TWI813951B - 一種雙功能融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭露提供包含TGFβRII的至少一部分和抗PD-L1抗體或其抗原結合部分的融合蛋白，產生該融合蛋白的方法，使用該融合蛋白治療疾病或病況的方法及其用途。

Description

一種雙功能融合蛋白及其用途

對相關申請的交叉引用

本申請要求2020年2月25日提交的國際專利申請PCT/CN2020/076658的優先權，其全部內容藉由提述併入本文。 序列表

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本揭露一般涉及雙功能融合蛋白、其製備方法和用途。

PD-1是免疫檢查點蛋白之一，是CD28家族的抑制性成員，在啟動的CD4 + T細胞和CD8 + T細胞以及B細胞上表達。它的配體PD-L1是一種1型跨膜蛋白，據推測在抑制適應性免疫系統中起主要作用。PD-L1與PD-1的結合藉由基於免疫受體酪氨酸的開關基序（ITSM）與磷酸酶（SHP-1或SHP-2）相互作用而傳遞抑制訊號。結果，該途徑抑制T細胞增殖和T細胞功能，例如細胞因數產生和細胞毒性活性。PD-1/PD-L1軸在下調免疫系統中起主要作用[1,2]。

靶向PD-1或PD-L1的單植株抗體可以阻斷PD-1/PD-L1的結合並增強針對癌細胞的免疫反應。這些藥物在治療某些癌症方面顯示出巨大的潛力。幾家製藥公司已經開發出多種獲批的靶向PD-1/PD-L1的治療性抗體，包括Pembrolizumab (Keytruda)、Nivolumab (Opdivo)、Cemiplimab (Libtayo)、Atezolizumab (Tecentriq)、Avelumab (Bavencio)和Durvalumab (Imfinzi)。這些藥物已顯示可有效治療各種類型的癌症，包括皮膚黑素瘤、非小細胞肺癌、腎臟癌、膀胱癌、頭頸癌和霍奇金氏淋巴瘤。還在研究這些藥物用於治療許多其他類型的癌症[3]。

轉化生長因數β（TGF-β）是結構相關的一類蛋白質家族，包括TGF-β、啟動素/抑制素、和骨形態發生蛋白（BMP）。TGF-β家族的成員控制著許多細胞功能，包括增殖、凋亡、分化、上皮-間質轉化（EMT）和遷移。TGF-β失調與癌變有關。在癌症的早期階段，TGF-β藉由抑制細胞週期進程並促進細胞凋亡而表現出腫瘤抑制作用。然而，在晚期，TGF-β發揮腫瘤促進作用，增加腫瘤侵襲性和轉移。此外，TGF-β訊號傳導途徑以協同或拮抗的方式與其他訊號傳導途徑通訊並調節細胞功能。考慮到TGF-β在腫瘤進展中的關鍵作用，該途徑是癌症治療的有吸引力的靶標[4]。有幾種治療工具已顯示出抑制TGF-β訊號傳導的巨大潛力，例如TGF-β抗體、反義寡核苷酸、和TGF-β受體1（TGF-βR1）的小分子抑制劑。最後，為了開發未來的治療方法，有必要進行進一步的研究以鑒定TGF-β與腫瘤微環境中其他訊號傳導途徑和致癌因數的新的匯合點。

最近，已經報導了同時靶向PD1/PD-L1和TGF-β途徑的治療劑，例如含有TGFβRII細胞外結構域（ECD）和抗PD-L1抗體的雙功能蛋白。但是，這種融合抗體的開發仍具有改善的空間和臨床需求。在本揭露中，描述了包含TGFβRII ECD和抗PD-L1抗體的新型雙功能蛋白。該融合抗體蛋白顯示出優異的蛋白穩定性和體內抗腫瘤活性。這些結果證明了該新型融合抗體作為用於進一步臨床前研究的候選藥物的巨大潛力。

廣義而言，本揭露涉及提供具有改善功效的抗體和抗體類蛋白質（例如融合蛋白分子）的化合物、方法、組合物和製品。本揭露提供的益處廣泛地適用於抗體治療和診斷領域，並且可以與能夠與各種靶標反應的抗體聯合使用。

在一個方面，本揭露提供一種融合蛋白，其包含特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分融合於能夠結合TGFβ的人轉化生長因數β受體(TGFβR)或其部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含： 重鏈CDR1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列； HCDR2，其包含SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列； HCDR3，其包含SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列； 輕鏈CDR1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列； LCDR2，其包含SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和 LCDR3，其包含SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些實施方案中，如本文揭露的抗體或其抗原結合部分包含： 包含SEQ ID NO: 1的HCDR1；包含SEQ ID NO: 2的HCDR2；和包含SEQ ID NO: 3的HCDR3；和 包含SEQ ID NO: 4的LCDR1；包含SEQ ID NO: 5的LCDR2；和SEQ ID NO: 6的LCDR3。

在一些實施方案中，如本文揭露的抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH包含： (A) 如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列； (B) 與SEQ ID NO: 7至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或 (C) 與SEQ ID NO: 7相比具有一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個）氨基酸的添加、缺失、和/或取代的氨基酸序列； 和/或VL包含： (A) 如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列； (B) 與SEQ ID NO: 8至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或 (C) 與SEQ ID NO: 8相比具有一個或多個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個）氨基酸的添加、缺失、和/或取代的氨基酸序列。

在一些實施方案中，人TGFβR選自TGFβRII或TGFβRIII，較佳TGFβRII。在一些較佳的實施方案中，融合蛋白包含TGFβRII的一部分而非全長TGFβRII，該部分是TGFβRII的胞外結構域。

在一些實施方案中，如本文揭露的能結合TGFβ的人TGFβR或其部分包含： (A) 與野生型人TGFβRII的氨基酸序列至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列； (B) 與野生型人TGFβRII胞外結構域的氨基酸序列至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或 (C) 野生型人TGFβRII的部分，其保留與TGFβ的結合能力的至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。

在一些實施方案中，能結合TGFβ的TGFβR或其部分包含或組成為野生型人TGFβRII的胞外結構域的氨基酸序列，即SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

在一些實施方案中，包含在融合蛋白中的抗體或其抗原結合部分是全抗體、ScFv、Fab、F(ab’)2、或Fv片段，例如全抗體。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結合部分包含VH區可操作地連接於重鏈Fc區。例如，抗體或其抗原結合部分可以是全抗體並且在重鏈包含VH-CH1-鉸鏈-Fc，在輕鏈包含VL-CL。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結合部分是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型，較佳IgG1同種型。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結合部分的Fc區可操作地連接於人TGFβR或其部分的N末端，任選地經由接頭。接頭可以是肽接頭。在一些實施方案中，接頭包含(G4S)n，其中n= 1-4，例如n可以是1、2、3或4。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結合部分是人源化的或全人抗體，例如全人抗體。在一些實施方案中，融合蛋白的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NO: 10和11。

在一個方面，本揭露提供分離的核酸分子，其包含編碼如上文限定的融合蛋白的抗體或其抗原結合部分和/或人TGFβR或其部分的核酸序列。

在一個方面，本揭露提供包含如本文中限定的核酸分子的載體。在一個方面，本揭露提供包含如本文中揭露的核酸分子或載體的宿主細胞。

在一個方面，本揭露提供包含如本文中揭露的融合蛋白以及藥學可接受的載體的藥物組合物。

在一個方面，本揭露提供一種產生如本文中揭露的融合蛋白的方法，包括以下步驟： - 在如本文揭露的宿主細胞中表達該融合蛋白；和 - 從該宿主細胞分離該融合蛋白。

在一個方面，本揭露提供一種調控受試者中免疫應答的方法，包括對該受試者施用如本文中揭露的融合蛋白或藥物組合物。

在一個方面，本揭露提供一種抑制受試者中與PD-1/PD-L1有關的腫瘤細胞生長的方法，包括對該受試者施用有效量的如本文中揭露的融合蛋白或藥物組合物。

在一個方面，本揭露提供一種預防或治療受試者中與PD-1/PD-L1有關的癌症的方法，包括對該受試者施用有效量的如本文中揭露的融合蛋白或藥物組合物。該癌症可選自結腸癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌、子宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、膠質母細胞瘤、前列腺癌、食道癌或胃癌。在某些實施方案中，該癌症為結腸癌或肺癌，例如NSCLC。

在一些實施方案中，如本文揭露的融合蛋白與化療劑、放療和/或用於癌症免疫治療的其他藥劑組合施用。

在一個方面，本揭露提供如本文揭露的融合蛋白用於治療或預防與PD-1/PD-L1有關的癌症。

在一個方面，本揭露提供如本文揭露的融合蛋白在製備用於調控受試者中與PD-1/PD-L1有關的免疫應答或抑制與PD-1/PD-L1有關的腫瘤細胞生長的藥物中的用途。

在一個方面，本揭露提供如本文揭露的融合蛋白在製備用於治療或預防與PD-1/PD-L1有關的癌症的藥物中的用途。

在一個方面，本揭露提供一種用於治療或診斷癌症的試劑盒，其包含在容器中的如本文中揭露的融合蛋白。

以上內容是一個概述，因此必要時包含細節的簡化、概括和省略；因此，本領域技術人員將認識到，該概述僅是舉例說明性的，並不意圖以任何方式進行限制。本文所述的方法、組合物和/或裝置和/或其他主題的其它方面、特徵和優勢將在本文所示的教導中變得明顯。提供概述以簡化地介紹一些選擇的概念，這些概念將在下面的詳細描述中進一步描述。本概述不旨在確定所要求保護的主題的關鍵特徵或基本特徵，也不旨在用作確定所要求保護的主題的範圍的輔助手段。此外，貫穿本申請引用的所有參考文獻、專利和揭露的專利申請的內容藉由引用整體併入本文。

雖然本發明可以以許多不同的形式來實施，但在此揭露的是驗證本發明原理的其具體的舉例說明性實施方案。應該強調的是，本發明不限於所舉例說明的具體實施方案。此外，本文使用的任何章節標題僅用於組織目的，並不被解釋為限制所描述的主題。

除非在此另外定義，否則與本發明結合使用的科學和技術術語將具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數指示物。因此，例如，提及“一種蛋白質”包括多種蛋白質；提及“一種細胞”包括細胞的混合物等。在本申請中，除非另有說明，否則使用“或”意指“和/或”。此外，術語“包含”以及其他形式（諸如“包括”和“含有”）的使用不是限制性的。此外，說明書和所附申請專利範圍中提供的範圍包括端點和端點之間的所有值。

通常，與本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和蛋白質以及核酸化學和雜交有關的術語以及其技術是本領域眾所週知和常用的術語。除非另有說明，否則本發明的方法和技術通常根據本領域公知的常規方法進行，並如在本說明書全文中引用和討論的各種通用和更具體的參考文獻中所述進行。參見例如Abbas等人, Cellular and Molecular Immunology, 第6版, W.B. Saunders Company (2010)；Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)；Ausubel等人, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)；Harlow和Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998)；和Coligan等人, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)。與本文描述的分析化學、合成有機化學以及醫藥和藥物化學有關的術語以及實驗室程式和技術是本領域中眾所週知和常用的那些。 定義

為了更好地理解本發明，相關術語的定義和解釋提供如下。

術語“抗體”或“Ab”在本文中以最廣泛含義使用，其涵蓋多種抗體結構，包括多植株抗體、單特異性和多特異性抗體（例如雙特異性抗體）。天然的完整抗體通常是指包含藉由共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）多肽鏈的Y形四聚體蛋白。抗體的輕鏈可以分為κ和λ輕鏈。重鏈可分為μ、δ、γ、α和ε，它們分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區藉由約12個或更多個氨基酸的“J”區與恆定區連接，並且重鏈還包含約3個或更多個氨基酸的“D”區。每條重鏈由重鏈可變區（VH）和重鏈恆定區（CH）組成。重鏈恆定區由3個結構域（CH1，CH2和CH3）組成。每條輕鏈由輕鏈可變區（VL）和輕鏈恆定區（CL）組成。VH和VL區可以進一步分為由相對保守的區域（稱為框架區（FR））間隔開的高變區（稱為互補決定區（CDR））。每個VH和VL由以下順序的3個CDR和4個FR組成：從N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每個重鏈/輕鏈對的可變區（VH和VL）分別形成抗原結合位點。氨基酸在各種區域或結構域中的分佈遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987和1991))或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人, (1989) Nature 342:878-883中的定義。抗體可以具有不同的抗體同種型，例如IgG（例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型），IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。如本文揭露的包含抗PD-L1抗體或其抗原結合部分的融合蛋白也屬於抗體。

