KR20200064060A - 재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약 - Google Patents

재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약 Download PDF

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콜린 하우스킨스
스콧 후쎌
캐서린 시에라
멜리사 웍스
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 세포를 자극, 농축, 증폭 및/또는 활성화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 결합분자, 예컨대 폴리펩티드 항원 또는 항-이디오타입 항체에 부착된 입자, 예를 들어, 비드 입자와 인큐베이션하여 세포를 생체 외 또는 시험관 내에서 자극, 농축, 증폭 및/또는 활성화시키는 것을 포함한다. 또한 본 명세서에서 항-CD3/항-CD28 항체 및/또는 하나 이상의 재조합 사이토카인과 인큐베이션하지 않은 것과 같이 활성화 제제 또는 자극 제제와 이전에 인큐베이션한 적이 없는 세포를 부착된 결합분자를 갖는 입자의 존재 하에 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시킴으로서 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 양자 면역 요법을 위해 세포, 예를 들어, 유전적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 방법에 사용될 수 있다.

Description

재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약
본 발명은 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 세포(engineered cell)를 자극, 농축, 증폭 및/또는 활성화시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 재조합 수용체를 인식하거나 결합하는 부착된 결합분자를 갖는 입자, 예를 들어 비드 입자와의 인큐베이션에 의한 세포의 생체 외 또는 시험관 내 자극, 농축, 증폭 및/또는 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 부착된 결합분자는 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 수용체에 결합하는 폴리펩티드 항원 또는 항-이디오타입 항체이다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 양자 면역 요법(adoptive immunotherapy)을 위해 세포, 예를 들어 유전자 조작된 T 세포를 제조하는 방법에 사용될 수 있다.
양자 세포 면역 요법 또는 암 요법에 사용하기 위해 시험관 내 항원-특이적 T 세포를 증폭시키는 것을 포함하여 시험관 내 또는 생체 외에서 세포 집단을 자극 또는 증폭시키기 위한 다양한 전략이 이용 가능하다. 연구, 진단 및 치료 목적을 포함하여 세포 집단을 자극하거나 증폭하기 위해 개선된 전략이 필요하다. 상기 요구를 충족시키는 시약, 방법 및 제조 물품 및 키트가 제공된다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 7월 29일에 출원된 미국 가출원 제 62/538,671호("재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약"); 2017년 12월 8일에 출원된 미국 가출원 제 62/596,742호("재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약"); 2018년 2월 9일에 출원된 미국 가출원 제 62/628,889호("재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약"); 및 2018년 5월 1일에 출원된 미국 가출원 제 62/665,468호("재조합 수용체를 발현하는 세포 증폭용 시약")의 우선권을 주장하며 상기 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 전자 포맷으로 서열 목록과 함께 출원되었다. 서열 목록은 크기가 123,336 바이트이고, 2018년 7월 27일에 생성된 735042007340SeqList.TXT라는 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자 포맷의 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
본 명세서에 세포를 증폭하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다수의 입자를 가진 항원과 특이적으로 결합하거나 또는 인식하는 세포 외 항원-결합 도메인을 함유하는 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 상기 다수의 입자 각각은 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 결합분자를 함유하고, 여기서 항원-결합 도메인에 결합분자의 결합은 재조합 항원 수용체를 함유하는 세포의 증폭을 유도하여 증폭된 세포를 함유하는 산출 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유한다. 일부 경우에, 항원-결합 단편은 단일 사슬 항체 단편이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 항원-결합 단편은 가요성 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 항원 결합 단편은 scFv이거나 이를 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린(ephrin) B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스(Lewis) Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린(mesothelin), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란(melan) A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG; 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스(Wilms) 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자 중 선택된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원 및 유니버설 태그와 관련된 항원 중 선택된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 재조합 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역에 결합하거나 이를 인식하지 않으며, 상기 링커 또는 스페이서 영역은 항원-결합 도메인을 항원 수용체의 막 관통 도메인에 연결한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 항원 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 명세서에 세포를 증폭하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 복수의 입자를 갖는 항원과 특이적으로 결합하거나 또는 인식하는 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 함유하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 상기 복수의 입자 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 결합분자를 함유하고, 여기서 항원-결합 도메인에 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 키메라 항원 수용체를 함유하는 세포의 증폭을 유도하여 증폭된 세포를 함유하는 산출 조성물을 생산한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 함유한다.
본 명세서에 세포를 증폭하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 복수의 입자, 예를 들어 비드를 갖는 항원을 특이적을 인식하거나 또는 결합하는 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 함유하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 상기 복수의 입자 각각은 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 함유하는 결합분자를 함유하고, 여기서 항원-결합 도메인에 재조합 항원 또는 이의 일부의 결합은 키메라 항원 수용체를 함유하는 세포의 증폭을 유도하여 증폭된 세포를 함유하는 산출 조성물을 생산한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지됨), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 상호변이효소, 도파크롬 델타-이성화효소 또는 DCT로도 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자 중 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138 및 병원체-특이적 항원 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 전술한 것 중 어느 하나의 부분 중에서 선택된다. 일부 경우에, 재조합 항원은 BCMA, CD22 또는 ROR1이거나 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 이의 일부이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부를 반드시 함유한다.
일부 구현예에서, 본 명세서는 세포를 증폭하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 상기 투입 조성물은 항원-결합 도메인을 특이적으로 인식하거나 또는 이와 결합하는 부착된 결합분자를 갖는 비드이거나 또는 비드를 포함하는 복수의 입자를 갖는 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 이와 결합하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하고, 여기서 (i) 복수의 입자는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL(수치 포함) 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL(수치 포함)를 포함하는 결합분자 농도를 갖는 조성물로부터 유래하고, 인큐베이션하는 동안 투입 조성물에 존재하는 전체 세포 대 복수의 분자의 비는 5:1 내지 1:5 또는 약 5:1 내지 1:5를 포함하고; (ii) 항원-결합 도메인에 결합분자의 결합은 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포의 증폭을 유도하여 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
또한 본 명세서는 세포를 증폭하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 복수의 입자, 예를 들어 비드를 갖는 B 세포 성숙 항원(BCMA)을 특이적으로 인식하거나 또는 이와 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 함유하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA의 세포 외 도메인 또는 BCMA의 세포 외 도메인의 일부를 함유하는 결합분자를 함유하고, 여기서 항원-결합 도메인에 BCMA의 세포 외 도메인 또는 이의 일부의 결합은 키메라 항원 수용체를 함유하는 세포의 증폭을 유도하여 증폭된 세포를 함유하는 산출 조성물을 생산한다. 일부 실시예에서, BCMA의 일부는 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부로 반드시 구성된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 재조합 항원을 함유하는 융합 폴리펩티드 또는 모이어티(moiety)에 연결된 이의 일부이고, 임의로 상기 모이어티는 입자에 대한 부착을 용이하게 한다. 일부 경우에, 상기 모이어티는 재조합 항원의 C-말단에 연결된다. 일부 경우에, 상기 모이어티는 소수성이거나 또는 소수성 아미노산이 농축되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 모이어티는 Fc 도메인이거나 또는 이를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원은 CD19이다.
또한 본 명세서는 세포를 증폭하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 복수의 입자, 예를 들어 비드를 갖는 CD19를 특이적으로 인식하거나 또는 이와 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 함유하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 상기 복수의 입자 각각은 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 결합분자를 합유하고, 여기서 항원-결합 도메인에 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 키메라 항원 수용체를 함유하는 세포의 증폭을 유도하여 증폭된 세포를 함유하는 산출 조성물을 생산한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원-결합 단편은 scFv이거나 또는 이를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원 또는 재조합 항원은 인간이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 면역글로불린 불변 영역의 일부를 함유한다. 일부 실시예에서, 적어도 면역글로불린 불변 영역의 일부는 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 Fc 영역을 함유하거나 또는 Fc의 일부를 함유한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전한 항체 또는 전장 항체이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 또는 비공유 결합으로 부착된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 결합분자의 C-말단 아미노산 잔기에서 또는 이의 근방에서 복수의 입자 각각에 부착되고/거나 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에 결합분자의 부착은 항원 수용체의 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 결합분자 영역 또는 에피토프가 항원 수용체에 의해 인식될 수 있도록 배향되게 수행된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자, 예를 들어 비드는 합성 입자, 불용성 입자, 고체 입자이거나 또는 비세포성 입자이다. 본 명세서에 개시된 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 비드이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자는 비드를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 하나 이상의 중합체이거나 올리고머이거나 또는 이를 포함하고/거나 중합체이고/거나 올리고머이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자는 1 μm 내지 10 μm 또는 약 1 μm 내지 10 μm 또는 2 μm 내지 5 μm 또는 약 2 μm 내지 5 μm 사이의 평균 직경을 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 2.8 μm의 평균 직경을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 4.5 μm의 평균 직경을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 0.5 g/cm3 내지 5.0 g/cm3 또는 1 g/cm3 내지 2 g/cm3 또는 약 1 g/cm3 내지 약 2 g/cm3 사이의 평균 밀도를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 1.3 g/cm3의 평균 밀도를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 1.5 g/cm3의 평균 밀도를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 단순 분산성(monodisperse)이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 입자에 공유 결합으로 부착된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 결합분자의 부착을 위해 표면 노출 작용기를 함유하고/거나 여기서 결합분자는 표면 노출 작용기를 통해 입자에 공유 결합으로 부착된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 표면 노출 작용기는 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기, 클로로메틸기, 에폭시기, 히드록실기, 토실기 또는 히드라진기다. 일부 구현예에서, 표면 노출 작용기는 토실기다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 생체 적합성이거나 세포에 대해 비독성이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물, 히드록시 카르복실산의 공중합체, 디카르복실산의 공중합체 또는 금속을 포함하는 입자를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자, 예를 들어 비드는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 탄소 또는 이의 조합물을 포함하는 표면을 함유한다. 일부 실시예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 이의 조합물이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자는 소수성 표면을 포함하는 입자를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 폴리스티렌 표면을 포함하는 입자를 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 자성인 입자를 함유하고/거나 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL(수치 포함) 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL(수치 포함)를 포함하는 결합분자 농도를 갖는 조성물로부터 유래한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상 또는 약 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상인 결합분자 농도를 갖는 조성물로부터 유래한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 결합분자를 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상 또는 약 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상을 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하여 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하는 제제(agent)의 존재하에 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 제제는 입자, 예를 들어 비드와 함께 제공되고, 선택적으로 상기 제제는 복수의 입자 또는 이의 서브세트 각각에 의해 함유된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 제제는 복수의 입자, 예를 들어 비드와 별개로 제공된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자, 예를 들어 비드는 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하여 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하는 제제를 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 제제는 리간드이거나 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 분자는 공자극 분자이거나 또는 활성 공수용체다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 공자극 분자 또는 활성 공수용체는 OX-40, ICOS, DAP10, CD28 또는 4-1BB이다. 일부 구현예에서, 분자는 활성화 수용체 또는 공수용체, 예컨대 OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 또는 4-1BBL의 리간드이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 분자는 억제 수용체이다. 일부 실시예에서, 상기 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 제제는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 분자는 억제 수용체의 리간드이고, 예컨대 PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 또는 LIGHT이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자와 입자, 예를 들어 비드에 함유된 제제의 비율, 선택적으로 몰비 또는 중량비는 1:1이거나 또는 약 1:1이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물에 존재하는 전체 세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2이거나 또는 약 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물에 존재하는 전체 세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 1:0.1 내지 1:5이거나 또는 약 1:0.1 내지 1:5이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물에 존재하는 전체 세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 1:1이거나 또는 약 1:1이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 인큐베이션은 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일 또는 14 일 이상 또는 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일 또는 14 일 초과 또는 약 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일 또는 14 일 초과 동안 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 인큐베이션은 30 ℃ 내지 39 ℃(수치 포함)를 포함하는 온도에서 또는 약 30 ℃ 내지 39 ℃(수치 포함)를 포함하는 온도에서 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 인큐베이션은 37 ℃ ± 2.0 ℃의 온도에서 수행된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포는 면역 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 면역 세포는 T 세포이거나 NK 세포이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1이거나 또는 약 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포는 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터 얻어진 1 차 세포이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 세포는 인간이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물은 조성물에 있는 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 도입하기 위한 조건 하에서, 재조합 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 세포 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
본 명세서는 또한 세포를 유전적으로 조작하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조성물에 있는 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 도입하기 위한 조건 하에서, 재조합 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 세포 조성물을 접촉시켜 투입 조성물을 생산하는 단계; 및 투입 조성물의 세포를 본 명세서에 기재된 방법에 따라 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 접촉시키는 단계와 인큐베이션하는 단계의 적어도 일부는 동시에 수행된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 핵산 분자는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 또는 트랜스포존 내에 포함된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 접촉은 트랜스포존/전위효소 유전자 전달에 의해 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 접촉은 바이러스 벡터로 형질 도입에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 선택적으로 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 경우에, 접촉은 세포 조성물을 갖는 바이러스 벡터를 원심분리접종하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 원심분리접종은 원심분리 챔버의 내부 공동에서 바이러스 벡터 입자 및 세포 조성물을 회전시키는 것을 포함하고, 여기서 회전은 공동 측벽의 내부 표면에서의 상대적인 원심분리 힘이고, 이는 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g(각각의 수치 포함)이거나 또는 약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g(각각의 수치 포함)이거나; 또는 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g 또는 2000 g 이상이거나 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g 또는 2000 g 이상이다. 일부 구현예에서, 원심분리접종은 약 5 분 이상, 약 10 분 이상, 약 15 분 이상, 약 20 분 이상, 약 30 분 이상, 약 45 분 이상, 약 60 분 이상, 약 90 분 이상 또는 약 120 분 이상; 또는 5 분 내지 60 분, 10 분 내지 60 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각각의 수치 포함)이거나 또는 약 5 분 내지 60 분, 10 분 내지 60 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각각의 수치 포함)의 시간 동안 한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 접촉은 형질 도입 보조제의 존재하에 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포 조성물은 복수의 T 세포를 함유하고, 상기 방법은 접촉하기 전에 T 세포를 자극하거나 활성화시키는 단계를 포함하지 않는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포 조성물은 복수의 T 세포를 함유하고, 상기 방법은 접촉 전에, TCR 복합체를 통한 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하지 않고/거나 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 분화를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들; 및/또는 CD3-결합분자, CD28-결합분자, 재조합 IL-2, 재조합 IL-15 및 재조합 IL-7 또는 이의 조합물의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 접촉 전에, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체의 존재 하에 T 세포를 자극하는 것을 포함하지 않는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포 조성물은 복수의 T 세포를 함유하고, 상기 복수의 세포는 대상체 샘플로부터 얻어지고, 여기서 접촉은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 24 시간 이내에 시작되고/거나; 접촉 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간 또는 24 시간 초과의 시간 동안 15 ℃, 18 ℃, 22 ℃ 또는 25 ℃ 초과의 온도 또는 약 15 ℃, 약 18 ℃, 약 22 ℃ 또는 약 25 ℃ 초과의 온도에 노출되지 않았고/거나; 접촉 전에, T 세포는 대상체로부터 샘플을 수득한 후 15 분, 30 분, 1 시간 또는 2 시간 초과의 시간 동안 37 ℃ ± 2.0 ℃ 온도, 약 37 ℃ ± 2.0 ℃ 온도, 37 ℃ ± 2.0 ℃ 초과의 온도, 약 37 ℃ ± 2.0 ℃ 이상의 온도에 노출되지 않았다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 접촉 전에, T 세포의 5 %, 10 %, 20 %, 30 % 또는 40 % 이내가 활성화된 세포이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표면 마커를 발현하며; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현을 포함하고, 세포 주기 중 G1 단계이거나 G1 후기 단계에 있고/거나 증식할 수 있다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 인큐베이션 또는 접촉 전에, 세포를 함유하는 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것 및 선택적으로 샘플로부터 세포, 선택적으로 T세포를 선택하거나 농축하는 것을 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물 내 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포의 백분율은 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작거나 또는 약 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 세포 조성물 또는 투입 조성물은 1 x 102 개의 세포, 1 x 103 개의 세포, 1 x 104 개의 세포, 1 x 105 개의 세포, 1 x 106 개의 세포 또는 1 x 107 개 이상의 세포 또는 약 1 x 102 개의 세포, 1 x 103 개의 세포, 1 x 104 개의 세포, 1 x 105 개의 세포, 1 x 106 개의 세포 또는 1 x 107 개 이상의 세포를 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 산출 조성물에 존재하는 세포의 활성 마커 또는 소진 마커의 표면 발현은 유사한 인큐베이션 후이지만, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 다클론성 자극 분자의 존재 하에 생산된 세포 조성물 내 마커의 표면 발현보다는 적다. 일부 경우에, 상기 소진 마커는 억제 수용체이다. 일부 경우에, 상기 소진 마커는 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA 또는 TIGIT이다. 일부 실시예에서, 상기 활성 마커는 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 또는 4-1BB이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 표면 발현은 적어도 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배 이상이거나 또는 적어도 약 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배 이상이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 산출 조성물 내 세포 수는 유사한 인큐베이션에 의하지만, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 다클론성 자극 분자의 존재 하에 생산된 세포 조성물 내 세포 수와 실질적으로 동일하거나 그보다 많다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 다클론성 자극 분자는 항-CD3 항체 또는 단편 및/또는 항-CD28 항체 또는 단편을 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 산출 조성물 내 세포 수는 투입 조성물 내 세포 수보다 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배, 25 배, 50 배 초과 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배, 25 배, 50 배 초과, 100 배 이상 더 많다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 산출 조성물 내 재조합 항원 수용체를 함유하는 세포의 백분율은 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 이상보다 크거나 또는 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 이상보다 크다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 재조합 항원 수용체를 함유하는 산출 조성물 내 세포 수는 투입 조성물 내 항원 수용체를 함유하는 세포 수에 비해 1.2 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 6.0 배, 7.0 배, 8.0 배, 9.0 배, 10 배 이상 증가하거나 농축된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 적어도 인큐베이션의 일부는 세포 증폭 또는 세포 활성을 조절하는 하나 이상의 추가 제제의 존재 하에 수행된다. 일부 경우에, 상기 하나 이상의 추가 제제는 레날리도마이드(lenalidomide)이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원 수용체는 CAR 및 ITAM을 함유하는 세포 내 신호 전달 도메인이 추가된 CAR이다. 일부 경우에, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 추가로 공자극 신호 전달 영역을 함유한다. 일부 측면에서, 상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 실시예에서, 공자극 도메인은 CD28이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 추가로 산출 조성물로부터 복수의 입자, 예를 들어 비드를 제거하는 것을 포함한다.
본 명세서는 본 명세서에서 제공된 임의의 방법으로 생산된 세포 조성물을 제공한다. 또한 본 명세서는 입자의 표면에 결합된 결합분자 및 입자를 함유하는 표면 개질 입자를 제공하고, 여기서 상기 결합분자는 항원 수용체의 세포 외 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 상기 결합분자는 재조합 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역을 인식하거나 이와 결합하지 않고, 상기 링커 또는 스페이서 영역은 항원-결합 도메인을 항원 수용체의 막 관통 도메인에 연결한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 재조합 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지됨), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 상호변이효소, 도파크롬 델타-이성화효소 또는 DCT로도 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 함유한다. 일부 측면에서, 상기 재조합 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138 및 병원체-특이적 항원 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 전술한 것 중 어느 하나의 부분 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 항원은 CD19, BCMA, CD22 또는 ROR1이거나 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 이의 일부이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부로 반드시 구성된다.
본 명세서는 입자의 표면에 결합된 결합분자 및 입자를 함유하는, 표면 개질 입자를 제공하고, 여기서 상기 결합분자는 B 세포 성숙 항원(BCMA)의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 결합분자는 모이어티에 연결된 재조합 항원 또는 이의 일부를 함유하는 융합 폴리펩티드고, 선택적으로 여기서 상기 모이어티는 입자에의 부착을 용이하게 한다. 일부 경우에, 상기 모이어티는 재조합 항원의 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 모이어티는 소수성이거나 또는 소수성 아미노산이 농축되어 있다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 모이어티는 Fc 도메인이거나 이를 함유한다. 일부 경우에, 상기 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 재조합 항원은 인간이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 항원은 CD19이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 scFv이거나 또는 이를 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 함유한다. 일부 경우에, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부는 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 불변 영역 또는 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전한 항체 또는 전장 항체이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 또는 비공유 결합으로 부착된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 결합분자의 C-말단 아미노산 잔기 또는 그 근방에서 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에 부착되고/거나 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에 결합분자의 부착은 항원 수용체의 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 결합분자의 영역 또는 에피토프가 항원 수용체에 의해 인식될 수 있도록 배향되게 수행된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 합성 입자, 불용성 입자, 고체 입자이거나 또는 비세포성 입자이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 비드를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 입자는 1 μm 내지 10 μm(각각의 수치 포함) 또는 약 1 μm 내지 10 μm(각각의 수치 포함) 또는 2 μm 내지 5 μm(각각의 수치 포함) 또는 약 2 μm 내지 5 μm(각각의 수치 포함)의 직경을 갖는다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 입자는 약 2.8 μm의 직경을 갖는다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 입자는 약 4.5 μm의 직경을 갖는다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 결합분자의 부착을 위해 표면 노출 작용기를 함유하고/거나 여기서 상기 결합분자는 표면 노출 작용기를 통해 입자에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 표면 노출 작용기는 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기, 클로로메틸기, 에폭시기, 히드록실기, 토실기 또는 히드라진기다. 일부 경우에, 상기 표면 노출 작용기는 토실기다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 생체 적합성이거나 또는 세포에 대해 비독성이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물, 히드록시 카르복실산의 공중합체, 디카르복실산의 공중합체 또는 금속을 함유하는 입자, 예를 들어 비드를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자, 예를 들어 비드는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 탄소 또는 이의 조합물을 포함하는 표면을 함유한다. 일부 경우에, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 이의 조합물이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 소수성 표면을 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자, 예를 들어 비드는 폴리스티렌 표면을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 자성이고/거나 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 함유한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 결합분자의 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상 또는 결합분자의 약 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상을 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 입자는 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하여 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하는 제제를 추가로 함유하여 세포의 증폭을 조절한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 제제는 리간드이거나 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 분자는 공자극 분자이거나 또는 활성 공수용체다. 일부 실시예에서, 상기 공자극 분자 또는 활성 공수용체는 OX-40, ICOS, DAP10, CD28 또는 4-1BB이다. 일부 구현예에서, 분자는 활성화 수용체 또는 공수용체, 예컨대 OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 또는 4-1BBL의 리간드이다. 일부 경우에, 분자는 억제 수용체이다. 일부 실시예에서, 상기 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT이다. 일부 구현예에서, 분자는 억제 수용체의 리간드, 예컨대 PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 또는 LIGHT이다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 제제는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자 및 입자에 함유된 제제의 비율, 선택적으로 몰비 또는 중량비는 1:1이거나 약 1:1이다.
본 명세서는 본 명세서에 기재된 복수의 표면 개질 입자, 예를 들어 비드를 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 결합분자의 농도가 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL(각각의 수치 포함)이거나 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL(각각의 수치 포함)인 조성물로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 결합분자의 농도가 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상이거나 또는 약 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상인 조성물로부터 유래한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 단순 분산성이다.
본 명세서는 또한 본 명세서에 기재된 임의의 입자, 예를 들어 비드 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 경우에, 지침은 세포 집단으로부터 결합분자에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 함유하는 항원 수용체를 발현하는 세포를 선택하거나 농축하기 위한 것이다. 일부 경우에, 지침은 세포 집단으로부터 결합분자에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 함유하는 항원 수용체를 발현하는 세포를 증폭시키기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포의 백분율은 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작거나 또는 약 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작다.
본 명세서는 본 명세서에 기재된 임의의 입자, 예를 들어 비드 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 세포 집단과 인큐베이션하는 것을 포함하여 세포를 증폭시키는 방법을 제공한다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 입자, 예를 들어 비드 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물과 세포 집단을 접촉시키는 것을 포함하는 세포를 선택하거나 농축시키는 방법을 제공한다.
본 명세서는 투입 조성물에 있는 세포 내 CAR-의존 활성을 자극하는 조건 하에서 투입 조성물을 10 일 이상의 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법을 제공하고, 상기 투입 조성물은 항원에 특이적으로 결합하거나 이를 특이적으로 인식하는 세포 외 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 함유하여, 산출 조성물을 생산하고; 산출 조성물의 하나 이상의 세포의 활성 또는 하나 이상의 표현형을 평가한다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, CAR-의존 활성을 자극하는 조건은 CAR의 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 결합분자의 존재를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 결합분자는 지지체에 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 지지체는 고체 지지체이다. 일부 구현예에서, 상기 고체 지지체는 마이크로플레이트의 웰 또는 비드 표면이다. 일부 구현예에서, 상기 고체 지지체는 마이크로플레이트에 부착된 결합분자를 갖는 마이크로플레이트이고, 인큐베이션은 마이크로플레이트 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 고체 지지체는 부착된 결합분자를 갖는 비드이고 인큐베이션은 복수의 비드의 존재 하에 수행된다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 결합분자는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 항원 또는 이의 일부는 BCMA이거나 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 이의 일부이다. 일부 구현예에서, 상기 결합분자는 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함한다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물은 재조합 사이토카인을 포함하지 않는 배지의 존해 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 연속적으로 수행되거나 기간 동안 중단되지 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션하는 동안, 세포를 재플레이팅하지 않고, 배지는 교환되지 않으며 결합분자는 추가되지 않는다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 산출 조성물의 하나 이상의 세포의 활성, 소진 또는 분화 상태의 하나 이상의 표현형을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 소진이고 상기 평가는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2b4, BTLA, TIM3, VISTA 또는 CD96으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로 표면 발현을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 활성이고 상기 평가는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 또는 Ki67로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로 표면 발현을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 분화 상태이고 상기 평가는 (i) CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 중 하나 이상 및/또는 (ii) CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 측정하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 마커는 나이브-유사 T 세포와 양성으로 또는 역으로 관련된 마커이다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 산출 조성물의 하나 이상의 세포의 하나 이상의 활성을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 활성은 CAR-의존 활성, 선택적으로 항원-자극 활성을 포함한다. 장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 하나 이상의 활성은 세포 용해 활성 또는 사이토카인 생산을 포함한다.
임의의 장기 자극 방법 중 일부 구현예에서, 기간은 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일 이상 또는 약 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일 이상이다. 일부 구현예에서, 기간은 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일이거나 또는 약 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일이다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 투입 조성물은 인큐베이션 전 테스트 제제 또는 화합물에 노출되었거나 또는 접촉했던 세포를 함유하고, 선택적으로 상기 노출 또는 접촉은 CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하기 위한 하나 이상의 공정 단계 중에 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 투입 조성물에서 수행되고, 상기 복수의 투입 조성물 각각은 상이한 공정에 의해 생산된다.
장기 자극 방법의 임의의 구현예 중 일부에서, 방법은 산출 조성물의 표현형 또는 활성과 대조군 조성물의 표현형 또는 활성을 비교하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 대조군 조성물은 CAR-의존 활성을 자극하기 위한 같은 조건 하에서 10 일 이상 동안 인큐베이션된 T 세포 조성물이고, 상기 T 세포 조성물은 테스트 제제 또는 화합물의 존재 하에 생산되지 않았거나 또는 투입 조성물과 비교하여 대안적인 공정으로 생산되었다. 일부 구현예에서, 방법은 예컨대 대조군 조성물과 비교하여, 감소된 소진, 감소된 활성 또는 저하된 분화를 나타내는 산출 조성물을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 저하된 분화는 하나 이상의 나이브-유사 T 세포 마커의 발현 증가를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 BCMA 접합-비드와 함께 인큐베이션한 후 CAR을 발현하지 않는CD3+ 세포(모의)와 항-BCMA CAR을 발현하는 CD3+ T 세포(CAR T 세포)를 염색한 Cell Trace Violet(CTV)의 막대 그래프를 나타낸다.
도 2a는 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드(왼쪽) 또는 BCMA-접합 비드(오른쪽)와 함께 인큐베이션한 후 세포에서의 CD25 표면 발현(y-축) 및 CTV 염색 강도(x-축)에 대한 점 도표를 나타낸다.
도 2b는 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드 또는 BCMA-접합 비드로 처리한 후 세포의 CTV 염색 막대 그래프를 나타낸다.
도 2c는 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드 또는 BCMA-접합 비드와 함께 세포를 인큐베이션한 후 CD4+ 세포(왼쪽) 또는 CD8+ 세포(오른쪽)에서의 PD-1 발현의 막대 그래프를 나타낸다.
도 3a는 최대 14 일 동안 BCMA-접합 비드와 함께 CAR-발현 T 세포를 함유하는 3 개의 상이한 T 세포 조성물(상이한 도너로부터 각각 생성됨) 각각의 인큐베이션 후 항-BCMA CAR+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 각 세포 조성물로부터의 결과는 삼각형, 사각형 및 원으로 별개로 표시된다.
도 3b는 최대 14 일 동안 BCMA 접합 비드와 함께 4 일, 7 일, 14 일의 인큐베이션 후에 CD8+ 세포에서 CD25(왼쪽), CCR7(중앙) 및 CD27(오른쪽)의 검출을 위한 평균 형광 강도(MFI)로 결정된 표면 발현을 나타낸다. 결과는 도 3a에 기재된 항-BCMA CAR 발현 세포를 함유하는 3 개의 상이한 세포 조성물 각각에 대해 도시되고 삼각형, 사각형 및 원으로 별개로 표시된다.
도 4a는 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 CD25의 표면 발현에 대한 그래프를 나타낸다. 도 4b는 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에 있는 PD-1의 표면 발현에 대한 막대 그래프 도표를 나타낸다. BCMA 50, BCMA 25, BCMA 10 및 BCMA 5는 대략 4x108 개의 비드 당 50, 25, 10 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 5a 및 도5b는 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 총 CD3+ T 세포 수(도 5a) 또는 CD4+ T 세포 상의 CTV 증식 마커 염료 수준(도 5b)을 나타내는 그래프를 도시한다. BCMA 50, BCMA 25, BCMA 10 및 BCMA 5는 대략 4x108 개의 비드 당 50, 25, 10 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 6은 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포 상의 CD25 표면 발현을 나타내는 그래프를 도시한다. BCMA 50, BCMA 25, BCMA 10 및 BCMA 5는 대략 4x108 개의 비드 당 50, 25, 10 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 7a 내지 도 7h는 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션된 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에서의 증식 수준 또는 다양한 마커에 대한 염색을 도시한다. 도 7a는 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 CD25의 표면 발현에 대한 유동 세포 측정 막대 그래프를 도시한다. 도 7b는 T 세포 대 비드(200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물)의 상이한 비율로 또는 고정된 항-CD3와 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 CD25의 표면 발현에 대한 유동 세포 측정 막대 그래프를 도시한다. 도 7c는 T 세포 대 비드(200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물)의 상이한 비율로 또는 고정된 항-CD3와 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 CD69의 표면 발현에 대한 유동 세포 측정 막대 그래프를 도시한다. 도 7d는 T 세포 대 비드(200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물)의 상이한 비율로 또는 고정된 항-CD3와 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 TIM3의 표면 발현에 대한 유동 세포 측정 막대 그래프를 도시한다. 도 7e는 T 세포 대 비드(200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물)의 상이한 비율로 또는 고정된 항-CD3와 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 PD-1의 표면 발현에 대한 유동 세포 측정 막대 그래프를 도시한다. 도 7f는 5μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 T 세포 대 비드를 1:1의 비율로 비드(200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물)와 함께 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 있는 전체 세포의 CTV 염색(증식 측정)의 막대 그래프 도표를 도시한다. 도 7g 및 도 7h는 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 T 세포 대 비드의 비율을 1:1로 비드(200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물)와 함께 또는 고정된 항-CD3와 함께 각각 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널)에서 CD25에 대한 유동 세포 측정 막대 그래프를 도시한다. 상기 도면에서, "50," "100," 및 "200"은 대략 4x108 개의 비드 당 50, 100 및 200 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 8a 내지 도 8i는 0 μM, 0.5 μM 또는 50 μM 레날리도마이드 존재 하에 상이한 양의 BCMA-접합 비드 또는 항-CD3 및 항-CD28 접합 비드와 함께 인큐베이션하거나 자극없이 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에 존재하는 CD4+ T 세포(왼쪽 패널) 또는 CD8+ T 세포(오른쪽 패널) 상 또는 내에서의 전사 인자 및 활성 마커의 수준을 나타내는 그래프를 도시한다. Blimp1(도 8a), CD25(도 8b), CD31(도 8c), PD-1(도 8d), TbeT(도 8e), EOMES(도 8f), GATA3(도 8g), Helios(도 8h) 및 Ikaros(도 8i)의 수준이 도시된다. 200 BCMA, 50 BCMA 및 5 BCMA는 대략 4x108 개의 비드 당 200, 50 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 5μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 2 개의 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물을 인큐베이션한 후 배양물로부터의 IFN-감마(도 9a), IL-2(도 9b) 및 TNF 알파(도 9c)의 세포 외 수준을 나타내는 그래프를 도시한다. 50 μg BCMA 및 5 μg BCMA는 대략 4x108 개의 비드 당 50 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 9d는 0 μM, 1 μM 또는 5 μM 레날리도마이드의 존재 하에 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 2 개의 상이한 도너(도너 A 및 도너 B) 세포로부터 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물을 인큐베이션한 후 배양물로부터의 세포 외 IL-2 수준을 나타내는 그래프를 도시한다. 200 BCMA 및 5 BCMA는 대략 4x108 개의 비드 당 200 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 9e는 50 μg BCMA 비드로 CAR 자극(stim) 2 시간 후 인산화된 STAT5(pSTAT5)의 유동 세포 측정 분석을 도시한다. 자극을 주지 않은 대조군은 점선으로 도시되었다. 도 9f는 BCMA 비드 자극 24 시간 후에 대표적인 정상 CAR T 도너에서 세포 내 사이토카인 수준의 유동 세포 측정 분석(형질 도입되고 살아 있는 CD3+에 게이팅)을 도시한다.
도 9g 및 도 9h는 5 μM 레날리도마이드의 존재 하에 상이한 양의 BCMA-접합 비드로 4 일(도 9g) 또는 7 일(도 9h) 동안 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물의 배양 후 전체 세포 계수를 도시한다. 50 BCMA 및 5 BCMA는 대략 4x108 개의 비드 당 50 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 9i는 5 μM 레날리도마이드의 존재(5uM Len) 또는 레날리도마이드의 부재(비히클)에서 BCMA-접합 비드와 함께 4 일 또는 7 일 동안 인큐베이션한 후 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 CTV 염색(증식 측정)의 막대 그래프 도표를 도시한다.
도 9j 및 도 9k는 5 μM 레날리도마이드의 존재 또는 레날리도마이드의 부재(비히클)에서 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 4 일(도 9j) 또는 7 일(도 9k) 동안 항-BCMA CAR+ T 세포 조성물을 인큐베이션한 후 항-EGFR 항체로 결정된 바와 같은 EGFRt 대리 마커에 양성인 세포의 백분율을 나타내는 그래프를 도시한다. "50" 및 "5"는 대략 4x108 개의 비드 당 50 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 9l은 5 μM 레날리도마이드의 존재 또는 레날리도마이드의 부재(비히클)에서 상이한 양의 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션된 항-BCMA CAR+ T 세포 이펙터 세포에 의한 RPMI-8226 표적 세포의 세포 사멸 백분율을 도시한다. 추가로 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에서, 이펙터 세포 대 표적 세포를 3:1 또는 1:1의 비율로 함유하는 조성물의 용해 활성을 도시한다. "50" 및 "5"는 대략 4x108 개의 비드 당 50 및 5 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 BCMA-접합 비드를 각각 나타낸다.
도 9m은 BCMA-접합 비드(대략 4x108 개의 비드 당 50 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 50 μg/mL 조성물)와 함께 24 시간 또는 7 일 동안 인큐베이션된 RPMI-8226 표적 세포 및 새로운 항-BCMA CAR+ T 세포 이펙터 세포 또는 항-BCMA CAR+ T 세포 이펙터 세포를 함유하는 배양물에서 사멸 평가 중에 생산된 세포 외 IFN-감마의 수준을 나타내는 그래프를 도시한다. 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율을 0.3:1 또는 1:1로 함유하는 배양으로부터의 결과가 도시된다.
도 9n은 BCMA-접합 비드(대략 4x108 개의 비드 당 50 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 50 μg/mL 조성물)와 함께 24 시간 또는 7 일 동안 인큐베이션된 RPMI-8226 표적 세포 및 새로운 항-BCMA CAR+ T 세포 이펙터 세포 또는 항-BCMA CAR+ T 세포 이펙터 세포를 함유하는 배양물에서 표적 세포 계수로 정규화된 세포 사멸을 도시한다. 결과는 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율을 0.3:1 또는 1:1로 함유하는 배양으로부터 도시된다.
도 10a 및 도 10b는 BCMA-접합 비드(대략 4x108 개의 비드 당 50 μg의 BCMA 양으로 비드와 함께 BCMA를 인큐베이션하여 생성된 50 μg/mL 조성물)와 함께 7 일 동안 인큐베이션된 항-BCMA CAR T 세포 조성물의 순차적인 재자극 평가 결과를 도시한다. 3 개의 상이한 도너 조성물로부터의 결과가 도시되었다. 도 10a 및 도 10b는 2 개의 상이한 도너에 대해 각각의 시점에서 항-BCMA CAR+ T 세포의 세포 용해 활성을 도시한다.
도 11은 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질 도입 직후 BCMA -접합 비드의 존재 하에서(실선) 또는 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드와 함께(점선) 인큐베이션된 5 개의 상이한 항-BCMA CAR+ 세포 조성물에서 시간의 흐름에 따른 CAR+ T 세포의 백분율을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 사이토카인의 존재(실선) 또는 사이토카인의 부재(파선) 하에서 대조군 항-CD3/항-CD28 항체로 코팅된 비드 또는 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드의 지시된 비율로 자극된 EGFRt+/CD4+ T 세포 또는 EGFRt+/CD4+ T 세포의 증폭 배수 및 누적 세포 수 각각을 도시한다. 항-CD3/항-CD28 항체 코팅된 비드 대 세포의 비 3:1(원), 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:1(사각형) 및 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:5(삼각형)로 자극한 결과가 도시된다.
도 13은 배양 3 일, 7 일, 10 일 및 14 일에서 유동 세포 측정에 의해 평가된 바와 같이 사이토카인의 존재(실선) 또는 사이토카인의 부재(파선) 하에서 대조군 항-CD3/항-CD28 항체로 코팅된 비드 또는 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드의 지시된 비율로 자극한 후 항-EGFR 항체에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 PD-1 발현 수준을 도시한다. 항-CD3/항-CD28 항체 코팅된 비드 대 세포의 비 3:1(원), 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:1(사각형) 및 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:5(삼각형)로 자극한 결과가 도시된다.
도 14는 배양 3 일, 7 일, 10 일 및 14 일에서 유동 세포 측정에 의해 평가된 바와 같이 사이토카인의 존재(실선) 또는 사이토카인의 부재(파선) 하에서 대조군 항-CD3/항-CD28 항체로 코팅된 비드 또는 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드의 지시된 비율로 자극한 후 유동 세포 측정으로 평가된 바와 같이 FMC63-유래 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 생존력을 도시한다. 항-CD3/항-CD28 항체 코팅된 비드 대 세포의 비 3:1(원), 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:1(사각형) 및 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:5(삼각형)로 자극한 결과가 도시된다.
도 15a는 FMC63-유래 scFv-특이적 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드로 자극한 후 FMC63-유래 CAR을 발현하는 T 세포의 IL-2, TNFα 및 IFNγ에 대한 세포 내 사이토카인 염색을 도시한다. EGFRt 대리 마커(EGFRt+ 또는 EGFRt-)에 대해 양성 또는 음성인 CD8+ T 세포 결과가 도시된다.
도 15b는 항원-발현 K562-CD19 세포로 자극한 후 FMC63-유래 CAR을 발현하는 T 세포의 IL-2, TNFα 및 IFNγ에 대한 세포 내 사이토카인 염색을 도시한다. EGFRt 대리 마커에 대해 양성인 CD8+ T 세포 결과가 도시된다.
도 16는 사이토카인의 존재(실선) 또는 사이토카인의 부재(파선) 하에서 대조군 항-CD3/항-CD28 항체로 코팅된 비드 또는 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드의 지시된 비율로 자극한 후 FMC63-유래 CAR을 발현하는 T 세포의 14 일 배양 기간에 걸친 순차적인 자극 평가에서 집단 수의 배가를 도시한다. EGFRt 대리 마커(EGFRt+)에 대해 양성인 CD8+ T 세포 또는 EFGRt 대리 마커(EGFRt+)에 대해 양성인 CD4+ T 세포에 대한 결과가 도시된다. 항-CD3/항-CD28 항체 코팅된 비드 대 세포의 비 1:3(원), 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:1(사각형) 및 항-ID B-1 코팅된 비드 대 세포의 비 1:5(삼각형)로 자극한 결과가 도시된다.
도 17a 내지 도 17c는 FMC63-유래 scFv-특이적 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드와 함께 공배양(파선)되었거나 또는 단독 배양(실선)된, FMC63-유래 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 자극 후 결과를 도시한다. 2 개의 상이한 도너(원 및 사각형으로 도시됨)에 대한 결과가 도시된다. 도 17a는 EGFRt 대리 마커(EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+)에 대해 양성이었던 배양에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증폭 배수를 도시한다. 도 17b는 EGFRt 대리 마커(EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+)에 대해 양성이었던 배양에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 빈도를 도시한다. 도 17c는 배양물에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 생존력을 도시한다.
도 18a 및 도 18b는 FMC63-유래 scFv-특이적 항-이디오타입 항체(항-ID B-1)로 코팅된 비드와 함께 공배양되었거나 또는 단독 배양된, FMC63-유래 CAR을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 자극 후 5 일, 7 일 및 9 일 배양에서 T 세포 표면 마커에 대한 유동 세포 측정 결과를 도시한다. 도 18a는 EGFRt 대리 마커(EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+)에 대해 양성이었던 배양에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 상의 PD-1 표면 발현을 도시한다. 도 18b는 EGFRt 대리 마커(EGFRt+/CD4+ 또는 EGFRt+/CD8+)에 대해 양성이었던 배양에서 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 상의 CD25 표면 발현을 도시한다.
도 19a는 PMA/이오노마이신 또는 CD19를 발현하는 K562 세포로 배양 중에 증폭되었던 FMC63-유래 CAR을 발현하는 T 세포를 함유하는 해동된 조성물 내에 존재하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 유동 세포 측정에 의해 평가된 바와 같이 TNFα, IFNγ 및 IL-2의 세포 내 사이토카인 수준을 도시한다. 항-ID B-1 접합 비드의 존재 하에 추가 9 일 동안 추가 배양한 후 또는 해동 시(d=0), 공배양 또는 단독배양으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포 내 사이토카인 수준이 도시된다.
도 19b는 PMA/이오노마이신 또는 CD19를 발현하는 K562 세포로 배양 중에 증폭되었던 FMC63-유래 CAR을 발현하는 T 세포를 함유하는 해동된 조성물 내에 존재하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 유동 세포 측정에 의해 평가된 바와 같이 CD25 또는 Ki67에 대해 양성인 세포의 빈도를 도시한다. 항-ID B-1 접합 비드의 존재 하에 추가 9 일 동안 추가 배양한 후 또는 해동 시(d=0), 공배양 또는 단독배양으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포 내 마커의 수준이 도시된다.
도 20a는 CAR 항원-특이적 세포 용해 활성에 대한 결과를 도시하고 도 20b는 레날리도마이드의 존재 대 레날리도마이드의 부재 하에 배양된 세포와 비교하여, 공배양 중의 BCMA 비드로 사전 자극되었던 항-BCMA CAR-T 세포(새롭게-해동된(사전에 자극되지 않은) 항-BCMA CAR-T 세포에 비해)에 대한 사이토카인 생산 결과를 도시한다. 도 20c는 3 개의 항-BCMA CAR T 도너에 대해 평가된 전반적인 생존력 및 세포 계수를 도시한다. 도 20d는 1 μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 7일 동안 BCMA 비드로 자극 후(전처리) CD4+ 및 CD8+ 항-BCMA CAR T 세포에 대한 CD25 및 PD-1의 표면 발현(평균 형광 강도(MFI))의 유동 세포 측정 분석 결과를 도시한다. 도 20e는 CD4+ CAR+ 및 CD8+ CAR+ 서브세트에서 T 세포 마커의 표면에서 PD-1 및 Lag3 양성 백분율 또는 평균 형광 강도(MFI; CD25 및 Tim3)에 대한 CAR T 도너에 걸친 유동 세포 측정 분석(살아 있는 CD3+ 세포에 게이트됨)을 도시한다. 기준선(Veh) MFI, 생존력 또는 계수 값이 백분율로 도시된다.
도 21a는 3 개의 도너 각각에 대해 기준선(비히클) 반응과 비교하여 1 μM 레날리도마이드의 존재 하에 24 시간 동안 50 μg BCMA 비드로 CAR-특이적 자극 후 이펙터 사이토카인 생산 분석을 도시한다.
도 21b는 CAR T 이펙터 사이토카인 생산에 대한 레날리도마이드 부재(왼쪽 막대) 또는 레날리도마이드 0.1 μM(중간 막대) 또는 레날리도마이드 1 μM(오른쪽 막대) 존재 하에 상이한 농도의 BCMA 비드(즉, 5 μg, 50 μg 및 200 μg)로 활성화된 항-BCMA CAR T 세포의 영향을 도시한다.
도 21c는 1 μM 레날리도마이드 존재 또는 부재 하에 비드에 PD-L1를 추가한 BCMA 비드 또는 추가하지 않은 BCMA 비드로 자극된 대표적인 정상 도너 및 다발성 골수종 환자로부터 유래한 항-BCMA CAR T 세포의 사이토카인 생산을 도시한다.
도 22a 및 도 22b는 항-BCMA CAR 발현 T 세포에서 사이토카인 생산을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 22a는 대략 4x108 개의 비드 당 200 μg/ml, 50 μg/ml 또는 5 μg/ml 농도의 접합된 BCMA(각각 200 μg, 50 μg 또는 5 μg BCMA)를 갖는 BCMA-접합 비드, 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드(CD3/CD28)와 함께 24 시간 인큐베이션 후 항-BCMA CAR 발현 T 세포 또는 비드 없이 인큐베이션된 세포(무자극)로부터 수집된 상청액에서 IFN-감마, IL-2, TNF-알파, IL-6, GM-CSF 및 IL-4의 농도(pg/mL)를 도시한다. 수평 파선은 정량 상한(ULOQ)을 나타낸다. 도 22b는 CD3/CD28 비드, 200 μg, 50 μg 또는 5 μg BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 또는 무자극에서 IFN-감마, IL-2 또는 TNF-알파의 세포 내 염색에 대해 양성인 CD4+CAR+ 세포(상단) 또는 CD8+CAR+ 세포(하단)의 백분율을 도시한다.
도 23a 및 도 23b는 항-CD19 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물의 활성을 나타내는 그래프를 도시한다. 세포는 14 일 동안 항-CD19 항체 항-ID 접합 비드와 인큐베이션되었거나(14 일; 2 차) 또는 활성 평가 전에 인큐베이션되지 않았다. CD19 발현 세포에 노출된 후 세포 독성 평가(도 23a) 및 세포 내 사이토카인 염색(ICS) 평가(도 23b) 결과가 도시된다.
도 24a 내지 도 24c는 14 일 동안 항-CD19 항체 항-ID 접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 또는 인큐베이션하는 동안 항-CD19 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물의 특성을 나타내는 그래프를 도시한다. 상이한 테스트 화합물 또는 비히클의 존재 하에 생성된 T 세포 조성물로부터의 결과가 도시된다. 도 24a 및 도 24b는 인큐베이션되지 않았거나(1 차) 또는 14 일 동안 인큐베이션된(2 차) T 세포 조성물의 CD19 세포 노출에 대한 반응 활성을 도시한다. CD19 발현 세포에 대한 노출 후에 ICS에 의한 다작용성 염색(도 24a) 및 세포 용해 활성 결과(도 24b)가 도시된다. 도 24c는 20 시간 동안 CD19 발현 세포와 1:1의 비율로 인큐베이션된 항-CD19 CAR 발현 세포를 함유하는 세포 조성물의 상청액으로부터 분비된 사이토카인의 수준을 도시한다. IL2, TNF 및 IFN-감마의 양이 측정되었고 3 가지 사이토카인 모두에 대한 조정된 점수의 평균이 도시된다.
도 25a 내지 도 25d는 항-CD19 CAR에 특이적인 항-이디오타입 항체와 접합된 비드 표면으로 자극한 후의 화합물 1, 화합물 2, DMSO 비히클 대조군 또는 배지만의 존재하에서 증폭되어 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터의 T 세포 활성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 25a는 항-이디오타입 항체와 접합된 비드 표면과 함께 공배양되어 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터의 T 세포 웰 당 총 살아 있는 T 세포 계수를 도시한다. 도 25b는 배지만의 대조군과 비교하여 살아 있는 T 세포 계수에 대해 계산된 곡선 하 면적(AUC)을 도시한다. 도 25c는 항-이디오타입 항체에 접합된 비드 표면과 함께 15 일 인큐베이션 후에 조사된 K562-CD19 표적 세포와 함께 16 시간 공배양으로 자극한 후에 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터의 T 세포에 의한 TNF-알파(TNF), IFN-감마(IFNg) 및 IL-2의 생산을 나타내는 그래프를 도시한다. 배지만의 조건과 비교한 세포 외 TNF-알파(TNF), IFN-감마(IFNg) 및 IL-2의 배수 변화가 도시된다. 도 25d는 항-이디오타입 항체와 접합된 비드와 함께 15 일 인큐베이션 후 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD8+ T 세포의 다작용성 사이토카인 프로필을 나타내는 그래프를 도시한다.
본 명세서는 재조합 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 농축, 증폭 및/또는 활성화하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공되는 방법은 재조합 수용체를 인식하거나 이와 결합하는 부착된 결합분자를 갖는 입자, 예를 들어, 비드 입자와 인큐베이션하여 세포를 생체 외 또는 시험관 내에서 농축, 증폭 및/또는 활성화하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 부착된 결합분자는 재조합 수용체에 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항-이디오타입 항체이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 조성물 및 방법은 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 증폭, 농축 또는 활성화하는 기존의 방법에 비해 하나 이상의 이점을 갖는다. 생체 외 또는 시험관 내 증폭을 위한 기존의 많은 프로토콜은 TCR 복합체 성분을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 세포, 예를 들어, T 세포를 인큐베이션하는 것에 의존한다. 예를 들어, 세포를 증폭시키기 위한 통상적인 프로토콜은 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체와 인큐베이션, 예컨대 상자성 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체와 세포를 인큐베이션하는 것이다. 상기 방법의 일 단점은 주어진 조성물, 예를 들어, 배양된 T 세포의 모든 또는 대부분의 세포가 항체와 접촉하고 자극될 것이라는 점이다. 따라서, 일부 구현예에서, 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉한 주어진 세포 조성물에 있어서, 전부 또는 대부분의 세포가 재조합 수용체를 발현하는지 여부와 상관없이 활성화되었다. 대조적으로, 특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 입자, 예를 들어 비드와 세포가 인큐베이션되는 경우, 입자, 예를 들어 비드의 결합분자는 직접 재조합 수용체에 결합하기때문에 수용체가 없는 세포와 비교하여 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 보다 큰 자극, 활성화, 증식 및/또는 증폭을 초래한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드와 함께 재조합 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 세포를 인큐베이션하면 재조합 수용체를 발현하는 세포의 일부, 부분 또는 서브세트를 증가시킨다.
특정 구현예에서, 다른 방법 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극하는 방법과 비교하여, 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드로 세포를 증폭, 농축 및/또는 활성화하는 일 장점은 본 명세서에서 제공되는 입자와의 인큐베이션은 기타 방법에 의한 증폭, 농축 및/또는 활성화된 세포와는 대조적으로 보다 덜 활성화되고/거나 소진된다는 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 입자와 인큐베이션된 세포는, TCR 복합체 성분, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체를 활성화시킬 수 있는 다클론성 자극 분자와 인큐베이션된 세포와 비교하여, 활성화, 예를 들어, CD25의 표면 발현 또는 소진, 예를 들어, PD1의 발현과 관련된 마커를 보다 낮은 수준으로 발현한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 처리 또는 인큐베이션하는 동안 세포로 재조합 수용체 또는 CAR을 암호화하는 핵산을 전달하기 위한 바이러스 또는 비바이러스 벡터로 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키기 위한 방법, 형질 도입 또는 형질 감염 공정의 적어도 일부를 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드의 존재 하에서 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키는 것의 일 장점은 다클론성 자극 분자, 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체로 사전에 활성화되지 않은 세포의 형질 도입 또는 형질 감염을 허용한다는 점이다. 특정 구현예로 다클론성 분자로 사전에 활성화되지 않고 형질 도입 또는 형질 감염된 세포는 형질 도입 또는 형질 감염 전에 활성화된 세포와 비교하여 증가된 지속성 및/또는 감소된 소진을 나타낼 것임이 고려된다.
특정 구현예로 기재된 바와 같은 입자, 예를 들어 비드에 부착된 특정 재조합 항원 또는 이의 단편은 항원을 인식하는 항원-결합 도메인을 함유하는 CAR을 특이적으로 자극하기 위한 용도에 특히 적합할 수 있음이 고려된다. 일부 경우에, 특정 재조합 항원, 예를 들어 BCMA는, 비특이적 상호 작용, 예컨대 비특이적 단백질-단백질 상호 작용 또는 세포와의 비특이적 상호 작용이 거의 없거나 전혀 없어서 세포에 의해 흡수되거나 세포에 비특이적으로 달라붙은 항원을 최소화하거나 방지할 수 있다. 일부 경우에, 상기는 CAR-발현 세포의 자극의 질을 개선시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 비드 또는 입자에의 부착은 재조합 항원이 상이한 고체 지지체, 예컨대 플레이트 또는 접시의 표면에 결합되거나 결합되지 않은 경우와 비교할 때 증가된, 향상된, 일관성 있고/거나 보다 신뢰할 수 있는 세포의 자극, 활성화 또는 증폭을 초래한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 BCMA 또는 이의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 부착된 재조합 BCMA를 함유하는 입자 또는 비드(예컨대 재조합 BCMA-FC 융합)는 세포 조성물 중의 세포를 활성화, 자극 또는 증폭하기 위한 제공된 방법과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 BCMA를 함유하는 입자 또는 비드는 BCMA, 예를 들어, 항-BCMA CAR을 인식하거나 이와 결합하는 항원-결합 도메인을 함유하는 재조합 수용체를 발현하는 세포를 선별적으로 활성화, 자극 또는 증폭시킨다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 항-BCMA CAR 발현 세포의 활성화, 자극 또는 증폭은 예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 시약과 같은 기타 시약에 의한 활성화, 자극 또는 증폭과 비교하여 보다 크거나 증가한다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 항-BCMA CAR 발현 세포의 활성화, 자극 또는 증폭은 예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 시약과 같은 기타 시약에 의한 활성화, 자극 또는 증폭과 비교하여 생체 내 및/또는 내인성 항원에 대한 반응에서 세포의 활성화, 자극 또는 증폭을 보다 잘 나타낸다. 일부 측면에서, 부착된 재조합 BCMA를 함유하는 입자 또는 비드 입자 또는 비드에 의해 세포가 활성화, 자극 또는 증폭되는 정도는 입자 또는 비드에 부착된 재조합 BCMA의 양을 변경함으로서 또는 입자의 비율 또는 비드 대 세포의 비율을 변경함으로서 조절, 변경 또는 제어될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 BCMA에 의한 세포, 예를 들어, 항-BCMA CAR 발현 세포의 활성화, 자극 또는 증폭은 재조합 BCMA가 입자 또는 비드에 부착된 경우가 재조합 BCMA가 자유롭게 부유하거나 부착되지 않은 경우 또는 재조합 BCMA가 상이한 표면, 예를 들어, 배양 접시 또는 플레이트에 부착된 경우보다 더 효과적이다.
일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 인식하거나 이와 결합하는 항-이디오타입 항체(항-ID)이다. 특정 구현예에서, 부착된 재조합 항-ID를 함유하는 입자 또는 비드가 세포 조성물 중의 세포를 활성화, 자극 또는 증폭하기 위해 제공된 방법과 함께 사용된다. 다양한 구현예에서, 항-ID를 함유하는 입자 또는 비드는 조성물 중의 세포, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 선별적으로 활성화, 자극 또는 증폭한다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, CAR 발현 세포의 활성화, 자극 또는 증폭은 예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 시약과 같은 기타 시약에 의한 활성화, 자극 또는 증폭과 비교하여 보다 크거나 증가한다. 특정 측면에서, 항-ID를 함유하는 입자 또는 비드 입자 또는 비드에 의해 세포가 활성화, 자극 또는 증폭되는 정도는 입자 또는 비드에 부착된 항-ID의 양을 변경함으로서 또는 입자의 비율 또는 비드 대 세포의 비율을 변경함으로서 조절, 변경 또는 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-ID는 항-CD19 항체 항-ID이다. 특정 구현예에서, 항-CD19 항체 항-ID를 함유하는 입자 또는 비드에 의한 항-CD19 CAR 발현 세포의 활성화, 자극 또는 증폭은 예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 시약과 같은 기타 시약에 의한 활성화, 자극 또는 증폭과 비교하여 보다 크거나 증가한다.
일부 구현예에서, 제공된 조성물 및 방법은, 대상체에 투여될 경우, 다른 기술로 증폭된 유전적으로 조작된 T 세포와 비교하여, 증가된 지속성 및/또는 감소된 소진을 나타내는 재조합 수용체 또는 CAR을 발현하는 유전적으로 조작된 T 세포를 증폭 및 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 증가된 지속성 및/또는 감소된 소진을 갖는 유전적으로 조작된 T 세포는 투여된 대상체 내에서 보다 좋은 효능을 나타낸다.
본 출원에서 참조된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함하는 모든 출판물은 각각의 개별적인 출판물이 개별적 참조로 편입된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 편입된다. 본 명세서에 제시된 정의가 참조로 본 명세서에 편입된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공개에 제시된 정의와 상반되거나 불일치하는 경우, 본 명세서에 제시된 정의가 참조로 본 명세서에 편입된 정의보다 우선한다.
본 명세서 사용된 섹션 제목은 구성상의 목적만을 위한 것이고 기재되는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 입자 접합
본 명세서는 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)의 항원-결합 도메인에 의해 인식되거나 이와 결합하는 결합 분자에 부착되거나 이에 접합되는 입자, 예컨대 비드와 이를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 비세포 입자이다.
A. 입자
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)의 항원-결합 도메인에 의해 인식되거나 이와 결합하는 결합 분자는 입자(예를 들어 비드 입자), 예를 들어 입자의 표면에 부착되거나 결합된다. 특정 구현예에서, 상기 입자는 비세포 입자이다. 특정 구현예에서, 상기 입자는 콜로이드 입자, 미소 구체, 나노입자, 비드, 예컨대 자성 비드 또는 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 입자 또는 비드는 생체 적합성, 즉 비독성이다. 특정 구현예에서 상기 입자 또는 비드는 배양된 세포, 예를 들어, 배양된 T 세포에 대해 비독성이다. 특정 구현예에서, 상기 입자는 단순 분산성이다. 특정 구현예에서, "단순 분산성(monodisperse)"은 5 % 미만의 표준 편차, 예를 들어, 직경의 5 % 미만의 표준 편차를 갖는 크기 분산의 입자(예를 들어 비드 입자)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자(예를 들어 비드 입자)는 결합분자, 예컨대 본 명세서에 기재된 결합분자(예를 들어, 항원 또는 항체)가 결합분자와 세포 사이의 상호 작용, 특히 결합분자와 재조합 수용체(예를 들어, 세포의 표면에 발현된 CAR) 사이의 결합을 허용하는 방식으로 부착되거나 결합될 수 있는 고체 지지체 또는 매트릭스를 제공한다. 특정 구현예에서, 접합되거나 또는 부착된 결합분자와 세포 사이의 상호 작용은 세포 표면에 있는 하나 이상의 재조합 수용체의 발현 또는 발현 수준에 기초하여 세포 집단에서 하나 이상의 세포 유형의 농축, 활성화, 자극 및/또는 증폭을 촉진하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 입자(예를 들어, 비드 입자)는 재조합 수용체, 예를 들어, 세포의 표면에 발현된 CAR의 항원 결합 영역에 결합하는 하나 이상의 결합분자(예를 들어, 항체 또는 항원)를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 생체 적합성, 즉, 생물학적 용도에 적합한 물질로 구성된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 배양된 세포, 예를 들어, 배양된 T 세포에 대해 비독성이다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 결합분자와 세포 사이의 상호 작용을 허용하는 방식으로 결합분자에 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 입자의 표면에서 결합분자의 부착을 허용하도록 개질, 예를 들어, 표면 작용기화될 수 있는 임의의 입자일 수 있다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물 또는 히드록시 카르복실산의 공중합체 및 디카르복실산으로 구성된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 직쇄 또는 분지형, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화, 선형 또는 가교, 알칸일, 할로알킬, 티오알킬, 아미노알킬, 아릴, 아랄킬, 알켄일, 아랄켄일, 이종아릴 또는 알콕시 히드록시산의 폴리에스테르 또는 직쇄 또는 분지형, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 선형 또는 가교, 알칸일, 할로알킬, 티오알킬, 아미노알킬, 아릴, 아랄킬, 알켄일, 아랄켄일, 이종아릴 또는 알콕시 디카르복실산의 폴리무수물로 구성되거나 또는 적어도 부분적으로 구성될 수 있다. 추가로, 입자, 예를 들어 비드는 양자점일 수 있거나 또는 양자점, 예컨대 양자점 폴리스티렌 입자, 예를 들어 비드로 구성될 수 있다. 에스테르와 무수물 결합의 혼합물(예를 들어, 글리콜산 및 세바식산의 공중합체)을 포함한 입자, 예를 들어 비드가 이용될 수도 있다. 예를 들어, 입자, 예를 들어 비드는 폴리글리콜산 중합체(PGA), 폴리락틱산 중합체(PLA), 폴리세바식산 중합체(PSA), 폴리(락틱-코-글리콜)산 공중합체(PLGA), [로(rho)]폴리(락틱-코-세바식)산 공중합체(PLSA), 폴리(글리콜-코-세바식)산 공중합체(PGSA) 등을 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 입자, 예를 들어 비드가 구성될 수 있는 기타 중합체는 카프로락톤의 중합체 또는 공중합체, 카보네이트, 아미드, 아미노산, 오르토에스테르, 아세탈, 시아노아크릴레이트 및 분해성 우레탄뿐만 아니라 직쇄 또는 분지형, 치환 또는 비치환, 알칸일, 할로알킬, 티오알킬, 아미노알킬, 알켄일 또는 방향족 히드록시- 또는 디-카르복실산을 갖는 이들의 공중합체를 포함한다. 또한, 반응성 측쇄 그룹, 예컨대 리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신 및 시스테인 또는 이들의 거울상 이성질체를 갖는 생물학적으로 중요한 아미노산이 결합분자 예컨대 폴리펩티드 항원 또는 항체에 접합하기 위한 반응성 그룹을 제공하도록 상기 언급된 임의의 물질과의 공중합체에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 0.001 μm 초과, 0.01 μm 초과, 0.05 μm 초과, 0.1 μm 초과, 0.2 μm 초과, 0.3 μm 초과, 0.4 μm 초과, 0.5 μm 초과, 0.6 μm 초과, 0.7 μm 초과, 0.8 μm 초과, 0.9 μm 초과, 1 μm 초과, 2 μm 초과, 3 μm 초과, 4 μm 초과, 5 μm 초과, 6 μm 초과, 7 μm 초과, 8 μm 초과, 9 μm 초과, 10 μm 초과, 20 μm 초과, 30 μm 초과, 40 μm 초과, 50 μm 초과, 100 μm 초과, 500 μm 초과 및/또는 1,000 μm 초과의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 0.001 μm 내지 1,000 μm, 0.01 μm 내지 100 μm, 0.1 μm 내지 10 μm, 0.1 μm 내지 100 μm, 0.1 μm 내지 10 μm, 0.001 μm 내지 0.01 μm, 0.01 μm 내지 0.1 μm, 0.1 μm 내지 1 μm, 1 μm 내지 10 μm, 1 μm 내지 2 μm, 2 μm 내지 3 μm, 3 μm 내지 4 μm, 4 μm 내지 5 μm, 1 μm 내지 5 μm 및/또는 5 μm 내지 10 μm(각각의 수치 포함) 또는 약 0.001 μm 내지 1,000 μm, 0.01 μm 내지 100 μm, 0.1 μm 내지 10 μm, 0.1 μm 내지 100 μm, 0.1 μm 내지 10 μm, 0.001 μm 내지 0.01 μm, 0.01 μm 내지 0.1 μm, 0.1 μm 내지 1 μm, 1 μm 내지 10 μm, 1 μm 내지 2 μm, 2 μm 내지 3 μm, 3 μm 내지 4 μm, 4 μm 내지 5 μm, 1 μm 내지 5 μm 및/또는 5 μm 내지 10 μm(각각의 수치 포함)의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 입자 또는 비드는 1 μm 내지 10 μm(각각의 수치 포함)의 평균 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 1 μm 또는 약 1 μm의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 2.8 μm 또는 약 2.8 μm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 4.8 μm 또는 약 4.8 μm의 직경을 갖는다.
