CN116987198B - 一种靶向人pd-l1的融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种融合蛋白，其从N端到C端包含：第一抗PD‑L1抗体的VL、第一连接子、第二抗PD‑L1抗体的VH、第二连接子、Fc区、第三连接子、第二抗PD‑L1抗体的VL、第四连接子以及第一抗PD‑L1抗体的VH。本申请还提供了编码所述融合蛋白的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞、检测PD‑L1的检测试剂盒以及所述融合蛋白的相关用途。产生的这类融合蛋白不仅在免疫组化反应中提高了检测的灵敏度，而且能够适应不同的抗体分子检测。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测领域，尤其涉及一种用于PD-1/PD-L1阻断治疗伴随诊断的免疫组化检测技术。
背景技术
PD-1/PD-L1抑制剂是一组用于治疗癌症的免疫检查点抑制剂。此类免疫检查点抑制剂正在成为几种癌症的一线治疗药物。随着越来越多的PD-1/PD-L1抑制剂药物获批上市，越来越多的肿瘤患者从治疗中获益。但是，通常需要进行PD-L1免疫组化检测来预判患者能否从PD-1/PD-L1抑制剂获益。
FDA批准的OPDIVO伴随诊断免疫组化试剂为PD-L1 IHC 28-8 pharmDx，批准的KEYTRUDA伴随诊断免疫组化试剂为PD-L1 IHC 22C3 pharmDx，批准的TECENTRIQ伴随诊断免疫组化检测试剂为VENTANA PD-L1 (SP142) Assay。这种“一种药物一种检测”的模式，包括不同的诊断标准，对于伴随诊断在病理日常诊断工作中的应用影响很大。
发明内容
本申请通过制备靶向PD-L1分子上的不同表位的双特异性抗体，在一定程度上可以解决通用型PD-L1分子免疫组化诊断的一致性问题。
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其从N端到C端包含：第一抗PD-L1抗体的VL、第一连接子、第二抗PD-L1抗体的VH、第二连接子、Fc区、第三连接子、第二抗PD-L1抗体的VL、第四连接子以及第一抗PD-L1抗体的VH。
在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。
在第五方面，本申请提供了一种检测试剂盒，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及关于如何进行所述检测的说明书。
在第六方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于检测受试者的样品中的PD-L1表达的用途。
在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于筛选是否适于施用PD-1/PD-L1抑制剂的肿瘤候选者的试剂中的用途。
使用来自不同抗体的可变区的组合，构建了一种能够特异性识别人PD-L1两种不同表位的双特异性抗体，产生的这类双特异性抗体不仅在免疫组化反应中提高了检测的灵敏度，而且能够适应不同的抗体分子检测。
附图说明
图1显示了本申请制备的双特异性抗体IMB0601的示意性结构；
图2显示了本申请制备的双特异性抗体IMB0601的SDS-PAGE结果，其中泳道1显示了非还原条件下的电泳结果；泳道2显示了还原条件下的电泳结果；并且M显示了蛋白质Marker；
图3显示了本申请制备的双特异性抗体IMB0601的免疫组化结果，其中A：阴性对照组；B：22C3组；C：双抗组(IMB0601)，并且其中A至C中的左侧图均为直肠癌，右侧图均为十二指肠癌。
发明的详细描述
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
定义
本文使用的术语“融合蛋白(fusion protein)”是指有目的地把两段或更多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所述蛋白。这种通过人工条件下将两个或更多个基因的编码区首尾连接，由调控序列控制的基因表达后所得的蛋白质产物即为融合蛋白。
本文所用的术语“连接子”在本申请的背景下是指用于连接两个功能蛋白之间的短肽，长度可以从3个氨基酸(aa)高至76个氨基酸。连接子可为融合蛋白中的各功能蛋白提供一定的柔性，使其能够发挥各自的功能。
本文所用的术语“抗体”包括典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文的“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文所用的术语“可变区”是指抗体重链或轻链中所包含的使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构，每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。
