CN117903316A - 抗独特型抗体及相关方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了特异性识别抗CD19抗体模块的抗独特型抗体，所述抗CD19抗体模块特别是存在于包括嵌合抗原受体(CAR)在内的重组受体中的抗CD19抗体模块。本公开进一步涉及抗独特型抗体用于特异性地鉴定和/或选择表达这种重组受体的细胞比如抗CD19CAR T细胞的用途。本公开进一步涉及抗独特型抗体用于特异性地激活这种细胞的用途。

Description

抗独特型抗体及相关方法
本申请是申请号为201780059515.0的中国专利申请(申请日：2017年7月29日，发明名称：抗独特型抗体及相关方法)的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月29日提交的名称为“抗体及相关方法”的美国临时专利申请62/369,008的优先权权益，出于所有目的将其内容通过提述完整并入本文。
通过提述并入序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。提供的序列表为2017年7月15日创建的名为735042006540SeqList.TXT的文件，其大小为86,050字节。将序列表电子格式信息通过提述完整并入。
领域
本公开在一些方面涉及特异性识别抗CD19抗体模块的抗独特型抗体，所述抗CD19抗体模块特别是存在于包括嵌合抗原受体(CAR)在内的重组受体中的抗CD19抗体模块。本公开进一步涉及抗独特型抗体用于特异性地鉴定或选择表达这种重组受体的细胞比如抗CD19 CAR T细胞的用途。本公开进一步涉及抗独特型抗体用于特异性地激活这种细胞的用途。
背景
使用表达重组受体(比如含有细胞外抗体抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR))的工程化细胞的方法可用于过继细胞疗法。有多种策略可用于在受试者体外或体内评估这种细胞的活性。需要改进的方法，以便特异性地评估表达CAR的细胞的活性。提供了满足这种需要的试剂、组合物和制品。
概述
本文中提供了与抗体特异性地结合的药剂，包括抗体片段(比如scFv)和含有它们的嵌合分子(比如嵌合抗原受体)。还提供了含有这样的药剂的组合物和制品，包括具有与所述药剂结合的表面(比如固体表面)的那些制品，例如平板或珠子。在实施方案中，本文还提供了这样的药剂、组合物和制品的用途和使用方法，包括用于检测、使用、操作和/或刺激含有或疑似含有抗体或嵌合分子的细胞或疗法，比如用于表达CAR的细胞的检测、刺激或用途。
在一些方面，所述抗体是或包括与靶抗体特异性地结合的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述靶抗体是或含有命名为SJ25C1的抗体的可变区、和/或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述药剂(例如，抗独特型抗体或抗原结合片段)含有与SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或者100％同一性)的轻链可变(VL)区；和/或与SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或100％同一性)的重链可变(VH)区。
本文中提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段含有与SEQID NO:5中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或者100％同一性)的VL区；和/或与SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或100％同一性)的VH区。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有重链互补决定区3(CDR-H3)，所述CDR-H3含有在SEQ ID NO:11或84中列出的氨基酸序列或含有在SEQ ID NO:1中列出的VH序列内包含的CDR-H3；并且/或者VL区含有轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述CDR-L3含有在SEQ IDNO:14或87中列出的氨基酸序列或含有在SEQ ID NO:5中列出的VL序列内包含的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有CDR-H1和CDR-H2，其分别含有在SEQID NO:1中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1和CDR-H2序列的氨基酸序列；并且/或者VL区含有CDR-L1和CDR-L2，其分别含有在SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1和CDR-L2序列的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有在SEQ ID NO:9、78、79或80中列出的CDR-H1，在SEQ ID NO:10、81、82或83中列出的CDR-H2，和在SEQ ID NO:11或84中列出的CDR-H3；并且/或者VL区含有在SEQ ID NO:12或85中列出的CDR-L1，在SEQ ID NO:13或86中列出的CDR-L2，和在SEQ ID NO:14或87中列出的CDR-L3。
本文中提供了含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和/或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别含有在SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别含有在SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
本文中提供了抗独特型抗体或其抗原结合片段，其含有包含氨基酸序列SEQ IDNO:9、78、79或80的CDR-H1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:10、81、82或83的CDR-H2，和包含如SEQ ID NO:11或84列出的氨基酸序列的CDR-H3；和/或包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或85的CDR-L1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或86的CDR-L2，和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14或87的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，所述抗体或片段的VH区含有氨基酸序列SEQ IDNO:1，并且/或者所述抗体或片段的VL区含有氨基酸序列SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，所述抗体或片段的VH区含有氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且所述抗体或片段的VL区含有氨基酸序列SEQ ID NO:5。在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段含有在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述药剂是抗独特型抗体或其抗原结合片段，其与靶抗体(是或含有命名为FMC63的抗体的可变区)或其抗原结合片段特异性地结合和/或与含有这样的抗体片段的嵌合分子特异性地结合，所述嵌合分子比如具有结合结构域的CAR，所述结合结构域含有衍生自FMC63的抗体可变区或其部分(比如处于scFv形式)。在一些实施方案中，所述药剂(例如，抗独特型抗体或抗原结合片段)含有与SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性的轻链可变(VL)区；和/或与SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或100％同一性)的重链可变(VH)区。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段含有与SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或者100％同一性)的VL区；和/或与SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性(和/或至少95％或99％序列同一性，或100％同一性)的VH区。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有包括氨基酸序列GYX3FX5X6YX8MX10(SEQID NO:108)的重链互补决定区1(CDR-H1)，其中X3是T或S，X5是T或S，X6是D或R，X8是Y或W，并且X10是K或N；包括氨基酸序列WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20(SEQ ID NO:109)的重链互补决定区2(CDR-H2)，其中X4是D或M，X6是N或H，X8是N或S，X9是N或D，X10是G或S，X11是G或E，X13是D或R，X14是Y或L，X17是N或K，并且X20是G或D；包括氨基酸序列AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X1 2X13X14X15(SEQ ID NO:110)的重链互补决定区3(CDR-H3)，其中X2是R或S，X3是E或I，X4是G或Y，X5是N或Y，X6是N或E，X7是Y或空值，X8是G或空值，X9是S或空值，X10是R或空值，X11是D或空值，X12是A或空值，X13是M或空值，X14是D或E，并且X15是Y或A；和/或VL区含有包括氨基酸序列X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY(SEQ ID NO:111)的轻链互补决定区1(CDR-L1)，其中X1是S或R，X3是S或R，X4是S或G，X5是G或N，X6是V或I，X7是I或H，X8是N或空值，X10是M或L，并且X11是Y或A；包括氨基酸序列X1X2X3YX5X6X7X8LAX11(SEQ ID NO:112)的轻链互补决定区2(CDR-L2)，其中X1是P或L，X2是W或L，X3是I或V，X5是L或N，X6是T或A，X7是S或K，X8是N或T，并且X11是S或D；包括氨基酸序列QX2X3X4X5X6PX8T(SEQ ID NO:113)的轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中X2是Q或H，X3是W或F，X4是S或W，X5是S或W，X6是N或T，并且X8是L或Y。
在一些实施方案中，互补决定区3(CDR-H3)含有在SEQ ID NO:94或104中列出的氨基酸序列或含有在SEQ ID NO:36或58中列出的VH序列内包含的CDR-H3；并且/或者轻链互补决定区3(CDR-L3)含有在SEQ ID NO:97或107中列出的氨基酸序列或含有在SEQ ID NO:40或62中列出的VL序列内包含的CDR-L3。
在一些实施方案中，VH区含有CDR-H1和CDR-H2，其分别包括在SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1和CDR-H2序列的氨基酸序列；并且/或者VL区含有CDR-L1和CDR-L2，其分别包括在SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1和CDR-L2序列的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有在SEQ ID NO:88、89、90、98、99或100中列出的CDR-H1，在SEQ ID NO:91、92、93、101、102或103中列出的CDR-H2，和在SEQ ID NO:94或104中列出的CDR-H3；并且/或者VL区含有在SEQ ID NO:95或105中列出的CDR-L1，在SEQ ID NO:96或106中列出的CDR-L2，和在SEQ ID NO:97或107中列出的CDR-L3。
本文中提供了含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和/或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别含有在SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分别包括在SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
本文中提供了抗独特型抗体或其抗原结合片段，其含有包括氨基酸序列SEQ IDNO:88、89、90、98、99或100的CDR-H1，包括氨基酸序列SEQ ID NO:91、92、93、101、102或103的CDR-H2，和包括如SEQ ID NO:94或104列出的氨基酸序列的CDR-H3；和/或包括氨基酸序列SEQ ID NO:95或105的CDR-L1，包括氨基酸序列SEQ ID NO:96或106的CDR-L2，和包括氨基酸序列SEQ ID NO:97或107的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，所述抗体或片段的VH区含有氨基酸序列SEQ IDNO:36或58，并且/或者所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:40或62。在一些情况下，所述抗体或片段的VH区包括氨基酸序列SEQ ID NO:36或58，并且所述抗体或片段的VL区包括氨基酸序列SEQ ID NO:40或62。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有在SEQ ID NO:44、88、89或90中列出的CDR-H1，在SEQ ID NO:45、91、92或93中列出的CDR-H2和在SEQ ID NO:46或94中列出的CDR-H3；并且/或者VL区含有在SEQ ID NO:47或95中列出的CDR-L1，在SEQ ID NO:48或96中列出的CDR-L2，和在SEQ ID NO:49或97中列出的CDR-L3。在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有在SEQ ID NO:65、98、99或100中列出的CDR-H1，在SEQ ID NO:66、101、102或103中列出的CDR-H2和在SEQ ID NO:67或104中列出的CDR-H3；并且/或者VL区含有在SEQ ID NO:68或105中列出的CDR-L1，在SEQ ID NO:69或106中列出的CDR-L2，和在SEQ ID NO:100或107中列出的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包括在SEQ ID NO:36中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；并且/或者VL区含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包括在SEQ ID NO:40中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包括在SEQ ID NO:58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；并且/或者VL区含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包括在SEQ ID NO:62中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ IDNO:36，并且/或者所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:40。在任何这样的实施方案的一些中，所述抗体或片段的VH区包括氨基酸序列SEQ ID NO:58，并且/或者所述抗体或片段的VL区包括氨基酸序列SEQ ID NO:62。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段是单链片段。在一些方面，片段含有通过柔性接头连接的抗体可变区。在任何这样的实施方案的一些中，片段含有scFv。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段含有在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区；并且/或者是包含在SEQ IDNO:28中列出的氨基酸序列的scFv。在一些实施方案中，靶抗体或抗原结合片段含有在SEQID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区；并且/或者是包含在SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列的scFv。
在任何这样的实施方案的一些中，所述抗独特型抗体或抗原结合片段与靶抗体或其抗原结合片段的表位特异性地结合，所述表位与被根据本文所述的任何一个实施方案的抗独特型抗体或抗原结合片段特异性地结合的表位相同或重叠。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中；并且/或者抗独特型抗体或抗原结合片段特异性地结合被包含在CAR的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中的靶抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或抗原结合片段是scFv，并且抗独特型抗体或抗原结合片段与CAR的scFv中的表位特异性地结合。
在任何这样的实施方案的一些中，抗体或片段与包含在嵌合抗原受体的细胞外部分中的衍生自抗体SJ25C1的单链可变片段(scFv)特异性地结合，任选地其中衍生自抗体SJ25C1的scFv含有在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区；和/或含有在SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。在任何这样的实施方案的一些中，抗体或片段与包含在嵌合抗原受体的细胞外部分中的衍生自抗体FMC63的单链可变片段(scFv)特异性地结合，任选地其中衍生自抗体FMC63的scFv含有在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区；和/或含有在SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或抗原结合片段与表位特异性地结合，所述表位在靶抗体或抗原结合片段的互补决定区(CDR)内或包括所述互补决定区的全部或部分。
在任何这样的实施方案的一些中，CAR进一步含有通过间隔物与抗原结合结构域连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，间隔物含有来自CD28的细胞外部分，所述CD28任选地是人CD28。在一些方面，来自CD28的细胞外部分含有在SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。在任何这样的实施方案的一些中，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分，所述CD28任选地是人CD28。在任何这样的实施方案的一些中，抗体或片段不与CAR的间隔物结构域中的表位结合。
在任何这样的实施方案的一些中，抗体或片段与CD28或其部分不结合或不特异性地结合，所述CD28任选地是人CD28，其任选地含有CD28的细胞外部分，任选地含有在SEQ IDNO:27中列出的氨基酸序列。在任何这样的实施方案的一些中，抗体或片段不与Fc结构域中的表位结合，所述Fc结构域任选地是人IgG1 Fc结构域。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段与人CD19特异性地结合。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或片段不与另一种抗CD19抗体交叉反应，所述抗CD19抗体任选地包含在另一个CAR的细胞外抗原结合结构域中。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或片段不与另一个CAR交叉反应。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或片段是含有靶抗体或抗原结合片段的CAR的激动剂抗体。在任何这样的实施方案的一些中，抗体或片段是含有靶抗体或抗原结合片段的CAR的拮抗剂。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是人源化的。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是重组的。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是单克隆的。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。在一些方面，抗原结合片段选自片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段含有免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区的至少一部分含有Fc区或含有CH2和CH3结构域的Fc的一部分。在一些方面，恒定区衍生自人IgG。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或抗原结合片段是完整抗体或全长抗体。
在任何这样的实施方案的一些中，提供了含有根据上述任一实施方案的抗独特型抗体或抗原结合片段和异源分子或模块的缀合物。在一些实施方案中，异源分子或模块是标记物。在一些方面，标记物选自荧光染料、荧光蛋白、放射性同位素、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、多肽、酶、链霉亲和素、生物素、发光化合物或寡核苷酸。在一些情况下，异源分子或模块是蛋白质、肽、核酸或小分子，其任选地是或含有毒素Strep-Tag。
在一些实施方案中，提供了编码根据本文所述的任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。在一些方面，核酸分子含有在SEQ ID NO:15中列出的编码(i)重链可变区的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或在SEQ ID NO:19中列出的编码(iv)轻链可变区的核苷酸序列、(v)与SEQ ID NO:19中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。
在任何这样的实施方案的一些中，核酸分子含有在SEQ ID NO:17中列出的编码(i)重链的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或在SEQ ID NO:21中列出的编码(iv)轻链的核苷酸序列、(v)与SEQ ID NO:21中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。
在一些实施方案中，核酸分子含有在SEQ ID NO:50或71中列出的编码(i)重链可变区的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:50或71中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或在SEQ ID NO:54或75中列出的编码(iv)轻链可变区的核苷酸序列、(v)与SEQ ID NO:54或75中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。在一些实施方案中，核酸分子含有在SEQ ID NO:52或73中列出的编码(i)重链的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:52或73中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或在SEQ ID NO:56或76中列出的编码(iv)轻链的核苷酸序列、(v)与SEQ ID NO:56或76中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。在一些实施方案中，编码重链和/或轻链的核苷酸序列含有信号序列。
本文中提供了含有根据本文所述任一实施方案的核酸分子的载体。本文中还提供了含有根据本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或根据本文所述任一实施方案的核酸分子的细胞。
本文中提供了产生抗独特型抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合的宿主细胞中表达由根据本文所述任一实施方案的核酸分子或根据本文所述任一实施方案的载体编码的重链和/或轻链，并且回收或分离抗体。在一些实施方案中，产生抗独特型抗体或抗原结合片段的方法包括在表达重链和/或轻链的条件下培养根据本文所述任一实施方案的细胞，并且回收或分离抗体。本文中还提供了通过根据本文所述任一实施方案的方法产生的抗独特型抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了含有根据本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段、根据本文所述任一实施方案的缀合物或根据本文所述任一实施方案的细胞的组合物。在任何这样的实施方案的一些中，组合物进一步含有药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，提供了含有根据本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段、根据本文所述任一实施方案的缀合物、根据本文所述任一实施方案的核酸中的一者或多者、以及任选的使用说明书的试剂盒。在一些情况下，试剂盒进一步含有用于固定抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物的试剂或支持物，其中所述试剂或支持物是珠子、柱子、微孔、棒、过滤器、条带或可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。
还提供了使用任何所提供的药剂(比如抗独特型抗体)的检测方法。在一些实施方案中，提供了检测靶抗体或其抗原结合片段(比如含有它的CAR)的方法，所述方法包括(a)使含有靶抗体(比如具有衍生自抗体SJ25C1或来自抗体FMC63、或来自这样的抗体之一的抗原结合片段的可变区的抗体)的组合物与抗独特型抗体或其抗原结合片段接触；(b)检测与靶抗体或抗原结合片段结合的抗独特型抗体和/或检测靶抗体或药剂的存在或不存在。
在一些实施方案中，所述方法包括(a)使含有或怀疑含有靶抗体(为抗体FMC63或抗原结合片段)的组合物与所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任何实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合；(b)检测与靶抗体或抗原结合片段结合的抗独特型抗体和/或检测靶抗体或药剂的存在或不存在。.
在一些方面，靶抗体或抗原结合片段与细胞结合或在细胞表面上表达，并且(b)中的检测包括检测与抗独特型抗体结合的细胞。在一些情况下，细胞在其表面上表达含有靶抗体或靶抗原结合片段的CAR。
在一些实施方案中，所提供的方法包括检测含有任何实施方案的靶抗体或其抗原结合片段的CAR，比如含有衍生自FMC63或SJ25C的可变结构域的CAR。在一些方面，所述方法包括(a)使表达含有靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞与根据所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或根据所述任一实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合；和(b)检测与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，所述方法包括(a)使表达含有靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞与所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任一实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合；和(b)检测与抗独特型抗体结合的细胞。在任何这样的实施方案的一些中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段直接或间接标记用于检测。
在一些实施方案中，提供了从细胞群中选择细胞的方法，所述方法包括(a)使表达含有靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞群或与靶抗体结合的细胞与根据本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或根据所述任一实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段；和(b)选择与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，所述方法包括(a)使表达包含靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞群或与靶抗体结合的细胞与所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任一实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段；和(b)选择与抗独特型抗体结合的细胞。
在一些情况下，通过基于亲和力的分离选择与抗独特型抗体结合的细胞。在一些方面，基于亲和力的分离是基于免疫亲和力的分离。在任何这样的实施方案的一些中，基于亲和力的分离是通过流式细胞术来完成。在一些实施方案中，基于亲和力的分离是通过磁激活细胞分选来完成。在一些方面，基于亲和力的分离包括亲和色谱法。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体可逆地结合或固定在支持物或固定相上。
其中所提供的方法还有使用所述药剂刺激细胞的方法，比如刺激含有诸如CAR的分子的细胞，所述CAR是或含有被抗独特型抗体识别的靶抗体。在一些方面，所述方法涉及将表达含有靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的输入组合物与根据所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任一实施方案的缀合物一起温育，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合，由此生成含有刺激细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所述方法包括将表达含有靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的输入组合物与所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任一实施方案的缀合物一起温育，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合，由此生成含有刺激细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，所述方法导致表达嵌合受体(比如被抗独特型抗体识别的CAR)的细胞的增殖、活化、刺激、细胞因子释放或其他功能性结果，比如活化标志物的上调或细胞因子释放或产生。在一些方面，在这样的细胞中诱导这种增殖或其他功能性反应或读出的程度与通过将细胞用刺激T细胞增殖的药剂和/或条件(比如抗CD3/CD28珠和/或交联的抗CD3)温育诱导的程度相似或更大。在一些方面，所述方法不涉及抗独特型抗体的交联。在任何实施方案的一些方面，在没有交联抗独特型抗体的情况下，抗独特型药剂能够诱导特定的增殖或其功能性结果或程度。在一些方面，本文中的抗独特型药剂在刺激或引起表达靶受体的T细胞或其他免疫细胞的特定功能性结果的能力方面是有利的，而不需要交联抗Id抗体或使用第二药剂。在一些方面，用可溶性或平板结合形式的抗独特型抗体实现结果。在一些方面，用与珠子偶联的抗独特型抗体实现结果。
在一些实施方案中，提供了产生细胞组合物的方法，所述方法包括(a)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子引入到细胞中，由此生成输入组合物；和(b)将所述输入组合物与对抗原受体CAR特异的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，由此产生细胞组合物。
在一些方面，CAR含有与CD19特异性地结合的靶抗体。在一些实施方案中，靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是根据所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合。在一些情况下，靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段。在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或其抗原结合片段与靶抗体(为所述任一实施方案的抗体FMC63)特异性地结合，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合。
在任何这样的实施方案的一些中，(a)中的引入包括通过病毒转导、转座、电穿孔或化学转染将核酸分子引入到细胞中。在一些情况下，(a)中的引入包括通过用含有核酸分子的逆转录病毒载体转导将核酸分子引入到细胞中，任选地其中病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些方面，(a)中的引入包括通过用含有核酸分子的转座子转座将核酸分子引入到细胞中。在一些情况下，(a)中的引入包括通过含有核酸分子的载体的电穿孔或转染将核酸分子引入到细胞中。
在任何这样的实施方案的一些中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前激活细胞的步骤。在一些方面，激活细胞的步骤包括使细胞与CD3激动剂和任选的CD28激动剂接触。在一些情况下，激活细胞的步骤包括使细胞与含有激动性抗CD3抗体和抗CD28抗体的试剂接触。
在任何这样的实施方案的一些中，在抗独特型抗体或其抗原结合片段与CAR结合的条件下进行温育，由此诱导或调节在输入组合物的一个或多个细胞中的信号。在任何这样的实施方案中，所述细胞含有T细胞。在一些情况下，T细胞含有CD4+和/或CD8+T细胞。
在任何这样的实施方案的一些中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至固体支持物，所述固体支持物任选地含有或缀合至含有多个结合位点的试剂，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。在任何这样的实施方案的一些中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至可溶性试剂，所述可溶性试剂任选地是或含有多个结合位点，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。在一些方面，所述试剂含有链霉亲和素突变蛋白。
在任何这样的实施方案的一些中，温育至少或约至少5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。
在任何这样的实施方案的一些中，作为组合物中总细胞的百分比，输入组合物含有少于或少于约60％、少于或少于约50％、少于或少于约40％、少于或少于约30％、少于或少于约20％或少于或少于约10％的表达CAR的细胞。
在任何这样的实施方案的一些中，与输入组合物中表达CAR的细胞数相比，输出组合物中表达CAR的细胞数增加大于1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；和/或与组合物中的总细胞相比，输出组合物中表达CAR的细胞的百分比增加大于10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
在任何这样的实施方案的一些中，在引入和/或温育之前，未针对所述细胞选择或富集表达CAR的细胞。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段含有在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体或抗原结合片段含有在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ IDNO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了纯化抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)使含有靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的组合物与根据本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或根据所述任一实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合；和(b)分离含有抗独特型抗体的复合物。在一些实施方案中，所述方法包括(a)使含有靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的组合物与所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任一实施方案的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合；和(b)分离包含抗独特型抗体的复合物。
在一些实施方案中，通过基于亲和力的分离将含有抗独特型抗体的复合物分离。在一些方面，基于亲和力的分离是基于免疫亲和力的分离。在一些情况下，基于亲和力的分离是基于磁性的分离。在一些实施方案中，基于亲和力的分离包括亲和色谱法。
在一些实施方案中，提供了鉴定抗独特型抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)向受试者引入可溶性免疫试剂，所述可溶性免疫试剂含有与增溶模块融合的靶抗体的抗原结合片段；和(b)鉴定来自受试者的与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合的抗体。
在任何这样的实施方案的一些中，抗原结合片段含有靶抗体的可变重链区和/或可变轻链区。在一些实施方案中，抗原结合片段是单链片段。在一些方面，抗原结合片段是scFv。在任何这样的实施方案的一些中，抗原结合片段在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中。
在任何这样的实施方案的一些中，增溶模块是Fc结构域或其片段，其任选地是人IgG1 Fc。在一些方面，增溶模块是缺乏铰链区的Fc结构域。在一些情况下，增溶模块含有在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，鉴定抗体包括(i)从受试者的脾中分离B细胞并将它们与永生化B细胞融合以生成杂交瘤；(ii)筛选杂交瘤用于产生特异性地结合靶抗体或其抗原结合片段或含有该抗原结合片段的嵌合抗原受体的抗体；和(iii)对来自产生特异性结合的抗体的杂交瘤的抗体进行测序，由此鉴定抗独特型抗体。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体与CD19结合。在一些实施方案中，靶抗体的抗原结合片段衍生自抗体SJ25C1，任选地其中所述靶抗体的抗原结合片段含有在SEQ IDNO:23列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体的抗原结合片段是衍生自抗体SJ25C1的单链可变片段(scFv)，任选地其中scFv含有在SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，靶抗体的抗原结合片段衍生自抗体FMC63，任选地其中所述靶抗体的抗原结合片段含有在SEQ ID NO:30列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体的抗原结合片段是衍生自抗体FMC63的单链可变片段(scFv)，任选地其中scFv含有在SEQ IDNO:34中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了耗竭细胞的方法，所述方法包括向受试者施用包含根据本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或根据所述任一实施方案的缀合物的组合物，所述独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述受试者已经被施用表达包含靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述靶抗体为抗体SJ25C1或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用包含本文所述任一实施方案的抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任一实施方案的缀合物的组合物，所述独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述受试者已经施用表达含有靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述靶抗体为抗体FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发生耗竭。
本文中提供了确定与嵌合抗原受体(CAR)结合的分子的存在或不存在的方法，所述方法包括(a)使结合试剂与来自已经施用细胞疗法的受试者的样品在形成含有所述结合试剂和与所述结合试剂结合的来自样品的分子的复合物的条件下接触，所述细胞疗法包括用含有靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体为抗体SJ25C1或其抗原结合片段，其中所述结合试剂包含含有靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或其部分；和(b)检测所述复合物的存在或不存在，由此确定结合CAR的分子的存在或不存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对阳性对照样品进行步骤(a)和(b)，并且任选地，通过与阳性对照比较确定所述分子的存在或不存在，其中阳性对照样品含有本文所述的任何抗独特型抗体或其抗原结合片段或本文所述的任何缀合物，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
本文中提供了确定与嵌合抗原受体(CAR)结合的分子的存在或不存在的方法，所述方法包括(a)使结合试剂与来自已经施用细胞疗法的受试者的样品在形成包含所述结合试剂和与所述结合试剂结合的来自样品的分子的复合物的条件下接触，所述细胞疗法含有用含有靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体为抗体FMC63或其抗原结合片段，其中所述结合试剂含有包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或其部分；和(b)检测所述复合物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对阳性对照样品进行步骤(a)和(b)，并且任选地，通过与阳性对照比较确定所述分子的存在或不存在，其中阳性对照样品含有如本文所述的任何抗独特型抗体或其抗原结合片段或本文所述的任何缀合物，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
在任何这样的实施方案的一些中，与结合试剂结合的分子是或含有抗体。在一些实施方案中，结合试剂经过可检测标记或能够产生可检测信号。在一些情况下，结合试剂与固体支持物结合或是可溶的。
在任何这样的实施方案的一些中，通过免疫测定法检测所述复合物。在一些实例中，免疫测定法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如BIAcore)、流式细胞术或Western印迹。在一些实施方案中，免疫测定法包括中尺度发现。在一些情况下，免疫测定法是夹心测定法或桥接测定法。
在任何这样的实施方案的一些中，所述结合试剂是第一结合试剂，并且检测复合物的存在或不存在包括：(i)使步骤(a)中形成的复合物与第二结合试剂接触，其中所述第二结合试剂(1)含有包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或其部分，和(2)经过可检测标记或能够产生可检测信号；和(ii)评估所述可检测信号的存在或不存在。在一些方面，第一结合试剂与固体支持物结合，任选地其中所述第一结合试剂直接或间接地与生物素连接和/或通过链霉亲和素与固体支持物结合；并且/或者所述第二结合试剂是可溶的。在一些情况下，第一和第二结合试剂的CAR的细胞外结构域或其部分是相同的。
在任何这样的实施方案的一些中，可检测标记物是或含有荧光标记物、化学发光标记物、电致发光标记物、比色标记物、生物发光标记物或放射性标记物；和/或可检测信号是或含有荧光信号、化学发光信号、电致发光信号、比色信号、生物发光信号或放射性信号。在任何这样的实施方案的一些中，可检测标记物是或含有SULFO-TAG。
在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体的抗原结合片段含有靶抗体的可变重链区和/或可变轻链区。在任何这样的实施方案的一些中，靶抗体的抗原结合片段是单链片段。在一些实施方案中，靶抗体的抗原结合片段是scFv。
在任何这样的实施方案的一些中，样品包括全血、血清或血浆。
本文中提供了含有本文所述的任何抗独特型抗体或其抗原结合片段或所述任何缀合物的制品、以及使用所述抗独特型抗体的说明书，所述抗独特型抗体用于检测SJ25C1抗体或其抗原结合片段或包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体；从细胞群中选择或富集表达含有抗体SJ25C1或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞；刺激包含表达嵌合抗原受体的细胞的输入组合物，所述嵌合抗原受体包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段。
本文中提供了含有如本文所述的任何抗独特型抗体或其抗原结合片段或本文所述的任何缀合物的制品、以及使用所述抗独特型抗体的说明书，所述抗独特型抗体用于检测FMC63抗体或其抗原结合片段或含有FMC63抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体；从细胞群中选择或富集表达包含抗体FMC63或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞；刺激包含表达嵌合抗原受体的细胞的输入组合物，所述嵌合抗原受体含有FMC63抗体或其抗原结合片段。
本文中提供了含有结合试剂的制品，所述结合试剂包括含有靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域，所述细胞外结构域或其部分含有靶抗体或其抗原结合片段；和本文所述的抗独特型抗体或抗原结合片段或本文所述的任何缀合物。在一些实施方案中，所述结合试剂是第一结合试剂，并且所述制品进一步包括含有CAR的细胞外结构域或其部分的第二结合试剂。
在任何这样的实施方案的一些中，第一和第二结合试剂的CAR的细胞外结构域或其部分是相同的。
在任何这样的实施方案的一些中，所述制品进一步包括使用所述结合试剂(任选地第一和第二结合试剂)通过使用免疫测定法测定样品中与所述结合试剂结合的分子的存在或不存在的说明书，任选地，其中所述免疫测定法是桥接或夹心免疫测定法，任选地其中所述样品来自已经施用细胞疗法的受试者，所述细胞疗法包括用含有靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段。
本文中提供了包括结合试剂的制品，所述结合试剂包含含有靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域，所述细胞外结构域或其部分含有靶抗体或其抗原结合片段；和本文所述的抗独特型抗体或抗原结合片段或本文所述的缀合物。
在一些实施方案中，所述结合试剂是第一结合试剂，并且所述制品进一步包含含有CAR的细胞外结构域或其部分的第二结合试剂。在一些方面，第一和第二结合试剂的CAR的细胞外结构域或其部分是相同的。
在任何这样的实施方案的一些中，所述制品进一步含有使用所述结合试剂(任选地第一和第二结合试剂)通过使用免疫测定法测定样品中与所述结合试剂结合的分子的存在或不存在的说明书，任选地，其中所述免疫测定法是桥接或夹心免疫测定法，任选地其中所述样品来自已经施用细胞疗法的受试者，所述细胞疗法包括用包含靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述结合试剂(任选地第一和/或第二结合试剂)经过可检测标记或能够产生可检测信号。在一些情况下，第一和第二结合试剂中的一者被附着于固体支持物上或能够被附着于固体支持物上，并且第一和第二结合试剂中的另一者是可检测标记物或能够产生可检测信号。在一些实施方案中，所述制品进一步包括固体支持物，任选地其中第一和第二结合试剂中的一者直接或间接地与生物素连接，并且所述固体支持物包括链霉亲和素包被的表面。
附图简述
图1显示了用于评估SJ25C1衍生的scFv特异性抗独特型抗体克隆A-1(抗独特型抗体A-1)在用SJ25C1衍生的CAR工程化的Jurkat细胞中刺激Erk1/2磷酸化的功能活性的流式细胞术的结果。包括用抗CD3抗体激活作为阳性对照。包括未刺激细胞或同种型对照刺激的细胞作为阴性对照。
图2A-B显示了表达含有SJ25C1衍生的结合结构域(图2A)或FMC63衍生的结合结构域(图2B)的CAR的T细胞的增殖测定结果，如在用抗CD3抗体(OKT3)、抗ID A-1或抗ID B-1抗独特型抗体刺激后通过使用流式细胞术的染料稀释所评估的。包括未刺激细胞作为阴性对照。
图2C显示了T细胞(用染料标记)在通过识别CAR的结合结构域的平板结合的抗独特型抗体刺激存在下培养后的模拟转导和CAR转导的增殖的测定结果，如通过使用流式细胞术的染料稀释所评估的。
图3显示了在用平板结合的抗CD3抗体(OKT3)、抗ID A-1或抗ID B-1刺激后，如通过流式细胞术评估的表达具有衍生自SJ25C1的可变区的CAR的CD4+或CD8+T细胞中的两种T细胞活化标志物CD69和CD25表达的评估结果。
图4显示了在用平板结合的抗CD3抗体(OKT3)、抗ID A-1或抗ID B-1或阴性对照非靶标抗独特型抗体刺激后，如通过流式细胞术评估的表达具有结合结构域(具有衍生自FMC63的可变区)的CAR的CD4+或CD8+T细胞中的两种T细胞活化标志物CD69和CD25表达的评估结果。包括未刺激细胞作为阴性对照。
图5显示了用于检测抗CAR抗体的桥式ELISA的结果，其中使用在一定浓度范围内的识别CAR结合结构域的抗ID B-1和抗ID B-2抗体作为阳性对照。
图6和图7分别显示了在细胞因子存在或不存在下用指定比例的用抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子或对照CD3/CD28抗体包被的珠子刺激的EGFRt+/CD4+T细胞或EGFRt+/CD8+T细胞的扩增倍数和累积细胞数。
图8显示了在细胞因子存在或不存在下对于抗EGFR抗体染色呈阳性并且因此对转导标志物EGFRt呈阳性的CD4+T细胞在用指定比例的用抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子或对照CD3/CD28抗体包被的珠子刺激后的PD-1表达水平，如通过流式细胞术在培养的第3天、第7天、第10天和第14天评估的。
图9显示了如通过流式细胞术评估的表达FMC63衍生的CAR的CD4+或CD8+T细胞在细胞因子存在或不存在下在用指定比例的用抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子或对照CD3/CD28抗体包被的珠子刺激后的活力，如通过流式细胞术在培养的第3天、第7天、第10天和第14天评估的。
图10A显示了表达FMC63衍生的CAR的T细胞在用FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子刺激后针对IL-2、TNFα和IFNγ的细胞内细胞因子染色。显示了对EGFRt替代转导标志物阳性或阴性(EGFR+或EGFRt-)的CD8+T细胞的结果。
图10B显示了表达FMC63衍生的CAR的T细胞在用表达抗原的K562-CD19细胞刺激后针对IL-2、TNFα和IFNγ的细胞内细胞因子染色。显示了对作为CAR表达的替代物的抗EGFR抗体阳性的CD8+T细胞的结果。
图11显示了表达FMC63衍生的scFv衍生的CAR的T细胞在细胞因子存在或不存在下在用指定比例的用抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子或对照抗CD3/抗CD28抗体包被的珠子刺激后在14天培养期中的连续刺激测定中的群体倍增数。显示了对EGFRt替代转导标志物(EGFRt+/CD4+)阳性的CD4+T细胞或对EGFRt阳性的CD8+T细胞(EGFRt+/CD8+)的结果。
图12A-12C显示了刺激表达FMC63衍生的CAR的CD4+或CD8+T细胞后的结果，所述T细胞单独地或作为共培养物与FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子一起培养。显示了两个不同供体的结果。图12A描绘了培养物中对EGFRt替代转导标志物阳性的CD4+T细胞或CD8+T细胞(EGFRt+/CD4+或EGFRt+/CD8+)的扩增倍数。图12B显示了培养物中对EGFRt阳性的CD4+T细胞或CD8+T细胞(EGFRt+/CD4+或EGFRt+/CD8+)的频率。图12C显示了培养物中CD4+T细胞或CD8+T细胞的活力。
