-VEGF 항체로부터 유래된 VEGF 결합 모이어티에 작동 가능하게 연결된 모 항-PD-L1 항체로부터 유래된 PD-L1 결합 모이어티를 포함한다.
본 개시의 이중특이성 항체는 인간 PD-L1 및 인간 VEGF에 높은 친화력으로 결합할 수 있다. 본 개시의 항체와 PD-L1 또는 VEGF의 결합은 당업자에게 잘 확립된 하나 이상의 기술, 예를 들어 ELISA를 사용하여 평가할 수 있다. ELISA 분석법에서, 재조합 PD-L1 단백질이 사용될 수 있다. 본원에 개시된 항체의 결합 특이성은 또한 PD-L1 단백질 또는 VEGF 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터링함으로써(예를 들어, 유세포 분석) 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체는 유세포 분석법에 의해 테스트될 수 있는데, 이 분석법은 항체를 인간 PD-L1을 발현하는 세포주(예컨대, 세포 표면에 PD-L1을 발현하도록 형질전환된 CHO 세포)와 반응시킨다. 추가적으로 또는 대안으로, 결합 동역학(예: KD 값)을 포함한 항체의 결합은 BIAcore 결합 분석에서 테스트할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 표면 플라즈몬 공명으로 측정한 1×10-8 M 이하의 KD , 5×10-9 M 이하의 KD , 2×10-9 M 이하의 KD , 1×10-9 M 이하의 KD, 5×10-10 M 이하, 4×10-10 M 이하, 3×10-10 M 이하, 2×10-10 M 이하, 1×10-10 M 이하, 5×10-11 M 이하, 또는 3×10-11 M 이하의 KD 로 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 VEGF 단백질에 결합한다.
예시에서 설명한 바와 같이, 본 개시의 이중특이성 항체는 높은 친화력으로 PD-L1 및 VEGF에 결합할 수 있고, 예를 들어 nM 수준의 IC50으로 PD-1/PD-L1 및 VEGFR/VEGF 신호 경로를 모두 효과적으로 차단하고, VEGF에 의한 HUVEC 증식을 차단하고, 사이토카인 분비에 대한 강력한 작용 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 단일특이성 항-PD-L1 항체(예컨대, 아테졸리주맙) 또는 다른 항-PD-L1/VEGF 이중특이성 항체에 비해 PD-L1에 더 높은 결합 친화력을 갖는다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 단일특이성 항-PD-L1 항체 또는 다른 항-PD-L1/VEGF 이중특이성 항체보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 높은 PD-L1에 대한 결합 친화력을 갖는다 (예를 들어 KD를 측정했을 때와 같이).
본 발명의 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 단일특이성 항-VEGF 항체(예컨대, 아바스틴) 또는 다른 항-PD-L1/VEGF 이중특이성 항체와 비교하여 VEGF에 대한 결합 친화력이 더 높다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 폴리펩타이드 복합체는 단일특이성 항-VEGF 항체 또는 다른 항-PD-L1/VEGF 이중특이성 항체보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 높은 VEGF에 대한 결합 친화력을 갖는다(예를 들어, KD를 측정했을 때와 같이).
본 발명의 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 단일특이성 항-PD-L1 항체(예컨대, 아테졸리주맙)에 비해 PD-L1에 더 높은 결합 친화력을 가지며 및/또는 단일특이성 항-VEGF 항체(예컨대, 아바스틴)에 비해 VEGF에 더 높은 결합 친화력을 가진다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 아테졸리주맙에 비해 PD-L1에 대한 결합 친화력이 더 높고, 아바스틴에 비해 VEGF에 대한 결합 친화력이 더 높거나 유사하다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 단일특이성 항-PD-L1 항체 및 단일특이성 항-VEGF 항체의 조합, 예를 들어 아테졸리주맙과 아바스틴의 조합에 비해 항종양 효능이 현저히 개선된다.
일부 실시예에서, 본원에 개시된 이중특이성 항체는 다른 항-PD-L1/VEGF 이중특이성 항체와 비교하여 PD-L1에 대한 결합 친화력이 더 높고 및/또는 다른 항-PD-L1/VEGF 이중특이성 항체와 비교하여 VEGF에 대한 결합 친화력이 더 높다.
PD-L1 항원 결합 모이어티
본원에 정의된 PD-L1 결합 모이어티는 이중특이성 항체에 적합하고 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 다양한 형식(예컨대, VHH, scFv, Fab)으로 제공될 수 있다. 일반적으로, 이중특이성 항체에 포함된 PD-L1 결합 모이어티는 단일특이성 항-PD-L1 항체로부터 유래되며, 이는 공지된 항체 또는 신규로 개발된 항체일 수 있다. 본 출원에 따른 일부 실시예에서, PD-L1 결합 모이어티는 완전 인간 단일클론 항체로부터 유래된다. 특정 항원에 대한 완전 인간 항체를 얻기 위한 다양한 방법이 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 인코딩 서열을 이용하는 형질전환 비인간 동물(예를 들어, OMT 쥐)을 면역화함으로써 얻을 수 있다.
PD-L1 결합 모이어티는 항-PD-L1 단일클론 항체로부터 유래될 수 있다. 본원에서 "유래하다"는 것은 PD-L1 결합 모이어티가 항원 결합 능력을 유지하는 PD-L1의 항원 결합 부분 또는 이의 변이체를 포함하거나 구성한다는 것을 의미한다. 예를 들어, PD-L1 결합 모이어티는 항-PD-L1 모체 항체의 scFv, Fab 또는 VHH 단편일 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, PD-L1 결합 모이어티는 항-PD-L1 항체의 VH에 작동 가능하게 연결된 항-PD-L1 항체의 VL을 포함하는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)을 포함한다. VH와 VL은 (G4S)n과 같은 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있으며, n=1 내지 4이다.
본 발명의 일부 실시예에서, PD-L1 항원 결합 모이어티는 다음과 같이 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함한다:
(i) 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 1과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(ii) 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 2와 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
(iii) 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 3과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
(iv) 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 4와 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(v) 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 5와 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(vi) 서열 번호 6의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 6과 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
일부 실시예에서, VH는 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR1; (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR2; 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR3를 포함하며; 및 VL은 (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR1 (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR2; 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR3를 포함한다.
일부 실시예에서, PD-L1 항원-결합 모이어티는 VH 및 VL 영역을 포함하며, 상기 VH 영역은 (i) 서열번호 13의 아미노산 서열; (ii) 서열번호 13과 적어도 85%, 90% 또는 95%의 동일성(바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 을 갖는 아미노산 서열, 또는 (iii) 서열번호 13과 비교하여 하나 이상의 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) 아미노산의 추가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열; 및/또는
상기 VL 영역은 (i) 서열번호 14의 아미노산 서열; (ii) 서열번호 14와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 동일성(바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 을 갖는 아미노산 서열, 또는 (iii) 서열번호 14와 비교하여 하나 이상의 (예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) 아미노산의 추가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열이다.
VEGF 항원 결합 모이어티
유사하게, 본원에 제공된 VEGF 항원-결합 모이어티는 모 항-VEGF 단일특이적 항체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, VEGF 항원-결합 모이어티는 항-VEGF 완전 항체의 Fab 단편, 즉 중쇄의 VH 영역 및 CH1 영역, 경쇄의 VL 영역 및 CL 영역을 포함한다.
모 항체로 사용되는 항-VEGF 항체는 당업자에게 이미 공지된 단일클론 항체(예: 베바시주맙)이거나 신규로 개발된 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 완전 인간 항체 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 일부 실시예에서, VEGF 결합 모이어티는 완전한 인간 단일클론 항체로부터 유래된다. 예를 들어, VEGF 결합 모이어티는 항-VEGF 모체 항체의 scFv, Fab, 또는 VHH 단편일 수 있다. 일부 실시예에서, VEGF 결합 모이어티는 항-VEGF 항체의 VL과 연관된 항-VEGF 항체의 VH를 포함하는 Fab을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, VEGF 항원-결합 모이어티의 VH 영역은 다음과 같이 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 CDR(HCDR)을 포함한다:
(i) 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 7과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(ii) 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 8과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
(iii) 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 9과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 및/또는
VL 영역은 다음과 같이 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR(LCDR)를 포함한다:
(i) 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 10과 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 11과 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(iii) 서열 번호 12의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 추가, 결실 또는 치환에 의해 서열 번호 12과 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
일부 실시예에서, VH는 (i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR1; (ii) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR2; 및 (iii) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR3를 포함하며; 및 VL은 (i) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR1; (ii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR2; 및 (iii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR3를 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서 VEGF 항원-결합 모이어티의 VH는 (i) 서열번호 15의 아미노산 서열; (ii) 서열번호 15와 적어도 85%, 90% 또는 95%의 동일성(바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 동일성)을 갖는 아미노산 서열; 또는 (iii) 서열번호 15와 비교하여 하나 이상의 (예: 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) 아미노산의 추가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서 VEGF 항원-결합 모이어티의 VL는 (i) 서열번호 16의 아미노산 서열; (ii) 서열번호 16과 적어도 85%, 90% 또는 95%의 동일성(바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%(예를 들어, 예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 동일성)을 갖는 아미노산 서열; 또는 (iii) 서열번호 16과 비교하여 하나 이상의 (예: 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) 아미노산의 추가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
각 CDR에 대한 아미노산 할당은 별도의 언급이 없는 한, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th　Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al.,1996, PMID: 8876650; 또는 Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed.,　Wily-VCH Verlag GmbH and Co. 에서 제공하는 넘버링 체계를 따를 수 있다.
항체 서열의 가변 영역 및 CDR은 당업에서 개발된 일반적인 규칙(예: kabat 번호 시스템 등 위에 명시된 바와 같이)에 따라 또는 알려진 가변 영역의 데이터베이스에 서열을 정렬하여 식별할 수 있다. 이러한 영역을 식별하는 방법은 Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000에 기재되어 있다. 항체 서열의 예시적인 데이터베이스는 "Abysis" 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs (A.C. Martin in the Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England 에 의해 유지 관리됨) 및 VBASE2 웹사이트 www.vbase2.org에 설명되어 있으며 이를 통해 Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)에 기재된 바와 같이 액세스 할 수 있다. 가급적 서열은 Kabat, IMGT 및 단백질 데이터 은행(PDB)의 서열 데이터를 PDB의 구조 데이터와 통합하는 Abysis 데이터베이스를 사용하여 분석한다. Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter　Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In:　Antibody Engineering Lab Manual　(Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, 또한 웹사이트 bioinforg.uk/abs 에서 이용가능)를 참조할 수 있다. Abysis 데이터베이스 웹사이트에는 본 지침에 따라 사용할 수 있는 CDR 식별을 위해 개발된 일반 규칙이 추가로 포함되어 있다. 달리 명시되지 않는 한, 여기에 명시된 모든 CDR은 Kabat에 따라 Abysis 데이터베이스 웹사이트에 따라 도출된 것이다.
두 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 E. Meyers와 W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있으며, PAM120 무게 잔류 테이블, 간격 길이 페널티 12 및 간격 페널티 4를 사용한다. 또한 두 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman과 Wunsch의 알고리즘(J. Mol. 48:444-453 (1970)으로 결정될 수 있으며, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 개시의 단백질 서열은 예를 들어, 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 더 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시의 항체 분자와 상동하는 아미노산 서열을 얻기 위해 점수 = 50, 단어 길이 = 3의 XBLAST 프로그램을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기술된 바와 같이 Gapped BLAST 를 활용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때는 각 프로그램의 기본 매개변수(예: XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.