術語抗體的“抗原結合部分”或“抗原結合片段”，可以在本申請的上下文中互換使用，是指包含全長抗體的片段的多肽，其保留了與全長抗體特異性結合的抗原特異性結合的能力，和/或其與全長抗體競爭結合相同的抗原。一般而言，參見Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W.編,第二版, Raven Press, N.Y. (1989)，其出於所有目的藉由引用併入本文。抗體的抗原結合片段可使用任何適合的標準技術，例如蛋白質水解消化作用或涉及編碼抗體可變結構域和任選地恆定結構域的DNA的操作和表達的重組基因工程技術，衍生自例如全抗體分子。這樣的DNA為已知的和/或可容易地從例如商業來源、DNA庫(包括，例如噬菌體-抗體庫)取得，或是可合成的。DNA可用化學或藉由使用分子生物技術來測序和操作，例如，以將一或多個可變和/或恆定結構域排列成適合的構型，或導入密碼子、產生半胱氨酸殘基、修飾、增加或刪除氨基酸等。

抗原結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區的氨基酸殘基所組成的最小識別單位(例如分離的互補決定區(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子，例如結構域特異性抗體、單結構域抗體、結構域刪除的抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小模組免疫藥物(SMIP)及鯊可變IgNAR結構域，也涵蓋在本文所用的表述“抗原結合片段”內。在某些實施方案中，抗體的抗原結合片段可以含有與至少一個恆定結構域共價連接的至少一個可變結構域。可變結構域和恆定結構域可以彼此直接連接或可以藉由完整或部分鉸鏈或接頭區域連接。鉸鏈區可由至少2個（例如5、10、15、20、40、60個或更多個）氨基酸組成，其導致單個多肽分子中相鄰的可變和/或恆定結構域之間的柔性或半柔性連接。

如本文中使用的，術語抗體的“可變域/可變結構域”或“可變區”指包含一個或多個CDR的抗體可變區或其片段。儘管可變域可以包含完整的可變區(如HCVR或LCVR)，但也可以包含少於完整的可變區而仍然保留結合抗原或形成抗原結合位點的能力。

抗體的“Fc”是指抗體的以下部分，其包含第一重鏈的第二(CH2)和第三(CH3)恆定區經由二硫鍵聯合第二重鏈的第二和第三恆定區。Fc區還可以包含全部或部分的鉸鏈區。抗體的Fc部分負責多種效應器功能例如ADCC和CDC，但並不在抗原結合中發揮功能。抗體經由其Fc域啟動和調節效應器功能的能力是其體內保護性活性的關鍵部分。儘管以前認為抗體的中和活性僅僅是Fab-抗原相互作用的結果，但越來越多的證據表明其體內活性還高度依賴於IgG Fc域與其相關受體Fcγ受體(FcγR)之間的相互作用，這些受體在效應器淋巴細胞表面上表達。.

術語“PD-L1”，也稱為程式性死亡配體1，是一種40 kDa的1型跨膜蛋白，據推測在抑制適應性免疫系統中起主要作用。PD-L1是程式性死亡1（PD-1）的主要配體。如本文所用，術語“PD-L1”在指PD-L1蛋白的氨基酸序列（例如NCBI GenBank ID: NP_054862.1所提供的）時，包括全長PD-L1蛋白，或PD-L1的胞外域（PD-L1 ECD）或含有PD-L1 ECD的片段；還包括PD-L1 ECD的融合蛋白，例如與小鼠或人的IgG Fc（mFc或hFc）融合的片段。此外，如本領域技術人員所理解的，PD-L1蛋白也將包括那些天然或人工引入氨基酸序列的突變（包括但不限於置換、缺失和/或添加）而不影響生物學功能的PD-L1蛋白。

如本文所用，術語“結合PD-L1的抗體”或“抗PD-L1抗體”包括特異性識別或結合PD-L1的抗體及其抗原結合片段。如本文所用，表述“抗PD-L1抗體”包括具有單一特異性的單價抗體，以及包含結合PD-L1的第一抗原結合位點和結合第二（靶）抗原的第二抗原結合位點的雙特異性抗體。

術語“TGFβ”，即轉化生長因數β（TGF-β），是屬於轉化生長因數超家族的多功能細胞因數，該家族包括三種不同的哺乳動物同工型（TGF-β1至3，HGNC代號TGFB1、TGFB2、TGFB3）和許多其他訊號蛋白。TGFβ參與旁分泌訊號傳導，可以在許多不同的組織類型中發現，包括腦、心臟、腎臟、肝臟、骨骼和睪丸。TGF-β失調與癌變有關。例如，據報導在某些人腫瘤樣品中PD-L1表達升高與活化的TGF-β訊號傳導之間存在潛在關聯(Justin M. David等人Oncoimmunology. 2017; 6(10): e1349589)。

術語“TGFβR”，即TGFβ家族受體，可以分為I型、II型和III型三種類型。對於總共13種TGFβ超家族受體，有7種I型受體，5種II型受體和1種III型受體。如本文所用，“TGFβRII”或“TGFβ受體II”是指具有野生型人TGFβ受體2型同工型A序列（例如，NCBI參考序列（RefSeq）登錄號NP-001020018），或具有野生型人TGFβ受體2型同工型B序列（例如，NCBI RefSeq登錄號NP-003233的氨基酸序列）或具有與野生型氨基酸序列基本相同的序列的多肽。TGFβRII可保留野生型序列的TGFβ結合活性的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％。表達的TGFβRII的多肽可能缺少訊號序列。

如本文所用，術語“單植株抗體”或“mAb”是指單分子成分的抗體分子製劑。單植株抗體顯示對特定表位元的單一結合特異性和親和力。

如本文所用，術語“人抗體”或“全人抗體”意圖包括具有以下可變區的抗體，其中框架區和CDR區均衍生自人種系免疫球蛋白序列。此外，如果抗體含有恆定區，那麼恆定區也衍生自人種系免疫球蛋白序列。本揭露的人抗體可包括並非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如藉由體外隨機的或位點特異性的誘變或藉由體內體細胞突變)。然而，術語“人抗體”在本文中不意圖包括其中將衍生自另一個哺乳動物物種（例如小鼠）的CDR序列嫁接到人框架區序列上的抗體。

術語“人源化抗體”意指其中衍生自另一哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已嫁接到人框架序列上的抗體。可以在人框架序列內進行其他框架區修飾。

術語“融合蛋白”，如本文所用，是指具有兩個（或更多個）共價連接在一起的部分的多肽，其中每個部分是具有不同特性的肽。該性質可以是生物學性質，例如體外或體內活性。該性質也可以是簡單的化學或物理性質，例如與靶抗原的結合，反應的催化等。這兩個部分可以藉由單個肽鍵直接連接或藉由包含一個或多個氨基酸殘基的肽接頭連接。通常，這兩個部分和接頭將符合閱讀框地連接。在某些實施方案中，融合蛋白的兩個部分分別是特異性結合PD-L1的抗原結合部分和能夠結合TGFβ的人TGFβ受體（TGFβR）或其部分。這樣的包含抗體的融合蛋白在本揭露中也可以視為抗體（例如，稱為“融合抗體”）。

術語“可操作地連接”是指兩個或多個感興趣的生物序列的並置（帶有或不帶有間隔區或接頭）以使得它們處於允許以預期方式起作用的關係。就多肽而言，是指以允許連接的產物具有預期的生物學功能的方式連接多肽序列。例如，抗體可變區可以可操作地連接於恆定區，以便提供具有抗原結合活性的穩定產物。該術語也可以關於多核苷酸使用。舉例來說，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接於調節序列（例如啟動子、增強子、沉默子序列等）時，其意指多核苷酸序列以允許調節多肽從該多核苷酸的表達的方式連接。

如本文所用，術語“Ka”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而本文所用的術語“Kd”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離速率。抗體的Kd值可以使用本領域良好建立的方法來確定。如本文所用，術語“K_D ”旨在表示特定抗體-抗原相互作用的解離常數，其從Kd與Ka的比率（即，Kd/Ka）獲得並且表示為摩爾濃度（M）。確定抗體Kd的較佳方法是藉由使用表面電漿共振，較佳使用生物感測器系統如Biacore®系統。

如本文所用的術語IgG抗體的“高親和力”是指標對靶抗原具有1×10^-7 M或更低，更佳5×10^-8 M或更低，甚至更佳1×10^-8 M或更低，甚至更佳5×10^-9 M或更低，和甚至更佳1×10^-9 M或更低的K_D 的抗體。

如本文所用，術語“EC₅₀ ”也被稱為“半數有效濃度”，是指在特定的暴露時間後誘導在基線和最大值之間的50%的應答的藥物、抗體或毒劑的濃度。在本申請的上下文中，EC₅₀ 的單位為“nM”。

如本文所用，“抑制結合”的能力是指抗體或融合蛋白抑制或阻斷兩個分子（例如PD1和PD-L1）的結合至任何可檢測水準。在某些實施方案中，兩個分子的結合可以被抗體或其抗原結合片段抑制至少50%。在某些實施方案中，這類抑制效果可以大於60%、大於70%、大於80%或大於90%。在某些實施方案中，本發明的融合蛋白以不超過0.1 nM的IC₅₀ 阻斷PD1與細胞表面PD-L1的結合。

如本文所用，術語“表位”是指免疫球蛋白或抗體特異性結合的抗原部分。“表位”也被稱為“抗原決定簇”。表位或抗原決定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖側鏈的化學活性表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構和特定的電荷特徵。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, 編 (1996)。

如本文所用，術語“分離的”是指藉由人工方式從天然狀態獲得的狀態。如果某種“分離的”物質或組分天然存在，則可能是因為其天然環境發生變化，或者物質與天然環境分離，或者兩者兼而有之。例如，某種未分離的多核苷酸或多肽天然存在於某個活動物體內，從該天然狀態分離的相同的高純度多核苷酸或多肽被稱為分離的多核苷酸或多肽。術語“分離的”既不排除混合的人造或合成物質，也不排除不影響分離的物質的活性的其他不純物質。

如本文所用，術語“分離的抗體”旨在指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體（例如，特異性結合PD-L1蛋白的分離的抗體基本上不含特異性結合除PD-L1蛋白以外的抗原的抗體）。然而，特異性結合人PD-L1蛋白的分離的抗體對其他抗原如來自其他物種的PD-L1蛋白可能具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞材料和/或化學物質。

如本文所用，術語“載體”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。當載體允許插入其中的多核苷酸編碼的蛋白質的表達時，該載體稱為表達載體。該載體可以藉由轉化、轉導或轉染入宿主細胞而使攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中表達。載體是本領域技術人員所熟知的，包括但不限於質粒，噬菌體，黏粒，人工染色體如酵母人工染色體（YAC），細菌人工染色體（BAC）或P1衍生人工染色體（PAC）；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體和動物病毒。可用作載體的動物病毒包括但不限於逆轉錄病毒（包括慢病毒），腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒（如單純皰疹病毒），痘病毒，杆狀病毒，乳頭瘤病毒，乳多空病毒（如SV40）。載體可以包含用於控制表達的多個元件，包括但不限於啟動子序列，轉錄起始序列，增強子序列，選擇元件和報導基因。另外，載體可以包含複製起點。

如本文所用，術語“宿主細胞”是指可被工程化以產生感興趣的蛋白質、蛋白質片段或肽的細胞系統。宿主細胞包括但不限於培養細胞，例如來源於齧齒動物（大鼠，小鼠，豚鼠或倉鼠）的哺乳動物培養細胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人體組織或雜交瘤細胞，酵母細胞和昆蟲細胞，以及包含在轉基因動物或培養組織內的細胞。該術語不僅涵蓋特定的受試細胞，還涵蓋這種細胞的後代。由於突變或環境影響可能在後代中發生某些修飾，這樣的後代可能與親本細胞不同，但仍包括在術語“宿主細胞”的範圍內。

如本文所用，術語“同一性”是指藉由比對和比較序列確定的兩個或更多個多肽分子或兩個或更多個核酸分子的序列之間的關係。“百分比同一性”是指比較分子中氨基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並基於被比較的最小分子的大小計算。對於這些計算，比對中的缺口（如果有的話）較佳藉由特定的數學模型或電腦程式（即“演算法”）來定址。可以用於計算比對的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M.編), 1988, New York: Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W.編), 1993, New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M.和Griffin, H. G.編), 1994, New Jersey: Humana Press；von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M.和Devereux, J.編), 1991, New York: M. Stockton Press；和Carillo等人, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073中描述的那些。