图13A和13B显示了刺激表达FMC63衍生的CAR的CD4+或CD8+T细胞后在培养的第5天、第7天和第9天的T细胞表面标志物的流式细胞术结果，所述T细胞单独培养或作为共培养物与FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体(抗ID B-1)包被的珠子一起培养。图13A显示了培养物中在对EGFRt替代转导标志物阳性的CD4+T细胞或CD8+T细胞(EGFRt+/CD4+或EGFRt+/CD8+)上的PD-1表面表达。图13B显示了培养物中在对作为CAR表达替代物的抗EGFR抗体阳性的CD4+T细胞或CD8+T细胞(EGFRt+/CD4+或EGFRt+/CD8+)上的CD25表面表达。
图14A显示了通过流式细胞术评估的CD4+或CD8+T细胞的TNFα、IFNγ和IL-2的细胞内细胞因子水平，所述CD4+或CD8+T细胞存在于解冻的组合物中，所述组合物含有表达FMC63衍生的CAR的T细胞，所述表达FMC63衍生的CAR的T细胞已经用表达CD19的K562细胞或用PMA/离子霉素在培养物中扩增。显示了单独的或作为共培养物的CD4+和CD8+T细胞在解冻(d＝0)时或在抗ID B-1缀合的珠子存在下进一步培养另外9天后在其中的细胞因子水平。
图14B显示了通过流式细胞术评估的CD4+或CD8+T细胞对CD25或Ki67阳性的细胞的频率，所述CD4+或CD8+T细胞存在于解冻的组合物中，所述组合物含有表达FMC63衍生的CAR的T细胞，所述表达FMC63衍生的CAR的T细胞已经用表达CD19的K562细胞或用PMA/离子霉素在培养物中扩增。显示了单独的或作为共培养物的CD4+和CD8+T细胞在解冻(d＝0)时或在抗ID B-1缀合的珠子存在下进一步培养另外9天后在其中的标志物水平。
图15A和15B显示了描绘用抗EGFR抗体或FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体(抗ID B-1和抗ID B-2)染色细胞的结果的曲线图。图15A显示了描绘用不同浓度的抗体染色的细胞的平均荧光强度的曲线图。细胞包括PBMC和表达CAR的细胞的混合物。图15B显示了描绘在用不同浓度的抗体染色的细胞中检测到的包含FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体(抗ID B-1)的表达CAR的细胞的百分比的曲线图。细胞包括PBMC和表达CAR的细胞的混合物及单独的PBMC。
详细说明
本文中提供了特异性地识别抗CD19抗体模块(比如在包括嵌合抗原受体在内的重组受体中存在的抗CD19抗体模块)的药剂，比如抗独特型抗体和抗原结合片段(比如单链片段，包括scFv)。还提供了其用途和使用方法、以及包括这样的药剂的组合物和制品，包括用于特异性地鉴定、选择和/或刺激和/或活化表达或包括靶抗体或片段的细胞，比如抗CD19CAR T细胞。在一些实施方案中，所提供的抗体可用于特异性地鉴定和/或选择各种抗CD19CAR，例如结合或表达在细胞表面上的CAR，并且还可用于特异性地激活表达靶CAR的细胞，比如CAR T细胞。在一些实施方案中，提供了对命名为SJ25C1或FMC63的抗CD19抗体特异的抗体、或由其衍生的抗体片段，包括含有衍生自这样的抗体的可变区的抗体和CAR、和/或含有其中包含的独特型的抗体。
在一些方面，与用于检测、鉴定、操作和/或影响和/或工程改造表达CAR(特别是含有抗CD19抗体scFv细胞外结构域的CAR或含有公认的独特型的CAR)的细胞的常规试剂相比，所提供的抗独特型抗体提供了优势。在某些可用方法中，通过评估替代分子的存在或不存在或量来进行样品中CAR或表达CAR的细胞的存在或不存在或量的检测(和/或CAR的刺激或操作)，所述替代分子比如被包含在编码CAR的构建体中并因此用作其表达的间接或替代标志物的分子。在某些可用方法中，使用通用抗体试剂和/或对所评估的特定CAR非特异的(例如，与可具有除抗原结合区之外的相似或相同结构域的其他CAR相比)试剂进行检测；例如，这样的抗体可包括识别来自衍生CAR结构域的物种的间隔物或其他结构域的抗物种抗体、和/或识别在靶标的间隔区中使用的特定组分以及其他嵌合受体的抗体。在设计为检测CAR存在或不存在的某些可用方法中，使用识别CAR恒定区的药剂进行检测。在某些可用的方法中，通过使用通用试剂，比如抗CD3/CD28识别剂来刺激CAR细胞。某些方法使用CAR的重组配体(例如，CD19-Fc)。在某些情况下，这样的方法可能不完全令人满意和/或具有某些局限性。在一些情况下，CAR配体(比如CD19)可能并不总是完全有效地例如用于复杂的流式细胞术组中。改进的方法和药剂，包括提供改进的灵敏度和/或选择性的那些方法和药剂是需要的。本文中提供满足这种需要的实施方案。
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体和抗原结合片段克服了如下挑战：与靶抗体配体相关的低结合亲和力和与针对靶抗体恒定区的抗体试剂相关的非特异性结合，从而提供了对其靶抗体或其抗原结合片段具有高亲和力和特异性的试剂。在一些实施方案中，与CD19-Fc和目前可用于检测或鉴定CAR的其他试剂相比，所提供的抗体对其靶抗体或抗原结合片段(比如命名为SJ25C1或FMC63的抗CD19抗体)表现出更高的特异性和结合亲和力。
此外，在某些实施方案中，可以选择抗独特型抗体和抗原结合片段作为嵌合受体(包含其靶抗体或抗原结合片段)的激动剂或拮抗剂，从而允许选择性地检测、分离、消融和/或耗竭(例如，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤)、和/或刺激或激活细胞，所述细胞具有结合或表达在其表面上的这种嵌合受体。本文中提供了抗独特型抗体激动剂，其表现出刺激(比如激活)含有衍生自命名为SJ25C1或FMC63的抗CD19抗体的细胞外结合结构域的CAR的活性。在一些方面，这样的抗体可用于刺激和扩增表达特异性CAR的细胞的方法中，所述方法包括在生成和制备表达CAR的细胞的过程中。
本文中还提供了编码所提供的抗独特型抗体和片段的核酸、以及表达和产生这些抗独特型抗体和片段的细胞，比如重组细胞。还提供了制造和使用抗独特型抗体和片段的方法、以及表达或含有所述抗独特型抗体和片段的细胞。
出于所有目的将本申请中提及的所有出版物，包括专利文献、科学论文和数据库在内，通过提述完整并入本文，其程度如同每一单独的出版物通过提述单独并入一样。如果本文中阐述的定义与通过提述并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或以别的方式不一致，则本文中阐述的定义优先于通过提述并入本文的定义。
在本文中使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，而不应当解释为限制所描述的主题。
抗独特型抗体
在一些方面，提供了结合分子，比如特异性地识别靶抗CD19抗体模块的抗独特型抗体或抗原结合片段(“抗ID”)。在一些实施方案中，所提供的抗体识别靶抗CD19抗体，所述靶抗CD19抗体是SJ25C1或其抗原结合片段或者是衍生自SJ25C1的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所提供的抗体识别靶抗CD19抗体，所述靶抗CD19抗体是FMC63或其抗原结合片段或者是衍生自FMC63的抗体或抗原结合片段。
SJ25C1是针对表达人源CD19的Nalm-1和-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:114-116中列出的CDRH1、H2和H3，以及分别在SEQ ID NO:117-119中列出的CDRL1、L2和L3序列。SJ25C1抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的重链可变区(VH)和含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，靶抗体是SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体。在一些实施方案中，衍生自SJ25C1的抗体是包含SJ25C1的VH和/或VL、SJ25C1的独特型、SJ25C1的互补位、或SJ25C1的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体(为SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:23中列出的SJ25C1的VH、或其与SEQ ID NO:23具有至少90％序列同一性的变体、和/或在SEQID NO:24中列出的SJ25C1的VL、或其与SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施方案中，靶抗体(为SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:23中列出的SJ25C1的VH、或其与SEQ ID NO:23具有至少90％序列同一性的变体、和在SEQ ID NO:24中列出的SJ25C1的VL、或其与SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含分别在SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中列出的SJ25C1的VH和VL。在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO:23和/或SEQ ID NO:24具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
在一些实施方案中，靶抗体(为SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:23中列出的SJ25C1 VH的一个或多个重链CDR(CDR-H)(比如在SEQ ID NO:114-116列出)、和/或在SEQ ID NO:24中列出的SJ25C1 VL的一个或多个轻链CDR(CDR-L)(比如在SEQ ID NO:117-119列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SJ25C1的CDR-H3(例如，在SEQ ID NO:116中列出)和/或SJ25C1的CDR-L3(例如，在SEQID NO:119中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含SJ25C1的CDR-H3和CDR-L3(例如分别在SEQ ID NO:116和119中列出)。在一些实施方案中，靶抗体(为SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含SJ25C1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的一者或多者(例如分别在SEQ ID NO:114、115、116中列出)和/或SJ25C1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的一者或多者(例如分别在SEQ ID NO:117、118、119中列出)。在一些实施方案中，靶抗体(为SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含SJ25C1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(例如分别在SEQ ID NO:114、115、116中列出)和/或SJ25C1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(例如分别在SEQ ID NO:117、118、119中列出)。在一些实施方案中，靶抗体(为SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含SJ25C1的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(例如分别在SEQ ID NO:114、115、116中列出)和SJ25C1的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(例如分别在SEQ ID NO:117、118、119中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括诸如抗原结合片段(Fab)、F(ab’)2、Fab'、可变区片段(Fv)或单链Fv(scFv)的抗原结合片段。参见例如Bejcek,B.E.等人(1995).Cancerresearch.55(11):2346-2351。
FMC63是针对表达人源CD19的JVM3细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Nicholson等人(1997).Molecular Immunology.34(16-17):1157-1165)。FMC63抗体包含分别在SEQ IDNO:120-122中列出的CDRH1、H2和H3，以及分别在SEQ ID NO:123-125中列出的CDRL1、L2和L3序列。FMC63抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的重链可变区(VH)和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，靶抗体是FMC63或衍生自FMC63的抗体。在一些实施方案中，衍生自FMC63的抗体是包含FMC63的VH和/或VL、FMC63的独特型、FMC63的互补位、或FMC63的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体(为FMC63或衍生自FMC63的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:30中列出的FMC63的VH、或其与SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的变体、和/或在SEQ ID NO:31中列出的FMC63的VL、或其与SEQ ID NO:31具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施方案中，靶抗体(为FMC63或衍生自FMC63的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含在SEQID NO:30中列出的FMC63的VH、或其与SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的变体、和在SEQ ID NO:31中列出的FMC63的VL、或其与SEQ ID NO:31具有至少90％序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含分别在SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31中列出的FMC63的VH和VL。在一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO:30和/或SEQ ID NO:31具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
在一些实施方案中，靶抗体(为FMC63或衍生自FMC63的抗体)是这样的抗体或抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:30中列出的FMC63 VH的一个或多个重链CDR(CDR-H)(比如在SEQ ID NO:120-122列出)、和/或在SEQ ID NO:31中列出的FMC63 VL的一个或多个轻链CDR(CDR-L)(比如在SEQ ID NO:123-125列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含FMC63的CDR-H3(例如，在SEQ ID NO:122中列出)和/或FMC63的CDR-L3(例如，在SEQ IDNO:125中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含FMC63的CDR-H3(例如，在SEQID NO:122中列出)和CDR-L3(例如，在SEQ ID NO:125中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含FMC63的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的一者或多者(分别在SEQ ID NO:120、121、122中列出)和/或FMC63的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的一者或多者(分别在SEQID NO:123、124、125中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含FMC63的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(分别在SEQ ID NO:120、121、122中列出)和/或FMC63的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(分别在SEQ ID NO:123、124、125中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含FMC63的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(分别在SEQ ID NO:120、121、122中列出)和FMC63的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(分别在SEQ ID NO:123、124、125中列出)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包括诸如抗原结合片段(Fab)、F(ab’)2、Fab'、可变区片段(Fv)或单链Fv(scFv)的抗原结合片段。
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体包括与可变结构域(Fv)比如衍生自SJ25C1或FMC63的单链Fv(scFv)特异性地结合的抗体。在一些实施方案中，抗独特型抗体与Fv的特定表位或区特异性地结合，所述表位或区通常是包含一个或多个互补决定区的表位或区。在一些实施方案中，抗独特型抗体与Fv互补位的重叠表位或区特异性地结合。
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体包括与衍生自SJ25C1或FMC63的抗CD19模块特异性地结合的那些抗体，所述SJ25C1或FMC63作为靶嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域的一部分而被包含在内。在一些实施方案中，靶CAR含有抗原结合部分，所述抗原结合部分含有SJ25C1或FMC63抗体分子或SJ25C1或FMC63抗体的抗原结合片段或部分。在一些实施方案中，靶CAR包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域是衍生自抗体SJ25C1或FMC63的VH和VL链的scFv。在一些实施方案中，提供了与抗CD19 CAR特异性地结合的抗独特型抗体，所述抗CD19 CAR含有衍生自抗体SJ25C1或FMC63的scFv。CAR的示例性特征在下面进一步描述。
本文中的术语“抗体”以最广义的方式加以使用，包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab’片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖基因工程和/或其他修饰形式的免疫球蛋白，比如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异源偶联抗体、多特异性(例如双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联di-scFv、串联tri-scFv。除非另外说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类型或亚型的抗体，包括IgG及其亚型、IgM、IgE、IgA和IgD。
术语“抗独特型抗体”是指特异性地识别、特异性地靶向至和/或特异性结合至抗体的独特位(比如抗原结合片段)的抗体，包括其抗原结合片段。抗体的独特位可以包括但不必限于在抗体的互补决定区(CDR)、抗体的可变区、和/或这样的可变区和/或这样的CDR的不完全部分或部分中的一者或多者之内的残基，和/或前述项的任何组合。CDR可以是选自下组的一者或多者，该组的组成为：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。抗体的可变区可以是重链可变区、轻链可变区、或重链可变区和轻链可变区的组合。抗体的重链可变区和/或轻链可变区的部分片段或部分可以是包含在抗体的重链可变区或轻链可变区内的2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸，例如，约2个至约100个、约5个至约100个、约10个至约100个、约2个至约50个、约5个至约50个、或约10个至约50个连续氨基酸的片段；独特位可包括多个不连续的氨基酸段。抗体的重链可变区和轻链可变区的部分片段可以是包含在可变区内的2个或更多个、5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸，例如，约2个至约100个、约5个至约100个、约10个至约100个、约2个至约50个、约5个至约50个、或约10个至约50个连续氨基酸的片段；独特位可包括多个不连续的氨基酸的片段；在一些实施方案中，含有一个或多个CDR或CDR片段。CDR片段可以是在CDR内的连续或非连续的2个或更多个、或5个或更多个氨基酸。因此，抗体的独特位可以是约2个至约100个、约5个至约100个、约10个至约100个、约2个至约50个、约5个至约50个、或约10个至约50个连续氨基酸，其包含在抗体的重链可变区或轻链可变区内的一个或多个CDR或一个或多个CDR片段。在另一个实施方案中，独特位可以是位于抗体可变区的单个氨基酸，例如CDR位点。
在一些实施方案中，独特位是抗体可变部分内的任何单个抗原决定簇或表位。在一些情况下，它可以与抗体的实际抗原结合位点重叠，并且在一些情况下，它可以包含抗体的抗原结合位点外的可变区序列。在一些实施方案中，抗体的个体独特型的组被称为这种抗体的“独特型”。
本领域已知术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，是指赋予抗原特异性和/或结合亲和力的抗体可变区内的非连续氨基酸序列。通常，在每个重链可变区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)中有三个CDR，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是本领域已知的，是指重链和轻链可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
可以使用许多熟知方案中的任何一种容易地确定给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界，包括由以下文献描述的那些方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”numbering scheme)，Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”numbering scheme)，MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding sitetopography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”numbering scheme)，Lefranc MP等人，“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariabledomains and Ig superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”numbering scheme)，以及Honegger A和Plückthun A，“Yet anothernumbering scheme for immunoglobulin variabledomains:an automatic modeling andanalysis tool,”J Mol Biol,2001Jun 8；309(3):657-70,(“Aho”numbering scheme)。
给定CDR或FR的边界可以根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案两者的编号都基于最常见的抗体区序列长度，其中通过插入字母表示插入，例如“30a”，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案在不同位置放置某些插入和缺失(“插入缺失”)，导致编号差别。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。
下面的表1列出了分别通过Kabat、Chothia和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia编号方案两者列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，其中FR-L1位于CDR-L1和CDR-L2之间，等等。应当注意的是，由于所示的Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处，在使用所示的Kabat编号规则编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，这取决于环的长度。
表1
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(比如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或个体指定的CDR(例如，“CDR-H1、DR-H2)”应当理解为包括由任何前述方案定义的(或特异性的)互补决定区。例如，当陈述特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列时，应当理解这样的CDR具有可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)序列，如由任何上述方案定义的。在一些实施方案中，详细说明了指定的CDR序列。
同样地，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(比如其可变区)的FR或个体指定的FR(例如，FR-H1、FR-H2)应当理解为包括由任何已知方案定义的(或特异性的)框架区。在一些情况下，指定了特定CDR、FR或多个FR或CDR(比如由Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR)的鉴定方案。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人，Kuby Immunology,6thed.,W.H.Freeman和Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
其中提供的抗体为抗体片段。“抗体片段”指的是除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定的实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，比如scFv。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
可以通过各种技术制造抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，比如包含非天然存在的排列的片段，比如具有通过合成接头(例如肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的片段，和/或不能通过酶消化天然存在的完整抗体来产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基衍生自非人CDR并且所有或基本上所有框架区(FR)氨基酸残基衍生自人FR的抗体。在一些实施方案中，非人抗体(例如，鼠抗体)的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体是来自非人物种的抗体，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(FR)。在一些实施方案中，人源化抗体任选地可以包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指经历了人源化的非人抗体的变体，通常为了降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，用来自非人抗体(例如，自其衍生CDR残基的抗体)的相应残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如，用于恢复或提高抗体特异性或亲和力。(参见，例如，Queen，美国专利No.5,585,089和Winter，美国专利No.5,225,539。)可以通过本领域已知的重组DNA技术产生这样的嵌合和人源化单克隆抗体。
在某些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的重链可变区的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和/或能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等非人物种的重链可变区(供体抗体)的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的残基。在一些实施方案中，编码人可变重链和可变轻链的核酸序列被改变，用编码非人抗体序列(供体序列)中的对应CDR的序列替换人(受体)序列的一个或多个CDR序列。在一些实施方案中，人受体序列可包含衍生自不同基因的FR。在具体的实施方案中，人源化抗体将含有至少一个(通常两个)可变结构域中的基本上所有的可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。在一些实施方案中，人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(一般是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。关于更多详情，参见，例如Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见，例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利No.6,982,321和7,087,409，将其通过提述并入本文。在一些实施方案中，本文中提供了人源化抗独特型抗体。
在具体的实施方案中，抗体，例如抗独特型抗体，是人源化的。在某些实施方案中，通过任何适合的已知手段将抗体人源化。例如，在一些实施方案中，人源化抗体可以具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”氨基酸残基，一般取自“输入”可变结构域。在具体的实施方案中，基本上可以通过遵循Winter和同事的方法进行人源化(Jones等人(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534-1536)，比如通过用高变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上不太完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在某些实施方案中，人源化抗体是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
随后可以通过将提供的可变重链和可变轻链序列连接至人恒定重链和恒定轻链区而获得编码全长抗体的序列。适合的人恒定轻链序列包括κ和λ恒定轻链序列。适合的人恒定重链序列包括IgG1、IgG2和编码IgG1突变体的序列，所述突变体被提供了免疫刺激特性。这样的突变体可具有降低的激活补体和/或抗体依赖性细胞毒性的能力，并被描述于美国专利No.5,624,821；WO 99/58572，美国专利No.6,737,056。适合的恒定重链还包括包含取代E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331S和残基236的缺失的IgG1。在另一个实施方案中，全长抗体包含IgA、IgD、IgE、IgM、IgY或IgW序列。
可以通过小鼠供体序列所编码的肽序列与一组人序列的序列比较来确定适合的人供体序列，所述人序列优选由人种系免疫球蛋白基因或成熟抗体基因编码的序列。具有高序列同源性，优选地具有确定的最高同源性的人序列可以用作人源化过程的受体序列。
除了将人CDR交换为小鼠CDR之外，可以进行人供体序列中的进一步操作，以获得编码具有优化特性(例如抗原亲和力)的人源化抗体的序列。
此外，还可以使改变的人受体抗体可变结构域序列编码对应于非人供体序列的轻链可变区的位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98以及重链可变区的位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92的一个或多个氨基酸(根据Kabat编号系统)(Carter和Presta，美国专利No.6,407,213)。
在具体的实施方案中，通常希望将抗体人源化，同时保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了实现这个目标，在一些实施方案中，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获得说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以根据受体序列和输入序列选择和组合FR残基，使得实现期望的抗体特征，比如增加的对靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接地且最主要地参与影响抗原结合。
在具体的实施方案中，用于制造人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择对于降低抗原性可能是重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库，筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架。参见，例如Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901。另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。参见，例如Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta等人(1993)J.Immunol.,151:2623。
其中提供的抗体为人抗体。“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体、或利用人抗体谱或其他的人抗体编码序列的非人来源(包括人抗体文库)产生的抗体的氨基酸序列。该术语排除了包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，比如其中所有或基本上所有CDR都是非人的那些抗体。
人抗体可以通过向转基因动物施用免疫原加以制备，所述转基因动物已经被修饰以产生完整人抗体或具有应答于抗原攻击的人可变区的完整抗体。这样的动物一般含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其代替内源性免疫球蛋白基因座，或者在染色体外存在或随机整合到动物染色体中。在这样的转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。人抗体也可以衍生自人抗体文库，包括噬菌体展示文库和无细胞文库，其含有衍生自人谱的抗体编码序列。
其中所提供的抗体是单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群获得或在所述群之内的抗体，即构成该群的单独的抗体是相同的，例外情况是可能存在变体，其含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂生产过程中产生，这样的变体通常以少量存在。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一表位。该术语不应解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。可以通过多种技术制造单克隆抗体，包括但不限于从杂交瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。
SJ25C1衍生的抗体
在一些实施方案中，提供了对靶抗CD19抗体特异的抗独特型抗体，所述靶抗CD19抗体是或衍生自抗体SJ25C1或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所提供的抗体或抗原结合片段对衍生自SJ25C1的scFv是特异的。
在一些实施方案中，提供了包括重链可变(VH)区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述重链可变(VH)区与SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性，比如与其具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，提供了包括重链可变(VH)区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述重链可变(VH)区含有具有在SEQ ID NO:11或84中列出的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)和/或包含在SEQ ID NO:1中列出的重链可变(VH)序列内的CDR-H3。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区包括包含在SEQ ID NO:9、78、79或80中列出的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)和/或包含在SEQ ID NO:1中列出的VH序列内的CDR-H1；和/或包含在SEQ ID NO:10、81、82或83中列出的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)和/或包含在SEQ ID NO:1中列出的VH序列内的CDR-H2。
提供了包括包含重链互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中CDR-H1包含在SEQ ID NO:9、78、79或80中列出的氨基酸序列；CDR-H2包含在SEQ ID NO:10、81、82或83中列出的氨基酸序列；并且/或者CDR-H3包含在SEQ ID NO:11或84中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其包括具有在SEQ ID NO:9、78、79或80中列出的氨基酸序列的CDR-H1；具有在SEQ ID NO:10、81、82或83中列出的氨基酸序列的CDR-H2；和具有在SEQ ID NO:11或84中列出的氨基酸序列的CDR-H3。
提供了包括重链互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2和CDR-H3的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述三个互补决定区分别包含在SEQ ID NO:1中列出的包含在VH区氨基酸序列内的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，VH区含有框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，VH区含有框架区1(FR1)、FR2、FR3和FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区具有在SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或抗原结合片段是仅重链、仅VH，和/或不包括VL或其抗原结合部分，并且/或者抗独特型抗体或片段的抗原结合位点仅包括来自重链的残基和/或不包括来自轻链的残基。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或片段不含轻链可变(VL)区，不含CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3，和/或是仅含有VH区的单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体或片段是仅含有来自任何所述的VH区的sdAb。
在含有任何上述VH区序列的任何抗独特型抗体或片段的一些实施方案中，所述抗独特型抗体或片段进一步包含轻链可变(VL)区。在一些这样的实施方案中，VL区与SEQ IDNO:5中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性，比如与SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述CDR-L3包含在SEQ ID NO:14或87中列出的氨基酸序列。在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述CDR-L3具有在SEQ ID NO:14或87中列出的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包括包含在SEQ ID NO:12或85中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)和/或包含在SEQ ID NO:5中列出的VL序列内的CDR-L1；和/或包含在SEQ ID NO:13或86中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)和/或包含在SEQ ID NO:5中列出的VL序列内的CDR-L2。在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含具有在SEQ ID NO:12或85中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)和/或包含在SEQ ID NO:5中列出的VL序列内的CDR-L1；和/或具有在SEQ ID NO:13或86中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)和/或包含在SEQ ID NO:5中列出的VL序列内的CDR-L2。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含含有在SEQ ID NO:12或85中列出的氨基酸序列的CDR-L1；含有在SEQ ID NO:13或86中列出的氨基酸序列的CDR-L2；和含有在SEQID NO:14或57中列出的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含在SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列内的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4，其分别与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，VL区包含框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，VL区包含框架区1(FR1)、FR2、FR3和FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区具有在SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。
提供了这样的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和/或包含在SEQ IDNO:5中列出的轻链可变(VL)区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
提供了包括VH和VL区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述VH和VL区具有分别与SEQ ID NO:1和5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了包括分别具有在SEQ ID NO:1和5中列出的氨基酸序列的VH和VL区的抗独特型抗体或其抗原结合片段。
在任何这样的实施方案的一些中，VH和VL区分别包括SEQ ID NO:1和5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，对抗体SJ25C1或其抗原结合片段特异的抗独特型抗体是单链抗体片段，比如scFv或双抗体。在一些实施方案中，单链抗体包括连接两个抗体结构域或区域比如可变重链(VH)区和可变轻链(VL)的一个或多个接头。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头。其中接头是富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下富含苏氨酸的接头。在一些实施方案中，接头进一步包括带电残基，比如赖氨酸和/或谷氨酸，其可以提高溶解度。在一些实施方案中，接头进一步包括一个或多个脯氨酸。
在一些实施方案中，抗独特型抗体是完整抗体或全长抗体。在一些实施方案中，抗ID可以含有免疫球蛋白恒定区的至少一部分，比如一个或多个恒定区结构域。在一些实施方案中，恒定区包括轻链恒定区(CL)和/或重链恒定区1(CH1)。在一些实施方案中，抗ID包括CH2和/或CH3结构域，比如Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人IgG(比如IgG1或IgG4)的Fc区。在一些实施方案中，抗独特型抗体含有在SEQ ID NO:2中列出的CH结构域或其部分、或表现出与SEQ ID NO:2具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或其部分。在一些实施方案中，抗独特型抗体含有在SEQ ID NO:6中列出的CL结构域或其部分、或表现出与SEQ ID NO:6具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或其部分。
在一些实施方案中，对SJ25C1特异的抗独特型抗体包含在SEQ ID NO:3中列出的重链序列或表现出与SEQ ID NO:3具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，和/或包含在SEQ ID NO:7中列出的轻链序列或表现出与SEQ ID NO:7具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，对SJ25C1特异的抗独特型抗体包含在SEQ ID NO:3中列出的重链序列和/或在SEQ IDNO:7中列出的轻链序列。在一些实施方案中，抗独特型抗体的重链和/或轻链进一步包含信号肽。在一些情况下，信号肽具有在SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中列出的序列。
在一些实施方案中，抗独特型抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自下组，该组的组成为：片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。
因此，提供了单链抗体片段，比如scFv和双抗体，特别是人单链片段，其通常包含连接两个抗独特型抗体结构域或区域如VH和VL结构域的接头。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，比如富含甘氨酸和丝氨酸的肽接头。
在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的这种氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。接头长度通常在约5个至约50个氨基酸之间，通常在10个或约10个至30个或约30个之间，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或30个，并且在一些实例中，长度为10个至25个氨基酸。示例性接头包括具有不同数目的重复的序列GGGS(3GS；SEQ ID NO:29)或GGGGS(4GS；SEQ ID NO:26)的接头，比如这种序列的2、3、4和5个重复。示例性接头包括具有在SEQ ID NO:25(GGGGSGGGGSGGGGS)中列出的序列或由其组成的接头。示例性接头进一步包括具有在SEQ ID NO:33(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)中列出的序列或由其组成的接头。
在一些实施方案中，抗独特型抗体包括分离的抗体。在一些实施方案中，抗ID是人源化的、重组的和/或单克隆的。在一些实施方案中，抗ID是人的抗ID。
在一些实施方案中，对SJ25C1特异的抗独特型抗体是人源化的。在具体的实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体的所有或基本上所有CDR氨基酸残基衍生自抗SJ25C1非人CDR。在一些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。
在某些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的重链可变区的残基被来自对SJ25C1特异的非人抗独特型抗体的重链可变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体含有衍生自不同基因的FR。在一些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体含有免疫球蛋白恒定区(Fc)(一般是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。
在一些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体含有改变的人受体抗体可变结构域序列，已经使所述序列编码对应于非人供体序列的轻链可变区的位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98(Kabat)和重链可变区的位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92(Kabat)的一个或多个氨基酸残基。
在某些实施方案中，对SJ25C1特异的抗独特型抗体是人源化的。在具体的实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体含有对SJ25C1特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3区的一者或多者。在一些实施方案中，CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3区的一些或全部含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述修饰用人残基替换非人氨基酸残基。在具体的实施方案中，将CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者插入到人抗体的FR区中。在具体的实施方案中，非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3是具有分别在SEQ ID NO:1和5中列出的氨基酸序列的VH和VL区的CDR。在一些实施方案中，将对SJ25C1特异的抗独特型抗体的所有CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3插入到人抗体的FR中。在具体的实施方案中，CDR和FR区是通过Kabat、Chothia、AbM和/或Contact方案鉴定的区域。
在具体的实施方案中，将对SJ25C1特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者或全部插入到人抗体的框架区中。在一些实施方案中，人抗体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。在具体的实施方案中，人抗体是人IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的亚类之一，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。在一些实施方案中，将对SJ25C1特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者或全部插入到来自和/或衍生自人抗体的抗原结合区的框架区中。在某些实施方案中，抗原结合片段来自和/或衍生自人IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。不同类别的人免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并且例如总体上由Abbas等人描述于Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。在一些实施方案中，人抗体或其抗原结合片段可以是较大融合分子的一部分，所述较大融合分子通过人抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成。