특정 구현예에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 균일한 입자 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 균일한 입자 크기는 복수의 평균 직경의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만의 직경 표준 편차를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드는 복수의 평균 직경의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만의 직경 표준 편차를 갖는다.
특정 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자)는 균일한 형상이다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 구형이다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 비구형이다.
일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 0.001 g/cm3 초과, 0.01 g/cm3 초과, 0.05 g/cm3 초과, 0.1 g/cm3 초과, 0.5 g/cm3 초과, 0.6 g/cm3 초과, 0.7 g/cm3 초과, 0.8 g/cm3 초과, 0.9 g/cm3 초과, 1 g/cm3 초과, 1.1 g/cm3 초과, 1.2 g/cm3 초과, 1.3 g/cm3 초과, 1.4 g/cm3 초과, 1.5 g/cm3 초과, 2 g/cm3 초과, 3 g/cm3 초과, 4 g/cm3 초과 또는 5g/cm3 초과의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 0.001 g/cm3 내지 100 g/cm3, 0.01 g/cm3 내지 50 g/cm3, 0.1 g/cm3 내지 10 g/cm3, 0.1 g/cm3 내지 0.5 g/cm3, 0.5 g/cm3 내지 1 g/cm3, 0.5 g/cm3 내지 1.5 g/cm3, 1 g/cm3 내지 1.5 g/cm3, 1 g/cm3 내지 2 g/cm3 또는 1 g/cm3 내지 5 g/cm3 또는 약 0.001 g/cm3 내지 100 g/cm3, 0.01 g/cm3 내지 50 g/cm3, 0.1 g/cm3 내지 10 g/cm3, 0.1 g/cm3 내지 0.5 g/cm3, 0.5 g/cm3 내지 1 g/cm3, 0.5 g/cm3 내지 1.5 g/cm3, 1 g/cm3 내지 1.5 g/cm3, 1 g/cm3 내지 2 g/cm3 또는 1 g/cm3 내지 5 g/cm3의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 0.5 g/cm3, 0.5 g/cm3, 0.6 g/cm3, 0.7 g/cm3, 0.8 g/cm3, 0.9 g/cm3, 1.0 g/cm3, 1.1 g/cm3, 1.2 g/cm3, 1.3 g/cm3, 1.4 g/cm3, 1.5 g/cm3, 1.6 g/cm3, 1.7 g/cm3, 1.8 g/cm3, 1.9 g/cm3 또는 2.0 g/cm3의 밀도(각각의 수치 포함), 0.5 g/cm3, 0.5 g/cm3, 0.6 g/cm3, 0.7 g/cm3, 0.8 g/cm3, 0.9 g/cm3, 1.0 g/cm3, 1.1 g/cm3, 1.2 g/cm3, 1.3 g/cm3, 1.4 g/cm3, 1.5 g/cm3, 1.6 g/cm3, 1.7 g/cm3, 1.8 g/cm3, 1.9 g/cm3 또는 2.0 g/cm3이상의 밀도(각각의 수치 포함) 또는 약 0.5 g/cm3, 0.5 g/cm3, 0.6 g/cm3, 0.7 g/cm3, 0.8 g/cm3, 0.9 g/cm3, 1.0 g/cm3, 1.1 g/cm3, 1.2 g/cm3, 1.3 g/cm3, 1.4 g/cm3, 1.5 g/cm3, 1.6 g/cm3, 1.7 g/cm3, 1.8 g/cm3, 1.9 g/cm3 또는 2.0 g/cm3의 밀도(각각의 수치 포함)를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드 또는 입자는 1.6 g/cm3 또는 약 1.6 g/cm3의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드 또는 입자는 1.5 g/cm3 또는 약 1.5 g/cm3의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 1.3 g/cm3 또는 약 1.3 g/cm3의 밀도를 갖는다.
특정 구현예에서, 복수의 입자 또는 비드는 균일한 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 균일한 밀도는 10 % 미만, 5 % 미만 또는 1 % 미만의 평균 입자 밀도의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 입자, 예를 들어 비드 1 g 당 0.001 m2/g 내지 1,000 m2/g, 0.010 m2/g 내지 100 m2/g, 0.1 m2/g 내지 10 m2/g, 0.1 m2/g 내지 1 m2/g, 1 m2/g 내지 10 m2/g, 10 m2/g 내지 100 m2/g, 0.5 m2/g 내지 20 m2/g, 0.5 m2/g 내지 5 m2/g 또는 1 m2/g 내지 4 m2/g(각각의 수치 포함) 또는 약 0.001 m2/g 내지 1,000 m2/g, 0.010 m2/g 내지 100 m2/g, 0.1 m2/g 내지 10 m2/g, 0.1 m2/g 내지 1 m2/g, 1 m2/g 내지 10 m2/g, 10 m2/g 내지 100 m2/g, 0.5 m2/g 내지 20 m2/g, 0.5 m2/g 내지 5 m2/g 또는 1 m2/g 내지 4 m2/g(각각의 수치 포함)의 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 1 m2/g 내지 4 m2/g 또는 약 1 m2/g 내지 4 m2/g의 표면적을 갖는다.
특정 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자)는 특정 비중, 즉 입자, 예를 들어 비드의 밀도 대 물의 밀도의 비율로 0.01 내지 100, 0.1 내지 10, 0.5 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 2, 1.1 내지 1.8 또는 1.2 내지 1.5(각각의 수치 포함) 또는 약 0.01 내지 100, 0.1 내지 10, 0.5 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 2, 1.1 내지 1.8 또는 1.2 내지 1.5(각각의 수치 포함)를 갖는다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 1.2 내지 1.5의 특정 비중을 갖는다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 단순 분산성이고 특정 비중은 균일하다. 특정 구현예에서, 균일한 특정 비중을 갖는 입자, 예를 들어 비드는 10 % 미만, 5 % 미만 또는 1 % 미만의 특정 비중 표준 편차를 갖는다. 다양한 구현예에서, 상기 입자는 단순 분산성이고 10 % 미만, 5 % 미만 또는 1 % 미만의 표준 편차를 갖는 특정 비중을 갖는다.
특정 구현예에서, 입자 표면은 결합분자에 결합하거나 부착할 수 있는 부착된 생체 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 생체 분자는 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 단백질 A, 단백질 G 또는 비오틴에 노출된 표면을 포함한다.
구현예 중 일부에서, 입자는 입자의 표면에 하나 이상의 코트 또는 코팅(예를 들어, 표면 코팅)과 같은 하나 이상의 코트 또는 코팅을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 코트 또는 코팅은 결합분자에 접합 또는 커플링을 위한 물질, 예를 들어, 표면 작용기화되거나 될 수 있는 코트를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 코트는 표면 노출 작용기를 포함하거나 이에 부착할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 코팅은 카르복실기, 아미노기, 히드록실기, 토실기, 에폭시기, 클로로메틸기 또는 이의 조합물에 노출된 표면을 포함하거나 이에 부착할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 코트 또는 코팅은 소수성이다. 특정 구현예에서 상기 코트 또는 코팅은 비소수성이다.
1. 자성 입자
일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자)는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 입자는 자성 입자(예를 들어, 자성 비드 입자)이다. 일부 구현예에서, 상기 자성 입자는 상자성이다. 특정 구현예에서, 상기 자성 입자는 초상자성이다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 이들이 자기장에 노출되지 않는 한, 어떠한 자기 특성도 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, 입자는 내부 코어를 함유하는 복합 입자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 내부 코어는 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어이다. 일부 구현예에서, 상기 내부 코어(예를 들어, 자성 코어)는 금속이거나 금속을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 금속은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈륨(tantalum), 아연, 지르코늄 또는 이의 임의의 조합물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 내부 코어(예를 들어, 자성 코어)에 포함될 수 있는 적합한 물질은 산화 금속(예를 들어, 산화철), 페라이트(예를 들어, 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 등), 적철석 및 금속 합금(예를 들어, CoTaZn)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 내부 코어는 하나 이상의 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화철 또는 이산화 크롬을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 내부 코어는 원소 철 또는 이의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 내부 코어는 하나 이상의 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γFe2O3) 또는 그레이자이트(Fe3S4)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 내부 코어는 산화철(예를 들어, Fe3O4)을 포함한다.
특정 구현예에서, 입자는 표면 작용기화된 코트 또는 코팅으로 덮인 자성, 상자성 및/또는 초상자성 코어를 함유한다. 일부 구현예에서, 입자는 토실기에 노출된 표면을 포함한다.
일부 구현예에서, 코트는 비제한적으로 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소 또는 이의 조합물을 포함할 수 있는 물질을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜 산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 또는 폴리비닐 알코올일 수 있다. 특정 구현예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스티렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 코트는 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민), 단백질 A 및 단백질 G인 단백질이거나 이를 포함하는 물질을 함유하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 탄소는 아크릴아미드 또는 말레산이다. 일부 구현예에서, 상기 물질은 본 명세서에 기재된 결합분자에 커플링, 연결 또는 접합된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자(예를 들어, 비드 입자)는 내부 코어 및 코트(예를 들어, 보호 코트)를 가질 수 있고 상기 코트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 코트는 소수성이다. 특정 구현예에서, 상기 코트는 친수성이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자(예를 들어, 비드 입자)는 산화 금속 코어(예를 들어, 산화철 내부 코어) 및 코트(예를 들어, 보호 코트)를 갖고, 상기 코트는 폴리스티렌을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법에 이용되는 입자(예를 들어 비드 입자)는 상업적으로 생산되거나 수득될 수 있다. 입자, 예를 들어 비드를 생산하는 방법을 포함하여 입자, 예를 들어 비드는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 참조[미국 특허 번호 6,074,884; 5,834,121; 5,395,688; 5,356,713; 5,318,797; 5,283,079; 5,232,782; 5,091,206; 4,774,265; 4,654,267; 4,554,088; 4,490,436; 4,452,773; 미국 특허 출원 공개 번호 20100207051; 및 Sharpe, Pau T., Methods of Cell Separation, Elsevier, 1988]. 상업적으로 이용 가능한 입자, 예를 들어 비드(예를 들어 비드 입자)는 비제한적으로 하기를 포함한다: ProMagTM(PolySciences, Inc.); COMPELTM(PolySciences, Inc.); BioMag® Plus(PolySciences, Inc.) 및 BioMag® Maxi(Bang Laboratories, Inc.)를 포함한 BioMag®(PolySciences, Inc.); M-PVA(Cehmagen Biopolymer Technologie AG); SiMAG(Chemicell GmbH); beadMAG(Chemicell GmbH); MagaPhase®(Cortex Biochem); Dynabeads® M-280 양 항-토끼 IgG(Invitrogen), Dynabeads® FlowCompTM(예를 들어, Dynabeads® FlowCompTMHuman CD3, Invitrogen), Dynabeads® M-450(예를 들어, 토실활성화 Dynabeads® M-450, Invitrogen), Dynabeads® UntouchedTM(예를 들어, Dynabeads® UntouchedTM Human CD8 T 세포, Invitrogen) 및 T 세포와 결합, 증폭 및/또는 활성화시키는 Dynabeads®(예를 들어, T 세포 증폭 및 활성화를 위한 Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28, Invitrogen); Estapor® M(Merk Chimie SAS); Estapor® EM(Merk Chimie SAS); MACSiBeadsTM Particles(예를 들어, 항-비오틴 MACSiBead Particles, Miltenyi Biotec, 카탈로그 번호 130-091-147); Streptamer® Magnetic Beads(IBA BioTAGnology); Strep-Tactin® Magnetic Beads(IBA BioTAGnology); Sicastar®-M(Micormod Partikeltechnologie GmbH) Micromer®-M(Micromod Partikeltechnologie); MagneSilTM(Promega GmbH); MGP(Roche Applied Science Inc.); PierceTM Protein G Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Protein A Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Protein A/G Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM NHS-Activated Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Protein L Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Anti-HA Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Anti-c-Myc Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Glutathione Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); PierceTM Streptavidin Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); MagnaBindTM Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); Sera-MagTM Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.); Anti-FLAG® M2 Magnetic Beads(Sigma-Aldrich); SPHEROTM Magnetic Particles (Spherotech Inc.); 및 HisPurTM Ni-NTA Magnetic Beads(Thermo Fisher Scientific Inc.).
특정 구현예에서, 입자는 단순 분산성이고, 초상자성 철 코어, 예를 들어, 마그네타이트(Fe3O4) 또는 마그헤마이트(γFe2O3) 코어, 폴리스티렌 코트 또는 코팅 및 노출된 토실기를 포함하는 작용기화된 표면을 포함하는 초상자성 비드 입자이다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 1.5 g/cm3의 밀도 및 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g의 표면적을 갖는다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 4.5 μm의 직경 및 약 1.5 g/cm3의 밀도를 갖는 단순 분산성 초상자성 입자, 예를 들어 비드이다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드, 입자는 약 2.8 μm의 평균 직경 및 약 1.3 g/cm3의 밀도를 갖는 단순 분산성 초상자성 입자이다.
2. 올리고머 입자
일부 구현예에서, 입자는 올리고머 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 입자는 단백질, 예를 들어, 스트렙타비딘으로 구성된 올리고머 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 입자는 개별 분자를 구성하는 서브 유닛의 복합체(예를 들어, 자연적으로 존재하는 바와 같은 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체 등과 직접 또는 간접적으로 연결) 또는 단량체의 개별 분자와 직접 또는 간접적으로 연결되어 자연적으로 존재하는 바와 같은 단백질, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 이의 변이체의 개별 분자와 직접 또는 간접적으로 연결되어 생성될 수 있는 올리고머 또는 중합체이다. 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘의 사량체성 동종 이량체 또는 이종 이량체가 각각의 올리고머 또는 중합체의 개별 분자 또는 가장 작은 빌딩 블록으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 중합체는 2 개 이상의 단백질 개별 분자의 연결(예를 들어, 2-mer)을 함유할 수 있거나 또는 단백질(예를 들어, 단량체, 사량체) 개별 분자의 3-mer, 4-mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 25-mer, 30-mer, 35-mer, 40-mer, 45-mer 또는 50-mer 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 다량체이거나 또는 올리고머성 시약은 다량체성 시약이다. 특정 구현예에서, 입자는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘의 돌연변이 단백질(예를 들어, STREP-TACTIN® 또는 STREP-TACTIN® XT 스트렙타비딘 돌연변이 단백질)을 포함하는 올리고머 또는 중합체이다.
올리고머는 공개된 미국 특허 출원 번호 미국 제 2004/0082012호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 예컨대 다당류 또는 2 작용성 링커에 의해 가교될 수 있는 2 개 이상의 개별 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 다당류에 존재하는 개별 분자를 구성하는 서브 유닛의 복합체 또는 개별 분자를 가교시켜 얻어진 올리고머 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 입자는 다당류, 예를 들어, 덱스트란으로 카르복실 잔기를 도입시켜 제조될 수 있는 올리고머 또는 중합체이다. 일부 측면에서, 입자의 개별 분자(예를 들어, 단량체, 사량체)는 통상적인 카르보디이미드 화학을 사용하여 내부 리신 잔기의 1 차 아미노기 및/또는 덱스트란 골격에 있는 자유 N-말단 내지 카르복실기를 통해 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 커플링 반응은 덱스트란 1 몰 당 시약(예를 들어, 단량체, 사량체)의 개별 분자 약 60 몰의 몰비로 수행된다.
일부 구현예에서 입자는 하나 이상의 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 임의의 유사체 또는 돌연변이 단백질(예를 들어, Strep-Tactin® 또는 Strep-Tactin® XT) 또는 아비딘의 유사체 또는 돌연변이 단백질(예를 들어, 뉴트라비딘)의 올리고머 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 상기 아비딘 또는 스트렙타비딘은 개별 분자 내에 결합 위치가 4 개까지 존재(예를 들어, 사량체는 결합 위치 Z를 4 개 함유)할 수 있는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 천연 비오틴 결합 위치인 결합 위치 Z를 포함하고, 동종-사량체는 같은 결합 위치, 즉 Z1을 4 개까지 함유할 수 있고, 반면에 이종-사량체는 상이할 수 있는, 예를 들어 Z1 및 Z2를 함유하는 4 개까지의 결합 위치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 같은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질, 아비딘 또는 아비딘 돌연변이 단백질의 복수의 개별 분자(예를 들어, 복수의 동종-사량체)로부터 생성되거나 생산되고, 상기의 경우 올리고머의 각각의 결합 위치 Z, 예를 들어 Z1은 같다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고머는 복수의 결합 위치 Z1, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 개 이상의 결합 위치 Z1을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질, 아비딘 또는 아비딘 돌연변이 단백질의 이종-사량체일 수 있는 복수의 개별 분자 및/또는 이들의 결합 위치 Z, 예를 들어, Z1 및 Z2가 상이한 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질, 아비딘 또는 아비딘 돌연변이 단백질의 2 개 이상의 상이한 복수의 개별 분자(예를 들어, 상이한 동종-사량체)로부터 생성되거나 생산되고, 상기의 경우 복수의 상이한 결합 위치 Z, 예를 들어, Z1 및 Z2는 올리고머 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고머는 복수의 결합 위치 Z1 및 복수의 결합 위치 Z를 함유할 수 있고, 이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 개 이상의 결합 위치 Z1 및 Z2의 조합으로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 입자는 2 작용성 링커 또는 기타 화학적 링커, 예컨대 아비딘을 이용하여 개별 분자를 구성하는 서브 유닛의 복합체 또는 개별 분자를 가교시키거나 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 수득된 올리고머 또는 중합체이다. 일부 측면에서, 스트렙타비딘 또는 아비딘의 가교 올리고머 또는 중합체 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘의 임의의 돌연변이 단백질 또는 유사체가 링커로 작용하는 2 작용성 분자, 예컨대 글루타르알데히드를 통해 개별 스트렙타비딘 또는 아비딘 분자를 가교시키거나 또는 당업계에 공지된 기타 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질로 티올기를 도입(이는 예를 들어, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질을 2-이미노티올란(트라우트 시약)과 반응시켜 수행될 수 있음)하고 예를 들어 별개의 반응으로 스트렙타비딘 돌연변이 단백질에서 이용 가능한 아미노기를 활성화시켜 스트렙타비딘 돌연변이 단백질의 올리고머를 생성하는 것이 가능하다. 일부 구현예에서, 상기 아미노기의 활성화는 스트렙타비딘 돌연변이 단백질을 상업적으로 이용 가능한 이종 2 작용성 가교제 예컨대 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(설포 SMCC) 또는 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH)와 함게 반응시켜 달성될 수 있다. 일부 상기 구현예에서, 상기와 같이 수득된 2 개의 반응 산물은 함께 혼합되어, 하나의 배치의 개질된 스트렙타비딘 돌연변이 단백질에 함유된 티올기와 다른 배치의 개질된 스트렙타비딘 돌연변이 단백질의 활성화(예컨대 말레이미드 작용기에 의함)된 아미노산과의 반응을 전형적으로 유도한다. 일부 경우에, 상기 반응으로, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질의 다량체/올리고머가 형성된다. 상기 올리고머들은 임의의 적합한 개별 분자 수, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 이상을 가질 수 있고, 올리고머화 정도는 반응 조건에 따라 변할 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머성 또는 중합체성 시약은 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 분리될 수 있고 임의의 원하는 분획이 입자로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 2-이미노티올란 및 이종 2 작용성 가교제 예컨대 설포 SMCC의 존재 하에 개질 스트렙타비딘 돌연변이 단백질을 반응시킨 후에, 올리고머성 또는 중합체성 시약이 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 분리될 수 있고 임의의 원하는 분획을 입자로 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머는 단일 분자량을 갖지 않으나 (및 가질 필요가 없으나) 예컨대 가우시안(Gaussian) 분포와 같은 통계적 중량 분포로 관측될 수 있다. 일부 경우에, 3 개 이상의 스트렙타비딘 또는 돌연변이 단백질 사량체, 예를 들어, 동종사량체 또는 이종사량체를 갖는 임의의 올리고머, 예컨대 일반적으로 3 내지 50 개의 사량체, 예를 들어, 동종사량체 또는 이종사량체, 10 내지 40 개의 사량체, 예를 들어, 동종사량체 또는 이종사량체 또는 25 내지 35 개의 사량체, 예를 들어, 동종사량체 또는 이종사량체가 가용성 입자로 사용될 수 있다. 상기 올리고머는 예를 들어, 3 내지 25 개의 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 사량체, 예를 들어, 동종사량체 또는 이종사량체를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질은 약 50 kDa의 분자량을 갖고, 상기 가용성 올리고머는 150 kDa 내지 2000 kDa, 150 kDa 내지 1500 kDa, 150 kDa 내지 1250 kDa, 150 kDa 내지 1000 kDa, 150 kDa 내지 500 kDa 또는 150 kDa 내지 300 kDa, 300 kDa 내지 2000 kDa, 300 kDa 내지 1500 kDa, 300 kDa 내지 1250 kDa, 300 kDa 내지 1000 kDa, 300 kDa 내지 500 kDa, 500 kDa 내지 2000 kDa, 500 kDa 내지 1500 kDa, 500 kDa 내지 1250 kDa, 500 kDa 내지 1000 kDa, 1000 kDa 내지 2000 kDa, 1000 kDa 내지 1500 kDa, 1000 kDa 내지 1250 kDa, 1250 kDa 내지 2000 kDa 또는 1500 kDa 내지 2000 kDa의 분자량 또는 약 150 kDa 내지 2000 kDa, 150 kDa 내지 1500 kDa, 150 kDa 내지 1250 kDa, 150 kDa 내지 1000 kDa, 150 kDa 내지 500 kDa 또는 150 kDa 내지 300 kDa, 300 kDa 내지 2000 kDa, 300 kDa 내지 1500 kDa, 300 kDa 내지 1250 kDa, 300 kDa 내지 1000 kDa, 300 kDa 내지 500 kDa, 500 kDa 내지 2000 kDa, 500 kDa 내지 1500 kDa, 500 kDa 내지 1250 kDa, 500 kDa 내지 1000 kDa, 1000 kDa 내지 2000 kDa, 1000 kDa 내지 1500 kDa, 1000 kDa 내지 1250 kDa, 1250 kDa 내지 2000 kDa 또는 1500 kDa 내지 2000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일반적으로, 각각의 스트렙타비딘 분자/돌연변이 단백질은 4 개의 비오틴 결합 위치를 갖기 때문에, 상기 시약은 12 내지 160 개의 결합 위치 Z, 예컨대 12 내지 100 개의 결합 위치 Z를 제공할 수 있다.
B. 결합분자
본 명세서는 입자, 예를 들어, 비드 입자에 접합 또는 부착되는 재조합 수용체, 예컨대 CAR의 항원-결합 도메인에 의해 인식되거나 이와 결합하는 결합분자, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 폴리펩티드다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체, 예를 들어 CAR이 결합 또는 인식하도록 설계된 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인을 인식 또는 결합하는 항-이디오타입 항체이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 의해 인식되거나 또는 이와 결합하는 폴리펩티드다. 특정 구현예에서, 결합분자는 CAR의 항원 결합 도메인에 의해 인식되거나 또는 이와 결합하는 폴리펩티드다.
일부 구현예에서, 결합분자는 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR)의 막 관통 도메인 또는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하지 않는 CAR에 의해 인식되거나 이와 결합한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 KIR2DS2, KIR2DL3, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DS1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 및 KIR3DP1 중 어떠한 막 관통 도메인 또는 세포 내 도메인도 함유하지 않는 CAR에 의해 인식되거나 이와 결합한다.
1. 항원
일부 구현예에서, 결합분자는 항원, 예를 들어, 재조합 항원 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 항원은 질병, 예를 들어, 암과 관련된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원은 질병, 예를 들어, 암 세포 및/또는 종양 세포와 관련된 세포의 표면에서 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 변이체 또는 단편이다.
일부 구현예에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지됨), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 상호변이효소, 도파크롬 델타-이성화효소 또는 DCT로도 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체 표적 항원은 다수의 공지된 임의의 B 세포 마커와 같은 B 세포 악성과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig 카파, Ig 람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체 및/또는 CAR에 의해 인식되거나 이와 결합하는 폴리펩티드 항원의 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체 및/또는 CAR에 의해 인식되거나 이와 결합하는 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원의 일부는 재조합 수용체 및/또는 CAR에 의해 인식되거나 이와 결합하는 폴리펩티드 중10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 또는 500 개의 아미노산 또는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 또는 500 개의 아미노산 또는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 또는 500 개 이상의 아미노산을 함유하고 일부 경우에 상기 폴리펩티드에 인접한 아미노산을 함유한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 일부는 재조합 수용체 및/또는 CAR에 의해 인식되는 에피토프의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체 및/또는 CAR에 의해 인식되고/거나 이와 결합하는 폴리펩티드와 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 % 또는 약 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 % 또는 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 함유하는 폴리펩티드 변이체이다.
특정 구현예에서, 입자는 폴리펩티드 항원의 일부를 포함하는 결합분자에 결합하고, 상기 일부는 재조합 수용체, 즉 CAR에 의해 잠재적으로 인식 또는 결합될 수 있거나 또는 재조합 수용체, 즉 CAR에 의해 인식되고/거나 결합되는 항원의 일부이다. 일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 항원의 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항원의 일부는, 항원이 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지됨), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 상호변이효소, 도파크롬 델타-이성화효소 또는 DCT로도 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함하는 구현예에서의 항원의 일부이다. 일부 구현예에서 수용체 표적 항원은 다수의 공지된 임의의 B 세포 마커와 같은 B 세포 악성과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig 카파, Ig 람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 입자는 BCMA 폴리펩티드의 일부를 포함하는 결합분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 입자는 CD22 폴리펩티드의 일부를 포함하는 결합분자에 결합한다. 특정 구현예에서, 입자는 ROR1 폴리펩티드의 일부를 포함하는 결합분자에 결합한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원의 일부는 BCMA 폴리펩티드의 일부이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 BCMA 폴리펩티드 중 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상, 35 개 이상, 40 개 이상, 50 개 이상, 55 개 이상, 60 개 이상, 65 개 이상, 70 개 이상, 75 개 이상, 80 개 이상, 85 개 이상, 90 개 이상, 95 개 이상, 100 개 이상, 110 개 이상, 120 개 이상, 130 개 이상, 140 개 이상, 150 개 이상, 160 개 이상, 170 개 이상 또는 180 개 이상의 인접한 아미노산과 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 아미노산 서열 동일성을 함유하거나, 약 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 아미노산 서열 동일성을 함유하거나 또는 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 % 이상의 아미노산 서열 동일성을 함유한다. 특정 구현예에서, BCMA 폴리펩티드 변이체는 재조합 수용체 및/또는 CAR에 의해 인식되고/거나 이와 결합하는 BCMA 에피토프의 아미노산 서열과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 98 % 동일하거나, 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 98 % 동일하거나 또는 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 98 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항원은 BCMA 또는 이의 일부 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, BCMA 폴리펩티드는 포유류의 BCMA 폴리펩티드다. 특정 구현예에서, BCMA 폴리펩티드는 인간의 BCMA 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, BCMA 항원은 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 BCMA의 세포 외 도메인 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, BCMA 항원은 SEQ ID 번호: 1 또는 SEQ ID 번호: 1의 인접한 50 개 이상, 55 개 이상, 60 개 이상, 65 개 이상, 70 개 이상, 75 개 이상, 80 개 이상, 85 개 이상, 90 개 이상, 95 개 이상, 100 개 이상, 110 개 이상, 120 개 이상, 130 개 이상, 140 개 이상, 150 개 이상, 160 개 이상, 170 개 이상 또는 180 개 이상의 아미노산을 함유하는 이의 단편과 적어도 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA 항원은 SEQ ID 번호: 1로 제시된 서열 또는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프이거나 이를 함유하는 상기 서열의 일부이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 ROR1 또는 이의 일부 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, ROR1 폴리펩티드는 포유류이다. 특정 구현예에서, ROR1 폴리펩티드는 인간이다. 일부 구현예에서, ROR1 항원은 ROR1의 세포 외 도메인 또는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, ROR1 항원은 SEQ ID 번호: 31 또는 SEQ ID 번호: 31의 인접한 50 개 이상, 55 개 이상, 60 개 이상, 65 개 이상, 70 개 이상, 75 개 이상, 80 개 이상, 85 개 이상, 90 개 이상, 95 개 이상, 100 개 이상, 110 개 이상, 120 개 이상, 130 개 이상, 140 개 이상, 150 개 이상, 160 개 이상, 170 개 이상 또는 180 개 이상의 아미노산을 함유하는 이의 단편과 적어도 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, ROR 항원은 SEQ ID 번호: 31로 제시된 서열 또는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 상기 서열의 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 CD22 또는 이의 일부 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, CD22 폴리펩티드는 포유류이다. 특정 구현예에서, CD22 폴리펩티드는 인간이다. 일부 구현예에서, 항원은 CD22의 세포 외 도메인 또는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 이의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원은 SEQ ID 번호: 29 또는 SEQ ID 번호: 29의 인접한 50 개 이상, 55 개 이상, 60 개 이상, 65 개 이상, 70 개 이상, 75 개 이상, 80 개 이상, 85 개 이상, 90 개 이상, 95 개 이상, 100 개 이상, 110 개 이상, 120 개 이상, 130 개 이상, 140 개 이상, 150 개 이상, 160 개 이상, 170 개 이상 또는 180 개 이상의 아미노산을 함유하는 이의 단편과 적어도 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, CD22 항원은 SEQ ID 번호: 29로 제시된 서열 또는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 상기 서열의 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원의 일부는 BCMA 폴리펩티드의 일부이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원의 일부는 CD22 폴리펩티드가 일부이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원의 일부는 ROR1 폴리펩티드의 일부이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드의 일부는 SEQ ID 번호: 1, 29 또는 31에 제시된 아미노산 서열 중 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 25 개 이상, 30 개 이상, 35 개 이상, 40 개 이상, 50 개 이상, 55 개 이상, 60 개 이상, 65 개 이상, 70 개 이상, 75 개 이상, 80 개 이상, 85 개 이상, 90 개 이상, 95 개 이상, 100 개 이상, 110 개 이상, 120 개 이상, 130 개 이상, 140 개 이상, 150 개 이상, 160 개 이상, 170 개 이상 또는 180 개 이상의 인접한 아미노산을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포는 항체 또는 이의 단편 또는 이의 변이체와 융합될 수 있는 유니버설 태그를 인식하거나 이와 결합하는 CAR을 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 CAR을 발현하는 세포는 유니버설 태그로 융합된 항체가 결합한 표적 세포, 예를 들어 종양 세포를 특이적으로 인식하여 죽일 수 있다. 하나의 실시예는 비제한적으로, 항-FITC CAR 발현 T 세포는 암-반응성 FITC-표지된 항체가 상기 세포에 결합될 때 다양한 인간 암 세포를 인식하고/거나 이에 결합할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 유니버설 태그를 함유하는 암과 관련된 항원을 인식하는 항체가 이용가능한 경우, 유니버설 태그에 결합하는 같은 CAR은 상이한 암의 치료에 유용하다. 특정 구현예에서, 입자(예를 들어, 비드 입자)는 유니버설 태그에 결합하는 항원 수용체, 예를 들어 CAR을 인식 또는 결합하는 항원 또는 이의 일부를 포함하는 결합 분자에 노출된 표면을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식 또는 결합되는 유니버설 태그 또는 이의 일부이다.
특정 구현예로 항체가 각각의 표적에 결합하는 것을 막지 못하면서 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 변이체와 융합될 수 있는 임의의 폴리펩티드 도메인이 유니버설 태그로 사용하기에 적합할 것임이 고려된다. 일부 구현예에서, 입자는 FITC, 스트렙타비딘, 비오틴, 히스티딘, 디니트로페놀, 페리디닌 엽록소 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, PE, HRP, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리 포스파타아제, 포도당 산화 효소 및 말토오스 결합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택된 유니버설 태그 또는 이의 일부를 포함하는 결합분자에 결합한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체(예를 들어 CAR)을 인식 및/또는 결합하는 2 개 이상의 폴리펩티드 항원 또는 이의 일부 또는 이의 변이체를 포함하는 다량체, 예를 들어 이량체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원 또는 이의 일부는 동일하다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 도메인 또는 영역 사이의 상보적 상호 작용을 통해 2 개 이상의 폴리펩티드 항원 사이의 상호 작용을 촉진하거나 안정화시키는 영역 또는 도메인, 예를 들어 다량체화 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체, 예를 들어 이량체로 폴리펩티드 항원을 제공하는 것은 일부 측면에서 상호 작용의 친화력을 증가시킬 수 있는, 항원 수용체의 항원-결합 도메인, 예를 들어 CAR과 결합분자 사이의 다가 상호 작용을 제공한다. 일부 구현예에서, 증가된 친화력은 비드에 접합된 결합분자에 의해 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 자극 활성 또는 작용제(agonist) 활성에 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 다량체화 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 예시적인 다량체화 도메인에는 면역글로불린 서열 또는 이의 일부, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역 및 양립 가능한 단백질-단백질 상호 작용 도메인이 포함된다. 예를 들어, 상기 다량체화 도메인은, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 유형을 포함하는 IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM 및 이의 개질된 형태의 Fc 도메인 또는 이의 일부와 같은 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인일 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 Fc 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드 항원 또는 이의 일부 및 상기 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드다.
특정 구현예에서, 결합분자는 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG, IgA 또는 IgD 아이소타이프의 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 도메인(즉, CH2 및 CH3 도메인), 예를 들어 IgG, IgA 및 IgD 아이소타이프의 CH2 또는 CH3로 구성된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgM 또는 IgE 아이소타이프의 3 개의 중쇄 불변 도메인(즉, CH2, CH3 및 CH4 도메인)으로 구성된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 서열 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자뿐만 아니라 CH2 및 CH3 도메인의 힌지 도메인 전부 또는 일부를 함유한다. 일부 경우에, Fc 도메인은 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 2 개의 폴리펩티드 사슬 이량체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 적합한 포유 동물(예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 염소, 양 또는 시미안)의 면역글로불린(예를 들어, IgG, IgA, IgM 또는 IgE)으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 폴리펩티드 항원의 C-말단에 융합된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 폴리펩티드 항원의 N-말단에 융합된다.
일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인 또는 이의 일부 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은, SEQ ID 번호: 2에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 2에 제시된 서열과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 도메인 또는 이의 일부 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 야생형 인간 IgG Fc 도메인 또는 이의 일부 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인의 변이체이다.
일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은, Fc 도메인과 경쇄 사이의 페어링을 감소, 저하 및/또는 경감시키는 돌연변이, 예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입을 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이의 결합 친화도를 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이의 상호 작용 또는 상호 작용의 확률 또는 가능성을 감소, 저하 및/또는 경감시키는 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 보체 시스템의 단백질 사이의 결합 친화도를 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 보체 시스템의 단백질 사이의 상호 작용 또는 상호 작용의 확률 또는 가능성을 감소, 저하 및/또는 경감시키는 돌연변이를 함유한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 힌지 영역에서 시스틴의 세린으로의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 힌지 영역에서 류신의 알라닌으로의 치환을 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 힌지 영역에서 글리신의 알라닌으로의 치환을 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 CH2 영역에서 알라닌의 세린으로의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 CH2 영역에서 프롤린의 세린으로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 28에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하고, 상기 Fc 도메인은 융합 폴리펩티드의 C-말단에 존재한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 BCMA 폴리펩티드 또는 이의 일부 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, BCMA 폴리펩티드 또는 이의 일부는 SEQ ID 번호: 1로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 1에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내고 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 2로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 2에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 28로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 28에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA 항원은 BCMA 또는 이의 일부 또는 이의 변이체 및 태그 또는 융합 도메인, 예를 들어, Fc 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, BCMA 항원은 SEQ ID 번호: 35로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 35에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내고 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 함유한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 ROR1 폴리펩티드 또는 이의 일부 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, ROR1 폴리펩티드 또는 이의 일부는 SEQ ID 번호: 31로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 31에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및 Fc 도메인에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 2로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 2에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 28로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 28에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 SEQ ID 번호: 33으로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 33에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내고 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드다.
특정 구현예에서, 결합분자는 SEQ ID 번호: 29로 제시된 CD22 폴리펩티드 또는 이의 일부 또는 SEQ ID 번호: 29에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및 Fc 도메인에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 융합 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 2로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 2에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 상기 Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 28로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 28에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ ID 번호: 34로 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 34에 대한 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 및 다량체화 도메인, 예컨대 Fc 도메인은 링커, 예컨대 아미노산 링커에 의해 연결된다. 특정 구현예에서, 항원은 아미노산 링커의 N-말단에 융합되고 다량체화 도메인, 예컨대 Fc 도메인은 링커의 C-말단에 융합된다. 아미노산 링커는 임의의 길이일 수 있고 임의의 아미노산 조합물을 함유할 수 있지만, 상기 링커 길이는 결합 도메인 간의 상호 작용을 감소시키기 위해 상대적으로 짧을 수 있다(예를 들어, 10 개 이하의 아미노산). 링커의 아미노산 조성은 부피가 큰 측쇄를 갖는 아미노산 또는 2 차 구조를 도입할 가능성이 있는 아미노산의 수를 감소시키기 위해 조정될 수도 있다. 적합한 아미노산 링커는 최대 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20 또는 25 개의 아미노산 길이의 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표적인 아미노산 링커 서열은 GGGGS(SEQ ID 번호: 27)를 포함하고 링커는 GGGGS(SEQ ID 번호: 27)를 2, 3, 4 또는 5 카피를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 폴리펩티드 항원 또는 이의 일부와 Fc 도메인, 예를 들어 BCMA-Fc, ROR1-Fc 또는 CD22-Fc를 함유하는 2 개의 Fc 융합 폴리펩티드에 의해 형성된 이량체이다. 임의의 Fc 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 핵산 분자를 암호화하는 발현 벡터를 포함한 벡터가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 결합분자는 적합한 숙주 세포 내 발현으로 세포 내에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 포유 동물 세포주이다. 단백질의 재조합 발현을 위한 예시적인 포유 동물 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 또는 이의 유도 세포주를 포함한다. 일부 측면에서, 결합분자는 세포로부터 분비를 위한 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 예시적인 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 CD33(예를 들어 SEQ ID 번호: 30에 제시)이다. 일부 구현예에서, 상기 생성된 폴리펩티드 항원-Fc 융합 단백질, 예를 들어 BCMA-Fc, ROR1-Fc 또는 CD22-Fc는 숙주 세포, 예를 들어 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에서 발현될 수 있고, Fc 도메인 사이의 조립은 Fc 모이어티 사이에 형성된 사슬 간 이황화 결합으로 발생하여 이량체성, 예컨대 2 가의, 폴리펩티드 항원 융합 단백질을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 결합분자는 인간 BCMA 또는 이의 일부이거나 또는 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 인간 BCMA의 세포 외 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 SEQ ID 번호: 1로 제시된 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 BCMA의 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 인간 BCMA의 세포 외 도메인과 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인의 변이체이다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 융합 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ ID 번호: 1로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 BCMA의 일부 및 SEQ ID 번호: 29로 제시된 아미노산을 포함하는 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 BCMA 폴리펩티드에 Fc 도메인을 연결하는 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 링커는 SEQ ID 번호: 27로 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 결합분자는 인간 BCMA 폴리펩티드(또는 이의 일부 또는 이의 변이체) 및 C-말단 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드고 입자(예를 들어 비드 입자)에 표면 접합되거나 그렇지 않으면 부착된다. 특정 구현예에서, 상기 융합 폴리펩티드는 Fc 도메인 내의 위치에서 입자에 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 CD28을 인식 또는 결합하는 표면 접합 항체 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.
2. 항-이디오타입 항체
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 바와 같이 입자, 예를 들어 비드에 접합된 결합분자는, 표적 항원 수용체, 예를 들어 CAR 또는 이의 활성 단편에 결합하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원 결합 단편("항-ID")이다. 특정 구현예에서, 상기 결합 분자는 CAR의 항원 결합 도메인에 결합하는 항-ID이다. 특정 구현예에서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 scFv 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 결합분자는 항원 결합 도메인에서 CAR에 결합하는 항-ID이고 항원 결합 도메인, 예를 들어, scFv와 CAR의 막 관통 도메인을 연결하는 CAR의 링커 또는 스페이서 영역에는 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 항-ID는 질병 또는 병태, 예를 들어 암 세포 또는 조직에서 발현되거나 이와 관련된 표적 항원과 같은 표적 항원에 결합하는 항체를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항-ID는, 항원이 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지됨), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 상호변이효소, 도파크롬 델타-이성화효소 또는 DCT로도 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자이거나 또는 이를 포함하는 일부 구현예에서의 항원이거나 이를 포함하는 항원에 결합하는 표적 항체를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적된 항원은 B 세포 악성, 예컨대 공지된 다수의 임의의 B 세포 마커와 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-ID는 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138 또는 병원체-특이적 항원에 결합하는 표적 항원을 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 항-ID는 표적 항-CD19 항체 모이어티를 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편("항-ID")이다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는 SJ25C1 또는 이의 항원-결합 단편인 표적 항-CD19 항체를 인식하거나 또는 SJ25C1로부터 유래한 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는 FMC63 또는 이의 항원-결합 단편인 표적 항-CD19 항체를 인식하거나 또는 FMC63으로부터 유래한 항체 또는 항원-결합 단편이다.
SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 Nalm-16 세포에 대해 발생시킨 마우스 단일 클론 IgG1 항체이다(Ling, N. R., 외 (1987). Leucocyte typing III. 302). 상기 SJ25C1 항체는 SEQ ID 번호: 40 내지 42에 제시된 CDRH1, H2 및 H3 및 SEQ ID 번호: 43 내지 45에 제시된 CDRL1, L2 및 L3 서열을 각각 포함한다. 상기 SJ25C1 항체는 SEQ ID 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 SJ25C1이거나 또는 SJ25C1로부터 유래한 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 SJ25C1로부터 유래한 항체는 SJ25C1의 VH 및/또는 VL, SJ25C1의 이디오타입, SJ25C1의 파라토프 또는 SJ25C1의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래한 항체인 표적 항체는 SEQ ID 번호: 36으로 제시된 SJ25C1의 VH 또는 SEQ ID 번호: 36에 제시된 서열과 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체 및/또는 SEQ ID 번호: 37로 제시된 SJ25C1의 VL 또는 SEQ ID 번호: 37과 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 36으로 제시된 SJ25C1의 VH 또는 SEQ ID 번호: 36과 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체 및 SEQ ID 번호: 37로 제시된 SJ25C1의 VL 또는 SEQ ID 번호: 37과 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 36 및 SEQ ID 번호: 37에 제시된 SJ25C1의 VH 및 VL을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 SEQ ID 번호: 36 및/또는 SEQ ID 번호: 37과 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, SJ25C1 또는 SJ25C1로부터 유래한 항체인 표적 항체는 SEQ ID 번호: 36, 예컨대 SEQ ID 번호: 40 내지 42에 제시된 SJ25C1 VH의 하나 이상의 중쇄 CDR(CDR-H) 및/또는 SEQ ID 번호: 37, 예컨대 SEQ ID 번호: 43 내지 45에 제시된 SJ25C1 VL의 하나 이상의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 42에 제시) 및/또는 SJ25C1의 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 45에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 CDR-H3 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 42 및 SEQ ID 번호: 43에 각각 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 하나 이상의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 40, 41, 42 각각에 제시) 및/또는 SJ25C1의 하나 이상의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 43, 44, 45 각각에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 40, 41, 42 각각에 제시) 및/또는 SJ25C1의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 43, 44, 45 각각에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SJ25C1의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 40, 41, 42 각각에 제시) 및 SJ25C1의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 43, 44, 45 각각에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항원-결합 단편, 예컨대 항원-결합 단편(Fab), F(ab')2, Fab', 가변 단편(Fv) 또는 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함한다. 예를 들어 참조[Bejcek, B. E., 외 (1995). Cancer research. 55(11): 2346-2351].
FMC63은 인간 기원의 CD19를 발현하는 JVM3 세포에 대해 발생시킨 마우스 단일 클론 IgG1 항체이다(Nicholson. 외 (1997). Molecular Immunology. 34(16-17):1157-1165). 상기 FMC63 항체는 SEQ ID 번호: 46 내지 48 각각에 제시된 CDRH1, H2 및 H3 및 SEQ ID 번호: 49 내지 51 각각에 제시된 CDRL1, L2 및 L3 서열을 포함한다. 상기 FMC63 항체는 SEQ ID 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 항체는 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 FMC63으로부터 유래한 항체는 FMC63의 VH 및/또는 VL, FMC63의 이디오타입, FMC63의 파라토프 또는 FMC63의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체인 표적 항체는 SEQ ID 번호: 38에 제시된 FMC63의 VH 또는 SEQ ID 번호: 38과 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체 및/또는 SEQ ID 번호: 39에 제시된 FMC63의 VL 또는 SEQ ID 번호: 39와 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 38에 제시된 FMC63의 VH 또는 SEQ ID 번호: 38과 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체 및 SEQ ID 번호: 39에 제시된 FMC63의 VL 또는 SEQ ID 번호: 39와 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 38 및 39 각각에 제시된 FMC63의 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 변이체는 SEQ ID 번호: 38 및/또는 SEQ ID 번호: 39와 적어도 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체인 표적 항체는 SEQ ID 번호: 38, 예컨대 SEQ ID 번호: 46 내지 48에 제시된 FMC63 VH의 하나 이상의 중쇄 CDR(CDR-H) 및/또는 SEQ ID 번호: 39, 예컨대 SEQ ID 번호: 49 내지 51에 제시된 FMC63 VL의 하나 이상의 경쇄 CDR(CDR-L)를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체인 표적 항체는 FMC63의 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 48에 제시) 및/또는 FMC63의 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 51에 제시)을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 48에 제시) 및 FMC63의 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 51에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체인 표적 항체는 항체 또는 항원-결합 단편이고 FMC63의 하나 이상의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 46, 47, 48 각각에 제시) 및/또는 FMC63의 하나 이상의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 49, 50, 51 각각에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체인 표적 항체는 항체 또는 항원-결합 단편이고 FMC63의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 46, 47, 48 각각에 제시) 및/또는 FMC63의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 49, 50, 51 각각에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 FMC63 또는 FMC63으로부터 유래한 항체인 표적 항체는 항체 또는 항원-결합 단편이고 FMC63의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3(예를 들어 SEQ ID 번호: 46, 47, 48 각각에 제시) 및 FMC63의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3(예를 들어 SEQ ID 번호: 49, 50, 51 각각에 제시)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 항원-결합 단편, 예컨대 항원-결합 단편(Fab), F(ab')2, Fab', 가변 단편(Fv) 또는 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 SJ25C1 또는 FMC63으로부터 유래한 가변 도메인(Fv), 예컨대 단일 사슬 Fv(scFv)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 Fv의 특정 에피토프 또는 영역, 일반적으로 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 Fv 파라토프와 중복되는 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제공된 항-이디오타입 항체는 표적 키메라 항원 수용체(CAR)의 세포 외 도메인의 일부로서 함유된 SJ25C1 또는 FMC63으로부터 유래한 항-CD19 모이어티에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표적 CAR은 SJ25C1 또는 FMC63 항체 분자 또는 SJ25C1 또는 FMC63 항체의 항원-결합 단편 또는 부분을 함유하는 항원-결합 부분을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 표적 CAR은 SJ25C1 또는 FMC63 항체의 VH 및 VL 사슬에서 유래한 scFv인 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 또는 FMC63 항체에서 유래한 scFv를 함유한 항-CD19 CAR에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 제공한다. CAR의 예시적인 특징이 하기에 추가로 기재된다.
본 명세서의 용어 "항체(antibody)"는 가장 넓은 의미로 사용되고 다클론 및 단일 클론 항체를 포함하고, 온전한 항체 및 작용성(항원-결합) 항체 단편을 포함하고, 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 단일 사슬 항체 단편을 포함하고, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노항체) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전적으로 조작되고/거나 그렇지 않으면 개질된 형태의 면역글로불린, 예컨대 세포내 항체, 펩티바디, 키메라 항체, 전장 인간 항체, 인간화 항체 및 이종접합 항체, 다중 특이적, 예를 들어, 이중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 이중-scFv, 탠덤 삼중-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체(antibody)"는 이의 작용성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위-분류, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 분류 또는 하위-분류의 항체를 포함한 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다.
용어 "항-이디오타입 항체(anti-idiotype antibody)"는 항체의 이디오토프, 예컨대 항원-결합 단편에 특이적으로 결합하고/거나 특이적인 대상이 되고, 특이적으로 인식하는 이의 항원-결합 단편을 포함한 항체를 지칭한다. 상기 항체의 이디오토프는 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(들)(CDR들) 내의 잔기, 항체의 가변 영역 및/또는 상기 가변 영역의 부분적인 일부 또는 일부 및/또는 상기 CDR들의 부분적인 일부 또는 일부 및/또는 임의의 상기 조합물을 포함할 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. CDR은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 구성된 그룹으로부터 하나 이상 선택될 수 있다. 항체의 가변 영역은 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합물일 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 부분적인 단편 또는 일부는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내에 있는 2 개 이상, 5 개 이상 또는 10 개 이상의 인접한 아미노산, 예를 들어 2 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 2 내지 50, 5 내지 50 또는 10 내지 50 개의 인접한 아미노산 또는 약 2 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 2 내지 50, 5 내지 50 또는 10 내지 50 개의 인접한 아미노산을 포함하는 단편일 수 있고; 이디오토프는 인접하지 않은 다수의 아미노산 스트레치를 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 부분적인 단편은 가변 영역 내에 있는 2 개 이상, 5 개 이상 또는 10 개 이상의 인접한 아미노산, 예를 들어 2 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 2 내지 50, 5 내지 50 또는 10 내지 50 개의 인접한 아미노산 또는 약 2 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 2 내지 50, 5 내지 50 또는 10 내지 50 개의 인접한 아미노산을 포함하는 단편일 수 있고, 일부 구현예에서 하나 이상의 CDR 또는 CDR 단편을 함유할 수 있다. 상기 CDR 단편은 CDR 내의 연속적인 또는 비연속적인 2 개 이상 또는 5 개 이상의 아미노산일 수 있다. 그러므로, 항체의 이디오토프는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 내의 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 CDR 단편을 함유하는 2 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 2 내지 50, 5 내지 50 또는 10 내지 50 개의 인접한 아미노산 또는 약 2 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 2 내지 50, 5 내지 50 또는 10 내지 50 개의 인접한 아미노산일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이디오토프는 항체의 가변 영역, 예를 들어, CDR 사이트에 위치한 단일 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, 이디오토프는 항체의 가변 부분 내의 임의의 단일 항원 결정요인 또는 에피토프이다. 일부 경우에 이디오토프는 항체의 실제적인 항원-결합 위치와 중복될 수 있고, 일부 경우에는 항체의 항원-결합 위치 외부의 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 항체의 개별 이디오토프 세트를 일부 구현예에서 상기 항체의 "이디오타입(idiotype)"이라 지칭한다.
"초가변 영역(hypervariable region)" 또는 "HVR"과 동의어인 용어 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)" 및 "CDR"은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 비인접한 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 존재한다. "프레임워크 영역(framework region)" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 CDR이 아닌 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에 4 개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4) 및 각각의 전장 경쇄 가변 영역에 4 개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 존재한다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 하기 다수의 잘 알려진 임의의 체계를 이용하여 쉽게 결정될 수 있다: Kabat 외 (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 체계), Al-Lazikani 외, (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 넘버링 체계), MacCallum 외, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" 넘버링 체계), Lefranc MP 외, "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol., 2003 Jan; 27(1): 55-77 ("IMGT" 넘버링 체계), 및 Honegger A 및 Pl
Figure pct00001
ckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3): 657-70, ("Aho" 넘버링 체계).
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 확인을 위해 사용되는 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상기 Kabat 체계는 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면, 상기 Chothia 체계는 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 체계 모두에 대한 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어, "30a"로 설명되는 삽입 및 일부 항체에서 나타나는 결실을 갖는, 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 한다. 상기 2 개의 체계는 특정 삽입 및 결실("indel")을 상이한 위치에 배치하여, 차별적인 넘버링을 생성한다. 상기 Contact 체계는 복합체 결정 구조 분석을 기반으로 하고 Chothia 넘버링 체계와 여러 측면에서 유사하다.
하기 표 1은 Kabat, Chothia 및 Contact 체계 각각에 의해 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 열거한다. CDR-H1에서, Kabat 및 Chothia 넘버링 체계 모두를 이용하여 잔기 번호가 나열된다. FR들은 CDR들 사이에 배치되는데, 예를 들어, FR-L1은 CDR-L1과 CDR-L2 사이에 배치되는 식이다. 도시된 Kabat 넘버링 체계는 삽입을 H35A 및 H35B에 배치하기 때문에, Chothia CDR-H1 루프의 말단이 도시된 Kabat 넘버링 관례를 이용할 경우 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변하는 점이 주목된다.
[표 1]
Figure pct00002
1 - Kabat 외 (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani 외, (1997) JMB 273, 927-948.
따라서, 달리 특정되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 "CDR" 또는 "상보적 결정 영역" 또는 개별적인 특정 CDR(예를 들어, CDR-H1, CDR-H2)은 상기 언급된 임의의 체계로 정의된 바와 같이 (또는 특정) 상보적 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예를 들어, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열에 있는 대응 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 할 경우, 상기 CDR은 상기 언급된 임의의 체계로 정의된 바와 같이, 가변 영역 내의 대응 CDR(예를 들어, CDR-H3) 서열을 갖는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 특정 CDR 서열이 특정된다.
유사하게, 달리 특정되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 FR 또는 개별적인 특정 FR(들)(예를 들어, FR-H1, FR-H2)은 공지된 임의의 체계에 의해 정의된 바와 같이 (또는 특정) 프레임워크 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에, Kabat, Chothia 또는 Contact 방법에 의해 정의된 바와 같이 CDR 예컨대 특정 CDR, FR 또는 FR들 또는 CDR들의 확인을 위한 체계가 특정된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체의 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 각각의 도메인이 4 개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3 개의 CDR을 포함하는 유사한 구조를 갖는다(예를 들어, 참조: Kindt 외 Kuby Immunology, 6th ed. W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 상보적 VL 또는 VH 도메인의 각각의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 특정 항원에 결합하는 항체가 분리될 수 있다. 예를 들어, 참조[Portolano 외, J. Immunol., 150: 880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352: 624-628 (1991)].
제공된 항체 중에는 항체 단편이 존재한다. "항체 단편(antibody fragment)"은 온전한 항체가 결합하는, 항원이 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대 scFv를 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
단일 도메인 항체는 항체의 전부 또는 일부의 중쇄 가변 도메인 또는 전부 또는 일부의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다.
항체 단편은 비제한적으로 온전한 항체의 단백질 가수 분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하여 다양한 기술로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 재조합 생산 단편, 예컨대 자연적으로 발생하지 않는 배열, 예컨대 합성 링커, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 연결된 사슬 또는 2 개 이상의 항체 영역을 갖는 것을 포함하는 단편이고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 분해에 의해 생산되지 않을 수 있다. 일부 측면에서, 항체 단편은 scFv이다.
"인간화(humanized)" 항체는 전부 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래하고 전부 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래한 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래한 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 "인간화 형태(humanized form)"는 인간화를 경험하여 전형적으로 인간에 대한 면역원성이 감소한 반면, 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하는 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체에 있는 일부 FR 잔기는 비인간 항체로부터 대응하는 잔기(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 개선하거나 회복시킨다.
제공된 항체 중에는 인간 항체가 존재한다. "인간 항체(human antibody)"는 인간 항체 라이브러리를 포함하여 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체 암호화 서열을 이용하는 인간 또는 인간 세포 또는 비인간 출처에 의해 생산된 항체의 그것에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 용어는 비인간 항원-결합 영역을 포함하는 비인간 항체의 인간화된 형태, 예컨대 전부 또는 실질적으로 모든 CDR이 비인간인 것을 제외한다.
인간 항체는 항원의 도전에 대한 반응으로 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 유전자 도입 동물에 면역원을 투여하여 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로 전부 또는 일부의 인간 면역글로불린 유전자 자리를 함유하고, 이는 내인성 면역글로불린 유전자 자리를 대체하거나 또는 동물의 염색체로 무작위로 통합되거나 염색체 외에 존재한다. 상기 유전자 도입 동물에서, 내인성 면역글로불린 유전자 자리는 일반적으로 비활성화된다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 및 무세포 라이브러리를 포함한 인간 항체 라이브러리로부터 유래할 수 있고, 인간 레퍼토리로부터 유래한 항체-암호화 서열을 함유할 수 있다.
제공된 항체 중에는 단일 클론 항체 단편을 포함한 단일 클론 항체가 존재한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 상기 용어 "단일 클론 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종 유전자 항체의 집단으로부터 또는 내에서 수득된 항체, 즉, 상기 집단을 포함한 개별 항체가, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하는 가능한 변이 또는 단일 클론 항체 생산 중에 발생하는 가능한 변이(상기 변이는 일반적으로 소량 존재)를 제외하고 동일한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 에피토프를 겨냥한 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조와는 대조적으로, 단일 클론 항체 제조의 각각의 단일 클론 항체는 항원에 있는 단일 에피토프를 겨냥한다. 상기 용어는 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 이해되어서는 않된다. 단일 클론 항체는 비제한적으로 하이브리도마, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 및 기타 항체 디스플레이 방법으로부터의 생성을 포함한 다양한 기술로 제조될 수 있다.
a. SJ25C1-유래 항체
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이로부터 유래한 항-CD19 항체 표적에 특이적이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 52에 제시된 VH 영역 아미노산 서열과 90 % 이상, 예컨대 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 53 또는 54에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 함유하는 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 SEQ ID 번호: 52에 제시된 중쇄 가변(VH) 서열 내에 함유된 CDR-H3를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 55, 56, 57 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1) 및/또는 SEQ ID 번호: 52에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H1; 및/또는 SEQ ID 번호: 59, 60, 61 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2) 및/또는 SEQ ID 번호: 52에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H2를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하고, 여기서 CDR-H1은 SEQ ID 번호: 55, 56, 57 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID 번호: 59, 60, 61 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 CDR-H3은 SEQ ID 번호: 53 또는 54에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID 번호: 55, 56, 57 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1; SEQ ID 번호: 59, 60, 61 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2; 및 SEQ ID 번호: 53 또는 54에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에서, 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), CDR-H2 및 CDR-H3 각각을 포함하고, SEQ ID 번호: 52에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 52에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열 각각을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 52에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 각각 함유한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 52에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 각각 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 52에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 오직 중쇄, VH이고/거나 VL 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하지 않고/거나 항-이디오타입 항체 또는 단편의 항원-결합 위치는 오직 중쇄 잔기만을 포함하고/거나 경쇄 잔기를 포함하지 않는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 경쇄 가변(VL) 영역을 함유하지 않고, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3를 함유하지 않고/거나 VH 영역만을 함유하는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 기재된 바와 같은 선택적으로부터 VH 영역만을 함유하는 sdAb이다.
상기 VH 영역 서열 중 임의를 함유하는 임의의 항-이디오타입 항체 또는 단편의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 경쇄 가변(VL) 영역을 추가로 포함한다. 일부 상기 구현예에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대한 90 % 이상의 서열 동일성, 예컨대 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대한 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 64 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 64 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 66 또는 67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 및/또는 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID 번호: 68 또는 69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및/또는 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 66 또는 67에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 및/또는 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID 번호: 68 또는 69에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및/또는 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 66 또는 67에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1; SEQ ID 번호: 68 또는 69에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L2; 및 SEQ ID 번호: 64 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L3을 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 63에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 각각을 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 63에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4를 각각 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 63에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4를 각각 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 63에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4를 각각 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 63에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 52에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하고/거나; SEQ ID 번호: 63에 제시된 경쇄 가변(VL) 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 52 및 63에 대해 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역을 각각 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID 번호: 52 및 63에 각각 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 VL 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 및 VL 영역은 SEQ ID 번호: 52 및 63의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
일부 구현예에서, SJ25C1 항체에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일 사슬 항체 단편, 예컨대 scFv 또는 디아바디이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 항체는 2 개의 항체 도메인 또는 영역, 예컨대 가변 중쇄(VH) 영역 및 가변 경쇄(VL)를 연결하는 하나 이상의 링커를 포함한다. 상기 링커는 전형적으로 펩티드 링커, 예를 들어, 가요성 및/또는 가용성 펩티드 링커이다. 링커 중에는 글리신 및 세린이 풍부한 링커가 있고/거나 일부 경우에 트레오닌이 풍부하다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 가용성을 개선시킬 수 있는 하전된 잔기 예컨대 리신 및/또는 글루타메이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 하나 이상의 프롤린을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 온전한 항체 또는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항-ID는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 하나 이상의 불변 영역 도메인를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 불변 영역은 경쇄 불변 영역(CL) 및/또는 중쇄 불변 영역 1(CH1)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-ID는 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예컨대 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 115에 제시된 CH 도메인을 함유하거나 또는 SEQ ID 번호: 115에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 118에 제시된 CL 도메인 또는 이의 일부를 함유하거나 또는 SEQ ID 번호: 118에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 일부를 함유한다.
일부 구현예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 116에 제시된 중쇄 서열 또는 SEQ ID 번호: 116에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함하고/거나 SEQ ID 번호: 119에 제시된 경쇄 서열 또는 SEQ ID 번호: 119에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1에 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 116에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID 번호: 119에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID 번호: 117 또는 SEQ ID 번호: 120에 제시된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항원-결합 단편은 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
따라서, 2 개의 항-이디오타입 항체 도메인 또는 영역, 예컨대 VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커를 전형적으로 포함하는, 단일 사슬 항체 단편, 예컨대 scFv 및 디아바디, 특히 인간 단일 사슬 단편이 제공된다. 상기 링커는 전형적으로 펩티드 링커, 예를 들어, 가요성 및/또는 가용성 펩티드 링커이고, 예컨대 글리신 및 세린이 풍부하다.