如本文所用，術語“免疫原性”是指刺激生物體中特異性抗體或致敏淋巴細胞形成的能力。它不僅指抗原刺激特定免疫細胞活化、增殖和分化以最終產生免疫效應物質如抗體和致敏淋巴細胞的性質，還指抗體或致敏T淋巴細胞的特異性免疫應答可以在用抗原刺激生物體後在生物體的免疫系統中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能夠成功誘導宿主中免疫應答的產生取決於三個因素：抗原的性質、宿主的反應性和免疫手段。

如本文所用，術語“轉染”是指將核酸引入真核細胞特別是哺乳動物細胞的過程。用於轉染的方案和技術包括但不限於脂質轉染和化學和物理方法如電穿孔。許多轉染技術在本領域是公知的並且在本文中揭露。參見例如Graham等人, 1973, Virology 52:456；Sambrook等人, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,同上；Davis等人, 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier；Chu等人, 1981, Gene 13:197。在本發明的一個具體實施方案中，將人PD-L1基因轉染入293F細胞。

如本文所用，術語“SPR”或“表面電漿共振”是指並且包括允許藉由檢測生物感測器基質內的蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用的光學現象，例如使用BIAcore系統（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ）。關於詳細描述，參見Jönsson, U.,等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jönsson, U.,等人(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson, B.,等人(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；和Johnnson, B.,等人(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。

如本文所用，術語“螢光啟動細胞分選”或“FACS”是指專門類型的流式細胞術。它提供了根據每個細胞的特定光散射和螢光特徵，將生物細胞的異質混合物以每次一個細胞分揀到兩個或更多個容器中的方法（FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. 2017-11-09）。用於進行FACS的儀器是本領域技術人員已知的並且可以對於公眾是可商購獲得的。這種儀器的實例包括Becton Dickinson（Foster City，CA）的FACS Star Plus、FACScan和FACSort儀器、來自Coulter Epics Division（Hialeah，FL）的Epics C和來自Cytomation（Colorado Springs，Colorado）的MoFlo。

術語“受試者”包括任何人或非人動物，較佳人。

如本文所用，術語“癌症”是指引發醫學病症的任何腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移介導的實體瘤和非實體瘤如白血病。

本文在治療病況的情況中使用的術語“治療”、“處理”和“醫治”一般涉及人或動物的治療和療法，其中實現了一些期望的治療效果，例如，抑制病況進展，包括進展速度下降，進展速度停滯，病況消退，病況改善和病況治癒。還包括了作為預防措施（即預防）的治療。對於癌症，“治療”可能是指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移或其某種組合。對於腫瘤，“治療”包括去除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長和轉移、預防或延遲腫瘤的發展或其某種組合。

如本文所用，術語“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、組合物或劑量的量，其在按照所需的治療方案施用時有效用於產生與合理的益處/風險比相稱的某些所需的治療效果。例如，當與治療PD-1/PD-L1相關疾病或病症聯合使用時，“有效量”是指抗體或其抗原結合部分有效治療該疾病或病症的量或濃度。

如本文所用，關於哺乳動物中的某種疾病病況的術語“預防”、“防止”或“阻止”是指預防或延遲疾病的發作或預防其臨床或亞臨床症狀的表現。

如本文所用，術語“藥學上可接受”是指載體、稀釋劑、賦形劑和/或其鹽在化學和/或物理上與製劑中的其他成分相容，並且與接受者在生理學上相容。

如本文所用，術語“藥學上可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性劑相容的載體和/或賦形劑，其在本領域中是公知的（參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 第19版，Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995），並且包括但不限於pH調節劑、表面活性劑、佐劑和離子強度增強劑。例如，pH調節劑包括但不限於磷酸鹽緩衝液；表面活性劑包括但不限於陽離子、陰離子或非離子表面活性劑，例如Tween-80；離子強度增強劑包括但不限於氯化鈉。

如本文所用，術語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，其在與抗原一起遞送至生物體或被提前遞送至有機體時可以增強生物體中的對抗原的免疫應答或改變免疫應答的類型。存在多種佐劑，包括但不限於鋁佐劑（例如氫氧化鋁）、弗氏佐劑（例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑）、短小棒狀桿菌、脂多糖、細胞因數等。弗氏佐劑是目前動物實驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑更常用於臨床試驗。 包含抗PD-L1抗體和TGFβR或其部分的融合蛋白

本申請提供能特異性結合PD-L1和TGFβ (例如TGFβ1和TGFβ3)兩者的融合蛋白，因此不僅靶向PD-L1抗原或表達PD-L1的細胞，還促進微環境中TGFβ的局部消耗。廣義上而言，這類融合蛋白也可視為抗體，因為其能特異性結合PD-L1、拮抗PD-L1活性和阻斷PD-1/PD-L1訊號傳導途徑。該融合蛋白在本文中也可以稱為“雙功能性蛋白”或“TGFβ捕獲-PD-L1靶向性抗體融合物”。

本文中的融合蛋白可以包含(a) 特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分，和(b) 能夠結合TGFβ的人轉化生長因數β受體(TGFβR)或其部分（也稱為TGFβ捕獲者），其中(a)和(b)可以經由接頭融合。該抗體或其抗原結合部分可以具有多種形式，例如全抗體、單特異性抗體、雙特異性抗體、ScFv、域抗體（SdAb）、VHH、Fab、F（ab'）2或Fv片段等，只要它具有與PD-L1的特異性結合親和力。人轉化生長因數β受體可以選自TGFβRII和TGFβRIII，較佳TGFβRII。融合蛋白可包含野生型TGFβRII的一部分，該部分保留一些或全部的TGFβ結合能力，例如融合蛋白可包含TGFβRII的細胞外結構域（ECD）。

(a)和(b)之間的接頭將特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分的C末端連接到能結合TGFβ的人轉化生長因數β受體(TGFβR)或其部分的N末端或C末端。在一些實施方案中，在不存在Fc區的情況下，接頭可以連接至抗體的可變結構域（例如Fab、域Ab或ScFv）的C末端；或者，在抗體是全抗體或重鏈抗體的情況下，接頭可以連接至Fc區的C末端。

在單一藥劑中將抗PD-L1和TGFβ捕獲者組合引發了協同的抗腫瘤作用，這是由於同時阻斷腫瘤細胞上的PD-L1和免疫細胞上的PD-1之間的相互作用，以及中和腫瘤微環境中的TGFβ。如實施例所證實的，與M7824相比，本揭露的融合蛋白表現出更好的對PD-1/PD-L1訊號傳導途徑的阻斷，並更有效地增強了IFNγ的產生。

具體地，本發明的融合蛋白提供了以下一種或多種特性： (a) 能夠以不超過7×10^-10 M的KD結合人PD-L1，以及以不超過2×10^-12 M的KD結合TGFβ1，如藉由SPR測定的； (b) 能夠以不超過2nM的EC50結合食蟹猴PD-L1，如藉由FACS測定的； (c) 能夠同時結合PD-L1和TGFβ1; (d) 能夠實現PD-1/PD-L1訊號傳導阻斷和TGF-β1阻斷; (e) p在同種異體混合淋巴細胞反應中有力地增強IL-2和IFNγ產生； (f) 在加速穩定性研究中是穩定的；和 (g) 在人血清中穩定至少14天。 特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分

在一些實施方案中，特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分包含一個或多個重鏈CDR (HCDR)，該重鏈CDR選自由以下組成的至少一組： (i) HCDR1，其包含SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列； (ii) HCDR2，其包含SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和 (iii) HCDR3，其包含SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或 包含一個或多個輕鏈CDR (LCDR)，該輕鏈CDR選自由以下組成的至少一組： (i) LCDR1，其包含SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列； (ii) LCDR2，其包含SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和 (iii) LCDR3，其包含SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6相差不超過2個氨基酸的氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中重鏈可變區包含(i) 包含或組成為SEQ ID NO: 1的HCDR1；(ii) 包含或組成為SEQ ID NO: 2的HCDR2；和(iii) 包含或組成為SEQ ID NO: 3的HCDR3；和/或輕鏈可變區包含：(i) 包含或組成為SEQ ID NO: 4的LCDR1；(ii) 包含或組成為SEQ ID NO: 5的LCDR2；和(iii) 包含或組成為SEQ ID NO: 6的LCDR3。

在一些實施方案中，該重鏈可變區包含：(i) SEQ ID NO: 7的氨基酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 7至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或(iii)與SEQ ID NO: 7相比具有一個或多個氨基酸的添加、缺失、和/或取代的氨基酸序列；和/或 該輕鏈可變區包含：(i) SEQ ID NO: 8的氨基酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 8至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或(iii)與SEQ ID NO: 8相比具有一個或多個氨基酸的添加、缺失、和/或取代的氨基酸序列。

包含上述抗體或其抗原結合部分的本揭露的融合蛋白能以高親和力結合人PD-L1。本揭露的抗體對PD-L1的結合可使用本領域中確立的一種或多種技術（例如ELISA）來評估。本揭露的抗體的結合特異性也可以藉由監測抗體對表達PD-L1蛋白的細胞的結合（例如流式細胞術）來測定。例如，可以藉由流式細胞術測定來測試抗體，其中使抗體與表達人PD-L1的細胞系反應，例如經過轉染以在其細胞表面上表達PD-L1的CHO-K1或293F細胞。另外或者備選地，可以在BIAcore結合測定法中測試抗體的結合，包括結合動力學(例如K_D 值)。其他合適的結合測定法包括ELISA或FACS測定法，例如可使用重組PD-L1蛋白。

例如，本揭露的抗體以1×10^-7 M或更低的K_D 、5×10^-8 M或更低的K_D 、2×10^-8 M或更低的K_D 、1×10^-8 M或更低的K_D 、5×10^-9 M或更低的K_D 、4×10^-9 M或更低的K_D 、3×10^-9 M或更低的K_D 、2×10^-9 M或更低的K_D 、1×10^-9 M或更低的K_D 、5×10^-10 M或更低的K_D 、1×10^-10 M或更低的K_D 結合人PD-L1蛋白，如藉由表面等離子共振測量的。或者，本揭露的抗體能以低於5 nM、低於4 nM、低於3 nM、低於2 nM、低於1 nM或甚至低於0.5 nM的EC50結合表達人或食蟹猴PD-L1的細胞系，如藉由FACS測定的。

除非另有說明，否則將氨基酸分配給每個CDR可以根據以下提供的編號方案之一：Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242；Chothia等人, 1987, PMID: 3681981；Chothia等人, 1989, PMID: 2687698；MacCallum等人,1996, PMID: 8876650；或Dubel編(2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 第3版, Wily-VCH VerVEGF GmbH and Co.。

抗體序列中的可變區和CDR可以根據本領域已經開發的一般規則（如上所述，例如Kabat編號系統）或藉由將序列與已知可變區的資料庫比對來鑒定。在Kontermann和Dubel編, Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001和Dinarello等人, Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000中描述了鑒定這些區域的方法。抗體序列的示例性資料庫描述於並可獲自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”網站（由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England的A.C. Martin維護）和VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人, Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)中所述。較佳使用Abysis資料庫分析序列，其整合了來自Kabat、IMGT和蛋白質資料庫（PDB）的序列資料與來自PDB的結構資料，參見Dr. Andrew C. R. Martin所著的書中的Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (編: Duebel, S.和Kontermann, R., Springer-VerVEGF, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547，也可在網站bioinforg.uk/abs上獲得）。Abysis資料庫網站還包括已經開發用於識別可以根據本文的教導使用的CDR的一般規則。除非另有說明，否則本文所述的所有CDR均根據Kabat的Abysis資料庫網站獲得。

兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的演算法(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))確定，該演算法已被併入ALIGN程式（版本2.0），使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。另外，兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以藉由Needleman和Wunsch的演算法（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）確定，其已併入GCG套裝軟體（可從http://www.gcg.com獲得）中的GAP程式中，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。

另外地或可選地，本發明的蛋白質序列可以進一步用作“查詢序列”來執行針對公共資料庫的搜索以例如識別相關序列。這種搜索可以使用Altschul,等人(1990) J. MoI. Biol. 215:403-10的XBLAST程式（版本2.0）來執行。可用XBLAST程式進行BLAST蛋白質搜索，得分= 50，字長= 3，以獲得與本發明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對，可使用空位BLAST，如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述的。當使用BLAST和空位BLAST程式時，可以使用各個程式（例如，XBLAST和NBLAST）的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