본 발명의 다른 실시예에서, CDR 아미노산 서열은 상술한 각 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 가변 영역의 아미노산 서열은 상술한 각 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
바람직하게는, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 CDR은 2개 이하의 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산의 보존적 치환을 포함한다. 본원에서 사용되는 "보존적 치환(conservative substitution)"이라는 용어는 아미노산 서열을 구성하는 단백질/폴리펩타이드의 필수 특성에 불리하게 영향을 미치거나 변화시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 예를 들어, 보존적 치환은 부위 지향적 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당업자에게 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 해당 아미노산 잔기와 물리적 또는 기능적으로 유사한(예를 들어, 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합 형성 능력을 포함한 화학적 특성 등) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업에 정의되어 있다. 이러한 계열에는 알칼리성 측쇄를 갖는 아미노산 (예 : 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예 : 아스파르트 산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예 : 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예 : 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β- 분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예 : 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예 : 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하는 아미노산이 있다. 따라서, 상응하는 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열의 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이 바람직하다. 아미노산 보존적 치환을 식별하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi 외, Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); Burks et al. Natl. USA 94: 412-417 (1997), 참조용으로 본원에 통합됨).
이중특이성 항체 제작
항 PD-L1/VEGF 이중특이성 항체를 구성하기 위해, 상술한 바와 같이 PD-L1 항원 결합 모이어티와 VEGF 항원 결합 모이어티는 다양한 형태로 서로 융합될 수 있다. 이중특이성 항체의 PD-L1 항원-결합 모이어티 및 VEGF 항원-결합 모이어티는 서로 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 특정 실시예에서, PD-L1 항원-결합 모이어티 및 VEGF 항원-결합 모이어티는 링커에 의해 서로 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드 링커일 수 있는데, 예를 들어, 1-4 카피의 GGGGS(G4S)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 링커는 (G4S)2 이다.
본 발명의 일부 특정 실시예에서, PD-L1 항원-결합 모이어티는 VEGF 항원-결합 모이어티의 N 말단에 융합된다. PD-L1 항원-결합 모이어티가 scFv인 경우, PD-L1 항원-결합 모이어티의 단일 사슬은 선택적으로 링커를 통해 VEGF 항원-결합 모이어티의 중쇄 또는 경쇄에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 바람직하게는, PD-L1 항원 결합 모이어티는 펩타이드 링커를 통해 VEGF 항원 결합 모이어티의 중쇄에 연결된다.
특정 실시예에서, PD-L1 항원-결합 모이어티 및 VEGF 항원-결합 모이어티의 융합은 Fc 영역에 추가로 결합된다. 또는, PD-L1 모이어티 및 VEGF 모이어티는 각각 Fc 영역의 한쪽 말단에 연결된다.
본원에 제공된 이중특이성 항체 및 항원 결합 부분은 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법으로 제조될 수 있다. 종래의 접근법에서는, 두 개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 숙주 세포에서 공동 발현시켜 재조합 방식으로 이중특이성 항체를 생산한 후(예를 들어, Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983) 참조), 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 두 특이성에 대한 항체 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 각각 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합한 다음, 이중특이성 항체의 재조합 발현을 위해 경쇄 서열에 대한 발현 벡터와 함께 적합한 숙주 세포에 공동 전이되는 발현 벡터에 삽입하는 다른 재조합 접근법도 사용될 수 있다(예: WO 94/04690; Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) 참조). 유사하게, scFv 이량체도 숙주 세포로부터 재조합적으로 구성 및 발현될 수 있다(예: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조).
Fc 영역
본 발명의 특정 실시예에서, Fc 영역은 VEGF 항원-결합 모이어티에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 개시된 이중특이성 항체의 Fc 영역은 바람직하게는 인간 IgG Fc 영역이다. IgG Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하되 이에 국한되지 않는 임의의 이소타입일 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, Fc 영역은 IgG1 이소타입이다. 구체적으로, 이중특이성 항체의 중쇄는 scFv-VH-CH1-힌지-Fc에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함할 수 있는데, 여기서 scFv는 PD-L1 항원-결합 모이어티로부터 유래하고 VH-CH1은 VEGF 항원-결합 모이어티로부터 유래하며; 경쇄는 VL-CL에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하며, 여기서 VL-CL은 VEGF 항원-결합 모이어티로부터 유래한다.
본 개시의 이중특이성 항체의 맥락에서, Fc 영역은 Fc 영역의 특정 키메라 버전과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이(예컨대, 삽입, 결실 또는 치환)를 포함할 수 있다. 본 발명은 Fc 영역에서 하나 이상의 변이를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하며, 이는 Fc와 FcRn 또는 FcγR 사이의 변이된 결합 상호 작용을 갖는 변이된 Fc 영역을 초래한다.
예를 들어, Fc 영역은 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 또는 기타 이펙터 기능을 변경하는 하나 이상의 아미노산 변이(예: Leu234Ala/Leu235Ala 또는 LALA)을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, Fc 변이는 LALA 돌연변이, 즉 L234A 및 L235A의 돌연변이를 포함한다(Kabat 외에서와 같이 EU 넘버링에 따라). LALA 돌연변이는 아마도 항체 이펙터 기능을 방해하는 데 가장 일반적으로 사용되는 돌연변이일 것이다(예: 특정 FcγR에 대한 Fc 결합을 제거하고, PBMC 및 단핵구에 의해 매개되는 ADCC 활성을 감소시키는 등). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔류물을 지칭할 때 사용된다(예: Kabat 등, 위 논문에서 보고된 EU 인덱스). "Kabat 에서와 같은 EU 넘버링" 또는 "Kabat 에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔류물 번호를 나타낸다. 본 문서에 달리 명시되지 않는 한, 항체의 불변 영역에서 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 번호 지정을 의미한다.
특정 실시예에서, Fc 영역은 힌지 영역을 통해 VEGF 결합 모이어티에 작동 가능하게 연결되며, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 특정 실시예에서, 힌지 영역은 Fc와 동일한 이소타입을 가지며 또한 인간 IgG1로부터 유래된다.
본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 예를 들어, 핵산 서열은 이중특이성 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩할 수 있다. 또는, 핵산 서열은 PD-L1 항원-결합 모이어티, 또는 VEGF 항원-결합 모이어티의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩할 수 있다. 핵산 서열은 이중특이성 항체의 Fc 영역을 추가로 인코딩할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, 분리된 핵산 분자는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다:
(A) VEGF 결합 모이어티의 중쇄 서열 또는 경쇄 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
(B) PD-L1 결합 모이어티의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
(C) PD-L1 결합 모이어티의 아미노산 서열에 작동 가능하게 연결된 VEGF 결합 모이어티의 중쇄 서열을 인코딩하는 핵산 서열;
(D) (A)-(C)의 모든 조합; 그리고
(E) (A)-(D)의 핵산 서열의 상보적 가닥에 고강도 조건에서 교잡한 핵산 서열.
본 발명의 일부 실시예에 있어서, 이중특이성 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 19에 나타낸 바와 같고, 이중특이성 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 20에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 다른 실시예에서, 발현 벡터는 이중특이성 항체의 불변 영역, 예를 들어 인간화 이중특이성 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
본 개시의 맥락에서 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 핵산 벡터(적절한 발현 제어 요소 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예로는 SV40 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바쿨로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합에서 유래한 벡터, 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서, PD-L1 또는 VEGF 항체 인코딩 핵산은 예를 들어 선형 발현 요소를 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터에 구성된다(예를 들어 Sykes 및 Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)에 기술된 바와 같이), 압축된 핵산 벡터(예를 들어 US 6,077, 835 및/또는 WO 00/70087에 기술된 바와 같이), pBR322, pUC 19/18 또는 pUC 118/119와 같은 플라스미드 벡터, "미지(midge)" 최소 크기의 핵산 벡터(예를 들어 Schakowski et al. , Mol Ther 3, 793-800 (2001)에 설명된 바와 같이), 또는 CaP04 침전 구조와 같은 침전된 핵산 벡터 구조(예를 들어 WO200046147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al. , Cell 14, 725 ( 1978) 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981))로 사용된다. 이러한 핵산 벡터 및 그 사용법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).
본 발명의 일 실시예에서, 벡터는 박테리아 세포에서 항-PD-L1 항체 및/또는 항-VEGF 항체의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예로는 블루스크립트(스트라타진), pIN 벡터 Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET 벡터(Novagen, Madison WI) 등과 같은 발현 벡터를 포함한다. 벡터는 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수도 있고, 또는 다른 벡터일 수도 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도적 프로모터를 포함하는 벡터를 포함한다(F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), and Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)에서 리뷰된 것).
벡터는 포유류 세포에서의 발현에 적합한 벡터일 수도 있고, 선택 가능한 마커로서 글루타민 합성효소를 포함하는 벡터(예: Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10: 169-175에 기술된 벡터)일 수도 있다.
핵산 및/또는 벡터는 또한 분비/위치화 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 초기 폴리펩타이드 사슬과 같은 폴리펩타이드를 세포질 주변 공간 또는 세포 배양 배지로 표적화할 수 있다. 이러한 서열은 당업자에게 알려져 있으며 분비 리더(secretion leader) 또는 신호 펩타이드를 포함한다.
벡터는 임의의 적합한 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 촉진 요소를 포함하거나 이와 연관될 수 있다. 이러한 요소의 예로는 강력한 발현 프로모터(예: 인간 CMV IE 프로모터/인핸서, RSV, SV40, SL3-3, MMTV 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리(A) 종결 서열, 대장균의 플라스미드 생성물에 대한 복제 기원, 선택 가능한 마커로서의 항생제 내성 유전자 및/또는 편리한 복제 부위(예: 폴리링커)가 포함된다. 핵산은 또한 CMV IE와 같은 구성 프로모터와는 반대로 유도 가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 형질전환종과 같은 본 개시의 이중특이성 항체를 생성하는 재조합 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포에 관한 것이다.
PD-L1-특이적 항체는 본원에 정의된 바와 같이 본 개시의 항체를 생성하는 형질전환종과 같은 재조합 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포 또는 본원에 정의된 바와 같이 본 개시의 이중특이항체에서 발현될 수 있다. VEGF-특이적 항체는 마찬가지로 본원에 정의된 바와 같이 본 개시의 항체 또는 본원에 정의된 바와 같이 본 개시의 이중특이성 항체를 생성하는 형질전환종과 같은 재조합 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
숙주 세포의 예로는 효모, 박테리아, 식물 및 포유류 세포(예: CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 또는 NSO 세포 또는 림프구 세포 등)가 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 숙주 세포는 세포 게놈에 안정적으로 통합된 제1 및 제2 핵산 구조체를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명은 상술한 바와 같이 제1 및 제2 핵산 구조체를 포함하는 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 요소와 같은 비통합 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시의 항체를 발현하기 위한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)( Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220에 기술된, R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621에 기술된 DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr CHO 세포 포함), COS 세포 및 SP2 세포를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 또한 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al, 1980, 미국 국립과학원회보 77:4216); 마우스 정소세포(TM4, Mather, 1980, 생물학 Reprod. 23:243-251); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; NSO(예: RCB0213, 1992, Bio/Technology 10:169) 및 SP2/0 세포(예: SP2/0-Ag14 세포, ATCC CRL 1581)와 같은 마우스 골수종 세포; YB2/0 세포(예: YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, ATCC CRL 1662), PER.C6 세포, 인간 간종양 세포주(Hep G2)가 포함된다. CHO 세포는 본 발명에 사용될 수 있는 세포주 중 하나이며, CHO-K1, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44(Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555 (1986)) 및 Lec13이 예시적인 숙주 세포주이다. CHO-K1, DUK-B11, DG44 또는 CHO-DP12 숙주 세포의 경우, 이들은 발현된 단백질을 푸코실화시키는 능력이 결핍되도록 변이될 수 있다.