일부 측면에서, 글리신 및 세린 (및/또는 트레오닌)이 풍부한 링커는 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 % 이상의 상기 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들은 50 %, 55 %, 60 %, 70 % 또는 75 % 이상 또는 약 50 %, 55 %, 60 %, 70 % 또는 75 %의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 실질적으로 완전히 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 상기 링커는 일반적으로 길이가 5 내지 50 개 아미노산 또는 약 5 내지 50 개 아미노산이고, 전형적으로 10 내지 30 개 또는 약 10 내지 약 30 개(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개)이고 일부 실시예에서 10 내지 25 개 아미노산 길이이다. 예시적인 링커는 다양한 수의 반복 서열 GGGS(3GS; SEQ ID 번호: 70) 또는 GGGGS(4GS; SEQ ID 번호: 27), 예컨대 상기 서열의 2, 3, 4 및 5 사이의 반복을 갖는 링커를 포함한다. 예시적인 링커는 SEQ ID 번호: 71(GGGGSGGGGSGGGGS)에 제시된 서열로 구성되거나 이를 갖는 것을 포함한다. 예시적인 링커는 SEQ ID 번호: 72(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)에 제시된 서열로 구성되거나 이를 갖는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 분리된 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 인간화된, 재조합 및/또는 단일 클론이다. 일부 구현예에서, 항-ID는 인간이다.
b. FMC63-유래 항체
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이로부터 유래한 항-CD19 항체 표적에 특이적이다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 VH 영역 아미노산 서열에 대해 90 % 이상의 서열 동일성, 예컨대 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 GYX3FX5X6YX8MX10(SEQ ID 번호: 95)의 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1)(여기서 X3은 T 또는 S, X5는 T 또는 S, X6은 D 또는 R, X8은 Y 또는 W이고 X10은 K 또는 N); 및/또는 WIGX4IX6PX8X9X10X11TX13X14NQX17FKX20(SEQ ID 번호: 96)의 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2)(여기서 X4는 D 또는 M, X6은 N 또는 H, X8은 N 또는 S, X9는 N 또는 D, X10은 G 또는 S, X11은 G 또는 E, X13은 D 또는 R, X14는 Y 또는 L, X17은 N 또는 K 및 X20은 G 또는 D); 및/또는 AX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15(SEQ ID 번호: 97)의 아미노산 서열을 함유하는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)(여기서 X2는 R 또는 S, X3은 E 또는 I, X4는 G 또는 Y, X5는 N 또는 Y, X6은 N 또는 E, X7은 Y 또는 부존재, X8은 G 또는 부존재, X9는 S 또는 부존재, X10은 R 또는 부존재, X11은 D 또는 부존재, X12는 A 또는 부존재, X13은 M 또는 부존재, X14는 D 또는 E 및 X15는 Y 또는 A)을 갖는 VH 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 75, 76, 77 또는 78에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-H3)을 함유하는 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 중쇄 가변(VH) 서열 내에 함유된 CDR-H3를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1) 및/또는 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H1; 및/또는 SEQ ID 번호: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-H2) 및/또는 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 VH 서열 내에 함유된 CDR-H2를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하고, 여기서 CDR-H1은 SEQ ID 번호: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDR-H2는 SEQ ID 번호: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하고/거나; CDR-H3은 SEQ ID 번호: 75, 76, 77 또는 78에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SEQ ID 번호: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1; SEQ ID 번호: 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 또는 94에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2; 및 SEQ ID 번호: 75, 76, 77 또는 78에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-H1), CDR-H2 및 CDR-H3 각각을 포함하고, SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 79, 81, 82, 83에 제시된 CDR-H1; SEQ ID 번호: 87, 89, 90, 91에 제시된 CDR-H2; 및/또는 SEQ ID 번호: 71 또는 77에 제시된 CDR-H3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 80, 84, 85, 86에 제시된 CDR-H1; SEQ ID 번호: 88, 92, 93, 94에 제시된 CDR-H2; 및/또는 SEQ ID 번호: 76, 78에 제시된 CDR-H3을 각각 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 각각 함유한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 각각 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 각각 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 함유한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VH 영역은 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 항원-결합 단편은 오직 중쇄, VH만이고/거나 VL 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하지 않고/거나 항-이디오타입 항체 또는 단편의 항원-결합 위치는 중쇄로부터의 잔기만을 포함하고/거나 경쇄로부터의 잔기는 포함하지 않는다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 경쇄 가변(VL) 영역을 함유하지 않고, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3을 함유하지 않고/거나 VH 영역만을 함유하는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 기재된 바와 같은 선택적으로부터의 VH 영역만을 함유하는 sdAb이다.
상기 VH 영역 서열 중 임의를 함유하는 임의의 항-이디오타입 항체 또는 단편의 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 단편은 경쇄 가변(VL) 영역을 추가로 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 상기 VL 영역은 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 영역 아미노산 서열과 90 % 이상의 서열 동일성, 예컨대 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 영역 아미노산 서열에 대해 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, X1AX3X4X5X6X7X8YX10X11WY(SEQ ID 번호: 112)의 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1)(여기서 X1은 S 또는 R, X3은 S 또는 R, X4는 S 또는 G, X5는 G 또는 N, X6은 V 또는 I, X7은 I 또는 H, X8 i은 N 또는 부존재, X10은 M 또는 L 및 X11은 Y 또는 A); 및/또는 X1X2X3YX5X6X7X8LAX11(SEQ ID 번호: 113)의 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2)(여기서 X1은 P 또는 L, X2는 W 또는 L, X3은 I 또는 V, X5는 L 또는 N, X6은 T 또는 A, X7은 S 또는 K, X8은 N 또는 T 및 X11은 S 또는 D); 및/또는 QX2X3X4X5X6PX8T(SEQ ID 번호: 114)의 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)(여기서 X2는 Q 또는 H, X3은 W 또는 F, X4는 S 또는 W, X5는 S 또는 W, X6은 N 또는 T 및 X8은 L 또는 Y)을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 100, 101, 102 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 100, 101, 102 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3(CDR-L3)을 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 104, 105, 106 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 및/또는 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID 번호: 108, 109, 110 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및/또는 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2를 포함한다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 104, 105, 106 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1(CDR-L1) 및/또는 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L1; 및/또는 SEQ ID 번호: 108, 109, 110 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2(CDR-L2) 및/또는 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 서열 내에 함유된 CDR-L2를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 104, 105, 106 또는 107에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L1; SEQ ID 번호: 108, 109, 110 또는 111에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L2; 및 SEQ ID 번호: 100, 101, 102 또는 103에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 CDR-L3을 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 VL 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 104 또는 106에 제시된 CDR-L1; SEQ ID 번호: 108 또는 110에 제시된 CDR-L2; 및/또는 SEQ ID 번호: 100 또는 101에 제시된 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 105 또는 07에 제시된 CDR-L1; SEQ ID 번호: 109 또는 111에 제시된 CDR-L2; 및/또는 SEQ ID 번호: 102 또는 103에 제시된 CDR-L3을 각각 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4를 각각 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4의 아미노산 서열에 대해 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 프레임워크 영역 1(FR1), FR2, FR3 및/또는 FR4 서열을 각각 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, VL 영역은 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 73 또는 74 에 제시된 VH 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 아미노산 서열을 포함하고/거나; SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 경쇄 가변(VL) 영역 아미노산 서열 내에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID 번호: 73 또는 74에 대한 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 대한 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID 번호: 73 또는 74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역 및 SEQ ID 번호: 98 또는 99에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는 SEQ ID 번호: 73에 제시된 VH 영역 및 SEQ ID 번호: 98에 제시된 VL 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 항체는 SEQ ID 번호: 74에 제시된 VH 영역 및 SEQ ID 번호: 99에 제시된 VL 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 단일 사슬 항체 단편, 예컨대 scFv 또는 디아바디이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 사슬 항체는 2 개의 항체 도메인 또는 영역, 예컨대 가변 중쇄(VH) 영역 및 가변 경쇄(VL)를 연결하는 하나 이상의 링커를 포함한다. 상기 링커는 전형적으로 펩티드 링커, 예를 들어, 가요성 및/또는 가용성 펩티드 링커이다. 링커 중에는 글리신 및 세린이 풍부한 것이 있고/거나 일부 경우에 트레오닌이 풍부하다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 하전된 잔기 예컨대 리신 및/또는 글루타메이트를 추가로 포함하고 이는 가용성을 개선시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 하나 이상의 프롤린을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 온전한 항체 또는 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항-ID는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 하나 이상의 불변 영역 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 불변 영역은 경쇄 불변 영역(CL) 및/또는 중쇄 불변 영역 1(CH1)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예컨대 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 121 또는 127에 제시된 CH 도메인 또는 이의 일부 또는 SEQ ID 번호: 121 또는 127에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 일부를 함유한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 124 또는 130에 제시된 CL 도메인 또는 이의 일부 또는 SEQ ID 번호: 124 또는 130에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 일부를 함유한다.
일부 구현예에서, SJ25C1에 대해 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 122 또는 128에 제시된 중쇄 서열 또는 SEQ ID 번호: 122 또는 128에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함하고/거나 SEQ ID 번호: 125 또는 131에 제시된 경쇄 서열 또는 SEQ ID 번호: 125 또는 131에 대해 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1에 대해 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 122에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID 번호: 131에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1에 대해 특이적인 항-이디오타입 항체는 SEQ ID 번호: 128에 제시된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID 번호: 131에 제시된 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID 번호: 123, 126, 129 또는 132에 제시된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
따라서, 2 개의 항-이디오타입 항체 도메인 또는 영역, 예컨대 VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커를 전형적으로 포함하는 단일 사슬 항체 단편, 예컨대 scFv 및 디아바디, 특히 인간 단일 사슬 단편이 제공된다. 상기 링커는 전형적으로 펩티드 링커, 예를 들어, 가요성 및/또는 가용성 펩티드 링커, 예컨대 글리신 및 세린이 풍부한 펩티드 링커이다.
일부 측면에서, 글리신 및 세린 (및/또는 트레오닌)이 풍부한 링커는 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 % 이상의 상기 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들은 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 50 %, 55 %, 60 %, 70 % 또는 75 % 이상 또는 약 50 %, 55 %, 60 %, 70 % 또는 75 %를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 실질적으로 완전히 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 상기 링커는 일반적으로 5 내지 50 개 아미노산 길이 또는 약 5 내지 50 개 아미노산 길이이고, 전형적으로 10 내지 30 개 또는 약 10 내지 약 30 개, 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개이고 일부 실시예에서 10 내지 25 개 아미노산 길이이다. 예시적인 링커는 다양한 수의 서열 반복 GGGS(3GS; SEQ ID 번호: 70) 또는 GGGGS(4GS; SEQ ID 번호: 27), 예컨대 2, 3, 4 및 5 개 사이의 상기 서열 반복을 갖는 링커를 포함한다. 예시적인 링커는 SEQ ID 번호: 71(GGGGSGGGGSGGGGS)에 제시된 서열로 구성되거나 이를 갖는 것을 포함한다. 예시적인 링커는 SEQ ID 번호: 72(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)에 제시된 서열로 구성되거나 이를 갖는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 분리된 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 인간화된, 재조합 및/또는 단일 클론이다. 일부 구현예에서, 항-ID는 인간이다.
3. 추가 성분
특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드 입자는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항원-결합 도메인에 의해 인식되거나 이와 결합하는 표면 접합 또는 그렇지 않으면 부착된 결합분자 및 세포 상의 추가 분자를 인식 및/또는 결합할 수 있는 하나 이상의 추가 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 추가 결합분자이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 결합분자는 재조합 수용체를 발현하는 세포의 표면에 존재하는 폴리펩티드(예를 들어, 당단백질)에 결합하는 항체(또는 이의 단편 또는 이의 변이체)이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 결합분자는 재조합 수용체를 발현하는 세포와 같은 세포의 표면에서 발현되는 세포 표면 분자, 예컨대 수용체, 예를 들어 활성화 수용체, 공자극 수용체 또는 공수용체에 결합하는 폴리펩티드 또는 이의 일부이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 결합분자는 재조합 수용체를 발현하는 세포와 같은 세포의 표면에 존재하는 폴리펩티드에 결합하는 리간드 또는 이의 일부이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 입자 표면에 노출되어 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 세포의 표면에 있는 추가 분자에 결합하여 세포의 기능, 예를 들어, 증폭을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 세포 상의 추가 분자에 결합하고 세포 상의 보조 신호를 활성화시킨다, 즉, 세포 표면에 있는 추가 분자에 추가 제제의 결합은 하나 이상의 세포 기능, 예를 들어, 증폭에 대해 세포 표면에 있는 추가 분자에 보조 분자의 결합과 같거나 유사한 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 상기 추가 제제는 세포 표면에 있는 추가 분자를 인식 또는 결합하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 상기 제제는 세포의 표면에 있는 추가 분자를 인식 또는 결합하는 리간드 또는 이의 일부이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제를 인식하거나 이와 결합하는 분자는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54(ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, ICOSL, PD-1 (CD279), PD-L1(CD274, B7-H1), PDL2(CD273, B7-DC), OX40(CD134, TNFRSF4), OX-40L, DAP10, CD27L (CD70), 4-1BB(CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL- 10R, CD18/CDl lA(LFA-1), CD62L(L-셀렉틴), CD29/CD49D(VLA-4), Notch 리간드(예를 들어, 델타-유사 1/4, Jagged 1/2, 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CXCR3, CTLA-4, LAG-3(CD223), TIM-3, 4-1BB(CD137), GITR (TNFRSF18, AITR), CD40, CXCR2, 종양 관련 항원(TAA), B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2b4(CD2 분자 패밀리에 속하고 모든 NK, γδ 및 기억 CD8+ (αβ) T 세포에서 발현), CD160(BY55로도 지칭), CGEN-15049, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), TIGIT, CD155, CD155, LAIR1, CD160, 2b4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), LIGHT, KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신 또는 형질 전환 성장 인자 수용체(TGFR; 예를 들어, TGFR 베타)이다.
일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항원-결합 도메인을 인식 또는 결합하는 표면 접합 또는 그렇지 않으면 부착된 결합분자 및 체크포인트 분자, 예컨대 억제 수용체 또는 활성화 수용체 또는 이의 리간드에 결합하는 하나 이상의 추가 결합분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 억제 수용체 또는 이의 리간드 또는 활성화 수용체 또는 이의 리간드의 세포 외 도메인 또는 이의 결합 부분을 함유한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 다량체화 도메인, 예컨대 Fc 영역 또는 도메인에 융합된다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항원-결합 도메인을 인식 또는 결합하는 표면 접합 또는 그렇지 않으면 부착된 결합분자 및 OX-40, ICOS, DAP10, CD28 또는 4-1BB, CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT에 결합하는 하나 이상의 추가 결합분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항원-결합 도메인을 인식 또는 결합하는 표면 접합 또는 그렇지 않으면 부착된 결합분자 및 OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 또는 4-1BBL, PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 또는 LIGHT에 결합하는 하나 이상의 추가 결합분자를 포함한다.
특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항원-결합 도메인을 인식 또는 결합하는 표면 접합 또는 그렇지 않으면 부착된 결합분자 및 CD3 및/또는 CD28에 결합하는 하나 이상의 추가 결합분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 추가 분자는 CD2 또는 CD28에 결합한다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항원-결합 도메인을 인식 또는 결합하는 표면 접합 또는 그렇지 않으면 부착된 결합분자 및 CD28에 결합하는 하나 이상의 추가 결합분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 표면 접합 결합분자 및 CD2에 결합하는 추가 표면 접합 제제를 함유한다. 특정 구현예에서, 입자는 표면 접합 결합분자 및 표면 접합 항-CD2 항체를 함유한다. 특정 구현예에서, 입자는 표면 접합 결합분자 및 CD28에 결합하는 추가 표면 접합 제제를 함유한다. 다양한 구현예에서, 입자는 표면 접합 결합분자 및 표면 접합 항-CD28 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, 입자는 표면 접합 결합분자 및 CD2 및 CD28에 결합하는 추가 표면 접합 제제를 함유한다. 다양한 구현예에서, 입자는 표면 접합 결합분자 및 표면 접합 항-CD2 항체 및 항-CD28 항체를 함유한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 BCMA, ROR1 또는 CD22 항원 또는 단편을 함유하는 에피토프이거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 인식 또는 결합하는 항-ID이다.
특정 구현예에서, 입자는 표면 접합 항-ID, 예를 들어, CAR 예컨대 항-CD19 CAR을 인식 또는 결합하는 항-ID 및 표면 접합 항-CD2 항체를 함유한다. 특정 구현예에서, 입자는 표면 접합 항-ID, 예를 들어, CAR 예컨대 항-CD19 CAR을 인식 또는 결합하는 항-ID 및 표면 접합 항-CD28 항체를 함유한다. 다양한 구현예에서, 입자는 표면 접합 항-ID, 예를 들어, CAR 예컨대 항-CD19 CAR을 인식 또는 결합하는 항-ID 및 표면 접합 항 CD2 및 항-CD28 항체를 함유한다.
일부 구현예에서, 결합분자와 추가 제제 또는 추가 분자의 비율, 예컨대 몰비 또는 중량비는 1:10 내지 10:1 또는 약 1:10 내지 10:1, 예컨대 1:5 내지 5:1 또는 1:2 또는 2:1이거나 또는 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 결합분자 대 상기 2 개의 추가 제제의 비율, 예컨대 몰비 또는 중량비는 1:1:1 또는 약 1:1:1이다.
C. 접합 방법
재조합 수용체(예를 들어, CAR)와 결합 또는 인식하는 결합분자(예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체)에 접합 및/또는 부착된 입자(예를 들어 비드 입자)를 본 명세서에서 제공한다. 입자(예를 들어 비드 입자)에 결합분자, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 및 항-이디오타입 항체를 접합시키기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 방법들은 결합분자의 구조 또는 생물학적 활성을 심각하게 제한하거나 파괴하지 않고, 재조합 수용체와 결합분자, 예를 들어, 항원 펩티드 또는 단백질의 상호 작용을 허용하는 방식으로 입자에 접합될 충분한 수의 결합 분자를 허용하는 임의의 표준 화학을 포함한다. 일부 구현예에서, 입자에 결합분자, 예를 들어, 폴리펩티드 결합분자의 C-말단 영역을 접합시키는 접합 방법이 선택된다. 당업자는 접합을 위한 정확한 화학이 입자 물질의 성질, 입자의 표면에 노출된 작용기, 결합분자에 C-말단 융합의 존재 또는 부재 및 접합 모이어티의 존재 또는 부재에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 어떤 화학이 선택되더라도, 접합 방법이 결합분자의 기능 및/또는 구조적 확립을 변경하지 않는 것이 중요하다. 예를 들어, 결합분자가 항원인 경우, 입자에 항원을 접합시키기 위해 선택된 방법이 항원이 이의 접합 수용체에 의해 인식되는 것을 방해해서는 안된다. 특정 구현예에서, 결합분자가 항체, 예를 들어 항-ID 인 경우, 접합 방법은 항체가 이의 표적 항원에 결합하는 것을 방해해서는 안된다.
일부 구현예에서, 결합분자(예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항-ID)는 입자의 평평한 표면에 수동적인 흡수에 의해 입자(예를 들어, 비드 입자)에 부착된다. 상기 방법에 의한 부착은 전형적으로 비드에 결합분자를 결합시키는 소수성 상호 작용에 의존한다. 일부 구현예에서, 상기 방법이 상대적으로 간단하지만, 상기 방법은 결합분자를 부착시키는 다른 기술, 예컨대 본 명세서, 예컨대 섹션 I-C에서 논의된 임의의 기술과 비교하여 부착된 분자의 최종 배향에 대한 제어를 거의 제공하지 못한다.
1. 입자 표면에 결합
특정 구현예에서, 결합분자는 공유 화학 결합을 통해 담체와 결합한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 폴리펩티드이고 아미노산의 반응성 그룹 또는 모이어티는 직접적인 화학 반응으로 입자의 표면에 있는 반응성 그룹 또는 모이어티에 직접 접합된다. 특정 구현예에서, 결합분자의 아미노산 카르복실기(예를 들어, C-말단 카르복실기), 히드록실기, 티올기 또는 아민기(예컨대 아미노산 측쇄 그룹)은 직접적인 화학 반응으로 PLA 또는 PGA 중합체의 히드록실기 또는 카르복실기, 덴드리머의 말단 아민기 또는 카르복실기 또는 입자의 표면에 있는 인지질의 히드록실기, 카르복실기 또는 포스페이트기에 직접적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 결합분자 및 입자 둘 다에 접합, 예를 들어, 공유적으로 결합하여 이들을 서로 연결한다.
특정 구현예에서, 입자의 표면은 결합분자(예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체)의 부착(예를 들어, 공유 결합, 비공유 결합)을 허용하는 화학적 모이어티 및/또는 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 입자 상의 화학적 모이어티 및/또는 작용기의 수, 배향, 간격 등은 입자 화학 및 결합분자의 특성에 따라 변한다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드에 개질된 표면이 도입되었다. 특정 구현예에서, 입자 표면은 노출된 작용기를 함유한다. 작용기가 노출된 적합한 표면은 카르복실기, 아미노기, 히드록실기, 설페이트기, 토실기, 에폭시기 및 클로로메틸기를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 결합분자는 폴리펩티드이고 표면 노출된 작용기에 접합된다. 일부 구현예에서, 상기 표면 노출 작용기는 활성화되어야 한다, 즉, 폴리펩티드를 직접 결합시킬 수 있는 중간 생산물을 생성하기 위한 화학 반응을 거쳐야 한다. 특정 구현예로 결합분자의 접합을 허용하도록 입자 상의 표면 노출 작용기의 활성화는 당업계에서 정례적인 기술의 문제이고 당업자는 입자에 결합분자를 접합시킬 필요한 임의의 활성화 단계를 수행하기 위한 적합한 시약 및 프로토콜을 쉽게 확인할 것임이 고려된다.
일부 구현예에서, 카르복실화 입자, 예를 들어 비드 입자에 폴리펩티드 결합분자를 결합시키기 위해, 입자의 표면 노출 카르복실기는 아민기를 직접 결합시킬 수 있는 중간체 에스테르를 생성하는 제제와 작용기를 접촉시켜 활성화시키는 것이 필요하다. 입자의 표면에 있는 반응성(즉 활성화된) 카르복실기는 폴리펩티드에 있는 자유 아민(예를 들어, Lys 잔기로부터의)에 접합될 수 있다. 적합한 제제에는, 예를 들어 2 개의 에폭시 잔기, 에피클로로히드린(epichlorohydrin), N-히드록시숙신이미드(NHS) 또는 설포-NHS 또는 에틸 (디메틸아미노프로필)을 함유하는 카르보디이미드(EDC), 에틸렌 카르보디이미드(ECDI), 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 프로필렌글리콜 디-글리시딜에테르(propyleneglycol di-glycidylether)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자는 표면 노출된 카르복실기에서 입자에 공유 결합으로 부착된다. 특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 결합분자는 중간체 에스테르를 생성하도록 제제와 카르복실기를 먼저 접촉시킴으로서 표면 노출된 카르복실기에서 입자에 공유 결합으로 부착된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자의 작용기는 폴리펩티드를 표면 노출된 작용기에 접합시키기 전에 활성화된다. 예를 들어, 폴리펩티드 분자의 카르복실기는 입자의 표면 노출 아미노기에 직접 결합할 수 있는 에스테르 중간체를 생성하기 위해 상기 기재된 제제로 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자는 표면 노출 아민기에서 입자에 접합된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자의 카르복실기는 입자의 표면 노출 카르복실기에 입자를 공유적으로 부착하기 전에 에스테르 중간체를 생성하도록 제제와 접촉된다. 대안적으로, 담체의 표면에 있는 자유 아민기는 설포석신이미딜 (4-아이오도아세틸) 아미노벤조에이트(설포-SIAB) 화학을 이용하여 항원 펩티드 및 단백질 또는 항원 펩티드 또는 단백질 융합 단백질에 공유 결합될 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자는 공유 부착을 형성하기 전에 제제에 의한 활성화가 필요없는 표면 노출 작용기에서 입자, 예를 들어 비드 입자에 공유적으로 부착된다. 상기 작용기의 예에는 토실기, 에폭시기 및 클로로메틸기가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 공유 부착은 당업자에 의해 상기 임의의 작용기에 용이하게 수행되고 확인될 수 있는 특정 시간 동안, 특정 온도 범위에서, 특정 pH 범위에서 및 특정 완충액의 존재 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 입자 표면에 있는 토실기는 pH에 따라 결합분자(예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체)의 아미노기 또는 설프히드릴기에 결합한다. 토실기에 폴리펩티드의 설프히드릴기가 결합하기 위해 중성 pH가 사용되는 반면, 토실기에 폴리펩티드의 아미노기가 결합하기 위해 보다 염기성 pH가 사용된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자(예를 들어, 항원 또는 항체)는 입자의 표면 노출된 토실기, 에폭시기 또는 클로로메틸기에서 입자(예를 들어, 비드 입자)에 공유적으로 부착된다. 특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드 결합분자는 토실화된 입자(즉 표면 노출 토실기를 포함하는 입자)에 부착된다.
일부 구현예에서, 항원 펩티드 또는 단백질에 결합된 리간드와 담체에 부착된 항-리간드 사이의 비공유 결합은 담체에 항원을 접합시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 비오틴 리가아제 인식 서열 태그가 항원 펩티드 또는 단백질의 C-말단에 연결될 수 있고 상기 태그는 비오틴 리가아제로 비오티닐화될 수 있다. 상기 비오틴은 이 후에 항-리간드로서 담체의 표면에 흡착되거나 그렇지 않으면 결합되는 아비딘 또는 스트렙타비딘에 항원 펩티드 또는 단백질을 비공유 결합으로 접합시키기 위한 리간드로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 항원 펩티드 및 단백질이 상기 기재된 바와 같이 Fc 영역을 가지고 있는 면역글로불린 도메인에 융합된 경우, 상기 Fc 도메인은 리간드로서 작용할 수 있고, 담체의 표면에 공유 또는 비공유 결합된 단백질 A는 항원 펩티드 또는 단백질을 상기 담체에 비공유 결합으로 접합시키기 위한 항-리간드로 작용할 수 있다. 금속 이온 킬레이트화 기술(예를 들어, 항원 펩티드 또는 단백질 또는 항원 펩티드 또는 단백질 융합 단백질의 C-말단에서 폴리-His 태그 및 Ni-코팅된 담체를 이용)을 포함하여 항원 펩티드 및 단백질을 담체에 비공유 결합으로 접합시키기 위해 이용될 수 있는 기타 수단이 당업계에 잘 알려져 있고, 상기 방법들은 본 명세서에 기재된 방법으로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, 결합분자는 링커에 의해 입자에 접합된다. 특정 구현예에서, 상기 링커는 다양한 2 작용성 단백질 커플링 제제 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-l-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2 작용성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대 디석신이미딜 서버레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조니움 유도체(예컨대 비스-(p-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예컨대 l,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특정 커플링 제제는 이황화 결합을 제공하기 위한 N- 석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)를 포함한다.
2. 가역적 결합
일부 구현예에서, 결합분자는 입자, 예를 들어, 비드 입자에 가역적으로 부착되거나 그렇지 않으면 가역적으로 관련된다. 특정 구현예에서, 결합분자는 입자에 부착된 시약에 가역적으로 부착되거나 그렇지 않으면 가역적으로 관련된다. 특정 구현예에서, 상기 시약은 입자 표면에 노출되어 있다. 특정 구현예에서, 상기 시약은 결합분자에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 위치를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 다량체화 시약이다. 일부 구현예에서, 결합분자와 상기 시약 사이의 결합 상호 작용은 비공유 결합 상호 작용이다. 일부 구현예에서, 결합분자와 상기 시약 사이의 결합 상호 작용, 예를 들어, 비공유 결합 상호 작용은 가역적이다. 일부 구현예에서, 결합분자는 단백질, 예를 들어, 스트렙타비딘으로 구성된 올리고머 또는 중합체인 입자에 가역적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 결합분자와 시약 사이의 가역적 회합은 결합분자에 의해 결합되는 시약의 같은 결합 위치(또는 위치들)에 결합할 수도 있는 결합 위치이거나 이를 함유하는 물질, 예컨대 경쟁 시약(용리제 시약으로도 명명)의 존재 하에서 매개될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질(예를 들어, 경쟁 시약)은 결합분자보다 더 높은 농도로 존재하기 때문에 및/또는 시약에 존재하는 결합 위치에 대한 보다 높은 결합 친화도 때문에 경쟁자로 작용할 수 있어서, 시약으로부터 결합분자를 분리 및/또는 해리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 시약에 있는 하나 이상의 결합 위치에 대한 상기 물질(예를 들어, 경쟁 시약)의 친화도는 시약에 있는 하나 이상의 결합 위치에 대한 결합분자의 친화도보다 더 크다. 따라서, 일부 구현예에서, 시약과 결합분자의 결합 사이의 결합은 물질(예를 들어, 경쟁 시약)의 추가로 파괴될 수 있어서, 제제(예를 들어, 수용체-결합 제제 또는 선택 제제)의 회합을 만들고 시약을 가역적으로 만든다.
상기 가역적 시스템에서 사용될 수 있는 시약은 당업계에 공지되고 기재되어 있다. 예를 들어, 참조[미국 특허 번호 5,168,049; 5,506,121; 6,103,493; 7,776,562; 7,981,632; 8,298,782; 8,735,540; 9,023,604; 및 국제 공개 PCT 출원 번호 WO2013/124474 및 WO2014/076277]. 상기 결합을 역전시킬수 있는 물질(예를 들어, 경쟁 시약)뿐만 아니라 가역적 상호 작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 시약은 입자, 예를 들어, 비드 입자의 표면에 부착 및 노출되고, 결합분자에 특이적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 위치를 함유하여 상기 시약은 복수의 결합분자, 예를 들어, 다량체화 시약에 가역적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 입자의 표면에 부착된 개별 분자를 구성하는 개별 분자(예를 들어, 단량체)의 올리고머 또는 중합체 또는 복합체(예를 들어, 사량체)이고, 각각은 결합분자에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 위치를 함유한다. 일부 구현예에서, 입자는 시약으로 구성된다, 즉 입자는 시약의 올리고머 또는 중합체이다.
일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체(예컨대 뉴트라비딘) 또는 이의 혼합물이고, 상기 시약은 결합분자와 가역적 회합이 가능한 하나 이상의 결합 위치를 함유한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 분자인 융합 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체이다. 일부 구현예에서, 결합분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 분자인 융합 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편과 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘의 유사체 또는 돌연변이 단백질 또는 아비딘의 유사체 또는 돌연변이 단백질이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 도메인은 결합분자의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘-결합 펩티드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘의 유사체 또는 돌연변이 단백질 또는 아비딘의 유사체 또는 돌연변이 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 물질(예를 들어, 경쟁 시약)은 시약의 하나 이상의 결합 위치에 대해 결합분자와 결합을 두고 경쟁할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 결합분자의 융합 도메인과 물질(예를 들어, 경쟁 시약)은 상이하고 물질(예를 들어, 경쟁 시약)은 시약에 대한 결합분자의 친화도와 비교하여 시약에 대해 보다 높은 결합 친화도를 나타낸다. 특정 구현예에서, 융합 도메인과 물질, 예를 들어, 경쟁 시약은 동일하다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체, 예컨대 스트렙타비딘-유사 폴리펩티드일 수 있다. 유사하게, 일부 측면에서, 아비딘은 야생형 아비딘 또는 아비딘의 돌연변이 단백질 또는 유사체 예컨대 뉴트라비딘, 천연 아비딘의 대안으로 이용 가능하고 보다 중성 등전점을 전형적으로 나타내는 개질 아르기닌을 갖는 탈당화된 아비딘을 포함한다. 일반적으로, 아비딘의 탈당화된, 중성 형태는 상업적으로 이용 가능한 형태 예컨대 "Extravidin"(Sigma Aldrich를 통해 이용 가능) 또는 "NeutrAvidin"(예를 들어 Thermo Scientific 또는 Invitrogen을 통해 이용 가능)을 포함한다.
일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 또는 유사체이다. 일부 구현예에서, 야생형 스트렙타비딘(wt-스트렙타비딘)은 문헌[Argarana 외, Nucleic Acids Res. 14(1986) 1871-1882(SEQ ID 번호: 21)]에 개시된 아미노산 서열을 갖는다. 일반적으로, 스트렙타비딘은 자연에서 4 개의 같은 서브 유닛의 사량체로 존재한다, 즉 동종-사량체이고, 각각의 서브 유닛은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 단일 결합 위치를 함유한다. 스트렙타비딘 서브 유닛의 예시적인 서열은 SEQ ID 번호: 21에 제시된 아미노산 서열이나, 상기 서열은 다른 Streptomyces 종으로부터 이의 상동물에 존재하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 특히, 스트렙타비딘의 각각의 서브 유닛은 약 10-14 M 정도의 평형 해리 상수(KD)로 비오틴에 대한 강력한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 스트렙타비딘은 4 개의 결합 위치 중 하나만이 작용성인 1 가 사량체(Howarth 외 (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang 외 (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63)), 4 개의 결합 위치 중 2 개가 작용성인 2 가 사량체(Fairhead 외 (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214)로 존재할 수 있고 또는 단량체 또는 이량체 형태(Wu 외 (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim 외 (2010) Biochemistry, 50:8682-91)로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합분자는 예를 들어, 비오틴 모방체로 작용하고 스트렙타비딘에 대한 결합 친화도를 실증하는 펩티드 서열이고, 미국 특허 번호 제 5,506,121호에 개시된 것과 같은 Strep-태그인 융합 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 결합 친화도는 스트렙타비딘 분자 내에 돌연변이를 일으켜 더욱 개선될 수 있다. 예를 들어, 참조[미국 특허 번호 6,103,493 또는 국제 공개된 PCT 출원 번호 WO2014/076277]. 일부 구현예에서, 결합 친화도는 당업계에 공지된 방법으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 돌연변이 단백질은 결합분자의 융합 도메인에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 융합 도메인은 SEQ ID 번호: 11에 제시된 일반적인 방식의 서열, 예컨대 SEQ ID 번호: 12에 제시된 서열을 함유하는 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 서열은 SEQ ID 번호: 13, 예컨대 SEQ ID 번호: 43에 제시된 일반적인 방식을 갖는다. 하나의 실시예에서, 펩티드 서열은 SEQ ID 번호: 9에 제시된다. 하나의 실시예에서, 펩티드 서열은SEQ ID 번호: 10으로 제시되고, STREP- TAG® Ⅱ 스트렙타비딘 폴리펩티드로도 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 2 개 이상의 스트렙타비딘-결합 모듈의 순차적인 배열을 함유하고, 여기서 2 개의 모듈 사이 거리는 0 이상 및 50 개 이하의 아미노산이고, 여기서 1 개의 결합 모듈은 3 내지 8 개의 아미노산을 갖고 적어도 His-Pro-XaA(SEQ ID 번호: 11) 서열을 함유하고, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이고, 다른 결합 모듈은 예컨대 SEQ ID 번호: 13에 제시된 동일하거나 상이한 스트렙타비딘 펩티드 리간드를 갖는다(예를 들어, 참조: 국제 공개 PCT 출원 번호 WO02/077018; 미국 특허 번호 7,981,632). 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 임의의 SEQ ID 번호: 15 또는 16에 제시된 방식을 갖는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 임의의 SEQ ID 번호: 15 내지 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 시약은 기타 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비제한적으로, 비오틴, 이미노비오틴, 리포산, 데스티오비오틴, 디아미노비오틴, HABA(히드록시아조벤젠-벤조산) 및/또는 디메틸-HABA를 인식 또는 결합하는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 돌연변이 단백질(또는 이의 일부)이다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 돌연변이 단백질은 또 다른 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비오틴 또는 데스티오비오틴에 대해 SEQ ID 번호: 7 내지 19 중 어느 하나에 제시된 것과 같은 비오틴 모방 펩티드 리간드에 대한 스트렙타비딘 돌연변이 단백질의 결합 친화도보다 큰 결합 친화도를 나타낸다. 따라서, 일부 구현예에서, 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 유도체(예를 들어, 데스티오비오틴)가 제공된 방법에서 경쟁 시약으로 이용될 수 있다. 예를 들어, Strep-tactin®(예를 들어, SEQ ID 번호: 23에 제시된 서열을 함유)으로 표시된 돌연변이 단백질 스트렙타비딘의 상호 작용의 예가 있다.
일부 구현예에서, 시약은 전이 금속 이온과 결합할 수 있는 2 개 이상의 킬레이트 그룹 K를 포함한다. 일부 구현예에서, 시약은 올리고히스티딘 친화도 태그, 글루타티온-S-전달효소, 칼모듈린 또는 이의 유사체, 칼모듈린 결합 펩티드(CBP), FLAG-펩티드, HA-태그, 말토오스 결합 단백질(MBP), HSV 에피토프, myc 에피토프 및/또는 비오티닐화 담체 단백질에 결합할 수 있다.
3. 결합분자 배향
일부 구현예에서, 결합분자는 결합분자를 인식 또는 결합하는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포와 결합 분자 간의 최적의 상호 작용을 허용하는 배향으로 입자, 예를 들어, 비드 입자에 결합하거나 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 최적화된 배향은 결합분자가 결합된 입자에 의한 간섭을 갖지 않거나 최소화하면서 재조합 수용체와 결합분자 간의 결합을 허용한다. 일부 구현예에서, CAR, 예를 들어, 항원 또는 항-ID를 인식 또는 결합하는 결합분자의 영역에 대한 입자의 상대적인 위치는 재조합 수용체, 예를 들어, 상기 CAR을 발현하는 세포와 접촉하는 상기 영역에 대한 접근을 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 결합분자는 표적 세포의 재조합 수용체, 예를 들어, 항원 또는 항-ID를 인식 또는 결합하는 영역과는 상이한 영역, 예를 들어, 융합 도메인에서 입자에 부착된다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 영역에서 입자에 부착되지 않는다. 특정 구현예에서, 결합분자는 결합분자의 또 다른 영역과 비교하여 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 영역에서 입자에 부착될 가능성이 낮다.
특정 구현예로 결합분자가 결합분자 말단, 예를 들어, C-말단에서 입자, 예를 들어, 비드 입자와 결합할 경우, 결합분자가 재조합 수용체에 결합하는 최적의 배향을 제공하는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체가 인식 또는 결합하는 영역의 반대쪽 말단에서 입자에 결합된다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예를 들어, 항원 또는 항-ID에 결합하는 영역이 입자로부터 떨어져 위치하도록 입자에 부착된다. 특정 구현예에서, 결합분자는 한쪽 말단, 예를 들어 이의 C-말단에서 입자에 부착되고 재조합 수용체에 결합하는 영역은 반대쪽 말단, 예를 들어 결합분자의 N-말단에 위치한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 결합분자의 항원 또는 항-ID가 입자에 대해 외부 배향으로 위치하도록 입자에 부착된다. 일부 구현예로 입자로부터 재조합 수용체에 결합하는 영역에 대한 외부 배향은 재조합 수용체를 발현하는 세포와 결합분자 사이의 상호 작용에 대한 가장 큰 가능성을 제공하는 것으로 고려된다.
일부 구현예에서, 결합분자, 예를 들어, 폴리펩티드는 표적 세포의 재조합 수용체, 예를 들어 및 항원 또는 항-ID를 인식 또는 결합하는 영역 및 별개 영역, 예를 들어, 융합 도메인에서 입자에 결합하거나 부착되는 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 영역과 별개 영역, 예를 들어 융합 도메인은 결합분자의 반대쪽 말단에 위치한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 결합분자의 N-말단에 있는 또는 근방에 있는 표적 세포의 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 영역 및 C-말단 도메인에 있는 또는 근방에 있는 별개 영역, 예를 들어 융합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 결합분자의 C-말단에 있는 또는 근방에 있는 표적 세포의 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 영역 및 N-말단 도메인에 있는 또는 근방에 있는 별개 영역, 예를 들어 융합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체의 영역은 상기 영역이 N-말단 또는 C-말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 아미노산 이내에 위치할 경우 N-말단 또는 C-말단 근방이다.
일부 구현예에서, 결합분자는 입자에 결합하는 융합 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체이다. 일부 구현예에서, 결합분자는 융합 도메인 내에 있는 하나 이상의 위치에서 입자에 결합한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 융합 도메인의 외부에 있는 하나 이상의 결합분자 위치에서보다 융합 도메인 내에 있는 하나 이상의 위치에서 입자와 결합할 가능성이 더 크다. 일부 구현예에서, 결합분자는 융합 도메인의 외부에 있는 하나 이상의 결합분자 위치에서보다 융합 도메인 내에 있는 하나 이상의 위치에서 입자와 결합할 가능성이 1 % 이상, 5 % 이상, 10 % 이상, 15 % 이상, 20 % 이상, 25 % 이상, 30 % 이상, 35 % 이상, 40 % 이상, 45 % 이상, 50 % 이상, 55 % 이상, 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 99 % 이상, 99.9 % 이상 또는 100 % 이상 더 크다. 특정 구현예에서, 결합분자는 1 배 이상, 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 30 배 이상, 40 배 이상, 50 배 이상, 100 배 이상, 500 배 이상 또는 1,000 배 이상 융합 도메인의 외부에 있는 하나 이상의 결합분자 위치에서보다 융합 도메인 내에 있는 하나 이상의 위치에서 입자와 결합할 가능성이 크다.
특정 구현예에서, 결합분자는 융합 도메인 또는 태그에 결합한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체 또는 CAR을 인식하고/거나 결합하는 항원 또는 항-ID, 융합 도메인 또는 태그에 직접 또는 간접적으로 결합하는 항원 또는 항-ID이거나 또는 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 항원 또는 이의 일부 및 융합 도메인 또는 태그를 함유하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 결합분자는 융합 도메인 또는 태그에서 또는 이의 내부에 있는 위치(예를 들어, 아미노산의 측쇄)에서 입자에 접합된다. 특정 구현예에서, 융합 도메인 또는 태그에서 입자에 결합분자의 부착은 재조합 수용체 또는 CAR에 의해 인식 또는 결합되는 입자에 접합된 결합 분자에 대한 최적의 배향을 초래한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체, 예를 들어 CAR을 인식하는 항원 또는 항-ID를 포함하는 결합분자는 C-말단에 있는 융합 도메인 또는 태그에 결합하고, 이 경우 융합 도메인 또는 태그를 통한 입자에의 접합은 항원 수용체, 예를 들어 CAR와의 상호 작용을 위한 결합된 결합분자의 N-말단 영역을 우선적으로 배향시키거나 노출시킨다.
융합 도메인 또는 태그는 당업계에 잘 알려져 있고, 융합 도메인 또는 태그는 제공된 결합분자에 있는 항원에 결합되어 원하는 특성, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩티드의 분리 또는 입자 표면 상의 작용기에 공유적 부착을 부여할 수 있다. 상기 융합 도메인의 잘 알려진 예로는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 아비딘, 글루타티온 S 전달효소(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP) 또는 인간 혈청 알부민이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 도메인은 폴리펩티드 태그이다. 잘 알려진 폴리펩티드 태그의 예로는 AviTag(SEQ ID 번호: 3), 칼모듈린-태그(SEQ ID 번호: 4), 폴리글루타메이트 태그(SEQ ID 번호: 5), FLAG-태그(SEQ ID 번호: 6), HA-태그(SEQ ID 번호: 7), His-태그(5-10 히스티딘), Myc-태그(SEQ ID 번호: 8) 및 형광 단백질-태그(예를 들어, EGFP)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 융합 도메인 또는 태그는 스트렙타비딘-결합 펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 서열은 SEQ ID 번호: 9 및 10으로 예시된 바와 같이 STREP-TAG® 스트렙타비딘-결합 펩티드 서열이다. 일부 구현예에서, 융합 도메인은 SEQ ID 번호: 11 내지 19에 제시된 아미노산 서열로 예시된 바와 같이 스트렙타비딘-결합 펩티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 입자의 표면 노출 글루타티온과 결합하는 GST 융합 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 GST 융합 도메인은 결합분자의 C-말단이나 그 근방에 위치한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 입자의 표면 노출 비오틴 또는 스트렙타비딘 리간드에 결합하는 strep-태그 융합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 strep-태그 융합 도메인은 결합분자의 C-말단이나 그 근방에 위치한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 입자의 표면에 부착된 Fc 폴리펩티드에 결합하는 단백질 A 융합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 단백질 A 융합 도메인은 결합분자의 C-말단이나 그 근방에 위치한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 입자의 표면에 부착된 알부민 또는 Fc 폴리펩티드에 결합하는 단백질 G 융합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 단백질 A 융합 도메인은 결합분자의 C-말단이나 그 근방에 위치한다.
특정 구현예에서, 결합분자는 소수성 영역 또는 나머지 결합분자보다 더 소수성인 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 소수성 영역의 외부에 있는 결합분자의 위치보다 더 소수성인 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 소수성 영역은 융합 도메인이다. 특정 구현예에서, 상기 소수성 영역은 Fc 도메인이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 입자의 표면이 소수성인 경우, 결합분자의 다른 영역에서보다 소수성 영역에 있는 하나 이상의 위치에서 입자에 결합하거나 부착될 가능성이 더 크다. 다양한 구현예에서, 결합분자의 소수성 영역은 입자의 표면 노출 작용기에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 작용기는 토실기거나 또는 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 Fc 도메인을 포함하고, 상기 Fc 도메인은 융합 폴리펩티드의 C-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 항체, 예를 들어 Fc 도메인을 포함하는 항-이디오타입 항체이다. 특정 구현예에서, 상기 Fc 도메인은 입자의 표면 노출 단백질 G 또는 단백질 A에 결합하거나 부착한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 작용기는 입자의 작용기에 결합한다. 특정 구현예에서, 입자 표면이 Fc 도메인의 외부에 있는 결합분자의 위치보다 소수성인 경우, 융합 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 도메인은 결합분자의 항원 또는 항체 영역보다 더 소수성이고 Fc 도메인 내의 위치는 입자, 예를 들어, 표면 노출 작용기에 결합할 가능성이 더 크다.
특정 구현예에서, Fc 도메인을 포함하는 결합분자는 Fc 영역 내의 하나 이상의 위치에서 입자에 결합한다. 입자, 예를 들어, 비드 입자에 Fc 영역에 위치한 사이트에서 결합분자의 결합은 당업계의 표준 기술을 통해 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 입자 표면이 소수성인 경우, Fc 도메인은 소수성인 경향이 있고 Fc 도메인이 결합분자(예를 들어, 폴리펩티드 항원)의 다른 도메인보다 더 소수성인 경우, 이후 Fc 도메인 내에 위치한 아미노산 측쇄와 입자(예를 들어, 토실기)에 위치한 표면 노출 작용기 사이에서 결합이 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 입자의 표면은 소수성이다. 일부 구현예에서, 입자의 표면은 비친수성이다. 특정 구현예에서, 입자의 표면은 소수성이고 표면 노출 토실기를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 비-소수성이다. 특정 구현예에서, 입자는 친수성이다. 일부 구현예에서, 입자의 표면은 비-소수성이다. 일부 구현예에서, 입자의 표면은 친수성이다.
4. 접합 입자
일부 구현예에서, 결합분자(예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 항체)는 입자, 예를 들어, 비드 입자에 부착된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 상기 입자에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 상기 입자에 비공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 1 개 이상의 결합분자, 10 개 이상의 결합분자, 102 개 이상의 결합분자, 103 개 이상의 결합분자, 104 개 이상의 결합분자, 105 개 이상의 결합분자, 106 개 이상의 결합분자, 107 개 이상의 결합분자, 108 개 이상의 결합분자 또는 109 개 이상의 결합분자가 각각의 입자에 부착된다. 특정 구현예에서, 102 결합분자 내지 109 결합분자, 102 결합분자 내지 107 결합분자, 103 결합분자 내지 109 결합분자, 103 결합분자 내지 108 결합분자 또는 103 결합분자 내지 106 결합분자(각각의 수치 포함) 또는 약 102 결합분자 내지 109 결합분자, 102 결합분자 내지 107 결합분자, 103 결합분자 내지 109 결합분자, 103 결합분자 내지 108 결합분자 또는 103 결합분자 내지 106 결합분자(각각의 수치 포함)가 각각의 입자에 공유 결합으로 부착된다. 특정 구현예에서, 103 결합분자 내지 106 결합분자(수치 포함) 또는 약 103 결합분자 내지 106 결합분자(수치 포함)가 각각의 입자에 공유 결합으로 부착된다. 특정 구현예에서, 104 결합분자 내지 106 결합분자(수치 포함) 또는 약 104 결합분자 내지 106 결합분자(수치 포함)가 각각의 입자에 공유 결합으로 부착된다. 특정 구현예에서, 104 결합분자 내지 105 결합분자(수치 포함) 또는 약 104 결합분자 내지 105 결합분자(수치 포함)가 각각의 입자에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 약 105 결합분자 내지 106 결합분자(수치 포함)가 각각의 입자에 공유 결합으로 부착된다.
특정 구현예에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드 입자에 공유 결합으로 부착된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자의 0.001 μg 이상, 0.01 μg 이상, 0. 1 μg 이상, 0.5 μg 이상, 1 μg 이상, 1.5 μg 이상, 2 μg 이상, 2.5 μg 이상, 3 μg 이상, 3.5 μg 이상, 4 μg 이상, 4.5 μg 이상, 5 μg 이상, 6 μg 이상, 7 μg 이상, 8 μg 이상, 9 μg 이상, 10 μg 이상 또는 50 μg 이상의 양이 107 입자 당 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자의 0.001 μg 내지 100 μg, 0.01 μg 내지 50 μg, 0.1 μg 내지 10 μg, 0.5 μg 내지 10 μg, 0.1 μg 내지 1 μg, 1 μg 내지 10 μg, 0.5 μg 내지 5 μg 또는 1 μg 내지 5 μg(각각의 수치 포함) 또는 약 0.001 μg 내지 100 μg, 0.01 μg 내지 50 μg, 0.1 μg 내지 10 μg, 0.5 μg 내지 10 μg, 0.1 μg 내지 1 μg, 1 μg 내지 10 μg, 0.5 μg 내지 5 μg 또는 1 μg 내지 5 μg(각각의 수치 포함)이 107 입자 당 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자의 1 μg 내지 10 μg(수치 포함) 또는 약 1 μg 내지 약 10 μg(수치 포함)이 107 입자 당 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다.
특정 구현예에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드 입자에 결합되거나 부착된다. 특정 구현예에서, 0.0001 pg, 0.001 pg, 0.005 pg, 0.01 pg, 0.02 pg, 0.03 pg, 0.04 pg, 0.05 pg, 0.06 pg, 0.07 pg, 0.08 pg, 0.09 pg, 0.1 pg, 0.2 pg, 0.3 pg, 0.4 pg, 0.5 pg, 0.6 pg, 0.7 pg, 0.8 pg, 0.9 pg, 1.0 pg 또는 5.0 pg의 폴리펩티드 결합분자 평균량 또는 약 0.0001 pg, 0.001 pg, 0.005 pg, 0.01 pg, 0.02 pg, 0.03 pg, 0.04 pg, 0.05 pg, 0.06 pg, 0.07 pg, 0.08 pg, 0.09 pg, 0.1 pg, 0.2 pg, 0.3 pg, 0.4 pg, 0.5 pg, 0.6 pg, 0.7 pg, 0.8 pg, 0.9 pg, 1.0 pg 또는 5.0 pg의 폴리펩티드 결합분자 평균량 또는 0.0001 pg, 0.001 pg, 0.005 pg, 0.01 pg, 0.02 pg, 0.03 pg, 0.04 pg, 0.05 pg, 0.06 pg, 0.07 pg, 0.08 pg, 0.09 pg, 0.1 pg, 0.2 pg, 0.3 pg, 0.4 pg, 0.5 pg, 0.6 pg, 0.7 pg, 0.8 pg, 0.9 pg, 1.0 pg 또는 5.0 pg 이상의 폴리펩티드 결합분자 평균량이 각각의 입자에 결합되거나 부착된다. 일부 구현예에서, 결합분자 0.0001 pg 내지 10 pg, 0.001 pg 내지 1 pg, 0.001 pg 내지 1 pg, 0.001 μg 내지 0.1 pg, 0.01 pg 내지 0.1 pg, 1 pg 내지 10 pg, 0.5 pg 내지 5 pg 또는 1 pg 내지 5 pg(각각의 수치 포함) 또는 결합분자 약 0.0001 pg 내지 약 10 pg, 약 0.001 pg 내지 약 1 pg, 약 0.001 pg 내지 약 1 pg, 약 0.001 μg 내지 약 0.1 pg, 약 0.01 pg 내지 약 0.1 pg, 약 1 pg 내지 약 10 pg, 약 0.5 pg 내지 약 5 pg 또는 약 1 pg 내지 약 5 pg(각각의 수치 포함)이 입자에 결합하거나 부착된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드 결합분자 0.0001 pg, 0.001 pg, 0.005 pg, 0.01 pg, 0.02 pg, 0.03 pg, 0.04 pg, 0.05 pg, 0.06 pg, 0.07 pg, 0.08 pg, 0.09 pg, 0.1 pg, 0.2 pg, 0.3 pg, 0.4 pg, 0.5 pg, 0.6 pg, 0.7 pg, 0.8 pg, 0.9 pg, 1.0 pg 또는 5.0 pg 이하의 평균량이 각각의 입자에 부착되거나 결합한다. 특정 구현예에서, 입자는 약 2.8 μm의 직경을 갖고 0.001 내지 0.1 pg(수치 포함) 또는 약 0.001 내지 0.1 pg(수치 포함)의 결합분자가 입자에 부착되거나 결합한다. 특정 구현예에서, 입자는 약 4.5 μm의 직경을 갖고 0.01 내지 1 pg(수치 포함) 또는 약 0.01 내지 1 pg pg(수치 포함)의 결합분자가 입자에 부착되거나 결합한다.
특정 구현예에서, 결합분자는 107 입자 당 10-16 mol 이상, 10-15 mol 이상, 10-14 mol 이상, 10-13 mol 이상, 10-12 mol 이상, 10-11 mol 이상, 10-10 mol 이상, 10-9 mol 이상, 10-8 mol 이상, 10-7 mol 이상, 10-6 mol 이상, 10-5 mol 이상, 10-4 mol 이상, 10-3 mol 이상, 10-2 mol 이상, 10-1 mol 이상 또는 1 mol 이상의 양으로 입자, 예를 들어 비드 입자에 부착되거나 결합한다. 일부 구현예에서, 107 입자 당 1 x 10-13 mol 내지 1 x 10-9 mol, 1 x 10-12 mol 내지 1 x 10-9 mol, 1 x 10-13 mol 내지 1 x 10-10 mol, 또는 1 x 10-12 mol 내지 1 x 10-9 mol(각각의 수치 포함) 또는 약 1 x 10-13 mol 내지 1 x 10-9 mol, 1 x 10-12 mol 내지 1 x 10-9 mol, 1 x 10-13 mol 내지 1 x 10-10 mol 또는 1 x 10-12 mol 내지 1 x 10-9 mol(각각의 수치 포함)이 입자에 부착되거나 결합한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 각각의 입자에 10-20 mol이상, 10-19 mol이상, 10-18 mol이상, 10-17 mol이상, 10-16 mol이상, 10-15 mol이상, 10-14 mol이상, 10-13 mol이상, 10-12 mol이상, 10-11 mol 이상 또는 10-10 mol이상의 양으로 입자, 예를 들어 비드 입자에 부착되거나 결합한다. 일부 구현예에서, 각각의 입자에 대해 10-21 mol 내지 10-10 mol, 10-20 mol 내지 10-18 mol, 10-19 mol 내지 10-17 mol 또는 10-21 mol 내지 10-19 mol(각각의 수치 포함) 또는 약 10-21 mol 내지 10-10 mol, 10-20 mol 내지 10-18 mol, 10-19 mol 내지 10-17 mol 또는 10-21 mol 내지 10-19 mol(각각의 수치 포함)이 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 2.8 μm의 직경을 갖고 결합분자는 10-20 mol 내지 10-18 mol(수치 포함) 또는 약 10-20 mol 내지 10-18 mol(수치 포함)의 양으로 입자에 부착되거나 결합한다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 4.5 μm의 직경을 갖고 결합분자는 10-19 mol 내지 10-17 mol(수치 포함) 또는 약 10-19 mol 내지 10-17 mol(수치 포함)의 양으로 입자에 부착되거나 결합한다.
특정 구현예에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 결합분자를 입자에 부착 및/또는 접합시키기 위해 입자, 예를 들어 비드, 예를 들어, 토실활성화된 비드와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 결합분자 및 입자, 예를 들어 비드는 1x108 내지 1x1010 입자(수치 포함) 당, 1 μg, 2 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 175 μg 또는 200 μg의 결합분자 또는 약 1 μg, 2 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 175 μg 또는 200 μg의 결합분자 농도에서 인큐베이션되고 상기 결합분자는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 초과 또는 100 % 또는 약 100 %의 효율로 입자, 예를 들어 비드에 부착되고/거나 접합된다. 일부 구현예에서, 결합분자 및 입자, 예를 들어 비드는 4x108 내지 5x108 입자(수치 포함) 당, 1 μg, 2 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 175 μg 또는 200 μg 의 결합분자 또는 약 1 μg, 2 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 175 μg 또는 200 μg 의 결합분자 농도로 인큐베이션되고, 결합분자는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 초과 또는 100 % 또는 약 100 %의 효율로 입자, 예를 들어 비드에 부착되고/거나 접합된다. 특정 구현예에서, 결합분자 및 입자, 예를 들어 비드는 3.5x109 내지 4.5x109 입자(수치 포함) 당, 1 μg, 2 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 175 μg 또는 200 μg 의 결합분자 또는 약 1 μg, 2 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 25 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 75 μg, 100 μg, 125 μg, 150 μg, 175 μg 또는 200 μg 의 결합분자 농도로 인큐베이션되고, 결합분자는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 초과 또는 100 % 또는 약 100 %의 효율로 입자에 부착되고/거나 접합된다. 특정 구현예에서, 1 μg 내지 5 μg, 5 μg 내지 25 μg, 1 μg 내지 50 μg, 10 μg 내지 50 μg, 0.1 μg 내지 10 μg 또는 50 μg 내지 200 μg(각각의 수치 포함)의 결합분자가 4x108 내지 5x108 입자 또는 3.5x109 내지 4.5x109 입자(각각의 수치 포함) 또는 약 4x108 내지 5x108 입자 또는 약 3.5x109 내지 4.5x109 입자(각각의 수치 포함)와 인큐베이션되고, 결합분자는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 또는 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.9 % 초과 또는 100 % 또는 약 100 %의 효율로 입자, 예를 들어 비드에 부착되고/거나 접합된다.
일부 구현예에서, 입자에 접합 또는 부착된 결합분자의 평균량은 2x10-16 g/입자, 1x10-15 g/입자, 2x10-15 g/입자, 5x10-15 g/입자, 1x10-14 g/입자, 2x10-14 g/입자, 5x10-14 g/입자, 1x10-13 g/입자, 2x10-13 g/입자, 5x10-13 g/입자, 1x10-13 g/입자 및 2x10-13 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 또는 약 2x10-16 g/입자, 1x10-15 g/입자, 2x10-15 g/입자, 5x10-15 g/입자, 1x10-14 g/입자, 2x10-14 g/입자, 5x10-14 g/입자, 1x10-13 g/입자, 2x10-13 g/입자, 5x10-13 g/입자, 1x10-13 g/입자 및 2x10-13 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 또는 2x10-16 g/입자, 1x10-15 g/입자, 2x10-15 g/입자, 5x10-15 g/입자, 1x10-14 g/입자, 2x10-14 g/입자, 5x10-14 g/입자, 1x10-13 g/입자, 2x10-13 g/입자, 5x10-13 g/입자, 1x10-13 g/입자 및 2x10-13 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 이상이다. 특정 구현예에서, 입자에 접합 또는 부착된 결합분자의 평균량은 2x10-16 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 또는 약 2x10-16 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 %이다. 특정 구현예에서, 입자에 접합 또는 부착된 결합분자의 평균량은 1x10-15 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 또는 약 1x10-15 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 %이다. 특정 구현예에서, 입자에 접합 또는 부착된 결합분자의 평균량은 2x10-15 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 또는 약 2x10-15 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 %이다. 특정 구현예에서, 입자에 접합 또는 부착된 결합분자의 평균량은 1x10-14 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 또는 약 1x10-14 g/입자 ± 50 %, ± 40 %, ± 30 %, ± 25 %, ± 20 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 %이다. 특정 구현예에서, 입자에 접합 또는 부착된 결합분자의 평균량은 5x10-13 g/입자, 2x10-13 g/입자, 1x10-13 g/입자, 5x10-14 g/입자, 2x10-14 g/입자, 1x10-14 g/입자, 5x10-15 g/입자, 2x10-15 g/입자, 1x10-15 g/입자 또는 2x10-16 g/입자 이하이다.
일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 CAR의 항원-결합 도메인에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 활성 단편인 결합분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-이디오타입 항-CAR 항체 또는 이의 활성 단편은 항체의 Fc 도메인 내에 위치한 위치(예를 들어, 측쇄 아미노기 또는 아미노산의 설프히드릴기)에서 입자의 표면 노출 토실기에 결합한다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 단순 분산성 및 초상자성이다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 2.8 μm의 직경을 갖고, 입자 당 약 104 내지 약 106 카피(수치 포함)의 결합분자, 즉, 항-이디오타입 항-CAR 항체를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 4.5 μm의 직경을 갖고 입자 당 약 5x105 내지 약 5x106 카피(수치 포함)의 항-이디오타입 항-CAR 항체를 포함한다.
특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 BCMA 폴리펩티드 항원이거나 이를 함유하는 결합분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 인간 BCMA 세포 외 도메인 및 일부 경우에, C-말단 Fc 도메인인 Fc 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 280 μm의 직경을 갖고 입자 당 약 105 카피의 결합분자, 예를 들어, BCMA 융합 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, BCMA 융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드의 Fc 도메인 내에 위치한 위치(예를 들어, 측쇄 아미노기 또는 아미노산의 설프히드릴기)에서 입자의 표면 노출 토실기에 결합한다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 단순 분산성 및 초상자성이다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 2.8 μm의 직경을 갖고, 입자 당 약 104 내지 약 106 카피(수치 포함)의 결합분자, 즉, BCMA 융합 폴리펩티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 4.5 μm의 직경을 갖고 입자 당 5 x 105 내지 5 x106 카피(수치 포함) 또는 약 5 x 105 내지 5 x106 카피(수치 포함)의 BCMA 융합 폴리펩티드를 포함한다.
Ⅱ. 생체 외 자극 또는 세포의 증폭
본 명세서는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 확장하거나 상기 세포를 자극하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 재조합 수용체, 예를 들어 제공된 바와 같은 비드-접합 시약, 예컨대 항-ID 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드와 특이적으로 결합 또는 인식하는 결합 분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 함께 CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자와 재조합 수용체, 예를 들어, CAR 사이의 결합은 CAR을 발현하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체의 항원-결합 단편에 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 CAR에 결합하거나 이를 인식하는 항원이다.
일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 하나 이상의 세포를 포함하는 투입 조성물과 접촉하거나 이와 함께 인큐베이션되어 산출 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물 또는 투입세포는 투입 조성물의 적어도 일부의 세포에 하나 이상의 변화를 자극, 활성화, 야기, 생성 및/또는 생산하는 조건 하에서 처리, 인큐베이션 또는 접촉되어 투입 조성물을 산출 조성물로 바꾸고자 하는 조성물 및/또는 다수의 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 투입세포는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 함유하는 면역 세포 조성물, 예를 들어, T 세포 조성물이다. 특정 구현예에서, 투입 조성물에 있는 적어도 일부의 세포는 제공된 방법의 수행에 의해 생성된 산출 조성물 안에서 활성화, 증폭 및/또는 농축된다.
특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 투입 조성물로부터의 세포와 접촉 또는 인큐베이션되어 투입 세포의 적어도 일부 예를 들어, 하위그룹 또는 분획을 증폭, 농축 및/또는 활성화하여 산출 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물로부터의 세포는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 적어도 일부의 세포 및/또는 재조합 수용체를 암호화하는 이종성 핵산 분자를 함유하는 적어도 일부의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 결합분자를 포함하는 입자와 인큐베이션, 접촉 또는 처리될 세포를 포함하고, 여기서 제제와의 인큐베이션, 접촉 또는 처리는 투입 조성물의 세포 중 적어도 일부를 변경하여 산출 조성물을 생성한다. 상기 변경은 세포 중 일부의 증폭 및/또는 농축, 세포 중 적어도 일부의 활성화 및/또는 세포 중 적어도 일부의 하나 이상의 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 산출 조성물은 제제와의 인큐베이션, 접촉 또는 처리에 의한 변경 후에 변경을 겪은 투입 조성물로부터의 세포 중 적어도 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 세포를 인큐베이션하여 달성된 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화는 각각의 입자에 접합되거나 그렇지 않으면 부착된 결합분자의 특정 수, 수준 또는 양으로 입자, 예를 들어 비드를 선택하여 적정, 조정 및/또는 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 입자에 접합되거나 그렇지 않으면 부착된 결합분자의 수를 증가시키면 입자, 예를 들어 비드와 세포를 인큐베이션하여 달성된 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화가 증가한다. 특정 구현예에서, 각각의 입자에 접합되거나 그렇지 않으면 부착된 결합분자의 수를 감소시키면 입자, 예를 들어 비드와 세포를 인큐베이션하여 달성된 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화가 감소한다. 특정 구현예에서, 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화는 임의의 적합한 공지된 수단으로 측정된다. 특정 구현예에서, 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화에서의 증가는 예를 들어, 입자, 예를 들어 비드와의 인큐베이션 후 또는 중에 취해진 세포의 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화와 관련된 측정의 상이한 조건 하에서의 인큐베이션 및/또는 대조군과 비교하여, 통계적으로 유의한 증가 및/또는 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 1 배, 2 배, 3 배, 5 배, 10 배, 100 배 이상의 증가 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 1 배, 2 배, 3 배, 5 배, 10 배, 100 배 이상의 증가이다. 특정 구현예에서, 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화에서의 감소는 입자, 예를 들어 비드와의 인큐베이션 후 또는 중에 취해진 세포의 증폭, 농축, 자극 및/또는 활성화와 관련된 측정의 통계적으로 유의한 감소 및/또는 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 이상의 저하 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 이상의 저하이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물은 진핵 세포, 예컨대 포유 동물 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 인간 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래한 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 면역 시스템 세포를 포함한다, 즉, 선천성 면역 세포 또는 적응성 면역 세포, 예를 들어, 골수성 세포 또는 림프계 세포는 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 유도 다능성 줄기 세포(iPSCs)를 포함한 줄기 세포, 예컨대 다분화능 및 다능성 줄기 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 CD3+ 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물은 CD4+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 또한 CD28을 낮은 수준으로 발현하거나 전혀 발현하지 않는 CD3+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합분자는 CD28 음성인 세포 또는 CD28을 낮은 수준으로 발현하는 세포의 활성화 및/또는 증폭을 자극한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 결합분자와 세포를 접촉시키기 전에 항-CD3/항-CD28 접합 시약과 접촉하지 않는다.
