KR102553195B1 - 항-cd19 항체에 대한 항-이디오타입 항체 - Google Patents

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콜린 하우스킨스
마크 디. 하이펠
클레어 엘. 서덜랜드
타허 사탈리야
제프 스미쓰
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

본원은 항-CD19 항체 모이어티, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)를 비롯하여 재조합 수용체에 존재하는 항-CD19 항체를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. 본원은 또한 예컨대 항-CD19 CAR T 세포와 같이, 이러한 재조합 수용체를 발현하는 세포들을 특이적으로 동정 및/또는 선별하는데 있어서의 항-이디오타입 항체의 용도에 관한 것이기도 하다. 본원은 그러한 세포들을 특이적으로 활성화시키기 위한 항-이디오타입 항체의 용도에도 관한다.

Description

항-CD19 항체에 대한 항-이디오타입 항체
관련 출원의 상호참조
[1] 이 출원은 2016.07.29. 자로 출원된 "항체 및 관련 방법"이라는 명칭의 미국 가특허출원 62/369에 기초한 우선권 주장 출원으로서 상기 가출원의 내용은 그 전체가 모든 목적 상 본 발명에 참조 병합되었다.
서열목록의 참조 병합
[2] 본 출원은 전자형태의 서열목록과 함께 제출된다. 서열목록은 2017.07.15. 자 생성되었고 86, 050 바이트 크기의 735042006540SeqList.TXT라는 파일명으로 제공된다. 이 전자형태의 서열목록에 담긴 정보는 그 전체가 본 발명에 참조 병합된다.
분야
[3] 본 발명은 일부 측면에서 항-CD19 항체 부분, 특히 키메라 항원 수용체 (CARs)를 비롯한, 재조합 수용체에 존재하는 항-CD19 항체를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 재조합 수용체, 예컨대 항-CD19 CAR T 세포들을 발현하는 세포를 특이적으로 동정 또는 선별하기 위한, 항-이디오타입 항체의 용도에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 또한 이러한 세포들을 특이적으로 활성화시키기 위한 항-이디오타입 항체들의 용도에도 관한다.
[4] 본 발명의 방법은 재조합 수용체, 예컨대 세포외 항체 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체 (CARs)를 발현하는 조작된 세포들을 이용하는 입야야 세포 치료법에 이용가능하다. 이러한 세포들의 시험관내 또는 대상자에서의 생체내 활성을 평가하는데 다양한 전략을 이용할 수 있다. CAR-발현 세포들의 활성을 특이적으로 평가하기 위해서는 개선된 방법이 요구된다. 본 발명에 따라 이러한 요구를 만족하는 시약, 조성물 및 제조 물품이 제공된다.
개요
[5] 본 발명에 따라 scFvs와 같은 항체 단편을 비롯한 항체들, 및 이를 함유하는 키메라 분자, 예컨대 키메라 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 제제(agents)가 제공된다. 또한 본 발명에 따라 조성물 및 고체 표면, 예컨대 플레이트 또는 비드처럼 표면에 이러한 제제가 결합되어 있는 것들도 제공된다. 본 발명에 띠라 제공된 구체예들에는, CAR-발현 세포들의 검출, 자극 또는 사용 등 항체 또는 키메라 분자를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 세포 또는 치료법의 검출, 사용, 조작 및/또는 자극 등에 있어서의 이러한 제제, 조성물 및 물품의 용도 및 방법도 제공된다.
[6] 일부 측면에서, 항체는 SJ25C1로 명명된 항체, 및/또는 그의 항원-결합 단편의 가변 영역(들)이거나 도는 이를 함유하는 표적 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 제제, 예컨대, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 함유하는 경쇄 가변 (VL) 영역; 및/또는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 함유하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 함유한다.
[7] 본 발명에 따라 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공되되, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성(및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 함유하는 VL 영역; 및/또는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성(및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 함유하는 VH 영역을 함유하는 것이다.
[8] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO:11 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 함유하거나 또는 SEQ ID NO:1에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H3을 함유하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO:14 또는 87에 제시된 아미노산 서열을 함유하거나 또는 SEQ ID NO:5에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L3을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 함유한다.
[9] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1 및 CDR-H2 서열의 아미노산 서열을 각각 함유하는 CDR-H1 및 CDR-H2를 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1 및 CDR-L2 서열의 아미노산 서열을 각각 함유하는 CDR-L1 및 CDR-L2를 함유한다.
[10] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO:9,78,79, 또는 80에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO:10, 81, 82, 또는 83에 제시된 CDR-H2, 및 SEQ ID NO:11 또는 84에 제시된 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO:12 또는 85에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO:13 또는 86에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO:14 또는 87에 제시된 CDR-L3을 함유한다.
[11] 본 발명에 따라 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열들의 아미노산 서열을 각각 함유하는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및/또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열들의 아미노산 서열을 각각 함유하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 함유하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
[12] 본 발명에 따라 SEQ ID NO: 9,78,79, 또는 80의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 10, 81, 82 또는 83의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 11 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H3; 및/또는 SEQ ID NO: 12 또는 85의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 13 또는 86의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 14 또는 87의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L3을 함유하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
[13] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 상기 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 함유하거나; 및/또는 상기 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 함유하고 상기 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다.
[14] 일부 구체예에서, 제제는 FMC63이라 명명된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 가변 영역(들)이거나 이를 함유하는 표적 항체에 특이적으로 결합하거나 및/또는 그러한 항체 단편을 함유하는 키메라 분자, 예컨대 FMC63으로부터 유래된 항체 가변 영역 또는 그의 부분, 예컨대 scFv 형태를 함유하는 결합 도메인을 갖는 CAR에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 제제, 예컨대, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 함유하는 경쇄 가변 (VL) 영역; 및/또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 함유하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 함유한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성(및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 포함하는 VL 영역; 및/또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성(및/또는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성, 또는 100% 동일성)을 포함하는 VH 영역을 함유한다.
[15] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 GYX3FX5X6YX8MX10 (SEQ ID NO: 108)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) [여기서 X3은 T 또는 S, X5는 T 또는 S, X6는 D 또는 R, X8은 Y 또는 W이고, X10은 K 또는 N임]; WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20 (SEQ ID NO: 109)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) [여기서 X4는 D 또는 M, X6는 N 또는 H, X8은 N 또는 S, X9은 N 또는 D, X10은 G 또는 S, X11은 G 또는 E, X13 은 D 또는 R, X14은 Y 또는 L, X17은 N 또는 K이고, X20는 G 또는 D임]; AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 (SEQ ID NO: 110)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) [여기서 X2는 R 또는 S, X3는 E 또는 I, X4는 G 또는 Y, X5는 N 또는 Y, X6는 N 또는 E, X7은 Y 또는 없음, X8은 G 또는 없음, X9은 S 또는 없음, X10은 R 또는 없음, X11은 D 또는 없음, X12는 A 또는 없음, X13은 M 또는 없음, X14은 D 또는 E, 및 X15은 Y 또는 A임]을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 아미노산 서열 X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY (SEQ ID NO: 111)을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1) [여기서 X1은 S 또는 R, X3는 S 또는 R, X4는 S 또는 G, X5는 G 또는 N, X6는 V 또는 I, X7은 I 또는 H, X8은 N 또는 없음, X10은 M 또는 L이고, X11은 Y 또는 A임]; 아미노산 서열 X1X2X3YX5X6X7X8LAX11 (SEQ ID NO: 112)을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) [여기서, X1은 P 또는 L, X2는 W 또는 L, X3는 I 또는 V, X5는 L 또는 N, X6는 T 또는 A, X7은 S 또는 K, X8은 N 또는 T이고, X11은 S 또는 D임]; 아미노산 서열 QX2X3X4X5X6PX8T (SEQ ID NO: 113)을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3) [여기서, X2는 Q 또는 H, X3는 W 또는 F, X4 는 S 또는 W, X5는 S 또는 W, X6는 N 또는 T이고, X8 is은 L 또는 Y임]을 함유한다.
[16] 일부 구체예에서, 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)은 SEQ ID NO: 94 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 함유하거나 또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)은 SEQ ID NO: 97 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 함유하거나 또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L3을 함유한다.
[17] 일부 구체예에서,
VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1 및 CDR-H2 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1 및 CDR-H2를 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1 및 CDR-L2 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1 및 CDR-L2를 함유한다.
[18] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103에 제시된 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 94 또는 104에 제시된 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 95 또는 105에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 96 또는 106에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 97 또는 107에 제시된 CDR-L3을 함유한다.
[19] 본 발명에 따라 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 각각 함유하는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 각각 함유하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 함유하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
[20] 본 발명에 따라 SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 94 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 SEQ ID NO: 95 또는 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 96 또는 106의 의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 97 또는 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다.
[21] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58의 아미노산 서열을 함유하고; 및/또는 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62의 아미노산 서열을 함유한다. 일부 사례에서, 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58의 아미노산 서열을 포함하고 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62의 아미노산 서열을 포함한다.
[22] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 44, 88, 89, 또는 90에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 45, 91, 92, 또는 93에 제시된 CDR-H2 및 SEQ ID NO:46 또는 94에 제시된 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 47 또는 95에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 48 또는 96에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 49 또는 97에 제시된 CDR-L3을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 65, 98, 99, 또는 100에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 66, 101, 102, 또는 103에 제시된 CDR-H2 및 SEQ ID NO:67 또는 104에 제시된 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 68 또는 105에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 69 또는 106에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 100 또는 107에 제시된 CDR-L3을 함유한다.
[23] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하는, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 40에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 함유한다.
[24] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 함유하고; 및/또는 VL 영역은 SEQ ID NO: 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 함유한다.
[25] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함한다
[26] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 단일사슬 단편이다. 일부 측면에서, 단편은 유연한(flexible) 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 단편은 scFv을 함유한다.
[27] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유하거나; 및/또는 SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유하거나; 및/또는 SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
[28] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편들은 본 발명에 기재된 어느 하나의 임의 구체예에 따른 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 특이적으로 결합된 에피토프와 동일하거나 중복된 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
[29] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 있거나 이에 포함되고; 및/또는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편들은 CAR의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 함유되거나 이에 포함되는 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 scFv이고 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR의 scFv 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
[30] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편은 키메라 항원 수용체의 세포외 부분에 함유된 항체 SJ25C1로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 항체 SJ25C1로부터 유래된 scFv는 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유하고; 및/또는 SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 임의의 그러한 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편은 키메라 항원 수용체의 세포외 부분에 포함된 항체 FMC63로부터 유래된 단일사슬 가변 단편 (scFv)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로, 항체 FMC63으로부터 유래된 scFv는 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유하고; 및/또는 SEQ ID NO : 34에 제시된 아미노산 서열을 함유한다.
[31] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편의 상보성 결정 영역 (CDR)의 전부 도는 일부 내에 존재하거나 이를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
[32] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, CAR은 스페이서를 통해 항원-결합 도메인에 연결된 막관통 도메인을 더 함유한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 선택적으로 인간 CD28인 CD28로부터의 세포외 부분을 함유한다. 일부 측면에서, CD28로부터의 세포외 부분은 SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 막관통 도메인은 선택적으로 인간 CD28인 CD28의 막관통 부분이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편은 CAR의 스페이서 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는다.
[33] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편은 선택적으로 인간 CD28이거나, 선택적으로 CD28의 세포외 부분을 함유하거나, 선택적으로 SEQ ID NO: 27에 제시된 아미노산 서열을 함유하는, CD28 또는 그의 부분에 결합하지 않거나 특이적으로 결합하지 않는다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편은 선택적으로 인간 IgG1 Fc 도메인인 Fc 도메인 내 에피토프에 결합하지 않는다.
[34] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 CD19에 특이적으로 결합한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 선택적으로 다른 CAR의 세포외 항원-결합 도메인이거나 이에 함유된 다른 항-CD19 항체와 교차 반응하지 않는다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 다른 CAR과 교차 반응하지 않는다.
[35] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 CAR의 작용제(agonist) 항체이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체 또는 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 CAR의 길항제(antagonist)이다.
[36] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화된 것이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 재조합이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 모노클로날이다.
[37] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 항원-결합 단편은 단편 항원 결합 (Fab) 단편들, F(ab') 2단편들, Fab' 단편들, Fv 단편들, 단일사슬 가변 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체로부터 선별된다.
[38] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분을 함유한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분은 Fc 영역 또는 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 Fc의 일부분을 함유한다. 일부 측면에서, 불변 영역은 인간 IgG로부터 유래한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 무손상(intact) 항체 또는 전장(full-length) 항체이다.
[39] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 전술한 임의의 구체예들 중 한가지에 따른 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 함유하는 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 구체예에서, 이종 분자 또는 모이어티는 표지(label)이다. 일부 측면에서, 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 크로모포어, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩타이드, 효소, 스트렙타비딘, 바이오틴, 발광 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드로부터 선별된다. 경우에 따라, 이종 분자 또는 모이어티는 선택적으로 독소인 Strep-Tag이거나 이를 함유하는 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 소분자이다.
[40] 일부 구체예에서, 본원에 기재된 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자(들)이 제공된다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 (i) SEQ ID NO: 15에 기재된 중쇄 가변 영역, (ii) SEQ ID NO: 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열; 및/또는 (iv) SEQ ID NO: 19에 제시된 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열, (v) SEQ ID NO: 19에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.
[41] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 핵산 분자는 (i) SEQ ID NO:17에 제시된 중쇄, (ii) SEQ ID NO:17에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열; 및/또는 (iv) SEQ ID NO:21에 제시된 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, (v) SEQ ID NO:21에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다.
[42] 일부 구체예에서, 핵산 분자는 (i) SEQ ID NO: 50 또는 71에 제시된 중쇄 가변 영역, (ii) SEQ ID NO: 50 또는 71에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하거나; 및/또는 (iv) SEQ ID NO: 54 또는 75에 제시된 경쇄 가변 영역, (v) SEQ ID NO: 54 또는 75에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 (i) SEQ ID NO: 52 또는 73에 제시된 중쇄, (ii) SEQ ID NO: 52 또는 73에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하거나; 및/또는 (iv) SEQ ID NO: 56 또는 76에 제시된 경쇄, (v) SEQ ID NO: 56 또는 76에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 시그널 서열을 함유한다.
[43] 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 핵산 분자를 함유하는 벡터가 제공된다. 또한 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 핵산 분자를 함유하는 세포도 제공된다.
[44] 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 핵산 분자에 의해 인코딩된 중쇄 및/또는 경쇄 또는 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키고 항체를 회수 또는 단리하는 것을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 방법은 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 세포를 중쇄 및/또는 경쇄가 발현되는 조건 하에서 배양하고 항체를 회수 또는 단리하는 것을 포함한다. 또한, 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 방법에 의해 제조된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편도 제공된다.
[45] 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 컨쥬게이트, 또는 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 세포를 함유하는 조성물이 제공된다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다.
[46] 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 컨쥬게이트, 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예에 따른 핵산 중 하나 이상, 및 선택적으로 사용 설명서를 함유하는 키트가 제공된다. 일부 사례에서, 키트는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 컨쥬게이트를 고정하기 위한 지지체 또는 시약을 더 함유하며, 여기서 상기 시약 또는 지지체는 비드, 컬럼, 마이크로웰, 스틱, 필터, 스트립 또는 가용성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약이다.
[47] 본원은 또한 항-이디오타입 항체들과 같은 제공된 임의의 제제를 이용하는 검출 방법도 제공한다. 일부 구체예에서, 본원은 (a) 표적 항체 (예컨대 항체 SJ25C1으로부터, 또는 항체 FMC63으로부터, 또는 이러한 항체들의 항원-결합 단편으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 것)를 함유하는 조성물을 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체를 검출하거나 및/또는 표적 항체 또는 제제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 이를 함유하는 CAR을 검출하는 방법을 제공한다.
[48] 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 항체 FMC63 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 조성물을 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는, 본원에서 설명된 임의의 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및 (b) 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체를 검출하거나 및/또는 표적 항체 또는 제제의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
[49] 일부 측면에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 세포에 결합되거나 세포 표면에서 발현되며 단계 (b)에서의 검출은 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들을 검출하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 세포는 그 표면에서 표적 항체 또는 표적 항원-결합 단편을 함유하는 CAR을 발현한다.
[50] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 FMC63 또는 SJ25C로부터 유도된 가변 도메인을 함유하는 CAR과 같은, 임의 구체예들의 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 CAR을 검출하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 (a) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를, 본원에 설명된 임의 구체예에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 본원에 설명된 임의 구체예에 따른 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-이디오타입 항체와 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-이디오타입 항체에 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출을 위해 직간접적으로 표지된다.
[51] 일부 구체예에서, 본원은 (a) 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체에 결합된 세포를 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 단계; 및 (b) 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들을 선별하는 단계를 포함하는, 세포 집단으로부터 세포들을 선별하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체에 결합된 세포를, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 항체는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 것인 단계; 및 (b) 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들을 선별하는 단계를 포함한다.
[52] 일부 사례에서, 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들은 친화성-기반 분리법에 의해 선별된다. 일부 측면에서, 친화성-기반 분리법는 면역친화성-기반 분리법이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 친화성-기반 분리법는 유세포 계측법에 의한다. 일부 구체예에서, 친화성-기반 분리법는 자기 활성화된 세포 소팅법에 의한다. 일부 측면에서, 친화성-기반 분리법는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체는 지지체 또는 고정상에 가역적으로 결합되거나 고정된다.
[53] 본원은 또한 항-이디오타입 항체에 의해 인식되는 표적 항체이거나 이를 함유하는 CAR과 같은 분자를 함유하는 세포들을 자극하는 것과 같이, 세포들을 상기 제제를 이용하여 자극하는 방법도 제공한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포들을 함유하는 인풋 조성물을, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션함으로써, 자극된 세포들을 함유하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포들을 함유하는 인풋 조성물을, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션함으로써, 자극된 세포들을 함유하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것을 포함한다.
[54] 일부 구체예에서, 상기 방법은 항-Id 항체에 의해 인식되는 CAR과 같은 키메라 수용체를 발현하는 세포들의 증식, 활성화, 자극, 사이토카인 방출, 또는 다른 기능적 결과 에컨대 활성화 마커의 상향조절 또는 사이토카인 방출 또는 생성을 초래한다. 일부 측면에서, 이러한 증식 또는 기타 기능적인 반응 또는 판독(readout)은 이러한 세포들에서, 상기 세포들을 어떤 제제와 함께 인큐베이션함으로써 유도되거나 및/또는 항-CD3/CD28 비드 및/또는 가교된 항-CD3과 같은, T 세포들의 증식을 자극하는 조건에 의해 유도되는 것과 비슷하거나 더 큰 정도로 유도된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 항-이디오타입 항체의 가교를 포함하지 않는다. 임의 구체예들의 일부 측면에서, 항-이디오타입 제제는 항-이디오타입 항체의 가교 없이, 명시된 증식 또는 기능적 결과나 그러한 정도를 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 본원의 항-이디오타입 제제는 항-Id 항체를 가교시키거나 제2의 제제의 사용을 필요로 함이 없이, T 세포들 또는 표적 수용체를 발현하는 기타 면역 세포들을 자극하거나 이들의 특정 기능을 도출하는 능력이 있다는 점에서 유리하다. 일부 측면에서, 이러한 결과는 항-이디오타입 항체의 가용성 형태 또는 플레이트-결합 형태에서 달성된다. 일부 측면에서, 상기 결과는 비드에 커플링된 항-이디오타입 항체에서 달성된다.
[55] 일부 구체예에서, 본원은 (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입함으로써, 인풋 조성물을 생성하는 단계; 및 (b) CAR의 항원 수용체에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 상기 인풋 조성물을 인큐베이션함으로써 세포 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법을 제공한다.
[56] 일부 측면에서, CAR은 CD19에 특이적으로 결합하는 표적 항체를 함유한다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 경우에서, 표적 항체는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나의 항체 FMC63인 표적 항체에 특이적으로 결합한다.
[57] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 단계 (a)에서의 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 일렉트로포레이션, 또는 화학적 형질감염에 의해 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 단계 (a)에서의 도입은 핵산 분자를 함유하는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 형질도입에 의해 세포에 핵산 분자를 도입하는 것을 포함하되, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 측면에서, 단계 (a)에서의 도입은 핵산 분자를 함유하는 트랜스포존을 이용하여 전위에 의해 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 단계 (a)에서의 도입은 핵산 분자를 함유하는 벡터의 일렉트로포레이션 또는 형질감염에 의해 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 것을 포함한다.
[58] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 상기 방법은 단계 (a)에 앞서 세포를 활성화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 측면에서, 세포를 활성화시키는 상기 단계는 세포를 CD3의 작용제 및 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 사례에서, 세포의 활성화 단계는 세포들을 길항적 항-CD3 및 항-CD28 항체들를 함유하는 시약과 접촉시키는 것을 포함한다.
[59] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 CAR에 결합함으로써 인풋 조성물 내 하나 이상의 세포에서 시그널을 유도 또는 변조하는 조건 하에서 인큐베이션이 수행된다. 이러한 임의의 구체예에서, 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 사례에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
[60] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 고상 지지체에 고정되는데 이 고상 지지체는 선택적으로, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 부위를 복수개 함유하는 시약을 함유하거나 이에 컨쥬게이트된다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 시약에 고정되는데, 이 가용성 시약은 선택적으로, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합할 수 있는 복수개의 결합 부위이거나 또는 이를 함유하는 것이다. 일부 측면에서, 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 함유한다.
[61] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 인큐베이션은 적어도 또는 약 적어도 5분, 10분, 30분, 60분,2시간, 6시간, 12시간,24시간, 36, 48시간,72시간 또는 96시간 수행된다.
[62] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 인풋 조성물은 조성물 내 총 세포에 대한 백분율로서, 약 60% 미만 (번역자 주: 본 명세서에서 "약"이라는 표현은 그 다음에 나오는 숫자 자체도 포함하는 것으로 한다, 예를 들어 약 60%에는 60%도 포함되는 것으로 한다), 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 또는 약 10% 미만의 CAR-발현 세포들을 함유한다.
[63] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 수는 인풋 조성물은 조성물 내 CAR-발현 세포의 수에 비해 1.2배, 1.5배,2.0배, 3.0배, 4.0배,5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하거나; 및/또는 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 백분율은 조성물 내 총 세포에 비해 10%,20%, 40%,50%, 60%,70%, 80% 또는 그 이상 증가한다.
[64] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 도입 및/또는 인큐베이션 전에 세포들은 CAR-발현 세포들에 대해 선별되거나 농축(enriched)되지 않는다.
[65] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:24에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다.
[66] 일부 구체예에서, 본원은 (a) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 조성물을 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 또는 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-이디오타입 항체를 함유하는 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 정제 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 (a) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 조성물을 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 또는 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-이디오타입 항체를 함유하는 복합체를 단리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 정제 방법을 제공한다.
[67] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체를 함유하는 복합체는 친화성-기반 분리법에 의해 단리된다. 일부 측면에서, 친화성-기반 분리법은 면역친화성-기반 분리법이다. 일부 사례에서, 친화성-기반 분리법은 자성-기반 분리법이다. 일부 구체예에서, 친화성-기반 분리법은 친화성 크로마토그래피를 포함한다
[68] 일부 구체예에서, 본원은 (a) 가용화 모이어티에 융합된 표적 항체의 항원-결합 단편을 함유하는 가용성 면역화 시약을 대상자에게 도입하는 단계; 및 (b) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는, 대상자로부터의 항체를 동정하는 단계를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 방법을 제공한다.
[69] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항원-결합 단편은 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 단일사슬 단편이다. 일부 측면에서, 항원-결합 단편은 scFv이다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 이에 포함된다.
[70] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 가용화 모이어티는 Fc 도메인 또는 그의 단편이며, 선택적으로 인간 IgG1 Fc이다. 일부 측면에서, 가용화 모이어티는 힌지 영역이 결여된 Fc 도메인이다. 일부 사례에서, 가용화 모이어티는 SEQ ID NO: 32에 제시된 아미노산 서열을 함유한다.
[71] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항체를 동정하는 것은 (i) 대상자의 비장으로부터 B 세포를 단리하고 이를 불멸화 B 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하는 단계; (ii) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 생성 여부에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계; 및 (iii) 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 항체를 시퀀싱함으로써 항-이디오타입 항체를 동정하는 단계를 포함한다.
[72] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체는 CD19에 결합한다. 일부 구체예에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1로부터 유래하되, 선택적으로 여기서 표적 항체의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1으로부터 유래하는 단일사슬 가변 단편 (scFv)이며, 선택적으로 상기 scFv는 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 FMC63으로부터 유래하며, 선택적으로 상기 표적 항체의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다. 일부 구체예에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 FMC63으로부터 유래하는 단일사슬 가변 단편 (scFv)이고, 선택적으로 상기 scFv는 SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열을 함유한다.
[73] 일부 구체예에서, 본원은 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 다른 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포들의 고갈 방법을 제공하며, 여기서 상기 대상자는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 세포가 투여된 바 있는 대상자이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 대상자에게, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 따른 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 구체예 중 어느 하나에 다른 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하되 여기서 상기 대상자는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 세포가 투여된 바 있는 대상자이다. 일부 구체예에서, 상기 고갈은 항체-의존성 세포-매개형 세포독성(ADCC)을 통해 일어난다.
[74] 본원은 (a) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 CAR에 의해 조작된 세포들을 포함하는 세포요법이 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플을 결합 시약과 접촉시키되, 결합 시약에 결합하는 샘플로부터의 분자와 상기 결합 시약을 함유하는 복합체가 형성되는 조건 하에서 접촉시키는 단계로서, 상기 결합 시약은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 복합체의 존재 또는 부재를 탐지함으로써 CAR에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 양성 대조군 샘플에 대해 수행하고, 선택적으로 양성 대조군과 비교하여 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 양성 대조군 샘플은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 본원에 설명된 임의의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에 설명된 임의의 컨쥬게이트을 함유하는 것이다.
[75] 본원은 (a) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 CAR에 의해 조작된 세포들을 포함하는 세포요법이 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플을 결합 시약과 접촉시키되, 결합 시약에 결합하는 샘플로부터의 분자와 상기 결합 시약을 함유하는 복합체가 형성되는 조건 하에서 접촉시키는 단계로서, 상기 결합 시약은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 CAR의 세포외 도메인 또는 세포외 도메인의 일부를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 복합체의 존재 또는 부재를 탐지함으로써 CAR에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 양성 대조군 샘플에 대해 수행하고, 선택적으로 양성 대조군과 비교하여 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 양성 대조군 샘플은 본원에 설명된 임의의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는, 본원에 설명된 임의의 컨쥬게이트을 함유하는 것이다.
[76] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 결합 시약에 결합하는 분자는 항체이거나 하체를 함유한다. 일부 구체예에서, 결합 시약은 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있다. 일부 사례에서, 결합 시약은 고체 지지체에 결합되거나 또는 가용성이다.
[77] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 복합체는 면역분석법에 의해 검출된다. 일부 예에서, 면역분석법은 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 화학발광 분석법, 전자화학발광 분석법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 바이오센서 (예컨대, BIAcore), 유세포 계측법, 또는 웨스턴 블롯이다. 일부 구체예에서, 면역분석법은 중간 규모(meso scale)의 발견을 포함한다. 일부 경우에서, 면역분석법은 샌드위치 분석법 또는 브릿지 분석법이다.
[78] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 복합체의 존재 또는 부재를 검출 또는 탐지하는 것은: (i) 단계 (a)에서 형성된 복합체를 제2 결합 시약과 접촉시키되, 여기서 상기 제2 결합 시약은 (1) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 함유하고, (2) 검출가능한 시그널을 생성할 수 있거나 또는 검출가능하게 표지된 것인 접촉 단계; 및 (ii) 검출가능한 시그널의 존재 또는 부재를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 제1 결합 시약은 고체 지지체에 결합되며, 여기서 상기 제1 결합 시약은 바이오틴에 직접 또는 간접적으로 연결되거나 및/또는 스트렙타비딘을 통해 고체 지지체에 결합되며; 및/또는 제2 결합 시약은 가용성이다. 일부 경우에서, 제1 및 제2 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부는 동일하다.
[79] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 검출가능한 표지는 형광 표지, 화학발광 표지, 전자발광 표지, 비색계 표지, 생물발광 표지 또는 방사성표지이거나 또는 이들을 함유하고; 및/또는 검출가능한 시그널은 형광시그널, 화학발광 시그널, 전자발광 시그널, 비색계 시그널, 생물발광 시그널 또는 방사성 시그널이거나 또는 이들을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 검출가능한 표지는 SULFO-TAG이거나 또는 이를 함유한다.
[80] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 단일사슬 단편이다. 일부 구체예에서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 scFv이다.
[81] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 샘플은 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함한다.
[82] 본원은 본원에 설명된 임의의 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에 설명된 임의의 컨쥬게이트, 및 SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하거나; 세포 집단으로부터, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 조작된 세포들을 선별 또는 농축하거나; SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 자극하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 제조 물품을 제공한다.
[83] 본원은 본원에 설명된 임의의 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에 설명된 임의의 컨쥬게이트, 및 FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하거나; 세포 집단으로부터, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 조작된 세포들을 선별 또는 농축하거나; FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 자극하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 제조 물품을 제공한다.
[84] 본원은 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인을 포함하되, 상기 세포외 도메인 또는 그의 일부는 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 것인 결합 시약; 및 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본원에 설명된 임의의 컨쥬게이트를 함유하는 제조 물품을 제공한다. 일부 구체예에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 제조 물품은 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 함유하는 제2 결합 시약을 더 포함한다.
[85] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 제1 및 제2 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부는 동일하다.
[86] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 제조 물품은 면역분석법을 이용하여 결합 시약에 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위한 결합 시약, 선택적으로 제1 및 제2 결합 시약의 사용 설명서를 추가로 포함하되, 여기서 선택적으로 상기 면역분석법은 브릿지 또는 샌드위치 면역분석법이고, 선택적으로 상기 샘플은 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 CAR에 의해 조작된 세포를 포함하는 세포 요법이 이전에 투여된 바 있는 대상자로부터 유래한 것이다.
[87] 본원은 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인을 함유하는 결합 시약 (상기 세포외 도메인 또는 그의 일부는 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유함); 및 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본원에 설명된 컨쥬게이트를 포함하는 제조 물품을 제공한다.
[88] 일부 구체예에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 제조 물품은 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 함유하는 제2 결합 시약을 더 함유한다. 일부 측면에서, 제1 및 제2 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부는 동일하다.
[89] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 제조 물품은 면역분석법을 이용하여 결합 시약에 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위한 결합 시약, 선택적으로 제1 및 제2 결합 시약의 사용 설명서를 추가로 포함하되, 여기서 선택적으로 상기 면역분석법은 브릿지 또는 샌드위치 면역분석법이고, 선택적으로 상기 샘플은 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 CAR에 의해 조작된 세포를 포함하는 세포 요법이 이전에 투여된 바 있는 대상자로부터 유래한 것이다.
[90] 일부 구체예에서, 결합 시약, 선택적으로 제1 및/또는 제2 결합 시약은 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 고체 지지체에 부착되거나 또는 고체 지지체에 부착될 수 있고 제1 및 제2 결합 시약 중 또 다른 하나는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있거나 검출가능한 표지이다. 일부 구체예에서, 제조 물품은 고체 지지체를 더 포함하되, 여기서 선택적으로 제1 및 제2 결합 시약 중 어느 하나는 바이오틴에 직접 또는 간접적으로 연결되고 고체 지지체는 스트렙타비딘-코팅된 표면을 포함한다.
[91] 도 1은 SJ25C1-유래된 CAR에 의해 조작된 Jurkat 세포에서의 Erk1/2 인산화를 자극하는, SJ25C1-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 클론 A-1 (항-ID A-1)의 기능 활성을 평가하기 위한 유세포 계측 결과를 나타낸다. 항-CD3 항체에 의한 활성화는 양성 대조군으로서 포함되었다. 비자극 또는 이소타입 대조군 자극 세포들은 음성 대조군으로서 포함되었다.
[92] 도 2A-B는 SJ25C1-유래된 결합 도메인(도 2A) 또는 FMC63-유래된 결합 도메인 (도 2B)을 함유하는 CAR을 발현하는 T 세포의 즈식에 대한 분석 결과를 나타낸 도면으로서, 평가는 항-CD3 항체 (OKT3), 항-ID A-1, 또는 항-ID B-1항-이디오타입 항체로 자극한 후 유세포 계측법을 이용한 염료 희석에 의해 이루어졌다. 자극되지 않은 세포들은 음성 대조군으로서 포함되었다.
[93] 도 2C는 CAR의 결합 도메인을 인식하는 플레이트-결합된 항-이디오타입 항체에 의한 자극 존재하에서의 배양 후 T 세포의 CAR 형질도입된 경우와 모의 형질도입된 경우의 증식에 대한 분석 결과를 나타낸 도면으로서 평가는 유세포 계측법을 이용한 염료 희석에 의해 이루어졌다.
[94] 도 3은 플레이트-결합된 항-CD3 항체 (OKT3), 항-ID A-1 또는 항-ID B-1으로 자극한 후 유세포 게측법으로 평가되는 바와 같이 SJ25C1으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+T 세포들에서 T 세포 활성화의 두 가지 마커인 CD69 및 CD25 발현의 평가 결과를 나타낸 도면이다.
[95] 도 4는 플레이트-결합된 항-CD3 항체 (OKT3), 항-ID A-1 또는 항-ID B-1, 또는 음성 대조군인 비-표적 항-이디오타입 항체로 자극 후 유세포 게측법으로 평가되는 바와 같이 FMC63로부터 유래된 가변 영역을 갖는 결합 도메인을 함유하는 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+T 세포들에서 T 세포 활성화의 두 가지 마커인 CD69 및 CD25 발현의 평가 결과를 나타낸 도면이다. 자극되지 않은 세포들은 음성 대조군으로서 포함시켰다.
[96] 도 5는 양성 대조군으로서, 일정 범위의 농도에서 CAR 결합 도메인을 인식하는 항-ID B-1 및 항-ID B-2 항체들을 이용하여 항-CAR 항체들을 검출하기 위한 브릿지 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
[97] 도 6 및 도 7은 사이토카인 존재 또는 부재 하에서 표시된 비율의 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1)로 코팅된 비드 또는 대조군 CD3/CD28 항체 코팅된 비드에 의해 각각 자극된 EGFRt+/CD4+ T 세포들 또는 EGFRt+/CD8+ T 세포들의 폴드 팽창 및 누적 세포수를 나타낸 도면이다.
[98] 도 8은 사이토카인 존재 또는 부재 하에서 표시된 비율의 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1)로 코팅된 비드 또는 대조군 CD3/CD28 항체 코팅된 비드에 의해 자극된 후의, 항-EGFR 항체 염색에 양성인 따라서 형질도입 마커 EGFR에 양성인 CD4+ T 세포의 PD-1 발현 수준을 나타낸 도면으로서 평가는 배양 제3, 7, 10 및 14일에서 유세포 계측법에 의해 이루어졌다.
[99] 도 9는 사이토카인 존재 또는 부재 하에서 표시된 비율의 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1)로 코팅된 비드 또는 대조군 CD3/CD28 항체 코팅된 비드에 의해 자극된 후 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들의 생존능을 나타낸 도면이다. 평가는 배양 제3, 7, 10 및 14일에서 유세포 계측법에 의해 이루어졌다.
[100] 도 10A는 FMC63-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1) 코팅된 비드로 자극된 후 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 T 세포들의 IL-2, TNFα, 및 IFNγ에 대한 세포내 사이토카인 염색을 나타낸 도면이다. 도면은 EGFRt 대리 형질도입 마커 (EGFR+ 또는 EGFRt-)에 대해 양성 또는 음성인 CD8+ T 세포들의 결과를 보여준다.
[101] 도 10B는 항원-발현 K562-CD19 세포로 자극된 후 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 T 세포들의 IL-2, TNFα, 및 IFNγ에 대한 세포내 사이토카인 염색을 나타낸 도면이다. 도면은 CAR 발현에 대한 대체물로서 항-EGFR 항체에 양성인 CD8+ T 세포들의 결과를 나타낸다.
[102] 도 11은 사이토카인 존재 또는 부재 하에서 표시된 비율의 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1)로 코팅된 비드 또는 대조군 항-CD3/항-CD28 항체 코팅된 비드로 자극 후 FMC63-유래된 scFv-유래된 CAR을 발현하는 T 세포들의 14일간의 배양 기간 후 연속 자극 분석법에서의 집단 배가(doubling) 수를 나타낸 도면이다. 도면은 EGFRt 대리 형질도입 마커 (EGFRt+/CD4+)에 대해 양성인인 CD8+ T 세포 또는 EGFRt (EGFRt+/CD8+)에 대해 양성인 CD8+ T 세포에 대한 결과를 보여준다.
[103] 도 12A-12C는 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들을 단독으로 또는 공동-배양체로 하여, FMC63-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1) 코팅된 비드로 자극한 후의 결과를 나타낸 도면이다. 결과를 두 명의 상이한 공여자에 대해 나타내었다. 도 12A는 EGFRt 대리 형질도입 마커 (EGFRt +/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+)에 대해 양성인 배양체 중의 CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포들의 폴드 팽창을 나타낸다. 도 12B는 EGFRt (EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt +/CD8+)에 양성인 배양체 중의 CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포들의 빈도를 나타낸다. 도 12C는 배양체 내 CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포들의 생존능을 나타낸다.
[104] 도 13A 및 13B는 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들 (단독 또는 공동-배양체로서 배양됨)을 FMC63-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1) 코팅된 비드로 자극한 후 배양 제5일, 제7일, 및 제9일에서의 T 세포 표면 마커에 대한 유세포 계측 결과를 나타낸 도면이다. 도 13A는 EGFRt 대리 형질도입 마커 (EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+)에 양성인 배양체 중의 CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포 상에서의 PD-1 표면 발현을 나타낸다. 도 13B는 CAR 발현에 대한 대체물로서 항-EGFR 항체에 양성인 (EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+) 배양체 중의 CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포 상에서의 CD25의 표면 발현을 나타낸다.
[105] 도 14A는 CD19 발현 K562 세포 또는 PMA/이오노마이신과 함께 배양체에서 팽창된 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 T 세포를 함유하는 해동된 조성물에 존재하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들의 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같은 TNFα, IFNγ, 및 IL-2의 세포내 사이토카인 수준을 나타낸 도면이다. 도면은 해동시(제0일) 또는 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드 존재 하에 9일간 추가 배양된 경우 단독 또는 공동-배양체로서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 내의 사이토카인 수준을 나타낸다.
[106] 도 14B는 CD19 발현 K562 세포 또는 PMA/이오노마이신과 함께 배양시 팽창된 FMC63-유래된 CAR을 발현하는 T 세포를 함유하는 해동된 조성물에 존재하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들 중 유세포 계측법에 따라 평가한 CD25 또는 Ki67에 대해 양성인 세포들의 빈도를 나타낸 도면이다. 도면은 해동시(제0일) 또는 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드 존재 하에 9일간 추가 배양된 경우 단독 또는 공동-배양체로서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 내의 마커 수준을 나타낸다.
[107] 도 15A 및 15B는 항-EGFR 항체 또는 FMC63-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체들 (항-ID B-1 및 항-ID B-2)로 세포를 염색한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 15A는 상이한 농도의 항체들로 염색된 세포들의 평균 형광 강도를 나타낸 그래프이다. 세포들은 PBMCs 및 CAR 발현 세포들의 혼합물을 포함하였다. 도 15B는 상이한 농도의 항체들로 염색된 세포들에서 검출된 FMC63-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1)에서 CAR 발현 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 세포들은 PBMCs과 CAR 발현 세포들의 혼합물 및 PBMCs 단독을 포함하였다.
상세한 설명
[108] 본원은 항-CD19 항체 모이어티 (예컨대, 키메라 항원 수용체를 비롯한 재조합 수용체에 존재하는 항-CD19 항체 모이어티)를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체들 및 항원-결합 단편들 (예컨대, scFv를 비롯한 단일사슬 단편들)과 같은 제제를 제공한다. 본원은 또한 표적 항체들 또는 단편들 예컨대 항-CD19 CAR T 세포를 발현하거나 포함하는 세포들을 특이적으로 동정, 선별, 및/또는 자극 및/또는 활성화하기 위한 것을 포함하는, 이러한 제제를 포함하는 제조 물품과 조성물 및 이의 용도 및 사용방법도 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 항체들은 세포 표면에서 결합되거나 발현되는 CAR과 같은 다양한 항-CD19 CAR의 특이적인 동정 및/또는 선별에 사용될 수 있고, CAR T 세포와 같은 표적 CAR을 발현하는 세포들을 특이적으로 활성화시키는데도 이용가능하다. 일부 구체예에서, 본원은 SJ25C1 또는 FMC63이라 명명된 항-CD19 항체에 특이적인 항체, 또는 그로부터 유래한 항체 단편을 제공하며, 여기에는 항체 및 그러한 항체로부터 유래된 가변 영역을 함유하는 CAR, 및/또는 이디오토프를 함유하는 항체가 포함된다.
[109] 일부 측면에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 CAR, 및 특히 항-CD19 항체 scFv 세포외 도메인을 함유하는 CAR 또는 인식된 이디오타입을 함유하는 것을 발현하는 세포들을 검출, 동정, 조작 및/또는 영향 및/또는 조작하는데 있어서 종래 시약에 비해 유리하다. 이용가능한 특정 방법에서 샘플 내 CAR 또는 CAR-발현 세포들 (및/또는 CAR의 자극 또는 조작)의 존재 또는 부재 또는 양을 검출하는 것은 대체(surrogate) 분자, 예컨대 CAR을 인코딩함으로 해서, 그의 발현에 대한 간접 마커 또는 대체 마커 기능을 하는 구조물에 포함된 것과 같은 대체 분자의 존재 또는 부재 또는 그의 양을 평가함으로써 수행된다. 이용가능한 특정 방법에서, 항원 결합 영역 이외의 유사한 또는 동일한 도메인을 가질 수 있는 다른 CAR과 비교하여, 평가 된 특정 CAR에 특이적이지 않은 일반 항체 시약 및/또는 시약을 사용하여 검출이 수행된다; 예를 들어, 그러한 항체는 CAR 도메인이 유래한 종으로부터의 스페이서 또는 다른 도메인을 인식하는 항-종(항-species) 항체, 및/또는 표적의 스페이서 영역 및 다른 키메라 수용체에서도 사용되는 특정 성분을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. CAR의 존재 또는 부재를 검출하도록 고안된 특정한 이용가능한 방법에서, 검출은 CAR 불변 영역을 인식하는 제제를 사용하여 수행된다. 이용가능한 특정 방법에서, CAR 세포들은 항-CD3/CD28 인식 제제와 같은 일반적인 시약을 이용하여 자극된다. 특정한 방법은 CAR의 재조합 리간드(예컨대, CD19-Fc)를 이용한다. 어떤 맥락에서 이러한 방법들은 전적으로 만족스럽지 않을 수 있고 및/또는 어떤 한계를 가질 수 있다. 일부 경우에서, CAR 리간드, 예컨대 CD19는 예컨대 복합 유세포 계측 패널에서의 사용시, 항상 완전히 효과적이지 않을 수 있다. 개선된 감도 및/또는 선별성을 제공하는 것들을 포함하여, 개선된 방법과 제제가 요구되고 있다. 본원은 이러한 요구를 만족하는 구체예들을 제공한다.
[110] 제공된 항-이디오타입 항체들 및 항원-결합 단편들은 일부 구체예에서
표적 항체 리간드와 연관된 낮은 결합 친화성 및 표적 항체 불변 영역에 지향된 항체 시약과 연관된 비-특이적 결합의 문제점을 극복하여, 그의 표적 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 높은 친화성과 특이성 두 가지 모두를 구비한 시약을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 항체들은 그들의 표적 항체들 또는 항원-결합 단편들, 예컨대 SJ25C1 또는 FMC63이라 명명된 항-CD19 항체에 대해, CAR을 검출 또는 동정하는데 현재 이용가능한 다른 시약 및 CD19-Fc에 비해 더 높은 특이성과 결합 친화성을 나타낸다.
[111] 뿐만 아니라, 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체들 및 항원-결합 단편들은 그의 표적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 수용체의 작용제 또는 길항제로서 선별될 수 있고 선별적 검출, 단리, 절제(제거) 및/또는 고갈 (예를 들어, 항체-의존성 세포-매개형 세포독성, ADCC를 통한 살상) 및/또는 그의 표면에 결합되거나 발현되는 이러한 키메라 수용체를 갖는 세포의 자극 또는 활성화를 가능케 한다. 본원은 SJ25C1 또는 FMC63이라 명명된 항-CD19 항체로부터 유래된 세포외 결합 도메인을 함유하는 CAR을 자극, 예컨대 활성화하는 능력을 나타내는 항-이디오타입 항체 작용제를 제공한다. 일부 측면에서, 이러한 항체들은 CAR-발현 세포들의 생성 및 제조 과정을 포함하여, 특이적인 CAR-발현 세포를 자극 및 확장하는 방법에 이용될 수 있다.
[112] 본원은 제공된 항-이디오타입 항체 및 단편을 인코딩하는 핵산, 및 세포들, 이들 항-이디오타입 항체 및 단편을 발현하거나 생산하는 세포, 예컨대 재조합 세포도 제공한다. 본원은 또한 항-이디오타입 항체 및 단편을 제조 및 사용하기 위한 방법, 및 항-이디오타입 항체 및 단편을 발현 또는 함유하는 세포도 제공한다.
[113] 본원에 언급된 특허 문헌, 과학 기사 및 데이터베이스를 비롯한 모든 간행물은 각각의 간행물이 개별적으로 참고 문헌으로 인용된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다. 본원에 제시된 정의가 본원에서 참고 문헌으로 인용된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공보에 기재된 정의와 상반되거나 달리 불일치하는 경우, 본원에 기재된 정의가 본원에 참고로 인용 된 정의에 우선한다.
[114] 본 명세서에 사용된 섹션 표제는 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
I. 항- 이디오타입 항체들
[115] 일부 측면에서 본원은 표적 항-CD19 항체 모이어티를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체들 또는 항원-결합 단편들 ("항-IDs")과 같은, 결합 분자들을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 항체들은 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체 또는 항원-결합 단편인 표적 항-CD19 항체를 인식한다. 일부 구체예에서, 제공된 항체들은 제공된 항체들은 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 FMC63으로부터 유래된 항체 또는 항원-결합 단편인 표적 항-CD19 항체를 인식한다.
