TW202003563A - 新型抗ｐｄ－１抗體 - Google Patents

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Abstract

提供了與細胞表面PD-1特異性結合的新型抗PD-1抗體。還提供了編碼抗PD-1抗體的核酸分子，用於表達抗PD-1抗體的表達載體和宿主細胞。本發明進一步提供了產生抗PD-1抗體的方法及其用途。

Description

新型抗PD-1抗體
序列表
本申請包含序列表，並且其全部內容藉由引用併入本文。
本申請一般而言涉及抗體。更具體地，本申請涉及與PD-1特異性結合的單結構域抗體，其製備方法及其用途。
來自臨床前和臨床結果的越來越多的證據表明，靶向免疫檢查點正在成為治療癌症患者的最有前途的方法。與CD28具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制成員程序性死亡蛋白1(PD-1)在T細胞、活化的B細胞和骨髓細胞上表達(Agata等人，同上；Okazaki等人 (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett等人. (2003) J Immunol 170:711-8)，並且在調節免疫系統中的刺激和抑制信號方面具有關鍵作用(Okazaki，Taku等人. 2007 International Immunology 19:813-824)。PD-1藉由篩選凋亡細胞中的差異表達而被發現(Ishida等人 (1992) EMBO J 11:3887-95)。
PD-1是I型跨膜蛋白，其是Ig基因超家族的一部分(Agata等人. (1996) bit Immunol 8:765-72)，並且PD-1的結構由一個免疫球蛋白可變樣胞外結構域和含有免疫受體酪氨酸基抑制模體(ITIM)和免疫受體酪氨酸基開關模體(ITSM)的細胞質結構域組成。雖然在結構上與CTLA-4相似，但PD-1缺乏對B7-1和B7-2結合至關重要的MYPPPY模體。PD-1具有兩種已知的配體，即PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，它們是B7家族的表達在細胞表面的成員(Freeman等人 (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman等人 (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter etal (2002) Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1和PD-L2都是與PD-1結合但不與其他CD28家族成員結合的B7同系物。
作為免疫檢查點蛋白之一的PD-1是在活化的B細胞、T細胞和骨髓細胞上表達的CD28家族的抑制成員(Agata等人，同上；Okazaki等人. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett等人. (2003) J Immunol 170:711-8)，並且在限制T細胞的活性方面起主要作用，這提供了腫瘤細胞逃脫免疫監視的主要免疫抗性機制。PD-1在T細胞中誘導無效能或無反應狀態，導致細胞不能產生最佳水準的效應細胞因子。PD-1也可能藉由其抑制存活信號的能力誘導T細胞凋亡。PD-1缺陷動物發展各種自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病和具有關節炎和腎炎的狼瘡樣綜合症(Nishimura等人. (1999) Immunity 11:141-51; Nishimura等人. (2001) Science 291:319-22)。此外，已經發現PD-1在自身免疫性腦脊髓炎，系統性紅斑狼瘡，移植物抗宿主病(GVHD)，I型糖尿病和類風濕性關節炎中發揮作用(Salama等人. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13:R143; Nielsen等人. (2004) Lupus 11:510)。在小鼠B細胞腫瘤系中，PD-1的ITSM顯示出對阻斷下游效應分子的BCR介導的Ca2+流和酪氨酸磷酸化是必需的(Okazaki等人. (2001) PNAS 98: 13866-71)。
在活化的T細胞上表達的PD-1和在腫瘤細胞上表達的PD-L1的相互作用負調節免疫應答並抑制抗腫瘤免疫。PD-L1在多種人類癌症中大量存在(Dong等人 (2002) Nat. Med 8:787-9)。PD-L1在腫瘤上的表達與食管癌、胰腺癌和其他類型癌症中存活率降低相關，突出顯示該途徑作為腫瘤免疫治療的有希望的靶標。幾個研究小組已經顯示，PD-1-PD-L1相互作用使疾病惡化，導致腫瘤浸潤淋巴細胞的減少，T細胞受體介導的增殖的減少和癌細胞的免疫逃避(Dong等人. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank等人. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi等人. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100)。藉由抑制PD-1與PD-L1的局部相互作用可以逆轉免疫抑制，並且當PD-1與PD-L2的相互作用也被阻斷時，效果是可加成的。
單結構域抗體(sdAb)是由單個單體可變抗體域組成的抗體。像整個抗體一樣，它能夠選擇性結合特定的抗原。單結構域抗體比由兩條蛋白重鏈和兩條輕鏈組成的常見抗體小得多。第一個單結構域抗體是由駱駝科動物中發現的重鏈抗體改造而來的(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363(6428):446–448.)；這些被稱為VHH片段。目前，對單結構域抗體的大多數研究基於重鏈可變結構域。
單結構域抗體具有許多優點。例如，它們通常表現出高溶解度和穩定性，並且還可以容易地在酵母、植物和哺乳動物細胞中產生(Harmsen MM，De Haard HJ (2007) Properties，production，and applications of camelid single-domain antibody fragments. Appl Microbiol Biotechnol 77(1):13–22.)。此外，它們具有良好的熱穩定性和良好的組織滲透性。而且它們還在生產中具有成本效益。單結構域抗體的優勢使其適用於各種生物技術和治療應用。例如，它們可用於治療疾病，包括但不限於癌症、感染性疾病、炎症性疾病和神經退化性疾病。
雖然已開發出針對PD-1的抗體，但作為治療劑仍有改善抗PD-1抗體的需要。此外，值得注意的是，目前針對PD-1的單結構域抗體很少。因此，本領域希望開發新的抗PD-1抗體，特別是針對PD-1的單結構域抗體。
廣義而言，本發明涉及提供具有改善功效的抗體的新型化合物、方法、組合物和製品。本發明提供的益處廣泛地適用於抗體治療和診斷領域，並且可以與能夠與各種靶標反應的抗體聯合使用。本發明提供了抗PD-1抗體，較佳單結構域抗體。還提供了製備抗體的方法，編碼抗PD-1抗體的核酸分子，用於表達抗PD-1抗體的表達載體和宿主細胞。本發明的抗體提供了治療或預防與PD-1相關的病症的方法。
在一些方面，本發明涉及PD-1結合分子。
在一些實施方案中，PD-1結合分子具有一種或多種以下性質： (a)以1×10-7 M或更小的KD 結合人體PD-1； (b)抑制PD-L1/2與PD-1的結合； (c)誘導CD4+ T細胞中IFN-γ的產生； (d)基本上不與人體CD28、CTLA-4、ICOS和BTL結合； (e)與人體PD-1沒有交叉反應性，但與小鼠PD-1具有交叉反應性；和 (f)至少在60℃是穩定的，如藉由DSF測定檢測的。
在一些實施方案中，該PD-1結合分子包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1包含與SEQ ID NO：1至少90%相同的氨基酸序列，CDR2包含與SEQ ID NO：2至少90%相同的氨基酸序列，和CDR3包含與SEQ ID NO：3至少80%相同的氨基酸序列。
在一些實施方案中，該PD-1結合分子包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1在氨基酸序列上與SEQ ID NO：1存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；CDR2在氨基酸序列上與SEQ ID NO：2存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；及/或CDR3在氨基酸序列上與SEQ ID NO：3存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異。
在一些實施方案中，PD-1結合分子包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1、CDR2和CDR3選自： (a)由DSIX1 SX2 VNMG表示的CDR1，其中X1 = D或Q，並且X2 = M或L； (b)由LIAX3 YITHYADFVKG表示的CDR2，其中X3 = N、T、Y、R或W； (c)由RX4 IX5 X6 DY表示的CDR3，其中X4 = N或S，X5 = I、R或Y，並且X6 = V或E。
在一些實施方案中，PD-1結合分子包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1、CDR2和CDR3選自： (a)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3； (b)具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR3； (c)具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的CDR3； (d)具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR3； (e)具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR3； (f)具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的CDR3； (g)具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR3； (h)具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR3； (i)具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的CDR3； (j)具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的CDR3； (k)具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR3；和 (l)具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些實施方案中，PD-1結合分子包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中VHH包含 (A)SEQ ID NO：37-49中任一個所示的氨基酸序列； (B)與SEQ ID NO：37-49中的任何一個至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；或 (C)與SEQ ID NO：37-49中的任何一個相比具有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的添加、缺失及/或取代的氨基酸序列。
在一些方面，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的PD-1結合分子的核酸序列。
在一些方面，本發明涉及包含編碼如本文所揭露的PD-1結合分子的核酸分子的表達載體。
在一些方面，本發明涉及包含本文揭露的表達載體的宿主細胞。
在一些方面，本發明涉及包含至少一種本文揭露的PD-1結合分子和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
在一些方面，本發明涉及用於製備PD-1結合分子的方法，其包括在宿主細胞中表達PD-1結合分子並從宿主細胞分離PD-1結合分子。
在一些方面，本發明涉及抑制或阻斷受試者中PD-L1與PD-1結合的方法，其包括：向受試者施用治療有效量的本文揭露的PD-1結合分子。
在一些方面，本發明涉及用於抑制或阻斷受試者中PD-L2與PD-1結合的方法，其包括：向受試者施用治療有效量的本文揭露的PD-1結合分子。
在一些方面，本發明涉及治療受試者中與PD-1相關的病症的方法，其包括：向受試者施用治療有效量的本文揭露的PD-1結合分子。
在一些方面，本發明涉及治療受試者中會受益於免疫應答上調的病症的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的本文揭露的PD-1結合分子。
在一些方面，本發明涉及本文揭露的PD-1結合分子在製備用於治療或預防增殖性病症例如癌症的藥物中的用途。
在一些方面，本發明涉及本文揭露的PD-1結合分子在製備用於治療或預防將受益於免疫應答上調的病症的藥物中的用途。
在一些方面，本發明涉及使用本文揭露的PD-1結合分子以及本文揭露的藥物組合物的試劑盒或裝置和相關方法，其可用於治療增殖性疾病如癌症。為此，本發明較佳提供可用於治療此類病症的製品，其包含含有如本文揭露的PD-1結合分子的容器和用於使用本文所揭露的PD-1結合分子來治療、改善或預防增殖性疾病或其進展或復發的說明材料。在選定的實施方案中，裝置和相關方法將包括使至少一種循環腫瘤細胞與本文揭露的PD-1結合分子接觸的步驟。
以上內容是一個概述，因此必要時包含細節的簡化、概括和省略；因此，本領域技術人員將認識到，該概述僅是舉例說明性的，並不意圖以任何方式進行限制。本文所述的方法、組合物及/或裝置及/或其他主題的其它方面、特徵和優勢將在本文所示的教導中變得明顯。提供概述以簡化地介紹一些選擇的概念，這些概念將在下面的詳細描述中進一步描述。本概述不旨在確定所要求保護的主題的關鍵特徵或基本特徵，也不旨在用作確定所要求保護的主題的範圍的輔助手段。此外，貫穿本申請引用的所有參考文獻、專利和揭露的專利申請的內容藉由引用整體併入本文。
雖然本發明可以以許多不同的形式來實施，但在此揭露的是驗證本發明原理的其具體的舉例說明性實施方案。應該強調的是，本發明不限於所舉例說明的具體實施方案。此外，本文使用的任何章節標題僅用於組織目的，並不被解釋為限制所描述的主題。
除非在此另外定義，否則與本發明結合使用的科學和技術術語將具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數指示物。因此，例如，提及“一種蛋白質”包括多種蛋白質；提及“一個細胞”包括細胞的混合物等。在本申請中，除非另有說明，否則使用“或”意指“及/或”。此外，術語“包含”以及其他形式(諸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，說明書和所附申請專利範圍中提供的範圍包括端點和斷點之間的所有值。
通常，與本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質以及核酸化學和雜交有關的術語以及其技術是本領域眾所周知和常用的術語。除非另有說明，否則本發明的方法和技術通常根據本領域習知的常規方法進行，並如在本說明書全文中引用和討論的各種通用和更具體的參考文獻中所述進行。參見例如Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，6th ed.，W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D.Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (2000); Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology ，Wiley，John & Sons，Inc. (2002); Harlow and LaneUsing Antibodies: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1998); 和Coligan等人，Short Protocols in Protein Science ，Wiley，John & Sons，Inc. (2003)。與本文描述的分析化學，合成有機化學和藥物和藥物化學有關的術語以及實驗室程序和技術是本領域中眾所周知和常用的術語。此外，本文使用的任何章節標題僅用於組織目的，並且不被解釋為限制所描述的主題。 定義
為了更好地理解本發明，相關術語的定義和解釋提供如下。
如本文所用，術語“抗體”或“Ab”通常是指表現出所需生物學或結合活性的任何形式的抗體。它包括但不限於人源化抗體、完全人抗體、嵌合抗體和單結構域抗體。抗體可以包含重鏈和輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α和ε，它們分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每條重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1，CH2和CH3)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。VH和VL區可以進一步分為由相對保守的區域(稱為框架區(FR))間隔開的高變區(稱為互補決定區(CDR))。每個VH和VL由以下順序的3個CDR和4個FR組成：從N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。氨基酸在各種區域或結構域中的分佈遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1987 and 1991))或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia等人，(1989) Nature 342:878-883中的定義。抗體可以具有不同的抗體同種型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