在一些实施方案中，将对SJ25C1特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者或全部插入到具有全部或部分Fc区的人抗体或其抗原结合片段的框架区中。在某些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体含有Fc区的全部或部分。在一些实施方案中，Fc区具有一个或多个修饰，比如在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。例如，可以进行这样的修饰以改善半衰期、改变与一种或多种类型的Fc受体的结合、和/或改变效应子功能。在一些实施方案中，相对于未修饰的Fc区与FcαR的结合，修饰的Fc区改变(例如，降低)了与FcαR的结合。在某些实施方案中，人源化抗独特型抗体含有修饰的Fc区的全部或部分，相对于未修饰的Fc区与Fc受体的结合，所述修饰的Fc区具有改变的(例如，降低的)与Fc受体的结合。改变其与Fc受体结合的Fc修饰的非限制性实例描述于，例如，美国专利No.7,217,797和7,732,570；和美国申请号US2010/0143254和2010/0143254。
在某些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:132中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:133中列出的氨基酸序列的轻链。在具体的实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:134中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:135中列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，对SJ25C1特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:136中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:137中列出的氨基酸序列的轻链。
FMC63衍生的抗体
在一些实施方案中，提供了对靶抗CD19抗体特异的抗独特型抗体，所述靶抗CD19抗体是或衍生自抗体FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所提供的抗体或抗原结合片段对衍生自FMC63的scFv是特异的。
在一些实施方案中，提供了包括重链可变(VH)区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述重链可变(VH)区与SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性，比如与其具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，提供了包括VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区具有：含有氨基酸序列GYX3FX5X6YX8MX10(SEQ ID NO:108)的重链互补决定区1(CDR-H1)，其中X3是T或S，X5是T或S，X6是D或R，X8是Y或W，并且X10是K或N；和/或含有氨基酸序列WIGX4IX6PX8X9X1 0X11TX13X14NQX17FKX20(SEQ ID NO:109)的重链互补决定区2(CDR-H2)，其中X4是D或M，X6是N或H，X8是N或S，X9是N或D，X10是G或S，X11是G或E，X13是D或R，X14是Y或L，X17是N或K，并且X20是G或D；和/或含有氨基酸序列AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15(SEQ ID NO:110)的重链互补决定区3(CDR-H3)，其中X2是R或S，X3是E或I，X4是G或Y，X5是N或Y，X6是N或E，X7是Y或空值，X8是G或空值，X9是S或空值，X10是R或空值，X11是D或空值，X12是A或空值，X13是M或空值，X14是D或E，并且X15是Y或A。
在一些实施方案中，提供了包括重链可变(VH)区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述重链可变(VH)区含有具有在SEQ ID NO:46、67、94或104中列出的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)和/或包含在SEQ ID NO:36或58中列出的重链可变(VH)序列内的CDR-H3。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区包括包含在SEQ ID NO:44、65、88、89、90、98、99或100中列出的氨基酸序列的重链互补决定区1(CDR-H1)和/或包含在SEQ ID NO:36或58中列出的VH序列内的CDR-H1；和/或包含在SEQ ID NO:45、66、91、92、93、101、102或103中列出的氨基酸序列的重链互补决定区2(CDR-H2)和/或包含在SEQ ID NO:36或58中列出的VH序列内的CDR-H2。
提供了包括包含重链互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中CDR-H1包含在SEQ ID NO:44、65、88、89、90、98、99或100中列出的氨基酸序列；CDR-H2包含在SEQ ID NO:45、66、91、92、93、101、102或103中列出的氨基酸序列；并且/或者CDR-H3包含在SEQ ID NO:46、67、94或104中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了这样的抗体或其抗原结合片段，其包括具有在SEQ ID NO:44、65、88、89、90、98、99或100中列出的氨基酸序列的CDR-H1；具有在SEQ ID NO:45、66、91、92、93、101、102或103中列出的氨基酸序列的CDR-H2；和具有在SEQ ID NO:46、67、94或104中列出的氨基酸序列的CDR-H3。
提供了包括重链互补决定区1(CDR-H1)、CDR-H2和CDR-H3的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述三个互补决定区分别包含在SEQ IDNO:36或58中列出的包含在VH区氨基酸序列内的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段包括在SEQ ID NO:44、88、89或90中列出的CDR-H1；在SEQ ID NO:45、91、92或93中列出的CDR-H2；和/或在SEQ ID NO:46或94中列出的CDR-H3。在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段分别包括在SEQID NO:65、98、99或100中列出的CDR-H1；在SEQ ID NO:66、101、102或103中列出的CDR-H2；和/或在SEQ ID NO:67或104中列出的CDR-H3。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区含有框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:36或58中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，VH区含有框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:36或58中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，VH区含有框架区1(FR1)、FR2、FR3和FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:36或58中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在任何这样的实施方案的一些中，VH区具有在SEQ ID NO:36或58中列出的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或抗原结合片段是仅重链、仅VH，和/或不包括VL或其抗原结合部分，并且/或者抗独特型抗体或片段的抗原结合位点仅包括来自重链的残基和/或不包括来自轻链的残基。
在任何这样的实施方案的一些中，抗独特型抗体或片段不含轻链可变(VL)区，不含CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3，和/或是仅含有VH区的单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗体或片段是仅含有来自任何所述的VH区的sdAb。
在含有任何上述VH区序列的任何抗独特型抗体或片段的一些实施方案中，所述抗独特型抗体或片段进一步包含轻链可变(VL)区。在一些这样的实施方案中，VL区与SEQ IDNO:40或62中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性，比如与SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，提供了包括VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VH区具有：含有氨基酸序列X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY(SEQ ID NO:111)的轻链互补决定区1(CDR-L1)，其中X1是S或R，X3是S或R，X4是S或G，X5是G或N，X6是V或I，X7是I或H，X8是N或空值，X10是M或L，并且X11是Y或A；和/或含有氨基酸序列X1X2X3YX5X6X7X8LAX11(SEQ ID NO:112)的轻链互补决定区2(CDR-L2)，其中X1是P或L，X2是W或L，X3是I或V，X5是L或N，X6是T或A，X7是S或K，X8是N或T，并且X11是S或D；和/或含有氨基酸序列QX2X3X4X5X6PX8T(SEQ ID NO:113)的轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中X2是Q或H，X3是W或F，X4是S或W，X5是S或W，X6是N或T，并且X8是L或Y。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述CDR-L3包含在SEQ ID NO:49、97、70或107中列出的氨基酸序列。在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含轻链互补决定区3(CDR-L3)，所述CDR-L3具有在SEQ ID NO:49、97、70或107中列出的氨基酸序列。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包括包含在SEQ ID NO:47、68、95或105中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)和/或包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL序列内的CDR-L1；和/或包含在SEQ ID NO:48、69、96或106中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)和/或包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL序列内的CDR-L2。在任何这样的实施方案的一些中，VL区包括具有在SEQ ID NO:47、68、95或105中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)和/或包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL序列内的CDR-L1；和/或具有在SEQ ID NO:48、69、96或106中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区2(CDR-L2)和/或包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL序列内的CDR-L2。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含含有在SEQ ID NO:47、68、95或105中列出的氨基酸序列的CDR-L1；含有在SEQ ID NO:48、69、96或106中列出的氨基酸序列的CDR-L2；和含有在SEQ ID NO:49、97、70或107中列出的氨基酸序列的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列内的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段包括在SEQ ID NO:47或95中列出的CDR-L1；在SEQ ID NO:48或96中列出的CDR-L2；和/或在SEQ ID NO:49或97中列出的CDR-L3。在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段分别包括在SEQ ID NO:68或105中列出的CDR-L1；在SEQ ID NO:69或106中列出的CDR-L2；和/或在SEQ ID NO:70或107中列出的CDR-L3。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区包含框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4，其分别与SEQ ID NO:40或62中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，VL区包含框架区1(FR1)、FR2、FR3和/或FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:40或62中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，VL区包含框架区1(FR1)、FR2、FR3和FR4序列，所述序列分别与SEQ ID NO:40或62中列出的氨基酸序列的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
在任何这样的实施方案的一些中，VL区具有在SEQ ID NO:40或62中列出的氨基酸序列。
提供了这样的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含在SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和/或包含在SEQ ID NO:40或62中列出的轻链可变(VL)区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
提供了包括VH区和VL区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述VH区具有与SEQID NO:36或58具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或％99％同一性的氨基酸序列，所述VL区具有与SEQ ID NO:40或62具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了包括VH区和VL区的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述VH区具有在SEQ ID NO:36或58中列出的氨基酸序列，并且所述VL区具有在SEQ ID NO:40或62中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的抗体含有在SEQ ID NO:36中列出的VH区和在SEQ ID NO:40中列出的VL区。在一些实施方案中，所提供的抗体含有在SEQ IDNO:58中列出的VH区和在SEQ ID NO:62中列出的VL区。
在一些实施方案中，抗独特型抗体是单链抗体片段，比如scFv或双抗体。在一些实施方案中，单链抗体包括连接两个抗体结构域或区域比如可变重链(VH)区和可变轻链(VL)的一个或多个接头。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头。其中接头是富含甘氨酸和丝氨酸和/或在一些情况下富含苏氨酸的接头。在一些实施方案中，接头进一步包括带电残基，比如赖氨酸和/或谷氨酸，其可以提高溶解度。在一些实施方案中，接头进一步包括一个或多个脯氨酸。
在一些实施方案中，抗独特型抗体是完整抗体或全长抗体。在一些实施方案中，抗ID可以含有免疫球蛋白恒定区的至少一部分，比如一个或多个恒定区结构域。在一些实施方案中，恒定区包括轻链恒定区(CL)和/或重链恒定区1(CH1)。在一些实施方案中，抗ID包括CH2和/或CH3结构域，比如Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人IgG(比如IgG1或IgG4)的Fc区。在一些实施方案中，抗独特型抗体含有在SEQ ID NO:37或59中列出的CH结构域或其部分、或表现出与SEQ ID NO:37或59具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或其部分。在一些实施方案中，抗独特型抗体含有在SEQ ID NO:41或63中列出的CL结构域或其部分、或表现出与SEQ ID NO:41或63具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列或其部分。
在一些实施方案中，对FMC63特异的抗独特型抗体包含在SEQ ID NO:38或60中列出的重链序列或表现出与SEQ ID NO:38或60具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，和/或包含在SEQID NO:42或63中列出的轻链序列或表现出与SEQ ID NO:42或63具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，对FMC63特异的抗独特型抗体包含在SEQ ID NO:38中列出的重链序列和/或在SEQ ID NO:42中列出的轻链序列。在一些实施方案中，对FMC63特异的抗独特型抗体包含在SEQ ID NO:60中列出的重链序列和/或在SEQ ID NO:63中列出的轻链序列。在一些实施方案中，抗独特型抗体的重链和/或轻链进一步包含信号肽。在一些情况下，信号肽具有在SEQ ID NO:39、43、61或64中列出的序列。
在一些实施方案中，抗独特型抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自下组，该组的组成为：片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。
因此，提供了单链抗体片段，比如scFv和双抗体，特别是人单链片段，其通常包含连接两个抗独特型抗体结构域或区域如VH和VL结构域的接头。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头，比如富含甘氨酸和丝氨酸的肽接头。
在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的这种氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸组成。接头长度通常在约5个至约50个氨基酸之间，通常在10个或约10个至30个或约30个之间，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或30个，并且在一些实例中，长度为10个至25个氨基酸。示例性接头包括具有不同数目的重复的序列GGGS(3GS；SEQ ID NO:29)或GGGGS(4GS；SEQ ID NO:26)的接头，比如这种序列的2、3、4和5个重复。示例性接头包括具有在SEQ ID NO:25(GGGGSGGGGSGGGGS)中列出的序列或由其组成的接头。示例性接头进一步包括具有在SEQ ID NO:33(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)中列出的序列或由其组成的接头。
在一些实施方案中，抗独特型抗体包括分离的抗体。在一些实施方案中，抗ID是人源化的、重组的和/或单克隆的。在一些实施方案中，抗ID是人的抗ID。
在一些实施方案中，对FMC63特异的抗独特型抗体是人源化的。在具体的实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体的所有或基本上所有CDR氨基酸残基衍生自非人抗FMC63 CDR。在一些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。
在某些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的重链可变区的残基被来自对FMC63特异的非人抗独特型抗体的重链可变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体含有衍生自不同基因的FR。在一些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体含有免疫球蛋白恒定区(Fc)(一般是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。
在一些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体含有改变的人受体抗体可变结构域序列，已经使所述序列编码对应于非人供体序列的轻链可变区的位置4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98(Kabat)和重链可变区的位置2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92(Kabat)的一个或多个氨基酸残基。
在某些实施方案中，对FMC63特异的抗独特型抗体是人源化的。在具体的实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体含有对FMC63特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者。在一些实施方案中，CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3区的一些或全部含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述修饰用人残基替换非人氨基酸残基。在具体的实施方案中，将CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者插入到人FR区中。在具体的实施方案中，非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3是具有在SEQID NO:36或58中列出的氨基酸序列的VH区的CDR。在某些实施方案中，非人抗独特型VH区的CDR是或包括含有在SEQ ID NO:44、65、88、89、90、98、99或100中列出的氨基酸序列的CDR-H1；含有在SEQ ID NO:45、66、91、92、93、101、102或103中列出的氨基酸序列的CDR-H2；和/或含有在SEQ ID NO:46、67、94或104中列出的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3是具有在SEQ ID NO:40或62中列出的氨基酸序列的VL区的CDR。在一些实施方案中，非人抗独特型VL区的CDR是或包括含有在SEQ ID NO:47、68、95或105中列出的氨基酸序列的CDR-L1；含有在SEQ IDNO:48、69、96或106中列出的氨基酸序列的CDR-L2；和/或含有在SEQ ID NO:49、97、70或107中列出的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，将对FMC63特异的抗独特型抗体的所有CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3区插入到人抗体的FR中。在具体的实施方案中，CDR和FR区是通过Kabat、Chothia、AbM和/或Contact方案鉴定的区域。
在具体的实施方案中，将对FMC63特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者或全部插入到人抗体的框架区中。在一些实施方案中，人抗体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。在具体的实施方案中，人抗体是人IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的亚类之一，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。在一些实施方案中，将对FMC63特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者或全部插入到来自和/或衍生自人抗体的抗原结合区的框架区中。在某些实施方案中，抗原结合片段来自和/或衍生自人IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。不同类别的人免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并且例如总体上由Abbas等人描述于Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。在一些实施方案中，人抗体或其抗原结合片段可以是较大融合分子的一部分，所述较大融合分子通过人抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成。
在一些实施方案中，将对FMC63特异的非人抗独特型抗体的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的一者或多者或全部插入到具有全部或部分Fc区的人抗体或其抗原结合片段的框架区中。在某些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体含有Fc区的全部或部分。在一些实施方案中，Fc区具有一个或多个修饰，比如在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如取代、插入或缺失)。例如，可以进行这样的修饰以改善半衰期、改变与一种或多种类型的Fc受体的结合、和/或改变效应子功能。在一些实施方案中，相对于未修饰的Fc区与FcαR的结合，修饰的Fc区改变(例如，降低)了与FcαR的结合。在某些实施方案中，人源化抗独特型抗体含有修饰的Fc区的全部或部分，相对于未修饰的Fc区与Fc受体的结合，所述修饰的Fc区具有改变的(例如，降低的)与Fc受体的结合。改变其与Fc受体结合的Fc修饰的非限制性实例描述于，例如，美国专利No.7,217,797和7,732,570；和美国申请号US2010/0143254和2010/0143254。
在某些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:138中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:139中列出的氨基酸序列的轻链。在具体的实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:140中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:141中列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:142中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:143中列出的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:144中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:145中列出的氨基酸序列的轻链。在具体的实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:146中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:147中列出的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，对FMC63特异的人源化抗独特型抗体具有含有在SEQ ID NO:148中列出的氨基酸序列的重链和含有在SEQ ID NO:149中列出的氨基酸序列的轻链。
示例性特征
可以通过各种已知的测定法来鉴定、筛选或通过其物理/化学性质和/或生物活性来表征在本文中提供的抗独特型抗体。在一个方面，通过诸如ELISA、Western印迹和/或流式细胞术测定法的已知方法(包括基于细胞的结合测定法)测试抗独特型抗体的抗原结合活性，例如，评估抗独特型抗体(例如，与荧光标志物缀合的或加标签的)与呈递靶抗CD19抗体模块的细胞的结合，并且在一些情况下与使用不表达靶抗CD19抗体模块的细胞的结果相比较。可以将结合亲和力量度为Kd或EC50。
在任何提供的抗体的一些实施方案中，例如，在上述A部分中提供的任何抗体中，靶抗CD19抗体模块是SJ25C1或是衍生自SJ25C1的抗体。
在任何提供的抗体的一些实施方案中，例如，在上述B部分中提供的任何抗体中，靶抗CD19抗体模块是FMC63或是衍生自FMC63的抗体。
可以使用竞争测定法来鉴定与本文所述的任何抗独特型抗体竞争的抗体。还可以使用用于映射被抗独特型抗体和参考抗体结合的表位的测定法，并且这些测定法是已知的。
在一些实施方案中，抗独特型抗体不与不同于靶抗CD19抗体模块的抗CD19抗体模块交叉反应。在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块衍生自SJ25C1抗体。在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块衍生自SJ25C1抗体，并且抗独特型抗体不与衍生自FMC63抗体的抗CD19抗体模块交叉反应，所述抗CD19抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL。在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块衍生自FMC63抗体。在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块衍生自FMC63抗体，并且抗独特型抗体不与衍生自SJ25C1抗体的抗CD19抗体模块交叉反应，所述抗CD19抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的VL。
在一些实施方案中，抗独特型抗体与靶抗CD19抗体模块特异性地结合，所述靶抗CD19抗体模块是融合蛋白比如重组受体的一部分。在一些实施方案中，抗独特型抗体不与靶抗CD19抗体模块外的融合蛋白中的任何表位结合。例如，在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块是嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域或者是其一部分，并且抗独特型抗体不结合所述抗原结合结构域外的任何表位。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含scFv或由其组成。
在一些实施方案中，抗独特型抗体与靶抗CD19抗体模块特异性地结合，所述靶抗CD19抗体模块是包含在CAR中的scFv。在一些实施方案中，抗独特型抗体与靶抗CD19 scFv的一个或多个互补决定区(CDR)的重叠表位特异性地结合。在一些实施方案中，抗独特型抗体不结合scFv外的CAR中的任何表位；在一些实施方案中，它不与参考抗体结合。在一些实施方案中，参考抗体和靶抗体与相同的抗原特异性地结合，例如其与CD19结合和/或包含与靶抗体的相应框架区具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的一个或多个可变重链和/或可变轻链框架区(在一些方面，所述一个或多个框架区包含重链和/或轻链的FR1、FR2、FR3和/或FR4)；和/或含有与靶抗体相同的重链和/或轻链v基因(或v基因使用)和/或衍生自与靶抗体相同的v基因序列。在一些方面，所述参考抗体是FMC63。在一些方面，所述参考抗体是SJ25C1。在一些实施方案中，CAR包含将scFv连接至其跨膜结构域的间隔物，并且抗独特型抗体不结合间隔物中的任何表位。在一些实施方案中，间隔物是衍生自CD28的序列，比如来自CD28的细胞外部分。在一些实施方案中，间隔物包含氨基酸序列SEQID NO:27。在一些实施方案中，抗独特型抗体不结合Fc结构域(比如IgG1的Fc结构域)中的任何表位。在一些实施方案中，Fc结构域是缺乏铰链区的IgG1 Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:32。
在一些实施方案中，抗独特型抗体不与不同的CAR交叉反应。在一些实施方案中，抗独特型抗体不与不同的抗CD19 CAR交叉反应。在一些实施方案中，抗独特型抗体不与(例如参考抗体的)抗CD19抗体模块交叉反应，所述抗CD19抗体模块与靶抗CD19 scFv相比具有一个或多个不同的独特位。在一些实施方案中，抗独特型抗体对衍生自SJ25C1抗体的CAR的靶抗CD19 scFv是特异的。在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块衍生自SJ25C1抗体，并且抗独特型抗体不与含有衍生自FMC63抗体的抗CD19抗体模块的CAR交叉反应。在一些实施方案中，抗独特型抗体对衍生自FMC63抗体的CAR的靶抗CD19 scFv是特异的。在一些实施方案中，靶抗CD19抗体模块衍生自FMC63抗体，并且抗独特型抗体不与含有衍生自SJ25C1抗体的抗CD19抗体模块的CAR交叉反应。
在一些实施方案中，抗独特型抗体是CAR的激动剂。在一些实施方案中，抗独特型抗体是CAR的拮抗剂。
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体能够以至少一定的亲和力结合靶抗CD19模块(比如抗体SJ25C1或FMC63)，如通过许多已知方法中的任一种测量的。在一些实施方案中，亲和力以平衡解离常数(KD)表示；在一些实施方案中，亲和力以EC50表示。在某些实施方案中，抗独特型抗体与抗CD19模块的结合亲和力(EC50)和/或解离常数等于或约为(或小于或小于约)100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1nM，比如在等于或约1nM和等于或约15nM之间，例如，在等于或约5nM和等于或约10nM之间。在一个实施方案中，抗独特型抗体与和靶抗CD19模块无关的模块的结合程度小于所述抗体与靶抗CD19模块的结合的10％或约10％，正如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。
核酸
还提供了编码抗体和/或其部分(例如它的链)的核酸。其中所提供的核酸是编码本文所述抗独特型抗体的核酸。核酸可包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的核酸，例如包括具有主链修饰的核酸。术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用，是指核苷酸聚合物。这样的核苷酸聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指核苷酸的线性序列，包括核酸分子或多核苷酸。示例性核酸和载体是具有如SEQ ID NO:15-22、50-57、71-77列出的序列及其CDR编码部分的那些核酸和载体，以及含有与所述序列具有至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的核酸和载体。所述核酸可编码包含抗独特型抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗独特型抗体的VH的氨基酸序列(例如所述抗体的轻和/或重链)。
还提供了例如用于产生所述抗体的含有所述核酸的载体、含有所述载体的宿主细胞。还提供了用于产生所述抗体的方法。在一个另外的实施方案中，提供了一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在一个另外的实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化有)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，提供了制造抗独特型抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达所述抗体的条件下培养如上文提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
产生抗体的方法
还提供了制造如任何提供的实施方案的抗独特型抗体的方法。在一些实施方案中，为了重组产生抗独特型抗体，可以分离编码例如如上所述的抗体的核酸，并将其插入一个或多个载体中，以便在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规程序(例如通过使用能够与编码所述抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地对这样的核酸进行分离和测序。
除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码抗体的载体的适合克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被修饰为模拟或接近于人细胞中的那些糖基化途径从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于，COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；细胞；和NSO细胞。在一些实施方案中，可以在酵母中表达抗体重链和/或轻链。参见，例如，美国公开号US2006/0270045 A1。在一些实施方案中，具体真核宿主细胞的选择根据是其对重链和/或轻链进行期望的翻译后修饰的能力。例如，在一些实施方案中，相比于在293细胞中产生的同一种多肽，CHO细胞产生具有更高水平的唾液酸化的多肽。
在一些实施方案中，在无细胞系统中产生抗独特型抗体。示例性无细胞系统描述于，例如，Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人，Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
所提供的实施方案进一步包括用于表达和产生抗体和其他结合蛋白的载体和宿主细胞以及其他表达系统，包括真核和原核宿主细胞，包括细菌、丝状真菌和酵母，以及哺乳动物细胞(比如人细胞)，以及无细胞表达系统。
抗独特型抗体或抗体模块可以是人源化抗体或人抗体。“人源化”抗体是其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基衍生自人FR的抗体。人源化抗体任选地可以包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指经历了人源化的非人抗体的变体，通常为了降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，用来自非人抗体(例如，自其衍生CDR残基的抗体)的相应残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如，用于恢复或提高抗体特异性或亲和力。
其中所提供的抗独特型抗体或抗体模块是人抗体。“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体、或利用人抗体谱或其他的人抗体编码序列的非人来源(包括人抗体文库)产生的抗体的氨基酸序列。该术语排除了包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，比如其中所有或基本上所有CDR都是非人的那些抗体。
人抗体可以通过向转基因动物施用免疫原加以制备，所述转基因动物已经被修饰以产生完整人抗体或具有应答于抗原攻击的人可变区的完整抗体。这样的动物一般含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其代替内源性免疫球蛋白基因座，或者在染色体外存在或随机整合到动物染色体中。在这样的转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。人抗体也可以衍生自人抗体文库，包括噬菌体展示文库和无细胞文库，其含有衍生自人谱的抗体编码序列。
免疫缀合物
在一些实施方案中，抗独特型抗体是免疫缀合物(抗独特型抗体免疫缀合物)或其部分，其中抗独特型抗体与一个或多个异源分子(比如但不限于细胞毒性剂或成像剂)缀合。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂(例如美登木素生物碱类、紫杉烷、甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，比如溶核酶；抗生素；毒素，比如小分子毒素或酶促活性毒素。在一些实施方案中，所述抗体与一种或多种细胞毒性剂缀合，所述细胞毒性剂比如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白毒素、酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
其中抗独特型抗体免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中独特型抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于：美登木素生物碱(参见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀，如单甲基澳瑞他汀药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和5,780,588、以及7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类比如道诺霉素或多柔比星(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、替司他赛和奥他赛；单端孢霉烯；和CC1065。
并且其中抗独特型抗体免疫缀合物是其中所述抗体与酶促活性毒素或其片段缀合的缀合物，所述酶促活性毒素或其片段包括但不限于：白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯类毒素。
并且其中抗独特型抗体免疫缀合物是其中所述抗独特型抗体与放射性原子缀合形成放射性缀合物的那些。示例性放射性同位素包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。
可以使用许多已知蛋白质偶联剂的任何一种来制造抗独特型抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述偶联剂例如接头(参见Vitetta等人，Science 238:1098(1987)),WO94/11026。接头可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”，比如酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头和含二硫化物接头(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
还提供了抗独特型抗体免疫缀合物，其包含附着于标记物的抗独特型抗体，所述标记物例如可检测标记物，其可间接或直接产生可检测信号。这些抗独特型抗体免疫缀合物可用于研究或诊断应用。标记物优选地能够直接或间接产生可检测信号。例如，标记物可以是不透射线的或放射性同位素，比如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，比如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，比如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，标记物是用于闪烁照相研究的放射性原子，例如99Tc或123I，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，比如锆-89、碘-123、碘碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂络合并与抗体缀合，例如用于PET成像(WO2011/056983)。
可检测标记物的实例包括但不限于放射性核素(radionucleotide)、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂(chemiluminescer)、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白、香豆素、Alexa488、俄勒冈绿(Oregon green)488、罗丹明绿、Alexa 532、Cy3、Bodipy 588/586、Alexa586、TAMRA、Rox、Alexa 594、德克萨斯红(Texas Red)、Bodipy 630/650、Cy5、Alexa647、IR染料680、IR染料680、IR染料700DX、Cy5.5、Alexa750、IR染料800CW、IR染料800、Atto 532和Atto 465。
在一些实施方案中，抗独特型抗体免疫缀合物是可直接检测的。例如，可以使用对于抗独特型抗体免疫缀合物特异的并含有可检测标记物的二级抗体来检测抗独特型抗体免疫缀合物。
多特异性抗体
在某些实施方案中，抗独特型抗体是多特异性的。其中多特异性结合分子是多特异性抗体，包括例如双特异性抗体。多特异性结合配偶体(例如抗体)对至少两个不同的位点具有结合特异性，所述结合位点可以在相同或不同的抗原中。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对抗CD19抗体模块，而另一种针对另一抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与抗CD19抗体模块的两个不同表位结合。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于在其表面上表达抗CD19抗体模块的细胞，比如抗CD19 CAR T细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段的形式。其中双特异性抗体是特异性单链抗体，例如双抗体、三抗体和四抗体、串联di-scFv和串联tri-scFv。
变体
在某些实施方案中，与本文所述抗独特型抗体的序列相比，抗独特型抗体包括一个或多个氨基酸变异，例如取代、缺失、插入和/或突变。示例性变体包括设计为改善抗独特型抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性的变体。可通过将适当的修饰引入编码抗独特型抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗独特型抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，抗独特型抗体氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。
在某些实施方案中，例如，与本文所述抗独特型抗体序列相比，抗独特型抗体包括一个或多个氨基酸取代。取代型诱变的感兴趣位点包括CDR和FR。可以将氨基酸取代引入到感兴趣的抗独特型抗体中，并针对期望活性筛选产物，所述期望活性例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的半衰期和/或改善的效应子功能，所述效应子功能比如促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在一些实施方案中，变体抗独特型抗体表现出保留或改善的与靶抗CD19抗体或其片段的结合。例如，在一些实施方案中，与未修饰的抗独特型抗体相比，变体抗独特型抗体表现出对靶抗CD19抗体的结合亲和力增加至少约10％(比如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％或更多中的任一者)。
在一些实施方案中，亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的CDR内的一个或多个残基被取代。在一些实施方案中，进行取代以将序列或序列中的位置恢复为种系序列，比如在种系(例如，人种系)中发现的抗体序列，以便例如在施用于人类个体时降低免疫原性的可能性。
在一些实施方案中，可以在CDR“热点”中进行改变，所述“热点”即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))、和/或接触抗原的残基，其中测试了所得变体VH或VL的结合亲和力。通过从次级文库构建和重新选择的亲和力成熟例如已经描述于Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法的任一种(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入到经选择用于成熟的可变基因中。然后创建次级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR指导的方法，其中将几个CDR残基(例如一次4-6个残基)随机化。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异性地鉴定参与抗原结合的CDR残基。特别地，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个CDR内进行，只要这样的改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如本文中提供的保守取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR未改变，或者含有不超过一个、二个或三个氨基酸取代。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括所述抗体的N或C末端与酶或增加所述抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
修饰
在某些实施方案中，例如，使用某些细胞系，例如，通过经由改变氨基酸序列去除或插入一个或多个糖基化位点和/或通过修饰附着于糖基化位点的寡糖改变抗体，以增加或降低抗体糖基化的程度。
示例性修饰、变体和细胞系描述于例如专利公开号US 2003/0157108、US2004/0093621、US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004).Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)；WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)；WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)。
其中修饰的抗体是具有在Fc区中的一个或多个氨基酸修饰的抗体，比如具有包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列或恒定区的其他部分(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)的那些抗体。
例如，可以进行这样的修饰以改善半衰期、改变与一种或多种类型的Fc受体的结合、和/或改变效应子功能。
并且，其中变体是半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAbs”和其他半胱氨酸工程化变体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代，以在可接近的位点生成反应性硫醇基团，例如用于药剂和接头剂的缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化抗体描述于例如美国专利No.7,855,275和7,521,541中。
在一些实施方案中，修饰抗体以含有另外的非蛋白质模块，包括水溶性聚合物。示例性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有在制造方面的优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，并且如果附接多于一种聚合物的话，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项来确定，包括但不限于，待改进的抗体的特定性质或功能，是否在定义的条件下将抗体衍生物用于治疗中，等等。
鉴定抗独特型抗体的方法
在一些实施方案中，提供了鉴定与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合的抗独特型抗体或抗原结合片段的方法，比如通过使用杂交瘤方法与包含靶抗体或其片段的免疫原(参见例如Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)以及Sergeeva等人，Blood,117(16):4262-4272)。免疫原可包含与靶抗体或片段融合的免疫原性增强模块。这样的免疫原性增强模块可具有多种特性，包括但不限于增加免疫原的溶解度和半衰期。示例性免疫原性增强模块包括Fc结构域或其片段。在一些实施方案中，免疫原性增强模块是Fc结构域(比如任选地来自人IgG1)。在一些实施方案中，免疫原性增强模块是缺乏全部或部分铰链区的Fc结构域(比如任选地来自人IgG1)。
在一些实施方案中，提供了鉴定与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合的抗独特型抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：(a)向受试者引入可溶性免疫原，所述可溶性免疫原包含与免疫原性增强模块融合的靶抗体的抗原结合片段；和(b)鉴定来自受试者的与所述靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合的抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段包含靶抗体的可变重链区和/或可变轻链区。在一些实施方案中，抗原结合片段是单链片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是scFv。在一些实施方案中，抗原结合片段在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中。