[116] SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및-16 세포들에 대해 생성된 마우스 모노클로날 IgG1 항체이다 (Ling, N. R. , et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). SJ25C1 항체는 각각 SEQ ID NOS: 114-116에 제시된 CDRH1, H2 및 H3, 그리고 각각 SEQ ID NOS: 117-119에 제시된 CDRL1, L2 및 L3 서열을 포함한다. SJ25C1 항체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)과 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
[117] 일부 구체예에서, 표적 항체는 SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체이다. 일부 구체예에서, SJ25C1로부터 유래된 항체는 SJ25C1의 VH 및/또는 VL, SJ25C1의 이디오타입, SJ25C1의 파라토프, 또는 SJ25C1의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SEQ ID NO:23에 제시된 SJ25C1의 VH, 또는 SEQ ID NO:23에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체, 및/또는 SEQ ID NO:24에 제시된 SJ25C1의 VL, 또는 SEQ ID NO:24에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SEQ ID NO:23에 제시된 SJ25C1의 VH, 또는 SEQ ID NO:23에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체와 SEQ ID NO:24에 제시된 SJ25C1의 VL, 또는 SEQ ID NO:24에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24에 각각 제시된 SJ25C1 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:23 및/또는 SEQ ID NO:24에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
[118] 일부 구체예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SEQ ID NO:23에 제시된 SJ25C1 VH의 하나 이상의 중쇄 CDRs (CDR-H), 예컨대 SEQ ID NOS: 114-116에 제시된 것 및/또는 SEQ ID NO:24에 제시된 SJ25C1 VL의 하나 이상의 경쇄 CDRs (CDR-Ls), 예컨대 SEQ ID NOS: 117-119에 제시된 것을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 CDR-H3(예컨대 SEQ ID NO: 116에 제시됨) 및/또는 SJ25C1의 CDR-L3(예컨대 SEQ ID NO: 119에 제시됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 CDR-H3 및 CDR-L3 (예컨대 SEQ ID NO:116 및 119에 각각 제시됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SJ25C1의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 (예컨대 SEQ ID NOs: 114, 115, 116에 각각 제시됨) 중 하나 이상 및/또는 SJ25C1의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 (예컨대 SEQ ID NOs: 117, 118, 119에 각각 제시됨) 중 하나 이상을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SJ25C1의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 (예컨대 SEQ ID NOs: 114, 115, ,116에 각각 제시됨) 및/또는 SJ25C1의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 (예컨대 SEQ ID NOs: 117, 118, 119에 각각 제시됨)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SJ25C1의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 (예컨대 SEQ ID NOs: 114, 115, 116에 각각 제시됨) 및 SJ25C1의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 (예컨대 SEQ ID NOs: 117, 118, 119에 각각 제시됨)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항원-결합 단편, 예를 들어 단편 항원-결합 (Fab), F(ab')2, Fab', 단편 가변부 (Fv), 또는 단일사슬 Fv (scFv)를 포함한다. [참조: 예컨대 Bejcek, B. E., et al. (1995). Cancer research. 　55(11): 2346-2351].
[119] FMC63은 인간 기원의 CD19를 발현하는 JVM3세포들에 대해 생성된 마우스 모노클로날 IgG1 항체이다 (Nicholsonet al. (1997). Molecular Immunology. 34(16-17): 1157-1165). FMC63 항체는 SEQ ID NOS: 120-122에 각각 제시된 CDRH1, H2 및 H3과 SEQ ID NOS: 123-125에 각각 제시된 CDRL1, L2 및 L3 서열을 포함한다. FMC63 항체는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 SEQ ID NO: 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
[120] 일부 구체예에서, 표적 항체는 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래된 항체이다. 일부 구체예에서, FMC63으로부터 유래된 항체는 FMC63의 VH 및/또는 VL, FMC63의 이디오타입, FMC63의 파라토프, 또는 FMC63의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, FMC63 또는 FMC63으로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SEQ ID NO:30에 제시된 FMC63의 VH, 또는 SEQ ID NO:30에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체, 및/또는 SEQ ID NO:31에 제시된 FMC63의 VL, 또는 SEQ ID NO:31에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, FMC63 또는 FMC63으로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SEQ ID NO:30에 제시된 FMC63의 VH, 또는 SEQ ID NO:30에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체와 SEQ ID NO:31에 제시된 FMC63의 VL, 또는 SEQ ID NO:31에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31에 각각 제시된 FMC63 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:30 및/또는 SEQ ID NO:31에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
[121] 일부 구체예에서, 일부 구체예에서, FMC63 또는 FMC63으로부터 유래된 항체인 표적 항체는 SEQ ID NO:30에 제시된 FMC63 VH의 하나 이상의 중쇄 CDRs (CDR-H), 예컨대 SEQ ID NOS: 120-122에 제시된 것 및/또는 SEQ ID NO:31에 제시된 FMC63 VL의 하나 이상의 경쇄 CDRs (CDR-Ls), 예컨대 SEQ ID NOS: 123-125에 제시된 것을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FMC63의 CDR-H3(예컨대 SEQ ID NO: 122에 제시됨) 및/또는 FMC63의 CDR-L3(예컨대 SEQ ID NO: 125에 제시됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FMC63의 CDR-H3 (예컨대 SEQ ID NO:122에 제시됨)및 CDR-L3 (예컨대 SEQ ID NO: 125에 제시됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FMC63의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 (SEQ ID NOs: 120, 121, 122에 각각 제시됨) 중 하나 이상 및/또는 FMC63의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 (SEQ ID NOs: 123, 124, 125에 각각 제시됨) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FMC63의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 (SEQ ID NOs: 120, 121, 122에 각각 제시됨) 및/또는 FMC63의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 (SEQ ID NOs: 123, 124, 125에 각각 제시됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FMC63의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 (SEQ ID NOs: 120, 121, 122에 각각 제시됨) 및 FMC63의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 (SEQ ID NOs: 123, 124, 125에 각각 제시됨)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항원-결합 단편, 예를 들어 단편 항원-결합 (Fab), F(ab')2, Fab', 단편 가변부 (Fv), 또는 단일사슬 Fv (scFv)를 포함한다.
[122] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 SJ25C1 또는 FMC63로부터 유래된 단일사슬 Fv (scFv)과 같은, 가변 도메인 (Fv)에 특이적으로 결합하는 항체들을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체들은 Fv의 에피토프 또는 영역, 일반적으로 에피토프 또는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체들은 에피토프 또는 Fv 파라토프와 중복되는 영역에 특이적으로 결합한다.
[123] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 표적 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인의 일부로서 함유된 SJ25C1 또는 FMC63으로부터 유래된 항-CD19 모이어티에 특이적으로 결합하는 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 CAR은 SJ25C1 또는 FMC63 항체 분자 또는 SJ25C1 또는 FMC63 항체의 항원-결합 단편 또는 일부분을 함유하는 항원-결합 부분을 함유한다. 일부 구체예에서, 표적 CAR은 항체 SJ25C1 또는 FMC63의 VH 및 VL 사슬로부터 유래된 scFv인 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 SJ25C1 또는 FMC63으로부터 유래된 scFv를 함유하는 항-CD19 CAR에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체가 제공된다. CAR의 예시적인 특징들은 이하에 후술한다.
[124] 본원에서 용어 "항체"는 최광의로 사용되며 여기에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체들, 예컨대 무손상 항체들 및 기능적(항원-결합) 항체 단편들, 예컨대 단편 항원 결합 (Fab) 단편들, F(ab') 2단편들, Fab' 단편들, Fv 단편들, 재조합 IgG (rIgG) 단편들, 단일사슬 항체 단편들, 예를 들어 단일사슬 가변 단편들 (scFv), 및 단일 도메인 항체들 (예컨대, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편들이 포함된다. 이 용어는 유전자 조작되거나 및/도는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체들, 완전한 인간 항체들, 인간화된 항체들, 및 헤테로컨쥬게이트 항체들, 다중특이, 예컨대, 이중 특이 항체들, 다이아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탄뎀 디-scFv, 탄뎀 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급하지 않는 한 용어 "항체"는 그의 기능적 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 임의의 클래스 또는 서브-클래스의 항체, 예컨대 IgG 및 그의 서브-클래서, IgM, IgE, IgA, 및 IgD 등 무손상 또는 전장 항체들도 포괄한다.
[125] 용어 "항-이디오타입 항체"는 항원-결합 단편과 같은 항체의 이디오토프(idiotopes)를 특이적으로 인식하거나, 이에 특이적으로 표적화되거나, 및/또는 특이적으로 결합하는, 항원-결합 단편을 비롯한 항체를 가리킨다. 항체의 이디오토프는 그 항체의 상보성 결정 영역(들) (CDRs) 중 하나 이상, 그 항체의 가변 영역 및/또는 그러한 가변 영역 및/또는 CDR의 부분적 일부 또는 일부 내의 잔기 및/또는 전술한 것들의 조합을 포함할 수 있으나 반드시 이들로 한정되는 것은 아니다. CDR은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3으로 이루어진 군으로부터 선별되는 하나 이상일 수 있다. 항체의 가변 영역은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합일 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 부분적인 단편 또는 일부분은 단편들은 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내 2 이상,5 이상, 또는 10 이상의 인접(contiguous) 아미노산, 예컨대, 약 2 내지 약 100, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 2 내지 약 50, 약 5 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50개의 인접 아미노산을 포함하는 단편들일 수 있고; 이디오토프는 복수개의 인접하지 않은 아미노산 범위(stretches)를 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 부분적 단편들은 가변 영역 내 2 이상,5 이상, 또는 10 이상의 인접 아미노산들, 예컨대, 약 2 내지 약 100, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 2 내지 약 50, 약 5 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50개의 인접 아미노산들을 포함하는 단편들일 수 있고, 일부 구체예에서 하나 이상의 CDR 또는 CDR 단편들을 포함한다. CDR 단편들은 CDR 내에서 연속적 또는 비-연속적인 2 이상, 또는 5 이상의 아미노산일 수 있다. 그러므로, 항체의 이디오토프는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내에서 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 CDR 단편들을 함유하는 약 2 내지 약 100, 약 5 내지 약 100, 약 10 내지 약 100, 약 2 내지 약 50, 약 5 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50개의 인접 아미노산들일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이디오토프는 항체의 가변 영역, 예컨대, CDR 부위에 위치하는 단일 아미노산일 수도 있다.
[126] 일부 구체예에서, 이디오토프는 항체의 가변 부분 내에 위치하는 임의의 단일 항원 결정인자 또는 에피토프이다. 일부 사례에서 이것은 항체의 실제 항원-결합 부위와 중복될 수 있고, 일부 경우 항체의 항원-결합 부위 외부의 가변 영역 서열들을 포함할 수도 있다. 항체의 개별적인 이디오토프 세트는 일부 구체예에서 이러한 항체의 "이디오타입(idiotype)"이라 칭해진다.
[ 127] "초가변 영역(hypervariable region)" 또는 "HVR"과 동의어인 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)," 및 "CDR"이라는 용어는 기술 분야에서, 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하는, 항체 가변 영역 내에서 아미노산의 비-인접(non-contiguous) 서열을 가리키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDRs (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 존재하며 각각의 경쇄 가변 영역에도 3개의 CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 존재한다. "프레임워크 영역(Framework regions)" 및 "FR"은 기술 분야에서 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 가리키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 전장(full-length) 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및 FR-H4)이 있고, 각각의 전장 경쇄 가변 영역에도 4개의 FR (FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4)이 있다.
[0128] 주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 하기 문헌에 설명된 공지의 방법을 이용함으로써 쉽게 결정가능하다: Kabat 외 (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 방식), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 넘버링 방식), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262,732-745." ("Contact" 넘버링 방식), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol,2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" 넘버링 방식), 및 Honegger A and Plueckthun A, "Yet another 넘버링 방식 for immunoglobulin variable domains: automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol,2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" 넘버링 방식).
[0129] 주어진 CDR 또는 FR의 경계는 서열을 동정하는데 사용된 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 방식은 구조 정렬에 기반하는 반면, Chothia 방식은 구조 정보에 기반한다. Kabat 방식과 Chothia 방식 양자 모두의 넘버링은 가장 흔한 항체 영역 서열 길이에 기반하되, 예컨대 "30a"과 같은 삽입 문자 및 몇몇 항체에 나타나는 결실을 표시한다. 이들 2 가지 방식은 상이한 위치에 삽입 및 결실("indels")를 나타내므로, 결과적으로 상이한 넘버링이 결과된다. Contact 방식은 복잡한 결정 구조 분석에 기반하며 여러 측면에서 Chothia 넘버링 방식과 유사하다.
[0130] 하기 표 1은, 각각 Kabat, Chothia, 및 Contact 방식에 의해 동정된 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 나타낸 것이다. CDR-H1의 경우, 잔기 넘버링이 Kabat 및 Chothia 넘버링 방식 양자 모두를 이용하여 나타나있다. FRs은 CDRs 사이에 위치하며, 예를 들어, FR-L1은 CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치하는 형식이다. 나타낸 Kabat 넘버링 방식은 H35A 및 H35B에서 삽입을 나타내므로, 나타낸 Kabat 넘버링 변환을 이용하여 넘버링할 경우, Chothia CDR-H1 루프의 말단은, 루프 길이에 따라, H32와 H34 사이에서 변한다.
Figure 112019032556139-pct00001
[131] 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그의 영역, 예를 들면 그의 가변 영역의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역," 또는 개별적으로 명시된 CDRs (예컨대, "CDR-H1, CDR-H2)은 여하한 전술한 방식에 의해 정의된 상보성 결정 영역(또는 특이적인 상보성 결정 영역)을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR (예컨대, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열에서 대응하는 CDR의 아미노산을 함유한다고 언급되는 경우, 이러한 CDR은 전술한 여하한 방식으로 정의되는 바와 같이, 가변 영역 내 대응하는 CDR (예컨대, CDR-H3)의 서열을 갖는 것으로 이해된다. 일부 구체예에서, 명시된 CDR 서열이 명시된다.
[132] 마찬가지로, 달리 언급되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그의 영역, 예를 들면 그의 가변 영역의 FR 또는 개별적인 특정된 FR(들) (예컨대, FR-H1, FR-H2)은 상기 여하한 공지 방식에 의해 정의되는 프레임워크(또는 특정 프레임워크) 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 몇몇 경우, 특정 CDR, FR, 또는 FRs 또는 CDRs의 동정을 위한 방식이 명시된다. 예를 들면 CDR은 Kabat, Chothia, 또는 Contact 방법으로 명시된다. 또 다른 경우, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 주어진다.
[133] "가변 영역(variable 영역)" 또는 "가변 도메인(가변 도메인)"이라는 용어는 항원에 대한 항체 결합과 연관된 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 가리킨다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 CDRs을 포함하는 각 도메인과 유사한 구조를 갖는다. [예컨대, Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman 및 Co., page 91 (2007) 참조]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 뿐만 아니라, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. [예컨대, Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991) 참조]
[134] 제공된 항체에는 항체 단편들이 포함된다. An "항체 단편"이라 함은 무손상(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 가리킨다. 항체 단편들의 비제한적인 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예컨대 scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이 항체를 들 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예를 들면 scFvs을 포함하는 단일-사슬 항체 단편들이다
[135] 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다.
[136] 항체 단편은 다양한 기술에 의해 만들 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 무손상 항체의 단백질 가수분해 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산법을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 재조합적으로-생산된 단편, 예컨대 자연발생되지 않는 배열을 포함하는 단편, 예컨대 펩타이드 링커와 같은 합성 링커에 의해 연결된 두 개 이상의 항체 영역 또는 사살을 갖는 것들, 및/또는 자연발생적인 무손상 항체의 효소 절단에 의해 제조될 수 없는 것들이다. 몇몇 측면에서, 항체 단편은 scFvs이다.
[137] "인간화(humanized)" 항체는 모든 또는 실제로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래하고 모든 또는 실제로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 일부 구체예에서, 비-인간 항체, 예컨대, 쥐 항체의 인간화된 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체들이다. 특정 구체예에서, 인간화된 항체들은 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 인간 면역글로불린분자로부터의 프레임워크 영역 (FR)를 갖는 비-인간 종으로부터의 항체들이다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 "인간화 형태"라 함은, 친(親: parental) 비인간 항체의 특이성과 친화성을 유지하는 한편, 일반적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 수행된 비인간 항체의 변이체를 가리킨다. 일부 구체예에서는, 예컨대 항체 특이성 또는 친화성을 복구 또는 개선시키기 위해, 인간화 항체 중의 몇몇 FR 잔기들을 비인간 항체(예컨대 CDR 잔기가 유래된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환시킨다 (참조: 예컨대, Queen, 미국특허 No. 5,585,089 및 Winter, 미국특허 No. 5,225,539.). 이러한 키메라 인간화된 모노클로날 항체들은 기술 분야에 공지인 재조합 DNA 기술에 의해 제조가능하다.
[138] 특정 구체예에서, 인간화된 항체는 수혜자의 중쇄 가변 영역으로부터의 잔기들이, 바람직한 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류 등의 비-인간 종(공여자 항체)의 중쇄 가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체들은 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 인간 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열은 인간(수용자) 서열의 하나 이상의 CDR 서열을 비인간 항체 서열 (공여자 서열) 내의 각 CDR을 인코딩하는 서열로 대체시킴으로써 변형된다. 일부 구체예에서, 인간 수용자 서열은 상이한 유전자들로부터 유래한 FR을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 인간화된 항체는 모든 또는 실제로 모든 초가변 루프들이 비-인간 면역글로불린의 그것에 상응하고, 모든 또는 실제로 모든 FR들이 인간 면역글로불린 서열의 그것인, 적어도 한 개, 및 전형적으로 두 개의 가변 도메인들을 실제로 모두 함유할 것이다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가 상세에 관해서는, 예컨대 문헌[Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al. , Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)]을 참조할 수 있다. 또한, 예컨대 문헌 [Vaswani 및 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.1:105-115 (1998) ; Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995) ; Hurle 및 Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994) ; 및 미국특허 Nos. 6,982,321 및 7,087,409, 본원에 참조 병합됨]도 참조할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원은 인간화된 항-이디오타입 항체들을 제공한다.
[139] 특정 구체예에서, 항체, 예컨대, 항-이디오타입 항체는 인간화된다. 특정 구체예에서, 항체는 적절한 임의의 공지 수단에 의해 인간화된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 비-인간 소스로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 인간화된 항체에 도입될 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입(import)" 잔기라 칭해지며, 이들은 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 특정 구체예에서, 인간화는 예컨대 인간 항체의 대응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써, 기본적으로 다음의 Winter 및 공동 연구자의 방법에 의해 수행될 수 있다 (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536). 따라서, 이러한 "인간화된" 항체들은 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 No. 4,816, 567). 특정 구체예에서, 인간화 항체는 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
[140] 전장 항체를 인코딩하는 서열은 렌더링된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 인간 불변 중쇄 및 불변 경쇄 영역에 결합시킴으로써 연속적으로 수득할 수있다. 적합한 인간 불변 경쇄 서열은 카파 및 람다 불변 경쇄 서열을 포함한다. 적합한 인간 불변 중쇄 서열은 IgG1, IgG2 및 렌더링된 면역-자극 성질을 갖는 IgG1 돌연변이체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 이러한 돌연변이체는 보체 및/또는 항체 의존성 세포 세포독성을 활성화시키는 능력이 감소될 수 있으며, 미국특허 No. 5,624,821; WO 99/58572, 미국특허 No. 6,737,056에 설명되어 있다. 적절한 불변 중쇄는 또한 치환체 E233P, L234V, L235A, A327G, A330S, P331S를 갖고 잔기 236이 결실된 IgG1도 포함한다. 또 다른 구체예에서, 전장 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM, IgY 또는 IgW를 포함한다
[141] 적절한 인간 공여자 서열은 마우스 공여자 서열에 의해 인코딩된 펩타이드 서열과 인간 서열 그룹, 바람직하게는 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 또는 성숙한 항체 유전자에 의해 인코딩된 서열을 서열 비교함으로써 결정될 수 있다. 서열 상동성이 높은, 바람직하게는 결정된 가장 높은 상동성을 갖는 인간 서열은 인간화 프로세스의 수용자 서열로서 작용할 수 있다.
[142] 마우스 CDR에 대한 인간 CDR의 교환에 더해, 인간 공여자 서열에서 추가 조작을 수행하여 최적화된 특성 (예컨대 항원의 친화성)을 갖는 인간화 항체를 인코딩하는 서열을 수득할 수 있다.
[143] 또한, 변형된 인간 수용자 항체 가변 도메인 서열은 비-인간 공여자 서열에 상응하는 중쇄 가변 영역의 2, 4, 36, 39, 43, 45, 69,70,74,75,76, 78, 92 및 경쇄 가변 영역의 위치 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69,73, 85, 98 중 하나 이상의 아미노산 (Kabat 번호 부여 시스템에 따름)을 인코딩하도록 렌더링될 수 있다 (Carter and Presta, 미국특허 No. 6,407,213).
[144] 특정 구체예에서, 항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질을 유지하면서 인간화되는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 일부 구체예에서, 인간화 항체들은 부모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용 가능하며 당업자에게 익숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 배열 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능, 즉 후보 면역글로불린이 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석에서 잔기의 가능한 역할의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수혜자 서열 및 수입 서열로부터 선별되고 결합되어, 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성을 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기들은 항원 결합에 영향을 미치는데 있어 직접적으로 그리고 실질적으로 관련된다.
[145] 특정 구체예에서, 인간화 항체를 제조하는데 사용되는 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선별은 항원성을 감소시키는데 있어 중요할 수 있다. 소위 "최적" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열이 알려진 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서 설치류 동물과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체의 인간 프레임워크로서 받아들여진다. 예를 들어, 문헌 [Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 : 2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196 : 901] 참조. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러가지 인간화 항체에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623] 참조.
[146] 본 발명에 따라 제공된 항체에는 인간 항체가 있다. "인간 항체(human antibody)"는 인간 항체 라이브러리를 비롯하여, 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 인간 또는 인간 세포, 또는 비-인간 소스에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 한편, 예를 들면 모든 또는 실제로 모든 CDRs이 비-인간인, 비-인간 항원-결합 영역들을 포함하는 비-인간 항체의 인간화 형태는 이 용어로부터 배제된다.
[0147] 인간 항체는 항원 챌린지에 응답하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 이러한 동물들은 일반적으로 내인성 면역글로불린을 대체하는 인간 면역글로불린 위치, 또는 그 동물의 염색체 내로 무작위 통합되거나 염색체외에 존재하는 인간 면역글로불린 위치의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 내인성 면역글로불린 위치는 일반적으로 불활성화되어 있다. 인간 항체는 또한 인간 레퍼토리로부터 유래된 항체-인코딩 서열을 함유하는, 파지 디스플레이 및 무세포 라이브러리를 비롯한 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수도 있다.
[0148] 제공된 항체 중에는 모노클로날 항체 단편들을 비롯한 모노클로날 항체가 포함된다. 본 발명에서 "모노클로날 항체"라 함은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 또는 그 집단에서 수득되는 항체를 가리키며, 즉, 상기 집단에 포함되는 개별적인 항체들은 자연발생적인 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제 생산시 발생하는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량 존재한다. 일반적으로 상이한 에피토프들에 지향된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 모노클로날 항체 각각은 어떤 항원 상의 단일 에피토프에 대해 지향되어 있다. 이 용어는 어떤 특정항 방법으로 항체를 생산한 것을 요구하는 것으로 추정되는 것은 아니다. 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 및 기타 항체 디스플레이 방법과 같은 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있으나 이들 방법으로 한정되지 않는다.
A. SJ25C1 -유도된 항체들
[149] 일부 구체예에서, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 이로부터 유래된 표적 항-CD19 항체에 특이적인 항-이디오타입 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1-유래된 scFv에 특이적이다.
[150] 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
[151] 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NO: 11 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) 및/또는 SEQ ID NO: 1에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열에 함유된 CDR-H3을 함유하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
[152] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 9,78,79 또는 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) 및/또는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H1; 및/또는 SEQ ID NO : 10, 81, 82 또는 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) 및/또는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H2를 포함한다.
[153] 본원은 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공하며, 여기서 상기 CDR-H1은 SEQ ID NO: 9,78,79, 또는 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 10, 81, 82, 또는 83에 제시된 아미노산 서열을 포함하며; 및/또는 CDR-H3은 SEQ ID NO: 11 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NO: 9,78,79, 또는 80에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1; SEQ ID NO:10, 81, 82, 또는 83에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO: 11 또는 84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[154] 본원은 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[155] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4 각각에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 함유한다.
[156] 이러한 임의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
[157] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄만으로, VH-만으로 이루어지거나, 및/또는 VL 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하지 않거나 및/또는 항-이디오타입 항체 또는 단편의 항원-결합 부위는 중쇄만으로부터의 잔기를 포함하거나 및/또는 경쇄로부터의 잔기를 포함하지 않는다.
[158] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은경쇄 가변 (VL) 영역을 함유하지 않고, CDR-L1, CDR-L2, 및/또는 CDR-L3을 함유하지 않거나, 및/또는 VH 영역만을 함유하는 단일-도메인 항체 (sdAb)이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 전술한 임의의 것으로부터의 VH 영역만을 함유하는 sdAb이다.
[159] 전술한 임의의 VH 영역 서열을 함유하는 항-이디오타입 항체들 또는 단편들의 임의의 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 경쇄 가변 (VL) 영역을 더 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, VL영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
[160] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO:14 또는 87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO:14 또는 87에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다
[161] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 12 또는 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 및/또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID NO: 13 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및/또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2를 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 12 또는 85에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 및/또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID NO: 13 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및/또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2을 포함한다.
[162] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 12 또는 85에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1; SEQ ID NO: 13 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO: 14 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L3을 포함한다.
[163] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다.
[164] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4를 포함한다. 일부 구체예에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VL 영역은 에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4 각각에 대해 적어도 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 포함한다.
[165] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
[166] 본원은 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열; 및/또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 경쇄 가변 (VL) 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다.
[167] 본원은 SEQ ID NOs: 1 및 5 각각에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[168] 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NOs: 1 및 5각각에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[169] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 및 VL 영역은 SEQ ID NOs: 1 및 5의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
[170] 일부 구체예에서, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적인 항-이디오타입 항체는 단일-사슬 항체 단편, 예컨대 scFv 또는 다이아바디이다. 일부 구체예에서, 단일-사슬 항체는 예컨대 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL)과 같이 두 개의 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 링커를 하나 이상 포함한다. 링커는 일반적으로 펩타이드 링커, 예컨대, 유연한 및/또는 가용성 펩타이드 링커이다. 링커들 중에는 글리신 및 세린이 풍부하거나 및/또는 일부 경우 쓰레오닌이 풍부한 것들이 있다. 일부 구체예에서, 링커는 가용성을 향상시킬 수 있는 리신 및/또는 글루타메이트와 같은 하전된 잔기들을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 하나 이상의 프롤린을 더 포함한다.
[171] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 무손상 항체 또는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항-ID는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 하나 이상의 불변 영역 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 경쇄 불변 영역 (CL) 및/또는 중쇄 불변 영역 1 (CH1)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-ID는 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예컨대 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 인간 IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 2 또는 그의 일부 또는 SEQ ID NO: 26에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그의 일부에 제시된 CH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO:6 또는 그의 일부 또는 SEQ ID NO:6에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그의 일부에 제시된 CL 도메인을 포함한다.
[172] 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO:3에 제시된 중쇄 서열 또는 SEQ ID NO:3에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 및/또는 SEQ ID NO:7에 제시된 경쇄 서열 또는 SEQ ID NO:7에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO:3에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO:7에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 시그널 펩타이드를 더 포함한다. 일부 경우에서, 시그널 펩타이드는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO: 8에 제시된 서열을 갖는다.
[173] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 단편 항원 결합 (Fab) 단편들, F(ab') 2단편들, Fab' 단편들, Fv 단편들, 단일사슬 가변 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선별된다.
[174] 따라서, 본원은 전형적으로 VH 및 VL 도메인과 같은 2 개의 항-이디오타입 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 링커(들)을 포함하는, 단일-사슬 항체 단편들, 예컨대 scFvs 및 다이아바디, 특히 인간 단일-사슬 단편들을 제공한다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예컨대, 유연한 및/또는 가용성 펩타이드 링커, 예컨대 글리신과 세린이 풍부한 링커이다.
[175] 일부 측면에서, 글리신과 세린 (및/또는 쓰레오닌)이 풍부한 링커는 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 이러한 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들은 적어도 또는 약 50%,55%, 60%,70%, 또는 75%, 글리신, 세린, 및/또는 쓰레오닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 실질적으로 완전히 글리신, 세린, 및/또는 쓰레오닌으로 이루어진다. 링커는 일반적으로 길이가 약 5 내지 약 50 아미노산, 전형적으로 약 10 내지 약 30, 예컨대, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29, 또는 30개의 아미노산, 및 일부 예에서 10 내지 25개의 아미노산 길이를 갖는다. 예시적인 링커에는 서열 GGGS (3GS; SEQ ID NO: 29) 또는 GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 26)의 다양한 수의 반복물, 예를 들면 이러한 서열의 2, 3, 4, 내지 5개 반복물을 갖는 링커가 포함된다. 예시적인 링커에는 SEQ ID NO: 25 (GGGGSGGGGSGGGGS)에 제시된 서열을 갖거나 이 서열로 이루어진 것들이 포함된다. 예시적인 링커는 또한 SEQ ID NO: 33 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG)에 제시된 서열을 갖거나 이 서열로 구성된 것들을 추가로 포함한다.
[176] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체들은 단리된 항체들을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-ID는 인간화, 재조합, 및/또는 모노클로날이다. 일부 구체예에서, 항-ID는 인간이다.
[177] 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체는 인간화된다. 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체의 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기는 항 SJ25C1비-인간 CDR로부터 유래된다. 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
[178] 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 수혜자의 중쇄 가변 영역으로부터의 잔기들이 SJ25C1에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 중쇄 가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)을 포함한다.일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 상이한 유전자들로부터 유래된 FR을 함유한다. 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는, 일반적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 함유한다.
[179] 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 비-인간 공여자 서열에 대응하는 중쇄 가변 영역의 2, 4, 36, 39, 43, 45, ,69,70,74,75,76, 78, 92(Kabat) 및 경쇄 가변 영역의 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69,73, 85, 98 (Kabat) 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 인코딩하도록 렌더링된 변형된 인간 수용자 항체 가변 도메인 서열을 함유한다.
[180] 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체는 인간화된다. 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SJ25C1에 특이적인 비-인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역 중 하나 이상을 함유한다. 일부 구체예에서, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역의 전부 또는 일부는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 변형은 비인간 아미노산 잔기를 인간 잔기로 대체하는 것이다. 특정 구체예에서, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상이 인간 항체의 FR 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3은 각각 SEQ ID NOs: 1 및 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역의 CDR들이다. 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 모두가 인간 항체의 FR 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, CDR 및 FR 영역은 Kabat, Chothia, AbM, 및/또는 및 Contact 방식에 의해 동정되는 영역들이다.
[181] 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 전부는 인간 항체의 프레임워크 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체이다. 특정 구체예에서, 인간 항체는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 서브클래스, 예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2 중 하나이다. 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 전부는 인간 항체로부터의 것이거나 인간 항체로부터 유래된 항원 결합 영역의 프레임워크 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, 항원 결합 단편은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체로부터의 것이거나 및/또는 그로부터 유래된다. 인간 면역글로불린들의 여러가지 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있으며 에컨대 문헌 [Abbas et al. Cellular 및 Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.,2000)]에 설명되어 있다. 일부 구체예에서, 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 공유 또는 비공유적으로 연계된 인간 항체에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
[182] 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 모두는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 갖는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 프레임워크 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 함유한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 하나 이상의 변형, 예컨대 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예컨대 치환, 삽입 또는 결실)을 갖는다. 이러한 변형은 예컨대 반감기 향상, 1 이상의 유형의 Fc 수용체에 대한 결합 변경, 및/또는 이펙터 기능 변경을 위해 행할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 Fc 영역은 변형되지 않은 Fc 영역의 FcαR에 비해 FcαR에 대한 결합을 변경(예컨대 감소)시켰다. 특정 구체예에서, 인간화된 항-이디오타입 항체는 변형되지 않은 Fc 영역의 그것과 비교하여 Fc 수용체에 대한 변경된 (예를 들어, 감소된) 결합을 갖는 변형된 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합을 변경시키는 Fc 변형의 비제한적 예로는, 예컨대, 미국특허 Nos. 7,217,797 및 7,732,570; 및 미국특허출원 Nos. US 2010/0143254 및 2010/0143254에 설명된 것들을 들 수 있다.
[183] 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 132에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 133에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 특정 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 134에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 135에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 일부 구체예에서, SJ25C1에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 136에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 137에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다
B. FMC63 -유도된 항체들
[184] 일부 구체예에서, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 이로부터 유래된 표적 항-CD19 항체에 특이적인 항-이디오타입 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 FMC63-유래된 scFv에 특이적이다.
[185] 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
[186] 일부 구체예에서, 본원은 GYX3FX5X6YX8MX10 (SEQ ID NO: 108)의 아미노산 서열 [여기서 X3는 T 또는 S, X5는 T 또는 S, X6는 D 또는 R, X8은 Y 또는 W, 및 X10은 K 또는 N임]을 함유하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1)을 갖는 VH 영역; 및/또는 WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20 (SEQ ID NO: 109)의 아미노산 서열 [여기서 X4는 D 또는 M, X6는 N 또는 H, X8은 N 또는 S, X9은 N 또는 D, X10은 G 또는 S, X11은 G 또는 E, X13은 D 또는 R, X14은 Y 또는 L, X17은 N 또는 K, 및 X20는 G 또는 D임]중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2); 및/또는 AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 (SEQ ID NO: 110)의 아미노산 서열 [여기서 X2는 R 또는 S, X3는 E 또는 I, X4는 G 또는 Y, X5는 N 또는 Y, X6는 N 또는 E, X7은 Y 또는 없음, X8은 G 또는 없음, X9은 S 또는 없음, X10은 R 또는 없음, X11은 D 또는 없음, X12는 A 또는 없음, X13은 M 또는 없음, X14은 D 또는 E, 및 X15은 Y 또는 A임]중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하는 항체들 또는 항원-결합 단편들을 제공한다.
[187] 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NO: 46, 67, 94 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) 및/또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 중쇄 가변 (VH) 서열에 함유된 CDR-H3을 함유하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
[188] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) 및/또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H1; 및/또는 SEQ ID NO : 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) 및/또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H2를 포함한다.
[189] 본원은 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공하며, 여기서 상기 CDR-H1은 SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 포함하며; 및/또는 CDR-H3은 SEQ ID NO: 46, 67, 94 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1; SEQ ID NO: 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2; 및 SEQ ID NO: 46, 67, 94 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[190] 본원은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1), CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[191] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NOS: 44, 88, 89 또는 90에 제시된 CDR-H1; SEQ ID NOS: 45, 91, 92 또는 93에 제시된 CDR-H2; 및/또는 SEQ ID NO: 46 또는 94에 제시된 CDR-H3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 65, ,98, 99 또는 100에 제시된 CDR-H1; SEQ ID NO: 66, 101, 102 또는 103에 제시된 CDR-H2; 및/또는 SEQ ID NO: 67 또는 104에 제시된 CDR-H3을 각각 포함한다.
[192] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4 각각에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 함유한다.
[193] 이러한 임의 구체예들의 일부에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
[194] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄만으로, VH-만으로 이루어지거나, 및/또는 VL 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하지 않거나 및/또는 항-이디오타입 항체 또는 단편의 항원-결합 부위는 중쇄만으로부터의 잔기를 포함하거나 및/또는 경쇄로부터의 잔기를 포함하지 않는다.
[195] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은경쇄 가변 (VL) 영역을 함유하지 않고, CDR-L1, CDR-L2, 및/또는 CDR-L3을 함유하지 않거나, 및/또는 VH 영역만을 함유하는 단일-도메인 항체 (sdAb)이다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 전술한 임의의 것으로부터의 VH 영역만을 함유하는 sdAb이다.
[196] 전술한 임의의 VH 영역 서열을 함유하는 항-이디오타입 항체들 또는 단편들의 임의의 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 경쇄 가변 (VL) 영역을 더 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, VL영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성, 예컨대 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
[197] 일부 구체예에서, 본원은 X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY (SEQ ID NO: 111)의 아미노산 서열 [여기서 X1은 S 또는 R, X3는 S 또는 R, X4는 S 또는 G, X5는 G 또는 N, X6 는 V 또는 I, X7은 I 또는 H, X8은 N 또는 없음, X10은 M 또는 L, 및 X11은 Y 또는 A임]을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1); 및/또는 X1X2X3YX5X6X7X8LAX11 (SEQ ID NO: 112)의 아미노산 서열 [여기서 X1은 P 또는 L, X2는 W 또는 L, X3는 I 또는 V, X5는 L 또는 N, X6는 T 또는 A, X7은 S 또는 K, X8은 N 또는 T, 및 X11은 S 또는 D임]을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2); 및/또는 QX2X3X4X5X6PX8T (SEQ ID NO: 113)의 아미노산 서열 [여기서 X2는 Q 또는 H, X3는 W 또는 F, X4는 S 또는 W, X5는 S 또는 W, X6는 N 또는 T, 및 X8은 L 또는 Y임]을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[198] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 49, 97, 70 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 49, 97, 70 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함한다
[199] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 47, 68, 95 또는 105에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID NO: 48, 69, 96 또는 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2를 포함한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 47, 68, 95, 또는 105에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID NO: 48, 69, 96 또는 106에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2), 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2을 포함한다.
[200] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 47, 68, 95 또는 105에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1; SEQ ID NO: 48, 69, 96 또는 106에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO: 49, 97, 70 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L3을 포함한다.
[201] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다.
[202] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NOS: 47 또는 95에 제시된 CDR-L1; SEQ ID NOS: 48 또는 96에 제시된 CDR-L2; 및/또는 SEQ ID NO: 49 또는 97에 제시된 CDR-L3을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 68 또는 105에 제시된 CDR-L1; SEQ ID NO: 69 또는 106에 제시된 CDR-L2; 및/또는 SEQ ID NO: 70 또는 107에 제시된 CDR-L3을 각각 포함한다.
[203] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4를 포함한다. 일부 구체예에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4 각각에 대해 적어도 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및/또는 FR4 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VL 영역은 에 제시된 아미노산 서열의 FR1, FR2, FR3, 및 FR4 각각에 대해 적어도 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1 (FR1), FR2, FR3, 및 FR4 서열을 포함한다.
[204] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
[205] 본원은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열; 및/또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 경쇄 가변 (VL) 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다.
[206] 본원은 SEQ ID NOs: 36 또는 58에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 SEQ ID NOs: 40 또는 62에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL영역을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
[207] 일부 구체예에서, 본원은 SEQ ID NOs: 36 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 SEQ ID NOs: 40 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL영역을 포함하는 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다. 일부 구체에에서, 제공된 항체는SEQ ID NO: 36에 제시된 VH 영역 및 SEQ ID NOs:40에 제시된 VL 영역을 함유한다. 일부 구체예에서, 제공된 항체는 SEQ ID NO: 58에 제시된 VH 영역 및 SEQ ID NOs: 62에 제시된 VL 영역을 함유한다.
[208] 일부 구체예에서, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적인 항-이디오타입 항체는 단일-사슬 항체 단편, 예컨대 scFv 또는 다이아바디이다. 일부 구체예에서, 단일-사슬 항체는 예컨대 가변 중쇄 (VH) 영역 및 가변 경쇄 (VL)과 같이 두 개의 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 링커를 하나 이상 포함한다. 링커는 일반적으로 펩타이드 링커, 예컨대, 유연한 및/또는 가용성 펩타이드 링커이다. 링커들 중에는 글리신 및 세린이 풍부하거나 및/또는 일부 경우 쓰레오닌이 풍부한 것들이 있다. 일부 구체예에서, 링커는 가용성을 향상시킬 수 있는 리신 및/또는 글루타메이트와 같은 하전된 잔기들을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 하나 이상의 프롤린을 더 포함한다.
[209] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 무손상 항체 또는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 항-ID는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 하나 이상의 불변 영역 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 경쇄 불변 영역 (CL) 및/또는 중쇄 불변 영역 1 (CH1)을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-ID는 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예컨대 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 인간 IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 37 또는 59 또는 그의 일부 또는 SEQ ID NO: 37 또는 59에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그의 일부에 제시된 CH 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 41 또는 63 또는 그의 일부 또는 SEQ ID NO: 41 또는 63에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그의 일부에 제시된 CL 도메인을 포함한다.
[210] 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 38 또는 60에 제시된 중쇄 서열 또는 SEQ ID NO: 38 또는 60에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나 및/또는 SEQ ID NO: 42 또는 63 제시된 경쇄 서열 또는 SEQ ID NO: 42 또는 63에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO:38에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO:42에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 60에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO: 63에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 시그널 펩타이드를 더 포함한다. 일부 경우에서, 시그널 펩타이드는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO: 39, 43, 61 또는 64에 제시된 서열을 갖는다.
[211] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 단편 항원 결합 (Fab) 단편들, F(ab') 2단편들, Fab' 단편들, Fv 단편들, 단일사슬 가변 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선별된다.
[212] 따라서, 본원은 전형적으로 VH 및 VL 도메인과 같은 2 개의 항-이디오타입 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 링커(들)을 포함하는, 단일-사슬 항체 단편들, 예컨대 scFvs 및 다이아바디, 특히 인간 단일-사슬 단편들을 제공한다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예컨대, 유연한 및/또는 가용성 펩타이드 링커, 예컨대 글리신과 세린이 풍부한 링커이다.
[213] 일부 측면에서, 글리신과 세린 (및/또는 쓰레오닌)이 풍부한 링커는 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 이러한 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들은 적어도 또는 약 50%,55%, 60%,70%, 또는 75%, 글리신, 세린, 및/또는 쓰레오닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 실질적으로 완전히 글리신, 세린, 및/또는 쓰레오닌으로 이루어진다. 링커는 일반적으로 길이가 약 5 내지 약 50 아미노산, 전형적으로 약 10 내지 약 30, 예컨대, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29, 또는 30개의 아미노산, 및 일부 예에서 10 내지 25개의 아미노산 길이를 갖는다. 예시적인 링커에는 서열 GGGS (3GS; SEQ ID NO: 29) 또는 GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 26)의 다양한 수의 반복물, 예를 들면 이러한 서열의 2, 3, 4, 내지 5개 반복물을 갖는 링커가 포함된다. 예시적인 링커에는 SEQ ID NO: 25 (GGGGSGGGGSGGGGS)에 제시된 서열을 갖거나 이 서열로 이루어진 것들이 포함된다. 예시적인 링커는 또한 SEQ ID NO: 33 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG)에 제시된 서열을 갖거나 이 서열로 구성된 것들을 추가로 포함한다.
[214] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체들은 단리된 항체들을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-ID는 인간화, 재조합, 및/또는 모노클로날이다. 일부 구체예에서, 항-ID는 인간이다.
[215] 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 항-이디오타입 항체는 인간화된다. 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체의 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기는 비-인간, 항-FMC63 CDR로부터 유래된다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
[216] 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 수혜자의 중쇄 가변 영역으로부터의 잔기들이 FMC63에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 중쇄 가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수혜자 항체)을 포함한다.일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 상이한 유전자들로부터 유래된 FR을 함유한다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는, 일반적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 함유한다.
[217] 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 비-인간 공여자 서열에 대응하는 중쇄 가변 영역의 2, 4, 36, 39, 43, 45, ,69,70,74,75,76, 78, 92(Kabat) 및 경쇄 가변 영역의 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69,73, 85, 98 (Kabat) 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 인코딩하도록 렌더링된 변형된 인간 수용자 항체 가변 도메인 서열을 함유한다.
[218] 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 항-이디오타입 항체는 인간화된다. 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 FMC63에 특이적인 비-인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역 중 하나 이상을 함유한다. 일부 구체예에서, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역의 전부 또는 일부는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 변형은 비인간 아미노산 잔기를 인간 잔기로 대체하는 것이다. 특정 구체예에서, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상이 인간 FR 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3은 SEQ ID NOs: 36 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역의 CDR이다. 특정 구체예에서, 비인간 항-이디오타입 VH 영역의 CDR은 SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H1; SEQ ID NO: 45, ,66, 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H2; 및/또는 SEQ ID NO: 46, 67, 94 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H3이거나 이들을 포함한다. 일부 구체예에서, 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3은 SEQ ID NOs: 40 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역의 CDR이다. 일부 구체예에서, 비인간 항-이디오타입 VL 영역의 CDR은 SEQ ID NO: 47, 68, 95, 또는 105에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1; SEQ ID NO: 48, 69, 96, 또는 106에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L2; 및 SEQ ID NO: 49, 97,70, 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L3이거나 또는 이들을 포함한다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 영역 모두가 인간 항체의 FR 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, CDR 및 FR 영역은 Kabat, Chothia, AbM, 및/또는 및 Contact 방식에 의해 동정되는 영역들이다.
[219] 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 전부는 인간 항체의 프레임워크 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체이다. 특정 구체예에서, 인간 항체는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 서브클래스, 예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2 중 하나이다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 전부는 인간 항체로부터의 것이거나 인간 항체로부터 유래된 항원 결합 영역의 프레임워크 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, 항원 결합 단편은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체로부터의 것이거나 및/또는 그로부터 유래된다. 인간 면역글로불린들의 여러가지 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있으며 에컨대 문헌 [Abbas et al. Cellular 및 Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.,2000)]에 설명되어 있다. 일부 구체예에서, 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 공유 또는 비공유적으로 연계된 인간 항체에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
[220] 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 비인간 항-이디오타입 항체의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 중 하나 이상 또는 모두는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 갖는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 프레임워크 영역 내로 삽입된다. 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 Fc 영역의 전부 또는 일부를 함유한다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 하나 이상의 변형, 예컨대 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예컨대 치환, 삽입 또는 결실)을 갖는다. 이러한 변형은 예컨대 반감기 향상, 1 이상의 유형의 Fc 수용체에 대한 결합 변경, 및/또는 이펙터 기능 변경을 위해 행할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 Fc 영역은 변형되지 않은 Fc 영역의 FcαR에 비해 FcαR에 대한 결합을 변경(예컨대 감소)시켰다. 특정 구체예에서, 인간화된 항-이디오타입 항체는 변형되지 않은 Fc 영역의 그것과 비교하여 Fc 수용체에 대한 변경된 (예를 들어, 감소된) 결합을 갖는 변형된 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합을 변경시키는 Fc 변형의 비제한적 예로는, 예컨대, 미국특허 Nos. 7,217,797 및 7,732,570; 및 미국특허출원 Nos. US 2010/0143254 및 2010/0143254에 설명된 것들을 들 수 있다.
[221] 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 138에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 139에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 140에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 141에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 일부 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 142에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 143에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 144에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 145에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 특정 구체예에서, FMC63에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 146에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 147에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다. 일부 구체예에서, FMC에 특이적인 인간화된 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 148에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 149에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄를 갖는다.
C. 예시적인 특성
[222] 본원에 제공된 항-이디오타입 항체들은 다양한 공지 분석법에 의해 그들의 물리/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 동정, 스크리닝 또는 특징화될 수 있다. 일 측면에서, 항-이디오타입 항체는 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 및/또는 유세포 계측법, 예컨대 세포-기반 결합 분석법과 같은 공지 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 테스트되며, 예를 들어, 표적 항-CD19 항체 모이어티를 산생하는 세포에 대한 항-이디오타입 항체 (예컨대, 형광 마커에 컨쥬게이트되거나 태그됨)의 결합을 평가하되 일부 경우, 표적 항-CD19 항체 모이어티를 발현하지 않는 세포를 이용한 경우의 결과와 비교한다. 결합 친화성은 Kd 또는 EC50으로서 측정가능하다.
[223] 제공된 항체들의 임의의 일부 구체예에서, 예컨대 전술한 섹션 A에서 제공된 임의의 항체들에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항체이다.
[224] 제공된 항체들의 임의의 일부 구체예에서, 예컨대 전술한 섹션 B에서 제공된 임의의 항체들에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 FMC63 또는 FMC63로부터 유래된 항체이다.