如本文所用的術語“人源化抗體”是指其中來源於另一種哺乳動物物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人體框架序列上的抗體。可以在人體框架序列內進行額外的框架區修飾。
如本文所用的術語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其中可變區序列來自一個物種並且恆定區序列來自另一物種，例如其中可變區序列源自小鼠抗體和恆定區序列來源於人體抗體。
如本文所用，術語“PD-1”是指程序性細胞死亡蛋白，其屬於免疫球蛋白超家族並且作為共抑制性受體發揮作用以負調節免疫系統。PD-1是CD28/CTLA-4家族的成員，並且具有兩種已知的配體，包括PD-L1和PD-L2。PD-1的替代名稱或同義詞包括PDCD1，PD1，CD279和SLEB2等。在NCBI登錄號：NP_005009.2下揭露了人體PD-1的代表性氨基酸序列，並且在NCBI登錄號NM_005018.2下顯示了編碼人體PD-1的代表性核酸序列。
如本文所用，術語“PD-L1”是指程序性細胞死亡配體1(PD-L1，參見例如Freeman等人. (2000) J. Exp. Med. 192: 1027)。PD-L1的替代名稱或同義詞包括PDCD1L1，PDL1，B7H1，CD274和B7-H等。人體PD-L1的代表性氨基酸序列在NCBI登錄號NP_054862.1中揭露，編碼人體PD-L1的代表性核酸序列顯示在NCBI登錄號：NM_014143.3下。PD-L1在胎盤，脾臟，淋巴結，胸腺，心臟，胎兒肝臟中表達，並且也在許多腫瘤或癌細胞中發現。PD-L1結合其受體PD-1或B7-1，其在活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞上表達。PD-L1和其受體的結合誘導信號轉導以抑制TCR介導的細胞因子產生和T細胞增殖的激活。因此，PD-L1在特定事件(例如妊娠，自身免疫疾病，組織同種異體移植物)期間抑制免疫系統中起主要作用，並且被認為允許腫瘤或癌細胞繞過免疫檢查點並逃避免疫應答。
如本文所用，術語“PD-L2”是指程序性細胞死亡配體2。PD-L2的替代名稱或同義詞包括PDCD1L2，PDL2，B7-DC，Btdc和CD273等。人體PD-L2的代表性氨基酸序列在NCBI登錄號NP_079515.2中揭露。
如本文所用，術語“抗PD-1抗體”是指能夠特異性結合PD-1(例如人體，猴或猴PD-1)的抗體。有利的是，抗PD-1抗體以足以提供診斷及/或治療用途的親和力與PD-1特異性結合。
如本文所用，術語“Ka”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而本文所用的術語“Kd”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離速率。抗體的Kd值可以使用本領域良好建立的方法來確定。如本文所用，術語“KD ”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離常數，其從Kd與Ka的比率(即，Kd/Ka)獲得並且表示為摩爾濃度(M)。確定抗體Kd的較佳方法是藉由使用表面電漿共振，較佳使用生物感測器系統如Biacore®系統。
如本文所用的術語“特異性結合”或“特異性結合至”是指兩個分子之間例如抗體和抗原之間的非隨機結合反應。
如本文所用，“抑制結合”、“阻斷結合”或“競爭相同表位”的能力是指抗體抑制兩個分子(例如人體PD-1和抗- PD-1抗體)的結合至任何可檢測的程度的能力。在一些實施方案中，阻斷兩個分子之間結合的抗體將兩個分子之間的結合相互作用抑制至少50％。在一些實施方案中，該抑制可以大於60％，大於70％，大於80％或大於90％。
如本文所用的術語IgG抗體的“高親和力”是指針對靶抗原具有1×10-7 M或更低，更佳5×10-8 M或更低，甚至更佳1×10-8 M或更低，甚至更佳5×10-9 M或更低，和甚至更佳1×10-9 M或更低的KD 的抗體。
如本文所用的術語“EC50 ”，也被稱為“半數有效濃度”，是指在特定的暴露時間後誘導在基線和最大值之間的50%的應答的藥物、抗體或毒劑的濃度。在本申請的上下文中，EC50 的單位為“nM”。
如本文所用，術語“表位”是指免疫球蛋白或抗體特異性結合的抗原部分。“表位”也被稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖側鏈的化學活性表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構和特定的電荷特徵。例如，表位通常包含獨特立體構象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或不連續的氨基酸，其可以是“線性”或“構象”表位。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol. 66，G. E. Morris，Ed. (1996)。在線性表位中，蛋白質和相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用位點沿蛋白質的一級氨基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用位點跨越蛋白質中彼此分離的氨基酸殘基。取決於藉由本領域技術人員已知的常規技術檢測的結合相同表位的競爭性，可以篩選抗體。例如，可以進行競爭或交叉競爭研究以獲得彼此競爭或交叉競爭結合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗體。在國際專利申請WO 03/48731中描述了用於獲得結合相同表位的抗體的高通量方法，其基於它們的交叉競爭。
如本文所用，術語“分離的”是指藉由人工方式從天然狀態獲得的狀態。如果某種“分離的”物質或組分天然存在，則可能是因為其天然發生變化，或者物質與天然分離，或者兩者兼而有之。例如，某種未分離的多核苷酸或多肽天然存在於某個活動物體內，從該天然狀態分離的相同的高純度多核苷酸或多肽被稱為分離的多核苷酸或多肽。術語“分離的”既不排除混合的人造或合成物質，也不排除不影響分離的物質的活性的其他不純物質。
如本文所用，術語“分離的抗體”旨在指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結合PD-1蛋白的分離的抗體基本上不含特異性結合除PD-1蛋白以外的抗原)。但是，特異性結合人體PD-1蛋白的分離的抗體可能與其他抗原如來自其他物種的PD-1蛋白具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料及/或化學物質。
如本文所用，術語“載體”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。當載體允許插入其中的多核苷酸編碼的蛋白質的表達時，該載體稱為表達載體。該載體可以藉由轉化、轉導或轉染入宿主細胞而使攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中表達。載體是本領域技術人員所熟知的，包括但不限於質粒、噬菌體、黏粒、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體和動物病毒。可用作載體的動物病毒包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(如SV40)。載體可以包含用於控制表達的多個元件，包括但不限於啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件和報道基因。另外，載體可以包含複製起點。
如本文所用，術語“宿主細胞”是指可以導入載體的細胞，包括但不限於原核細胞如大腸桿菌(E. coli )或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )、真菌細胞如酵母細胞或麯黴屬(Aspergillus )、昆蟲細胞如S2果蠅細胞或Sf9，以及動物細胞如成纖維細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK293細胞或人體細胞。
如本文所用的術語“T細胞”包括CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、T輔助1型T細胞、T輔助2型T細胞、T輔助17型T細胞和抑制性T細胞。
如本文所用，術語“同一性”是指藉由比對和比較序列確定的兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子的序列之間的關係。“百分比同一性”是指比較分子中氨基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並基於被比較的最小分子的大小計算。對於這些計算，比對中的間隙(如果有的話)較佳藉由特定的數學模型或計算機程序(即“算法”)來尋址。可以用於計算比對的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology，(Lesk，A. M.，ed.)，1988，New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects，(Smith，D. W.，ed.)，1993，New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data，Part I，(Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.)，1994，New Jersey: Humana Press; von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis in Molecular Biology，New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer，(Gribskov，M. and Devereux，J.，eds.)，1991，New York: M. Stockton Press; 和Carillo等人，1988，SIAMJ. Applied Math. 48:1073中描述的那些。
如本文所用，術語“免疫原性”是指刺激生物體中特異性抗體或致敏淋巴細胞形成的能力。它不僅指抗原刺激特定免疫細胞活化、增殖和分化以最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的性質，還指抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答可以在用抗原刺激生物體後在生物體的免疫系統中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能夠成功誘導宿主中免疫應答的產生取決於三個因素：抗原的性質，宿主的反應性和免疫手段。
如本文所用，術語“轉染”是指將核酸引入真核細胞特別是哺乳動物細胞的過程。用於轉染的方案和技術包括但不限於脂質轉染和化學和物理方法如電穿孔。許多轉染技術在本領域是習知的並且在本文中揭露。參見例如Graham等人，1973，Virology 52:456; Sambrook等人，2001，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，同上; Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier; Chu et al，1981，Gene 13:197。
如本文所用，術語“SPR”或“表面電漿共振”是指並且包括允許藉由檢測生物感測器基質內的蛋白質濃度的改變來分析實時生物特異性相互作用的光學現象，例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。關於詳細描述，參見實施例和Jönsson，U.,等人 (1993)Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson，U.,等人 (1991)Biotechniques 11:620-627; Johnsson，B.,等人 (1995)J. Mol. Recognit. 8:125-131; 和Johnnson，B.,等人 (1991)Anal. Biochem. 198:268-277。
如本文所用，術語“螢光流式細胞分選”或“FACS”是指專門類型的流式細胞術。它提供了根據每個細胞的特定光散射和螢光特徵，將生物細胞的異質混合物以每次一個細胞分揀到兩個或更多個容器中的方法(FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. 2017-11-09)。用於進行FACS的儀器是本領域技術人員已知的並且可以對於公眾是可商購獲得的。這種儀器的實例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort儀器、來自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的Epics C和來自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。
術語“受試者”包括任何人體或非人動物，較佳為人體。
如本文所用，術語“與PD-1關聯的病症”或“與PD-1相關的病症”是指由PD-1(如人體PD-1)的增加或減少的表達或活性引起、加重或以其它方式與其相關的任何病症。
如本文所用，術語“癌症”是指引發醫學病症的任何腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移介導的實體瘤和非實體瘤如白血病。
本文在治療病情的情況中使用的術語“治療”和“醫治”一般涉及人體或動物的治療和療法，其中實現了一些期望的治療效果，例如，抑制病情進展，包括進展速度下降、進展速度停滯、病情消退、病情改善和病情治癒。還包括了作為預防措施(即預防)的治療。對於癌症，“治療”可能是指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移或其某種組合。對於腫瘤，“治療”包括去除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長和轉移、預防或延遲腫瘤的發展或其某種組合。
如本文所用，術語“治療有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、組合物或劑型的量，其在按照所需的治療方案施用時有效用於產生與合理的益處/風險比相稱的某些所需的治療效果。具體而言，“治療有效量”意指抗體或其抗原結合部分有效治療人體PD-1相關疾病或病症的量或濃度。
如本文所用，本發明的“宿主細胞”是指引入外源多核苷酸的細胞。
如本文所用，術語“藥學上可接受”是指載體、稀釋劑、賦形劑及/或其鹽在化學及/或物理上與製劑中的其他成分相容，並且與接受者在生理學上相容。
如本文所用，術語“藥學上可接受的載體及/或賦形劑”是指在藥理學及/或生理學上與受試者和活性劑相容的載體及/或賦形劑，其在本領域中是習知的(參見，例如， Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR，19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company，1995)，並且包括但不限於pH調節劑，表面活性劑，佐劑和離子強度增強劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液；表面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或非離子表面活性劑，例如Tween-80；離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。
如本文所用，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，其在與抗原一起遞送至生物體或被提前遞送至有機體時可以增強生物體中的對抗原的免疫應答或改變免疫應答的類型。存在多種佐劑，包括但不限於鋁佐劑(例如氫氧化鋁)，弗氏佐劑(例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑)，短小棒狀桿菌，脂多糖，細胞因子等。弗氏佐劑是目前動物實驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑更常用於臨床試驗。 PD-1結合分子
在一些方面，本發明包含PD-1結合分子。
一般來說，PD-1結合分子可以包括任何特異性結合PD-1的分子。在一些情況下，“PD-1結合分子”可以包括“PD-1拮抗劑”。“PD-1拮抗劑”是指阻斷PD-L1與免疫細胞(T細胞，B細胞或NKT細胞)上表達的PD-1結合的任何化合物或生物分子，並且較佳還阻斷PD-L2與免疫細胞表達的PD-1結合。PD-1結合分子或PD-1拮抗劑可以是多肽或蛋白質，例如抗體，更具體地說是抗PD-1抗體。
抗體包括但不限於嵌合抗體、人源化抗體或單結構域抗體。在具體的實施方案中，PD-1結合分子是單結構域抗體，其通常是指由單個單體可變抗體結構域組成的抗體。像整個抗體一樣，單結構域抗體能夠選擇性結合特定抗原。
更具體而言，PD-1結合分子是單結構域重鏈抗體，其可與術語“VHH”、“VHH抗體”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH ”或“奈米抗體”等互換使用。來自駱駝科抗體的VHH 分子是已知的最小完整抗原結合結構域之一(約15KD a，或是常規IgG的1/10)，因此非常適合遞送至緻密組織和進入大分子之間的有限空間。
本文揭露的本發明的單結構域抗體可由本領域技術人員根據本領域已知的方法或任何未來的方法製備。例如，可以使用本領域已知的方法獲得VHH，例如藉由免疫駱駝並從中獲得雜交瘤，或者藉由使用本領域已知的分子生物學技術複製本發明的VHH的文庫，然後藉由使用噬菌體展示進行選擇。