이 목적에 적합한 원핵 생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체와 같은 유박테리아(예: Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella(예를 들어 Salmonella typhimurium), Serratia(예를 들어 Serratia marcescans), Shigella같은 Enterobacteriaceae, Bacilli (예: B. subtilis and B. licheniformis)), Pseudomonas (예: P. aeruginosa), 및 treptomyces 이 포함된다.
원핵생물 외에도 사상성 진균(filamentous fungi )이나 효모와 같은 진핵생물 미생물은 이중특이성 항체 인코딩 벡터에 적합한 복제 또는 발현 숙주이다. Saccharomyces cerevisiae 또는 일반적인 제빵 효모는 하핵 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 본 발명에서 다른 많은 속, 종 및 균주(예: Schizosaccharomyces pombe; 예를 들어 K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, and K. marxianus와 같은 Kluyveromyces ；yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurosporacrassa; Schwanniomycesoccidentalis 와 같은 Schwanniomyces; 및 예를 들어Neurospora, Penicillium, Tolypocladium와 같은 사상성 진균, 및 A. nidulans and A. niger 와 같은 Aspergillus 숙주) 일반적으로 이용 가능하고 유용하다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 인간 중쇄 및 인간 경쇄의 하나 또는 두 세트를 인코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환 비인간 동물 또는 식물에 관한 것으로, 동물 또는 식물은 본 개시의 이중특이성 항체를 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 개시의 이중특이성 항체에 사용하기 위한 항체를 생성하는 하이브리도마에 관한 것으로, 본 개시에 정의된 바와 같다.
일 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다:
(i) PD-L1 항원 결합 모이어티를 인코딩하는 핵산 서열;
(ii) VEGF 항원 결합 모이어티의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열;
(iii) Fc 영역을 인코딩하는 핵산 서열; 또는
(iv) 이중특이성 항체의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 본원에 개시된 실시예 중 임의의 하나에 따른 이중특이성 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본원에 개시된 이중특이성 항체를 발현하는 발현 벡터 또는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 숙주 세포는 재조합 진핵세포, 재조합 원핵세포 또는 재조합 미생물 숙주 세포이다.
약학적 조성물
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
조성물의 구성요소
약학 조성물은 선택적으로 다른 항체 또는 약물과 같은 하나 이상의 추가적인 약학 활성 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 개시의 약학적 조성물은 예를 들어, 다른 면역 자극제, 항암제, 항바이러스제 또는 백신과 병용 요법으로 투여될 수 있으며, 이에 따라 항-PD-L1/항-VEGF 이중특이성 항체가 백신에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 약학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 매체, 비수성 매체, 항균제, 등장성 제제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 킬레이트제, 희석제, 어쥬번트, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 기타 당업자에게 알려진 다양한 성분 이상의 조합을 포함할 수 있다.
적합한 성분에는 예를 들어 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 방부제, 윤활제, 향료, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정제(예: 당 및 사이클로덱스트린)가 포함될 수 있다. 적합한 항산화제는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라아제, 구연산, 시스테인, 메르캅토 글리세롤, 티오글리콜산, 메르캅토 소르비톨, 부틸 메틸 아니솔, 부틸화 하이드록시 톨루엔 및/또는 프로필갈락테를 포함할 수 있다. 본 개시에 개시된 바와 같이, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 용매에서, 본 개시의 조성물은 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하고, 항체 또는 항원 결합 단편을 환원시켜 산화시킬 수 있다. 산화 환원은 결합 친화도의 감소를 방지하거나 감소시켜 항체 안정성을 향상시키고 보관 수명을 연장할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 항체 또는 항원 결합 단편이 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제와 혼합되어 항체 또는 항원 결합 단편이 산화를 방지하고, 저장 수명을 연장 및/또는 활성을 증가시킬 수 있도록 하는 다양한 방법을 제공한다.
더 자세히 설명하기 위해, 의약품 허용 담체는 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 포도당 주사제, 멸균수 주사제 또는 포도당 및 젖산 링거 주사제와 같은 수성 담체, 식물성 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩유와 같은 비수성 담체, 정균 또는 진균 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 포도당과 같은 등장성 제제, 인산염 또는 구연산염 완충액과 같은 완충제, 중황산나트륨과 같은 항산화제, 염산프로카인과 같은 국소 마취제, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 현탁 및 분산제, 폴리소르베이트 80(TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌글리콜테트라아세트산), 에틸알코올, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 수산화나트륨, 염산, 구연산 또는 젖산과 같은 격리 또는 킬레이트 제제를 포함할 수 있다. 운반체로 사용되는 항균제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화 벤잘코늄 및 염화 벤제토늄을 포함하는 다중 용량 용기에 담긴 제약 조성물에 첨가될 수 있다. 적절한 부형제에는 예를 들어 물, 식염수, 포도당, 글리세롤 또는 에탄올이 포함될 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질에는 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 증진제 또는 아세테이트 나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 또는 사이클로덱스트린과 같은 약제가 포함될 수 있다.
투여, 제형 및 복용량
본 개시의 약학 조성물은 경구, 정맥, 동맥 내, 피하, 비경구, 비강 내, 근육 내, 두개 내, 심장 내, 심실 내, 기관 내, 구강 내, 직장 내, 복강 내, 피내, 국소, 경피, 경피 및 척수 내를 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 경로를 통해 생체 내에서, 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있고, 이식 또는 흡입에 의해 다른 방식으로 투여될 수 있다. 대상 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 관장제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸을 포함하되 이에 국한되지 않는 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 적절한 제형 및 투여 경로는 의도된 용도 및 치료 요법에 따라 선택할 수 있다.
경장 투여에 적합한 제형에는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 정제(코팅 정제 포함), 엘릭서, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이들의 방출 조절 형태가 포함된다.
비경구 투여(예: 주사)에 적합한 제형에는 활성 성분이 용해, 현탁 또는 기타 방식으로 제공(예: 리포좀 또는 기타 미립자)되는 수성 또는 비수성, 등장성, 발열원이 없는 멸균 액체(예: 용액, 현탁액)가 포함된다. 이러한 액체에는 항산화제, 완충제, 방부제, 안정제, 박테리오스타트, 현탁제, 농축제, 용질 등 약학적으로 허용되는 기타 성분이 추가로 포함될 수 있으며, 이는 제형을 의도된 수여자의 혈액(또는 기타 관련 체액)과 등장성으로 만드는 역할을 한다. 부형제의 예로는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등이 있다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예로는 염화나트륨 주사제, 링거액 또는 수유성 링거 주사제가 있다. 마찬가지로, 용량, 투여 시기 및 반복을 포함한 특정 투여 요법은 특정 개인 및 해당 개인의 병력뿐만 아니라 약동학(예: 반감기, 청소율 등)과 같은 경험적 고려사항에 따라 달라질 수 있다.
투여 빈도는 치료 과정에서 결정 및 조정될 수 있으며, 증식성 또는 종양원성 세포의 수 감소, 그러한 종양 세포의 감소 유지, 종양 세포의 증식 감소 또는 전이 발생 지연에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 투여되는 용량은 잠재적인 부작용 및/또는 독성을 관리하기 위해 조정되거나 약화될 수 있다. 또는, 대상 치료 조성물의 지속적 연속 방출 제형이 적절할 수 있다.
당업자에게는 적절한 용량이 환자마다 다를 수 있음을 알 수 있을 것이다. 최적의 용량을 결정하는 것은 일반적으로 치료 효과의 수준과 위험 또는 유해한 부작용의 균형을 맞추는 것을 포함한다. 선택한 용량 수준은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 질환의 중증도, 환자의 종, 성별, 나이, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 화합물의 양과 투여 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 재량에 따라 결정되지만, 일반적으로 상당한 유해하거나 해로운 부작용을 일으키지 않으면서 원하는 효과를 얻을 수 있는 작용 부위의 국소 농도를 달성하기 위해 투여량을 선택한다.
일반적으로, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다양한 범위에서 투여될 수 있다. 여기에는 1회 투여당 약 5 μg/kg~약 100 mg/kg 체중, 1회 투여당 약 50 μg/kg~약 5mg/kg 체중, 1회 투여당 약 100 μg/kg~약 10 mg/kg 체중이 포함된다. 다른 범위는 1회 투여당 약 100 μg/kg~약 20 mg/kg 체중 및 1회 투여당 약 0.5 mg/kg~약 20 mg/kg 체중을 포함한다. 특정 실시예에서, 투여량은 1회 투여당 적어도 약 100 μg/kg 체중, 적어도 약 250 μg/kg 체중, 적어도 약 750 μg/kg 체중, 적어도 약 3 mg/kg 체중, 적어도 약 5 mg/kg 체중, 적어도 약 10 mg/kg 체중이다.
어떤 경우에도, 본 개시의 항체 또는 그 항원 결합 부분은 이를 필요로 하는 대상에게 필요에 따라 투여하는 것이 바람직하다. 투여 빈도의 결정은 주치의와 같은 당업자에 의해 치료 대상 질환, 치료 대상자의 연령, 치료 대상 질환의 중증도, 치료 대상자의 일반적인 건강 상태 등을 고려하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 실시예에서, 본원 개시의 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하는 치료 과정은 수주 또는 수개월에 걸쳐 선택된 의약품의 복수의 투여를 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본원 개시의 항체 또는 항원 결합 부분은 매일, 2일마다, 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 한 번씩 투여될 수 있다. 이와 관련하여 환자의 반응 및 임상 관행에 따라 투여량을 변경하거나 간격을 조정할 수 있음을 이해할 것이다.
용량 및 요법은 또한 하나 이상의 투여를 받은 개인에 대해 개시된 치료 조성물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 개인에게는 본원에 기술된 바와 같이 제조된 치료 조성물의 점증적 용량이 제공될 수 있다. 선택된 실시예에서, 투여량은 각각 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 점진적으로 증가되거나 감소 또는 약화될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질병, 장애 또는 상태의 마커를 앞서 설명한 바와 같이 따를 수 있다. 암의 경우 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접 측정, 엑스레이 또는 기타 영상 기술을 통한 종양 크기의 간접 측정, 종양 샘플의 직접 종양 생검 및 현미경 검사로 평가한 개선, 간접 종양 표지자 측정(예, 전립선암의 경우 전립선 특이항원) 또는 여기에 설명된 방법에 따라 확인된 종양 유발 항원, 통증 또는 마비의 감소, 언어, 시각, 호흡 또는 종양과 관련된 기타 장애의 개선, 식욕 증가, 또는 공인된 검사로 측정한 삶의 질 향상 또는 생존 기간의 연장을 의미한다. 투여량은 개인, 종양 상태의 유형, 종양 상태의 단계, 종양 상태가 개인의 다른 위치로 전이되기 시작했는지 여부, 과거 및 동시 사용 중인 치료법에 따라 달라질 것임은 당업자에게 명백할 것이다.
비경구 투여(예컨대, 정맥 주사)에 적합한 제형은 본원에 개시된 바와 같이 항체 또는 항원 결합 부분을 약 10 μg/ml 내지 약 100 mg/ml의 농도로 구성된다. 특정 선택된 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 농도는 20 μg/ml, 40 μg/ml, 60 μg/ml, 80 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300, μg/ml, 400 μg/ml, 500 μg/ml, 600 μg/ml, 700 μg/ml, 800 μg/ml, 900 μg/ml 또는 1 mg/ml를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 항체 또는 항원 결합 부분의 농도는 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, 12 mg/ml, 14 mg/ml, 16 mg/ml, 18 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml 또는 100 mg/ml를 포함할 수 있다.
발명의 적용
본 발명의 일부 양태에 있어서, 본 발명은 대상의 장애를 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 치료가 필요한 대상(예를 들어, 인간)에 본원에 개시된 바와 같이 치료적으로 효과적인 양의 항체 또는 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 장애는 암이다.