在其他實施方案中，CDR氨基酸序列可以是與上述相應序列中所包含的具體的CDR氨基酸序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在其他實施方案中，可變區的氨基酸序列可以與上述相應序列至少80%，85%，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。

較佳地，分離的抗體或其抗原結合部分的CDR包含不多於2個氨基酸或不多於1個氨基酸的保守取代。本文使用的術語“保守取代”是指氨基酸取代，其不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白質/多肽的基本性質。例如，保守取代可以藉由本領域已知的標準技術（例如定點誘變和PCR介導的誘變）引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一氨基酸殘基取代的取代，例如物理或功能相似的殘基（例如具有相似的大小，形狀，電荷，化學性質包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）至相應的氨基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的氨基酸（例如賴氨酸，精氨酸和組氨酸），具有酸性側鏈的氨基酸（例如天冬氨酸和谷氨酸），具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸（例如甘氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸），具有非極性側鏈的氨基酸（例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸），具有β-分支側鏈的氨基酸（例如蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸）和具有芳香族側鏈的氨基酸（例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸）。因此，相應的氨基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。用於鑒定氨基酸保守取代的方法在本領域中是公知的（參見例如Brummell等人, Biochem. 32: 1180-1187 (1993)；Kobayashi等人, Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)；和Burks等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)，其藉由引用併入本文）。 包含人轉化生長因數β受體(TGFβR)或其部分的TGFβ捕獲者

TGFβ具有三個配體同工型，TGFβ1、2和3，它們均以同二聚體形式存在。還有三種TGFβR受體（TGFβR），分別稱為I、II和III型TGFβR。TGFβRI是訊號鏈，不能結合配體。TGFβRII以高親和力結合配體TGFβ1和3，但不結合TGFβ2。TGFβRIII是TGFβ與其訊號受體結合的陽性調節物，並以高親和力結合所有3種TGFβ同工型。據報導，TGFβ1和TGFβ2分別在腫瘤微環境和心臟生理中起主要作用，因此中和TGFβ1而非TGFβ2的治療劑可藉由使心臟毒性最小化而不損害抗腫瘤活性而提供最佳的治療指標。因此，選擇了TGFβRII，並且TGFβRII的胞外結構域僅具有136個氨基酸殘基的長度（SEQ ID No：9），這使其非常適合於構建抗體-捕獲者融合蛋白。

在該融合蛋白中，人轉化生長因數β受體(TGFβR)或其部分可以包含： (A) 與野生型人TGFβRII的氨基酸序列至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列； (B) 與野生型人TGFβRII胞外結構域的氨基酸序列至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或 (C) 野生型人TGFβRII的部分，其保留與TGFβ的結合能力的至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。

在一些實施方案中，本文中的融合蛋白中包含的TGFβ捕獲者是TGFβRII的胞外結構域或其部分。在一些特定的實施方案中，該TGFβ捕獲者包含或組成為如SEQ ID NO: 9中所示的序列。 編碼本揭露的融合蛋白的核酸分子

在一些方面，本揭露涉及分離的核酸分子，其包含編碼以下一種或多種的核酸序列： (i)抗體或其抗原結合部分，或抗體的VH或VL結構域； (ii) 融合蛋白的人TGFβRII或其部分；和 (iii) 融合蛋白的重鏈或輕鏈。

在一些方面，本揭露涉及包含編碼如本文所揭露的核酸序列的載體。在本發明的情況下載體可以是任何合適的載體，包括染色體、非染色體和合成的核酸載體(包含一組合適的表達控制元件的核酸序列)。這樣的載體的實例包括SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、杆狀病毒、酵母質粒、源自質粒和噬菌體DNA的組合的載體，和病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施方案中，PD-L1抗體編碼核酸包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表達元件(描述於例如Sykes和Johnston, Nat Biotech 17,355-59 (1997))、緊密核酸載體(描述於例如US 6,077, 835和/或WO 00/70087)、質粒載體例如pBR322, pUC 19/18或pUC 118/119、"midge"最小尺寸的核酸載體(描述於例如Schakowski等人, Mol Ther 3, 793-800 (2001))或作為沉澱的核酸載體構建體，例如CaPO4沉澱的構建體(描述於例如WO200046147, Benvenisty和Reshef, PNAS USA 83,9551-55 (1986), Wigler等人, Cell 14, 725 (1978)和Coraro和Pearson, SomaticCell Genetics 7, 603 (1981))。這樣的核酸載體和其用途是本領域眾所週知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。

在一個實施方案中，載體適合在細菌細胞中表達如本文揭露的融合蛋白。這樣的載體的實例包括表達載體，例如BlueScript (Stratagene)、pIN載體(Van Heeke &Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989)、pET載體(Novagen, Madison WI)等)。載體還可或備選地是適合在酵母系統中表達的載體。可使用合適在酵母系統中表達的任何載體。合適的載體包括，例如包含組成型或誘導型啟動子，例如α因數、醇氧化酶和PGH的載體(綜述於：F. Ausubel等人編, Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)和Grant等人, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987))。

載體還可或備選地是適合在哺乳動物細胞中表達的載體，例如，包含穀氨醯胺合成酶作為可選擇標記的載體，例如描述於Bebbington (1992) Biotechnology (NY)10:169-175中的載體。

核酸和/或載體還可包含編碼分泌/定位序列的核酸序列，該序列可將多肽，例如新生的多肽鏈靶向週質空間或細胞培養基。這樣的序列是本領域已知的，和包括分泌前導或訊號肽。

表達載體可包含任何合適的啟動子、增強子和其它表達促進元件或與其締合。這樣的元件的實例包括強表達啟動子(例如人CMV IE啟動子/增強子以及RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的多聚(A)終止序列、在大腸桿菌中質粒產物的複製起點、作為可選擇標記的抗生素抗性基因和/或方便的複製位點(例如，聚合接頭)。核酸還可包含與組成型啟動子相對的誘導型啟動子，例如CMV IE。

在再一個方面，本揭露涉及包含本文所述的載體的宿主細胞。因此，本發明還涉及產生本發明的融合蛋白的重組真核或原核宿主細胞，例如轉染瘤。

融合蛋白可在重組的真核或原核宿主細胞例如轉染瘤中表達，其產生本文定義的融合蛋白。

宿主細胞的實例包括酵母、細菌、植物和哺乳動物細胞，例如CHO、CHO-S、HEK，HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NS0細胞或淋巴細胞。例如，在一個實施方案中，宿主細胞可包含穩定整合至細胞基因組的第一和第二核酸構建體。在另一個實施方案中，本發明提供包含非整合核酸、例如質粒、黏粒、噬菌粒或線性表達元件的細胞，其包含上文所述的第一和第二核酸構建體。

在另一個方面，本發明涉及轉基因非人動物或植物，其包含編碼如本文揭露的融合蛋白的重鏈和輕鏈的一組或兩組的核酸，其中該動物或植物產生該融合蛋白。

在再一個方面，本揭露涉及雜交瘤，其產生用於本文定義的融合蛋白的抗體。

在一個方面，本發明涉及表達載體，其包含 (i)核酸序列，其編碼根據本文揭露的任一個實施方案的抗體或其抗原結合部分，或抗體的VH或VL結構域； (ii)核酸序列，其編碼根據本文揭露的任一個實施方案的融合蛋白的人TGFβRII或其部分； (iii)核酸序列，其編碼融合蛋白的重鏈或輕鏈；或 (iv)上述兩種或更多種的組合。

在一個方面，本揭露涉及編碼序列表中所列一種或多種氨基酸序列的核酸構建體。

在一個方面，本揭露涉及產生根據本文揭露的任一個實施方案的融合蛋白的方法，包括培養本文揭露的包含表達融合蛋白的一種或多種表達載體的宿主細胞，和從培養基純化該融合蛋白。在一個方面，本發明涉及包含上文定義的表達載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是重組真核、重組原核或重組微生物宿主細胞。 藥物組合物

在一些方面，本發明涉及藥物組合物，其包含至少一種如本文所揭露的融合蛋白和藥學上可接受的載體。 組合物的組分

藥物組合物可以任選地含有一種或多種另外的藥物活性成分，例如另一種抗體或藥物。本發明的藥物組合物還可以與例如另一種免疫刺激劑、抗癌劑、抗病毒劑或疫苗組合施用，使得如本文揭露的融合蛋白增強對抗原的免疫反應。藥學上可接受的載體可以包括例如藥學上可接受的液體、凝膠或固體載體、水性介質、非水性介質、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒的輔助物質，本領域已知的各種組分的組合或更多。

合適的組分可以包括例如抗氧化劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑如糖和環糊精。合適的抗氧化劑可包括例如甲硫氨酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羥基甲苯和/或丙基砷酸鹽。如本發明所揭露的，在包含還原抗體或其抗原結合片段的一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的含有本發明揭露的組合物的抗體或抗原結合片段的溶劑中，其可被氧化。氧化還原可防止或減少結合親和力的降低，從而增強抗體穩定性並延長保質期。因此，在一些實施方案中，本發明提供了包含一種或多種抗體或其抗原結合片段和一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的組合物。本發明進一步提供了多種方法，其中將抗體或其抗原結合片段與一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸混合。從而，抗體或其抗原結合片段可以被防止氧化，以延長其保質期和/或增加活性。

為了進一步說明，藥學上可接受的載體可以包括例如含水載體、例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性載體如植物來源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑細菌劑或抑真菌濃度的抗微生物劑，等滲劑如氯化鈉或葡萄糖，緩衝劑如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑，抗氧化劑如硫酸氫鈉，局部麻醉劑如鹽酸普魯卡因，懸浮劑和分散劑如羧甲基纖維素鈉，羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化劑如聚山梨酯80（TWEEN-80），隔絕劑或螯合劑如EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇四乙酸）、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。用作載體的抗微生物劑可以添加到包含酚或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨的多劑量容器中的藥物組合物中。合適的賦形劑可以包括例如水，鹽水，右旋糖，甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質可包括例如潤濕劑或乳化劑，pH緩衝劑，穩定劑，溶解度增強劑或諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。 施用、製劑和劑量

本發明的藥物組合物可以藉由各種途徑體內施用至有需要的受試者，該途徑包括但不限於口服、靜脈內、動脈內、皮下、腸胃外、鼻內、肌內、顱內、心內、心室內、氣管內、口腔、直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮和鞘內，或者藉由植入或吸入。本發明組合物可以配製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑；包括但不限於片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。根據預期的應用和治療方案可以選擇合適的製劑和施用途徑。

用於腸內施用的合適製劑包括硬或軟的明膠膠囊、丸劑、片劑，包括包衣片劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑或吸入劑及其控釋劑型。

適用於腸胃外施用（例如藉由注射）的製劑包括活性成分溶解、懸浮於其中或以其他方式提供的（例如，在脂質體或其他微粒中）的水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體（例如溶液，混懸液）。這些液體可以另外含有其它藥學上可接受的成分，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑和使製劑與預期接受者的血液（或其他相關體液）等滲的溶質。賦形劑的實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。適用於此類製劑的等滲載體的實例包括氯化鈉注射液、林格溶液或乳酸林格氏注射液。類似地，特定劑量方案（包括劑量、時間和重複）將取決於具體個體和個體的病史以及諸如藥代動力學（例如半衰期、清除率等）的經驗考慮。

施用頻率可以在治療過程中確定和調整，並且基於減少增殖或致瘤細胞的數量，維持這種腫瘤細胞的減少，減少腫瘤細胞的增殖或延遲轉移的發展。在一些實施方案中，施用的劑量可以被調節或減少以控制潛在的副作用和/或毒性。或者，本發明治療組合物的持續連續釋放製劑可能是合適的。

本領域技術人員將會理解，合適的劑量可因患者而異。確定最佳劑量通常涉及治療益處水準與任何風險或有害副作用的平衡。所選擇的劑量水準將取決於多種因素，包括但不限於特定化合物的活性，施用，施用時間，化合物清除速率，治療持續時間，其他聯合使用的藥物、化合物和/或材料，病症的嚴重程度，以及物種，患者的性別、年齡、體重、病況、一般健康狀況和以前的病史。化合物的量和施用途徑最終由醫生、獸醫或臨床醫師決定，但通常選擇劑量以達到實現所需效果的作用部位處的局部濃度，而不會導致實質性的有害或不利副作用。