例如，可藉由用所需抗原免疫美洲駝或羊駝並隨後分離編碼重鏈抗體的mRNA來獲得單結構域抗體。藉由逆轉錄和聚合酶鏈反應，產生含有數百萬殖株的單結構域抗體的基因文庫。篩選技術如噬菌體展示和核糖體展示有助於鑑定結合抗原的殖株。一種技術是噬菌體展示，其中在噬菌體上合成(較佳人體)抗體文庫，用感興趣的抗原或其抗體結合部分篩選文庫，並分離結合抗原的噬菌體，從其中可以獲得免疫反應性片段。用於製備和篩選這種文庫的方法是本領域眾所周知的，並且用於產生噬菌體展示文庫的試劑盒可商購獲得(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；以及Stratagene SurfZAPTM 噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)。還有其他方法和試劑可用於產生和篩選抗體展示文庫(參見例如Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982(1991))。
當最有效的殖株被鑑定時，例如藉由親和力成熟或人源化最佳化其DNA序列。人源化可以防止人體對抗抗體的免疫反應。
因此，可藉由以下方式獲得單結構域抗體：(1)分離天然存在的重鏈抗體的VHH結構域；(2)藉由表達編碼天然存在的VHH結構域的核苷酸序列；(3)藉由天然存在的VHH結構域的“人源化”(如下所述)或藉由表達編碼這種人源化VHH結構域的核酸；(4)藉由來自任何動物物種，特別是哺乳動物物種，例如來自人體的天然存在VH結構域的“駱駝化”，或藉由表達編碼這種駱駝化VH結構域的核酸；(5)藉由如Ward等人(上文)描述的“結構域抗體”或“Dab”的“駱駝化”，或藉由表達編碼這種駱駝化VH結構域的核酸；(6)使用合成或半合成技術製備蛋白質、多肽或其他氨基酸序列；(7)藉由使用用於核酸合成的技術製備編碼VHH的核酸，然後表達由此獲得的核酸；及/或(8)藉由前述的任何組合。基於本文的揭露內容，用於執行前述內容的合適方法和技術對於本領域技術人員將是清楚的，並且例如包括下文更詳細描述的方法和技術。
單結構域抗體通常藉由從免疫動物獲得的血液、淋巴結或脾cDNA PCR殖株可變結構域庫至噬菌體展示載體中而產生。通常藉由在固定化抗原(例如塗佈在試管塑膠表面的抗原，固定在鏈黴抗生物素蛋白珠上的生物素化抗原或細胞表面上表達的膜蛋白)上淘選相文庫來選擇抗原特異性單結構域抗體。藉由體外模擬該策略可以提高adAb的親和力，例如藉由CDR區的定點誘變和在增加的嚴格條件(更高溫度、高或低鹽濃度、高或低pH和低抗原濃度)下對固定化抗原進行進一步的淘選(Wesolowski等人.，Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol (2009) 198: 157-174)。
用於製備特異性結合抗原或表位的VHH的方法描述於參考文獻中，參見例如：R. van der Linden等人.，Journal of Immunological Methods，240(2000) 185-195; Li等人.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721; Deffar等人.，African Journal of Biotechnology Vol. 8(12)，pp.2645，17 June，2009和WO94/04678。
在一些實施方案中，PD-1結合分子中的VHH與抗體的Fc結構域(例如IgG的Fc結構域(例如IgG4或IgG1))融合。在具體實施方案中，Fc-結構域是IgG4的Fc-結構域。藉由將VHH融合至Fc結構域，可以更有效地募集效應功能，例如ADCC和CDC。而且，VHH與Fc結構域的融合可以幫助PD-1結合分子形成二聚體，並且還可以幫助延長PD-1結合分子的體內半衰期。
如本文所用，術語“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指其中與某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)結合的分泌的Ig使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞並隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。抗體“武裝”細胞毒性細胞，並且對於這種殺傷是絕對需要的。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達總結在Ravetch and Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)的464頁的表3中。為了評估感興趣分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，例如美國專利號5,500,362或5,821,337中所述的測定。可用於此類測定的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。可選或另外地，感興趣分子的ADCC活性可以在體內評估，例如在如Clynes等人 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)揭露的動物模型中評估。
術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體存在下靶細胞的裂解。經典補體途徑的激活由補體系統的第一組分(C1q)與結合其同源抗原的抗體(適當的亞類)結合而啟動。為了評估補體活化，可以執行CDC測定，例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所述的。
為了便於描述，在下面的章節中將PD-1結合分子描述為抗PD-1抗體。 具有某些性質的抗PD-1抗體
本發明的抗體的特徵在於抗體的特定功能特徵或性質。在一些實施方案中，抗體具有以下性質中的一種或多種： (a)以1×10-7 M或更小的KD 結合人體PD-1； (b)抑制或阻斷PD-L1或PD-L2與PD-1的結合； (c)誘導CD4+ T細胞中IFN-γ的產生； (d)基本上不與人體CD28、CTLA-4、ICOS及/或BTL結合； (e)與人體PD-1沒有交叉反應性，但與小鼠PD-1具有交叉反應性；和 (f)至少在60℃是穩定的。
本發明的抗體以高親和力與細胞表面PD-1結合。本發明的抗體與PD-1的結合可以使用本領域良好建立的一種或多種技術，例如ELISA來評估。本發明抗體的結合特異性也可以藉由監測抗體與表達PD-1蛋白的細胞的結合（例如流式細胞術）來確定。例如，抗體可以藉由流式細胞術測定來測試，其中抗體與表達人體PD-1的細胞系例如已轉染以在其細胞表面表達PD-1的CHO細胞反應。另外或可選地，可以在BIAcore結合測定中測試抗體的結合，包括結合動力學(例如KD 值)。其他合適的結合測定包括ELISA測定，例如使用重組PD-1蛋白。例如，本發明的抗體以1×10-7 M或更低，5×10-8 M或更低，2×10-8 M或更低，5×10-9 M或更低，4×10-9 M或更低，3×10-9 M或更低，2×10-9 M或更低，1×10-9 M或更低，5× 10-10 M或更低，1×10-10 M或更低的KD 結合細胞表面(例如人體PD-1)蛋白。
在一些實施方案中，本發明的抗體以不超過或約10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM、0.1 nM、0.09 nM、0.08 nM、0.07 nM、0.06 nM、0.05 nM、0.04 nM、0.03 nM、0.02 nM、或0.01 nM的EC50 結合食蟹猴或猴PD-1，如藉由FACS測量的。
在一些實施方案中，本發明的抗體以0.2nM-100nM(例如0.2nM-50nM、0.2nM-30nM、0.2nM-20nM、0.2nM nM-10nM或1nM-10nM)的IC50 抑制人體PD-1與其配體的結合，如在競爭測定中例如藉由ELISA所測量的。
本發明的抗PD-1抗體對PD-1是特異性的。在一些實施方案中，抗體及其抗原結合片段不結合CD28、CTLA-4、ICOS及/或BTL。例如，與CD28、CTLA-4、ICOS及/或BTL的結合親和力小於與PD-1的結合親和力的15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，或1％。
在一些實施方案中，本發明的抗體阻斷人體PD-1與其配體的結合，從而提供生物學活性，包括例如從活化的T細胞(例如CD4+ T細胞和CD8 + T細胞)誘導細胞因子產生，誘導活化的T細胞(例如CD4+ T細胞和CD8 + T細胞)的增殖，以及逆轉T reg的抑制功能。示例性的細胞因子包括IL-2和IFNγ。術語“IL-2”是指白細胞介素2，其是免疫系統中調節白血球(例如白細胞)活性的一類細胞因子信號傳導分子。術語“干擾素γ(IFNγ)”是由天然殺傷細胞(NK)，NKT細胞，CD4+和CD8 + T細胞產生的細胞因子，其是巨噬細胞的關鍵激活劑和主要組織相容性複合體(MHC)分子表達的誘導劑。細胞因子產生可以使用本領域已知的方法確定，例如藉由ELISA。方法也可用於檢測T細胞的增殖，包括[3H]胸苷摻入測定。
在一些實施方案中，本發明的抗體與人體PD-1沒有交叉反應性，但與小鼠PD-1具有交叉反應性。目前在臨床試驗中測試的大多數針對PD-1的單殖株抗體僅針對人體PD-1，這限制了臨床前體內測定和由於小鼠來源的蛋白質序列的免疫原性而降低的功效。與小鼠PD-1具有交叉反應性的人源化抗體克服了這些缺陷，並顯示出更高的體內耐受性和更高的效率。 包含與特定序列具有序列同一性的CDR的抗PD-1抗體
在一些實施方案中，本發明的抗PD-1抗體包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1包含與SEQ ID NO：1至少90%相同的氨基酸序列，CDR2包含與SEQ ID NO：2至少90%相同的氨基酸序列，和CDR3包含與SEQ ID NO：3至少980%相同的氨基酸序列。
除非另有說明，否則將氨基酸分配給每個CDR可以根據以下提供的編號方案之一：Kabat等人 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242; Chothia等人, 1987, PMID: 3681981; Chothia等人, 1989, PMID: 2687698; MacCallum等人,1996, PMID: 8876650; 或Dubel, Ed. (2007)Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co.。
抗體序列中的可變區和CDR可以根據本領域已經開發的一般規則(如上所述，例如Kabat編號系統)或藉由將序列與已知可變區的資料庫比對來鑑定。在Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001和Dinarello等人, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000中描述了鑑定這些區域的方法。抗體序列的示例性資料庫描述於並可獲自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”網站(由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England的A.C. Martin維護)和VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人, Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)中所述。較佳使用Abysis資料庫分析序列，其整合了來自Kabat、IMGT和蛋白質資料庫(PDB)的序列數據與來自PDB的結構數據，參見Dr. Andrew C. R. Martin所著的書中的Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains . In:Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547，也可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis資料庫網站還包括已經開發用於識別可以根據本文的教導使用的CDR的一般規則。除非另有說明，否則本文所述的所有CDR均根據Kabat的Abysis資料庫網站獲得。
兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以使用E. Meyers和W. Miller的算法(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))確定，該算法已被併入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。另外，兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以藉由Needleman和Wunsch的算法(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))確定，其已併入GCG軟體套件(可從http://www.gcg.com獲得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，空隙權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。
另外地或可選地，本發明的蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列”來執行針對公共資料庫的搜索以例如識別相關序列。這種搜索可以使用Altschul,等人 (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)來執行。可用XBLAST程序進行BLAST蛋白質搜索，得分= 50，字長= 3，以獲得與本發明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對，可使用空位BLAST，如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述的。當使用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各個程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
在另一些實施方案中，CDR氨基酸序列可以與上文出的各個序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。 包含具有氨基酸添加、缺失或取代的CDR的抗PD-1抗體
在一些實施方案中，本發明的抗PD-1抗體包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1在氨基酸序列上與SEQ ID NO：1存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；CDR2在氨基酸序列上與SEQ ID NO：2存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；及/或CDR3在氨基酸序列上與SEQ ID NO：3存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異。例如，CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列存在僅一個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異。
在一些實施方案中，本發明的抗PD-1抗體包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1、CDR2和CDR3選自： (a)由DSIX1 SX2 VNMG表示的CDR1，其中X1 = D或Q，並且X2 = M或L； (b)由LIAX3 YITHYADFVKG表示的CDR2，其中X3 = N、T、Y、R或W； (c)由RX4 IX5 X6 DY表示的CDR3，其中X4 = N或S，X5 = I、R或Y，並且X6 = V或E。
較佳地，分離的抗體或其抗原結合部分的CDR含有不多於2個氨基酸或不多於1個氨基酸的保守取代。如本文所用，術語“保守取代”是指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白質/多肽的基本性質的氨基酸取代。例如，保守取代可以藉由本領域已知的標準技術（例如定點誘變和PCR介導的誘變）引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一氨基酸殘基取代的取代，例如物理或功能相似的殘基（例如具有相似的大小、形狀、電荷、化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）至相應的氨基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸（例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸），具有酸性側鏈的氨基酸（例如天冬氨酸和谷氨酸），具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸（例如甘氨酸、天冬醯胺、谷氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非極性側鏈的氨基酸（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β-分支側鏈的氨基酸（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具有芳香族側鏈的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，相應的氨基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。用於鑑定氨基酸保守取代的方法在本領域中是習知的（參見例如Brummell等人, Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi等人, Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 和Burks等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)，其藉由引用併入本文）。 包含CDR的抗PD-1抗體