악성 또는 양성, 원발성 또는 이차성 여부에 관계없이 PD-L1 및/또는 VEGF가 관여하는 다양한 암은 본 개시에서 제공하는 방법으로 치료 또는 예방될 수 있다. 암은 고형암 또는 혈액학적 악성 종양일 수 있다. 일부 실시예에서, 본원에 개시된 항체는 대장암 및/또는 결장암과 같은 PD-L1 및/또는 VEGF와 관련된 암의 예방, 개선 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
일부 다른 실시예에서, 본원에 개시된 항체는 혈관신생과 관련된 장애의 예방, 개선 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
일부 다른 실시예에서, 장애는 자가 면역 질환이다. 항체 또는 항원 결합 부분으로 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 예로는 자가 면역성 뇌척수염, 홍반성 루푸스 및 류마티스 관절염이 포함된다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 감염성 질환, 염증성 질환(예: 알레르기성 천식) 및 만성 이식편대숙주질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
화학 요법과의 병용 사용
항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항암제, 세포 독성 제제 또는 화학 요법제와 함께 사용할 수 있다.
"항암제" 또는 "항증식제"라는 용어는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 임의의 약제를 의미하며, 세포 독성 약제, 세포 증식 억제제, 항 혈관 신생 억제제, 디블링 약제, 화학 요법제, 방사선 요법 및 방사선 치료제, 표적 항암제, BRM, 치료 항체, 암 백신, 사이토카인, 호르몬 요법, 방사선 치료 및 전이 방지제 및 면역 치료제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전술한 바와 같이 선택된 실시예에서, 이러한 항암제는 컨쥬게이트를 포함할 수 있고, 투여 전에 개시된 부위 특이적 항체와 연관될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로, 특정 실시예에서, 선택된 항암제는 본원에 기재된 바와 같이 엔지니어링된 컨쥬게이트를 제공하기 위해 엔지니어링된 항체의 비페어링된 시스테인과 연결될 것이다. 따라서, 그러한 엔지니어링된 컨쥬게이트는 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 명시적으로 고려된다. 다른 실시예에서, 개시된 항암제는 상술한 바와 같이 다른 치료제를 포함하는 부위 특이적 컨쥬게이트와 조합하여 제공될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 독성 물질"은 세포에 독성이 있고 세포의 기능을 감소 또는 억제하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 특정 실시예에서, 해당 물질은 살아있는 유기체에서 유래한 자연 발생 분자이다. 세포 독성 물질의 예로는 박테리아의 저분자 독소 또는 효소 활성 독소(예: 디프테리아 독소, 슈도모나스 내독소 및 외독소, 포도상구균 장독소 A), 곰팡이(예: α-사신, 레프리토신), 식물(예:, 아브린, 리신, 모데신, 비스쿠민, 포케위드 항바이러스 단백질, 사포린, 젤로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리독소, 알레루라이트 포르디 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 커신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미테겔린, 리스토신, 페노마이신, 네오마이신 및 트리코테센) 또는 동물(예를 들어, 세포 외 췌장 Rnase와 같은 세포 독성 Rnase; Dnase I, 그 단편 및/또는 변이체 포함)을 포함한다.
본 개시의 목적상, "화학요법제"는 암세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 비특이적으로 감소시키거나 억제하는 화합물(예: 세포 독성 또는 세포 증식 억제제)로 구성된다. 이러한 화학 물질은 세포 성장이나 분열에 필요한 세포 내 과정에 작용하는 경우가 많기 때문에 일반적으로 빠르게 성장하고 분열하는 암세포에 특히 효과적이다. 예를 들어 빈크리스틴은 미세소관을 해중합하여 세포가 유사 분열에 들어가는 것을 억제한다. 일반적으로 화학요법제에는 암세포 또는 암이 되거나 종양 유발 자손(예: TIC)을 생성할 가능성이 있는 세포를 억제하거나 억제하도록 고안된 모든 화학요법제가 포함될 수 있다. 이러한 약제는 종종 CHOP 또는 FOLFIRI와 같은 요법에서 조합하여 투여되며, 종종 가장 효과적이다.
본 개시의 항체와 조합하여 사용될 수 있는 항암제의 예로는(부위 특이적 컨쥬게이트의 성분으로서 또는 비-컨쥬게이트 상태로서) alkylating agents, alkyl sulfonates, aziridines, ethylenimines and methylamelamines, acetogenins, camptothecin, bryostatin, callystatin, CC-1065, cryptophycins, dolastatin, duocarmycin, eleutherobin, pancratistatin, sarcodictyin, spongistatin, nitrogen mustards, antibiotics, enediyne antibiotics, dynemicin, bisphosphonates, esperamicin, chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores, aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycinis, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, ADRIAMYCIN® doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites, erlotinib, vemurafenib, crizotinib,sorafenib, ibrutinib, enzalutamide, folic acid analogues, purine analogs, androgens, anti-adrenals, folic acid replenisher such as frolinic acid, aceglatone, aldophosphamide glycoside, aminolevulinic acid, eniluracil, amsacrine, bestrabucil, bisantrene, edatraxate, defofamine, demecolcine, diaziquone, elfornithine, elliptinium acetate, an epothilone, etoglucid, gallium nitrate, hydroxyurea, lentinan, lonidainine, maytansinoids, mitoguazone, mitoxantrone, mopidanmol, nitraerine, pentostatin, phenamet, pirarubicin, losoxantrone, podophyllinic acid, 2- ethylhydrazide, procarbazine, PSK® polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxane; rhizoxin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2',2”-trichlorotriethylamine; trichothecenes (especially T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidine); urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside (“Ara-C”); cyclophosphamide; thiotepa; taxoids, chloranbucil; GEMZAR® gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogs, vinblastine; platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; vincristine; NAVELBINE® vinorelbine; novantrone; teniposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; irinotecan (Camptosar, CPT-11), topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluorometlhylornithine; retinoids; capecitabine; combretastatin; leucovorin; oxaliplatin; inhibitors of PKC-alpha, Raf, H-Ras, 세포 분화를 감소시키는 EGFR 및 VEGF-A 및 약제학적으로 허용되는 염, 상기 기재한 물질의 산 또는 변이체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이 정의에는 또한 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 항안드로겐과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제; troxacitabine (a 1,3- dioxolane nucleoside cytosine analog), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임(예: VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제), 백신, , PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제, ABARELIX® rmRH, Vinorelbine 및 Esperamicins 및 상기 기제한 물질의 약제학적 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
방사선 치료와 병용 사용
본 발명은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 방사선 요법(즉, 감마선 조사, X-선, 자외선 조사, 마이크로파, 전자 방출 등과 같은 종양 세포 내에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하는 임의의 메커니즘)과 결합하는 방법도 제공한다. 종양 세포에 방사성 동위원소를 직접 전달하는 병용 요법도 고려되며, 개시된 항체는 표적 항암제 또는 다른 표적 수단과 연계하여 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선 요법은 약 1주 내지 약 2주 정도의 기간에 걸쳐 펄스 형태로 투여된다. 방사선 요법은 두경부암을 가진 대상에게 약 6~7주 동안 투여될 수 있다. 선택적으로, 방사선 요법은 단일 용량으로 또는 여러 번의 순차적 용량으로 투여될 수 있다.
제약 팩 및 키트
하나 이상의 용기를 포함하고, 하나 이상의 용량의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제약 팩 및 키트도 제공된다. 본 발명의 특정 실시예에서, 단위 용량이 제공되며, 단위 용량은 하나 이상의 추가 약제를 포함하거나 포함하지 않고, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물의 소정량을 포함한다. 다른 실시예에서, 이러한 단위 용량은 주사용 일회용 프리필드 주사기에 공급된다. 다른 실시예에서, 단위 투여량에 포함된 조성물은 식염수, 자당 등을 포함하거나, 인산염 등과 같은 완충제를 포함하거나, 안정적이고 효과적인 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 또는, 특정 실시예에서, 조성물은 적절한 액체, 예를 들어 멸균수 또는 식염수를 첨가하여 재구성될 수 있는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 특정 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 자당 및 아르기닌을 포함하되 이에 국한되지 않는 단백질 응집을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기에 부착되거나 이와 관련된 모든 라벨은 동봉된 조성물이 선택된 종양성 질환 상태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다.
본 발명은 또한 항체의 단일 용량 또는 다중 용량 투여 단위 및 선택적으로 하나 이상의 항암제를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기 및 용기에 부착되거나 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 인서트를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있으며, 공액 또는 비공액 형태로 약학적으로 효과적인 양의 개시된 항체를 함유할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 용기는 멸균 액세스 포트를 포함한다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥주사 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 이러한 키트는 일반적으로 적절한 용기에 약학적으로 허용되는 항체 제형과 선택적으로 동일하거나 다른 용기에 하나 이상의 항암제를 포함할 수 있다. 키트에는 진단 또는 병용 요법을 위해 약학적으로 허용되는 다른 제형도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 부분 이외에, 그러한 키트는 화학요법제 또는 방사선요법제, 항혈관신생제, 항전이제, 표적 항암제, 세포독성제, 및/또는 기타 항암제와 같은 항암제 범위 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 키트는 추가 성분을 포함하거나 포함하지 않고, 개시된 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하는 단일 용기를 가질 수 있으며, 또는 원하는 각 약제에 대해 별개의 용기를 가질 수 있다. 결합된 치료제가 접합을 위해 제공되는 경우, 단일 용액은 몰 등가 조합으로 또는 한 성분이 다른 성분을 초과하여 미리 혼합될 수 있다. 또는, 항체와 키트의 선택적 항암제는 환자에게 투여하기 전에 별도의 용기 내에 별도로 유지될 수 있다. 키트는 또한 멸균되고 약학적으로 허용되는 완충액 또는 기타 희석제(예: 주사용 박테리오스태틱수(BWFI), 인산 완충 식염수(PBS), 링거액 및 포도당 용액)를 포함하는 제2/제3의 용기 수단을 포함할 수도 있다.
키트 구성품이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액인 것이 바람직하며 멸균 수용액 또는 식염수가 특히 바람직하다. 그러나, 키트의 구성 요소는 건조 분말로 제공될 수 있다. 시약 또는 구성품이 건조 분말로 제공되는 경우, 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 다른 용기에 제공될 수도 있을 것으로 예상된다.
전술한 바와 같이, 키트는 또한 항체 또는 항원 결합 부분 및 임의의 선택적 구성요소를 환자에게 투여하는 수단, 예를 들어 하나 이상의 바늘, 정맥주사백 또는 주사기, 또는 점안제, 피펫 또는 기타 유사한 장치를 포함할 수 있으며, 이로부터 제형이 동물에 주입 또는 도입되거나 신체의 질병 부위에 적용될 수 있다. 본 개시의 키트는 또한 일반적으로 바이알 등을 포함하는 수단과 상업적 판매를 위해 밀폐된 다른 구성요소를 포함하며, 예를 들어, 원하는 바이알 및 기타 장치가 배치되고 유지되는 사출 또는 블로우 성형 플라스틱 용기와 같은 수단을 포함한다.
서열 목록 요약
본원에 여러 아미노산 서열로 구성된 서열 목록이 첨부되어 있다. 다음 표 A는 포함된 서열에 대한 요약이다.
본원에 개시된 예시적 항체 중 하나는 항-VEGF/항-PD-L1 이중특이성 항체이며, W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(약칭 "W3253")으로 지칭한다.
[표 A]
도 1은 W3253 항체의 포맷을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(lane 1)의 SDS-PAGE를 나타낸다. 1: 비환원 상태, 1': NuPAGE(Novex 4-12% Bis-Tris) 겔에서의 환원 상태. M, PageRuler™ 염색되지 않은 단백질 래더.
도 3은 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 HPLC-SEC 결과를 나타낸다.