在一些实施方案中，免疫原性增强模块是Fc结构域或其片段，其任选地是人IgG1Fc。在一些实施方案中，免疫原性增强模块是缺乏铰链区的Fc结构域。在一些实施方案中，免疫原性增强模块包含在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，鉴定抗体包括使用杂交瘤技术鉴定由受试者产生的单独抗体克隆，并筛选所述克隆与靶抗体或其抗原结合片段的结合。在一些实施方案中，鉴定抗体包括：(i)从受试者的脾中分离B细胞并将它们与永生化B细胞融合以生成杂交瘤；(ii)筛选杂交瘤用于产生特异性地结合靶抗体或其抗原结合片段或包含该抗原结合片段的嵌合抗原受体的抗体；和(iii)对来自产生特异性地结合靶抗体或抗原结合片段的抗体的杂交瘤的抗体进行测序，由此鉴定抗独特型抗体。在一些实施方案中，筛选杂交瘤包括确定杂交瘤抗体对包含靶抗体或靶抗体的独特位的靶分子的结合亲和力，所述靶分子比如scFv或包含靶抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的CAR或其片段。在一些实施方案中，筛选杂交瘤进一步包括确定杂交瘤抗体对不包含靶抗体的独特位的非靶分子的结合亲和力，所述非靶分子比如Fc或其片段或不包含靶抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的另一种抗体或其片段，其中杂交瘤抗体与靶分子结合但不与非靶分子结合表明，所述杂交瘤抗体特异性地结合所述靶抗体。
在任何这样的实施方案的一些中，所述方法包括：(a)向受试者引入可溶性免疫原，所述可溶性免疫原包含与Fc结构域或其片段融合的靶抗体的scFv；和(b)鉴定来自受试者的与包含所述靶抗体的独特位的分子(比如免疫原)特异性地结合的抗体。在一些实施方案中，scFv在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段是人IgG1 Fc或其片段。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段是缺乏铰链区的Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段包含在SEQ IDNO:32中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，鉴定抗体包括使用杂交瘤技术鉴定由受试者产生的单独抗体克隆，并筛选所述抗体克隆与包含靶抗体的独特位的分子(比如免疫原)的结合。在一些实施方案中，鉴定抗体包括：(i)从受试者的脾中分离B细胞并将它们与永生化B细胞融合以生成杂交瘤；(ii)筛选杂交瘤用于产生特异性地结合包含靶抗体的独特位的分子(比如免疫原)的抗体；和(iii)对来自产生特异性地结合包含靶抗体的独特位的分子(比如免疫原)的抗体的杂交瘤的抗体进行测序，由此鉴定抗独特型抗体。在一些实施方案中，筛选杂交瘤包括确定杂交瘤抗体对包含靶抗体的独特位的靶分子的结合亲和力，所述靶分子比如免疫原、scFv或包含靶抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的CAR或其片段。在一些实施方案中，筛选杂交瘤进一步包括确定杂交瘤抗体对不包含靶抗体的独特位的非靶分子的结合亲和力，所述非靶分子比如Fc或其片段或不包含靶抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的另一种抗体或其片段，其中杂交瘤抗体与靶分子结合但不与非靶分子结合表明，所述杂交瘤抗体特异性地结合所述靶抗体。
在任何这样的实施方案的一些中，所述方法包括：(a)向受试者引入可溶性免疫原，所述可溶性免疫原包含与Fc结构域或其片段融合的靶抗体的scFv；和(b)鉴定来自受试者的抗体，所述抗体(i)与包含靶抗体的独特位的靶分子结合，所述靶分子比如免疫原、scFv、或包含靶抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的CAR或其片段；(ii)不与不包含靶抗体的独特位的非靶分子结合，所述非靶分子比如Fc或其片段或不包含靶抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的另一种抗体或其片段。在一些实施方案中，scFv在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段是人IgG1 Fc或其片段。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段是缺乏铰链区的Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域或其片段包含在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，鉴定抗体包括使用杂交瘤技术鉴定由受试者产生的单独抗体克隆，并筛选所述抗体克隆与靶分子和非靶分子的结合。在一些实施方案中，鉴定抗体包括：(i)从受试者的脾中分离B细胞并将它们与永生化B细胞融合以生成杂交瘤；(ii)筛选杂交瘤用于产生与靶分子结合但不与非靶分子结合的抗体；和(iii)对来自产生与靶分子结合但不与非靶分子结合的抗体的杂交瘤的抗体进行测序，由此鉴定抗独特型抗体。在一些实施方案中，筛选杂交瘤包括确定杂交瘤抗体对靶分子和非靶分子的结合亲和力。
在任何这样的实施方案的一些中，所述方法包括：(a)向受试者引入可溶性免疫原，所述可溶性免疫原包含与Fc结构域或其片段融合的衍生自FMC63抗体的scFv(比如包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的scFv)；和(b)鉴定来自受试者的抗体，所述抗体(i)与包含FMC63抗体的独特位的靶分子结合，所述靶分子比如免疫原、scFv、或包含FMC63抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的CAR或其片段；(ii)不与不包含FMC63抗体的独特位的非靶分子结合，所述非靶分子比如Fc或其片段或不包含FMC63抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的另一种抗体或其片段。在一些实施方案中，免疫原包含任选地被接头(例如在SEQ IDNO:33中列出)分开的在SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫原包含氨基酸序列SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，在(b)中鉴定的抗体与免疫原结合并且不与Fc结构域或其片段或包含衍生自SJ25C1抗体的scFv(比如包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的scFv)的分子结合。在一些实施方案中，在(b)中鉴定的抗体与包含氨基酸序列SEQ ID NO:34或35的靶分子结合，并且不与包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的非靶分子或包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的非靶分子结合。
在任何这样的实施方案的一些中，所述方法包括：(a)向受试者引入可溶性免疫原，所述可溶性免疫原包含与Fc结构域或其片段融合的衍生自SJ25C1抗体的scFv(比如包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的scFv)；和(b)鉴定来自受试者的抗体，所述抗体(i)与包含SJ25C1抗体的独特位的靶分子结合，所述靶分子比如免疫原、scFv、或包含SJ25C1抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的CAR或其片段；(ii)不与不包含SJ25C1抗体的独特位的非靶分子结合，所述非靶分子比如Fc或其片段或不包含SJ25C1抗体的重链可变区和/或轻链可变区或其部分(比如VH和/或VL区的一个或多个CDR)的另一种抗体或其片段。在一些实施方案中，免疫原包含任选地被接头(例如在SEQ IDNO:33中列出)分开的在SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，在(b)中鉴定的抗体与免疫原结合并且不与Fc结构域或其片段或包含衍生自FMC63抗体的scFv(比如包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的scFv)的分子结合。在一些实施方案中，在(b)中鉴定的抗体与包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的靶分子结合，并且不与包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的非靶分子或包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的非靶分子结合。
在一些实施方案中，鉴定抗体包括使用杂交瘤技术鉴定由受试者产生的单独抗体克隆，并筛选所述抗体克隆与靶分子和非靶分子的结合。在一些实施方案中，鉴定抗体包括：(i)从受试者的脾中分离B细胞并将它们与永生化B细胞融合以生成杂交瘤；(ii)筛选杂交瘤用于产生与靶分子结合但不与非靶分子结合的抗体；(iii)对来自产生与靶分子结合但不与非靶分子结合的抗体的杂交瘤的抗体进行测序，由此鉴定抗独特型抗体。在一些实施方案中，筛选杂交瘤包括确定杂交瘤抗体对靶分子和非靶分子的结合亲和力。
在示例性实施方案中，为了鉴定识别含有衍生自SJ25C1的抗CD19scFv的示例性抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的scFv部分的抗独特型抗体，可以使用包含如下列出的序列的免疫原：
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQG
LEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSA
VYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI
ELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIY
SATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYT
SGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，免疫原可以进一步含有Fc结构域或其片段，例如，如SEQ ID NO:32中列出。
在示例性实施方案中，为了鉴定识别含有衍生自FMC63的抗CD19scFv的示例性抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的scFv部分的抗独特型抗体，可以使用包含如下列出的序列的免疫原：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVK
LLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLP
YTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLS
VTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL
TIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQG
TSVTVSS(SEQ ID NO:34)。
在一些实施方案中，免疫原可以进一步含有Fc结构域或其片段，例如，如SEQ IDNO:32中列出。在一些实施方案中，为了鉴定识别含有衍生自FMC63的抗CD19 scFv的示例性抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的scFv部分的抗独特型抗体，可以使用包含如下列出的序列的免疫原：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIY
HTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFG
GGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCT
VSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKD
NSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV
SSPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:35)。
嵌合抗原受体(CAR)和基因工程化细胞
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体与嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合部分特异性地结合，所述嵌合抗原受体比如含有衍生自抗体SJ25C1或FMC63的抗原结合部分的抗CD19 CAR。在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体与细胞上表达的这样的CAR结合，所述细胞比如与过继细胞疗法结合使用的细胞。在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程引入的一个或多个核酸，由此表达这样的核酸的重组或基因工程CAR产物。在一些实施方案中，当经基因工程化进入免疫细胞中时，嵌合受体可调节T细胞活性，并且，在一些情况下，可调节T细胞分化或稳态，由此产生具有改进的体内寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，以供例如在过继细胞治疗方法中使用。在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体可在调节这些活性中的一者或多者的方法中使用，所述活性包括激活、刺激和/或扩增表达靶CAR的工程化细胞。
在一些实施方案中，细胞包含通过根据所提供方法的基因工程引入的一个或多个核酸，由此表达这样的核酸的重组或基因工程产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常在细胞或从细胞获得的样品中不存在，比如从另一生物或细胞获得的核酸，例如，通常在被工程化的细胞中和/或从中获得这种细胞的生物中未发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，比如在自然界未发现的核酸，包括编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。在具体的实施方案中，核酸含有编码CAR的基因。
在一些实施方案中，所提供的方法可以与用于制造或制备基因工程化细胞的一个或多个处理步骤同时、依次或并行地进行。所述方法的处理步骤可以包括单独或组合的多个细胞处理步骤中的任何一个或多个。在具体的实施方案中，处理步骤包括用一种或多种核酸转导或转染细胞，所述核酸例如包含编码重组受体的基因的异源多核苷酸。在某些实施方案中，用含有比如编码用于在细胞中表达的重组产物的逆转录病毒载体的病毒载体颗粒转导细胞。在某些实施方案中，用一种或多种非病毒核酸例如游离型质粒或转座子转染细胞。所述方法可以进一步和/或替代地包括其他处理步骤，例如用于分离、分开、选择、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤。在一些情况下，所述方法还可以包括培养、刺激或扩增细胞的离体步骤(例如，刺激细胞，例如，以便诱导它们的增殖和/或活化)，在某些情况下，可以按照提供的方法进行。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，制备、处理、培养和/或工程改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入到同一受试者中。
在一些实施方案中，所述方法包括以下列顺序进行的处理步骤：首先从生物样品中分离(比如选择或分开)细胞，例如原代细胞；将选择的细胞与病毒载体颗粒一起温育以进行转导；并且将转导的细胞配制成组合物。在一些情况下，比如根据所提供的方法，比如通过在刺激试剂存在下刺激将转导的细胞离体活化、扩增或增殖。在一些实施方案中，所述方法可包括洗涤、悬浮、稀释和/或浓缩细胞中的一个或多个处理步骤，其可在分离(比如分开或选择)、转导、刺激、和/或配制步骤中的一个或多个之前、期间或的同时或之后进行。
在具体的实施方案中，在与一种或多种核酸接触之前，对于待转染或转导的细胞不予分离、选择或富集。在一些实施方案中，在使细胞与一种或多种核酸接触之前，对所述细胞不予选择。在一些实施方案中，在使细胞与一种或多种核酸接触之前，对于待转染或转导的细胞不予富集。
在一些实施方案中，结合所提供的方法，包括与制备含有基因工程化细胞的组合物相结合，与制备、处理和/或温育细胞相结合的一个或多个细胞处理步骤可以在离心室的内腔中进行，所述离心室比如基本上刚性的室，其通常为圆柱形并可围绕旋转轴旋转，其相比于其他可用的方法提供了某些优点。在一些实施方案中，所有处理步骤均在同一个离心室中进行。在一些实施方案中，一个或多个处理步骤在不同的离心室比如相同类型的多个离心室中进行。这样的方法包括国际公开号WO2016/073602中描述的任何方法。
示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括与和/>2系统一起使用的那些离心室，包括A-200/F和A-200离心室以及与这样的系统一起使用的各种试剂盒。示例的室、系统以及处理仪器和机柜在例如美国专利No.6,123,655、美国专利No.6,733,433和公开的美国专利申请公开号US2008/0171951以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762中进行了描述，将其各自的内容通过提述完整并入本文。取决于具体的过程(例如稀释、洗涤、转导、配制)，选择对于所述过程适当的具体试剂盒在技术人员的水平之内。与这样的系统一起使用的示例性试剂盒包括但不限于BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将所述系统与其他仪器包括在一起和/或与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监视在所述系统中执行的各个处理步骤的多个方面的仪器。在一些实施方案中，该仪器被容纳在机柜内。在一些实施方案中，仪器包括机柜，其包括容纳控制电路的壳体、离心机、盖子、马达、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利No.6,123,655、美国专利No.6,733,433和US2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包括一系列容器，例如袋子、管、旋塞、夹具、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(比如袋子)包括一个或多个容器(比如袋子)，其容纳待转导或转染的细胞和载体颗粒，例如病毒载体颗粒或非病毒质粒，所述细胞和载体颗粒在同一容器或分开的容器(比如同一个袋子或分开的袋子)中。在一些实施方案中，所述系统进一步包括容纳介质(比如稀释剂和/或洗涤溶液)的诸如袋子的一个或多个容器，所述介质在所述方法过程中被吸入(pull)到室中和/或其他组分中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。容器可以连接在系统中的一个或多个位置处，比如在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置处。
在一些实施方案中，系统(比如封闭系统)是无菌的。在一些实施方案中，系统的部件(比如在管线和容器之间)经由连接器的所有连接都在无菌条件下进行。在一些实施方案中，在层流下进行连接。在一些实施方案中，在管与容器之间使用产生无菌连接(比如无菌焊接点)的无菌连接装置进行连接。在一些实施方案中，无菌连接装置在足够高的热条件下实现连接以保持无菌性，比如至少200℃的温度，比如至少260℃或300℃。
在一些实施方案中，系统可以是一次性的，比如一次性试剂盒。在一些实施方案中，例如，在以连续或半连续方式发生的过程中，一次性试剂盒可用于一个或多个过程的多次循环中，比如至少2、3、4、5次或更多次。在一些实施方案中，系统(比如一次性试剂盒)用于处理来自单个患者的细胞。在所述方法的多个方面，所述过程不需要在同一个封闭系统中比如在同一个离心室中进行，而是可以在不同的封闭系统下比如在不同的离心室中进行；在一些实施方案中，这样的不同的离心室位于与同一系统相关联的方法的对应点处，比如与同一离心机相关联。在一些实施方案中，所有处理步骤均在封闭系统中进行，其中每个或多个处理步骤的全部或子集在相同或不同的离心室中进行。
靶嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体特异性地结合靶CAR的细胞外结构域，所述靶CAR含有抗体或抗体片段的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域提供对期望抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性并且与细胞内信号传导结构域可操作连接或联结。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体SJ25C1或衍生自SJ25C1的部分的抗体片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体FMC63或衍生自FMC63的部分的抗体片段。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是活化细胞内结构域部分，比如T细胞活化结构域，其提供初级活化信号。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域含有或另外含有促进效应子功能的共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，提供了表达对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性的CAR的工程化细胞(比如T细胞)，所述抗原比如在特定细胞类型表面上表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如肿瘤或病原细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定的实施方案中，重组受体(比如嵌合受体)含有细胞内信号转导区，所述细胞内信号转导区包括胞质信号传导结构域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域)，比如能够在T细胞中诱导初级活化信号的胞质(细胞内)区，比如T细胞受体(TCR)组分的胞质信号传导结构域(例如CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号转导部分)，其包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
在一些实施方案中，嵌合受体进一步含有与配体(例如抗原)特异性地结合的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有与抗原特异性地结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(比如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工的肽抗原，比如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样，在主要组织相容性复合体(MHC)分子的背景下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)、以及用于将这样的受体工程化和引入细胞中的方法包括例如在以下文献中描述的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利No.6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416，和/或Sadelain等人，Cancer Discov.2013April；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人，Curr.Opin.Immunol.,2012October；24(5):633-39；Wu等人，Cancer,2012March 18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利No.7,446,190中描述的CAR、和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的实例包括任何上述出版物中公开的CAR，比如WO2014031687、美国专利No.8,339,645、美国专利No.7,446,179、US2013/0149337、美国专利No.7,446,190、美国专利No.8,389,282，Kochenderfer等人，2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人，Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO2014031687、美国专利No.8,339,645、美国专利No.7,446,179、US2013/0149337、美国专利No.7,446,190和美国专利No.8,389,282。
在一些实施方案中，CAR构建为对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性，比如在过继治疗所靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如，旨在诱导抑制(dampening)反应的癌症标志物和/或抗原，比如在正常或非病变细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其细胞外部分包括一个或多个抗原结合分子，比如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，比如衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分在细胞上表达为CAR的一部分。通常，含有表现出针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可称为TCR样CAR。在一些实施方案中，对TCR样CAR的MHC-肽复合物特异的细胞外抗原结合结构域在一些方面经由接头和/或跨膜结构域与一种或多种细胞内信号转导组分连接。在一些实施方案中，这样的分子通常可通过天然抗原受体(比如TCR)模拟或接近信号，并且，任选地通过这种受体与共刺激受体联合模拟或接近信号。
在一些实施方案中，重组受体，比如嵌合受体(例如CAR)，包括与抗原(或配体)结合(例如特异性地结合)的配体结合结构域。其中嵌合受体所靶向的抗原是在经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的背景下表达的抗原。其中疾病和病症是增殖性、肿瘤性以及恶性疾病和疾患，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症、免疫系统的癌症，比如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，比如B、T和髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞(例如肿瘤或病原细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，CAR含有特异性识别抗原的抗体或抗原结合片段(例如scFv)，所述抗原比如在细胞表面上表达的完整抗原。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标志物。在一些实施方案中，抗原(或配体)是αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌-睾丸抗原、癌/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人类高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、富亮氨酸重复8家族成员A(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(RORl)、生存素、滋养层细胞糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、维尔姆斯瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原、通用标签相关抗原、和/或生物素化分子，和/或HIV、HCV、HBV、HPV或其他病原体和/或其致癌形式所表达的(和/或特征性的或特异的)分子。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，比如许多已知的B细胞标志物的任何一种。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是病原体特异性抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，受体所靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，比如许多已知的B细胞标志物的任何一种。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是CD19并且特异性地被抗CD19抗体结合，所述抗CD19抗体比如SJ25C1或衍生自SJ25C1的抗原结合片段、或FMC63或衍生自FMC63的抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别地为IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
其中提供的抗体为抗体片段。“抗体片段”指的是除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子如scFv和单结构域VH单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在具体的实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，比如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人，Kuby Immunology,6thed.,W.H.Freeman和Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原比如癌症标志物或被靶向的细胞(比如肿瘤细胞或癌细胞)或疾病的细胞表面抗原，比如本文所述或本领域已知的任何靶抗原。
可以通过各种技术制造抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，比如包含非天然存在的排列的片段，比如具有通过合成接头(例如肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的片段，和/或不能通过酶消化天然存在的完整抗体来产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基衍生自人FR的抗体。人源化抗体任选地可以包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指经历了人源化的非人抗体的变体，通常为了降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，用来自非人抗体(例如，自其衍生CDR残基的抗体)的相应残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如，用于恢复或提高抗体特异性或亲和力。
嵌合受体(比如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，比如抗体分子(例如SJ25C1或FMC63)的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些实施方案中，scFv衍生自SJ25C1并且包含在SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv衍生自FMC63并且包含在SEQID NO:34中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体，比如CAR，比如其抗体模块，进一步包括间隔物，其可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或修饰形式，比如铰链区，例如IgG4铰链区和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(比如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。在一些方面，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如scFv)和跨膜结构域之间的间隔区。间隔物的长度与不存在间隔物相比可以在抗原结合后提供增加的细胞反应性。在一些实例中，间隔物的长度为或约为12个氨基酸或其长度不超过12个氨基酸。示例性间隔物包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸、或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出范围的端点之间的任何整数)的那些间隔物。在一些实施方案中，间隔区具有约12个氨基酸或更少，约119个氨基酸或更少，或约229个氨基酸或更少。示例性间隔物包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链、或与CH3结构域连接的IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔物具有在SEQ ID NO:150列出的序列，并且由SEQ IDNO:151中列出的序列编码。在一些实施方案中，间隔物具有在SEQ ID NO:152中列出的序列。在一些实施方案中，间隔物具有在SEQ ID NO:153中列出的序列。示例性间隔物包括但不限于在Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153、国际专利申请公开号WO2014031687、美国专利No.8,822,647或公开的申请号US2014/0271635中描述的那些。
在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的恒定区或部分。在一些实施方案中，间隔物具有在SEQ ID NO:154中列出的序列。在一些实施方案中，间隔物具有表现出与SEQ IDNO:1、3、4和5的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，抗原识别结构域(例如，细胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号转导组分连接，所述细胞内信号转导组分例如在CAR的情况下通过抗原受体复合物(比如TCR复合物)模拟激活和/或经由另一种细胞表面受体模拟信号的信号转导组分。在一些实施方案中，嵌合受体包含连接或融合在细胞外结构域(例如scFv)和细胞内信号传导结构域之间的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用与受体(例如CAR)中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而将与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面，结构域衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包含其跨膜区)的那些跨膜区。或者，一些实施方案中的跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成跨膜结构域的每个末端。在一些实施方案中，通过接头、间隔物和/或跨膜结构域加以连接。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔物连接，比如本文所述的任何间隔物。在一些实施方案中，受体含有衍生跨膜结构域的分子的细胞外部分，比如CD28细胞外部分。
其中细胞内信号传导结构域是通过天然抗原受体模拟或接近信号、通过这种受体与共刺激受体联合模拟或接近信号、和/或仅通过共刺激受体模拟或接近信号的那些细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，比如含有甘氨酸和丝氨酸(例如甘氨酸-丝氨酸双联体)的接头，并且所述接头形成在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。
T细胞活化在一些方面被描述为由两类细胞质信号转导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级细胞质信号转导序列)，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供二级信号或共刺激信号的那些序列(二级细胞质信号转导序列)。在一些方面，CAR包括这样的信号转导组分中的一种或两种。
受体(例如CAR)通常包括至少一种细胞内信号转导组分。在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级活化的初级细胞质信号转导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号转导序列可含有信号转导基序，其被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有初级细胞质信号序列的ITAM的实例包括衍生自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的细胞质信号转导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，比如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分与一个或多个细胞信号转导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR)进一步包括一种或多种另外的分子的一部分，所述分子比如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括在CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体时，受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞的正常效应子功能或应答中的至少一种，所述免疫细胞例如经工程化以表达CAR的T细胞。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，比如细胞溶解活性或T辅助活性，比如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如，条件是它转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，并且在一些方面还包括在自然情况下与这样的受体协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体的那些序列、和/或这样的分子的任何衍生物或变体、和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR发信号，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成二级信号或共刺激信号的组分也包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并提供用于生成二级信号或共刺激信号的组分。
T细胞活化在一些方面被描述为由两类细胞质信号转导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级细胞质信号转导序列)，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供二级信号或共刺激信号的那些序列(二级细胞质信号转导序列)。在一些方面，CAR包括这样的信号转导组分中的一种或两种。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体的信号传导结构域和/或跨膜部分，所述共刺激受体比如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。在一些方面，同一个CAR包括活化组分和共刺激组分两者。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有衍生自T细胞共刺激分子或其功能变体的细胞内结构域，比如在跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，活化结构域包含在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括活化或刺激性CAR、共刺激CAR，两者都在同一个细胞上表达(参见WO2014/055668)。在一些方面，细胞包含一种或多种刺激或活化性CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，所述细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，比如识别除与疾病或病症相关和/或对疾病或病症特异的抗原之外的抗原的CAR，由此通过抑制性CAR与其配体的结合减少或抑制通过疾病靶向的CAR递送的活化信号，以便例如减少脱靶效应。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中包括一个或多个，例如两个或更多个共刺激结构域和活化结构域，例如初级活化结构域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，抗原受体进一步包括标志物，并且/或者表达CAR或其他抗原受体的细胞进一步包括替代标志物，比如细胞表面标志物，其可用于证实表达所述受体的细胞的转导或工程化。在一些方面，标志物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如，截短形式)，比如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标志物的核酸与编码接头序列的多核苷酸可操作连接，所述接头序列比如可切割的接头序列，例如T2A。例如，标志物和任选的接头序列可以是在公开的专利申请号WO2014031687中公开的任何一种。例如，标志物可以是任选地与接头序列(比如T2A可切割的接头序列)连接的截短的EGFR(tEGFR)。在实施方案中，tEGFR含有在SEQ ID NO:155或156中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，tEGFR含有与SEQ ID NO:155或156中列出的序列具有或具有约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标志物是非天然存在于T细胞上或非天然存在于T细胞表面上的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即未被其中有待过继转移细胞的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。
在一些实施方案中，除了用作基因工程的标志物(例如，用于选择成功工程化的细胞)之外，标志物没有治疗功能和/或不产生作用。在其他实施方案中，标志物可以是治疗分子或以别的方式发挥某一期望作用的分子，比如在体内将会遇到的细胞的配体，比如在过继转移和遇到配体后增强和/或抑制细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
在某些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后只提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，比如包括来自共刺激受体如CD28或CD137的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同的共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括布置在细胞外结构域和细胞内信号转导区之间的跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔物连接，比如本文所述的任何间隔物。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，比如在跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
例如，在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、作为或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域含有CD28的信号转导部分或其功能变体和CD3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、作为或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域含有4-1BB的信号转导部分或其功能变体和CD3ζ的信号转导部分或其功能变体。在一些这样的实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(比如人Ig分子)的一部分(比如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔物，比如仅有铰链的间隔物。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27-氨基酸跨膜结构域，或是这样的跨膜结构域，其包含在SEQ ID NO:157中列出的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:157具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含在SEQ IDNO:158列出的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，细胞内信号转导区包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，比如其41个氨基酸结构域和/或比如在天然CD28蛋白的位置186-187具有LL至GG取代的结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可包含在SEQ IDNO:159或160中列出的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:159或160具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，比如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42-氨基酸细胞质结构域或其功能变体或部分，比如在SEQ ID NO:161中列出的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:161具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号转导区包含人CD3链任选地人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，比如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同工型3的112AA细胞质结构域或CD3ζ信号传导结构域，如在美国专利No.7,446,190或美国专利No.8,911,993中描述。在一些实施方案中，细胞内信号转导区包含在SEQ ID NO:162、163或164中列出的氨基酸序列或表现出与SEQ ID NO:162、163或164具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔物仅含有IgG的铰链区，比如仅有IgG4或IgG1的铰链，比如在SEQID NO:150中列出的仅有铰链的间隔物。在其他实施方案中，间隔物是Ig铰链，例如，与CH2和/或CH3结构域连接的IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔物是Ig铰链，例如与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链，比如在SEQ ID NO:152列出。在一些实施方案中，间隔物是Ig铰链，例如仅与CH3结构域连接的IgG4铰链，比如在SEQ ID NO:153中列出。在一些实施方案中，间隔物是或包含富含甘氨酸-丝氨酸序列或其他柔性接头，比如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(比如抗体片段)，包括scFv；间隔物，比如含有免疫球蛋白分子的一部分(比如重链分子的铰链区和/或一个或多个恒定区)的间隔物，比如含有Ig-铰链的间隔物；含有CD28衍生的跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域；CD28衍生的细胞内信号传导结构域；和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(比如scFv)、间隔物(比如任何含有Ig铰链的间隔物)、CD28衍生的跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内信号传导结构域和CD3ζ衍生的信号传导结构域。
在一些实施方案中，编码这样的CAR构建体的核酸分子进一步包括编码T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列的序列，例如在编码CAR的序列的下游。在一些实施方案中，还可以生成表达抗原受体(例如CAR)的T细胞，以表达截短的EGFR(EGFRt)作为非免疫原性选择表位(例如通过引入编码由T2A核糖体开关分离的CAR和EGFRt的构建体，从同一个构建体表达两种蛋白质)，然后其可用作检测这样的细胞的标志物(参见例如美国专利No.8,802,374)。在一些实施方案中，单个启动子可以指导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码参与调节代谢途径的分子和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此分离。因此，ORF编码单个多肽，所述多肽在翻译期间(在2A的情况下)或之后被加工成单独的蛋白质。在一些情况下，肽(比如T2A)可引起核糖体在2A元件的C末端跳过(核糖体跳跃)肽键的合成，导致2A序列的末端与下一个下游肽之间的分离(参见，例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。许多2A元件在本领域中是已知的。可在本文中公开的方法和核酸中使用的2A序列的实例，包括但不限于，来自下列病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如，SEQ ID NO:131)、马甲型鼻炎病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:130)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如，SEQ IDNO:126或127)、和猪捷申病毒-1(P2A，例如，SEQ ID NO:128或129)，如美国专利公开No.20070116690中所述。
由施用于受试者的细胞表达的重组受体(比如CAR)通常识别或特异性结合这样的分子，所述分子在被治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与其相关和/或是对其特异的。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(比如ITAM转导的信号)递送到细胞中，由此促进靶向至疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，细胞表达与抗原特异性地结合的CAR，所述抗原由疾病或病症的细胞或组织表达或与所述疾病或病症相关。受体可以是另一种受体，比如免疫抑制性受体或共刺激信号促进受体，比如CCR或iCAR或非信号转导受体，例如其用于使用抗体将细胞耗竭或消除。
基因工程化细胞和生产细胞的方法
其中表达嵌合抗原受体的细胞是工程化细胞。基因工程通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸比如通过逆转录病毒转导、转染或转化引入到含有细胞的组合物中。用于引入基因工程化组分(例如重组受体，例如CAR)的各种方法是熟知的，并且可以使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的方法，包括借助于病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
用于基因工程的载体和方法