[225] 경쟁 분석법을 이용하여 본원에 설명된 임의의 항-이디오타입 항체들과 경쟁하는 항체를 동정할 수 있다. 항-이디오타입 항체들 및 레퍼런스 항체들에 의해 결합된 에피토프들을 맵핑하기 위한 분석법도 이용가능하며 또 알려져 있다.
[226] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-CD19 항체 모이어티와 상이한 항-CD19 항체 모이어티에 교차-반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 SJ25C1 항체로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 SJ25C1 항체로부터 유래하고, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD19 항체인 FMC63 항체로부터 유래된 항-CD19 항체 모이어티와 교차-반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 FMC63 항체로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 FMC63 항체로부터 유래하고, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD19 항체인 SJ25C1 항체로부터 유래된 항-CD19 항체 모이어티와 교차-반응하지 않는다.
[227] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 재조합 수용체 등 융합 단백질의 일부인 표적 항-CD19 항체 모이어티에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-CD19 항체 모이어티 외부의 융합 단백질 내의 어떠한 에피토프와도 결합하지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 키메라 항원 수용체(CAR)의 항원-결합 도메인이거나 또는 그의 일부이고, 항-이디오타입 항체는항원-결합 도메인 외부의 어떠한 에피토프와도 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, CAR 항원-결합 도메인은 scFv를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
[228] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR에 함유된 scFv인 표적 항-CD19 항체 모이어티에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-CD19 scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs)와 중복되는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 scFv의 외부의 CAR 내의 에피토프와는 결합하지 않는다; 일부 구체예에서, 이것은 레퍼런스 항체에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 레퍼런스 항체는 표적 항체, 예컨대, CD19와 동일한 항원에 특이적으로 결합하거나 및/또는 표적 항체의 대응하는 프레임워크 영역(들)에 대해 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 하나 이상의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 프레임워크 영역(들)을 포함하거나 (일부 측면에서, 하나 이상의 프레임워크 영역은 중쇄 및/또는 경쇄의 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4를 포함한다); 및/또는 표적 항체로서 동일한 중쇄 및/또는 경쇄 v-유전자(또는 v-유전자 사용)를 함유하거나 및/또는 표적 항체로서 동일한 v-유전자 서열로부터 유래된다. 일부 측면에서, 레퍼런스 항체는 FMC63이다. 일부 측면에서, 레퍼런스 항체는 SJ25C1이다. 일부 구체예에서, CAR은 scFv를 그의 막관통 도메인에 연결하는 스페이서를 포함하고, 및 항-이디오타입 항체는 스페이서 내의 에피토프와는 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 스페이서는 CD28로부터의 세포외 부분과 같이, CD28로부터 유래된 서열이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 IgG1의 Fc 도메인과 같은, Fc 도메인 내의 에피토프와는 결합하지 않는다. 부 구체예에서, Fc 도메인은 힌지 영역이 결여된 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함한다.
[229] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 상이한 CAR과 교차-반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 상이한 항-CD19 CAR과 교차-반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항-CD19 scFv에 비해 하나 이상의 상이한 이디오토프를 갖는, 레퍼런스 항체의 그것과 같은 항-CD19 항체 모이어티와 교차-반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 SJ25C1 항체로부터 유래된 CAR의 표적 항-CD19 scFv에 특이적이다. 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 SJ25C1 항체로부터 유래하며, 항-이디오타입 항체는 FMC63 항체로부터 유래된 항-CD19 항체 모이어티를 함유하는 CAR과 교차-반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 FMC63 항체로부터 유래된 CAR의 표적 항-CD19 scFv에 대해 특이적이다. 일부 구체예에서, 표적 항-CD19 항체 모이어티는 FMC63 항체로부터 유래하고, 항-이디오타입 항체는 SJ25C1 항체로부터 유래된 항-CD19 항체 모이어티를 함유하는 CAR과 교차-반응하지 않는다.
[230] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR의 작용제이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR의 길항제이다.
[231] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 몇몇 공지 방법에 의해 측정되는 바와 같이, 적어도 어떠한 친화도를 가지면서 항체 SJ25C1 또는 FMC63와 같은 표적 항-CD19 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성는 평형해리상수 (KD)에 의해 나타내진다; 일부 구체예에서, 친화성은 EC50으로 표시된다. 특정 구체예에서, 항-CD19모이어티에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 친화성 (EC50) 및/또는 해리상수는 약 100 nM,50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,7, 6, 5, 4, 3,2, 또는 1 nM 미만, 예컨대 약 1 nM 내지 약 15 nM, 예컨대, 약 5 내지 약 10 nM이다, 일 구체에에서, 표적 항-CD19 모이어티와 무관한 모이어티에 대한 항-이디오타입 항체의 결합 정도는 예컨대 방사면역분석법(RIA)로 측정시, 표적 항-CD19 모이어티에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다.
D. 핵산
[232] 또한 항체 및/또는 부분, 예컨대 그의 사슬을 인코딩하는 핵산도 제공된다. 제공된 핵산에는 본 발명에 설명된 항-이디오타입 항체를 인코딩하는 것들이 있다. 핵산에는 예컨대 백본이 변형된 것들을 비롯하여, 자연발생적 및/또는 비-자연발생적인 뉴클레오타이드 및 염기를 포괄하는 것들이 포함된다. "핵산 분자", "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 호환적으로 사용되며 뉴클레오타이드의 폴리머를 가리킨다. 이러한 뉴클레오타이드의 폴리머는 천연 및/또는 비-천연 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 여기에는 DNA, RNA, 및 PNA가 포함되나 이에 한정되지 않는다. "핵산 서열"이라 함은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드의 선형 서열을 가리킨다. 예시적인 핵산 및 벡터는 SEQ ID NOs: : 15-22, 50-57, 71-77에 제시된 서열을 갖는 것들, 및 그의 CDR-인코딩 부분들, 그리고 이들에 대해 적어도 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 것들이다. 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항-이디오타입 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예컨대 항체의 경쇄 또는 중쇄)을 인코딩할 수 있다.
[233] 또한 핵산을 함유하는 벡터, 예컨대 항체 생산을 위한 벡터를 함유하는 숙주 세포도 제공된다. 또한, 항체의 제조 방법도 제공된다. 또 다른 구체예에서, 이러한 핵산을 포함하는 1 이상의 벡터 (예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 일 구체예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예컨대, 형질전환됨). 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 제조 방법이 제공되며, 여기서 상기 제조 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함한다.
E. 항체의 제조 방법
[234] 또한 본원은 항-이디오타입 항체, 예컨대 임의의 구체예에서 제공된 항-이디오타입 항체의 제조 방법도 제공한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 재조합 생산을 위해, 예컨대 전술한 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 분리하고 이를 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현시키기 위한 1 이상의 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 핵산은 통상적인 방법(예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하는 방법)을 이용함으로써 쉽게 분리가능하며 시퀀싱할 수 있다.
[235] 원핵생물에 더해, 진핵생물 미생물, 예를 들면 사상 진균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 있어서 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며 여기에는 인간 세포의 글리코실화 경로를 모방 또는 근사하도록 변형됨으로 해서 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴으로 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주들이 포함된다 [참조: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 외, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)].
[236] 폴리펩타이드 발현에 사용가능한 예시적인 진핵 세포의 예로는 COS 세포, 예컨대 COS 7 세포; 293 세포, 예컨대 293-6E 세포; CHO 세포, 예컨대 CHO-S, DG44. Lec13 CHO 세포, 및 FUT8 CHO 세포; PER.C6® 세포; 및 NSO 세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 항체 중쇄 및/또는 경쇄는 효모에서 발현될 수 있다 [참조: 예컨대, 미국 공개 No. US 2006/0270045 A1]. 일부 구체예에서, 특정한 진핵 숙주 세포를, 중쇄 및/또는 경쇄에 대해 소망되는 번역 후 변형을 일으킬 수 있는 그의 능력에 기반하여 선별한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, CHO 세포는 293 세포에서 생산되는 동일한 폴리펩타이드에 비해 시알릴화 정도가 더 높은 폴리펩타이드를 생산한다.
[237] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 무세포 시스템에서 생산된다. 예시적인 무세포 시스템이 예컨대 다음 문헌에 설명되어 있다: 예컨대, Sitaraman 외, Methods Mol . Biol . 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol . 22: 538-45 (2004); Endo 외, Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).
[238] 제공된 구체예에는 또한 항체 및 기타 결합 단백질의 발현 및 생산을 위한 벡터 및 숙주 세포 및 기타 발현 시스템이 제공되며 여기에는, 진핵 및 원핵 숙주 세포, 예컨대 세균, 사상 진균 및 효모 뿐만 아니라, 인간 세포와 같은 포유동물 세포, 그리고 무세포 발현 시스템이 포함된다.
[239] 항-이디오타입 항체들 또는 항체 모이어티는 인간화된 항체들 또는 인간 항체들일 수 있다. "인간화(humanized)" 항체는 모든 또는 실제로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래하고 모든 또는 실제로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 "인간화 형태"라 함은, 친(親: parental) 비인간 항체의 특이성과 친화성을 유지하는 한편, 일반적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 수행된 비인간 항체의 변이체를 가리킨다. 일부 구체예에서는, 예컨대 항체 특이성 또는 친화성을 복구 또는 개선시키기 위해, 인간화 항체 중의 몇몇 FR 잔기들을 비인간 항체(예컨대 CDR 잔기가 유래된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환시킨다.
[240] 본 발명에 따라 제공된 항-이디오타입 항체 또는 항체 모이어티에는 인간 항체가 있다. "인간 항체(human antibody)"는 인간 항체 라이브러리를 비롯하여, 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 인간 또는 인간 세포, 또는 비-인간 소스에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 한편, 예를 들면 모든 또는 실제로 모든 CDRs이 비-인간인, 비-인간 항원-결합 영역들을 포함하는 비-인간 항체의 인간화 형태는 이 용어로부터 배제된다.
[241] 인간 항체는 항원 챌린지에 응답하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 이러한 동물들은 일반적으로 내인성 면역글로불린을 대체하는 인간 면역글로불린 위치, 또는 그 동물의 염색체 내로 무작위 통합되거나 염색체외에 존재하는 인간 면역글로불린 위치의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 내인성 면역글로불린 위치는 일반적으로 불활성화되어 있다. 인간 항체는 또한 인간 레퍼토리로부터 유래된 항체-인코딩 서열을 함유하는, 파지 디스플레이 및 무세포 라이브러리를 비롯한 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수도 있다.
F. 면역컨쥬게이트 ( Immunoconjugates )
[242] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 면역컨쥬게이트 (항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트) 또는 그의 일부로서, 여기서 항-이디오타입 항체는 비제한적인 예로서 세포독성 제제, 또는 조영제와 같은 1 이상의 이종 분자(들)과 컨쥬게이트되어 있다. 세포독성 제제의 비제한적인 예로는 방사능 동위원소 (예컨대, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사능활성 동위원소); 화학요법제 (예컨대, 메이탄시노이드, 탁산, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터컬레이팅 제제); 성장억제제; 효소 및 그의 단편 예컨대 핵분해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소 예컨대 소분자 독소 또는 효소활성 독소를 들 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 1 이상의 세포독성제제, 예를 들면 화학요법제 또는 약물, 성장억제제, 독소(예컨대 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 단백질 독소, 또는 그의 단편들) 또는 방사능 동위원소와 컨쥬게이트된다.
[243] 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트의 예로는 항-이디오타입 항체가 1 이상의 약물과 컨쥬게이트되어 있는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADCs)를 들 수 있는데, 이의 예로는 비제한적인 약물의 예로서 메이탄시노이드 (참조: 미국특허 Nos. 5,208,020, 5,416,064 및 유럽특허 EP 0 425 235 B1); 아우리스타틴 예를 들면 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (참조: 미국특허 Nos. 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 이들의 유도체 (참조: 미국특허 Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, ,5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; Hinman 외, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode 외, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); 안트라사이클린 예를 들면 다우노마이신 또는 독소루비신 (참조: Kratz 외, Current Med . Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey 외, Bioorganic & Med . Chem . Letters 16:358-362 (2006); Torgov 외, Bioconj . Chem . 16:717-721 (2005); Nagy 외, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 97:829-834 (2000); Dubowchik 외, Bioorg . & Med . Chem . Letters 12:1529-1532 (2002); King 외, J. Med . Chem . 45:4336-4343 (2002); 및 미국특허 No. 6,630,579); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예를 들면 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065와 항체가 컨쥬게이트되어 있는 것을 들 수 있다.
[244] 또한 면역컨쥬게이트 중에는 항-이디오타입 항체가 효소적 활성 독성 또는 그의 단편, 예컨대 비제한적인 예로서 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편들, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 에어루지노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토로카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센과 같은 효소적 활성 독소 또는 그의 단편과 컨쥬게이트되어 있는 것들이 포함된다.
[245] 또한 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트에는 항-이디오타입 항체가 방사능 원자에 컨쥬게이트되어 방사능 컨쥬게이트를 형성하는 것들도 포함된다. 예시적인 방사능 동위원소에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사능 동위원소가 포함된다.
[246] 항-이디오타입 항체 및 세포독성 제제의 컨쥬게이트는 몇 가지 공지의 단백질 커플링제 예컨대 링커를 이용하여 만들 수 있다 (참조: Vitetta 외, Science 238:1098 (1987)), WO94/11026. 링커는 예를 들면 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 및 디설파이드-함유 링커와 같이, 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다 (Chari 외, Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국특허 No. 5,208,020).
[247] 또한 본원은 검출가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는, 예컨대 검출가능한 표지와 같은 표지에 부착된 항-이디오타입 항체를 포함하는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트를 제공한다. 이들 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 연구 또는 진단 용도로 사용가능하다. 표지는 좋기로는 검출가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 생산할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 표지는 방사선-불투과성 또는 방사성 동위 원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; 형광 (플루오로포어) 또는 화학발광 (크로모포어) 화합물, 예컨대 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 효소, 예컨대 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제; 조영제; 또는 금속 이온일 수 있다. 일부 구체예에서, 표지는 신티그래피 연구용 방사성 원자, 예를 들어 99Tc 또는 123I, 또는 핵자기공명 (NMR) 이미징 (자기공명영상, MRI로도 알려진)용 스핀 표지, 예를 들면 지르코늄-89 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철이다. 지르코늄-89는 예를 들면 PET 이미징을 위해, 다양한 금속 킬레이트화제와 착물을 형성하고 항체에 콘쥬게이트될 수 있다 (WO 2011/056983).
[248] 검출가능한 표지의 예로는 방사성 핵종, 효소, 조효소, 형광제, 화학 발광체, 색소, 효소 기질 또는 보조 인자, 효소 저해제, 보철기 복합체, 유리 라디칼, 입자, 염료 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 적합한 효소의 예로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 들 수 있고; 적절한 보철기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 들 수 있고; 적절한 형광 재료의 예로는 엄벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린, 쿠마린, Alexa488, Oregon green 488, 로다민 green, Alexa 532, Cy3, Bodipy 588/586, Alexa586, TAMRA, Rox, Alexa 594, Texas red, Bodipy 630/650, Cy5, Alexa647, IR Dye 680, IR Dye 680, IR Dye 700 DX, Cy5. 5, Alexa 750, IR Dye 800CW, IR Dye 800, Atto 532, 및 Atto 465를 들 수 있다.
[249] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트에 특이적이면서 검출가능한 표지를 함유하는 제2 항체를 이용하여 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트를 검출할 수 있다.
다중특이 항체 ( Multispecific Antibodies)
[250] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 다중특이적이다. 다중특이 결합 분자에는 다중특이 항체, 예컨대 이중특이 항체가 포함된다. 다중특이 결합 파트너, 예컨대 항체는 동일 또는 상이한 항원 들에 존재할 수 있는 적어도 2개의 상이한 위치에 대한 결합 특이성을 갖는다. 특정 구체예에서, 결합 특이성들 중 하나는 항-CD19 항체 모이어티에 대한 것이고 다른 하나는 또 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구체예에서, 이중특이 항체는 항-CD19 항체 모이어티의 2 가지 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 이중특이 항체는 또한 항-CD19 항체 모이어티를 그 표면에서 발현하는 세포, 예컨대 항-CD19 CAR T 세포에 대해 세포독성 제제를 국소화시키는데 이용될 수도 있다. 이중특이 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 준비될 수 있다. 이중특이 항체로는 다중특이 단일-사슬 항체, 예컨대, 다이아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탄뎀(tandem) 디-scFvs, 및 탄뎀 트리-scFvs를 들 수 있다.
G. 변이체 (Variants)
[251] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 1 이상의 아미노산 변이, 예컨대, 본 발명에 설명된 항-이디오타입 항체 서열과 비교할 때 치환, 결실, 삽입 및/또는 돌연변이를 갖는다. 예시적인 변이에는 항-이디오타입 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위해 설계된 것들이 포함된다. 항-이디오타입 항체의 아미노산 서열 변이는 그 항-이디오타입 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변형을 도입하거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 준비될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 항-이디오타입 항체의 아미노산 서열 내 잔기들의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 구조물이 예컨대 항원-결합과 같은 소망되는 특징을 계속 지니는 한, 최종 구조물을 얻기 위해 결실, 삽입 및 치환을 어느 조합으로든 가할 수 있다.
[252] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 본 발명에 설명된 항-이디오타입 항체 서열과 비교시 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 치환 돌연변이에 관심대상이 되는 부위는 CDRs 및 FRs을 포함한다. 관심대상 항-이디오타입 항체 내로 아미노산 치환을 도입하고 생성물을 소망되는 활성, 예컨대 보유/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 향상된 반감기, 및/또는 향상된 이펙터 기능, 예를 들면 항체-의존성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)를 촉진하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 일부 구체예에서, 변이체 항-이디오타입 항체는 표적 항-CD19 항체 또는 그의 단편에 대해 유지되거나 개선된 결합력을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 변이체 항-이디오타입 항체는 변형되지 않은 항-이디오타입 항체와 비교시, 표적 항-CD19 항체에 대한 결합 친화성이 적어도 약 10% (예컨대 적어도 약 20, 30, 40,50, 60,70, 80, 90, 100,200, 300, 400,500, 1000% 이상) 증가한 것으로 나타난다.
[253] 일부 구체예에서, 친(親:parent) 항체 (예컨대 인간화 또는 인간 항체)의 CDR 내의 1 이상의 잔기들이 치환된다. 일부 구체예에서, 서열 또는 서열 내 위치를 생식세포 서열로, 예를 들면 생식세포(예컨대, 인간 생식세포)에서 발견되는 항체 서열로 복귀(revert)시키도록, 예를 들어 인간 개체에게 투여하여, 면역원성 가능성을 감소시키도록 치환시킬 수 있다.
[254] 일부 구체예에서는, CDR "핫스팟"에서, 체세포 성숙 프로세스 동안 높은 빈도로 돌연변이를 수행하는 코돈에 의해 인코딩된 잔기들 (참조: 예컨대, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기들을 변경시키고, 결과적인 변이체 VH 또는 VL를 결합 친화성에 대해 테스트한다. 2차 라이브러리로부터 구축 및 재선별에 의한 친화성 성숙이 예컨대 문헌[ Hoogenboom 외 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 설명되어 있다. 친화성 성숙의 일부 구체예에서는 다양한 방법 (예컨대 오류 발생이 쉬운 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지향된 돌연변이)에 의해 성숙에 대해 선별된 가변 유전자 내로 다양성이 도입된다. 이어서 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서 이 라이브러리를 소망되는 친화성을 갖는 항체 변이체를 동정하기 위해 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 CDR-지향된 접근법과 연관이 있는데 여기서는 몇 가지 CDR 잔기들(예컨대, 한 번에 4-6 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관이 있는 CDR 잔기들을 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 동정할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적이 된다.
[255] 특정 구체예에서, 치환, 삽입 또는 결실과 같은 변경이 항원에 대한 항체 결합능을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 치환, 삽입 또는 결실이 1 이상의 CDRs 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예컨대, 본 발명에서 보존적 치환)이 CDRs에서 행해질 수 있다. 이러한 변경은 예컨대 CDRs 내 잔기와 접촉하는 항원 외부에서 일어날 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구체예에서 각각의 CDR은 변경되지 않거나 또는 2, 3 또는 4 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
[256] 아미노산 서열 삽입에는 하나의 잔기로부터 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노-말단 및/또는 카르복실-말단 융합과, 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내(intrasequence) 삽입도 포함된다. 말단 삽입 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 그 밖의 삽입 변이에는 항체의 N-또는 C-말단을, 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드나 효소에 융합시키는 것이 포함된다.
변형(Modifications)
[257] 특정 구체예에서, 예컨대 특정 세포주를 이용하여 글리코실화 자리에 부착된 올리고당(들)을 변형시킴으로써 및/또는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 1 이상의 글리코실화 자리를 제거 또는 삽입하여, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경시킨다.
[258] 예시적인 변형체, 변이체 및 세포주들이 예컨대 특허공개 Nos. US 2003/0157108, US 2004/0093621, US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 외 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 외 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ripka 외 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Yamane-Ohnuki 외 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107); WO 2003/011878 (Jean-Mairet 외); 미국특허 No. 6,602,684 (Umana 외); 및 US 2005/0123546 (Umana 외); WO 1997/30087 (Patel 외); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 설명되어 있다.
[259] 변형된 항체들 중에는 Fc 영역에 1 이상의 아미노산 변형을 갖는 것들, 예컨대 1 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예컨대 치환)을 포함하는 불변 영역의 기타 부분(예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역) 또는 인간 Fc 영역 서열을 갖는 것들이 있다.
[260] 이러한 변형은 예컨대 반감기 향상, 1 이상의 유형의 Fc 수용체에 대한 결합 변경, 및/또는 이펙터 기능 변경을 위해 행할 수 있다.
[261] 또한 변이체에는, 시스테인 조작된 항체 예를 들면 "thioMAbs" 및 그 밖의 시스테인 조작된 변이체, 예컨대 제제 및 링커-제제들의 컨쥬게이션에 사용하여, 면역컨쥬게이트를 생산하도록, 이용가능한 자리에서 반응성 티올기를 생성하기 위해, 항체의 1 이상의 잔기들이 시스테인 잔기로 치환되어 있는 변이체가 포함된다. 시스테인 조작된 항체는 예컨대 미국특허 Nos. 7,855,275 및 7,521,541에 설명되어 있다.
[262] 일부 구체예에서, 수용성 폴리머를 비롯하여 부가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 항체를 변형시킨다. 예시적인 폴리머의 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/무수 말레산 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코-폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 조합을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 물에서의 안정성으로 인해 제조시 장점을 갖는다. 폴리머의 분자량은 어떠하든 무방하고 분지상일수도 또는 비분지상일 수도 있다. 항체에 결합된 폴리머의 수는 다양할 수 있으며, 두 개 이상의 폴리머가 결합되는 경우, 이들은 동일 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도화에 사용된 폴리머의 갯수 및/또는 종류는 비제한적인 예로서 개선하고자 하는 항체의 특정 성질이나 기능, 항체 유도체가 소정 조건 하의 치료법에 사용될지 여부 등을 고려하여 결정될 수 있다.
II. 항- 이디오타입 항체들의 동정 방법
[263] 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 단편을 포함하는 면역원에 의한 하이브리도마 방법을 이용하는 것과 같이, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 방법이 제공된다 (예컨대 참조: Kohler 및 Milstein, Nature,256: 495 (1975) 및 Sergeeva et al. , 혈액, 117(16): 4262-4272). 면역원은 표적 항체 또는 단편에 융합된 면역원성-강화 모이어티를 포함한다. 이러한 면역원성 강화 모이어티는 비제한적인 예로서 면역원의 가용성과 반감기를 증가시키는 것을 포함하는 특징을 가질 수 있다. 예시적인 면역원성-강화 모이어티에는 Fc 도메인 또는 그의 단편들이 포함된다. 일부 구체예에서, 면역원성-강화 모이어티는 Fc 도메인 (선택적으로 인간의, IgG1으로부터 유래됨)이다. 일부 구체예에서, 면역원성-강화 모이어티는 힌지 영역의 전부 또는 일부가 결여된 Fc 도메인 (선택적으로 인간의, IgG1으로부터 유래됨)이다.
[264] 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 방법이 제공되며 이 방법은: (a) 대상자에게 면역원성-강화 모이어티에 융합된 표적 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 가용성 면역원을 도입하는 단계; 및 (b) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합된 항체를 대상자로부터 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 단일사슬 단편이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 scFv이다. 일부 구체예에서, 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 이에 포함된다.
[265] 일부 구체예에서, 면역원성-강화 모이어티는 선택적으로 인간 IgG1 Fc인 Fc 도메인 또는 그의 단편이다. 일부 구체예에서, 면역원성-강화 모이어티는 힌지 영역이 결여된 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, 면역원성-강화 모이어티는 SEQ ID NO: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
[266] 일부 구체예에서, 항체를 동정하는 것은 대상자에 의해 생산된 개별적인 항체 클론들을 동정하고 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 결합 여부에 대해 클론들을 스크리닝하는 하이브리도마 기술을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체의 동정은: (i) 대상자의 비장으로부터 B 세포를 분리하여 이를 불멸화된 B 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계; (ii) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 생성 여부에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계; 및 (iii) 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 항체를 시퀀싱함으로써 항-이디오타입 항체를 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리도마의 스크리닝은 scFv와 같은 표적 항체의 이디오토프를 포함하는 표적 분자 또는, 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 CAR 또는 그의 단편에 대한 하이브리도마 항체의 결합 친화성을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리도마의 스크리닝은 Fc 또는 그의 단편과 같은 표적 항체의 이디오토프를 포함하지 않는 비-표적 분자 또는, 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하지 않는 또 다른 항체에 대한 하이브리도마 항체의 결합 친화성을 결정하는 것을 더 포함하며, 여기서, 하이브리도마 항체가 표적 분자에는 결합하지만 비-표적 분자에는 결합하지 않을 경우 이것은 그 하이브리도마 항체가 표적 항체에 특이적으로 결합함을 가리키는 것이다.
[267] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 상기 방법은: (a) 대상자에게 Fc 도메인 또는 그의 단편에 융합된 표적 항체의 scFv를 포함하는 가용성 면역원을 도입하는 단계; 및 (b) 면역원과 같은, 표적 항체의 이디오토프를 포함하는 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 대상자로부터 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, scFv는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 단편은 인간 IgG1 Fc 또는 그의 단편이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 단편은 힌지 영역이 결여된 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 단편은 SEQ ID NO: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체를 동정하ㅡㄴ 것은 대상자에 의해 생산된 개별적인 항체 클론을 동정하고 면역원과 같은, 표적 항체의 이디오토프를 포함하는 분자에 대한 결합에 대해 항체 클론을 스크리닝하는 하이브리도마 기술을 이용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체의 동정은: (i) 대상자의 비장으로부터 B 세포를 단리하고 이를 불멸화 B 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하는 단계; (ii) 면역원과 같은 표적 항체의 이디오토프를 포함하는 분자에 특이적으로 결합하는 항체의 생성에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계; 및 (iii) 면역원과 같은 표적 항체의 이디오토프를 포함하는 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체를 시퀀싱함으로써 항-이디오타입 항체를 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리도마의 스크리닝은 면역원, scFv와 같은 표적 항체의 이디오토프 또는, 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 CAR 또는 그의 단편에 대한 하이브리도마 항체의 결합 친화성을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리도마의 스크리닝은 Fc 또는 그의 단편과 같은 표적 항체의 이디오토프를 포함하지 않는 비-표적 분자 또는, 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하지 않는 또 다른 항체에 대한 하이브리도마 항체의 결합 친화성을 결정하는 것을 더 포함하며, 여기서, 하이브리도마 항체가 표적 분자에는 결합하지만 비-표적 분자에는 결합하지 않을 경우 이것은 그 하이브리도마 항체가 표적 항체에 특이적으로 결합함을 가리키는 것이다.
[268] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 상기 방법은: (a) 대상자에게 Fc 도메인 또는 그의 단편에 융합된 표적 항체의 scFv를 포함하는 가용성 면역원을 도입하는 단계; 및 (b) (i) 표적 항체의 이디오토프를 포함하는 표적 분자, 예컨대 면역원, scFv, 또는 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 CAR 또는 그의 단편에 결합하고; 및 (ii) 표적 항체의 이디오토프를 포함하지 않는 Fc와 같은 비-표적 분자 또는 그의 단편 또는 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하지 않는 또 다른 항체와 결합하지 않는 항체를 대상자로부터 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, scFv는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함된다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 단편은 인간 IgG1 Fc 또는 그의 단편이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 단편은 힌지 영역을 결여하는 Fc 도메인이다. 일부 구체예에서, Fc 도메인 또는 그의 단편은 SEQ ID NO: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체의 동정은 대상자에 의해 생성된 개별적인 항체 클론들을 동정하고 표적 및 비-표적 분자들에 대한 항체 클론들의 결합을 스크리닝하는 하이브리도마 기술을 이용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체의 동정은: (i) 대상자의 비장으로부터 B 세포를 단리하여 이를 불멸화 B 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하는 단계; (ii) 표적 분자에는 결합하지만 비-표적 분자에는 결합하지 않는 항체들의 생성에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계; 및 (iii) 표적 분자에는 결합하지만 비-표적 분자에는 결합하지 않는 항체들의 생성하는 하이브리도마로부터 항체를 시퀀싱함으로써 항-이디오타입 항체를 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리도마의 스크리닝은 표적 분자와 비-표적 분자에 대한 하이브리도마 항체의 결합 친화도를 결정하는 것을 포함한다.
[269] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 상기 방법은: (a) FMC63 항체 Fc 도메인 또는 그의 단편에 융합된 FMC63으로부터 유래된 scFv (예컨대 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 scFv)를 포함하는 가용성 면역원을 대상자에게 도입하는 단계; 및 (b) (i) FMC63 항체의 이디오토프를 포함하는 표적 분자, 예컨대 면역원, scFv, 또는 FMC63 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 CAR 또는 그의 단편에 결합하고; 및 (ii) FMC63 항체의 이디오토프를 포함하지 않는 Fc와 같은 비-표적 분자 또는 그의 단편 또는 FMC63 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하지 않는 또 다른 항체와 결합하지 않는 항체를 대상자로부터 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역원은 선택적으로 예컨대 SEQ ID NO:33에 제시된 링커에 의해 분리된, SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역원은 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)에서 동정된 항체는 면역원에는 결합하지만 Fc 도메인 또는 그의 단편이나 SJ25C1 항체로부터 유래된 scFv (예컨대 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 scFv)를 포함하는 분자에는 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 단계 (b)에서 동정된 항체는 SEQ ID NO: 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함하는 표적 분자에는 결합하지만 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 비-표적 분자 또는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 비-표적 분자에는 결합하지 않는다.
[270] 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 상기 방법은: (a) FMC63 항체 Fc 도메인 또는 그의 단편에 융합된 FMC63으로부터 유래된 scFv (예컨대 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 scFv)를 포함하는 가용성 면역원을 대상자에게 도입하는 단계; 및 (b) (i) SJ25C1 항체의 이디오토프를 포함하는 표적 분자, 예컨대 면역원, scFv, 또는 SJ25C1 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 CAR 또는 그의 단편에 결합하고; 및 (ii) SJ25C1 항체의 이디오토프를 포함하지 않는 Fc와 같은 비-표적 분자 또는 그의 단편 또는 SJ25C1 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역 또는 그의 일부분, 예컨대 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하지 않는 또 다른 항체와 결합하지 않는 항체를 대상자로부터 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역원은 선택적으로 예컨대 SEQ ID NO:33에 제시된 링커에 의해 분리된, SEQ ID NO:28 및 SEQ ID NO:32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)에서 동정된 항체는 면역원에는 결합하지만 Fc 도메인 또는 그의 단편이나 SJ25C1 항체로부터 유래된 scFv (예컨대 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 scFv)를 포함하는 분자에는 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 단계 (b)에서 동정된 항체는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 표적 분자에는 결합하지만 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 비-표적 분자 또는 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 비-표적 분자에는 결합하지 않는다.
[271] 일부 구체예에서, 항체를 동정하는 것은 대상자에 의해 생성된 개별적인 항체 클론들을 동정하고 표적 및 비-표적 분자들에 대한 결합 여부에 대해 항체 클론들을 스크리닝하는 하이브리도마 기술을 이용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체를 동정하는 것은:(i) 대상자의 비장으로부터 B 세포를 단리하여 이를 불멸화 B 세포와 융합함으로써 하이브리도마를 생성하는 단계; (ii) 표적 분자에는 결합하지만 비-표적 분자에는 결합하지 않는 항체들의 생성에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계; 및 (iii) 표적 분자에는 결합하지만 비-표적 분자에는 결합하지 않는 항체들을 생산하는 하이브리도마로부터 항체를 분리함으로써 항-이디오타입 항체를 동정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 하이브리도마를 스크리닝하는 것은 표적 분자와 비-표적 분자에 대한 하이브리도마 항체의 결합 친화도를 결정하는 것을 포함한다.
[272] 예시적인 일 구체예에서, SJ25C1로부터 유래된 항-CD19 scFv를 함유하는 예시적인 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)의 scFv 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체의 동정은 다음에 제시된 서열을 포함하는 면역원을 이용하여 생성가능하다:
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 28). 일부 구체예에서, 면역원은 예컨대 SEQ ID NO:32에 제시된 것과 같은. Fc 도메인 또는 그의 단편을 더 함유할 수도 있다.
[273] 예시적인 일 구체예에서, FMC63으로부터 유래된 항-CD19 scFv를 함유하는 예시적인 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)의 scFv 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체의 동정은 다음에 제시된 서열을 포함하는 면역원을 이용하여 생성가능하다:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:34).
[274] 일부 구체예에서, 면역원은 예컨대 SEQ ID NO:32에 제시된 것과 같은. Fc 도메인 또는 그의 단편을 더 함유할 수도 있다. 일부 구체예에서, FMC63으로부터 유래된 항-CD19 scFv를 함유하는 예시적인 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)의 scFv 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체의 동정은 다음에 제시된 서열을 포함하는 면역원을 이용하여 생성가능하다:
Figure 112019032556139-pct00002
Ⅲ. 키메라 항원 수용체(CAR) 및 유전자 조작된 세포들
[275] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 SJ25C1 또는 FMC63으로부터 유래된 항원-결합 부분을 함유하는 항-CD19 CAR과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)의 항원-결합 부분에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 예컨대 입양 세포 치료법과 관련하여 사용된 세포와 같은 세포에서 발현되는 그러한 CAR에 결합한다. 일부 구체예에서, 이러한 세포들은 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함함으로 해서, 그러한 핵산의 재조합 산물 또는 유전자 조작된 CAR 산물을 발현한다. 일부 구체예에서, 키메라 수용체는 면역 세포 내로 유전자 조작되는 경우 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 일부 경우에는 T 세포 분화 또는 항상성을 조절함으로 해서, 예컨대 입양 세포 치료법에서 사용시 요구되는 생체내에서의 개선된 수명, 생존력 및/또는 지속성을 갖춘 유전자 조작된 세포들을 결과시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 표적 CAR을 발현하는 조작된 세포들의 활성화, 자극 및/또는 증식을 비롯하여 이들 활성 중 하나 이상을 조절하기 위한 방법에 이용될 수 있다.
[276] 일부 구체예에서, 세포들은 제공된 방법에 따라 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고 이에 따라 이러한 핵산의 재조합 산물 또는 유전자 조작 산물을 발현한다. 일부 구체예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 존재하지 않고, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것이며, 예를 들어, 조작된 세포및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것이다. 일부 구체예에서, 핵산은 예컨대 복수의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산들의 키메라 조합을 포함하는 것을 비롯하여, 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이, 자연발생적인 것이 아니다.
[277] 일부 구체예에서, 제공된 방법은 유전자 조가된 세포들의 제조 또는 준비를 위한 하나 이상의 처리 단계들과 동시(simultaneously), 순차(sequentially) 또는 동시(concurrently)에 일어날 수 있다. 이 방법의 처리 단계들은 다수의 세포 처리 단계 중 임의의 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 처리 단계는 하나 이상의 핵산, 예를 들어, 재조합 수용체를 인코딩하는 유전자를 포함하는 이종 폴리뉴클레오타이드로 세포의 형질도입 또는 형질감염하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포는 레트로바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 세포에서의 발현을 위한 재조합 산물을 인코딩하는 바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된다. 특정 구체예에서, 세포들은 하나 이상의 비-바이러스 핵산, 예를 들어 에피솜 플라스미드 또는 트랜스포존으로 형질감염된다. 상기 방법은 세포의 단리, 분리, 선별, 세척, 현탁, 희석, 농축 및/또는 제형화를 위한 단계와 같은 다른 처리 단계를 추가로 및/또는 택일적으로 포함할 수 있다. 어떤 경우, 상기 방법은 또한 세포의 배양, 자극 또는 팽창 (예를 들어, 그들의 증식 및/또는 활성화를 유도하기 위한 세포의 자극)을 위한 생체외 단계를 포함할 수 있으며, 경우에 따라, 제공된 방법에 따라 수행된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 대상자로부터 세포를 단리하고, 이들을 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고 동결보존 전 또는 후에 동일 대상으로 재도입하는 것을 포함한다.
[278] 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포, 예를 들어 1차 세포가 생물학적 샘플로부터 선별되거나 분리되는 것과 같이 먼저 분리되는 단계; 선별된 세포를 형질도입을 위해 바이러스 벡터 입자와 함께 배양하는 단계; 및 형질도입된 세포를 조성물로 제형화하는 단계의 순서로 수행된다. 일부 경우에 있어서, 형질도입된 세포는 제공된 방법에 따라, 자극 시약의 존재하에 자극에 의해 생체외에서 활성화, 확대 또는 전파된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포를 세척, 현탁, 희석 및/또는 농축하는 하나 이상의 처리 단계들을 포함할 수 있고 이러한 처리 단계는 단리 예컨대 분리 또는 선별, 형질도입, 자극, 및/또는 제형화 단계들 중 하나 이상을 수행하기 전, 동안 또는 후에 일어날 수 있다.
[279] 특정 구체예에서, 형질감염 또는 형질도입될 세포들은 하나 이상의 핵산과 접촉되기 전에 단리, 선별 또는 농축되지 않는다. 일부 구체예에서, 세포들은 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 선별되지 않는다. 일부 구체예에서, 형질감염 또는 형질도입될 세포들은 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 농축되지 않는다.
[280] 일부 구체예에서, 유전적으로 조작된 세포를 함유하는 조성물을 제조하는 것과 관련하여 제공된 방법과 관련하여 세포를 제조, 처리 및/또는 인큐베이션하는 것과 관련된 하나 이상의 세포 처리 단계는 일반적으로 원통형이고 회전축 주위로 회전가능한 실질적으로 강성인 챔버와 같은 원심분리 챔버의 내부 공동에서 수행될 수 있고, 이것은 이용 가능한 다른 방법에 비해 소정의 이점을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 모든 처리 단계는 동일한 원심분리 챔버에서 수행된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 처리 단계는 서로 다른 원심분리 챔버, 예컨대 동일 유형의 복수개의 원심분리 챔버에서 수행된다. 이러한 방법은 국제특허공개 WO2016/073602에 설명된 임의의 방법을 포함한다.
[281] 예시적인 원심 분리 챔버는 A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버 및 이러한 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 포함하여 Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용되기 위한 것을 포함하여 Biosafe SA사가 제조 및 판매하는 것을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리 기기 및 캐비넷은 예컨대 미국특허 No. 6,123,655, 미국특허 No. 6,733,433 및 미국특허출원공개 No.: US 2008/0171951, 및 국제출원공개 WO 00/38762에 설명되어 있고, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 특정 처리 (예컨대 희석, 세척, 형질도입, 제형화)에 따라, 해당 처리에 적합한 특정 키트를 선별하는 것은 당업자의 재량이다. 이러한 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 BioSafe SA사가 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2라는 제품명으로 판매하는 일회용 키트를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
[282] 일부 구체예에서, 시스템은 시스템에서 수행되는 다양한 처리 단계의 양태를 조작, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 장비를 포함한 다른 장비에 함께 포함되거나 및/또는 관련될 수 있다. 일부 구체예에서 이러한 장비는 캐비넷 내에 포함된다. 일부 구체예에서, 장비는 제어 회로, 원심 분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 포함하는 하우징을 포함하는 캐비닛을 포함한다. 예시적인 기기는 미국특허 No. 6,123,655, 미국특허 No. 6,733,433, 및 미국특허출원 2008/0171951에 개시되어있다.
[283] 일부 구체예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어, 백, 튜빙, 스톱 코크, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구체예에서, 백과 같은 용기는 형질도입되거나 형질감염될 세포 및 벡터 입자, 예를 들어, 바이러스 벡터 입자 또는 비-바이러스성 플라스미드를 동일한 용기 별도의 용기 예컨대 동일한 백 도는 별도의 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 시스템은 챔버 및/또는 다른 구성 요소로 인출되어 방법이 수행되는 동안 성분 및/또는 조성물을 희석, 재순환 및/또는 세척하는 희석액 및/또는 세척액과 같은 매질을 함유하는 하나 이상의 용기 예컨대 백을 더 포함한다. 용기는 인풋 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 아웃풋 라인에 대응하는 위치와 같이 시스템 내 하나 이상의 위치에 연결될 수 있다.
[284] 일부 구체예에서, 폐쇄형 시스템과 같은 시스템은 무균이다. 일부 구체예에서, 예컨대 커넥터를 통한 튜빙 라인과 용기 사이와 같은, 시스템의 구성 요소들 간의 모든 연결은 무균 조건 하에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 연결은 라미나 흐름 하에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 연결은 튜빙과 용기 사이에서 무균 용접과 같은 무균 연결을 생성하는 무균 연결 장치를 사용하여 이루어진다. 일부 구체예에서, 무균 연결 장치는 적어도 200℃ 또는 260℃ 또는 300℃와 같은 무균성을 유지하기에 충분히 높은 가열 조건 하에서 연결을 수행한다.
[285] 일부 구체예에서, 시스템은 일회용 키트와 같은 일회용일 수 있다. 일부 구체예에서, 일회용 키트는 예를 들어, 연속 또는 반-연속 방식으로 일어나는 공정에서 적어도 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상과 같은 공정 또는 공정의 복수의 사이클에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 일회용 키트와 같은 시스템은 단일 환자로부터의 세포의 처리에 사용된다. 상기 방법의 측면에서, 상기 공정은 동일한 원심분리 챔버와 같은 동일한 폐쇄 시스템에서 수행될 필요가 없으며, 다른 원심 분리 챔버와 같은 다른 폐쇄 시스템 하에서 수행될 수 있다; 일부 구체예에서, 이러한 상이한 원심분리 챔버는 동일한 원심분리 챔버와 관련하여 배치되는 것과 같이 동일한 시스템과 관련하여 배치된 방법에서 각각의 지점에 위치한다. 일부 구체예에서, 모든 처리 단계는 각각의 하나 이상의 처리 단계의 전부 또는 일부가 동일하거나 상이한 원심분리 챔버에서 수행되는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
A. 표적 키메라 항원 수용체(CAR)
[286] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들은 원하는 항원 (예를 들어, 종양 항원)에 대한 특이성을 제공하고 세포내 시그널링 도메인에 작동적으로 결합 또는 연결된 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인을 함유하는 표적 CAR의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 항체 SJ25C1 또는 SJ25C1 유래 부분의 항체 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 항체 FMC63 또는 FMC63 유래 부분의 항체 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 T 세포 활성화 도메인과 같은 활성화 세포내 도메인 부분으로서 일차 활성화 시그널을 제공한다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 이펙터 기능을 용이하게 한다.
[287] 일부 구체예에서, 특정 세포 유형의 표면에 발현되는 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 세포들이 제공된다. 일부 구체예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 이것은 탄수화물 또는 기타 분자이다. 일부 구체예에서, 항원은 정상 세포 또는 비-표적화 세포 또는 조직에 비해, 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구체예에서, 항원은 정상 세포 상에 발현되고 및/또는 조작된 세포 상에 발현된다.
[288] 특정 구체예에서, 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체는 T 세포에서 일차 활성화 시그널을 유도할 수 있는 세포질(세포내) 영역과 같은 세포질 시그널링 도메인 (세포 내 시그널링 도메인이라고도 칭해짐), 예를 들어, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 성분의 세포질 시그널링 도메인(예컨대 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 세포질 시그널링 도메인 또는 그의 기능적 변이체 또는 시그널링 부분)을 포함하는, 세포내 시그널링 d여역을 함유한다.
[289] 일부 구체예에서, 키메라 수용체는 리간드 (예컨대 항원)에 특이적으로 결합하는 세포 외 리간드-결합 도메인을 추가로 함유한다. 일부 구체예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구체예에서, 항원과 같은 리간드는, 세포 표면에서 발현되는 단백질이다. 일부 구체예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고 항원은 처리된 펩타이드 항원, 예를 들어 TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 관점에서 세포 표면에서 인식되는 세포내 단백질의 펩티드 항원이다.
[290] CARs를 비롯한 예시적인 항원 수용체 및 조작 방법 및 이러한 수용체를 세포 내로 도입하는 방법이 예컨대 국제특허출원 공개번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 U.S. 특허출원 공개번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국특허 Nos.: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, ,8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446, 191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽특허출원 번호 EP2537416, 및/또는 문헌 [Sadelain 외, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 외 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 외, Curr . Opin . Immunol ., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 외, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 설명되어 있다. 몇몇 측면에서, 항원 수용체는 미국특허 No.: 7,446, 190에 설명된 바와 같은 CAR, 및 국제특허출원공개 No.: WO/2014055668 A1에 설명된 것들을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 공개문헌들, 예를 들면 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 No.: 7,446,190, 미국특허 No.: 8,389,282, 문헌[Kochenderfer 외, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 외 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens 외, Sci Transl Med . 2013 5(177)]에 설명된 CAR을 들 수 있다. 또한, WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446, 179, US 2013/0149337, 미국특허 No.: 7,446,190, 및 미국특허 No.: 8,389,282]에 설명된 것도 참조가능하다.
[291] 일부 구체예에서, CAR은, 예를 들어 암 마커에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현된 항원 및/또는 정상 또는 비병-질병성 세포 유형에서 발현되는 항원과 같은 완충 반응(dampening response)을 유도하기 위한 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 구비하도록 구성된다. 따라서, CAR은 전형적으로 그의 세포외 부분에, 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인, 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자와 같은 하나 이상의 항원 결합 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 모노클로날 항체(mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄(VL)에서 유래된 단일-사슬 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 항원-결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
[292] 일부 구체예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 CAR의 일부로서 세포 상에 발현된다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대해 지시된 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR 유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구체예에서, TCR-유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인을 통해 하나 이상의 세포 내 시그널링 성분에 연결된다. 일부 구체예에서, 이러한 분자는 전형적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통해 시그널을, 및 선택적으로공동자극 수용체와 조합하여 그러한 수용체를 통해 시그널을 모방하거나 근사할 수있다.
[293] 일부 구체예에서, 키메라 수용체 (예컨대 CAR)와 같은 재조합 수용체는 항원 (또는 리간드)에 특이적으로 결합하는 것과 같이 결합하는, 리간드-결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화된 항원들 중에는 입양 세포 치료를 통해 표적화될 질병, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 항원이 있다. 질병 및 병태 중에는 증식성, 신생물 및 악성종양 질환 및 질병이 있고, 여기에는 암 및 종양, 예컨대 혈액암, 면역계의 암, 예컨대 림프종, 백혈병, 및/또는 골수종, 예컨대 B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종이 포함된다.