在一些實施方案中，至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1、CDR2和CDR3選自： (a)包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (b)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (c)包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (d)包含SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (e)包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (f)包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：17中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：18中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (g)包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：20中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (h)包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (i)包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：26中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：27中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (j)包含SEQ ID NO：28中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：29中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：30中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3； (k)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3；和 (l)包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列或由其組成的CDR1，包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列或由其組成的CDR2，和包含SEQ ID NO：36中所示氨基酸序列或由其組成的CDR3。
在一些實施方案中，至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1、CDR2和CDR3選自： (a)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3； (b)具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR3； (c)具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的CDR3； (d)具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR3； (e)具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR3； (f)具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的CDR3； (g)具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR3； (h)具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR3； (i)具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的CDR3； (j)具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的CDR3； (k)具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR3；和 (l)具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR3。 藉由VHH序列定義的抗PD-1抗體
在一些實施方案中，抗PD-1抗體包含至少一個免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)，其中該VHH包含或由以下組成： (A)SEQ ID NO：37-49中任一個所示的氨基酸序列； (B)與SEQ ID NO：37-49中的任何一個至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；或 (C)與SEQ ID NO：37-49中的任何一個相比具有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的添加、缺失及/或取代的氨基酸序列。
在其他實施方案中，VHH的氨基酸序列可以與上述各個序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。作為說明性實例，抗體可以包含與SEQ ID NO：37具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VHH。
在一些進一步的實施方案中，抗PD-1抗體可以包含重鏈及/或輕鏈的可變區中的氨基酸的保守取代或修飾。本領域理解的是，可以進行某些不消除抗原結合的保守序列修飾。參見例如Brummell等人 (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt等人 (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov等人 (1997) J. Biol. Chem. 272:26864- 26870; Hall等人 (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O’ Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy等人 (1998) Int. Immunol. 10:341-6和Beers等人 (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43。
本文使用的術語“保守取代”是指氨基酸取代，其不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白質/多肽的基本性質。例如，保守取代可以藉由本領域已知的標準技術(例如定點誘變和PCR介導的誘變)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一氨基酸殘基取代的取代，例如物理或功能相似的殘基(例如具有相似的大小，形狀，電荷，化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)至相應的氨基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)，具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸，天冬醯胺，谷氨醯胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。因此，相應的氨基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。用於鑑定氨基酸保守取代的方法在本領域中是習知的(參見例如Brummell等人, Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi等人, Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 和Burks等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)，其藉由引用併入本文)。 分倉和表位作圖
將進一步理解的是，所揭露的抗體將與由所選擇的靶或其片段呈遞的離散表位或免疫原性決定簇締合或結合。在一些實施方案中，表位或免疫原性決定簇包括分子的化學活性表面分組，例如氨基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基。在一些實施方案中，表位可以具有特定的三維結構特徵及/或特異性電荷特性。因此，如本文所用，術語“表位”包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合或以其他方式與分子相互作用的任何蛋白質決定簇。在一些實施方案中，當抗體優先識別蛋白質及/或大分子的複雜混合物中的其靶抗原時，抗體被認為特異性結合(或免疫特異性結合或反應)抗原。在一些實施方案中，當平衡解離常數(KD )小於或等於10-6 M或小於或等於10-7 M時，更佳當KD 小於或等於10-7 M時，稱抗體與抗原特異性結合等於10-8 M，甚至更佳當KD 小於或等於10-9 M時，抗體被認為特異性結合抗原。
由連續氨基酸形成的表位(有時稱為“線性”或“連續”表位)通常在蛋白質變性時保留，而藉由三級折疊形成的表位通常在蛋白質變性後丟失。在任何情況下，抗體表位通常在獨特的空間構象中包含至少3個，更通常地至少5或8-10個氨基酸。
在這方面，應該理解的是，在一些實施方案中，表位可以與例如PD-1蛋白的一個或多個區域、結構域或模體結合或位於其中。類似地，本領域公認的術語“模體”將根據其通用含義使用，並且通常應該是指通常十至二十個連續氨基酸殘基的蛋白質的短保守區域。
無論如何，一旦確定了抗原上的所需表位，就有可能產生針對該表位的抗體，例如藉由使用本發明中描述的技術用包含表位的肽免疫。或者，在發現過程中，抗體的產生和表徵可以闡明關於位於特定結構域或模體中的期望表位的資訊。從這些資訊中，可以競爭性篩選與相同表位的結合的抗體。實現這一點的方法是進行競爭研究以發現彼此競爭性結合的抗體，即抗體競爭結合抗原。在WO 03/48731中描述了基於其交叉競爭對抗體進行分倉的高通量方法。分倉或結構域水準或表位作圖包括抗體競爭或在酵母上的抗原片段表達的其他方法在本領域中是習知的。
如本文所用，術語“分倉”是指用於基於抗原結合特徵和競爭對抗體進行分組或分類的方法。儘管這些技術對於定義和分類本發明的抗體是有用的，但是這些倉(bin)並不總是直接與表位結合，並且表位結合的這種初始測定可以藉由本領域中和如本文所述的其他公認的方法進一步改進和確認。然而，可以理解的是，將抗體憑驗性地分配至各個倉提供了可以指示所揭露的抗體的治療潛力的資訊。
更具體地，可以藉由使用本領域已知和本文實施例中所示的方法確定選定的參考抗體(或其片段)是否結合相同的表位或與第二測試抗體交叉競爭結合(即，在相同的倉內)。
其他相容的表位作圖技術包括丙氨酸掃描突變體，肽印跡(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248：443-63)(特別地藉由引用整體併入本文)或肽切割分析。另外，可以使用抗原的表位切除，表位提取和化學修飾等方法(Tomer (2000) Protein Science 9：487-496)(特別地藉由引用整體併入本文)。 編碼本發明抗體的核酸分子
在一些方面，本發明涉及分離的核酸分子，其包含編碼如本文所揭露的VHH的核酸序列。
本發明的核酸可以使用標準分子生物學技術獲得。對於從免疫球蛋白基因文庫獲得的抗體(例如，使用噬菌體展示技術)，編碼這種抗體的核酸可以從基因文庫中回收。
本發明的示例性核酸分子分別是SEQ ID Nos：50-62所列的那些。在一些實施方案中，該核酸分別與SEQ ID NO：17-20具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些實施方案中，同一性的百分比源自遺傳密碼的簡並性，並且編碼的蛋白質序列保持不變。
可以使用本領域已知的重組技術將編碼抗PD-1抗體的核酸分子插入載體以進一步複製(擴增DNA)或用於表達。在另一個實施方案中，抗體可以藉由本領域已知的同源重組產生。編碼單殖株抗體的DNA易於使用常規方法分離和測序(例如，藉由使用能夠與編碼抗體重鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。許多載體是可用的。載體組分通常包括但不限於以下一種或多種：信號序列、複製起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)，和轉錄終止序列。選擇標記基因有助於選擇導入了載體的宿主細胞(參見例如美國專利號4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常選擇標記基因賦予載體已經導入其中的宿主細胞對藥物(例如G418、潮黴素或甲氨蝶呤)的抗性。選擇標記基因可以包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於具有甲氨蝶呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞)和neo基因(用於G418選擇)。
在一些實施方案中，載體系統包括哺乳動物、細菌、酵母系統等，並包括質粒，例如，但不限於，pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等等，以及其他實驗室和商業可用的載體。合適的載體可以包括質粒或病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。在本發明的一個實施方案中，載體可以是pET，例如含有六組氨酸標籤和c-Myc-標籤基因的pETbac。
包含編碼PD-1結合分子的核酸序列的載體可以被引入宿主細胞用於殖株或基因表達。用於在本文的載體中殖株或表達DNA的合適宿主細胞是原核生物、酵母或高等真核生物細胞。用於該目的的合適原核生物包括真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷伯氏菌屬，變形桿菌屬，沙門氏菌屬，例如鼠傷寒沙門氏菌，沙雷氏菌屬，例如黏質沙雷氏菌和志賀氏菌，以及芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，假單胞菌屬如銅綠假單胞菌和鏈黴菌。
除了原核生物以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母是合適的用於抗PD-1抗體編碼載體的殖株或表達宿主。釀酒酵母或普通麵包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其它屬、種和菌株通常是可獲得的並且可用於本發明，例如粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)；西洋蓍黴(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)；許旺氏酵母屬 (schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)；和絲狀真菌，例如鏈孢黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、Tolypocladium以及麯黴屬宿主如構巢麯黴(A.nidulans)和黑麯黴(A. niger)。
用於表達本文提供的抗PD-1抗體的其他合適的宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。目前已經從下述宿主中鑑定了大量的杆狀病毒株和變體以及相應的容許型昆蟲宿主細胞：草地夜蛾 (Spodoptera Frugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白紋伊蚊 (Aedes albopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾(Bombyx mori)。用於轉染的各種病毒株是公眾可獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，並且根據本發明，這些病毒可以用作本文的病毒，特別是用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛花、番茄和煙草的植物細胞培養物也可用作宿主。
用上述用於抗PD-1抗體產生的表達或殖株載體轉化宿主細胞，並在用於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列的基因的根據需要修改的常規營養培養基中培養。