本文所用的术语“Fc区”是指完整抗体经木瓜蛋白酶水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据Kabat编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群抗体的单个抗体之间是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异外。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原表位。本文公开的单克隆抗体不限于抗体来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体挑选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括在“抗体”定义下的完整免疫球蛋白以及其片段等。
本文所用的术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合两种或更多种抗原。
本文所用的术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本文所用的术语“受体”是指任何能够同激素、神经递质、药物或细胞内信号分子结合并能引起细胞功能变化的生物大分子。受体本身至少含有两个活性部位：一个是识别并结合配体的活性部位；另一个是负责产生应答反应的功能活性部位，这一部位只有在与配体结合形成二元复合物并变构后才能产生应答反应，由此启动一系列的生化反应，最终导致靶细胞产生生物效应。受体能够与其配体特异性结合。通常，将受体的胞外区作为本申请中的结合部分。
本文使用的术语“配体”是指能够与其受体结合的任何分子。大多数配体是亲水性的生物大分子，如细胞因子，蛋白质多肽类激素、水溶性激素、前列腺素、亲水性神经递质等，由于不能通透靶细胞膜进入胞内，因此，这类配体信号分子的受体是定位于靶细胞膜上。
本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。
本文使用的术语“PD-1/PD-L1抑制剂”是指免疫哨点单抗药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。已上市的尼伏单抗(nivolumab)、潘利珠单抗(pembrolizumab)和替雷利珠单抗(Tislelizumab)属于PD-1抑制剂，主要用于黑素瘤和非小细胞肺癌的治疗，对肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等的疗效还在大规模临床试验中。PD-L1抑制剂阿替珠单抗(atezolizumab)、度伐单抗(durvalumab)和阿维单抗(avelumab)已被批准用于治疗尿道上皮癌，还有其他几种药物尚处于早期临床试验阶段。
具体实施方式
PD-1全称程序性死亡受体1 (Programmed Death 1)，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。以PD-1为靶点的免疫调节在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。
PD-L1全称程序性死亡受体-配体1 (Programmed Cell Death-Ligand 1)，是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生。而 PD-1与PD-L1的结合，可以传导抑制性的信号，降低T细胞的增生。
免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)分析利用抗体和抗原之间的结合的高度特异性，借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位和强度显示出来，以期达到对组织或细胞中的相应抗原进行定性、定位或定量的研究。
PD-L1免疫组化检测是预测PD-1或PD-L1疗效的一种简单有效的方法，它是通过检测肿瘤细胞(TC)或免疫细胞(IC)表面的PD-L1表达量，进而推测PD-L1抑制剂疗效的方法。目前，PD-L1免疫组化检测试剂盒/抗体有 6 种：SP263、22C3、28-8、SP142、73-10和E1L3N。不同抗体需要用不同的检测平台检测，主流检测平台为两家公司的5种抗体检测平台，分别为DAKO 22C3、28-8和73-10检测的AutoStainer Link 48平台和Ventana SP142和SP263检测的Ventana Benchmark Ultra平台。
现在已有22C3、28-8、SP142、SP263获得FDA批准应用于临床检测PD-L1表达的伴随诊断(CDx)。通常一个试剂盒/抗体只作为一种药物的伴随诊断或辅助诊断。PD-L1检测的患者选择应以PD-1/PD-L1抑制剂的获批适应证为主要依据。
诊断检测对于治疗药物的安全有效使用(伴随诊断)是必不可少的，或者可以在不限制药物获取的情况下提高受益/风险比(补充诊断)，这两种诊断检测被认为是实现精准医疗的重要因素。伴随诊断与补充诊断是具有不同的开发背景下的产品类别。
伴随诊断(companion diagnostics，CDx)是一种医疗设备，通常是一种体外诊断设备，它对于患者用药是必需的，它可以为患者使用药物的安全性和有效性提供重要的信息，包括：确定最有可能从药物中受益的患者；确定该药物相关严重不良反应风险较大的患者；确定已经过充分研究具备安全性和有效性的人群亚组等。