通常，本發明的融合蛋白可以以各種範圍施用。這些包括每劑量約5 μg/kg體重至約100 mg/kg體重；每劑量約50 μg/kg體重至約5 mg/kg體重；每劑量約100 μg/kg體重至約10 mg/kg體重。其他範圍包括每劑量約100 μg/kg體重至約20 mg/kg體重和每劑量約0.5 mg/kg體重至約20 mg/kg體重。在一些實施方案中，每劑量為至少約100 μg/kg體重，至少約250 μg/kg體重，至少約750μg/kg體重，至少約3 mg/kg體重，至少約5 mg/kg體重，至少約10 mg/kg體重。

無論如何，本發明的融合蛋白較佳根據需要施用於有需要的受試者。本領域技術人員可以確定施用頻率，例如主治醫生基於所治療病況、所治療受試者的年齡、所治療病況的嚴重程度、所治療受試者的一般健康狀況等的考慮。

在某些較佳的實施方案中，涉及本發明的融合蛋白的治療過程將包含在數週或數月的時間內施用的多劑量的所選藥物產品。更具體地說，本發明的融合蛋白可以每天，每兩天，每四天，每週，每十天，每兩週，每三週，每月，每六週，每兩個月，每十週或每三個月施用。就此而言，可以理解的是，可以基於患者響應和臨床實踐來改變劑量或者調整間隔。

在給予一次或多次施用的個體中也可憑經驗確定所揭露的治療組合物的劑量和方案。例如，可給予個體增量劑量的如本文該產生的治療組合物。在選定的實施方案中，劑量可分別根據經驗確定或觀察到的副作用或毒性逐漸增加或減少或減輕。為了評估所選擇的組合物的功效，可以如前該跟蹤特定疾病、病症或病況況的標誌物。對於癌症，這些包括藉由觸診或視覺觀察直接測量腫瘤大小，藉由X射線或其他成像技術間接測量腫瘤大小；藉由直接腫瘤活組織檢查和腫瘤樣本的顯微鏡檢查評估的改善；測量根據本文該方法鑒定的間接腫瘤標誌物（例如用於前列腺癌的PSA）或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的減輕；與腫瘤相關的言語、視力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或藉由接受的測試測量的生活品質的提高或生存期的延長。本領域技術人員將明白，劑量將根據個體、腫瘤病況的類型、腫瘤病況的階段、腫瘤病況是否已開始轉移至個體中的其他位置以及過去使用的治療和並行使用的治療而變化。

用於腸胃外施用（例如靜脈內注射）的相容製劑將包含濃度為約10 μg/ml至約100 mg/ml的本文揭露的融合蛋白。在某些選定的實施方案中，融合蛋白的濃度將包括20 μg/ml，40 μg/ml，60 μg/ml，80 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml，300μg/ μg/ml，400 μg/ml，500 μg/ml，600 μg/ml，700 μg/ml，800 μg/ml，900 μg/ml或1 mg/ml。在其他較佳的實施方案中，融合蛋白的濃度將包括2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，8 mg/ml，10 mg/ml，12 mg/ml，14mg ml，16 mg/ml，18 mg/ml，20 mg/ml，25 mg/ml，30 mg/ml，35 mg/ml，40 mg/ml，45 mg/ml，50 mg/ml，60 mg/ml，70 mg/ml，80 mg/ml，90 mg/ml或100 mg/ml。 本發明的應用

在一些方面，本發明提供了治療受試者病症的方法，其包括向需要治療的患者（例如人）施用治療有效量的如本文揭露的融合蛋白。例如，這種病症是一種癌症。

可以使用本揭露提供的方法治療或預防涉及PD-1/PD-L1的多種癌症，無論是惡性的還是良性的，以及是否是原發性的或繼發性的。這些癌症可以是實體癌或血液惡性腫瘤。這些癌症的實例包括肺癌如支氣管癌（例如鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞癌和腺癌）、肺泡細胞癌、支氣管腺瘤、軟骨性錯構瘤（非癌性）和肉瘤（癌性）；心臟癌如黏液瘤、纖維瘤和橫紋肌瘤；骨癌例如骨軟骨瘤、軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨樣軟骨瘤、骨樣骨瘤、巨細胞瘤、軟骨肉瘤、多發性骨髓瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、尤因氏腫瘤（尤因氏肉瘤）和網織細胞肉瘤；腦癌例如神經膠質瘤（例如多形性成膠質細胞瘤）、間變性星形細胞瘤、星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、脊索瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、松果體瘤、骨瘤、血管母細胞瘤、顱咽管瘤、脊索瘤、生殖細胞瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫和血管瘤；消化系統中的癌症如結腸癌、平滑肌瘤、表皮樣癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、腸脂肪瘤、腸神經纖維瘤、腸纖維瘤、大腸息肉和結腸直腸癌；肝癌如肝細胞腺瘤、血管瘤、肝細胞癌、纖維板層癌、膽管癌、肝母細胞瘤和血管肉瘤；腎臟癌如腎腺癌、腎細胞癌、高腎上腺瘤和腎盂的移行細胞癌；膀胱癌；血液系統癌症如急性淋巴細胞白血病（急性淋巴細胞性白血病）、急性骨髓性（髓細胞性、骨髓、成髓細胞性、骨髓單核細胞性）白血病、慢性淋巴細胞性白血病（例如Sezary症候群和毛細胞性白血病）、慢性髓細胞性（髓性、骨髓性、粒細胞性）淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病和骨髓增殖性疾病（包括骨髓增生性疾病，如真性紅細胞增多症、骨髓纖維化、血小板增多症和慢性粒細胞白血病）；皮膚癌如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑素瘤、卡波西肉瘤和佩吉特氏病；頭頸部癌症；與眼相關的癌症，如成視網膜細胞瘤和眼內黑素癌；男性生殖系統癌症如良性前列腺增生，前列腺癌和睪丸癌（例如精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌和絨毛膜癌）；乳腺癌；女性生殖系統癌症如子宮癌（子宮內膜癌）、子宮頸癌（宮頸腫瘤）、卵巢癌（卵巢腫瘤）、外陰癌、陰道癌、輸卵管癌和葡萄胎；甲狀腺癌（包括乳頭狀、濾泡狀、間變性或髓樣癌）；嗜鉻細胞瘤（腎上腺）；甲狀旁腺的非癌性生長；胰腺癌；和血液學癌症例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。在具體的實施方案中，癌症是結腸癌。在一些其他實施方案中，癌症是肺癌，例如非小細胞肺癌（NSCLC）。

在一些實施方案中，癌症的實例包括但不限於B細胞癌，包括B細胞淋巴瘤（包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）；小淋巴細胞（SL）NHL；中級/濾泡性NHL；中間級別擴散性NHL；免疫母細胞NHL；高級別淋巴母細胞NHL；高級別小型非切割細胞NHL；大塊疾病NHL；套細胞淋巴瘤；愛滋病相關淋巴瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；慢性淋巴細胞白血病（CLL）；急性淋巴細胞白血病（ALL）；毛細胞白血病；慢性粒細胞白血病；和移植後淋巴增生性疾病（PTLD），以及與瘢痣病相關的異常血管增生，水腫（例如與腦腫瘤相關的），B細胞增殖性病症和Meigs'症候群，更具體的例子包括但不限於復發或難治性NHL，前線低級別NHL，III/IV級NHL，化療耐受性NHL，前體Bly成淋巴細胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴細胞性淋巴瘤，B細胞慢性淋巴細胞白血病和/或幼淋巴細胞性白血病和/或小淋巴細胞性淋巴瘤，B細胞幼淋巴細胞淋巴瘤，免疫細胞瘤和/或淋巴漿細胞淋巴瘤，淋巴漿細胞性淋巴瘤，邊緣區B細胞淋巴瘤，脾邊緣區淋巴瘤，結外邊緣區-MALT淋巴瘤，淋巴結邊緣區淋巴瘤，毛細胞白血病，漿細胞瘤和/或漿細胞骨髓瘤，低級/濾泡性淋巴瘤，中級/濾泡性NHL，套細胞淋巴瘤，濾泡中心淋巴瘤（包括侵襲性前線NHL和侵襲性復發NHL），自體幹細胞移植後復發或復發的NHL，原發性縱隔大B細胞淋巴瘤，原發性縱隔大B細胞淋巴瘤，原發性滲出性淋巴瘤，高級別免疫母細胞NHL，高級成淋巴細胞性NHL，高級別小非裂解性細胞NHL，龐大疾病NHL，伯基特淋巴瘤，前體（外週）大顆粒淋巴細胞白血病，蕈樣肉芽腫和/或塞紮裡症候群，皮膚（皮膚）淋巴瘤，間變性大細胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些實施方案中，癌症的實例進一步包括但不限於B細胞增殖性病症，其進一步包括但不限於淋巴瘤（例如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（NHL））和淋巴細胞白血病。這種淋巴瘤和淋巴細胞白血病包括例如a）濾泡性淋巴瘤，b）小的未分裂細胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤（包括地方性伯基特淋巴瘤，散發性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤），c）邊緣區淋巴瘤（包括結外邊緣區B細胞淋巴瘤（黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT），結節邊緣區B細胞淋巴瘤和脾邊緣區淋巴瘤），d）套細胞淋巴瘤（MCL），e）大細胞淋巴瘤（包括B細胞彌漫性大細胞淋巴瘤（DLCL）細胞淋巴瘤，免疫母細胞性淋巴瘤，原發性縱隔B細胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤 - 肺B細胞淋巴瘤），f）毛細胞白血病，g）淋巴細胞淋巴瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症，h）急性淋巴細胞白血病（ALL），慢性淋巴細胞白血病CLL）/小淋巴細胞性淋巴瘤（SLL），B細胞幼淋巴細胞性白血病，i）漿細胞瘤，漿細胞性骨髓瘤，多發性骨髓瘤，漿細胞瘤和/或j）霍奇金氏病。

在一些其他實施方案中，病症是自身免疫性疾病。可以用抗體或其抗原結合部分治療的自身免疫性疾病的實例包括自身免疫性腦脊髓炎，紅斑狼瘡和類風濕性關節炎。抗體或其抗原結合部分也可用於治療或預防感染性疾病，炎症性疾病（例如變應性哮喘）和慢性移植物抗宿主病。 與化療組合使用

本文揭露的融合蛋白可以與抗癌劑、細胞毒性劑或化學治療劑組合使用。

術語“抗癌劑”或“抗增殖劑”意指可用於治療細胞增殖性病症例如癌症的任何藥劑，並且包括但不限於細胞毒性劑，細胞抑制劑，抗血管生成劑，放射療法和放射治療劑，靶向抗癌劑，BRM，治療性抗體，癌症疫苗，細胞因數，激素療法，放射療法和抗轉移劑和免疫治療劑。應該理解的是，在如上所述的選定實施方案中，此類抗癌劑可以包含綴合物並且可以在施用之前與揭露的融合蛋白締合。更具體而言，在一些實施方案中，將選擇的抗癌劑連接至抗體的不配對半胱氨酸以提供工程化綴合物。因此，這樣的工程化綴合物被明確地考慮在本發明的範圍內。在其他實施方案中，所揭露的抗癌劑將與包含如上所述的不同治療劑的位點特異性綴合物組合施用。

如本文所用，術語“細胞毒性劑”是指對細胞有毒並降低或抑制細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。在一些實施方案中，該物質是源自活生物體的天然存在的分子。細胞毒性劑的實例包括但不限於，細菌（例如，白喉毒素、假單胞菌內毒素和外毒素，葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxin）A），真菌（例如α-八疊球菌素（sarcin），局限麯黴素（restrictocin）），植物（相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、蒴蓮根毒素、槲寄生素、美洲商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、momoridin、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐（Aleurites fordii）蛋白、石竹素蛋白、Phytolacca mericana蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜（Momordica charantia）抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒素、石鹼草（Saponaria officinalis）抑制劑、白樹毒素、mitegellin、局限麯黴素、酚黴素、新黴素和單端孢黴烯族化合物）或動物（例如細胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或變體）的小分子毒素或酶促活性毒素。