用於產生本文提供的抗PD-1抗體的宿主細胞可以在各種培養基中培養。諸如Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Sigma)的商業上可獲得的培養基適於培養宿主細胞。此外，Ham等人., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes等人., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Pat. No. 4,767,704； 4,657,866； 4,927,762； 4,560,655； 或5,122,469； WO 90/03430； WO 87/00195; 或U.S. Pat. Re. 30,985中描述的任何培養基可用作宿主細胞的培養基。必要時可以用激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸腺嘧啶)、抗生素(如GENTAMYCINTM藥物)、微量元素(定義為無機化合物，通常以微摩爾範圍內的終濃度存在)和葡萄糖或等同能量來源添加至任何這些培養基。任何其他必需的補充劑也可以以本領域技術人員已知的適當濃度包含在內。諸如溫度、pH等的培養條件是與之前選擇用於表達的宿主細胞一起使用的那些，並且對普通技術人員而言將是明顯的。
當使用重組技術時，抗體可以在細胞內，在周質空間中產生，或者直接分泌到培養基中。如果抗體在細胞內產生，作為第一步，例如藉由離心或超濾除去微粒碎片(宿主細胞或裂解片段)。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的方法。簡而言之，在約30分鐘內，在乙酸鈉(pH 3.5)，EDTA和苯甲基磺醯氟(PMSF)的存在下融化細胞糊。細胞碎片可以藉由離心去除。在抗體分泌到培養基中的情況下，通常首先使用市售的蛋白質濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自這種表達系統的上清液。蛋白酶抑制劑例如PMSF可包括在任何前述步驟中以抑制蛋白水解，並可包含抗生素以防止外來污染物的生長。
可以使用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析、硫酸銨沉澱、鹽析和親和層析來純化從細胞製備的抗體，其中親和層析是較佳的純化技術。
在任何初步純化步驟之後，包含目標抗體和污染物的混合物可以使用pH介於約2.5-4.5之間的洗脫緩衝液進行低pH疏水相互作用色譜，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進行。 藥物組合物
在一些方面，本發明涉及藥物組合物，其包含至少一種如本文所揭露的PD-1結合分子和藥學上可接受的載體。 組合物的組分
藥物組合物可以任選地含有一種或多種另外的藥物活性成分，例如另一種抗體或藥物。本發明的藥物組合物還可以與例如另一種免疫刺激劑、抗癌劑、抗病毒劑或疫苗組合施用，使得抗PD-1抗體增強對疫苗的免疫反應。藥學上可接受的載體可以包括例如藥學上可接受的液體、凝膠或固體載體、水性介質、非水性介質、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒的輔助物質，本領域已知的各種組分的組合或更多。
合適的組分可以包括例如抗氧化劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑如糖和環糊精。合適的抗氧化劑可包括例如甲硫氨酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羥基甲苯及/或丙基砷酸鹽。如本發明所揭露的，在包含還原抗體或其抗原結合片段的一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的含有本發明揭露的組合物的抗體或抗原結合片段的溶劑中，其可被氧化。氧化還原可防止或減少結合親和力的降低，從而增強抗體穩定性並延長保質期。因此，在一些實施方案中，本發明提供了包含一種或多種抗體或其抗原結合片段和一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的組合物。本發明進一步提供了多種方法，其中將抗體或其抗原結合片段與一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸混合。從而，抗體或其抗原結合片段可以被防止氧化，以延長其保質期及/或增加活性。
為了進一步說明，藥學上可接受的載體可以包括例如水性載體，例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液、非水性載體如植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑菌劑或抑真菌濃度的抗微生物劑、等滲劑如氯化鈉或葡萄糖、緩衝劑如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑、抗氧化劑如硫酸氫鈉、局部麻醉劑如鹽酸普魯卡因、懸浮劑和分散劑如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化劑如聚山梨酯80(TWEEN-80)、螯合劑或螯合劑如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。用作載體的抗微生物劑可以添加到包含酚或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨的多劑量容器中的藥物組合物中。合適的賦形劑可以包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質可以包括例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑或諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。 施用、製劑和劑量
本發明的藥物組合物可以藉由各種途徑體內施用至有需要的受試者，該途徑包括但不限於口服、靜脈內、動脈內、皮下、腸胃外、鼻內、肌內、顱內、心內、心室內、氣管內、口腔、直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮和鞘內，或者藉由植入或吸入。本發明組合物可以配製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑；包括但不限於片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。根據預期的應用和治療方案可以選擇合適的製劑和施用途徑。
用於腸內施用的合適製劑包括硬或軟的明膠膠囊、丸劑、片劑、包括包衣片劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑或吸入劑及其控釋劑型。
適用於腸胃外施用(例如藉由注射)的製劑包括活性成分溶解、懸浮於其中或以其他方式提供的(例如，在脂質體或其他微粒中)的水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體(例如溶液、混懸液)。這些液體可以另外含有其它藥學上可接受的成分，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑和使製劑與預期接受者的血液(或其他相關體液)等滲的溶質。賦形劑的實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。適用於此類製劑的等滲載體的實例包括氯化鈉注射液、林格溶液或乳酸林格氏注射液。類似地，特定劑量方案(即劑量、時間和重複)將取決於具體個體和個體的病史以及諸如藥代動力學(例如半衰期、清除率等)的經驗考慮。
施用頻率可以在治療過程中確定和調整，並且基於減少增殖或致瘤細胞的數量，維持這種腫瘤細胞的減少，減少腫瘤細胞的增殖或延遲轉移的發展。在一些實施方案中，施用的劑量可以被調節或減少以控制潛在的副作用及/或毒性。或者，本發明治療組合物的持續連續釋放製劑可能是合適的。
本領域技術人員將會理解，合適的劑量可因患者而異。確定最佳劑量通常涉及治療益處水準與任何風險或有害副作用的平衡。所選擇的劑量水準將取決於多種因素，包括但不限於特定化合物的活性、施用、施用時間、化合物清除速率、治療持續時間、其他聯合使用的藥物、化合物及/或材料、病症的嚴重程度，以及物種、患者的性別、年齡、體重、病情、一般健康狀況和以前的病史。化合物的量和施用途徑最終由醫生、獸醫或臨床醫師決定，但通常選擇劑量以達到實現所需效果的作用部位處的局部濃度，而不會導致實質性的有害或不利副作用。
通常，PD-1結合分子可以以各種範圍施用。在一些實施方案中，本文提供的PD-1結合分子可以以約0.01mg/kg至約100mg/kg(例如約0.01 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、約70 mg/kg、約75 mg/kg、約80 mg/kg、約85 mg/kg、約90 mg/kg、約95 mg/kg、或約100 mg/kg)的治療有效劑量施用。在這些實施方案的某些中，抗體以約50mg/kg或更低的劑量施用，並且在這些實施方案中的某些中，劑量為10mg/kg或更低、5mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.5mg/kg或更低，或者0.1mg/kg或更低。在某些實施方案中，施用劑量可以在治療過程中改變。例如，在某些實施方案中，初始施用劑量可以高於後續施用劑量。在某些實施方案中，取決於受試者的反應，施用劑量可以在治療過程中變化。
無論如何，本發明的抗體或其抗原結合部分較佳根據需要施用於有需要的受試者。本領域技術人員可以確定施用頻率，例如主治醫生基於所治療病症、所治療受試者的年齡、所治療病症的嚴重程度、所治療受試者的一般健康狀況等的考慮。
在某些較佳的實施方案中，涉及本發明的抗體或其抗原結合部分的治療過程將包含在數週或數月的時間內施用的多劑量的所選藥物產品。更具體地說，本發明的抗體或其抗原結合部分可以每天、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月施用。就此而言，可以理解的是，可以基於患者響應和臨床實踐來改變劑量或者調整間隔。
在給予一次或多次施用的個體中也可憑經驗確定所揭露的治療組合物的劑量和方案。例如，可給予個體增量劑量的如本文該產生的治療組合物。在選定的實施方案中，劑量可分別根據經驗確定或觀察到的副作用或毒性逐漸增加或減少或減輕。為了評估所選擇的組合物的功效，可以如前所述跟蹤特定疾病、病症或病情的標誌物。對於癌症，這些包括藉由觸診或視覺觀察直接測量腫瘤大小，藉由X射線或其他成像技術間接測量腫瘤大小；藉由直接腫瘤活組織檢查和腫瘤樣本的顯微鏡檢查評估的改善；測量根據本文該方法鑑定的間接腫瘤標誌物(例如用於前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痺的減輕；與腫瘤相關的言語、視力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或藉由接受的測試測量的生活質量的提高或生存期的延長。本領域技術人員將明白，劑量將根據個體、腫瘤病情的類型、腫瘤病情的階段、腫瘤病情是否已開始轉移至個體中的其他位置以及過去使用的治療和並行使用的治療而變化。
用於腸胃外施用(例如靜脈內注射)的相容製劑可包含濃度為約10μg/ml至約100mg/ml的如本文提供的PD-1結合分子。在一些實施方案中，PD-1結合分子的濃度可包括20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他較佳的實施方案中，PD-1結合分子的濃度將包括2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。 本發明的應用
本發明的PD-1結合分子具有許多體外和體內用途。例如，可以將這些分子體外或離體施用於培養細胞，或例如體內施用於人體受試者，以增強各種情況下的免疫力。免疫應答可以被增強、刺激或上調。
較佳的受試者包括需要增強免疫應答的人體患者。該方法特別適用於治療具有可藉由增強免疫應答(例如T細胞介導的免疫應答)治療的病症的人體患者。在一個具體的實施方案中，該方法特別適合於體內治療癌症。為了實現免疫的抗原特異性增強，可以將抗PD-1抗體與感興趣的抗原一起施用，或者抗原可能已經存在於待治療的受試者中(例如攜帶腫瘤或病毒的受試者)。當抗PD-1抗體與另一種藥劑一起施用時，兩者可以以任何順序施用或同時施用。
本發明進一步提供了用於檢測樣品中PD-1抗原的存在或測量人體PD-1抗原的量的方法，包括在允許PD-1結合分子與PD-1之間形成複合物的條件下使樣品和對照樣品與PD-1結合分子接觸。然後檢測複合物的形成，其中與對照樣品相比，樣品之間的差異複合物形成表明樣品中存在PD-1抗原。此外，本發明的PD-1結合分子可用於藉由免疫親和純化來純化人體PD-1。 治療癌症
與PD-1相關的病症和障礙可以是與免疫相關的疾病或病症。在一些實施方案中，PD-1相關的病症和病症包括腫瘤和癌症，例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、真菌病毒、梅克爾細胞癌和其他血液惡性腫瘤，如經典霍奇金淋巴瘤(CHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富含T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤、EBV陽性和陰性PTLD以及EBV相關彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、漿細胞淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌和HHV8相關原發性滲出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)腫瘤如原發性CNS淋巴瘤、脊髓軸腫瘤或腦幹膠質瘤。在某些實施方案中，腫瘤和癌症是轉移性的，特別是表達PD-L1的轉移性腫瘤。在某些實施方案中，PD-1相關的病症和障礙包括自身免疫性疾病，例如系統性紅斑狼瘡(SLE)、牛皮癬、系統性硬皮病、自身免疫性糖尿病等。在某些實施方案中，該PD-1相關的病症和病症包括感染性疾病，例如慢性病毒感染、例如乙型肝炎、丙型肝炎、皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、HIV、巨細胞病毒、I型單純皰疹病毒的病毒感染、單純皰疹病毒2型、人體乳頭瘤病毒、腺病毒、卡波西肉瘤相關皰疹病毒流行病、細環病毒(Torquetenovirus)、JC病毒或BK病毒。
抗體或其抗原結合部分可以與化學療法或放射療法組合使用。 與化療組合使用
抗體或其抗原結合部分可以與抗癌劑、細胞毒性劑或化學治療劑組合使用。
術語“抗癌劑”或“抗增殖劑”意指可用於治療細胞增殖性病症例如癌症的任何藥劑，並且包括但不限於細胞毒性劑、細胞抑制劑、抗血管生成劑、放射療法和放射治療劑、靶向抗癌劑、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞因子、激素療法、放射療法和抗轉移劑和免疫治療劑。應該理解的是，在如上所述的選定實施方案中，此類抗癌劑可以包含綴合物並且可以在施用之前與揭露的位點特異性抗體結合。更具體而言，在一些實施方案中，將選擇的抗癌劑連接至工程化抗體的不配對半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶聯物。因此，這樣的工程化綴合物被明確地考慮在本發明的範圍內。在其他實施方案中，所揭露的抗癌劑將與包含如上所述的不同治療劑的位點特異性綴合物組合施用。
如本文所用，術語“細胞毒性劑”是指對細胞有毒並降低或抑制細胞功能及/或引起細胞破壞的物質。在一些實施方案中，該物質是源自活生物體的天然存在的分子。細胞毒性劑的實例包括但不限於細菌(例如，白喉毒素，假單胞菌內毒素和外毒素，葡萄球菌腸毒素A)，真菌(例如α-八疊球菌素，侷限麯黴素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴蓮根毒素，槲寄生素，美洲商陸抗病毒蛋白，皂草素，白樹毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麥毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制劑，麻風樹毒蛋白，巴豆毒素，石堿草抑制劑，白樹毒素，mitegellin，侷限麯黴素，酚黴素，新黴素和單端孢黴烯族化合物)或動物(例如細胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段及/或變體)的小分子毒素或酶促活性毒素。
為了本發明的目的，“化學治療劑”包括非特異性降低或抑制癌細胞的生長、增殖及/或存活的化學化合物(例如細胞毒性劑或細胞抑制劑)。這些化學試劑通常針對細胞生長或分裂所需的細胞內過程，因此對於通常快速生長和分裂的癌細胞特別有效。例如，長春新堿使微管解聚，從而抑制細胞進入有絲分裂。通常，化學治療劑可以包括抑制或被設計用於抑制癌細胞或可能變成性或產生致瘤後代(例如TIC)的細胞的任何化學藥劑。這些藥劑通常是組合使用的，並且通常是最有效的，例如，在諸如CHOP或FOLFIRI的方案中。