도 4는 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 인간 VEGF에 대한 ELISA 결합 결과를 나타낸다(사이노 VEGF와 동일).
도 5는 인간 PD-L1에 대한 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 FACS 결합 결과를 나타낸다.
도 6은 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 VEGF와 PD-L1에 대한 이중 결합 결과를 나타낸다.
도 7은 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320과 시노몰구스 PD-L1의 FACS 결합 결과를 나타낸다.
도 8A, 8B, 9는 인간 PD-L1(도 8A), 시노몰구스 PD-L1(도 8B), 인간 VEGF(도 9)에 결합한 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 SPR 센서그램을 나타낸다.
도 10-12는 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320과 인간 VEGFR1(도 10) 및 VEGFR2(도 11)의 인간 VEGF 결합에 대한 경쟁과 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320과 인간 PD-1의 인간 PD-L1 결합에 대한 경쟁을 나타낸다(도 12).
도 13은 항체에 의한 HUVEC 세포 증식 억제를 나타낸다.
도 14는 PD-L1 리포터 유전자 분석에 대한 항체의 효과를 나타낸다.
도 15A-15B는 MLR 분석에서 항체가 hCD4+T 세포 IL-2(도 15A) 및 IFN-γ(도 15B) 분비에 미치는 영향을 나타낸다.
도 16은 이중결합 ELISA를 통한 인간 혈청 안정성 테스트에서 항체의 효과를 나타낸다.
도 17은 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 DSF 프로파일을 나타낸다.
도 18은 다양한 방법으로 검출한 마우스에서 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 약동학 프로파일을 나타낸다.
도 19-20은 서로 다른 항체로 치료한 후 혼합 RKO-PBMC 모델에서 각 그룹의 체중(도 19) 및 종양 부피(도 20)를 나타낸다.
도 21-22는 다양한 항체로 처리한 후 인간 PD-L1 넉인 MC38 + 인간 PD1/PD-L1 이중 넉인 형질전환 마우스 모델에서 각 그룹의 체중(도 21) 및 종양 부피(도 22)를 나타낸다.
따라서 일반적으로 설명된 본 발명은 예시로서 제공되며 본 개시를 제한하기 위한 것이 아닌 다음의 실시예를 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 아래의 실험이 수행된 모든 실험 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다.
실시예 1 : 재료, 벤치마크 항체 및 세포주 준비
1.1 재료 준비
예제에 사용된 상업적으로 이용 가능한 자료에 대한 정보는 표 1에 나타내었다.
재료 공급업체 카탈로그 번호
Expi293 발현 시스템 Thermo Fisher Scientific A14635
단백질 A 컬럼 GE healthcare 17-5438-02
Ni 컬럼 GE healthcare 17-5247-01
HPLC-SEC TOSOH 0008541
NuPAGE4%-12% 비스-트리스 젤 Invitrogen NP0322BOX
인간 VEGF Sino Biological 11066-HNAB
인간 VEGF, 비오틴 표지 ACRO Biosystems VE5-H8210
인간 VEGFR1, hFc 태그 Sino Biological 10136-H02H
인간 VEGFR2, hFc 태그 Sino Biological 10012-H02H1
인간 PD-L1, his 태그 Sino Biological/ In house 10084-H08H
시노몰구스 PD-L1, his 태그 Sino Biological/ In house 90251-C08H
인간 PD-L1, mFc 태그 자체 제작
인간 PD-1, mFc 태그 자체 제작
고트 항-인간 IgG Fc-HRP 항체 Bethyl A80-304P
RPMI 1640 Gibco 22400-089
고트 x-인간 IgG Fc FITC 컨쥬게이트 Bethyl A80-304F
재조합 인간 IL-2 스탠다드 R&D 202-IL-050
재조합 인간 IFN γ 스탠다드 PeproTech 300-02
항-hIL-2 정제 마우스 단일클론 IgG2A 클론 5355 R&D MAB602
항-hIL-2 바이오티닐화 고트 IgG R&D BAF202
인간 IFNγ Mab 클론 2G1 Thermo prod M700A
인간 IFNγ Mab 바이오틴 표지 Thermo prod M701B
스트렙타비딘 HRP Invitrogen SNN1004
태아 소 혈청(FBS) ExCell Bio FND500
페니실린-스트렙토마이신(PS) Invitrogen SV30010
1.2 항원 준비
인간 VEGF 서열(유니포트 번호: P15692), 인간 PD-L1의 세포외 도메인 서열(유니포트 번호: Q9NZQ7), 시노몰구스 원숭이 PD-1(유니포트 번호: Q15116) 및 인간 PD-1(유니포트 번호.: Q15116)을 인코딩하는 DNA 서열을 Sangon Biothech (Shanghai, China)에서 합성한 후, C-말단에 다른 태그(예: 6xhis, 인간 Fc 또는 마우스 Fc)를 가진 변이된 pcDNA3.3 발현 벡터에 서브클론했다.
Expi293 세포( Thermo Fisher Scientific, A14527)에 정제된 발현 벡터를 형질전환시켰다. 세포를 5일간 배양하고 상층액을 수집하여 Ni-NTA 컬럼(GE 헬스케어, 175248), 단백질 A 컬럼(GE 헬스케어, 175438) 또는 단백질 G 컬럼(GE 헬스케어, 170618)을 사용하여 단백질 정제를 수행했다. 얻어진 인간 VEGF, 인간 PD-L1 및 인간 PD-1을 SDS-PAGE 및 SEC로 QC한 다음 -80o C에서 보관했다.
1.3 벤치마크 항체(BMK Abs) 생산
베바시주맙(즉, 아바스틴, Drug Bank의 서열, Drug Bank No.: DB00112)과 아테졸리주맙(로슈가 개발한 항-PD-L1 항체)의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 Sangon Biothech (Shanghai, China) 또는 Genewiz (Suzhou, China)에서 합성한 후 인간 IgG1의 일정한 영역을 가진 변이된 pcDNA3.3 발현 벡터에 서브클론했다.
중쇄와 경쇄를 인코딩하는 플라스미드를 Expi293 세포에 공동 형질전환시켰다. 세포를 5일간 배양하고 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, 175438)을 사용하여 단백질 정제를 위해 상층액을 수집했다. 얻어진 항체를 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC로 분석한 후 -80o C에서 보관했다.
1.4 안정적인 세포주/세포 풀 구축
PD-L1 발현 세포주
인간 PD-L1 고발현 안정 세포주(WBP315.CHO-K1.hPro1.C11)와 시노몰구스 원숭이 PD-L1 고발현 안정 세포주(WBP315.293F.cPro1.2A)를 제한적으로 희석하여 얻었다.
간단히 말해서, 인간 PD-L1 또는 시노몰구스 원숭이 PD-L1의 유전자를 각각 발현 벡터 pcDNA 3.3에 삽입했다. 그런 다음 플라스미드를 각각 CHO-K1/293F 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 후 6~8시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 6웰 플레이트에 신선한 비선별 배지 3ml를 공급했다. 세포에 트립신을 처리해 형질전환 후 24-48시간 후에 수확하고 선별 배지(F12-K, 10% FBS, 10μg/ml 블라스티딘)에서 T75 플라스크에 플레이팅했다. 희석을 제한하여 고발현 안정 세포주를 얻었고, FACS로 발현 수준을 측정했다.
불멸 세포주
인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 ScienceCell(Cat: 8000)에서 구입하여 기본 배지, 5% FBS, 1% 내피 세포 성장 인자(ECGS, ScienceCell, 1052)가 포함된 내피 세포 배지(ECM, ScienceCell, Cat: 1001)에서 배양했다. 세포는 37°C, 5% CO2가 있는 인큐베이터에서 배양되었다. 장기 보관을 위해 세포를 5% (v/v) DMSO가 보충된 완전 성장 배지에서 동결하고 액체 질소 기체 상에 보관했다.
실시예 2 : PD-L1/VEGF 이중특이성 항체 제작
BsAb 구성을 위해, 항 PD-L1 완전 인간 단일 클론 항체는 OMT 쥐 면역 및 하이브리도마 기술에 의해 자체적으로 생성되었으며, 얻어진 항 PD-L1 단일 클론 항체는 확인되어 W3155-r1.14.4로 명명되었다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 13 및 14에 표시된 것과 같다. W3155-r1.14.4와 베바시주맙의 가변 영역은 이중특이성 항체를 구성하는데 사용되었다.
W3155-r1.14.4의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 하나의 사슬로 결합하여 항-PD-L1 scFv를 형성했다. 항 PD-L1 scFv를 인코딩하는 DNA 서열(VH-(G4S)4-VL)을 베바시주맙 중쇄의 N-말단에 (G4S)2 링커를 추가하여 Fc 영역에 Fc 이펙터 기능을 무력화시키는 LALA 돌연변이를 포함시켰다. 경쇄는 베바시주맙과 동일했다. 생성된 BsAb의 이름은 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(접미사 "V320"은 IgG1 Fc 영역이 L234A/L235A 치환으로 구성됨을 의미) 또는 W3253으로 명명되었다. 그런 다음 두 사슬을 모두 인코딩하는 DNA 서열을 변이된 pcDNA3.3 발현 벡터에 복제했다.
중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 제조사의 지침에 따라 Expi293 발현 시스템 키트(ThermoFisher- A14635)를 사용하여 Expi293 세포에 공동 형질전환시켰다. 형질전환 5일 후, 상층액을 수집하여 단백질 A 컬럼과 CEX 컬럼을 사용하여 단백질 정제에 사용했다. 항체 농도는 나노드롭으로 측정했다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC로 평가했다(도 2 및 3). W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 항체의 특정 서열은 아래 표 2 내지 4에 나와 있다.
Anti-VEGF
항체
(베바시주맙)		 HCDR1 HCDR2 HCDR3
서열번호 7 서열번호 8 서열번호 9
GYTFTNYGMN WINTYTGEPTYAADFKR YPHYYGSSHWYFDV
LCDR1 LCDR2 LCDR3
서열번호 10 서열번호 11 서열번호 12
SASQDISNYLN YFTSSLHS QQYSTVPWT
Anti-PD-L1 ScFv
(W3155-r1.14.4)		 HCDR1 HCDR2 HCDR3
서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3
GFTFSSYAMS GISGSGGFTYYADSVKG PPRGYNYGPFDY
LCDR1 LCDR2 LCDR3
서열번호 4 서열번호 5 서열번호 6
GGNNIGSKSVH DDSDRPS QVWDSSSDHVV
VEGF 결합 모이어티의 VH의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS
(서열번호 15)
VEGF 결합 모이어티의 VL의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK
(서열번호 16)
PD-L1 결합 모이어티의 VH의 아미노산 서열:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPPRGYNYGPFDYWGQGTLVTVSS
(서열번호 13)
PD-L1 결합 모이어티의 VL의 아미노산 서열:SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
(서열번호 14)
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 중쇄의 아미노산 서열:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGFTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPPRGYNYGPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(서열번호 17)
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 경쇄의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(서열번호 18)
실시예 3 : 이중특이성 항체의 시험관 내 특성 분석
3.1 인간/시노몰구스 원숭이 VEGF-결합(ELISA)
시노몰구스 원숭이 VEGF의 아미노산 서열은 인간 VEGF와 동일하다. ELISA 결합을 위해, 비조직 배양 처리된 평평한 바닥 96웰 플레이트(Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)를 0.25 μg/ml Sino Biological 인간 VEGF 단백질 W325-hPro1(Sino)로 4o C에서 밤새 사전 코팅했다. 2% BSA 차단 후, 200 nM ~ 0.000190735 nM의 4배 적정 항체 100 μL를 각 웰에 피펫팅하고 상온에서 2시간 동안 배양했다. 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 1:5000으로 희석한 HRP 표지 고트 항-인간 IgG(Bethyl A80-304P) 100μL를 웰에 첨가하고 1시간 동안 배양했다. 100μL TMB 기질을 분배하여 색을 발현한 다음 100μL 2M HCl로 정지시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계(SpectraMax® M5e )를 사용하여 450nm 및 540nm에서 판독했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 인간 VEGF에 대해 모항체인 Avastin과 유사한 결합력을 보이며 EC50 는 0.01 nM이었다(도 4).