[294] 일부 구체예에서, 항원 (또는 리간드)은 폴리펩티드이다. 일부 구체 예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구체예에서, 항원 (또는 리간드)은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구체예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고 및/또는 조작된 세포에서 발현된다.
[295] 일부 구체예에서, CAR은 무손상 항원과 같은, 세포 표면에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대 scFv)을 함유한다.
[296] 일부 구체예에서, 항원(또는 리간드)은 종양 항원 또는 암 마커이다. 일부 구체예에서, 항원(또는 리간드)은 αvβ6 인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원 (BCMA), B7-H6, 탄산 탈수효소 9 (CA9 또는 CAIX 또는 G250으로도 공지 됨), 암-고환 항원 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, CC 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피성장인자 단백질 (EGFR), 절삭된(truncated) 표피성장인자 단백질 (tEGFR), III형 표피성장인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백질 2 (EPG-2), 상피 당단백질 40 (EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 5 (FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD 3, 당단백질 100 (gp100), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색 종 관련 항원 (HMW-MAA) B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-AI), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입물 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자 (L1CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8개의 패밀리 멤버 A를 함유하는 류신 농축 수용체(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소쎌린, c-Met, 쥐의 시토메갈로바이러스(CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 내추럴 킬러 그룹 2 멤버 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 중성 세포 부착 분자 (NCAM), 온코페탈 항원, 흑색종의 우선 발현되는 항원(PRAM), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기세포 항원 (PSCA), 전립선 특이 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 오펀 수용체 1 (ROR1), 서바이빈, 트로포블래스트 당단백질 (5ST4라고도 알려진 TPBG), 종양-관련 당단백질 72 (TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관-내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름 종양 (Wilms Tumor) 1 (WT-1), 병원체-특이적 항원, 범용 태그가 연계된 항원, 및/또는 바이오티닐화된 분자들, 및/또는 HIV, HCV, HBV, HPV, 및/또는 기타 병원체에 의해 발현 및/또는 특징적 또는 특이적인 분자 및/또는 그의 발암성 버젼을 포함한다. 일부 구체예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 임의의 것과 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igκ, Igλ, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
[297] 일부 구체예에서, 항원은 병원체-특이적 항원이다. 일부 구체예에서, 항원은 바이러스 항원 (예컨대 HIV, HCV, HBV 등의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생 항원이다.
[298] 일부 구체예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 임의의 것과 같은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, ,CD21, CD5, CD33, Igκ, Igλ, CD79a, CD79b 또는 CD30이다. 일부 구체예에서, 항원은 CD19이고, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래된 항원-결합 단편 또는 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래된 항원-결합 단편과 같은 항-CD19 항체에 의해 특이적으로 결합된다.
[299] 일부 구체예에서, 항원-결합 단백질, 항체 및 그의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구체예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원-결합 부분 (Fab, F (ab') 2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv))일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE로부터 선별되고, 특히 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선별되며, 더욱 특히는, IgG1 (예컨대, 인간 IgG1)이다. 또 다른 구체예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예컨대, 카파 또는 람다, 특히 카파로부터 선별된다.
[300] 제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 비제한적인 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일 사슬 항체 분자, 예컨대 scFv 및 단일-도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 포함된다. 특정 구체예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대 scFv를 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
[301] "가변 영역(variable 영역)" 또는 "가변 도메인(가변 도메인)"이라는 용어는 항원에 대한 항체 결합과 연관된 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 가리킨다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 CDRs을 포함하는 각 도메인과 유사한 구조를 갖는다. [예컨대, Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman 및 Co., page 91 (2007) 참조]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 뿐만 아니라, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다 [예컨대, Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991) 참조].
[302] 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다. 일부 구체예에서, CAR은 항원, 예컨대 본원에 설명되거나 기술분야에 공지인 임의의 표적 항원과 같은, 종양 세포 또는 암 세포 등, 표적화될 세포 또는 질병의 세포 표면 항원 또는 암 마커와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
[303] 항체 단편들은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 여기에는 무손상 항체의 단백질 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 예를 들어 펩타이드 링커와 같은 합성 링커에 의해 결합된 2개 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것고 같이 자연발생되지 않거나 및/또는 자연발생적인 무손상 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않는 배열을 포함하는 단편과 같은, 재조합적으로 생산된 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 단편은 scFv이다.
[304] "인간화된" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR에서 유래된 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서 전형적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비-인간 항체의 변이체를 가리킨다. 일부 구체예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유도된 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다,
[305] CAR과 같은 키메라 수용체는 일반적으로 항체 분자 (예를 들어, SJ25C1 또는 FMC63)의 일부와 같은 세포외 항원 결합 도메인, 일반적으로 항체의 가변 중쇄 (VH) 사슬 영역 및/또는 가변 경쇄 (VL) 영역, 예를 들어, scFv 항체 단편을 포함한다.
[306] 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포 내 시그널링 도메인을 함유하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구체 예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 구체 예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래되며 SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래되며 SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
[307] 일부 구체예에서, 재조합 수용체, 예를 들면 CAR, 예를 들면 그의 항체 부분은 스페이서를 추가로 포함하며, 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 변이체 또는 변형된 버전, 예를 들면 힌지 영역, 예컨대, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역일 수 있거나 또는 적어도 이의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역 또는 부분은 인간 IgG 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 그것이다. 일부 측면에서, 불변 영역 부분은 예컨대, scFv과 같은 항원-인식 성분과 막관통 도메인 사이의 스페이서 영역 역할을 한다. 스페이서는 스페이서가 부재할 경우에 비해, 항원 결합에 이어 세포의 증가된 응답성을 제공하는 길이일 수 있다. 몇 가지 예에서, 스페이서의 길이는 12 또는 약 12 아미노산 또는 12개 이하의 아미노산일 수 있다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229 아미노산, 약 10 내지 200 아미노산, 약 10 내지 175 아미노산, 약 10 내지 150 아미노산, 약 10 내지 125 아미노산, 약 10 내지 100 아미노산, 약 10 내지 75 아미노산, 약 10 내지 50 아미노산, 약 10 내지 40 아미노산, 약 10 내지 30 아미노산, 약 10 내지 20 아미노산, 또는 약 10 내지 15 아미노산, 및 상기 나열된 범위들의 양 종점의 숫자들 사이의 여하한 정수의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산 또는, 약 119개 이하의 아미노산 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 링크된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 링크된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지만, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 일부 구체예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 150에 제시된 서열을 갖고, SEQ ID NO: 151에 제시된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 152에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 스페이서는 SEQ ID NO: 153에 제시된 서열을 갖는다. 예시적인 스페이서의 비제한적인 예로는 문헌 [Hudecek et al. (2013) Clin . Cancer Res., 19: 3153], 국제특허출원공개 WO2014031687, 미국특허 No. 8,822,647 또는 미국특허출원공개 No. US2014/0271635에 설명된 것들을 들 수 있다.
[308] 일부 구체예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 SEQ ID NO:154에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 스페이서는 SEQ ID NOS: 1, 3, 4, 및 5 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
[309] 일부 구체예에서, 항원 수용체는 세포 외 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인 및 세포 내 시그널링 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 막관통 도메인은 세포외 도메인에 융합되어 있다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 ITAM을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 항원 인식 도메인 (예컨대 세포외 도메인)은 일반적으로 하나 이상의 세포내 시그널링 성분, 예를 들어 CAR의 경우 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통해 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통한 시그널을 통해 활성화를 모방하는 시그널링 성분들와 연결된다. 일부 구체예에서, 키메라 수용체는 세포외 도메인 (예컨대 scFv)과 세포내 시그널링 도메인 사이에 연결 또는 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 항원-결합 성분 (예컨대, 항체)는 하나 이상의 막관통 및 세포내 시그널링 도메인에 연결된다.
[310] 일 구체예에서, 보통, 예컨대, CAR과 같이 수용체 내 도메인들 중 하나와 연관되어 있는 막관통 도메인이 이용된다. 일부 구체예에서는 수용체의 다른 멤버와의 상호반응을 초소화시키기 위해, 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 회피하도록, 막관통 도메인을 선별하거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형시킨다.
[311] 일부 구체예에서 막관통 도메인은 천연 또는 합성 소스로부터 유도된다. 소스가 천연의 것일 경우, 도메인은 일부 측면에서 여하한 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막관통 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154로부터 유래된 것을 포함한다. 별법으로 일부 구체예에서 막관통 도메인은 합성된 것이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 예를 들면 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기들을 주로 포함한다. 일부 측면에서, triplet of 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼량체가 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견된다. 일부 구체예에서, 연결은 링커, 스페이서, 및/또는 막관통 도메인(들)에 의한다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다.
[312] 일부 구체예에서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 본원에 설명된 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 수용체는 CD28 세포외 부분과 같이, 막관통 도메인이 유래된 분자의 세포외 부분을 함유한다.
[313] 세포내 시그널링 도메인에는 천연 항원 수용체를 통해 시그널을 모방 또는 근사하는 것들, 공동자극 수용체와 조합된 수용체를 통해 시그널을 모방 또는 근사하는 것들, 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통해 시그널을 모방 또는 근사하는 것들이 포함된다. 일부 구체예에서, 짧은 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어, 길이가 2 내지 10 아미노산인 링커, 예를 들면 글라이신들 및 세린들, 예컨대, 글라이신-세린 더블렛을 함유하는 것이 존재하며 CAR의 막관통 도메인과 세포질 시그널링 도메인 사이의 연결(linkakage)를 형성한다.
[314] T 세포 활성화는 일부 측면에서 2가지 부류의 세포질 시그널링 서열에 의해 매개되는 것으로 설명된다: 즉 TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 세포질 시그널링 서열), 및 항원-독립적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 시그널을 제공하는 것들(2차 세포질 시그널링 서열)이 그것이다. 일부 측면에서, CAR은 이러한 시그널링 성분들 중 한 가지 또는 양자 모두를 포함한다.
[315] 수용체, 예컨대, CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포내 시그널링 서분 또는 성분들을 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 시그널링 서열을 포함한다. 자극적 방식으로 작용하는 1차 세포질 시그널링 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAMs(immunoreceptor tyrosine-기반 활성화 motifs)이라 알려져 있는 시그널링 모티프를 함유할 수도 있다. ITAM 함유 1차 세포질 시그널링 서열의 예로는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, 및 CD3 엡실론으로부터 유래한 것들을 들 수 있다. 일부 구체예에서, CAR 내 세포질 시그널링 분자(들)은 세포질 시그널링 도메인, 그의 일부, 또는 CD3 제타로부터 유래한 서열을 함유한다.
[316] 일부 구체예에서, 수용체는 예컨대, CD3 제타 사슬과 같이, T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 그러므로, 일부 측면에서, 항원-결합 부분은 1 이상의 세포 시그널링 모듈에 링크된다. 일부 구체예에서, 세포 시그널링 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 시그널링 도메인, 및/또는 다른 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 수용체, 예컨대, CAR은, 1 이상의 부가적인 분자 예를 들면 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16의 부분을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3-제타 (CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
[317] 일부 구체예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 접합(ligation)시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 시그널링 도메인은 정상 이펙터 기능 또는 예컨대 CAR의 발현을 위해 조작된 T 세포와 같은 면역 세포 응답성 중 적어도 한 가지를 활성화시킨다. 예를 들어, 몇 가지 맥락에서, CAR은 시토카인 또는 다른 인자의 분비와 같은, T-헬퍼 활성 또는 세포독성 활성 등의 T 세포 기능을 유도한다. 일부 구체예에서, 예를 들어 만일 이것이 이펙터 기능 시그널을 형질도입할 경우 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포내 시그널링 도메인의 트렁케이트된 부분이 온전한 면역자극 사슬 대신 사용된다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 자연적 관점에서 항원 수용체 결부 후 그러한 수용체와 협업하여 시그널 형질도입을 개시하도록 작용하는 공동-수용체의 서열, 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 그러한 분자의 유도체 또는 변이체, 및/또는 여하한 합성 서열을 포함한다.
[318] 천연 TCR 관점에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 시그널링 뿐만 아니라, 공동자극 시그널 역시도 필요로 한다. 그러므로, 일부 구체예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공동-자극 시그널을 위한 성분 역시도 CAR에 포함된다. 다른 구체예에서, CAR은 공동자극 시그널을 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 부가적인 CAR이 동일한 세포에서 발현되어 2차 또는 공동자극 시그널을 발생시키기 위한 성분을 제공한다.
[319] T 세포 활성화는 일부 측면에서 2가지 부류의 세포질 시그널링 서열에 의해 매개되는 것으로 설명된다: 즉 TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 세포질 시그널링 서열), 및 항원-독립적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 시그널을 제공하는 것들(2차 세포질 시그널링 서열)이 그것이다. 일부 측면에서, CAR은 이러한 시그널링 성분들 중 한 가지 또는 양자 모두를 포함한다.
[320] 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구체예에서, CAR은 공동자극 수용체, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS의 시그널링 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 성분과 공동자극 성분 두 가지를 모두 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 예컨대 막관통 도메인과 세포내 시그널링 도메인 사이에, T 세포 공동자극 분자 또는 그의 기능성 변이체로부터 유래한 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
[321] 일부 구체예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR에 포함된 반면 공동자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구체예에서, CARs은 활성화 또는 자극 CARs, 공동자극 CARs을 포함하되, 두 가지 모두 동일 세포에서 발현되는 것들이다 (참조: WO2014/055668). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 추가로 억제 CARs (iCARs, 참조: Fedorov 외, Sci . Transl . Medicine, 5(215) (December, 2013), 예를 들면 질병 또는 병태와 관련되거나 및/또는 그에 대해 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR을 포함함으로 해서, 질병-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 시그널이, 억제 CAR과 그의 리간드와의 결합에 의해 감소 또는 억제되어 오프-표적 효과를 감소시키게 된다.
[322] 특정 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD28 막관통 및 CD3 (예컨대, CD3-제타) 세포내 도메인에 링크된 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 링크된, 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인을 포함한다.
[323] 일부 구체예에서, CAR은 1 이상, 예컨대 2 이상의 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대, 1차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포함한다. 예시적인 CARs은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다.
[324] 일부 구체예에서, 항원 수용체는 마커를 더 포함하고 및/또는 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 수용체를 발현하기 위해 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는데 이용될 수 있는 대리 마커, 예를 들면 세포 표면 마커를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 마커는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체의 전부 또는 일부 (예컨대 트렁케이트된 형태), 예컨대 그러한 세포 표면 수용체의 트렁케이트된 버젼 (예컨대, tEGFR)을 포함한다. 일부 구체예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 링커 서열, 예를 들면 절단가능한 링커 서열, 예컨대, T2A를 인코딩하는 폴리뉴클레오탕드에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 임의로 링커 서열은 공개특허출원 No. WO2014031687에 개시된 것이면 어느 것이든 무방하다. 예를 들어, 마커는 링커 서열, 예를 들면 T2A 절단가능한 링커 서열에 임의로 링크된, 트렁케이트된 EGFR (tEGFR)일 수 있다. 일부 구체예에서, tEGFR은 SEQ ID NO: 155 또는 156에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, tEGFR은 SEQ ID NO: 155 또는 156에 제시된 서열에 대해 약 75%,76%,77%,78%,79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 보다 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
[325] 일부 구체예에서, 마커는 T 세포 상에서 자연적으로 발견되는 것이 아닌, 또는 T 세포의 표면 또는 그의 일부에서 자연적으로 발견되는 것이 아닌 분자, 예컨대, 세포 표면 단백질이다. 일부 구체예에서, 분자는 비-자가 분자, 예컨대, 비-자가 단백질, 즉, 세포가 입양 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 "자가(self)"인 것으로 인식되지 않는 것들이다.
[326] 일부 구체예에서, 마커는 치료 기능을 하지 않고 및/또는 유전자 조작을 위하한 마커, 예컨대 성공적으로 조작된 세포를 선별하기 위한 마커로서 사용되는 것 이외에 다른 효과는 나타내지 않는다. 다른 구체예에서, 마커는 치료 분자이거나 또는 일부 소망되는 효과, 예를 들면 공동자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같이생체내에서 마주치게될 세포에 대한 리간드일 수 있음으로 해서, 입양 전달 및 리간드와 조우시 세포의 반응을 향상 및/또는 감소시킬 수 있다.
[327] 일부 경우에서, CARs은 1세대, 2세개 및/또는 3세대 CARs로 칭해진다. 일부 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 시그널만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 2세대 CARs은 시그널 및 공동자극 시그널을 제공하는 것, 예를 들면 공동자극 수용체 예를 들면 CD28 또는 CD137로부터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것이며; 일부 측면에서, 3세대 CAR은 일부 측면에서 상이한 공동자극 수용체들의 복수개의 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
[328] 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 설명된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 설명된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일-도메인 VH 항체를 포함하고 세포내 도메인은 ITAM을 포함한다. 일부 측면에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 시그널링 영역 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
[329] 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함한다. 세포외 도메인과 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포외 도메인과 막관통은 스페이서, 본 발명에 설명된 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 막관통 도메인과 세포내 시그널링 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
[330] 예를 들어, 일부 구체예에서, CAR은 항체, 예컨대, 항체 단편, CD28 또는 그의 기능성 변이체의 막관통 부분이거나 상기 부분을 포함하는 막관통 도메인, 및 CD28 또는 그의 기능성 변이체의 시그널링 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능성 변이체의 시그널링 부분을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 항체, 예컨대, 항체 단편, 4-1BB 또는 그의 기능성 변이체의 막관통 부분이거나 상기 부분을 포함하는 막관통 도메인, 및 4-1BB 또는 그의 기능성 변이체의 시그널링 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능성 변이체의 시그널링 부분을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 이러한 몇 가지 구체예에서, 수용체는 추가로 Ig 분자, 예를 들면 인간 Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예를 들면 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지, 예를 들면 힌지-온리(only) 스페이서를 추가로 포함한다.
[331] 일부 구체예에서, 수용체, 예컨대, CAR의 막관통 도메인은, 인간 CD28 (수탁번호 P01747.1) 또는 그의 변이체 예컨대 인간 CD28의 27-아미노산 막관통 도메인(수탁번호 P01747.1)이거나 또는 SEQ ID NO: 157에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 157에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이거나 이 막관통 도메인을 포함한다; 일부 구체예에서, 막관통-도메인은 SEQ ID NO: 158에 제시된 아미노산 서열 또는 상기 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[332] 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
[333] 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 영역은, 인간 CD28 또는 그의 기능성 변이체 또는 일부의 세포내 공동자극 시그널링 도메인, 예컨대 그의 41 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 187-187 위치에서 LL이 GG로 치환된 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 SEQ ID NO: 159 또는 160에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 159 또는 160에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포내 영역은 4-1BB의 세포내 공동자극 시그널링 도메인 또는 그의 기능성 변이체 또는 일부, 예컨대 인간 4-1 BB의 42-아미노산 세포질 도메인 (수탁번호 Q07011.1) 또는 그의 기능성 변이체 또는 일부, 예컨대 SEQ ID NO:161에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 161에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[334] 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 영역은 미국특허 No.: 7,446,190 또는 미국특허 No. 8,911,993에 설명된 바와 같이 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극 시그널링 도메인 또는 그의 기능성 변이체, 예를 들면 인간 CD3ζ (수탁번호: P20963.2) 또는 CD3 제타 시그널링 도메인의 이소폼 3의 112 AA 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포내 시그널링 영역은 SEQ ID NO: 162, 163 또는 164에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 162, 163 또는 164에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
[335] 일부 측면에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역만을, 예를 들면 IgG4 또는 IgG1의 힌지 만을, 예를 들면 SEQ ID NO: 150에 제시된 힌지 온리 스페이서를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예컨대, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예를 들면 SEQ ID NO:152에 제시된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 링크된 IgG4 힌지이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예컨대, SEQ ID NO:153에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 글라이신-세린이 풍부한 서열 또는 예컨대 공지의 유연한 링커와 같은 기타 유연한 링커이거나 이들을 포함한다.
[336] 예를 들어, 일부 구체예에서, CAR은 항체 예를 들면 scFvs를 비롯한 항체 단편, 스페이서, 예를 들면 면역글로불린 분자의 일부, 예를 들면 중쇄 분자의 힌지 영역 및/또는 1 이상의 불변 영역을 함유하는 스페이서, 예를 들면 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유도된 막관통 도메인, CD28-유도된 세포내 시그널링 도메인, 및 CD3 제타 시그널링 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 막관통 도메인을 포함한다.　일부 구체예에서, CAR은 항체 또는 단편, 예를 들면 scFvs, 스페이서 예를 들면 여하한 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유도된 막관통 도메인, 4-1BB-유도된 세포내 시그널링 도메인, 및 CD3 제타-유도된 시그널링 도메인을 포함한다.
[337] 일부 구체예에서, 이러한 CAR 구조물을 인코딩하는 핵산 분자는 T2A 리보좀 스킵 성분 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR을 인코딩하는 서열의 하류를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 비-면역원성 선발 에피토프로서 트렁케이트된 EGFR (EGFRt)을 발현하도록항원 수용체 (예컨대 CAR)을 발현하는 T 세포를 생성한 다음 (예를 들어, T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 인코딩하는 구조물을 도입함으로써 동일 구조물로부터 2개의 단백질을 발현) 그러한 세포를 검출하기 위한 마커로서 이것을 이용할 수 있다 (예를 들어, 미국특허 No. 8,802,374 참조), 일부 구체예에서, 단일 프로모터는 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)에서, 자기 절단 펩타이드 (예컨 2A 서열)를 인코딩하는 서열 또는 프로테아제 인식 부위(예컨대 퓨린)에 의해 분리된 2개 또는 3개의 유전자 (예컨대 대사 경로를 조절하고 재조합 수용체를 암호화하는 분자를 인코딩함)를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서 ORF는 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는데, 이는 (2A의 경우) 또는 번역 후에, 개별 단백질로 가공된다. 경우에 따라, T2A와 같은 펩타이드는 2A 요소의 C 말단에서 펩타이드 결합의 스킵 (리보좀 건너뛰기) 합성을 일으켜 2A 서열의 말단과 하류의 다음 펩타이드 사이의 분리를 유도할 수 있다 (예를 들어 de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 deFelipe 등, Traffic 5: 616-626 (2004) 참조). 많은 2A 원소가 당업계에 공지되어 있다. 본원의 방법에서 사용가능한 2A 서열 및 본원에 개시된 핵산의 비제한적인 예에는, 구제역 바이러스 (F2A, 예를 들어, SEQ ID NO: 131), 우성 A형 비염 바이러스 (E2A, 예컨대 SEQ ID NO: 130), Thosea asigna 바이러스 (T2A, 예컨대 SEQ ID NO: 126 또는 127) 및 돼지 테스코바이러스-1 (P2A, 예를 들어, SEQ ID NO: 128 또는 129)를 들 수 있으며 미국특허출원공개 No. 20070116690에 설명되어 있다.
[338] 대상자에 투여된 세포에 의해 발현되는 CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 치료되는 질환 또는 상태 또는 세포에서 발현, 관련, 및/또는 특이적인 분자를 인식하거나 또는 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어, 항원에 특이 적으로 결합하면, 수용체는 일반적으로 ITAM-형질 감염된 시그널와 같은 면역 자극 시그널를 세포 내로 전달하여, 질병 또는 병태에 표적화되 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직에 의해 발현되는 항원 또는 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다. 수용체는 면역억제 또는 공동자극 시그널-촉진 수용체와 같은 또 다른 수용체, 예를 들어 CCR 또는 iCAR 또는 비-시그널링 수용체 (예컨대 항체를 사용하는 세포의 고갈 또는 제거에 사용됨)일 수 있다.
B. 유전자 조작 세포 및 세포의 제조 방법
[339] 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 중에는 조작된 세포가 있다. 유전자 공학은 일반적으로 레트로바이러스 형질도입, 형질감염 또는 형질전환에 의해, 세포를 함유하는 조성물 내로 재조합 또는 조작된 성분을 코딩하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 유전적으로 조작된 성분, 예를 들어 CAR과 같은 재조합 수용체의 도입 방법은 잘 알려져 있으며 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 통한, 형질도입, 트랜스포존, 및 일렉트로포레이션에 의한, 수용체를 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다.
1. 유전자 조작을 위한 벡터 및 방법
[340] 본원은 또한 키메라 항원 수용체 (CARs)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 핵산 분자들), 이러한 CAR을 발현하기 위해 세포를 유전자 조작하기 위한 벡터 및 조작된 세포의 제조방법도 제공한다. 일부 구체예에서, 벡터는 CAR을 인코딩하는 핵산을 함유한다. 일부 경우에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다.
[341] 일부 구체예에서, 재조합 핵산은 예컨대 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자들을 이용하여 세포 내로 도입된다. 일부 구체예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들면 감마-레트로바이러스 벡터를 이용하여 T 세포 내로 전달된다 (참조: 예컨대, Koste 외 (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 외 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 외 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 외, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557).
[342] 일부 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열 (LTR), 예컨대, 멀로니 쥐 백혈병 바이러스(MoMLV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터, 골수증식 육종 바이러스(MPSV), 쥐의 배아 줄기세포 바이러스(MESV), 쥐의 줄기세포 바이러스(MSCV), 골수 포커스 형성 바이러스(SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐의 레트로바이러스로부터 유래된 것이다. 일부 구체예에서, 레트로바이러스는 조류 또는 포유동물 세포 소스로부터 유래된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 일반적으로 양생(amphotropic)인데, 이는 이들이 인간을 비롯하여 일부 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일 구체예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 일부 예시적인 레트로바이러스 시스템이 설명된 바 있다(예컨대, 미국특허 Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller 및 Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 외 (1991) Virology 180:849-852; Burns 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie 및 Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 참조).
[343] 렌티바이러스 형질도입 방법이 알려져 있다. 예시적인 방법은 예컨대 문헌 [Wang 외 (2012) J. Immunother . 35(9): 689-701; Cooper 외 (2003) 혈액. 101:1637-1644; Verhoeyen 외 (2009) Methods Mol Biol . 506: 97-114; 및 Cavalieri 외 (2003) 혈액.　 102(2): 497-505]에 설명되어 있다.
[344] 일부 구체예에서, 재조합 핵산은 전기영동을 통해 T 세포에 전달된다 (참조: 예컨대, Chicaybam 외, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo 외 (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). 일부 구체예에서, 재조합 핵산은 전좌(transposition)을 통해 T 세포에 전달된다 (참조: 예컨대, Manuri 외 (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 외 (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang 외 (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). 면역 세포에서 유전자 물질
Figure 112019032556139-pct00003
제제를 도입 및 발현하는 그 밖의 방법으로는 인산칼슘 형질도입 (예컨대, 문헌 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 설명됨), 원형질 융합, 양이온성 리포좀-매개된 형질감염; 텅스텐 입자-보조된 마이크로입자 폭발법 (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산 스트론튬 DNA 공침법 (Brash 외, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 들 수 있다.
[345] 재조합 산물을 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 그 밖의 접근법 및 벡터는 예컨대 국제특허출원 공개 No.: WO2014055668, 및 미국특허 No. 7,446,190에 설명되어 있다.
[346] 일부 구체예에서, 세포, 예를 들어, T 세포는 팽창 도중 또는 팽창 후, T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 형질감염될 수 있다. 바람직한 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 형질감염은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포 집단은 초기 자극 (예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있고, 이어서 예컨대 de novo 도입된 수용체를 통한 제2 유형의 자극으로 자극될 수 있다. 이 제2 유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자 형태의 항원 자극, 유전적으로 도입된 수용체 (예컨대 CAR의 천연 리간드)의 동족(가교) 리간드 또는 새로운 수용체의 프레임워크 내에 직접 결합하는(예컨대 수용체 내 불변 영역을 인식함으로써) 임의의 리간드 (예컨대 항체)를 포함할 수 있다. 예컨대 참조: Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907: 645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014). 일부 구체예에서, 세포들은 제공된 방법에 따라 제공된 항-이디오타입 항체로 자극된다
[347] 일부 경우에서, 세포, 예를 들어, T 세포가 활성화될 것을 요구하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 몇 가지 경우에, 세포는 활성화 전에 선별 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는 세포 배양 전 또는 배양 후, 경우에 따라서는 배양과 동시 또는 배양 중 적어도 일부의 기간 동안 조작될 수 있다.
[348] 부가적인 핵산, 예를 들어, 도입을 위한 유전자로는 전달된 세포의 생존능 및/또는 기능을 촉진시킴으로써 치료 효능을 향상시키는 것; 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하는 것과 같은 세포의 선별 및/또는 평가를 위한 유전적 마커를 제공하는 유전자; 예컨대 생체내 음성 선별에 민감한 세포를 만듦으로써 안정성을 향상시키는 유전자 [Lupton S. D. et al. , Mol . and Cell Biol . , 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992)에 설명된 바와 같음. 또한 우세한 양성 선별 마커와 음성 선별 마커를 융합시켜 유래된 이관능성의 선별가능한 융합 유전자의 용도를 설명하는 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601도 참조. 또한 예컨대, Riddell et al., 미국특허 No. 6,040,177, 컬럼 14-17 참조]를 들 수 있다.
2. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포의 제조
[349] 본원은 키메라 항원 수용체(CAR)를 함유하는 조작된 세포를 포함하는 세포를 제공한다. 또한 본원은 그러한 세포의 집단 및 이러한 세포를 함유하는 조성물도 제공한다. 조성물 중에는 세포가 배양되거나 접촉되는 하나 이상의 입자 상에 존재하는 결합 분자에 의해 인식되거나 결합될 수 있는 재조합 수용체를 발현할 가능성이 있거나 발현하거나 또는 공지인 하나 이상의 세포를 함유하는 인풋 조성물이 있다. 또한 조성물 중에는 제공된 방법에 의해 제조된 조성물이 포함되며 여기에는 자극 또는 팽창된 세포들이 함유된 아웃풋 조성물, 입자의 결합 분자에 의해 결합되거나 인식되는 재조합 수용체를 함유하는 세포에 대해 농축된 조성물, 예컨대
이 포함되며, 재조합 수용체, 예컨대 키메라 수용체를 발현하는 세포가 조성물 내 총 세포의 적어도50, 60,70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 퍼센트 이상을 차지하거나 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포와 같은 특정 유형의 T 세포를 함유하는 조성물이 포함된다. 그러므로, 본원은 재조합 수용체 예컨대, CAR을 발현하는 유전자 조작된 세포들을 제공한다.
[350] 조성물 중에는 입양 세포 치료와 같은 투여를 위한 의약 조성물 및 제형이 있다. 또한 이러한 세포를 조작, 생산 또는 생성하는 방법, 대상자, 예컨대 환자에게 세포 및 조성물을 투여하는 치료 방법, 및 그러한 세포를 검출, 선별, 분리 또는 분리하는 방법이 제공된다.
[351] 일부 구체예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 존재하지 않고, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것이며, 예를 들어, 조작된 세포및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것이다. 일부 구체예에서, 핵산은 예컨대 복수의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산들의 키메라 조합을 포함하는 것을 비롯하여, 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이, 자연발생적인 것이 아니다.
[352] 세포는 일반적으로 진핵 세포, 예를 들면 포유동물 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되며, 면역계의 세포, 예를 들면 선천 또는 후천 면역 세포, 예컨대, 골수 또는 림프 세포이고, 여기에는 림프구, 일반적으로 T 세포 및/또는 NK 세포가 포함된다. 그 밖의 예시적인 세포에는 줄기세포, 예를 들면 다능성(multipotent) 및 전능성(pluripotent) 세포, 유도된 다능성(iPSCs)가 포함된다.
[353] 세포는 일반적으로 일차 세포, 예를 들면 대상자로부터 직접 분리되거나 및/또는 대상자로부터 분리되어 동결된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 T 세포 또는 기타 세포 유형의 1 이상의 서브세트, 예를 들면 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 예를 들면 기능, 활성 상태, 성숙도, 분화 잠재능, 팽창, 재순환, 국소화 및/또는 지속능, 항원-특이성, 항원 수용체의 종류, 특정 장기 또는 분획 내의 존재여부, 마커 또는 시토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화도에 의해 정의되는 바와 탁은 그의 서브집단을 포함한다. 치료될 대상자와 관련하여, 세포는 동종이계(allogeneic) 및/또는 자가(autologous)일 수 있다. 방법에는 기성의 상용(off-the-shelf) 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예를 들면 기성의 상용 기술에서, 세포는 전능성 및/또는 다능성, 예를 들면 줄기 세포, 예를 들면 유도된 전능성 줄기 세포 (iPSCs)이다. 일부 구체예에서, 이 방법은 대상자로부터 세포를 분리, 이를 준비, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 동결보전 전 또는 후에 이를 동일 대상자에게 재도입하는 것을 포함한다.
[354] T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브타입 및 서브집단에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이의 서브타입들, 예를 들면 줄기세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-주입 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들면 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 소포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포를 들 수 있다.
[0355] 일부 구체예에서, 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예컨대, 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염기구이다.
[356] 일부 구체예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 1 이상의 핵산을 포함하며, 그에 따라 이러하나 핵산의 재조합 또는 유전자 조작 산물을 발현한다. 일부 구체예에서, 핵산은 세포 또는 그 세포로부터 수득된 샘플 내에 보통은 존재하지 않는 이종의 것, 예를 들면 다른 생명체 또는 세포로부터 수득된 것이거나, 예를 들어 조작하고자 하는 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 생명체에서 보통 발견되지 않는 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산은 자연발생적인 것이 아니다. 예를 들면 핵산은 복수개의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인들을 인코딩하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 비롯하여, 자연에서 발견되지 않는 핵산이다.
[357] 일부 구체예에서, 조작된 세포의 준비는 1 이상의 배양 및/또는 준비 단계를 포함한다. 예컨대 CAR과 같은 트랜스제닉 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입을 위한 세포는 샘플, 예컨대 생물학적 샘플, 예컨대 대상자로부터 수득 또는 유래된 샘플로부터 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포가 분리되는 대상자는 세포 요법을 필요로 하는 질병 또는 병태에 걸린 대상자 또는 세포 요법이 투여될 대상자이다. 일부 구체예에서 대상자는 특정한 치료적 개재, 예를 들면 세포가 분리, 가공 및/또는 조작될 입양 세포 치료법을 필요로 하는 인간이다.
[358] 따라서, 일부 구체예에서 세포는 일차 세포, 예컨대 일차 인간 세포이다. 샘플에는 대상자로부터 직접 채취된 조직, 유액(fluid), 및 기타 세포 뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전자 조작 (예컨대 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척, 및/또는 인큐베이션과 같은 한 가지 이상의 프로세싱 단계의 결과 얻어지는 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 프로세싱되는 샘플 또는 생물학적 공급원으로부터 직접 얻어지는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예로는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 뇨 및 땀, 조직 및 장기 샘플 및 이들로부터 유래된 프로세싱된 샘플을 들 수 있다.
[359] 일부 측면에서, 세포가 유래 또는 단리되는 샘플은 혈액 또는 혈액-유래된 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 유래된 것이다. 예시적인 샘플로는 전혈, 말초혈액단핵 세포(PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장연관 림프조직, 점막연관 림프조직, 비장, 기타 림프조직, 간, 폐, 위, 소장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도, 또는 기타 장기, 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 예컨대, 입양세포 치료와 같은 세포 치료 맥락에서 샘플에는 예컨대 자가 공급원 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
[360] 일부 구체예에서, 세포는 세포주, 예컨대, T 세포주로부터 유래된다. 일부 구체예에서 세포는 이종발생(xenogeneic) 공급원, 예컨대 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
[361] 일부 구체예에서, 세포 또는 세포 집단들의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반 세포 단리 단계를 포함한다. 몇 가지 예에서, 세포들은 예컨대 원치 않는 성분들을 제거하고, 원하는 성분들을 농축시키거나, 특정 시약에 민감한 세포들을 용해 또는 제거하기 위한 1종 이상의 시약의 존재 하에, 세척, 원심분리, 및/또는 인큐베이션된다. 몇 가지 예에서, 세포들은 밀도, 흡착 특성, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 성질에 기반하여 분리된다.
[362] 몇 가지 예에서, 대상자의 순환 혈액으로부터 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 세포를 수득한다. 일부 측면에서 샘플은 림프구, 예컨대 T 세포, 단핵구, 과립구, B 그 밖에 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포, 및/또는 혈소판을 포함하며 일부 측면에서 적혈구 세포 및 혈소판 이외의 세포들을 함유한다. 일부 구체예에서, 세포의 선별 및/또는 농축 전에, 샘플 또는 샘플 내의 세포는 추가 공정 단계 전에 안착되거나 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서, 최대 48시간, 예컨대 최대 12시간, 24시간 또는 36시간 동안 유지된다. 특정 구체예에서, 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 선택 및/또는 농축되지 않는다. 일부 구체예에서, 샘플 또는 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉시키거나 인큐베이션하기 전에 휴지되거나 유지될 수 있다. 특정 구체예에서, 샘플은 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서, 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉 또는 인큐베이션하기 전 최대 48시간, 예컨대 최대 12시간, 24시간 또는 36시간 동안 유지되거나 안치된다.
[363] 일부 구체예에서, 구체예에서, 대상자로부터 수집된 혈액 세포들을 세척하여 예컨대 혈장 분획을 제거하고 후속 프로세싱 단계를 위하여 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣는다. 일부 구체예에서, 세포들을 인산완충염수(PBS)로 세척한다. 일부 구체예에서, 세척용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수의 또는 모든 2가 양이온을 결여한다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사 설명서에 따라 반자동화식 "병류(flow-through)" 원심분리 (예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)에 의해 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사 설명서에 따라 탄젠트 유동 여과(tangential flow filtration: TFF)에 의해 달성된다. 일부 구체예에서, 세포는 예컨대 Ca++/Mg++가 없는 PBS와 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁된다. 특정 구체예에서, 혈액세포 샘플 성분들을 제거하고 세포들을 배양 배지에 직접 현탁시킨다.
[364] 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 적혈구 세포의 용해 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리에 의해 말초혈액으로부터 백혈구 세포를 준비하는 것과 같은, 밀도-기반 세포 단리방법을 포함한다.
[365] 일부 구체예에서, 단리 방법은 세포 내 하나 이상의 특이 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산의 발현 또는 존재여부에 기초하여 상이한 세포 유형을 분리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 마커에 기반한 공지의 분리 방법들이 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 분리는 친화성-또는 면역친화성-기반 분리이다. 예컨대, 일부 측면에서 단리는 세포 발현 또는 전형적으로 세포 표면 마커와 같은 하나 이상의 마커의 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단을 분리하는 것을 포함하며, 예컨대 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션한 다음, 일반적으로 세척 단계 및, 항체 또는 결합 파트너와 결합된 세포를 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포들로부터 분리함으로써 달성된다.
[366] 이러한 분리 단계는 시약과 결합한 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포들이 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 몇 가지 예에서, 두 가지 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 소망되는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 분리가 최선으로 수행되는 것인, 이종 집단 내의 세포 유형을 특이적으로 동정할 수 있는 항체가 없을 경우 특히 유용할 수 있다.
[367] 분리에 의해 특정 마커를 발현하는 세포 특정 세포 집단 또는 세포가 반드시 100% 농축되거나 제거되는 것은 아니다. 예컨대, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 농축 또는 양성 선택은 그러한 세포의 갯수 또는 밸분율을 증가시키는 것을 가리키는 것이지 그 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 반드시 결과시키는 것은 아니다. 마찬가지로, 예컨대 마커를 발현하는 것처럼 어떤 특정한 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 갯수 또는 백분율을 감소시키는 것을 가리키는 것일 뿐 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 반드시 결과시키는 것은 아니다.
[368] 몇 가지 예에서, 분리 단계를 복수 라운드로 수행하는데, 이 경우 어떤 한 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획을 후속적인 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계로 처리한다. 몇 가지 예에서, 음성 선택에 표적화된 마커에 대해 각각 특이적인 복수개의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 함께 인큐베이션시킴으로써, 단일 분리 단계에 의해 복수개의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 종류에서 발현되는 복수개의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 함께 인큐베이션시킴으로써 복수개의 세포 종류들을 동시에 양성 선택할 수 있다.
[369] 예컨대, 일부 측면에서, 예컨대, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은, 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포와 같은 T 세포의 특별한 하위집단이 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
[370] 예컨대, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이트된 자기 비드 (예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 이용하여 양성 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포는 세포를 하나 이상의 핵산과 접촉시키기 전에 CD3+, CD28+ T 세포를 팽창시키기 위해 항-CD3/항-CD28 컨쥬게이트된 자기 비드 (예컨대 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)와 접촉된다. 특정 구체예에서, 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 항-CD3/항-CD28 컨쥬게이트된 자기 비드와 접촉되지 않는다.
[371] 일부 구체예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구체예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 비교적 고수준 (마커하이)으로 또는 발현되는 (마커+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 기타 결합제와 세포를 함께 인큐베이션함으로써 달성된다.
[372] 일부 구체예에서, T 세포는 비-T 세포, 예를 들면 B 세포, 단핵구, 또는 기타 백혈구 세포, 예를 들면 CD14 상에서 발현되는 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계를 이용하여 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리한다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 1 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 서브집단 상에서 상대적으로 더 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대해 양성 또는 음성 선택에 의해 서브집단으로 추가 소팅될 수 있다.
[373] 일부 구체예에서, CD8+ 세포를 나이브 중심 기억, 이펙터 기억, 및/또는 중심 기억 줄기 세포에 대해, 예컨대 이들 각각의 하위집단과 연계된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 추가로 농축 또는 고갈시킨다. 일부 구체예에서, 효능 증가를 위해, 예컨대 투여 후 장기간 생존, 증식 및/또는 이식을 위해 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축이 수행되는데, 이는 일부 측면에서 이러한 하위집단들에서 특히 원기왕성하다. 참조 [Terakuraet al. (2012) 혈액.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother . 35(9):689-701]. 일부 구체예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 조합에 의해 효능이 추가로 향상된다.
[374] 일부 구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L-서브세트 양쪽 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 이용함으로써, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축 또는 고갈시킬 수 있다.
[375] 일부 구체예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD27 및/또는 CD 127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초한다; 일부 측면에서, 이것은 CD45RA 및/또는 그랜자임(granzyme) B를 발현 또는 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기반한다. 일부 측면에서, TCM 세포가 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L를 발현하는 세포의 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택 처리되는 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포들의 음성 분획으로부터 출발하여 수행된다. 일부 측면에서 이러한 선택은 동시적으로 수행되며 또 다른 측면에서는 순서와 상관없이 순차적으로 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위집단을 준비하는데 사용된 것과 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계를, CD4+ 세포 집단 또는 하위집단을 생성하는데도 이용함으로써, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 양방 모두를 유지하여 후속 단계에서 이용할 수 있으며, 한 가지 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계를 임의로 더 실시할 수 있다.
[376] 특정 예에서, PBMCs 샘플 또는 기타 백혈구 세포 샘플을 CD4+ 세포 선택 처리하여, 음성 분획과 양성 분획 양자 모두를 유지시킨다. 이어서 음성 분획을 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기반하여 음성 선택하고, 중심 기억 T 세포, 예컨대 CD62L 또는 CCR7에 특징적인 마커에 기초하여 양성 선택하되, 이 때 양성 선택과 음성 선택을 순서와 관계없이 수행한다.
[377] 세포 표면 항원을 가는 세포 집단을 동정함으로써 CD4+ T 헬퍼 세포를 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포로 소팅한다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 수득가능하다. 일부 구체예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구체예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L-및 CD45RO-이다.
[378] 일례에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 일반적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 고상 지지체 또는 매트릭스, 예를 들면 자성 비드 또는 상자성 비드와 결합되어 양성 및/또는 음성 선택으로 세포를 분리시킬 수 있다. 예컨대, 일부 구체예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 친화자성) 분리 기술에 의해 분리 또는 단리된다 (문헌 Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks 및 U. Schumacher " Humana Press Inc., Totowa, NJ에서 검토됨).
[379] 일부 측면에서, 분리하고자 하는 세포의 샘플 또는 조성물은 자성 반응성 입자 또는 마이크로입자, 예컨대 상자성 비드 (예컨대 Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같이 자화가능하거나 또는 자성적으로 반응성인 소형 물질과 함께 인큐베이션된다. 자성적으로 반응성인 물질, 예컨대, 입자는 일반적으로 분리하고자 하는, 예컨대 양성 또는 음성 선택이 요구되는 세포 또는 세포 집단 상에 존재하는 예컨대 표면 마커와 같은 분자에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 일반적으로 직접 또는 간접적으로 결합된다.
[380] 일부 구체예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 기타 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 멤버에 결합된 자성적으로 반응성인 물질을 포함한다. 이 분야에는 자성 분리방법에 사용되는 자성적으로 반응성인 많은 물질들이 알려져 있다. 적절한 자성 입자에는 Molday의 미국특허 No. 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 설명된 것들이 포함되며, 이들 문한은 본 발명에 참조 통합되었다. 그 밖의 예로는 예컨대 Owen의 미국특허 No. 4,795,698, 및 Liberti 등의 미국특허 No. 5,200,084에 설명된 콜로이드 크기의 입자를 들 수 있다.
[381] 인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하고 자성 입자 또는 비드에 결합된 예컨대 2차 항체 또는 기타 시약이 샘플 내 세포 상에 존재할 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 그러한 조건 하에서 수행된다.
[382] 일부 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자성적으로 반응성인 세포 또는 그에 결합된 자화가능한 입자들이 자석에 이끌려 비표지 세포로부터 분리된다. 양성 선택의 경우, 자석에 유인되는 세포들이 유지된다; 음성 선택의 경우, 유인되지 않는 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 동일한 선택 단계 동안 양성 및 음성 선택의 조합을 수행하여, 양성 및 음성 분획을 유지하여 추가 분리 단계로 처리하거나 또는 추가 프로세싱한다.
[383] 특정 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 일차 항체 또는 기타 결합 파트너, 이차 항체, 렉틴, 효소, 또는 스트렙타비딘에서 코팅된다. 특정 구체예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커에 특이적인 일차 항체의 코팅을 통해 세포에 결합된다. 특정 구체예에서는 비드가 아닌 세포가 일차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 다음, 세포-유형 특이적인 이차 항체-또는 기타 결합 파트너(예컨대, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구체예에서, 스트렙타비딘-코팅된 자성 입자들은 바이오티닐화된 일차 또는 이차 항체와 연계적으로 사용된다.
[384] 일부 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 후속적으로 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 방치된다; 일부 측면에서, 이들 입자들은 환자에 대한 투여를 위해 세포에 부착된 채로 방치된다. 일부 구체예에서, 자화가능한 또는 자성적으로 반응성인 입자들이 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화가능한 입자를 제거하는 방법은 공지이며 여기에는 예컨대 경쟁적 비-표지 항체의 사용, 및 자화가능한 입자 또는 절단가능한 링커에 컨쥬게이션된 항체의 사용, 등이 포함된다. 일부 구체예에서, 자화가능한 입자들은 생분해성이다.
[385] 일부 구체예에서, 친화성-기반 선택은 자기-활성화 세포 소팅(MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 경유한다. 자기 활성화 세포 소팅(MACS) 시스템은 그에 결합된 자화된 입자들을 갖는 세포의 고순도 선택이 가능하다. 특정 구체예에서, MACS은 비표적 종 또는 표적 종이 외부 자기장 인가 후에 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포들은 그 자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종들은 용리된다. 이어서, 이 1차 용리 단계가 종결된 후, 자기장에 포획된 종들 및 용리되지 않은 종들이 용리 및 회수가능한 일부 방식으로 방출된다. 특정 구체예에서, 비-표적 세포가 표지되어 이질적인 세포 집단으로부터 고갈된다.