补充诊断(complementary diagnostics)也是一种体外诊断设备，它对于患者用药不是必需的，这些检测不是接受药物的先决条件，但可以进一步帮助医生就药物的使用作出获益/风险决策(例如，确定哪些患者更有可能从中获益)。
PD-L1免疫组化检测的获批试剂对应药物各有不同，因此各检测平台和试剂间的相关性和一致性也是临床医生与病理医生关注的重点。由于免疫组化结果判读主要通过人为及半定量判断，具有一定主观性，因此，PD-L1检测应在有资质的实验室由经过PD-L1判读培训的病理医师进行诊断。
对于22C3抗体，使用该抗体检测时只观察肿瘤细胞膜染色情况，细胞质阳性着色忽略不计。部分或全部细胞膜表达任何线性或颗粒状染色的肿瘤细胞均算作阳性细胞，且PD-L1 (22C3)是唯一一个以TPS(任何强度的部分或完全膜染色的肿瘤细胞占标本中所有肿瘤细胞的百分比)作为表达结果的抗体。TPS<1%诊断为阴性表达，TPS≥1%诊断为阳性表达，其中TPS 1%-49%为低表达，TPS≥50%为高表达，上述数值区间对临床用药有指导意义。
具体而言，本申请提供了如下技术方案：
在第一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其从N端到C端包含：第一抗PD-L1抗体的VL、第一连接子、第二抗PD-L1抗体的VH、第二连接子、Fc区、第三连接子、第二抗PD-L1抗体的VL、第四连接子以及第一抗PD-L1抗体的VH。
在一些实施方案中，所述第一抗PD-L1抗体和所述第二抗PD-L1抗体各自独立地选自：阿替珠单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)、度伐单抗(Durvalumab)、尼伏单抗(Nivolumab)、潘利珠单抗(Pembrolizumab)、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、阿得贝利单抗(Adebrelimab)、贝莫苏拜单抗(Benmelstobart)、柯希利单抗(Cosibelimab)、Danburstotug、多塔利单抗(Dostarlimab)、Garivulimab、仑卡奈单抗(Lesabelimab)和玛奈利单抗(Manelimab)。
在优选的实施方案中，所述第一抗PD-L1抗体是阿替珠单抗，并且所述第二抗PD-L1抗体是阿维单抗，或者所述第一抗PD-L1抗体是阿维单抗，并且所述第二抗PD-L1抗体是阿替珠单抗。
连接子可以是“合成的肽接头”，其富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基例如以多达5个氨基酸的小重复单元排列，如GGGS、GGGGS、QQQG、QQQQG、SSG或SSSSG。这个小的重复单元可以重复两到五次以形成多聚体单元，如例如，(GGGS)2、(GGGS)3、(GGGS)4、(GGGS)5、(GGGGS)2、(GGGGS)3或(GGGGS)4。在多聚体单元的氨基和/或羧基端末端，可以加入多达六个的额外任意、天然存在的氨基酸。其它合成的肽接头由单个氨基酸组成，其重复10至20 次，并且可以在氨基和/或羧基端末端包含多达六个的额外任意、天然存在的氨基酸，如，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG中的丝氨酸。所有连接子可以由核酸分子编码，因此可以重组表达。
在优选的实施方案中，所述第一连接子、所述第二连接子和所述第四连接子的长度可以较短，而所述第三连接子的长度可以较长，以便为本申请的融合蛋白提供更大的柔韧性。
在优选的实施方案中，所述第三连接子可以选自(GGGS)2、(GGGS)3、(GGGS)4、(GGGS)5、(GGGGS)2、(GGGGS)3、(GGGGS)4和GSSSSSSSSSSSSSSSG，并且所述第一连接子、所述第二连接子和所述第四连接子可以各自独立地选自GGGS、GGGGS、QQQG、QQQQG、SSG和SSSSG。
在一些实施方案中，所述Fc区来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。
在一些实施方案中，所述IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区来源于人或鼠，优选地，所述Fc区来源于鼠IgG1恒定区。
在第二方面，本申请提供了一种核酸，其编码第一方面所述的融合蛋白。
在优选的实施方案中，所述核酸可以是适合在宿主细胞中表达的密码子优化的核酸。例如根据密码子的简并性，其仍然编码同样的蛋白质。根据所用宿主细胞进行密码子优化的方法是本领域技术人员公知的。
在第三方面，本申请提供了一种表达载体，其包含第二方面所述的核酸。