可以與本發明的位點特異性建構體組合使用的抗癌劑(作為位點特異性綴合物的組分或未綴合狀態)的實例包括但不限於烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺和甲基三聚氰胺、多聚乙醯(acetogenins)、喜樹堿、苔蘚抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉堿、沙克迪因(sarcodictyin)、海綿素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔類抗生素、dynemicin、雙膦酸鹽、埃斯波黴素、色素蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素類(aclacinomysins)、放線菌素、安麯黴素、偶氮絲氨酸、博萊黴素、放線菌素C、卡拉賓辛(carabicin)、洋紅黴素、嗜癌黴素、色黴素類(chromomycinis)、更生黴素、柔紅黴素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN® 多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、博地黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗-代謝物、埃羅替尼、威羅菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依魯替尼、恩雜魯胺、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗-腎上腺素、葉酸補充劑如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛內酯、醛磷醯胺糖苷、氨基乙醯丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、貝斯布希(bestrabucil)、比生群、依達曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋銨、愛波喜龍、依託格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明、美坦生類化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩爾(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、PSK®多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)、雷佐生；根黴素；西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯類(尤其是T-2毒素、維拉庫林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR®吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；氨甲喋呤；鉑類似物；長春堿；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新堿，NAVELBINE®長春瑞濱；諾消靈；替尼泊苷；依達曲沙；柔紅黴素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸；類視色素；卡培他濱；考布他汀；甲醯四氫葉酸；奧沙利鉑；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制劑(其減少細胞增殖)，以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。這一定義中還包括的是用於調節或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑，抑制調節腎上腺中的雌激素產生的芳香酶的芳香酶抑制劑，和抗-雄激素；以及曲沙他濱(1，3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶諸如VEGF表達抑制劑和HER2表達抑制劑；疫苗，PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱和埃斯波黴素，以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。 與放射療法組合使用
本發明還提供了抗體或其抗原結合部分與放射療法(即，用於在腫瘤細胞內局部誘導DNA損傷的任何機制，例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發射等)的組合。還考慮了使用放射性同位素至腫瘤細胞的定向遞送的聯合療法，並且所揭露的綴合物可以與靶向的抗癌劑或其他靶向手段結合使用。通常，放射療法在約1週至約2週的時間段內以脈衝方式施用。放射療法可以對患有頭頸癌的受試者施用約6至7週。任選地，放射療法可以作為單劑量或作為多個順序劑量施用。 診斷
本發明提供了用於檢測、診斷或監測增殖性病症的體外和體內方法以及篩選來自患者的細胞以鑑定腫瘤細胞包括致瘤細胞的方法。這樣的方法包括鑑定用於治療的患有癌症的個體或監測癌症的進展，包括將患者或從患者獲得的樣品(體內或體外)與本文所述的抗體接觸，並檢測樣品中與結合的或游離的靶分子的結合的抗體的存在或不存在或結合水準。在一些實施方案中，抗體將包含如本文所述的可檢測標記或報道分子。
在一些實施方案中，抗體與樣品中特定細胞的結合可表示樣品可能含有致瘤細胞，從而表明具有癌症的個體可用本文所述的抗體有效治療。
可以藉由多種測定法分析樣品，例如放射免疫測定法，酶免疫測定法(例如ELISA)，競爭結合測定法，螢光免疫測定法，免疫印跡測定法，Western印跡分析和流式細胞術測定法。兼容的體內診斷或診斷測定可以包括本領域習知的成像或監測技術，例如本領域技術人員已知的磁共振造影、電腦斷層攝影(例如CAT掃描)、正電子斷層掃描(例如PET掃描)、放射線照相術、超音波等。 藥物包裝和試劑盒
還提供了包含一個或多個劑量的抗體或其抗原結合部分的一個或多個容器的藥物包裝和試劑盒。在一些實施方案中，提供單位劑量，其中單位劑量含有預定量的組合物，該組合物包含例如抗體或其抗原結合部分，具有或不具有一種或多種其他試劑。對於其他實施方案，這種單位劑量以一次性使用的預充式注射用注射器供應。在其他實施方案中，單位劑量中包含的組合物可以包含鹽水、蔗糖或類似物；緩衝液，如磷酸鹽等；及/或配製在穩定和有效的pH範圍內。或者，在一些實施方案中，綴合物組合物可以作為凍乾粉末提供，其可以在加入合適的液體(例如無菌水或鹽溶液)後重建。在一些較佳的實施方案中，組合物包含一種或多種抑制蛋白質聚集的物質，包括但不限於蔗糖和精氨酸。容器上或與容器相關聯的任何標籤指示封裝的綴合物組合物用於治療選擇的腫瘤疾病狀況。
本發明還提供了用於產生位點特異性綴合物以及任選地一種或多種抗癌劑的單劑量或多劑量施用單元的試劑盒。該試劑盒包括容器以及在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑膠，並且包含藥學有效量的所揭露的綴合或非綴合形式的綴合物。在其他較佳實施例中，容器包括無菌存取口(例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。這樣的試劑盒通常在合適的容器中包含工程化偶聯物的藥學上可接受的製劑，並且任選地在相同或不同的容器中包含一種或多種抗癌劑。試劑盒還可以含有其他藥學上可接受的製劑，用於診斷或組合治療。例如，除了本發明的抗體或其抗原結合部分之外，這樣的試劑盒可以含有任何一種或多種抗癌劑，例如化學治療劑或放射治療劑、抗血管生成劑、抗轉移劑、靶向抗癌劑、細胞毒性劑，及/或其他抗癌劑。
更具體地說，試劑盒可以具有含有所揭露的抗體或其抗原結合部分的單個容器，其含有或不含另外的組分，或者它們可以具有用於每種所需試劑的不同容器。在提供用於綴合的組合治療劑的情況下，可以按摩爾當量組合或一種組分多於另一種的方式預混合單一溶液。或者，試劑盒的綴合物和任何任選的抗癌劑可以在施用於患者之前分開保存在不同的容器中。試劑盒還可以包含用於容納無菌藥學上可接受的緩衝液或其他稀釋劑例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器裝置。
當試劑盒的組分以一種或多種液體溶液提供時，液體溶液較佳為水溶液，特別佳無菌水溶液或鹽水溶液。然而，試劑盒的組分可以作為乾粉提供。當試劑或組分以乾粉形式提供時，可以藉由添加合適的溶劑來重構粉末。可以設想溶劑也可以提供於另一個容器中。
如上簡要所述，該試劑盒還可含有向患者施用抗體或其抗原結合部分和任何任選組分的工具，例如一種或多種針、I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他類似裝置，藉由其可以將製劑注射或引入動物體內或將其施用於身體的患病區域。本發明的試劑盒通常還包括用於容納小瓶或類似物的裝置以及用於商業銷售的其他緊密封閉的部件，例如注射或吹塑塑膠容器，其中放置並且保持所需的小瓶和其他裝置。 序列表概述
本申請附帶有包含許多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。 表A
Figure 108109186-A0304-0001
 實施例
藉由參考以下實施例將更容易地理解本文一般地描述的本發明，這些實施例是以舉例說明的方式提供的，並且不旨在限制本發明。這些實施例並不旨在表示下面的實驗是全部或僅進行的實驗。 實施例1
材料的製備 1.材料的準備 1.1商業材料
表1中提供了實施例中使用的市售材料的資訊。 表1.商業材料
Figure 108109186-A0304-0002
 1.2材料代碼
表2總結了包括參照抗體、胞外結構域和細胞的材料的代碼或縮寫。 表2.材料代碼
Figure 108109186-A0304-0003
 2.抗原的產生
在Sangon Biothech (Shanghai, China)合成編碼下述抗原的DNA序列： hPro1.ECD(Genbank登錄號NP_005009.2), hProL1.ECD (Genbank登錄號NP_054862.1), hCTLA-4.ECD (Genbank登錄號NP_005205.2), hCD28.ECD (Genbank登錄號NP_006130.1), hICOS.ECD (Genbank登錄號NP_036224.1)和mPro1.ECD (Genbank登錄號NP_032824.1), mProL1.ECD (Genbank登錄號NP_068693.1)，然後將該DNA序列亞複製到修飾的pcDNA3.3表達載體（在C末端具有不同的標籤（如6xhis、人體Fc或小鼠Fc））中。將得到的表達載體進一步純化。用純化的表達載體轉染Expi293細胞(Invitrogen-A14527)。將轉染的細胞培養5天，收集上清，使用Ni-NTA 柱(GE Healthcare, 175248)或蛋白質A柱(GE Healthcare, 175438)或蛋白質G柱(GE Healthcare, 170618)進行蛋白純化。得到的抗原藉由SDS-PAGE和SEC大小排阻層析進行質量控制，然後保存在-80o C。 3.參照抗體的產生
在Sangon Biothech (Shanghai, China)合成編碼抗PD-1抗體可變區的DNA序列，然後將該DNA序列亞複製到具有人體IgG4 (S228P)恆定區的修飾的pcDNA3.3表達載體中。BMK1的重鏈和輕鏈可變區序列與批准的抗PD-1抗體Opdivo（PCT申請WO2006/121168A1中的殖株5C4的序列）相同。BMK3抗體的重鏈和輕鏈可變區序列與美國專利US8168757B2中的殖株1B8的序列相同。
將包含編碼各種抗PD-1抗體的重鏈和輕鏈區域的DNA序列的質粒共同轉染Expi293細胞。將轉染的細胞培養5天，並且收集上清，使用蛋白質A柱(GE Healthcare, 175438)或蛋白質G柱(GE Healthcare, 170618)進行蛋白純化。得到的抗體藉由SDS-PAGE和SEC進行分析，然後保存在-80o C。 3.建立穩定的細胞系
使用Lipofectamine 2000，用包含編碼全長人體PD-1或小鼠PD-1的基因的表達載體轉染CHO-S或293F細胞。在含有適當的選擇壓力的培養基中培養細胞。藉由有限稀釋得到高表達人體PD-1的穩定細胞系(WBP305.CHO-S.hPro1.C6)和高表達小鼠PD-1的穩定細胞系(WBP305.293F.mPro1.B4)。 實施例2 VHH和嵌合VHH-Fc(hIgG4)蛋白質的產生 1.免疫接種
為了在駱駝科動物中誘導針對PD-1的體液免疫應答，對動物以1至3週間隔皮下注射7至9個劑量的人體及/或小鼠PD-1 ECD蛋白。劑量範圍是每次注射50ug到200ug。 2.血清效價檢測
免疫後，藉由ELISA測定抗PD-1特異性抗體血清效價。對於ELISA試驗，用1μg/ml重組帶his標籤的人體PD-1 ECD蛋白和小鼠PD-1 ECD蛋白分別包被ELISA板(Nunc，Rochester，MN，USA)，並在4℃下孵育過夜。封閉和洗滌後，加入系列稀釋的免疫前和免疫血清並在室溫下孵育2小時，然後在室溫下用山羊抗Llama IgG-HRP(Novas Biologicals，Littleton，CO，USA) 孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，並藉由2M HCl終止反應。使用酶標儀(Molecular Device，Sunnyvale，CA，USA)讀取450nm處的吸光度。 3.噬菌體文庫建構
分別在最後兩次注射後6-7天收集50ml血液樣品。使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)藉由密度梯度離心純化外周血單核細胞（PBMC），收集到約8×107 個PBMC。然後從PBMC中提取總RNA並使用寡聚dT引物和SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix System(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)按照供應商的推薦轉錄成cDNA。
cDNA純化後用作模板以使用信號肽結構域特異性引物和CH2結構域特異性引物擴增Ig重鏈編碼基因片段庫。該擴增產生約900bp(代表常規IgG)和700bp(代表缺少CH1結構域的重鏈IgG)的PCR片段。然後將兩類重鏈編碼基因在瓊脂糖凝膠上根據大小分離，並且藉由QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)純化僅編碼重鏈IgG的基因。使用純化的片段作為模板以使用框架1(FR1)和框4(FR4)特異性引物對擴增VHH庫。該擴增程序在FR1的5'末端引入Sfi I 限制性位點並在FR4的3'末端引入Not I 限制性位點。將約300-400bp的PCR擴增的VHH基因庫加載到瓊脂糖凝膠上並藉由QIAquick凝膠提取試劑盒純化。然後將純化的片段用Sfi I 和Not I 切割並藉由QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)純化。將VHH基因片段最終連接到噬菌粒載體pFL249中並電轉化到大腸桿菌TG1中。轉化後，將TG1細胞在SOC培養基中以200rpm振盪培養1h，然後將大腸桿菌TG1鋪板於含有補充有100μg/mL Cab和1％(w/v)葡萄糖的固體2YT培養基的平板上，並且在37℃培養過夜。第二天，將菌落刮入補充有1/3(v/v) 80％甘油的液體2YT培養基中並儲存在-80℃。 4.抗PD-1特異性VHH片段的噬菌體展示選擇
為了選到能有效結合PD-1的VHH片段，採用了蛋白質淘選和細胞淘選的方法。
對於蛋白質淘選，首先在4℃下以400rpm振盪過夜將20μg重組his標記的人體和小鼠PD-1 ECD蛋白分別包被在5ml免疫管(Nunc、Rochester、MN、USA)中。第二天，在洗去未結合的蛋白質後，將管用10％脫脂牛奶在25℃封閉1小時。將來自免疫噬菌體文庫的大約1012 cfu噬菌體添加到用10％脫脂乳封閉的未包被免疫管中以消耗非特異性結合的噬菌體，然後將處理的噬菌體加入管中，並在25℃下孵育2小時。用PBST充分洗滌後，丟棄非特異性吸附的噬菌體，用甘氨酸-HCl(pH2.2)洗脫特異性結合的目標噬菌體，然後用1M Tris-HCl(pH8.0)中和用於感染指數生長的TG1細胞。
將感染的TG1細胞鋪在含有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青黴素的2YT瓊脂平板上並在37℃培養過夜。第二天，將菌落用3ml 2YT從平板上刮下並藉由加入1/3(v/v) 80％甘油在-80℃下冷凍。將刮下的細菌文庫接種到含有100μg/ml氨苄青黴素的2YT-Carb中，並用輔助噬菌體M13Ko7在含有50μg/ml卡那黴素和1mM IPTG的2YT培養基中感染以用於噬菌體救援，用作下一輪淘選。
對於細胞淘選，將1012 cfu噬菌體與2×106 -1×107 個CHO-S或293F細胞預孵育以消耗非特異性結合的噬菌體顆粒。然後將處理的噬菌體與2×106 -1×107 個PD-1轉染的CHO-S或293F細胞一起在4℃下孵育1小時，同時以12rpm轉動。用冷的5％FBS-PBS洗滌細胞，並如上所述洗脫細胞結合的噬菌體顆粒。對於Dynabeads的淘選，首先將約1012 cfu噬菌體與200μl Dynabeads M-280鏈黴抗生物素蛋白(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)一起孵育以消耗非特異性結合的噬菌體顆粒，然後將處理的噬菌體與另外200μl用20μg生物素化的PD-1 ECD蛋白質飽和的Dynabeads在室溫下輕輕攪拌孵育1小時。強化洗滌後，如上所述洗脫結合在dynabeads上的噬菌體。 5.VHH蛋白質表達和篩選
在所需的淘選步驟後，刮下平板上生長的噬菌體感染的TG1細胞集落，並提取含有VHH片段的pFL249噬菌粒。藉由用Sfi I 和Not I 消化pFL249質粒來複製VHH片段，然後將其連接到含有6個組氨酸標籤和c-Myc-標籤基因的表達載體pETbac中。將連接產物轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，然後在25℃在ZYM-5052培養基中以230rpm振盪培養48小時。然後收集細菌培養上清液用於ELISA或FACS測試。
使用ELISA作為首個篩選方法來測試VHH與人體PD-1 ECD蛋白的結合。簡言之，將96孔板(Nunc，Rochester，MN，USA)用重組his標記的人體和小鼠PD-1 ECD蛋白在4℃包被過夜。封閉和洗滌後，將BL21大腸桿菌上清液轉移至包被的平板並在室溫下孵育1小時。然後洗滌板，隨後用二抗山羊抗c-Myc-HRP(Bethyl，Montgomery，TX，USA)孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止反應。使用酶標儀(Molecular Device，Sunnyvale，CA，USA)讀取450nm處的吸光度。
為了證實抗PD-1 VHH對細胞膜上表達的構象性PD-1分子的天然結合，用人體PD-1轉染的CHO-S細胞和小鼠PD-1轉染的293F細胞進行流式細胞術分析。親本CHO-S或293F細胞系用作陰性對照。首先將細胞與大腸桿菌培養物上清樣品在96孔U形底平板(BD，Franklin Lakes，NJ，USA)中以1×105 個細胞/孔的密度在4℃孵育1小時，然後與二抗山羊抗-c-Myc-PE(Bethyl，Montgomery，TX，USA)在4℃下孵育30分鐘。在每個步驟之間應用2次洗滌，並將細胞重懸於1X PBS/1％ BSA中進行流式細胞分析(IntelliCyt、Albuquerque、NM、USA)。 6.測序