还提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种多核苷酸(例如，核酸分子)、用于遗传工程改造细胞以表达此这样的CAR的载体以及用于生产工程化细胞的方法。在一些实施方案中，载体含有编码CAR的核酸。在一些情况下，载体是病毒载体，比如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒，例如衍生自猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体，将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(比如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人，Trends Biotechnol.2011November 29(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括衍生自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的几个物种的宿主细胞。在一个实施方案中，有待表达的基因置换逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利No.5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Chicaybam等人(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther NuclAcids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如在国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利No.7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后用例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)转染细胞(例如T细胞)。这种转染用于引入期望受体的基因，可以用例如任何适合的逆转录病毒载体来进行。然后可以从初始刺激物(例如抗CD3/抗CD28刺激物)释放遗传修饰的细胞群，随后用第二种类型的刺激物(例如通过从头引入的受体)刺激所述细胞群。这种第二类型的刺激物可包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或直接结合在新受体的框架内(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(比如抗体)。参见，例如，Cheadle等人，“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人，ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347(2014)。在一些实施方案中，根据提供的方法用提供的抗独特型抗体刺激细胞。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如T细胞)的载体。在一些这样的情况下，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在细胞培养之前或之后，并且在一些情况下在培养的同时或在培养的至少一部分的过程中将细胞工程化。
在另外的核酸中，例如，引入基因是比如通过促进转移细胞的活力和/或功能以改善治疗功效的基因；提供用于选择和/或评估细胞(比如评估体内存活或定位)的遗传标志物的基因；例如通过使细胞易于经历体内阴性选择以提高安全性的基因，如Lupton S.D.等人，Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人，Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述；另见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开文本，其描述了通过显性阳性选择标志物与阴性选择标志物融合而衍生的双功能选择融合基因的用途。参见，例如，Riddell等人，美国专利No.6,040,177，第14-17栏。
细胞和用于基因工程的细胞的制备
本文中提供了细胞，包括含有嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞。还提供了这样的细胞的群和含有这样的细胞的组合物。其中所述组合物是含有细胞的输入组合物，其中一个或多个细胞是已知的或可能或将表达重组受体，所述重组受体能够被存在于与细胞一起温育或接触的一个或多个颗粒上的结合分子识别或结合。并且，其中所述组合物是通过所提供的方法产生的组合物，包括其中含有经过刺激或扩增的细胞的输出组合物，包括富集含有重组受体的细胞的组合物，所述重组受体被颗粒上的结合分子结合或识别，比如其中表达重组受体(例如嵌合受体)的细胞构成组合物中的总细胞或某种类型的细胞(比如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。因此，提供了表达重组受体例如CAR的基因工程化细胞。
其中这些组合物是药物组合物和给药制剂，比如用于过继细胞疗法。还提供了用于工程化、生产或生成这样的细胞的方法，用于将所述细胞和组合物施用于受试者(例如患者)的治疗方法，以及用于检测、选择、分离或分开这样的细胞的方法。
在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常在细胞或从细胞获得的样品中不存在，比如从另一生物或细胞获得的核酸，例如，通常在被工程化的细胞中和/或从中获得这种细胞的生物中未发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，比如在自然界未发现的核酸，包括编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
细胞通常是真核细胞，比如哺乳动物细胞，并且典型地是人细胞。在一些实施方案中，细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，比如先天性或适应性免疫的细胞，例如髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，例如多能和多能性干细胞，包括诱导的多能性干细胞(iPSC)。
细胞通常是原代细胞，比如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞的一个或多个亚群或其他细胞类型，比如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，比如由功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱、和/或分化程度定义的那些。参考待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。其中这些方法包括现成的方法。在一些方面，比如对于现成技术，细胞是多能性和/或多能的，比如干细胞，比如诱导的多能性干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，制备、处理、培养和/或工程改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入到同一受试者中。
其中T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，比如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，比如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程引入的一种或多种核酸，由此表达这样的核酸的重组或基因工程产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常在细胞或从细胞获得的样品中不存在，比如从另一生物或细胞获得的核酸，例如，通常在被工程化的细胞中和/或从中获得这种细胞的生物中未发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，比如在自然界未发现的核酸，包括编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。可以从样品中分离用于引入编码转基因受体(比如CAR)的核酸的细胞，所述样品比如生物样品，例如从受试者获得或衍生的样品。在一些实施方案中，从其分离细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预的人，所述治疗干预比如过继细胞疗法，其中细胞被分离、处理和/或工程化。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、液体和其他样品，以及由一个或多个处理步骤产生的样品，所述处理步骤比如分离、离心、基因工程(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或温育。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，比如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括由其衍生的处理样品。
在一些方面，从其衍生或分离细胞的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或衍生自血液成分单采术或白细胞单采术产品。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官、和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法例如过继细胞疗法的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞衍生自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获自异种来源，例如，来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下将细胞洗涤、离心和/或温育，例如，以去除不需要的组分，富集期望的组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质分离细胞，所述性质比如密度、粘附性质、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性。
在一些实例中，例如通过血液成分单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。在一些实施方案中，在细胞的选择和/或富集之前，可以在进一步的处理步骤之前静置或保持样品或样品中的细胞。在一些实施方案中，将样品维持在或保持在从或从约2℃至8℃的温度下最多48小时，比如最多12小时、24小时或36小时。在某些实施方案中，在使细胞与一种或多种核酸接触之前，对所述细胞不予选择和/或富集。在一些实施方案中，在使细胞与一种或多种核酸接触或一起温育之前，可以静置或保持样品或细胞。在某些实施方案中，将样品维持在或保持在从或从约2℃至8℃的温度下最多48小时，比如最多12小时、24小时或36小时，然后使细胞与一种或多种核酸接触或一起温育。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆部分，并将所述细胞置于适当的缓冲液或介质中，以备随后的处理步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，使用半自动“直流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)根据制造商的说明完成洗涤步骤。在一些方面，通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液例如不含Ca++/Mg++的PBS中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特异性分子(比如表面标志物，例如表面蛋白、细胞内标志物或核酸)的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于这样的标志物的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞的表达或一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达水平分离细胞和细胞群，例如通过用与这样的标志物特异性地结合的抗体或结合配偶体温育，随后通常为洗涤步骤以及将已经结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合抗体或结合配偶体的细胞分离。
这样的分离步骤可以基于其中保留已经结合试剂的细胞用于进一步使用的阳性选择、和/或其中保留未与抗体或结合配偶体结合的细胞的阴性选择。在一些实例中，两个部分都被保留以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性地鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得基于由除期望群体之外的细胞表达的标志物最佳地进行分离。
分离不必导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标志物的细胞。例如，特定类型的细胞(比如表达标志物的细胞)的阳性选择或富集是指增加这样的细胞的数量或百分比，但不必导致不表达所述标志物的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(比如表达标志物的细胞)的阴性选择、去除或耗竭是指减少这样的细胞的数量或百分比，但不必导致所有这样的细胞的完全去除。
在一些实例中，进行了多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，比如随后的阳性或阴性选择。在一些实例中，比如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起温育，单个分离步骤可以同时耗竭表达多种标志物的细胞，其中每种抗体或结合配偶体对于靶向阴性选择的标志物是特异的。同样，通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起温育，可以同时进行多种细胞类型的阳性选择。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离特定的T细胞亚群，比如阳性或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，所述细胞例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。
例如，可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，M-450CD3/CD28 TCell Expander)进行CD3+、CD28+T细胞的阳性选择。在具体的实施方案中，在使细胞与一种或多种核酸接触之前，使细胞与抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，/>M-450CD3/CD28T Cell Expander)接触以扩增CD3+、CD28+T细胞。在某些实施方案中，在使细胞与一种或多种核酸接触之前，细胞不与抗CD3/抗CD28缀合的磁珠接触。
在一些实施方案中，通过阳性选择富集特定的细胞群、或通过阴性选择耗竭特定的细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起温育来完成阳性或阴性选择，所述抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标志物+)或以较高水平表达(标志物高)的一种或多种表面标志物特异性地结合。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(比如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物(比如CD14)的阴性选择，将T细胞从PBMC样品分离。在一些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对一个或多个幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标志物的阳性或阴性选择，可以将这样的CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，例如通过基于与对应的亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择，从CD8+细胞进一步富集或耗竭幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以增加效力，比如改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在这样的亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，联合富含TCM的CD8+T细胞和CD4+T细胞进一步增强效力。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。比如使用抗CD8和抗CD62L抗体，可以从PBMC富集或耗竭CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性表达或高表面表达；在某些方面，它基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗竭以及表达CD62L的细胞的阳性选择或富集，进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，以基于CD4表达选择的阴性细胞级分开始进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集，将所述阴性细胞级分进行基于CD14和CD45RA表达的阴性选择和基于CD62L的阳性选择。在一些方面，同时进行这样的选择，并且在其他方面，以任一顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性级分和阴性级分都被保留并用于这些方法的后续步骤中，任选地随后为一个或多个另外的阳性或阴性选择步骤。
在特定的实例中，对PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞选择，其中阴性级分和阳性级分两者都被保留。然后基于CD14和CD45RA或CD19的表达对阴性级分进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞的标志物特征(如CD62L或CCR7)进行阳性选择，其中以任一顺序进行阳性选择和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。可通过标准方法获得CD4+淋巴细胞。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+的。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-的。
在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(比如磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离用于阳性和/或阴性选择的细胞。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术(在Methods in MolecularMedicine,vol.58:Metastasis Research Protocols,Vol.2:Cell Behavior In Vitroand In Vivo,第17-25页，编辑：S.A.Brooks和U.Humana Press Inc.,Totowa,NJ中综述)来分开或分离细胞和细胞群。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料一起温育，所述材料比如磁响应颗粒或微粒，比如顺磁珠(例如Dynalbeads或MACS珠)。磁响应材料(例如颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如抗体)，所述结合配偶体与存在于期望分离(例如，期望被阴性或阳性选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上的分子(例如表面标志物)特异性地结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠子包含与特异性结合成员(比如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多熟知的在磁分离方法中使用的磁响应材料。适合的磁性颗粒包括在Molday的美国专利No.4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中描述的那些磁性颗粒，将其通过提述并入本文。胶体大小颗粒(如在Owen的美国专利No.4,795,698和Liberti等人的美国专利No.5,200,084中所述的那些)是其他的实例。
温育通常在这样的条件下进行，抗体或结合配偶体或分子(比如二级抗体或其他试剂)借此条件与细胞表面分子(如果存在于样品中的细胞上)特异性地结合，所述二级抗体或其他试剂与附着于磁性颗粒或珠子的这样的抗体或结合配偶体特异性地结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体上并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引到磁体上的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在相同的选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中阳性和阴性级分被保留并进一步处理或经受进一步的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一级抗体或其他结合配偶体、二级抗体、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性颗粒通过对一种或多种标志物特异的一级抗体的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一级抗体或结合配偶体标记细胞而不是珠子，然后加入细胞类型特异性二级抗体包被的或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一级抗体或二级抗体结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于细胞，所述细胞随后将被温育、培养和/或工程化；在一些方面，将颗粒附着于细胞，用于施用于患者。在一些实施方案中，从细胞去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞去除可磁化颗粒的方法是已知的，包括例如使用竞争性非标记抗体、和可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)来进行。磁激活细胞分选(MACS)系统能够以高纯度选择其上具有附着的磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非目标物质和目标物质。也就是说，附着在磁化颗粒上的细胞保持在适当的位置，而未附着的物质被洗脱。然后，在完成该第一个洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被免受洗脱的物质，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，将非靶细胞标记并从异质细胞群中去除。
在某些实施方案中，使用系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行分离、细胞制备、分开、处理、温育、培养和/或制剂方法步骤中的一个或多个。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如，以便将错误、用户操作和/或污染降到最低。在一个实例中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380A1中描述的系统。在一个实例中，所述系统是如国际公开号WO2016/073602中描述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在一体化或自含式系统中和/或以自动或可编程方式进行分离、处理、工程化和制剂步骤中的一个或多个(例如全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和制剂步骤的各个方面进行编程、控制、评估结果和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如，用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。组件可包括集成微型计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制该仪器的所有组件并指导该系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制管组各处的流速，并与夹管阀一起确保缓冲剂通过该系统的流动受到控制和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用提供在无菌、无热原溶液中的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞之后，洗涤细胞以除去过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，管组进而连接到含有缓冲剂的袋和细胞收集袋。管组包括预组装的无菌管，包括预柱和分离柱，仅供一次性使用。在启动分离程序之后，系统自动将细胞样品施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，与本文所述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且未保留在柱中。在一些实施方案中，与本文所述的方法一起使用的细胞群是标记的并且保留在柱中。在一些实施方案中，在去除磁场后，将与本文所述方法一起使用的细胞群从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理单元，其允许通过离心将细胞自动洗涤和分级分离。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培养室，其完成细胞培养方案，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660,Terakura等人(2012)Blood.1:72-82和Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群，其中在流体流中携带针对多个细胞表面标志物染色的细胞。在一些实施方案中，通过制备规模的(FACS)-分选收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)JBiophoton.1(5):355-376。在两种情况下，可以用多种标志物标记细胞，从而允许以高纯度分离定义明确的T细胞亚群。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标志物标记抗体或结合配偶体，以促进针对阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记抗体的结合。在一些实例中，比如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括例如与流式细胞检测系统联合的制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片，基于对一种或多种细胞表面标志物特异的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞，所述细胞表面标志物被携带在流体流中。这样的方法允许同时基于多种标志物进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、温育和/或工程化之前或之后冷冻例如冷冻保存细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和随后的解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，将细胞悬浮在冷冻溶液中，例如随后为洗涤步骤以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用各种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个实例涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS或其他适合的细胞冷冻培养基。然后用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的终浓度分别为10％和4％。然后将细胞通常以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程之前(或与基因工程相结合)温育和/或培养细胞。温育步骤可包括培养、培育、刺激、活化和/或增殖。温育和/或工程化可以在培养容器中进行，例如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下温育组合物或细胞。这样的条件包括设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程(比如用于引入重组抗原受体)的那些条件。
所述条件可包括下列一种或多种：特定的介质、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、作用剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的作用剂。
在一些实施方案中，刺激条件或作用剂包括一种或多种作用剂，例如配体，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述作用剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号级联。这样的作用剂可以包括抗体，比如对TCR特异的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种能够刺激共刺激受体的作用剂，例如配体，例如抗CD28。在一些实施方案中，这样的作用剂和/或配体可以与固体支持物如珠子和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法可以进一步包括向培养基中加入抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤(例如，浓度至少约0.5ng/ml)。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，根据例如在Riddell等人的美国专利No.6,040,1 77，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701中描述的技术进行温育。
在一些实施方案中，通过向培养起始组合物添加饲养细胞(比如非分裂外周血单核细胞(PBMC))来扩增T细胞(例如，使得所得细胞群针对待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少约5个、10个、20个或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并温育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围的γ射线照射PBMC以阻止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30度，并且通常为或约为37摄氏度。任选地，温育可以进一步包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围的γ射线照射LCL。在一些方面，以任何适合的量提供LCL饲养细胞，比如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比例为至少约10:1。
组合物
还提供了包含本文中提供的结合分子(比如抗体)的组合物，包括药物组合物和制剂。组合物和制剂通常包含一种或多种任选的可接受的载体或赋形剂。
术语“药物制剂”是指其为这样的形式的制剂，所述形式允许其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且所述制剂不含另外的对该制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分地由特定的细胞、结合分子、和/或抗体和/或由施用方法决定。因此，有多种适合的制剂。例如，药物组合物可含有防腐剂。适合的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)。药学上可接受的载体通常在采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，缓冲剂被包括在组合物中。适合的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
在一些方面，组合物可含有防腐剂。适合的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)。可接受的载体包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
抗体制剂可包括冻干制剂和水溶液。
在一些实施方案中，将组合物提供为无菌液体制剂，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍微更便于施用，特别是通过注射。另一方面，可以将粘性组合物配制在适当的粘度范围内，以提供更长的与特异性组织接触的时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其适合的混合物。
可以通过将结合分子掺入溶剂中来制备无菌注射溶液，所述溶剂比如具有适合的载体、稀释剂或赋形剂的混合物，所述赋形剂比如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。组合物也可以冻干。组合物可含有辅助物质，比如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于给药途径和期望的制剂。在一些方面可以查阅标准文本来制备适合的制剂。
可以加入各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等确保预防微生物作用。可通过使用吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现注射药物形式的延长吸收。
组合物也可以冻干。组合物可含有辅助物质，比如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、着色剂等。在一些方面可以查阅标准文本来制备适合的制剂。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。
抗体的方法和用途
在一些实施方案中，本文中提供了涉及使用一种或多种抗独特型抗体的方法。在一些方面，本文中提供了用于测量或检测靶抗体(例如CAR或表达CAR的细胞)的方法，以及用于修饰靶抗体活性(比如CAR的活性或表达CAR的细胞的活性)的方法。在某些实施方案中，一种或多种抗独特型抗体结合、检测、鉴定和/或量化CAR和/或表达CAR的细胞。在一些实施方案中，本文中提供的方法提供了将一种或多种抗独特型抗体与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞或含有或被认为含有所述细胞的样品接触和/或一起温育的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在允许在抗独特型抗体和靶抗体(例如CAR)之间形成复合物的条件下，将抗独特型抗体用组合物或样品处理、温育和/或接触。在一些方面，所述复合物可用于检测、分离和/或测量CAR的目的。在一些实施方案中，比如通过刺激受体信号转导活性，或在一些实施方案中，通过预防CAR与抗原结合来拮抗靶抗体(例如CAR)的活性，复合物的形成改变了靶抗体(例如CAR)的活性。
A.检测/分离方法
在一些实施方案中，提供了涉及使用一种或多种抗独特型抗体和/或含有一种或多种这样的抗独特型抗体的分子(比如缀合物和复合物)检测、结合和/或分离抗体(例如靶抗体)的方法。在某些实施方案中，所述方法提供了将一种或多种抗独特型抗体用样品和/或组合物进行接触、温育和/或暴露的一个或多个步骤。在一些实施方案中，样品和/或组合物具有、可能具有和/或疑似具有被一种或多种抗独特型抗体结合和/或识别的靶抗体和/或其抗原结合片段。在某些实施方案中，被一种或多种抗独特型抗体结合或识别的抗体或其抗原结合片段含有一个或多个融合结构域和/或是融合蛋白。在某些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段是CAR。在某些实施方案中，抗独特型抗体结合和/或识别抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段，包括包含CAR的嵌合分子或缀合物，所述CAR含有这样的抗CD19抗体(例如，抗体片段)。
一些实施方案中的方法包括将含有或疑似含有靶抗体的样品和/或组合物用抗独特型抗体温育、处理和/或接触。在某些实施方案中，在允许抗独特型抗体与组合物中存在的靶抗体结合的条件下温育，例如以便形成含有抗独特型抗体和靶抗体的复合物。
在一些实施方案中，样品和/或组合物含有或疑似含有靶抗体，例如CAR。在某些实施方案中，样品和/或组合物含有或疑似含有表达靶抗体例如CAR的细胞。在某些实施方案中，样品是生物样品。在具体的实施方案中，样品是血清样品和/或血液样品。在一些实施方案中，生物样品含有一个或多个免疫细胞。在一些实施方案中，生物样品是或衍生自组织，比如结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在具体的实施方案中，生物样品是或衍生自心脏、脉管系统、唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、下丘脑、垂体、松果腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、肾、输尿管、膀胱、尿道、淋巴系统、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、咽、喉、气管、支气管、肺、膈肌、骨、软骨、韧带或肌腱。在具体的实施方案中，从人受试者取得、收集和/或获得生物样品。在某些实施方案中，样品含有活细胞和/或完整细胞。在一些实施方案中，样品是或含有已被破坏和/或裂解的匀浆和/或细胞。在一些实施方案中，生物样品含有已经从血液、血清和/或组织中分离的蛋白质和/或抗体。
在具体的实施方案中，抗独特型抗体与靶抗体(例如CAR)形成或能够形成复合物。在具体的实施方案中，检测、测量、量化和/或评估复合物，例如，以允许检测、鉴定、测量和/或量化例如组合物或样品中的靶抗体。在某些实施方案中，所述方法包括检测在抗独特型抗体和样品中的靶抗体之间是否形成复合物，和/或检测这种结合的存在或不存在或水平。在一些实施方案中，所述复合物含有可检测标记物。在具体的实施方案中，抗独特型抗体是含有可检测标记物的免疫缀合物。在某些实施方案中，抗独特型抗体含有、缀合至、结合至和/或附着于可检测标记物。在一些实施方案中，复合物含有结合和/或识别抗独特型抗体的抗体，例如二级抗体，其缀合至、结合至和/或附着于可检测标记物。
在一些实施方案中，用于检测、量化、检测和/或评估例如样品或组合物中的靶抗体的方法包括检测靶抗体和抗独特型抗体的复合物。在一些实施方案中，所述复合物含有可检测标记物。在某些实施方案中，用可检测标记物探测和/或接触复合物。在一些实施方案中，通过任何适合的方法或手段检测复合物，例如但不限于流式细胞术、免疫细胞化学、免疫组织化学、Western印迹分析和ELISA。
在一些实施方案中，靶抗体或抗原结合片段与细胞结合或在细胞表面上表达。在具体的实施方案中，靶抗体(例如CAR)不结合细胞或不被包含在细胞内，例如，在一些实施方案中，靶抗体是分泌的。在某些实施方案中，抗体已经从细胞表面分离、去除和/或裂解。
在一些实施方案中，靶抗体或抗原结合片段被包含在嵌合抗原受体(CAR)比如在细胞表面上表达的CAR中。在一些实施方案中，细胞是干细胞(例如，iPSC)或免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，比如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和/或δ/γT细胞。在一些实施方案中，细胞来自组织，例如心脏、脉管系统、唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、结肠、直肠、下丘脑、垂体、松果腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、肾、输尿管、膀胱、尿道、淋巴系统、皮肤、肌肉、脑、脊髓、神经、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、咽、喉、气管、支气管、肺、膈肌、骨、软骨、韧带或肌腱。
在一些实施方案中，靶抗体是抗CD19抗体。在一些实施方案中，靶抗体是或衍生自抗体SJ25C1或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体是或衍生自抗体FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了检测靶抗体比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段(和/或包含这样的抗体的嵌合分子，例如抗体片段，比如CAR)的方法，所述方法包括使包含靶抗体或抗原结合片段的组合物与本文所述的抗独特型抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体免疫缀合物接触，并检测与靶抗体或抗原结合片段结合的抗独特型抗体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测在抗独特型抗体和组合物中的靶抗体之间是否形成复合物，比如检测这种结合的存在或不存在或水平。在一些实施方案中，靶抗体或抗原结合片段与细胞结合或在细胞表面上表达，并且所述检测包括检测与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段直接或间接标记用于检测。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了分离靶抗体比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段(和/或包含这样的抗体的嵌合分子，例如抗体片段，比如CAR)的方法，所述方法包括使含有或疑似含有靶抗体或抗原结合片段的组合物和/或样品与本文所述的抗独特型抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体免疫缀合物接触，并分离包含与靶抗体或抗原结合片段结合的抗独特型抗体的复合物。在某些实施方案中，用抗独特型抗体或其抗原结合片段(为免疫缀合物)分离靶抗体，所述免疫缀合物比如在部分I-F中描述的免疫缀合物。在一些实施方案中，靶抗体或抗原结合片段与细胞结合或在细胞表面上表达，并且所述分离包括分离与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，通过基于亲和力的分离将包含抗独特型抗体的复合物分离。在一些实施方案中，基于亲和力的分离选自下组，该组的组成为：基于免疫亲和力的分离、基于磁性的分离和亲和色谱法。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了检测表达CAR的细胞的方法，所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括使表达CAR的细胞与本文所述的抗独特型抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体免疫缀合物接触，并检测与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段直接或间接标记用于检测。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在某些实施方案中，用本文所述的抗独特型抗体检测靶抗体的方法用于评估受试者中的靶抗体。例如，在一些实施方案中，本文中提供了抗独特型抗体用于评估、测量和/或量化治疗性细胞组合物的表达CAR的细胞的体内药代动力学、扩增和/或持久性的使用方法。在一些实施方案中，可以用本文中提供的抗独特型抗体测量在本文提供的方法中的细胞的体内药代动力学、扩增和/或持久性、和/或细胞表型或细胞的功能活性的变化，所述细胞比如为免疫疗法(例如CAR-T细胞疗法)施用的表达CAR的细胞。在一些实施方案中，在施用所述疗法期间和/或之后，在施用治疗性细胞组合物后，通过用本文中提供的抗独特型抗体检测受试者中和/或从受试者获得的样品中表达CAR的细胞的存在和/或量来评估、测量表达CAR的细胞的药代动力学、扩增和/或持久性。
在一些方面，抗独特型抗体与流式细胞术一起用于评估在受试者的血液或血清或器官或组织样品(例如，疾病部位，例如肿瘤样品)中表达重组受体的细胞(例如，为基于T细胞的疗法施用的表达CAR的细胞)的数量。在一些方面，将持久性量化为每微升样品(例如，血液或血清)或按照每微升样品的外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞总数的CAR表达性细胞的数目。在某些方面，将扩增量化为每微升样品(例如，血液或血清)或按照每微升样品的外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞总数的CAR表达性细胞的数目随时间的增加。在一些实施方案中，通过检测在多个时间点的受试者中和/或从受试者收集的样品中表达CAR的细胞的量，测量或评估了药代动力学、扩增和/或持久性。在某些实施方案中，在施用治疗性细胞组合物之后24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、6个月、一年之内或一年以上，从受试者收集、获得和/或取得一个或多个样品。
在一些实施方案中，提供了选择表达CAR的细胞的方法，所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括使包含表达CAR的细胞的细胞群与本文所述的抗独特型抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体免疫缀合物接触，并选择与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，通过基于亲和力的分离选择与抗独特型抗体结合的细胞。在一些实施方案中，基于亲和力的分离选自下组，该组的组成为：基于免疫亲和力的分离、流式细胞术、基于磁性的分离和亲和色谱法。在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段或抗独特型抗体免疫缀合物可逆地结合或固定在支持物或固定相上。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了验证CAR的方法，所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括a)将包含用CAR转导的T细胞的样品与靶向所述CAR的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育；b)确定与抗独特型抗体或其抗原结合片段结合的细胞的百分比；和c)基于抗独特型抗体结合的T细胞的百分比验证CAR。在一些实施方案中，将抗独特型抗体标记，并通过流式细胞术测定抗独特型抗体结合的T细胞。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
还提供了涉及使用所提供的抗独特型抗体和含有一种或多种这样的抗独特型抗体的分子(比如缀合物和复合物)用于告知个体的治疗决定的方法，比如其通过检测被抗独特型抗体识别的CAR来实现，所述CAR比如包含靶抗体的CAR，所述靶抗体比如抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法用于告知与包括施用CAR T细胞(例如抗CD19 CAR T细胞)的疗法相关的个体治疗决定。在一些实施方案中，所述方法包括用抗独特型抗体温育和/或探测生物样品和/或向个体施用抗独特型抗体。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织或其部分，比如肿瘤或癌症组织或活组织检查或其切片。在某些实施方案中，在允许抗独特型抗体与样品中存在的CAR结合的条件下温育。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测在抗独特型抗体和样品中的CAR之间是否形成复合物，比如检测这种结合的存在或不存在或水平。这样的方法可以是体外或体内方法。
在一个实施方案中，抗独特型抗体用于确定是否需要调整个体中的CAR T细胞疗法，例如，其中个体中低水平的CAR T细胞表明需要调整所述疗法。在一些实施方案中，靶抗体是抗CD19抗体。在一些实施方案中，靶抗体是或衍生自抗体SJ25C1或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体是或衍生自抗体FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了评估个体中CAR T细胞疗法的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括将来自个体的样品与靶向CAR的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，并确定与抗独特型抗体结合的T细胞的量，并且基于抗独特型抗体结合的T细胞的量确定所述疗法的潜在治疗益处。在一些实施方案中，将抗独特型抗体标记，并通过流式细胞术测定抗独特型抗体结合的T细胞。在一些实施方案中，样品是血液衍生的样品，或者是或衍生自血液成分单采术或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了评估个体中CAR T细胞疗法的方法。在一些方面，CAR包含靶抗体，比如是或衍生自SJ25C1或FMC63的抗体，比如全长SJ25C1或FMC63的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用靶向CAR的抗独特型抗体或其抗原结合片段(例如，靶向CAR的抗体，例如抗体片段)。在一些方面，在开始所述疗法的第一个剂量后进行施用。所述方法可包括确定个体中一种或多种组织/器官中抗独特型抗体的存在。在一些方面，所述方法包括基于在一种或多种组织/器官中的至少一种中抗独特型抗体的存在来确定所述疗法的潜在治疗益处。在一些实施方案中，将抗独特型抗体标记，并且通过在个体中成像以检测标记物来确定个体中抗独特型抗体的存在。在一些实施方案中，确定个体中一种或多种组织/器官中抗独特型抗体的存在包括确定一种或多种组织/器官中抗独特型抗体的水平或其结合，或通过所述确定来实施。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在开始所述疗法的第二个剂量或后续剂量后向个体施用抗独特型抗体和/或确定抗独特型抗体在个体中的一种或多种组织/器官中的存在。在一些方面，所述方法进一步涉及基于在第一次和第二次抗独特型抗体施用之间个体中的一种或多种组织/器官中的至少一种中抗独特型抗体水平的差异来确定所述疗法的潜在治疗益处。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了调整个体中CAR T细胞疗法的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段。在一些方面，所述方法包括将来自个体的样品与靶向CAR的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育或接触。在一些方面，所述方法包括确定结合至抗独特型抗体或与其结合的T细胞的量。在一些方面，所述方法包括基于抗独特型抗体结合的T细胞的量来调整所述疗法。在一些实施方案中，将抗独特型抗体直接或间接标记。在这样的实施方案的一些方面，例如，在一些情况下，通过流式细胞术，通过测定来自施用CAR-T细胞和抗独特型抗体的受试者的样品，使抗独特型抗体结合的T细胞在体内或离体成像。在一些实施方案中，样品是血液衍生的样品，并且/或者是或衍生自血液成分单采术或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ IDNO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了调整个体中CAR T细胞疗法的方法。在一些方面，对CAR-T细胞疗法实行这样的方法，其中CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63，包括SJ25C1或FMC63的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述方法包括在开始施用所述疗法的第一个剂量后向个体施用靶向或结合CAR的抗独特型抗体或其抗原结合片段，并确定个体中的一种或多种组织/器官中的抗独特型抗体的存在、不存在或水平。在一些方面，所述方法包括基于一种或多种组织/器官中的至少一种中抗独特型抗体的存在、不存在或水平来调整所述疗法。在一些实施方案中，将抗独特型抗体直接或间接标记，并且在一些这样的实施方案中通过在个体中成像以检测标记物来确定个体中抗独特型抗体的存在。在一些实施方案中，确定个体中一种或多种组织/器官中抗独特型抗体的存在包括确定一种或多种组织/器官中抗独特型抗体的水平或其结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在开始施用所述疗法的第二个剂量或后续剂量后向个体施用抗独特型抗体，并且在一些方面，确定个体中一种或多种组织/器官中抗独特型抗体的存在、不存在或水平，和/或基于观察结果(比如基于在第一次和第二次抗独特型抗体施用之间个体中一种或多种组织/器官中的至少一种中抗独特型抗体水平的差异)调整所述疗法。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些方面，在下列情况下调整所述疗法：(i)如果在施用T细疗法之后在血液或其他生物样品中可检测的T细胞疗法的细胞数在已经可检测之后不可检测或减少(任选地与前一时间点相比减少)；(ii)在开始施用T细胞疗法(任选地第一个、第二个或后续剂量)后，相比于在受试者的血液或生物样品中可检测的T细胞疗法的峰值或最大细胞数，在血液或其他生物样品中可检测的T细胞疗法的细胞数减少(或减少超过)1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；(iii)在受试者的血液中可检测到T细胞疗法的细胞的峰值或最高水平之后的时间，来自受试者的血液中可检测的T细胞或从其衍生的细胞数少于10％、少于5％、少于1％或少于0.1％的在受试者的血液中的总外周血单核细胞(PBMC)；和/或(iv)如果在血液中可检测的细胞疗法的CD3+或CD8+细胞数少于20个细胞/μL、15个细胞/μL、10个细胞/μL、少于5个细胞/μL或少于1个细胞/μL。在一些实施方案中，通过下列方式来调整所述疗法：施用一个或多个额外剂量的CAR-T细胞疗法，施用增加剂量的CAR-T细胞疗法，施用对相同或不同抗原特异的替代CAR-T细胞疗法，施用一种或多种免疫调节剂或促进或增加CAR-T细胞的扩增或持久性的其他药剂。