可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的衍生物。可用于酵母的载体的实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括以下众所周知的衍生物：SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列以及衍生自功能性哺乳动物载体(如上述那些)和功能性质粒和噬菌体DNA的组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体为本领域已知的(例如，P J. Southern&P. Berg, J. Mol.Appl. Genet, 1:327-341 (1982)；Subramani等人, Mol. Cell. Biol, 1: 854-864(1981)；Kaufinann&Sharp, "Amplification And Expression of SequencesCotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,"J. Mol. Biol, 159:601-621 (1982)；Kaufhiann&Sharp, Mol. Cell. Biol, 159:601-664 (1982)；Scahill等人, "Expression And Characterization Of The Product Of AHuman Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'lAcad. Sci USA, 80:4654-4659 (1983)；Urlaub&Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci USA,77:4216-4220, (1980)，将其全部通过引用并入本文)。
可用于本申请的表达载体含有至少一个表达控制序列，其与待表达的DNA序列或片段可操作连接。将控制序列插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母α-交配因子的启动子，以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子，例如SV40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的其它序列。
在第四方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核酸或第三方面所述的表达载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。
在第五方面，本申请提供了一种检测试剂盒，其包含第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞，以及关于如何进行所述检测的说明书。
本文所述的融合蛋白可与可检测部分结合。示例性的可检测部分包括但不限于放射性同位素例如碘 125、碘-131、铯- 137、铱192和钴60、辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素、生物素、碱性磷酸酶、化学发光剂如鲁米诺类等。本领域技术人员可以根据需要选择适合的可检测部分与本申请的融合蛋白结合，从而实现不同的检测目的。
在第六方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于检测受试者的样品中的PD-L1表达的用途。
所述受试者可以是哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。优选地，哺乳动物为非人类的灵长类或者人类。特别优选的哺乳动物是人。
此处所用的样品可以是表达PD-L1的任何样品，例如细胞、组织或器官，但是优选表达PD-L1的组织，例如肿瘤组织，因为其是用作免疫组化检测的合适样品。
在第七方面，本申请提供了第一方面所述的融合蛋白，第二方面所述的核酸，第三方面所述的表达载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于筛选是否适于施用PD-1/PD-L1抑制剂的肿瘤候选者的试剂中的用途。
肿瘤可以指良性肿瘤或恶性肿瘤，即癌症。本文使用的术语“癌症”是指由个体中的细胞的不受控制或异常生长引起的疾病状态。癌症的代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。其它实例包括但不限于胆管癌、脑癌(例如成胶质细胞瘤)、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、CNS (例如听神经瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、成血管细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜细胞瘤、成神经细胞瘤、少突神经胶质瘤、松果体瘤和视网膜母细胞瘤)、子宫内膜癌、造血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)、肾癌、喉癌、肺癌、肝癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(例如黑色素瘤和鳞状细胞癌)和甲状腺癌。癌症可以包括实体瘤(例如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)、弥漫性肿瘤(例如，白血病)或这些肿瘤的一些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。癌症也可以耐受常规治疗(例如常规化疗和/或放疗)。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容总体上描述了本申请，通过下面的实施例进一步示例本申请。描述这些实施例仅为说明本申请，而不是限制本申请的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本申请的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域常规的方法和技术。对于其它没有特别注明厂家的材料和设备等，其通常是可通过商业途径常规获得的。