藉由ELISA和FACS篩選得到的陽性大腸桿菌殖株被送到Biosune(中國上海)，用於VHH基因的核苷酸測序。使用CLC Main Workbench(Qiagen、Hilden、Germany)分析測序結果。
一種先導抗體為命名為“AP17R1-2H2”的VHH。其序列資訊提供在序列資訊表A和序列表中。該抗體也用作用於最佳化(包括人源化和親和力成熟)的“親本”。人源化和親和力成熟將在下面的實施例3中更詳細地描述。 7. VHH產生
攜帶VHH基因的BL21大腸桿菌殖株在25℃，40ml ZYM-5052培養基中以230rpm振盪培養48小時。藉由SDS-PAGE確認BL21上清中his和c-Myc標籤融合的VHH蛋白的表達，然後使用Ni-NTA柱純化。VHH的純度藉由SEC-HPLC確定。對於低上清表達殖株，使用超音波(Scientz、Ningbo、China)破碎的大腸桿菌細胞釋放可溶性VHH蛋白。 8.嵌合VHH-Fc(hIgG4)蛋白質產生
將目的殖株轉化為VHH-Fc (hIgG4)融合抗體。簡言之，使用含有適當限制性位點的VHH特異性殖株引物從pET-bac載體PCR擴增VHH基因，然後藉由融合複製到含有人體hIgG4.S228P的Fc的修飾的pcDNA3.3表達載體中以產生相應的VHH-Fc (hIgG4.SP)嵌合抗體殖株。用載體瞬時轉染293F或Expi293細胞進行抗體表達。收集含有抗體的細胞培養物上清液並使用蛋白質A層析純化。 實施例3 抗體最佳化 1.人源化
選擇對PD-1具有高親和力和特異性的VHH用於人源化。使用“最適合”方法將VHH鏈人源化。
VHH構架區的氨基酸序列針對人體種系V基因資料庫進行比對，並且藉由使用Kabat CDR定義用VHH CDR序列置換最高命中的人體CDR序列來產生人源化VHH序列。框架區中的某些殘基被回復突變至VHH原有殘基以維持親和力。將人源化基因回譯，針對哺乳動物表達密碼子最佳化，並由GENEWIZ合成。將這些基因用含有適當限制性位點的殖株引物再擴增，並複製到修飾的pcDNA3.3載體中以表達人源化VHH-Fc (hIgG4.SP)。在使用SPR對PD-1結合進行測試後，選擇具有適當親和力的突變體作為人源化抗體先導。關於親本抗體“AP17R1-2H2”的VHH-Fc (hIgG4)形式命名為“AP17R1-2H2-Fc(IgG4)”或“W3056-AP17R1-2H2-FC(IgG4.SP)”。 2.親和力成熟
使用定點誘變方法將親本殖株的三個互補決定區(CDR1、CDR2和CDR3)中的每個氨基酸分別突變為其他20個氨基酸。使用含有編碼20個氨基酸的NNS密碼子的DNA引物將突變引入每個靶向CDR位置。磷酸化的單個簡並引物用於定點誘變反應。將200ng反應產物電穿孔入BL21並表達。
藉由使用競爭性ELISA試驗篩選突變殖株。簡而言之，將96孔Maxisorp Immunopla在4℃下用pH 9.2的包被緩衝液(200mM Na2CO3/NaHCO3)中的0.5ug/ml抗c-Myc抗體包被過夜。第二天，在室溫下用酪蛋白封閉板1小時。封閉後，將上述突變殖株和親本VHH(即AP17R1-2H2)殖株的大腸桿菌上清液加入平板並在室溫下孵育1小時。洗滌平板後，將hPro1.hFc-生物素(0.25μg/ml)和AP17R1-2H2-FC(IgG4.sp)(0.25μg/ml)的預混合物加入到孔中並在室溫下孵育1小時。隨後在室溫下與鏈黴抗生物素蛋白-HRP綴合物孵育1小時。用TMB底物檢測HRP活性並用2M HCl終止反應。在450nm讀板。挑出顯示在450nm處的光密度(OD)信號大於親本VHH(即，AP17R1-2H2)殖株的1.5倍的殖株並對其進行測序。這些突變殖株在BL21中重新表達並純化。表面電漿共振(SPR)用於檢測突變體的親和力。在人源化和親和力成熟之後，得到一系列變體。 3. SPR的KD 排序
為了從親和力成熟的突變體中篩選到WBP3056 VHH抗體，使用Biacore 8K藉由SPR測定法檢測針對hPro1.ECD.hFc、mPro1.ECD.hFc和cynoPro1.ECD.hFc(AcrobioSystems) 的koff。在固定抗人體IgG Fc抗體的CM5感測器晶片上獲取hPro1.ECD.hFc、mPro1.ECD.hFc或cynoPro1.ECD.hFc(AcrobioSystems)。將每種VHH抗體以30μL/分鐘的流速注射到感測器晶片上，締合相為120s，接著150s的解離。使用Langmuir分析將締合和解離曲線擬合至1：1模型。結果如表3所示。
Figure 02_image001
在表3中，證明了在親和力成熟後，親和力成熟的VHH分別結合hPro1.ECD.hFc、mPro1.ECD.hFc和cynoPro1.ECD.hFc， 並且其親和力比親和力成熟前(例如， AP17R1-2H2-z1，人源化AP17R1-2H2)有所提高。 表3中列出的VHH蛋白的序列資訊在上表A和隨附的序列表中提供。 實施例4 體外表徵 1.藉由FACS測量與人體、小鼠和食蟹猴PD-1的結合 1.1人體PD-1結合
將細胞CHO-S.hPro1.C6(2×105 個細胞/孔)與各種濃度的抗-PD-1抗體(從133.3nM以4倍連續稀釋至0.008nM)在4℃孵育1小時。用1×PBS/1％BSA洗滌後，施加二抗PE標記的山羊抗人體IgG，並與細胞在4℃孵育1小時。使用抗人體PD-1抗體BMK1和BMK3作為陽性對照。使用人體IgG4同種型抗體作為陰性對照。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀(BD)測量細胞的MFI並藉由FlowJo(版本7.6.1)分析。數據顯示在第1圖和表4中。 表4. 藉由FACS測量與人體PD-1的結合EC50
Figure 108109186-A0304-0004
如第1圖和表4所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4)的W3056抗體以劑量依賴性方式有效地結合至細胞表面人體PD-1。 1.2小鼠PD-1結合
將細胞293F.mPro1.B4(2×105 個細胞/孔)與各種濃度的抗-PD-1抗體(從133.3nM以3倍連續稀釋至0.008nM)在4℃孵育1小時。用1×PBS/1％BSA洗滌後，施加二抗PE標記的山羊抗人體IgG，並與細胞在4℃孵育1小時。使用人體IgG4同種型抗體作為陰性對照。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI並藉由FlowJo(版本7.6.1)分析。數據顯示在第2圖和表5中。 表5. 藉由FACS測量與小鼠PD-1的結合EC50
Figure 108109186-A0304-0005
如第2圖和表5所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4) 的W3056抗體以劑量依賴性方式與細胞表面小鼠PD-1有效結合。 1.3食蟹猴PD-1結合
將食蟹猴PD-1(GenBank登錄號NP_001271065.1)瞬時轉染的293F細胞(2×105 個細胞/孔)與各種濃度的抗PD-1抗體(從133.4nM以3倍連續稀釋至0.008nM)在4℃孵育1小時。用1×PBS/1％BSA洗滌後，施加二抗PE標記的山羊抗人體IgG，並與細胞在4℃孵育1小時。使用抗人體PD-1抗體BMK1和BMK3作為陽性對照。使用人體IgG4同種型抗體作為陰性對照。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI並藉由FlowJo(版本7.6.1)分析。數據顯示在第3圖和表6中。 表6. 在兩次分開的實驗中藉由FACS測量與食蟹猴PD-1的結合EC50
Figure 108109186-A0304-0006
如第3圖和表6所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4)的W3056抗體以劑量依賴性方式與細胞表面食蟹猴PD-1有效結合。 2.阻斷PD-L1或PD-L2與PD1的結合 2.1藉由FACS測量的人體PD-1/PD-L1阻斷
將人體PD-1轉染的CHO-S.hPro1.C6細胞以2×105 個細胞/孔的密度轉移到96孔U形底平板中。將各種濃度的抗體(從133.3nM以4倍連續稀釋至0.008nM)和恆定濃度的小鼠Fc標記的PD-L1-ECD蛋白(hProL1.ECD.mFc)(5μg/mL)預先混合並與細胞在4℃下孵育1小時。用1×PBS/1％BSA洗滌後，施加二抗PE標記的山羊抗小鼠IgG，並與細胞在4℃孵育1小時。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI並藉由FlowJo(版本7.6.1)分析。數據顯示在第4圖和表7中。 表7. 阻斷人體PD-L1與細胞表面人體PD-1的結合
Figure 108109186-A0304-0007
如第4圖和表7所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4) 的W3056抗體以劑量依賴性方式有效阻斷人體PD-L1與細胞表面人體PD-1的結合。 2.2藉由FACS測量的小鼠PD-1/PD-L1阻斷
將小鼠PD-1轉染的293F.mPro1.B4細胞以2×105 個細胞/孔的密度轉移到96孔U形底平板中。將不同濃度的抗PD-1抗體(從1334nM以3倍連續稀釋至0.07nM)和恆定濃度的小鼠Fc標記的小鼠PD-L1 ECD蛋白(mProL1.ECD.mFc)(5μg/mL)預先混合並與細胞在4℃孵育1小時。用1×PBS/1％BSA洗滌後，施加二抗PE標記的山羊抗小鼠IgG，並與細胞在4℃孵育1小時。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI並藉由FlowJo(版本7.6.1)分析。數據顯示在第5圖和表8中。 表8. 阻斷小鼠PD-L1與細胞表面小鼠PD-1的結合
Figure 108109186-A0304-0008
如第5圖和表8所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4) 的W3056抗體以劑量依賴性方式有效阻斷小鼠PD-L1與細胞表面PD-1的結合。 2.3藉由ELISA測量的人體PD-1/PD-L2阻斷
用1μg/mL，每孔100μL的人體PD-1ECD(hPro1.ECD.mFc)在4℃預包被板過夜。在使用200μL 1×PBS/2％BSA封閉1小時後，將恆定濃度的his標記的人體PD-L2 ECD(hPro1L2.ECD.His)和各種濃度的測試抗體(從66.7nM以3倍連續稀釋至0.003nM)預先混合並加入板中。在環境溫度下孵育2小時後，藉由HRP標記的山羊抗His抗體檢測配體與固定化蛋白的結合。藉由分配100μL的TMB底物來顯色，然後用100μL的2N HCl停止顯色。使用微孔板分光光度計在450nm和540nm處讀取吸光度。數據顯示在第6圖和表9中。 表9. 在兩次分開的實驗中阻斷人體PD-L2與固定的人體PD-1的結合
Figure 108109186-A0304-0009
如第6圖和表9所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4) 的W3056抗體以劑量依賴性方式有效阻斷人體PD-L2與固定的PD-1的結合。 2.4藉由ELISA測量的食蟹猴PD-1/PD-L1阻斷
用1μg/mL，每孔100μL的食蟹猴 PD-1 ECD蛋白(cynoPro1.ECD.hFc) 在4℃預包被板過夜。使用200μL 1×PBS/2％BSA封閉1小時後，將恆定濃度的生物素化食蟹猴PD-L1(cynoProL1.ECD.hFc.生物素)(2.5μg/mL)和各種濃度的測試抗體、陽性和陰性對照(從133.4nM以3倍連續稀釋至0.007nM)預先混合並加入板中。將板在環境溫度下孵育1小時。藉由鏈黴親和素-HRP檢測配體與固定化蛋白的結合。藉由分配100μL的TMB底物來顯色，然後用100μL的2M HCl終止。使用微孔板分光光度計在450nm和540nm處讀取吸光度。數據顯示在第7圖和表10中。 表10. 在兩次分開的實驗中阻斷食蟹猴PD-L1與固定的食蟹猴PD-1的結合
Figure 108109186-A0304-0010
如第7圖和表10所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4) 的W3056抗體以劑量依賴性方式有效阻斷食蟹猴PD-L1與固定化食蟹猴PD-1的結合。 3.藉由ELISA測量的跨家族蛋白結合測定
用1μg/mL，每孔100μL的hPD-1.ECD.mFc、hCD28.ECD.mFc、hCTLA-4.ECD.His、hICOS.ECD.mFc或hBTLA.ECD.His在4℃預包被過夜。用200μL 1×PBS/2％BSA封閉1小時後，以100nM的濃度向板中加入測試抗體。將板在環境溫度下孵育1小時。用HRP標記的山羊抗人體IgG抗體檢測抗體與固定化蛋白質的結合。藉由分配100μL的TMB底物來顯色，然後用100μL的2N HCl停止顯色。使用微孔板分光光度計在450nm和540nm處讀取吸光度。數據顯示在第8圖中。
如第8圖所示，包括抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和抗體AP17R1-2H2-FC(IgG4) 的W3056抗體與固定的人體PD-1特異性結合，並且與人體CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA不交叉反應。 4.藉由FACS表位分倉
將人體PD-1轉染的細胞CHO-S.hPro1.C6以1~2×105 個細胞/孔的密度轉移到96孔U形底平板中。分別將恆定濃度的生物素化的BMK1(1μg/mL)或生物素化的BMK3(1μg/mL)與測試抗體的連續稀釋液(從133.3nM以4倍連續稀釋至0.008nM)混合。然後將混合物加入到96孔板中的細胞中並在4℃孵育1小時。用1×PBS/1％BSA洗滌後，施加二抗SA-PE並與細胞在4℃下孵育1小時。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI並藉由FlowJo分析。數據如第9圖所示。
如第9圖所示，W3056抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和AP17R1-2H2與BMK1和BMK3共享相似的表位倉。 5.基於人體細胞的功能測定
使用單向混合淋巴細胞反應(單向MLR)來測試PD-1抗體對人體CD4+ T細胞的細胞因子分泌的激動作用。 i)細胞分離、細胞培養和誘導
使用Ficoll-Paque PLUS梯度離心從健康供體新鮮分離人體PBMC。將分離的PBMC培養在補充有100U/mL重組人體IL-2的完全RPMI-1640(含有10％FBS和1％PS)中。
根據製造商的說明使用人體單核細胞富集試劑盒分離人體單核細胞。在補充有800U/mL的重組人體GM-CSF和50ng/mL的IL-4的完全RPMI-1640培養基中將細胞濃度調節至2×106 個細胞/mL。將細胞懸液以2.5mL/孔接種在6孔板中。細胞培養5-7天以分化成樹突細胞(DC)。每2-3天藉由用補充有細胞因子的新鮮培養基替換一半培養基來補充細胞因子。
根據製造商的方案使用人體CD4+ T細胞富集試劑盒分離人體CD4+ T細胞。 ii)混合的淋巴細胞反應
對於人體同種異體MLR，將純化的CD4+ T細胞與同種異體不成熟的DC (iDC)共同培養。對於人體自體同源MLR，在CD4+ T細胞分離之前，將PBMC用CMV肽處理5天。在測定那天，將DC用CMV肽處理1小時，然後與自體同源人體CD4+ T細胞共同培養。
使用完全RPMI-1640培養基在96孔圓底培養板中設置MLR。將CD4+ T細胞、各種濃度的抗體和同種異體DC以適當的比率加入平板中。平板在37℃，5％CO2 下孵育。孵育3-5天后，檢測細胞因子產生或細胞增殖。 iii)細胞因子檢測
使用匹配的抗體對藉由ELISA測量人體IL-2和IFN-γ釋放。使用重組人體IL-2和IFN-γ作為標準。IL-2的系列濃度為2 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml、0.25 ng/ml、0.125 ng/ml、0.063 ng/ml、0.031 ng/ml、0.016 ng/ml、0.008 ng/ml，並且IFN-γ的系列濃度為8 ng/ml、4 ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml、0.5 ng/ml、0.25 ng/ml、0.125 ng/ml、0.063 ng/ml、0.031 ng/ml。將平板分別用對人體IL-2或IFN-γ特異的獲取抗體預包被。封閉後，將100μL標準品或樣品移液至每個孔中並在環境溫度下孵育2小時。除去未結合的物質後，將生物素綴合的檢測抗體加入孔中並孵育1小時。然後在環境溫度下將鏈黴抗生物素蛋白-HRP加入孔中30分鐘。藉由分配100μL的TMB底物來顯色，然後用100μL的2N HCl終止。使用微孔板分光光度計在450nm處讀取吸光度。從標準曲線計算上清液中細胞因子的濃度。 iv) 增殖檢測
藉由CellTiter-Glo螢光細胞存活力測定按照供應商的說明確定培養物中存活細胞的數量。
如第10A圖和第10B圖所示，在人體allo-MLR反應中，包括W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)和 AP17R1-2H2-FC(IgG4)的W3056抗體以劑量依賴性方式促進IL-2和IFN-γ產生。第11A圖和第11B圖顯示在auto-MLR 反應中W3056抗體AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC (IgG4.SP)促進IFN-γ產生和T細胞增殖。 v) 抑制性Treg抑制作用測定
從一名健康的捐獻者的PBMC富集人體CD4+ T淋巴細胞，並從另一名健康的捐獻者分離人體單核細胞。使用人體CD4+ CD25HIGH T細胞分離試劑盒從人體CD4+ T細胞分離調節T細胞(Tregs)，並且剩餘的T淋巴細胞為CD4+ CD25- T細胞。如上文該從單核細胞誘導DC。