可以使用本领域已知的用于检测特异性抗体-抗原结合的各种方法。示例性免疫测定法包括荧光偏振免疫测定法(FPIA)、荧光免疫测定法(FIA)、酶免疫测定法(EIA)、比浊抑制免疫测定法(NIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。可以将指示剂模块或标记物基团附着于抗独特型抗体，并且选择为满足所述方法的各种用途的需要，这通常由测定设备的可用性和相容的免疫测定法程序决定。示例性标记物包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H或32P和/或铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(rutheroium)(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、(85Sr)、硫(35S))、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)；酶类(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶或β-半乳糖苷酶)；荧光模块或蛋白质(例如，荧光素、罗丹明、藻红蛋白、GFP或BFP)；或发光模块(例如，由Quantum Dot Corporation,Palo Alto,Calif.提供的QdotTM纳米颗粒)。用于进行上述各种免疫测定法的各种通用技术是已知的。
在一些实施方案中，不需要标记抗独特型抗体，并且可以使用与任何抗独特型抗体结合的标记抗体检测其存在。
本文中提供的抗独特型抗体可用于任何已知的测定方法，比如竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定法。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manualof Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.1987)。
抗独特型抗体还可用于体内诊断测定，比如体内成像。通常，将抗独特型抗体用放射性核素(比如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)标记，使得感兴趣的细胞或组织在施用于个体后可在体内定位。
在一些实施方案中，将抗独特型抗体或抗原结合片段固定或结合至固体支持物，其中使包括CAR-T细胞的一个或多个靶细胞与固体支持物接触。在一些实施方案中，固体支持物是珠子。在一些实施方案中，固体支持物是孔或板(例如细胞培养板)的表面。在一些实施方案中，固体支持物是存在于色谱柱中或包含在色谱柱内的树脂或基质，例如，以允许CAR+T细胞的色谱分离或选择。在一些实施方案中，抗独特型抗体或抗原结合片段可逆地或能够可逆地与固体支持物结合。在一些实施方案中，固体支持物是亲和色谱基质，其包含一个或多个能够与抗独特型抗体中存在的结合配偶体结合(例如，可逆地结合)的结合位点。在一个示例性实施方案中，抗独特型抗体包含链霉亲和素结合肽或其他链霉亲和素结合模块，其能够结合存在于或固定在固体支持物上的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子，在一些情况下，所述结合在竞争物质比如生物素的存在下可以解离。这样的系统的示例包括在美国公开专利申请号US20150024411中描述的那些系统。
在一些方面，本文中提供的抗ID抗体可以在细胞表面上表达。在一些方面，细胞表达的抗ID抗体可用于诱导或刺激表达CAR的细胞，比如用于使CAR细胞选择性生长的系统的一部分。在一些方面，抗ID抗体或其抗原结合片段在人工抗原呈递细胞(aAPC)上表达。表达抗ID的aAPC可用作刺激或扩增CAR T细胞群的试剂。
制备或生成aAPC的方法是已知的，参见例如美国专利No.6,225,042、6,355,479、6,362,001、6,790,662、7,754,482；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；和国际公开号WO2007/103009。各种aAPC是本领域已知的，参见例如美国专利No.8,722,400、公开申请号US2014/0212446；Butler和Hirano(2014)Immunol Rev.,257(1):10.1111/imr.12129；Suhoshki等人(2007)Mol.Ther.,15:981-988)。
aAPC包括天然APC的特征，包括MHC分子、刺激和共刺激分子、Fc受体、粘附分子的表达和/或产生或分泌细胞因子(例如IL-2)的能力。通常，aAPC是缺乏以上一种或多种分子的表达的细胞系，并且通过引入(例如通过转染或转导)刺激细胞(例如CAR-T细胞)必需的一个或多个缺失元件而生成。
在一些实施方案中，被选择成为aAPC的细胞在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHC I类或II类分子-肽加载方面具有缺陷。在一些方面，这样的细胞还缺乏表达MHC I类或II类分子和/或参与或涉及抗原加工的分子的能力。示例性aAPC构成或衍生自与抗原加工(TAP)缺陷细胞系(比如昆虫细胞系)相关的转运体。示例性细胞系是果蝇(Drosophila)细胞系，比如Schneider 2细胞系(参见，例如Schneider,J.Embryol.Exp.Morph.1972Vol 27,pp.353-365)。用于Schneider 2细胞的制备、生长和培养的说明性方法提供于美国专利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001。
在一些实施方案中，细胞是K652细胞或K562衍生的细胞。在一些实施方案中，细胞是可在ATCC No.CCL-243获得的细胞系。
在一些方面，将aAPC进一步工程改造为表达另外的分子，以增强、加强或增进对表达CAR的T细胞的刺激。在一些实施方案中，所述另外的分子是免疫刺激配体、共刺激配体、细胞因子或粘附分子。在一些实施方案中，共刺激配体与存在于T细胞上的至少一种共刺激分子特异性地结合。在一些实施方案中，例如，通过转导或转染生成aAPC，以表达一种或多种共刺激信号(例如CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、3/TR6或B7-H3的配体；或与CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、Toll配体受体或CD83的配体特异性地结合的抗体)、细胞粘附分子(例如ICAM-1或LFA-3)和/或细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、干扰素-α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子-β(TNFβ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、和粒细胞集落刺激因子(GCSF))。在一些情况下，aAPC通常不表达MHC分子，但可被工程改造为表达MHC分子，或者在一些情况下，被诱导或可被诱导为表达MHC分子，比如通过用细胞因子刺激。在一些情况下，aAPC还可以装载刺激或共刺激配体，其可包括例如抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD2抗体。在一些实施方案中，aAPC表达能够介导细胞中的初级信号的分子，比如通过T细胞上的T细胞受体/CD3复合物介导。在一些实施方案中，aAPC包含刺激配体，其与TCR/CD3复合物特异性地结合，从而转导初级信号。
在一些实施方案中，由于抗ID能够通过CAR递送信号，aAPC不表达与TCR/CD3复合物特异性地结合的刺激配体。在一些实施方案中，aAPC不表达共刺激分子。
在一些实施方案中，抗ID表达为在细胞表面上表达的单链片段(scFv)。可以将编码scFV的核酸与编码跨膜结构域的DNA序列融合。特定用途的跨膜区包括衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区的那些。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸。在一些情况下，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成跨膜结构域的每个末端。示例性跨膜结构域包括衍生自CD8或CD28的那些结构域。
B.在细胞刺激中的用途
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体或其抗原结合片段是激动剂和/或表现出刺激表达靶抗体的细胞的特异性活性，所述靶抗体包括含有它的缀合物或嵌合受体，比如抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了涉及使用所提供的抗独特型抗体和含有一种或多种这样的抗独特型抗体的分子(比如缀合物和复合物)用于刺激或激活表达CAR的细胞或表达其他嵌合受体的细胞(比如T细胞)的方法。在一些方面，CAR或其他受体包含靶抗体，比如抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述方法可以与制备基因工程化T细胞的方法结合使用，比如用于扩增基因工程化T细胞或其他细胞的方法中，其中所述细胞中已经例如通过转染、转导或核酸转移的非病毒方式(比如基于转座子的方法)引入了编码包含靶抗体的嵌合受体(比如CAR)的核酸分子。在一些方面，靶抗体是抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，靶抗体是或含有CAR，例如抗CD19 CAR。在具体的实施方案中，抗CD19 CAR含有scFv，所述scFv来自和/或衍生自抗CD19抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63。
一些实施方案中的方法包括将包含用CAR转导的T细胞的样品与抗独特型抗体一起温育。在某些实施方案中，所述方法进一步包括比如通过评估CAR T细胞中的活化标志物的活力、增殖和/或表达来检测CAR T细胞是否被激活或刺激。在一些实施方案中，靶抗体是抗CD19抗体。在一些实施方案中，靶抗体是或衍生自抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了模拟细胞的方法，其包括将包含表达CAR(包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段)的细胞的输入组合物与本文所述的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，由此生成包含刺激细胞的输出组合物。在一些实施方案中，在抗独特型抗体或其抗原结合片段与CAR结合的条件下进行温育，由此诱导或调节在输入组合物的一个或多个细胞中的信号。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞。在一些实施方案中，T细胞包括CD4+和/或CD8+T细胞。
在一些实施方案中，本文中提供了通过将含有表达CAR的细胞的输入组合物与结合和/或识别所述CAR的抗独特型抗体一起温育来刺激或扩增表达CAR的细胞的方法。在一些实施方案中，抗独特型抗体和CAR之间的结合诱导表达CAR的细胞的扩增，由此产生包含扩增细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，将抗独特型抗体与具有一个或多个细胞的输入组合物接触或一起温育以生成输出组合物。在某些实施方案中，输入细胞和/或输入组合物是在对输入组合物的至少一部分细胞将产生一种或多种变化的条件下被(或者期望被)处理、温育或接触的组合物和/或多个细胞，由此将输入组合物转化成输出组合物。在一些实施方案中，输入细胞是免疫细胞的组合物，例如，含有表达CAR的细胞的T细胞的组合物。在具体的实施方案中，通过实施所提供的方法，输入组合物中的至少一部分细胞被激活、扩增和/或富集在所生成的输出组合物中。
在某些实施方案中，抗独特型抗体使输入组合物的表达CAR的细胞扩增或富集。在一些实施方案中，输入组合物包含真核细胞，比如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有人类细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官的细胞。在具体的实施方案中，输入组合物含有免疫系统的细胞，即先天或适应性免疫的细胞，例如髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有干细胞，例如多能和多能性干细胞，包括诱导的多能性干细胞(iPSC)。在具体的实施方案中，输入组合物含有CD3+细胞。在某些实施方案中，输入组合物含有CD4+细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有CD8+细胞。在一些实施方案中，输入组合物是CD4+细胞的组合物。在具体的实施方案中，输入组合物是CD8+细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述方法和药剂能够刺激缺乏或已经下调一种或多种天然信号转导分子但表达被抗Id抗体识别的嵌合受体(例如CAR)的T细胞，所述天然信号转导分子比如一种或多种共刺激受体或抗原受体或细胞因子受体。在一些实施方案中，输入组合物的细胞就CD28或其他共刺激分子或其他信号转导分子的表面表达而言是低的或阴性的。因此，在一些实施方案中，与可能需要或依赖于CD28或其他内源信号转导分子的表面表达的某些其他活化或刺激剂或方法相比，所提供的药剂和方法具有某些优点，其提供期望的信号和/或这种信号的完全程度，例如，提供共刺激信号和/或实现完全激活/在一些实施方案中，与抗CD3/抗CD28试剂(例如珠子)相比，所提供的试剂和方法在这方面是有利的；在一些方面，所提供的抗ID抗体的优点在于能够刺激或实现期望的效果，比如CD28或其他天然信号转导分子是低的或阴性的细胞的活化或增殖。在一些方面，仅使用单一试剂，通过用抗ID抗体刺激，借助于CAR的信号转导经由CAR产生初级信号和二级(共刺激)信号两者。在一些实施方案中，输入组合物包含表达低水平CD28或其他内源信号转导分子的CD3+细胞。在一些实施方案中，输入组合物包含CD3+细胞，其为CD28阴性或为其他内源信号转导分子阴性。在一些实施方案中，抗ID抗体刺激表达低水平CD28的细胞或CD28阴性细胞的活化和/或扩增。在一些实施方案中，使细胞与固定或结合至固体支持物的抗独特型抗体或抗原结合片段接触。在一些实施方案中，固体支持物是珠子。在一些实施方案中，固体支持物是孔或板(例如细胞培养板)的表面。在一些实例中，抗ID抗体是可溶的。在某些实施方案中，在使细胞与抗独特型抗体或抗原结合片段接触之前，细胞不与抗CD3/抗CD28缀合的试剂接触。
在某些实施方案中，将抗独特型抗体施加于已经用编码CAR的核苷酸转导或转染的细胞的输入组合物、与其接触或温育。在具体的实施方案中，将输入细胞用抗独特型抗体温育、处理和/或接触导致表达CAR的细胞的扩增和/或富集。在具体的实施方案中，将输入细胞用抗独特型抗体温育、处理和/或接触并不导致不表达CAR的细胞的扩增和/或富集。在具体的实施方案中，将输入细胞用抗独特型抗体温育、处理和/或接触导致不表达CAR的细胞的扩增和/或富集比表达CAR的细胞的扩增和/或富集减少至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％或至少99.99％。在一些实施方案中，本文中提供的抗独特型抗体用于扩增输入组合物的表达CAR的细胞，所述输入组合物经历了低转导效率和/或低转染效率和/或含有低量表达CAR的细胞。在某些实施方案中，抗独特型抗体选择性地扩增和/或富集表达CAR的细胞。
一些实施方案预期的是，相比于通过借助于多克隆刺激(例如抗CD3和/或抗CD28抗体刺激)来扩增和/或富集细胞，抗独特型抗体对于扩增和/或富集具有低转导效率或低转染效率的输入组合物的细胞和/或具有低量的表达CAR的细胞是更有效的。在具体的实施方案中，多克隆刺激导致输入组合物中表达CAR的细胞和不表达CAR的细胞的扩增，因此，在一些实施方案中，可能不能富集表达CAR的细胞，特别是当输入组合物具有低数量的表达CAR的细胞时。相反，在一些实施方案中，与抗独特型抗体一起温育导致表达CAR的细胞的选择性扩增，因此，在某些实施方案中，将导致表达CAR的细胞的选择性扩增和/或富集。在一些实施方案中，将输入细胞用抗独特型抗体温育、接触和/或处理比通过多克隆刺激导致更多的表达CAR的细胞的富集和/或扩增。
在具体的实施方案中，用抗独特型抗体温育输入细胞、将其施加于输入细胞和/或与输入细胞接触，所述输入细胞相比于通过多克隆刺激扩增和/或富集的输入细胞经过较低量的病毒颗粒转染和/或转导，其具有较低的病毒载体颗粒拷贝与细胞的比例和/或较低的感染单位(IU)。例如，在一些实施方案中，用抗独特型抗体温育的输入组合物是用比通过多克隆刺激扩增和/或富集的输入组合物少(或至少少)0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60个IU/细胞的病毒载体颗粒转导的细胞生成的。在一些实施方案中，用抗独特型抗体温育的输入组合物是用比通过多克隆刺激扩增和/或富集的输入组合物少(或至少少)1x105IU/mL、5x 105IU/mL、1x 106IU/mL、5x 10 6IU/mL、6x 106IU/mL、7x 106IU/mL、8x 106IU/mL、9x 106IU/mL或1x 107IU/mL滴度的病毒载体颗粒转导的细胞生成的。
在具体的实施方案中，具有高IU/细胞的转导细胞将导致高转导效率，但是在一些实施方案中，也可能导致具有高载体拷贝数(VCN)的转染细胞，其可能存在安全风险并且可能不符合监管标准。在具体的实施方案中，降低细胞被转导的IU/细胞将降低转导效率，但会降低VCN。在具体的实施方案中，增加细胞被转导的IU/细胞将提高转导效率，但也将增加VCN。
在一些实施方案中，输入组合物含有已经用一个或多个编码被抗独特型抗体结合或识别的CAR的核酸转导或转染的细胞群、或衍生自已经被转导或转染的细胞的细胞。在一些实施方案中，输入组合物含有少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％或少于1％的表达CAR的细胞。在具体的实施方案中，来自输入组合物的细胞已被转染或转导，如第III部分中所述。在某些实施方案中，输入细胞含有已经用编码抗CD19 CAR(比如含有scFv的抗CD19CAR)的一个或多个核酸转导或转染的细胞群、或衍生自已经被转导或转染的细胞的细胞，所述scFv来自和/或衍生自抗CD19抗体(如抗体SJ25C1或FMC63)。
在具体的实施方案中，在用于刺激、扩增和/或活化细胞的条件下用抗独特型抗体进行输入组合物的细胞的温育、接触或处理，所述条件可包括下列一种或多种：特定的介质、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、作用剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的作用剂。
在一些实施方案中，输入组合物的细胞已经用包含编码CAR的基因的一种核酸转染或转导，并且将所述细胞用结合或识别重组受体的抗独特型抗体接触、温育或处理。在一些实施方案中，在输入组合物的细胞转导或转染编码CAR的核酸之后，将所述细胞用抗独特型抗体处理、温育或接触。在具体的实施方案中，在输入组合物的细胞已经被转导或转染之后立即、约1分钟内、约5分钟内、约30分钟内、约1小时内、约2小时内、约4小时内、约6小时内、约8小时内、约12小时内、约24小时内、约2天内、约3天内、约4天内、约5天内、约6天内、约1周内、约2周内、约3周内、约4周内、约5周内或约6周内用抗独特型抗体处理、温育或接触输入组合物的细胞。
在一些实施方案中，将输入组合物的细胞用可溶性抗独特型抗体处理、温育和/或接触，与未交联的抗体接触和/或与未结合或附着于固体支持物的抗体接触。
在一些实施方案中，所述方法导致表达嵌合受体(比如被抗独特型抗体识别的CAR)的细胞的增殖、活化、刺激、细胞因子释放或其他功能性结果，比如活化标志物的上调或细胞因子释放或产生。在一些方面，在这样的细胞中诱导这种增殖或其他功能性反应或读出的程度与通过将细胞用刺激T细胞增殖的药剂和/或条件(比如抗CD3/CD28珠和/或交联的抗CD3)温育诱导的程度相似或更大。在一些方面，所述方法不涉及抗独特型抗体的交联。在任何实施方案的一些方面，在没有交联抗独特型抗体的情况下，抗独特型药剂能够诱导特定的增殖或其功能性结果或程度。在一些方面，本文中的抗独特型药剂在刺激或引起表达靶受体的T细胞或其他免疫细胞的特定功能性结果的能力方面是有利的，而不需要交联抗Id抗体或使用第二药剂。在一些方面，用可溶性或平板结合形式的抗独特型抗体实现结果。在一些方面，用与珠子偶联的抗独特型抗体实现结果。
在具体的实施方案中，以10pg/ml至100μg/ml、1pg/ml至1ng/ml、1ng/ml至1μg/l、100ng/ml至1.0μg/ml、1ng/ml至100ng/ml、10ng/ml至1.0μg/ml、100ng/ml至10pg/ml、250ng/ml至10μg/ml、250pg/ml至1ng/ml、1μg/ml至10μg/ml、250ng至约2.5μg/ml、或1μg/ml至10μg/ml处理、温育和/或接触输入组合物的细胞。
在一些实施方案中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至固体支持物，所述固体支持物任选地包含或缀合至包含多个结合位点的试剂，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。在一些实施方案中，固体支持物是板或孔的表面。在一些实施方案中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至可溶性试剂，所述可溶性试剂任选地是或包含多个结合位点，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。在一些实施方案中，所述试剂包括链霉亲和素突变蛋白。在一个示例性实施方案中，抗独特型抗体包含链霉亲和素结合肽或其他链霉亲和素结合模块，其能够结合存在于或固定在可溶性试剂上的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子，在一些情况下，所述结合在竞争物质比如生物素的存在下可以解离。这样的系统的示例包括在PCT公开专利申请号WO2015/158868中描述的那些系统。
在具体的实施方案中，将输入组合物的细胞用抗独特型抗体处理、温育和/或接触，所述抗独特型抗体附着、结合、包被和/或缀合到固体表面或支持物(例如板或孔)上。在某些实施方案中，通过将固体表面或支持物与一定浓度的抗独特型抗体一起温育，将抗独特型抗体附着、结合、包被和/或缀合到固体表面或支持物上。在具体的实施方案中，固体表面或支持物与10ng/ml至100μg/ml、100ng/ml至1.0μg/ml、250ng/ml至10μg/ml、250ng/ml至1μg/ml、1μg/ml至10μg/ml、250ng/ml至2.5μg/ml或1μg/ml至10μg/ml的抗独特型抗体一起温育。在一些实施方案中，将固体表面或支持物与250ng/ml至10μg/ml的抗独特型抗体一起温育。在某些实施方案中，将固体表面或支持物与(或与约)0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml或10μg/ml的抗独特型抗体一起温育。
在一些实施方案中，温育至少或约至少5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。在一些实施方案中，作为组合物中总细胞的百分比，输入组合物包含少于或少于约60％、少于或少于约50％、少于或少于约40％、少于或少于约30％、少于或少于约20％或少于或少于约10％的表达CAR的细胞。在一些实施方案中，与输入组合物中表达CAR的细胞数相比，输出组合物中表达CAR的细胞数增加大于1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；和/或与组合物中的总细胞相比，输出组合物中表达CAR的细胞的百分比增加大于10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在一些实施方案中，在温育之前，未针对细胞选择或富集表达CAR的细胞。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在某些实施方案中，用抗独特型抗体接触或温育来自输入组合物的细胞(例如包含表达CAR的细胞)持续一定的时间量，以扩增输入组合物的一个或多个细胞，比如扩增表达重组受体的输入组合物的细胞。在具体的实施方案中，用抗独特型抗体接触、温育或处理来自输入组合物的细胞至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、或至少约4周。在具体的实施方案中，用抗独特型抗体接触、温育或处理来自输入组合物的细胞少于约1天、少于约2天、少于约3天、少于约4天、少于约5天、少于约6天、或少于或少于约12天。在一些实施方案中，用抗独特型抗体接触、温育或处理来自输入组合物的细胞约1天至约14天、约3天至7天、或4天至6天。
在具体的实施方案中，在高于室温的温度下用抗独特型抗体温育、接触或处理来自输入组合物的细胞，例如包含表达CAR的细胞，以扩增表达重组受体的输入组合物的细胞。在一些实施方案中，处理、温育或接触在高于约25℃的温度下进行，比如通常高于或高于约32℃、35℃或37℃。在一些实施方案中，处理、接触或温育在或在约37℃±2℃的温度比如在或在约37℃的温度下进行。
在一些实施方案中，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％、至少99.9％、约100％或100％的输出组合物的细胞表达CAR。
在具体的实施方案中，在用抗独特型抗体温育、处理和/或接触的输出组合物中表达CAR的细胞数比输入组合物中表达CAR的细胞数高至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在具体的实施方案中，在用抗独特型抗体温育、处理和/或接触的输出组合物中表达CAR的细胞的百分比比输入组合物中表达CAR的细胞数高至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在一些实施方案中，在用抗独特型抗体温育、处理和/或接触的输出组合物中表达CAR的细胞数比接受多克隆刺激(用抗CD3和抗CD28抗体温育)的输出组合物中的细胞数高至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在某些实施方案中，在用抗独特型抗体温育、处理和/或接触的输出组合物中表达CAR的细胞的百分比比接受多克隆刺激(用抗CD3和抗CD28抗体温育)的输出组合物中的细胞数高至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在一些实施方案中，相比于接受多克隆刺激(例如用抗CD3和抗CD28抗体温育)的输出组合物的细胞，在用抗独特型抗体温育、处理和/或接触的输出组合物中的表达CAR的细胞含有低至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、或至少99％的VCN。在一些实施方案中，输出组合物中表达CAR的细胞的平均VCN不超过或不超过约10、5、4、2.5、1.5或1。
在一些实施方案中，这样的方法可用作制造、分析和/或质量控制方法的一部分，其例如与细胞疗法(比如CAR T细胞)的产生相关联，所述细胞表达含有被抗独特型抗体识别的抗体或其片段的重组多肽，所述方法用于测试目的，包括测试工程化受体在例如经工程改造用于个体的疗法的细胞中的表达和/或效力。在某些实施方案中，可以在生成表达CAR的T细胞的过程中的任何阶段测试细胞组合物。在具体的实施方案中，可以在该过程的任何阶段从细胞组合物中收集细胞样品，并且例如通过冻存和/或冷冻保存来储存，用于以后的测试和/或分析。所测试的组合物可以是药物组合物，例如包括含有细胞和药学上可接受的赋形剂(recipient)和/或冷冻保存剂的那些。
在一些实施方案中，抗独特型抗体在体内刺激表达靶抗体(例如CAR)的细胞。具体实施方案预期的是，CAR-T细胞疗法在癌症和其他疾病和病症的治疗中是有效的。然而，在某些情况下，CAR-T细胞疗法的可用方法可能并不总是完全令人满意。例如，在一些实施方案中，受试者中表达CAR的细胞的暴露和持久性随时间降低或下降。然而，观察结果表明，在一些情况下，表达CAR的细胞的暴露增加可以改善CAR-T细胞疗法的功效和治疗结果。因此，在一些实施方案中，施用抗独特型抗体以增强、增进和/或增加表达CAR的细胞的持久性和/或扩增。
在某些实施方案中，将抗独特型抗体施用于受试者，比如先前已施用含有表达CAR的细胞的治疗性细胞组合物的受试者。在一些实施方案中，向受试者施用抗独特型抗体促进受试者中表达CAR的细胞的再扩增，在一些情况下，其可以在施用抗独特型抗体之前达到或超过初始峰值扩增水平。在一些实施方案中，当表达CAR的细胞的水平下降或不可检测时，施用抗独特型抗体以调节表达CAR的细胞的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，例如，与施用抗独特型抗体之前的效力相比，通过抗独特型抗体再扩增的表达CAR的细胞在施用它的受试者中表现出增加的效力。
在某些实施方案中，抗独特型抗体的施用增加或增强了受试者中表达CAR的细胞的持久性。在一些实施方案中，在施用抗独特型抗体后(或至少)7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或超过6个月，在受试者中可检测到表达CAR的细胞。在一些方面，受试者对细胞的暴露增加包括细胞的扩增和/或扩增增加。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞在施用抗独特型抗体后在受试者中扩增。在具体的实施方案中，施用抗独特型抗体导致受试者的血液或血清或其他体液或器官或组织中的最大浓度为每微克DNA至少100、500、1000、1500、2000、5000、10,000或15,000个编码CAR的核酸拷贝，或每微升至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9个表达CAR的细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞被检测为受试者血液中总PBMC的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％，和/或以这样的水平在施用抗独特型抗体后持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48周或52周，或在施用抗独特型抗体后持续1、2、3、4、5年或更多年。在一些方面，施用抗独特型抗体导致例如受试者的血清、血浆、血液或组织(例如肿瘤样品)中每微克DNA编码重组受体(例如，CAR)的核酸拷贝增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。在具体的实施方案中，施用抗独特型抗体导致在受试者中循环的表达CAR的细胞数增加至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少20倍。
在一些方面，施用抗独特型抗体后，至少约1x 102、至少约1x 103、至少约1x 104、至少约1x 105、或至少约1x 106或至少约5x 106或至少约1x 107或至少约5x 107或至少约1x108个表达CAR的细胞和/或每微升至少10、25、50、100、200、300、400或500个或1000个(例如每微升至少10个)表达CAR的细胞是可检测的或存在于受试者或其液体、血浆、血清、组织或区室中，比如在血液中，例如在外周血或疾病部位中。在一些实施方案中，施用抗独特型抗体后至少约20天、至少约40天、或至少约60天，或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11个月或12个月，或至少2年或3年，在受试者中可检测到这样的数量或浓度的细胞。
各种递送系统是已知的并且可用于施用抗独特型抗体。在某些实施方案中，通过包封在脂质体、微粒和微胶囊中和/或附着于其上来施用抗独特型抗体。施用抗独特型抗体的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任何合宜的途径施用抗独特型抗体，例如，输注、快速注射、经上皮或粘膜(例如口腔、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器，以及用雾化剂配制。在某些实施方案中，将抗独特型抗体在囊泡中递送，特别是脂质体(Langer,1990,Science 249:1527-1533)，例如阳离子脂质体(WO 98140052)。
在一些实施方案中，提供了产生细胞组合物的方法，所述方法包括将编码CAR的核酸分子引入到细胞中，由此生成输入组合物，并且将所述输入组合物与对CAR的抗原结合结构域特异的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，由此产生细胞组合物。在一些实施方案中，CAR包含与CD19特异性地结合的靶抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体是抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是本文所述的抗独特型抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是CAR的激动剂。在一些实施方案中，引入包括通过病毒转导、转座、电穿孔或化学转染将核酸分子引入到细胞中。在一些实施方案中，引入包括通过用包含核酸分子的逆转录病毒载体转导、通过用包含核酸分子的慢病毒载体转导、通过用包含核酸分子的转座子转座、或通过包含核酸分子的载体的电穿孔或转染将所述核酸分子引入到细胞中。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在引入编码CAR的核酸分子之前刺激或激活细胞的步骤。在一些实施方案中，激活细胞包括使细胞与CD3激动剂和任选的CD28激动剂接触。在一些实施方案中，激活细胞包括使细胞与包含激动性抗CD3抗体和抗CD28抗体的试剂接触。在一些这样的实施方案中，在与抗CD3/抗CD28接触的至少一部分期间和/或在引入编码CAR的核酸的至少一部分期间，所述方法包括将细胞与抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育或接触。在一些实施方案中，在抗独特型抗体或其抗原结合片段与CAR结合的条件下进行温育，由此诱导或调节在输入组合物的一个或多个细胞中的信号。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞。
在一些这样的实施方案中，T细胞包括CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至固体支持物，所述固体支持物任选地包含或缀合至包含多个结合位点的试剂，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。在一些实施方案中，将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至可溶性试剂，所述可溶性试剂任选地是或包含多个结合位点，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。在一些实施方案中，所述试剂包括链霉亲和素突变蛋白。在一个示例性实施方案中，抗独特型抗体包含链霉亲和素结合肽或其他链霉亲和素结合模块，其能够结合存在于或固定在可溶性试剂上的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子，在一些情况下，所述结合在竞争物质比如生物素的存在下可以解离。这样的系统的示例包括在PCT公开专利申请号WO2015/158868中描述的那些系统。在一些实施方案中，温育至少或约至少5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。在一些实施方案中，作为组合物中总细胞的百分比，输入组合物包含少于或少于约60％、少于或少于约50％、少于或少于约40％、少于或少于约30％、少于或少于约20％或少于或少于约10％的表达CAR的细胞。在一些实施方案中，与输入组合物中表达CAR的细胞数相比，输出组合物中表达CAR的细胞数增加大于1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；和/或与组合物中的总细胞相比，输出组合物中表达CAR的细胞的百分比增加大于10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在一些实施方案中，在温育之前，未针对细胞选择或富集表达CAR的细胞。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了监测CAR活性的方法，所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括下列步骤：将包含用CAR转导的T细胞的样品与靶向或结合所述CAR的激动性抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育；和/或确定CAR T细胞的激活、刺激和/或扩增的存在、不存在或量，由此监测CAR-T细胞的活性。在一些实施方案中，这样的方法可用于验证CAR，在这种情况下，所述方法可包括c)基于CAR-T细胞的激活、刺激和/或扩增水平验证CAR。
在一些实施方案中，通过在与抗独特型抗体温育一段时间后确定CAR T细胞中T细胞活化标志物的活力、增殖和/或表达来评估CAR T细胞的激活、刺激和/或扩增。在一些实施方案中，通过计算与抗独特型抗体温育后用CAR转导的活T细胞与总T细胞的百分比来评估CAR T细胞的活力。在一些实施方案中，通过染料稀释来评估CAR T细胞的增殖，在与抗独特型抗体温育之前使用所述染料将CAR T细胞染色。在一些实施方案中，通过流式细胞术以及针对识别T细胞活化标志物的抗体的染色来评估T细胞活化标志物的表达。在一些实施方案中，T细胞活化标志物选自下组，该组的组成为：CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD69、CD71、CD134、CD137和CD154。在一些实施方案中，温育时间为约1天至约10天(比如约1、2、3、4、5、6、7、8、9天或10天中的任一者，包括在这些值之间的任何范围))。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了监测CAR T细胞制剂的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括a)将所述制剂的一部分与靶向或结合所述CAR的激动性抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育；和b)确定CAR T细胞的激活、刺激和/或扩增的存在、不存在或量。在一些实施方案中，CAR-T细胞制剂可以是在期望待测试的特定条件下产生或制造的细胞。在一些实施方案中，与放行测定(releaseassay)相结合进行监测，比如用于在施用于受试者之前验证所述细胞。在一些方面，所述方法进一步包括c)基于CAR T细胞的活化水平来验证所述制剂。在一些实施方案中，通过在与抗独特型抗体温育一段时间后确定CAR T细胞中T细胞活化标志物的活力、增殖和/或表达来评估所述制剂中CAR T细胞的激活。在一些实施方案中，通过计算与抗独特型抗体温育后用CAR转导的活T细胞与总T细胞的百分比来评估CAR T细胞的活力。在一些实施方案中，通过染料稀释来评估CAR T细胞的增殖，在与抗独特型抗体温育之前使用所述染料将CAR T细胞染色。在一些实施方案中，通过流式细胞术以及针对识别T细胞活化标志物的抗体的染色来评估T细胞活化标志物的表达。在一些实施方案中，T细胞活化标志物选自下组，该组的组成为：CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD69、CD71、CD134、CD137和CD154。在一些实施方案中，温育时间为约1天至约10天(比如约1、2、3、4、5、6、7、8、9天或10天中的任一者，包括在这些值之间的任何范围))。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
C.在细胞失活/耗竭中的用途
在一些实施方案中，所提供的抗独特型抗体或其抗原结合片段是拮抗剂和/或表现出抑制、消融和/或耗竭(例如，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤)表达靶抗体的细胞的特异性活性，所述靶抗体比如抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段。还提供了涉及使用所提供的抗独特型抗体和含有一种或多种这样的抗独特型抗体的分子(比如缀合物和复合物)用于CAR T细胞的失活、消融和/或耗竭的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗CD19抗体(例如，抗体SJ25C1或FMC63)或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述方法包括用抗独特型抗体处理、接触和/或温育包含用CAR转导的T细胞和的组合物和/或样品。在某些实施方案中，所述方法进一步包括比如通过评估CAR T细胞中的活化标志物的活力、增殖和/或表达来检测CAR T细胞是否被失活。在一些实施方案中，所述方法与包括施用CAR T细胞的疗法相关联。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用抗独特型抗体。在一个实施方案中，抗独特型抗体或缀合物用于消融和/或耗竭(比如杀伤)个体中的CAR T细胞。在一些实施方案中，靶抗体是抗CD19抗体。在一些实施方案中，靶抗体是或衍生自抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ IDNO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ IDNO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，施用抗独特型抗体以耗竭、降低和/或减少受试者中表达CAR的细胞的数目。在具体的实施方案中，施用抗独特型抗体耗竭、降低和/或减少了至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％、100％或约100％的表达CAR的细胞(例如，循环CAR-T细胞)的量。在某些实施方案中，耗竭、降低和/或减少与施用抗独特型抗体之前受试者中表达CAR的细胞的量有关。在具体的实施方案中，耗竭、降低和/或减少与未施用抗独特型抗体的受试者中表达CAR的细胞的量有关。在一些实施方案中，在施用抗独特型抗体后，在受试者中检测不到表达CAR的细胞。在具体的实施方案中，抗独特型抗体是人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，提供了使CAR T细胞失活的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括将包含CAR T细胞的样品与靶向CAR的拮抗性抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，由此使样品中的CAR T细胞失活。在一些实施方案中，以足以减弱样品中CAR T细胞激活的量使用抗独特型抗体。在一些实施方案中，以足以基本上使样品中CAR T细胞失活的量使用抗独特型抗体。在一些实施方案中，与抗独特型抗体一起温育导致样品中CAR T细胞的消融和/或耗竭。在一些实施方案中，以足以导致样品中CAR T细胞清除的量使用抗独特型抗体。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，施用抗独特型抗体以耗竭、降低和/或减少受试者中CAR和/或表达CAR的细胞的活性。在具体的实施方案中，施用抗独特型抗体降低和/或减少了至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％、100％或约100％的CAR和/或表达CAR的细胞的刺激和/或激活。在某些实施方案中，降低和/或减少与施用抗独特型抗体之前受试者中CAR和/或表达CAR的细胞的刺激和/或活性有关。在具体的实施方案中，降低和/或减少与未施用抗独特型抗体的受试者中CAR和/或表达CAR的细胞的刺激和/或活性有关。在一些实施方案中，活性和/或刺激是指CAR受体或CAR T细胞活性的一个或多个方面，并且可以通过任何适合的已知手段评估，包括通过本文中提供的任何手段。在一些实施方案中，在施用抗独特型抗体后，在受试者中检测不到CAR和/或表达CAR的细胞的活性和/或刺激。在具体的实施方案中，抗独特型抗体是人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，施用抗独特型抗体以预防、降低和/或减少CAR和/或表达CAR和细胞与抗原的结合和/或结合能力。在具体的实施方案中，施用抗独特型抗体降低和/或减少了至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％、100％或约100％的CAR和/或表达CAR的细胞的抗原结合。在某些实施方案中，降低和/或减少与施用抗独特型抗体之前受试者中CAR和/或表达CAR的细胞的抗原结合和/或与抗原结合的能力有关。在具体的实施方案中，降低和/或减少与未施用抗独特型抗体的受试者中CAR和/或表达CAR的细胞的抗原结合和/或结合抗原的能力有关。在具体的实施方案中，抗独特型抗体是人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，提供了消融和/或耗竭(例如杀伤)CAR T细胞的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括将包含CAR T细胞的样品与靶向CAR的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，由此消融和/或耗竭样品中的CAR T细胞。在一些实施方案中，消融和/或耗竭是借助于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，以足以导致样品中基本上所有CAR T细胞消融和/或耗竭的量使用抗独特型抗体。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ IDNO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ IDNO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了调整个体中CAR T细胞疗法的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括向个体施用靶向CAR的拮抗性抗独特型抗体或其抗原结合片段，由此使CAR T细胞失活。在一些实施方案中，以足以减弱个体中CAR T细胞激活的量施用抗独特型抗体。在一些实施方案中，以足以基本上使个体中CAR T细胞失活的量施用抗独特型抗体。在一些实施方案中，施用抗独特型抗体导致个体中CAR T细胞的消融和/或耗竭。在一些实施方案中，以足以导致个体中CAR T细胞清除的量施用抗独特型抗体。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在一些实施方案中，提供了调整个体中CAR T细胞疗法的方法，其中所述CAR包含靶抗体，比如抗体SJ25C1或FMC63或其抗原结合片段，所述方法包括向个体施用靶向CAR的抗独特型抗体免疫缀合物，其中所述抗独特型抗体免疫缀合物包含细胞毒性剂。在一些实施方案中，以足以减弱个体中CAR T细胞疗法的量施用抗独特型抗体免疫缀合物。在一些实施方案中，以足以基本上停止个体中CAR T细胞疗法的量施用抗独特型抗体免疫缀合物。在一些实施方案中，以足以导致个体中CAR T细胞清除的量施用抗独特型抗体免疫缀合物。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂选自下组，该组的组成为：化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白毒素、酶促活性毒素或其片段)和放射性同位素。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。在一些实施方案中，靶抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
在结合测定法或方法中的用途
本文中提供了用于评估样品中分子的存在或不存在的方法，所述分子与嵌合抗原受体(CAR)比如CAR的细胞外结构域或其含有抗原结合结构域的部分结合。在一些实施方案中，所述方法可用于评估受试者中对所施用的包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞疗法的体液应答或抗体应答的存在或不存在。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含靶抗体，所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含靶抗体，所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段。在一些实施方案中，对CAR(比如本文所述的任何一种)的细胞外结构域特异的抗独特型抗体或其抗原结合片段，可以用作所述方法中的阳性对照。
在具体的实施方案中，所述方法包括使样品与对CAR的细胞外结构域特异的抗独特型抗体或其抗原结合片段接触，其中抗独特型抗体的浓度为10ng/ml至100μg/ml、100ng/ml至1.0μg/ml、250ng/ml至10μg/ml、250ng/ml至1μg/ml、1μg/ml至10μg/ml、250ng至2.5μg/ml或1μg/ml至10μg/ml。在一些实施方案中，抗独特型抗体的浓度为250ng/ml至10μg/ml。在某些实施方案中，抗独特型抗体的浓度为约0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml的抗独特型抗体。
在一些方面，过继细胞疗法可能与受试者中对所施用的细胞和/或构建体的免疫应答的发展相关。例如，在一些情况下，暴露于嵌合受体可能受到针对所施用细胞表达的重组受体的宿主免疫应答的限制，所述宿主免疫应答可能过早地消除所施用的细胞。观察到的是，即使在具有B细胞恶性肿瘤的通常是免疫受损的某些受试者中，也可以检测到对过继细胞疗法中施用的细胞表达的受体区特异的免疫应答。例如，被施用了用CAR基因工程改造的细胞的受试者(例如人类受试者)可以产生针对嵌合区的免疫原性区域的特异性免疫应答，所述疫原性区域包括可含有非人序列(例如鼠scFv)的区域和/或含有在嵌合受体的两个结构域或部分(例如CAR的跨膜和共刺激结构域)之间的连接的区域。
在一些实施方案中，提供了涉及使结合试剂与来自受试者的样品接触或一起温育的方法，所述受试者已经被施用包含嵌合抗原受体工程改造的细胞的细胞疗法，其中所述结合试剂是包含CAR的细胞外结构域或其部分(含有靶抗体或其抗原结合片段)的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测在结合试剂和存在于样品中的分子例如结合分子(比如抗体)之间是否形成复合物，和/或检测这种结合的存在或不存在或水平。在某些实施方案中，在允许结合试剂与来自受试者的样品中存在的分子结合的条件下接触或温育。在某些方面，所述方法可进一步在阳性对照样品上进行，所述阳性对照样品含有对如所述的任何CAR特异的抗独特型抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，确定所述分子与结合试剂结合的存在、不存在或水平可包括：将所述结合或检测与阳性对照样品与结合试剂的结合或检测进行比较。
在一些实施方案中，细胞疗法是或包含表达抗CD19 CAR的基因工程化细胞，所述抗CD19 CAR包含靶抗体(为抗体SJ25C1的或其抗原结合片段)，其中所述结合试剂包含CAR的细胞外结构域或其部分(包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，阳性对照包括如I.A小节中所述的抗独特型抗体。
在一些实施方案中，细胞疗法是或包含表达抗CD19 CAR的基因工程化细胞，所述抗CD19 CAR包含靶抗体(为抗体FMC63的或其抗原结合片段)，其中所述结合试剂包含CAR的细胞外结构域或其部分(包含FMC63抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，阳性对照包括如I.B小节中所述的抗独特型抗体。
在一些实施方案中，所述方法包括检测在结合试剂和存在于样品中的分子例如结合分子(比如抗体)之间是否形成复合物，和/或检测这种结合的存在或不存在或水平。在某些实施方案中，在允许结合试剂与来自受试者的样品中存在的分子结合的条件下接触或温育。在一些方面，通过免疫测定法，任选地夹心测定法或桥接测定法来检测复合物。例如，免疫测定法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光、电化学发光、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如BIAcore)、流式细胞术或Western印迹。在一些实施方案中，免疫测定法是或包括中尺度发现。
在一些方面，免疫测定法是夹心测定法或桥接测定法。在夹心或桥接测定法中，所述结合试剂是第一结合试剂，并且检测分子或包含所述分子的复合物的存在或不存在包括：使第一结合试剂和分子形成的复合物与第二结合试剂接触，其中所述第二结合试剂是能够与第一结合试剂结合相同或相似分子的试剂。在一些实施方案中，第二结合试剂包含CAR的细胞外结构域或其部分。在一些方面，第一结合试剂和第二结合试剂的CAR细胞外结构域或其部分是相同或基本相同的。