為了本發明的目的，“化學治療劑”包括非特異性降低或抑制癌細胞的生長、增殖和/或存活的化學化合物（例如細胞毒性劑或細胞抑制劑）。這些化學藥劑通常針對細胞生長或分裂所需的細胞內過程，因此對於通常快速生長和分裂的癌細胞特別有效。例如，長春新鹼使微管解聚，從而抑制細胞進入有絲分裂。通常，化學治療劑可以包括抑制或被設計用於抑制癌細胞或可能變成性或產生致瘤後代（例如TIC）的細胞的任何化學藥劑。這些藥劑通常是組合使用的，並且通常是最有效的，例如，在諸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以與本發明的融合蛋白組合使用的抗癌劑（作為位點特異性綴合物的組分或未綴合狀態）的實例包括但不限於烷化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺和甲基三聚氰胺、多聚乙醯(acetogenins)、喜樹鹼、苔蘚抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、朵拉司他汀、多卡米星、艾榴素（eleutherobin）、水鬼蕉鹼、沙克迪因（sarcodictyin）、海綿素（spongistatin）、氮芥、抗生素、烯二炔類抗生素、dynemicin、雙膦酸鹽、埃斯波黴素、色素蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素類（aclacinomysins）、放線菌素、安麯黴素、偶氮絲氨酸、博萊黴素、放線菌素C、卡拉賓辛（carabicin）、洋紅黴素、嗜癌黴素、色黴素類（chromomycinis）、更生黴素、柔紅黴素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN^® 多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、博地黴素（potfiromycin）、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗-代謝物、埃羅替尼、威羅菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依魯替尼、恩雜魯胺、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗-腎上腺素、葉酸補充劑如弗林酸（frolinic acid）、醋葡醛內酯、醛磷醯胺糖苷、氨基乙醯丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、貝斯布希（bestrabucil）、比生群、依達曲沙、迪夫法明（defofamine）、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛（elfornithine）、依利醋銨、愛波喜龍、依託格魯、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明、美坦生類化合物（maytansinoids）、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩爾（mopidanmol）、尼特林（nitraerine）、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、PSK®多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)、雷佐生；根黴素；西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯類(尤其是T-2毒素、維拉庫林A（verracurin A）、杆孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；呱泊溴烷；凱西托欣（gacytosine）；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類；苯丁酸氮芥（chloranbucil）；GEMZAR®吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；氨甲喋呤；鉑類似物；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼，NAVELBINE®長春瑞濱；諾消靈；替尼泊苷；依達曲沙；柔紅黴素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸；類視色素；卡培他濱；考布他汀；甲醯四氫葉酸；奧沙利鉑；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制劑（其減少細胞增殖），以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。這一定義中還包括的是用於調節或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑，抑制調節腎上腺中的雌激素產生的芳香酶的芳香酶抑制劑，和抗-雄激素；以及曲沙他濱(1，3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶諸如VEGF表達抑制劑和HER2表達抑制劑；疫苗，PROLEUKIN^® rIL-2；LURTOTECAN^® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX^® rmRH；長春瑞濱和埃斯波黴素，以及上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。 與放射療法組合使用

本發明還提供了融合蛋白與放射療法（即，用於在腫瘤細胞內局部誘導DNA損傷的任何機制，例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發射等）的組合。還考慮了使用放射性同位素至腫瘤細胞的定向遞送的聯合療法，並且所揭露的抗體可以與靶向的抗癌劑或其他靶向手段結合使用。通常，放射療法在約1週至約2週的時間段內以脈衝方式施用。放射療法可以對患有頭頸癌的受試者施用約6至7週。任選地，放射療法可以作為單劑量或作為多個順序劑量施用。 藥物包裝和試劑盒

還提供了包含含有一個或多個劑量的抗體或其抗原結合部分的一個或多個容器的藥物包裝和試劑盒。在一些實施方案中，提供單位劑量，其中單位劑量含有預定量的組合物，該組合物包含例如抗體或其抗原結合部分，具有或不具有一種或多種其他試劑。對於其他實施方案，這種單位劑量以一次性使用的預充式注射用注射器供應。在其他實施方案中，單位劑量中包含的組合物可以包含鹽水、蔗糖或類似物；緩衝液，如磷酸鹽等；和/或配製在穩定和有效的pH範圍內。或者，在一些實施方案中，組合物可以作為凍幹粉末提供，其可以在加入合適的液體（例如無菌水或鹽溶液）後重建。在某些較佳的實施方案中，組合物包含一種或多種抑制蛋白質聚集的物質，包括但不限於蔗糖和精氨酸。一種或多種容器上或與容器相關聯的任何標籤指示封裝的組合物用於治療選擇的腫瘤疾病病況。

本發明還提供了用於產生融合蛋白以及任選地一種或多種抗癌劑的單劑量或多劑量施用單元的試劑盒。該試劑盒包括容器以及在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多種材料形成，例如玻璃或塑膠，並且包含藥學有效量的所揭露的綴合或非綴合形式的抗體。在其他較佳實施例中，一種或多種容器包括無菌存取口（例如容器可以是靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶）。這樣的試劑盒通常在合適的容器中包含抗體的藥學上可接受的製劑，並且任選地在相同或不同的容器中包含一種或多種抗癌劑。試劑盒還可以含有其他藥學上可接受的製劑，用於診斷或組合治療。例如，除了本發明的抗體或其抗原結合部分之外，這樣的試劑盒可以含有任何一種或多種抗癌劑，例如化學治療劑或放射治療劑；抗血管生成劑；抗轉移劑；靶向抗癌劑；細胞毒性劑；和/或其他抗癌劑。

更具體地說，試劑盒可以具有含有所揭露的抗體或其抗原結合部分的單個容器，其含有或不含另外的組分，或者它們可以具有用於每種所需試劑的不同容器。在提供用於綴合的組合治療劑的情況下，可以按摩爾當量組合或一種組分多於另一種的方式預混合單一溶液。或者，試劑盒的抗體和任何任選的抗癌劑可以在施用於患者之前分開保存在不同的容器中。試劑盒還可以包含用於容納無菌藥學上可接受的緩衝液或其他稀釋劑例如抑菌注射用水（BWFI）、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器裝置。

當試劑盒的組分以一種或多種液體溶液提供時，液體溶液較佳為水溶液，特別佳無菌水溶液或鹽水溶液。然而，試劑盒的組分可以作為乾粉提供。當試劑或組分以乾粉形式提供時，可以藉由添加合適的溶劑來重構粉末。可以設想溶劑也可以提供於另一個容器中。

如上簡要所述，該試劑盒還可含有向患者施用抗體或其抗原結合部分和任何任選組分的工具，例如一種或多種針，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他類似裝置，藉由其可以將製劑注射或引入動物體內或將其施用於身體的患病區域。本發明的試劑盒通常還包括用於容納小瓶或類似物的裝置以及用於商業銷售的其他緊密封閉的部件，例如注射或吹塑塑膠容器，其中放置並且保持所需的小瓶和其他裝置。 序列表概述

本申請附帶有包含許多氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

如本文中揭露的一種示例性融合蛋白，稱為WT1122-U14T1.G15-1.uIgG1(簡寫為WT1122)。 表A

SEQ ID NO.	描述
1	抗PD-L1抗體HCDR1的氨基酸序列
2	抗PD-L1抗體HCDR2的氨基酸序列
3	抗PD-L1抗體HCDR3的氨基酸序列
4	抗PD-L1抗體LCDR1的氨基酸序列
5	抗PD-L1抗體LCDR2的氨基酸序列
6	抗PD-L1抗體LCDR3的氨基酸序列
7	抗PD-L1抗體VH的氨基酸序列
8	抗PD-L1抗體VL的氨基酸序列
9	TGFβRII ECD結構域的氨基酸序列
10	融合蛋白重鏈的氨基酸序列
11	融合蛋白輕鏈的氨基酸序列

實施例

藉由參考以下實施例將更容易地理解本文一般地描述的本發明，這些實施例是以舉例說明的方式提供的，並且不旨在限制本發明。這些實施例並不旨在表示下面的實驗是全部或僅進行的實驗。 實施例1 抗原、基準抗體和細胞系的製備 1.1 抗原的製備

帶有His標籤的人PD-L1胞外結構域(ECD)抗原購自Sino Biological (目錄號10084-H08H)。帶有His標籤的食蟹猴(cyno) PD-L1 ECD抗原購自Sino Biological (目錄號90251-C08H)。人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3抗原購自R&D Systems (目錄號7754-BH, 7754-BH/CF; 目錄號302-B2, 302-B2/CF; 目錄號8420-B3, 8420-B3/CF)。 1.2 表達PD-L1的細胞系的建立

表達人PD-L1的細胞系(W315-CHO-K1.hPro1.C11)、表達小鼠PD-L1的細胞系(W315-293F.mPro1.C1)和表達食蟹猴PD-L1的細胞系(W315-293F.cynoPro1.2A2)如下生成。簡言之，使用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher-11668027)將CHO-K1或293F細胞用含有編碼全長人PD-L1或食蟹猴PD-L1或小鼠PD-L1的基因的表達載體轉染。將細胞在含有合適的選擇壓力的培養基中培養。藉由有限稀釋獲得穩定的細胞系。 1.3 基準抗體(BMK)的產生

融合有TGFβRII ECD的抗PD-L1 BMK抗體稱為WT112-BMK2-IgG1，基於Merck Patent GmbH的專利US9676863B2中M7824的序列構建。用Expi293表達試劑盒（ThermoFisher-A14524）將含有重鏈基因的質粒和含有輕鏈基因的質粒共轉染至Expi293細胞。將細胞培養幾天，並收集上清液用於蛋白質純化。 實施例2 生成融合有TGFβRII ECD的抗PD-L1抗體

WT1122-U14T1.G15-1.uIgG1是融合有TGFβRII ECD的抗PD-L1單植株抗體。抗PD-L1抗體的序列來自PCT/CN2020/110494（藉由引用全文併入本文）中的植株W3152-r11.135.5-zAb17-m6。Fc的C末端藉由接頭連接至TGFβRII ECD的序列，該序列與WT112-BMK2-IgG1（SEQ ID NO：9）中的相同。Fc和TGFβRII ECD之間的接頭是(G4S)₄ 。下表1中列出了WT1122-U14T1.G15-1.uIgG1（在本文中簡稱為“WT1122”）的CDR序列。 表1

WT1122	HCDR1	HCDR2	HCDR3
SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 3
GFSLTENSVS	AVWSSGSTDYNSALKS	STYSNDFYYYFDY
LCDR1	LCDR2	LCDR3
SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6
SGSELPKRYAY	KDSERPS	SSTYGDRKLPI
TGFβRII ECD (SEQ ID NO: 9)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD

實施例3 WT1122的體外表徵 3.1 人TGF-β結合ELISA

藉由ELISA測定抗體對人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的結合。將板在4°C分別用人TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3包被過夜。封閉和洗滌後，將各種濃度的測試抗體添加至板中，並在室溫孵育1小時。然後洗滌板，並與HRP標記的山羊抗人IgG抗體（Bethyl）一起孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀（SpectraMax M5e）讀取450 nm和540 nm的吸光度。

抗體與板上包被的人TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3的結合曲線如圖1A所示。WT1122顯示出與WT112-BMK2-IgG1類似的親和力。它們與固定的TGF-β1（EC50 = 0.5nM）和TGF-β3（EC50 = 0.8 nM）牢固結合，但不與固定的TGF-β2結合。

還藉由固定有測試抗體的ELISA來測定抗體與人TGF-β2的結合。封閉和洗滌後，將各種濃度的TGF-β2加入板，並在室溫孵育1小時。然後洗滌板，並與生物素化的TGF-β2檢測抗體（R＆D，DY240）一起孵育1小時，然後與鏈黴親和素-HRP孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀（SpectraMax M5e）讀取450 nm和540 nm的吸光度。

抗體對可溶性人TGF-β2的結合曲線如圖1B所示。固定化的WT1122和WT112-BMK2-IgG1能夠以可比的EC50與可溶性TGF-β2結合，EC50分別為0.07nM和0.05nM。 3.2人PD-L1結合FACS

將各種濃度的測試抗體與表達人PD-L1的W315-CHO-K1.hPro1.C11在4℃孵育1小時。洗滌後，將細胞與PE標記的山羊抗人IgG-Fc抗體（Jackson Immuno Research）一起孵育。最後，藉由流式細胞儀測量細胞的MFI，並藉由FlowJo進行分析。

與人PD-L1轉染細胞的結合曲線如圖2A所示。WT1122和WT112-BMK2-IgG1與細胞表面人PD-L1牢固結合，EC50分別為0.7nM和1.21nM。 3.3 交叉物種結合FACS

藉由FACS確定測試抗體與食蟹猴或小鼠PD-L1的結合。將各種濃度的測試抗體與表達獼猴PD-L1的W315-293F.cynoPro1.2A2細胞或表達小鼠PD-L1的W315-293F.mPro1.C1細胞在4℃孵育1小時，然後用PE標記的山羊抗人IgG-Fc抗體（Jackson Immuno Research）檢測抗體對細胞表面的結合。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI，並藉由FlowJo進行分析。