[386] 특정 구체예에서, 단리 또는 분리는 당해 방법의 단리, 세포 준비, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계를 1 이상 수행하는 시스템, 디바이스 또는 장치를 이용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 예컨대 실수, 사용자 핸들링 및/또는 오염으르 최소화하기 위해 밀폐 또는 멸균 환경에서 이들 단계들을을 각각 수행하는데 이용된다. 일례에서, 시스템은 국제특허출원, 공개번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380 A1에 설명된 바와 같은 시스템이다. 일 실시에에서, 시스템은 국제특허공개 WO2016/073602에 설명된 것이다.
[387] 일부 구체예에서, 시스템 또는 장치는 통합형 또는 자납식 시스템, 및/또는 자동화 또는 프로그램 방식으로, 단리, 가공, 조작 및 제형화 단계들 중 1 이상, 예컨대 모두를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자로 하요금 결과를 프로그램, 제어, 평가하거나 및/또는 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계들의 다양한 측면을 조정할 수 있도록 해주는, 시스템 또는 장치와 교통하는 컴퓨터 프로그램 및/또는 컴퓨터를 포함한다.
[388] 예컨대 밀폐 및 멸균 시스템에서 임상-규모 수준으로 세포를 자동화 분리하기 위해, 일부 측면에서, 분리 및/또는 기타 단계들은 CliniMACS 시스템(Miltenyi BBiotec)을 이용하여 수행된다. 부품으로는 일체형 마이크로컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프, 다양한 핀치 밸브를 들 수 있다. 일부 측면에서 일체형 컴퓨터는 장비의 모든 부품들을 제어하여 시스템으로 하여금 표준화된 시퀀스로 공정을 반복 수행하게 할 수 있다. 일부 측면에서 자성 분리 유닛은 이동가능한 영구자석 및 선택 컬럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트를 통해 유속을 조절하고 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 흐름과 세포의 지속적인 현탁을 통제한다.
[389] 일부 구체예에서, 자동화 분리, 예컨대 일부 측면에서 CliniMACS 시스템을 이용한 분리는 멸균된 비발열성 용액에 공급되는 항체-커플링된 자화가능한 입자를 이용한다. 일부 구체예에서, 세포를 자성 입자로 표지한 후 세포들을 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 제조 백을 튜빙 세트에 연결한 다음 이것을 완충액을 함유하는 백과 세포 수집 백에 연결한다. 튜빙 세트는 예비-컬럼 및 분리 컬럼을 비롯하여, 미리-조립된 멸균 튜빙으로 구성되며, 1회 사용만을 염두에 둔 것이다. 분리 프로그램 개시 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 자동적으로 적용한다. 표지된 세포들은 컬럼 내에 유지되는 한편, 비표지 세포들은 일련의 세척 단계로부터 제거된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 표지되지 않으며 컬럼에 유지되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 표지되며 컬럼 내에 유지된다. 일부 구체예에서, 본 발명에 설명된 방법에 사용되기 위한 세포 집단은 자기장 제거 후 컬럼으로부터 용리되어, 세포 수집 백에 수집된다.
[390] 특정 구체예에서, 분리 및/또는 기타 단계들은 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 이용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 일부 측면에서 자동화 세척 및 원심분리에 의한 세포의 분획화를 가능케 해주는 세포 가공 유닛이 구비되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 소스 세포 산물의 현거시적인 층을 알아차림으로써 최적 분획화 종말점을 탐지하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 말초 혈액을 적혈구, 백혈구 및 혈장 층 내로 자동 분리한다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 예컨대 세포 분화 및 성장, 항원 로딩 및 장기간 세포 배양 등의 세포 배양 프로토콜을 달성하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함할 수도 있다. 인풋 포트는 배지의 멸균 제거 및 재보충을 가능케하며 일체형 현미경을 이용하여 세포를 모니터링할 수 있다. 예컨대, Klebanoff et al.(2012) J Immunother . 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) 혈액.1:72-82, 및 Wang et al. (2012) J Immunother . 35(9):689-701 참조.
[391] 일부 구체예에서, 복수개의 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포를 유동 스트림에서 처리하는, 유세포분석법을 통해 본 발명에서 설명된 세포 집단을 수집 및 농축 (또는 고갈)시킨다. 일부 구체예에서, 예비 스케일 (FACS)-소팅을 경유하여 본 발명에 설명된 세포 집단을 수집 및 농축한다. 특정 구체예에서는 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 마이크로전기기계 시스템(MEMS)를 이용함으로써 본 발명에 설명된 세포 집단을 수집 및 농축시킨다 (참조: 예컨대, WO 2010/033140, Cho 외 (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin (2008) J Biophoton. 1(5):355-376). 양자 모두에 있어서, 세포를 복수개의 마커로 표지할 수 있으므로, 잘-장의된 T 세포 서브세트를 고순도로 단리해낼 수 있다.
[392] 일부 구체예에서는, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이화하기 위해 항체 또는 결합 파트너를 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지한다. 예컨대, 분리는 형광 표지된 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 몇 가지 예에서, 1개 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 기타 결합 파트너의 결합에 기초한 세포 분리를 유체 스트림에서, 예컨대, 예비 규모(FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEM) 칩을 비롯한, 형광-활성화 세포 소팅(FACS)에 의해, 유세포 검출 시스템과 조합하여 수행한다. 이러한 방법에 의해 복수 마커에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 수행할 수 있다.
[393] 일부 구체예에서, 준비 방법은 세포를 단리, 인큐베이션 및/또는 조작하기 전 또는 후에 세포를 동결, 예컨대 동결보존하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 동결 및 후속되는 해동 단계는 세포 집다에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거한다. 일부 구체예에서, 세포는 예컨대 혈장 및 혈소판 제거를 위한 세척 단계 후에 동결 용액 중에서 현탁된다. 일부 측면에서, 다양한 공지의 동결 용액 및 변수들이 이용될 수 있다. 그 한 가지 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 PBS , 또는 기타 적절한 세포 동결 매질을 이용하는 것이다. 이어서 이를 매질과 1:1로 희석하여 DMSO 및 HSA의 최종 농도를 각각 10% 및 4%로 한다. 이어서 일반적으로 세포를 분 당 1℃의 비율로-80℃까지 동결시키고 증기상 액체질소 보관 탱크에서 보존한다.
[394] 일부 구체예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 그와 관련하여 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화, 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예를 들면, 세포를 배양 또는 재배하기 위한 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시 또는 백에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물 또는 세포를 자극 조건 또는 자극 제제 존재 하에 인큐베이션한다. 이러한 조건은 항원 노출 모방, 및/또는 예를 들면 재조합 항원 수용체 도입과 같은 유전자 조작을 위한 세포 프라임을 위해, 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하도록 설계된 것들을 포함한다.
[395] 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예컨대 영양제제, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자, 예를 들면 시토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포 활성화를 위해 설계된 기타 제제 중 1가지 이상을 포함할 수 있다.
[396] 일부 구체예에서, 자극 조건 또는 제제는 1 이상의 제제, 예컨대, TCR 복합체의 세포내 시그널링 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 제제는 T 세포 내에서 TCR/CD3 세포내 시그널링을 촉발 또는 개시한다. 이러한 제제로는 항체, 예를 들면 TCR에 특이적인 것들, 예컨대, 항-CD3을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 자극 조건은 하나 이상의 제제, 예컨대 항-CD28과 같은 공동자극 수용체를 자극할 수 있는 리간드를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 제제 및/또는 리간드는 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 임의로, 팽창 방법은 또한 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계 (적어도 약 0.5ng/ml의 농도로)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 자극 제제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, IL-2 농도는 적어도 약 10 유닛/mL이다.
[397] 일부 측면에서, 인큐베이션은 Riddell 등의 미국특허 No. 6,040,177, Klebanoff et al.(2012) J Immunother . 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) 혈액.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother . 35(9):689-701에 설명된 기술에 따라 수행된다.
[398] 일부 구체예에서, T 세포는 예컨대 비-분열성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 조성물 피더 세포를 첨가함하고 (예컨대 결과적인 세포 집단이 증식시키고자 하는 초기 집단 중의 각각의 T 림프구에 대해 PBMC 피더 세포를 적어도 5, 10, 20, 또는 40배 또는 그 이상 함유하도록); 배양체를 인큐베이션 (예컨대 일부 T 세포들이 증식하는데 충분한 기간 동안) 함으로써 증식된다. 일부 측면에서, 비분열 피더 세포들은 감마선이 조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위로 PBMC에 감마선을 조사한다. 일부 측면에서, T 세포 집단을 첨가하기에 앞서서, 배양 배지에 피더 세포를 첨가한다.
[399] 일부 구체예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도예컨대, 적어도 약 25℃, 일반적으로 적어도 약 30도, 및 일반적으로 약 37℃를 포함한다. 필요에 따라, 인큐베이션은 피더 세포로서 비분열 EBV-형질전환된 림프모구 세포(LCL)을 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL에 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 감마선을 조사할 수 있다. 일부 측면에서 LCL 피더 세포가 적절한 양, 예컨대 적어도 약 10:1의 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포 비율로서 제공된다.
IV. 조성물
[400] 본원은 또한 본원에 제공된 바와 같은 항체 등의 결합 분자를 포함하는 조성물, 에컨대 의약 조성물 (pharmaceutical compositions) 및 제형 (formulations)도 제공한다. 조성물과 제형은 하나 이상의 선택적인 허용가능한 담체 또는 부형제를 일반적으로 함유한다.
[401] "의약 제형(pharmaceutical formulation)"이라는 용어는 그러한 형태에서, 그에 함유된 활성 성분의 생물확적 활성이 유효하게끔 허용해주는 제제로서, 상기 제형이 투여될 대상자에게 허용불가능하게 독성인 부가적인 성분들을 전혀 함유하지 않는 제제를 가리킨다.
[402] "약학적으로 허용가능한 담체"라 함은 의약 조성물 내에서 활성 성분이 아니면서 대상자에게 비독성인 성분을 가리킨다. 약학적으로 허용가능한 담체의 비제한적인 예로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 들 수 있다.
[403] 일부 측면에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정한 세포, 결합 분자, 및/또는 항체, 및/또는 투여 방법에 따라 결정된다. 따라서, 적절한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 의약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적절한 보존제로는 예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 및 염화 벤잘코늄을 들 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 설명되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예를 들면 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들면 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들면 EDTA; 당 예를 들면 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온 예를 들면 소듐; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다.
[404] 완충제는 일부 측면에서 조성물에 포함된다. 적절한 완충제의 예로는 시트르산, 소듐 시트레이트, 인산, 포타슘 포스페이트, 및 그 밖에 다양한 및 염을 들 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 총 조성물에 대해 일반적으로 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투약가능한 의약 조성물의 제조 방법은 공지이다. 예시적인 방법은 예를 들면 문헌 [Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 자세히 설명되어 있다.
[405] 일부 측면에서, 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적절한 보존제로는 예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 및 염화 벤잘코늄을 들 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 설명되어 있다. 허용가능한 담체는: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예를 들면 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들면 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들면 EDTA; 당 예를 들면 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온 예를 들면 소듐; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다.
[406] 항체 제형은 동결건조 제형 및 수용액을 포함할 수 있다.
[407] 일부 구체예에서, 조성물은 멸균 액상 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이들은 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물에 비해 제조하기가 더 쉽다. 이에 더해, 액상 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기가 다소 더 간편하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 장기간 접촉을 제공하기 위해 적절한 점도 범위를 갖도록 제제화될 수 있다. 액상 및 점성 조성물은 예컨대 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
[408] 예컨대 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합된 용매에 결합 분자를 혼입시킴으로써 주사가능한 멸균 용액을 제조할 수 있다. 조성물은 동결건조될 수도 있다. 투여 경로 및 소망되는 제제에 따라 조성물은 보조 제제, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예컨대 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도증강 첨가제, 방부제, 풍미제, 색소 등을 함유할 수 있다. 일부 측면에서 적절한 제제를 제조하기 위해, 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
[409] 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성과 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 이용함으로써 주사가능한 의약 형태를 장기간 흡수시킬 수 있다.
[410] 조성물은 동결건조될 수도 있다. 조성물은 보조 제제, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예컨대 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도증강 첨가제, 방부제, 풍미제, 색소 등을 함유할 수 있다. 일부 측면에서 적절한 제제를 제조하기 위해, 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
[411] 생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예컨대 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 쉽게 달성가능하다.
V. 방법 및 항체의 용도
[412] 일부 구체예에서, 본원은 하나 이상의 항-이디오타입 항체의 사용을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본원은 CAR 또는 CAR을 발현하는 세포와 같은 표적 항체를 측정하거나 검출하는 방법 및 CAR의 활성 또는 CAR을 발현하는 세포의 활성 등, 표적 항체의 활성을 변형시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 항-이디오타입 항체는 CAR 및/또는 CAR을 발현하는 세포를 결합, 검출, 동정 및/또는 정량한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 방법은 하나 이상의 항-이디오타입 항체를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 여겨지는 세포 또는 샘플과 접촉 및/또는 인큐베이션하는 하나 이상의 단계를 제공한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 항-이디오타입 항체와 표적 항체, 예를 들어 CAR 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건하에 조성물 또는 샘플로 처리, 배양 및/또는 접촉된다. 일부 측면에서, 복합체는 CAR을 검출, 분리 및/또는 측정하기 위한 목적으로 활용 될 수 있다. 일부 구체예에서, 복합체의 형성은 수용체 시그널링 활성을 자극하거나, 또는 일부 구체예에서, CAR과 항원과의 연게를 방지함으로써 예컨대 CAR과 같은 표적 항체의 활성을 길항시킴으로써 CAR과 같은 표적 항체의 활성을 us형시킨다.
A. 검출 및/단리 방법
[413] 일부 구체예에서, 항체, 예컨대, 표적 항체의 검출, 결합 및/또는 단리를 위해, 이러한 항-이디오타입 항체를 하나 이상 함유하는, 항-이디오타입 항체들, 및/또는 분자들 (예컨대 컨쥬게이트 및 복합체) 중 하나 이상을 사용하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 샘플 및/또는 조성물에 하나 이상의 항-이디오타입 항체를 접촉, 인큐베이션 및/또는 노출시키는 하나 이상의 단계를 제공한다. 일부 구체예에서, 샘플 및/또는 조성물은 하나 이상의 항-이디오타입에 의해 결합되거나 및/또는 인식되는 표적 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편을 갖거나, 가질 가능성이 있거나, 및/또는 갖는 것으로 의심된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 항 이디오타입 항체에 의해 결합되거나 또는 인식되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 융합 도메인을 포함하거나 및/또는 융합 단백질이다. 특정 구체예에서, 표적 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편은 CAR이다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 항-CD19 항체 (예를 들어, 항체 SJ25C1 또는 FMC63) 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하고 및/또는 이를 인지하며, 키메라 분자 또는 이를 포함하는 컨쥬게이트, 그러한 항-CD1919 항체 (예컨대 항체 단편)이 포함된다.
[414] 일부 구체예의 방법은 표적 항체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플 및/또는 조성물을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 인큐베이션은 조성물에 존재하는 표적 항체에 항-이디오타입 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서, 예컨대 항-이디오타입 항체와 표적 항체를 함유하는 복합체 형성을 위해 수행된다.
[415] 일부 구체예에서, 샘플 및/또는 조성물은 표적 항체, 예컨대, CAR를 함유하거나 함유하는 것으로 의심된다. 특정 구체예에서, 샘플 및/또는 조성물은 표적 항체, 예컨대, CAR을 발현하는 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심된다. 특정 구체예에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 특정 구체예에서, 샘플은 혈청 샘플 또는 혈액 샘플이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 면역 세포들을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 또는 상피 조직과 같은 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 생물학적 샘플은 심장, 혈관계, 타액선, 식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 내장, 결장, 직장, 시상 하부, 뇌하수체, 송과선, 갑상선, 부갑상선, 신장, 요관, 방광, 요도, 림프계, 피부, 근육, 뇌, 척수, 신경, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 인두, 후두, 기관지, 기관지, 폐, 횡격막, 뼈, 연골, 인대 또는 힘줄이거나 이로부터 유래된다. 구체예에서, 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 채취, 수집 및/또는 수득된다. 특정 구체예에서, 샘플은 생균 및/또는 손상되지 않은 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 샘플은 파쇄 및/또는 용해된 균질물 및/또는 세포이거나이를 함유한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 및/또는 조직으로부터 단리된 단백질 및/또는 항체를 함유한다.
[416] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표적 항체, 예컨대, CAR와 복합체를 형성하거나 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 복합체는 예를 들어 조성물 또는 샘플에서 표적 항체의 검출, 동정, 측정 및/또는 정량화를 가능케 위해 검출, 측정, 정량화 및/또는 평가된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 샘플에서 항-이디오타입 항체 및 표적 항체 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계 및/또는 상기 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 복합체는 검출 가능한 라벨을 함유한다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 검출 가능한 표지를 함유하는 면역 컨쥬게이트이다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 검출 가능한 표지를 포함하거나, 이와 결합되거나, 및/또는 이에 부착된다. 일부 구체예에서, 상기 복합체는 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트되거나, 결합하거나 및/또는 부착된 항-이디오타입 항체, 예를 들어 제2 항체에 결합하거나 및/또는 이를 인식하는 항체를 포함한다.
[417] 일부 구체예에서, 예를 들어 샘플 또는 조성물에서 표적 항체를 검출, 정량화, 검출 및/또는 평가하는 방법은 표적 항체와 항 이디오타입 항체의 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 복합체는 검출 가능한 표지를 함유한다. 특정 구체예에서, 복합체는 검출가능한 표지로 프로브 및/또는 접촉된다. 일부 구체예에서, 복합체는 유세포 계측법, 면역세포화학법, 면역조직화학법, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA와 같은 임의의 적합한 방법 또는 수단에 의해 검출되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
[418] 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 세포에 결합되거나 세포 표면 상에 발현된다. 특정 구체예에서, 표적 항체, 예를 들어 CAR 세포에 결합되거나 포함되지 않으며, 예컨대, 일부 구체예에서 표적 항체는 분비된다. 특정 구체예에서, 항체는 세포 표면으로부터 분리, 제거 및/또는 용해되었다.
[419] 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 세포의 표면 상에 발현되는 CAR과 같은 키메라 항원 수용체(CAR)에 함유되어있다. 일부 구체예에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어 iPSC, 또는 면역 세포이다. 일부 구체예에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼T 세포들, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연발생적 및 적응 조절T (Treg) 세포, 헬퍼T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포조절 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및/또는 델타/감마 T 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 조직, 예컨대 심장, 혈관계, 타액선, 식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 장, 결장, 직장, 시상 하부, 뇌하수체, 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신 뇌, 척수, 신경, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 인두, 후두, 기관지, 기관지, 폐, 횡격막, 뼈, 연골, 인대, 또는 힘줄로부터 유래한다.
[420] 일부 구체예에서, 표적 항체는 항-CD19 항체이다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 이로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 기재된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO : 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 FMC63 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 이로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO : 30에 기재된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO : 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[421] 일부 구체예에서, 본원은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편 (및/또는 그러한 항체, 예컨대, 항체 단편을 포함하는 키메라 분자, 예컨대 CAR)과 같은 표적 항체를 검출하는 방법을 제공하며 이 방법은, 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을, 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트와 접촉시키는 단계, 및 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 조성물 내 항-이디오타입 항체과 표적 항체 사이에 복합체가 형성되었는지를 검출하는 단계, 예컨대 그러한 결합의 존재나 부재 또는 그 수준을 검출하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 세포에 결합하거나 세포 표면에서 발현되며 검출은 항-이디오타입 항체와 결합된 세포를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출을 위해 직접 또는 간접적으로 표지된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[422] 일부 구체예에서, 본원은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편 (및/또는 그러한 항체, 예컨대, 항체 단편을 포함하는 키메라 분자, 예컨대 CAR)과 같은 표적 항체를 단리하는 방법을 제공하며 이 방법은 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 조성물 및/또는 샘플을 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트와 접촉시키는 단계, 및 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체를 포함하는 복합체를 단리하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 항체는 항-이디오타입 항체와 함께 단리되거나 또는 그의 항원 결합 단편은 면역컨쥬게이트, 예컨대 섹션 I-F에서 설명된 면역컨쥬게이트이다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 세포에 결합되거나 세포 표면에서 발현되며 단리는 항-이디오타입 항체와 결합된 세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체를 포함하는 복합체는 친화성-기반 분리에 의해 단리된다. 일부 구체예에서, 친화성-기반 분리는 면역친화성-기반 분리법, 자성-기반 분리법, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[423] 일부 구체예에서, 본원은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 CAR을 발현하는 세포의 검출 방법을 제공하며, 이 방법은 CAR을 발현하는 세포를 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트와 접촉시키는 단계, 항-이디오타입 항체와 결합된 세포를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출을 위해 직접 또는 간접적으로 표지된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[424] 특정 구체예에서, 본원에 설명된 항-이디오타입 항체로 표적 항체를 검출하는 방법은 대상자에서 표적 항체를 평가하는데 이용된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원은 치료용 세포 조성물의 CAR 발현 세포의 생체 내 약물동태학, 팽창 및/또는 지속성을 평가, 측정 및/또는 정량하기 위한 항-이디오타입 항체의 사용 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 제공된 방법에서 세포의 생체 내 약물동태학, 팽창 및/또는 지속성 및/또는 예를 들어 CAR-T 세포 요법과 같은 면역 요법을 위해 투여된 CAR 발현 세포를 발현하는 CAR과 같은 세포의 표현형 또는 세포의 기능적 활성의 변화는 본원에 제공된 항-이디오타입 항체에 의해 측정가능하다. 일부 구체예에서, CAR 발현 세포의 약물동태학, 팽창 및/또는 지속성을 측정하고, 대상자 및/또는 대상자로부터 수득된 샘플에서 CAR을 발현하는 세포의 존부 및/또는 양을 평가한 다음 본원에 제공된 항-이디오타입 항체로 치료제를 투여하는 동안 및/또는 투여 후에 치료용 세포 조성물을 투여한다.
[425] 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체는 대상자의 혈액 또는 혈청 또는 장기 또는 조직 샘플 (예컨대 병소, 예컨대 종양 샘플)에서 재조합 수용체 (예를 들어, T-세포 기반 요법을 위해 투여되는 CAR-발현 세포)를 발현하는 세포의 양을 평가하기 위해 유세포 계측법과 함께 사용된다. 일부 측면에서, 지속성은 예를 들어 혈액 또는 혈청과 같은 샘플 1 마이크로리터 당 CAR-발현 세포의 수, 또는 샘플 1 마이크로리터 당 말초혈액단핵 세포 (PBMC) 또는 백혈구의 총 개수로서 정량된다. 특정 측면에서, 팽창은 시간 경과에 따라, 혈액 또는 혈청과 같은 샘플들 간에 1 마이크로리터 당 CAR-발현 세포의 수의 증가로서, 또는 샘플 1 마이크로리터 당 말초혈액단핵 세포 (PBMC) 또는 백혈구의 총 개수의 증가로서 정량된다. 일부 구체예에서, 약물동태학, 팽창, 및/또는 지속성은 대상자 및/또는 대상자로부터 수집된 샘플 내에서 CAR 발현 세포의 여러 시점에서의 양을 검출함으로써 측정 또는 평가된다. 특정 구체예에서, 치료용 세포 조성물 투여로부터 24시간, 48시간,72시간, 4일,5일, 6일,7일, 10일, 14일,21일, 3주일, 4주일, 5주일, 6주일,7주일, 8주일, 9주일, 10주일, 11주일, 12주일, 3개월, 4개월, 6개월, 1년 또는 1년 이후 이내에 하나 이상의 샘플이 수집, 수득 및/또는 채취된다.
[426] 일부 구체예에서, 항체 SJ25C1 또는 FMC63 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 선별하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단을, 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트와 접촉시키는 단계 및 항-이디오타입 항체와 결합된 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체와 결합된 세포는 친 화성-기반 분리에 의해 선택된다. 일부 구체예에서, 친화성-기반 분리는 면역친화성-기반 분리법, 유세포 계측법, 자성-기반 분리법, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 지지체 또는 고정상에 가역적으로 결합되거나 고정된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[427] 일부 구체예에서, 본원은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 CAR을 검정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) CAR로 형질도입된 T 세포를 CAR을 표적으로 하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인큐베이션하는 단계; b) 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 결합된 세포의 백분율을 결정하는 단계; 및 c) 항-이디오타입 항체-결합된 T 세포의 백분율에 기반하여 CAR을 검정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표지되고, 항-이디오타입 항체-결합된 T 세포들은 유세포 계측법에 의해 분석된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[428] 또한 본원은 항-이디오타입 항체에 의해 인식되는 CAR, 예컨대 항-CD19 항체 (예컨대, 항체 SJ25C1 또는 FMC63)와 같은 표적 항체를 포함하는 CAR의 검출에 의해, 개체에서 치료 결정을 알리기 위한, 항-이디오타입 항체, 및 상기 항-이디오타입 항체 중 하나 이상을 함유하는 분자(예컨대 컨쥬게이트 및 복합체)의 사용을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 CAR T 세포들, 예컨대 항-CD19 CAR T 세포들의 투여를 포함하는 치료법과 연계하여 개체에서 치료 결정을 알리기 위한 것이다. 일부 구체예에서 이들 방법은 생물학적 샘플을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션 및/또는 프로브하고 및/또는 개체에게 항-이디오타입 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양 또는 암 조직 또는 그의 생검물 또는 그의 절편과 같은 세포 또는 조직 또는 그의 일부를 포함한다. 특정 구체예에서, 인큐베이션은 샘플에 존재하는 CAR에 항-이디오타입 항체가 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 수행된다. 일부 구체예에서, 이 방법은 샘플 내에서 항-이디오타입 항체와 CAR 사이에 복합체가 형성되었는지를 검출하는 것, 예컨대 그러한 결합의 존부 또는 결합 수준을 검출하는 것을 더 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
[429] 일 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 개체에서 CART 세포 요법에 대한 조정이 필요한지 여부를 결정하는데 사용되며 여기서 예컨대 개체 내 CAR T 세포 수준이 낮으면 그러한 요법이 조정될 필요가 있음을 가리킨다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항-CD19 항체이다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 그로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO : 23에 기재된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO : 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편이거나 이로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[430] 일부 구체예에서, 본원은 CAR이 표적 항체, 예컨대 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편를 포함하는 CAR T 세포 요법을 개체에서 평가하는 방법을 제공하며, 이 방법은 개체로부터의 샘플을 CAR을 표적화하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션하는 단계 및 항-이디오타입 항체와 결합된 T 세포의 양을 결정하는 단계, 그리고 항-이디오타입 항체-결합된 T 세포들의 양에 기반하여 상기 요법의 잠재적인 치료 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표지되며, 항-이디오타입 항체-결합된 T 세포들는 유세포 계측법에 의해 분석된다. 일부 구체예에서, 샘플은 혈액-유래된 샘플이거나 또는 아페레시스(apheresis) 또는 백혈구 추출물(leukapheresis)이거나 또는 이로부터 유래된 것이다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[431] 일부 구체예에서, 본원은 개체에서 CAR T 세포 요법을 평가하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, CAR은 SJ25C1 또는 FMC63이거나 이로부터 유래된 항체, 예컨대 전장 SJ25C1 또는 FMC63의 항원 결합 단편과 같은 표적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 CAR을 표적으로하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예를 들어, CAR의 항체 단편과 같은 항체를 표적으로 함)을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 투여는 치료의 첫 번째 투여 개시 후에 수행된다. 이 방법은 개체의 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 존재를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 하나 이상의 조직/장기 중 적어도 하나에서 항-이디오타입 항체의 존재에 기초하여 해당 요법의 잠재적인 치료 효과를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 표지되고, 개체 내 항-이디오타입 항체의 존재 여부는 표지 검출을 위해 개체를 영상화함으로써 결정된다. 일부 구체예에서, 개체 중 하나 이상의 조직/장기에서 항-이디오타입 항체의 존재를 결정하는 것은 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 수준 또는 그의 결합을 결정하는 것을 포함하거나 또는 수행함으로써 수행된다.
[432] 일부 구체예에서, 상기 방법은 치료의 두 번째 또는 후속 투여를 개시 한 후 및/또는 개체의 하나 이상의 조직/장기에서 항-이디오타입 항체의 존재를 결정한 후에 개체에 항-이디오타입 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 첫 번째 및 두 번째 항체 투여 사이에 개체의 하나 이상의 조직/장기 중 적어도 하나에서 항-이디오타입 항체의 수준 차이에 기초하여 해당 요법의 잠재적인 치료 효과를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[433] 일부 구체예에서, 본원은 CAR이 표적 항체, 예컨대 항체 SJ25C1 또는 FMC63 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 개체에서 CAR T 세포 치료를 조정하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 개체로부터 얻은 샘플을 CAR을 표적으로 하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인큐베이션하거나 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 항-이디오타입 항체와 결합된 T 세포의 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 이 방법은 항-이디오타입 항체-결합된 T 세포의 양에 기초하여 치료법을 조정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 이러한 구체예의 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체-결합된 T 세포들은, 예컨대 일부 사례에서 CAR-T 세포 및 항-이디오타입 항체가 투여된 대상자로부터의 샘플을 유세포 계측법에 의해 분석하는 것과 같이 생체내 또는 생체외에서 영상화한다. 일부 구체예에서, 샘플은 혈액-유래된 샘플이거나, 및/또는 아페레시스(apheresis) 또는 백혈구 추출물(leukapheresis) 산물이거나 또는 이로부터 유래된 것이다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[434] 일부 구체예에서, 본원은 개체에서 CAR T 세포 요법을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 CAR이 SJ25C1 또는 FMC63의 항원 결합 단편을 비롯, 항체 SJ25C1 또는 FMC63과 같은 표적 항체를 포함하는, CAR-T 세포 요법에 대해 수행된다. 일부 구체예에서 이 방법은 치료제를 제1 투여량으로 투여 개시한 후 CAR을 표적으로 하거나 또는 이와 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개체에게 투여하고, 개체의 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 존재, 부재 또는 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 표지되고, 일부 이러한 구체예에서, 개체에서 항-이디오타입 항체의 존재는 표지를 검출하기 위해 개체 내 영상화에 의해 결정된다. 일부 구체예에서, 개체의 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 존부를 결정하는 것은 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 수준 또는 그의 결합을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 치료제의 2차 또는 후속 투여량 투여를 개시한 후 개체에게 항-이디오타입 항체를 투여하는 단계 및 일부 측면에서 개체의 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 존부 또는 수준을 결정하는 단계, 및/또는 첫 번째와 두 번째 항-이디오타입 항체 투여 사이에 개체의 하나 이상의 조직/장기에서의 항-이디오타입 항체의 수준 차이에 기초하는 것과 같은 관찰에 기초해서 치료법을 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[435] 일부 측면에서, (i) 혈액 또는 생물학적 샘플 내에서 검출가능한 T 세포 요법의 세포의 수가, 검출가능하였다가, 검출가능하지 않거나 감소되는 경우, 선택적으로 T 세포 요법제 투여 후 선행 시점에 비해 감소된 경우; (ii) 혈액 또는 기타 생물학적 샘플 내 검출가능한 T 세포 치료법의 세포 수가, T 세포 요법제 투여 개시 후, 선택적으로 첫 번째, 두 번째, 또는 후속 투여 후 대상자의 혈액 또는 생물학적 샘플에서 검출가능한 T 세포 요법의 최대 세포 수에 비해 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 이상 감소된 경우; (iii) 대상자 혈액 내 검출가능한 T 세포 치료제의 세포의 최대 수준 시점에서, 대상자의 혈액에서 검출가능한 T 세포 또는 세포의 수가 대상자 혈액 내의 총 말초혈액 단핵 세포(PBMCs)의 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 0.1% 미만인 경우; 및/또는 (iv) 혈액 내 검출가능한 세포 치료제의 CD3+ 또는 CD8+ 세포 수가 μL 당 20 세포 미만, μL 당 15 세포, μL 당 10 세포, μL 당 5 세포 미만, μL 당 1 세포 미만인 경우, 치료법이 조정된다. 일부 구체예에서, 치료는 CAR-T 세포 요법의 하나 이상의 부가적인 투여량 투여, CAR-T 세포 요법의 증가된 투여량 투여, 동일 또는 상이한 항원에 특이적인 대안적인 CAR-T 세포 요법의 투여, CAR-T 세포의 팽창 또는 지속성을 촉진 또는 증가시키기 위해 하나 이상의 면역조절제 또는 기타 제제를 투여하는 것에 의해 조정된다.
[436] 특이적인 항체-항원 결합을 검출하기 위한 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 면역분석법에는 형광분극면역분석법(FPIA), 형광면역분석법(FIA), 효소면역분석법(EIA), 혼탁억제면역분석법(NIA), 효소결합면역흡착분석법(ELISA), 및 방사능면역분석법(RIA)이 포함된다. 분석 장비에 이용가능한 것으로 명시되거나 호환가능한 면역분석 공정으로 종종 알려진 방법의 다양한 사용 조건을 만족하도록, 표시자 부분 또는 표지 그룹을 대상자 항체에 부착시켜 선택할 수 있다. 예시적인 표지의 예로는 방사성핵종(예컨대 125I, 131I, 35S, 3H, 또는 32P 및/또는 크롬 (51Cr), 코발트 (57Co), 불소 (18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 게르마늄 (68Ge), 홀뮴 (166Ho), 인듐 (115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(125I, 123I, 121I), 란타늄 (140La), 루테슘 (177Lu), 망간 (54Mn), 몰리브덴(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴 (142Pr), 프로메티움 (149Pm), 레늄 (186Re, 188Re), 로듐 (105Rh), 루테륨(97Ru), 사마륨 (153Sm), 스칸듐 (47Sc), 셀레늄(75Se), (85Sr), 황 (35S), 테크네슘(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석 (113Sn, 117Sn), 삼중수소(3H), 제논 (133Xe), 이테르븀 (169Yb, 175Yb), 이테륨(90Y),), 효소 (예컨대, 알칼라인 포스파타제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 루시페라제, 또는 β-갈락토시다제), 형광 모이어티 또는 단백질 (예컨대, 플루오레신, 로다민, 피코에리트린, GFP, 또는 BFP), 또는 발광 모이어티 (예컨대, Palo Alto, Calif.에 소재하는 Quantum Dot Corporation사가 공급하는 QdotTM 나노입자)를 들 수 있다. 상기한 다양한 면역분석법을 수행하는데 있어서 다양한 일반 기술이 알려져 있다.
[437] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체들은 표지될 필요가 없고 그의 존재는 임의의 항-이디오타입 항체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출가능하다.
[438] 본원에서 제공되는 항-이디오타입 항체들은 임의의 공지 분석법, 예를 들면 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침전분석법, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)에 사용될 수 있다.
[439] 항-이디오타입 항체들은 또한 생체내 진단 번석법, 예컨대 생체내 조영을 위해 사용될 수도 있다. 일반적으로, 항체를 방사성 핵종(예를 들면 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 또는 3H)으로 표지시켜, 대상자에게 투여 후 관심대상 세포 또는 조직을 생체내에서 국소화시킬 수 있다.
[440] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR-T 세포를 포함하는 하나 이상의 표적 세포가 고체 지지체와 접촉되는 고체 지지체에 고정되거나 결합된다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 웰 또는 플레이트, 예를 들어 세포 배양 플레이트의 표면이다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 예를 들어, 크로마토그래피 분리 또는 CAR + T 세포의 선택을 허용하기 위해 크로마토그래피 컬럼에 존재하거나 함유된 수지 또는 매트릭스이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 고체 지지체에 가역적으로 결합되거나 또는 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 예컨대 항 이디오타입 항체에 존재하는 결합 파트너에 가역적으로 결합하는 것과 같이 결합가능한, 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 친화성 크로마토그래피 매트릭스이다. 예시적인 일 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 스트렙타비딘 결합 펩타이드 고체 지지체에 존재하거나 이에 고정된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자에 결합할 수 있는 다른 스트렙타비딘 결합 모이어티를 포함하며, 일부 경우, 이것은 바이오틴과 같은 경쟁 물질 존재 하에 분리될 수 있다. 이러한 시스템의 예로는 미국공개특허출원 No. US20150024411에 기술된 시스템을 들 수 있다.
[441] 일부 측면에서, 본원에서 제공된 항-ID 항체는 세포 표면에서 발현 될수 있다. 일부 측면에서, 세포-발현된 항-ID 항체는 CAR 세포를 선택적으로 성장시키기 위한 시스템의 일부와 같은 CAR-발현 세포를 유도하거나 자극시키는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 항-ID 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 상에서 발현된다. 항-ID-발현 aAPC는 CAR T-세포 집단의 자극 또는 팽창을 위한 시약으로 사용될 수 있다.
[442] aAPC의 제조 또는 생성 방법은 공지이며 예컨대 미국특허 Nos. 6,225,042, 6,355,479, 6,362,001, 6,790,662; 7,754,482; 미국특허출원공개 Nos.2009/0017000 및 2009/0004142; 및 국제공개 No. WO2007/103009를 참조할 수 있다. 다양한 aAPC가 기술 분야에 알려져 있으며, 예컨대, 미국특허 No. 8,722,400, 미국특허출원공개 No. US2014/0212446; Butler and Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1):10. 1111/imr.12129; Suhoshki et al. (2007) Mol. Ther., 15:981-988를 참조할 수 있다.
[443] aAPC는 MHC 분자, 자극 및 공동자극 분자(들), Fc 수용체, 접착 분자(들) 및/또는 사이토카인 (예컨대 IL-2)을 생산 또는 분비하는 능력의 발현을 포함하는 천연 APC의 특징을 포함한다. 통상적으로, aAPC는 상기 중 하나 이상의 발현이 결핍된 세포주이고, 세포의 자극에 필요한 누락 요소를 하나 이상 도입함으로써(예를 들어, 형질감염 또는 형질도입에 의함) 생성된다.
[444] 일부 구체예에서, aAPC가 되도록 선택된 세포는 세포 내 항원-처리, 세포 내 펩타이드 수송 및/또는 세포내 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자-펩타이드 로딩에 결함이 있다. 일부 측면에서, 이러한 세포는 또한 항원 처리에 관여하거나 이에 관련된 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자 및/또는 분자들을 발현하는 능력도 결여한다. 예시적인 aAPC는 곤충 세포주와 같은 항원 처리(TAP)-결핍 세포주와 관련된 운반체를 구성하거나 이로부터 유도된다. 예시적인 세포주는 Schneider 2 세포주와 같은 초파리 세포주이다 (예컨대 Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 1972 Vol27, pp. 353-365 참조). Schneider 2 세포의 제조, 성장 및 배양에 대한 예시적인 방법은 미국특허 Nos. 6,225,042, 6,355,479, 및 6,362,001에 설명되어 있다.
[445] 일부 구체예에서, 세포는 K652 세포 또는 K562-유래된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 ATCC No. CCL-243로 입수가능한 세포주이다.
[446] 일부 측면에서, aAPC는 추가로 CAR 발현 T 세포의 자극을 강화, 강화 또는 증가시키기 위해 추가의 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 추가 분자는 면역자극 리간드, 공동자극 리간드, 사이토카인 또는 접착 분자이다. 일부 구체예에서, 공동자극 리간드는 T 세포 상에 존재하는 적어도 하나의 공동 자극 분자와 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 공동자극 시그널은 aAPC가 생성된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 공동-자극 시그널 (예컨대 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, 3/TR6 또는 B7-H3의 리간드; 또는 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 톨 리간드 수용체 또는 CD83의 리간드에 특이적으로 결합하는 항체), 세포 부착 분자 (예컨대 ICAM-1 또는 LFA-3) 및/또는 사이토카인 (예컨대 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, 인터페론-알파(IFNα), 인터페론-베타(IFNβ), 인터페론-감마(IFNγ), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자-베타(TNFβ), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 및 과립구 콜로니 자극인자 (GCSF))을 발현하기 위해, 예컨대 형질도입 또는 형질감염에 의해 aAPC가 생성된다. 일부 경우에서, aAPC는 일반적으로 MHC 분자를 발현시키지 않지만, MHC 분자를 발현하도록 조작되거나, 경우에 따라, 사이토카인에 의한 자극에 의해 MHC 분자를 발현하도록 유도되거나 유도될 수 있다. 일부 경우, aAPC에는 또한 예를 들어 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 또는 항-CD2 항체를 포함 할 수있는 자극성 또는 공동자극 리간드가 로딩될 수도 있다. 일부 구체예에서, aAPC는 예컨대 T 세포상의 T 세포 수용체/CD3 복합체를 매개로 하여 세포에서 1차 시그널을 매개할 수 있는 분자를 발현한다. 일부 구체예에서, aAPC는 TCR/CD3 복합체와 특이적으로 결합하여 1차 시그널이 형질도입되도록 자극성 리간드를 포함한다.
[447] 일부 구체예에서, 항-ID는 CAR을 통해 시그널을 전달할 수 있기 때문에, aAPC는 TCR/CD3 복합체와 특이적으로 결합하는 자극성 리간드를 발현하지 않는다. 일부 구체예에서, aAPC는 공동자극 분자를 발현하지 않는다.
[448] 일부 구체예에서, 항-ID는 세포 표면에서의 발현을 위한 단일사슬 단편(scFv)으로서 발현된다. scFV를 인코딩하는 핵산은 막관통 도메인을 인코딩하는 DNA 서열에 융합될 수 있다. 특히, 특정 용도의 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 영역(들)로부터 유래된 것들을 포함한다. 별법으로, 막관통 도메인은 합성된 것일 수 있고,이 경우 그것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함 할 것이다. 일부의 경우, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 예시적인 막관통 도메인은 CD8 또는 CD28로부터 유래된 것들을 포함한다.
B. 세포 자극에서의 용도
[449] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 예컨대 항-CD19 항체 (예컨대, 항체 SJ25C1 또는 FMC63), 또는 그의 항원-결합 단편과 같은, 표적 항체를 함유하는 컨쥬게이트 또는 키메라 수용체를 비롯한 표적 항체를 발현하는 세포들을 자극하는 특이적 활성을 나타내거나 및/또는 그의 작용제이다. 일부 구체예에서, 본원은 항-이디오타입 항체, 및 그러한 항-이디오타입 항체를 하나 이상 함유하는 분자들 (예컨대 컨쥬게이트 및 복합체)의, CAR-발현 또는 기타 키메라 수용체-발현 세포 예컨대 T 세포의 자극 또는 활성화를 위한, 사용을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, CAR 또는 다른 수용체는 표적 항체, 예를 들어 항-CD19 항체 (예컨대, 항체 SJ25C1 또는 FMC63), 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
[450] 일부 구체예에서, 상기 방법은 유전적으로 조작된 T 세포의 제조 방법과 관련하여, 예컨대 표적 항체를 포함하는 CAR과 같은 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산 분자가 예컨대 형질감염, 형질도입 또는 비-바이러스적인 핵산 전달 수단, 예컨대 트랜스포존-기반 접근법에 의해 삽입된, 유전자 조작된 T 세포 또는 기타 세포를 팽창시키는 방법과 관련하여 사용가능하다. 일부 측면에서, 표적 항체는 항-CD19 항체 (예컨대, 항체 SJ25C1 또는 FMC63), 또는 그의 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, 표적 항체는 CAR, 예컨대, 항-CD19 CAR이다. 특정 구체예에서, 항-CD19 CAR은 항체 SJ25C1 또는 FMC63와 같은 항-CD19 항체로부터 유래되거나 수득된 scFv를 함유한다.
[451] 일부 구체예에서 이들 방법은 CAR로 형질도입된 T 세포를 포함하는 샘플을 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 CAR T 세포의 활성화 마커의 생존능, 증식 및/또는 발현을 평가하는 것과 같이 CAR T 세포가 활성화되거나 자극되는지 여부를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항-CD19 항체이다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편이거나 이로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[452] 일부 구체예에서, 본원은 항체 SJ25C1 또는 FMC63 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션함으로써 자극된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것을 포함하는, 세포의 자극 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 CAR에 결합함으로써 인풋 조성물 중의 하나 이상의 세포에서 시그널을 유도 또는 조절하는 조건하에 수행된다. 일부 구체예에서, 세포는 T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
[453] 일부 구체예에서, 본원은 CAR을 발현하는 세포를 함유하는 인풋 조성물을 CAR에 결합하고/하거나 CAR을 인식하는 항-ID 항체와 함께 인큐베이션함으로써 CAR을 발현하는 세포를 자극 또는 팽창시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 항-ID 항체와 CAR 사이의 결합은 CAR을 발현하는 세포의 팽창을 유도함으로 해서, 팽창된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
[454] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 아웃풋 조성물을 생성하기 위해 하나 이상의 세포의 인풋 조성물과 접촉되거나 배양된다. 특정 구체예에서, 상기 인풋 세포 및/또는 상기 인풋 조성물은 인풋 조성물의 세포들의 적어도 일부에 대해 하나 이상의 변화를 일으킴으로써 인풋 조성물을 아웃풋 조성물로 전환시키는 조건 하에서 처리되거나, 인큐베이션되거나, 접촉되는 조성물 및/또는 복수의 세포이다. 일부 구체예에서, 인풋 세포들은 면역 세포의 조성물, 예를 들어 CAR을 발현하는 세포를 함유하는 T 세포의 조성물이다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물 내 세포들의 적어도 일부는 제공된 방법의 실행에 의해, 생성된 아웃풋 조성물에서 활성화, 팽창 및/또는 농축된다.
[455] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 인풋 조성물의 CAR 발현 세포를 팽창시키거나 농축한다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 포유류 세포와 같은 진핵 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물은 인간 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유도 된 세포를 함유한다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물은 면역계 세포, 즉 선천면역 또는 후천면역 세포, 예를 들어 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 골수 또는 림프 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 인풋 조성물은 유도된 다능성 줄기세포 (iPSCs)를 포함하여 다능성 및 전능성 줄기세포와 같은 줄기세포를 함유한다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물은 CD3+ 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물은 CD4+ 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 CD8+ 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 CD4+ 세포의 조성물이다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물은 CD8+ 세포의 조성물이다.