在一些实施方案中，所述结合试剂(比如第一和/或第二结合试剂)经过可检测标记或能够产生可检测信号。所述结合试剂(比如第一和/或第二结合试剂)直接或间接地与可检测标记物连接。在一些实施方案中，可检测标记物是或包括荧光标记物、化学发光标记物、电致发光标记物、比色标记物、生物发光标记物或放射性标记物。在一些实施方案中，所述结合试剂(比如第一和/或第二结合试剂)直接或间接地与SULFO标签连接。在一些实施方案中，第一和第二结合试剂中的至少一者经过可检测标记或能够产生可检测信号，并且第一和第二结合试剂中的另一者附着或固定到固体支持物上。在一些方面，第一结合试剂附着或固定到固体支持物上或能够附着或固定到固体支持物上。将结合试剂直接或间接地附着到固体支持物上的方法是本领域熟知的。附着方法通常包括结合试剂到固体支持物上的非特异性吸附或结合试剂(通常通过游离胺基)与固体支持物上的化学反应性基团(比如活化的羧基、羟基或醛基)的共价附接。附着方法还包括将结合试剂间接附着到固体支持物上，例如通过用捕获试剂(比如链霉亲和素)包被固体支持物，并将亲和标记的结合试剂(比如生物素标记的试剂)添加到固体支持物上，使得在亲和标记物(例如，生物素)和捕获试剂(例如链霉亲和素)之间的相互作用将结合试剂连接到固体支持物上。在一些实施方案中，第一结合试剂直接或间接地与生物素连接。在一些实例中，第一可溶性试剂与包被有链霉亲和素的固体支持物结合。在一些实施方案中，第二结合试剂直接或间接地与可检测标记物(任选地SULFO标签)连接。
在具体的实施方案中，使样品与第一结合试剂接触，所述第一结合试剂附着、结合、包被和/或缀合至固体表面或支持物(例如板或孔)上。在某些实施方案中，通过将结合试剂间接附着到固体支持物而将第一结合试剂附着、结合、包被和/或缀合至固体表面或支持物上，例如通过用捕获试剂(比如链霉亲和素)包被固体支持物，并将亲和标记的结合试剂(比如生物素标记的试剂)添加到固体支持物上，使得在亲和标记物(例如，生物素)和捕获试剂(例如链霉亲和素)之间的相互作用将结合试剂连接到固体支持物上。在一些实施方案中，使样品与第二结合试剂接触，所述第二结合试剂直接或间接地与SULFO标签连接。在具体的实施方案中，第一和/或第二结合试剂的使用浓度为：10ng/ml至100μg/ml、100ng/ml至1.0μg/ml、250ng/ml至10μg/ml、250ng/ml至1μg/ml、1μg/ml至10μg/ml、250ng/ml至2.5μg/ml或1μg/ml至10μg/ml的抗独特型抗体。在一些实施方案中，将固体表面或支持物与250ng/ml至10μg/ml的抗独特型抗体一起温育。在某些实施方案中，将固体表面或支持物与(或与约)0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml或10μg/ml的抗独特型抗体一起温育。
在一些实施方案中，来自已经被施用包含嵌合抗原受体工程改造的细胞的细胞疗法的受试者的样品是或包含来自受试者的任何体液样品。在一些方面，样品是或包含全血、血清或血浆。在一些实施方案中，在开始施用细胞疗法或细胞剂量之后(或之后约)1小时至1年内，比如在(或约)6小时、12小时、24小时、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或十二个月内从受试者获得样品。在一些方面，在开始施用细胞疗法之后(或约)1个月至6个月，比如在开始施用细胞疗法之后2个月至6个月或2个月至4个月，例如约或大约2个、3个月、4个月、5个月或6个月，从受试者获得样品。
制品
还提供了含有所提供的抗独特型抗体和/或组合物的制品或试剂盒。在一些实施方案中，提供了包含抗独特型抗体或其抗原结合片段的制品。在一些情况下，抗独特型抗体结合抗CD19抗体或其抗原结合片段、或包含抗CD19抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。在一些实例中，抗CD19抗体是SJ25C1或FMC63。在一些方面，在制品或试剂盒中提供了含有本文所述的抗独特型抗体的缀合物。
在一些实施方案中，试剂盒或制品包含抗独特型抗体或其抗原结合片段和结合试剂，所述结合试剂含有所述独特型抗体所结合(比如特异性地结合)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域或细胞外结构域的部分。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域是或包含抗CD19抗体(例如，FMC63或SJ25C1)或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述结合试剂是第一结合试剂，并且所述试剂盒或制品另外包含第二结合试剂。在这样的实例中，第二结合试剂是能够与第一结合试剂结合相同或相似分子的试剂。在一些实施方案中，第二结合试剂包含CAR的细胞外结构域或其部分。在一些方面，第一结合试剂和第二结合试剂的CAR细胞外结构域或其部分是相同或基本相同的。
在一些实施方案中，结合试剂或第一和第二结合试剂中的至少一者与标记物(例如可检测标记物)比如本文所述的标记物附接。在一些实施方案中，第一和第二结合试剂中的至少一者附着于固体支持物或能够附着于固体支持物，比如本文所述的固体支持物。在一些方面，第一和第二结合试剂之一经过可检测标记或能够产生可检测信号，并且第一和第二结合试剂中的另一者附着或固定到固体支持物上。在一些实施方案中，作为试剂盒或作为本文其他地方所述的系统的一部分提供结合试剂，其用于与免疫测定法(例如夹心或桥接测定法)结合使用。在一些实施方案中，第一结合试剂与固体支持物，任选地与链霉亲和素包被的固体支持物结合。在一些实施方案中，第二可溶性蛋白直接或间接地与可检测标记物(比如SULFO标签)连接。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含抗独特型抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗独特型抗体结合抗CD19抗体或其抗原结合片段、或包含抗CD19抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体。在一些实例中，抗CD19抗体是SJ25C1或FMC63。在一些实施方案中，提供抗独特型抗体或其抗原结合片段作为阳性对照样品。在一些实例中，阳性对照样品与第一和第二可溶性蛋白或试剂形成复合物，所述蛋白质或试剂含有嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域的区域，所述CAR包含CD19抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，试剂盒或制品包含用于实施任何提供的方法的试剂或组分。在一些实施方案中，制品或试剂盒包含立足于商业、治疗和用户立场所需的一种或多种试剂或其他物质，包括二级抗体、亲和标记物、捕获试剂、缓冲剂、稀释剂、信号检测剂、过滤器、针头、注射器、毛细管和具有使用说明的包装说明书。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以作为包括包装材料的制品提供，所述包装材料用于包装抗体或其组合物或一种或多种另外的试剂，例如结合试剂或组分。例如，试剂盒可包括容器、瓶子、管、小瓶和适合于分隔或组织试剂盒组分的任何包装材料。
在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器。适合的容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(比如单室或双室注射器)和试管。可以由各种材料比如玻璃或塑料形成一个或多个容器。所述一个或多个容器容纳在所述方法中使用的包含抗体或其他试剂(例如，结合试剂)的组合物。本文中的制品或试剂盒可包含在分开的容器中或在同一个容器中的抗体或试剂。在一些实施方案中，容纳组合物的一个或多个容器可以是一次性小瓶或多次使用的小瓶，在一些情况下，其可以允许重复使用复原的组合物。
在一些实施方案中，制品或试剂盒可进一步包括包含适合的稀释剂的第二容器。制品或试剂盒可以进一步包括立足于商业、治疗和用户立场所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器、治疗剂和/或具有使用说明的包装说明书。
制品可以包括容器和标签或在容器上或与容器相关联的包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。在一些实施方案中，容器容纳含有本文中提供的抗独特型抗体的组合物，所述组合物自身或与另一种组合物组合用于有效治疗、预防和/或诊断疾病或病症。在一些实施方案中，容器具有无菌进入口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶，包括具有可被注射针刺穿的塞子的那些。制品可包括其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含抗独特型抗体。替代地，或另外地，制品可进一步包括包含可接受的缓冲剂的另一个或相同的容器。它可进一步包括其他物品，比如其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和/或注射器。
在一些实施方案中，制品或试剂盒包括固体支持物，包括由玻璃(例如，可控孔径玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇、硝酸纤维素、纤维素、尼龙、硅酮和本领域熟知的其他材料形成的固体支持物，所述材料用于固体支持物中，用于直接或间接附着如所述的结合试剂。包含在本文提供的制品或试剂盒中的固体支持物包括但不限于珠、柱子(例如，色谱柱等)、阵列(例如，微阵列、纳米阵列等)、测定板、盒、棒、过滤器、条带或本文所述的任何其他固体支持物。
在一些实施方案中，制品或试剂盒可进一步包括包含适合的稀释剂的第二容器。制品或试剂盒可以进一步包括立足于商业、治疗和用户立场所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器、治疗剂和/或具有使用说明的包装说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可任选地包括说明书。说明书通常包括描述抗体和任选地包括在试剂盒中的其他组分(例如，结合试剂)、以及在所述任何用途或方法中(或与所述任何用途或方法结合)使用所述抗体和/或其他组分的方法的有形表达。在一些实施方案中，将说明书提供为位于容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。在一些实施方案中，说明书可指示组合物的复原和/或用途的指导。
在一些实施方案中，提供了使用抗独特型抗体检测SJ25C1抗体或其抗原结合片段或包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体的说明书，例如根据任何所述方法或测定法(或与任何所述方法或测定法结合)。在一些实例中，提供了使用抗独特型抗体从细胞群中选择或富集表达包含抗体SJ25C1或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞的说明书。在一些实例中，提供了使用抗独特型抗体刺激包含表达嵌合抗原受体的细胞的输入组合物的说明书，所述嵌合抗原受体包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了使用抗独特型抗体检测FMC63抗体或其抗原结合片段或包含FMC63抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体的说明书，例如根据任何所述方法或测定法(或与任何所述方法或测定法结合)。在一些方面，提供了使用抗独特型抗体从细胞群中选择或富集表达包含抗体FMC63或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞的说明书。在一些实施方案中，提供了使用抗独特型抗体刺激包含表达嵌合抗原受体的细胞的输入组合物的说明书，所述嵌合抗原受体包含FMC63抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供了使用所提供的试剂盒检测与细胞疗法的嵌合抗原受体结合的分子的说明书，所述分子比如抗体，例如通过对嵌合抗原受体(CAR)的体液免疫应答产生的抗体。在一些实施方案中，提供了用于使结合试剂与来自已经被施用细胞疗法的受试者的样品接触的说明书，所述细胞疗法包含用CAR工程改造的细胞，所述CAR包含靶抗体，所述靶抗体为抗CD19抗体(例如，FMC63或SJ25C1)或其抗原结合片段，其中所述结合试剂包含CAR的细胞外结构域或所述细胞外结构域的一部分，所述细胞外结构域包含靶抗体或其抗原结合片段。在一些方面，说明书还详细说明了检测包含结合试剂和来自样品的分子的复合物的存在或不存在，所述分子与第一和第二结合试剂两者都结合，任选地其中所述分子是或包含抗体。在一些方面，CD19抗体是SJ25C1或FMC63。在一些其他实施方案中，提供了使用结合试剂和阳性对照样品的说明书。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有术语、符号和其他技术和科学术语或用辞预期具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不应被解释为表示与本领域通常所理解的实质性差异。
如本文中使用的，关于抗体的“相应形式”表示当比较两种抗体的性质或活性时，所述性质是使用相同形式的抗体比较的。例如，如果陈述抗体与第一抗体的相应形式的活性相比具有更高的活性，这表示该抗体的特定形式比如scFv与第一抗体的scFv形式相比具有更高的活性。
如本文中使用的，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”公开序列中(比如在序列表中列出)的核苷酸或氨基酸位置，是指在与公开序列比对时鉴定的核苷酸或氨基酸位置，以便使用标准比对算法(比如GAP算法)使同一性最大化。通过比对序列，本领域技术人员可以鉴定相应的残基，例如，使用保守和相同的氨基酸残基作为引导。通常，为了鉴定相应的位置，比对氨基酸序列以获得最高级别的匹配(参见，例如：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New.Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；Carrillo等人(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统(也称为EU索引)进行的，如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指的是具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中分离的抗体。在一些实施方案中，正如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的评述，参见例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但核酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗独特型抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的此类核酸分子，并且此类核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而无需考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。
如本文中使用的，当相对于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)之后候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
氨基酸取代可包括多肽中的一个氨基酸被另一个氨基酸替换。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入到感兴趣的结合分子(例如抗体)中，并筛选出具有期望活性的产物，所述活性例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
通常可以根据以下常见的侧链性质将氨基酸分组：
(1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可涉及将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可涉及将这些类别之一的成员交换为另一类别。
如本文中使用的术语“载体”是指能够传送与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。例如，“一个(a)”或“一个(an)”表示“至少一个”或“一个或多个”。应当理解的是，在本文中描述的方面和变体包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方面和变体。
贯穿本公开内容，将要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该陈述述范围内的任何其他陈述值或中间值都被包括在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小范围内，并且还被包括在要求保护的主题内，受制于所陈述范围内的任何特别排除的极限值。当陈述范围包括极限值之一或两者时，排除这些被包括的极限值的任一者或两者的范围也被包括在要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都是适用的。
如本文中使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的对应值的通常误差范围。在本文中提及的“大约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包括所提供的抗体和抗体链以及其他肽(例如接头)在内的多肽，可包含包括天然和/或非天然氨基酸残基在内的氨基酸残基。这些术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化，等等。在一些方面，多肽可以含有相对于自然或天然序列的修饰，只要蛋白质保持期望的活性即可。这些修饰可以是有意的，比如通过定点诱变，或者可以是偶然的，比如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误。
如本文中使用的，组合物是指包括细胞在内的两种或更多种产物、物质或化合物的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文中使用的，细胞或细胞群对于特定标志物是“阳性”的陈述是指特定标志物(通常是表面标志物)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标志物时，该术语是指通过流式细胞术检测的表面表达的存在，例如，通过用与标志物特异性地结合的抗体染色并检测所述抗体，其中在基本上高于在其他条件都相同时用同种型匹配的对照进行相同的程序检测到的染色的水平和/或在与已知对标志物呈阳性的细胞基本上相似的水平、和/或在比已知对标志物呈阴性的细胞显著更高的水平可通过流式细胞术检测染色。
如本文中使用的，细胞或细胞群对于特定标志物是“阴性”的陈述是指特定标志物(通常是表面标志物)在细胞上或细胞中的实质性可检测存在的缺乏。当提及表面标志物时，该术语是指通过流式细胞术检测的表面表达的缺乏，例如，通过用与标志物特异性地结合的抗体染色并检测所述抗体，其中在基本上高于在其他条件都相同时用同种型匹配的对照进行相同的程序检测到的染色的水平、和/或在比已知对标志物呈阳性的细胞显著更低的水平、和/或在与已知对标志物呈阴性的细胞相比基本上相似的水平通过流式细胞术未检测到染色。
示例性实施方案
其中本文提供的实施方案为：
1.一种与靶抗体特异性地结合的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段。
2.实施方案1的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
轻链可变(VL)区，其与SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性；和/或
重链可变(VH)区，其与SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
3.一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
VL区，其与SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性；和/或
VH区，其与SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
4.实施方案2或实施方案3的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包括包含在SEQ ID NO:11或84中列出的氨基酸序列的重链互补决定区3(CDR-H3)或包含在SEQ ID NO:1中列出的VH序列内包含的CDR-H3；并且/或者
所述VL区包括包含在SEQ ID NO:14或87中列出的氨基酸序列的轻链互补决定区3(CDR-L3)或包含在SEQ ID NO:5中列出的VL序列内包含的CDR-L3。
5.实施方案2-4中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含CDR-H1和CDR-H2，其分别包含在SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1和CDR-H2序列的氨基酸序列；并且/或者
所述VL区包含CDR-L1和CDR-L2，其分别包含在SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1和CDR-L2序列的氨基酸序列。
6.实施方案2-5中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含在SEQ ID NO:9、78、79或80中列出的CDR-H1；在SEQ ID NO:10、81、82或83中列出的CDR-H2；和在SEQ ID NO:11或84中列出的CDR-H3；并且/或者
所述VL区包含在SEQ ID NO:12或85中列出的CDR-L1；在SEQ ID NO:13或86中列出的CDR-L2；和在SEQ ID NO:14或87中列出的CDR-L3。
7.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含在SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和/或
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含在SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
8.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含氨基酸序列SEQ ID NO:9、78、79或80的CDR-H1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:10、81、82或83的CDR-H2；和包含SEQ ID NO:11或84列出的氨基酸序列的CDR-H3；和/或
包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或85的CDR-L1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或86的CDR-L2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14或87的CDR-L3。
9.实施方案1-8中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中：
所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；并且/或者
所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
10.实施方案9的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
11.实施方案1-10中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述靶抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。
12.一种与靶抗体特异性地结合的抗独特型抗体或其抗原结合片段，所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段。
13.实施方案12的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
轻链可变(VL)区，其与SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性；和/或
重链可变(VH)区，其与SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
14.一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
VL区，其与SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列具有至少90％序列同一性；和/或
VH区，其与SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
15.实施方案13-14中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含：
包含氨基酸序列GYX3FX5X6YX8MX10(SEQ ID NO:108)的重链互补决定区1(CDR-H1)，其中X3是T或S，X5是T或S，X6是D或R，X8是Y或W，并且X10是K或N；
包含氨基酸序列WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20(SEQ ID NO:109)的重链互补决定区2(CDR-H2)，其中X4是D或M，X6是N或H，X8是N或S，X9是N或D，X10是G或S，X11是G或E，X13是D或R，X14是Y或L，X17是N或K，并且X20是G或D；
包含氨基酸序列AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15(SEQ ID NO:110)的重链互补决定区3(CDR-H3)，其中X2是R或S，X3是E或I，X4是G或Y，X5为N或Y，X6是N或E，X7是Y或空值，X8是G或空值，X9是S或空值，X10是R或空值，X11是D或空值，X12是A或空值，X13是M或空值，X14是D或E，并且X15是Y或A；并且/或者
所述VL区域包含：
包含氨基酸序列X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY(SEQ ID NO:111)的轻链互补决定区1(CDR-L1)，其中X1是S或R，X3是S或R，X4是S或G，X5是G或N，X6是V或I，X7是I或H，X8是N或空值，X10是M或L，并且X11是Y或A；
包含氨基酸序列X1X2X3YX5X6X7X8LAX11(SEQ ID NO:112)的轻链互补决定区2(CDR-L2)，其中X1是P或L，X2是W或L，X3是I或V，X5是L或N，X6是T或A，X7是S或K，X8是N或T，并且X11是S或D；
包含氨基酸序列QX2X3X4X5X6PX8T(SEQ ID NO:113)的轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中X2是Q或H，X3是W或F，X4是S或W，X5是S或W，X6是N或T，并且X8是L或Y。
16.实施方案15的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述互补决定区3(CDR-H3)包含在SEQ ID NO:94或104中列出的氨基酸序列或包含在SEQ ID NO:36或58中列出的VH序列内包含的CDR-H3；并且/或者
所述轻链互补决定区3(CDR-L3)包含在SEQ ID NO:97或107中列出的氨基酸序列或包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL序列内包含的CDR-L3。
17.实施方案13-16中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含CDR-H1和CDR-H2，其分别包含在SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1和CDR-H2序列的氨基酸序列；并且/或者
所述VL区包含CDR-L1和CDR-L2，其分别包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1和CDR-L2序列的氨基酸序列。
18.实施方案13-17中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含在SEQ ID NO:88、89、90、98、99或100中列出的CDR-H1；在SEQ IDNO:91、92、93、101、102或103中列出的CDR-H2；和在SEQ ID NO:94或104中列出的CDR-H3；并且/或者
所述VL区包含在SEQ ID NO:95或105中列出的CDR-L1；在SEQ ID NO:96或106中列出的CDR-L2；和在SEQ ID NO:97或107中列出的CDR-L3。
19.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含在SEQ ID NO:36或58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和/或
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含在SEQ ID NO:40或62中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
20.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含氨基酸序列SEQ ID NO:88、89、90、98、99或100的CDR-H1；包含氨基酸序列SEQID NO:91、92、93、101、102或103的CDR-H2；和包含SEQ ID NO:94或104列出的氨基酸序列的CDR-H3；和/或
包含氨基酸序列SEQ ID NO:95或105的CDR-L1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:96或106的CDR-L2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:97或107的CDR-L3。
21.实施方案13-21中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中：
所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:36或58；并且/或者
所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:40或62。
22.实施方案21的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:36或58，并且所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ IDNO:40或62。
23.实施方案13-22中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含在SEQ ID NO:44、88、89或90中列出的CDR-H1；在SEQ ID NO:45、91、92或93中列出的CDR-H2；和在SEQ ID NO:46或94中列出的CDR-H3；并且/或者
所述VL区包含在SEQ ID NO:47或95中列出的CDR-L1；在SEQ ID NO:48或96中列出的CDR-L2；和在SEQ ID NO:49或97中列出的CDR-L3。
24.实施方案13-23中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含在SEQ ID NO:65、98、99或100中列出的CDR-H1；在SEQ ID NO:66、101、102或103中列出的CDR-H2；和在SEQ ID NO:67或104中列出的CDR-H3；并且/或者
所述VL区包含在SEQ ID NO:68或105中列出的CDR-L1；在SEQ ID NO:69或106中列出的CDR-L2；和在SEQ ID NO:100或107中列出的CDR-L3。
25.实施方案13-24中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:36中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；并且/或者
所述VL区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含在SEQ ID NO:40中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
26.实施方案13-24中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述VH区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:58中列出的VH区氨基酸序列内包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；并且/或者
所述VL区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含在SEQ ID NO:62中列出的VL区氨基酸序列内包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
27.实施方案13-25中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:36；并且/或者
所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:40。
28.实施方案13-24中和26中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述抗体或片段的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:58；并且/或者
所述抗体或片段的VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:62。
29.实施方案1-28中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述靶抗体或抗原结合片段是单链片段。
30.实施方案29的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
31.实施方案29或实施方案30的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述片段包含scFv。
32.实施方案1-11和29-31中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述靶抗体或抗原结合片段：
包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区；和/或
是包含在SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列的scFv。
33.实施方案12-31中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述靶抗体或抗原结合片段：
包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区；和/或
是包含在SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列的scFv。
34.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗独特型抗体或抗原结合片段与靶抗体或其抗原结合片段的表位特异性地结合，所述表位与被实施方案1-33中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段特异性地结合的表位相同或重叠。
35.实施方案1-34中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中：
所述靶抗体或抗原结合片段在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中；并且/或者
所述抗独特型抗体或抗原结合片段特异性地结合包含在CAR细胞外部分的抗原结合结构域内或包含在其中的靶抗体或抗原结合片段。
36.实施方案35的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述靶抗体或抗原结合片段是scFv，并且抗独特型抗体或抗原结合片段与CAR的scFv中的表位特异性地结合。
37.实施方案1-11、29-32和35中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与包含在嵌合抗原受体的细胞外部分中的衍生自抗体SJ25C1的单链可变片段(scFv)特异性地结合，任选地其中衍生自抗体SJ25C1的scFv包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ IDNO:24中列出的轻链可变区；和/或包含在SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。
38.实施方案12-31和33-35中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与包含在嵌合抗原受体的细胞外部分中的衍生自抗体FMC63的单链可变片段(scFv)特异性地结合，任选地其中衍生自抗体FMC63的scFv包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区；和/或包含在SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列。39.实施方案1-38中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗独特型抗体或抗原结合片段与表位特异性地结合，所述表位在靶抗体或抗原结合片段的互补决定区(CDR)内或包括所述互补决定区的全部或部分。
40.实施方案35-39中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述CAR进一步包含通过间隔物与抗原结合结构域连接的跨膜结构域。
41.实施方案40的抗独特型抗体，其中所述间隔物包含来自CD28的细胞外部分，所述CD28任选地是人CD28。
42.实施方案41的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中来自CD28的细胞外部分包含在SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。
43.实施方案40-42中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分，所述CD28任选地是人CD28。
44.实施方案40-43中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段不与CAR的间隔物结构域中的表位结合。
45.实施方案1-44中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段与CD28或其部分不结合或不特异性地结合，所述CD28任选地是人CD28，其任选地包含CD28的细胞外部分，任选地包含在SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。
46.实施方案1-45中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段不与Fc结构域中的表位结合，所述Fc结构域任选地是人IgG1 Fc结构域。
47.实施方案1-46中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述靶抗体或抗原结合片段与人CD19特异性地结合。
48.实施方案1-47中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗独特型抗体或片段不与另一种抗CD19抗体交叉反应，所述抗CD19抗体任选地包含在另一个CAR的细胞外抗原结合结构域中。
49.实施方案1-48中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗独特型抗体或片段不与另一个CAR交叉反应。
50.实施方案1-49中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗独特型抗体或片段是包含靶抗体或抗原结合片段的CAR的激动剂抗体。
51.实施方案1-50中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段是包含靶抗体或抗原结合片段的CAR的拮抗剂。
52.实施方案1-51中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
53.实施方案1-52中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其是重组的。
54.实施方案1-53中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其是单克隆的。
55.实施方案1-54中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其是抗原结合片段。
56.实施方案55的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体。
57.实施方案1-54中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分。
58.实施方案57的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中免疫球蛋白恒定区的至少一部分包含Fc区或包含CH2和CH3结构域的Fc的一部分。
59.实施方案57或实施方案58的抗独特型抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区衍生自人IgG。
60.实施方案57-59中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段，其是完整抗体或全长抗体。
61.一种缀合物，其包含实施方案1-60中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段和异源分子或模块。
62.实施方案61的缀合物，其中所述异源分子或模块是标记物。
63.实施方案62的缀合物，其中所述标记物选自荧光染料、荧光蛋白、放射性同位素、发色团、金属离子、金颗粒、银颗粒、磁性颗粒、多肽、酶、链霉亲和素、生物素、发光化合物或寡核苷酸。
64.实施方案62的缀合物，其中所述异源分子或模块是蛋白质、肽、核酸或小分子，其任选地是或包含毒素Strep-Tag。
65.一种核酸分子，其编码实施方案1-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链。
66.实施方案65的核酸分子，其包含：
在SEQ ID NO:15中列出的编码(i)重链可变区的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:15中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或
在SEQ ID NO:19中列出的编码(iv)轻链可变区的核苷酸序列、(v)与SEQ ID NO:19中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。
67.实施方案65或实施方案66的核酸分子，其包含：
在SEQ ID NO:17中列出的编码(i)重链的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:17中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或
在SEQ ID NO:21中列出的编码(iv)轻链的核苷酸序列、(v)与SEQ ID NO:21中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。
68.实施方案65的核酸分子，其包含：
在SEQ ID NO:50或71中列出的编码(i)重链可变区的核苷酸序列、(ii)与SEQ IDNO:50或71中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或
在SEQ ID NO:54或75中列出的编码(iv)轻链可变区的核苷酸序列、(v)与SEQ IDNO:54或75中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。
69.实施方案65或实施方案68的核酸分子，其包含：
在SEQ ID NO:52或73中列出的编码(i)重链的核苷酸序列、(ii)与SEQ ID NO:52或73中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的简并序列；和/或
在SEQ ID NO:56或76中列出的编码(iv)轻链的核苷酸序列、(v)与SEQ IDNO:56或76中列出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或(vi)(iv)或(v)的简并序列。
70.实施方案65-69中任一项的核酸分子，其中编码重链和/或轻链的核苷酸序列包含信号序列。
71.一种载体，其包含实施方案65-70中任一项的核酸分子。
72.一种细胞，其包含实施方案1-41中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案65-70中任一项的核酸分子。
73.一种产生抗独特型抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合的宿主细胞中表达由实施方案65-70中任一项的核酸分子或实施方案71的载体编码的重链和/或轻链，并且回收或分离抗体。
74.一种产生抗独特型抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在表达重链和/或轻链的条件下培养实施方案72的细胞，并且回收或分离抗体。
75.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其通过实施方案73或实施方案74的方法产生。
76.一种组合物，其包含实施方案1-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、实施方案61-64中任一项的缀合物或实施方案72的细胞。
77.实施方案76的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
78.一种试剂盒，其包含下述一者或多者：实施方案1-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、实施方案61-64中任一项的缀合物、实施方案65-70中任一项的核酸以及任选的使用说明。
79.实施方案78的试剂盒，其进一步包含用于固定抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物的试剂或支持物，其中所述试剂或支持物是珠子、柱子、微孔、棒、过滤器、条带或可溶性寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。
80.一种检测靶抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(a)使包含靶抗体(为抗体SJ25C1或抗原结合片段)的组合物与实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合；和
(b)检测与靶抗体或抗原结合片段结合的抗独特型抗体。
81.一种检测靶抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(a)使包含靶抗体(为抗体FMC63或抗原结合片段)的组合物与实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合；和
(b)检测与靶抗体或抗原结合片段结合的抗独特型抗体。
82.实施方案81的方法，其中所述靶抗体或抗原结合片段与细胞结合或在细胞表面上表达，并且(b)中的检测包括检测与抗独特型抗体结合的细胞。
83.实施方案82的方法，其中所述细胞在其表面上表达包含靶抗体或抗原结合片段的CAR。
84.一种检测包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的方法，其包括：
(a)使表达包含靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞与实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合；和
(b)检测与抗独特型抗体结合的细胞。
85.一种检测包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的方法，其包括：
(a)使表达包含靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞与实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合；和
(b)检测与抗独特型抗体结合的细胞。
86.实施方案80-85中任一项的方法，其中所述抗独特型抗体或其抗原结合片段被直接或间接标记用于检测。
87.一种从细胞群中选择细胞的方法，其包括：
(a)使表达包含靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞群或与靶抗体结合的细胞与实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段；和
(b)选择与抗独特型抗体结合的细胞。
88.一种从细胞群中选择细胞的方法，其包括：
(a)使表达包含靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞群或与靶抗体结合的细胞与实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段；和
(b)选择与抗独特型抗体结合的细胞。
89.实施方案87或实施方案88的方法，其中通过基于亲和力的分离选择与抗独特型抗体结合的细胞。
90.实施方案89的方法，其中基于亲和力的分离是基于免疫亲和力的分离。
91.实施方案89或实施方案90的方法，其中基于亲和力的分离是通过流式细胞术来完成。
92.实施方案89或实施方案90的方法，其中基于亲和力的分离是通过磁激活细胞分选来完成。93.实施方案89或实施方案90的方法，其中基于亲和力的分离包括亲和色谱法。94.实施方案92或实施方案93的方法，其中所述抗独特型抗体可逆地结合或固定在支持物或固定相上。
95.一种刺激细胞的方法，其包括将表达包含靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的输入组合物与实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物一起温育，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合，由此生成包含刺激细胞的输出组合物。
96.一种刺激细胞的方法，其包括将表达包含靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的输入组合物与实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物一起温育，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合，由此生成包含刺激细胞的输出组合物。
97.一种产生细胞组合物的方法，其包括：
(a)将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子引入到细胞中，由此生成输入组合物；和
(b)将所述输入组合物与对抗原受体CAR特异的抗独特型抗体或其抗原结合片段一起温育，由此产生细胞组合物。
98.实施方案97的方法，其中所述CAR包含与CD19特异性地结合的靶抗体。
99.实施方案98的方法，其中所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段。
100.实施方案97-99中任一项的方法，其中所述抗独特型抗体或其抗原结合片段是实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合。
101.实施方案98的方法，其中所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段。
102.实施方案97-98和101中任一项的方法，其中与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合的所述抗独特型抗体或其抗原结合片段与靶抗体特异性地结合，所述靶抗体为实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗体FMC63。
103.实施方案97-102中任一项的方法，其中(a)中的引入包括通过病毒转导、转座、电穿孔或化学转染将核酸分子引入到细胞中。
104.实施方案97-103中任一项的方法，其中(a)中的引入包括通过用包含核酸分子的病毒载体转导将核酸分子引入到细胞中，任选地其中所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
105.实施方案97-103中任一项的方法，其中(a)中的引入包括通过用包含核酸分子的转座子转座将核酸分子引入到细胞中。
106.实施方案97-103中任一项的方法，其中(a)中的引入包括通过包含核酸分子的载体的电穿孔或转染将核酸分子引入到细胞中。
107.实施方案97-106中任一项的方法，进一步包括在步骤(a)之前激活细胞的步骤。
108.实施方案107的方法，其中激活细胞的步骤包括使细胞与CD3激动剂和任选的CD28激动剂接触。