圖2B顯示了與食蟹猴PD-L1轉染細胞的結合，圖2C顯示了與小鼠PD-L1轉染細胞的結合。WT1122和WT112-BMK2-IgG1能夠與細胞表面的食蟹猴和小鼠PD-L1牢固結合。WT1122和WT112-BMK2-IgG1與食蟹猴PD-L1結合的EC50分別為1.08nM和1.59nM，與小鼠PD-L1結合的EC50分別為1.2nM和1.5nM。 3.4 與人PD-L1和人TGF-β1的同時結合

藉由ELISA測定測試抗體與人TGF-β1和人PD-L1的同時結合。用人TGF-β1包被板在4℃過夜。封閉和洗滌後，將各種濃度的測試抗體添加至板中，並在室溫孵育1小時。然後洗滌板，並與生物素化的人PD-L1 ECD蛋白然後是鏈黴親和素-HRP（Invitrogen）一起孵育1小時。洗滌後，加入TMB底物，並用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀（SpectraMax M5e）讀取450 nm和540 nm的吸光度。

類似地，還藉由用人PD-L1包被板來測試同時的雙重靶結合。在與各種濃度的測試抗體然後是TGF-β1抗原孵育後，在板中加入生物素化的人TGF-β1檢測抗體（R＆D，目錄號840117）然後是鏈黴親和素-HRP（Invitrogen）。最後，加入TMB底物，並用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀（SpectraMax M5e）讀取450 nm和540 nm的吸光度。

圖3A和圖3B所示的結果表明，當固定TGF-β1時，WT1122和WT112-BMK2-IgG1同時結合PD-L1和TGF-β1，EC50分別為0.29和0.17 nM（圖3A）；當固定人PD-L1時，EC50分別為0.01 nM和0.02 nM（圖3B）。 3.5 藉由競爭FACS測定的PD-1/PD-L1阻斷

將各種濃度的測試抗體、陽性和陰性對照抗體與mFc標記的人PD-1混合，然後在4℃與表達人PD-L1的轉染細胞孵育1小時。藉由PE標記的抗小鼠IgG Fc抗體（Abcam）檢測人PD-1與人PD-L1表達細胞的結合。藉由流式細胞儀測量細胞的MFI，並藉由FlowJo進行分析。

如圖4所示，WT1122和WT112-BMK2-IgG1阻斷PD-1與細胞表面PD-L1的結合，IC50分別為0.04 nM和0.32 nM。 3.6 報告基因測定(RGA)

藉由RGA測定測試了TGF-β1訊號傳導的阻斷。RGA細胞系是藉由穩定表達全長人啟動素受體II B以及穩定整合的SBE螢光素酶報告基因而制得的。為了測定測試抗體的TGF-β1訊號傳導阻斷活性，將人TGF-β1和各種濃度的抗體預先混合，並加入RGA細胞中，並在37°C、5％CO2下孵育過夜。孵育後，加入重構的螢光素酶底物（Promega，目錄號E6130），並藉由微板分光光度計測量螢光素酶強度。

藉由RGA測定法測試了PD-1/PD-L1訊號傳導的阻滯。PD-1 RGA細胞系是藉由在Jurkat E6-1細胞中穩定表達PD-1的全長以及NFAT螢光素酶報導基因而製備的。將PD-1 RGA細胞與表達人PD-L1的人工APC（表達人PD-L1和OKT3 sc-Fv的CHO-K1細胞）在各種濃度的測試抗體存在下於37°C、5％ CO₂ 孵育4-6小時。溫育後，加入重構的螢光素酶底物，並藉由微板分光光度計測量螢光素酶強度。

如圖5A所示，WT1122顯示出與WT112-BMK2相當的TGF-β1阻斷，IC50為1.2nM，WT112-BMK2的IC50為0.7nM。如圖5B所示，在RGA測定中，WT1122和WT112-BMK2-IgG1顯示出較強的hPD-1/PD-L1訊號阻斷活性。WT1122和WT112-BMK2-IgG1的IC50分別為0.31 nM和0.59 nM。 3.7 同種異體混合淋巴細胞反應(allo-MLR)

使用Ficoll-Paque PLUS（Stem Cell）梯度離心從健康供體中新鮮分離人外週血單核細胞（PBMC）。根據製造商的說明，使用CD14 MicroBeads（MiltenyiBiotec）分離單核細胞。將細胞在含有GM-CSF（Amoytop Biotech）和IL-4（R＆D）的培養基中培養5至7天，以產生樹突細胞（DC）。根據製造商的方案，使用人CD4 + T細胞富集試劑盒（Stem Cell）分離人CD4 + T細胞。將純化的CD4 + T細胞與同種異體未成熟DC（iDC）在存在測試抗體、陽性和陰性對照抗體的情況下在96孔板中共培養。將板在37℃、5％CO2下孵育。分別在第3天和第5天收穫上清液用於IL-2和IFN-γ測試。

使用匹配的抗體對藉由ELISA測量人IL-2和IFN-γ釋放。重組人IL-2（R＆D）和IFN-γ（PeproTech）分別用作標準品。分別在板上預塗對人IL-2（R＆D）或IFN-γ（Pierce）特異性的捕獲抗體。封閉後，將50 µL標準品或樣品吸移到每個孔中，並在環境溫度孵育2小時。除去未結合的物質後，將對相應細胞因數具有特異性的綴合有生物素的檢測抗體添加到孔中，並孵育一小時。然後將HRP標記的鏈黴親和素添加至孔中，在室溫孵育30分鐘。藉由加入50 µL TMB底物顯色，然後用50 µL 2N HCl停止。使用微孔板分光光度計在450 nm和540 nm處讀取吸光度。

圖6A至圖6B中所示的結果表明，WT1122和WT112-BMK2-IgG1能夠以劑量依賴性方式增強人CD4 + T細胞同種異體MLR測定中的IL-2產生（圖6A）和IFNγ產生（圖6B）。 3.8血清穩定性

將WT1122在5％CO2培養箱中於37°C在新鮮分離的人血清（血清含量＞ 95％）中培養。在指示的時間點，從培養箱中取出等分的血清處理樣品，並在液氮中速凍，然後保存在-20°C直至準備測試。在穩定性測試之前立即將樣品快速融化。同時結合ELISA、人TGF-β1結合ELISA和人PD-L1結合FACS的程式如上文所描述的。

如圖7所示，這些WT1122樣品顯示出與靶標的正常結合，表明該抗體在人血清中穩定至少14天。 3.9 抗體蛋白加速穩定性研究 3.9.1 樣品處理和加速穩定性研究

將WT1122藉由透析袋（Spectrum-888-10987，MWCO 3.5kDa）透析到PBS緩衝液中，然後稀釋至2 ug/ml。藉由分別在4°C、25°C和40°C孵育測試抗體1天、4天和7天，以及在-80°C凍融3個迴圈來進行加速穩定性研究（表2）。在每種測試條件下孵育後，立即對樣品肉眼檢查以仔細檢測是否存在任何顆粒。所有樣品均顯示為無顆粒的澄清溶液。藉由SDS-PAGE、分析性SEC-HPLC、DSF和DLS測定法來分析每個處理樣品的抗體穩定性。表2中顯示的結果表明WT1122在加速穩定性研究中是穩定的。 3.9.2 藉由DSF的熱穩定性

使用即時螢光定量PCR（QuantStudio 7 Flex，Thermo Fisher Scientific）進行DSF分析。簡要地說，將19 µL抗體溶液與1 µL 62.5×SYPRO Orange溶液（Invitrogen）混合，然後添加到96孔板（Biosystems）中。以0.9℃/ min的速率將板從26℃加熱至95℃，並收集所得的螢光資料。計算相對於不同溫度的螢光變化的負導數，並且將最大值定義為熔融溫度。資料收集和Tm計算由操作軟體（QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.3）自動進行。PBS緩衝液中WT1122的Tm約為65.6°C（表2）。 3.9.3 藉由DLS的分子半徑測量

使用DynaPro Plate Reader III動態光散射（DLS）儀器（Wyatt DynaproTM）研究了分子半徑測量。每個蛋白質樣品進行了五次採集，每次採集時間為5 s。每個孔在1536板（Aurora微孔板）中包含7.5μL溶液。對於每次測量，測定擴散係數。半徑由操作軟體（DYNAMICS 7.8.1.3）自動計算。表2中的結果表明，經過不同處理後的樣品的半徑範圍為13.6 nm至14.9 nm，這與從-80°C剛融化的樣品（T0的半徑為13.7 nm）相當。 表2. PBS中的加速穩定性結果

處理	外觀	濃度 (mg/mL)	DLS 半徑(nm)		DSF Tm °C
T0	無顆粒	2.05	13.7	3.05/96.95	65.6
3X	無顆粒	2.02	14.8	3.83/96.17	65.9
4℃-第1天	無顆粒	2.02	14.8	3.22/96.78	65.7
4℃-第4天	無顆粒	1.98	13.7	3.19/96.81	65.7
4℃-第7天	無顆粒	2.03	13.6	3.02/96.98	65.7
25℃-第1天	無顆粒	2.02	14.3	3.11/96.89	65.9
25℃-第4天	無顆粒	2.05	14.6	3.12/96.69/0.19	65.7
25℃-第7天	無顆粒	2.03	14.1	2.95/96.81/0.24	65.9
40o C -第1天	無顆粒	2.05	14.9	3.1/96.64 /0.26	65.7
40o C -第4天	無顆粒	2.03	14.3	3.01/96.47 /0.53	65.9
40o C -第7天	無顆粒	2.03	14.9	3.22/95.96/0.82	65.9

T0: 凍融一次(從-80 ℃)。

3X: 樣品比T0多凍融3次。 3.10 對PD-L1的完全動力學結合親和力（藉由SPR）

使用Biacore 8K藉由SPR分析檢測WT1122與人、小鼠和食蟹猴PD-L1的結合親和力。在固定有抗人IgG Fc抗體的CM5感測器晶片（GE）上捕獲抗體。將不同濃度的人或食蟹猴PD-L1以30μL/ min的流速注入感測器晶片，持續180 s的締合階段，然後解離3600 s。將不同濃度的小鼠PD-L1以30μL/ min的流速注入感測器晶片，持續120 s的締合階段，然後解離1200 s。每個結合迴圈後，晶片藉由10 mM甘氨酸（pH 1.5）再生。

從測試傳感圖中減去空白表面和緩衝液通道的傳感圖。對於WT1122與小鼠PD-L1的結合，在擬合過程中使用了0-300 s的曲線。使用Langmiur分析藉由1：1模型擬合實驗資料。將40 kDa的分子量用於計算人、小鼠和食蟹猴PD-L1的摩爾濃度。如表3所示，WT1122對人和食蟹猴PD-L1具有相似的親和力。 表3. WT1122對人、食蟹猴和小鼠PD-L1的結合親和力

分析物	配體	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
人PD-L1	WT1122	2.41E+06	1.68E-03	6.95E-10
食蟹猴PD-L1	3.03E+06	1.35E-03	4.46E-10
小鼠PD-L1	/	/	1.08E-06

3.11 對TGFβ的完全動力學結合親和力（藉由SPR）

使用Biacore8K藉由SPR測定法檢測對TGFβ的抗體結合親和力。將每種抗體固定在CM5感測器晶片（GE）上。將不同濃度的人TGFβ1和TGFβ3以50 uL/min的流速注入感測器晶片，持續240 s的締合階段，然後解離1200 s。將不同濃度的人TGFβ2以50 uL/min的流速注入感測器晶片，持續240 s的締合階段，然後解離300 s。每個結合迴圈後，晶片藉由10 mM甘氨酸（pH 1.5）再生。

從測試傳感圖中減去空白表面和緩衝液通道的傳感圖。使用Langmiur分析藉由1：1模型擬合實驗資料。使用分子量22 kDa、24 kDa和22 kDa分別計算分析物TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的摩爾濃度。結果列於表4。 表4.藉由SPR測定的WT1122對TGFβ的結合親和力。

分析物	配體	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
TGF-β1	WT1122	1.25E+08	2.06E-04	1.65E-12
TGF-β2	4.02E+07	1.49E-02	3.69E-10
TGF-β3	5.78E+07	9.35E-05	1.62E-12