3.2 인간 PD-L1 결합(FACS)
FACS 결합을 위해, 조작된 인간 PD-L1 발현 세포 W315-CHOK1.hPro1.C11을 U-바텀 96웰 플레이트(COSTAR 3799)에 1×105 세포/웰로 시딩했다. 1%BSA DPBS를 200 nM 에서 0.000762939 nM 로 4배 적정된 Abs를 세포에 첨가했다. 플레이트를 4o C에서 1시간 동안 배양했다. 세척 후, 100μL 1:150 희석된 PE 표지 고트 항-인간 항체(Jackson 109-115-098)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 o C에서 30분간 배양했다. 세포에 대한 항체의 결합은 유세포 분석법으로 테스트하고 평균 형광 강도(MFI)는 FlowJo로 분석했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 또한 인간 PD-L1에 대한 아테졸리주맙과 유사한 결합 능력을 보여주었으며 EC50 는 0.128 nM이었다(도 5).
3.3 인간 VEGF/인간 PD-L1 이중 결합(ELISA)
이중특이성 항체가 인간 PD-L1과 VEGF에 모두 결합할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 다음과 같이 ELISA 분석법을 개발했다. 96웰 ELISA 플레이트(Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)를 탄산염-중탄산염 완충액에 1μg/ml 항원-1(hVEGF.his, W325-hPro1.his(자체 제작)을 4o C에서 하룻밤 동안 코팅했다. 카제인 완충액으로 1시간 차단 단계를 거친 후, 카제인 완충액에서 서로 다른 PD-L1×VEGF 이중특이성 항체(5배 희석, 100 nM ~ 0.00128 nM)를 실온에서 1시간 동안 플레이트에 배양했다. 배양 후, 0.5%(v/v) Tween 20을 함유한 PBS 웰당 300μL로 플레이트를 세 번 세척했다. 1 μg/ml 항원-2(hPD-L1-ECD.mFc, W315-hPro1.ECD.mFc(자체 제작)를 플레이트에 첨가하고 1시간 배양했다. 플레이트를 세 번 세척한 후, 100 μL 1:5000 희석된 HRP 표지 고트 항 마우스 IgG(Bethyl A90-231P)를 추가하고 실온에서 1시간 동안 플레이트에서 배양했다. 0.5%(v/v) Tween 20을 함유한 PBS 웰당 300μL로 6회 세척한 후, 검출 전 웰을 위해 100μL의 TMB 기질을 추가했다. 웰당 100μL의 2M HCl을 첨가하여 약 5분 후 반응을 중단했다. 웰의 흡광도는 멀티월 플레이트 판독기(SpectraMax® M5e )를 사용하여 450nm 및 540nm에서 측정했다.
인간 VEGF 및 인간 PD-L1에 대한 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 이중 결합 활성은 ELISA 기반 결합 분석으로 측정되었다. 그 결과 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 결합은 PD-L1의 후속 결합에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 6).
3.4 시노몰구스 원숭이 PD-L1 결합(FACS)
FACS 결합을 위해, 조작된 시노 PD-L1 발현 세포 W315-293F.cPro1.2A2(자체 제작)를 U-바닥 96웰 플레이트(COSTAR 3799)에 1×105 세포/웰로 시딩했다. 1%BSA DPBS와 4배 적정된 Abs를 200nM에서 0.000762939nM까지 세포에 첨가했다. 플레이트를 4o C에서 1시간 동안 배양했다. 세척 후, 100μL 1:150 희석된 PE 표지 고트 항-인간 항체(Jackson 109-115-098)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 o C에서 30분간 배양했다. 세포에 대한 항체의 결합은 유세포 분석법으로 테스트하고 평균 형광 강도(MFI)는 FlowJo로 분석했다.
시노몰구스 원숭이 VEGF의 아미노산은 인간 VEGF와 동일하므로 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320도 시노몰구스 VEGF에 결합 활성을 가지고 있다. W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 0.59 nM의 EC50 로 시노몰구스 PD-L1에 대한 아테졸리주맙과 유사한 결합 능력을 보여주었다(도 7).
3.5 VEGF 및 PD-L1에 대한 결합 친화성(SPR)
항원에 대한 항체 결합 친화도는 Biacore 8K를 사용한 SPR 분석으로 검출했다. 항-인간 IgG Fc 항체가 고정된 CM5 센서 칩(GE)에서 ABS를 캡처했다. 다양한 농도의 항원을 30μL/min의 유속으로 센서 칩 위에 주입하여 결합 단계를 거친 후 해리 단계를 거쳤다. 칩은 각 결합 주기 후에 10mM 글리신(pH 1.5)으로 재생되었다. 블랭크 표면과 버퍼 채널의 센서그램은 테스트 센서그램에서 뺐다. 실험 데이터는 랑미르(Langmiur) 분석을 사용하여 1:1 모델로 피팅되었다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 친화도 상수(KD)는 SPR 기술을 기반으로 측정되었다. 그 동안 온율 상수(ka)와 오프율 상수(kd)를 측정했다. 각 상호작용의 최종 데이터는 기준 채널과 버퍼 채널 데이터에서 추출했다. 실험 데이터는 도 8A, 도 8B 및 도 9와 같이 분석되었다. 항체의 동역학적 친화도 결과는 표 5에 나열되어 있다.
분석 리간드 ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) KD1 (M)
인간 PD-L1(W315-hPro1.ECD.His) W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 1.81E+06 8.57E-04 4.75E-10
아테졸리주맙 (Atezolizumab) 1.00E+06 9.06E-05 9.04E-11
사이노 PD-L1(W315-cynoPro1.ECD.His(Sino)) W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 2.45E+06 3.80E-04 1.55E-10
아테졸리주맙 (Atezolizumab) 9.49E+05 4.65E-03 4.90E-09
인간 VEGF(W325-hPro1(Sino)) W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 4.26E+05 <1.00E-05* <2.35E-11
아바스틴 (Avastin) 4.81E+05 <1.00E-05* <2.08E-11
3.6 인간 VEGFR1 및 VEGFR2 경쟁 분석
이중특이성 항체가 인간 VEGFR1 및 VEGFR2 가 인간 VEGF 단백질에 결합하는 것을 차단할 수 있는지 테스트하기 위해 다음과 같이 리간드 경쟁 분석을 수행했다.
ELISA에서 평평한 바닥 96웰 플레이트(Nunc MaxiSorp, ThermoFisher)를 0.5 μg/ml W325-hpro1R1.ECD.hFc(SB) 또는 2 μg/ml W325-hpro1R2.ECD.hFc(SB)로 4 o C에서 하룻밤 동안 사전 코팅했다. 카제인 완충액을 차단한 후, 0.02 μg/ml 인간 VEGF 단백질 W325-hPro1.his.biotin과 결합된 200 nM ~ 0.000190735 nM의 2배 적정 Abs 100 μL를 각 웰에 피펫팅하고 상온에서 2시간 동안 배양했다. 배양 후, 0.5% (v/v) Tween 20을 함유한 PBS를 웰당 300 μL로 3번 세척했다. 1:10000으로 희석한 스트렙타비딘-HRP(Lifetechnologies #SNN1004) 100μL를 플레이트 프리 웰에 첨가하고 1시간 배양했다. 6회 세척한 후 100μL의 TMB 기질을 분주하여 발색한 다음 100μL의 2M HCl로 정지시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계(SpectraMax®M5e )를 사용하여 450nm 및 540nm에서 판독했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 IC50 1.47nM로 VEGF에 결합하는 모체 항체보다 우수한 경쟁 능력을 보였으며(도 10), IC50 1.04nM로 VEGF에 결합하는 모체 항체보다 우수한 경쟁 능력을 나타냈다(도 11).
3.7 인간 PD-1 경쟁 분석
이중특이성 항체가 PD-L1 발현 세포에 대한 PD-1 단백질 결합을 차단할 수 있는지 테스트하기 위해 다음과 같은 경쟁 분석을 수행했다.
인간 PD-1과 인간 PD-L1의 결합을 FACS로 차단하기 위해, 조작된 인간 PD-L1 발현 세포 W315-CHOK1.hPro1.C11을 U-바닥 96웰 플레이트(COSTAR 3799)에 1×105 세포/웰에 시딩했다. 4배 적정된 200 nM ~ 0.000762939 nM의 Abs와 5ug/ml의 자체 인간 PD-1 단백질 W305-hPro1.ECD.mFc를 세포에 첨가했다. 플레이트를 4o C에서 1시간 동안 배양했다. 세척 후, 100μL 1:150 희석된 PE-표지 고트 항-마우스 항체(abcam 98742)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4 o C에서 30분간 배양했다. 세포에 대한 항체의 경쟁 결합은 유세포 분석법으로 테스트하고 평균 형광 강도(MFI)는 FlowJo로 분석했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 shows comparable competition ability with Atezolizumab in blocking the binding between human PD-1 and PD-L1 with IC50 of 0.39 nM (Figure 12).
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 인간 PD-1과 PD-L1의 결합을 차단하는 데 있어서 0.39nM의 IC50 로 아테졸리주맙과 비슷한 경쟁 능력을 나타내었다(도 12).
3.8 HUVEC 세포 증식 분석
VEGF로 유도된 HUVEC 증식에서 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 생물학적 활성을 평가했다. HUVEC 세포를 ECM+5%FBS+1%ECGS에서 일상적으로 배양했다. 트립신으로 아류 세포를 채취하고 ECM+1%FBS+0.05%ECGS로 1 ×105 세포/mL로 희석했다. 세포를 96웰 투명 바닥 검정색 플레이트(Greiner, 655090)에 4000세포/웰의 밀도로 도금했다. 50ng/mL의 인간 VEGF(WBP325-hPro1, Sino Biological, 11066-HNAB)와 함께 직렬 희석 항체를 추가했다. 배양기를 5일 동안 인큐베이터로 돌려보낸 후 CellTiter Glo(Promega, G7573)를 사용하여 세포 생존력을 평가했다. 리간드를 첨가하지 않은 웰은 리간드 자극 세포 성장에 대한 대조군으로 사용했다. 리간드 자극 세포 성장 억제에 대한 테스트 항체의 효과는 배경(리간드 없음) 발광을 뺀 후 항체 첨가 유무에 따른 발광 값(리간드만)을 비교하여 계산했다. 4개 파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하여 증식 억제 IC50 값을 얻기 위해 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 농도 의존적으로 VEGF에 의해 유도된 HUVEC 증식을 효과적으로 차단했으며, IC50 는 0.95 nM, 최대 억제율은 114.2%에 달했다(도 13).
3.9 리포터 유전자 분석
WBP3253 선도 항체가 T 세포 반응 조절에서 PD-L1의 역할에 기능적으로 대응할 수 있는지 테스트하기 위해 전장 PD-1을 발현하고 NFAT-RE-Luc2p(효과 세포)와 통합된 Jurakt 세포와 항 CD3(OTK3) ScFv Ab(표적 세포)가 있는 CHO-K1-PD-L1 세포를 각각 2×104 세포/50 μL 및 4×104 세포/50 μL에 시딩했다. 그런 다음 37o C에서 6시간 동안 50 μL WBP3253 Abs(4배 희석, 33.5 nM ~ 0.002045 nM 형태)와 공동 배양했다. 배양 후 각 웰에 50μL의 1-glo 루시퍼라제 기질을 추가하여 현상했다. 웰의 형광 강도는 EnVision(NO. 798104)으로 측정했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 은 PD-L1 리포터 유전자 분석의 기능을 나타내었다(도 14).