일부 구현예에서, 방법 및 결합분자(예를 들어 제공된 바와 같은 비드-접합 시약, 예컨대 항-ID 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드)를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 하향 조절된 하나 이상의 천연 신호 전달 분자 예컨대 하나 이상의 공자극 수용체 또는 항원 수용체 또는 사이토카인 수용체를 가지나 제공된 비드-접합 시약의 결합분자에 의해 인식되는 키메라 수용체, 예를 들어, CAR의 발현이 결여된 T 세포를 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 CD28 또는 기타 공자극 분자 또는 기타 신호 전달 분자의 표면 발현이 음성이거나 낮다. 따라서 일부 구현예에서, 제공된 시약 및 방법은 원하는 신호 및/또는 상기 신호의 전체 범위를 제공하기 위해, 예를 들어, 공자극 신호를 제공하고/거나 전체 활성화를 달성하기 위해 CD28 또는 기타 내인성 신호 전달 분자의 표면 발현에 의존하거나 이를 요구할 수 있는 특정 기타 활성화 또는 자극 제제 또는 방법과 비교하여 특정 이점을 갖는다. 일부 구현예에서, 제공된 제제 및 방법은 항-CD3/항-CD28 시약(예를 들어 비드)과 비교하여 상기 측면에서 유리하고; 일부 측면에서, 결합분자(예를 들어 제공된 바와 같은 비드-접합 시약, 예컨대 항-ID 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드)를 포함하는 제공된 입자, 예를 들어 비드는, CD28 또는 기타 천연 신호 전달 분자가 음성이거나 낮은 세포의 활성화 또는 증식과 같은 원하는 효과를 달성하거나 자극할 수 있는 점에서 유리하다. 일부 측면에서, 항-ID 항체로 자극하여 CAR을 통한 신호 전달은 단일 시약만을 이용한 CAR을 경유한 1 차 및 2 차 (공자극) 신호 모두를 초래한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD28 또는 기타 내인성 신호 전달 분자가 낮은 수준으로 발현되는 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 CD28 음성이거나 또는 기타 내인성 신호 전달 분자가 음성인 CD3+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자(예를 들어 제공된 바와 같은 비드-접합 시약, 예컨대 항-ID 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드)를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 CD28 음성인 세포 또는 CD28을 낮은 수준으로 발현하는 세포의 활성화 및/또는 증폭을 자극한다.
특정 구현예에서, 투입 조성물은 1 차 인간 T 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 농축된 CD4+ T 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 농축된 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물에서 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 약 50:1을 초과하거나 또는 25:1 내지 50:1, 10: 1 내지 25:1, 5:1 내지 10:1, 3:1 내지 5:1, 2:1 내지 3:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 1:2, 2:1 내지 1:2, 1:2 내지 1:3, 1:3 내지 1:5, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:25 또는 1:25 내지 1:50(각각의 수치 포함) 또는 약 25:1 내지 50:1, 10: 1 내지 25:1, 5:1 내지 10:1, 3:1 내지 5:1, 2:1 내지 3:1, 1:1 내지 2:1, 1:1 내지 1:2, 2:1 내지 1:2, 1:2 내지 1:3, 1:3 내지 1:5, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:25 또는 1:25 내지 1:50(각각의 수치 포함)이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물은 입자, 예를 들어 비드의 결합분자를 인식 또는 결합하는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 형질 도입 또는 형질 감염된 세포 집단 또는 형질 도입 또는 형질 감염된 세포로부터 유래한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 결합분자를 인식 또는 결합하는 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 형질 도입 또는 형질 감염된 세포 집단 또는 형질 도입 또는 형질 감염된 세포로부터 유래한 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같은 임의의 방법으로 형질 도입 또는 형질 감염되었다. 특정 구현예에서, 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같이 바이러스를 이용하여 세포를 하나 이상의 핵산으로 형질 감염시켰다. 일부 구현예에서, 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같이 비바이러스 플라스미드, 예를 들어, 에피솜 또는 트랜스포존을 이용하여 세포를 하나 이상의 핵산으로 형질 감염시켰다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 입자, 예를 들어 비드의 결합분자를 인식 또는 결합하는, 세포 표면에서 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 조성물은 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 임의의 방법으로부터 유래한 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 조성물은 재조합 수용체 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 당초에는 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 당초에 재조합 수용체를 발현하는 세포를 포함하지 않는 투입 조성물의 세포는 결합분자를 인식 또는 결합하는 재조합 수용체를 발현하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 형질 감염 또는 형질 도입하는 적어도 일부 과중에 결합 분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션된 또는 처리된다. 일부 구현예에서, 형질 감염 또는 형질 도입은 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같이 수행된다. 일부 구현예에서, 세포로 핵산 도입시 결합분자와 인큐베이션하는 적어도 일부 과정에서, 재조합 수용체는 결합분자와 상호작용할 수 있는 세포의 표면에서 발현된다. 특정 구현예에서, 형질 감염 또는 형질 도입은 임의의 선행 증폭, 활성화 및/또는 분리 단계없이 수행된다. 특정 구현예에서, 세포는 형질 감염 또는 형질 도입 전에 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉하지 않는다. 특정 구현예에서, 세포는 형질 감염 또는 형질 도입 전에 항-CD3 및 항-CD28 항체인 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 접촉하지 않는다.
특정 구현예에서, 투입 조성물은 결합분자를 인식 또는 결합하는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하지 않는 세포와 발현하는 세포 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 투입 조성물의 세포를 처리, 접촉 또는 인큐베이션하는 것은 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포의 활성화 및/또는 증폭을 자극하나, 재조합 수용체를 발현하지 않는 세포의 활성화 및/또는 증폭을 자극하지 않을 것이다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 투입 조성물의 세포를 처리, 접촉 또는 인큐베이션하는 것은 재조합 수용체를 발현하는 세포보다 재조합 수용체를 발현하지 않는 세포의 활성화 및/또는 증폭을 보다 작은 정도로 자극할 것이다.
특정 구현예에서 투입 조성물의 세포 중 일부는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 이종 DNA를 발현하거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 0.01 % 미만, 0.1 % 미만, 1 % 미만, 5 % 미만, 10 % 미만, 20 % 미만, 25 % 미만, 30 % 미만, 35 % 미만, 40 % 미만, 45 % 미만, 50 % 미만, 55 % 미만, 60 % 미만, 65 % 미만, 70 % 미만, 80 % 미만 또는 90 % 미만의 세포가 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 함유하는 하나 이상의 핵산을 발현하거나 함유한다. 재조합 수용체를 발현하는 세포 또는 재조합 수용체를 암호화하는 이종 DNA를 포함하는 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단으로 확인할 수 있다. 예를 들어 세포에서 재조합 수용체를 암호화하는 mRNA의 검출, 이종 수용체의 직접적인 검출, 예를 들어, 재조합 수용체에 결합한 표지된 프로브 또는 항체의 결합 검출 또는 이종 DNA에 의해 암호화된 대리 마커의 검출로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 대리 마커를 검출하여 확인된다. 특정 구현예에서, 상기 대리 마커는 절단형 EGFR 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 투입세포는 입자, 예를 들어 비드와 접촉하기 전에, 소량의 바이러스 입자, 예를 들어 비드, 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 비드의 카피 대 세포의 비율 및/또는 감염단위(IU)로 형질 감염 및/또는 형질 도입된 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입세포, 예를 들어, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드로 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된 세포는 다클론성 자극, 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 코팅된 입자로 증폭되고/거나 농축된 투입세포라기보다 소량의 바이러스 입자, 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 비드의 카피 대 세포의 비율 및/또는 IU로 형질 도입된 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션된 투입 조성물은, 다클론성 자극에 의해 증폭되고/거나 농축된 투입 조성물이라기보다 세포 당 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 미만의 IU 또는 세포 당 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 미만의 IU로 형질 도입된 세포로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션된 투입 조성물은, 다클론성 자극에 의해 증폭되고/거나 농축된 투입 조성물이라기보다 1 x 105 IU/mL, 5 x 105 IU/mL, 1 x 106 IU/mL, 5 x 10 6 IU/mL, 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL 또는 1 x 107 IU/mL 미만 또는 적어도 1 x 105 IU/mL, 5 x 105 IU/mL, 1 x 106 IU/mL, 5 x 10 6 IU/mL, 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL 또는 1 x 107 IU/mL 미만의 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 비드의 역가로 형질 도입된 세포로부터 생성된다.
특정 구현예에서, 높은 IU/세포를 갖는 세포를 형질 도입하는 것은 높은 형질 도입 효율로 연결되나, 일부 구현예에서 규제 표준을 충족하지 않을 수 있고 안정성 위험을 제시할 수 있는 높은 벡터 카피 수(VCN)를 가진 형질 감염된 세포를 생성할 수도 있다. 특정 구현예에서, 세포가 형질 도입되는 IU/세포를 낮추는 것은 형질 도입 효율은 감소하나 보다 낮은 VCN을 생성할 것이다. 특정 구현예에서, 세포가 형질 도입되는 IU/세포를 증가시키는 것은 형질 도입 효율을 증가시키나 VCN 또한 증가할 것이다.
특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 투입 조성물의 세포를 인큐베이션, 접촉 또는 처리하는 것은, 세포의 자극, 증폭 및/또는 활성화를 위한 조건 하에서 수행되고, 상기 조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agent), 예를 들어, 영양분, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 기타 임의의 제제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하지 않고 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 핵산과 접촉하는 동안 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드의 결합분자는 유전자에 의해 암호화된 재조합 수용체를 인식 또는 결합한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 바이러스 입자 내에서 전달된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 에피솜 벡터이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 트랜스포존이다. 특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 하나 이상의 핵산이 투입 조성물의 세포와 접촉하는 시간의 적어도 일부에서 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 처리, 인큐베이션 또는 접촉한다. 특정 구현예에서, 세포는 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같이 하나 이상의 핵산과 접촉한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 하나의 핵산으로 형질 감염 또는 형질 도입되고; 투입 조성물는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함하고; 세포는 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 세포가 형질 도입 또는 형질 감염된 후에 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리, 인큐베이션 또는 접촉한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 세포가 본 명세서, 예를 들어, 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같이 하나 이상의 핵산으로 형질 도입 또는 형질 감염된 후에 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리, 인큐베이션 또는 접촉한다. 특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 세포가 하나 이상의 핵산과 접촉한 후, 약 1 분 이내, 약 5 분 이내, 약 30 분 이내, 약 1 시간 이내, 약 2 시간 이내, 약 4 시간 이내, 약 6 시간 이내, 약 8 시간 이내, 약 12 시간 이내, 약 24 시간 이내, 약 2 일 이내, 약 3 일 이내, 약 4 일 이내, 약 5 일 이내, 약 6 일 이내, 약 1 주 이내, 약 2 주 이내, 약 3 주 이내, 약 4 주 이내, 약 5 주 이내 또는 약 6 주 이내 즉시 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 섹션 Ⅲ에 기재된 바와 같이 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 핵산으로 형질 도입 또는 형질 감염되고 이어서 세포는 동결 건조되어 세포를 해동하고 증폭시키기 전 시간 동안 저장된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 동결 건조되고 세포가 해동된 후 1 분, 5 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주 또는 6 주 또는 약 1 분, 5 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주 또는 6 주 이내에 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포를 결합분자를 포함하는 입자(예를 들어 비드)와 처리, 인큐베이션 또는 접촉은 컨테이너, 예를 들어, 세포 배양 접시, 세포 배양 웰 또는 백에서 수행된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포를 입자, 예를 들어 비드와 투입 조성물의 전체 세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율을 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 25:1 내지 1:25, 10:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2 또는 약 100:1 내지 1:100, 50:1 내지 1:50, 25:1 내지 1:25, 10:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2으로 접촉, 인큐베이션 또는 처리한다. 특정 구현예에서, 상기 비율은 1:0.1 내지 1:5 또는 약 1:0.1 내지 약 1:5이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 전체 세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 약 1:1이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물로부터 102 내지 1012, 103 내지 1010, 104 내지 109, 103 내지 106, 104 내지 108, 102 내지 104, 103 내지 105, 104 내지 106, 105 내지 107 또는 106 내지 108 개의 세포(각각의 수치 포함) 또는 약 102 내지 1012, 103 내지 1010, 104 내지 109, 103 내지 106, 104 내지 108, 102 내지 104, 103 내지 105, 104 내지 106, 105 내지 107 또는 106 내지 108 개의 세포(각각의 수치 포함)가 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다. 특정 구현예에서, 투입 조성물로부터 약 102 미만 또는 102 내지 103, 103 내지 104, 104 내지 105, 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 108, 108 내지 109, 109 내지 1010, 1010 내지 1011 또는 1011 내지 1012 개의 세포(각각의 수치 포함) 또는 약 102 내지 103, 103 내지 104, 104 내지 105, 105 내지 106, 106 내지 107, 107 내지 108, 108 내지 109, 109 내지 1010, 1010 내지 1011 또는 1011 내지 1012 개의 세포(각각의 수치 포함)가 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포를 인큐베이션 또는 접촉시키는 것은 결합분자를 포함하는 충분한 양의 입자, 예를 들어 비드와 수행하여, 투입 조성물에 있는 하나 이상의 세포에 결합분자가 결합하도록 하고/거나 투입 조성물에 있는 하나 이상의 세포의 자극, 활성화 및/또는 증식을 유도한다. 투입 조성물의 입자, 예를 들어 비드 대 세포의 특정 비율 또는 수는 비드 당 결합분자의 특정 양, 특정 항원, 투입 조성물의 세포의 출처 및 당업자의 수준 내에서 기타 인자에 따라 실험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포에 추가되는 입자, 예를 들어 비드의 양은 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물의 세포 당, 1 결합분자 내지 1012 개의 결합분자 또는 약 1 결합분자 및 내지 1012 개의 결합분자를 제공하는 양, 예컨대 세포 당 102 결합분자 내지 1010 개의 결합분자, 103 결합분자 내지 108 개의 결합분자, 104 결합분자 내지 106 개의 결합분자, 1 결합분자 내지 102 개의 결합분자, 102 결합분자 내지 103 개의 결합분자, 103 결합분자 내지 104 개의 결합분자, 104 결합분자 내지 105 개의 결합분자, 105 결합분자 내지 106 개의 결합분자, 105 결합분자 내지 106 개의 결합분자, 106 결합분자 내지 107 개의 결합분자, 107 결합분자 내지 108 개의 결합분자, 109 결합분자 내지 1010 개의 결합분자, 1010 결합분자 내지 1011 개의 결합분자 또는 1011 결합분자 내지 1012 개(각각의 수치 포함)의 결합분자 또는 세포 당 약 102 결합분자 내지 1010 개의 결합분자, 103 결합분자 내지 108 개의 결합분자, 104 결합분자 내지 106 개의 결합분자, 1 결합분자 내지 102 개의 결합분자, 102 결합분자 내지 103 개의 결합분자, 103 결합분자 내지 104 개의 결합분자, 104 결합분자 내지 105 개의 결합분자, 105 결합분자 내지 106 개의 결합분자, 105 결합분자 내지 106 개의 결합분자, 106 결합분자 내지 107 개의 결합분자, 107 결합분자 내지 108 개의 결합분자, 109 결합분자 내지 1010 개의 결합분자, 1010 결합분자 내지 1011 개의 결합분자 또는 1011 결합분자 내지 1012 개(각각의 수치 포함)의 결합분자를 (인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에서) 제공하는 양이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물에 추가되는 입자, 예를 들어 비드의 양은 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물의 각 세포에 대해 약 104 결합분자 내지 약 106 개의 결합분자를 제공하는 양이다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드의 양은 투입 조성물에서 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 각 세포에 대해 약 105 개의 결합분자를 함유하는 양이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에 추가되는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드의 양은 0.0001 pg 내지 10 pg, 0.001 pg 내지 1 pg, 0.001 pg 내지 1 pg, 0.001 pg 내지 0.1 pg, 0.005 pg 내지 0.05 pg, 0.005 pg 내지 0.02 pg 또는 0.01 pg 내지 0.05 pg의 결합분자(각각의 수치 포함) 또는 약 0.0001 pg 내지 약 10 pg, 약 0.001 pg 내지 약 1 pg, 약 0.001 pg 내지 약 1 pg, 약 0.001 pg 내지 약 0.1 pg, 약 0.005 pg 내지 약 0.05 pg, 약 0.005 pg 내지 약 0.02 pg 또는 약 0.01 pg 내지 약 0.05 pg의 결합분자(각각의 수치 포함)를 투입 조성물에서 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 각각의 세포에 대해 함유하는 입자, 예를 들어 비드의 양이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포에 추가되는 입자, 예를 들어 비드의 총량은 0.0001 μg 내지 10 μg, 0.001 μg 내지 1 μg, 0.001 μg 내지 1 μg, 0.001 μg 내지 0.1 μg, 0.005 μg 내지 0.05 μg, 0.005 μg 내지 0.02 μg 또는 0.01 μg 내지 0.05 μg의 결합분자(각각의 수치 포함) 또는 약 0.0001 μg 내지 10 μg, 0.001 μg 내지 1 μg, 0.001 μg 내지 1 μg, 0.001 μg 내지 0.1 μg, 0.005 μg 내지 0.05 μg, 0.005 μg 내지 0.02 μg 또는 0.01 μg 내지 0.05 μg의 결합분자(각각의 수치 포함)를 제공하는 양이다
일부 구현예에서, 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에 추가되는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드의 양은 10-20 mol 이상, 10-19 mol 이상, 10-18 mol 이상, 10-17 mol 이상, 10-16 mol 이상, 10-15 mol 이상, 10-14 mol 이상, 10-13 mol 이상, 10-12 mol 이상, 10-11 mol 이상 또는 10-10 mol 이상의 결합분자를 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에서 각각의 세포에 대해 함유하는 입자, 예를 들어 비드의 양이다. 일부 구현예에서, 상기 양은 10-21 mol 내지 10-10 mol, 10-20 mol 내지 10-18 mol, 10-19 mol 내지 10-17 mol 또는 10-21 mol 내지 10-19 mol의 결합분자(각각의 수치 포함) 또는 약 10-21 mol 내지 10-10 mol, 10-20 mol 내지 10-18 mol, 10-19 mol 내지 10-17 mol 또는 10-21 mol 내지 10-19 mol의 결합분자(각각의 수치 포함)를 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에서 각각의 세포에 대해 함유하는 양이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포에 추가되는 입자, 예를 들어 비드의 총량은 10-16 mol 이상, 10-15 mol 이상, 10-14 mol 이상, 10-13 mol 이상, 10-12 mol 이상, 10-11 mol 이상, 10-10 mol 이상, 10-9 mol 이상, 10-8 mol 이상, 10-7 mol 이상, 10-6 mol 이상, 10-5 mol 이상, 10-4 mol 이상, 10-3 mol 이상, 10-2 mol 이상, 10-1 mol 이상 또는 1 mol 이상의 결합분자를 제공하는 양이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물과 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드의 접촉 또는 인큐베이션은 0.01 mL 내지 100 mL, 예컨대 0.01 mL 내지 50 mL, 0.01 mL 내지 25 mL, 0.01 mL 내지 10 mL, 0.01 mL 내지 5 mL, 0.01 mL 내지 1 mL, 0.01 mL 내지 0.5 mL, 0.01 mL 내지 0.1 mL, 0.01 mL 내지 0.05 mL, 0.05 mL 내지 100 mL, 0.05 mL 내지 50 mL, 0.05 mL 내지 25 mL, 0.05 mL 내지 10 mL, 0.05 mL 내지 5 mL, 0.05 mL 내지 1 mL, 0.05 mL 내지 0.5 mL, 0.05 mL 내지 0.1 mL, 0.1 mL 내지 100 mL, 0.1 mL 내지 50 mL, 0.1 mL 내지 25 mL, 0.1 mL 내지 10 mL, 0.1 mL 내지 5 mL, 0.1 mL 내지 1 mL, 0.1 mL 내지 0.5 mL, 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 25 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 0.5 mL 내지 5 mL, 0.5 mL 내지 1 mL, 1 mL 내지 100 mL, 1 mL 내지 50 mL, 1 mL 내지 25 mL, 1 mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 5 mL, 5 mL 내지 100 mL, 5 mL 내지 50 mL, 5 mL 내지 25 mL, 5 mL 내지 10 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 10 mL 내지 25 mL, 25 mL 내지 100 mL, 25 mL 내지 50 mL 또는 50 mL 내지 100 mL(각각의 수치 포함) 또는 약 0.01 mL 내지 100 mL, 예컨대 약 0.01 mL 내지 50 mL, 0.01 mL 내지 25 mL, 0.01 mL 내지 10 mL, 0.01 mL 내지 5 mL, 0.01 mL 내지 1 mL, 0.01 mL 내지 0.5 mL, 0.01 mL 내지 0.1 mL, 0.01 mL 내지 0.05 mL, 0.05 mL 내지 100 mL, 0.05 mL 내지 50 mL, 0.05 mL 내지 25 mL, 0.05 mL 내지 10 mL, 0.05 mL 내지 5 mL, 0.05 mL 내지 1 mL, 0.05 mL 내지 0.5 mL, 0.05 mL 내지 0.1 mL, 0.1 mL 내지 100 mL, 0.1 mL 내지 50 mL, 0.1 mL 내지 25 mL, 0.1 mL 내지 10 mL, 0.1 mL 내지 5 mL, 0.1 mL 내지 1 mL, 0.1 mL 내지 0.5 mL, 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 25 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 0.5 mL 내지 5 mL, 0.5 mL 내지 1 mL, 1 mL 내지 100 mL, 1 mL 내지 50 mL, 1 mL 내지 25 mL, 1 mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 5 mL, 5 mL 내지 100 mL, 5 mL 내지 50 mL, 5 mL 내지 25 mL, 5 mL 내지 10 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 10 mL 내지 25 mL, 25 mL 내지 100 mL, 25 mL 내지 50 mL 또는 50 mL 내지 100 mL(각각의 수치 포함)인 부피에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 부피는 용액 예컨대 배지 또는 약학적으로 허용가능한 완충액으로 제공된다.
일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 0.001 μg/ml 이상, 0.01 μg/ml 이상, 0.1 μg/ml 이상, 0.5 μg/ml 이상, 1 μg/ml 이상, 1.5 μg/ml 이상, 2 μg/ml 이상, 3 μg/ml 이상, 4 μg/ml 이상, 5 μg/ml 이상, 6 μg/ml 이상, 7 μg/ml 이상, 8 μg/ml 이상, 9 μg/ml 이상, 10 μg/ml 이상, 50 μg/ml 이상, 100 μg/ml 이상, 500 μg/ml 이상, 1 mg/ml 이상 또는 10 mg/ml 이상의 결합분자 농도를 갖는 입자, 예를 들어 비드의 조성물로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 상기 입자의 조성물은 ml 당 5x107 내지 1x1010 개의 입자 또는 비드(수치 포함) 또는 약 5x107 내지 1x1010 개의 입자 또는 비드(수치 포함)를 함유한다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 0.001 μg/ml 내지 10 mg/ml, 0.001 μg/ml 내지 1 μg/ml, 0.001 μg/ml 내지 1 μg/ml, 0.001 μg/ml 내지 0.1 μg/ml, 0.01 μg/ml 내지 1 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 5 μg/ml 또는 1 μg/ml 내지 5 μg/ml 또는 약 0.001 μg/ml 내지 10 mg/ml, 0.001 μg/ml 내지 1 μg/ml, 0.001 μg/ml 내지 1 μg/ml, 0.001 μg/ml 내지 0.1 μg/ml, 0.01 μg/ml 내지 1 μg/ml, 1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 0.5 μg/ml 내지 5 μg/ml 또는 1 μg/ml 내지 5 μg/ml의 결합분자 농도를 갖는 입자 예를 들어 비드의 조성물로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 상기 입자 조성물은 ml 당 5x107 내지 1x1010, 1x108 내지 5x109 또는 4x108 내지 4x109 개의 입자 또는 비드(각각의 수치 포함) 또는 ml 당 약 5x107 내지 1x1010, 1x108 내지 5x109 또는 4x108 내지 4x109 개의 입자 또는 비드(각각의 수치 포함)를 함유한다.
특정 구현예에서, 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에 추가되는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드의 양은 10-13 M, 10-12 M 이상, 10-11 M 이상, 10-10 M 이상, 10-9 M 이상, 10-8 M 이상, 10-7 M 이상, 10-6 M 이상, 10-5 M 이상, 10-4 M 이상, 10-3 M 이상, 10-2 M 이상, 0.1 M 이상, 1 M 이상 또는 10 M 이상의 결합분자 농도를 제공하는 입자, 예를 들어 비드의 양이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 또는 접촉하는 동안 투입 조성물에 추가되는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드의 양은 10-10 M 내지 10-3 M, 10-9 M 내지 10-6 M, 10-10 M 내지 10-7 M 또는 10-9 M 내지 약 10-6 M(수치 포함) 또는 약 10-10 M 내지 10-3 M, 10-9 M 내지 10-6 M, 10-10 M 내지 10-7 M 또는 10-9 M 내지 약 10-6 M(수치 포함)의 농도를 제공하는 입자, 예를 들어 비드의 양이다.
특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 3 주 또는 4 주 이상 또는 약 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 3 주 또는 4 주 이상 동안 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다. 특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 12 일 미만 또는 약 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 약 12 일 미만 동안 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 1 일 내지 약 14 일, 3 일 내지 7 일 또는 4 일 내지 6 일(수치 포함) 또는 약 1 일 내지 약 14 일, 3 일 내지 7 일 또는 4 일 내지 6 일(수치 포함) 동안 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 약 5 일 동안 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 접촉, 인큐베이션 또는 처리된다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물의 세포와 접촉 또는 인큐베이션되어 재조합 수용체를 발현하는 투입 조성물의 세포를 증폭시키는 것과 같이 얼마간의 시간 동안 투입 조성물의 하나 이상의 세포를 증폭한다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 투입 조성물로부터의 세포와 접촉 또는 인큐베이션되어 예를 들어, 얼마의 시간 동안 투입 조성물에 만성적으로 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함하는, 투입 조성물로부터의 세포를 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 실온 이상의 온도에서 인큐베이션, 접촉 또는 처리하여 재조합 수용체를 발현하는 투입 조성물의 세포를 증폭시킨다. 일부 구현예에서, 상기 처리, 인큐베이션 또는 접촉은 약 25 ℃ 초과, 예컨대 일반적으로 32 ℃, 35 ℃ 또는 37 ℃ 초과 또는 약 32 ℃ , 35 ℃ 또는 37 ℃ 초과의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 처리, 인큐베이션 또는 접촉은 37 ℃ ± 2 ℃ 또는 약 37 ℃ ± 2 ℃ , 예컨대 37 ℃ 또는 약 37 ℃ 의 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물의 세포는 결합분자 및 하나 이상의 추가 제제(예를 들어, 자극 및/또는 보조 제제), 예를 들어, TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 추가 제제는 입자의 표면에 부착된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 입자, 예를 들어 비드와는 별개이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 하나 이상의 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 하나 이상의 재조합 사이토카인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 대한 내인성이고/거나 T 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리의 하나 이상의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 15(IL-15), 과립성 백혈구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 과립성 백혈구-대식 세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 하나 이상의 IL-2, IL-7 및 IL-15이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포 중 적어도 일부는 CAR을 발현하고 상기 세포는 부착된 결합분자를 갖는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 처리 또는 접촉되고, 상기 결합분자는 CAR의 항원-결합 도메인에 결합하는, 항-이디오타입 항체 또는 이의 활성 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 약 3 내지 7 일(수치 포함) 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 280 μm의 직경을 갖고, 입자, 예를 들어 비드는 약 105 카피의 결합분자, 즉, 항-이디오타입 항-CAR 항체를 입자 당 포함하고 세포는 입자, 예를 들어 비드 대 세포의 비율 약 1:1로 세포와 인큐베이션, 접촉 및/또는 처리된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 450 μm의 직경을 갖고, 입자, 예를 들어 비드는 입자 당 약 1x106 내지 약 2x106 카피의 항-이디오타입 항-CAR 항체를 포함하고, 세포는 입자, 예를 들어 비드 대 세포의 비율 약 1:1로 세포와 인큐베이션, 접촉 및/또는 처리된다.
특정 구현예는 세포를 증폭하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 CAR을 인식 또는 결합하는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드를 갖는 BCMA와 특이적으로 결합 또는 인식하는 항원-결합 도메인을 갖는CAR을 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자는 인간 BCMA 세포 외 도메인 및 Fc 도메인의 C-말단을 포함하는 융합 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, 세포는 약 3 내지 7 일 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 280 μm의 직경을 갖고, 입자, 예를 들어 비드는 입자 당 약 105 카피의 결합분자, 즉 BCMA 융합 폴리펩티드를 포함하고, 세포는 입자, 예를 들어 비드 대 세포의 비율 약 1:1로 세포와 인큐베이션, 접촉 및/또는 처리된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 약 450 μm의 직경을 갖고, 입자, 예를 들어 비드는 입자 당 약 1x106 내지 약 2x106 카피의 결합분자, 즉, BCMA 융합 폴리펩티드를 포함하고, 세포는 입자, 예를 들어 비드 대 세포의 비율 약 1:1로 세포와 인큐베이션, 접촉 및/또는 처리된다.
특정 구현예에서, 투입 조성물로부터의 세포는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 연장된 시간의 기간 동안 접촉, 인큐베이션 또는 처리하여 장기간 자극, 예를 들어, 10 일 이상을 수행한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 결합분자를 함유하는 입자 또는 비드와 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일 또는 16 일 이상 동안 인큐베이션, 예컨대 연속적으로 또는 중단없이 인큐베이션된다. 일부 측면에서, 인큐베이션을 위해 선택된 시간의 길이는 조성물 세포의 하나 이상의 기능 또는 활성이 만성적으로 자극된 세포의 특징 또는 인큐베이션 말기 또는 종료 시에 항원에 장기 노출된 세포의 특징을 나타내는 시간이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 입자 또는 비드와 인큐베이션하여 만성적으로 자극된 세포의 특징 또는 항원에 대한 장기 노출된 세포를 모델링하는 것과 같은 장기 자극 방법을 수행한다.
산출 조성물의 예시적인 특징
특정 구현예에서, 결합분자(제공된 바와 같이 예를 들어 비드-접합 시약, 예컨대 항-ID 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드)를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 투입 조성물의 세포를 접촉시키는 것은 투입 조성물의 대응 세포와는 상이한 하나 이상의 특성 예를 들어, 전체 세포 수, 재조합 수용체를 발현하는 세포의 일부 또는 서브세트, 세포 증식 속도 및/또는 활성 마커 또는 소진 마커와 같은 유전자 발현을 포함하는 산출 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 결합분자에 의해 인식되는 키메라 수용체 예컨대 CAR을 발현하는 세포의 증식, 활성화, 자극, 사이토카인 방출 또는 활성 마커 또는 사이토카인 방출 또는 생산의 상향 조절과 같은 다른 기능적 결과를 초래한다. 일부 측면에서, 상기 증식 또는 기타 기능적 반응 또는 판독은 T 세포의 증식을 자극하는 제제 및/또는 조건, 예컨대 항-CD3/CD28 비드 및/또는 가교된 항-CD3와 세포를 인큐베이션하여 유도된 것과 유사하거나 더 큰 정도로 상기 세포에서 유도된다.
일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드는 산출 조성물로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 자화성 또는 자기적으로 반응하는 예를 들어, 상자성 또는 초상자성 입자, 예를 들어 비드이다. 일부 구현예에서, 입자, 예를 들어 비드는 스트렙타비딘 올리고머이다. 세포로부터 입자, 예를 들어 비드(예를 들어 비드 입자, 예를 들어 비드 또는 자화성 입자)를 제거하는 방법이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 결합분자에 결합 및 세포 상의 재조합 수용체에 대한 친화도를 변경하여, 결합분자의 완만한 분리를 허용하고 따라서 입자에 대한 경쟁 비표지된 항체의 이용이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 분리 후에 상기 경쟁 항체는 입자의 결합분자와 관련된 상태를 유지할 수 있으나 반응하지 않은 비표지된 항체는 세척되거나 될 수 있고 세포는 항체 및 결합 분자가 없다. 상기 시약의 예로는 DETACaBEAD(Friedl 외 1995; Entschladen 외 1997)가 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자)는 절단 가능한 링커(예를 들어, DNA 링커)의 존재 하에 제거될 수 있고, 입자-결합된 항체는 링커(예를 들어, CELLection, Dynal)에 접합된다. 일부 경우에, 링커 영역은 분리, 예를 들어, DNA 분해효소 또는 기타 방출 완충액의 추가로 세포로부터 입자(예를 들어 비드 입자)를 제거하기 위한 절단 가능한 위치를 제공한다. 일부 구현예에서, 기타 효소적 방법이 세포로부터 입자(예를 들어 비드 입자)를 방출시키기 위해 이용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자 또는 자화성 입자)는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물로부터의 세포는 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물과 비교된다. 특정 구현예에서, 상기 동일한 투입 조성물은 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리되지 않았다. 일부 구현예에서, 동일한 투입 조성물로부터의 세포는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리한 투입 조성물로부터의 세포와 같은 조건(예를 들어, 같은 배지, 같은 온도, 같은 기간 및 결합분자의 양 및/또는 농도와 같은 하나 이상의 다클론성 자극 분자의 양 및/또는 농도) 하에서 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 접촉, 인큐베이션 또는 처리되었다. 일부 구현예에서, 동일한 투입 조성물의 세포가 표면에 부착된 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 접촉되었다. 특정 구현예에서, 동일한 투입 조성물의 세포가 입자(예를 들어, 비드 입자)의 표면에 부착된 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 접촉되었다. 특정 구현예에서, 동일한 투입 조성물의 세포가 항-CD3 및 항-CD28 항체인 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 접촉되었다.
특정 구현예에서, 산출 조성물에 있는 세포 수는 투입 조성물에 있는 세포 수를 초과한 약 1 % 이상, 약 5 % 이상, 약 10 % 이상, 약 15 % 이상, 약 20 % 이상, 약 25 % 이상, 약 30 % 이상, 약 35 % 이상, 약 40 % 이상, 약 45 % 이상, 약 50 % 이상, 약 55 % 이상, 약 60 % 이상, 약 65 % 이상, 약 70 % 이상, 약 75 % 이상, 약 80 % 이상, 약 85 % 이상, 약 95 % 이상, 약 100 % 이상, 약 2 배 이상, 약 3 배 이상, 약 4 배 이상, 약 5 배 이상, 약 6 배 이상, 약 7 배 이상, 약 8 배 이상, 약 9 배 이상, 약 10 배 이상, 약 15 배 이상, 약 20 배 이상, 약 25 배 이상, 약 50 배 이상 또는 약 100 배 이상이다
특정 구현예에서, 산출 조성물은 결합분자를 포함한 입자, 예를 들어 비드로 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물보다 더 많은 세포 수를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 포함한 입자, 예를 들어 비드로 처리된 산출 조성물의 세포 수는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 산출 조성물로부터의 세포 수보다 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 더 많다.
특정 구현예에서, 투입 조성물의 세포는 투입 조성물 세포의 서브세트에 의해 발현된 재조합 수용체에 의해 인식되거나 또는 이와 결합하는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 처리, 접촉 또는 인큐베이션되어, 투입 조성물에서보다 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트를 더 많이 포함하는 산출 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트는 투입 조성물에서보다 산출 조성물에서 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 더 많다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전에 투입 조성물에서보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 재조합 수용체를 발현하는 세포의 더 큰 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물 세포의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상이 재조합 수용체를 발현한다.
특정 구현예에서, 산출 조성물은 TCR 복합체 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체의 하나 이상의 성분을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물에 있는 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 결합 분자에 의해 인식 또는 결합되는 재조합 수용체를 발현하는 세포의 더 큰 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리된 세포의 산출 조성물에서 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트보다 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 더 크다.
일부 구현예에서, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉된 산출 조성물에 있는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 세포는 다클론성 자극을 받은, 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 인큐베이션된 산출 조성물의 세포보다 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상 더 적은 VCN을 함유한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물의 CAR 발현 세포의 평균 VCN은 10, 5, 4, 2.5, 1.5 또는 1 또는 약 10, 5, 4, 2.5, 1.5 또는 1이내이다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전 투입 조성물보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 활성화된 세포의 더 큰 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 하나 이상의 활성 마커, 즉, 활성화와 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 10 초과의 상이한 활성 마커를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 활성 마커는 인간 백혈구 항원-항원 D 관련(HLA-DR), CD25, CD69, CD71, CD40L 또는 4-1BB(CD137)이다. 특정 구현예에서, 상기 활성 마커는 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파이다. 일부 구현예에서, 상기 활성 마커는 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파의 세포 내 발현이다. 특정 구현예에서, 상기 활성 마커는 분비된 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파이다. 특정 구현예에서, 활성 마커를 발현하는 세포의 서브세트는 투입 조성물에서보다 산출 조성물에서 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 더 크다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전에 투입 조성물에서보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 활성화된 세포를 더 많은 수로 포함한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물 중 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상의 세포가 활성화된다. 일부 구현예에서, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % 또는 70 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % 또는 70 % 미만의 세포가 활성화된다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 활성화된 세포의 더 작은 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리된 산출 조성물의 활성화된 세포의 서브세트는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물의 활성화된 세포의 서브세트의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만이다.
특정 구현예에서, 산출 조성물의 세포는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전의 투입 조성물보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 더 많이 활성화된다. 일부 구현예에서, 세포는 활성화되지 않은 세포 또는 덜 활성화된 세포보다 하나 이상의 활성 마커를 보다 높은 수준으로 발현하는 경우 더 많이 활성화된다. 일부 구현예에서, 더 많이 활성화된 세포는 활성화되지 않은 세포 또는 덜 활성화된 세포보다 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 또는 10 초과의 상이한 활성 마커를 보다 높은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 투입 조성물로부터의 세포보다 인간 백혈구 항원-항원 D 관련(HLA-DR), CD25, CD69, CD71, CD40L 또는 4-1BB(CD137) 중 하나 이상을 보다 많은 양으로 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파, 예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드를 보다 높은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 세포 내 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파를 보다 많은 양으로 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파를 보다 많은 양으로 분비한다. 특정 구현예에서, 상기 활성화된 세포는 투입 조성물로부터의 세포에 의해 발현되는 활성 마커의 양보다 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상의 양으로 활성 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 덜 활성화된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리된 산출 조성물의 세포에서 하나 이상의 활성 마커의 발현은 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터의 산출 조성물로부터 세포 내에 있는 하나 이상의 활성 마커의 발현의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만이다.
일부 구현예에서, 산출 조성물로부터 재조합 수용체(결합분자에 의해 인식)를 발현하는 세포의 더 큰 서브세트가 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전에 투입 조성물의 재조합 수용체를 발현하는 세포보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 활성화된다. 특정 구현예에서, 활성화된 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트는 투입 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 활성화된 세포의 서브세트보다 산출 조성물에서 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 더 크다.
일부 구현예에서, 산출 조성물의 재조합 수용체(결합분자에 의해 인식되거나 결합)를 발현하는 세포는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전에 투입 조성물에서보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 활성화된 세포의 더 큰 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 98 %, 99 % 또는 99.9 % 이상이 활성화된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % 미만이 활성화된다.
일부 구현예에서, 산출 조성물로부터 재조합 수용체(결합분자에 의해 인식되거나 결합)를 발현하는 세포의 더 작은 서브세트가 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포와 비교한 바와 같이 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 활성화된다. 일부 구현예에서, 활성화된 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포의 서브세트보다 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만이다.
특정 구현예에서, 산출 조성물의 재조합 수용체(결합분자이거나 결합분자가 결합하거나 인식)를 발현하는 세포는 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리하기 전에 투입 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 더 많이 활성화된다. 일부 구현예에서, 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포는 투입 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포와 비교하여 하나 이상의 활성 마커를 더 많은 양으로 발현한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포는 투입 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포보다 인간 백혈구 항원-항원 D 관련(HLA-DR), CD25, CD69, CD71, CD40L 또는 4-1BB(CD137) 중 하나 이상을 더 많은 양으로 발현한다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파를 더 높은 수준으로 발현한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 세포 내 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파를 보다 많은 양으로 발현한다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 IL-2, IFN 감마 또는 TNF-알파를 보다 많은 양으로 분비한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포는 투입 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포에 의해 발현되는 활성 마커의 양보다 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 100 %, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 더 많은 양으로 활성 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자와 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포보다 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리 후에 덜 활성화된 재조합 수용체(결합분자에 인식 또는 결합)를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드로 처리된 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 하나 이상의 활성 마커의 발현은 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포에서 하나 이상의 활성 마커의 발현의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만이다.
일부 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물의 세포는 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 같은 조건 하에서 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 세포 구성을 갖는 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포와 비교하여 소진의 더 낮은 수준 또는 감소된 수준을 나타낸다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물의 세포는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터의 세포와 비교하여 소진 마커의 감소된 발현 또는 보다 낮은 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 소진 마커는 소진과 관련된 폴리펩티드거나 또는 소진과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 소진 마커의 발현은 소진 마커 폴리펩티드의 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 소진 마커는 억제 수용체, 즉, 대응하는 리간드에 결합할 경우, 하나 이상의 세포의 면역 활성 또는 세포 활성이 감소하는 수용체이다. 특정 구현예에서, 상기 소진 마커는 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA 또는 TIGIT이다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물로부터의 세포는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 산출 조성물로부터의 세포보다 하나 이상의 소진 마커의 발현의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만이다.
특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물의 재조합 수용체를 발현하는 세포는 동일한 투입 조성물, 즉, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 같은 조건 하에서 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포와 비교하여 소진의 더 낮은 수준 또는 감소된 수준을 나타낸다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물의 재조합 수용체를 발현하는 세포는 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 같은 조건 하에서 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 같은 동일한 투입 조성물로부터 유래한 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포와 비교하여 소진 마커의 더 낮은 발현 또는 감소된 발현을 나타낸다. 특정 구현예에서, 결합분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션, 접촉 또는 처리된 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포는 하나 이상의 다클론성 자극 분자로 인큐베이션, 처리 또는 접촉된 산출 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포보다 하나 이상의 소진 마커의 발현의 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만 또는 약 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, l 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 99 % 또는 99.9 % 미만을 발현한다.
Ⅲ. 장기 자극의 평가 방법
본 명세서는 세포 조성물의 표현형, 특성 또는 활성, 예를 들어, 세포 조성물을 평가하는데 그 중에서도 유용한 장기 자극 방법(본 명세서에서 장기 자극을 위한 방법으로도 지칭)을 제공한다. 일부 구현예에서, 장기 자극 방법은 세포에서 재조합 수용체-의존 활성(예를 들어, CAR-의존 활성)을 자극하기 위한 조건 하에서 재조합 수용체 예컨대 CAR을 발현하는 세포를 함유하는 세포 조성물 예를 들어, 투입 조성물을 인큐베이션하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 세포 조성물 예를 들어, 투입 조성물은 항원을 특이적으로 결합 또는 인식하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포를 함유한다. 일부 측면에서, 상기 인큐베이션은 만성적으로 자극된 세포의 특징 또는 항원에 장기 노출된 세포의 특징을 나타내는 세포를 함유하는 T 세포 조성물, 예를 들어, 산출 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 장기 자극 방법은 세포에서 재조합 수용체-의존 활성(예를 들어, CAR-의존 활성)을 자극하기 위한 조건 하에서 재조합 수용체 예컨대 CAR을 발현하는 세포를 함유하는 세포 조성물 예를 들어, 투입 조성물을 인큐베이션하는 것이거나 이를 포함한다. 상기 구현예에서, 재조합 수용체-의존 활성은 재조합 수용체를 특이적으로 자극하는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 항원 또는 기타 제제의 존재를 통하는 것과 같이 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 자극에 특이적인 활성이다. 일부 측면에서, 세포 조성물, 예를 들어, 투입 조성물은 항원에 특이적으로 결합 또는 인식하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포를 함유한다. 일부 측면에서, 상기 인큐베이션은 만성적으로 자극된 세포의 특징 또는 항원에 장기 노출된 세포의 특징을 나타내는 세포를 함유하는 T 세포 조성물, 예를 들어, 산출 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 상기 인큐베이션은 중단없이 연속적으로 수행된다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 장기 자극을 위한 방법은 생체 내에 투여되는 경우 바람직한 특징, 예컨대 유지된 또는 연장된 지속성, 생존력 또는 활성을 가질 수 있는 세포 조성물을 확인하는데 그 중에서도 유용하다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체 내에 투여되는 경우와 같이 지속성, 활성 또는 생존력을 향상 또는 연장시킬 수 있거나 또는 소진 또는 분화를 저하시킬 수 있는 차이를 확인하기 위한 2 개 이상의 상이한 세포 조성물에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 차이는 제조 공정의 측면, 예컨대 타이밍, 조건 또는 조작 공정의 상이한 단계에서 사용되는 시약, 재조합 수용체에서의 차이(예를 들어, 재조합 수용체의 전달에 사용되는 구조물 또는 벡터에서 아미노산 서열 차이에서의 차이 또는 유전자 전달의 상이한 방법), 세포에서의 차이(예를 들어, 세포 유형 또는 하위 유형 또는 세포 출처에서의 차이, 예컨대 세포가 수득된 샘플 또는 대상체에서의 차이), 상이한 저장 조건(예를 들어, 사전 동결-해동 사이클의 수, 저장 온도, 저장 매체의 제형, 저장 용기, 동결 보존제 또는 세포 밀도) 또는 평가 조건(예컨대 인큐베이션하는 동안 대조군 또는 테스트 화합물의 존재 또는 부재)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체에 의해 인식되거나 이에 결합되는 항원(예컨대 재조합 항원 또는 이의 단편)이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 항-ID이다. 일부 구현예에서, 상기 특징은 저하된 생존력, 활성 또는 지속성 또는 증가된 소진 또는 분화의 증거를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 세포는 세포 분열, 성장, 증폭 또는 활성화를 촉진하는 추가 제제 없이 배지의 존재 하에서 결합 분자와 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 임의의 추가적인 조작, 예를 들어, 배지 교환, 비드 교체 또는 세포의 분할 또는 재제조 없이 연장된 시간 예를 들어, 14 일 동안 입자와 인큐베이션된다.
특정 구현예로 본 명세서에서 제공되는 장기 자극 방법은 그 중에서도 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에 투여되는 경우 생체 내에서 세포 요법의 세포가 겪는 조건을 생체 외에서 모델링하는데 유용함이 고려된다. 따라서, 일부 측면에서, 제공된 평가는 생체 내에 투여되는 경우 바람직한 특징, 예컨대 비제한적으로 유지된 또는 연장된 지속성, 생존력 또는 활성을 가질 수 있는 세포 조성물을 확인하는데 유용하다.
특정 구현예에서, 장기 자극 방법은 생존력, 활성 또는 지속성을 증가 또는 유지시키거나 또는 마커 예를 들어, 증가된 생존력, 활성 또는 지속성을 나타내는 바이오마커의 발현을 증가 또는 유지시키는 세포 조성물을 확인하기 위해 2 개 이상의 세포 조성물, 예를 들어, 투입 조성물에서 수행된다. 특정 구현예에서, 장기 자극 방법은 소진 또는 분화(예를 들어, 예컨대 분화 내지 노화 상태)를 저하 또는 방해하거나 또는 증가된 소진 또는 분화를 나타내는 마커의 발현을 저하시키는 세포 조성물에서의 차이를 확인하기 위해 2 개 이상의 세포 조성물에서 수행된다. 일부 구현예에서, 결합분자는 고체 표면, 예컨대 세포 배양 플레이트 또는 접시의 표면에 부착되거나 또는 접합된다. 특정 구현예에서, 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 접합 또는 부착된다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 결합분자, 예를 들어 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드의 존재 하에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드는 제공된 바와 같이 비드-접합 시약, 예컨대 항-ID 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 조성물은 본 명세서 예를 들어, 섹션 I에 기재된 부착된 결합분자를 갖는 입자와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 입자는 본 명세서 예를 들어, 섹션 I-A에 기재된 입자이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 본 명세서 예를 들어, 섹션 I-B에 기재된 결합분자이다. 특정 구현예에서, 결합분자는 재조합 수용체를 인식 또는 결합한다.
특정 구현예에서, 투입 조성물은 결합분자, 예컨대 결합분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 21 일 동안, 약 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 21 일 동안 또는 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 21 일 이상 동안 인큐베이션된다. 다양한 구현예에서, 투입 조성물은 결합분자, 예컨대 결합분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 10 일 내지 21 일, 12 일 내지 18 일 또는 14 일 내지 16 일(수치 포함) 또는 약 10 일 내지 21 일, 12 일 내지 18 일 또는 14 일 내지 16 일(수치 포함) 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 결합분자, 예컨대 결합분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 14 일 동안, 약 14 일 동안 또는 14 일 이상 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포 조성물의 세포는 실온을 초과하는 온도에서 결합분자와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 약 25 ℃ 초과 온도, 예컨대 일반적으로 32 ℃ , 35 ℃ 또는 37 ℃ 초과 또는 약 32 ℃ , 35 ℃ 또는 37 ℃ 초과의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 37 ℃ ± 2 ℃ 또는 약 37 ℃ ± 2 ℃ , 예컨대 37 ℃ 또는 약 37 ℃ 의 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 결합분자, 예컨대 결합분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 세포를 촉진, 예를 들어, T 세포 분열, 성장, 증폭 또는 활성화하는 추가 제제 없이 배지의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 임의의 재조합 사이토카인의 부재 하에서 결합분자와 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 인큐베이션은 중단 없이, 예를 들어, 재제조, 배지 교체 또는 새로운 결합분자의 추가 등이 없이 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 인큐베이션은 정지 상태의 조건 하에서 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 인큐베이션은 임의의 관류, 혼합, 진동 또는 진탕없이 수행된다. 일부 측면에서, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드가 인큐베이션 전 기간 동안에 존재한다. 특정 구현예에서, 결합분자는 인큐베이션하는 동안 교환되거나 교체되지 않는다. 특정 구현예로 일부 측면에서, 배지는 임의의 재조합 사이토카인을 함유하지 않음으로 인큐베이션하는 동안 배지에 존재하는 사이토카인은 세포에 의해, 예를 들어, 세포의 재조합 수용체와 입자의 결합분자 사이의 상호 작용에 대한 반응으로 생산되었을 것임이 고려된다.
일부 구현예에서, 장기 자극을 위해 제공된 방법은 상이한 세포 또는 세포 조성물을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 같은 재조합 수용체, 예를 들어, 같은 CAR을 발현하는 세포를 각각 함유하는 2 개 이상의 세포 조성물이 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 같은 결합분자를 함유하는 같은 결합분자, 예를 들어, 입자 또는 비드와 함께 세포를 인큐베이션하여 비교될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 2 개 이상의 세포 조성물은 상이한 조작 공정, 예컨대 상이한 조건이 관여하는 공정, 상이한 타이밍 및 기간 또는 상이한 장비 또는 시약으로 생성된다. 특정 구현예에서, 세포 조성물은 하나 이상의 테스트 제제 또는 화합물, 예컨대 소진을 감소시키거나 또는 지속성을 촉진하는 것으로 의심되는 제제의 존재 하에서 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포 조성물은 대조군 또는 참조 세포 조성물과 비교될 수 있다. 일부 측면에서, 대조군 또는 참조 세포 조성물은 임의의 인큐베이션을 겪지 않은 세포 조성물, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드의 존재 하에 인큐베이션되지 않은 세포 조성물, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유하지 않은 세포 조성물, 상이한 조작 공정으로 생성된 세포 조성물 및/또는 비히클 또는 대조군 화합물의 존재 하에 인큐베이션된 세포 조성물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 장기 자극 방법은 하나 이상의 테스트 제제 또는 화합물 존재 하에 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 테스트 제제 또는 화합물은 세포 조성물의 세포, 예를 들어, 인큐베이션 동안 또는 이후에 재조합 수용체를 발현하는 세포의 하나 이상의 특성, 표현형 또는 활성을 바꾸거나 영향을 주는 후보이거나 의심되는 제제이다. 일부 측면에서, 상기 테스트 제제 또는 화합물은 T 세포의 하나 이상의 표현형, 특성 또는 활성, 예컨대 성장, 분열, 증폭, 분열, 지속성, 분화, 활성화 또는 소진 또는 활성, 예컨대 비제한적으로 세포 용해 활성 또는 사이토카인 생산을 포함하는 항원-자극 활성을 증가 또는 저하시키거나 증가 또는 저하시키는 것으로 의심된다. 특정 구현예에서, 테스트 제제 또는 화합물은 천연 또는 화학적으로 개질된 폴리펩티드, 항체, 천연 또는 화학적으로 개질된 작은 올리고펩티드, 천연, 비천연 또는 화학적으로 개질된 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 화학적으로 개질된 올리고뉴클레오티드, RNAi, shRNA, siRNA, 작은 뉴클레오티드, 천연 또는 화학적으로 개질된 모노뉴클레오티드, 리포펩티드, 항균제, 작은 분자 또는 약학적 분자이다.
특정 구현예에서, 상이한 재조합 수용체, 예를 들어, 상이한 CAR을 발현하는 세포를 각각 함유하는 2 개 이상의 세포 조성물은 결합분자, 예컨대 상이한 재조합 수용체를 인식 또는 결합하는 상이한 결합분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 세포를 인큐베이션하여 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 장기 자극 방법, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 장기 자극 방법의 전부 또는 일부를 겪은 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 장기 자극 방법을 겪은 세포는 인큐베이션하는 동안 상이한 시점에서 평가된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 하나 이상의 세포 조성물로부터 세포의 표현형, 특징 또는 활성이 중간 시점, 예컨대 인큐베이션의 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 약 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 % 또는 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 % 이상이 완성된 시점에서 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 인큐베이션하는 동안 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 10 회 이상 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 인큐베이션하는 동안 상이한 간격, 예컨대 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일 또는 8 일의 간격, 약 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일 또는 8 일의 간격 또는 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일 또는 8 일 이상의 간격 후에 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 매일 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 3 일마다 1 회 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 7 일마다 1 회 평가된다.
특정 구현예에서, 산출 조성물의 세포, 예를 들어, 장기 자극 방법을 겪은 세포는 활성, 예를 들어, 항원 자극된 활성, 표현형 또는 특징에 대해 평가된다. 일부 구현예에서 항원 자극 활성은 상기 방법이 완료된 후 또는 동안에 예를 들어, 결합분자와 인큐베이션 후 또는 동안에 세포에서 평가된다. 특정 구현예에서, 평가의 결과는 상이한 세포 조성물, 예를 들어, 대조군 또는 참조 세포 조성물로부터 세포에서 측정된 같은 또는 유사한 활성의 평가가 비교된다.
일부 구현예에서, 활성은 항원-자극 활성이다. 특정 구현예로 세포, 예컨대 재조합 수용체를 발현하는 T 세포의 항원-자극 활성은 다수의 공지된 적합한 임의의 기술로 평가될수 있음이 고려된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 생산은 세포 내 사이토카인 염색으로 측정, 검출 및/또는 정량된다. 일부 측면에서, 유동 세포 측정에 의한 세포 내 사이토카인 염색(ICS)은 단일-세포 수준에서 사이토카인 생산을 연구하기에 편리한 기술이다. 특정 측면에서, ICS는 예컨대 항원 또는 입자, 예를 들어, 비드 입자를 발현하는 세포로, 접합 항원으로 세포 자극 후에 소포체 내에 사이토카인의 생산 및 축적을 검출하는데 유용하고, 특정 사이토카인의 생산에 대해 양성 또는 음성인 세포 집단의 확인 또는 역치에 기초하여 고생산 및 저생산 세포의 분리를 가능하게 한다. ICS는 또한 특정 세포의 하위그룹에서 사이토카인 생산에 접근하기 위해 세포 표면 마커, 예를 들어, CD4 또는 CD8을 이용하여 면역표현형을 위한 기타 유동 세포 측정 프로토콜과 조합하여 이용될 수 있다. 사이토카인 생산을 측정 또는 검출하기 위한 기타 단일-세포 기술은 ELISPOT, 제한 희석 및 T 세포 클로닝을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 항원-자극 활성는 하나 이상의 사이토카인의 생산이다. 항원 자극에 대한 반응으로 생산될 수 있는 사이토카인은 IL-1, IL-1β, IL-2, sIL-2Ra, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL 27, IL-33, IL-35, TNF, TNF 알파, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL24, PGD2, LTB4, 인터페론 감마(IFN-γ), 과립성 백혈구 대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식 세포 염증성 단백질(MIP)-1a, MIP-1b, Flt-3L, 프랙탈킨(fracktalkine) 및/또는 IL-5를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 하나 이상의 IL-2, IFN-감마 또는 TNF-알파이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 분비는 항원 발현 세포와의 공배양 후 또는 부착된 항원 또는 항원 단편을 함유하는 입자, 예를 들어 비드의 인큐베이션 후에 세포 외 사이토카인의 양 또는 농도를 측정, 검출 또는 정량하여 평가된다.
특정 구현예에서, 항원-자극 활성은 세포 용해(세포 독성) 활성이다. 일부 구현예에서, 세포 용해 활성은 조성물의 세포, 예를 들어, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 재조합 수용체에 의해 인식되는 항원 또는 에피토프를 발현하는 표적 세포에 노출, 인큐베이션 및/또는 접촉시켜 평가된다. 상기 세포 용해 활성은 시간의 흐름에 따른 표적 세포 수를 직접 또는 간접적으로 측정하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 재조합 수용체 발현 세포와 인큐베이션되기 전에 검출 가능한 마커와 인큐베이션될 수 있고, 상기 마커는 표적 세포가 용해되는 경우 검출 가능하거나 또는 생존 가능한 표적 세포에서만 검출 가능한 검출 가능 마커이다. 상기 판독은 직접적 또는 간접적인 표적 세포 수 및/또는 표적 세포 사멸을 제공하고 평가 중 상이한 시점에서 측정될 수 있다. 표적 세포 수의 감소 및/또는 표적 세포 사멸의 증가는 세포의 세포 용해 활성을 나타낸다. 세포 용해 평가를 수행하기 위한 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 크롬-51 방출 평가, 비-방사성 크롬 평가, 형광 염료 예컨대 카르복시플루오레신 석신이미딜 에스테르(CFSE), PKH-2 및 PKH-26을 이용한 유동 세포 측정 평가를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 조성물의 세포, 예를 들어, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 평가 중 또는 후에, 예를 들어, 결합 수용체를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와의 인큐베이션 중 또는 후에 하나 이상의 특성 또는 표현형에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 특성 또는 표현형은 하나 이상의 활성, 소진 또는 분화와 관련된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 표현형 또는 특성은 하나 이상의 마커의 존재, 부재, 양 또는 수준을 측정, 검출 또는 정량하여 평가된다.
일부 구현예에서, 활성, 소진 또는 분화와 양성적으로 또는 음성적으로 관련된 마커, 예를 들어 바이오마커의 발현은 샘플에서 마커의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량하는 것이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 마커는 유전자에 의해 암호화된 정보로 조합, 생성 및/또는 합성된 유전자 산물, 예를 들어, 임의의 생체 분자이고 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 마커의 수준, 양 또는 농도는 변형(예를 들어, 정규화)되거나 또는 직접 분석(예를 들어, 미가공)될 수 있다. 일부 구현예에서, 마커는 단백질이다. 특정 구현예에서, 마커는 유전자에 의해 암호화된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, mRNA 또는 단백질이다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드인 마커의 양 또는 수준은 임의의 적합한 공지된 수단으로 평가, 측정, 결정 및/또는 정량될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 마커의 양 또는 수준은 역전사 효소(rt) PCR, 미세 방울 디지털(droplet digital) PCR, 실시간 정량(real-time and quantitative) PCR 방법을 포함한 중합효소 연쇄 반응(PCR)(예를 들어, TAQMAN®, 분자 비콘(molecular beacon), LIGHTUPTM, SCORPIONTM, SIMPLEPROBES® 포함; 예를 들어, 미국 특허 번호 5,538,848; 5,925,517; 6,174,670; 6,329,144; 6,326,145 및 6,635,427 참조); 노던 블럿(northern blotting); 예를 들어, 역전사 산물 및 유도체의 서던 블럿(Southern blotting); 블롯 어레이(blotted arrays), 마이크로 어레이 또는 인-시츄 합성 어레이(in situ-synthesized arrays)를 포함한 어레이를 기초로 한 방법; 및 시퀀싱, 예를 들어, 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 디디옥시 시퀀싱(dideoxy sequencing) 또는 결찰에 의한 시퀀싱 또는 HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD® 및 POLONATOR® 시퀀싱과 같은 특이적 플랫폼을 포함하여 예컨대 문헌[Shendure 외, Nat. Rev. Genet. 5:335-44(2004) 또는 Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310(2010)]에서 논의되고 당업계에 공지된 임의의 기타 방법으로 평가, 측정, 결정 및/또는 정량될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 유전자 산물의 수준은 qRT-PCR로 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 qRT-PCR은 각각의 유전자에 대해 3 개의 핵산 세트를 이용하고, 상기 3 개의 핵산은 프라이머가 결합하는 표적 핵산 영역 사이에서 결합하는 프로브와 함께 프라이머 쌍을 포함한다(상업적으로 TAQMAN® 평가로 공지됨).
특정 구현예에서, 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 마커의 발현이 동시에 측정 또는 평가된다. 특정 구현예에서, 멀티플렉스 PCR, 예를 들어, 멀티플렉스 rt-PCR은 2 개 이상의 유전자 산물의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량한다. 일부 구현예에서, 마이크로어레이(예를 들어, AFFYMETRIX®, AGILENT® 및 ILLUMINA® 방식 어레이)가 2 개 이상의 유전자 산물의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량하기 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 마이크로어레이는 RNA 유전자 산물로부터 유래한 cDNA 폴리뉴클레오티드의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량하기 위해 이용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 마커의 발현은 mRNA 마커로부터 유래한 cDNA 폴리뉴클레오티드 또는 mRNA 마커를 시퀀싱하여 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 시퀀싱은 비-생거 시퀀싱(non-Sanger sequencing) 방법 및/또는 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS) 기술로 수행된다. 차세대 시퀀싱 기술의 예로는 MPSS(Massively Parallel Signature Sequencing), 폴로니(Polony) 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 가역적 염료- 터미네이터 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱, 헬리오스코프(Helioscope) 단일 분자 시퀀싱, 단일 분자 실시간(SMRT) 시퀀싱, 단일 분자 실시간(RNAP) 시퀀싱 및 나노포어(Nanopore) DNA 시퀀싱이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, NGS 기술은 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 유전자 산물의 발현이 RNA-Seq로 측정, 결정 및/또는 정량된다. 전체 전사체 샷건 시퀀싱이라고도 하는 RNA-Seq는 샘플 내 RNA의 존재 및 양을 결정한다. RNA 시퀀싱 방법은 가장 일반적인 DNA 시퀀싱 플랫폼[HiSeq systems(Illumina), 454 게놈 Sequencer FLX System(Roche), Applied Biosystems SOLiD(Life 기술), IonTorrent(Life 기술)]에 맞게 조정되었다. 상기 플랫폼들은 RNA를 cDNA로 초기 역전사를 요구한다. 반대로, 단일 분자 시퀀서 HeliScope(Helicos BioSciences)는 시퀀싱을 위한 템플리트로 RNA를 이용할 수 있다. PacBio RS 플랫폼에서 RNA 시퀀싱을 겨냥한 원리 검증이 또한 실증되었다(Pacific Bioscience). 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNA 유전자 산물이 RNA-seq에 의해 평가, 측정, 결정 및/또는 정량된다. 일부 구현예에서, 상기 RNA-seq는 태그-기반 RNA-seq 또는 샷건 RNA-seq이다.