109.实施方案108的方法，其中激活细胞的步骤包括使细胞与包含激动性抗CD3抗体和抗CD28抗体的试剂接触。
110.实施方案95-109中任一项的方法，其中在抗独特型抗体或其抗原结合片段与CAR结合的条件下进行温育，由此诱导或调节输入组合物的一个或多个细胞中的信号。
111.实施方案95-110中任一项的方法，其中所述细胞包括T细胞。
112.实施方案111的方法，其中T细胞包括CD4+和/或CD8+T细胞。
113.实施方案95-112中任一项的方法，其中将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至固体支持物，所述固体支持物任选地包含或缀合至包含多个结合位点的试剂，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。
114.实施方案95-112中任一项的方法，其中将抗独特型抗体或其抗原结合片段固定至可溶性试剂，所述可溶性试剂任选地是或包含多个结合位点，所述结合位点能够与所述抗独特型抗体或其抗原结合片段可逆地结合。
115.实施方案113或实施方案114的方法，其中所述试剂包括链霉亲和素突变蛋白。
116.实施方案95-115中任一项的方法，其中温育至少或约至少5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。
117.实施方案95-116中任一项的方法，其中按照占组合物中总细胞的百分比计，输入组合物包含少于或少于约60％、少于或少于约50％、少于或少于约40％、少于或少于约30％、少于或少于约20％或少于或少于约10％的表达CAR的细胞。
118.实施方案95-117中任一项的方法，其中：
与输入组合物中表达CAR的细胞数相比，输出组合物中表达CAR的细胞数增加大于1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍或更多；和/或
与组合物中的总细胞相比，输出组合物中表达CAR的细胞的百分比增加大于10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
119.实施方案95-118中任一项的方法，其中在引入和/或温育之前，未针对所述细胞选择或富集表达CAR的细胞。
120.实施方案80、82-84、86、87、89-95、97-100、103-119中任一项的方法，其中所述靶抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23中列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。
121.实施方案81、82、83、85、86、88-94、96-99、101和102-119中任一项的方法，其中所述靶抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和/或在SEQ IDNO:31中列出的轻链可变区。
122.一种纯化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(a)使包含靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的组合物与实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合；和
(b)分离包含抗独特型抗体的复合物。
123.一种纯化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(a)使包含靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的组合物与实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段、或实施方案61-64中任一项的缀合物接触，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合；和
(b)分离包含抗独特型抗体的复合物。
124.实施方案122或实施方案123的方法，其中通过基于亲和力的分离来分离包含抗独特型抗体的复合物。
125.实施方案124的方法，其中基于亲和力的分离是基于免疫亲和力的分离。
126.实施方案124的方法，其中基于亲和力的分离是基于磁性的分离。
127.实施方案124的方法，其中基于亲和力的分离包括亲和色谱法。
128.一种鉴定抗独特型抗体或抗原结合片段的方法，其包括：
(a)向受试者引入可溶性免疫试剂，所述可溶性免疫试剂含有与增溶模块融合的靶抗体的抗原结合片段；和
(b)鉴定来自受试者的与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合的抗体。
129.实施方案128的方法，其中所述抗原结合片段包含靶抗体的可变重链区和/或可变轻链区。
130.实施方案128或实施方案129的方法，其中所述抗原结合片段是单链片段。
131.实施方案130的方法，其中所述抗原结合片段是scFv。
132.实施方案128-131中任一项的方法，其中所述抗原结合片段在嵌合抗原受体(CAR)的细胞外部分的抗原结合结构域内或被包含在其中。
133.实施方案128-132中任一项的方法，其中所述增溶模块是Fc结构域或其片段，其任选地是人IgG1 Fc。
134.实施方案133的方法，其中所述增溶模块是缺乏铰链区的Fc结构域。
135.实施方案134的方法，其中所述增溶模块包含在SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列。
136.实施方案128-135中任一项的方法，其中鉴定抗体包括：
(i)从受试者的脾中分离B细胞并将它们与永生化B细胞融合以生成杂交瘤；
(ii)筛选杂交瘤用于产生特异性地结合靶抗体或其抗原结合片段或包含该抗原结合片段的嵌合抗原受体的抗体；和
(iii)对来自产生特异性结合的抗体的杂交瘤的抗体进行测序，由此鉴定抗独特型抗体。
137.实施方案128-136中任一项的方法，其中所述靶抗体与CD19结合。138.实施方案128-137中任一项的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段衍生自抗体SJ25C1，任选地其中所述靶抗体的抗原结合片段包含在SEQ ID NO:23列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:24中列出的轻链可变区。
139.实施方案128-138中任一项的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段是衍生自抗体SJ25C1的单链可变片段(scFv)，任选地其中scFv包含在SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。
140.实施方案128-137中任一项的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段衍生自抗体FMC63，任选地其中所述靶抗体的抗原结合片段包含在SEQ ID NO:30列出的重链可变区和/或在SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
141.实施方案128-137和140中任一项的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段是衍生自抗体FMC63的单链可变片段(scFv)，任选地其中scFv包含在SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列。
142.一种耗竭细胞的方法，其包括向受试者施用包含实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物的组合物，所述独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述受试者已经被施用表达包含靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述靶抗体为抗体SJ25C1或其抗原结合片段。
143.一种耗竭细胞的方法，其包括向受试者施用包含实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物的组合物，所述独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)特异性地结合，其中所述受试者已经被施用表达包含靶抗体的嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述靶抗体为抗体FMC63或其抗原结合片段。
144.实施方案109的方法，其中通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发生耗竭。
145.一种确定与嵌合抗原受体(CAR)结合的分子的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)使结合试剂与来自已经施用细胞疗法的受试者的样品在形成包含所述结合试剂和与所述结合试剂结合的来自样品的分子的复合物的条件下接触，所述细胞疗法包含用包含靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体为抗体SJ25C1或其抗原结合片段，其中所述结合试剂含有包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或其部分；和
(b)检测所述复合物的存在或不存在，由此确定结合CAR的分子的存在或不存在。
146.实施方案145的方法，其进一步包括对阳性对照样品进行步骤(a)和(b)，并且任选地，通过与阳性对照比较确定所述分子的存在或不存在，其中所述阳性对照样品包含实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
147.一种确定与嵌合抗原受体(CAR)结合的分子的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)使结合试剂与来自已经施用细胞疗法的受试者的样品在形成包含所述结合试剂和与所述结合试剂结合的来自样品的分子的复合物的条件下接触，所述细胞疗法包含用包含靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体为抗体FMC63或其抗原结合片段，其中所述结合试剂含有包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或所述细胞外结构域的一部分；
(b)检测所述复合物的存在或不存在。
148.实施方案147的方法，其进一步包括对阳性对照样品进行步骤(a)和(b)，并且任选地，通过与阳性对照比较确定所述分子的存在或不存在，其中所述阳性对照样品包含实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物，所述抗独特型抗体或其抗原结合片段或缀合物与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
149.实施方案145-148中任一项的方法，其中与结合试剂结合的分子是或包含抗体。
150.实施方案145-149中任一项的方法，其中所述结合试剂经过可检测标记或能够产生可检测信号。
151.实施方案145-150中任一项的方法，其中所述结合试剂与固体支持物结合或是可溶的。
152.实施方案145-153中任一项的方法，其中通过免疫测定法检测所述复合物。
153.实施方案152的方法，其中所述免疫测定法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、电化学发光测定、基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器(例如BIAcore)、流式细胞术或Western印迹。
154.实施方案152或实施方案153的方法，其中所述免疫测定法包括中尺度发现。
155.实施方案152-154中任一项的方法，其中所述免疫测定法是夹心测定法或桥接测定法。
156.实施方案145-155中任一项的方法，其中所述结合试剂是第一结合试剂，并且检测所述复合物的存在或不存在包括：
(i)使步骤(a)中形成的复合物与第二结合试剂接触，其中所述第二结合试剂(1)含有包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或其部分，和(2)经过可检测标记或能够产生可检测信号；和
(ii)评估所述可检测信号的存在或不存在。
157.实施方案156的方法，其中：
所述第一结合试剂与固体支持物结合，任选地其中所述第一结合试剂直接或间接地与生物素连接和/或通过链霉亲和素与固体支持物结合；并且/或者
所述第二结合试剂是可溶的。
158.实施方案156或实施方案157的方法，其中所述第一和第二结合试剂的CAR的细胞外结构域或其部分是相同的。
159.实施方案150-158中任一项的方法，其中：
所述可检测标记物是或包括荧光标记物、化学发光标记物、电致发光标记物、比色标记物、生物发光标记物或放射性标记物；并且/或者
所述可检测信号是或包括荧光信号、化学发光信号、电致发光信号、比色信号、生物发光信号或放射性信号。
160.实施方案150-159中任一项的方法，其中所述可检测标记物是或包含SULFO标签。
161.实施方案145-160中任一项的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段包含所述靶抗体的可变重链区和/或可变轻链区。
162.实施方案145-161的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段是单链片段。
163.实施方案145-162中任一项的方法，其中所述靶抗体的抗原结合片段是scFv。
164.实施方案145-163中任一项的方法，其中样品包括全血、血清或血浆。
165.一种制品，其包含实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物、以及使用所述抗独特型抗体的说明书，所述抗独特型抗体用于检测SJ25C1抗体或其抗原结合片段或包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体；从细胞群中选择或富集表达包含抗体SJ25C1或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞；刺激包含表达嵌合抗原受体的细胞的输入组合物，所述嵌合抗原受体包含SJ25C1抗体或其抗原结合片段。
166.一种制品，其包含实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或其抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物、以及使用所述抗独特型抗体的说明书，所述抗独特型抗体用于检测FMC63抗体或其抗原结合片段或包含FMC63抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体；从细胞群中选择或富集表达包含抗体FMC63或其抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞；刺激包含表达嵌合抗原受体的细胞的输入组合物，所述嵌合抗原受体包含FMC63抗体或其抗原结合片段。
167.一种制品，其包含：
含有包含靶抗体(为抗体FMC63或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域的结合试剂，所述细胞外结构域或其部分包含所述靶抗体或其抗原结合片段；和
实施方案12-31、33-36和38-60中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物。
168.实施方案167的制品，其中所述结合试剂是第一结合试剂，并且所述制品进一步包含含有CAR的细胞外结构域或其部分的第二结合试剂。
169.实施方案167或实施方案168的制品，其中所述第一和第二结合试剂的CAR的细胞外结构域或其部分是相同的。
170.实施方案167-169中任一项的制品，其进一步包括使用所述结合试剂(任选地第一和第二结合试剂)通过使用免疫测定法测定样品中与所述结合试剂结合的分子的存在或不存在的说明书，任选地，其中所述免疫测定法是桥接或夹心免疫测定法，任选地其中所述样品来自已经施用细胞疗法的受试者，所述细胞疗法包含用包含靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体是抗体FMC63或其抗原结合片段。
171.一种制品，其包含：
含有包含靶抗体(为抗体SJ25C1或其抗原结合片段)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外结构域的结合试剂，所述细胞外结构域或其部分包含所述靶抗体或其抗原结合片段；和
实施方案1-11和29-32、34-37和39-60中任一项的抗独特型抗体或抗原结合片段或实施方案61-64中任一项的缀合物。
172.实施方案171的制品，其中所述结合试剂是第一结合试剂，并且所述制品进一步包含含有CAR的细胞外结构域或其部分的第二结合试剂。
173.实施方案171或实施方案172的制品，其中所述第一和第二结合试剂的CAR的细胞外结构域或其部分是相同的。
174.实施方案171-173中任一项的制品，其进一步包括使用所述结合试剂(任选地第一和第二结合试剂)通过使用免疫测定法测定样品中与所述结合试剂结合的分子的存在或不存在的说明书，任选地，其中所述免疫测定法是桥接或夹心免疫测定法，任选地其中所述样品来自已经施用细胞疗法的受试者，所述细胞疗法包含用包含靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体是抗体SJ25C1或其抗原结合片段。
175.实施方案167-174中任一项的制品，其中所述结合试剂(任选地第一和/或第二结合试剂)经过可检测标记或能够产生可检测信号。
176.实施方案168-170和172-175中任一项的制品，其中所述第一和第二结合试剂中的一者被附着于固体支持物上或能够被附着于固体支持物上，并且第一和第二结合试剂中的另一者是可检测标记物或能够产生可检测信号。
177.实施方案176的方法，其中所述制品进一步包括固体支持物，任选地其中第一和第二结合试剂中的一者直接或间接地与生物素连接，并且所述固体支持物包括链霉亲和素包被的表面。
实施例
下面的实施例仅仅是为了说明的目的而被包括在内，并非意在限制本发明的范围。
实施例1针对SJ25C1可变区衍生抗体的抗独特型抗体的生成
本实施例描述了识别示例性抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的scFv部分的抗独特型抗体(抗ID)的生成，所述抗CD19嵌合抗原受体含有抗CD19scFv，所述抗CD19 scFv具有衍生自SJ25C1(抗体(在这种情况下为scFv)的可变重链区和可变轻链区，其具有由SEQ ID NO:25中列出的接头分开的在SEQ ID NO:23和24中列出的可变区序列；人CD28衍生的细胞外部分；人CD28衍生的跨膜结构域；人CD28衍生的细胞内信号传导结构域和人CD3ζ衍生的信号传导结构域。
A.杂交瘤生成和抗体筛选
用CAR(含有具有衍生自SJ25C1的可变区的抗CD19 scFv)的细胞外结构域(ECD)部分免疫小鼠。所述ECD部分含有序列
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPG QGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:28)和来自CD28的细胞外部分(SEQ ID NO:27)。
通过ELISA测试从免疫小鼠分离的血清，通过用二级抗体检测所述血清与重组可溶性ECD部分结合的能力。生成杂交瘤融合克隆，通过ELISA进一步表征其与ECD的结合，并选择五(5)个阳性克隆。扩增每个选择的杂交瘤克隆并纯化抗体。为了在随后的测定法中检测抗体，将每种抗体与Alexa647缀合。
评估抗体与用抗CD19(SJ25C1衍生的)CAR工程改造的T细胞特异性地结合的能力(通过与模拟转导的对照T细胞的结合比较进行评估)。通过基于免疫亲和力的富集从人受试者分离T细胞，激活所述细胞并用编码抗CD19(SJ25C1衍生的)CAR的病毒载体转导。各自使用每种抗独特型抗体的一系列两倍连续稀释物(从20μg/mL开始并稀释至0.0195μg/mL)通过流式细胞术检测CAR的表面表达。作为阳性对照，还使用能够检测CAR的ECD部分的鼠可变区部分的相似浓度的山羊抗小鼠(“GAM”)抗体评估细胞的CAR表面表达。还测试了无抗体对照。用CAR转导的T细胞中Alexa647信号阳性细胞百分比的剂量反应曲线对于所测试的每种抗独特型抗体是相似的，并且与阳性对照GAM抗体的相当，其中没有一种识别用空载体转导的模拟T细胞。还确定了抗独特型抗体和GAM抗体的染色指数，其为阳性和背景(模拟)峰平均值与背景峰展宽(spread)之间的差值，并且发现在抗独特型抗体和阳性对照GAM抗体之间是相当的。选择抗独特型抗体克隆A-1(抗ID A-1)用于进一步表征。
B.功能活性
在存在或不存在交联剂抗体的每种情况下，在用抗ID A-1抗体或抗CD3抗体刺激后，通过流式细胞术评估被工程改造为表达上述CAR的Jurkat细胞中的Erk1/2磷酸化。温育后，将细胞用甲醛固定，透化，与对磷酸化Erk1/2特异的抗体一起温育，并通过流式细胞术分析。如图1所示，在抗ID A-1抗体存在下温育细胞后，观察到Erk1/2磷酸化的增加水平与在交联剂存在下用抗CD3抗体刺激所观察到的增加水平相似。即使在交联不存在的情况下也观察到两种抗体诱导相似程度的Erk1/2磷酸化。
进一步使用Western印迹来比较在交联剂抗体存在或不存在下在用抗ID A-1、同种型对照或抗CD3刺激后或在刺激不存在的情况下在表达CAR的Jurkat细胞或不表达CAR的亲本Jurkat细胞中的Erk磷酸化。结果表明，用抗独特型抗体刺激特异性地增加了用抗CD19(SJ25C1衍生的)CAR转导的Jurkat细胞中的Erk1/2磷酸化，但在亲本Jurkat细胞中则不然(其中仅观察到背景信号，类似于未刺激细胞和同种型对照刺激的细胞)，其程度与抗CD3抗体所诱导的程度相似。相反，抗CD3抗体以非特异性方式(即在表达CAR的Jurkat细胞和亲本Jurkat细胞两者中)诱导了磷酸化。
C.序列鉴定
确定了抗ID A-1抗体的序列。使用PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)，使用同种型特异性反义引物或通用引物，从含有表达抗ID A-1抗体的杂交瘤克隆的杂交瘤细胞中提取总RNA，并且生成cDNA。进行RACE PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)和恒定区，然后将其分别克隆到克隆载体中并测序。表2列出了抗体的核苷酸或氨基酸序列的相应SEQ ID NO。
表2.抗ID A-1序列
实施例2针对FMC63衍生抗体的抗独特型抗体的生成
本实施例描述了识别示例性抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的结合结构域(scFv)部分的抗独特型抗体的生成，所述抗CD19嵌合抗原受体含有抗CD19 scFv，所述抗CD19 scFv具有衍生自FMC63(一种含有分别在SEQ ID NO:30和31中列出可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的抗体)的VH和VL结构域。scFv在SEQ ID NO:34中列出，并含有由SEQ ID NO:33中列出的接头分开的VH和VL区。
A.杂交瘤生成和抗体筛选
用含有该CAR的scFv部分(SEQ ID NO:34)的可溶性蛋白免疫小鼠，所述scFv部分与人IgG1 Fc结构域融合(SEQ ID NO:32；该蛋白质缺乏铰链区)。用于免疫的可溶性蛋白试剂在SEQ ID NO:35中列出。
通过ELISA测试从免疫小鼠分离的血清，通过用二级抗体检测所述血清与scFv-Fc部分结合的能力。针对仅含有Fc结构域(SEQ ID NO:32)的肽对克隆进行反筛选，以选择不与用于免疫小鼠的scFv-Fc的Fc部分交叉反应的抗独特型抗体。还针对含有衍生自另一种CD19抗体的scFv的构建体对克隆进行反筛选，以进一步选择不与不同的抗CD19抗体交叉反应的抗独特型抗体，所述另一种CD19抗体为SJ25C1(具有由SEQ ID NO:25中列出的接头分开的可变区序列SEQ ID NO:23和24)，所述scFv与无铰链Fc结构域(SEQ ID NO:32)融合。
生成杂交瘤融合克隆，并通过流式细胞术进一步表征12个候选克隆。从人受试者中分离外周血单核细胞，激活所述细胞并用编码抗CD19CAR的病毒载体转导。对于流式细胞术，将每100μL约1x 106个细胞与10μL的生物素缀合的抗独特型抗体一起温育，然后用PE缀合的链霉亲和素染色。作为CAR表面表达的阳性对照，用抗EGFR抗体将细胞染色，以验证EGFRt转导标志物的表达，其为CAR表达的替代物。作为模拟对照，用不表达CAR的空载体转导PBMC。针对CD3+CD4+/CD8+PBMC对细胞设门并测定荧光信号。结果显示，候选抗独特型抗体显示出针对PBMC表面上的CAR的特异性结合。为了证实所述抗体对衍生自抗CD19抗体(衍生自FMC63)的scFv是特异的，在用衍生自SJ25C1的抗CD19 CAR转导的细胞上进行相似的实验，如实施例1中所述。针对FMC63衍生的抗体的候选抗独特型抗体都没有表现出对表达不同的抗CD19 CAR的细胞的特异性结合，所述不同的抗CD19 CAR含有衍生自SJ25C1的scFv。选择抗独特型抗体克隆B-1(抗ID B-1)和B-2(抗ID B-2)用于进一步表征。
B.序列鉴定
确定了抗ID B-1和B-2抗体的序列。使用PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(Takara，目录号6110A)，使用同种型特异性反义引物或通用引物，从含有表达抗ID B-1或抗ID B-2抗体的杂交瘤克隆的杂交瘤细胞中提取总RNA，并且生成cDNA。进行RACE PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)和恒定区，然后将其分别克隆到克隆载体中并测序。表3列出了抗体的核苷酸或氨基酸序列的相应SEQ ID NO。
表3.抗ID B-1和B-2序列
实施例3平板结合的抗独特型抗体对T细胞刺激的影响
本实施例描述了在实施例1中描述的SJ25C1特异性抗独特型抗体(抗ID A-1)存在下或在实施例2中描述的FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体(抗ID B-1)的存在下温育CAR T细胞后的结果。
从人受试者中分离外周血单核细胞，并用编码具有结合结构域的抗CD19 CAR的病毒载体激活并转导所述细胞，所述结合结构域包括具有衍生自FMC63或衍生自SJ25C1的VH和VL结构域的scFv。将这样的载体引入细胞中，以分别生成经过工程改造以表达含有FMC63衍生的scFv的CAR的T细胞，以及经过工程改造以表达含有SJ25C1衍生的scFv的CAR的T细胞。在FMC63衍生的CAR的情况下，CAR编码构建体进一步包括编码截短的EGFR(EGFRt)的序列，其用作转导和CAR表达的替代标志物；EGFRt编码区通过T2A跳跃序列与CAR编码序列分开。在各种测定法中评估所述工程化细胞。
对于增殖研究，用50nM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)或CELL TRACE VIOLET(CTV)染料标记工程化T细胞。在相关的情况下，通过用抗EGFR抗体染色来检测替代EGFRt标志物的表达。将细胞以每孔固定数目的细胞接种在用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0)中的10、5、2.5或1.25μg/ml的OKT3(抗CD3抗体)或识别SJ25C1和FMC63的抗独特型抗体(分别为抗ID A-1和抗ID-B-1)预先过夜包被的孔中。将接种在无抗体包被的孔中的细胞作为阴性对照。将细胞培养4天并评估活力、增殖以及CD69和CD25的表达。
使用流式细胞术通过染料稀释来评估表达抗CD19(SJ25C1或FMC63)CAR的T细胞的增殖。在用抗ID A-1刺激表达抗CD19(SJ25C1)CAR的T细胞后观察到的CD3+/CFSE低细胞的百分比示于图2A中。在用抗ID B-1刺激表达抗CD19(FMC63)CAR的T细胞后观察到的CD3+/EGFR+/CFSE低细胞的百分比示于图2B中。观察到在SJ25C1衍生的scFv特异性抗ID A-1抗体的存在下温育导致表达抗CD19(SJ25C1)CAR的T细胞的增殖，其水平与用抗CD3抗体刺激相当(图2A)。相比之下，在对不同的抗CD19 CAR结合结构域特异的其他抗Id(FMC63衍生的scFv特异性抗ID B-1)存在下温育的表达抗CD19(SJ25C1)CAR的T细胞中观察到的增殖与在没有任何刺激剂的细胞中观察到的相似。类似地，观察到在FMC63衍生的scFv特异性抗独特型抗体抗ID B-1的存在下温育导致表达抗CD19(FMC63衍生的结合结构域)CAR的T细胞的增殖，其水平与用抗CD3抗体刺激相当。相比之下，在识别不同的抗CD19 CAR(SJ25C1衍生的scFv特异性抗ID A-1抗体)的另一种抗Id存在下温育的细胞与在没有刺激剂的情况下温育的细胞观察到的相似(图2B)。这些结果证明，抗ID A-1和抗ID B-1中的每一者都能够刺激和诱导表达含有抗体特异性的对应scFv的CAR的T细胞的增殖，但不诱导表达不同的CAR的T细胞的增殖，所述不同的CAR针对相同的抗原但不含抗体特异性的特异性结合结构域。所述结果与抗ID A-1和抗ID B-1的能力一致，即，抗ID A-1和抗ID B-1特异性识别其对应的靶标而不识别含有针对相同抗原的其他结合结构域的CAR。
另一种测定法的结果证实了在该测定法中评估的示例性抗ID以抗ID浓度特异性方式向T细胞提供CAR特异性信号的能力，这与抗ID调节经由表达CD19特异性CAR的T细胞接收的信号量的效用一致。在该测定法中，用CELL TRACE VIOLET(CTV)标记模拟转导的和CAR转导的T细胞。在接种之前，用0.25、0.5或1μg/ml的对于抗CD19 CAR的结合结构域特异的示例性抗独特型抗体包被孔。将细胞培养4天，通过经由流式细胞术评估染料稀释程度来评估增殖。图2C显示了CD8+CAR T细胞增殖的抗独特型浓度依赖性诱导。这些结果证明了在各种情况下调节本文中提供的平板结合的示例性抗独特型抗体的量的能力，例如，以便调节表达CAR的T细胞的信号量和/或提供受控水平的刺激和/或优化刺激程度。
为了进一步探测抗ID A-1和抗ID B-1的刺激能力，使用流式细胞术评估用靶抗CD19 CAR(分别为SJ25C1衍生或FMC63衍生的)转导的T细胞在使用浓度为1.25、2.5、5和10μg/ml的平板结合的抗体刺激后两种T细胞活化标志物CD69和CD252的表达。将转导的T细胞针对EGFR设门，作为CAR表达的替代物，并评估CD4+或CD8+EGFR+细胞的CD69或CD25表达。
如图3所示，对于用SJ25C1衍生的抗CD19 CAR转导的T细胞，相比于用抗CD3抗体刺激的细胞，抗ID A-1在CD4+和CD8+T细胞两者中诱导了更高的CD25表达。抗ID A-1还诱导了CD4+和CD8+T细胞中CD69的表达，其水平与用抗CD3抗体刺激细胞时相似或略低。在未刺激细胞或用FMC63衍生的scFv特异性抗ID B-1处理的细胞中未观察到CD69和CD25表达。如图4所示，对于用FMC63衍生的抗CD19 CAR转导的T细胞，相比于用抗CD3抗体刺激的细胞，抗ID B-1在CD4+/EGFR+T细胞和CD8+/EGFR+T细胞两者中诱导了更高的CD25表达。与用抗CD3抗体刺激相比，抗ID B-1抗体也在CD4+/EGFR+T细胞中诱导了更高水平的CD69表达，并且其诱导水平与在CD8+/EGFRT+T细胞中的诱导水平相似或略高。在较高抗体浓度下在CD8+/EGFR+T细胞中的CD69表达相似或略高。在未刺激细胞或用SJ25C1特异性抗ID A-1处理的细胞中未观察到CD69和CD25表达。这些结果表明，抗ID A-1和抗ID-B-1两者都能够特异性地刺激表达含有其靶scFv的CAR的T细胞。
实施例4转基因产物特异性宿主免疫应答的分析
开发了抗治疗性抗体(ATA)桥接测定法，以检测被治疗受试者血清中识别所施用的抗CD19 CAR的抗体的存在或不存在。将实施例1-3中描述的某些抗ID用作阳性对照，并且验证该测定法检测这样的抗体的存在的能力。
使用生物素化的人Fc融合蛋白(生物素化的ECD融合蛋白)，其含有CAR的具有衍生自FMC63的可变区(在SEQ ID NO:34中列出)的scFv部分。将生物素化的ECD融合蛋白加入到链霉亲和素包被的孔中；将平板在允许融合蛋白结合的条件下培养，并洗涤。向生物素化融合蛋白包被的孔中加入各种浓度的抗ID B-1或抗ID-B-2，在允许抗体特异性结合的条件下温育。洗涤后，产生带有磺基标签形式的ECD融合蛋白(磺基-ECD融合蛋白)，其含有FMC63衍生的Fc-scFv融合物。洗涤孔并在Meso Scale Discovery(MSD)Sector Imager上读取电化学发光(ECL)信号。
如图5所示，ECL信号随着抗ID B-1和抗ID B-2的浓度增加而增加，表明该测定法可用于评估血清样品中抗体的存在或不存在和水平，其中任一示例性抗ID抗体用作阳性对照。
在一些实施方案中，利用使用抗ID B-1和/或抗ID B-2抗体作为阳性对照的ATA测定法，评估来自受试者的样品中针对CAR的ATA抗体的存在或不存在，所述受试者接受了一定剂量的含有表达抗CD19(FMC63)CAR的T细胞的细胞疗法的输注。在一些情况下，这样的ATA可能指示针对所施用的CAR的宿主体液免疫应答。在示例性测定法中，在各个时间点从受试者获得血浆样品，比如在输注之前和/或在开始施用细胞疗法之后第14天和第28天，并且在一些情况下，在第3个月、第6个月和/或第12个月。在如上所述的测定法中，将衍生自这样的血浆样品的样品与含有抗ID抗体的对照样品一起使用。
还产生了相似的桥接测定法来评估来自受试者的样品，所述受试者接受了一定剂量的含有表达抗CD19(SJ25C1)CAR的T细胞的细胞疗法的输注。在该测定法中，将抗ID A-1抗体用作阳性对照。正如基于阳性对照抗ID抗体和比血浆背景高4至5倍的信号确定的，观察到该测定法具有小于100ng/mL的灵敏度。
实施例5抗独特型抗体与珠子的缀合
使如实施例2中所述的抗ID B-1或抗-ID-B1任一者与可商购的甲苯磺酰基活化的磁珠(ThermoFisher,Waltham MA)的表面共价偶联，所述磁珠是超顺磁性、无孔、单分散、甲苯磺酰基活化的珠子。珠子共价结合伯氨基和巯基。使用具有大约2.8μm(命名为M-280)或4.5μm(命名为M-450)直径的珠子进行缀合。
将200μg抗ID抗体加入到大约1mL的甲苯磺酰基活化的珠子中(例如，具有2.8μm直径的大约4x109个甲苯磺酰基活化的珠子或具有4.5μm直径的约4x108个甲苯磺酰基活化的珠子)，通过在含有0.1％人血清白蛋白(HSA)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中在37℃下过夜温育进行共价偶联。洗涤珠子并重悬于具有0.1％ HSA的1mL PBS中。缀合后，使用Cellometer确定珠子浓度。
为了评估抗ID缀合的珠子的稳定性，使珠子沉淀，移除上清液并上样到4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上，将凝胶用考马斯蓝染色。作为缀合在珠子上的总蛋白的对照，将沉淀的珠子在4X(十二烷基硫酸锂)LDS样品缓冲液中在约70℃下煮沸20分钟，并且也在SDS-PAGE凝胶上运行大约12.5μL或25μL煮沸过的上清液，通过考马斯蓝评估。同样通过SDS-PAGE和考马斯染色评估未与珠子缀合的大约2.5μg或5.0μg抗独特型抗体(阳性对照)或5μL 0.1％ HSA(阴性对照)。在来自未曾煮沸的缀合样品的上清液中未检测到抗ID抗体，这表明缀合是稳定的，而在来自煮沸过的缀合样品的上清液中检测到抗ID抗体。
实施例6用抗独特型抗体缀合的珠子培养的T细胞的刺激的评估
将FMC63衍生的scFv特异性抗ID B-1缀合的珠子与T细胞一起温育。通过基于免疫亲和力的富集，从健康供体的白细胞单采术样品中分离CD3纯化的T细胞。用病毒载体转导分离的细胞，所述病毒载体编码具有衍生自FMC63的scFv的抗CD19 CAR。所述病毒载体构建体进一步编码截短的EGFR(EGFRt)，所述EGFRt用作CAR表达的替代标志物；EGFRt编码区通过T2A跳跃序列与CAR序列分开。转导后，使细胞在培养基中扩增，通过冷冻保存进行冷冻。
对于T细胞刺激研究，将解冻的表达CAR的CD4+或CD8+细胞分别以每孔大约50,000个总细胞接种。在一些情况下，培养基另外补充有如下细胞因子：对于CD4+细胞，大约1200IU/mL重组IL-7、20IU/mL重组IL-15和100IU/mL重组IL-2；对于CD8+细胞，大约200IU/mL重组IL-2和20IU/mL重组IL-15。将抗ID B-1缀合的珠子以1:1或1:5的细胞:珠子比添加到细胞中，并且温育长达14天，其中每2-3天更换一次50％的培养基。作为阳性对照，在存在或不存在指定的细胞因子的情况下，将细胞用抗CD3/抗CD28磁珠以3:1的细胞:珠子比培养。
在培养的不同时间，评估CD4+或CD8+转导的细胞(如通过抗EGFR检测替代标志物的表达)的扩增、PD-1表达和活力。
如图6和7所示，当细胞用抗ID缀合的珠子以1:1或1:5的细胞:珠子比培养时，分别观察到CD4+和CD8+T细胞的扩增，特别是在存在细胞因子的情况下。扩增程度高于用对照抗CD3/抗CD28磁珠培养细胞时的扩增程度。
在培养的第3天、第7天、第10天和第14天，通过流式细胞术评估CD4+细胞亚群上PD-1的表面表达。如图8所示，PD-1表达在用抗CD3/抗CD28磁珠培养的细胞上是高的，然而，在用抗ID缀合的珠子培养的细胞中的PD-1水平显著更低或不可检出。
如图9所示，当在细胞因子存在下另外培养细胞时，将CD4+和CD8+T细胞用抗ID缀合的珠子或对照抗CD3/抗CD28缀合的珠子以1:1或1:5比培养，其活力百分比在培养期间一致地保持高水平。然而，在所有条件下，细胞活力在没有添加细胞因子的情况下降低，其中在细胞培养的后几天出现细胞活力的最大丧失。
实施例7用抗独特型抗体缀合的珠子培养的T细胞的细胞因子产生的评估
基本上如实施例6中所述，生成了用具有衍生自FMC63的scFv的抗CD19 CAR工程改造的T细胞。在存在Golgi抑制剂的情况下，将解冻的CD8+T细胞与抗ID B-1缀合的珠子一起培养4小时。通过流式细胞术，确定了CAR+T细胞亚群(如通过用抗EGFR的替代EGFRt转导标志物的阳性表面染色确定)或CAR-T细胞亚群(如通过用抗EGFR的EGFRt的阴性表面染色确定)中的TNFα、IFNγ和IL-2的细胞内细胞因子水平。作为比较，以1:2的效应细胞:T细胞比，还将CAR+T细胞(EGFR+)与表达CD19的靶细胞(经转导以表达CD19、K562-CD19的K562细胞)一起培养。
如图10A所示，当在抗ID B-1缀合的珠子存在下培养细胞时，在CAR+T细胞(EGFRt+)中诱导了TNFα、IFNγ和IL-2细胞因子的细胞内细胞因子水平，而在CAR-T细胞(EGFR-)中则不然。在本研究中，在抗ID缀合的珠子存在下观察到的刺激程度类似于使用表达抗原的K562-CD19细胞刺激CAR+T细胞的情况，所述K562-CD19细胞是替代的CAR特异性刺激试剂(图10B)。这些结果证明，与珠子缀合的抗ID是激动性的并且特异性地刺激表达具有被抗ID抗体识别的抗原结合结构域的CAR的T细胞。此外，珠子试剂与细胞系相比提供了更好的CAR特异性刺激试剂，而后者需要细胞培养并且易于发生批间变异性。
实施例8连续再刺激后的扩增评估
细胞在重复刺激后离体扩增的能力可能是CAR+T细胞存留能力的潜在替代物(例如，在初始激活后)和/或指示体内功能(Zhao等人(2015)Cancer Cell,28:415-28)。如上所述生成CAR+T细胞，并将解冻的表达CAR的CD4+或CD8+T细胞分别以50,000个CAR+细胞/孔接种于平板。如实施例6中所述，在存在或不存在细胞因子的情况下以1:1或1:5的细胞:珠子比将抗ID B-1缀合的珠子添加到细胞中。作为对照，在存在或不存在细胞因子的情况下，以3:1的细胞:珠子比将抗CD3/抗CD28磁珠添加到细胞中。每3-4天收获细胞并计数，在将细胞数重新设定为每轮的初始接种密度后，使用相同的培养条件用新的靶细胞再刺激。在14天培养期间进行总共4轮刺激。针对每轮刺激，确定倍增数。
如图11所示，在用抗ID缀合的珠子再刺激后观察到表达CAR的(EGFR+)CD4+细胞的持续细胞扩增，不过当在细胞因子存在下培养细胞时扩增程度更高。同样，扩增程度高于用抗CD3/抗CD28珠子培养细胞时的扩增程度。对于CD8+T细胞，当在抗ID缀合的珠子或抗CD3/抗CD28珠子的存在下培养细胞时观察到相似的扩增动力学，不过当用抗ID缀合的珠子培养细胞时扩增程度稍微更高，特别是在没有添加重组细胞因子的情况下。
实施例9使用抗独特型抗体缀合的珠子进一步分析CAR特异性细胞扩增
进行了与实施例7和8中所述相似的研究，不同之处在于使用由两个不同的患者供体产生的表达CAR的T细胞。从两个供体患者的外周血单核细胞(PBMC)分离CD3纯化的T细胞，将其用编码具有衍生自FMC63的scFv的抗CD19 CAR的病毒载体转导，在培养基中扩增，冷冻，解冻。
将解冻的CD4+、CD8+或CD4/CD8的共培养物(1:1比例)以大约5x106个总细胞/孔接种于6孔板的孔中，其中培养基中另外补充有如下细胞因子：对于CD4+细胞或CD4+/CD8+共培养物，培养基补充有大约1200IU/mL重组IL-7、20IU/mL重组IL-15和100IU/mL重组IL-2；对于CD8+细胞，培养基补充有200IU/mL重组IL-2和20IU/mL重组IL-15。将抗ID B-1缀合的珠子以1:1的细胞:珠子比添加到细胞中，并且温育长达9天，其中每2-3天更换一次50％的培养基。
在培养的不同时间，评估每种条件的培养物中存在的CD4+或CD8+转导细胞的数目(通过抗EGFR检测替代标志物的表达)，并确定表达CAR的细胞的扩增倍数或频率(为占总细胞的百分比)。还测定了PD-1和CD25的表达和细胞活力。
如图12A所示，当单独用抗ID缀合的珠子培养CD4+细胞时，观察到表达CAR的(EGFRt+)CD4+T细胞的超过60倍扩增。对于CD8+T细胞，当将CD8+T细胞与CD4+细胞共培养时，在抗ID缀合的珠子存在下出现表达CAR的(EGFRt+)CD8+T细胞的显著更高的扩增。如图12B所示，在抗ID缀合的珠子存在下培养9天期间，表达CAR(EGFRt+)的CD4+或CD8+的频率增加，在第9天的培养物中存在大于90％的转导细胞(EGFRt+)。在培养期间CD4+和CD8+细胞的活力也保持接近100％，其中当CD8+T细胞与CD4+T细胞共培养时观察到的活力略高(图12C)。对两个供体观察到相似的结果。
在用抗ID缀合的珠子培养的第5天、第7天和第9天，通过流式细胞术评估在转导的(EGFRt+)CD4+或CD8+细胞上的PD-1和CD25的表面表达。如图13A所示，在CD4+和CD8+T细胞两者上的PD-1表达都随着用抗ID缀合的珠子培养的时间过去而显著降低。如图13B所示，在抗ID缀合的珠子存在下培养9天后，CD25表达也降低。对两个供体观察到相似的结果。
实施例10用抗独特型抗体缀合的珠子培养后细胞因子水平和表型的比较
从两个供体患者的外周血单核细胞(PBMC)分离CD3纯化的T细胞，将其用编码具有衍生自FMC63的scFv的抗CD19 CAR的病毒载体转导，并且用抗CD3抗体和抗CD28抗体任一者包被的珠子培养扩增。扩增后，通过冷冻保存将扩增的T细胞冷冻。为了研究，将冷冻的T细胞解冻并评估CD4+和CD8+T细胞的细胞内细胞因子水平或表面表型(d＝0)，或者将解冻的CD4+、CD8+或CD4+/CD8+共培养T细胞在抗ID B-1缀合的珠子存在下另外培养9天，然后在通过PMA/离子霉素或CD19转导的K562细胞刺激之后评估细胞内细胞因子水平和表面标志物表型(d＝9)。
为了评估细胞内细胞因子水平，加入Golgi抑制剂维持4小时，然后通过流式细胞术评估TNFα、IFNγ和IL-2。对于所有条件，与用CD19转导的K562细胞的CAR特异性刺激相比，当用PMA/离子霉素刺激细胞时，细胞内细胞因子表达的程度显著更高。如图14A所示，与在抗ID缀合的珠子存在下进一步培养9天的相应的CD4+或CD8+细胞或CD4/CD8 T细胞的共培养物相比，在解冻后即刻的CD4+或CD8+细胞中的TNFα和IL-2细胞因子的水平是相似的。与解冻之后即刻的CD4+或CD8+T细胞中的IFNγ水平相比，在解冻后在抗ID缀合的珠子存在下进一步培养9天的CD4+、CD8+或CD4/CD8共培养T细胞中观察到IFNγ水平增加。这些结果证明，在用抗ID缀合的珠子扩增9天后，T细胞功能被维持。在来自两个供体的细胞中获得了相似的结果。
还在解冻之后即刻(d＝0)评估了CD4+或CD8+细胞中的活化标志物CD25的表面表达、抑制性受体PD-1和LAG-3的表面表达以及增殖标志物Ki-67的核表达，或者在抗ID缀合的珠子存在下另外培养9天之后评估在单独扩增的CD4+或CD8+T细胞中或CD4/CD8共培养物中的上述各项表达(d＝9)。如图14B所示，与解冻之后即刻的T细胞相比，在抗ID缀合的珠子存在下进一步培养9天的细胞中观察到CD25表达降低，而Ki-67则不然。在CD8+细胞中的CD25表达降低比CD4+细胞中的降低显著更多。另外，与解冻之后即刻的细胞中的表达相比，在与抗ID缀合的珠子一起温育9天后，在单独培养的CD4+和CD8+细胞两者或CD4/CD8共培养物中也观察到PD-1和LAG-3的表达降低。这个结果证明，在与抗ID缀合的珠子一起温育后，先前冷冻的转导细胞保留了功能能力，这通过高百分比的标志物Ki-67(指示细胞增殖)阳性细胞得以证明，但也表现出以CD25活化标志物和抑制性受体标志物PD-1和LAG-3的低表面表达为特征的不同的活化状态。
实施例11用抗独特型抗体检测表达CAR的细胞.
产生了含有表达抗CD19 CAR的CAR-T细胞的T细胞组合物，所述抗CD19 CAR含有具有衍生自FMC63抗体的可变区的CD19 scFv、免疫球蛋白间隔物、衍生自CD28的跨膜结构域、衍生自4-1BB的共刺激区和CD3ζ细胞内信号传导结构域。编码CAR的病毒构建体进一步编码EGFRt替代标志物，所述EGFRt替代标志物通过T2A跳跃序列与CAR序列分开。
将表达抗CD19 CAR的细胞掺入到含有健康人外周血单核细胞(PBMC)的细胞样品中。将得到的细胞组合物与不同浓度的抗CD19 FMC63scFv特异性抗ID B1或抗ID B2抗体一起温育。作为对照，还将每种条件的样品与一定浓度的抗EGFR抗体一起温育，所述抗EGFR抗体能够检测转导细胞上的EGFRt替代标志物。对照样品包括仅含有PBMC而没有添加额外的表达CAR的T细胞的样品。将阳性标记的细胞中的几何平均荧光强度(MFI)定量，以评估抗体染色。
如图15A所示，两种抗独特型抗体均以浓度依赖性方式检测具有抗CD19 CAR的T细胞，所述抗CD19 CAR具有scFv，所述scFv具有衍生自FMC63的可变区。如图15B所示，在含有表达CAR的细胞的组合物中，抗ID B1和抗ID B2抗体检测到阳性细胞，而在仅含有PBMC的组合物中则不然。针对EGFRt的染色表明，在所有条件下，表达转基因的细胞与PBMC的比例是一致的。所述结果证实了抗ID B1和抗ID B2抗体特异性地检测表达抗CD19 FMC63 scFvCAR的细胞的能力，甚至在含有不表达CAR的人PBMC的样品中也是如此。所述结果与以下解释一致：抗独特型抗体可用于检测来自受试者(已被施用被所述抗体识别的表达CAR的细胞)的样品(比如从人受试者收集的外周血样品)中的表达CAR的细胞，例如用于测量这样的细胞在受试者的各种组织和/或体液中随时间过去的扩增、运输和/或持久性。
本发明并不意图限于特定公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如用于说明本发明的各个方面。根据本文中的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施这样的变化，并且这些变化预期落入本公开的范围内。
序列
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Claims (10)

1.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链，所述重链含有与SEQ ID NO:38中列出的重链氨基酸序列至少85％的序列同一性；和
轻链，所述轻链含有与SEQ ID NO:42中列出的轻链氨基酸序列至少85％的序列同一性；
其中所述抗独特型抗体或其抗原结合片段特异性地结合靶抗体，所述靶抗体为抗体FMC63或其抗原结合片段，其中所述靶抗体或其抗原结合片段含有SEQ ID NO:30中列出的重链可变区和SEQ ID NO:31中列出的轻链可变区。
2.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其各自含有SEQ ID NO:58中列出的VH区氨基酸序列中含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其各自含有SEQ ID NO:62中列出的VL区氨基酸序列中含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
3.一种抗独特型抗体或其抗原结合片段，其包含：
CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其各自含有SEQ ID NO:1中列出的VH区氨基酸序列中含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和
CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其各自含有SEQ ID NO:5中列出的VL区氨基酸序列中含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
4.一种鉴定抗独特型抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：
(a)向受试者引入可溶性免疫试剂，所述可溶性免疫试剂含有与增溶模块融合的靶抗体的抗原结合片段；和
(b)鉴定来自受试者的与靶抗体或其抗原结合片段特异性地结合的抗体。
5.一种确定与嵌合抗原受体(CAR)结合的分子的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)使结合试剂与来自已经施用细胞疗法的受试者的样品在形成包含所述结合试剂和与所述结合试剂结合的来自样品的分子的复合物的条件下接触，所述细胞疗法包含用包含靶抗体的CAR工程改造的细胞，所述靶抗体为抗体SJ25C1或抗体FMC63或其抗原结合片段，其中所述结合试剂含有包含靶抗体或其抗原结合片段的CAR的细胞外结构域或其部分；和
(b)检测所述复合物的存在或不存在，由此确定结合CAR的分子的存在或不存在。
6.权利要求1的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链可变(VH)区，并且其中：
所述CDR-H1含有SEQ ID NO:44中列出的序列；所述CDR-H2含有SEQ ID NO:45中列出的序列；以及所述CDR-H3含有SEQ ID NO:46中列出的序列；或
所述CDR-H1含有SEQ ID NO:88中列出的序列；所述CDR-H2含有SEQ ID NO:91中列出的序列；以及所述CDR-H3含有SEQ ID NO:46中列出的序列；或
所述CDR-H1含有SEQ ID NO:89中列出的序列；所述CDR-H2含有SEQ ID NO:92中列出的序列；以及所述CDR-H3含有SEQ ID NO:46中列出的序列；或
所述CDR-H1含有SEQ ID NO:90中列出的序列；所述CDR-H2含有SEQ ID NO:93中列出的序列；以及所述CDR-H3含有SEQ ID NO:94中列出的序列。
7.权利要求6的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述重链含有与SEQ ID NO:36中列出的VH区氨基酸序列具有90％序列同一性的VH区；以及所述轻链含有与SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列具有90％序列同一性。
8.权利要求1的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含含有CDR-L2和CDR-L3的轻链可变(VL)区，其各自包含SEQ ID NO:40中列出的VL氨基酸序列含有的CDR-L2和CDR-L3序列。
9.权利要求1的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中
所述重链包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，其各自包含SEQ ID NO:36中列出的VH区氨基酸序列中含有的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的氨基酸序列；和
所述轻链包含含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其各自包含SEQ ID NO:40中列出的VL区氨基酸序列中含有的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的氨基酸序列。
10.权利要求1的抗独特型抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区，以及所述轻链包含含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其中：
所述CDR-H1包含SEQ ID NO:44中列出的序列；所述CDR-H2包含SEQ ID NO:45中列出的序列；所述CDR-H3包含SEQ ID NO:46中列出的序列；所述CDR-L1包含SEQ ID NO:47中列出的序列；所述CDR-L2包含SEQ ID NO:48中列出的序列；所述CDR-L3包含SEQ ID NO:49中列出的序列；或
所述CDR-H1包含SEQ ID NO:88中列出的序列；所述CDR-H2包含SEQ ID NO:91中列出的序列；所述CDR-H3包含SEQ ID NO:46中列出的序列；所述CDR-L1包含SEQ ID NO:47中列出的序列；所述CDR-L2包含SEQ ID NO:48中列出的序列；所述CDR-L3包含SEQ ID NO:49中列出的序列；或
所述CDR-H1包含SEQ ID NO:89中列出的序列；所述CDR-H2包含SEQ ID NO:92中列出的序列；所述CDR-H3包含SEQ ID NO:46中列出的序列；所述CDR-L1包含SEQ ID NO:47中列出的序列；所述CDR-L2包含SEQ ID NO:48中列出的序列；所述CDR-L3包含SEQ ID NO:49中列出的序列；或
所述CDR-H1包含SEQ ID NO:90中列出的序列；所述CDR-H2包含SEQ ID NO:93中列出的序列；所述CDR-H3包含SEQ ID NO:94中列出的序列；所述CDR-L1包含SEQ ID NO:95中列出的序列；所述CDR-L2包含SEQ ID NO:96中列出的序列；所述CDR-L3包含SEQ ID NO:97中列出的序列。
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