3.10 혼합 림프구 반응(MLR) 분석
MLR은 사이토카인, 인간 IFN-γ 분비 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포의 증식에 대한 PD-L1 항체의 작용 효과를 테스트에 사용되었다
인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 건강한 기증자로부터 피콜-패크 플러스 원심분리기를 사용하여 신선하게 분리했다. 단핵구는 제조업체의 지침에 따라 인간 단핵구 농축 키트(Miltenyi Biotec-130-050-201)를 사용하여 분리했다. 세포 농도는 6웰 플레이트의 2.5㎖/웰에서 800 U/㎖의 재조합 인간 GM-CSF와 50 μg/㎖의 IL-4가 보충된 완전한 RPMI-1640 배지(Gibco-22400089)에서 2×106 세포/㎖로 조정되었다. 세포를 5~7일 동안 배양하여 수지상 세포(DC)로 분화시켰다. 배지의 절반을 사이토카인이 보충된 새로운 배지로 교체하여 2~3일마다 사이토카인을 보충했다. 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 CD4+ T 세포를 인간 CD4+ T 세포 농축 키트를 사용하여 분리했다.
완전한 RPMI-1640 배지를 사용하여 96웰 원형 바닥 플레이트(Nunc, 163320)에 MLR을 설정했다. CD4+ T 세포, 다양한 농도의 항체 및 미성숙 DC를 플레이트에 추가했다. 플레이트는 37°C, 5% CO2 에서 배양되었다. 5일째에 IFN-γ 생산을 측정했다.
일치하는 항체 쌍을 사용하여 효소결합면역흡착분석법(ELISA)으로 인간 IFN-γ를 측정했다. 재조합 인간 IFN-γ(PeproTech, 300-02)를 각각 표준으로 사용했다. 플레이트는 인간 IFN-γ에 특이적인 포획 항체(피어스, M700A)로 사전 코팅되었다. 차단 후, 표준 또는 샘플을 각 웰에 피펫팅하여 상온에서 2시간 동안 배양했다. 결합되지 않은 물질을 제거한 후, IFN-γ에 특이적인 비오틴 결합 검출 항체(피어스, M701B)를 웰에 첨가하고 각각 1시간 동안 배양했다. 그런 다음 스트렙타비딘 접합 양 고추냉이 과산화효소(HRP)(Invitrogen, SNN1004)를 웰에 첨가하여 상온에서 30분간 배양했다. TMB 기질을 디스펜싱하여 색을 발현한 다음 2M HCl로 정지시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 450 및 540 nm에서 판독했다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 혼합 림프구 반응 분석에서 농도 의존적인 방식으로 인간 IL-2(hIL-2) 및 인간 IFN-γ(hIFN-γ) 분비를 유도할 수 있었다(도 15A 및 도 15B).
3.11 인간 혈청 안정성
항체를 37°C에서 갓 분리한 인간 혈청(혈청 함량 90% 이상)에서 배양했다. 지정된 시점에 혈청 처리된 샘플을 인큐베이터에서 제거하고 액체 N2에 스냅 냉동한 다음 테스트 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관했다. 샘플은 안정성 테스트 직전에 빠르게 해동했다. 간단히 말해서, 플레이트는 4°C에서 하룻밤 동안 1μg/mL의 W325-hPro1.ECD.his(사내 보유)로 사전 코팅되었다. 1시간 차단 후, 테스트 항체를 다양한 농도(25nM에서 0.0015nM까지 4배 연속 희석)로 플레이트에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 0.5%(v/v) Tween 20을 함유한 PBS 웰당 300μL로 플레이트를 세 번 세척했다. 1 μg/ml의 W315-hPro1.ECD.mFc(자체 개발)를 플레이트에 첨가하고 1시간 배양했다. 플레이트를 세 번 세척한 후, 100 μL 1:5000 희석된 HRP 표지 고트 항 마우스 IgG(Bethyl A90-231P)를 추가하고 실온에서 1시간 동안 플레이트에서 배양했다. 0.5%(v/v) Tween 20을 함유한 PBS 웰당 300μL로 6회 세척한 후, 검출 전 웰을 위해 100μL의 TMB 기질을 추가했다. 웰당 100μL의 2M HCl을 첨가하여 약 5분 후 반응을 중단했다. 웰의 흡광도는 멀티월 플레이트 판독기(SpectraMax®M5e)를 사용하여 450nm 및 540nm에서 측정하였다.
W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 혈청 안정성은 37°C의 인간 혈청에서 2주간 평가했다. 1일, 4일, 7일, 14일 동안 인간 혈청으로 처리한 항체 결합 능력은 0일과 비슷했다(도 16).
3.12 열 안정성(DSF)
항체의 Tm은 QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 조사했다. 19μL의 항체 용액을 1μL의 62.5 X SYPRO Orange 용액(Invitrogen)과 혼합하여 96 웰 플레이트(Biosystems)로 옮겼다. 이 플레이트는 26°C에서 95°C까지 0.9°C/min의 속도로 가열되었고, 그 결과 형광 데이터가 수집되었다. 다양한 온도에 대한 형광 변화의 음의 미분값을 계산하고 최대값을 용융 온도 Tm으로 정의했다. 단백질에 여러 개의 전개 전이가 있는 경우 처음 두 개의 Tm을 Tm1 및 Tm2로 명명하여 보고했다. 데이터 수집 및 Tm 계산은 운영 소프트웨어(QuantStudio Real Time PCR software v1.3)에 의해 자동으로 수행되었다.
DSF 분석 결과에 따르면 Tm1 값은 68.7°C이었다(도 17).
실시예 4 : 이중특이성 항체의 생체 내 특성 분석
4.1 마우스 PK 연구
WBP3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320의 약동학은 C57BL/6 암컷 마우스에서 테스트되었다. 생후 6~8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Shanghai Lingchang Biotech Co., LTD)가 실험에 사용되었다.
약동학 연구를 위해 세 마리의 C57BL/6 암컷 마우스에 13.3 mg/kg의 WBP3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320을 정맥 주사했다. 항체 주사 전에 투여 전 혈액을 채취했다. 항체 주사 후 30분, 2시간, 6시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일의 시간 간격으로 눈에서 혈액 샘플을 채취하여 EDTA 튜브로 옮겼다. 튜브를 4℃에서 5분간 6000rpm으로 원심분리한 다음 혈장을 수집하여 -20℃에서 보관했다.
혈청 항체 농도는 ELISA로 세 가지 방법을 통해 측정했다. 고트 항-인간 IgG Fc 또는 W315-hPro1.ECD.mFc를 각각 1μg/ml로 4℃에서 하룻밤 동안 96개의 ELISA 플레이트에 고정시켰다. 플레이트를 100μl 인산 완충 식염수 트윈(PBST)으로 3회 세척하고 나머지 결합 부분을 실온에서 1시간 동안 2%(w/v) 소 알부민(BSA)으로 차단했다. 정제된 재조합 항체, 혈청 샘플 및 QC 샘플을 2% BSA로 희석하여 이중으로 적정하고 실온에서 1시간 동안 ELISA 플레이트에서 배양했다. PBST로 플레이트를 3회 세척한 후 고트 항-인간 IgG Fc-바이오틴(0.0625 μg/ml) 또는 VEGF.his.바이오틴(1 μg/ml)을 실온에서 1시간 동안 배양하고 50 μl 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 사용하여 HRP-접합 스트렙타비딘으로 검출을 수행했다. 50μl의 2M HCl로 반응을 중단하고 흡광도를 450-540 nm에서 SpectraMax®M5e로 측정했다. 표준 곡선은 정제된 재조합 항체에 의해 계산되었다. 혈청 항체 농도는 표준 곡선을 기준으로 SoftMax를 사용하여 계산했다. 그래프 프리즘 소프트웨어(미국 캘리포니아주 라호야)를 사용하여 3개의 독립적인 결합 곡선으로부터 데이터를 맞췄다. 혈청 항체의 농도는 비구획 모델에서 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(버전 8.1, Pharsight, 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용하여 분석했으며, PK의 파라미터는 선형 로그 사다리꼴 규칙을 사용했다. 결과는 평균과 표준편차(평균 ± SD)로 표시되었다. 이 방법은 PK 워크플로우에 요약되어 있다.
이 연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험동물관리평가인증협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC)의 지침에 따라 Shanghai WuXibiologics Co., Ltd 의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)가 승인한 지침에 따라 수행되었다.
도 18에서 볼 수 있듯이 세 가지 검출 방법에서 비슷한 결과를 얻었으며, 항체가 마우스에서 안정적이라는 것을 알 수 있었다. 표 6에 표시된 바와 같이, t½는 각각 292시간(Fc+Fc), 342시간(Fc+PD-L1), 356시간(PDL1+VEGF)이었다.
마우스 PK 매개변수
화합물 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320
복용량 13.3 mg/kg, iv
방법 Fc+Fc PD-L1+Fc PD-L1+VEGF
t ½ (h) 292* 342* 356*
Cmax (μg/mL) 281 300 321
AUC 0-t (h*μg/mL) 31815 30479 36449
Cl_obs (mL/day/kg) 4.50 4.22 3.58
MRTINF_obs (h) 416 484 500
Vss_obs (mL/kg) 75.8 83.8 70.4
* AUC_% Extrap_obs가 20%보다 크거나 Rsq_adjusted가 0.9보다 작으면 t ½ 가 정확하지 않을 수 있다.
4.2 외이식된 RKO 대장암 종양 모델
WBP3253 생체 내 효능 연구는 NCG 암컷 마우스의 RKO 대장암종 종양 모델에서 테스트되었다. 연구에는 8~10주령의 암컷 NCG 마우스(Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co., LTD)가 사용되었다. RKO 세포는 공기 중 5% CO2, 37°C에서 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 EMEM 배지에서 단층 배양으로 체외에서 유지되었다. 종양 세포는 0.25% 트립신-EDTA 처리와 함께 일주일에 두 번 정기적으로 하위 배양되었다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 채취하여 종양 접종을 위해 계수했다.
치료 모델의 경우, 각 마우스의 오른쪽 앞쪽 옆구리에 RKO 종양 세포와 냉동 PBMC(2.0×106 종양 세포와 2.0×106 PBMC를 200μl PBS에 50%의 매트리젤과 혼합)를 피하 접종했다. 접종 후 6일 후 평균 종양 부피가 약 137mm3 에 도달했을 때, 동물을 무작위로 5개 그룹으로 나누고 각 그룹에는 7마리의 생쥐를 포함시켰다. 5개의 마우스 그룹은 각각 다음과 같은 복강 내 주사를 받았다: PBS, 아바스틴(3 mg/kg), 아테졸리주맙(3 mg/kg), 아바스틴 + 아테졸리주맙(3 mg/kg+3 mg/kg), W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(4.2 mg/kg)을 각각 주입했다. 복강 내 주사한 날을 0일로 간주했다. 모든 종양 연구에서 마우스의 체중을 측정하고 일주일에 두 번 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 측정했다. 이 연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험동물 관리 평가 및 인증 협회(AAALAC)의 지침에 따라 Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltd 의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 지침에 따라 수행되었다.