3.12 對FcRn的完全動力學結合親和力（藉由SPR）

使用Biacore 8K檢測對人FcRn（ARCO，FCM-H5286）的抗體結合親和力。將每種抗體固定在CM5感測器晶片（GE）上。將不同濃度的人FcRn以30 uL/min的流速注入感測器晶片上，持續60 s的締合階段，然後解離90 s。然後在每個結合迴圈後，用10 mM甘氨酸（pH 1.5）再生晶片。從測試傳感圖中減去空白表面和緩衝液通道的傳感圖。實驗資料藉由穩態親和力模型擬合。將45 KDa的分子量用於計算分析物FcRn的摩爾濃度。運行緩衝液是PBST，pH 6.0。

WT1122和WT112-BMK2-IgG1對FcRn的親和力相似（表5）。 表5. 藉由SPR測定的對FcRn的親和力

分析物	配體	KD (M)
人FcRn	WT1122	2.57E-06
WT112-BMK2-IgG1	1.89E-06

實施例4 體內抗腫瘤功效研究 4.1 HCC827 PBMC模型中的體內抗腫瘤功效研究

在HCC827模型中對NCG雌性小鼠進行了WT1122抗腫瘤功效研究。研究中使用了13-14週齡的雌性NCG小鼠（南京銀河生物製藥有限公司）。HCC827細胞以單層培養的形式在37°C空氣中5％CO2的氣氛中，在補充有10％胎牛血清、100 U/mL青黴素和100μg/ mL鏈黴素的RPMI 1640培養基中進行體外維持。常規每週兩次將腫瘤細胞傳代培養兩次，用0.25％胰蛋白酶-EDTA處理。收穫在指數生長期生長的細胞，並計數腫瘤接種量。

對於治療模型，每隻小鼠的右前側皮下均接種了HCC827腫瘤細胞（5.0×10⁶ 細胞，在200μL PBS中含有50％的基質凝膠）。當平均腫瘤體積達到約173 mm³ 時，將動物隨機分為5組，每組包含7隻小鼠。小鼠靜脈注射人PBMC（5.0×10⁶ ，Hemocare，批號19057819）。PBMC植入後1-2h，在第0天、第3天、第7天和第10天藉由腹膜內注射對動物進行藥物處理，共進行4次注射。4組（G2-G5）分別注射20mg/kg的WT112-BMK2-IgG1或0.2mg/kg、2mg/kg和20mg/kg的WT1122。對照組（G1）注射了媒介物-PBS。第一次注射的日期被認為是第0天。對於所有腫瘤研究，稱重小鼠並使用測徑器每週兩次測量腫瘤生長。

本研究中與動物處理、護理和治療有關的所有程式均按照上海SIPPR-BK實驗動物有限公司的機構動物護理和使用委員會（IACUC）批准的指南，並遵循實驗室動物護理評估和鑒定協會（AAALAC）的指導進行。用公式（1/2（長×寬² ））計算腫瘤體積。結果用均值和標準誤差（平均值±SEM）表示。資料藉由Graphpad Prism 6.0使用雙向ANOVA Tukey多重比較檢驗進行，P ＜0.05被認為具有統計學顯著的。

如圖8A所示，實驗期間所有小鼠均正常，沒有明顯的體重減輕，表明抗體沒有毒性。如圖8B所示，在第一次給藥後的第16天，媒介物組的平均腫瘤體積為798mm³ ，這表明HCC827模型已經很好地建立。與媒介物組相比，WT1122顯示出有力的抗腫瘤作用並顯著抑制了腫瘤的生長。每組第16天的TGI對於WT112-BMK2-IgG1（20 mg/kg）為55.91％，對於0.2mg/kg、2mg/kg和20mg/kg的WT1122分別為55.42％、50.72％和77.13％。WT1122在高劑量時顯示出比BMK2更好的抗腫瘤活性（p ＜0.05），在低劑量和中劑量時則顯示出可比的抗腫瘤活性（p＞ 0.05）。 4.2 WT1122以30mg/kg在食蟹猴中的體內藥代動力學研究

將兩隻成年食蟹猴(一隻雄性+一隻雌性)藉由靜脈內注射施用30 mg/Kg WT1122。每天進行體重、食物消耗和臨床的觀察。在不同時間點採集心電圖（ECG）、血液和血清樣品。將血液收集到裝有EDTA-K2的試管中進行血液學檢查，並將2.0 mL血液收集到無添加劑的試管中進行血清化學測定。進行標準臨床化學和血液學分析。為了進行PK和免疫學分析，收集了約1.2 mL血液，在3500 rpm和4°C離心15分鐘收集了約0.5 mL血清，並在約-70°C或更低的溫度冷凍保存。進行每日臨床觀察並記錄。所有與動物處理、護理和治療有關的程式均按照廣州中醫藥大學科技園公司的機構動物護理和使用委員會（IACUC）批准的指南遵循實驗室動物護理評估與認證協會（AAALAC）的指導進行。血清中WT1122的濃度採用生物分析ELISA方法進行測定。使用Phoenix WinNonlin軟體（8.1版，Pharsight，Mountain View，CA）對血清濃度進行非區室性藥代動力學分析。應用線性/對數梯形法則獲得PK參數，資料用均值±SD表示。

動物對單次靜脈注射WT1122的劑量30mg/kg耐受良好，未觀察到明顯的副作用，包括心電圖、日常臨床觀察、體重和主要血液學參數（ALT，AST，WBC，RBC，PLT，QTc等）。如表6和圖9A所示，終末半衰期為92.1h，AUC_0-inf 為34993h *μg/mL，清除率為20.9ml/天/kg。 表5. 單次靜脈內注射30mg/kg後WT1122的PK譜

PK參數	雄性 (1001)	雌性 (1501)	均值	SD
Rsq_adj	0.908	0.983	-	-
用於T1/2的端點數	4.00	7.00	-	-
Cmax (μg/mL)	986	1140	1063	109
T1/2 (h)	82.6	102	92.1	13.5
Cl (mL/天/kg)	23.6	18.2	20.9	3.78
Vdss (mL/kg)	70.6	79.0	74.8	5.96
MRT0-last (h)	71.8	103	87.6	22.4
MRT0-inf (h)	71.8	104	87.9	22.7
Tlast (h)	288	504	396	153
AUC0-last (h*μg/mL)	30515	39434	34975	6307
AUC0-inf (h*μg/mL)	30516	39469	34993	6331

本領域技術人員可以認識和理解本專利描述，在不脫離其本質或基本特徵的情況下，本發明可以以其他具體形式來實施。由於本發明的前述描述僅揭露了其示例性實施方案，其他變化應該被理解為在本發明的範圍內。因此，本發明不限於在此詳細描述的特定實施方案。相反，應當參考所附申請專利範圍來指示本發明的範圍和內容。 參考文獻

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BMK:基準抗體 PBS:磷酸鹽緩衝鹽水 TGF:轉化生長因數

圖1顯示藉由ELISA測定的，當將TGF-β固定化時(A)或將抗體固定化時(B)抗體對人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的結合結果。人IgG1是同種型對照。 圖2顯示藉由FACS測定的，抗體對表達人PD-L1 (A), 食蟹猴PD-L1 (B)和小鼠PD-L1(C)的細胞的結合結果。 圖3顯示藉由ELISA測定的，當將TGF-β1(A)或人PD-L1(B)固定化時抗體同時結合PD-L1和TGF-β1。 圖4顯示藉由FACS測定的，抗體阻斷PD-1對細胞表面PD-L1結合的結果。 圖5A顯示在RGA測定中，抗體阻斷TGF-β1訊號傳導的結果。圖5B顯示在RGA測定中，抗體阻斷人PD-1/PD-L1訊號傳導的結果。數據呈現為均值 ± SEM。 圖6顯示抗體在同種異體混合的淋巴細胞反應中的IL-2 (A)和IFN-γ(B)產生結果。 圖7顯示藉由雙重結合ELISA測試和PD-L1結合FACS測試的抗體的血清穩定性結果。 圖8顯示抗體施用在小鼠HCC827 PBMC模型中引起的體重變化(A)和抗腫瘤功效(B)。 圖9顯示WT1122抗體的體內藥代動力學研究結果。

<110> 上海藥明生物技術有限公司(WuXi Biologics(Shanghai)CO.,LTD.)

<120> 一種雙功能融合蛋白及其用途

<130> IEC196146-TW

<140> 110106549

<141> 2021-02-24

<150> PCT/CN2020/076658

<151> 2020-02-25

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 7

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 8

<210> 9

<211> 136

<212> PRT

<213> 人

<400> 9

<210> 10

<211> 606

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC

<400> 10

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC

<400> 11

PBS:磷酸鹽緩衝鹽水

Claims (25)

1. 一種融合蛋白，其包含特異性結合PD-L1的一抗體或其抗原結合部分融合於能夠結合TGFβ的一人轉化生長因數β受體II(TGFβRII)或其部分，且該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合部分在重鏈的C末端連接有該人TGFβRII或其部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含：SEQ ID NO：1所示的重鏈CDR1(HCDR1)；SEQ ID NO：2所示的HCDR2；SEQ ID NO：3所示的HCDR3；SEQ ID NO：4所示的輕鏈CDR1(LCDR1)：SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
2. 根據請求項1所述的融合蛋白，其中該人TGFβRII或其部分包含：(A)與野生型人TGFβRII的氨基酸序列至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；(B)與野生型人TGFβRII胞外結構域的氨基酸序列至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或(C)野生型人TGFβRII的部分，其保留與TGFβ的結合能力的至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。
3. 根據請求項2所述的融合蛋白，其中該TGFβRII或其部分包含或組成為野生型人TGFβRII的胞外結構域。
4. 根據請求項3所述的融合蛋白，其中該TGFβRII或其部分包含或組成為SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
5. 根據請求項1所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合部分包含一重鏈可變區(VH)和一輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含：(A)如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；(B)與SEQ ID NO：7至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或(C)與SEQ ID NO：7相比具有一個或2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的添加、缺失、和/或取代的氨基酸序列；和該VL包含：(A)如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；(B)與SEQ ID NO：8至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列；或(C)與SEQ ID NO：8相比具有一個或2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的添加、缺失、和/或取代的氨基酸序列。
6. 根據請求項1所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合部分是全抗體、ScFv、Fab、F(ab’)2、或Fv片段。
7. 根據請求項6所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合部分包含VH區可操作地連接於重鏈中的Fc區。
8. 根據請求項7所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合部分是IgG1同種型。
9. 根據請求項7所述的融合蛋白，其中抗體或其抗原結合部分的Fc區可操作地連接於人TGFβRII或其部分的N末端。
10. 根據請求項9所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合部分的Fc區經由一肽接頭可操作地連接於該人TGFβRII或其部分的N末端。
11. 根據請求項10所述的融合蛋白，其中該肽接頭包含(G4S)n且n=2-4。
12. 根據請求項1所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合部分是人源化的或全人抗體。
13. 根據請求項1所述的融合蛋白，其中該融合蛋白的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NO：10和11。
14. 一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項1至請求項13中任一項限定的融合蛋白的核酸序列。
15. 一種包含如請求項14所述的核酸分子的載體。
16. 一種包含如請求項14所述的核酸分子或如請求項15所述的載體的宿主細胞。
17. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至請求項13中任一項所述的融合蛋白以及藥學可接受的載體。
18. 一種產生如請求項1至請求項13中任一項限定的一融合蛋白的方法，包括以下步驟：- 在包含編碼該融合蛋白的核酸序列的一宿主細胞中表達該融合蛋白；和- 從該宿主細胞分離該融合蛋白。
19. 一種根據請求項1至請求項13中任一項所述的融合蛋白或如請求項17所述的藥物組合物的用途，用於製備調控受試者中免疫應答的藥物。
20. 一種根據請求項1至請求項13中任一項所述的融合蛋白或如請求項17所述的藥物組合物的用途，用於製備抑制受試者中與PD-1/PD-L1有關的腫瘤細胞生長的藥物。
21. 一種根據請求項1至請求項13中任一項所述的融合蛋白或如請求項17所述的藥物組合物的用途，用於製備治療受試者中與PD-1/PD-L1有關的一癌症的藥物。
22. 根據請求項21所述的用途，其中該癌症選自結腸癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌、子宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、膠質母細胞瘤、前列腺癌、食道癌和胃癌。
23. 根據請求項22所述的用途，其中該癌症為NSCLC。
24. 根據請求項19至請求項23中任一項所述的用途，其中該融合蛋白或藥物組合物與化療劑、放療和/或用於癌症免疫治療的其他藥劑組合施用。
25. 一種用於治療或診斷癌症的試劑盒，其包含在容器中的如請求項1至請求項13中任一項限定的融合蛋白。