특정 구현예에서, 마커는 단백질 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 단백질 마커는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단으로 측정된다. 하나 이상의 단백질 마커의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량하기 위한 적합한 방법은 면역평가 검출, 핵산-기반 또는 단백질-기반 앱타머(aptamer) 기술, HPLC(high precision liquid chromatography), 펩티드 시퀀싱(예컨대 선택적으로 HPLC에 연결된 에드만(Edman) 분해시퀀싱 또는 질량 분석법(예컨대 MS/MS)) 및 전술한 임의의 것의 마이크로어레이 응용(핵산, 항체 또는 단백질-단백질(즉, 비-항체) 어레이 포함)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역평가는 면역학적 반응에 기초, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 항체 단편이 유전자 산물에 결합하는 것을 검출하여 단백질을 검출하는 방법 또는 평가이거나 이를 포함한다. 면역평가는 정량적 면역세포화학 또는 면역조직화학, ELISA(직접, 간접, 샌드위치, 경쟁, 다중 및 휴대용 ELISA 포함(예를 들어, 미국 특허 번호 7,510,687 참조), 웨스턴 블럿팅(선택적으로 펩티드 시퀀싱을 포함하여 1 차원, 2 차원 또는 그 이상의 차원 블럿팅 또는 기타 크로마토그래피 수단 포함), 효소 면역평가(EIA), RIA(radioimmunoassay) 및 SPR(surface plasmon resonance)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 단백질 마커는 유동 세포 측정에 의해 측정, 검출 또는 정량된다. 일부 측면에서, 유동 세포 측정은 유체 스트림에서 세포를 현탁시키고 전자 검출 장치를 통해 세포를 통과시킴으로써 마커 검출에 사용되는 레이저 기반 또는 임피던스 기반의 생물 물리학적 기술이다. 세포에 존재하는 마커는 예컨대 유동 세포 측정에 의한 검출을 위해 형광 태그된 항체로 표지된다. 일부 측면에서, 유동 세포 측정은 세포 집단에 존재하는 마커의 존재, 부재, 양 또는 수준을 측정, 검출 또는 정량하기 위해 이용된다. 일부 측면에서 세포 집단은 세포 조성물로부터의 세포의 서브세트로부터 또는 세포 조성물의 총 생존 가능한 세포 또는 전체 세포, 예를 들어, 재조합 수용체, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에 양성인 세포일 수 있다.
특정 구현예에서, 마커는 활성화 또는 활성화-유사 상태와 양성으로 관련되거나 연관성이 있다. 일부 구현예에서, 상기 마커는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 또는 Ki67이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커는 소진 또는 소진 관련 조건과 양성으로 관련되거나 연관성이 있다. 특정 구현예에서, 상기 마커는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2b4, BTLA, TIM3, VISTA 또는 CD96 중 하나 이상이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커는 T 세포의 분화와 관련된다. 특정 구현예에서, 상기 마커는 CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 중 하나 이상 및/또는 CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7 중 하나 이상이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 산출 조성물의 세포는 CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7으로 구성된 그룹으로부터 선택된 T 세포 활성 마커에 대해 표면 양성; 및/또는 CD25, CD45RO, CD56, KLRG1으로 구성된 그룹으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성; 및/또는 CD95의 저발현; 및/또는 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10으로 구성된 그룹으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성인 세포에 대해 평가된다. 산출 조성물 일부는 CD45RA+, CD27+, CCR7+ 및/또는 CD45RO-인 세포에 대해 평가된다.
일부 구현예에서, 세포 조성물, 예를 들어, 산출 세포 조성물의 세포는 장기 자극 방법, 예를 들어, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션한 후에 장기 또는 만성 자극을 겪은 세포의 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 조성물, 예를 들어, 참조 또는 대조군 세포 조성물 중 재조합 수용체를 발현하는 세포는 평가 후, 예를 들어 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션한 후에 장기 또는 만성 자극을 겪은 세포의 특징을 나타낸다.
일부 구현예에서, 장기 자극 방법, 예를 들어, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션을 겪은 산출 조성물로부터의 세포는 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 감소된 항원-자극 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 항원-자극 활성은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 %, 약 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 또는 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 이상 또는 100 % 또는 약 100 % 감소된다. 특정 구현예에서, 항원-자극 활성은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 검출 가능한, 통계적으로 유의한 양으로 감소된다. 일부 구현예에서, 항원-자극 사이토카인 생산은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 감소된다. 특정 구현예에서, 항원-자극 사이토카인 분비은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 감소된다. 특정 구현예에서, 항원 자극 세포 용해 활성은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 감소된다.
특정 구현예에서, 산출 조성물로부터의 세포, 예컨대 대조군 또는 참조 조성물로부터의 세포는 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여, 나이브-유사 T 세포와 관련된 마커에 대해 양성인 세포의 감소된 수준, 발현 또는 양을 나타낸다. 특정 구현예에서, 마커 예컨대 마커, 예를 들어, 마커의 검출 가능한 양 또는 역치 수준 이상의 양 또는 발현 또는 염색의 양에 대해 양성인 세포의 양은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 %, 약 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 또는 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 이상 또는 100 % 또는 약 100 % 감소된다. 특정 구현예에서, 마커에 대해 양성인 세포의 양은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 검출 가능한, 통계적으로 유의한 양으로 감소된다.
일부 구현예에서, 마커 예컨대 활성화 관련된 마커 또는 나이브-유사 상태의 세포 또는 산출 조성물의 세포의 서브세트와 양성으로 관련된 마커의 평균, 중간 값 또는 평균 발현, 양 또는 수준은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 %, 약 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 또는 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 이상 또는 100 % 또는 약 100 % 감소된다. 특정 구현예에서, 활성화와 관련된 마커에 대해 양성인 세포의 양은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 검출 가능한, 통계적으로 유의한 양으로 감소된다.
특정 구현예에서, 장기 자극 방법, 예를 들어, 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션을 겪은 산출 조성물, 예를 들어, 산출 조성물 또는 대조군 또는 참조 조성물로부터의 세포는 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 분화된 T 세포와 양성으로 관련된 마커 또는 소진과 양성으로 관련된 마커와 같은 마커에 양성인 세포의 증가된 수준, 발현 또는 양을 나타낸다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 검출 가능한 마커의 양 또는 역치 수준 이상의 양 또는 발현 또는 염색의 양을 갖는 마커에 대해 양성인 세포의 양은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배, 약 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 또는 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 증가된다. 특정 구현예에서, 마커에 대해 양성인 세포의 양은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 검출 가능한, 통계적으로 유의한 양으로 증가된다.
다양한 구현예에서, 장기 자극 방법을 겪은 세포의 서브세트 또는 세포 중 분화된 T 세포와 양성으로 관련된 마커 또는 소진과 양성으로 관련된 마커와 같은 마커의 평균, 중간 값 또는 평균 발현, 양 또는 수준은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배, 약 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 또는 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이상 증가된다. 특정 구현예에서, 소진과 양성으로 관련된 마커에 대해 양성인 세포의 양은 장기 자극 방법을 겪지 않은 조성물의 세포와 비교하여 검출 가능한, 통계적으로 유의한 양으로 증가된다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 세포 조성물은 7 일 내지21 일 동안 결합분자를 함유한 입자의 존재 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, CAR 발현 세포를 함유하는 세포 조성물의 세포는 재조합 사이토카인의 부재 하에 14 일 이상 동안 결합분자를 함유하는 입자, 예를 들어 비드와 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 장기 자극 방법 후에, 세포의 서브세트 또는 세포, 예를 들어, CAR+ 세포는 항원-자극 활성, 예컨대 사이토카인 생산 또는 세포 용해 활성에 대해 평가된다. 특정 구현예에서, 생체 외 평가 후에, 조성물의 세포의 서브세트 또는 세포는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 평가된다. 특정 구현예에서, 장기 자극 방법을 겪은 2 개 이상의 세포 조성물은 생체 내에서 대상체로 투여될 경우 세포 조성물의 지속성, 생존력 또는 활성을 개선하는 시약 또는 변이를 확인하기 위해 비교된다.
Ⅳ. 유전적으로 조작된 세포 및 재조합 수용체
일부 구현예에서, 예를 들어 재조합 수용체-발현 세포를 자극 또는 증폭하기 위해 제공된 방법은 재조합 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물에서 및/또는 재조합 수용체를 갖는 유전적 조작 세포에 대한 방법과 연계하여 수행된다. 일부 측면에서, 재조합 수용체를 갖는 유전적 조작 세포는 조성물의 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 전달하기 위한 조건 하에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 유전자를 함유하는 핵산 분자, 예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 플라스미드와 세포의 조성물을 접촉시키는 것을 수반한다.
일부 구현예에서, 세포는 제공된 방법에 따라 유전적 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하여 상기 핵산의 재조합 또는 유전적으로 조작된 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 이종성, 즉, 또 다른 유기체 또는 세포로부터 수득되는 것과 같이 세포로부터 수득된 샘플 또는 세포에는 정상적으로 존재하지 않고, 이는 예를 들어, 상기 세포가 유래한 유기체 및/또는 조작된 세포에서 보통 발견되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 상이한 다수의 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하는 것을 포함하여 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이 자연적으로 발생하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 핵산은 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 유전자를 함유한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 유전적으로 조작된 세포를 제조 또는 조제하기 위한 하나 이상의 공정과 동시에, 순차적으로 또는 공동으로 수행될 수 있다. 상기 방법의 공정 단계는 임의의 하나 이상의 다수의 세포 공정 단계 단독 또는 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 공정 단계는 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 핵산, 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 세포에서 발현을 위한 재조합 산물을 암호화하는 것과 같은 레트로바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자로 형질 도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 비바이러스 핵산, 예를 들어, 에피솜 플라스미드 또는 트랜스포존으로 형질 감염된다. 상기 방법은 세포의 분리, 선별, 선택, 세척, 현탁, 희석, 농도 및/또는 제형화를 위한 단계와 같은 기타 공정 단계를 추가로 및/또는 대안적으로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 방법은 또한 세포의 배양, 자극 또는 증폭(예를 들어, 증식 및/또는 활성화를 유도하기 위한 예를 들어, 세포의 자극)을 위한 생체 외 단계를 포함할 수 있고, 이는 일부 경우에, 제공된 방법에 따라 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 냉동 보존 전 또는 후에 대상체로부터 세포의 분리, 세포의 제조, 프로세싱, 배양 및/또는 조작 및 같은 대상체로 세포의 재-도입을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 순서로 수행되는 공정 단계를 포함한다: 세포, 예를 들어, 1 차 세포가 생물학적 샘플로부터 선택되거나 선별되는 것과 같이 우선 분리된다; 선택된 세포는 형질 도입을 위해 바이러스 벡터 입자와 인큐베이션된다; 및 형질 도입된 세포는 조성물로 제형화된다. 일부 경우에, 형질 도입된 세포는 예컨대 제공된 방법에 따라 자극 시약의 존재 하에서 자극에 의한 것과 같이 생체 외에서 활성화, 증폭 또는 번식된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 세척, 현탁, 희석 및/또는 농축 중 하나 이상의 공정 단계를 포함할 수 있고, 이는 분리, 예컨대 선별 또는 선택, 형질 도입, 자극 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상 전, 중 또는 동시에 또는 다음에 발생할 수 있다.
특정 구현예에서, 형질 감염 또는 형질 도입될 세포는 하나 이상의 핵산과 접촉하기 전에 분리, 선택 또는 농축되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 선택되지 않는다. 일부 구현예에서, 형질 감염 또는 형질 도입될 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 농축되지 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상 또는 모든 공정 단계, 예를 들어, 분리, 선택 및/또는 농축, 프로세싱, 형질 도입 및 조작, 자극 및/또는 활성화 및 제형화 단계와 연결된 인큐베이션은 시스템, 장치 또는 통합 또는 독립된 시스템으로의 장치 및/또는 자동 또는 프로그램화할 수 있는 방식을 이용하여 수행된다. 일부 측면에서, 상기 시스템 또는 장치는 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함하고, 이는 사용자가 결과를 프로그램, 제어, 평가하는 것을 허용하고/거나 프로세싱, 분리, 조작 및 제형화 단계의 다양한 측면을 조정하는 것을 허용한다. 하나의 실시예에서, 상기 시스템은 국제 특허 출원, 공개 번호 WO2009/072003 또는 미국 특허출원 공개 번호 20110003380 A1에 기재된 바와 같은 시스템이다. 하나의 실시예에서, 상기 시스템은 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기재된 바와 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포를 함유하는 조성물을 제조하는 것과 관련한 것을 포함하여, 제공된 방법과 관련하여 세포를 제조, 프로세싱 및/또는 인큐베이션하는 것과 관련된 세포 공정 단계 중 하나 이상이 원심분리 챔버, 예컨대 기타 이용 가능한 방법과 비교하여 특정 이점을 제공할 수 있는 회전축 주위에서 회전 가능하고 일반적으로 원통형인 실질적으로 강성인 챔버의 내부 공동에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 모든 공정 단계가 같은 원심분리 챔버 안에서 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공정 단계는 상이한 원심분리 챔버, 예컨대 같은 유형의 다수의 원심분리 챔버에서 수행된다. 상기 방법은 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기재된 바와 같은 것 중 임의의 것을 포함한다.
원심분리 챔버의 예시로는 Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용하기 위한 것들을 포함하여, 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트 및 A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버를 포함하여 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 것들이 포함된다. 예시적인 챔버, 시스템 및 공정 기기 장치 및 캐비닛이 예를 들어, 미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 공개된 미국 특허 출원, 공개 번호 2008/0171951 및 공개된 국제 특허 출원, 공개 번호 WO 00/38762에 기재되어 있고, 각각의 내용이 본 명세서에 그 전체가 참조로 편입되어 있다. 특정 공정(예를 들어, 희석, 세척, 형질 도입, 제형화)에 따라, 공정에 적절한 특정 키트를 선택하는 것은 당업자의 수준 범위 내이다. 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2의 제품 이름으로 BioSafe SA 사에 의해 판매되는 1 회용 키트를 포함하고 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 시스템에서 수행되는 다양한 공정 단계의 측면을 작동, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 기기 장치를 포함하여 기타 기기 장치와 관련되어 포함되고/거나 배치된다. 상기 기기 장치는 일부 구현예에서 캐비닛 내에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 기기 장치는 제어 회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 함유하는 하우징을 포함하는 캐비닛을 포함한다. 예시적인 장치가 미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 미국 특허 출원 번호 2008/0171951에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 일련의 컨테이너, 예를 들어, 백, 배관, 마개, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 컨테이너, 예컨대 백은 같은 컨테이너 또는 별개의 컨테이너, 예컨대 같은 백 또는 별개의 백에 있는 벡터 입자, 예를 들어, 바이러스 벡터 입자 또는 비바이러스 플라스미드로 형질 도입 또는 형질 감염될 세포를 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 예컨대 백을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 방법 중에 성분 및/또는 조성물을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위해 챔버 및/또는 기타 성분으로 당겨지는 배지, 예컨대 희석제 및/또는 세척 용액을 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 예컨대 백을 추가로 포함한다. 상기 컨테이너는 투입 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 산출 라인에 대응하는 위치에서와 같이 시스템에서 하나 이상의 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 시스템, 예컨대 폐쇄된 시스템은 멸균 상태이다. 일부 구현예에서, 배관 라인과 커넥터를 경유한 컨테이너와 같은 시스템 성분의 모든 연결은 멸균 조건 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 연결은 층류 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 연결은 배관과 컨테이너 사이에 멸균 용접과 같은 멸균 연결을 생성하는 멸균 연결 장치를 이용하여 이루어진다. 일부 구현예에서, 멸균 연결 장치는 200 ℃ 이상의 온도, 예컨대 260 ℃ 또는 300 ℃ 이상의 온도와 같은 멸균을 유지하기에 충분히 높은 열 조건 하에서 연결을 가져온다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 1 회용 키트와 같이 1 회용일 수 있다. 일부 구현예에서, 1 회용 키트는 연속식 또는 반 연속식 방식으로 발생하는 공정에서 예를 들어 적어도 2 회, 3 회, 4 회, 5 회 또는 그 이상의 회수와 같이 공정 또는 공정들의 복수의 사이클에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1 회용 키트와 같은 상기 시스템은 단일 환자로부터 세포의 공정을 위해 이용될 수 있다. 방법 측면에서, 상기 공정은 같은 원심분리 챔버에서와 같이 같은 폐쇄된 시스템에서 수행될 필요는 없으나, 상이한 원심분리 챔버와 같이 상이한 폐쇄 시스템 하에서 수행될 수 있으며; 일부 구현예에서, 상기 상이한 원심분리 챔버는 같은 원심 분리기와 관련하여 배치되는 것과 같이 같은 시스템과 관련하여 배치된 방법에서 각각의 지점에 존재한다. 일부 구현예에서, 모든 공정 단계는 하나 이상의 각각의 공정 단계의 서브세트 또는 전체가 같거나 상이한 원심분리 챔버에서 수행되는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
A. 샘플 및 세포 제조
본 명세서에서는 재조합 수용체를 함유하는 조작된 세포를 포함한 세포를 제공한다. 상기 세포를 함유하는 상기 세포의 집단 및 조성물이 또한 제공된다. 조성물 중에는 세포가 인큐베이션되거나 접촉되는 하나 이상의 입자에 존재하는 결합분자에 의해 인식 또는 결합될 수 있는 재조합 수용체를 하나 이상의 세포가 발현하는 것으로 공지되거나 발현할 가능성이 있거나 발현할 세포를 함유하는 투입 조성물이 존재한다. 또한 조성물 중에는 입자의 결합분자에 의해 결합 또는 인식되는 재조합 수용체를 함유하는 세포가 농축된 조성물을 포함하여, 자극되거나 증폭된 세포가 함유된 산출 조성물을 포함한 제공된 방법으로 생산된 조성물이 존재하고, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 수용체를 발현하는 세포가 특정 유형의 세포 예컨대 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포 또는 조성물에 있는 전체 세포의 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % 이상을 이룬다. 따라서, 재조합 수용체 예를 들어, CAR을 발현하는 유전적으로 조작된 세포가 제공된다.
조성물 중에는 양자 세포 요법과 같은 투여를 위한 제형 및 약학적 조성물이 존재한다. 상기 세포를 조작, 생산 또는 생성하기 위한 방법, 대상체, 예를 들어, 환자에게 세포 및 조성물을 투여하기 위한 치료 방법 및 상기 세포를 검출, 선택, 분리 또는 선별하기 위한 방법이 또한 제공된다.
세포는 일반적으로 진핵 세포, 예컨대 포유 동물 세포 및 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래하고, 면역 시스템 세포, 예컨대 선천성 또는 적응성 면역 세포, 예를 들어, 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한 골수성 또는 림프 세포이다. 기타 예시적인 세포에는 줄기 세포, 예컨대 유도 다능성 줄기 세포(iPSCs)를 포함한 다분화능 및 다능성 줄기 세포가 포함된다.
세포는 전형적으로 대상체로부터 직접 분리되고/거나 대상체로부터 분리되고 동결된 것과 같은 1 차 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 T 세포 또는 기타 세포 유형, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이의 하위집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화, 증폭, 재순환, 국소화에 대한 가능성 및/또는 지속 용량, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로필 및/또는 분화 정도로 정의된 것의 하나 이상의 서브세트를 포함한다. 처리될 대상체와 관련하여, 상기 세포는 동종 이계 및/또는 자가 조직일 수 있다. 방법들 중에는 기성품 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예컨대 기성품 기술에 대해, 상기 세포는 다능성 및/또는 다분화능, 예컨대 줄기 세포, 예컨대 유도 다능성 줄기 세포(iPSCs)이다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위-유형 및 하위 집단 중에는 나이브 T(TN) 세포, 이펙터 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이의 하위-유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T(TSCM), 중앙 기억 T(TCM), 이펙터 기억 T(TEM) 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 보조 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막-관련 불변 T(MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절T(Treg) 세포, 보조 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 보조 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 천연 킬러(NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립성 백혈구, 예를 들어, 골수성 세포, 대식 세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염구이다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어, T 세포주로부터 유래한다. 일부 구현예에서 세포는 이종성 출처, 예를 들어, 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포는 예컨대 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 유래하거나 이로부터 수득된 샘플로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 분리된 대상체는 세포 요법이 투여되거나 세포 요법이 필요하거나 질병 또는 병태를 가진 대상체이다. 일부 구현예에서 대상체는 세포가 분리, 프로세싱 및/또는 조작되는 양자 세포 요법과 같은 특정 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 일부 구현예에서 세포는 1 차 세포, 예를 들어, 1 차 인간 세포이다. 샘플은 하나 이상의 공정 단계, 예컨대 선별, 원심분리, 유전적 조작(예를 들어, 바이러스 벡터로 형질 도입), 세척 및/또는 인큐베이션으로부터 생성된 샘플뿐만 아니라 대상체로부터 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 출처로부터 직접 수득된 샘플이거나 또는 프로세싱된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 윤활액, 소변 및 땀, 이로부터 유래한 프로세싱된 샘플을 포함하여 조직 및 기관 샘플을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포가 예를 들어, 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술로 수득된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포는 T 세포, 단핵구, 과립성 백혈구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판외의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포의 선택 및/또는 농축 전에, 샘플 또는 샘플에 있는 세포는 내지 추가 공정 단계 전에 휴식 또는 보유될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 2 ℃ 내지 8 ℃ 또는 약 2 ℃ 내지 8 ℃ 의 온도에서 최대 48 시간 동안, 예컨대 최대 12 시간, 24 시간 또는 36 시간 동안 유지되거나 보유된다. 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 선택 및/또는 농축되지 않는다. 일부 구현예에서, 샘플 또는 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉 또는 인큐베이션하기 전에 휴식 또는 보유될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉 또는 인큐베이션하기 전에 2 ℃ 내지 8 ℃ 또는 약 2 ℃ 내지 8 ℃ 의 온도에서 최대 48 시간 동안, 예컨대 최대 12 시간, 24 시간 또는 36 시간 동안 유지되거나 보유된다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 세포의 형질 도입 및 조작 및/또는 자극, 활성화 및/또는 증폭을 위해 분리, 선택 및/또는 농축, 인큐베이션하기 전 또는 후에 세포를 동결 예를 들어, 동결 보존하기 위한 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 세척 단계 후에 동결 용액에 현탁하여 혈장 및 혈소판을 제거한다. 일부 측면에서 다양한 공지된 임의의 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다. 하나의 실시예는 20 % DMSO 및 8 % 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS 또는 기타 적합한 세포 동결 배지 사용을 수반한다. 이 후에 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10 % 및 4 %가 되도록 배지로 1:1로 희석한다. 이 후에 세포는 분 당 1°의 속도로 -80 ℃까지 일반적으로 냉동되고 액체 질소 저장 탱크의 기체 상에서 보관된다.
일부 구현예에서, 세포의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화도 기반 세포주별 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 예를 들어, 원하지 않는 성분의 제거, 바림직한 성분의 농축, 특정 시약에 민감한 세포의 용해 또는 제거를 위해 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션된다. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감도 및/또는 저항에 기초하여 선별된다.
일부 구현예에서, 방법은 밀도-기반 세포주별 방법, 예컨대 적혈구를 용해시키고 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리로 말초 혈액으로부터 백혈구의 제조를 포함한다.
일부 구현예에서, 분리 방법은 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특이적 분자의 세포 내 존재 또는 발현에 기초하여 상이한 세포 유형의 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 마커에 기초한 임의의 공지된 선별 방법이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선별은 친화도-기반 또는 면역친화도-기반 선별이다. 예를 들어, 일부 측면에서 분리는 전형적으로 세포 표면 마커, 예를 들어, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션한 후, 일반적으로 세척 단계와 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 선별로 하나 이상의 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단을 선별하는 것을 포함한다.
상기 선별 단계는 결합된 시약을 갖는 세포를 추가 사용을 위해 보유하는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 보유되는 음성 선택을 기반으로 할 수 있다. 일부 실시예에서, 양쪽 분획 모두가 추가 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우 음성 선택이 특히 유용할 수있어서, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기초하여 선별이 가장 잘 수행된다.
선별은 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100 % 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 상기 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 부재할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 상기 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 말하지만, 상기 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 실시예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획에 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 다른 선별 단계가 수행되는 다중 라운드의 선별 단계가 수행된다. 일부 예에서, 단일 선별 단계는, 예를 들어 각각 음성 선별을 표적으로 하는 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 유형에서 발현된 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 세포 유형을 동시에 양성으로 선택할 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포와 같은 T 세포의 특이적 하위집단이 양성 또는 음성 선택 기술로 분리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 이용하여 양성으로 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 핵산을 갖는 세포와 접촉하기 전에 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)와 접촉하여 CD3+, CD28+ T 세포를 증폭한다. 특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 핵산과 세포를 접촉시키기 전에 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드와 접촉되지 않는다.
일부 구현예에서, 분리는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈 또는 양성 선택에 의한 특정 세포 집단의 농축에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 양성 또는 음성으로 선택된 세포에서 각각 상대적으로 더 높은 수준으로 발현(마커높은)되거나 또는 발현(마커+)된 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구 또는 기타 백혈구, 예컨대 CD14에서 발현되는 마커의 음성 선택으로 PBMC 샘플로부터 선별된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 보조 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 선별하기 위해 이용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 하위 집단에서 상대적으로 더 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가로 분류될 수있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 각각의 하위집단과 관련된 표면 항원을 기반으로 양성 또는 음성 선택에 의한 것과 같이 나이브, 중앙 기억, 이펙터 기억 및/또는 중앙 기억 줄기 세포가 추가로 농축되거나 또는 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 투여 후 장기 생존, 증폭 및/또는 생착을 개선하는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 일부 측면에서 이는 상기 하위 집단에서 특히 강력하다. 문헌[Terakura 외 (2012) Blood. 1:72-82; Wang 외 (2012) J Immunother. 35(9):689-701] 참조. 일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 추가로 향상시킨다.
구현예에서, 기억 T 세포는 CD62L+ 및 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체을 이용하는 것과 같이 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획이 농축 또는 고갈될 수 있다
일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD 127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B의 고발현 또는 세포발현에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 또는 CD62L을 발현하는 세포의 농축 또는 양성 선택으로 수행된다. 일 측면에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행되고, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음선 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택에 영향을 받는다. 상기 선택은 일부 측면에서 동시에 수행되고 다른 측면에서 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위집단을 제조하는데 사용된 같은 CD4 발현-기반 선택 단계는 CD4+ 세포 집단 또는 하위-집단을 생성하기 위해서도 사용되어, CD4-기반 선별로부터의 양성 및 음성 분획 모두가 보유되고 선택적으로 하나 이상의 추가 양성 또는 음성 선택 단계 후에 상기 방법의 다음 단계에서 사용된다.
특정 실시예에서, PBMC 샘플 또는 기타 백혈구 샘플은 CD4+ 세포의 선택에 영향을 받고, 음성 및 양성 분획 모두가 보유된다. 음성 분획은 이 후에 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선택 및 중앙 기억 T 세포, 예컨대 CD62L 또는 CCR7에 특징적인 마커에 기초한 양성 선택에 영향을 받고, 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 보조 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인하여 나이브, 중앙 기억 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 및 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
하나의 실시예에서, 음성 선택으로 CD4+ 세포를 농축하기 위해서는, 단일 클론 항체 혼합체는 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 자성 비드 또는 상자성 비드에 결합되어, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 선별을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(또는 자성친화도) 선별 기술을 이용하여 선별되거나 분리된다(검토 문헌[Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ]).
일부 측면에서, 샘플 또는 선별된 세포 조성물은 작은 자화성 또는 자기적으로 반응하는 물질, 예컨대 자기적으로 반응하는 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비드(예를 들어, 예컨대 Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 인큐베이션된다. 자기적으로 반응하는 물질, 예를 들어, 입자는 선별하고자 하는 예를 들어, 음성 또는 양성 선택을 하고자 하는 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하는 분자, 예를 들어, 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예를 들어, 항체에 일반적으로 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 특정 결합 구성원, 예컨대 항체 또는 기타 결합 파트너에 결합된 자기적으로 반응하는 물질을 포함한다. 자성 선별 방법에 이용되는 자기적으로 반응하는 물질 다수가 잘 알려져 있다. 적합한 자성 입자는 문헌[Molday, 미국 특허 번호 4,452,773 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B]에 기재된 것들을 포함하고 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 편입되어 있다. 문헌[Owen 미국 특허 번호 4,795,698 및 Liberti 외, 미국 특허 번호 5,200,084]에 기재된 것들과 같은 콜로이드 크기 입자가 기타 예이다.
인큐베이션은 자성 입자 또는 비드에 부착되고, 상기 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 예컨대 2 차 항체 또는 기타 시약이 샘플 내에 있는 세포에 존재할 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 일반적으로 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 배치되고, 자기 응답성 또는 자화성 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택을 위해, 자석에 끌리는 세포는 유지되고; 음성 선택을 위해, 끌리지 않은 세포(표지되지 않은 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 같은 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획이 유지되고 추가로 처리되거나 추가 선별 단계를 거친다.
특정 구현예에서, 자기 반응성 입자는 1 차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2 차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1 차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1 차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 후, 세포 유형 특이적 2 차 항체-또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅된 자성 입자는 비오티닐화된 1 차 또는 2 차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적으로 반응하는 입자는 후속 큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 남고; 일부 측면에서, 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화성 또는 자기 응답성 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화성 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 경쟁 비표지 항체의 사용 및 절단 가능한 링커에 접합된 자화성 입자 또는 항체의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화성 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도-기반 선택은 자성-활성화된 세포 분류(MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 경유한다. 자성 활성화 세포 분류(MACS) 시스템으로 자화 입자가 부착된 세포의 고순도 선택이 가능하다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장의 적용 후에 비 표적 및 표적 종이 순차적으로 용리되는 모드에서 작동한다. 즉, 자화 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종이 용리되는 동안 제자리에 유지된다. 이어서, 상기 제 1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리되는 것이 방지된 종은 이들이 용리 및 회수될 수 있도록 어떤 방식으로도 자유롭게 된다. 특정 구현예에서, 비 표적 세포는 표지되고 이종 세포 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 분리 또는 선별은 상기 방법의 분리, 세포 제조, 선별, 프로세싱, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치 또는 장치를 이용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 예를 들어 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 상기 단계 각각을 수행하는데 사용된다. 하나의 실시예에서, 상기 시스템은 문헌[국제 특허 출원, 공개 번호 WO2009/072003 또는 미국 특허 출원 20110003380 A1]에 기재된 바와 같은 시스템이다. 하나의 실시예에서, 상기 시스템은 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 시스템이다.
일부 측면에서, 선별 및/또는 기타 단계는 예를 들어 폐쇄 및 멸균 시스템에서 임상 규모 수준에서 세포의 자동 선별을 위해 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 구성 요소에는 통합 마이크로 컴퓨터, 자기 선별 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서 통합 컴퓨터는 기기의 모든 구성 요소를 제어하고 시스템이 표준화된 순서로 반복되는 절차를 수행하도록 지시한다. 일부 측면에서 자기 선별 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유량을 제어하고 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름과 세포의 지속적인 현탁을 보장한다.
일부 측면에서 CliniMACS 시스템은 멸균 비 발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자화성 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서, 세포 제조 백을 튜브 세트에 연결하고, 이어서 완충액을 함유하는 백 및 세포 수집 백에 연결한다. 튜브 세트는 사전 컬럼 및 선별 컬럼을 포함하여 사전 조립된 멸균 튜브로 구성되며 일회용이다. 선별 프로그램이 시작된 후, 시스템은 세포 샘플을 선별 컬럼에 자동으로 적용한다. 표지된 세포는 컬럼 내에 보유되고, 표지되지 않은 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 칼럼에 보유되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 보유된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장 제거 후 컬럼으로부터 용리되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 선별 및/또는 기타 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 원심 분리에 의해 세포의 자동 세척 및 분획을 가능하게 하는 세포 프로세싱 유닛을 갖추고있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 출처 세포 산물의 거시적 층을 식별하여 최적의 세포 분획 종점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어도 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 예를 들어 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 달성하는 통합 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 배지의 멸균 제거 및 보충을 가능하게 할 수 있고 통합된 현미경을 사용하여 세포를 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Klebanoff 외 (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 외 (2012) Blood. 1:72-82 및 Wang 외 (2012) J Immunother. 35(9):689-701] 참조.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 유동 세포 측정법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되는데, 여기서 다중 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 흐름으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 분취 규모(FACS) 분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 FACS 기반 검출 시스템과 조합된 MEMS(microelectromechanical systems) 칩을 사용하여 수집 및 농축(또는 고갈)된다(예를 들어, 문헌[WO 2010/033140, Cho 외 (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin 외 (2008) J Biophoton. 1(5):355-376] 참조.) 두 경우 모두, 세포는 다수의 마커로 표지될 수 있어서, 고순도로 잘 정의된 T 세포 서브세트를 분리할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 선별을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지된다. 예를 들어, 선별은 형광 표지된 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 분취 규모(FACS) 및/또는 MEMS 칩, 예를 들어, 유동 세포 분석 검출 시스템과의 조합을 포함하는 형광-활성화 세포 분류(FACS)와 같은 유체 흐름에서 수행된다. 상기 방법은 다수의 마커에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시킴으로써 세포를 유전자 조작하기 위한 하나 이상의 단계 이전에 활성화 또는 자극된다. 특정 구현예에서, 세포는 세포를 유전자 조작하기 위한 하나 이상의 단계 전에 자극 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 켜거나 개시한다. 상기 제제는 TCR에 특이적인 예를 들어 항-CD3와 같은 항체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 공자극 수용체, 예를 들어 항-CD28을 자극할 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합되거나 결합될 수 있다. 선택적으로, 활성화 또는 자극은 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양 배지에 첨가(예를 들어, 약 0.5 ng/ml 이상의 농도)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, IL-2 농도는 약 10 단위/mL 이상이다.
B. 이종 단백질을 암호화하는 핵산
재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 핵산 분자), 상기 수용체를 발현하기 위한 유전자 조작 세포용 벡터 및 조작된 세포의 제조 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산을 함유한다. 특정 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 비 바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 세포는 세포의 사전 활성화 없이 및/또는 대상체로부터 세포를 수득한 후 24 시간 이내에 개시되는 시간 내에 벡터와 접촉하고/거나 15 ℃ 내지 25 ℃ 초과의 온도, 예컨대 37 ℃ ± 2.0 ℃ 또는 약 37 ℃ ± 2.0 ℃ 초과의 온도에 세포가 대상체로부터 수득된 후 24 시간 이내 동안 노출되지 않는다. 특정 구현예에서, 벡터는 먼저, 즉 사전에 유전자 조작(예를 들어, 형질 도입 또는 형질 감염), T 세포를 생체 외 자극 시약(예를 들어 항-CD3/항-CD28 시약)으로 활성화 및/또는 자극하지 않고, 세포를 바이러스 입자와 접촉 또는 배양하기 전 및/또는 이와 함께 세포에 접촉된다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비 바이러스 벡터 또는 트랜스포존, 예를 들어 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존 시스템, 시미안 바이러스 40(SV40)에서 유래한 벡터, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터, 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV)에서 유래된 레트로바이러스 벡터, 골수 증식 육종 바이러스(MPSV), 마우스 배아 줄기 세포 바이러스(MESV), 마우스 줄기 세포 바이러스(MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 또는 비 바이러스 DNA는 이종 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, 이종 재조합 분자는 재조합 수용체, 예를 들어 항원 수용체, SB-트랜스포존, 예를 들어 유전자 침묵을 위한, 캡시드-봉입 트랜스포존, 상동성 이중 가닥 핵산, 예를 들어 게놈 재조합 또는 리포터 유전자를 위한(예를 들어, GFP와 같은 형광 단백질) 또는 루시퍼라제)이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 또는 비 바이러스 DNA는 재조합 수용체 및/또는 키메라 수용체, 예컨대 이종 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한다. 이종 수용체와 같은 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 작용성 비-TCR 항원 수용체와 같은 항원 수용체 및 유전자 도입 T 세포 수용체(TCR)와 같은 기타 항원-결합 수용체를 포함할 수 있다. 수용체는 또한 특정 리간드에 결합하고 CAR에 존재하는 것과 유사한 막 관통 및/또는 세포 내 신호 전달 도메인을 갖는 수용체와 같은 다른 키메라 수용체와 같은 다른 수용체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산은 일반적으로 바이러스 게놈의 비 필수 영역과 같은 바이러스 벡터의 영역에 삽입되거나 위치된다. 일부 구현예에서, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈 내로 삽입되어 복제 결함인 바이러스를 생성한다. 특정 구현예에서, 핵산은 비 바이러스 DNA 내에, 예를 들어 트랜스포존 내에 위치한다.
일부 구현예에서 CAR 및 재조합 TCR을 포함한 항원 수용체 및 생산 및 이의 도입은 예를 들어, 특허 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416] 및/또는 비특허 문헌[Sadelain 외, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 외 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 외, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 외, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다.
1. 키메라 항원 수용체
일부 구현예에서, 특정 세포 유형의 표면에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 마커 또는 리간드)에 대해 특이성을 갖는 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 기타 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비 표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포에서 선별적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고/거나 조작된 세포에서 발현된다.
특정 구현예에서, 키메라 수용체와 같은 재조합 수용체는 세포 내 신호 전달 영역을 함유하고, 이는 세포질 신호 전달 도메인(또한 세포 내 신호 전달 도메인으로 호환하여 지칭), 예컨대 T 세포에서 1 차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질(세포 내) 영역, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 성분의 세포질 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 세포질 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호 전달 부분)을 포함하고/거나 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드(예를 들어, 항원) 항원에 특이 적으로 결합하는 세포 외 리간드-결합 도메인을 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원 인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 리간드, 예컨대 항원은 세포 표면에서 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고, 항원은 TCR과 같이 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면상에서 인식되는 세포 내 단백질의 펩티드 항원과 같은 가공된 펩티드 항원이다.
CAR을 포함한 예시적인 항원 수용체 및 세포로 상기 수용체를 도입 및 조작하기 위한 방법이 예를 들어, 특허 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416] 및/또는 비특허 문헌[Sadelain 외, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 외 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 외, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 외, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌[미국 특허 번호: 7,446,190]에 기재된 바와 같은 CAR을 포함하고, 문헌[국제 특허 출원 공개 번호: WO/2014055668 A1]에 기재된 것들을 포함한다. CAR의 예시로 전술한 공개 문헌, 예컨대 문헌[국제 특허 출원 WO2014031687, 미국 특허 출원 8,339,645, 미국 특허 출원 7,446,179, 미국 특허 출원 2013/0149337, 미국 특허 번호: 7,446,190, 미국 특허 번호: 8,389,282, Kochenderfer 외, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 외 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens 외, Sci Transl Med. 2013 5(177)] 중 임의의 문헌에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다. 또한 문헌[국제 특허 출원 WO2014031687, 미국 특허 출원 8,339,645, 미국 특허 출원 7,446,179, 미국 특허 출원 2013/0149337, 미국 특허 번호: 7,446,190 및 미국 특허 번호: 8,389,282] 참조.
일부 구현예에서, CAR은 양자 요법, 예를 들어 암 마커에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현된 항원 및/또는 정상 또는 비-병리 세포 유형에서 발현된 항원과 같은 감쇠 반응을 유도하기 위한 항원과 같은 특정 항원(또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성으로 구성된다. 따라서, CAR은 전형적으로 세포 외 부분에 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 단일 클론 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일쇄 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 항원-결합 부분 또는 일부를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로서 세포에서 발현된다. 항원 수용체 중에는 기능성 비 TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)가 있다. 일반적으로, 펩티드-MHC 복합체에 대해 지시된 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR의 MHC-펩티드 복합체에 특이적인 세포 외 항원 결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막 관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 전형적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호 및 선택적으로 공자극 수용체와 조합된 상기 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체(예를 들어, CAR)와 같은 재조합 수용체는 항원(또는 리간드)에 결합, 예컨대 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화된 항원 중에는 양자 세포 요법을 통해 표적화될 질병, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것들이 있다. 질병 및 병태 중에는 혈액암, 면역계의 암, 예컨대 림프종, 백혈병 및/또는 골수종 예컨대, B, T 및 골수성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종을 포함하는 암 및 종양을 포함한 증식성, 신생물성 및 악성 질병 및 장애가 있다.
일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 폴리펩티드다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 기타 분자이다. 일부 구현예에서, 항원(또는 리간드)은 정상 또는 비 표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포에서 선별적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고/거나 조작된 세포에서 발현된다.
일부 구현예에서, CAR은 세포 표면에서 발현된 온전한 항원과 같은 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 함유한다.
일부 구현예에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지됨), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 상호변이효소, 도파크롬 델타-이성화효소 또는 DCT로도 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, CAR은 MHC-펩티드 복합체와 같이 세포 표면에서 제시되는 세포 내 항원, 예컨대 종양-관련 항원을 특이적으로 인식하는 TCR-유사 항체, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편(예를 들어 scFv)을 함유한다. 일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체의 일부로서 세포에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 작용성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)가 있다. 일반적으로, 펩티드-MHC 복합체에 대해 지시된 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하는 CAR 은 TCR-유사 CAR로도 지칭될 수 있다.
"주요 조직 적합성 복합체(Major histocompatibility complex, MHC)"에 대한 언급은 일부 경우에는 세포 장치에 의해 가공된 펩티드 항원을 포함하여 폴리펩티드의 펩티드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩티드 결합 부위 또는 결합 홈을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 지칭한다. 일부 경우에, TCR 또는 TCR-유사 항체와 같은 T 세포상의 항원 수용체에 의해 인식될 수 있는 형태로 항원을 제시하기 위해, 펩티드와의 복합체, 즉 MHC-펩티드 복합체를 포함하여 MHC 분자가 세포 표면 상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우에 3 개의 α 도메인을 갖는 막에 걸친 α 사슬 및 비공유 결합으로 연관된 β2 마이크로글로불린을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 2 개의 막 관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 이들 둘다는 전형적으로 막에 걸쳐있다. MHC 분자는 항원 결합 부위 또는 펩티드에 결합하기 위한 부위 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 유래하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 MHC- 펩티드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식되지만 일부 경우에는 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래된 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 이들은 CD4+ T 세포에 의해 전형적으로 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 연결된 유전자좌의 그룹에 의해 암호화되며, 이는 마우스에서 H-2로 총괄하여 지칭되고 인간에서 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭된다. 따라서, 전형적으로 인간 MHC는 또한 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭될 수 있다.
용어 "MHC-펩티드 복합체(MHC-peptide complex)" 또는 "펩티드-MHC 복합체(peptide-MHC complex)" 또는 이의 변이체는 예컨대, 일반적으로, MHC 분자의 틈이나 결합 홈에 있는 펩티드의 비공유 상호 작용에 의한 MHC 분자와 펩티드 항원의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 MHC-펩티드 복합체는 세포의 표면에 존재하거나 디스플레이된다. 일부 구현예에서, 상기 MHC-펩티드 복합체는 항원 수용체, 예컨대 TCR, TCR-유사 CAR 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드의 펩티드, 예컨대 펩티드 항원 또는 에피토프는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩티드는 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편에 기초하거나 이로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 전형적으로 약 8 내지 약 24 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 분류 II 복합체의 인식을 위해 9 내지 22 개 또는 약 9 내지 22 개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩티드는 MHC 분류 I 복합체의 인식을 위해 8 내지 13 개 또는 약 8 내지 13 개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC 분자, 예컨대 MHC-펩티드 복합체, 항원 수용체, 예컨대 TCR 또는 TCR-유사 CAR의 맥락에서 펩티드 인식 시, T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생산, 세포 독성 T 세포 반응 또는 기타 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호가 생산되거나 촉발된다.
일부 구현예에서, TCR-유사 항체 또는 항원-결합 부분은 당업계에 공지되어 있거나 공지된 방법으로 생산될 수 있다(예를 들어 미국 공개 출원 번호 2002/0150914; 미국 공개 출원 번호 2003/0223994; 미국 공개 출원 번호 2004/0191260; 미국 공개 출원 번호 2006/0034850; 미국 공개 출원 번호 2007/00992530; 미국 출원 번호 20090226474; 미국 출원 번호 20090304679; 및 국제 PCT 공개 번호 WO 03/068201 참조).
일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 특이적 MHC-펩티드 복합체를 함유하는 면역원의 유효량으로 숙주를 면역화하여 생산될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩티드 복합체의 펩티드는 종양 항원, 예를 들어 보편적인 종양 항원, 골수종 항원 또는 하기 기재된 바와 같은 기타 항원과 같은 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 이 후 면역 반응을 끌어내기 위해 면역원의 유효량이 숙주에 투여되고, 상기 면역원은 MHC 분자의 결합 홈에서 펩티드의 3 차원 제시로 면역 반응을 끌어내기에 충분한 시간의 기간 동안 이의 3 차원 형태를 보유한다. MHC 분자의 결합 홈에서 펩티드의 3 차원 제시를 인식하는 바림직한 항체가 생산되었는지 결정하기 위해 숙주로부터 수집된 혈청이 평가된다. 일부 구현예에서, 항체가 MHC 분자 단독, 관심 펩티드 단독 및 MHC 복합체 및 상관없는 펩티드로부터 MHC-펩티드 복합체를 식별할 수 있음을 확정하기 위해 생산된 항체가 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 라이브러리 디스플레이 방법, 예컨대 파지 항체 라이브러리를 이용하여 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이 Fab, scFv 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있고, 예를 들어, 상기 라이브러리의 구성원은 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이된다. 예를 들어 문헌[미국 공개 출원 번호 20020150914, 미국 공개 출원 번호 2014/0294841; 및 Cohen CJ. 외 (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332] 참조.
본 명세서에서 용어 "항체(antibody)"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 온전한 항체 및 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄(VH) 영역을 포함한 작용성(항원-결합) 항체 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함한 단일 사슬 항체 단편을 포함한 다클론성 및 단일 클론 항체를 포함한다. 상기 용어는 유전적으로 조작된 및/또는 그렇지 않으면 면역글로불린의 개질 형태, 예컨대 세포내 항체, 펩티바디, 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화 항체 및 이종접합 항체, 다중 특이적, 예를 들어, 이중 특이적, 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 이중-scFv, 탠덤 삼중-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어 "항체"는 이의 작용성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위-분류, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함한 임의의 분류 또는 하위-분류의 항체를 포함하여 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원-결합 부분(Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv))일 수 있다. 기타 구현예에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 특히 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되고, 보다 특히, IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파 또는 람다, 특히 카파로부터 선택된다.
제공된 항체중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편(antibody fragment)"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, 단일 사슬 항체 분자 예컨대 scFv 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대 scFv를 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체가 항원에 결합하는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 각각의 도메인이 4 개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3 개의 CDR을 포함하는 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt 외 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지(2007) 참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 분리되어 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참조.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 표적화될 세포 또는 질병의 암 마커 또는 세포 표면 항원, 예컨대 종양 세포 또는 암 세포, 예컨대 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 표적 항원과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백 분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 발생하지 않는 배열, 예컨대 합성 링커, 예를 들어 펩티드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 배열을 포함하는 단편 및/또는 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 단편과 같은 재조합적으로 생성된 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
"인간화된(humanized)" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 "인간화된 형태"는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간화를 겪고, 전형적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시킨 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 향상시키기 위해 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
따라서, 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포 외 부분 및 세포 내 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 1 차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1 차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR과 같은 재조합 수용체, 예컨대 이의 항체 부분은 면역 글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 개질 형태, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부이거나 이를 포함할 수 있는 스페이서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv 및 막 관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 기능한다. 스페이서는 스페이서가 없을 때와 비교하여 항원 결합 후 세포의 반응성을 증가시키는 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 12 개 또는 약 12 개 아미노산 길이이거나 또는 12 개 이하의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 약 10 내지 229 개 이상의 아미노산, 약 10 내지 200 개의 아미노산, 약 10 내지 175 개의 아미노산, 약 10 내지 150 개의 아미노산, 약 10 내지 125 개의 아미노산, 약 10 내지 100 개의 아미노산, 약 10 내지 75 개의 아미노산, 약 10 내지 50 개의 아미노산, 약 10 내지 40 개의 아미노산, 약 10 내지 30 개의 아미노산, 약 10 내지 20 개의 아미노산 또는 약 10 내지 15 개의 아미노산을 갖는 스페이서를 포함하고 임의의 나열된 범위의 종점 사이에 있는 임의의 정수를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12 개 이하의 아미노산, 약 119 개 이하의 아미노산 또는 약 229 개 이하의 아미노산을 갖는다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서는 문헌[Hudecek 외 (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID 번호: 133에 제시된 서열을 가지며, SEQ ID 번호: 134에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID 번호: 135에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID 번호: 136에 제시된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부는 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID 번호: 137에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 SEQ ID 번호: 133, 135, 136 및 137 중 어느 하나와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 통한 활성화를 모방하는 신호 성분과 같은 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분에 연결된다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막 관통 및 세포 내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 막 관통 도메인은 세포 외 도메인에 융합된다. 일 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR 내의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관된 막 관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막 관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 같거나 상이한 표면 막 단백질의 막 관통 도메인과 상기 도메인의 결합을 피하기 위해 선택되거나 아미노산 치환에 의해 개질된다.
일부 구현예에서, 막 관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서 도메인은 임의의 막-결합 또는 막 관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래 된 것(즉, 적어도 막 관통 영역(들)을 포함)을 포함한다. 대안적으로 일부 구현예에서 막 관통 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막 관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿은 합성 막 관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막 관통 도메인(들)에 의한 것이다.
세포 내 신호 전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합된 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호가 모방되거나 비슷한 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 2 내지 10 개 아미노산 길이의 링커 예컨대 글리신 및 세린을 함유하는 링커, 예를 들어 글리신-세린 더블릿이 CAR의 막 관통 도메인 및 세포질 신호 전달 도메인 사이에 존재하거나 연결을 형성한다.
수용체, 예를 들어, CAR은 일반적으로 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포 내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, CAR의 항원-결합 도메인은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막 관통 도메인, CD3 세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR은 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 결찰시, CAR의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호 전달 영역은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 이펙터 기능 또는 반응 중 하나 이상을 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 세포 용해 활성 또는 T-보조 세포 활성과 같은 T 세포의 기능, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동 자극 분자의 세포 내 신호 전달 영역의 절단된 부분은, 예를 들어 그것이 이펙터 기능 신호를 형질 도입하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포 내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포 내 신호 전달 영역은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 또한 항원 수용체 개입 후 신호 전달을 시작하기 위한 상기 수용체와 함께 자연 맥락에서 작용하는 공수용체의 서열 및/또는 상기 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 같은 기능적 수용력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
자연적인 TCR의 맥락에서, 완전 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공자극 신호도 필요로 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 완전 활성화를 촉진하기 위해, 2 차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분이 CAR에 또한 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 CAR은 같은 세포에서 발현되고 2 차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 측면에서 T 세포 활성화는 2 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통해 항원-의존적 1 차 활성화를 개시하는 것(1 차 세포질 신호 전달 서열) 및 2 차 또는 공자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존적 방식으로 작용하는 것(2 차 세포질 신호 전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 기술된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1 차 활성화를 조절하는 1 차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1 차 세포질 신호 전달 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 1 차 세포질 신호 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 또는 CD3 제타, FcR 감마 또는 FcR 베타로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내의 세포질 신호 전달 분자(들)는 세포질 신호 전달 도메인, 이의 부분 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, CAR은 공자극 수용체 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS의 신호 전달 영역 및/또는 막 관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 같은 CAR은 신호 전달 영역 및 공자극 성분 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 전달 영역은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극 CAR 및 공자극 CAR, 같은 세포상에서 발현된 둘 다를 포함한다(참조 WO2014/055668).
특정 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 CD28 막 관통 및 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포 내 도메인에 연결된 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에 있는 하나 이상, 예를 들어, 2 개 이상의, 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어, 1 차 활성화 도메인을 포괄한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포 내 성분을 포함한다.
일부 경우에, CAR은 1 세대, 2 세대 및/또는 3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제 1 세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 신호만을 제공하는 것; 일부 측면에서, 제 2 세대 CAR은 상기 신호 및 공자극 신호, 예컨대 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 제공하는 것; 일부 측면에서, 제 3 세대 CAR은 일부 측면에서 상이한 공자극 수용체의 다수의 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편을 함유하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편을 함유하는 세포 외 부분 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일 도메인 VH 항체를 포함하고 세포 내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 측면에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호 전달 영역 사이에 배치된 막 관통 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 막 관통 도메인은 CD28의 막 관통 부분을 함유한다. 세포 외 도메인 및 막 관통은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 외 도메인 및 막 관통은 본 명세서에 기재된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 막 관통 도메인과 세포 내 신호 전달 도메인 사이와 같은 T 세포 공자극 분자의 세포 내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28의 막 관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 이를 함유하는 막 관통 도메인 및 CD28의 신호 전달 부분 또는 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호 전달 도메인 및 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28의 막 관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 이를 함유하는 막 관통 도메인 및 4-1BB의 신호 전달 부분 또는 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호 전달 도메인 및 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 예컨대 힌지만의 스페이서를 함유하는 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어, CAR의 막 관통 도메인은 인간 CD28의 막 관통 도메인 또는 이의 변이체, 예를 들어, 인간 CD28의 27 개의 아미노산 막 관통 도메인(수탁 번호: P10747.1)이거나 또는 SEQ ID 번호: 138에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 138과 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막 관통 도메인이거나; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 함유하는 막 관통 도메인은 SEQ ID 번호: 139에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성 또는 약 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포 내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 인간 CD28의 세포 내 공자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능성 변이체 또는 일부, 예컨대 이의 41 개 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL이 GG로 치환된 상기 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 SEQ ID 번호: 140 또는 141에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 140 또는 141과 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 내 영역은 4-1BB의 세포 내 공자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부, 예컨대 인간 4-1BB의 42-아미노산 세포질 도메인(수탁 번호 Q07011.1) 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부, 예컨대 SEQ ID 번호: 142에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 142와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 미국 특허 번호: 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993에 기재된 바와 같은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 SEQ ID 번호: 143, 144 또는 145에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 143, 144 또는 145와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 오직 IgG의 힌지 영역, 예컨대 오직 IgG4 또는 IgG1의 힌지, 예컨대 SEQ ID 번호: 133에 제시된 힌지만의 스페이서를 함유한다. 기타 구현예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예를 들어, SEQ ID 번호: 135에 제시된 것과 같은 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예를 들어, SEQ ID 번호: 136에 제시된 것과 같은 CH3 도메인에만 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린이 많은 서열 또는 기타 가요성 링커 예컨대 공지된 가요성 링커이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 다른 항원 수용체는 세포 표면 마커와 같은 마커를 추가로 포함하며, 이는 수용체, 예컨대 절단된 EGFR(tEGFR)과 같은 세포 표면 수용체의 절단된 형태를 발현하는 세포의 형질 도입 또는 조작을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 일부 측면에서, 마커는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단된 형태)를 포함한다. 특정 구현예에서, tEGFR은 SEQ ID 번호: 147 또는 148에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, tEGFR은 SEQ ID 번호: 147 또는 148에 제시된 서열과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 약 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상 또는 99 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 링커 서열, 예컨대 절단 가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A를 암호화하는 폴리 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커 및 선택적으로 링커 서열은 공개 특허 출원 번호 WO2014031687에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 T2A 절단 가능한 링커 서열과 같은 링커 서열에 선택적으로 연결된 절단된 EGFR(tEGFR)일 수 있다.
핵산 분자가 2 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 특정 경우에, 폴리펩티드 사슬 각각은 별개의 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 별개의 핵산이 제공되며, 각각은 세포에서의 발현을 위해 개별적으로 세포 내로 전달되거나 도입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 제 1 및 제 2 핵산 서열을 함유하는 것과 같은 일부 구현예에서, 상이한 폴리펩티드 사슬 각각을 암호화하는 코딩 서열은 같거나 상이할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 2 개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬의 발현을 유도하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다중시스트론(이중시스트론(bicistronic) 또는 삼중시스트론(tricistronic), 예를 들어 미국 특허 번호 6,060,273 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 단위는 IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 이중시스트론 단위로서 조작될 수 있으며, 이는 단일 프로모터로부터의 정보에 의해 유전자 산물의 공발현(예를 들어, PSMA 또는 이의 개질 형태를 암호화하고 재조합 수용체를 암호화)을 가능하게 한다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에서, 자체 절단 펩티드(예를 들어, 2A 서열)를 암호화하는 서열 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 푸린)에 의해 서로 분리되어 있는 2 개 또는 3 개의 유전자(예를 들어, PSMA 또는 이의 개질 형태를 암호화하고 재조합 수용체를 암호화)를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서 ORF는 번역 중(2A의 경우) 또는 후에 개별 단백질로 프로세싱되는 단일 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩티드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 건너뛰게하는(리보솜 건너뛰기) 원인이 될 수 있으며, 2A 서열의 말단과 다음 펩티드 하류 사이의 분리를 유도한다(예를 들어, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13(2004) 및 deFelipe 외 Traffic 5:616-626 (2004) 참조). 다양한 2A 요소가 공지되어 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템에서 이용될 수 있는 2A 서열의 예는 미국 특허 공개 번호 20070116690에 기재된 바와 같이 비제한적으로 구제역 질병 바이러스로부터의 2A 서열(F2A, 예를 들어, SEQ ID 번호: 32), 말 비염 바이러스(E2A, 예를 들어, SEQ ID 번호: 153), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(T2A, 예를 들어, SEQ ID 번호: 146 또는 149) 및 돼지테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, SEQ ID 번호: 151 또는 152)가 있다.
2. T 세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, 종양 항원, 바이러스 또는 자가면역 단백질과 같은 표적 폴리펩티드의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원-결합 부분을 발현하는 조작된 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 이의 항원-결합 부분을 함유하는 분자이며, 이는MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되며, 여기서 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것이 일반적이다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 완전한 TCR뿐만 아니라 이의 항원-결합 부분 또는 그의항원-결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하여 온전한 또는 전장의 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR 미만이지만 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 것과 같은 MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, 그러나 전체 TCR이 결합하는 MHC-펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 주요 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 이의 조합은 주어진 TCR 분자의 모든 또는 실질적으로 모든 항원-결합 부위를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 프레임 워크 영역(FR)에 의해 분리되며, 이는 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 사이에서 덜 가변성을 나타낸다(예를 들어, Jores 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia 외, EMBO J. 7:3745, 1988 참조; Lefranc 외, Dev. Comp. Immunol., 27:55, 2003 또한 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식을 위해 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 프로세싱된 펩티드 부분과의 상호 작용을 위해 주어진 TCR 가변 영역상의 3 개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩타이드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 인식을 담당하는 주요 CDR이거나 이에 가장 크게 기여한다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가의 초 가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초 항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막 관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, Janeway 외, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막 관통 영역 및 C-말단 끝에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련된다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예를 들어, α-사슬 또는 β-사슬)의 세포 외 부분은 2 개의 면역글로불린 유사 도메인, 예컨대 가변 도메인(예를 들어, Vα 또는 Vβ; 전형적으로 Kabat 넘버링[Kabat 외, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.]에 기초한 1 내지 116 개의 아미노산)및 세포막에 인접한 불변 도메인(예를 들어, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 Cβ, 전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2 개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포 외 부분은 2 개의 막-근위 불변 도메인 및 2 개의 막-원위 가변 도메인을 함유하며, 가변 도메인은 각각 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 TCR의 두 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어, TCR은 불변 도메인에서 2 개의 이황화 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막 관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막 관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 상기 구조는 TCR이 CD3 및 이의 서브 유닛과 같은 다른 분자와 회합되도록 한다. 예를 들어, 막 관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시키고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호 전달 서브 유닛(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포 내 꼬리는 TCR 복합체의 신호 전달 능력에 관여하는 하나 이상의 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2 개의 사슬 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나 단일 사슬 TCR 구조물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예컨대 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2 개의 별개 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, TCR은 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 이용될 수 있는 Vα, β 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있다. 세포 공급원으로부터 V 사슬 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 얻는 방법은 잘 알려져있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 주어진 세포 또는 세포들로부터 분리되거나 내에서 TCR-암호화 핵산의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성과 같은 다양한 공급원으로부터 수득될 수있다.
일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포 독성 T 세포)와 같은 세포, T-세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 이용 가능한 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T-세포는 생체 내 분리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선에서 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 신에피토프-한정 TCR이다. 일부 구현예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩티드 항원 또는 이의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ의 레퍼토리의 증폭에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4 + 또는 CD8 + 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 정상의 건강한 대상체의 T 세포 공급원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 병에 걸린 대상체의 T 세포 공급원, 즉 병에 걸린 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 중첩 프라이머는 인간으로부터 얻은 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의해 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 생성물이 링커에 의해 분리되도록 클로닝되거나 조합되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조합될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립 유전자-특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이 유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 돌연변이 유발에 의한 것과 같은 지시된 진화에 영향을 받는다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 T 세포는 예컨대 펩티드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 스크리닝함으로써 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에 존재하는 TCR은 예컨대 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화도 또는 친화력에 의해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 개질 또는 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 지시된 진화 방법은 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 더 높은 친화력과 같은 변경된 특성을 갖는 TCR을 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 지시된 진화는 효모 디스플레이(Holler 외 (2003) Nat Immunol., 4, 55-62; Holler 외 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li 외 (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이(Chervin 외 (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근법은 공지된, 부모 또는 참조 TCR을 조작 또는 변경하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은 하나 이상의 CDR 잔기에서 CDR이 돌연변이되는 돌연변이 유발된 TCR을 생성하기 위한 주형 및 원하는 변화된 특성, 예컨대 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 돌연변이체를 선택하기 위한 주형으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 TCR을 생성 또는 생산하는데 사용하기 위한 표적 폴리펩티드의 펩티드는 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩티드는 하기 기재된 표적 폴리펩티드와 같은 관심 표적 폴리펩티드에서 HLA-한정 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 이용 가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에서, MHC 분류 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델에는 ProPred1(Singh 및Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) 및 SYFPEITHI(Schuler 외 (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC-한정 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 대략 39-46 %로 발현되므로, TCR 또는 다른 MHC-펩티드 결합 분자를 제조하는데 사용하기에 적합한 MHC 항원의 선택을 나타낸다.
컴퓨터 예측 모델을 사용하는 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 HLA-A0201-결합 모티프 및 절단 부위는 당업자에게 공지되어 있다. MHC 분류 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델에는 ProPred1(문헌[Singh 및 Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001]에 보다 상세히 기재됨) 및 SYFPEITHI(Schuler 외 SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol. 409(1): 75-93 2007. 참조)이 포함되나 이에 제한되지 않다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생성된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유 동물 중 하나로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포 표면 상에 발현된 세포 결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 문헌[국제 특허 출원 WO 03/020763, 국제 특허 출원 WO 04/033685, 국제 특허 출원 WO 2011/044186]에 기재된 바와 같은 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, TCR은 막 관통 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포의 표면에서 활성 TCR을 생성하는 신호 전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면에서 발현된다.
일부 구현예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제 1 폴리펩티드 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열은 TCR β 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 상응하는 N 말단 서열에 융합된 제 2 폴리펩티드를 함유하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬 간 이황화 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬 간 이황화 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포 외 서열에 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비 천연 이황화 결합 둘 모두가 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하기 위한 막 관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 이량체화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 이량체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 여기서 제 1 및 제 2 이량체화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 함께 연결하는 제 1 이량체화 모티프의 아미노산과 제 2 이량체화 모티프의 아미노산 사이의 공유 결합을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Soo Hoo, W. F. 외 PNAS(USA) 89, 4759(1992); W
Figure pct00003
lfing, C. 및 Pl
Figure pct00004
ckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655(1994); Kurucz, I. 외 PNAS(USA) 90 3830(1993); 국제 공개 PCT 번호 WO 96/13593, 국제 공개 PCT 번호 WO 96/18105, 국제 공개 PCT 번호 WO99/60120, 국제 공개 PCT 번호 WO99/18129, 국제 공개 PCT 번호 WO 03/020763, 국제 공개 PCT 번호 WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. 외 J. Mol. Biol. 256, 859(1996)] 참조. 일부 구현예에서, scTCR은 TCR 사슬의 회합을 용이하게 하는 비-천연 사슬 간 이황화 결합을 함유한다(예를 들어 국제 공개 PCT 번호 WO 03/020763 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 C-말단에 융합된 이종 류신 지퍼가 사슬 회합을 용이하게 하는 비-이황화 결합 절단 TCR이다(예를 들어 국제 공개 PCT 번호 WO99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유한다(예를 들어, 국제 공개 PCT 번호 WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포 외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 2 분절 및 제 2 분절의 N 말단에 제 1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 1 분절 및 β 사슬 세포 외 불변 서열 및 막 관통 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 2 분절 및 선택적으로 제 2 분절의 N 말단에 제 1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 1 분절 및 α 사슬 세포 외 불변 서열 및 막 관통 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 2 분절 및 선택적으로 제 2 분절의 N 말단에 제 1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 TCR 분절을 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어 화학식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산이 글리신 및 세린인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 분절은 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제 1 분절의 C 말단과 제 2 분절의 N 말단 또는 그 반대의 경우 사이의 거리에 걸쳐서 충분한 길이를 갖지만 표적 리간드에 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 10 내지 45 개 또는 약 10 내지 45 개의 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개의 아미노산 또는 26 내지 41 개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG- (SGGGG)5-P-를 가지며, 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이고, S는 세린이다(SEQ ID 번호: 28). 일부 구현예에서, 링커는 GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID 번호: 29)서열을 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬 간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 scTCR 폴리펩티드의 제 1 및 제 2 분절의 불변 영역 세포 외 서열에 편합될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화 결합 둘 모두가 바람직할 수 있다.