实施例
在本申请的实施例中，如没有特别指明，所用的原料和试剂皆为常规的，可通过市购获得。
实施例1：靶向人PD-L1的双特异性抗体的制备
1.1 靶向人PD-L1的双特异性抗体表达载体的构建
本双特异性抗体为单一链的同二聚体，单一链包含有两种抗PD-L1抗体的轻重链序列以及小鼠IgG1抗体的Fc段，其连接顺序从N端到C端为：抗PD-L1抗体A的VL-连接子1-抗PD-L1抗体B的VH-连接子2-小鼠IgG1 Fc-连接子3-抗PD-L1抗体B的VL-连接子4-抗PD-L1抗体A的VH，结构如图1所示。单一链的核苷酸序列通过合成的方式构建进pUC57载体中，命名为preB0601载体(江苏赛索飞生物科技有限公司)。本实施例中使用的抗PD-L1抗体A采用了Atezolizumab抗体序列，抗PD-L1抗体B采用了Avelumab抗体序列，其中连接子1、连接子2和连接子4的氨基酸序列为GGGGS，并且连接子3的氨基酸序列为(GGGGS)2。
通过基因重组的方式，以preB0601链为模板，使用金牌Mix PCR试剂盒(TSINGKE公司)，按照试剂盒的说明书，扩增表达单一链的完整片段，其扩增产物大小约为2127 bp；同时以限制性内切酶BspQI (NEB，R0712L)和限制性内切酶EcoRI (NEB，R3101S)对载体质粒pQKX2 (通用生物系统(安徽)有限公司)进行酶切，将所得的PCR扩增产物和酶切载体以BM无缝克隆试剂盒(博迈德公司)，按照试剂盒的说明书，进行重组连接以获得表达载体pQKIMB0601。
PCR扩增引物对如下：
1.2靶向人PD-L1的双特异性抗体表达载体的扩增
将如上获得的表达载体pQK IMB0601转化至大肠杆菌(E.coli) TOP10中。挑取单克隆并鉴定后，在含有氨苄青霉素(终浓度为100 mg/L)的LB培养基中培养16小时，培养条件为37℃，200 rpm振荡培养。以8000×g 离心20分钟收集细菌。使用NucleoBond XtraMidi试剂盒(Macherey-nagel)，按照试剂盒的说明书，对质粒进行分离提取，以1mL的无菌超纯水进行洗脱，最后使用Nanodrop微量分光光度计测定质粒浓度。
1.3靶向人PD-L1的双特异性抗体表达载体的表达
将表达载体pQK IMB0601转染HEK293 (ATCC，编号：CRL-1573)细胞进行表达。转染前24小时，将1.5×106的HEK293细胞接种于含有100 mL OPM-293 CD05无血清培养基(奥浦迈，Cat：81075-001)的500 mL摇瓶中，培养条件为36.5℃，7.5%CO2，120 rpm悬浮培养。转染时，将重组质粒pQK IMB0601(DNA总量为100 μg)加入10 mL OPM-293 CD05培养基中，随后加入100 μL PEI(浓度为3 mg/mL)，迅速涡旋混匀，室温静止孵育15分钟。然后将该混合物加入至上述细胞培养物中。细胞在36.5℃，7.5%CO2，120 rpm/min条件下继续培养7天以收获细胞培养物。
1.4靶向人PD-L1的双特异性抗体的纯化
将收获的细胞培养物以3000×g离心20 min，收集上清并用0.45 μm过滤器过滤。用20 mM PB和150 mM NaCl的混合缓冲液(pH 7.4)平衡5 mL Protein A亲和层析柱(GE)，流速5 mL/min，体积大于5CV。将过滤后的样品液以5 mL/min流速上样。上样完成后，用20mM PB和150 mM NaCl的混合缓冲液(pH 7.4)洗涤Protein A亲和层析柱，流速5 mL/min。用50 mM柠檬酸(pH 3.0)缓冲液进行洗脱，流速5 mL/min，收集完整洗脱峰，同时用1M TrisHCl (pH 9.0)缓冲液调节收集到的洗脱液的pH至7.0左右。纯化产物经超滤管超滤，将Tris-柠檬酸缓冲液置换成商品化的PBS缓冲液。将所获蛋白用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测(图2)，可见蛋白分子量符合预期，纯度大于95%，抗体命名为IMB0601。使用Nanodrop微量分光光度计测定蛋白浓度，计算蛋白产量为43.5 mg/L。
实施例2：免疫组织化学法检测双特异性抗体与靶分子的结合
将获得的抗体IMB0601以免疫组化的方法来鉴定其结合特异性以及灵敏度。本次采用了两例肿瘤患者的病理切片作为实验对象，分别为直肠癌和十二指肠癌。