종양 부피는 공식 (½ (길이 × 너비2 )로 계산했다. TGI(종양 성장 흡입량)는 다음 공식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산했다: TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] ×100. Ti는 특정 날짜에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. T0은 치료 첫날 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. Vi는 Ti와 같은 날의 차량 대조군의 평균 종양 부피이고, V0는 치료 첫날의 차량 그룹의 평균 종양 부피이다. 체중 변화의 상대적 변화(RCBW)는 [(BWt-BW0)/BW0] x100 공식으로 계산했으며, BW0은 0일차 평균 체중, BWt는 측정일 평균 체중을 의미한다. 결과는 평균과 표준 오차(평균 ± SEM)로 표시되었다. 17일째의 데이터는 그래프패드 프리즘 6.0을 사용하여 일반 이원 분산 분석 투키 다중 비교 테스트를 통해 분석했으며, p<0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주했다.
도 19에서 볼 수 있듯이 각 그룹의 다른 모든 동물에서는 뚜렷한 체중 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 동물이 각 시험 물품에 잘 견뎌냈음을 나타낸다.
도 20에 표시된 바와 같이, 17일째에 차량 대조군의 평균 종양 용적은 2017mm3 로, RKO 이종이식 대장암 종양 모델이 잘 확립되었음을 나타낸다. 각 그룹의 17일째 TGI는 아바스틴 69.37%, 아테졸리주맙 33.42%, 아바스틴+아테졸리주맙 병용요법 78.37%, W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 86.55%를 기록했다. 차량 대조군과 비교하여 모든 시험 물품이 종양 성장 억제를 보였으며, 두 단일 클론 항체와 비교하여 아바스틴 + 아테졸리주맙 조합 및 W3253 이중특이성 항체가 더 강력한 항종양 효과를 보였으며 (p<0.001), 조합에 비해 W3253 이중특이성 항체가 더 강력한 항종양 효과를 나타냈다 (p<0.05).
4.3 인간 PD1/PD-L1 이중 넉인(knock-in) 형질전환 마우스 모델에서의 인간 PD-L1 넉인(knock-in) MC38
WBP3253 생체 내 효능 연구는 인간 PD1/PD-L1 이중 넉인 형질전환 마우스 모델인 C57BL/6-hPD1/hPDL1 암컷 마우스의 MC38/hPD-L1에서 시험되었다. 연구에는 8~9주령의 암컷 C57BL/6-hPD1/hPD-L1 마우스(Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co., LTD)가 사용되었다. MC38/hPD-L1 세포는 공기 중 CO2 5%, 37°C에서 태아 소 혈청 10%, 페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL를 보충한 DMEM 배지에서 단층 배양으로 체외에서 유지되었다. 종양 세포는 0.25% 트립신-EDTA 처리로 일주일에 두 번 정기적으로 하위 배양되었다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 채취하여 종양 접종을 위해 계수했다.
치료 모델의 경우, 각 마우스에 MC38/hPD-L1 종양 세포(1.0×106 종양 세포 100ul PBS)를 오른쪽 앞쪽 측면에 피하 접종했다. 접종 후 6일 후 평균 종양 부피가 약 86mm3 에 도달했을 때, 동물을 무작위로 6개 그룹으로 나누고 각 그룹에는 8마리의 생쥐가 포함되었다. 6개의 마우스 그룹은 각각 다음과 같은 복강 내 주사를 받았다: 생리식염수, W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(13.3 mg/kg), W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(3.9 mg/kg), W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(1.3 mg/kg), 아테졸리주맙(10 mg/kg), 아바스틴(10 mg/kg)을 각각 주입했다. 복강 내 주사한 날을 0일로 간주했다. 모든 종양 연구에서 마우스의 체중을 측정하고 일주일에 두 번 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 측정했다. 이 연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험동물 관리 평가 및 인증 협회(AAALAC)의 지침에 따라 Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltd 의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 지침에 따라 수행되었다. 종양 부피는 공식 (½ (길이 × 너비2 )를 사용하여 계산했다.
TGI(tumor growth inhalation)와 RCBW(Relative change of bodyweight change)는 위에서 설명한 대로 계산했다. 결과는 평균과 표준 오차(평균 ± SEM)로 표시되었다. 30일째의 데이터는 그래프패드 프리즘 6.0을 사용하여 일반 이원 공변량 분석(Ordinary two-way ANOVA) 투키 다중 비교 테스트를 통해 분석했으며, p<0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주했다.
도 21에서 볼 수 있듯이 각 그룹의 다른 모든 동물에서는 뚜렷한 체중 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 동물이 각 시험 물품에 잘 견뎌냈음을 나타낸다.
도 22에 표시된 바와 같이, 30일째에 차량 대조군의 평균 종양 부피는 2037mm3 로, 인간 PD1/PD-L1 이중 넉인 형질전환 마우스 모델에서 MC38/hPD-L1이 잘 확립되었음을 나타낸다. 각 그룹의 30일째 TGI는 W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(13.3 mg/kg)의 경우 78.22%, W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(3.9 mg/kg), W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320(1.3 mg/kg) 30.95%, 아테졸리주맙(10 mg/kg) 73.76%, 아바스틴(10 mg/kg) 52.95%. 모든 시험물질은 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320 이중특이항체는 동등한 몰 용량 수준에서 아테졸리주맙과 유사한 종양 억제 효과를 보였으며, W3253-U9T2.G17-1.uIgG1V320은 용량 의존적인 종양 억제 효과를 나타냈다.
당업자들은 본 개시가 본 개시의 정신 또는 중심 속성을 벗어나지 않고 다른 구체적인 형태로 구체화될 수 있음을 더욱 이해할 것이다. 전술한 본 개시의 설명은 예시적인 실시예들만을 개시한다는 점에서, 다른 변형들이 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 상세히 설명된 특정 실시예에 한정되지 않는다. 오히려, 본 개시의 범위와 내용을 나타내는 첨부된 청구항을 참조해야 한다.
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Pro Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL PDL1 <400> 14 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH VEGF <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL VEGF <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 711 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Pro Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val 130 135 140 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg 145 150 155 160 Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser 180 185 190 Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly 195 200 205 Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala 210 215 220 Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe 225 230 235 240 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 260 265 270 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 275 280 285 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 290 295 300 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 305 310 315 320 Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser 325 330 335 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 340 345 350 Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr 355 360 365 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 370 375 380 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 385 390 395 400 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 405 410 415 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 420 425 430 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 435 440 445 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 450 455 460 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 465 470 475 480 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 485 490 495 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 500 505 510 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 515 520 525 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 530 535 540 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 545 550 555 560 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 565 570 575 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 580 585 590 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 595 600 605 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 610 615 620 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 625 630 635 640 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 645 650 655 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 660 665 670 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 675 680 685 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 690 695 700 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 705 710 <210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 19 <211> 2133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Heavy chain <400> 19 gaggtgcaac tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtggtggttt cacttactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaacctcct 300 cgtggataca actatggccc ttttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcaggcggcg gaggaagcgg aggaggtggc agcggtggcg gtggctccgg cggaggtggc 420 tcctcctatg tgctgactca gccaccctcg gtgtcagtgg ccccaggaca gacggccagg 480 attacctgtg ggggaaacaa cattggaagt aaaagtgtac actggtacca gcagaagcca 540 ggccaggccc ctgtgctggt cgtctatgat gatagcgacc ggccctcagg gatccctgag 600 cgattctctg gctccaactc tgggaacacg gccaccctga ccatcagcag ggtcgaagcc 660 ggggatgagg ccgactatta ctgtcaggtg tgggatagta gtagtgatca cgtggtattc 720 ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt ggaggtggca gtggaggcgg aggatctgaa 780 gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 840 tgtgcagctt ctggctatac cttcaccaac tatggtatga actgggtccg tcaggccccg 900 ggtaagggcc tggaatgggt tggatggatt aacacctata ccggtgaacc gacctatgct 960 gcggatttca aacgtcgttt cactttcagc ttagacacct ccaagtcgac agcatacctg 1020 cagatgaaca gcctgcgtgc tgaggacact gccgtctatt actgtgcaaa gtacccccac 1080 tattatggga gcagccactg gtatttcgac gtctggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 1140 tcctcggcgt cgaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 1200 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 1260 gtgtcctgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 1320 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 1380 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 1440 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcc 1500 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1560 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1620 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1680 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1740 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1800 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtct acaccctgcc cccatcccgg 1860 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1920 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1980 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 2040 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2100 tacacgcaga agagcttaag cctgtctccg ggt 2133 <210> 20 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Light chain <400> 20 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca gcgcaagtca ggatattagc aactatttaa actggtatca acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaaagtgct gatttacttc acctcctctc tccactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gatccggttc tgggacggat tttactctga ccatcagcag tctgcagcca 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcaacag tatagcaccg tgccgtggac gtttggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

Claims (26)

  1. VEGF 항원 결합 모이어티와 연관된 PD-L1 항원 결합 모이어티를 포함하는 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    상기 PD-L1 항원 결합 모이어티는 다음을 포함함:
    서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3; 및
    상기 VEGF는 항원 결합 모이어티는 다음을 포함함:
    서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PD-L1 항원 결합 모이어티는 scFv인 것, 및 상기 VEGF 항원 결합 모이어티는 Fab인 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 PD-L1 항원 결합 모이어티는, 서열 번호 13의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 14의 아미노산 서열 또는 서열 번호 14와 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것; 및/또는
    상기 VEGF 항원 결합 모이어티는, 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15와 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  4. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 항원 결합 모이어티는 상기 VEGF 항원 결합 모이어티의 N말단에 융합되어 있는 것인 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PD-L1 항원 결합 모이어티는 선택적으로 링커를 통해, VEGF 항원 결합 모이어티의 중쇄의 N 말단에 작동 가능하게 연결되는 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드 링커이고, 선택적으로 상기 링커는 1 내지 4 카피의 GGGGS(G4S)를 포함하거나 이로 구성되는 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    상기 중쇄는, N-말단으로부터 C-말단까지, scFv-VH-CH1-힌지-Fc에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하며, 상기 scFv는 PD-L1 항원 결합 모이어티로부터 유래하고 VH-CH1은 VEGF 항원 결합 모이어티로부터 유래한 것; 및
    상기 경쇄는, N-말단에서 C-말단까지, VL-CL에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하며, 상기 VL-CL은 VEGF 항원 결합 모이어티로부터 유래한 것.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG Fc 영역, 바람직하게는 인간 IgG1 Fc 영역 또는 이의 변이체인 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.

  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 Fc 영역은 EU 넘버링에 따라 L234A 및 L235A 치환을 포함하는 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  10. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄는 서열 번호 17을 포함하고 경쇄는 서열 번호 18을 포함하는 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  11. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 인간화 항체인 것인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 19 및/또는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 것인, 분리된 핵산 분자.
  14. 제12항 또는 제13항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제12항의 핵산 분자 또는 제14항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  17. 다음 단계를 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조 방법:
    - 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
    - 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 숙주 세포로부터 분리하는 단계.

  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 제16항의 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 면역 반응을 조절하는 방법:
    선택적으로 상기 면역 반응은 PD-L1 및/또는 VEGF와 관련되는 것임.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분 또는 제16항의 약학적 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.

  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 또는 제16항의 약학적 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상의 암을 예방 또는 치료하는 방법.

  21. 제20항에 있어서, 상기 암은 PD-L1 및/또는 VEGF와 관련된 것인 대상의 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 결장직장암인 것인, 대상의 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 암 면역 요법에 사용하기 위해 화학요법제, 방사선 및/또는 다른 약제와 병용 투여되는 것인, 대상의 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 다음과 같은 용도:
    i) PD-L1 및/또는 VEGF 관련 면역 반응의 조절;
    ii) T 세포 증식 및 사이토카인 생산 강화; 및/또는
    iii) 암세포에 대한 면역 반응을 촉진하는 등 면역 반응 또는 기능을 자극.
  25. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 암의 진단, 치료 또는 예방상의 용도.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 키트.
KR1020237035398A 2021-03-31 2022-03-30 이중특이성 항 pd-l1/vegf 항체 및 이의 용도 KR20230162942A (ko)

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