도입 된 사슬 간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 다른 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 제 1 및 제 2 분절 상의 비시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비천연 이황화 결합은 국제 공개 PCT 번호 WO2006/000830에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 단편은 10-5 내지 10-12 M 또는 약 10-5 내지 10-12 M 및 그 안의 모든 개별 값 및 범위의 표적 항원에 대한 평형 결합 상수를 갖는 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩티드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은 TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적합한 수단에 의해 증폭될 수 있고 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질 전환 또는 형질 감염시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같은 번식 및 증폭 또는 발현 또는 둘 다를 위해 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈(Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 또는 pEX 시리즈(Clontech, Palo Alto, Calif.) 중의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있고 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터가 이용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 벡터가 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지를 고려하고, 벡터가 도입될 숙주의 유형(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분(또는 다른 MHC-펩티드 결합 분자)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 비 천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비 바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 기타 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬은 관심 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 분리되고 발현 벡터로 클로닝된 총 cDNA로부터 PCR 증폭된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 같은 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 벡터로 편입된다.
C. 세포로 핵산 및 벡터의 도입
유전자 조작된 성분, 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR의 도입을 위한 다양한 방법이 잘 알려져 있으며 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비바이러스 벡터 또는 트랜스포존 예를 들어 슬리핑 뷰피 트랜스포존 시스템을 포함하는 폴리펩티드 또는 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다. 유전자 전달 방법은 형질 도입, 전기 천공법 또는 세포 내로 유전자 전달을 초래하는 다른 방법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 세포를 먼저 자극함으로써, 예컨대 활성화된 세포의 형질 도입 후 예를 들어 사이토카인 또는 활성 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같이 증식, 생존 및/또는 활성화 및 임상 적용에 충분한 수로 배양에서의 증폭과 같은 반응을 유도하는 자극과 세포를 조합함으로써 달성된다.
일부 맥락에서, 자극 인자(예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인)의 과다 발현이 잠재적으로 원치 않는 결과를 초래하거나 대상체에서 독성과 관련된 인자와 같은 대상체에서 보다 낮은 효능을 초래할 수 있는 가능성을 방지하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 맥락에서, 조작된 세포는 입양 면역 요법으로 투여될 때와 같은, 생체 내에서 음성 선택에 세포를 민감하게 하는 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 이들이 투여되는 환자의 생체 내 상태의 변화의 결과로서 제거될 수 있도록 조작된다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여된 제제, 예를 들어 화합물에 대한 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 가능한 유전자는 간시클로비르(ganciclovir) 민감성을 부여하는 단순 포진 바이러스 유형 I 티미딘키나제(HSV-1 TK) 유전자(Wigler 외, Cell 2 : 223, I977); 세포성 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자, 박테리아 시토신 데아미나제(Mullen 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어, T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산으로 증폭 중 또는 후에 형질 감염될 수 있다. 원하는 폴리펩티드 또는 수용체의 유전자 도입을 위한 상기 형질 감염은 레트로바이러스 벡터를 통한 것을 포함하여 임의의 적합한 유전자-기반 전달 시스템으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포 집단은 예를 들어 제공된 방법에 따르는 것과 같은 새로 도입된 수용체를 통해 항원 자극으로 공동으로, 동시에 또는 후속으로 자극될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 입자, 예를 들어 비드 상에 존재하는 결합 분자는 유전자 도입 수용체의 동질(가교) 항원 또는 리간드(예를 들어 CAR의 천연 리간드) 또는 재조합 수용체에 직접 결합하거나 인식하는 항이디오타입 항체의 형태로 제공되는 것과 같은 항원 자극을 제공한다.
추가의 핵산 중에서, 예를 들어 도입을 위한 유전자는 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써와 같은 요법의 효능을 개선시키는 것; 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 것과 같은 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; 예를 들어, 문헌[Lupton S. D. 외, Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell 외, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 세포를 생체 내 음성 선택에 민감하게 만들어 안전을 개선시키는 유전자이다. 또한 우세한 양성 선택 가능한 마커를 음성 선택 가능한 마커와 융합시키는 것으로부터 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[Lupton 외에 의한 국제 특허 출원 번호 PCT/US91/08442 및PCT/US94/05601] 참조. 예를 들어, Riddell 외, 미국 특허 번호 6,040,177, 14-17 열 참조.
상기 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 세포는 유전적 조작과 관련하여 인큐베이션 및/또는 배양되거나 유전적 조작 전에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 배양균, 자극, 활성화, 번식 및/또는 보존 예를 들어 냉동 보존을 위한 동결을 포함할 수 있다.
1. 바이러스 벡터 입자
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 예를 들어 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어, Koste 외 (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 외 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 외 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 외, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557. 참조).
일부 구현예에서, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)을 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유 동물 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 양쪽성이며, 이는 인간을 포함하여 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기재되었다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller 및 Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 외 (1991) Virology 180:849-852; Burns 외 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
렌티바이러스 형질 도입 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이 문헌[예를 들어, Wang 외 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 외 (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 외 (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri 외 (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유래된 것과 같은 레트로바이러스 게놈 기반 벡터로부터 유래된 게놈을 함유한다. 제공된 바이러스 벡터의 일부 측면에서, CAR과 같은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산은 벡터 게놈의 5 'LTR 및 3' LTR 서열 사이에 함유되고/거나 위치된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 렌티바이러스 게놈, 예컨대 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 약독화 독성 유전자를 증가시켜 생성되었으며, 예를 들어 env, vif, vpu 및 nef 유전자는 결실될 수 있어 치료 목적을 위해 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터가 공지되어 있다. 문헌[Naldini 외, (1996 and 1998); Zufferey 외, (1997); Dull 외, 1998, 미국 특허 번호 6,013,516; 및 5,994,136) 참조. See Naldini 외, (1996 및 1998); Zufferey 외, (1997); Dull 외, 1998, 6,013,516; 및 5,994,136). 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터들은 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산을 통합하고, 선별하고, 핵산을 숙주 세포 내로 전달하기 위해 필수 서열을 보유하도록 구성된다. 공지된 렌티바이러스는 American Type Culture Collection("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)과 같은 기탁 기관 또는 수집물로부터 쉽게 얻거나 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 공지된 출처로부터 분리할 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 비제한적 예는 렌티바이러스, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV-1), HIV-2, 시미안 면역 결핍 바이러스(SIV), 인간 T-림프친화바이러스 1(HTLV- 1), HTLV-2 또는 말 감염 빈혈 바이러스(E1AV)를 포함한다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 약독화 HIV 독성 유전자를 증가시켜 생성되었으며, 예를 들어 env, vif, vpr, vpu 및 nef 유전자는 결실되어 치료 목적을 위해 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 문헌[Naldini 외, (1996 및 1998); Zufferey 외, (1997); Dull 외, 1998, 미국 특허 번호 6,013,516; 및 5,994,136] 참조. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터들은 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산을 통합하고, 선별하고, 핵산을 숙주 세포 내로 전달하기 위해 필수 서열을 보유하도록 구성된다. 공지된 렌티바이러스는 American Type Culture Collection("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)과 같은 기탁 기관 또는 수집물로부터 쉽게 얻거나 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 공지된 출처로부터 분리할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 게놈 벡터는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스의 5' 및 3' LTR 서열을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 게놈 구조물은 렌티바이러스의 5' 및 3' LTR로부터의 서열을 함유할 수 있고, 특히 렌티바이러스의 5' LTR로부터의 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스의 불활성화 또는 자가-불활성화 3' LTR을 함유할 수 있다. LTR 서열은 임의의 종으로부터의 임의의 렌티바이러스로부터의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, 이들은 HIV, SIV, FIV 또는 BIV로부터의 LTR 서열일 수 있다. 전형적으로, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 HIV 바이러스 벡터의 핵산은 추가 전사 단위가 없다. 벡터 게놈은 불활성화 또는 자가-불활성화 3' LTR을 함유할 수 있다(Zufferey 외 J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi 외, J Virol 72:8150, 1998). 예를 들어, 바이러스 벡터 RNA를 생산하는데 사용된 핵산의 3' LTR의 U3 영역에서의 결실은 자가-불활성화(SIN) 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 이어서 상기 결실은 역전사 동안 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전달될 수 있다. 자가-불활성화 벡터는 일반적으로 3' 긴 말단 반복(LTR)으로부터 인핸서 및 프로모터 서열의 결실을 가지며, 이는 벡터 통합 동안 5' LTR로 복사된다. 일부 구현예에서, LTR의 전사 활성을 제거하기 위해 TATA 박스의 제거를 포함하여 충분한 서열이 제거될 수 있다. 이는 형질 도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 방지할 수 있다. 일부 측면에서, 3' LTR의 U3 요소는 인핸서 서열, TATA 박스, Sp1 및 NF-카파 B 부위의 결실을 함유한다. 자가-불활성화 3' LTR의 결과, 진입 및 역전사 후에 생성된 프로바이러스는 불활성화된 5' LTR을 함유한다. 이는 벡터 게놈의 이동 위험 및 근처의 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향을 감소시킴으로써 안전성을 개선시킬 수 있다. 자가-불활성화 3' LTR은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 벡터 역가 또는 벡터의 시험관 내 또는 생체 내 특성에 영향을 미치지 않는다.
선택적으로, 렌티바이러스 5' LTR로부터의 U3 서열은 이종 프로모터 서열과 같은 바이러스 구조물에서 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 패키징 세포주로부터 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열이 또한 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 사용될 수 있다. 일 예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다(미국 특허 번호 5,385,839 및 미국 특허 번호 5,168,062).
특정 구현예에서, 삽입 돌연변이 유발의 위험은 통합 결함이 있도록 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 게놈을 구축함으로써 최소화될 수 있다. 비통합 벡터 게놈을 생산하기 위해 다양한 접근법이 추구될 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 pol 유전자의 인테그라제 효소 성분에서 조작되어 불활성 인테그라제를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈 자체는 예를 들어 하나 또는 두 개의 부착 부위를 돌연변이 또는 결실시키거나 결실 또는 변형을 통해 3' LTR-근위 폴리푸린 트랙(PPT)을 기능하지 않게 함으로써 통합을 방지하도록 개질될 수 있다. 일부 구현예에서, 비유전적 접근법이 이용 가능하고; 이는 인테그라제의 하나 이상의 기능을 억제하는 약리학적 제제를 포함한다. 상기 접근법은 상호 배타적이지 않다. 즉, 한 번에 이들 중 하나 이상을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인테그라제와 부착 부위가 작동하지 않거나 인테그라제와 PPT 부위가 작동하지 않거나 부착 부위와 PPT 부위가 작동하지 않거나 이들 모두가 작동하지 않을 수 있다. 상기 방법 및 바이러스 벡터 게놈은 공지되어 있고 이용 가능하다(Philpott 및 Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman 외 J Virol 69:2729, 1995; Brown 외 J Virol 73:9011 (1999); 국제 특허 출원 WO 2009/076524; McWilliams 외, J Virol 77:11150, 2003; Powell 및 Levin J Virol 70:5288, 1996 참조).
일부 구현예에서, 벡터는 원핵 세포 숙주 세포와 같은 숙주 세포에서의 번식을 위한 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 핵산은 박테리아 세포와 같은 원핵 세포에서 번식을 위한 하나 이상의 복제 기점을 함유한다. 일부 구현예에서, 원핵 세포 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 부여하는 유전자를 함유할 수 있다.
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주로 형질 감염될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 만드는데 두 가지 이상의 성분: 첫째, 바이러스 벡터 입자를 생성하는데 필요한 구조적 단백질뿐만 아니라 효소를 포괄하는 패키징 플라스미드 및 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질이 관여한다. 상기 성분 중 하나 또는 둘 모두의 설계시 생물 안전 보호 장치를 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는 외피 단백질 이외의 단백질인 HIV-1과 같은 모든 레트로바이러스를 함유할 수 있다(Naldini 외, 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 추가적인 바이러스 유전자, 예컨대 독성과 관련된 것들, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 HIV의 1 차 전사촉진자인 Tat가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV-기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 모 바이러스의 3 가지 유전자: gag, pol 및 rev만을 포함하며, 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주 내로 바이러스 벡터 게놈이 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은 관심 대상의 하나 이상의 서열, 예를 들어 재조합 핵산 이외에 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나 일부 측면에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자가 제거되고 패키징 세포주에서 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질 감염된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 LTR, 시스-작용 패키징 서열 및 관심 서열, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스 효소 및/또는 구조적 성분, 예컨대 Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 포함하는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드로 형질 감염된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전자 성분을 선별하기 위해 다수의 벡터가 이용된다. 일부 상기 구현예에서, 패키징 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 적격 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건의 가능성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 위형화되어 숙주 세포의 형질 도입 효율을 증가시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 VSV-G 당단백질로 위형화되며, 이는 형질 도입될 수 있는 세포 유형을 확장시키는 넓은 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 친이종, 다열성 또는 양쪽성 외피, 예컨대 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피, GALV 또는 VSV-G를 포함하는 것과 같은 비-천연 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드로 형질 감염된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 트랜스로 필요한 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 작용성 렌티바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주는 293(ATCC CCL X), 293T, HeLA(ATCC CCL 2), D17(ATCC CCL 183), MDCK(ATCC CCL 34), BHK(ATCC CCL-10) 및 Cf2Th(ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 단백질(들)을 안정적으로 발현한다. 예를 들어, 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 다른 구조적 유전자를 함유하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포주가 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 이종 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피 당단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질 감염될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼 플라스미드는 형질 감염 또는 감염을 통해 패키징 세포주 내로 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 벡터 입자를 생산한다. 형질 감염 또는 감염 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산 칼슘, DEAE-덱스트란 및 리포펙션 방법, 전기 천공법 및 미세 주입법이 포함된다.
재조합 플라스미드 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열이 특별한 세포주 에 도입(예를 들어, 인산 칼슘 침전에 의함)될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징되도록 할 수 있고 이는 이 후에 배양 배지로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 선택적으로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 패키징 플라스미드 및 전달 벡터를 패키징 세포주로 공동 형질 감염시킨 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되고 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 형질 감염되고/거나 gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질 감염되고/거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 VSV-G와 같은 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질 감염되고/거나 이를 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 세포, 예를 들어 HEK 293T 세포의 형질 감염 후 대략 2 일 후, 세포 상청액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 함유하고, 이는 회수되고 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질 도입하는데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 이입되고, 숙주 게놈으로 안정적으로 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1 일 또는 2 일 후에, 재조합 단백질, 예를 들어 CAR과 같은 항원 수용체의 발현이 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 복수의 세포를 포함하는 세포 조성물을 바이러스 입자와 접촉, 예를 들어 인큐베이션함으로써 세포를 형질 도입시키는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 형질 감염 또는 형질 도입될 세포는 대상체로부터 농축되고/거나 선택된 세포와 같은 대상체로부터 수득된 1 차 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물의 형질 도입될 세포의 농도는 1.0 x 105 세포/mL 내지 1.0 x 108 세포/mL 또는 약 1.0 x 105 세포/mL 내지 1.0 x 108 세포/mL, 예컨대 1.0 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL 이상 또는 약 1.0 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL 이상 또는 약 1.0 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL이다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 형질 도입될 세포의 총 수 당(IU/세포) 바이러스 벡터 입자 카피 또는 이의 감염단위(IU)의 특정 비율로 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 접촉 중에 하나의 세포 당 바이러스 벡터 입자 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 IU 또는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 IU 또는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 IU 이상 또는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 IU로 존재한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가는 1 x 106 IU/mL 내지1 x 108 IU/mL 또는 약 1 x 106 IU/mL 내지1 x 108 IU/mL, 예컨대 5 x 106 IU/mL 내지 및 5 x 107 IU/mL 또는 약 5 x 106 IU/mL 내지 및 5 x 107 IU/mL, 예컨대 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL 또는 5 x107 IU/mL 이상이다.
일부 구현예에서, 형질 도입은 100 미만, 예컨대 일반적으로 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 이하의 감염다중도(MOI)에서 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 세포를 바이러스 입자와 접촉 또는 인큐베이션시키는 것을 수반한다. 일부 구현예에서, 접촉은 30 분 내지 72 시간, 예컨대 30 분 내지 48 시간, 30 분 내지 24 시간 또는 1 시간 내지 24 시간, 예컨대 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간 이상 또는 적어도 약 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간 이상 동안이다.
일부 구현예에서, 접촉은 용액에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포와 바이러스 입자는 0.5 mL 내지 500 mL 또는 약 0.5 mL 내지 500 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 200 mL, 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 0.5 mL 내지 5 mL, 5 mL 내지 500 mL, 5 mL 내지 200 mL, 5 mL 내지 100 mL, 5 mL 내지 50 mL, 5 mL 내지 10 mL, 10 mL 내지 500 mL, 10 mL 내지 200 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 50 mL 내지 500 mL, 50 mL 내지 200 mL, 50 mL 내지 100 mL, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 200 mL 또는 200 mL 내지 500 mL 또는 약 0.5 mL 내지 200 mL, 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 0.5 mL 내지 5 mL, 5 mL 내지 500 mL, 5 mL 내지 200 mL, 5 mL 내지 100 mL, 5 mL 내지 50 mL, 5 mL 내지 10 mL, 10 mL 내지 500 mL, 10 mL 내지 200 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 50 mL 내지 500 mL, 50 mL 내지 200 mL, 50 mL 내지 100 mL, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 200 mL 또는 200 mL 내지 500 mL의 부피에서 접촉된다.
일부 구현예에서, 접촉이 원심 분리, 예컨대, 회전식 접종(예를 들어, 원심분리 접종)으로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물은 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도 예컨대 600 rpm 내지 1700 rpm 또는 약 600 rpm 내지 1700 rpm(예를 들어, 600 rpm, 1000 rpm 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm, 또는 약 600 rpm, 1000 rpm 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm 또는 600 rpm, 1000 rpm 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm 이상)과 같은 세포를 펠릿화하기 위해 사용된 것보다 더 낮은 속도로 회전될 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 공동의 내부 또는 외부 벽에서 측정된 바와 같이 100 g 내지 3200 g 또는 약 100 g 내지 3200 g(예를 들어, 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g 또는 약 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g 또는 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g 이상 또는 약 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g)의 힘, 예를 들어, 상대적인 원심력에서 수행된다. 상기 용어 "상대적인 원심력(relative centrifugal force)" 또는 RCF는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간의 특정 지점에서 지구의 중력에 대한 물체 또는 물질(예를 들어, 세포, 샘플 또는 펠릿 및/또는 챔버 또는 다른 용기의 회전점)에 부여된 유효 힘으로 이해된다. 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(RCF가 측정되는 회전축과 물체, 물질 또는 입자로부터의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 투입 세포는 바이러스 DNA에 의해 암호화되는 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자를 포함하는 입자, 예를 들어 비드와 처리, 인큐베이션 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자와 세포의 인큐베이션은 바이러스 벡터 입자로 형질 도입된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하거나 생산한다.
2. 비바이러스 벡터
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기 천공법을 통해 T 세포 내로 전달된다(예를 들어, Chicaybam 외, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo 외 (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포 내로 전달된다(예를 들어, Manuri 외 (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 외 (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang 외 (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). 면역 세포에서 유전 물질을 도입 및 발현시키는 다른 방법은 인산 칼슘 형질 감염(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.]에 기재된 바와 같음), 원형질 융합, 양이온 리포좀-매개 형질 감염; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공침전(Brash 외, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
재조합 산물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 기타 접근법 및 벡터는 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원, 공개 번호: WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 트랜스포존을 통해 T 세포 내로 전달된다. 트랜스포존(전이 인자)은 게놈 내에서 한 유전자좌에서 다른 유전자좌로 이동할 수 있는 DNA의 이동 가능한 분절이다. 상기 요소는 보수적인 "잘라 내기 및 붙여 넣기" 메커니즘을 통해 이동한다: 전위효소는 트랜스포존의 원래 위치에서 절제를 촉매하고 게놈의 다른 곳에서 재통합을 촉진한다. 전위효소가 다른 전위효소 유전자에 의해 제공된다면, 전위효소 결핍 요소가 이동될 수 있다. 따라서, 트랜스포존은 바이러스 형질 도입 시스템을 사용하지 않고 외래 DNA를 숙주 게놈 내로 편입하기 위해 이용될 수 있다. 포유 동물 세포, 예를 들어 인간 1 차 백혈구와 함께 사용하기에 적합한 트랜스포존의 예는 슬리핑 뷰티 및 피기박(Piggybac)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
트랜스포존-기반 형질 감염은 전위효소 및 트랜스포존으로 구성된 2-성분 시스템이다. 일부 구현예에서, 시스템은 동반되는 전위효소에 의해 인식되는 역반복/직접 반복(IR/DR) 서열에 의해 측면 위치된 외래 DNA(본 명세서에서 카고 DNA로도 지칭), 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하도록 조작된 트랜스포존을 포함한다. 일부 구현예에서, 비바이러스 플라스미드는 프로모터의 제어 하에 전위효소를 암호화한다. 숙주 세포 내로의 플라스미드의 형질 감염은 전위효소의 일시적 발현을 초래하므로, 형질 감염 후 초기 기간 동안, 전위효소는 게놈 DNA 내로 트랜스포존을 통합시키기에 충분한 수준으로 발현된다. 일부 구현예에서, 전위효소 자체는 게놈 DNA에 통합되지 않으므로, 전위효소의 발현은 시간이 지남에 따라 감소한다. 일부 구현예에서, 전위효소 발현은 상응하는 트랜스포존을 약 4 시간 미만, 약 8 시간 미만, 약 12 *?*시간 미만, 약 24 시간 미만, 약 2 일 미만, 약 3 일 미만, 약 4 일 미만, 약 5 일 미만, 약 6 일 미만, 약 7 일 미만, 약 2 주 미만, 약 3 주 미만, 약 4 주 미만, 약 주 미만, 또는 약 8 주 미만 동안 통합하기에 충분한 수준으로 숙주 세포에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 숙주 게놈으로 도입된 카고 DNA는 적어도 숙주가 카고 DNA를 절제할 수 있는 내인성 전위효소를 발현하지 않기 때문에 이 후에 숙주 게놈으로부터 제거되지 않는다.
슬리핑 뷰티(SB)는 연어류 게놈에 보유된 휴면 요소로부터 재구성된 트랜스포존의 Tc/1-마리너 슈퍼패밀리의 합성 구성원이다. SB 트랜스포존-기반 형질 감염은 전위효소 및 TA 디뉴클레오티드에 정확한 통합을 초래하는 역반복/직접 반복(IR/DR) 서열을 함유하는 트랜스포존으로 구성된 2-성분 시스템이다. 트랜스포존은 IR/DR이 측면에 있는 관심있는 발현 카세트로 설계된다. SB 전위효소는 슬리핑 뷰티 트랜스포존의 IR에 위치한 특정 결합 부위에 결합한다. SB 전위효소는 촉매 효소(SB)에 대한 결합 부위를 보유하는 역전된 말단 반복에 의해 양쪽 측면에 위치된 카고 서열을 암호화하는 이동 요소인 트랜스포존의 통합을 매개한다. SB가 잘라 내기 및 붙여 넣기 메커니즘을 통해 TA 표적 디뉴클레오티드에서 척추 동물 염색체에 유전자 서열을 삽입할 때 안정적인 발현이 일어난다. 상기 시스템은 1 차 인간 말초 혈액 백혈구를 포함한 다양한 척추 동물 세포 유형을 조작하는데 사용되어 왔다. 일부 구현예에서, 세포는 카고 유전자, 예를 들어 SB IR 서열에 의해 측면 위치된 재조합 수용체 또는 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 SB 트랜스포존과 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 형질 감염될 세포는 카고 유전자, 예를 들어 SB IR 서열에 의해 측면 위치된 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 SB 트랜스포존을 포함하는 플라스미드와 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 SB IR 서열에 의해 측면 위치되지 않은 SB 전위효소를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.
예시적인 SB IR 서열은 SEQ ID 번호: 26에 의해 제공된다. SB 전위효소를 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열 및 예시적인 SB 전위효소의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID 번호: 24 및 25에 의해 제공된다.
피기백(PB)은 카고 DNA를 숙주, 예를 들어 인간의 게놈 DNA에 통합하는데 사용될 수 있는 또 다른 트랜스포존 시스템이다. PB 전위효소는 트랜스포존의 양쪽 말단에 위치한 PB 트랜스포존-특정 역위 말단 반복 서열(ITR)을 인식하고, 원래 위치로부터 내용물을 효과적으로 이동시키고 이를 TTAA 염색체 부위로 효과적으로 통합시킨다. PB 트랜스포존 시스템은 PB 벡터에서 2 개의 ITR 사이에 관심 유전자가 표적 게놈으로 이동될 수 있게 한다. PB 시스템은 1 차 인간 세포를 포함하여 다양한 척추 동물 세포 유형을 조작하는데 사용되어 왔다. 일부 구현예에서, 형질 감염될 세포는 카고 유전자, 예를 들어, PB IR 서열에 의해 측면 위치된 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 PB 트랜스포존과 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 형질 감염될 세포는 카고 유전자, 예를 들어, PB IR 서열에 의해 측면 위치된 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 PB 트랜스포존을 포함하는 플라스미드와 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 SB IR 서열에 의해 측면 위치되지 않은 SB 전위효소를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.
예시적인 PB IR 서열은 SEQ ID 번호: 27에 예시된다. PB 전위효소를 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID 번호: 28에 예시된다. 예시적인 PB 전위효소의 아미노산 서열은 SEQ ID 번호: 29에 예시된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 트랜스포존/전위효소의 다양한 요소, 예를 들어 SB 또는 PB 벡터(들)는 제한 효소 절단, 결찰 및 분자 클로닝의 표준 방법에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 벡터를 구성하기 위한 하나의 프로토콜은 다음 단계를 포함한다. 먼저, 원하는 성분 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 외부 서열을 함유하는 정제된 핵산 단편은 초기 공급원, 예를 들어 전위효소 유전자를 포함하는 벡터로부터 제한 엔도뉴클레아제로 절단된다. 이어서, 원하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 단편은 통상적인 분리 방법을 사용하여, 예를 들어 아가로스 겔 전기 영동에 의해 상이한 크기의 원치 않는 단편으로부터 분리된다. 원하는 단편은 겔로부터 절제되고, 원하는 서열, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 대상체 벡터의 다양한 요소에 상응하는 서열을 함유하는 원형 핵산 또는 플라스미드가 생산되도록 적절한 배치로 함께 결찰된다. 원하는 경우, 상기 구성된 원형 분자는 이어서 원핵 생물 숙주, 예를 들어 대장균에서 증폭된다. 상기 단계에 수반되는 절단, 플라스미드 구축, 세포 형질 전환 및 플라스미드 생산 절차는 당업자에게 널리 공지되어 있고 제한 및 결찰에 필요한 효소는 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979); T. Maniatis, E. F. Fritsch 및 J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalog 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc 참조). 본 발명의 방법에 사용된 벡터를 구성하는 방법의 예는 하기 실험 섹션에 제공된다. 대표적인 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템의 제조는 또한 국제 특허 출원 WO 98/40510 및 WO 99/25817에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 트랜스포존에 의한 형질 도입은 전위효소 유전자를 포함하는 플라스미드 및 전위효소에 의해 인식되는 역위 반복/직접 반복(IR/DR) 서열에 의해 측면 위치된 카고 DNA 서열을 함유하는 트랜스포존을 포함하는 플라스미드로 수행된다. 특정 구현예에서, 카고 DNA 서열은 이종 단백질, 예를 들어 재조합 T 세포 수용체 또는 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 전위효소 및 트랜스포존을 포함한다. 일부 구현예에서, 전위효소는 편재하는 프로모터 또는 표적 세포에서 전위효소의 발현을 유도하기에 적합한 임의의 프로모터의 제어 하에 있다. 편재하는 프로모터는 EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, 인간 β-액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa 및 U6을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 카고 DNA는 카고 DNA가 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합된 세포의 선택을 허용하는 선택 카세트를 포함한다. 적합한 선택 카세트는 카나마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카베니실린 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자 및 폴리믹신 B 내성 유전자를 암호화하는 선택 카세트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 트랜스포존, 예를 들어 SB 전위효소 및 SB 트랜스포존을 포함하는 플라스미드에 의한 형질 도입을위한 성분이 표적 세포 내로 도입된다. 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있으며, 여기서 상기 프로토콜은 표적 세포의 위치에 따라 시스템 성분을 표적 세포로 시험관 내 또는 생체 내 도입하기 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 분리된 세포인 경우, 시스템은 예를 들어 표준 형질 전환 기술을 사용하여 표적 세포의 생존을 허용하는 세포 배양 조건 하에서 세포로 직접 도입될 수 있다. 상기 기술은 바이러스 감염, 형질 전환, 컨쥬게이션, 원형질 융합, 전기 천공, 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 미세 주사, 바이러스 벡터 전달 및 이와 유사한 것을 포함하지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 방법의 선택은 일반적으로 형질 전환되는 세포의 유형 및 형질 전환이 일어나는 환경(즉, 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내)에 의존한다. 상기 방법들에 대한 일반적인 논의는 문헌[Ausubel, 외, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons,1995]에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, SB 트랜스포존 및 SB 전위효소 공급원은 트랜스포존을 운반하는 벡터로부터 역위 반복 측면 핵산의 절제 및 절제된 핵산을 표적 세포의 게놈 내로 이어서 통합시키기에 충분한 조건 하에서 다세포 유기체, 예를 들어 포유 동물 또는 인간의 표적 세포 내로 도입된다. 일부 구현예는 필수 전위효소 활성이 도입된 트랜스포존과 함께 표적 세포에 존재하는 것을 보장하는 단계를 추가로 포함한다. 트랜스포존 벡터 자체의 구조, 즉 벡터가 전위효소 활성을 갖는 생성물을 코딩하는 영역을 포함하는지 여부에 따라, 방법은 필수 전위효소 활성을 암호화하는 제 2 벡터를 표적 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함 할 수있다.
일부 구현예에서, 트랜스포존을 포함하는 벡터 핵산의 양 및 세포 내로 도입되는 전위효소를 암호화하는 벡터 핵산의 양은 표적 세포 게놈 내로 트랜스포존 핵산의 원하는 절제 및 삽입을 제공하기에 충분한 양이다. 이와 같이, 도입된 벡터 핵산의 양은 충분한 양의 전위효소 활성 및 표적 세포 내로 삽입되기를 원하는 충분한 카피 수의 핵산을 제공해야 한다. 표적 세포 내로 도입되는 벡터 핵산의 양은 사용되는 특정 도입 프로토콜, 예를 들어 사용되는 특정 생체 외 투여 프로토콜의 효율에 따라 변한다.
벡터 DNA가 필수 전위효소와 조합하여 표적 세포로 들어가면, 역위 반복에 의해 측면 위치된 벡터의 핵산 영역, 즉 역위 반복으로 인식된 슬리핑 뷰티 전위효소 사이에 위치된 벡터 핵산이 제공된 전위효소를 통해 벡터로부터 절제되고 표적 세포의 게놈에 삽입된다. 이와 같이, 벡터 DNA의 표적 세포로의 도입은 이어서 전위효소 매개된 절제 및 표적 세포의 게놈으로 벡터에 의해 운반된 외인성 핵산의 삽입이 뒤따른다. 특정 구현예에서, 벡터는 SB 트랜스포존 및/또는 SB 전위효소로 형질 감염된 세포의 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상, 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상, 10 % 이상, 15 % 이상 또는 20 % 이상이 게놈으로 통합된다. 일부 구현예에서, 표적 세포 게놈 내로의 핵산의 통합은 안정적이다, 즉 벡터 핵산은 일시적인 기간 이상 동안 표적 세포 게놈에 존재한 채 유지되며 염색체 유전 물질의 일부에서 표적 세포의 자손으로 전달된다.
특정 구현예에서, 트랜스포존은 다양한 크기의 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드를 표적 세포 게놈에 통합시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 0.1 kb 내지 200 kb, 약 0.5kb 내지 100 kb, 약 1.0 kb 내지 약 8.0 kb, 약 1.0 내지 약 200 kb, 약 1.0 내지 약 10 kb, 약 10 kb 내지 약 50 kb, 약 50 kb 내지 약 100 kb 또는 약 100 kb 내지 약 200 kb 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 1.0 kb 내지 8.0 kb 또는 약 1.0 kb 내지 약 8.0 kb의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0 내지 약 200 kb의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0 kb 내지 약 8.0 kb의 범위이다.
Ⅴ. 검출 및 정량 방법
BCMA-Fc 융합 단백질을 가진 CAR을 발현하는 세포(CAR-발현 세포)를 함유하는 조성물 또는 생물학적 샘플을 접촉시킴으로써 항-BCMA 항체인 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 검출하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 생물학적 샘플에서 세포에 의해 또는 세포 상에서 발현된 CAR과 BCMA-Fc 융합 단백질 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출, 예컨대 상기 결합의 존재 또는 부재 또는 수준을 검출하는 방법을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 검출은 BCMA-Fc 융합으로 결합된 세포를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합은 검출을 위해 직접 또는 간접적으로 표지된다.
일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합 단백질의 BCMA 항원은 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 BCMA의 세포 외 도메인 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 BCMA-Fc 융합 단백질은 CAR에 의해 인식되는 에피토프이거나 이를 함유하는 인간 BCMA의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 함유하는 BCMA 항원을 함유한다. 일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합의 BCMA 항원은 천연 인간 BCMA의 막 관통 도메인 및 세포질 도메인을 함유하지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합의 BCMA 항원은 본래의 인간 BCMA의 세포 외 도메인 또는 이의 일부이거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 이로 구성된다. 일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합 단백질의 BCMA 항원은 SEQ ID 번호: 1과 적어도 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드거나 이를 포함하거나, 일부 경우에 이로 구성되거나 또는 본질적으로 이로 구성되거나 또는 CAR의 항원-결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되거나 인식되는 SEQ ID 번호: 1의 50 개 이상, 55 개 이상, 60 개 이상, 65 개 이상, 70 개 이상, 75 개 이상, 80 개 이상, 85 개 이상, 90 개 이상, 95 개 이상, 100 개 이상, 110 개 이상, 120 개 이상, 130 개 이상, 140 개 이상, 150 개 이상, 160 개 이상, 170 개 이상 또는 180 개 이상의 인접한 아미노산을 함유하는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, BCMA 항원은 SEQ ID 번호: 1에 제시된 서열 또는 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프이거나 이를 함유하는 이의 일부이거나 이를 포함하고, 일부 경우에 이로 구성되거나 본질적으로 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 재조합 BCMA 항원 또는 이의 일부는 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형, IgA, IgE, IgD 및 IgM 및 이의 개질 형태를 포함하는 IgG로부터의 Fc 도메인 또는 이의 일부에 직접 또는 간접적으로 융합된다. 특정 구현예에서, BCMA 항원은 Fc 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 BCMA 항원 또는 이의 일부 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드다.
일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG, IgA 또는 IgD 아이소타이프의 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 도메인(즉, CH2 및 CH3 도메인), 예를 들어, IgG, IgA 및 IgD 아이소타이프의 CH2 또는 CH3으로 구성된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgM 또는 IgE 아이소타이프의 3 개의 중쇄 불변 도메인(즉, CH2, CH3 및 CH4 도메인)으로 구성된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 서열 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 힌지 도메인의 일부 또는 전부뿐만 아니라 CH2 및 CH3 도메인을 함유한다. 일부 경우에, Fc 도메인은 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 2 개의 폴리펩티드 사슬의 이량체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 적합한 포유 동물(예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 염소, 양 또는 원숭이)의 면역글로불린(예를 들어, IgG, IgA, IgM 또는 IgE)으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 BCMA 항원의 C- 말단에 융합된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 BCMA 항원의 N- 말단에 융합된다.
일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인 또는 이의 일부 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 2에 제시된 서열과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성인 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG Fc 도메인 또는 이의 일부 또는 변이체이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 야생형 인간 IgG Fc 도메인 또는 이의 일부 또는 변이체이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인의 변이체이다.
일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 경쇄 사이의 페어링을 감소, 저하 및/또는 경감시키는 돌연변이, 예를 들어 치환, 결실 또는 삽입을 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이의 결합 친화성을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이의 상호 작용 또는 상호 작용의 확률 또는 가능성을 감소, 저하 및/또는 경감시키는 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 보체 시스템의 단백질 사이의 결합 친화성을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인과 보체 시스템의 단백질 사이의 상호 작용 또는 상호 작용의 확률 또는 가능성을 감소, 저하 및/또는 경감시키는 돌연변이를 함유한다.
일부 구현예에서, BCMA-Fc는 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 힌지 영역에서 시스틴의 세린으로의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 힌지 영역에서 류신의 알라닌으로의 치환을 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 힌지 영역에서 글리신의 알라닌으로의 치환을 함유한다. 특정 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 CH2 영역에서 알라닌의 세린으로의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 Fc 도메인의 CH2 영역에서 프롤린의 세린으로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 인간 IgG Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 28로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, BCMA-Fc는 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 Fc 도메인은 융합 폴리펩티드의 C-말단에 존재한다.
일부 구현예에서, BCMA-Fc는 BCMA 폴리펩티드 또는 이의 일부 및 Fc 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, BCMA 폴리펩티드 또는 이의 일부는 SEQ ID 번호: 1에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 1과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 함유한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 2에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 2와 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 SEQ ID 번호: 28에 제시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID 번호: 28과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA 항원은 BCMA 또는 이의 일부 또는 변이체 및 태그 또는 융합 도메인, 예를 들어, Fc 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, BCMA 항원은 SEQ ID 번호: 35에 제시된 아미노산 서열의 전부 또는 일부 또는 SEQ ID 번호: 35에 대해 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상을 나타내는 아미노산 서열을 함유하고 항원 수용체, 예를 들어 CAR에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, BCMA-F는 기재된 바와 같은 2 개 이상의 BCMA 항원을 포함하는 이량체이고, 각각은 CAR에 의해 인식 및/또는 결합된다. 일부 구현예에서, BCMA 항원은 동일하다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 BCMA-Fc 융합으로 CAR-발현 세포를 검출하는 방법은 대상체에서 CAR-발현 세포를 평가하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 치료 세포 조성물의 CAR 발현 세포의 생체 내 약동학, 증폭 및/또는 지속성을 평가, 측정 및/또는 정량하기 위한 BCMA-Fc 융합에 사용되는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법에서 세포의 생체 내 약동학, 증폭 및/또는 지속성 및/또는 세포 표현형 또는 세포의 기능적 활성, 예컨대 면역 요법 예를 들어 CAR-T 세포 요법을 위해 투여되는 CAR 발현 세포의 변화가 BCMA-Fc 융합 단백질로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 발현 세포의 약동학, 증폭 및/또는 지속성은 요법의 투여 중 및/또는 후에 치료적 세포 조성물의 투여 후 대상체 및/또는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 CAR을 발현하는 세포의 존재 및/또는 양을 검출함으로써 측정 또는 평가된다.
일부 측면에서, BCMA-Fc 융합은 대상체의 혈액 또는 혈청 또는 기관 또는 조직 샘플(예를 들어, 질병 부위, 예를 들어, 종양 샘플)에서 CAR-발현 세포의 양을 평가하기 위해 유동 세포 측정법과 함께 사용된다. 일부 측면에서, 지속성은 샘플, 예를 들어 혈액 또는 혈청의 마이크로리터당 CAR-발현 세포의 수 또는 샘플 마이크로리터당 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 백혈구 또는 T 세포의 총 수당 CAR-발현 세포의 수로 정량화된다. 특정 측면에서, 증폭은 시간의 흐름에 따른 샘플, 예를 들어 혈액 또는 혈청 사이의 마이크로리터당 또는 샘플의 마이크로 리터당 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 백혈구 또는 T 세포의 총 수당 CAR-발현 세포의 수에서 증가로 정량화된다. 일부 구현예에서, 약동학, 증폭 및/또는 지속성은 대상체 및/또는 다수의 시점에서 대상체로부터 수집된 샘플에서 CAR 발현 세포의 양을 검출함으로써 측정 또는 평가된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 샘플은 24 시간, 48 시간, 72 시간, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 14 일, 21 일, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 3 개월, 4 개월, 6 개월, 1 년 이내 또는 치료적 세포 조성물이 투여된 후 1 년에 걸쳐 대상체로부터 수집, 획득 및/또는 채취된다.
일부 구현예에서, 개체에서 항-BCMA CAR T 세포 요법을 평가하는 방법이 제공되며, 여기서 CAR은 항-BCMA 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 대상체로부터의 샘플을 BCMA-Fc 융합 단백질과 인큐베이션하는 것과 BCMA-Fc 융합 단백질과 결합된 T 세포의 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합은 표지되고, BCMA-Fc 융합-결합 T 세포는 유동 세포 분석에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액-유래 샘플이거나, 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 산물이거나 또는 이로부터 유래된다. 일부 측면에서, 투여는 요법의 제 1 용량의 개시 후 수행된다.
일 구현예에서, BCMA-Fc는 개인에서 CAR T 세포 요법에 대한 조정이 필요한지, 예를 들어 개인에서 CAR T 세포의 낮은 수준은 요법을 조정할 필요성을 나타내는지의 여부를 결정하는데 사용된다. 일부 측면에서, 요법은 (i) 혈액 또는 다른 생물학적 샘플에서 검출 가능한 T 세포 요법의 세포의 수가 검출 가능한 후, 검출 가능하지 않거나 감소되거나, 선택적으로 T 세포 요법의 투여 후 이전 시점과 비교하여 감소되는 경우; (ii) 혈액 또는 다른 생물학적 샘플에서 검출 가능한 T 세포 요법의 세포의 수가 T 세포 요법, 선택적으로 제 1, 제 2 또는 후속 용량의 투여 개시 후, 대상체의 혈액 또는 생물학적 샘플에서 검출 가능한 T 세포 요법의 피크 또는 최대 세포 수의 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10 배 또는 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10 배 이상 감소; (iii) T 세포 요법의 세포의 피크 또는 최대 수준이 대상체의 혈액에서 검출 가능한 시점 후에, 대상체의 혈액에서 검출 가능한 T 세포의 세포 수 또는 T 세포로부터 유래된 세포의 수가 대상체의 혈액에서 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만 또는 0.1 % 미만인 경우; 및/또는 (iv) 혈액에서 검출 가능한 세포 요법의 CD3+ 또는 CD8+ 세포의 수가 μL 당 20 개 세포, μL 당 15 개 세포, μL 당 10 개 세포, μL 당 5 개 세포 또는 μL 당 1 개 세포 미만인 경우 조정된다. 일부 구현예에서, 요법은 하나 이상의 추가 용량의 CAR-T 세포 요법을 투여, 증가된 용량의 CAR-T 세포 요법을 투여, 같거나 상이한 항원에 특이적인 대안적인 CAR-T 세포 요법을 투여, CAR-T 세포의 증폭 또는 지속성을 촉진 또는 증가시키기 위한 하나 이상의 면역 조절제 또는 다른 제제를 투여하여 조정된다.
CAR-발현 세포에 대한 BCMA-Fc 융합의 결합을 검출하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 유동 세포 분석 또는 면역 분석을 포함한다. 지표 모이어티 또는 라벨 그룹은 BCMA-Fc 융합에 부착될 수 있으며, 종종 분석 장비의 이용 가능성 및 호환 가능한 면역 분석 절차에 의해 지시되는 다양한 방법의 용도의 요구를 충족시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 표지는 형광 모이어티 또는 단백질(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, GFP 또는 BFP), 또는 발광 모이어티(예를 들어, Quantum Dot Corporation, Palo Alto, Calif.에 의해 공급되는 QdotTM 나노입자)로부터 선택된다. 상기 언급된 다양한 면역 분석을 수행하는데 사용되는 다양한 일반적인 기술이 공지되어 있다.
일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합체는 표지될 필요가 없으며, BCMA-Fc 융합체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 이의 존재를 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 항체는 분자의 Fc 부분에 특이적이다.
일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합은 고체 지지체에 고정되거나 결합되며, CAR-T 세포를 포함하는 하나 이상의 표적 세포를 함유하는 조성물 또는 생물학적 샘플은 고체 지지체와 접촉된다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 웰 또는 플레이트, 예를 들어 세포 배양 플레이트의 표면이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는, 예를 들어, CAR+ T 세포의 크로마토그래피 분리 또는 선택을 허용하기 위해 크로마토그래피 칼럼 내에 존재하거나 크로마토그래피 칼럼 내에 함유된 수지 또는 매트릭스이다. 일부 구현예에서, BCMA-Fc 융합 단백질은 고체 지지체에 가역적으로 결합되거나 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 BCMA-Fc 융합 단백질에 존재하는 결합 파트너에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 친화성 크로마토그래피 매트릭스이다. 하나의 예시적인 구현예에서, BCMA-Fc 융합 단백질은 고체 지지체 상에 존재하거나 이에 고정될 수 있는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 돌연변이 단백질 분자에 결합할 수 있는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 스트렙타비딘 결합 모이어티를 포함하고, 이는 일부 경우에 비오틴과 같은 경쟁 물질이 존재할 때 해리될 수 있다. 상기 시스템의 예로는 미국 공개 특허 출원 번호 US20150024411에 기재된 시스템이 포함된다.
Ⅵ. 제조 물품 및 키트
일부 구현예에서, 제공된 방법을 수행하는데 유용한 시스템, 장치 및 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드, 즉 부착된 결합 분자를 갖는 입자, 예를 들어 비드를 함유하는 키트 또는 장치와 같은 제조 물품이 제공된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 재조합 수용체 또는 CAR에 결합하거나 이를 인식하는 항원 또는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 입양 세포 요법을 위해 유전자 조작된 세포를 제조하는 것에 따르는 것과 같은 세포를 증폭, 선별 및/또는 농축시키는 방법에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 유전자 조작된 세포는 부착된 결합 분자에 의해 결합되거나 이에 의해 인식되는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 제조 물품은 전형적으로 복수의 컨테이너, 포장 재료 및 라벨 또는 포장 삽입물 또는 하나 이상의 핵산, 예를 들어 재조합 수용체 또는 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 하나 이상의 핵산으로 형질 도입되거나 형질 감염된 대상체로부터의 세포와 같은 일반적으로 세포의 증폭을 위한 지침을 포함하여, 컨테이너 또는 컨테이너들 및/또는 패키징과 관련된 하나 이상의 컨테이너를 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 세포 집단으로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포를 선택하거나 농축하기 위해 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드를 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 CAR을 발현하는 세포를 농축시키기 위해 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드를 사용하기 위한 지침을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 세포를 포함하는 조성물을 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드와 함께 배양, 접촉 또는 처리하기 위한 지침을 포함하며, 여기서 모든 세포보다 적은 세포가 CAR을 발현한다. 일부 구현예에서, 키트는 CAR을 발현하는 세포를 활성화, 증폭 및/또는 농축하기 위한 지침을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 세포 집단으로부터 CAR을 발현하는 세포, 여기서 CAR을 발현하는 세포의 0.01 % 미만, 0.1 % 미만, 1 % 미만, 5 % 미만, 10 % 미만, 15 % 미만, 20 % 미만, 25 % 미만, 30 % 미만, 35 % 미만, 40 % 미만, 45 % 미만, 50 % 미만, 55 % 미만, 60 % 미만, 65 % 미만, 70 % 미만, 80 % 미만 또는 90 % 미만을 활성화, 증폭 및/또는 농축하기 위한 지침을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 입자, 예를 들어 비드와 세포를 접촉, 인큐베이션 또는 처리하여 형질 감염 또는 형질 도입하기 전에 증폭, 활성화 및/또는 농축된 적이 없는, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 형질 감염 또는 형질 도입하기 위한 지침을 추가로 함유한다.
Ⅶ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 즉시 이용 가능한 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에 상기 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적으로 차이가 있는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체의 "대응 형태(corresponding form)"에 대한 참조는 두 항체의 특성 또는 활성을 비교할 때, 같은 형태의 항체를 사용한 특성이 비교됨을 의미한다. 예를 들어, 항체가 제 1 항체의 대응 형태의 활성과 비교하여 더 큰 활성을 갖는다고 언급된 경우, 이는 상기 항체의 scFv와 같은 특정 형태가 제 1 항체의 scFv 형태와 비교하여 더 큰 활성을 갖는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 서열 목록에 제시된 바와 같은 개시된 서열에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에 "대응하는(correspond to)" 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에 대한 언급은 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 최대화하기 위해 개시된 서열과 정렬될 때 확인된 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬함으로써, 당업자는 예를 들어 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로 사용하여 대응하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 대응하는 위치를 확인하기 위해, 가장 높은 정도의 매치를 얻도록 아미노산 서열이 정렬된다(예를 들어, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo 외 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073. 참조).
"이펙터 기능(effector functions)"은 항체 아이소타이프에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포 독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포 독성(ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "Fc 영역(Fc region)"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실 말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템을 따른다.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)"및 "전체 항체(whole antibody)"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되어, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"분리된(isolated)" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 선별된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기 영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱(IEF), 모세관 전기 영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 때 95 % 또는 99 % 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도 평가 방법에 대한 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)] 참조.
"분리된(isolated)" 핵산은 자연 환경의 성분으로부터 선별된 핵산 분자를 지칭한다. 분리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 이의 천연 염색체 위치와는 다른 염색체 위치에 존재하거나 염색체 외에 존재한다.
"항-이디오타입 항체를 암호화하는 분리된 핵산(Isolated nucleic acid encoding an anti-idiotype antibody)"은 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 상기 핵산 분자(들)를 포함하여 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 상기 핵산 분자(들)는 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재한다.
용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포주(host cell line)" 및 "숙주 세포 배양(host cell culture)"은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질 전환체(transformants)"및 "형질 전환된 세포(transformed cells)"를 포함하고, 여기에는 1 차 형질 전환 세포 및 계대 수에 관계없이 이로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지는 않지만 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질 전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 같은 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "아미노산 서열 동일성 백분율(%)(percent (%) amino acid sequence identity)" 및 "백분율 동일성(percent identity)"이 아미노산 서열(참조 폴리펩티드 서열)과 관련하여 사용될 때 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 필요하다면, 갭을 도입하고 서열을 정렬한 후 참조 폴리펩티드 서열에 있는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어 대상체 항체 또는 단편)에 있는 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업자 범위 내의 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩티드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심있는 결합 분자, 예를 들어 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 하기의 통상적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 같은 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터(vector)"는 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는자가-복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터(expression vectors)"로 지칭된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기재된 측면 및 변형은 측면 및 변형을 "구성하는(consisting)" 및/또는 "본질적으로 구성하는(consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시를 통해, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 완강한 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라 상기 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 및 하한과 상기 언급된 범위의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값 사이의 각각의 개재 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한도에 따라 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 청구된 주제에 또한 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "약(about)"은 이 기술 분야의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 상기 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함(및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 일부 구현예에서, "약"은 값 또는 파라미터의 ± 20 %, ± 15 %, ± 10 %, ± 5 % 또는 ± 1 % 이내를 지칭한다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 사슬 및 다른 펩티드, 예를 들어 링커를 포함하는 폴리펩티드는 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 및 이와 유사한 것을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한 고유 또는 천연 서열에 대한 변형을 함유할 수 있다. 상기 변형은 부위-지정 돌연변이 유발을 통하는 것과 같이 고의적일 수 있거나 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오차를 통하는 것과 같이 우발적일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성(positive)"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능한 존재를 지칭한다. 표면 마커를 언급 할 때, 상기 용어는 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유동 세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 상기 염색은 그렇지 않으면 동일한 조건 하에서 아이소타이프 매칭된 대조군과 같은 절차로 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 상기 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 상기 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유동 세포 분석에 의해 검출 가능하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특정 마커에 대해 세포 또는 세포 집단이 "음성(negative)"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출 가능한 존재가 없음을 지칭한다. 표면 마커를 언급 할 때, 상기 용어는 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유동 세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 여기서 상기 염색은 그렇지 않으면 동일한 조건 하에서 아이소타이프 매칭된 대조군과 같은 절차로 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 상기 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 낮은 수준에서 및/또는 상기 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 비교할 때 실질적으로 유사한 수준에서 유동 세포 분석에 의해 검출 가능하지 않다.
Ⅷ. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기와 같은 것들이 있다:
1. 세포를 증폭하는 방법으로, 복수의 입자, 예를 들어 비드로 항원을 특이적으로 결합 또는 인식하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 결합분자를 포함하고, 여기서 항원-결합 도메인에 결합분자의 결합은 재조합 항원 수용체를 포함하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
2. 구현예 1의 방법에서, 상기 재조합 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
3. 구현예 1 또는 구현예 2의 방법에서, 상기 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
4. 구현예 3의 방법에서, 상기 항원-결합 단편은 단일 사슬 항체 단편이거나 이를 포함한다.
5. 구현예 3 또는 구현예 4의 방법에서, 이의 항원-결합 단편은 가요성 링커로 연결된 항체 가변 영역을 포함한다.
6. 구현예 3 내지 5 중 어느 하나의 방법에서, 이의 항원-결합 단편은 scFv이거나 이를 포함한다.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138, 병원체-특이적 항원 및 유니버설 태그와 관련된 항원 중 선택되고/거나 상기 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자 중 선택된다.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 재조합 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역을 결합 또는 인식하지 않으며, 상기 링커 또는 스페이서 영역은 항원-결합 도메인을 항원 수용체의 막 관통 도메인에 연결한다.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
10. 세포를 증폭하는 방법에서, 복수의 입자, 예를 들어 비드로 항원을 특이적으로 결합 또는 인식하는 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 결합분자를 포함하고, 여기서 항원-결합 도메인에 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
11. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함한다.
12. 세포를 증폭하는 방법으로, 복수의 입자, 예를 들어 비드로 항원을 특이적으로 결합 또는 인식하는 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 결합분자를 포함하고, 여기서 항원-결합 도메인에 재조합 항원 또는 이의 일부의 결합은 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
13. 구현예 11 또는 구현예 12의 방법에서, 상기 재조합 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138 및 병원체-특이적 항원 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 전술한 것 중 어느 하나의 부분 중 선택되고/거나 상기 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자 중 선택된다.
14. 구현예 11 내지 13 중 어느 하나의 방법에서, 상기 재조합 항원은 BCMA, CD22 또는 ROR1 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 이의 일부이다.
15. 구현예 11 내지 14 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부를 포함한다.
16. 구현예 11 내지 14 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부로 반드시 구성된다.
17. 세포를 증폭하는 방법으로, 복수의 입자, 예를 들어 비드로 B 세포 성숙 항원(BCMA)을 특이적으로 결합 또는 인식하는 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부를 포함하는 결합분자를 포함하고, 여기서 항원-결합 도메인에 BCMA의 세포 외 도메인 또는 이의 일부의 결합은 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
18. 구현예 17의 방법에서, 상기 BCMA의 일부는 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부로 반드시 구성된다.
19. 구현예 11 내지 18 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 모이어티에 연결된 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드고, 선택적으로 여기서 상기 모이어티는 입자에의 부착을 용이하게 한다.
20. 구현예 19의 방법에서, 상기 모이어티는 재조합 항원의 C-말단에 연결된다.
21. 구현예 19 또는 구현예 20의 방법에서, 상기 모이어티는 소수성이거나 또는 소수성 아미노산이 농축되어 있다.
22. 구현예 19 내지 21 중 어느 하나의 방법에서, 상기 모이어티는 Fc 도메인이거나 이를 포함한다.
23. 구현예 22의 방법에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다.
24. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원은 CD19이다.
25. 세포를 증폭하는 방법으로, 복수의 입자, 예를 들어 비드로 CD19를 특이적으로 결합 또는 인식하는 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고, 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 결합분자를 포함하고, 여기서 항원-결합 도메인에 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포의 증폭을 유도하여, 증폭된 세포를 포함하는 산출 조성물을 생산한다.
26. 구현예 9, 구현예 24 또는 구현예 25의 방법에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
27. 구현예 9, 구현예 24 또는 구현예 25의 방법에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
28. 구현예 26 또는 구현예 27의 방법에서, 상기 항원-결합 단편은 scFv이거나 이를 포함한다.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원 또는 재조합 항원은 인간이다.
30. 구현예 9, 10 및 25 내지 29 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
31. 구현예 30의 방법에서, 상기 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc의 일부를 포함한다.
32. 구현예 30 또는 구현예 31의 방법에서, 상기 불변 영역 또는 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다.
33. 구현예 9, 10 및 25 내지 32 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전한 항체 또는 전장 항체이다.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 또는 비공유 결합으로 부착된다.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에, 결합분자의 C-말단 아미노산 잔기에 또는 근방에 부착되고/거나 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에 결합분자의 부착은 항원 수용체의 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 결합분자의 영역 또는 에피토프가 항원 수용체에 의해 인식될 수 있도록 배향되는 방식으로 수행된다.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나의 방법에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 합성 입자, 불용성 입자, 고체 입자이거나 또는 비세포성 입자이다.
37. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자는 비드를 포함한다.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 1 μm 내지 10 μm 또는 약 1 μm 내지 10 μm 또는 2 μm 내지 5 μm 또는 약 2 μm 내지 5 μm의 평균 직경을 포함한다.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 2.8 μm의 평균 직경을 포함한다.
40. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 4.5 μm의 평균 직경을 포함한다.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 0.5 g/cm3 내지 5.0 g/cm3 또는 1 g/cm3 내지 2 g/cm3또는 약 1 g/cm3 내지 약 2 g/cm3의 평균 밀도를 포함한다.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 1.3 g/cm3의 평균 밀도를 포함한다.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 약 1.5 g/cm3의 평균 밀도를 포함한다.
44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 단순 분산성이다.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다.
46. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나의 방법에서, 상기 입자는 결합분자의 부착을 위한 표면 노출 작용기를 포함하고/거나 상기 결합분자는 표면 노출 작용기를 통해 입자에 공유 결합으로 부착된다.
47. 구현예 46의 방법에서, 상기 표면 노출 작용기는 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기, 클로로메틸기, 에폭시기, 히드록실기, 토실기 또는 히드라진기다.
48. 구현예 46 또는 구현예 47의 방법에서, 상기 표면 노출 작용기는 토실기다.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 생체 적합성 또는 세포에 비독성이다.
50. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물, 히드록시 카르복실산의 공중합체, 디카르복실산의 공중합체 또는 금속을 포함하는 입자를 포함한다.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나의 방법에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 탄소 또는 이의 조합물을 포함하는 표면을 포함한다.
52. 구현예 51의 방법에서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 이의 조합물이다.
53. 구현예 1 내지 52 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 소수성 표면을 포함하는 입자를 포함한다.
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 폴리스티렌 표면을 포함하는 입자를 포함한다.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 자성 입자를 포함하고/거나 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 포함한다.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자의 농도는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL이다.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자의 농도는 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상 또는 약 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상이다.
58. 구현예 1 내지 57 중 어느 하나의 방법에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각은 결합분자 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상 또는 결합분자 약 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상을 포함한다.
59. 구현예 1 내지 58 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하는 제제의 존재 하에 수행되어 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단한다.
60. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나의 방법에서, 상기 제제는 입자, 예를 들어 비드와 함께 제공되고, 선택적으로 상기 제제는 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각 또는 이의 서브세트로 구성된다.
61. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나의 방법에서, 상기 제제는 복수의 입자, 예를 들어 비드와 별개로 제공된다.
62. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나의 방법에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하는 제제를 추가로 포함하여 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단한다.
63. 구현예 59 내지 62 중 어느 하나의 방법에서, 상기 제제는 리간드이거나 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
64. 구현예 58 내지 63 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분자는 공자극 분자이거나 또는 활성 공수용체 또는 이의 리간드이다.
65. 구현예 64의 방법에서, 상기 공자극 분자 또는 활성 공수용체는 OX-40, ICOS, DAP10, CD28 또는 4-1BB이거나 또는 이의 리간드, 선택적으로 OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 또는 4-1BBL이다.
66. 구현예 58 내지 63 중 어느 하나의 방법에서, 상기 분자는 억제 수용체 또는 이의 리간드이다.
67. 구현예 66의 방법에서, 상기 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT이거나 또는 이의 리간드, 선택적으로 PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 또는 LIGHT이다.
68. 구현예 62 내지 67 중 어느 하나의 방법에서, 상기 제제는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다.
69. 구현예 62 내지 68 중 어느 하나의 방법에서, 상기 입자, 예를 들어 비드에 포함된 제제와 결합 분자의 비율, 선택적으로 몰비 또는 중량비는 1:1 또는 약 1:1이다.
70. 구현예 1 내지 69 중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물 내에 존재하는 총세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2 또는 약 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2이다.
71. 구현예 1 내지 70 중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물 내에 존재하는 총세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 1:0.1 내지 1:5 또는 약 1:0.1 내지 1:5이다.
72. 구현예 1 내지 71 중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물 내에 존재하는 총세포 대 입자, 예를 들어 비드의 비율은 1:1 또는 약 1:1이다.
73. 구현예 1 내지 72 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션은 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일 또는 12 일 초과 또는 약 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일 또는 12 일 초과 동안 수행된다.
74. 구현예 1 내지 73 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션은 30 ℃ 내지 39 ℃ 또는 약 30 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 수행된다.
75. 구현예 1 내지 74 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션은 37 ° ± 2.0 °C의 온도에서 수행된다.
76. 구현예 1 내지 75 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포는 면역 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다.
77. 구현예 1 내지 76 중 어느 하나의 방법에서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
78. 구현예 1 내지 77 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
79. 구현예 1 내지 78 중 어느 하나의 방법에서, 상기 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1이거나 또는 약 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 또는 3:1이다.
80. 구현예 1내지 79중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포는 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터 수득된 1 차 세포이다.
81. 구현예 1 내지 80 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포는 인간이다.
82. 구현예 1 내지 81 중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물은 조성물에 있는 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 도입하기 위한 조건 하에서 재조합 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 세포 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다.
83. 세포를 유전적으로 조작하는 방법으로,
(a) 조성물에 있는 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 도입하기 위한 조건 하에서 재조합 항원 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 세포 조성물을 접촉시켜, 투입 조성물을 생산하는 단계; 및
(b) 구현예 1 내지 74 중 어느 하나의 방법에 따라 투입 조성물의 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
84. 구현예 82 또는 구현예 83의 방법에서, 상기 접촉 및 인큐베이션 단계의 적어도 일부는 동시에 수행된다.
85. 구현예 82 내지 84 중 어느 하나의 방법에서, 상기 핵산 분자는 바이러스 벡터, 에피솜 벡터 또는 트랜스포존 내에 포함된다.
86. 구현예 82 내지 85 중 어느 하나의 방법에서, 상기 접촉은 트랜스포존/전위효소 유전자 전달에 의해 수행된다.
87. 구현예 82 내지 85 중 어느 하나의 방법에서, 상기 접촉은 바이러스 벡터로 형질 도입하여 수행된다.
88. 구현예 85 또는 구현예 87의 방법에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스이고, 이는 선택적으로 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
89. 구현예 87 또는 구현예 88의 방법에서, 상기 접촉은 세포 조성물과 바이러스 벡터를 원심분리접종하는 단계를 포함한다.
90. 구현예 89의 방법에서, 원심분리접종은 원심분리 챔버의 내부 공동에서, 바이러스 벡터 입자 및 세포 조성물을 회전시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 회전은 공동의 측벽 내부 표면에서,
500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 내지 1000 g 내지 1600 g(각각의 수치 포함) 또는 약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 내지 1000 g 내지 1600 g(각각의 수치 포함); 또는
600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g 또는 2000 g 이상 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1200 g, 1600 g 또는 2000 g 이상인 상대적인 원심력이다.