[456] 일부 구체예에서, 상기 방법 및 제제들은 하나 이상의 공동자극 수용체 또는 항원 수용체 또는 사이토카인 수용체와 같은 하나 이상의 천연 시그널링 분자가 결핍되거나 하향조절되지만, 예컨대 항-Id 항체에 의해 인식되는 CAR과 같은 키메라 수용체를 발현하는 T 세포를 자극할 수 있다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물의 세포는 CD28 또는 다른 공동자극 분자 또는 다른 시그널링 분자의 표면 발현에 대해 낮거나 음성이다. 따라서, 일부 구체예에서, 제공된 제제 및 방법은 예를 들어 공동자극 시그널을 제공하거나 전체 활성화를 달성하기 위한 시그널을 제공하는 것과 같이, 원하는 시그널 및/완전한 정도의 그러한 시그널을 제공하기 위해, CD28 또는 다른 내인성 시그널링 분자의 표면 발현을 필요로 하거나 그에 의존할 수 있는 특정한 다른 활성화 또는 자극 제제 또는 방법에 비해 특정 이점을 갖는다. 일부 구체예에서, 제공된 제제 및 방법은 항-CD3/항-CD28 시약 (예 : 비드)과 비교하여 유리하다; 일부 측면에서, 제공된 항-ID 항체는 CD28 또는 다른 천연 시그널링 분자에 대해 낮은 또는 음성인 세포의 활성화 또는 증식과 같은 원하는 효과를 자극하거나 달성할 수 있다는 이점이 있다. 일부 측면에서, 항-ID 항체로 자극함으로써 CAR을 통한 시그널링은 단일 시약만을 사용하여 CAR을 통한 1차 및 2차 (공동자극) 시그널 모두를 초래한다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 CD28 또는 다른 내인성 시그널링 분자를 저수준으로 발현하는 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구체 예에서, 인풋 조성물은 CD28+ 음성이거나 다른 내인성 시그널링에 대해 음성인 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-ID 항체는 CD28을 저수준으로 발현하는 세포 또는 CD28 음성인 세포들 활성화 및/또는 팽창을 자극한다. 일부 구체예에서, 세포는 지지체에 고정되거나 결합된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉된다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구체 예에서, 고체 지지체는 웰 또는 플레이트, 예를 들어 세포 배양 플레이트의 표면이다. 일부 예에서, 항-ID 항체는 가용성이다. 특정 구체예에서, 세포는 세포를 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편와 접촉되기 전에 항-CD3/항-CD28 컨쥬게이트된 시약과 접촉되지 않는다.
[457] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR을 인코딩하는 뉴클레오타이드로 형질도입 또는 형질감염된 세포의 인풋 조성물에 적용, 접촉되거나 또는 이큐베이션된다. 특정 구체예에서, 인풋 세포들을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉시키면 CAR을 발현하는 세포의 팽창 및/또는 농축이 결과된다. 특정 구체예에서, 인풋 세포들을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉시키는 것은 CAR을 발현하지 않는 세포의 팽창 및/또는 농축을 초래하지 않는다. 특정 구체예에서, 인풋 세포들을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉시키는 것은 CAR을 발현하지 않는 세포의 팽창 및/또는 농축을 CAR을 발현하는 세포의 팽창 및/또는 농축에 비해 적어도 50% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 85% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 적어도 99% 미만, 적어도 99.9% 미만 또는 적어도 99.99% 미만으로 초래한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-이디오타입 항체들은 형질도입 및/또는 형질감염 효율이 낮거나, 및/또는 CAR 발현 세포의 함유량이 낮은 인풋 조성물의 CAR 발현 세포를 팽창시키는데 이용된다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR을 발현하는 세포들을 선택적으로 팽창 및/또는 농축시킨다.
[458] 일부 구체예는 형질도입 및/또는 형질감염 효율이 낮거나, 및/또는 CAR 발현 세포의 함유량이 낮은 인풋 조성물의 세포를 팽창 및/또는 농축하는데 있어 항-이디오타입 항체가, 폴리클로날 자극, 예컨대, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 자극에 의해 세포를 팽창 및/또는 농축시키는것보다 더 효과적이라고 고려한다. 특정 구체예에서, 폴리클로날 자극은 인풋 조성물에서 CAR을 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포의 팽창을 야기함으로 해서, 일부 구체예에서, 특히 인풋 조성물이 CAR 발현 세포를 소량 함유하는 경우, CAR 발현 세포를 농축하는데 실패할 수 있다. 이와 대조적으로, 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션은 CAR 발현 세포의 선택적 팽창을 초래하며 따라서 특정 구체예에서 CAR 발현 세포의 선택적인 팽창 및/또는 농축을 초래한다. 일부 구체예에서, 인풋 세포들을 항-이디오타입 항체와 인큐베이션, 접촉 및/또는 처리하는 것은 폴리클로날 자극에 비해 CAR 발현 세포를 더 높은 정도로 농축 및/또는 팽창시키는 결과를 가져온다.
[459] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 폴리클로날 자극에 의해 팽창 및/또는 농축된 인풋 세포들에 비해, 더 적은 양의 바이러스 입자, 더 적은 바이러스 벡터 입자 카피 대 세포 비율로 형질감염 및/또는 형질도입된 인풋 세포와 인큐베이션되거나 그에 적용되거나, 및/또는 접촉된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션된 인풋 조성물은, 폴리클로날 자극에 의해 팽창 및/또는 농축된 인풋 조성물에 비해 세포 당 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 더 적은 IU로 형질도입된 세포로부터 생성된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션된 인풋 조성물은, 폴리클로날 자극에 의해 팽창 및/또는 농축된 인풋 조성물에 비해 적어도 1 x 105 IU/mL, 5 x 105 IU/mL, 1 x 106 IU/mL, 5 x 10 6 IU/mL, 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 또는 1 x 107 IU/mL 더 낮은 바이러스 벡터 입자 역가로 형질도입된 세포로부터 생성된다.
[460] 특정 구체예에서, 높은 IU/세포로 세포를 형질도입하는 것은 높은 형질도입 효율을 유도하지만, 일부 구체예에서는 높은 벡터 카피 수 (VCN)로 세포를 형질도입하는 결과를 일으킬 수 있어, 안전성 위험을 나타낼 수 있고 따라서 규제 기준에 부합하지 않는다. 특정 구체예에서, 세포가 형질 전환 된 IU/세포를 낮추면 형질 도입 효율은 감소하지만 VCN은 낮아질 것이다. 특정 구체예에서, 세포를 형질도입시키는 IU/세포를 저하시키면 형질도입 효율은 낮아지지만 VCN도 저하된다. 특정 구체예에서, 세포를 형질도입시키는 IU/세포를 증가시키면 형질도입 효율은 증가되지만 VCN도 증가하게된다.
[461] 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 항-이디오타입 항체에 의해 결합 또는 인식되는, CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 의해 형질도입 또는 형질감염된 세포 집단, 또는 형질도입되거나 형질감염된 세포로부터 유래된 세포 집단을 함유한다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 CAR을 발현하는 세포를 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만으로 함유한다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물로부터의 세포들은 섹션 III에 설명된 바와 같이 형질감염 또는 형질도입된 것들이다. 특정 구체예에서, 인풋 세포들은 항-CD19 CAR, 예컨대 항체 SJ25C1 또는 FMC63와 같은 항-CD19 항체 및/또는 이로부터 유래된 scFv를 함유하는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 의해 형질도입 또는 형질감염된 세포 집단, 또는 형질도입되거나 형질감염된 세포로부터 유래된 세포 집단을 함유한다.
[462] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체로 인풋 조성물을 인큐베이션, 접촉 또는 처리하는 것은 세포의 자극, 팽창, 및/또는 활성화 조건 하에서 수행되며, 상기 조건은 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예컨대 영양성분, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자들, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키도록 고안된 다른 임의 제제들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[463] 일부 구체예에서, 인풋 조성물의 세포들은 CAR을 인코딩하는 유전자를 포함하는 하나의 핵산으로 형질도입 또는 형질감염된 것이고 세포는 재조합 수용체에 결합되거나 이를 인식하는 항-이디오타입 항체와 접촉, 인큐베이션 또는 이것으로 처리된다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물의 세포들은, 그 세포들이 CAR을 인코딩하는 핵산으로 형질도입 또는 형질감염된 후에 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물의 세포들은, 인풋 조성물의 세포들이 형질도입 또는 형질감염된 직후, 또는, 약 1분 이내, 약 5분 이내, 약 30분 이내, 약 1시간 이내, 약 2시간 이내, 약 4시간 이내, 약 6시간 이내, 약 8시간 이내, 약 12시간 이내, 약 24시간 이내, 약 2일 이내, 약 3일 이내, 약 4일 이내, 약 5일 이내, 약 6일 이내, 약 1주일 이내, 약 2주일 이내, 약 3주일 이내, 약 4주일 이내, 약 5주일, 또는 약 6주일 이내에 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다.
[464] 일부 구체예에서, 인풋 조성물의 세포는 고체 지지체와 결합 또는 부착되지 않은 항체와 접촉되거나 및/또는 가교되지 않은 항체와 접촉된, 가용성 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된다.
[465] 일부 구체예에서, 상기 방법은 항-Id 항체에 의해 인식된 CAR과 같은 키메라 수용체를 발현하는 세포의 증식, 활성화, 자극, 사이토카인 방출, 또는 활성 마커 또는 사이토카인 방출 또는 생산의 상향 조절과 같은 다른 기능적 결과를 가져온다. 일부 측면에서, 이러한 증식 또는 다른 기능적 반응 또는 판독은 항-CD3/CD28 비드 및/또는 가교된 항-CD3과 같은 T 세포의 증식을 자극하는 조건 및/또는 제제와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 유도되는 것과 비슷하거나 더 높은 정도로 그러한 세포에서 유도된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 항-이디오타입 항체의 교차 결합을 수“S하지 않는다. 임의 구체예들의 일부 측면에서, 항-이디오타입 제제는 항 이디오타입 항체의 교차 결합 없이 특정 증식 또는 기능적 결과 또는 그의 정도를 유도할 수 있다. 일부 양태에서, 본원의 항-이디오타입 제제는 항-Id 항체를 교차 결합시키거나 제2 제제를 사용할 필요 없이 T 세포 또는 표적 수용체를 발현하는 다른 면역 세포를 자극하거나 특정한 기능적 결과를 유발하는 능력 측면에서 유리하다. 일부 측면에서, 이러한 결과는 항-이디오타입 항체의 가용성 또는 플레이트-결합 형태로 달성된다. 일부 측면에서, 이러한 결과는 비드에 커플링된 항-이디오타입 항체로 달성된다
[466] 특정 구체예에서, 인풋 조성물의 세포들은
are treated, incubated, 및/또는 contacted with 10 pg/ml 내지 100μg/ml, 1 pg/ml 내지 1ng/ml, 1ng/ml 내지 1μg/l 내지 100ng/ml 및 1.0μg/ml, 1ng/ml 내지 100ng/ml, 10ng/ml 내지 1.0μg/ml, 100ng/ml 내지 10 pg/ml, 250ng/ml 내지 10μg/ml, 250 pg/ml 내지 1ng/ml, 1μg/ml 내지 10μg/ml, 250 ng 내지 약 2. 5μg/ml, 또는 1μg/ml 내지 10μg/ml로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된다.
[467] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 선택적으로, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합가능한 결합 부위를 복수개 포함하는 시약을 포함하거나 이에 컨쥬게이션된, 고체 지지체에 고정된다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 플레이트 또는 웰의 표면이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 선택적으로, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합가능한 결합 부위를 복수개 포함하는 가용성 시약에 고정된다. 일부 구체예에서, 상기 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함한다. 예시적인 일 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 스트렙타비딘-결합 펩타이드 또는, 가용성 시약에 존재하거나 이에 고정된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 결합가능한, 다른 스트렙타비딘 결합 모이어티를 포함하며, 이것은 일부 사레에서, 바이오틴과 같은 경쟁 물질의 존재 하에 해리될 수 있다. 이러한 시스템의 예로는 PCT 공개특허출원 No. WO2015/158868에 설명된 것들을 들 수 있다.
[468] 특정 구체예에서, 인풋 조성물의 세포들은 예를 들어 플레이트 또는 웰과 같은 고체 표면 또는 지지체에 부착, 결합, 코팅 및/또는 컨쥬게이트된 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 상기 고체 표면 또는 지지체를 어떤 농도의 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션함으로써 고체 표면에 부착, 결합, 코팅 및/또는 컨쥬게이션된 것이다. 특정 구체예에서, 고체 표면 또는 지지체는 10ng/ml 내지 100μg/ml, 100ng/ml 내지 1.0μg/ml, 250ng/ml 내지 10μg/ml, 250ng/ml 내지 1μg/ml, 1μg/ml 내지 10μg/ml, 250 ng 내지 2. 5μg/ml, 또는 1μg/ml 내지 10μg/ml의 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 고체 표면 또는 지지체는 250ng/ml 내지 10μg/ml로 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 고체 표면 또는 지지체는 약 0.25μg/ml, 0.5μg/ml, 1.0μg/ml, 1.25μg/ml, 2μg/ml, 2.5μg/ml, 5μg/ml 또는 10μg/ml의 항-이디오타입 항체와 함께 인큐베이션된다.
[469] 일부 구체예에서, 인큐베이션은 적어도 약 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 수행된다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물은 조성물 내 총 세포에 대한 백분율로서 CAR-발현 세포들을 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 또는 약 10% 미만으로 함유한다. 일부 구체예에서, 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 세포들의 수는 인풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 수에 비해 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 이상 증가한 것이며; 및/또는 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 백분율은 조성물 내 총 세포에 비해 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상 증가된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션에 앞서, 세포들은 CAR-발현 세포에 대해 선별되거나 농축되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[470] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 인풋 조성물의 하나 이상의 세포들을 팽창시키는 시간만큼, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 인풋 조성물의 세포들을 팽창시키는 시간만큼, 예컨대 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물로부터의 세포를 접촉 또는 인큐베이션시킨다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물로부터의 세포는 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약14일, 적어도 약 3주일, 또는 적어도 약 4주일 동안 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다. 특정 구체예에서, 인풋 조성물로부터의 세포들은 약 1일 미만, 약 2일 미만, 약 3일 미만, 약 4일 미만, 약 5일 미만, 약 6일, 또는 약 12일 미만 동안 항-이디오타입 항체로 처리, 접촉 또는 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 인풋 조성물로부터의 세포들은 약 1일 내지 약 14일, 약 3일 내지 7일, 또는 4일 내지 6일 동안 항-이디오타입 항체로 처리, 접촉 또는 인큐베이션된다.
[471] 특정 구체예에서, 예컨대 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물로부터의 세포들은, 재조합 수용체를 발현하는 인풋 조성물의 세포들을 팽창시키기 위해 실온을 상회하는 온도에서 항-이디오타입 항체로 처리, 접촉 또는 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 처리, 인큐베이션 또는 접촉은 약 25℃ 보다 높은 온도, 예컨대 일반적으로 약 32℃, 35℃ 또는 37℃보다 높은 온도에서 수행된다. 일부 구체예에서, 처리, 인큐베이션 또는 접촉은 약 37℃±2℃의 온도, 예컨대 약 37℃의 온도에서 수행된다.
[472] 일부 구체예에서, 아웃풋 조성물의 세포들의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 약 100%, 또는 100%는 CAR을 발현한다.
[473] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된 아웃풋 조성물의 CAR을 발현하는 세포의 수는, 인풋 조성물의 CAR을 발현하는 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많다.
[474] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된 아웃풋 조성물 내 CAR을 발현하는 세포의 백분율은, 인풋 조성물의 CAR을 발현하는 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많다..
[475] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된 아웃풋 조성물의 CAR을 발현하는 세포의 수는, 항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해 폴리클로날 자극, 인큐베이션을 받은 아웃풋 조성물의 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많다.
[476] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된 아웃풋 조성물의 CAR을 발현하는 세포의 백분율은, 항-CD3 및 항-CD28 항체들에 의해 폴리클로날 자극, 인큐베이션을 받은 아웃풋 조성물의 세포의 수보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 많다.
[477] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체로 처리, 인큐베이션 및/또는 접촉된 아웃풋 조성물의 CAR을 발현하는 세포들은, 폴리클로날 자극된, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체들과 인큐베이션된 아웃풋 조성물의 세포에 비해 VCN을 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적게 함유한다. 일부 구체예에서, 아웃풋 조성물의 CAR 발현 세포의 평균 VCN은 약 10,5, 4,2. 5, 1.5, 또는 1 이하이다.
[478] 일부 구체예에서, 이러한 방법은 예컨대 개체에서 치료 용도로 조작된 세포에서, 조작된 수용체의 발현 및/또는 강도를 시험하는 것을 포함하는 시험 목적상, CAR T 세포와 같은 항-이디오타입 항체에 의해 인식되는 항체 또는 그의 단편을 함유하는 재조합 폴리펩타이드를 발현하는 세포 치료의 생성과 연계하여, 제조, 분석 및/또는 품질 제어 방법의 일부로서, 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 조성물은 CAR 발현 T 세포를 생성하기 위한 방법 중 어느 단계에서든 시험될 수 있다. 특정 구체예에서, 차후 시험 및/또는 분석을 위해 예컨대 동결 및/또는 동결건조에 의해 어느 단계에서는 세포 조성물로부터 세포 샘플을 채취하여 보존할 수 있다. 시험된 조성물은 예컨대, 세포 및 약학적으로 허용가능한 수용체 및/또는 동결건조제를 함유하는 것들을 포함하는 의약 조성물일 수 있다.
[479] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 예컨대 CAR과 같은 표적 항체를 발현하는 세포를 생체내 자극한다. 특정 구체예는 CAR-T 세포 요법이 암 및 다른 질환과 질병을 치료하는데 효과적인 것으로 고려한다. 그러나, 어떤 맥락에서, CAR-T 세포 요법에 이용가능한 접근수단이 항상 전적으로 만족스럽지는 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상자에서 CAR 발현 세포의 노출 및 지속성은 시간이 지랄수록 감소하거나 감퇴한다. 그럼에도, 일부 사례의 관찰 결과, CAR 발현 세포의 증가된 노출은 CAR-T세포 요법의 치료 결과 및 효율을 개선시킬 수 있음을 가리킨다. 그러므로, 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 발현 세포를부스팅, 증강 및/또는 증가시키기 위해 투여된다.
[480] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 발현 세포들을 함유하는 치료용 세포 조성물이 이전에 투여된 바 있는 대상자와 같은 대상자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 대상자에 대한 항-이디오타입 항체의 투여는 일부 사례에서, 항-이디오타입 항체의 투여 전에 초기 피크 팽창 수준에 도달하거나 이를 초과할 수 있는, 대상자에 있어서의 CAR 발현 세포의 재-팽창을 촉진한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 발현 세포의 수준이 저하되거나 검출가능하지 않을 때 CAR 발현 세포의 팽창 및/또는 지속성을 조절하도록 투여된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체에 의해 재-팽창된 CAR 발현 세포들은 이들이 투여되는 대상자에서, 에컨대 항-이디오타입 항체 투여 전의 강도에 비해 더 증가된 강도를 나타낸다.
[481] 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 대상자에서 CAR 발현 세포들의 지속성을 증가 또는 증강시킨다. 일부 구체예에서, CAR 발현 세포들은 항-이디오타입 항체 투여 후 적어도 적어도 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 56일, 63일, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 경과시 또는 6개월 이상 경과시 대상자에서 검출가능하다. 일부 측면에서, 이들 세포에 대한 대상자의 증가된 노출은 세포의 팽창 및/또는 증가된 팽창을 포함한다.
[482] 일부 구체예에서, CAR-발현 세포들은 항-이디오타입 항체의 투여 후 대상자에서 팽창한다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 대상자의 혈액이나 혈청 또는 그 밖의 체액 또는 장기나 조직에서, DNA 1 마이크로그램 당 CAR을 인코딩하는 핵산을 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000 또는 15,000 카피, 또는 1 마이크로리터 당 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9 CAR-발현 세포를 초래한다. 일부 구체예에서, CAR을 발현하는 세포들은 항-이디오타입 항체 투여로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, 또는 52주일 후 또는 항-이디오타입 항체 투여로부터 1, 2, 3, 4, 또는 5년 이상 동안 대상자의 혈액 내 총 PBMC의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60%로서 및/또는 그러한 수준으로서 검출된다. 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 예컨대 대상자의 혈청, 혈장, 혈액 또는 조직, 예컨대, 종양 샘플 내 DNA 1 마이크로그램 당, 재조합 수용체 예컨대 CAR을 인코딩하는 핵산 카피를 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 또는 적어도 20배 증가시킨다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 대상자 내 CAR 발현 세포의 순화 개체수를 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 또는 적어도 20배 증가시킨다.
[483] 일부 측면에서, 1 마이크로리터 당 적어도 약 1 x 102, 적어도 약 1 x 103, 적어도 약 1 x 104, 적어도 약 1 x 105, 또는 적어도 약 1 x 106 또는 적어도 약 5 x 106 또는 적어도 약 1 x 107 또는 적어도 약 5 x 107 또는 적어도 약 1 x 108개의 CAR-발현 세포 및/또는 적어도 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500, 또는 1000개의 CAR 발현 세포들, 예컨대 1 마이크로리터 당 적어도 10개의 세포들이 항-이디오타입 항체 투여 후 혈액, 예컨대 말초 혈액 또는 병소 등과 같은 대상자의 체액, 혈장, 혈청, 조직, 또는 그의 일부에 존재하거나 검출가능하다. 일부 구체예에서, 이러한 세포 개수 또는 세포 농도는 항-이디오타입 항체 투여 후 적어도 약 20일, 적어도 약 40일, 또는 적어도 약 60일, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월, 또는 적어도 2 또는 3년 동안 대상자에서 검출가능하다.
[484] 다양한 전달 시스템이 공지이며 항-이디오타입 항체를 투여하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 리포좀, 마이크로입자 및 마이크로캡슐 내 캡슐화 및/또는 부착에 의해 투여된다. 항-이디오타입 항체의 투여 방법의 비제한적인 예로는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 코속, 경막외 및 경구 경로를 들 수 있다. 항-이디오타입 항체는 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입, 볼러스 주입, 상피 또는 점막 피부 라이닝 (예를 들어, 구강, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 제제와 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 또한 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용 및 에어로졸화제와의 제형에 의해 폐 투여도 수행가능하다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 소포, 특히 리포좀 (Langer, 1990, Science 249 : 1527-1533), 예를 들어 양이온 리포좀 (WO 98140052)을 통해 전달된다.
[485] 일부 구체예에서, CAR을 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입하여 인풋 조성물을 생성시키는 단계, CAR의 항원-결합 도메인에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 인풋 조성물을 인큐베이션함으로써 세포 조성물을 생산하는 단계를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, CAR은 CD19에 특이적으로 결합하는 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 설명된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CAR의 작용제이다. 일부 구체예에서, 상기 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 일렉트로포레이션, 또는 화학형질감염에 의해 핵산 분자 내로 세포를 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 도입은 핵산 분자를 포함하는 레트로바이러스 벡터에 의한 형질도입에 의해, 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입에 의해, 핵산 분자를 포함하는 트랜스포존에 의한 전위에 의해, 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터의 일렉트로포레이션 또는 형질감염에 의해, 세포 내 핵산 분자를 도입하는 것을 포함한다.
[486] 일부 구체예에서, 상기 방법은 CAR를 인코딩하는 핵산 분자의 도입에 앞서, 세포를 자극 또는 활성화하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 세포를 활성화하는 것은 CD3의 작용제 및 선택적으로 CD28의 작용제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포의 활성화는 작용성 항-CD3 및 항-CD28 항체들을 포함하는 시약과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, 항-CD3/항-CD28와 접촉되는 적어도 일부 동안 및/또는 CAR을 인코딩하는 핵산을 도입하는 적어도 일부 동안, 상기 방법은 세포를 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합단편과 접촉시키거나 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인큐베이션은 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 CAR에 결합하는 조건 하에서 수행됨으로 해서, 인풋 조성물 내 하나 이상의 세포에서 시그널이 유도 또는 조절된다. 일부 구체예에서, 세포는 T 세포를 포함한다.
[487] 이러한 구체예의 일부에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합하는 결합 부위를 복수개 포함하는 시약에 선택적으로 컨쥬게이트되거나 이를 포함하는, 고체 지지체에 고정된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 선택적으로, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 부위이거나 또는 이들을 복수개 포함하는 가용성 시약에 고정된다. 일부 구체예에서, 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함한다. 예시적인 일 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 스트렙타비딘-결합 펩타이드 또는, 가용성 시약에 존재하거나 이에 고정된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 결합가능한, 다른 스트렙타비딘 결합 모이어티를 포함하며, 이것은 일부 사레에서, 바이오틴과 같은 경쟁 물질의 존재 하에 해리될 수 있다. 이러한 시스템의 예로는 PCT 공개특허출원 No. WO2015/158868에 설명된 것들을 들 수 있다. 일부 구체예들에서, 인큐베이션은 적어도 또는 약 적어도 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36, 48시간,72시간 또는 96시간 수행된다. 일부 구체예들에서, 인풋 조성물은 조성물 내 총 세포에 대한 백분율로서, 약 60% 미만 (번역자 주: 본 명세서에서 "약"이라는 표현은 그 다음에 나오는 숫자 자체도 포함하는 것으로 한다, 예를 들어 약 60%에는 60%도 포함되는 것으로 한다), 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 또는 약 10% 미만의 CAR-발현 세포들을 함유한다. 일부 구체예에서, 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 수는 인풋 조성물은 조성물 내 CAR-발현 세포의 수에 비해 1.2배, 1.5배,2.0배, 3.0배, 4.0배,5.0배, 10배 또는 그 이상 증가하거나; 및/또는 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 백분율은 조성물 내 총 세포에 비해 10%,20%, 40%,50%, 60%,70%, 80% 또는 그 이상 증가한다. 일부 구체예에서, 도입 및/또는 인큐베이션 전에 세포들은 CAR-발현 세포들에 대해 선별되거나 농축(enriched)되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:24에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다. 이러한 임의의 구체예들의 일부에서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 함유한다.
[488] 일부 구체예에서, 예컨대 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 CAR의 활성을 모니터링하는 방법이 제공되며, 이 방법은 CAR에 결합하거나 이를 표적으로 하는 작용성 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께, CAR로 형질도입된 T 세포를 함유하는 샘플을 인큐베이션하는 단계; 및/또는 CAR T 세포의 활성화, 자극 및/또는 팽창의 존부 또는 그 양을 결정함으로써 CAR-T 세포의 활성을 모니터링하는 단게를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 방법은 CAR을 검정하는데도 이용될 수 있는데 이 경우 상기 방법은 c) CAR-T 세포의 활성화, 자극 및/또는 팽창 수준에 기초하여 CAR을 검정하는 단게를 포함할 수 있다.
[489] 일부 구체예에서, CAR T 세포의 활성화, 자극 및/또는 팽창은 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션 기간 후에 CAR T 세포 내에서 T 세포 활성화 마커의 활성화 마커의 생존능, 증식 및/또는 발현을 결정함으로써 평가된다. 일부 구체예에서, CAR T 세포들의 생존능은 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션 후, 살아있CAR로 형질도입된 전체 T 세포에 대한 살아있는 세포의 백분율을 구함으로써 평가된다. 일부 구체예에서, CAR T 세포들의 증식은 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션에 앞서 CAR T 세포들을 염색하는데 사용된 염료의 희석에 의해 평가된다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커의 발현은 T 세포 활성화 마커를 인식하는 항체에 대한 염색을 이용한 유세포 계측법에 의해 평가된다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD69, CD71, CD134, CD137, 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션 기간은 약 1 내지 약 10일이다 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일, 이들 수치 사이의 임의의 기간 범위도 포함됨)). 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[490] 일부 구체예에서, 본원은 CAR T 세포 조제물(preparation)을 모니터링하는 방법을 제공하되 (여기서 상기 CAR을 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함함), 상기 방법은 a) 조제물의 일부를 CAR에 결합하거나 이를 표적으로 하는 작용성 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인큐베이션하는 단계; 및 b) CAR T 세포의 활성화, 자극 및/또는 팽창의 존부 또는 그의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, CAR-T 세포의 조제물은 시험하고자 하는 특정 조건 하에서 생산 또는 제조된 세포들일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 모니터링은 대상자에 대한 투여에 앞서 상기 세포의 검정을 위한 것과 같은, 방출 분석법과 연계하여 수행된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 c) CAR T 세포의 활성화 수준에 기초하여 조제물을 검정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 조제물 내 CAR T 세포의 활성화는 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션 기간 후에 CAR T 세포 내 T 세포 활성화 마커의 생존능, 증식 및/또는 팽창을 결정함으로써 평가된다. 일부 구체예에서, CAR T 세포의 생존능은 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션 후 CAR에 의해 형질도입된 전체 T 세포에 대한 살아있는 세포의 백분율을 구함으로써 평가된다. 일부 구체예에서, CAR T 세포의 증식은 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션에 앞서, CAR T 세포를 염색하는데 이용된 염료의 희석에 의해 평가된다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커의 발현은 T 세포 활성화 마커를 인식하는 항체에 대한 염색을 이용하는 유세포 계측법에 의해 평가된다. 일부 구체예에서, T 세포 활성화 마커는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD69, CD71, CD134, CD137, 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 인큐베이션 기간은 약 1 내지 약 10일이다 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일, 이들 수치 사이의 임의의 기간 범위도 포함됨). 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
C. 세포 불활성화/고갈에서의 용도
[491] 일부 구체예에서, 제공된 항-이디오타입 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 길항제이거나 및/또는 항-CD19 항체 (예컨대, 항체 SJ25C1 또는 FMC63), 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 발현하는 세포를 저해, 제거 및/또는 고갈시키는 (예컨대 항체-의존성 세포-매개형 세포독성, ADCC에 의한 살해) 특별한 활성을 나타낸다. 또한 본원은 CAR T 세포의 불활성화, 제거, 및/또는 결실을 위해, 그러한 항-이디오타입 항체 중 하나 이상을 함유하는, 제공된 항-이디오타입 항체들, 및 분자들 (예컨대 컨쥬게이트 및 복합체)을 사용하는 것도 포함하며, 여기서 상기 CAR은 항-CD19 항체 (예컨대, 항체 SJ25C1 또는 FMC63), 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 것이다.
[492] 일부 실시 형태의 방법은 CAR로 형질도입된 T 세포를 포함하는 조성물 및/또는 샘플을 항-이디오타입 항체로 처리, 접촉 및/또는 인큐베이션하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 CAR T 세포에서 활성화 마커의 생존능, 증식 및/또는 발현을 평가함으로써 CAR T 세포가 불활성화되었는지 여부를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 CAR T 세포의 투여를 포함하는 치료법과 연계된다. 일부 구체예에서 상기 방법은 항-이디오타입 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 컨쥬게이트는 개체에서 CAR T 세포를 제거 및/또는 고갈 (예를 들어, 살해)하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항-CD19 항체이다. 일부 구체예에서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 FMC63 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 이로부터 유래된 것이다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[493] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 대상자에서 CAR 발현 세포의 수를 감소, 고갈 및/또는 저감시키기 위해 투여된다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 CAR 발현 세포, 예를 들어, 순환 CAR-T 세포의 양을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 100% 또는 약 100% 고갈, 감소 및/또는 저감시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 고갈, 감소 및/또는 저감은 항-이디오타입 항체 투여 전 대상자에서의 CAR 발현 세포들의 양과 관련된 것이다. 특정 구체예에서, 고갈, 감소 및/또는 저감은 항-이디오타입 항체가 투여되지 않은 대상자에서의 CAR 발현 세포들의 양과 관련된 것이다. 일부 구체예에서, CAR 발현 세포들은 항-이디오타입 항체의 투여 후 대상자에서 검출가능하지 않다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
[494] 일부 구체예에서, 본원은 CAR T 세포의 불활성화 방법을 제공하며 (여기서 CAR은, 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함하는 것임), 상기 방법은 CAR T 세포를 포함하는 샘플을 CAR을 표적화하는 길항성 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션함으로써 샘플 내 CAR T 세포를 불활성화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플 내 CAR T 세포의 활성화를 약화시키는데 충분한 양으로 사용된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플 내 CAR T를 실질적으로 불활성화ㅅ키는데 충분한 양으로 사용된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체와의 인큐베이션은 샘플 내 CAR T 세포의 제거 및/또는 고갈을 초래한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플 내 CAR T 세포의 소거를 야기하는데 충분한 양으로 사용된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[495] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 대상자에서 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 활성을 고갈, 감소 및/또는 저감시키기 위해 투여된다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 자극 및/또는 활성화를 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 100% 또는 약 100% 저감 및/또는 감소시킨다. 특정 구체예에서, 상기 감소 및/또는 저감은 항-이디오타입 항체의 투여에 앞서 대상자에서의 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 자극 및/또는 활성과 관련이 있다. 특정 구체예에서, 감소 및/또는 저감은 항-이디오타입 항체가 투여되지 않은 대상자에서의 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 활성 및/또는 자극과 연관이 있다. 일부 구체예에서, 활성 및/또는 자극은 CAR 수용체 또는 CAR T 세포 활성의 하나 이상의 측면을 가리키며 본원에 설명된 임의 수단을 비롯하여 공지의 적절한 수단에 의해 평가할 수 있다. 일부 구체예에서, CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 활성 및/또는 자극은 항-이디오타입 항체 투여 후 대상자에서 검출가능하지 않다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
[496] 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포가 항원에 결합하는 능력 및/또는 항원에 대한 결합을 방지, 감소 및/또는 저감시키기 위해 투여된다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 항원 결합을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 100% 또는 약 100% 감소 및/또는 저감시킨다. 특정 구체예에서, 감소 및/또는 저감은 항-이디오타입 항체의 투여에 앞서 대상자에서 항원에 결합하는 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 능력 및/또는 항원 결합과 관련된 것이다. 특정 구체예에서, 감소 및/또는 저감은 항-이디오타입 항체가 투여되지 않은 대상자에서의 CAR 및/또는 CAR 발현 세포의 항원에 결합하는 능력 및/또는 항원 결합과 관련되된 것이다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다.
[497] 일부 구체예에서, 본원은 CAR T 세포를 제거 및/또는 고갈(예컨대 살해)시키는 방법을 제공하며 (여기서 CAR은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함한다), 이 방법은 CAR T 세포들을 포함하는 샘플을, CAR을 표적으로 하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함꼐 인큐베이션함으로써, 샘플 내 CAR T 세포를 제거 및/또는 고갈시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거 및/또는 고갈은 항체-의존성 세포-매개형 세포독성 (ADCC)에 의한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 샘플 내 CAR T 세포들을 실질적으로 모두 제거 및/또는 고갈시키는데 충분한 양으로 사용된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[498] 일부 구체예에서, 본원은 개체에서 CAR T 세포 요법을 조정하기 위한 방법을 제공하며 (여기서 CAR은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함한다), 이 방법은 CAR을 표적으로 하는 길항성 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 개체에게 투여함으로써 CAR T 세포를 불활성화시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 개체 내 CAR T 세포의 활성화를 약화시키는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 개체내 CAR T 세포들을 실질적으로 불활성화시키는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 투여는 개체 내 CAR T 세포의 제거 및/또는 고갈을 일으킨다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체는 개체 내에서 CAR T 세포를 소거하는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[499] 일부 구체예에서, 본원은 개체에서 CAR T 세포 요법을 조정하기 위한 방법을 제공하며 (여기서 CAR은 항체 SJ25C1 또는 FMC63, 또는 그의 항원-결합 단편과 같은 표적 항체를 포함한다) 이 방법은 CAR을 표적으로 하는 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트를 개체에게 투여하는 것을 포함하되, 여기서 상기 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 세포독성 제제를 포함하는 것이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 개체에서 CAR T 세포 요법을 약화시키는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 개체에서 CAR T 를 실질적으로 중단시키는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 면역컨쥬게이트는 개체에서 CAR T 세포의 소거를 야기하는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 세포독성 제제는 화학치료제 또는 약물, 성장저해제, 독소 (예컨대, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독서 또는 그의 단편), 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
D. 결합 분석의 사용 또는 방법
[500] 본원은 CAR의 세포외 도메인 또는 항원 결합 도메인을 함유하는 그의 일부와 같은 키메라 항원 수용체 (CAR)에 결합하는 샘플에서 분자의 존재 또는 부재를 평가하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 투여된 세포 요법에 대한 대상자의 체액성 반응 또는 항체 반응의 존재 또는 부재를 평가하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 예컨대 본원에 설명된 임의의 것과 같은, CAR의 세포외 도메인에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 방법에서 양성 대조군으로서 이용가능하다.
[501] 특정 구체예에서, 상기 방법은 샘플을 CAR의 세포외 도메인에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과, 10ng/ml 내지 100μg/ml, 100ng/ml 내지 1.0μg/ml, 250ng/ml 내지 10μg/ml, 250ng/ml 내지 1μg/ml, 1μg/ml 내지 10μg/ml, 250 ng 내지 2.5μg/ml, 또는 1μg/ml 내지 10μg/ml의 항-이디오타입 항체 농도로 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 농도는 250ng/ml 내지 10μg/ml이다. 특정 구체예에서, 항-이디오타입 항체의 농도는 약 0.1μg/ml, 0.25μg/ml, 0. 5μg/ml, 1.0μg/ml, 1.25μg/ml, 2μg/ml, 2.5μg/ml, 또는 5μg/ml의 항-이디오타입 항체이다.
[502] 일부 측면에서, 입양 세포 치료는 투여된 세포 및/또는 구조물에 대한 대상자에서의 면역 반응 발달과 관련될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서 키메라 수용체에 대한 노출은 투여된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 의해 제한될 수 있으며, 이는 때 이르게 세포를 제거할 수 있다. 종종 면역저하를 일으키는, B 세포 악성종양이 있는 특정 대상자에서조차, 입양 세포 치료법으로 투여된 세포에 의해 발현되는 수용체 영역에 특이적인 면역 반응이 검출될 수 있다. 예를 들어, CAR에 의해 유전자 조작된 세포가 투여된 대상자, 예컨대 인간 대상자는 비-인간 서열 (예컨대 쥐의 scFv)을 함유할 수 있는 영역을 비롯하여, 키메라 영역의 면역원성 영역에 대해 및/또는 예컨대 CAR의 막관통 및 공동자극 도메인과 같은 키메라 수용체의 2개의 도메인이나 부분 사이의 접합무를 함유하는 영역에 대해 특이적인 면역 반응을 일으킬 수 있다.
[503] 일부 구체예에서, 본원은 CAR의 세포외 도메인 또는 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 그의 일부를 포함하는 단백질인 결합 시약을, 키메라 항원 수용체로 조작된 세포를 포함하는 세포 치료제가 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플과 접촉시키거나 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 결합 시약과 분자, 예컨대 샘플 내에 존재하는 항체와 같은 결합 분자 사이에 복합체가 형성되었는지를 검출하거나 및/또는 그러한 결합의 존재여부 또는 결합 수준을 검출하는 단계를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 접촉 또는 인큐베이션 단계는 대상자로부터의 샘플에 존재하는 분자에 결합 시약이 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 수행된다. 특정 측면에서, 상기 방법은 본원에 설명된 바와 같은 CAR에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 양성 대조군 샘플에 대해 더 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 결합 시약에 대한 분자의 결합의 존재 여부 또는 결합 수준을 결정하는 것은 상기 결합 또는 검출을, 결합 시약에 대한 양성 대조군 샘플의 결합 또는 검출과 비교하는 것을 포함할 수 있다.
[504] 일부 구체예에서, 세포 요법제는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 항-CD19 CAR을 발현하는 유전자 조작된 세포이거나 또는 이를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 결합 시약은 SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함하는 것이다. 일부 구체예에서, 양성 대조군은 서브섹션 I.A.에 설명된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함한다.
[505] 일부 구체예에서, 세포 요법제는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 항-CD19 CAR을 발현하는 유전자 조작된 세포이거나 또는 이를 포함하는 것으로, 여기서, 상기 결합 시약은 FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함하는 것이다. 일부 구체예에서, 양성 대조군은 서브섹션 I.B.에 설명된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함한다.
[506] 일부 구체예에서, 상기 방법은 결합 시약과 분자 예컨대 샘플에 존재하는 항체와 같은 결합 분자 사이에 복합체가 형성되었는지를 검출하거나 및/또는 그러한 결합의 존부 또는 수준을 검출하는 것을 포함한다. 특정 구체에에서, 접촉 또는 인큐베이션은 대상자로부터의 샘플에 존재하는 분자에 결합 시약이 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 수행된다. 일부 측면에서, 복합체는 면역분석법, 선택적으로 샌드위치 또는 브릿지 분석법에 의해 검출된다. 예를 들어, 면역분석법은 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 화학발광, 전자화학발광, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 바이오센서 (예컨대, BIAcore), 유세포 계측법, 또는 웨스턴 블롯이다. 일부 구체예에서, 면역분석법은 중간 규모(meso scale)의 발견이거나 또는 이를 포함한다.
[507] 일부 측면에서, 면역분석법은 샌드위치 분석법 또는 브릿지 분석법이다. 샌드위치 또는 브릿지 분석법에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 분자 또는 분자를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 제1 결합 시약과 분자 사이에 형성된 복합체를 제2 결합 시약과 접촉시키는 것을 포함하며 여기서 상기 제2 결합 시약은 제1 결합 시약과 동일 또는 유사한 분자와 결합할 수 있는 제제이다. 일부 구체예에서, 제2 결합 시약은 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 제1 결합 제제와 제2 결합 제제의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분은 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다.
[508] 일부 구체예에서, 결합 시약, 예컨대 제1 및/또는 제2 결합 시약은 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 것이다. 제1 및/또는 제2 결합 시약과 같은 결합 시약은 검출가능한 표지에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 검출가능한 표지는 형광 표지, 화학발광 표지, 전자발광 표지, 비색계 표지, 생물발광 표지 또는 방사성표지이거나 또는 이들을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 결합 시약과 같은 결합 시약은 SULFO-Tag에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 적어도 하나는 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있고 제1 및 제2 결합 시약 중 중 다른 하나는 고체 지지체에 부착 또는 고정된다. 일부 측면에서, 제1 결합 시약은 고체 지지체에 부착 또는 고정되거나 고체 지지체에 부착 또는 고정될 수 있는 것이다. 고체 지지체에 결합 시약을 직접 또는 간접적으로 부착시키는 방법은 기술분야에 공지이다. 부착 방법은 전형적으로는 고체 지지체 상의 화학적 반응기, 예컨대 활성화된 카르복실, 히드록실, 또는 알데히드기에 유리 아민기를 통한 결합 시약의 공유 부착 또는 고체 지지체에 대한 결합 시약의 비-특이적 부착을 포함한다. 부착 방법은 또한 고체 지지체를 스트렙타비딘과 같은 포획 시약으로 코팅하고 바이오틴-표지된 시약과 같은 친화성 표지된 결합 시약을 고체 지지체에 부가함으로써 친화성 표지 (예컨대, 바이오틴)와 포획 시약 (예컨대, 스트렙타비딘) 사이의 상호작용이 결합 시약을 고체 지지체에 연결시키는 것과 같은, 고치 지지체에 대한 결합 시약의 간접적인 부착도 포함한다. 일부 구체예에서, 제 1 결합 시약은 직접 또는 간접적으로 바이오틴에 연결된다. 일부 예에서, 제1 가용성 시약은 스트렙타비딘으로 코팅된 고체 지지체에 결합된다. 일부 구체예에서, 제2 결합 시약은 직접 또는 간접적으로 검출 가능 라벨, 선택적으로 SULFO-Tag에 연결된다.
[509] 특정 구체예에서, 샘플은 고체 표면 또는 지지체, 예컨대, 플레이트 또는 웰에 부착, 결합, 코팅 및/또는 컨쥬게이트된 제1 결합 시약과 접촉된다. 특정 구체예에서, 고체 지지체를 스트렙타비딘과 같은 포획 시약으로 코팅하고 바이오틴-표지된 시약과 같은 친화성 표지된 결합 시약을 고체 지지체에 부가함으로써 친화성 표지 (예컨대, 바이오틴)와 포획 시약 (예컨대, 스트렙타비딘) 사이의 상호작용이 결합 시약을 고체 지지체에 연결시키는 것과 같은, 고체 지지체에 대한 결합 시약의 간접 부착에 의해, 제1 결합 시약은 고체 표면 또는 지지체에 부착, 결합, 코팅 및/또는 컨쥬게이트된다. 일부 구체예에서, 샘플은 SULFO-Tag에 직접 또는 간접적으로 연결된 제2 결합 시약과 접촉된다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 결합 시약은 10ng/ml 내지 100μg/ml, 100ng/ml 내지 1.0μg/ml, 250ng/ml 내지 10μg/ml, 250ng/ml 내지 1μg/ml, 1μg/ml 내지 10μg/ml, 250ng 내지 2.5μg/ml, 또는 1μg/ml 내지 10μg/ml 항-이디오타입 항체의 농도로 사용된다. 일부 구체예에서, 고체 표면 또는 지지체는 250ng/ml 내지 10μg/ml로 인큐베이션된다. 특정 구체예에서, 고체 표면 또는 지지체는 약 0.25μg/ml, 0.5μg/ml, 1.0μg/ml, 1.25μg/ml, 2μg/ml, 2.5μg/ml, 5μg/ml 또는 10μg/ml로 인큐베이션된다.
[510] 일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체로 조작된 세포를 포함하는 세포 치료제가 투여된 대상자로부터의 샘플은 대상자로부터의 임의의 체액 샘플이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 샘플은 전혈, 혈청 또는 혈장이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 세포 치료제 또는 세포 투여량의 투여 개시 후 약 1 시간 내지 1년 이내, 에컨대 약 6시간, 12시간, 24시간, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이내에 대상자로부터 채취된다. 일부 측면에서, 샘플은 세포 치료제 투여 개시 후 약 1개월 내지 6개월, 예컨대 약 2개월 내지 6개월 또는 2개월 내지 4개월 에 대상자로부터 수득된다.
VI. 제조 물품(article of manufacture)
[511] 본원은 또한 제공된 항-이디오타입 항체들 및/또는 조성물을 함유하는 제조 물품 또는 키트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본원은 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 경우에서, 항-이디오타입 항체는 항-CD19 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항-CD19 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체와 결합한다. 일부 예에서, 항-CD19 항체는 SJ25C1 또는 FMC63이다. 일부 측면에서, 본원에 설명된 항-이디오타입 항체들을 함유하는 컨쥬게이트가 제조 물품 또는 키트에 제공된다.
[512] 일부 구체예에서, 키트 또는 제조 물품은 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 항-이디오타입 항체가 예컨대 특이적으로 결합되는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인, 또는 세포외 도메인의 일부분을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR의 세포외 도메인은 항-CD19 항체 (예컨대, FMC63 또는 SJ25C1) 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함한다.
[513] 일부 구체예에서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 키트 또는 제조 물품은 제2 결합 시약을 부가적으로 함유한다. 이러한 예에서 제2 결합 시약은 제1 결합 시약이 결합하는 것과 동일 또는 유사한 분자에 결합할 수 있는 제제이다. 일부 구체예에서, 제2 결합 시약은 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함한다. 일부 측면에서, 제1 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분과 제2 결합 시약의 그것은 동일하거나 실질적으로 동일하다.
[514] 일부 구체예에서, 결합 시약, 또는 제1 및 제2 결합 시약 중 적어도 하나는 본원에 설명된 표지와 같은 표지(예컨대 검출가능한 표지)에 부착된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 적어도 하나는 고체 지지체에 부착되거나 또는 고체 지지체, 예컨대 본원에 설명된 고체 지지체에 부착될 수 있다. 일부 측면에서, 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 검출가능하게 표지되거나 검출가능한 시그널을 생성할 수 있고 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 고체 지지체에 부착 또는 고정된다. 일부 구체예에서, 결합 시약은 키트로서 면역분석법 (예컨대 샌드위치 또는 브릿지 분석법)과 관련하여 사용되기 위해 본원에 설명된 시스템의 일부로서 제공된다. 일부 구체예에서, 제1 결합 시약은 고체 지지체, 선택적으로 스트렙타비딘 코팅된 고체 지지체에 결합된다. 일부 구체예에서, 제2의 가용성 단백질은 검출가능한 표지, 예컨대 SULFO-Tag에 직접 또는 간접적으로 연결된다.