病理切片的预处理 将获得的蜡片在75℃下烘烤1h并依次浸入二甲苯-无水乙醇-75%乙醇-水，进行脱蜡和水化。经处理的病理切片放入预热至95℃的1×pH 6.0的柠檬酸缓冲液中孵育20 min；取出冷却至室温后再以1×PBS清洗3次。最后以3%的过氧化氢酶封闭液滴加在切片组织上，室温孵育15 min，进行内源性过氧化氢酶的灭活，结束后以1×PBS清洗。
实验组抗体的孵育与显色 经过预处理的病理切片先要进行封闭，在玻片上滴加5%的羊血清(来源于显色抗体的种属)，室温孵育30 min，完成封闭以1×PBS清洗后进行分组。组别如下：阴性对照组(PBS+山羊抗小鼠IgG1 Fc HRP抗体(Cell SignalingTechnology公司，货号：#96714))，阳性对照抗体组(小鼠抗人PD-L1抗体，克隆号：22C3)以及双抗组(IMB0601)。其中阳性对照抗体组的使用浓度为3mg/mL，双抗组的用量根据分子量调整为4mg/mL，分别将各组别的抗体滴加至切片组织上，并于4℃湿盒中孵育过夜。第二天以1×PBS冲洗切片3次，每次10 min，甩干切片后滴加HRP标记的二抗(山羊抗小鼠IgG1 FcHRP抗体)，室温孵育40 min。孵育完成后以1×PBS冲洗切片3次，甩干后每张切片滴加新鲜配置的DAB显色液，于显微镜下观察，阳性信号显示为肿瘤细胞膜棕褐色，以1×PBS冲洗终止显色。最后用苏木素复染1 min左右，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再淋水冲洗返蓝。
切片的脱水固定和读片 将冲洗过的切片依次放入75%乙醇(5 min)-95%乙醇(5min)-二甲苯(20 min)中脱水至透明，最后在通风橱中风干切片。将中性树胶滴在组织旁边，再盖上盖玻片，避免产生气泡。将封好的切片置于通风橱中晾干。对晾干的切片进行观察和采集图像，结果如图3所示。在消化道肿瘤组织中，阳性对照抗体(22C3)在肿瘤细胞的细胞膜处着色; 与阳性对照抗体相比，IMB0601抗体定位相同，着色比22C3深，提示IMB0601抗体灵敏度优于22C3。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请的技术方案作了详尽的描述，但在这些技术方案的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
Claims (14)
1.一种融合蛋白，其连接顺序从N端到C端为：第一抗PD-L1抗体的VL、第一连接子、第二抗PD-L1抗体的VH、第二连接子、Fc区、第三连接子、第二抗PD-L1抗体的VL、第四连接子以及第一抗PD-L1抗体的VH，其中所述第一连接子、所述第二连接子和所述第四连接子的氨基酸序列为GGGGS，所述第三连接子的氨基酸序列为(GGGGS)2，并且所述融合蛋白特异性识别人PD-L1的两种不同表位。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一抗PD-L1抗体和所述第二抗PD-L1抗体各自独立地选自以下单克隆抗体：阿替珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、尼伏单抗、潘利珠单抗、替雷利珠单抗、阿得贝利单抗、贝莫苏拜单抗、柯希利单抗、Danburstotug、多塔利单抗、Garivulimab、仑卡奈单抗和玛奈利单抗。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一抗PD-L1抗体是阿替珠单抗，并且所述第二抗PD-L1抗体是阿维单抗，或者所述第一抗PD-L1抗体是阿维单抗，并且所述第二抗PD-L1抗体是阿替珠单抗。
4.如权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述Fc区来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区来源于人或鼠。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Fc区来源于鼠IgG1恒定区。
7.一种核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白。
8.一种表达载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的表达载体。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞和PER.C6细胞。
11.一种检测试剂盒，其包含权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求9或10所述的宿主细胞，以及关于如何进行所述检测的说明书。
12.权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的表达载体或权利要求9或10所述的宿主细胞用于检测受试者的样品中的PD-L1表达的用途，所述用途为非诊断目的的。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述受试者为人。
14.如权利要求12或13所述的用途，其中所述样品为肿瘤组织。
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