91. 구현예 89 또는 구현예 90의 방법에서, 원심분리접종은,
약 5 분 이상, 약 10 분 이상, 약 15 분 이상, 약 20 분 이상, 약 30 분 이상, 약 45 분 이상, 약 60 분 이상, 약 90 분 이상 또는 약 120 분 이상; 또는
5 분 내지 60 분, 10 분 내지 60 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각각의 수치 포함) 또는 약 5 분 내지 60 분, 10 분 내지 60 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각각의 수치 포함)의 시간 동안이다.
92. 구현예 87 내지 91 중 어느 하나의 방법에서, 상기 접촉은 형질 도입 보조제 존재 하에 수행된다.
93. 구현예 82 내지 92 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포 조성물은 복수의 T 세포를 포함하고, 접촉 전에, 상기 방법은 T 세포를 자극 또는 활성화시키는 것을 포함하지 않는다.
94. 구현예 82 내지 93 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포 조성물은 복수의 T 세포를 포함하고, 접촉 전에, 상기 방법은 TCR 복합체를 통한 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하지 않고/거나 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에 인큐베이션; 및/또는 CD3-결합분자, CD28-결합분자, 재조합 IL-2, 재조합 IL-15 및 재조합 IL-7 또는 이의 조합물을 포함하지 않는다.
95. 구현예 93 또는 구현예 94 의 방법에서, 접촉 전에, 상기 방법은 항 CD3 항체 및/또는 항 CD28 항체의 존재 하에 T 세포를 자극하는 것을 포함하지 않는다.
96. 구현예 82 내지 95 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포 조성물은 복수의 T 세포를 포함하고, 상기 복수의 세포는 대상체로부터의 샘플로부터 수득되며, 여기서:
접촉은 대상체로부터 샘플을 수득한 후 24 시간 이내에 시작되고/거나;
접촉 전에, 대상체로부터 샘플을 수득한 후, T 세포는 15 ℃, 18 ℃, 22 ℃또는 25 ℃ 초과 또는 약 15
Figure pct00005
℃, 약 18 ℃, 약 22 ℃ 또는 약 25 ℃ 초과의 온도에 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간 또는 24 시간 초과 동안 노출되지 않았고/거나;
접촉 전에, 대상체로부터 샘플을 수득한 후, T 세포는 37 ℃ ± 2.0 ℃의 온도, 약 37 ℃ ± 2.0 ℃의 온도, 37 ℃ ± 2.0 ℃ 초과의 온도 또는 약 37 ℃ ± 2.0 ℃ 초과의 온도에 15 분, 30 분, 1 시간 또는 2 시간 초과 동안 노출되지 않았다.
97. 구현예 82 내지 96 중 어느 하나의 방법에서, 상기 접촉 전에, 5 %, 10 %, 20 %, 30 % 또는 40 % 이내의 T 세포가 활성화된 세포이고, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB로 구성된 그룹으로부터 선택된 표면 마커를 발현하고; IL-2, IFN-감마, TNF-알파로 구성된 그룹으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현을 포함하고, 세포 주기 중 G1 단계이거나 G1 후기 단계에 있고/거나 증식할 수 있다.
98. 구현예 1 내지 97 중 어느 하나의 방법은, 인큐베이션 전 또는 접촉 전에, 세포를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로, 세포, 선택적으로, 샘플로부터 T 세포를 선택 또는 농축하는 것을 추가로 포함한다.
99. 구현예 1 내지 98 중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물에서 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포의 백분율은 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작거나 또는 약 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작다.
100. 구현예 1 내지 99 중 어느 하나의 방법에서, 상기 세포 조성물 또는 투입 조성물은 1 x 102 개의 세포, 1 x 103 개의 세포, 1 x 104 개의 세포, 1 x 105 개의 세포, 1 x 106 개의 세포 또는 1 x 107 개 이상의 세포 또는 약 1 x 102 개의 세포, 1 x 103 개의 세포, 1 x 104 개의 세포, 1 x 105 개의 세포, 1 x 106 개의 세포 또는 1 x 107 개 이상의 세포를 포함한다.
101. 구현예 1 내지 100중 어느 하나의 방법에서, 상기 산출 조성물에 존재하는 세포의 활성 마커 또는 소진 마커의 표면 발현은 유사한 인큐베이션 후이나 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 다클론성 자극 분자의 존재 하에 생산된 세포 조성물 내 마커의 표면 발현보다 작다.
102. 구현예 101의 방법에서, 상기 소진 마커는 억제 수용체이다.
103. 구현예 101 또는 구현예 102의 방법에서, 상기 소진 마커는 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA 또는 TIGIT이다.
104. 구현예 103의 방법에서, 상기 활성 마커는 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 또는 4-1BB이다.
105. 구현예 93 내지 96 중 어느 하나의 방법에서, 상기 표면 발현은 적어도 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배 이상 또는 적어도 약 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배 이상이다.
106. 구현예 1 내지 105 중 어느 하나의 방법에서, 상기 산출 조성물 내 세포 수는 유사한 인큐베이션에 의하나 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 다클론성 자극 분자의 존재 하에 생산된 세포 조성물 내 세포 수와 실질적으로 같거나 또는 그보다 더 많다.
107. 구현예 101 내지 106 중 어느 하나의 방법에서, 상기 다클론성 자극 분자는 항-CD3 항체 또는 단편 및/또는 항-CD28 항체 또는 단편을 포함한다.
108. 구현예 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에서, 상기 산출 조성물 내에 세포 수는 투입 조성물 내 세포 수보다 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배, 25 배, 50 배 초과 또는 약 1.2 배, 1.5 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 10.0 배, 25 배, 50 배 초과, 100 배 이상 더 많다.
109. 구현예 1 내지 108 중 어느 하나의 방법에서, 상기 산출 조성물 내 재조합 항원 수용체를 포함하는 세포의 백분율은 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 초과 또는 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 초과, 95 % 이상 더 많다.
110. 구현예 1 내지 109 중 어느 하나의 방법에서, 상기 산출 조성물 내 재조합 항원 수용체를 포함하는 세포 수는 투입 조성물 내 항원 수용체를 포함하는 세포 수와 비교하여 1.2 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 6.0 배, 7.0 배, 8.0 배, 9.0 배, 10 배 이상 증가하거나 또는 농축된다.
111. 구현예 1 내지 110 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 세포 증폭 또는 활성을 조절하는 하나 이상의 추가 제제의 존재 하에 수행된다.
112. 구현예 111의 방법에서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 하나 이상의 사이토카인이다.
113. 구현예 1 내지 112 중 어느 하나의 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
114. 구현예 1 내지 113 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원 수용체는 CAR 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인이 추가된 CAR이다.
115. 구현예 114의 방법에서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함한다.
116. 구현예 114 또는 구현예 115의 방법에서, 상기 CAR는 공자극 신호 전달 영역을 추가로 포함한다.
117. 구현예 116의 방법에서, 상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함한다.
118. 구현예 117의 방법에서, 상기 공자극 도메인은 CD28이다.
119. 구현예 1 내지 118 중 어느 하나의 방법은 상기 산출 조성물로부터 복수의 입자, 예를 들어 비드를 제거하는 것을 추가로 포함한다.
120. 구현예 1 내지 119 중 어느 하나의 방법으로 생산된 세포 조성물.
121. 입자 및 입자의 표면에 결합된 결합분자를 포함하는 표면 개질 입자로서, 상기 결합분자는 항원 수용체의 세포 외 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합한다.
122. 구현예 121의 표면 개질 입자에서, 상기 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
123. 구현예 121 또는 구현예 122 의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 재조합 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역에 결합하거나 인식하지 않고, 상기 링커 또는 스페이서 영역은 항원 수용체의 막 관통 도메인에 항원-결합 도메인을 연결한다.
124. 구현예 121 내지 123 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함한다.
125. 구현예 124의 표면 개질 입자에서, 상기 재조합 항원은 ROR1, B 세포 성숙 항원(BCMA), 탄산 탈수 효소 9(CAIX), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erbB2), Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이량체, EGFR vIII, 엽산 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, avb6 인테그린, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, Foetal AchR, NKG2D 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-고환 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1(MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아성 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화 GD2(OGD2), CE7, 빌름스 종양 1(WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, CCL-1, CD138 및 병원체-특이적 항원 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 전술한 것 중 어느 하나의 부분 중에서 선택되고/거나 상기 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지됨), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 유형 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지됨), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), G 단백질 커플 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 타이로신 인산화효소 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Ra2), 인산화효소 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복체 함유 8 패밀리 구성원 A(LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 뮤린 거대세포바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 접착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종의 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지됨), 종양-관련 당단백질 72(TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원 또는 유니버설 태그와 관련된 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택된다.
126. 구현예 124 또는 구현예 125의 표면 개질 입자에서, 상기 재조합 항원은 BCMA, CD22 또는 ROR1이거나 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 이의 일부이다.
127. 구현예 124 내지 126 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부를 포함한다.
128. 구현예 124 내지 126 중 어느 하나의 방법에서, 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원의 일부는 항원의 세포 외 도메인 또는 세포 외 도메인의 일부로 반드시 구성된다.
129. 입자 및 입자의 표면에 결합된 결합분자를 포함하는 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 B 세포 성숙 항원(BCMA)의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다.
130. 구현예 124 내지 129 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 모이어티에 연결된 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 선택적으로 여기서 상기 모이어티는 입자에의 부착을 용이하게 한다.
131. 구현예 130의 표면 개질 입자에서, 상기 모이어티는 재조합 항원의 C-말단에 연결된다.
132. 구현예 130 또는 구현예 131의 표면 개질 입자에서, 상기 모이어티는 소수성이거나 또는 소수성 아미노산으로 농축되어 있다.
133. 구현예 130 내지 132 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 모이어티는 Fc 도메인이거나 이를 포함한다.
134. 구현예 133의 표면 개질 입자에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG에서 유래한다.
135. 구현예 130 내지 134 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 재조합 항원은 인간이다.
136. 구현예 121 내지 123 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
137. 구현예 121 내지 123 및 136 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 항원 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 항원은 CD19이다.
138. 구현예 136 또는 구현예 137의 표면 개질 입자에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
139. 구현예 136 또는 구현예 137의 표면 개질 입자에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
140. 구현예 138 또는 구현예 139의 표면 개질 입자에서, 상기 항원-결합 단편은 scFv이거나 이를 포함한다.
141. 구현예 136 내지 140 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다.
142. 구현예 141의 표면 개질 입자에서, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부는 Fc 영역 또는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc의 일부를 포함한다.
143. 구현예 141 또는 구현예 142의 표면 개질 입자에서, 상기 불변 영역 또는 Fc 영역은 인간 IgG로부터 유래한다.
144. 구현예 136 내지 143 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전한 항체 또는 전장 항체이다.
145. 구현예 121 내지 144 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 또는 비공유 결합으로 부착된다.
146. 구현예 121 내지 145 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에, 결합분자의 C-말단 아미노산 잔기에 또는 근방에 부착되고/거나 복수의 입자, 예를 들어 비드 각각에 결합분자의 부착은 항원 수용체의 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 결합분자의 영역 또는 에피토프가 항원 수용체에 의해 인식될 수 있도록 배향되는 방식으로 수행된다.
147. 구현예 121 내지 146 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 합성 입자, 불용성 입자, 고체 입자이거나 또는 비세포성 입자이다.
148. 구현예 121 내지 147 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 복수의 입자는 비드를 포함한다.
149. 구현예 121 내지 148 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 1 μm 내지 10 μm 또는 약 1 μm 내지 10 μm 또는 2 μm 내지 5 μm 또는 약 2 μm 내지 5 μm의 직경을 갖는다.
150. 구현예 121 내지 149 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 약 2.8 μm의 직경을 갖는다.
151. 구현예 121 내지 149 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 약 4.5 μm의 직경을 갖는다.
152. 구현예 121 내지 151 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 결합분자는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다.
153. 구현예 121 내지 152 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 결합분자의 부착을 위한 표면 노출 작용기를 포함하고/거나 상기 결합분자는 표면 노출 작용기를 통해 입자에 공유 결합으로 부착된다.
154. 구현예 153의 표면 개질 입자에서, 상기 표면 노출 작용기는 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기, 클로로메틸기, 에폭시기, 히드록실기, 토실기 또는 히드라진기다.
155. 구현예 154의 표면 개질 입자에서, 상기 표면 노출 작용기는 토실기다.
156. 구현예 121 내지 155중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 생체 적합성 또는 세포에 비독성이다.
157. 구현예 121 내지 156 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 복수의 입자, 예를 들어 비드는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물, 히드록시 카르복실산의 공중합체, 디카르복실산의 공중합체 또는 금속을 포함하는 입자를 포함한다.
158. 구현예 121 내지 157 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 탄소 또는 이의 조합물을 포함하는 표면을 포함한다.
159. 구현예 158의 표면 개질 입자에서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 이의 조합물이다.
160. 구현예 121 내지 149 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 소수성 표면을 포함한다.
161. 구현예 121 내지 160 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자, 예를 들어 비드는 폴리스티렌 표면을 포함한다.
162. 구현예 121 내지 161 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 자성이고/거나 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 포함한다.
163. 구현예 121 내지 162 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 결합분자를 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상 또는 약 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상을 포함한다.
164. 구현예 121 내지 163중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자는 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하기 위해 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하는 제제를 추가로 포함하여, 세포의 증폭을 조절한다.
165. 구현예 165의 표면 개질 입자에서, 상기 제제는 리간드이거나 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
166. 구현예 164 또는 구현예 165의 표면 개질 입자에서, 상기 분자는 공자극 분자이거나 또는 활성 공수용체 또는 이의 리간드이다.
167. 구현예 166의 표면 개질 입자에서, 상기 공자극 분자 또는 활성 공수용체는 OX-40, ICOS, DAP10, CD28 또는 4-1BB이거나 또는 이의 리간드, 선택적으로 OX-40L, ICOSL, B7-1, B7-2 또는 4-1BBL이다.
168. 구현예 164 또는 구현예 165의 표면 개질 입자에서, 상기 분자는 억제 수용체 또는 이의 리간드이다.
169. 구현예 168의 표면 개질 입자에서, 상기 억제 수용체는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT이거나 또는 이의 리간드, 선택적으로 PD-L1, PD-L2, CD155, CD112 또는 LIGHT이다.
170. 구현예 164 내지 169 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 제제는 입자, 예를 들어 비드에 공유 결합으로 부착된다.
171. 구현예 164 내지 170 중 어느 하나의 표면 개질 입자에서, 상기 입자에 포함된 제제와 결합 분자의 비율, 선택적으로 몰비 또는 중량비는 1:1 또는 약 1:1이다.
172. 구현예 113 내지 153 중 어느 하나의 복수의 표면 개질 입자, 예를 들어 비드를 포함하는 조성물.
173. 구현예 172의 조성물에서, 상기 결합분자의 농도는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL이다.
174. 구현예 172 또는 구현예 173의 조성물에서, 상기 결합분자의 농도는 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상이거나 또는 약 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상이다.
175. 구현예 172 내지 174 중 어느 하나의 조성물은 단순 분산성이다.
176. 구현예 121 내지 171 중 어느 하나의 입자 또는 구현예 154 내지 158 중 어느 하나의 조성물 및 사용을 위한 지침을 포함하는 키트.
177. 구현예 176의 키트에서, 지침은 결합분자에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포, 세포 집단을 선택 또는 농축하기 위한 것이다.
178. 구현예 176의 키트에서, 지침은 결합분자에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포, 세포 집단을 증폭하기 위한 것이다.
179. 구현예 177 또는 구현예 178의 키트에서, 세포 집단에서 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포의 백분율은 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작거나 또는 약 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % 이하보다 작다.
180. 구현예 121 내지 171 중 어느 하나의 입자 또는 구현예 172 내지 175 중 어느 하나의 조성물과 세포 집단을 인큐베이션하는 것을 포함하는 세포를 증폭하는 방법.
181. 구현예 121 내지 171 중 어느 하나의 입자 또는 구현예 172 내지 175 중 어느 하나의 조성물과 세포 집단을 접촉시키는 것을 포함하는 세포를 선택 또는 농축하는 방법.
182. 세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법으로서 상기 방법은,
10 일 이상의 기간 동안 투입 조성물에 있는 세포 내 CAR-의존 활성을 자극하기 위한 조건 하에서, 항원을 특이적으로 결합 또는 인식하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 산출 조성물을 생산하고;
산출 조성물의 하나 이상의 세포의 하나 이상의 표현형 또는 활성을 평가하는 것을 포함한다.
183. 구현예 182의 방법에서, 상기 CAR-의존 활성을 자극하기 위한 조건은 CAR의 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 결합분자의 존재를 포함한다.
184. 구현예 183의 방법에서, 상기 결합분자는 지지체에 부착된다.
185. 구현예 184의 방법에서, 상기 지지체는 고체 지지체이다.
186. 구현예 185의 방법에서, 상기 고체 지지체는 마이크로플레이트 웰 또는 비드의 표면이다.
187. 구현예 183 내지 186 중 어느 하나의 임의의 방법에서, 상기 고체 지지체는 마이크로플레이트에 부착된 결합분자를 갖는 마이크로플레이트이고 상기 인큐베이션은 마이크로플레이트 내에서 수행된다.
188. 구현예 183 내지 187 중 어느 하나의 방법에서, 상기 고체 지지체는 부착된 결합분자를 갖는 비드이고 상기 인큐베이션은 복수의 비드의 존재 하에 수행된다.
189. 구현예 183 내지 187 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다.
190. 구현예 189의 방법에서, 상기 재조합 항원 또는 이의 일부는 BCMA이거나 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 이의 일부이다.
191. 구현예 183 내지 190 중 어느 하나의 방법에서, 상기 결합분자는 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
192. 구현예 191의 방법에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
193. 구현예 192의 방법에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
194. 구현예 183 내지 193 중 어느 하나의 방법에서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
195. 구현예 182 내지 194 중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물는 재조합 사이토카인을 포함하지 않는 배지의 존재에서 인큐베이션된다.
196. 구현예 182 내지 195 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션은 연속적으로 수행되거나 또는 일정 시간 동안 중단되지 않는다.
197. 구현예 182 내지 196 중 어느 하나의 방법에서, 상기 인큐베이션하는 동안, 세포를 재플레이팅하지 않고, 배지는 교환되지 않으며 결합분자는 추가되지 않는다.
198. 구현예182 내지 197 중 어느 하나의 방법은 산출 조성물 중 하나 이상의 세포의 활성, 소진 또는 분화 상태의 하나 이상의 표현형을 평가하는 것을 포함한다.
199. 구현예 198의 방법에서, 상기 표현형은 소진이고 상기 평가는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2b4, BTLA, TIM3, VISTA 또는 CD96으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로 표면 발현을 측정하는 것을 포함한다.
200. 구현예 198의 방법에서, 상기 표현형은 활성이고 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 또는 Ki67로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로 표면 발현을 측정하는 것을 포함한다.
201. 구현예 198의 방법에서, 상기 표현형은 분화 상태이고 상기 평가는 (i) CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 중 하나 이상 및/또는 (ii) CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 측정하는 것을 포함하고, 선택적으로 여기서 상기 하나 이상의 마커는 나이브-유사 T 세포와 양성으로 또는 역으로 관련된다.
202. 구현예 182 내지 201 중 어느 하나의 방법은 산출 조성물 중 하나 이상의 세포의 하나 이상의 활성을 평가하는 것을 포함한다.
203. 구현예 182 내지 202 중 어느 하나의 방법에서, 상기 하나 이상의 활성은 CAR-의존 활성, 선택적으로 항원-자극 활성을 포함한다.
204. 구현예 202 또는 203의 방법에서, 상기 하나 이상의 활성은 세포 용해 활성 또는 사이토카인 생산을 포함한다.
205. 구현예 182 내지 204 중 어느 하나의 방법에서, 상기 일정 시간은 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일 이상 또는 약 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일 이상이다.
206. 구현예 182 내지 205중 어느 하나의 방법에서, 상기 일정 시간은 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일이거나 또는 약 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일이다.
207. 구현예 182 내지 206중 어느 하나의 방법에서, 상기 투입 조성물은 인큐베이션 전 테스트 제제 또는 화합물에 노출 또는 접촉된 적이 있는 세포를 포함하고, 선택적으로 여기서 상기 노출 또는 접촉은 CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생산하는 공정 중 하나 이상의 단계 중에 수행된다.
208. 구현예 182 내지 207 중 어느 하나의 방법에서, 상기 방법은 복수의 투입 조성물에서 수행되고, 상기 복수의 투입 조성물 각각은 상이한 공정으로 생산된다.
209. 구현예 182 내지 208 중 어느 하나의 방법에서, 산출 조성물의 표현형 또는 활성과 대조군 조성물의 표현형 또는 활성을 비교하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 상기 대조군 조성물은 CAR-의존 활성을 자극하기 위한 같은 조건 하에서 10 일 이상 동안 인큐베이션된 T 세포 조성물이고, 상기 T 세포 조성물은 테스트 제제 또는 화합물의 존재 하에 생산되지 않았거나 또는 투입 조성물과 비교한 대안적인 공정으로 생산되었다.
210. 구현예 182 내지 209 중 어느 하나의 방법에서, 감소된 소진, 감소된 활성 또는 저하된 분화를 나타내는 산출 조성물을 확인하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 여기서 상기 저하된 분화는 하나 이상 나이브-유사 T 세포 마커의 증가된 발현을 포함한다.
Ⅸ. 실시예
하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 포함되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1: BCMA 접합 비드 생성
B-세포 성숙 항원(BCMA)은 IgG의 Fc 영역에 C-말단에서 융합된 가용성 인간 BCMA를 함유하는 BCMA-Fc 융합 폴리펩티드를 상업적으로 이용 가능한 토실 활성화 자성 비드의 표면에 공유적으로 커플링함으로써 비드에 접합되었다(ThermoFisher, Waltham MA). 비드는 1 차 아미노 및 설프히드릴기에 공유 결합하는 초상자성, 비다공성, 단순 분산성, 토실 활성화된 비드이다. 대략 2.8 ㎛(M-280으로 표기) 또는 4.5 ㎛(M-450으로 표기)의 직경을 갖는 비드를 사용하여 접합을 수행하였다.
BCMA-Fc(SEQ ID 번호: 35)는 인간 BCMA의 세포 외 도메인(GenBank 번호 NP_001183.2) 및 하기와 같은 링커에 연결된 인간 IgG1 Fc를 함유했다:
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA(BCMA의 세포 외 도메인; SEQ ID 번호: 1)
GGGGS(링커; SEQ ID 번호: 27)
PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(인간 IgG1 Fc; SEQ ID 번호: 28).
N-말단 CD33 리더 서열(SEQ ID 번호: 30)을 갖는 재조합 인간 BCMA-Fc 융합 구조물을 암호화하는 클론을 발현 벡터에 삽입하고 HEK 293 세포에서 발현시켰다. 일시적으로 형질 감염된 HEK 세포로부터의 상청액을 5 일 후에 수확하고 BCMA-FC 융합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제하였다. 생성된 BCMA-Fc 융합 단백질은 겔 투과 크로마토그래피에 의해 평가될 때 95 % 초과의 순도를 갖는 것으로 결정되었다. 결합을 시험하기 위해, BCMA-Fc 융합 단백질을 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포 및 BCMA에 결합하지 않는 CAR을 발현하는 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 유동 세포 분석 결과 BCMA-Fc 융합 단백질은 항-BCMA CAR 발현 T 세포에 특이적으로 결합하였음을 나타냈다.
5 ㎍ 내지 200 ㎍ 범위의 다양한 농도의 BCMA-Fc 융합 단백질을 대략 1 mL의 토실 활성화된 비드(예를 들어 2.8 μm의 직경을 갖는 약 4x109 개의 토실활성화된 비드 또는 4.5 μm의 직경을 갖는 약 4x108 개의 토실활성화된 비드 함유)에 첨가하였다. 0.1 % 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 포스페이트 완충 용액(PBS)에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션함으로써 공유 결합 커플링을 수행하였다. 비드를 세척하고 0.1 % HSA와 함께 1mL PBS에 재현탁시켰다. 접합 전후에, 비드 농도는 셀로미터(Cellometer )를 사용하여 결정되었다. 비드에 커플된 BCMA-Fc 항원의 백분율을 SDS 페이지 분석으로 결정하였다. 하기 실시예에서, 다양한 연구에 사용된 BCMA-접합 비드는 mL 당 첨가된 BCMA-Fc 항원의 양 또는 접합 동안의 항원 농도(μg/mL), 예를 들어 5 μg 또는 5 μg/mL; 50 μg 또는 50 μg/mL; 200 μg 또는 200 μg/mL 등을 참고하여 언급된다.
하기 기개된 일부 연구에 대해, 비드는 실질적으로 상기 기개된 바와 같은 절차를 사용하여 1:1 비로 BCMA-Fc 및 항-CD28 항체와 이중 접합되었다.
실시예 2: CAR T 세포의 항-BCMA 항체-접합된 비드 자극
실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 BCMA-접합 비드(4.5 μm의 직경)를 항-BCMA CAR-발현 T 세포와 인큐베이션하였다. T 세포는 건강한 도너의 백혈구 성분 채집술 샘플로부터 면역친화도-기반 농축으로 분리된었다. 분리된 T 세포를 2 개의 항-BCMA CAR 중 하나를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질 도입하였고, 각각은 BCMA에 대해 특이적인 상이한 scFv 항원-결합 도메인, 스페이서, CD28 막 관통 영역, 4-1BB 공자극 신호 전달 영역 및 CD3-제타 유래 세포 내 신호 전달 도메인을 함유했다(scFv 부분만 상이하며 항-BCMA CAR #1 및 항-BCMA CAR #2로 표기). 바이러스 벡터 구조물은 추가로 절단형 EGFR(EGFRt)을 암호화했고, 이는 CAR 발현을 위한 대리 마커로 기능했으며; EGFRt-암호화 영역은 T2A 스킵 서열에 의해 CAR 서열과 분리되었다. 형질 도입 후에, 세포는 증폭되었고, CAR+ CD4+ T 세포 대 CAR+ CD8+ T 세포가 대략 1:1의 비율로 제형화되었고 생성된 조성물은 냉동 보존으로 동결되었다. 기재된 연구에 대해, T 세포 조성물을 발현하는 항-BCMA CAR #1 및 항-BCMA CAR#2-발현의 형질 도입 효율은, EGFRt 대리 마커 검출을 위해 항-EGFR 항체를 이용하여 결정된 바와 같이 각각 45 % 또는 56 %이었다.
항-BCMA-CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 해동시키고 100 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드를 비드:세포의 비율을 1:1로 첨가하고 5 일 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 5 일 동안 비드:세포의 비율을 1:1로 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양하였다. CAR을 발현하지 않은 T 세포(모의 연구 그룹)도 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후에 평가되었다.
증식을 평가하기 위해, 항-BCMA CAR-발현 T 세포를 함유하는 세포 조성물을 BCMA-접합 비드와의 인큐베이션 전에 제조사의 프로토콜에 따라 증식 마커 염료 CELLTRACE VIOLET(CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA)로 표지하였다. 도 1에 도시된 예시적인 결과는 BCMA-접합 비드와의 인큐베이션이 CD3+ T 세포에서 CTV 염색의 형광 강도 감소를 초래했고, 이는 세포 분열의 수에 따른 증식 정도를 나타내는 증식 염료의 희석을 나타낸다는 것을 입증하였다. 모의 세포의 경우, 인큐베이션 후 생존한 CD3+ T 세포는 매우 적었으며 항-BCMA CAR을 발현하지 않는 모의 세포에 대해서는 CTV 강도의 감소가 관찰되지 않았다. 상기 데이터는 BCMA-접합 비드와의 인큐베이션이 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포에서 세포 증식을 특이적으로 증가시켰음을 나타냈다.
BCMA-접합 비드와의 인큐베이션 후 CAR+ T 세포의 증폭이 특이적으로 농축되는지를 평가하기 위해, T 세포 조성물의 세포를 CD4 또는 CD8의 표면 발현 및 항-EGFR 항체를 이용하여 EGFRt 형질 도입 마커의 발현에 대해 염색하였고 유동 세포 측정으로 분석하였다. BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션한 후 CAR+ T 세포의 농축 정도(EGFRt 대리 마커의 발현으로 검출)를 항-CD3/항-CD28 비드를 사용한 다클론성 자극 후 농축과 비교하였다. 세포 증식 정도(CTV 증식 염료의 염색 강도의 희석에 의해 결정) 및 활성화 정도(CD25 또는 PD-1의 표면 발현에 의해 결정)는 BCMA-접합 비드 또는 대조군 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양된 T 세포 조성물에서 또한 비교되었다.
표 E1에 도시된 바와 같이, 5 일 동안 BCMA-접합 비드와 함께 항-BCMA CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물의 인큐베이션은 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드와 함께 같은 T 세포 조성물을 인큐베이션한 것과 비교할 때, EGFRt를 발현하는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 보다 큰 백분율을 초래했고, 이는 BCMA-접합 비드가 항-BCMA CAR+ T 세포를 농축함을 나타낸다.
[표 E1]
Figure pct00006
도 2a에 도시된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드와의 인큐베이션과 비교하여, 항-BCMA-CAR-발현 T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 5 일 동안 BCMA-접합 비드와의 인큐베이션은 CTV 증식 염료의 강도에서 보다 큰 저하로 입증된 바와 같이, CD25의 감소된 발현이나, 어느 정도 보다 큰 증식 능력을 초래했다. 도 2b는 x 축은 CTV 염색 강도를 나타내고 y 축은 FlowJo 소프트웨어에 따라, "최대 %"의 측면에서 데이터를 표시하기 위해 정규화된 세포 수("정규화 모드(normalized to mode)"로 표시)를 나타내는 막대 그래프 플롯을 제공한다. 최대 %는 최대 세포 수를 함유하는 빈(bin) 내의 세포 수로 나누어진 각 빈 내의 세포 수를 나타낸다(x 축에서 파라미터에 대한 수치 범위). FlowJo는 256 빈을 사용하고 각각의 그래프는 최대 빈의 백분율로 조정되었다. 도시된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28-접합 비드와 인큐베이션된 T 세포와 비교하여 적어도 세포의 서브세트에서 CTV 염색의 약간 저하된 강도(세포 증식을 입증하는 보다 높은 희석)가 관찰되었다. 또한, 도 2c에 도시된 바와 같이, PD-1의 발현이 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드와 인큐베이션된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 증가한 반면, BCMA-접합 비드와 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 인큐베이션은 특히 CD8+ T 세포에서 PD-1의 발현 증가를 초래하지 않았다.
CAR+ T 세포의 농축 정도를 추가로 평가하기 위해, 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 3 개의 상이한 도너로부터 유래한 T 세포를 포함하는 3 개의 별개의 T 세포 조성물을 BCMA-접합 비드와 인큐베이션하였다. 세포를4 일, 7 일 또는 14 일의 인큐베이션 후에 유동 세포 측정으로 분석하였다(세포를 7 일째에 재플레이팅). 도 3a에 도시된 바와 같이, 항-BCMA CAR 발현 T 세포의 백분율이 3 개의 T 세포 조성물 모두에서 시간의 흐름에 따라 증가했다. 각각의 조성물로부터 CD8+ CAR+ 세포를 4 일, 7 일 또는 14 일의 인큐베이션 후에 CD25, CD27 또는 CCR7의 표면 발현에 대해 유동 세포 측정으로 분석하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, CD25 및 CCR7 표면 발현의 수준은 4 일의 측정치와 비교할 때 인큐베이션 중에 감소했다. 대조적으로, CD8+ CAR+ 세포에서 CD27의 표면 발현은 상대적으로 변함없이 유지되었다.
실시예 3: CAR T 세포에 대한 BCMA-접합 비드 적정의 효과
항-BCMA CAR+ CD4/CD8 T 세포를 함유하는 T 세포 조성물은, 생성된 제형화된 조성물이 대략 74 % CD8+ 세포 및 21 % CD4+ 세포를 함유한다는 점을 제외하고 실질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성되었고, 여기서 전체 세포의 82 %가 항-BCMA CAR에 대해 양성(가용성 BCMA-FC를 이용하여 검출)이었고 항-EGFR 항체를 이용하여 결정된 바와 같이 EGFRt에 대해 68 %가 양성이었다. 항-BCMA CAR+ T 세포를 함유하는 조성물은 냉동 보존으로 동결되었고 후속 연구에 사용하기 전에 해동되었다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 다양한 제조의 BCMA-접합 비드(4.5 μm의 직경; 50 μg/ml, 25 μg/ml, 10 μg/ml 또는 5 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드 포함)를 항-BCMA CAR-발현 T 세포를 함유하는 세포 조성물에 비드:세포의 비율을 1:1로 추가한 뒤, 4 일 동안 인큐베이션하였다. CTV 증식 마커 염료로 표지된 T 세포를 세포 증식의 지표로서 CTV 신호의 강도에 대해 유동 세포 측정으로 모니터링했다. 세포를 CD3, CD4, CD8, CD25, PD1 및 EGFRt 대리 마커의 표면 발현에 대해 유동 세포 측정으로 또한 평가하였다.
도 4a는 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 표면 CD25 염색 수준의 막대 그래프를 나타내고 도 4b는 BCMA-접합 비드의 지시된 농도로 인큐베이션한 후에 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 PD-1의 표면 발현에 대한, 상기 기재된 바와 같은 정규화 모드 막대 그래프 플롯을 나타낸다. 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, BCMA-접합 비드와의 인큐베이션은 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에서 CD25(상위 패널) 및 PD-1(하위 패널)의 표면 발현에서의 용량 의존적 증가를 초래했다.
도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, CD3+ 세포의 수로 평가된 바와 같이 총 T 세포 계수에서 용량 의존적 차이는 없었으나(도 5a), BCMA-접합 비드와 인큐베이션한 후 CD4+ 세포에서 CTV 평균 형광 강도(MFI)에서 약간의 용량 의존적 감소가 있었다(도 5b). 도 6에 도시된 바와 같이, BCMA-접합 비드와의 인큐베이션은 CD4+ 세포에서 CD25 표면 발현에서의 용량 의존적 증가를 초래했다.
상기 데이터들은 함께 보다 낮은 농도의 BCMA를 갖는 BCMA-접합 비드는 보다 낮은 활성 마커 발현 및 보다 높은 증식을 실증함을 나타냈다. 상기 데이터들은 항-BCMA CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물의 특정 특성이 비드에 접합된 BCMA 항원 양의 적정으로 조작될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: BCMA-접합 비드로 자극된 항-BCMA CAR+ T 세포에서 T 세포 마커의 평가
실시예 1에 기재된 바와 같이 다양한 양의 BCMA 항원으로 접합된 BCMA-접합 비드(4.5 μm의 직경)를 항-BCMA CAR+ T 세포와 인큐베이션하고 T 세포 마커의 발현을 평가했다.
하나의 실험에서, 실질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산되고 CD4+와 CD8+ T 세포의 비율을 1:1로 제형화하여 저온동결한 항-BCMA CAR T 세포를 해동하고 12 웰 플레이트의 웰당 1.5 x 106 개의 세포로 시딩했다. 상기 세포를 50 μg/ml, 100 μg/ml 또는 200 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드 존재 하에 3 일 동안 인큐베이션했다. 상기 인큐베이션은 T 세포 대 비드가 1:1인 비율로 수행했다. 유동 세포 측정에 의한 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 CD25 표면 발현의 분석은 모든 농도의 BCMA-접합 비드에 대해 CD25의 유사한 유도를 나타냈다(도 7a).
또 다른 실험에서, 상기 기재된 바와 같이 제조된 대략 1.5 x 106 개의 CAR+ T 세포를 12-웰 플레이트의 웰당 추가하고 200 μg BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드와 함께 CAR+ T 세포 대 BCMA-접합 비드의 비율을 1:0.3, 1:1 또는 1:3(대략 각각 웰 당 0.5x106, 1.5x106 및 4.5x106 개의 비드)으로 인큐베이션했다. 대조군으로, 5 μg/mL 항-CD3 항체(자극을 위한 차선의 농도)로 웰을 코팅하거나 또는 세포를 임의의 제제의 부재 하(무자극 대조군)에 시딩하였다. 5 μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 각각의 조건을 인큐베이션했다. 세포를 4 일 동안 인큐베이션하고나서 CD4, CD8, Tim3, PD-1, CD25 및 CD69의 표면 발현에 대해 유동 세포 측정으로 분석하였다. BCMA-접합 비드와 항-BCMA CAR+ T 세포의 인큐베이션은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD25(도 7b), CD69(도 7c) 및 Tim3(도 7d)의 표면 발현을 증가시켰다. CAR+ T 세포 대 비드의 비율을 1:3으로 제공한 가장 많은 양의 비드 존재 하에 자극한 세포가 상기 마커의 발현에서 가장 큰 증가를 나타냈다. 도 7e에 도시된 바와 같이, CD4+ 세포를 CAR+ T 세포 대 비드의 비율을 1:3으로 인큐베이션했을 때 항-BCMA CAR+ T 세포에서 PD-1의 표면 발현이 또한 가장 컸다. CAR+ T 세포 대 비드의 비율을 1:3으로 제공한 보다 높은 BCMA 비드 농도에서 BCMA-접합 비드로 자극했을 때 CD8+ 세포에서 PD-1 표면 발현에서 약간의 증가가 또한 있었다. 상기 결과는 인큐베이션하는 동안 존재하는 BCMA 농도가 CAR+ T 세포에서 표면 마커 발현을 차등적으로 조절할 수 있다는 발견과 일치한다.
도 7f 에 도시된 바와 같이, 레날리도마이드 부재 하에 비드와 인큐베이션(비히클 대조군)한 것과 비교하여, T 세포 대 비드의 비율 1:1에서 200 μg BCMA 항원으로 접합된 비드와 함께 3 일 동안 인큐베이션한 후 T 세포의 증식 능력이 5 μM 레날리도마이드의 존재 하에 증가했다(CTV 염료의 강도에서 감소로 관찰). 도 7g 및 7h에 도시된 바와 같이, 인큐베이션하는 동안 레날리도마이드의 존재는 BCMA-접합 비드와 함께 항-BCMA CAR+ T 세포의 인큐베이션(도 7g) 또는 항-CD3 자극(도 7h) 후에 유도된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD25의 표면 발현 정도를 추가로 증가시켰다.
추가 실험에서, 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산된 항-BCMA CAR-T 세포 조성물을 웰 당 5x105 개의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이트했다. 테스트된 CAR-T 세포 조성물은 플레이트로 평균, 대략 45 % 항-BCMA CAR+ 세포를 함유했다. 각각의 조성물로부터의 세포를 T 세포 대 비드 1:1의 비율에서 5 μg/ml, 50 μg/ml 또는 200 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드 존재 하에 18 시간 동안 인큐베이션했다. 대조군으로서, 세포를 항-CD3/항-CD28 항체-접합 비드와 함께(양성 대조군) 또는 제제를 추가하지 않고(음성 대조군) 인큐베이션했다. 상기 인큐베이션은 레날리도마이드 부재 하에 또는 0.5 μM 또는 5 μM 레날리도마이드의 존재 하에 수행했다. 인큐베이션 후에, 세포를 전사 인자 Blimp1, EOMES, GATA-3, ikaros, helios 및 Tbet 및 CD25, CD31 및 PD-1 마커에 대해 유동 세포 측정으로 세포 외 및 세포 내 항체 염색을 허용하는 시약으로 처리했다.
하나의 예시적인 도너로부터 CAR+ T 세포 조성물의 인큐베이션 후 BLIMP-1(도 8a), CD25(도 8b), CD31(도 8c), PD-1(도 8d), TbeT(도 8e) 및 EOMES(도 8f), GATA-3(도 8g), Helios(도 8h) 및 Ikaros(도 8i)에 대한 마커의 수준이 도시된다. 도시된 바와 같이, 다수의 평가된 T 이펙터 세포-관련 전사 인자 및 활성 마커의 발현이 BCMA-접합 비드로 자극 후에 증가했다. 다수의 평가된 마커에 대해, 증가된 발현의 정도는 항-CD3/항-CD28 비드로 자극하여 유도된 발현과 유사했다. 일부 경우에, BCMA-접합 비드로의 자극 정도는 5 μg 비드의 존재에서 가장 컸다. 도 8i에 도시된 바와 같이, Ikaros의 발현 수준은 모든 조건에서 레날리도마이드의 존재 하에 감소했다. 테스트된 조건 하에서 자극했을 때 제 2 도너로부터의 세포에서는 Helios 발현에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다는 점을 제외하고 유사한 결과가 제 2 도너로부터 생성된 CAR+ T 세포 조성물로부터 관찰되었다.
실시예 5: BCMA-접합 비드로 자극한 항-BCMA CAR T 세포의 활성 평가
BCMA-접합 비드의 존재하에 증폭을 포함하는 공정으로부터 생성된 항-BCMA CAR T 세포의 활성을 평가하였다.
A. 이펙터 반응
실질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산되고 CD4+와 CD8+ T 세포의 1:1 비율에서 제형화된 냉동동결된 항-BCMA CAR T 세포를 해동했다. 달리 지시되지 않는 한, 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 5 μg/ml 또는 50 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드(직경 약 4.5 μm)를 T 세포 대 비드 1:2의 비율에서 5 μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 추가했다. 세포를 최대 14 일까지 인큐베이션했고, EGFRt 대리 마커 및 세포 용해 활성에 대해 유동 세포 측정으로 사이토카인 분비, 세포 증폭에 대해 다양한 시점에서 분석하였다.
a. 사이토카인 발현
(i) 상청액에 사이토카인의 존재
BCMA-접합 비드 추가하고 24 시간 후에, 배양 상청액에서 TNF-α, IFNγ 및 IL-2의 존재를 평가했다. 도 9a-9c에 도시된 바와 같이, BCMA-접합 비드와의 인큐베이션은 배양 상청액으로 IFNγ(도 9a), IL-2(도 9b) 및 TNF-α(도 9c)의 분비를 유도했다. 5 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물과 비교하여 세포를 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드와 함께 인큐베이션 했을 때 사이토카인 생산 정도가 보다 컸고, 이는 BCMA 비드를 통한 CAR 자극은 용량 의존적임을 실증한다. 도시된 바와 같이, 레날리도마이드는 BCMA-접합 비드로 자극 후에 BCMA-유도된 CAR+ T 세포 사이토카인 생산을 증가시켰다.
추가의 예시적인 연구에서, 2 개의 상이한 항-BCMA CAR T 세포 조성물이 상이한 도너로부터 생성되었고, 각각은 같은 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포를 함유했다. 세포를 해동하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 5 μg/mL 또는 200 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드(직경 약 4.5 μm)와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션은 T 세포 대 비드 1:1의 비율에서 1 μM 또는 5 μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 수행했다. BCMA-접합 비드 추가 24 시간 후에, 항-BCMA CAR+ T 세포에 의한 IL-2 생산을 배양 상청액에서 평가했다. 도 9d에 도시된 바와 같이, 보다 낮은 항원 자극(5 μg/mL BCMA-접합 비드)과 비교하여 IL-2의 보다 높은 생산이 높은 항원 자극의 존재(200 μg/mL BCMA-접합 비드)에서 관찰되었다. 1 μM 또는 5 μM의 레날리도마이드는 높고 낮은 항원 자극 모두의 존재에서 사이토카인 생산을 증가시켰다.
(ii) 세포 내 사이토카인 수준
항-BCMA CAR+ T 세포는 1 μM 레날리도마이드 또는 비히클 및 50 μg/mL BCMA-Fc 접합 비드의 존재 하에 2 시간 동안 인큐베이션하고 세포를 인산화된 STAT 5에 대해 유동 세포 측정으로 평가했다. IFNγ 및 TNFα 사이토카인 수준을 평가하기 위해, 항-BCMA CAR+ T 세포를 0.1 μM 또는 1 μM 레날리도마이드 또는 비히클 및 5 μg/mL, 50 μg/mL 또는 200 μg/mL BCMA-Fc 접합 비드의 존재 하에 24 시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 형질 도입되고, 살아 있는 CD3+ 세포 상에 게이트하고 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 IFNγ 및 TNFα의 세포 내 사이토카인 축적을 유동 세포 측정으로 평가했다.
도 9e에 도시된 바와 같이, 항원으로 2 시간 자극은 무자극 대조군(점선으로 도시)과 비교하여 인광체-STAT5에 대해 양성인 세포의 백분율을 증가시켰다. 대표적인 정상 CAR-T 세포 도너로부터 생성된 항-BCMA CAR T 세포로부터의 IFNγ 및 TNFα의 세포 내 사이토카인 수준에 대한 결과가 도 9f에 도시된다. 상기 연구에서, 항-BCMA CAR-T 세포 사이토카인 생산은 항원 수준 및 농도의 넓은 범위에 걸쳐 레날리도마이드로 증가되었다.
b. 세포 증식
인큐베이션 시작 시점(파선)에 존재하는 세포와 비교하여, 5 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로는 아니나 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드로 항-BCMA CAR+ T 세포의 자극 후에 4 일(도 9g) 및 7 일(도 9h)에 모니터링된 전체 세포 계수가 증가했다. 7 일째 레날리도마이드의 존재하에 50 ug 비드와 함께 인큐베이션된 세포에서 증식의 작은 증가가 관찰되었다.
추가로 증식을 평가하기 위해, 항-BCMA CAR-발현 T 세포를 함유하는 세포를 BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션하기 전에 제조사의 프로토콜에 따라 증식 마커 염료 CELLTRACE VIOLET(CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA)로 표지했다. 증식을 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드로 자극된 세포에서 유동 세포 측정을 이용하여 염료 희석으로 평가했다. 레날리도마이드 부재 하의 증식과 비교하여, 레날리도마이드의 존재 하에 4 일째에 CTV 희석에 의해 평가된 바와 같이 증식에서 약간의 지연이 있었으나 7 일째는 없었다(도 9i).
c. 증폭
BCMA-접합 비드 추가 후 4 일 및 7 일에, 인큐베이션된 세포를 CD4 또는 CD8 및 항-EGFR 항체로 염색하여 CAR+ T 세포에 대한 대리로서 EGFRt에 양성인 세포의 백분율을 결정했다. 플레이팅 시에, BCMA-Fc로 염색하여 결정된 바와 같이 26 %의 CD4+ 세포가 항-BCMA CAR을 발현했고 39 %의 CD8+ 세포가 항-BCMA CAR을 발현했다. 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드 존재 하에 세포를 인큐베이션했을 때, EGFRt+CD4+ T 세포의 백분율은 인큐베이션 초기에 약 26 %에서 4 일까지 40 % 초과(도 9j) 및 7 일까지 60 % 초과(도 9k)로 증가했다. 도 9k에 도시된 바와 같이, 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드 존재 하에 세포를 인큐베이션했을 때, EGFRt+CD8+ T 세포의 백분율은 인큐베이션 초기에 약 38 %에서 7 일까지 60 % 초과로 증가했다. 5 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드와 비교하여 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드 존재 하에 세포를 인큐베이션했을 때 세포 증폭의 정도가 가장 컸다. 레날리도마이드의 존재는 상기 연구에서 CAR+ T 세포 증폭 정도에 실질적으로 영향을 주지 않았다.
d. 세포 용해 활성
BCMA-접합 비드와 인큐베이션 후 CAR+ T 세포의 세포 용해 활성을, BCMA+ 다발성 골수종 세포주인 BCMA-발현 표적 세포주 RPMI-8226과 인큐베이션하여 평가하였다. 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 BCMA-접합 비드(5 μg/ml 또는 50 μg/ml)와 항-BCMA CAR+ T 세포의 인큐베이션 7 일 후에, 비드를 배양물로부터 제거하고 5μM 레날리도마이드의 추가적인 존재 또는 부재 하에 세포를 이펙터 세포 대 표적 세포의 3:1 또는 1:1 비율에서 RPMI-8226 표적 세포와 함께 플레이트했다. 세포 용해 평가를 수행하기 위해, 표적 RPMI-8226 세포를 NucLight Red(NLR)로 표지하여 현미경으로 표적 세포를 추적할 수 있게 했다. 세포 용해 활성은 적색 형광 신호에 의해 결정된 바와 같이(INCUCYTE® Live Cell Analysis System, Essen Bioscience 이용) 4 일의 기간에 걸쳐 생존 가능한 표적 세포의 손실을 측정함으로써 평가되었다. RPMI-8226 표적 세포와 함께 인큐베이션하기 전 0 일의 세포에 대해 생존 가능한 세포의 수를 정규화하였다.
이펙터 대 표적 세포의 1:1 비율에서 예시적인 결과가 도 9l에 도시된다. 도시된 바와 같이, 항-BCMA CAR+ T 세포는 평가에서 효과적인 사멸을 실증했다. 5 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드로 자극된 항-BCMA CAR+ T 세포가 5 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드로 자극된 항-BCMA CAR+ T 세포보다 세포 사멸에 있어서 약간 덜 효과적이었다. 모든 조건에 대해, 사멸 평가 전 7 일 인큐베이션 동안 레날리도마이드와의 사전 인큐베이션은 CAR+ T 세포의 세포 용해 활성을 증가시켰다. 세포 사멸 평가 중에 레날리도마이드의 존재는 사멸 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않았다. RPMI 8226 세포를 단독 또는 레날리도마이드의 존재 하에 배양할 경우 세포 사멸은 관찰되지 않았고, 이는 상기 평가에서 표적 세포 생존력에 레날리도마이드가 직접 영향을 미치지 않았음을 실증한다.
추가로 예시적 연구에서, 항-BCMA CAR+ T 세포를 처리하지 않았거나 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드(직경 약 4.5 μm)와 함께 비드 대 세포의 1:1 비율에서 24 시간 또는 7 일 동안 인큐베이션했다. 항-BCMA CAR T+ 세포를 배양물로부터 제거하고 이펙터 세포 대 표적 세포의 비 0.3:1 또는 1:1에서 RPMI-8226 표적 세포와 함께 인큐베이션했다. BCMA-접합 비드와 함께 인큐베이션 후 표적 세포에 대한 사이토카인 반응을 평가하기 위해, IFN 감마 수준을 상청액에서 측정했다. 도 9m에 도시된 바와 같이, BCMA-접합 비드와 24 시간 동안 인큐베이션된 항-BCMA CAR+ T 세포는 어느 비율로 RPMI-8226 표적 세포와 함께 배양될 경우 다른 테스트된 세포와 비해 IFN-감마를 더 많이 생산했다. 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율 1:1에 대해 도 9n에 도시된 바와 같이, 항-BCMA CAR T 세포는 BCMA-접합 비드와 함께 24 시간 또는 7 일 동안 인큐베이션 후 효과적인 사멸을 입증했고 세포는 비드로 자극 후에 기능을 보유하고 있음을 입증했다.
B. 순차적인 재자극
각각이 같은 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포를 함유하는 3 개의 상이한 도너로부터 항-BCMA CAR T 세포 조성물이 생성되어 해동되었고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 50 μg/mL BCMA-접합 비드 조성물로부터의 비드(직경 약 4.5 μm)와 함께 비드 대 세포의 비율 1:1에서 7 일 동안 인큐베이션되었다. 상기 인큐베이션은 5μM 레날리도마이드의 존재 또는 레날리도마이드의 부재(비히클 대조군) 하에 수행되었다. 세포를 7 일 후에 수거하고 최대 28 일까지 3 개의 추가 라운드 동안 재플레이트하였고, 각 라운드는 초기 시딩 밀도로 재설정하고 같은 농도의 레날리도마이드의 존재하에 추가 7 일 동안 인큐베이션하는 것을 수반하였다.
전처리 후 각각의 리셋에서, 추가로 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 이펙터 세포 대 표적 세포(E:T)의 비율 1:1에서 BCMA-발현 표적 세포주 RPMI-8226(NucLight Red(NLR)로 표지)과 함께 인큐베이션하여 세포 용해 활성을 평가했다. 적색 형광 신호에 의해 결정된 바와 같이(IncuCyte® Live Cell Analysis System, Essen Bioscience 이용) 최대 80 내지 150 시간의 기간에 걸쳐 생존 가능한 표적 세포의 손실을 측정하여 세포 용해 활성을 평가했다. 각 조건으로부터의 세포를 3 회 플레이팅 하였다. 비히클 단독 대조군(100 %로 설정)과 비교하여 세포 사멸 %를 결정하였다.
도 10a는 7 일, 14 일 또는 21 일 동안 전처리 후 예시적 도너로부터의 항-BCMA CAR+ T 세포의 세포 용해 활성에 대한 결과를 보여준다. 도시된 바와 같이, 레날리도마이드와 7 일 또는 14 일 동안 사전 인큐베이션된 항-BCMA CAR+ T 세포는 레날리도마이드의 존재 하에서 사전 인큐베이션되지 않은 세포와 비교하여 보다 큰 세포 용해 활성을 나타냈다. 상기 도너에서, 7 일과 비교하여 14 일 또는 21 일 동안 레날리도마이드와 함께 사전 인큐베이션된 항-BCMA CAR+ T 세포에 의한 사멸 효능의 전반적인 감소가 관찰되었다. 7 일 또는 14 일 동안 레날리도마이드로 전처리 후 항-BCMA CAR+ T 세포의 세포 용해 활성에서 유사한 영향이 상기 도너에서 관찰되었으며; 21 일 동안 레날리도마이드 전처리 후의 세포 용해 활성은 상기 도너에서 평가되지 않았다. 도 10b에 도시된 바와 같이, 항-BCMA CAR+ T 세포의 증가된 사멸 효능은 모든 시점에서 레날리도마이드와 사전 인큐베이션된 상기 도너 세포에서 관찰되었다.
실시예 6: BCMA-접합 비드의 존재 하에 항-BCMA CAR+ T 세포의 형질 도입 및 증폭
단핵구가 농축된 인간 백혈구 성분 채집술 샘플은 백혈구 성분 채집술 수집 시스템을 사용하여 대상체로부터의 전혈 샘플로부터 수득되었다. 백혈구 성분 채집술과 같은 날에, 백혈구 성분 채집술 샘플의 세포를 세척하고 친화도-기반 선택에 사용하기 위해 완충액에 재현탁했으며, 상기 완충액은 인산 완충 식염수(PBS), EDTA 및 인간 혈청 알부민을 함유했다. T 세포의 면역 친화성-기반 선택을 위해, 선택 완충액에서 세척된 세포를 CD4 및 CD8에 특이적인 모노클론 항체에 커플링된 자기 비드와 함께 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 자기 분리 컬럼을 사용한 양성 선택에 의해 농축시켰다. 1:1의 비로 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포를 동결 보존 배지에 재현탁시키고, 세포를 제어 속도 냉동고에서 동결보존하고 추가 사용까지 액체 질소에 보관하였다. 4 개의 상이한 도너로부터의 동결 보존된 세포가 사용되었다.
동결보존된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 해동하고 세척한 뒤 T 세포 활성화 제제로 세포의 사전 활성없이, 예를 들어 항-CD3/항-CD28과 함께 세포를 인큐베이션하지 않고 렌티바이러스 벡터 입자와 접촉시켰다. 형질 도입을 위해, 대략 1 x 106 개의 해동된 T 세포를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 첨가했다. 다가양이온 형질 도입 보조제(이 경우, 100 μg/ml 프로타민 설페이트)와 혼합된 렌티바이러스 벡터 입자를 웰에 첨가했다. 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 항-BCMA CAR을 암호화하는 이식 유전자 및 자가 절단T2A 서열에 의해 CAR 서열과 분리되고 형질 도입 마커로 사용하기 위한 절단형 EGFR(EGFRt) 서열을 암호화하는 핵산을 함유했다. 웰 당 최종 부피를 100 μl로 조정했다. 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 세포를 함유하는 5 개의 상이한 조성물을 상기 기재된 절차를 이용하여 제조했다.
BMCA-Fc 및 항-CD28로 접합된 비드(BCMA/항-CD28-접합 비드로 표시)를 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 형질 도입 직후에, 각각의 도너로부터 생성된 대략 50 μL의 세포를 세포 당 비드 1:1의 비율로 BCMA/항-CD28-접합 비드 또는 항-CD3/항-CD28 접합 비드를 함유하는 배지 500 μL에 첨가하고 12 일 동안 인큐베이션했다.
세포를 격일로 계수하고, 형질 감염 후 3, 7, 10 및 12 일에 항-EGFR 항체를 사용하여 EGFRt(CAR 발현에 대한 대리 마커)의 발현에 대해 염색하였다. 항-CD3/항-CD28 접합 비드의 존재 하에 최대 12 일 동안 인큐베이션된 T 세포 조성물은 12 일의 배양으로 발생한 대략 95 배 내지 140 배 사이의 증폭으로 배양에서 증폭했음을 데이터는 나타냈다. 형질 도입되지는 않았으나, 항-CD3/항-CD28 접합 비드와 인큐베이션된 모의 대조 T 세포 증폭은 인큐베이션 시작과 비교하여 12 일에 약 65 배의 증폭을 또한 나타냈다. 형질 도입 직후 BCMA/항-CD28 비드와 함께 인큐베이션된 T 세포 조성물의 증폭 배수는 12 일까지 약 1.0 배 내지 7.0 배이었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28의 존재 하에 인큐베이션된 T 세포 조성물은 바이러스 입자로 형질 도입하기 전 세포를 활성화하지 않고도 EGFRt 형질 도입 마커의 높은 발현을 나타냈다. 상기 결과는 표면 CAR 발현과 관련된 즉각적인 자극과 일치한다. BCMA/항-CD28 비드로 자극된 T 세포는 EGFRt에 대해 양성인 세포의 같은 백분율에 도달하는데 보다 긴 동력학을 나타내었지만, 12 일까지 약 60 % 내지 90 % 사이의 세포가 EGFRt에 대해 양성이었다. 상기 결과는 항-CD3/항-CD28 비드와 비교하여 BCMA/항-CD28 비드와 함께 인큐베이션 후 세포의 보다 느린 성장에도 불구하고, CAR+ T 세포는 12 일의 배양에 걸쳐 농축될 수 있고, 이는 BCMA/항-CD28 비드가 CAR+ T 세포를 증폭했음을 나타낸다.
렌티바이러스 벡터 입자로 형질 도입하기 전 세포를 활성화하지 않고, 상기 기재된 조건 하에서 인큐베이션된 T 세포도 CD4 및 CD8의 표면 발현에 대해 12 일째에 염색하고 유동 세포 측정으로 분석했다. 대조군으로, 또한 CD4+ 및 CD8+ 세포의 1:1 비율에서 도너 세포로부터 생성된 T 세포 조성물을 형질 도입하기 전에 상기 기재된 바와 같이 항-BCMA CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자와 활성화된 세포를 접촉하기 전 24 시간 동안에 항-CD3/항-CD28 비드로 자극하여 활성화했고; 상기 조건에서 세포를 임의의 접합 비드 부재 하에 12 일 동안 추가로 인큐베이션했다.
표 E2는 상기 조건 하에서 인큐베이션된 같은 도너 세포로부터의 결과를 요약한다. 나타낸 바와 같이, 형질 도입 전에 세포를 활성화시키지 않고 항-CD3/항-CD28 접합 비드 또는 BCMA/항-CD28 비드와 함께 세포의 인큐베이션은, 형질 도입 전 항-CD3/항-CD28 접합 비드의 존재 하에 먼저 24 시간 활성화된 세포와 비교하여 CD4/CD8 T 세포의 비율이 달라졌다. 또한, 상기 결과들은 T 세포를 사전 활성화시키지 않고 BCMA/항-CD28 항체 접합 비드 또는 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드와 함께 인큐베이션은 유사한 CAR 발현 수준 및 CD4/CD8 세포 표현형을 초래했다. 표 E3에 나타낸 바와 같이, 형질 도입하기 전 항-CD3/항-CD28 접합 비드의 존재하에 24 시간 동안 먼저 활성화된 세포와 비교하여, CD4/CD8 T 세포 비율의 유사한 역전이 형질 도입하기 전에 세포를 활성화시키지 않고 항-CD3/항-CD28 비드와 인큐베이션할 때 4개의 상이한 도너로부터 유래한 T 세포에서 관찰되었다.
[표 E2]
Figure pct00007
[표 E3]
Figure pct00008
실시예 7: ROR1 접합 비드의 생성
수용체 타이로신 인산화효소 유사 고아 수용체 1(ROR1)을 상업적으로 이용 가능한 토실-활성화 자성 비드(ThermoFisher, Waltham MA)의 표면에 IgG의 Fc 영역 C-말단에서 융합된 인간 ROR1의 세포 외 도메인을 함유하는 ROR1-Fc 융합 폴리펩티드를 공유 결합으로 커플링하여 비드에 접합시켰다. 비드는 1 차 아미노 및 설프히드릴기에 공유 결합으로 결합한 초상자성, 비다공성, 단순 분산성, 토실활성화된 비드였다. 접합은 대략 2.8 μM(M-280으로 표기) 또는 4.5 μM(M-450으로 표기)의 직경을 갖는 비드를 이용하여 수행했다.
ROR1-Fc는 하기와 같은 링커에 연결된 인간 ROR1 단편 및 인간 IgG1 Fc를 함유했다:
QETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID 번호: 33).
다양한 농도의 ROR1-Fc 융합 단백질을 대략 1 mL의 토실활성화된 비드(예를 들어 2.8 μm의 직경을 갖는 4x109 개의 토실활성화된 비드)에 첨가했다. 공유 커플링을 0.1 % 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 인산 완충 용액(PBS)에서 37 ℃ 로 밤새 인큐베이션하여 수행했다. 비드를 세척하고 0.1 % HAS의 PBS 1 mL에서 재현탁시켰다. 접합 후에, 비드 농도는 셀로미터를 이용하여 결정했다.
항-ROR1 CAR-발현 T 세포를 ROR1 Fc-접합 비드와 인큐베이션하여 자극했다.
실시예 8: CD22 접합 비드의 생성
CD22를 상업적으로 이용 가능한 토실-활성화 자성 비드(ThermoFisher, Waltham MA)의 표면에 IgG의 Fc 영역 C-말단에서 융합된 인간 CD22의 세포 외 도메인을 함유하는 CD22-Fc 융합 폴리펩티드를 공유 결합으로 커플링하여 비드에 접합시켰다. 비드는 1 차 아미노 및 설프히드릴기에 공유 결합으로 결합한 초상자성, 비다공성, 단순 분산성, 토실활성화된 비드였다. 접합은 대략 2.8 μM(M-280으로 표기) 또는 4.5 μM(M-450으로 표기)의 직경을 갖는 비드를 이용하여 수행했다.
CD22-Fc는 하기와 같은 링커에 연결된 인간 CD22의 세포 외 도메인 및 인간 IgG1 Fc를 함유했다:
DSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRGGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID 번호: 34).
다양한 농도의 CD22-Fc 융합 단백질을 대략 1 mL의 토실활성화된 비드(예를 들어 2.8 μm의 직경을 갖는 4x109 개의 토실활성화된 비드)에 첨가했다. 공유 커플링을 인산 완충 용액(PBS)에서 37 °C로 밤새 인큐베이션하여 수행했다. 비드를 세척하고 0.1 % HAS의 PBS 1 mL에서 재현탁시켰다. 접합 후에, 비드 농도는 셀로미터를 이용하여 결정했다.
항-CD22 CAR-발현 T 세포를 CD22-Fc-접합 비드와 인큐베이션하여 자극하였다.
실시예 9: 비드에 항-이디오타입 항체의 접합
2 개의 상이한 항-CD19 항체 항-이디오타입 (ID) 항체 중 하나인, FMC63-유래 scFv-특이적 항-ID 항체(표 E4에 제시된 서열)를 초상자성, 비다공성, 단순 분산성, 토실활성화된 비드인 상업적으로 이용 가능한 토실-활성화된 자성 비드(ThermoFisher, Waltham MA)의 표면에 공유 결합으로 커플링했다. 상기 비드는 1 차 아미노 및 설프히드릴기에 공유 결합으로 결합한다. 접합을 대략 2.8 μM(M-280으로 표기) 또는 4.5 μM(M-450으로 표기)의 직경을 갖는 비드를 이용하여 수행하였다.
[표 E4]
Figure pct00009
200 μg의 항-ID 항체를 대략 1 mL의 토실-활성화된 비드(예를 들어 2.8 μm의 직경을 갖는 대략 4x109 개의 토실-활성화된 비드 또는 4.5 μm의 직경을 갖는 대략 4x108 개의 토실-활성화된 비드)에 첨가하고 공유 커플링을 0.1 % 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 인산 완충 용액(PBS)에서 37 °C로 밤새 인큐베이션하여 수행하였다. 비드를 세척하고 0.1 % HAS의 PBS 1 mL에서 재현탁시켰다. 접합 후에, 비드 농도는 셀로미터를 이용하여 결정했다.