將一萬個不成熟的DC、1×105 個CD4+ CD25- T效應細胞、1×105 個CD4+ CD25+ Treg細胞和166.7 nM抗PD-1抗體以200 μL的總體積在96孔板中孵育。將板在5% CO2 培養箱中在37 °C保持5天。檢驗IFN-γ釋放和T細胞增殖。使用BMK1和BMK3作為陽性對照，使用人體IgG4同種型抗體作為陰性對照。還包括沒有Treg細胞或抗PD-1抗體的孔作為對照。
如第12圖所示，W3056抗體 W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)能夠逆轉人體Treg誘導的T效應細胞抑制，這藉由IFN-γ產生（第12A圖）和T細胞增殖（第12B圖）測量。 vi) 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)
將人體PD-1轉染的細胞系WBP305-CHO-S.hPro1.C6細胞與各種濃度的測試抗體在96孔板中混合，並且以50:1的效應子/靶標比加入PBMC。將板在5% CO2 培養箱中在37 °C保持4-6小時。藉由基於LDH的細胞毒性檢測試劑盒確定靶標細胞裂解。將赫賽汀（Herceptin）在SK-Br-3細胞上誘導的ADCC作用用作陽性對照。結果表明，W3056抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC (IgG4.SP)對人體PD-1轉染的細胞不誘導ADCC作用，如第13圖所示。 6.藉由表面電漿共振(SPR)檢測針對人體、小鼠和食蟹猴PD-1的親和力
使用Biacore 8K檢測針對人體、小鼠和食蟹猴PD-1的抗體結合親和力。將W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC (IgG4.SP)獲取在固定有抗人體Fc IgG抗體的CM5感測器晶片（GE）上。在該感測器晶片上以30 uL/min的流速注入不同濃度的人體、小鼠和食蟹猴PD-1，締合相為120 s，接著是150 s解離。然後，在每一結合循環後，藉由pH 1.5的10 mM甘氨酸使晶片再生。
從測試感測圖中減去空白表面和緩衝液通道的感測圖。使用Langmiur分析將實驗數據擬合至1：1模型。使用40、45和40 kDa的分子量分別計算分析物人體、小鼠和食蟹猴PD-1的摩爾濃度。SPR結果顯示W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)對人體、食蟹猴和小鼠PD-1的親和力分別為3.45E-09M、8.53E-09M和2.87E-08M (表11)。 表11. 藉由表面電漿共振(SPR)檢測的結合動力學親和力
Figure 02_image003
7.藉由DSF測定熱穩定性
使用實時螢光定量PCR(QuantStudio 7 Flex, Thermo Fisher Scientific)進行DSF測定。簡而言之，將19μL抗體溶液與1μL 62.5 X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合並加入到96孔板(Biosystems)中。以2℃/分鐘的速率將平板從26℃加熱至95℃，並收集得到的螢光數據。計算相對於不同溫度的螢光變化的負導數，並將最大值定義為解鏈溫度Tm。如果蛋白質具有多個解折疊轉變，則報告前兩個Tm，命名為Tm1和Tm2。Tm1總是被解釋為正式解鏈溫度Tm以便於不同蛋白質之間的比較。在軟件(QuantStudio Real-Time PCR PCR Software v1.3)報告了不同溫度的負導數圖後，數據收集和Tm計算由其操作軟件自動進行。DST結果顯示在表12中，DSF譜顯示在第14圖中。W3056抗體具有正常的DSF譜，並且Tm值為60.3-62℃。 表12. 藉由DSF檢測的熱穩定性
Figure 108109186-A0304-0011
 8. 人體血清穩定性測定
藉由離心從健康捐獻者新鮮分離人體血清。將抗體以10倍稀釋在人體血清中。將五份樣品等分試樣在37o C孵育。分別在第0天、第1天、第4天、第7天和第14天收集樣品並冷凍在液氮中。
將人體PD-1轉染的細胞系WBP305-CHO-S.hPro1.C6細胞(1×105 個細胞/孔)用各種濃度的血清處理的W3056抗PD-1抗體（從129.9 nM以3倍連續稀釋至0.0007 nM）在4o C孵育1小時。用1×PBS/1%BSA洗滌後，施加二抗PE標記的山羊抗人體IgG並與細胞在4℃下孵育1小時。使用人體IgG4同種型抗體作為陰性對照。然後洗滌細胞並重懸於1×PBS/1％BSA中。藉由流式細胞儀(BD)測量細胞的MFI並藉由FlowJo分析。
第15圖所示的結合表明，W3056抗體 W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)在人體血清中穩定至少14天。
本領域技術人員將進一步認識到，在不脫離其精神或中心特徵的情況下，本發明可以以其他具體形式來實施。由於本發明的前述描述僅揭露了其示例性實施方案，應該理解的是，其他變化被認為是在本發明的範圍內。因此，本發明不限於在此詳細描述的特定實施方案。相反，應當參考所附申請專利範圍來指示本發明的範圍和內容。
Allo-MLR‧‧‧同種異體混合淋巴細胞反應 AP17R1-2H2、BMK‧‧‧抗體 MFI‧‧‧平均螢光強度
第1圖顯示了抗-PD-1抗體與細胞表面人體PD-1的結合，由MFI(平均螢光強度)表示並藉由FACS測量。 第2圖顯示了抗-PD-1抗體與細胞表面小鼠PD-1的結合，由MFI表示並藉由FACS測量。 第3圖顯示了抗-PD-1抗體與細胞表面食蟹猴PD-1的結合，由MFI表示並藉由FACS測量。 第4圖顯示了藉由FACS測量的人體PD1/PD-L1阻斷。 第5圖顯示了藉由FACS測量的小鼠PD1/PD-L1阻斷。 第6圖顯示了藉由ELISA測量的人體PD1/PD-L2阻斷。 第7圖顯示了藉由ELISA測量的食蟹猴PD1/PD-L1阻斷。 第8圖顯示了藉由ELISA測量的對人體PD-1、CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA的交叉反應性。 第9圖顯示抗體AP17R1-2H2（第9A圖和第9B圖）和抗體W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)（第9C圖和第9D圖）分別針對參照抗體BMK1和BMK3的表位分倉。 第10圖顯示了藉由ELISA測量並由IFN-2水準（第10A圖）和IFN-γ水準(第10B圖)反映的抗PD-1抗體對人體同種異體混合淋巴細胞反應(Allo-MLR)的影響。 第11圖顯示了藉由IFN-γ產生水準（第11A圖）和T細胞增殖水準(第11B圖)反映的抗PD-1抗體對人體自體同源MLR (Auto-MLR)的影響。 第12圖顯示了藉由IFN-γ產生水準（第12A圖）和T細胞增殖水準(第12B圖)反映的抗PD-1抗體對人體Treg MLR (Auto-MLR)影響。 第13圖顯示抗PD-1抗體的ADCC測定。 第14圖顯示藉由DSF(差示掃描螢光測定法)測定的熱穩定性測試的結果。 第15圖顯示藉由FACS檢測血清處理的樣品的靶標結合而檢測的W3056-AP17R1-2H2-Z1-R1-14A1-FC(IgG4.SP)在37℃在人體血清中的穩定性。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0017
MFI‧‧‧平均螢光強度
AP17R1-2H2、BMK‧‧‧抗體

Claims (35)

  1. 包含至少一免疫球蛋白單可變結構域(例如VHH)的程序性死亡1(PD-1)結合分子，其中該VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，並且其中CDR1包含與SEQ ID NO：1至少90%相同的氨基酸序列，CDR2包含與SEQ ID NO：2至少90%相同的氨基酸序列，和CDR3包含與SEQ ID NO：3至少80%相同的氨基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的PD-1結合分子，其中CDR1在氨基酸序列上與SEQ ID NO：1存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；CDR2在氨基酸序列上與SEQ ID NO：2存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；及/或CDR3在氨基酸序列上與SEQ ID NO：3存在不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的PD-1結合分子，其中CDR1在氨基酸序列上與SEQ ID NO：1存在1個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；CDR2在氨基酸序列上與SEQ ID NO：2存在1個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異；及/或CDR3在氨基酸序列上與SEQ ID NO：3存在1個氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差異。
  4. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該VHH包含選自以下的CDR1、CDR2和CDR3： (a)由DSIX1 SX2 VNMG表示的CDR1，其中X1 =D或Q，並且X2 =M或L； (b)由LIAX3 YITHYADFVKG表示的CDR2，其中X3 =N、T、Y、R或W； (c)由RX4 IX5 X6 DY表示的CDR3，其中X4 =N或S，X5 =I、R或Y，並且X6 =V或E。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子是PD-1拮抗劑，例如抗PD-1抗體。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該VHH包含選自以下的CDR1、CDR2和CDR3： (a)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3； (b)具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR3； (c)具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的CDR3； (d)具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR3； (e)具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR3； (f)具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的CDR3； (g)具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR3； (h)具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR3； (i)具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的CDR3； (j)具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的CDR3； (k)具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR3；和 (l)具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR3。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的PD-1結合分子，其中該VHH包含 (A)SEQ ID NO：37-49中任一個所示的氨基酸序列； (B)與SEQ ID NO：37-49中的任何一個至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；或 (C)與SEQ ID NO：37-49中的任何一個相比具有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的添加、缺失及/或取代的氨基酸序列。
  8. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子是單結構域抗體，例如重鏈單結構域抗體；嵌合抗體；或人源化抗體。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該VHH來自駱駝科動物，例如羊駝或美洲駝。
  10. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該VHH與另一分子融合，該另一分子是例如免疫球蛋白(例如IgG)的Fc結構域、螢光蛋白或具有不同特異性的VHH。
  11. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子是嵌合抗體。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子是來自駱駝科動物的VHH與人體IgG的Fc結構域的嵌合抗體。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子是來自駱駝動物的VHH與人體IgG4的Fc結構域的嵌合抗體。
  14. 如申請專利範圍第12項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子是人源化抗體。
  15. 如前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子，其中該PD-1結合分子具有以下性質中的一種或多種： (a)以1×10-7 M或更小的KD 結合人體PD-1； (b)抑制PD-L1或PD-L2與PD-1的結合； (c)誘導CD4+ T細胞中IFN-γ的產生； (d)基本上不與人體CD28、CTLA-4、ICOS和BTL結合； (e)與人體PD-1沒有交叉反應性，但與小鼠PD-1具有交叉反應性；和 (f)至少在60℃是穩定的。
  16. 一種PD-1結合分子，其與前述申請專利範圍中任一項所述的PD-1結合分子競爭相同表位。
  17. 分離的核酸分子，其包含編碼如前述申請專利範圍中任一項所定義的VHH的核酸序列。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的分離的合適分子，其包含如SEQ ID NO：50-62中任一項所示的核酸序列或由如SEQ ID NO：50-62中任一項所示的核酸序列組成。
  19. 一種表達載體，其包含如申請專利範圍第17項或第18項所述的分離的核酸分子。
  20. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第19項所述的表達載體。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的宿主細胞，該宿主細胞是細菌細胞(例如大腸桿菌（E. coli ）)，真菌細胞(例如酵母)或哺乳動物細胞。
  22. 一種藥物組合物，其包含至少一種如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子和藥學上可接受的載體。
  23. 製備如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子的方法，包括以下步驟： - 在申請專利範圍第20項或第21項所述的宿主細胞中表達如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子；和 - 從宿主細胞分離PD-1結合分子。
  24. 用於抑制或阻斷受試者中PD-L1或PD-L2與PD-1結合的方法，該方法包括：向該受試者施用治療有效量的如申請專利範圍第1項至第16項中任一項定義的PD-1結合分子。
  25. 治療受試者中與PD-1相關的病況的方法，該方法包括：向該受試者施用治療有效量的如申請專利範圍第1項至第16項中任一項定義的PD-1結合分子。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的方法，其中該受試者已被鑑定具有可能響應PD-1拮抗劑的病症或病況。
  27. 如申請專利範圍第26項所述的方法，其中該受試者已被鑑定為就來自該受試者的測試生物樣品中PD-L1或PD-L2的存在或水準上調而言是陽性的。
  28. 治療或預防受試者中會受益於免疫應答上調的病況的方法，該方法包括：向該受試者施用治療有效量的如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的方法，其中該受試者具有上調的PD-L1或PD-L2表達。
  30. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子在製備用於治療或預防會受益於免疫應答上調的病況的藥物中的用途。
  31. 如申請專利範圍第30項所述的用途，其中該病況是增殖性病症，例如癌症或慢性病毒感染。
  32. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子，其用於抑制或阻斷PD-L1與PD-1的結合。
  33. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子，其用於抑制或阻斷PD-L2與PD-1的結合。
  34. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子，其用於治療或預防受試者中與PD-1相關的病況（例如，該受試者具有上調的PD-L1或PD-L2表達）。
  35. 用於治療或診斷增殖性病症例如癌症的試劑盒，其包含容器，該容器包含如申請專利範圍第1項至第16項中任一項所定義的PD-1結合分子。
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