[515] 일부 구체예에서, 키트는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 더 포함한다. 일부 측면에서, 항-이디오타입 항체는 항-CD19 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항-CD19 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 결합한다. 일부 에에서, 항-CD19 항체는 SJ25C1 또는 FMC63이다. 일부 구체예에서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 양성 대조군 샘플로서 제공된다. 일부 예에서, 양성 대조군 샘플은 CD19 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인 영역을 함유하는 제1 및 제2 가용성 단백질 또는 시약과 복합체를 형성한다.
[516] 일부 구체예에서, 키트 또는 제조 물품은 제공된 임의의 방법을 수행하기 위한 시약이나 성분들을 포함한다. 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 제2 항체, 친화성 표지, 포획 시약, 완충액, 희석제, 시그널 검출제, 필터, 바늘, 주사기, 모세관 및 사용 설명서를 적은 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적, 치료적 및 사용자 관점에서 바람직한 하나 이상의 시약 또는 기타 물질을 포함한다.
[517] 일부 구체예에서, 키트는 항체 또는 이의 조성물 또는 하나 이상의 추가 시약, 예컨대 결합 시약 또는 그의 성분을 포장하기 위한 포장재를 포함하는 제조 물품으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 용기, 보틀, 튜브, 바이알 및 키트의 구성 요소를 분리하거나 구성하기에 적합한 포장재를 포함할 수 있다.
[518] 일부 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기를 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 보틀, 바이알 (예컨대 이중 챔버 바이알), 주사기(단일 또는 이중 챔버 주사기와 같은) 및 시험관이 포함된다. 하나 이상의 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 하나 이상의 용기는 본원의 방법에 사용하기 위한 항체 또는 결합 시약과 같은 다른 시약을 포함하는 조성물을 보유한다. 본원의 제조 물품 또는 키트는 별도의 용기 또는 동일한 용기에 항체 또는 시약을 포함 할 수있다. 일부 구체예에서, 조성물을 보유하는 하나 이상의 용기는 일부 경우에 재구성 된 조성물의 반복 사용을 허용할 수 있는 일회용 바이알 또는 다중 사용 바이알일 수 있다.
[519] 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 적절한 희석제를 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 치료제 및/또는 사용 설명서를 적은 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적, 치료적 및 사용자 관점에서 바람직한 하나 이상의 재료를 더 포함할 수 있다.
[520] 제조 물품은 용기 및 용기 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 보틀, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함할 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 구체예에서 용기는 항-이디오타입 항체를 함유하는 조성물을 단독으로 또는, 질환 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 조합된 상태로 보유한다. 일부 구체예에서, 용기는 무균 접근 포트를 갖는다. 예시적인 용기는 주사용 바늘에 의해 관통가능한 마개가 달린 것을 비롯하여, 정맥내 용액 백, 바이알을 포함한다. 제조 물품은 항-이디오타입 항체를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기를 포함할 수 있다. 별법으로 또는 이에 더해, 제조 물품은 허용가능한 완충제를 포함하는 또 다른 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및/또는 주사기와 같은 다른 재료를 더 포함할 수도 있다.
[521] 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 유리 (예를 들어, 조절된 공극 유리), 다당류 (컨대 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜, 니트로셀룰로스, 셀룰로스, 나일론, 실리콘 및 설명된 결합 시약의 직간접적인 부착을 위해 고체 지지체에 사용되는 기술분야에 잘 알려진 기타 재료로 이루어진 고체 지지체를 비롯한 고체 지지체를 포함한다. 본원에서 제공된 제조 물품 또는 키트에 포함된 고체 지지체의 비제한적인 예로는 비드, 컬럼 (예컨대 크로마토그래피 컬럼 등), 어레이 (예컨대 마이크로어레이, 나노어레이 등), 검정 플레이트, 카트리지, 스틱, 필터, 스트립 또는 본원에 기술된 임의의 다른 고체 지지체를 들 수 있다.
[522] 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 적합한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 사용 지시가있는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 치료제 및/또는 사용 설명서를 적은 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적, 치료적 및 사용자 관점에서 바람직한 하나 이상의 재료를 더 포함할 수 있다.
[523] 일부 구체예에서, 키트는 선택적으로 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 전형적으로 항체 및 임의로 키트에 포함된 다른 성분, 예를 들어 결합 시약 및 본원에 설명된 용도나 방법과 관련하여 상기 항체 및/또는 다른 성분들을 사용하는 방법을 설명하는 구체적인 표현을 포함한다. 일부 구체예에서, 설명서는 용기 상에 또는 용기와 결합하여, 표지 또는 패키지 삽입물로서 제공된다. 일부 구체예에서, 설명서는 조성물의 재조성 및/또는 사용에 대한 지시 사항을 나타낼 수있다.
[524] 일부 구체예에서, 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법 또는 분석법에 따라 또는 이와 연계하는 방식으로, SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하는데 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 예에서, 세포 집단으로부터, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 세포, 또는 세포 집단을 선별 또는 농축하는데 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 예에서, SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포들을 포함하는 인풋 조성물을 자극하는데 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다.
[525] 일부 구체예에서, 일부 구체예에서, 본원에 설명된 바와 같은 임의의 방법 또는 분석법에 따라 또는 이와 연계하는 방식으로, FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하는데 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 예에서, 세포 집단으로부터, 항체 FMC63 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 세포, 또는 세포 집단을 선별 또는 농축하는데 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다. 일부 예에서, FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포들을 포함하는 인풋 조성물을 자극하는데 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 설명서가 제공된다.
[526] 일부 구체예에서, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)에 대한 체액성 면역 반응에 의해 생성된 항체 등의 항체와 같은 세포 치료제의 키메라 항원 수용체에 결합하는 분자를 검출하는데 사용되기 위한, 제공된 키트의 설명서가 제공된다. 일부 구체예에서, 항-CD19 항체 (예컨대, FMC63 또는 SJ25C1) 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 CAR에 의해 조작된 세포를 포함하는 세포 치료제가 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플과 결합 시약을 접촉시키기 위한 설명서가 제공되며, 여기서 상기 결합 시약은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 세포외 도메인을 포함하는 그의 일부분을 포함하는 것이다. 일부 측면에서, 상기 설명서는 제1 및 제2 결합 시약 양자 모두와 결합하는 샘플로부터의 분자 및 결합 시약을 포함하는 복합체의 존재 또는 부재의 검출에 관해서도 설명하며, 여기서 상기 분자는 선택적으로 항체이거나 또는 이를 포함하는 것이다. 일부 측면에서, CD19 항체는 SJ25C1 또는 FMC63이다. 또 다른 구체예에서, 결합 시약 및 양성 대조군 샘플을 사용하기 위한 설명서도 제공된다.
VII. 정의
[527] 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 용어, 표기 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 전문용어들은 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우, 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본 발명에 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 용어를 정의하였으며, 이러한 정의를 본 발명에 포함시켰다 해서 곧 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것 이외의 실질적으로 다른 것을 나타내는 것으로 이해되어서는 아니된다.
[528] 본 발명에서, 항체의 "대응하는 형태"라 함은 2가지 항체의 특성 또는 활성을 비교할 경우, 특성이 항체의 동일한 형태를 이용하여 비교됨을 의미한다. 예를 들어, 만일 어떤 항체가 제1 항체의 대응하는 형태의 활성에 비해 더 큰 활성을 갖는다고 언급할 경우, 이는 그 항체의 특정 형태, 예를 들면 scFv가 제1 항체의 scFv 형태에 비해 더 큰 활성을 가짐을 의미하는 것이다.
[529] 본 발명에서, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 개시된 서열, 예를 들면 서열목록에 제시되어 있는 서열에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 "대응한다"라고 할 경우, 이것은 GAP 알고리듬과 같은 표준 정렬 알고리듬을 이용하여 동일성을 최대화하기 위해 개시된 서열들을 정렬하는 경우 동정된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 가리킨다. 서열들을 정렬함으로서, 통상의 기술자는, 가이드로서 예컨대 보존된 및 동일한 아미노산 잔기를 이용하여, 대응하는 잔기를 동정할 수 있다. 일반적으로, 대응하는 위치를 동정하기 위해서, 최고의 오더 맷치(highest order match)가 달성되도록 아미노산 서열을 정렬한다 (참조: 예컨대 : Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo 외 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
[530] "이펙터 기능"이라는 용어는 항체 이소타입에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기여가능한 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예로는: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개형 세포독성(ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체(예컨대 B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화를 들 수 있다.
[531] 본 발명에서 "Fc 영역"이라는 용어는 적어도 불변 영역의 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기 넘버링은 문헌 [Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 설명된 바와 같은, EU 인덱스라고도 칭해지는 EU 넘버링 시스템을 따른다.
[532] "전장 항체," "온전한 항체," 및 "완전한 항체" 등의 용어는 본 발명에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 가리키는 것으로 호환적으로 사용된다.
[533] "단리된(isolated)" 항체라 함은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것을 가리킨다. 일부 구체예에서, 항체는 예컨대 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전점 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피법(예컨대, 이온교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정되는 바와 같이 95% 초과 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 관하여는 에컨대 문헌 [Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조할 수 있다.
[534] "단리된" 핵산이라 함은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것을 가리킨다. 단리된 핵산은 그 핵산 분자를 보통 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 그의 천연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 또는 염색체 밖에 존재한다.
[535] "항-이디오타입 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"이라 함은 단일 벡터 또는 별도 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들)을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편들)을 인코딩하는 1 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포 내의 1 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 가리킨다.
[536] "숙주 세포," "숙주 세포주," 및 "숙주 세포 배양체"라는 용어는 호환적으로 사용되며 외인성 핵산이 도입된 세포를 가리키고, 여기에는및 이러한 세포의 자손도 포함된다. 숙주 세포는 계대 횟수와 무관하게, 일차 형질전환 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함하여, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 모세포의 핵산 함량과 완전히 핵산 함량이 동일하지 않을 수 있으며 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손들도 여기에 포함된다.
[537] 본 발명에서, 아미노산 서열 (레퍼런스 폴리펩타이드 서열)과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 및 "퍼센트 동일성"이라 함은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 그리고 서열 동일성의 일부로서 여하한 보존적 치환은 고려함이 없이, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후, 레퍼런스 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예컨대, 주제의 항체 또는 단편) 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정할 목적의 정렬은 당업자에게 공지인 다양한 방법, 예를 들면 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자라면 비교된 서열 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 여하한 알고리듬을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있을 것이다.
[538] 아미노산 치환은 폴리펩타이드 내 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환을 결합 분자, 에컨대 관심 대상 항체 내로 도입하고 그 생성물을 목적하는 활성, 예컨대 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝할 수 있다.
[539] 아미노산은 일반적으로 다음의 공통적인 측쇄 특성에 따라 그룹지을 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
[540] 일부 구체예에서, 보존적 치환은 이들 클래스 중 어느 하나의 구성원을 동일 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 비-보존적 아미노산 치환은 이들 클래스의 어느 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
[541] 본 발명에서 "벡터"라는 용어는 그것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터도 포함한다. 어떤 벡터들은 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭한다.
[542] "포장 삽입물(package insert)"이라 함은 치료 제품의 이용과 관련한 지침, 용법, 용량, 투여, 조합 치료법, 사용금지 사유 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 포장 내에 일상적으로 포함되는 지침서를 가리킨다.
[543] 본 발명에서, 단수 형태인 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수 개념을 포함한다. 예컨대, "a" 또는 "an"은 "적어도 1개" 또는 "1개 이상"을 의미한다.본 명세서에 설명된 여러 측면 및 변형예들은 "구성되는(consisting)" 및/또는 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 측면 및 변형예를 포함하는 것으로 이해된다.
[544] 본 명세서 전반에 걸쳐, 청구 대상 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로서 표현되었다. 이러한 범위 포맷의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것일 뿐 청구대상 발명의 범위를 경직적으로 한정하려는 것은 아니다. 따라서, 범위 설명은 가능한 모든 하위 범위 뿐만 아니라 그 범위 내에 속하는 개별적인 수치 값도 구체적으로 기재한 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 어떤 값의 범위가 제공된 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에 개재된 각각의 값들 및 명시된 범위 내의 달리 명시 또는 개재된 모든 값들 역시 청구대상발명에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 그 작은 범위에 독립적으로 포함되는 것일 수 있고, 또한 청구대상발명의 범위 내에 포괄되는 것이다. 명시된 범위가 이러한 한계의 일방 또는 양방 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 일방 또는 양방 모두를 제외한 범위 역시도 본 발명에 포괄된다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
[545] 본 발명에서 "약"이라는 용어는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 가리키는 것이다. 어떤 값 또는 파라미터에 대해 "약"이라는 표현이 사용될 경우 바로 그 값 또는 파라미터 자체에 지향된 구체예 역시도 포함((및 설명)하는 것이다. 예를 들어, "X에 관한"이라는 설명은 "X"의 설명도 포함한다.
[546] "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 폴리머를 가리키는 것으로 호환적으로 사용되며, 최소 길이로 한정되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 사슬 및 기타 펩타이드, 예컨대, 링커를 비롯한 폴리펩타이드들은 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 비롯한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등도 포함한다. 일부 측면에서, 단백질이 소망되는 활성을 유지하는 한, 폴리펩타이드는 본래의 또는 천연 서열과 관련한 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 위치-지향된 돌연변이를 통하는 것과 같이 의도적일 수 있으며 또는 예컨대 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한다던가 또는 PCR 증폭에 기인하는 에러와 같은 사고에 의할 수도 있다.
[547] 본 발명에서 조성물은 세포를 비롯하여 2 이상의 산물, 제제 또는 화합물의 여하한 혼합물을 가리킨다. 이것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비-수성이거나 또는 이들의 여하한 조합일 수 있다.
[548] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라 함은 특정 마커 일반적으로 표면 마커가 그 세포 내 또는 세포 상에 검출가능하게 존재함을 가리키는 것이다. 표면 마커라 함은, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색함으로써, 유세포 계측에 의해 검출시 표면 발현 존재를 가리키는 것으로, 여기서 염색은 이소타입-맷치된 대조군을 이용하여 동일 공정을 수행하여 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 양성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 음성으로 알려진 세포의 그것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 계측법으로 검출가능한 것이다.
[549] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라 함은 특정 마커 일반적으로 표면 마커가 그 세포 내 또는 세포 상에 검출가능할 정도로 존재하지 않음을 가리키는 것이다. 표면 마커라 함은, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색함으로써, 유세포 계측에 의해 검출시 표면 발현의 부재를 가리키는 것으로, 여기서 염색은 이소타입-맷치된 대조군을 이용하여 동일 공정을 수행하여 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 양성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 음성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 계측법으로 검출가능한 것이다.
VIII. 예시적인 구체예들
[550] 본원에 따라 특히 다음 구체예들이 제공된다:
1. 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
2. 구체예 1에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은:
SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역; 및/또는
SEQ ID NO: 1에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역
을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
3. SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 VL 영역; 및/또는
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 VH 영역
을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
4. 구체예 2 또는 구체예 3에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 84에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H3을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)을 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 14 또는 87에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L3을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
5. 구체예 2-4 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1 및 CDR-H2 서열의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-H1 및 CDR-H2를 각각 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1 및 CDR-L2 서열의 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1 및 CDR-L2를 각각 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
6. 구체예 2-5 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 9,78,79, 또는 80에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 10, 81, 82, 또는 83에 제시된 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 11 또는 84에 제시된 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 12 또는 85에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 13 또는 86에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 14 또는 87에 제시된 CDR-L3을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
7. SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및/또는
SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3
을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
8. SEQ ID NO: 9,78,79, 또는 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 10, 81, 82 또는 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 11 또는 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H13; 및/또는
SEQ ID NO: 12 또는 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 13 또는 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 14 또는 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
9. 구체예 1-8 중 어느 하나의 구체예에 있어서 :
항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
10. 구체예 9에 있어서, 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
11. 구체예 1-10 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
12. 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
13. 구체예 12에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은:
SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역; 및/또는
SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역
을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
14. SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 VL 영역; 및/또는
SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 VH 영역
을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
15. 구체예 13-14 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은:
GYX3FX5X6YX8MX10 (SEQ ID NO: 108)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1) [여기서 X3은 T 또는 S, X5는 T 또는 S, X6는 D 또는 R, X8은 Y 또는 W이고, X10은 K 또는 N임];
WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20 (SEQ ID NO: 109)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-H2) [여기서 X4는 D 또는 M, X6는 N 또는 H, X8은 N 또는 S, X9은 N 또는 D, X10은 G 또는 S, X11은 G 또는 E, X13 은 D 또는 R, X14은 Y 또는 L, X17은 N 또는 K이고, X20는 G 또는 D임];
AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 (SEQ ID NO: 110)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-H3) [여기서 X2는 R 또는 S, X3는 E 또는 I, X4는 G 또는 Y, X5는 N 또는 Y, X6는 N 또는 E, X7은 Y 또는 없음, X8은 G 또는 없음, X9은 S 또는 없음, X10은 R 또는 없음, X11은 D 또는 없음, X12는 A 또는 없음, X13은 M 또는 없음, X14은 D 또는 E, 및 X15은 Y 또는 A임]을 포함하고; 및/또는
VL 영역은:
X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY (SEQ ID NO: 111)의 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1) [여기서 X1은 S 또는 R, X3는 S 또는 R, X4는 S 또는 G, X5는 G 또는 N, X6는 V 또는 I, X7은 I 또는 H, X8은 N 또는 없음, X10은 M 또는 L이고, X11은 Y 또는 A임];
X1X2X3YX5X6X7X8LAX11 (SEQ ID NO: 112)의 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDR-L2) [여기서, X1은 P 또는 L, X2는 W 또는 L, X3는 I 또는 V, X5는 L 또는 N, X6는 T 또는 A, X7은 S 또는 K, X8은 N 또는 T이고, X11은 S 또는 D임];
QX2X3X4X5X6PX8T (SEQ ID NO: 113)의 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3) [여기서, X2는 Q 또는 H, X3는 W 또는 F, X4 는 S 또는 W, X5는 S 또는 W, X6는 N 또는 T이고, X8 is은 L 또는 Y임]
을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
16. 구체예 15에 있어서:
상보성 결정 영역 3 (CDR-H3)은 SEQ ID NO: 94 또는 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 서열 내에 포함된 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR-L3)은 SEQ ID NO: 97 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 서열 내에 포함된 CDR-L3을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
17. 구체예 13-16 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1 및 CDR-H2 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1 및 CDR-H2를 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1 및 CDR-L2 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1 및 CDR-L2를 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
18. 구체예 13-17 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103에 제시된 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 94 또는 104에 제시된 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 95 또는 105에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 96 또는 106에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 97 또는 107에 제시된 CDR-L3을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
19. SEQ ID NO: 36 또는 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및/또는
SEQ ID NO: 40 또는 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3
을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
20. SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99, 또는 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102, 또는 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 94 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는
SEQ ID NO: 95 또는 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 96 또는 106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 97 또는 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
21. 구체예 13-21 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
22. 구체예 21에 있어서, 항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 36 또는 58의 아미노산 서열을 포함하고, 항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 40 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
23. 구체예 13-22 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 44, 88, 89, 또는 90에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 45, 91, 92, 또는 93에 제시된 CDR-H2 및 SEQ ID NO:46 또는 94에 제시된 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 47 또는 95에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 48 또는 96에 제시된 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 49 또는 97에 제시된 CDR-L3을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
24. 구체예 13-23 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 65, 98, 99, 또는 100에 제시된 CDR-H1, SEQ ID NO: 66, 101, 102, 또는 103에 제시된 CDR-H2 및 SEQ ID NO:67 또는 104에 제시된 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 68 또는 105에 제시된 CDR-L1, SEQ ID NO: 69 또는 106에 제시된 CDR-L1, 및 SEQ ID NO: 100 또는 107에 제시된 CDR-L1을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
25. 구체예 13-24 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
VL 영역은 SEQ ID NO: 40에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
26. 구체예 13-24 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
VH 영역은 SEQ ID NO: 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고; 및/또는
VL 영역은SEQ ID NO: 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
27. 구체예 13-25 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
28. 구체예 13-24 및 26 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
항체 또는 단편의 VH 영역은 SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는
항체 또는 단편의 VL 영역은 SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
29. 구체예 1-28 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 단일사슬 단편인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
30. 구체예 29에 있어서, 단편은 유연한(flexible) 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
31. 구체예 29 또는 구체예 30에 있어서, 단편은 scFv을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
32. 구체예 1-11 및 29-31 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은:
SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 및/또는
SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
33. 구체예 12-31 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은:
SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 및/또는
SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
34. 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 구체예 1-33 중 어느 하나의 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 특이적으로 결합된 에피토프와 동일하거나 중복되는 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
35. 구체예 1-34 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
표적 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 그에 포함되고; 및/또는
항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 그에 포함된 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
36. 구체예 35에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 scFv이고 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR의 scFv 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
37. 구체예 1-11, 29-32 및 35 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체 또는 단편은 키메라 항원 수용체의 세포외 부분에 포함된 항체 SJ25C1으로부터 유래된 단일사슬 가변 단편 (scFv)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로, 항체 SJ25C1으로부터 유래된 scFv는 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 및/또는 SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
38. 구체예 12-31 및 33-35 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체 또는 단편은 키메라 항원 수용체의 세포외 부분에 포함된 항체 FMC63으로부터 유래된 단일사슬 가변 단편 (scFv)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로, 항체 FMC63로부터 유래된 scFv는 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 및/또는 SEQ ID NO: 34. 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
39. 구체예 1-38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편의 상보성 결정 영역 (CDR)의 전부 또는 일부 내에 존재하거나 또는 이들을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
40. 구체예 35-39 중 어느 하나의 구체예에 있어서, CAR은 스페이서를 통해 항원-결합 도메인에 연결된 막관통 도메인을 더 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
41. 구체예 40에 있어서, 스페이서는 선택적으로 인간 CD28인 CD28으로부터의 세포외 부분을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
42. 구체예 41에 있어서, CD28로부터의 세포외 부분은 SEQ ID NO: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
43. 구체예 40-42 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 막관통 도메인은 선택적으로 인간 CD28인 CD28의 막관통 부분을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
44. 구체예 40-43 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체 또는 단편은 CAR의 스페이서 도메인 내의 에피토프에 결합하지 않는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
45. 구체예 1-44 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체 또는 단편은 선택적으로 인간 CD28이거나, 선택적으로 CD28의 세포외 부분을 포함하거나, 선택적으로 SEQ ID NO: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD28 또는 그의 일부와 결합하지 않거나 또는 특이적으로 결합하지 않는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
46. 구체예 1-45 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체 또는 단편은 선택적으로 인간 IgG1 Fc 도메인인 Fc 도메인 내의 에피토프에 결합하지 않는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
47. 구체예 1-46 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
48. 구체예 1-47 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 선택적으로 다른 CAR의 세포외 항원-결합 도메인에 포함된 다른 항-CD19 항체와 교차-반응하지 않는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
49. 구체예 1-48 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 다른 CAR과 교차-반응하지 않는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
50. 구체예 1-49 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 작용제 항체인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
51. 구체예 1-50 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체 또는 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 길항제인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
52. 구체예 1-51 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 인간화된 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
53. 구체예 1-52 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 재조합된 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
54. 구체예 1-53 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 모노클로날인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
55. 구체예 1-54 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원-결합 단편인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
56. 구체예 55에 있어서, 항원-결합 단편은 단편 항원 결합 (Fab) 단편들, F(ab') 2단편들, Fab' 단편들, Fv 단편들, 단일사슬 가변 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체로부터 선별되는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
57. 구체예 1-54 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
58. 구체예 57에 있어서, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분은 Fc 영역 또는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 의 일부분을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
59. 구체예 57 또는 구체예 58에 있어서, 불변 영역은 인간 IgG로부터 유래된 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
60. 구체예 57-59 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 무손상 항체 또는 전장 항체인 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
61. 구체예 1-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트.
62. 구체예 61에 있어서, 이종 분자 또는 모이어티는 표지인 것인 컨쥬게이트.
63. 구체예 62에 있어서, 표지는 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위원소, 크로모포어, 금속 이온, 금 입자, 은 입자, 자성 입자, 폴리펩타이드, 효소, 스트렙타비딘, 바이오틴, 발광 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드로부터 선별되는 것인 컨쥬게이트.
64. 구체예 62에 있어서, 이종 분자 또는 모이어티는 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 소분자이고 선택적으로 독소, Strep-Tag이거나 이를 함유하는 것인 컨쥬게이트.
65. 구체예 1-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자(들).
66. 구체예 65에 있어서:
(i) SEQ ID NO: 15에 제시된 중쇄 가변 영역, (ii) SEQ ID NO: 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
(iv) SEQ ID NO: 19에 제시된 경쇄 가변 영역, (v) SEQ ID NO: 19에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는 핵산 분자.
67. 구체예 65 또는 구체예 66에 있어서:
(i) SEQ ID NO: 17에 제시된 중쇄, (ii) SEQ ID NO: 17에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
(iv) SEQ ID NO: 21에 제시된 경쇄, (v) SEQ ID NO: 21에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는 핵산 분자.
68. 구체예 65에 있어서:
(i) SEQ ID NO: 50 또는 71에 제시된 중쇄 가변 영역, (ii) SEQ ID NO: 50 또는 71에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
(iv) SEQ ID NO: 54 또는 75에 제시된 경쇄 가변 영역, (v) SEQ ID NO: 54 또는 75에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는 핵산 분자.
69. 구체예 65 또는 구체예 68에 있어서:
(i) SEQ ID NO: 52 또는 73에 제시된 중쇄, (ii) SEQ ID NO: 52 또는 73에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및/또는
(iv) SEQ ID NO: 56 또는 76에 제시된 경쇄, (v) SEQ ID NO: 56 또는 76에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (vi) (iv) 또는 (v)의 축퇴 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는 핵산 분자.
70. 구체예 65-69 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 시그널 서열을 포함하는 것인 핵한 분자.
71. 구체예 65-70 중 어느 하나의 구체예의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
72. 구체예 1-41 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 65-70 중 어느 하나의 구체예의 핵산 분자를 포함하는 세포.
73. 구체예 65-70 중 어느 하나의 구체예의 핵산 분자 또는 구체예 71의 벡터에 의해 인코딩된 중쇄 및/또는 경쇄를 적절한 숙주 세포에서 발현시키고 항체를 회수 또는 단리하는 것을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
74. 구체예 72의 세포를, 중쇄 및/또는 경쇄가 발현되는 조건 하에 배양하고 항체를 회수 또는 단리하는 것을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
75. 구체예 73 또는 구체예 74의 방법에 의해 제조된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
76. 구체예 1-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트, 또는 구체예 72의 세포를 포함하는 조성물.
77. 구체예 76에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는 조성물.
78. 구체예 1-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트, 구체예 65-70 중 어느 하나의 구체예의 핵산, 및 선택적으로 사용 설명서를 포함하는 것인 키트.
79. 구체예 78에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 컨쥬게이트를 고정하기 위한 시약 또는 지지체를 더 포함하되, 상기 시약 또는 지지체는 비드, 컬럼, 마이크로웰, 스틱, 필터, 스트립 또는 가용성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약인 것인 키트.
80. (a) 항체 SJ25C1 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계
를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 검출하는 방법.
81. (a) 항체 FMC63 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체를 검출하는 단계
를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 검출하는 방법.
82. 구체예 81에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 세포에 결합되거나 세포 표면에서 발현되고 단계 (b)에서의 검출은 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
83. 구체예 82에 있어서, 세포는 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR을 그의 표면에 발현하는 방법.
84. (a) 항체 SJ25C1 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 세포를, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 항-이디오타입 항체에 결합된 세포를 검출하는 단계
를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법.
85. (a) 항체 FMC63 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 세포를, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 항-이디오타입 항체에 결합된 세포를 검출하는 단계
를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법.
86. 구체예 80-85 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출을 위해 직접 또는 간접적으로 표지되는 것인 방법.
87. (a) 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체와 결합된 세포를, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 단계; 및
(b) 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들을 선별하는 단계
를 포함하는, 세포 집단으로부터 세포를 선별하는 방법.
88.(a) 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 집단 또는 표적 항체와 결합된 세포를, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체와 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들을 선별하는 단계
를 포함하는, 세포 집단으로부터 세포를 선별하는 방법.
89. 구체예 87 또는 구체예 88에 있어서, 항-이디오타입 항체와 결합된 세포들은 친화성-기반 분리에 의해 선별되는 방법.
90. 구체예 89에 있어서, 친화성-기반 분리는 면역친화성-기반 분리인 방법.
91. 구체예 89 또는 구체예 90에 있어서, 친화성-기반 분리는 유세포 계측법에 의한 것인 방법.
92. 구체예 89 또는 구체예 90에 있어서, 친화성-기반 분리는 자기 활성화된 세포 소팅법에 의한 것인 방법.
93. 구체예 89 또는 구체예 90에 있어서, 친화성-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
94. 구체예 92 또는 구체예 93에 있어서, 항-이디오타입 항체는 지지체 또는 고정상에 가역적으로 결합되거나 고정되는 방법.
95. 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션시킴으로써, 자극된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는, 세포를 자극하는 방법.
96. 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션시킴으로써, 자극된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는, 세포를 자극하는 방법.
97. (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입함으로써 인풋 조성물을 생성하는 단계; 및
(b) 인풋 조성물을 CAR의 항원 수용체에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션함으로써 세포 조성물을 생산하는 단계
를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법.
98. 구체예 97에 있어서, CAR은 CD19에 특이적으로 결합하는 표적 항체를 포함하는 방법.
99. 구체예 98에 있어서, 표적 항체는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
100. 구체예 97-99 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
101. 구체예 98에 있어서, 표적 항체는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
102. 구체예 97-98 및 101 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항체 FMC63인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
103. 구체예 97-102 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 단계 (a)에서의 도입은 바이러스 형질도입, 전위, 일렉트로포레이션, 또는 화학적 형질감염에 의해 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
104. 구체예 97-103 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 단계 (a)에서의 도입은 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한 형질도입에 의해 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것을 포함하되, 여기서 상기 바이러스 벡터는 선택적으로 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
105. 구체예 97-103 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 단계 (a)에서의 도입은 핵산 분자를 포함하는 트랜스포존을 이용한 전위에 의해 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
106. 구체예 97-103 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 단계 (a)에서의 도입은 핵산 분자를 포함하는 벡터의 일렉트로포레이션 또는 형질감염에 의해 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
107. 구체예 97-106 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 단계 (a)에 앞서서 세포를 활성화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
108. 구체예 107에 있어서, 세포를 활성화시키는 단계는 세포를 CD3의 작용제 및 선택적으로 CD28의 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
109. 구체예 108에 있어서, 세포를 활성화시키는 단계는 세포를 길항성 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
110. 구체예 95-109 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 인큐베이션은 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 CAR에 결합함으로써 인풋 조성물 내의 하나 이상의 세포들에서 시그널을 유도 또는 변조하는 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
111. 구체예 95-110 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 세포는 T 세포를 포함하는 방법.
112. 구체예 111에 있어서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 방법.
113. 구체예 95-112 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 고체 지지체에 고정되며, 상기 고체 지지체는 선택적으로, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약을 포함하거나 또는 이에 컨쥬게이트된 것인 방법.
114. 구체예 95-112 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 시약에 고정되며, 상기 가용성 시약은 선택적으로 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약이거나 또는 이를 포함하는 것인 방법.
115. 구체예 113 또는 구체예 114에 있어서, 시약은 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 방법.
116. 구체예 95-115 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 인큐베이션은 적어도 약 5분, 10분, 30분, 60분, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 동안 수행되는 방법.
117. 구체예 95-116 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 인풋 조성물은 조성물 내 총 세포들에 대한 백분율로서 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 또는 약 10% 미만의 CAR-발현 세포들을 포함하는 방법.
118. 구체예 95-117 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
아웃풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 수는 인풋 조성물 내 CAR-발현 세포의 수에 비해 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배 이상 증가되고; 및/또는
조성물 내 총 세포와 비교한 아웃풋 조성물 내 CAR-발현 백분율은 10%,20%, 40%,50%, 60%, 70%, 80% 이상 증가되는 것인 방법.
119. 구체예 95-118 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 도입 및/또는 인큐베이션 전에는 세포를 CAR-발현 세포에 대해 선별 또는 농축하지 않는 방법.
120. 구체예 80, 82-84, 86, 87, 89-95, 97-100, 103-119 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
121. 구체예 81, 82, 83, 85, 86, 88-94, 96-99, 101 및 102-119 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
122. (a) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 항-이디오타입 항체를 포함하는 복합체를 단리하는 단계
를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하는 방법.
123. (a) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계; 및
(b) 항-이디오타입 항체를 포함하는 복합체를 단리하는 단계
를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하는 방법.
124. 구체예 122 또는 구체예 123에 있어서, 항-이디오타입 항체를 포함하는 복합체는 친화성-기반 분리에 의해 단리되는 방법.
125. 구체예 124에 있어서, 친화성-기반 분리는 면역친화성-기반 분리인 방법.
126. 구체예 124에 있어서, 친화성-기반 분리는 자성-기반 분리인 방법.
127. 구체예 124에 있어서, 친화성-기반 분리는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 방법.
128. (a) 가용화 모이어티에 융합된 표적 항체의 항원-결합 단편을 함유하는 가용성 면역화 시약을 대상자에게 도입하는 단계; 및
(b) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 대상자로부터의 항체를 동정하는 단계
를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 방법.
129. 구체예 128에 있어서, 항원-결합 단편은 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 방법.
130. 구체예 128 또는 구체예 129에 있어서, 항원-결합 단편은 단일사슬 단편인 방법.
131. 구체예 130에 있어서, 항원-결합 단편은 scFv인 방법.
132. 구체예 128-131 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함된 것인 방법.
133. 구체예 128-132 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 가용화 모이어티는 Fc 도메인 또는 그의 단편이고, 선택적으로 인간 IgG1 Fc인 것인 방법.
134. 구체예 133에 있어서, 가용화 모이어티는 힌지 영역을 결여하는 Fc 도메인인 방법.
135. 구체예 134에 있어서, 가용화 모이어티는 SEQ ID NO: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
136. 구체예 128-135 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항체를 동정하는 것은:
(i) 대상자의 비장으로부터 B 세포를 단리하고 이를 불멸화 B 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하는 단계;
(ii) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 생성 여부에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계; 및
(iii) 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 항체를 시퀀싱함으로써 항-이디오타입 항체를 동정하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
137. 구체예 128-136 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체는 CD19에 결합하는 것인 방법.
138. 구체예 128-137 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1로부터 유래되고, 여기서 상기 표적 항체의 항원-결합 단편은 선택적으로 SEQ ID NO: 23에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 24에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
139. 구체예 128-138 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1로부터 유래된 단일사슬 가변 단편 (scFv)이고, 여기서 scFv는 선택적으로 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
140. 구체예 128-137 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 FMC63으로부터 유래되고, 여기서 상기 표적 항체의 항원-결합 단편은 선택적으로 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
141. 구체예 128-137 및 140 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 항체 FMC63으로부터 유래된 단일사슬 가변 단편 (scFv)이고, 여기서 scFv는 선택적으로 SEQ ID NO:34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
142. 세포를 고갈시키는 방법으로서, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 대상자는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 투여받은 적이 있는 대상자인 것인 방법.
143. 세포를 고갈시키는 방법으로서, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체에 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 대상자는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 투여받은 적이 있는 대상자인 것인 방법.
144. 구체예 109에 있어서, 고갈은 항체-의존성 세포-매개형 세포독성 (ADCC)을 통해 일어나는 방법.
145. 키메라 항원 수용체(CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 CAR에 의해 조작된 세포들을 포함하는 세포요법이 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플을 결합 시약과 접촉시키되, 결합 시약에 결합하는 샘플로부터의 분자와 상기 결합 시약을 포함하는 복합체가 형성되는 조건 하에서 접촉시키는 단계로서, 상기 결합 시약은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 것인 단계; 및
(b) 복합체의 존재 또는 부재를 탐지함으로써 CAR에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
146. 구체예 145에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 양성 대조군 샘플에 대해 수행하고, 선택적으로 양성 대조군과 비교하여 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 양성 대조군 샘플은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트를 함유하는 것인 방법.
147. 키메라 항원 수용체(CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 함유하는 CAR에 의해 조작된 세포들을 포함하는 세포요법이 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플을 결합 시약과 접촉시키되, 결합 시약에 결합하는 샘플로부터의 분자와 상기 결합 시약을 포함하는 복합체가 형성되는 조건 하에서 접촉시키는 단계로서, 상기 결합 시약은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 것인 단계; 및
(b) 복합체의 존재 또는 부재를 탐지함으로써 CAR에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
148. 구체예 147에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 양성 대조군 샘플에 대해 수행하고, 선택적으로 양성 대조군과 비교하여 분자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 양성 대조군 샘플은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트를 함유하는 것인 방법.
149. 구체예 145-148 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 결합 시약에 결합하는 분자는 항체이거나 또는 이를 포함하는 방법.
150. 구체예 145-149 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 결합 시약은 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생산할 수 있는 것인 방법.
151. 145-150 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 결합 시약은 고체 지지체에 결합되거나 또는 가용성인 것인 방법.
152. 구체예 145-153 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 복합체는 면역분석법에 의해 검출되는 방법.
153. 구체예 152에 있어서, 면역분석법은 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 화학발광 분석법, 전자화학발광 분석법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 바이오센서 (예컨대, BIAcore), 유세포 계측법, 또는 웨스턴 블롯인 방법.
154. 구체예 152 또는 구체예 153에 있어서, 면역분석법은 중간 규모(meso scale)의 발견을 포함하는 방법.
155. 구체예 152-154 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역분석법은 샌드위치 분석법 또는 브릿지 분석법인 방법.
156. 구체예 145-155 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 복합체의 존재 또는 부재를 탐지하는 것은:
(i) 단계 (a)에서 형성된 복합체를 제2 결합 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제2 결합 시약은 (1) 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하고, 및 (2) 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생산할 수 있는 것인 단계; 및
(ii) 검출가능한 시그널의 존제 또는 부재를 평가하는 단계
를 포함하는 방법.
157. 구체예 156에 있어서:
제1 결합 시약은 고체 지지체에 결합되고, 여기서 제1 결합 시약은 선택적으로 바이오틴에 직접 또는 간접적으로 결합되거나 및/또는 스트렙타비딘을 통해 고체 지지체에 결합되며; 및/또는
제2 결합 시약은 가용성인 방법.
158. 구체예 156 또는 구체예 157에 있어서, 제1 및 제2 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부는 동일한 것인 방법.
159. 구체예 150-158 중 어느 하나의 구체예에 있어서:
검출가능한 표지는 형광 표지, 화학발광 표지, 전자발광 표지, 비색계 표지, 생물발광 표지 또는 방사성 표지이거나 또는 이들을 포함하고; 및/또는
검출가능한 시그널은 형광시그널, 화학발광 시그널, 전자발광 시그널, 비색계 시그널, 생물발광 시그널 또는 방사성 시그널이거나 또는 이들을 포함하는 것인 방법.
160. 구체예 150-159 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 검출가능한 표지는 SULFO-TAG이거나 또는 이를 포함하는 방법.
161. 구체예 145-160 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 표적 항체의 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 방법.
162. 구체예 145-161 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 단일사슬 단편인 방법.
163. 구체예 145-162 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적 항체의 항원-결합 단편은 scFv인 방법.
164. 구체예 145-163 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 샘플은 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 방법.
165. 구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트, 및 SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하거나; 세포 집단으로부터, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 조작된 세포들을 선별 또는 농축하거나; SJ25C1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 자극하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하는 제조 물품.
166. 구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트, 및 FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하거나; 세포 집단으로부터, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 조작된 세포들을 선별 또는 농축하거나; FMC63 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 자극하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 사용 설명서를 포함하는 제조 물품.
167. 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약으로서, 상기 세포외 도메인 또는 그의 일부분은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 시약; 및
구체예 12-31, 33-36 및 38-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트
를 포함하는 제조 물품.
168. 구체예 167에 있어서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 제조 물품은 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함하는 제2 결합 시약을 더 포함하는 것인 제조 물품.
169. 구체예 167 또는 구체예 168에 있어서, 제1 및 제2 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분은 동일한 것인 제조 물품.
170. 구체예 167-169 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역 분석법을 이용하여 결합 시약과 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위해, 선택적으로 제1 및 제2 결합 시약인 결합 시약을 사용하기 위한 설명서를 더 포함하되, 여기서 상기 면역분석법은 선택적으로 브릿지 또는 샌드위치면역 분석법이고, 상기 샘플은 선택적으로 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 CAR에 의해 조작된 세포들을 포함하는 세포 요법이 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플인 것인 제조 물품.
171. 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약으로서, 상기 세포외 도메인 또는 그의 일부분은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 시약; 및
구체예 1-11 및 29-32, 34-37 및 39-60 중 어느 하나의 구체예의 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 또는 구체예 61-64 중 어느 하나의 구체예의 컨쥬게이트
를 포함하는 제조 물품.
172. 구체예 171에 있어서, 결합 시약은 제1 결합 시약이고 제조 물품은 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분을 포함하는 제2 결합 시약을 더 포함하는 것인 제조 물품.
173. 구체예 171 또는 구체예 172에 있어서, 제1 및 제2 결합 시약의 CAR의 세포외 도메인 또는 그의 일부분은 동일한 것인 제조 물품.
174. 구체예 171-173 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 면역 분석법을 이용하여 결합 시약과 결합하는 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하기 위해, 선택적으로 제1 및 제2 결합 시약인 결합 시약을 사용하기 위한 설명서를 더 포함하되, 여기서 상기 면역분석법은 선택적으로 브릿지 또는 샌드위치면역 분석법이고, 상기 샘플은 선택적으로 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 CAR에 의해 조작된 세포들을 포함하는 세포 요법이 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플인 것인 제조 물품.
175. 구체예 167-174 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 선택적으로 제1 및/또는 제2 결합 시약인 결합 시약은 검출가능하게 표지되거나 또는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 것인 제조 물품.
176. 구체예 168-170 및 172-175 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 고체 지지체에 부착되거나 또는 고체 지지체에 부착가능한 것이고 제1 및 제2 결합 시약 중 다른 하나는 검출가능한 표지이거나 또는 검출가능한 시그널을 생성할 수 있는 것인 제조 물품.
177. 구체예 176에 있어서, 제조 물품은 고체 지지체를 더 포함하고, 선택적으로 제1 및 제2 결합 시약 중 하나는 바이오틴에 직접 또는 간접적으로 결합되고, 고체 지지체는 스트렙타비딘-코팅된 표면인 것인 제조 물품.
IX. 실시예
[551] 다음의 실시예들은 설명 목적만을 위해 포함된 것일 뿐 본 발명의 범위를 이에 한정하고자 하는 의도가 아니다.
실시예 1: SJ25C1 가변 영역- 유래된 항체에 대한 항- 이디오타입 항체의 생성
[552] 이 실시예는 SJ25C1 (SEQ ID NO: 25에 제시된 링커에 의해 분리된 SEQ ID NO: 23 및 24 의 가변 영역 서열을 갖는 항체 (이 경우 scFv))로부터 유래된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 갖는 항-CD19 scFv, 인간 CD28-유래된 세포외 부분, 인간 CD28-유래된 막관통 도메인, 인간 CD28-유래된 세포내 시그널링 도메인 및 인간 CD3 제타-유래된 시그널링 도메인을 함유하는 예시적인 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)의 scFv 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체 (항-ID)의 생성을 기술한다.
A. 하이브리도마 생성 및 항체 스크리닝
[553] 마우스들을CAR (SJ25C1로부터 유래된 가변 영역과 함께 항-CD19 scFv를 함유함)의 세포외 도메인 (ECD) 부분으로 면역화시켰다. ECD 부분은 하기 서열
[554] EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 28) 및 CD28으로부터의 세포외 부분 (SEQ ID NO: 27)을 함유하였다.
[555] 면역화 마우스로부터 단리된 혈청을, 제2 항체를 이용한 검출에 의해 재조합 가용성 ECD 부분에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 하이브리도마 융합 클론들을 생성하고 ECD에 대한 결합을 ELISA로 특징화하여 다섯개(5)의 양성 클론들을 선발하였다. 선발된 각각의 하이브리도마 클론을 팽창시키고 항체를 정제하였다. 후속되는 분석법에서 항체를 검출하기 위해, 각 항체를 Alexa647와 컨쥬게이트시켰다.
[556] 항체들을 항-CD19 (SJ25C1-유래된) CAR로 조작된 T 세포에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 평가하였다 (모의-형질도입된 대조군 T 세포에 대한 결합을 비교함으로서 평가함). T 세포들을 인간 대상자로부터 면역친화성-기반 농축에 의해 단리하고 세포를 활성화 및 항-CD19 (SJ25C1-유래된) CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 이용하여 형질도입시켰다. 각각의 항-이디오타입 항체의 2배 연속 희석물 (20㎍/mL로부터 시작하여 0.0195㎍/mL로 희석함)을 유세포 계측법에 의해 CAR의 표면 발현을 검출하기 위해 개별적으로 사용하였다. 양성 대조군으로서, 세포들을 CAR의 ECD 부분의 쥐의 가변 영역 부분을 검출할 수 있는 염소-항-마우스 ("GAM") 항체를 유사한 농도로 사용하여 CAR의 표면 발현에 대해서도 평가하였다. 항체 대조군도 평가하였다. CAR로 형질도입된 T 세포에서 Alexa647 시그널에 양성인 세포의 백분율에 대한 투여량-반응 곡선은 시험된 각 항-이디오타입 항체들과 유사하였고 양성 대조군 GAM 항체의 그것과 필적하였는데, 이들 중 어느 것도 공 벡터로 형질도입된 모의 T 세포를 인식하지 않았다. 항-이디오타입 항체들과 GAM 항체의 배경 피크 스프레드 및 양성 및 배경(모의) 피크 평균 간의 차이인 염색 지수를 결정하자 항-이디오타입 항체들과 양성 대조군 GAM 항체는 필적하는 것으로 나타났다. 추가 특징화를 위해 항-이디오타입 항체 클론 A-1 (항-ID A-1)를 선발했다.
B. 기능적 활성
[557] 크로스-링커 항체의 존재 또는 부재 하에 항-ID A-1 항체 또는 항-CD3 항체로 자극시킨 후 술한 CAR을 발현하도록 조작된 Jurkat 세포에서의 Erk1/2 인산화를 유세포 계측법에 의해 평가하였다. 인큐베이션 후, 세포들을 포름알데히드로 고정하고, 투과성으로 만들고, 인산화된 Erk1/2에 특이적인 항체와 함께 배양하고, 유세포 계측법으로 분석하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 항-ID A-1 항체의 존재하에 세포를 인큐베이션한 후, 크로스링커의 존재 하에 항-CD3 항체로 자극하여 관찰된 것과 유사한 수준으로 Erk1/2 인산화의 증가가 관찰되었다. 두 항체 모두 가교 결합이 없는 경우에도 유사한 정도의 Erk1/2 인산화를 유도하는 것으로 관찰되었다.
[558] 항-ID A-1, 이소타입 대조군, 또는 항-CD3로 자극시킨 후 또는 자극 부재 하에, 크로스링커 항체의 존재 또는 부재 하에, CAR을 발현하지 않는 Jurkat 세포 또는 부모 Jurkat 세포에서의 Erk 인산화를 비교하기 위해 웨스턴 블랏을 추가로 사용하였다. 그 결과 항-이디오타입 항체로 자극하면 항-CD19 (SJ25C1 유래) CAR로 형질도입된 Jurkat 세포에서는 Erk1/2 인산화가 증가하지만 부모 Jurkat 세포(이 경우 비자극 및 이소타입 대조군-자극된 세포와 유사하게, 오직 배경 시그널만 관찰되었음)에서는 항-CD3 항체에 의해 유도된 것과 유사한 정도로 증가하지 않았다. 이와 대조적으로, 항-CD3 항체는 비특이적인 방식으로, 즉 CAR-발현 세포와 부모 Jurkat 세포 모두에서 인산화를 유도하였다.
C. 서열 동정
[559] 항-ID A-1 항체의 서열을 결정하였다. PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Cat. No. 6110A)을 이용하여, 이소타입-특이적 안티센스 프라이머 또는 유니버설 프라이머를 사용하여 항-ID A-1 및 cDNA를 발현하는 하이브리 도마 클론을 함유하는 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. RACE PCR을 수행하여 항체의 가변 (중쇄 및 경쇄) 및 불변 영역을 증폭시킨 후, 이를 클로닝 벡터에 개별적으로 클로닝하고 서열결정하였다. 표 2는 항체의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 상응하는 SEQ ID NO를 나타낸다.
Figure 112019032556139-pct00004
실시예 2: FMC63 - 유래된 항체에 대한 항- 이디오타입 항체의 생성
[560] 이 실시예는 FMC63 (SEQ ID NO: 30 및 31에 각각 제시된 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열을 함유하는 항체)로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 갖는 항-CD19 scFv를 함유하는 예시적인 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)의 결합 도메인(scFv) 부분을 인식하는 항-이디오타입 항체의 생성을 기술한다. scFv는SEQ ID NO:34에 제시되어 있고 SEQ ID NO: 33에 제시된 링커에 의해 분리된 VH 및 VL 영역을 함유한다.
A. 하이브리도마 생성 및 항체 스크리닝
[561] Mice 마우스들을 인간 IgG1 Fc 도메인 (SEQ ID NO:32; 힌지 영역이 결여된 단백질)에 융합된, 이 CAR (SEQ ID NO:34)의 scFv 부분을 함유하는 가용성 단백질로 면역화시켰다. 면역화에 사용된 가용성 단백질 시약은 SEQ ID NO:35에 제시되어 있다.
[562] 면역화된 마우스로부터 단리된 혈청의 scFv-Fc 부분에 대한 결합능을 2차 항체를 이용한 검출에 의해 ELISA로 시험하였다. 마우스를 면역화하는데 사용된 scFv-Fc의 Fc 부분과 교차 반응하지 않은 항-이디오타입 항체를 선별하기 위해, Fc 도메인 (SEQ ID NO: 32)만을 함유하는 펩타이드에 대해 클론을 카운터-스크리닝하였다. 힌지가 없는 Fc 도메인 (SEQ ID NO: 32)에 융합된 또 다른 CD19 항체, SJ25C1 (SEQ ID NO: 25에 제시된 링커에 의해 분리된 SEQ ID NO: 23 및 24의 가변 영역 서열들)로부터 유래된 scFv를 함유하는 구조물에 대해서도 클론을 카운터-스크리닝하여, 상이한 항-CD19 항체와 교차 반응하지 않은 항-이디오타입 항체를 추가로 선발하였다.
[563] 하이브리도마 융합 클론을 생성하고 12개의 후보 클론을 유세포 계측법으로 추가로 특성화시켰다. 말초혈액단핵 세포를 인간 대상자로부터 분리하고 세포를 활성화시키고 항-CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입하였다. 유세포 계측법을 위해, 100 μL 당 약 1 x 106 세포를 10 μL의 바이오틴-컨쥬게이트된 항-이디오타입 항체와 함께 인큐벵션한 후 PE-컨쥬게이트된 스트렙타비딘으로 염색하였다. CAR의 표면 발현에 대한 양성 대조군으로서 세포를 CAR 발현의 대체물인 EGFRt 형질도입 마커의 발현을 검정하기 위해 항-EGFL 항체로 염색하였다. 모의 대조군으로서, PBMC를 CAR을 발현하지 않은 공 벡터로 형질도입하였다. 세포들을 CD3+CD4+/CD8+ PBMC 상에서 게이트시키고 형광 시그널을 결정하였다. 그 결과 후보 항-이디오타입 항체들이 PBMC 표면 상의 CAR에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. FMC63으로부터 유래된 항-CD19 항체 유래의 scFv에 대해서 항체가 특이적인지 확인하기 위해, 실시예 1에 설명된 바와 같이 SJ25C1로부터 유래한 항-CD19 CAR로 형질도입된 세포에 대해 유사한 실험을 수행하였다. FMC63-유래된 항체에 대한 후보 항-이디오타입 항체들 중 어느 것도 SJ25C1로부터 유래된 scFv를 함유하는 상이한 항-CD19 CAR을 발현하는 세포에 대해 특이적인 결합을 나타내지 않았다. 항-이디오타입 항체 B-1(항-ID-B-1) 및 B-2(항-ID-B-2)를 추가 특징화를 위해 선택하였다.
B. 서열 동정
[564] 항-ID B-1 및 B-2 항체들의 서열을 결정하였다. PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Cat. No. 6110A)을 이용하여, 이소타입-특이적 안티센스 프라이머 또는 유니버설 프라이머를 사용하여 항-ID B-1 및 B-2 및 cDNA를 발현하는 하이브리도마 클론들을 함유하는 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. RACE PCR을 수행하여 항체의 가변 (중쇄 및 경쇄) 및 불변 영역을 증폭시킨 후, 이를 클로닝 벡터에 개별적으로 클로닝하고 서열결정하였다. 표 3은 항체의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 상응하는 SEQ ID NO를 나타낸다.
Figure 112019032556139-pct00005
실시예 3: T 세포 자극에 미치는 플레이트- 결합된 항- 이디오타입 항체의 효과
[565] 이 실시에는 실시예 1에 기재된 SJ25C1-특이적인 항-이디오타입 항체 (항-ID A-1)의 존재하에 또는 실시예 2에 기재된 FMC63-유도 된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 (항-ID B-1)의 존재 하에 CAR T 세포를 인큐베이션한 후의 결과들을 설명한다.
[566] 말초혈액단핵 세포들을 인간 대상자로부터 단리하고 이 세포들을 활성화하고 FMC63로부터 유래되거나 또는 SJ25C1으로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 갖는 scFv를 비롯한 결합 도메인을 갖는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 이러한 벡터들을 세포 내로 도입하여 각각 FMC63-유래된 scFv-함유 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포 및 SJ25C1-유래된 scFv-함유 CAR를 발현하도록 조작된 T 세포를 생성시켰다. FMC63-유래된 CAR의 경우, CAR-인코딩된 구조물은
CAR 코딩 구조는 형질 도입 및 CAR 발현을 위한 대리 마커로서 작용하는 절단된(truncated) EGFR (EGFRt)을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하고; EGFRt-코딩 영역은 T2A 스킵 서열에 의해 CAR-인코딩 서열로부터 분리되었다. 조작된 세포들을 다양한 분석법으로 평가하였다.
[567] 증식 연구를 위해, 조작된 T 세포들을 50 nM 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 또는 CELL TRACE VIOLET (CTV) 염료로 표지시켰다. 적절한 경우, 대리 EGFRt 마커의 발현을, 항-EGFL 항체 염색을 이용하여 검출하였다. 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액 (pH 9.0)에서 10, 5, 2.5, 또는 1.25 μg/ml의 OKT3 (항-CD3 항체), 또는 SJ25C1 및 FMC63을 인식하는 항-이디오타입 항체들 (각각 항-ID A-1 미 항-ID B-1)로 이전에 코팅시킨 웰에서 웰 당 고정된 세포 수로 세포를 밤새 접종하였다. 항체 코팅 없이 웰에 접종된 세포들을 음성 대조군으로서 포함시켰다. 세포를 4일간 배양하고 CD69 및 CD25의 생존능, 증식 및 발현에 대해 평가하였다.
[568] 항-CD19 (SJ25C1 또는 FMC63) CAR-발현 T 세포의 증식을 유세포 계측법을 이용하여 염료 희석에 의해 평가하였다. 항-ID A-1으로 항-CD19 (SJ25C1) CAR-발현 T 세포들을 자극한 후 관찰된 CD3+/CFSElow 세포의 백분율을 도 2A에 나타내었다. 항-ID B-1으로 항-CD19 (FMC63) CAR-발현 T 세포들을 자극한 후 관찰된 CD3+/EGFR+/CFSElow 세포의 백분율을 도 2B에 나타내었다. SJ25C1-유래된 scFv-특이적 항-ID A-1 항체의 존재하에서 인큐베이션한 결과 항-CD3 항체로 자극된 경우와 필적할만한 수준으로 항-CD19 (SJ25C1) CAR-발현 T 세포들이 증식되는 것으로 관찰되었다(도 2A). 이와 대조적으로, 다른 항-CD19 CAR 결합 도메인에 특이적인 다른 항-Id, FMC63-유래된 scFv-특이적 항-ID B-1의 존재 하에 인큐베이션된 항-CD19 (SJ25C1) CAR-발현 T 세포에서 관찰된 증식은, 자극제가 부재하는 경우의 세포에서 관찰된 것과 유사하였다. 마찬가지로, FMC63-유래된 scFv-특이적 항-이디오타입 항체 항-ID B-1의 존재 하에서의 인큐베이션은 항-CD3 항체으로 자극된 경우와 필적할만한 수준으로 항-CD19 (FMC63-유래된 결합 도메인) CAR-발현 T 세포들의 증식을 결과시키는 것으로 관찰되었다. 이와 대조되게, 상이한 항-CD19 CAR을 인식하는 또 다른 항-Id (SJ25C1-유래된 scFv-특이적 항-ID A-1 항체)의 존재 하에서 인큐베이션된 세포들은 자극제 부재하에 인큐베이션된 세포들에서 관찰된 것과 유사하였다 (도 2B). 이러한 결과는 각각의 항-ID A-1 및 항-ID B-1이, 해당 항체가 특이적인 각 scFv를 함유하는 CAR을 발현하는 T 세포의 자극과 유도를 모두 수행할 수 있고, 동일한 항원에 지향된 상이한 CAR을 세포를 발현하지만 해당 항체가 특이적인 특이적 결합 도메인은 함유하지 않는 동일한 항원에 지향된 상이한 CAR을 발현하는 T 세포 증식은 유도하지 않음을 입증하는 것이다. 이러한 결과는 항-ID A-1 및 항-ID B-1이 그들 각각의 표적을 특이적으로 인식하지만 동일 항원에 대한 다른 결합 도메인을 함유하는 CAR에 대해서는 인식하지 못하는 이들의 능력과 일치하는 것이다.
[569] 또 다른 분석 결과, 항-ID 농도에 특이적인 방식으로 T 세포에 CAR-스펙 시그널을 제공하는, 이 분석법에서 평가된 예시적인 항-ID의 능력이 확인되었는데, 이는 CD19-특이적 CAR-발현 T 세포를 통해 수신된 시그널의 양을 조정하는 항-ID의 이용성과도 일치하는 것이다. 이 분석에서, 모의 형질도입된 T 세포와 CAR 형질도입된 T 세포를 CELL TRACE VIOLET (CTV)으로 표지하였다. 접종에 앞서, 항-CD19 CAR의 결합 도메인에 특이적인 예시적인 항-이디오타입 항체 0.25, 0.5, 또는 1μg/ml로 웰을 코팅하였다. 세포들을 4일간 배양하고 유세포 계측법을 통한 염료 희석의 정도를 평가함으로써 증식을 평가하였다. 도 2C는 CD8+ CAR T 세포 증식의 항-이디오타입 농도-의존적 유도를 도시한다. 이러한 결과는 다양한 맥락에서, CAR-발현 T 세포들이, 본원에 제공된 플레이트-결합된 예시적인 항-이디오타입 항체들의 양을 조정하는 능력, 예컨대, 시그널의 양을 조정하거나 및/또는 자극 수준을 제어하고 및/또는 자극의 정도를 최적화하는 능력이 있음을 입증하는 것이다.
[570] 항-ID A-1 및 항-ID B-1의 자극 능력을 추가로 입증하기 위해, 표적 항-CD19 CAR (각각 SJ25C1-또는 FMC63-유래됨)로 형질도입된 T 세포들을, 유세포 계측법을 이용하여, 1.25, 2.5, 5, 및 10μg/ml를 포함하는 농도에서 플레이트-결합된 항체로 자극한 후, T 세포 활성화의 두 가지 마커인, CD69 및 CD25의 발현에 대해 평가하였다. 형질도입된 T 세포들을, CAR 발현을 위한 대체물로서 EGFR에 대해 게이트시키고, CD4+ 또는 CD8+ EGFR+ 세포들을 CD69 또는 CD25 발현에 대해 평가하였다.
[571] SJ25C1-유래된 항-CD19 CAR로 형질도입된 T 세포들과 관련하여 도 3에 도시된 바와 같이, 항-ID A-1은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 두 가지 모두에서 CD25의 발현을 항-CD3 항체로 자극된 세포들보다 더 높게 유도하였다. 항-ID A-1은 또한, 세포들이 항-CD3 항체로 자극된 경우와 유사하거나 살짝 낮은 수준으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포들에서의 CD69의 발현을 유도하기도 하였다. CD69 및 CD25의 발현은 비자극 세포들이나 또는 FMC63-유래된 scFv-특이적항-ID B-1으로 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. FMC63-유래된 항-CD19 CAR로 형질도입된 T 세포들과 관련하여 도 4에 도시된 바와 같이, 항-ID B-1은 CD4+/EGFR+ T 세포 및 CD8+/EGFR+ T 세포의 두 가지 모두에서 항-CD3 항체로 자극된 세포들에서보다 CD25의 발현을 더 높게 유도하였다. 항-CD3 항체에 의한 자극과 비교시, CD69의 발현은 또한 CD4+/EGFR+ T 세포들에서 항-ID B-1 항체의 경우보다 더 높은 수준으로 유도되었고 CD8+/EGFRT+ T 세포들에서는 유사하거나 살짝 더 높은 수준으로 유도되었다. CD69의 발현은 CD8+/EGFR+ T 세포들의 보다 높은 항체 농도에서 유사하거나 약간 더 높았다. CD69 및 CD25의 발현은 자극되지 않은 세포들이나 또는 SJ25C1-특이적 항-ID A-1 항체로 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 항-ID A-1 및 항-ID B-1 두 가지 모두 그들의 표적 scFv를 함유하는 CAR을 발현하는 T 세포들을 특이적으로 자극할 수 있었음을 가리킨다.
실시예 4: 유전자조작 산물-특이적인 숙주 면역 반응의 분석
[572] 처리된 대상자의 혈청 중, 투여된 항-CD19 CAR을 인식하는 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 브릿지 항-치료 항체 (ATA) 분석법이 개발되었다. 실시예 1-3에 설명된 어떤 항-ID 항체들을 양성 대조군으로서 사용하여 이러한 항체의 존재를 검출하기 위한 분석법의 능럭을 검정하였다.
[573] FMC63으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 CAR의 scFv 부분 (SEQ ID NO:34에 제시됨)을 함유하는, 바이오티닐화된 인간 Fc-융합 단백질 (바이오티닐화된 ECD 융합 단백질)이 사용되었다. 바이오티닐화된 ECD 융합 단백질을 스트렙타비딘-코팅된 웰에 첨가하고; 유압 단백질의 결합을 허용하는 조건 하에서 플레이트를 인큐베이션한 다음 세척하였다. 바이오티닐화된 융합 단백질-코팅된 웰에, 다양한 농도의 항-ID B-1 또는 항-ID B-2를 첨가하고, 항체의 특이적 결합을 허용하는 조건에서 인큐베이션하였다. 세척 후, FMC63-유래된 Fc-scFv 융합체를 함유하는 ECD 융합 단백질(설포-ECD 융합 단백질)의 설포-태그된 버젼. 웰들을 세척하고 Meso Scale Discovery (MSD) Sector Imager 상에서 전자화학발광(ECL) 시그널을 판독하였다.
[574] 도 5에 도시된 바와 같이, 항-ID B-1 및 항-ID B-2의 농도가 증가함에 따라 ECL 시그널이 증가하였는데, 이는, 양성 대조군으로서, 예시된 어떤 항-ID 항체들을 사용하든지, 혈청 샘플 내 항체의 존재 여부 및 그 수준을 평가하는데 이들 분석법이 이용될 수 있음을 가리키는 것이다.
[575] 일부 구체예에서, 양성 대조군으로서, 항-ID B-1 및/또는 항-ID B-2 항체를 이용하는 ATA 분석법을 이용함으로써, 항-CD19 (FMC63) CAR-발현 T 세포들을 함유하는 세포 치료제 투여량이 주입된 바 있는 대상자로부터의 샘플 내 CAR에 대한 ATA 항체의 존재 또는 부재를 평가한다. 이러한 ATA는 어떤 맥락에서, 투여된 CAR에 대한 숙주의 체액성 면역 반응을 잠재적으로 가리키는 것일 수 있다. 예시적인 분석법에서, 여러 시점, 예컨대 주입 전 및/또는 세포 치료제 투여 개시 후 제14일 및 제28일, 그리고 일부 경우 3, 6 및/또는 12개월에 대상자로부터 혈장 샘플을 수득한다. 이러한 혈장 샘플로부터 유래된 샘플들은, 전술한 분석법에서, 항-ID 항체를 함유하는 대조군 샘플로서 이용된다.
[576] 항-CD19 (SJ25C1) CAR-발현 T 세포들을 함유하는 세포 치료제 투여량이 주입된 바 있는 대상자로부터의 샘플을 평가하기 위해 유사한 브릿지 분석법도 생성되었다. 이 분석법에서는, 항-ID A-1 항체가 양성 대조군으로 사용되었다. 이 분석법은 양성 대조군 항-ID 항체에 기초하여 결정시 민감도가 100 ng/mL 미만이고 혈장 배경에 대해 >4배 내지 5배 시그널인 것으로 관찰되었다.
실시예 5 비드에 대한 항- 이디오타입 항체의 컨쥬게이션
[577] 실시예 2에 설명된 항-ID B-1 또는 항-ID-B1을, 초상자성, 비-공급성, 단일분산성, 토실활성화 비드인, 시중에서 입수가능한 토실-활성화된 자성 비드(ThermoFisher, Waltham MA)의 표면에 공유적으로 커플링시켰다. 이들 비드는 일차 아미노 및 술프히드릴기에 공유적으로 결합한다. 직경이 약 2.8 μm (M-280이라 칭함) 또는 4.5 μm (M-450이라 칭함)인 비드를 이용하여 컨쥬게이션을 수행하였다.
[578] 200 μg 항-ID 항체를 약 1 mL의 토실-활성화된 비드 (예컨대 직경이 2.8 μm인 대략 4x109개의 토실-활성화된 비드 또는 직경이 4.5 μm인 약 4x108개의 토실-활성화된 비드)에 첨가하고 37℃에서, 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 인산염 완충액(PBS)에서 밤새 인큐베이션함으로써 공유 커플링을 수행하였다. 컨쥬게이션 후, Cellometer를 이용하여 비드 농도를 결정하였다.
[579] 항-ID 컨쥬게이트된 비드의 안정성을 평가하기 위해, 비드들을 펠릿화하고, 상등액을 제거한 다음 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔에 로딩하고 상기 겔을 쿠마씨 블루로 염색하였다. 비드 상에 컨쥬게이션된 총 단백질에 대한 대조군으로서, 상기 펠릿화된 비드들을 약 70℃의 4X (리튬 도데실 설페이트) LDS 샘플 완충액에서 20분간 끓이고 약 12.5 μL 또는 25 μL의 비등 상등액 역시 SDS-PAGE 겔 처리하여 쿠마시 블루로 평가하였다. 비드에 컨쥬게이션되지 않은 대략 2.5 μg 또는 5.0 μg 항-ID 항체 (양성 대조군) 또는 5 μL 0.1% HSA (음성 대조군) 역시도 SDS-PAGE 및 쿠마씨 염색에 의해 평가하였다. 비등되지 않은 컨쥬게이션 샘플로부터의 상등액애세는 항-ID 항체가 검출되지 않았는데, 이는 컨쥬게이션이 안정함을 가리키한 반면, 항-ID 항체는 비등된 컨쥬게이션 샘플로부터의 상등액에서 검출되지 않았다.
실시예 6: 항- 이디오타입 항체- 컨쥬게이트된 비드와 함께 배양된 T 세포들의 자극 평가
[580] FMC63-유래된 scFv-특이적 항-ID B-1-컨쥬게이트된 비드들을 T 세포들과 인큐베이션하였다. 건강한 공여자의 백혈구추출 샘플로부터의 면역친화성-기반 농축에 의해 CD3-정제된 T 세포들을 단리하였다. 단리된 세포들을 FMC63으로부터 유래된 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 이들 바이러스 벡터 구조물은 CAR 발현의 대리 마커로서 기능하는 절단된 EGFR (EGFRt); T2A 스킵 서열에 의해 CAR 서열로부터 분리된 EGFRt-코딩 영역을 추가로 인코딩하였다. 형질도입 후, 세포들을 배양체에서 팽창시키고 냉동보존에 의해 동결시켰다.
[581] T 세포의 자극 연구를 위해, 해동된 CD4+ 또는 CD8+ CAR-발현 세포들을 웰 당 약 50,000개의 총 세포로 별도 접종하였다. 일부 경우에서, 배양 배지에 다음과 같이 사이토카인을 추가 보충하였다: CD4+ 세포들의 경우, 대략 1200 IU/mL 재조합 IL-7,20 IU/mL 재조합 IL-15 및 100 IU/mL 재조합 IL-2; CD8+ 세포들의 경우, 대략 200 IU/mL 재조합 IL-2 및 20 IU/mL 재조합 IL-15. 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드을 1:1 또는 1:5의 세포:비드 비율로 세포에 첨가하고 50% 배지를 2-3일마다 교환하면서 최대 14일간 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서, 표시된 사이토카인의 존재 또는 부재 하에 3:1의 세포:비드 비율로, 세포들을 항-CD3/항-CD28 자성 비드와 함께 배양하였다.
[582] 다양한 배양 시점에서, CD4+ 또는 CD8+ 형질도입된 세포들 (대리 마커의 발현을 위해 항-EGFR에 의해 검출됨)을 팽창, PD-1 발현 및 생존능에 대해 평가하였다.
[583] 도 6 및 7에 도시된 바와 같이, 특히 사이토카인 존재 하에, 1:1 또는 1:5의 세포:비드 비율로 세포들을 항-ID 컨쥬게이트된 비드아 함께 배양한 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 팽창이 각각 관찰되었다. 팽창 정도는 세포들을 대조군 항-CD3/항-CD28 자성 비드와 함께 배양한 경우보다 더 높았다.
[584] 배양 제3일, 제7일, 제10일 및 제14일에 유세포 계측법에 의해 CD4+ 세포 서브세트에서의 PD-1 표면 발현을 평가하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, PD-1 발현은 항-CD3/항-CD28 자성 비드와 배양된 세포들에서 높았지만, PD-1의 수준은 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 함께 배양된 세포에서 실질적으로 더 낮거나 검출불가능하였다.
[585] 도 9에 도시된 바와 같이, 1:1 또는 1:5 비율로 항-ID 컨쥬게이트된 비드 또는 대조군 항-CD3/항-CD28 컨쥬게이트된 비드와 함께 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 생존능 백분율은, 사이토카인 존재 하에 세포들을 부가적으로 배양시킨 배양 기간 동안 일정하게 높게 유지되었다. 그러나 모든 조건에서, 세포들의 생존능은 사이토카인 추가가 없는 경우 감소하였으며, 세포 생존능의 최대 손실은 세포 배양 후기에 일어났다.
실시예 7: 항- 이디오타입 항체- 컨쥬게이트된 비드와 함께 배양된 T 세포의 사이토카인 생산성 평가
[586] FMC63으로부터 유래된 scFv를 갖는 항-CD19 CAR에 의해 조작된 T 세포들을 실제로 실시예 6에 설명된 바와 같이 생성하였다. 해동된 CD8+ T 세포들을 골지(Golgi) 저해재 존재 하에 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드와 4 시간 동안 배양하였다. TNFα, IFNγ, 및 IL-2의 세포내 사이토카인 수준을, CAR+ T 세포 서브세트 (항-EGFR을 이용하여 대리 EGFRt 형질도입 마커에 대한 양성 표면 염색에 의해 결정됨) 또는 CAR-T 세포 서브세트 (항-EGFR을 이용하여 EGFRt에 대한 음성 표면 염색에 의해 결정됨)에서 유세포 계측법으로 결정하였다. 비교를 위해, CAR+ T 세포들 (EGFR+) 역시도, 이펙터:T 세포 비율을 1:2로 하여 CD19-발현 표적 세포들 (CD19, K562-CD19를 발현하도록 형질도입된 K562 세포들)과 함께 배양하였다.
[587] 도 10A에 도시된 바와 같이, 세포들을 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드의 존재 하에 배양한 경우 TNFα, IFNγ 및 IL2 사이토카인의 세포내 사이토카인 수준이 CAR+ T 세포들 (EGFRt+)에서 유도되었지만 CAR-T 세포들 (EGFR-)에서는 유도되지 않았다. 이 연구에서, 항-ID 컨쥬게이트된 비드의 존재 하에 관찰된 자극 정도는 대안적인 CAR-특이적 자극 시약인 항원-발현 K562-CD19 세포들을 이용하여 CAR+ T 세포들을 자극한 경우와 유사하였다 (도 10B). 이러한 결과는, 비드에 컨쥬게이션된 항-ID가 작용성이며, 항-ID 항체에 의해 인식되는 항원-결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 T 세포들을 특이적으로 자극한다는 것을 입증하는 것이다. 또한, 비드 시약은 세포 배양을 필요로 하고 로트(lot) 마다 변이를 일으킬 가능이 있는 세포주에 비해 더 우수한 CAR-특이적 자극 시약을 제공한다.
실시예 8: 연속 재자극 후의 팽창 평가
[588] 반복적인 자극 후 생체외에서 팽창하는 세포들의 능력은 CAR+ T 세포들이 지속되는 능력의 잠재적인 대리자(예컨대 초기 활성화 후)이거나 및/또는 생체내 기능을 가리키는 것이다 (Zhao et al. (2015) Cancer Cell,28:415-28). CAR+ T 세포들을 전술한 바와 같이 생성시키고 해동된 CD4+ 또는 CD8+ CAR-발현 T 세포들을 웰 당 50,000 CAR+ 세포들로 개별적으로 플레이팅하였다. 실시예 6에 설명된 바와 같이 사이토카인 존재 또는 부재 하에 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드를 1:1 또는 1:5의 세포:비드 비율로 세포에 부가하였다. 대조군으로서, 사이토카인 존재 또는 부재 하에 항-CD3/항-CD28 자성 비드를 3:1의 세포:비드 비율로 세포에 부가하였다. 3-4일마다 세포를 수확하여 계수하고, 매 라운드마다 초기 접종 밀도로 세포 수를 재설정한 후 동일한 배양 조건을 사용하여 새로운 표적 세포로 재자극 하였다. 14일간의 배양 기간 동안 총 4회의 자극이 수행되었다. 자극의 각 라운드마다 배가(doubling) 횟수를 결정하였다.
[589] 도 11에 도시된 바와 같이, 사이토카인 존재 하에 세포를 배양한 경우 팽창 정도가 더 크긴 하였지만, 항-ID 컨쥬게이트된 비드로 재자극한 후 CAR-발현 (EGFR+) CD4+ 세포들의 지속적인 세포 팽창이 관찰되었다. 또한, 세포를 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양한 경우 팽창 정도가 더 컸다. 세포들을 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 함께 배양한 경우, 특히 첨가된 재조합 사이토카인이 없는 경우, 팽창 정도가 다소 더 컸지만, CD8+ T 세포들의 경우, 항-ID 컨쥬게이트된 비드 또는 항-CD3/항-CD28 비드의 존재 하에서 세포를 배양했을 때 유사한 팽창 동력학이 관찰되었다.
실시예 9: 항- 이디오타입 항체- 컨쥬게이트된 비드를 이용한 CAR-특이적 세포 팽창의 추가 분석
[590] 서로 다른 두 명의 환자 공여자로부터 생성된 CAR-발현 T 세포들을 사용한 것을 제외하고, 실시예 7 및 8에 설명된 것과 유사한 연구를 수행하였다. CD3-정제된 T 세포들을 2명의 공여자 환자의 말초혈액단핵 세포(PBMC)로부터 단리하고, FMC63로부터 유래한 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터를 이용하여 형질도입하고, 배양체에서 팽창, 동결시킨 다음 해동하였다.
[591] 해동된 CD4+, CD8+ 또는 CD4/CD8 (1:1 비율)의 공동-배양체를, 다음과 같이 사이토카인이 추가 보강된 배양 배지에서 대략 5 x 106 총 세포들/웰의 농도로 6-웰 플레이트의 웰에 접종하였다: CD4+ 세포들 또는 CD4+/CD8+ 공동 배양체의 경우 배양체를 약 1200 IU/mL 재조합 IL-7,20 IU/mL 재조합 IL-15 및 100 IU/mL 재조합 IL-2로 보강하고; CD8+ 세포들의 경우 배지를 200 IU/mL 재조합 IL-2 및 20 IU/mL 재조합 IL-15로 보강하였다. 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드를 1:1의 세포:비드 비율로 세포에 첨가하고 50% 배지를 2-3일마다 교환하면서 최대 9일 동안 인큐베이션하였다.
[592] 다양한 배양 시점에서, 각 조건에 따라 배양체에 존재하는 CD4+ 또는 CD8+ 형질도입된 세포들 (대리 마커의 발현을 위해 항-EGFR에 의해 검출됨)의 수를 평가하고 총 세포의 백분율로서 CAR-발현 세포들의 빈도 또는 폴드 팽창을 결정하였다. PD-1 및 CD25의 발현 및 세포 생존능도 구하였다.
[593] 도 12A에 도시된 바와 같이, CD4+ 세포들 만을 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 함께 배양시킨 경우 CAR-발현 (EGFRt+) CD4+ T 세포들이 60배 이상 팽창한 것으로 관찰되었다. CD8+ T 세포들의 경우, CD8+ T 세포를 CD4+ 세포와 공동-배양한 경우, 항-ID 컨쥬게이트된 비드의 존재 하에 CAR-발현 (EGFRt+) CD8+ T 세포들의 실제로 더 높은 팽창이 일어났다. 도 12B에 도시된 바와 같이, CAR-발현 (EGFRt+) CD4+ 또는 CD8+ T의 빈도는 항-ID 컨쥬게이트된 비드의 존재 하에서 9일간의 배양 동안 제9일에 배양체에 존재하는 형질도입된 세포(EGFRt+)의 > 90%로 증가하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포들의 생존능 역시 배양하는 동안 100%에 가깝게 유지되었으며 CD4+ T 세포와 공동배양시 CD8+ T 세포의 생존능이 약간 더 높은 것으로 관찰되었다(도12C). 유사한 결과가 두 명의 공여자 모두에서 관찰되었다.
[594] 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 배양후 제5일, 제7일 및 제9일에 형질도입된 (EGFRt+) CD4+ 또는 CD8+ 세포 상의 PD-1 및 CD25의 표면 발현을 유세포 계측법에 의해 평가하였다. 도 13A에 도시된 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 두 가지 모두에서의 PD-1 발현은 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 배양시 시간이 지남에 따라 실제로 감소하였다. 도 13B에 나타난 바와 같이, CD25 발현 역시 항-ID컨쥬게이트된 비드의 존재 하에 배양 9일 후에 감소하였다. 유사한 결과가 두 명의 공여자 모두에서 관찰되었다.
실시예 10: 항- 이디오타입 항체 컨쥬게이트된 비드와 배양 후 사이토카인 수준 및 표현형 비교
[595] CD3-정제된 T 세포들을 FMC63로부터 유래된 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된 2명의 공여자 환자의 말초혈액단핵 세포(PBMC)로부터 단리하고 항-CD3 및 CD28 항체 코팅된 비드와 배양체에서 팽창시켰다. 팽창 후, 팽창된 T 세포들을 동결보존에 의해 동결시켰다. 연구를 위해, 동결된 T 세포들을 해동하고 세포내 사이토카인 수준 또는 표면 표현형(d=0)에 대해 CD4+ 및 CD8+ T 세포들을 평가하거나 또는 해동된 CD4+, CD8+, 또는 CD4+/CD8+ 공동-배양 T 세포들을 항-ID B-1 컨쥬게이트된 비드의 존재 하에 9일간 더 배양하고 PMA/이오노마이신 또는 CD19 형질도입된 K562 세포들 (d=9)에 의한 자극 후 세포내 사이토카인 수준 및 표면 마커 표현형을 평가하였다.
[596] 세포내 사이토카인 수준의 평가를 위해, 골지(Golgi) 저해제를 4 시간 동안 첨가한 다음 유세포 계측법에 의해 TNFα, IFNγ, 및 IL-2를 평가하였다. 모든 조건에서, 세포내 사이토카인 발현 정도는 CD19 형질도입된 K562 세포를 이용한 CAR-특이적 자극에 비해 세포를 PMA/이오노마이신으로 자극한 경우 실질적으로 더 높았다. 도 14A에 도시된 바와 같이, 해동 직후의 CD4+ 또는 CD8+ 세포들의 TNFα 및 IL-2 사이토카인 수준은 9일 동안 항-ID 컨쥬게이트된 비드 존재 하에 추가 배양된 대응하는 CD4+ 또는 CD8+ 세포들, 또는 CD4/CD8 T 세포의 공동 배양체와 유사하였다. 9일 동안 항-ID 컨쥬게이트된 비드 존재 하에 추가 배양된, 해동된 CD4+, CD8+ 또는 CD4/CD8 공동-배양 T 세포에서의 IFNγ 수준은 해동 직후의 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서의 IFNγ 수준에 비해 증가된 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 T 세포 기능이 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 함께 9일간 팽창 후에도 유지되었음을 입증하는 것이다. 두 명의 공여자로부터의 세포들에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
[597] 활성화 마커 CD25의 표면 발현, 저해 수용체 PD-1 및 LAG-3의 표면 발현 및 증식 마커 Ki-67의 핵 발현 역시도, 해동 직후의 CD4+ 또는 CD8+ 세포들(d=0) 또는 단독으로 팽창된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들에서 또는 항-ID 컨쥬게이트된 비드 존재 하에 9일간 더 배양된 CD4/CD8 공동-배양체(d=9)에서 평가하였다. 도 14B에 도시된 바와 같이, 해동 직후의 T 세포들에 비해, 항-ID 컨쥬게이트된 비드 존재 하에 9일간 추가 배양된 세포들에서는 CD25 발현이 감소된 것으로 관찰되었다 (Ki-67은 아님). CD25의 발현 감소는 CD4+ 세포들보다 CD8+ 세포들에서 더 심했다. 또한, 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 함께 9일간 인큐베이션된 후 단독 배양된 CD4+ 및 CD8+ 세포들이나 또는 CD4/CD8 공동-배양체에에서의 PD-1 및 LAG-3 발현은 해동 직후의 세포들에서의 발현에 비해 감소되었다. 이러한 결과는 세포 증식을 가리키는 마커 Ki-67에 대해 양성이면서도, 저해성 수용체 마커인 PD-1 및 LAG-3과 CD25 활성화 마커에 대해서는 낮은 표면 발현에 의해 특징화되는 상이한 활성화 상태를 나타내는 세포들의 백분율이 높다는 것으로부터 명백한 바와 같이, 항-ID 컨쥬게이트된 비드와의 인큐베이션 후, 이전에 동결된 형질도입된 세포들이 그 기능을 유지하였음을 입증하는 것이다.
실시예 11: 항- 이디오타입 항체를 이용한 CAR-발현 세포의 검출
[598] FMC63 항체로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항-CD19 scFv를 함유하는 항-CD19 CAR을 발현하는 CAR-T 세포들, 면역글로불린스페이서, CD28로붜 유래된 막관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동자극 영역, 및 CD3-제타 세포내 시그널링 도메인을 함유하는 T 세포 조성물을 생성하였다. 상기 CAR을 인코딩하는 바이러스 구조물은 T2A 스킵 서열에 의해 CAR 서열로부터 분리된 바 있는 EGFRt 대리 마커를 더 인코딩하였다.
[599] 항-CD19 CAR 발현 세포를 건강한 인간 말초혈액단핵 세포 (PBMC)를 함유하는 세포의 샘플에 첨가하였다. 결과적인 세포 조성물을 상이한 농도의 항-CD19 FMC63 scFv-특이적 항-ID B1 또는 항-ID B2 항체와 함께 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 각 조건의 샘플들 역시도 형질도입된 세포에서 EGFRt 대리 마커를 검출할 수 있는 농도의 항-EGFL 항체와 함께 인큐베이션하였다. 대조군 샘플에는 CAR-발현 T 세포가 첨가되지 않고 PBMC만을 함유하는 샘플이 포함되었다. 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 양성 표지된 세포에서 정량하여 항체 염색을 평가하였다.
[600] 도 15A에 도시된 바와 같이, 두 가지 항-이디오타입 항체들 모두 농도-의존적 방식으로, FMC63로부터 유래된 가변 영역과 함께 scFv를 갖는 항-CD19 CAR이 있는 T 세포를 검출하였다. 도 15B에 도시된 바와 같이, 항-ID B1 및 항-ID B2 항체들은 CAR 발현 세포를 함유하는 조성물에서는 양성 세포를 검출하였으나 PBMC만을 함유하는 조성물에서는 그렇지 않았다. EGFRt에 대한 염색 결과, PBMC에 대한 도입유전자를 발현하는 세포들의 비율이 모든 조건에서 일관되었음을 가리켰다. 이 결과는 CAR을 발현하지 않은 인간 PBMC를 함유하는 샘플들에서조차, 항-CD19 FMC63 scFv CAR-발현 세포를 특이적으로 검출하는 항-ID B1 및 항-ID B2 항체들의 능력을 확인해주었다. 이 결과는 예컨대 대상자의 다양한 조직 및/또는 체액에서 그러한 세포들의 팽창, 트래피킹 및/또는 지속성을 측정하기 위해, 인간 대상자로부터 수집된 말초혈액 샘플과 같은, 항체들에 의해 인식된 CAR-발현 세포들이 투여된 대상자로부터의 샘플에서 CAR-발현 세포를 인식하는데 항-이디오타입 항체가 이용될 수 있다는 해석과도 일치한다.
[601] 본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해 제공되는 특정 개시된 구체예에 대한 범위를 제한하려는 것이 아니다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본원 개시 내용의 진정한 범위와 사상을 벗어남이 없이 실시가능하며 본원의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. HAUSKINS, Colin HEIPEL, Mark D. SUTHERLAND, Claire L. SATHALIYA, Taher SMITH, Jeff <120> ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES AND RELATED METHODS <130> 735042006540 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/369,008 <151> 2016-07-29 <160> 164 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID CH <400> 2 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 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ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagcatctac 300 tatgaagagg cctggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa aacgacaccc 360 ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg 420 ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc 480 ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc 540 agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc 600 cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag 660 ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag 720 gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag 780 gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag 840 acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc 900 atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc 960 cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg 1020 tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg 1080 ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg 1140 gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc 1200 aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta 1260 catgagggcc tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaa 1317 <210> 74 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 HC signal sequence <400> 74 atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcc 57 <210> 75 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 VL <400> 75 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatag tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 76 <211> 642 <212> DNA <213> 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125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 157 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747) <400> 157 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 158 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747) <400> 158 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val 65 <210> 159 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747) <400> 159 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 160 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (LL to GG) <400> 160 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 161 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1) <400> 161 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 162 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 162 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 163 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 163 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 164 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 164 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110

Claims (177)

  1. SEQ ID NO: 36에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하는, 각각의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    SEQ ID NO: 40에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함하는, 각각의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 FMC63인 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하고,
    상기 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서:
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 44에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 45에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 46에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 47에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 48에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 49에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 88에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 91에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 46에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 47에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 48에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 49에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 89에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 92에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 46에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 47에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 48에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 49에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 90에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 95에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 96에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 97에 제시된 서열을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 1에 있어서, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열은 Kabat에 의해 정의된 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 1에 있어서:
    경쇄 가변 (VL) 영역은 SEQ ID NO: 40에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하고; 및
    중쇄 가변 (VH) 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 1에 있어서, 경쇄 가변 (VL) 영역은 SEQ ID NO: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 중쇄 가변 (VH) 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. SEQ ID NO: 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하는, 각각의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및
    SEQ ID NO: 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함하는, 각각의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 FMC63인 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하고,
    상기 표적 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 청구항 6에 있어서:
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 65에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 66에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 67에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 68에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 69에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 70에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 98에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 101에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 67에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 68에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 69에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 70에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 99에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 102에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 67에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 68에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 69에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 70에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 100에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 103에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 104에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 105에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 106에 제시된 서열을 포함하고; 및 CDR-L3는 SEQ ID NO: 107에 제시된 서열을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 청구항 6에 있어서, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열은 Kabat에 의해 정의된 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 청구항 6에 있어서:
    경쇄 가변 (VL) 영역은 SEQ ID NO: 62에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하고; 및
    중쇄 가변 (VH) 영역은 SEQ ID NO: 58에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 청구항 6에 있어서, 중쇄 (VH) 영역은 SEQ ID NO: 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 (VL) 영역은 SEQ ID NO: 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 청구항 1에 있어서, 표적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 청구항 6에 있어서, 표적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 청구항 1에 있어서:
    표적 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체 (CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함되고; 및/또는
    항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함된 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
  14. 청구항 6에 있어서:
    표적 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체 (CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함되고; 및/또는
    항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함된 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
  15. SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 함유된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열들을 포함하는, 각각의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및
    SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 함유된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열들을 포함하는, 각각의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역
    을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체 SJ25C1인 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하고,
    상기 표적 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 15에 있어서:
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 9에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 10에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 11에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L3은 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 78에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 81에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 11에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L3은 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 79에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 82에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 11에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L3은 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열을 포함하거나; 또는
    CDR-H1은 SEQ ID NO: 80에 제시된 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID NO: 83에 제시된 서열을 포함하며; CDR-H3은 SEQ ID NO: 84에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L1은 SEQ ID NO: 85에 제시된 서열을 포함하며; CDR-L2는 SEQ ID NO: 86에 제시된 서열을 포함하고; CDR-L3은 SEQ ID NO: 87에 제시된 서열을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. 청구항 15에 있어서, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열은 Kabat에 의해 정의되는 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 15에 있어서:
    경쇄 가변 (VL) 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하고; 및
    중쇄 가변 (VH) 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 청구항 15에 있어서, 중쇄 가변 (VH) 영역은 SEQ ID NO: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 (VL) 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  20. 청구항 15에 있어서, 표적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  21. 청구항 15에 있어서:
    표적 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체 (CAR)의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함되고; 및/또는
    항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 CAR의 세포외 부분의 항원-결합 도메인 내에 존재하거나 또는 이에 포함된 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 것인, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편.
  22. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR의 작용제(agonist) 항체인 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 인간화되거나 및/또는 재조합된 것인 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 모노클로날인 것인, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  25. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편은:
    항원-결합 단편이거나;
    항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및 단일 도메인 항체 (sdAb)으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원-결합 단편이거나;
    면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함하거나; 및/또는
    온전한 항체 또는 전장 항체인 것인,
    항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  26. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이종 분자 또는 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트.
  27. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자(들).
  28. 청구항 27에 기재된 핵산 분자(들)을 포함하는 벡터.
  29. 청구항 27에 기재된 핵산 분자(들)에 의해 인코딩된 중쇄 및 경쇄를 적절한 숙주 세포에서 발현시킨 다음 상기 항체를 회수 또는 단리하는 것을 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  30. 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포.
  31. 표적 항체 또는 상기 표적 항체를 포함하는 분자를 측정하거나 검출, 또는 표적 항체 또는 상기 표적 항체를 포함하는 분자의 활성을 변형시키는데 사용하기 위한, 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  32. 표적 항체를 측정하거나 검출, 또는 표적 항체의 활성을 변형시키는데 사용하기 위한, 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 및 지침을 포함하는 키트.
  33. (a) (i) 항체 SJ25C1 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을 청구항 15-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키거나; 또는
    (ii) 항체 FMC63 또는 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계로서,
    상기 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
    상기 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 표적 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 검출하는 단계
    를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 검출하는 방법.
  34. (a) (i) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포를 청구항 15-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키거나; 또는
    (ii) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포를 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계로서,
    상기 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
    상기 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 결합된 세포를 검출하는 단계
    를 포함하는, 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR을 검출하는 방법.
  35. (a) 표적 항체와 결합된 세포 또는 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 세포 집단을 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 결합된 세포를 선별하는 단계
    를 포함하는, 세포 집단으로부터 세포를 선별하는 방법.
  36. 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 청구항 15-21 중 어느 하나의 청구항의 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션시킴으로써, 자극된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하거나; 또는
    항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항의 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션시킴으로써, 자극된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것을 포함하고,
    상기 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
    상기 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 것인, 세포를 자극하는 방법.
  37. (a) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입함으로써, 인풋 조성물을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 인풋 조성물을, 청구항 1-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 함께 인큐베이션함으로써, 세포 조성물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 세포 조성물의 제조 방법.
  38. (a) (i) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을 청구항 15-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키거나; 또는
    (ii) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 조성물을 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계로서,
    상기 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고,
    상기 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 복합체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하는 방법.
  39. (a) 가용화 모이어티에 융합된 표적 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 가용성 면역화 시약을 대상자에게 도입하는 단계; 및
    (b) 대상자로부터 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 동정하는 단계
    를 포함하는, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편을 동정하는 방법.
  40. 키메라 항원 수용체 (CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 결합 시약 및 상기 결합 시약에 결합하는 샘플로부터의 분자를 포함하는 복합체가 형성되는 조건 하에서, 상기 결합 시약을, 항체 SJ25C1 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 CAR에 의해 조작된 세포를 포함하는 세포 요법제가 투여된 바 있는 대상자로부터의 샘플과 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 결합 시약은 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 CAR 또는 그의 일부의 세포외 도메인을 포함하고, 상기 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고, 상기 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 상기 복합체의 존재 또는 부재 여부를 검출함으로써, CAR에 결합하는 분자의 존재 또는 부재 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 (CAR)에 결합하는 분자의 존재 또는 부재 여부를 결정하는 방법.
  41. (a) 청구항 15-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 지침; 및
    세포 집단으로부터, 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 조작된 세포들을 선별 또는 농축하기 위한 지침; 또는
    항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 자극하기 위한 지침; 또는
    (b) 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약으로서, 상기 세포외 도메인 또는 그의 일부는 청구항 15-21 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 및 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 결합 시약
    을 포함하고,
    상기 항체 SJ25C1 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는, 제조 물품.
  42. (a) 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 검출하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하기 위한 지침; 및
    세포 집단으로부터, 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하는 조작된 세포들을 선별 또는 농축하기 위한 지침, 또는
    항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을 자극하기 위한 지침; 또는
    (b) 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편인 표적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 세포외 도메인을 포함하는 결합 시약으로서, 상기 세포외 도메인 또는 그의 일부는 청구항 1-14 중 어느 하나의 청구항에 기재된 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편 및 표적 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 결합 시약
    을 포함하고,
    상기 항체 FMC63 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 SEQ ID NO: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하는, 제조 물품.
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