항-ID 접합 비드의 안정성을 평가하기 위해, 비드를 펠릿화하고, 상청액을 제거하여 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE 겔에 로딩하고 상기 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색했다. 비드에 접합된 총 단백질에 대한 대조군으로, 펠릿화된 비드를 4X (리튬 도데실 설페이트) LDS 샘플 완충액에서 약 70 ℃ 로 20 분 동안 끓이고 대략 12.5 μL 또는 25 μL의 끓인 상청액을 SDS-PAGE 겔에서 러닝하고 쿠마시 블루로 평가했다. 비드에 접합되지 않은 대략 2.5 μg 또는 5.0 μg 항-ID 항체(양성 대조군) 또는 5 μL 0.1 % HSA(음성 대조군)를 또한 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색으로 평가했다. 끓이지 않은 접합 샘플로부터의 상청액에서는 항-ID 항체가 검출되지 않은 반면, 끓인 접합 샘플로부터의 상청액에서는 항-ID 항체가 검출되었고 이는 접합이 안정적이었음을 나타낸다.
실시예 10: 항-이디오타입 항체-접합 비드와 배양된 T 세포의 자극 평가
FMC63-유래 scFv-특이적 항-ID B-1-접합 비드를 T 세포와 인큐베이션했다. CD3-정제된 T 세포를 건강한 도너의 백혈구 성분 채집술 샘플로부터 면역친화도-기반 농축으로 분리했다. 분리된 세포를 FMC63으로부터 유래한 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질 도입하였다. 바이러스 벡터 구조물은 추가로 절단형 EGFR(EGFRt)을 암호화했고, 이는 CAR 발현에 대한 대리 마커로 기능하며; EGFRt-암호화 영역은 T2A 스킵 서열에 의해 CAR 서열과 분리되어 있다. 형질 도입 후에, 세포는 배양 중에 증폭되었고 냉동 보존으로 동결되었다.
T 세포 자극을 연구하기 위해, 해동된 CD4+ 또는 CD8+ CAR-발현 세포를 웰 당 대략 50,000 개의 전체 세포로 별도로 시딩했다. 일부 경우에, 배양 배지에 하기와 같이 사이토카인을 추가로 보충했다: CD4+ 세포에 대해서는, 대략 1200 IU/mL 재조합 IL-7, 20 IU/mL 재조합 IL-15 및 100 IU/mL 재조합 IL-2; CD8+ 세포에 대해서는, 대략 200 IU/mL 재조합 IL-2 및 20 IU/mL 재조합 IL-15. 항-ID B-1 접합 비드를 세포:비드의 비율 1:1 또는 1:5로 세포에 첨가하고 2-3 일마다 50 % 배지 교환으로 최대 14일 인큐베이션했다. 양성 대조군으로, 세포를 세포:비드의 비율 3:1에서 항-CD3/항-CD28 자성 비드와 함께 지시된 사이토카인의 존재 또는 부재 하에 배양했다.
배양 중 다양한 시간에, CD4+ 또는 CD8+ 형질 도입 세포(대리 마커의 발현에 대해 항-EGFR로 검출)를 증폭, PD-1 발현 및 생존력에 대해 평가했다.
도12a 및 12b에 도시된 바와 같이, 특히 사이토카인의 존재 하에서 세포:비드의 비율 1:1 또는 1:5에서 항-ID 접합 비드와 세포를 배양했을 때 CD4+ 및 CD8+ T 세포 각각의 증폭이 관찰되었다. 세포를 대조군 항-CD3/항-CD28 자성 비드와 함께 배양했을 때보다 증폭의 정도가 더 컸다.
CD4+ 세포 서브세트에서 PD-1의 표면 발현을 유동 세포 측정으로 배양 중 3, 7, 10 및 14 일에 평가했다. 도 13에 도시된 바와 같이, PD-1 발현은 항-CD3/항-CD28 자성 비드와 배양된 세포에서 높았으나, PD-1의 수준은 항-ID 접합 비드와 배양된 세포에서 실질적으로 더 낮거나 검출 가능하지 않았다.
도 14에 도시된 바와 같이, 항-ID 접합 비드 또는 대조군 항-CD3/항-CD28 접합 비드의 1:1 또는 1:5 비율로 배양된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 생존력 백분율은 사이토카인의 존재 하에 세포를 추가로 배양했을 때 배양 기간 중 일관성있게 높이 유지되었다. 그러나, 모든 조건 하에서, 세포의 생존력은 첨가된 사이토카인의 부재 하에 감소하였고, 세포 배양 후일에 세포 생존력에 있어 최대 손실이 발생했다.
실시예 11: 항-이디오타입 항체-접합 비드와 함께 배양된 T 세포의 사이토카인 생산 평가
FMC63으로부터 유래한 scFv를 갖는 항-CD19 CAR로 조작된 T 세포가 실질적으로 실시예 10에 기재된 바와 같이 생성되었다. 해동된 CD8+ T 세포를 Golgi 억제제의 존재 하에 4 시간 동안 항-ID B-1 접합 비드와 함께 배양했다. TNFα, IFNγ 및 IL-2의 세포 내 사이토카인 수준을 CAR+ T 세포 서브세트(대리 마커에 대한 항-EGFR로 양성 표면 염색으로 결정) 또는 CAR- T 세포 서브세트(항-EGFR로 음성 표면 염색으로 결정)에서 유동 세포 측정으로 결정했다. 비교로서, CAR+ T 세포(EGFRt+)를 또한 이펙터 세포:T 세포의 비율 1:2에서 CD19-발현 표적 세포(CD19, K562-CD19를 발현하도록 형질 도입된 K562 세포)와 함께 배양했다.
도 15a에 도시된 바와 같이, 세포를 항-ID B-1 접합 비드의 존재 하에 배양했을 때 TNFα, IFNγ 및 IL2 사이토카인의 세포 내 사이토카인 수준은 CAR+ T 세포(EGFRt+)에서 유도되었으나, CAR- T 세포(EGFRt-)에서는 유도되지 않았다. 상기 연구에서, 항-ID 접합 비드의 존재 하에 관찰된 자극의 정도는 대안적인 CAR-특이적 자극 시약인, 항원-발현 K562-CD19 세포를 이용한 CAR+ T 세포의 자극과 유사했다(도 15b). 상기 결과들은 비드에 접합된 항-ID가 작용제이고 항-ID 항체에 의해 인식되는 항원-결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 T 세포를 특이적으로 자극함을 입증했다. 추가로, 비드 시약은, 세포 배양을 요구하고 로트별로 가변성의 경향이 있는 세포주와 비교하여 보다 나은 CAR-특이적 자극 시약을 제공한다.
실시예 12: 순차적인 재자극 후의 증폭 평가
반복된 자극 후에 생체 외에서 증폭시키는 세포의 능력은 지속(예를 들어 초기 활성화 후)되는 CAR+ T 세포의 수용력에 대한 잠재적 대리일 수 있고/거나 생체 내 기능의 지표이다(Zhao 외 (2015) Cancer Cell, 28:415-28). CAR+ T 세포는 상기 기재된 바와 같이 생성되었고 해동된 CD4+ 또는 CD8+ CAR-발현 T 세포는 50,000 개 CAR+ 세포/웰로 각기 플레이팅되었다. 항-ID B-1 접합 비드를 실시예 10에 기재된 바와 같이 사이토카인의 존재 또는 부재 하에 세포:비드의 비율 1:1 또는 1:5로 세포에 첨가했다. 대조군으로서, 항-CD3/항-CD28 자성 비드를 사이토카인의 존재 또는 부재 하에 세포:비드의 비율 3:1로 세포에 추가했다. 세포를 3-4 일마다 수거하여 계수하고, 각 라운드마다 초기 시드 밀도로 세포 수를 재설정한 후 같은 배양 조건을 사용하여 새로운 표적 세포로 재자극시켰다. 14 일 배양 기간 동안 총 4 라운드의 자극이 수행되었다. 각 자극 라운드에 대해 배가 수를 결정했다.
16에 도시된 바와 같이, CAR-발현(EGFRt+) CD4+ 세포의 계속적인 세포 증폭이 항-ID 접합 비드로 재자극 후에 관찰되었지만, 증폭의 정도는 세포를 사이토카인의 존재 하에 배양했을 때보다 더 컸다. 또한, 증폭의 정도는 세포를 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 배양했을 때보다 더 컸다. CD8+ T 세포의 경우, 세포를 항-ID 접합 비드 또는 항-CD3/항-CD28 비드의 존재 하에 배양했을 때 유사한 증폭 동력학이 관찰되었지만, 세포를 항-ID 접합 비드와 함께, 특히 첨가된 재조합 사이토카인의 부재 하에 배양했을 때 증폭이 다소 컸다.
실시예 13: 항-이디오타입 항체-접합 비드를 이용한 CAR-특이적 세포 증폭의 추가 분석
2 명의 상이한 환자 도너로부터 생성된 CAR-발현 T 세포를 이용하는 점을 제외하고, 실시예 11 및 12에 기재된 것와 유사한 연구를 수행하였다. CD3-정제 T 세포를 2 명의 도너 환자의 말초 혈액 단핵구(PBMC)로부터 분리, FMC63으로부터 유래한 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질 도입, 배양 중 증폭, 동결 및 해동하였다.
해동된 CD4+, CD8+ 또는 CD4/CD8(1:1 비율)의 공배양물을 하기와 같이 사이토카인을 추가 보충한 배양 배지에 대략 5 x 106 개 전체 세포/웰로 6-웰 플레이트의 웰에 시딩했다: CD4+ 세포 또는 CD4+/CD8+ 공배양의 경우 배지를 대략 1200 IU/mL 재조합 IL-7, 20 IU/mL 재조합 IL-15 및 100 IU/mL 재조합 IL-2로 보충했고; CD8+ 세포의 경우 배지를 200 IU/mL 재조합 IL-2 및 20 IU/mL 재조합 IL-15로 보충했다. 항-ID B-1 접합 비드를 세포:비드의 비율 1:1로 세포에 첨가하고 2-3 일마다 50 % 배지 교환으로 최대 9일 인큐베이션했다.
배양 중 다양한 시간에, 각각의 조건에 대해 배양물에 존재하는 CD4+ 또는 CD8+ 형질 도입 세포의 수(EGFRt 대리 마커의 발현에 대해 항-EGFR로 검출)를 평가했고 CAR-발현 세포의 증폭 배수 또는 빈도를 전체 세포의 백분율로 결정했다. PD-1 및 CD25의 발현 및 세포 생존력을 또한 결정했다.
도 17a에 도시된 바와 같이, CD4+ 세포를 항-ID 접합 비드와 단독 배양했을 때 CAR-발현(EGFRt+) CD4+ T 세포의 60 배 초과 증폭이 관찰되었다. CD8+ T 세포의 경우, CD8+ T 세포를 CD4+ 세포와 공배양했을 때 항-ID 접합 비드의 존재 하에 CAR-발현(EGFRt+) CD8+ T 세포의 실질적으로 보다 많은 증폭이 일어났다. 도 17b에 도시된 바와 같이, CAR-발현(EGFRt+) CD4+ 또는 CD8+의 빈도가 항-ID 접합 비드의 존재 하에 배양 9 일 동안 9 일째 배양물에 존재하는 형질 도입 세포(EGFRt+)의 >90 %로 증가했다. CD4+ 및 CD8+ 세포의 생존력도 배양하는 동안 100 % 가까이 유지되었고, CD4+ T 세포와 공배양했을 때 CD8+ T 세포의 다소 보다 큰 생존력이 관찰되었다(도 17c). 유사한 결과가 두 개의 도너 모두에서 관찰되었다. 상기 결과는 CAR 특이적 항-이디오타입 항체-접합 비드의 사용을 통해 사전 CAR 선택없이 CAR+ T 세포를 농축한 것과 일치한다.
형질 도입된(EGFR+) CD4+ 또는 CD8+ 세포에서 PD-1 및 CD25의 표면 발현을 항-ID 접합 비드와의 배양 중 5, 7 및 9 일째에 유동 세포 측정으로 평가했다. 도 18a에 도시된 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 PD-1 발현이 항-ID 접합 비드와 배양 중 시간의 흐름에 따라 실질적으로 감소했다. 도 18b에 도시된 바와 같이, CD25 발현도 항-ID 접합 비드의 존재 하에 배양 9 일 후에 감소했다. 유사한 결과가 2 개의 도너 모두에서 관찰되었다.
실시예 14: 항-이디오타입 항체 접합 비드와 배양 후 사이토카인 수준 및 표현형 비교
CD3-정제 T 세포를 2 명의 도너 환자의 말초 혈액 단핵구(PBMC)로부터 분리, FMC63으로부터 유래한 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질 도입하고 항-CD3 및 항-CD28 항체 코팅된 비드로 배양 중 증폭시켰다. 증폭 후, 증폭된 T 세포는 냉동 보존으로 동결되었다. 연구를 위해, 동결된 T 세포를 해동하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 세포 내 사이토카인 수준 또는 표면 표현형(d=0)에 대해 평가하거나 또는 해동된 CD4+, CD8+ 또는 CD4+/CD8+ 공배양 T 세포를 세포 내 사이토카인 수준 및 표면 마커 표현형을 평가하기 전에 PMA/이오노마이신 또는 CD19 형질 도입 K562 세포(d=9)로 자극 후 항-ID B-1 접합 비드의 존재 하에 추가로 9일 동안 배양했다.
세포 내 사이토카인 수준을 평가하기 위해, Golgi 억제제를 4 시간 동안 첨가하고 나서 TNFα, IFNγ 및 IL-2를 유동 세포 측정으로 평가했다. 모든 조건에서, CD19 형질 도입 K562 세포를 이용한 CAR-특이적 자극과 비교하여 세포를 PMA/이오노마이신으로 자극했을 때 세포 내 사이토카인 발현 정도가 실질적으로 보다 컸다. 도 19a에 도시된 바와 같이, TNFα 및 IL-2 사이토카인의 수준은 항-ID 접합 비드의 존재 하에 추가로 9 일 동안 배양된 CD4+ 또는 CD8+ 세포 또는 CD4/CD8 T 세포의 공배양과 비교하여 해동 직후 대응하는 CD4+ 또는 CD8+ 세포에서 유사했다. 해동 직후 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 IFNγ의 수준과 비교하여 항-ID 접합 비드의 존재 하에 추가로 9 일 동안 배양된 해동된 CD4+, CD8+ 또는 CD4/CD8 공배양 T 세포에서 IFNγ의 수준 증가가 관찰되었다. 상기 결과는 새롭게 해동된 CAR+ T 세포와 비교하여 항-ID 접합 비드로 9 일 증폭 후에 T 세포 기능이 유지되었음을 입증했다. 유사한 결과를 2 명의 도너로부터의 세포에서 관찰했다.
활성 마커 CD25의 표면 발현, 억제 수용체 PD-1 및 LAG-3의 표면 발현 및 증식 마커 Ki-67의 핵 발현을 항-ID 접합 비드(d=9)의 존재 하에 추가 9 일 동안 CD4/CD8 공배양으로서 또는 증폭된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 단독에서 또는 해동 직후(d=0) CD4+ 또는 CD8+ 세포 에서 평가했다. 도 19b에 도시된 바와 같이, 해동 직후의 T 세포와 비교하여 항-ID 접합 비드의 존재 하에 추가로 9 일 동안 배양된 세포에서 CD25의 발현 감소가 관찰되었으나 Ki-67에서는 관찰되지 않았다. CD25의 발현 감소는 CD4+ 세포에서 보다 CD8+ 세포에서 실질적으로 더 컸다. 또한, PD-1 및 LAG-3의 발현 감소도 해동 직후 세포에서의 발현과 비교하여 항-ID 접합 비드로 9 일 동안 인큐베이션한 후 CD4+ 및 CD8+ 세포 단독 배양 또는 CD4/CD8 공배양 모두에서 관찰되었다. 상기 결과는 항-ID 접합 비드와 인큐베이션한 후에, 이전에 동결된 형질 도입 세포는 세포 증식을 나타내는 Ki-67 마커에 대해 양성인 세포의 높은 백분율로 명백한 바와 같이 기능성 능력을 보유하나 또한 CD25 활성 마커 및 억제 수용체 마커 PD-1 및 LAG-3에 대한 낮은 표면 발현으로 특징지어지는 상이한 활성화 상태를 나타냄을 입증했다.
실시예 15: PD-1 발현 및/또는 신호 전달에 대한 항-BCMA 접합 비드 또는 항-BCMA/PD-L1 접합 비드의 자극 효과
대표적인 건강한 도너 또는 다발성 골수종 환자 유래 물질로부터의 샘플로부터 생성된 항-BCMA CAR-T 세포를 1 μM 레날리도마이드 또는 비히클 대조군 중의 하나의 존재 하에 비드:CAR+ T 세포의 비율 1:1로 7 일 동안 50 μg/mL BCMA-Fc 접합 비드(생성된 in 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성됨)와 배양했다. 이어서 상이한 조건 하에서 배양된 CAR T 세포에서 CD25, PD-1, Tim3 및 Lag3의 발현(대리 CAR 마커로 항체 이용)을 유동 세포 측정으로 평가했다.
레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 비드로 사전 자극된 상기 항-BCMA CAR-T 세포 또는 유사한 도너 샘플로부터 생성된 새롭게 해동된 항-BCMA CAR-T 세포를 탈비시키고, 세척하여 1 μM 레날리도마이드 또는 비히클 대조군의 존재 하에 RPMI-8226 표적 세포(현미경에 의한 추적을 허용하도록 NucLight ReD(NLR)로 표지)와 배양했다. 구체적으로, 전처리를 레날리도마이드의 존재 하에 수행한 전처리 세포의 경우, 상기 세포를 레날리도마이드의 존재 하에 표적 세포와 배양했다; 유사하게, 전처리를 비히클의 존재 하에 수행한 전처리 세포의 경우, 세포를 비히클의 존재 하에 표적 세포와 배양했다. 공배양 후, 세포 용해 활성을 적색 형광 신호에 의해 결정된 바와 같이 7 일의 기간에 걸쳐 생존 가능한 표적 세포의 손실을 측정하여 평가하였다. 사멸 백분율을 비히클의 존재 하에 비드로 사전 자극된 항-BCMA CAR T 세포로 정규화했다. 사이토카인 생산을 표적 세포와 24 시간 동안 배양 후 상청액으로부터 ELISA로 평가했다. 실험을 3 개의 도너에서 2 회 수행했다. 처리, 도너 및 시간을 고정 효과로 처리하고 동물을 임의 효과로 처리하되, 반복된 측정이 같은 동물로부터 유래한 경우 시간으로 네스트되는, 선형 고정 효과 또는 혼합-효과 모델을 이용하여 세포 용해 활성 및 사이토카인 생산에 대한 레날리도마이드 처리의 유의성을 평가했다. P 값은 관심의 영향을 받는 전체 모델을 관심의 영향이 없는 모델에 대해 비교하는 우도 비 검정으로 얻어졌다.
도 20a는 CAR 항원-특이적 세포 용해 활성의 결과를 도시하고 도 20b는 레날리도마이드의 존재 대 레날리도마이드의 부재 하에 배양된 세포와 비교하여 공배양에서 BCMA 비드로 사전 자극된 항-BCMA CAR-T 세포에 대한 사이토카인 생산(새롭게-해동된(사전에 자극되지 않은) 항-BCMA CAR-T 세포와 비교) 결과를 도시한다. 사전 자극된 CAR T 세포는 새롭게 해동된 항-BCMA CAR T 세포와 비교하여 저하된 세포 용해 활성(P = 2.1 Х 10-4) 및 사이토카인 생산(IFN-γ의 경우 P = .03)을 나타냈다.
전처리 및 후속 공배양에서 레날리도마이드가 부재인 경우, 사전 자극된 CAR-T 세포는 새로운 CAR-T 세포와 비교하여 감소된 세포 사멸 및 사이토카인 생산을 나타냈고, 이는 만성적인 사전 자극이 기능적 손상을 초래함을 나타낸다. 상기 결과는 BCMA-접합 비드로 사전 자극에 의해 유도되었던 소진-유사 표현형과 일치한다. 사전 자극 기간 동안 레날리도마이드의 존재는 세포 용해 기능(P = .04)을 유지했고 사전 자극 기간 동안 비히클에 노출된 세포에 비해 사이토카인 생산의 증가 경향이 있었다(도 24b). 상기 평가에서 레날리도마이드의 존재는 레날리도마이드가 사전 자극된 CAR-T 세포에서 기능적 소진-유사 표현형을 감소시킬 수 있다는 관찰과 일치하였다.
도 20c에 도시된 바와 같이, BCMA 비드에서 7 일 동안 자극된 항-BCMA CAR T 세포의 표현형을 평가했고, 레날리도마이드의 첨가는 3 명의 건강한 도너(P = 0.04)에 걸쳐 항-BCMA CAR T 물질의 CAR+ 생존력을 유의하게 증가시켰다. 레날리도마이드의 첨가는 상기 7 일 기간에서 모든 도너에 걸쳐 전체 세포 계수를 변경하지 않았고 비히클- 및 레날리도마이드-처리 CAR T 세포 사이에 CAR+ 백분율에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 도 20d는 1 μM 레날리도마이드의 존재 또는 부재 하에 BCMA 비드로 7 일 동안 자극(전처리) 후 CD4+ 또는 CD8+ 항-BCMA CAR T-세포에 대한 CD25 및 PD-1의 표면 발현(평균 형광 강도(MFI))에 대한 유동 세포 측정 분석의 대표적인 결과를 도시한다. 도시된 바와 같이, 상기 결과는 장기 자극 후에 레날리도마이드가 BCMA-CAR-T 세포의 PD-1 발현을 감소시킨 반면, CD25 발현을 증가시켰음을 나타냈다. 도 20e에 도시된 바와 같이, 3 개의 CAR T 도너에 걸친 유동 세포 측정 분석은 레날리도마이드 첨가는 CD4+ CAR+ 집단에서 혼합 효과로 CD8+ 집단(P = 4.0 Х 10-4)에서 Tim3의 표면 발현을 증가시켰음을 나타냈다. CD4+ 및 CD8+ CAR+ 집단 모두에서 모든 도너에 걸쳐, 레날리도마이드는 증가 CD25(CD4+ 및 CD8+; P = 2.2 Х 10-16) 및 Lag3 발현에 대해 양성(CD8+ P < 0.03; CD4+ P = 0.002)인 백분율을 증가시켰다. 특히, PD-1+ 세포의 백분율 감소가 또한 CD4+ 집단(P = 0.04)에서 관찰되었고, 3 개의 도너 중 2 개가 CD8+ 집단에서 또한 저하를 나타내었다.
또 다른 연구에서, 재조합 인간 BCMA-접합 비드를 CAR T 세포를 자극하기 위해 다양한 농도에서 사용하여 자극의 크기, 낮거나(5 μg/ mL), 중간(50 μg/ mL) 및 높은(200 μg/ mL) 자극을 적정했다. 중간 자극 조건에서, 자극 24 시간 후 분비된 사이토카인 생산을 측정했고 비히클 대조군과 비교하여, IFN-γ(도 21a)에서 도너-의존적 증가로 IL-2 및 TNF-α 농도에서 200 % 증가가 관찰되었다. 0.1 μM 또는 1.0 μM 레날리도마이드 또는 비히클 대조군의 존재 하에 24 시간 동안 BCMA 접합 비드로 세포를 자극했다. 인큐베이션 최종 시간 내에 단백질 수송 억제제를 첨가하고 세포 내 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α에 대해 세포를 염색했다.
BCMA 비드에서 활성화된 항-BCMA CAR T 세포는 사이토카인 생산에 대해 자극 수준-의존적 영향을 보였고, 50-μg 및 200-μg BCMA 비드와 비교하여 5-μg BCMA 비드는 CAR T 이펙터 사이토카인 생산의 제한을 야기했다(도 21b). 레날리도마이드는 CD4+ 및 CD8+ CAR T 세포 둘 다에 대한 모든 자극 수준에서 IFN-γ+ 및 TNF-α+ 세포 내 염색의 백분율을 증가시켰다. 50-μg 및 200-μg 자극에서 레날리도마이드는 IL-2+ CAR+ T 세포의 백분율을 감소시켰으나 5-μg 자극 조건에서 레날리도마이드는 IL-2+ CAR+ T 세포의 백분율을 증가시키는 것으로, 자극의 크기는 레날리도마이드에 대한 반응에서 IL-2를 증가시키거나 감소시켰다. 자극의 부재 하에서, 레날리도마이드는 CAR T 사이토카인 생산에 어떠한 영향도 주지 않았고, 이는 레날리도마이드에 의해 제공된 사이토카인 향상은 자극을 요구함을 나타낸다.
또 다른 연구에서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 BCMA 비드의 존재 하에 인간 재조합 PD-L1-Fc의 추가적인 접합이 있거나 또는 없이 세포를 배양했다. 건강한 도너- 또는 환자-유래 CAR T 세포를 1 μM 레날리도마이드의 존재 하에 24 시간 동안 BCMA-접합 비드 또는 BCMA/PD-L1 접합 비드의 존재 하에 자극했다. 사이토카인 생산을 상청액에서 측정했다. 결과가 도 21c에 도시되어 있다. 도 25c에 도시된 바와 같이, 정상 및 환자 도너 CAR T 세포 모두의 평가로 재조합 BCMA 비드에 재조합 PD-L1의 첨가는 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α를 감소시키는 것이 입증되었다. 레날리도마이드 처리는 PD-L1의 존재 하에 비히클로 처리된 CAR T 세포로부터의 것을 초과하여 분비된 사이토카인 수준을 강화시키는 것으로 나타났다. 상기 결과는 BCMA-접합 비드와 인큐베이션 후에 항-BCMA CAR-T 사이토카인 생산은 PD-L1-매개 억제의 존재 하에 레날리도마이드에 의해 증가한다는 결론과 일치했다.
실시예 16: BCMA-접합 비드로 자극된 항-BCMA CAR T 세포에 의한 사이토카인 생산 평가
항-BCMA CAR T 세포가 일반적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성되었다. 상기 항-BCMA CAR T 세포를 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율 1:1로 제형화하고 해동하여 96-웰 플레이트에서 웰 당 5.0 x 105 개의 세포로 배양했다. 4.5 또는 2.8 μm 직경(실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 5 μg/ml, 50 μg/ml 또는 200 μg/ml BCMA-접합 비드 조성물 유래)을 갖는 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 또는 BCMA 접합 비드를 항-BCMA CAR-T 세포 대 비드의 비율 1:1로 배양물에 첨가했다. 항-CD3/항-CD28 항체 또는 BCMA 접합 비드의 부재 하에 배양된 항-BCMA CAR-T 세포는 대조군으로 작용했다.
24 시간 인큐베이션 후에, 배양 상청액 내 IFN-감마, IL-2, TNF-알파, IL-6, GM-CSF 및 IL-4의 존재를 멀티플렉스 사이토카인 면역평가(Luminex®)를 이용하여 평가하였다. 도 22a에 도시된 바와 같이, 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드와의 인큐베이션은 BCMA-접합 비드와의 인큐베이션과 비교하여 상청액 내 존재하는 사이토카인의 농도가 더 높은 결과를 초래했다. 상기 평가에서, BCMA-접합 비드와 인큐베이션된 세포로부터 사이토카인 생산 규모는 용량 의존적이었고, 비드 접합에 사용된 BCMA 농도 증가(즉, 5 μg/ml, 50 μg/ml 또는 200 μg/ml)와 관련이 있었다. 상기 결과는 BCMA-지시된 CAR 활성화는 비드에 접합된 BCMA 양을 변화시켜 제어될 수 있고 적정될 수 있다는 발견과 일치한다. 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드와 인큐베이션 후 사이토카인 방출 비교는 사이토카인 생산의 규모와 질에 있어서 차이를 나타냈고, BCMA-접합 비드로 자극 후에 보다 많은 Th1-유사 사이토카인 방출 프로필이 관찰되었다.
항-BCMA CAR-T 세포를 상기 기재된 바와 같이 배양하고 유동 세포 측정으로 세포 내 사이토카인 수준을 평가했다. 항-BCMA CAR T 세포를 단백질 수송 억제제와 4 시간 인큐베이션 후에 20 시간 동안 항-BCMA CAR-T 세포 대 비드의 비율 1:1로 항-CD3/항-CD28 항체 접합 비드 또는 BCMA-접합 비드와 인큐베이션했다. 세포를 생존력, CAR 발현, CD4 및 CD8에 대해 염색하고나서 고정, 투과화하고 IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파의 세포 내 수준에 대해 염색했다. 도 22b에 도시된 바와 같이, BCMA-접합 비드로의 자극은 CD4+ 및 CD8+ 항-BCMA CAR 발현 세포 모두에서 사이토카인 생산을 초래했다. 상기와 유사하게, 세포 내 사이토카인 수준의 규모는 비드에 접합된 BCMA의 양과 연관이 있어 보였다.
실시예 17: 항-CD19 항체 항-ID 및 항-CD2 항체 접합 비드의 생성
항-CD2 및 항-CD19 항체 항-ID 항체 코팅된 비드가 생성되었다. 실시예 9에 기재된 마우스 항-CD2 항체(클론 RPA-2.10, ED biosciences) 및 항-ID B-2 항-이디오타입 항체를 직경이 대략 4.5 μm인 상업적으로 이용 가능한 토실 활성화된 초상자성 표면(M-450표기; ThermoFisher, Waltham MA)에 공유 결합으로 연결하였다.
대략 6.67x10-10 몰의 각각의 항체를 토실-활성화된 비드(예를 들어 대략 4x108 개의 비드/mL) 1 mL 당 첨가하고 공유 결합 커플링을 0.1 % 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 인산 완충 용액(PBS)에서 37 °C로 밤새 인큐베이션하여 수행했다. 비드를 세척하고 0.1 % HSA의 1 mL PBS에 재현탁하였다. 접합 후, 비드 농도를 셀로미터를 이용하여 결정하였다. 커플링 농도 및 비드 계수에 기초하여, 비드 상에 있는 분자의 대략적인 수는 비드 당 1.58x106 개의 항체 분자이었다. 항체 코팅된 비드를 4.1 x108 개의 비드/mL 농도로 용액에 현탁시켰다.
비드에 접합된 항체의 안정성을 항체-접합 비드를 펠릿화하고, 얻어진 상청액을 4-12 % Bis-Tris 겔에서 러닝하고 쿠마시 블루로 단백질에 대해 겔을 염색하여 평가하였다. 비드에 접합된 총 단백질에 대한 대조군으로, LDS 샘플 완충액에서 끓인 펠릿화된 비드로부터의 상청액 샘플 10 μL를 또한 평가하였다. 대조군에는 또한 비드에 접합되지 않은 1 μg의 항-CD2 항체, 1 μg 항-ID B-2 항체(양성 대조군) 및 5 μL의 0.1 % HSA(음성 대조군)의 평가도 포함되었다. 항체에 대응하는 밴드가 끓인 샘플로부터의 상청액 샘플에서 검출되었다. 끓이지 않은 접합 샘플로부터의 상청액에서는 항-ID 항체가 검출되지 않았고 이는 안정적인 접합과 일치하는 결과이다.
실시예 18: 항-CD19 항체 항-ID 및 항-CD28 항체 접합 비드의 생성
항-CD28 및 항-CD19 항체 항-ID 항체 코팅된 비드가 생성되었다. 마우스 항-CD28 항체(낮은 내독소, 아지드 프리(LEAF) 정제 클론 CD28.2(Biolegend)) 및 실시예 9에 기재된 항-ID B-2 이디오타입 항체를 직경이 대략 4.5 μm인 상업적으로 이용 가능한 토실 활성화된 초상자성 표면(M-450표기; ThermoFisher, Waltham MA)에 공유 결합으로 연결하였다. 대략 6.67x10-10 몰의 각각의 항체를 토실-활성화된 비드(예를 들어 대략 4x108 개 비드/mL) 1 mL 당 첨가하고 실질적으로 실시예 17에 기재된 바와 같이 공유 결합으로 연결하였다. 커플링 농도 및 비드 계수에 기초하여, 비드 상에 있는 분자의 대략적인 수는 비드 당 1.79x106 개의 항체 분자이었다. 항체 코팅된 비드를 셀로미터로 결정된 바와 같이 3.2 x108 개 비드/mL 농도로 용액에 현탁시켰다.
실시예 19: 표면 접합된 항-CD19 항체 항-ID, 항-CD2 및 항-CD28 항체를 함유하는 비드의 생성
항-CD2, 항-CD28로 코팅된 상자성 비드 및 항-CD19 항체 항-ID 항체 코팅된 비드가 생성되었다. 마우스 항-CD2 항체(클론 RPA-2.10, ED biosciences), 마우스 항-CD28 (LEAF 정제 클론 CD28.2, Biolegend) 및 실시예 9에 기재된 항-ID B-2 이디오타입 항체를 직경이 대략 4.5 μm인 상업적으로 이용 가능한 토실 활성화된 초상자성 표면(M-450표기; ThermoFisher, Waltham MA)에 공유 결합으로 연결하였다.
대략 4.44x10-10 몰의 각각의 항체를 토실-활성화된 비드(예를 들어 대략 4x108 개 비드/mL) 1 mL 당 첨가하고 실질적으로 실시예 17에 기재된 바와 같이 공유 결합으로 연결하였다. 커플링 농도 및 비드 계수에 기초하여, 비드 상에 있는 분자의 대략적인 수는 비드 당 1.56x106 개의 항체 분자이었다. 항체 코팅된 비드를 3.91 x108 개 비드/mL 농도로 용액에 현탁시켰다.
비드에 접합된 항체의 안정성을 항체-접합 비드를 펠릿화하고, 얻어진 상청액을 4-12 % Bis-Tris 겔에서 러닝하고 쿠마시 블루로 단백질에 대해 겔을 염색하여 평가하였다. 비드에 접합된 총 단백질에 대한 대조군으로, LDS 샘플 완충액에서 끓인 펠릿화된 비드로부터의 상청액 샘플 10 μL를 또한 평가하였다. 추가 대조군으로 또한 비드에 접합되지 않은 1 μg의 항-CD2 항체, 1 μg 항-ID B-2 항체(양성 대조군) 및 5 μL의 0.1 % HSA(음성 대조군)을 평가하였다. 끓이지 않은 접합 샘플로부터의 상청액에서 항-ID 항체가 검출되지 않았고 이는 상기 접합이 안정적임을 나타내는 반면, 끓인 샘플로부터 로딩된 상청액에서 항체에 대응하는 밴드가 검출되었다.
실시예 20: 항-ID 접합 비드를 이용한 CAR+ T 세포의 만성 자극에 대한 시험관 내 평가
CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물을 인간 도너로부터 분리, 활성화하고, FMC63으로부터 유래한 scFv를 갖는 항-CD19 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질 도입하였다. 각각의 도너로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 별도로 수확, 제형화하고 극저온 냉동 시켰다. 상기 극저온 냉동 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 해동하고 같은 도너로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율 1:1로 제형화하여 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성하였다. 항-CD19 CAR에 대한 항-ID 접합 비드를 비드:세포의 비율 1:1로 14 일 동안 세포와 인큐베이션하였다.
이펙터 대 표적의 비율 1:1(사이토카인 수준 평가) 또는 3:1(세포 용해 활성 평가)에서 K562-CD19 항원-발현 표적 세포로 자극 후, 항-ID 접합 비드로 CAR-특이적 자극 후 14 일째에(14 일; 2 차) 수확된 CAR-T 세포의 2 차 반응을 평가하였다. 항-ID 접합 비드와 인큐베이션하지 않은 T 세포 조성물로부터 T 세포의 1 차 반응을 또한 항원-발현 세포(0 일; "1 차")로 유사한 자극에 의해 결정하였다. 세포 용해 활성을 평가하기 위해, 표적 세포를 NucLight Red(NLR)로 표지하여 형광 현미경에 의한 추적을 허용했다. 사멸 활성은 동역학 형광 현미경에 의해 시간의 흐름에 따른 형광 신호의 손실로 결정된 바와 같이, 72 시간에 걸쳐 생존 가능한 표적 세포의 손실을 측정하여 평가하였다(INCUCYTE® Live Cell Analysis System, Essen Bioscience 이용). 사멸 지수는 시간의 흐름에 따른 표적 형광에 대한 곡선 하 면적(AUC)의 역으로 결정되었다. IL-2 및 TNF-알파의 세포 내 사이토카인 수준을 Golgi 억제제의 존재 하에 인큐베이션한 후 공배양된 T 세포에서 유동 세포 측정으로 또한 평가하였다.
도 23a에 도시된 바와 같이, 항-ID 접합 비드로 14 일 동안 CAR-특이적 자극 후 수집된 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물에 의한 표적 세포 사멸은 사전 CAR-특이적 자극을 겪지 않은 CAR+ T 세포의 세포 용해 활성과 비교하여 감소되었다. IL-2 및 TNF-알파의 세포 내 사이토카인 수준 또한 항-ID 접합 비드로 장기 CAR-특이적 자극을 받은 CAR+ T 세포에서 감소되었다(도 23b). 상기 결과들은 항-ID 접합 비드로 14 일 동안 인큐베이션하는 것과 같은 장기 CAR-특이적 자극은 CAR의 만성 자극 및 지속적인 기능 상실로 이어진다는 관찰과 일치한다.
상기 기재된 만성 자극 평가를 이용하여 장기 자극 후 CAR+ T 세포 기능을 개선하는데 대한 다양한 화합물의 영향을 평가하였다. 상이한 화합물 또는 비히클 대조군의 존재를 제외하고 상기 기재된 바와 같이 항-CD19 CAR+ T 세포 조성물이 생성되었다. 각각 생성된 CAR-T 세포 조성물로부터의 세포를 비드 대 세포의 비율 1:1로 14 일 동안 항-ID 접합 상자성 비드와 인큐베이션했다.
해동 시 CAR-T 세포 조성물의 1 차 반응(항-ID 접합 비드로 무자극) 또는 CAR-자극 CAR-T 조성물의 2 차 반응(항-ID 접합 비드로 14 일 CAR-특이적 자극 후)을 항원-발현 세포로 자극 후에 평가하였다. CAR-T 세포 조성물을 Golgi 억제제의 존재 하에 K562-CD19 항원-발현 세포와 1:1로 배양하고 다작용성 사이토카인 생산을 IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파에 대한 세포 내 사이토카인 염색 후에 유동 세포 측정으로 평가하였다. 도너 코호트 내에서 데이터를 조정하여 정규화한 후에 CD8+ 세포에서 결정된 바와 같은 사이토카인의 누적 수준으로부터 다작용성 점수를 결정하였다(도 24a). 표적 세포와 20 시간 인큐베이션한 후 공배양물의 세포 배양 상청액으로부터 총 분비된 IL-2, TNF 및 IFN-감마 사이토카인을 결정하고 3 개의 사이토카인 모두에 대한 조정된 점수의 평균을 도 24b에 도시된 바와 같이 계산하였다. 도 24a 및 24b에 도시된 바와 같이, 특정 화합물은 사이토카인 생산을 위한 CAR-T 세포 조성물의 능력에 기반한 개선된 1 차 또는 2 차 반응을 초래했다. 상기 기재된 바와 같이 이펙터:표적 세포의 비율 3:1에서 표적 세포와 공배양 후에 1 차 또는 2 차 세포 용해 반응에서의 개선이 또한 특정 화합물의 존재 하에 생산된 T 세포 조성물 가운데서 관찰되었다(도 24c).
상기 결과들은 생체 내에서 항원에 장기 노출 후에 발생할 수 있는 것과 같은 만성 CAR-T 세포 자극 후에 장기 생존 및/또는 기능 유지를 나타내는 능력에 대한, 화합물 또는 기타 제제의 존재 하에 또는 상이한 조건 하에서 생산된 상이한 CAR-T 세포 조성물을 포함하여, CAR-T 세포 조성물을 평가하기 위한 만성 자극 평가의 이용을 입증했다.
실시예 21: 작은 분자 화합물의 존재 하에 증폭된 키메라 항원 수용체(CAR)-형질 도입 T 세포(CAR T 세포)의 기능 평가
항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포를 함유하는 조작된 T 세포 조성물이 상이한 화합물 또는 비히클 대조군의 존재 하에 3 개의 별개 도너로부터 생성되었다.
CAR 자극 후에 증폭시키는 상이한 T 세포 조성물로부터의 세포 능력을 항-CD19 CAR에 특이적인 항-이디오타입 항체로 접합된 비드 표면과 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 세포를 인큐베이션하여 평가하였다. 항-ID 접합 비드를 비드:세포의 비율 1:1로 24-웰 G-rex 증폭 용기(Argos Technologies)의 웰에서 15 일 동안 세포와 인큐베이션하였다. 웰 당 총 살아 있는 T 세포를 5 일마다 배양물에서 세포를 계수하여 결정하였다(도 25a). 시간의 흐름에 따른 T 세포 수 기능의 평균 곡선 하 면적(AUC)을 배지로만 증폭된 세포의 AUC와 비교하여 계산하였다(도 25b).
도 25a에 도시된 바와 같이, 항-이디오타입 항체 접합 비드로 세포의 자극은 세포 수의 감소로 이어지는 초기 증폭을 초래했다. 화합물과 인큐베이션하여 이전에 증폭되었던 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터의 T 세포가 비히클 대조군으로 이전에 증폭된 T 세포와 비교하여 보다 큰 평균 AUC을 가졌다(도 25b). 상기 결과는 장기 자극 평가의 존재를 이용하여 일부 경우에 단일 CAR-특이적 자극 후에 증폭 및 생존하는 생성된 T 세포 조성물의 능력을 개선하는 화합물을 확인할 수 있음을 나타낸다.
항원-발현 세포로 자극 후에 2 차 사이토카인 반응을 항-ID 접합 비드로 증폭 후 11 일째에 수확된 T 세포 조성물로부터의 CAR-T 세포에서 평가하였다. 항-ID 자극 세포를 이펙터:표적의 비율 1:1에서 대략 16 시간 동안 조사된 K562-CD19 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 Luminex Multiplex Assay를 이용하여 TNF-알파, IFN-감마 및 IL-2 사이토카인 생산을 측정하였다. 공배양 상청액에서 관찰된 사이토카인 생산의 배수 변화를 배지로만 증폭된 세포와 비교하여 화합물 또는 비히클 대조군의 존재 하에 증폭된 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 결정하였다. 도 25c에 도시된 바와 같이, 상기 평가는 항원으로 후속적인 자극 후에 개선된 2 차 사이토카인 생산을 나타냈던, 특정 화합물의 존재 하에 이전에 증폭되었던 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 생성된, T 세포 조성물을 확인했다. 또한, 상기 평가는 화합물의 존재 하에 조작 및 증폭했을 때, 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 4 시간 동안 Golgi 억제제와 인큐베이션한 후에 세포 내 사이토카인 염색으로 결정된 바와 같이, 11 일 째에 CD107a+IFNγ+ 세포인 CD8+ T 세포의 빈도 증가를 나타낸, 일부 도너-유래 세포로부터의 T 세포 조성물을 확인했다(도 25d). 상기 결과들은 조작된 T 세포 조성물의 기능을 개선하기 위해 T 세포를 조작하는 공정에 사용된 화합물의 효과를 확인하기 위한 장기 자극 평가의 이용과 일치한다.
본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위가 제한되도록 의도되지 않는다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 기재 및 교시로부터 명백해질 것이다. 상기 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. HAUSKINS, Collin HUSSELL, Scott SIERRA, Catherine WORKS, Melissa <120> REAGENTS FOR EXPANDING CELLS EXPRESSING RECOMBINANT RECEPTORS <130> 735042007340 <140> PCT/US2018/044263 <141> 2018-07-28 <150> 62/538,671 <151> 2017-07-29 <150> 62/596,742 <151> 2017-12-08 <150> 62/628,889 <151> 2018-02-09 <150> 62/665,468 <151> 2018-05-01 <160> 154 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala 50 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 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180 attcactgta tcacaattcc agtgggtcag aagtttacat acactaagtt gactgtgcct 240 ttaaacagct tggaaaattc cagaaaatga tgtcatggct ttagaagctt ctgatagact 300 aattgacatc atttgagtca attggaggtg tacctgtgga tgtatttcaa gg 352 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Human IgG1 Fc <400> 28 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 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Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 128 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 heavy chain <400> 128 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ile Tyr Tyr Glu Glu Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 210 215 220 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 275 280 285 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 340 345 350 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 370 375 380 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 405 410 415 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 420 425 430 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 <210> 129 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 HC signal sequence <400> 129 Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 130 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 VL <400> 130 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 131 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 light chain <400> 131 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 132 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-ID B-2 LC signal sequence <400> 132 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys 20 <210> 133 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer (IgG4hinge) <400> 133 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 134 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer (IgG4hinge) <400> 134 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 135 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH3 spacer <400> 135 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 85 90 95 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 100 105 110 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 115 <210> 136 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge-CH2-CH3 spacer <400> 136 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 137 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgD-hinge-Fc <400> 137 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys 165 170 175 Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser 180 185 190 Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu 195 200 205 Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro 210 215 220 Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser 225 230 235 240 Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg 260 265 270 Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His 275 280 <210> 138 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747) <400> 138 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 139 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747) <400> 139 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val 65 <210> 140 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747) <400> 140 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 141 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 (LL to GG) <400> 141 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 142 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1) <400> 142 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zeta <400> 143 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 144 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zeta <400> 144 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 145 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zeta <400> 145 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 146 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A artificial <400> 146 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 147 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR artificial <400> 147 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 148 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR artificial <400> 148 Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 50 55 60 Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 65 70 75 80 Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 115 120 125 Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 130 135 140 Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 145 150 155 160 Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 165 170 175 Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser 180 185 190 Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu 195 200 205 Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln 210 215 220 Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly 225 230 235 240 Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro 245 250 255 His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr 260 265 270 Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His 275 280 285 Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro 290 295 300 Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala 305 310 315 320 Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 325 330 335 <210> 149 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A artificial <400> 149 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 150 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP cleavable linker <400> 150 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 151 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 151 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 152 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 152 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 153 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A <400> 153 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 154 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A <400> 154 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20

Claims (155)

  1. 세포 증폭 방법으로서,
    투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되
    상기 투입 조성물은
    비드이거나 비드를 포함하는 복수의 입자를 가지며, 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 항원과 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포들을 포함하고,
    여기서, 상기 복수의 입자는 평균 직경이 2 μm 내지 5 μm이거나 또는 약 2 μm 내지 5 μm이고, 상기 항원-결합 도메인을 특이적으로 인식하거나 또는 상기 항원-결합 도메인과 특이적으로 결합하는 부착된 결합분자를 가지며,
    여기서, 상기 항원-결합 도메인과 상기 결합분자의 결합은 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포들의 증폭을 유도하여 증폭된 세포들을 포함하는 산출 조성물을 생산하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 키메라 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역을 인식하지 않거나 이에 결합하지 않고,
    상기 링커 또는 스페이서 영역은 상기 항원-결합 도메인을 상기 항원 수용체의 막 관통 도메인에 연결하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 CD19인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 항원은 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 세포 증폭 방법으로서,
    투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되,
    상기 투입 조성물은
    항원-결합 도메인에 의해 인식되는 B 세포 성숙 항원(B cell maturation antigen, BCMA)의 세포 외 도메인 또는 상기 세포 외 도메인의 일부를 포함하는 부착된 결합분자를 갖는 복수의 입자를 가지며, BCMA를 특이적으로 인식하거나 이와 특이적으로 결합하는 상기 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 세포들을 포함하고,
    여기서 상기 항원-결합 도메인에 BCMA의 상기 세포 외 도메인 또는 이의 일부의 결합은 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포들의 증폭을 유도하여 증폭된 세포들을 포함하는 산출 조성물을 생산하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 모이어티(moiety)에 연결된 상기 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 융합 폴리펩타이드이고,
    선택적으로 여기서 상기 모이어티는 상기 입자에의 부착을 용이하게 하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 모이어티는 상기 재조합 항원의 C-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 모이어티는 Fc 도메인이거나 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 세포 증폭 방법으로서,
    투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되
    상기 투입 조성물은
    항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 부착된 결합분자를 갖는 복수의 입자를 가지고, CD19를 특이적으로 인식하거나 이와 특이적으로 결합하는 상기 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포들을 포함하고,
    여기서 상기 항원-결합 도메인에 상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포들의 증폭을 유도하여 증폭된 세포들을 포함하는 산출 조성물을 생산하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 3 항, 제 4 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 수용체의 상기 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 3 항, 제 4 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 수용체의 상기 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 합성 입자, 불용성 입자, 고체 입자이거나 또는 비세포성 입자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/ mL(수치 포함) 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/ mL(수치 포함)의 상기 결합분자 농도를 갖는 조성물로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션하는 동안, 상기 투입 조성물에 존재하는 전체 세포들 대 복수의 입자의 비율은 5:1 내지 1:5(수치 포함) 또는 약 5:1 내지 1:5(수치 포함)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 세포 증폭 방법으로서,
    투입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하고,
    상기 투입 조성물은
    항원-결합 도메인을 특이적으로 인식하거나 이와 특이적으로 결합하는 부착된 결합분자를 갖는 비드들이거나 이를 포함하는 복수의 입자를 가지며, 항원을 특이적으로 인식하거나 항원과 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포들을 포함하고,
    여기서 상기 복수의 입자는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL(수치 포함) 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL(수치 포함)의 상기 결합분자 농도를 갖는 조성물로부터 유래하고, 상기 인큐베이션하는 동안, 상기 투입 조성물에 존재하는 전체 세포들 대 복수의 입자의 비율은 5:1 내지 1:5(수치 포함) 또는 약 5:1 내지 1:5(수치 포함)이고;
    상기 항원-결합 도메인에 상기 결합분자의 결합은 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 세포들의 증폭을 유도하여 증폭된 세포들을 포함하는 산출 조성물을 생산하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 키메라 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역을 인식하거나 이와 결합하지 않고,
    상기 링커 또는 스페이서 영역은 상기 항원-결합 도메인을 상기 항원 수용체의 막 관통 도메인에 연결하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 항원은 CD19인 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 재조합 항원은 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL(각각의 수치 포함) 또는 약 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL(각각의 수치 포함)의 상기 결합분자의 농도를 갖는 조성물로부터 유래하거나; 또는
    상기 복수의 입자는 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상 또는 약 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상의 상기 결합분자 농도를 포함하는 조성물로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL의 상기 결합분자 농도 또는 약 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL의 상기 결합분자 농도를 갖는 조성물로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션하는 동안, 상기 투입 조성물에 존재하는 전체 세포들 대 복수의 입자의 비율은 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2(각각의 수치 포함)이거나 또는 약 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2(각각의 수치 포함)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션하는 동안, 상기 투입 조성물에 존재하는 전체 세포들 대 복수의 입자의 비율은 1:1이거나 또는 약 1:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제 15 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 비드는 평균 직경이 2 μm 내지 5 μm 또는 약 2 μm 내지 5 μm이거나 또는 평균 밀도가 1 g/cm3 내지 2 g/cm3 또는 약 1 g/cm3 내지 약 2 g/cm3인 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평균 직경은 2.8 μm 또는 4.5 μm이거나 또는 약 2.8 μm 또는 4.5 μm인 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제 3 항, 제 4 항, 제 11 항 내지 제 17 항, 제 20 항, 제 21 항 및 제 24 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 단편은 scFv이거나 또는 scFv를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 제 3 항, 제 4 항 및 제 11 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 면역글로불린 불변 영역의 일부, 선택적으로 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc영역의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제 3 항, 제 4 항, 제 11 항 내지 제 17 항, 제 20 항, 제 21 항 및 제 24 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전한 항체 또는 전장 항체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 결합분자의 C-말단 아미노산 잔기 또는 그 근방에 있는 복수의 입자 각각에 부착되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 단순 분산성인 것을 특징으로 하는, 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 표면 노출 작용기를 통해 상기 입자에 공유 결합으로 부착되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 표면 노출 작용기는 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기, 클로로메틸기, 에폭시기, 히드록실기, 토실기 또는 히드라진기인 것을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
    상기 표면 노출 작용기는 토실기인 것을 특징으로 하는, 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물, 히드록시 카르복실산의 공중합체, 디카르복실산의 공중합체 또는 금속을 포함하는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 탄소 또는 이의 조합물을 포함하는 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 이의 조합물인 것을 특징으로 하는, 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 소수성 표면을 포함하는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 폴리스티렌 표면을 포함하는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 입자는 자성 입자를 포함하고/거나 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션의 적어도 일부는 상기 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하는 제제(agent)의 존재하에 수행되어 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 제제는 상기 입자와 함께 제공되고, 선택적으로 상기 제제는 복수의 입자 또는 이의 서브세트 각각에 부착되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  46. 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서,
    상기 제제는 상기 입자에 부착되고 상기 제제는 상기 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하여 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  47. 제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 리간드이거나 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
  48. 제 44 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가 분자는:
    공자극 분자이거나 또는 활성 공수용체, 선택적으로 OX-40, ICOS, DAP10, B7-1, B7-2, CD28 또는 4-1BB이거나; 또는
    억제 수용체, 선택적으로 CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT이거나; 또는
    T 세포 표면 단백질, 선택적으로 CD2 또는 CD3;
    인 것을 특징으로 하는, 방법.
  49. 제 44 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가 분자는 CD2 또는 CD28인 것을 특징으로 하는, 방법.
  50. 제 44 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 항-CD2 항체 및 항-CD28 항체 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    상기 결합분자는 항-CD19 항-이디오타입 항체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  52. 제 50 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 키메라 항원 수용체에 의해 인식되는 재조합 항원이고, 선택적으로 상기 재조합 항원은 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA이거나 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는, 방법.
  53. 제 45 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 상기 입자에 공유 결합으로 부착된 것을 특징으로 하는, 방법.
  54. 제 45 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자와 상기 입자에 부착된 상기 제제의 비율, 선택적으로 몰비 또는 중량비는 1:1 또는 약 1:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  55. 제 1 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일 또는 12 일 초과 또는 약 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일 또는 12 일 초과 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  56. 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일 또는 12 일 초과 또는 약 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일 또는 12 일 초과 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  57. 제 1 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일 또는 16 일 초과 또는 약 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일 또는 16 일 초과 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  58. 제 1 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포들은 면역 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  59. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  60. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포들은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  61. 제 1 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD4+ 세포 대 상기 CD8+ 세포의 비율은 1:2 내지 2:1 또는 1:3 내지 3:1 또는 약 1:2 내지 2:1 또는 약 1:3 내지 3:1이거나 또는 1:1 또는 약 1:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  62. 제 1 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포들은 대상체, 선택적으로 인간 대상체로부터 수득된 1 차 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  63. 제 1 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투입 조성물은 상기 조성물 안에 있는 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 도입하기 위한 조건 하에서 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 상기 핵산 분자와 세포 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 방법.
  64. 세포를 유전적으로 조작하는 방법으로,
    (a) 조성물 안에 있는 하나 이상의 세포로 핵산 분자를 도입하기 위한 조건 하에서 키메라 항원 수용체를 암호화하는 상기 핵산 분자와 세포 조성물을 접촉시켜 투입 조성물을 생산하는 단계; 및
    (b) 제 1 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 투입 조성물의 세포들을 인큐베이션하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  65. 제 63 항 또는 제 64 항에 있어서,
    상기 접촉 및 인큐베이션의 적어도 일부는 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  66. 제 63 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉은 바이러스 벡터로 형질 도입하여 수행되고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
  67. 제 62 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 조성물은 복수의 T 세포를 포함하고, 상기 접촉 전에, 상기 방법은 상기 T 세포를 자극하거나 활성화시키는 것을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  68. 제 63 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 조성물은 복수의 T 세포를 포함하고,
    상기 접촉 전에, 상기 방법은
    TCR 복합체를 통한 신호를 유도할 수 있는 제제 또는 제제들의 존재 하에 상기 조성물을 인큐베이션하는 것 및/또는
    T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 제제 또는 제제들; 및/또는 CD3-결합분자, CD28-결합분자, 재조합 IL-2, 재조합 IL-15 및 재조합 IL-7 또는 이들의 조합물의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하지 않고,
    선택적으로 상기 방법은 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체의 존재 하에 T 세포를 자극하는 것을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  69. 제 1 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산출 조성물에 존재하는 세포들의 활성 마커 또는 소진 마커의 표면 발현은 유사한 인큐베이션 후이나 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 다클론성 자극 분자의 존재 하에 생산된 세포 조성물에 있는 마커의 표면 발현보다 적고,
    선택적으로 상기 다클론성 자극 분자는 항-CD3 항체 또는 단편 및/또는 항-CD28 항체 또는 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법
  70. 제 69 항에 있어서,
    상기 소진 마커는 억제 수용체, 선택적으로 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA 또는 TIGIT인 것을 특징으로 하는, 방법.
  71. 제 69 항에 있어서,
    상기 활성 마커는 HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 또는 4-1BB인 것을 특징으로 하는, 방법.
  72. 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 상기 산출 조성물 안에 있는 세포들 수는, 상기 투입 조성물 내 상기 항원 수용체를 포함하는 세포들 수와 비교하여, 1.2 배, 2.0 배, 3.0 배, 4.0 배, 5.0 배, 6.0 배, 7.0 배, 8.0 배, 9.0 배, 10 배 이상 증가하거나 농축된 것을 특징으로 하는, 방법.
  73. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서
    시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  74. 제 1 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-결합 도메인, 막 관통 영역 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  75. 제 74 항에 있어서,
    상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  76. 제 74 항 또는 제 75 항에 있어서,
    상기 CAR은 CD28 또는 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함하는 공자극 신호 전달 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  77. 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산출 조성물로부터 복수의 비드를 제거하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  78. 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 세포 조성물.
  79. 표면 개질 입자로서,
    (i) 직경이 2 μm 내지 5 μm 또는 약 2 μm 내지 5 μm인 비드 입자; 및
    (ii) 상기 비드의 표면에 부착된 결합분자;
    를 포함하고,
    여기에서 상기 결합분자는 키메라 항원 수용체의 세포 외 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 재조합 항원 수용체의 링커 또는 스페이서 영역을 인식하거나 또는 이에 결합하지 않고,
    상기 링커 또는 스페이서 영역은 상기 항원-결합 도메인을 상기 항원 수용체의 막 관통 도메인과 연결하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  81. 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  82. 제 81 항에 있어서,
    상기 재조합 항원은 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA이거나 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  83. 표면 개질 입자로서,
    입자 및
    상기 입자 표면에 부착된 결합분자를 포함하고,
    여기에서 상기 결합분자는 B 세포 성숙 항원(BCMA)인 재조합 항원의 세포 외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  84. 제 81 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 모이어티에 연결된 상기 재조합 항원 또는 이의 일부를 포함하는 융합 폴리펩타이드이고,
    선택적으로 여기서 상기 모이어티는 상기 입자에의 부착을 용이하게 하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  85. 제 84 항에 있어서,
    상기 모이어티는 상기 재조합 항원의 C-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  86. 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서,
    상기 모이어티는 Fc 도메인이거나 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  87. 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서,
    상기 결합분자는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  88. 제 79 항, 제 80 항 및 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 항원은 CD19인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  89. 제 87 항 또는 제 88 항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체의 상기 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  90. 제 87 항 또는 제 88 항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체의 상기 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  91. 제 89 항 또는 제 90 항에 있어서,
    상기 항원-결합 단편은 scFv이거나 scFv를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  92. 제 87 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 선택적으로 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는Fc 영역 또는 Fc 영역의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  93. 제 87 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 온전한 항체이거나 전장 항체인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  94. 제 79 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 결합분자의 C-말단 아미노산 잔기 또는 그 근방에서 상기 입자에 부착된 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  95. 제 83 항 내지 제 94 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 합성 입자, 불용성 입자, 고체 입자 또는 비세포성 입자인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  96. 제 83 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 비드인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  97. 제 79 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 2 μm 내지 5 μm 또는 약 2 μm 내지 5 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  98. 제 79 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 2.8 μm 또는 4.5 μm 또는 약 2.8 μm 또는 4.5 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  99. 제 79 항 내지 제 98 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 입자에 공유 결합으로 부착된 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  100. 제 79 항 내지 제 99 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 표면 노출 작용기를 통해 상기 입자에 공유 결합으로 부착된 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  101. 제 100 항에 있어서,
    상기 표면 노출 작용기는 아미노기, 카르복실기, 티올기, 알데히드기, 클로로메틸기, 에폭시기, 히드록실기, 토실기 또는 히드라진기인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  102. 제 101 항에 있어서,
    상기 표면 노출 작용기는 토실기인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  103. 제 79 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 폴리무수물, 히드록시 카르복실산의 공중합체, 디카르복실산의 공중합체 또는 금속이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  104. 제 79 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 탄소 또는 이의 조합물을 포함하는 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  105. 제 104 항에 있어서,
    상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌 및 폴리비닐 알콜 또는 이의 조합물인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  106. 제 79 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 소수성 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  107. 제 79 항 내지 제 106 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 폴리스티렌 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  108. 제 79 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 자성이고/거나 자성 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  109. 제 79 항 내지 제 108 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 상기 결합분자의 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상 또는 약 10 카피, 102 카피, 103 카피, 104 카피, 105 카피 또는 106 카피 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  110. 제 79 항 내지 제 109 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 상기 입자의 상기 표면에 부착된 하나 이상의 제제를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 하나 이상의 제제는 세포 상의 추가 분자에 특이적으로 결합하여 보조 신호를 제공하고/거나 억제 신호를 차단하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  111. 제 110 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제제는 리간드이거나 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  112. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서,
    상기 추가 분자는 공자극 분자 또는 활성 공수용체, 선택적으로 OX-40, ICOS, DAP10, B7-1, B7-2, CD28 또는 4-1BB인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  113. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서,
    상기 추가 분자는 억제 수용체, 선택적으로 CTLA-4, PD-1, LAG-3, Tim-3, BTLA 또는 TIGIT인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  114. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서,
    상기 추가 분자는 T 세포 표면 단백질, 선택적으로 CD2 또는 CD3인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  115. 제 110 항 또는 제 111 항에 있어서,
    상기 추가 분자는 CD2 또는 CD28 인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  116. 제 115 항에 있어서,
    상기 입자는 항-CD2 항체 및 항-CD28 항체 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  117. 제 110 항 내지 제 116 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제제는 상기 입자에 공유 결합으로 부착된 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  118. 제 110 항 내지 제 117 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자와 상기 입자에 포함되는 상기 하나 이상의 제제의 비율, 선택적으로 몰비 또는 중량비는 1:1이거나 또는 약 1:1인 것을 특징으로 하는, 표면 개질 입자.
  119. 제 79 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항의 복수의 표면 개질 입자를 포함하는, 조성물.
  120. 제 119 항에 있어서,
    상기 조성물 내 상기 결합분자의 농도는 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL이거나 또는 약 0.5 μg/mL 내지 500 μg/mL, 1 μg/mL 내지 200 μg/mL 또는 5 μg/mL 내지 100 μg/mL L이거나; 또는
    상기 조성물 내 상기 결합분자의 농도는 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상 또는 약 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 또는 200 μg/mL 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  121. 제 119 항 또는 제 120 항에 있어서,
    상기 복수의 표면 개질 입자는 단순 분산성인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  122. 제 79 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항의 표면 개질 입자 또는 제 119 항 내지 제 121 항 중 어느 한 항의 조성물 및 사용 지침을 포함하는, 키트.
  123. 제 122 항에 있어서,
    지침은 세포 집단으로부터 상기 결합분자에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포들을 선택하거나 농축하기 위한 것임을 특징으로 하는, 키트.
  124. 제 122 항에 있어서,
    지침은 세포 집단으로부터 상기 결합분자에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포들을 자극하거나 증폭시키기 위한 것임을 특징으로 하는, 키트.
  125. 제 79 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항의 표면 개질 입자 또는 제 119 항 내지 제 121 항 중 어느 한 항의 조성물과 함께 세포 집단을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 세포 증폭 방법.
  126. 제 79 항 내지 제 118 항 중 어느 한 항의 상기 표면 개질 입자 또는 제 119 항 내지 제 121 항 중 어느 한 항의 조성물과 세포 집단을 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 선택 또는 농축시키는 방법.
  127. 세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법으로,
    상기 방법은
    투입 조성물에 있는 세포 내 CAR-의존 활성을 자극하기 위한 조건 하에서 상기 투입 조성물을 10 일 이상의 기간 동안 인큐베이션하되, 상기 투입 조성물은 항원을 특이적으로 인식하거나 항원과 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 포함하도록 하여, 산출 조성물을 생산하고; 및
    상기 산출 조성물의 하나 이상의 세포의 활성 또는 표현형 중 하나 이상을 평가;
    하는 것을 포함하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  128. 제 127 항에 있어서,
    CAR-의존 활성을 자극하기 위한 조건은 상기 CAR의 상기 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 분자의 존재를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  129. 제 128 항에 있어서,
    상기 결합분자는 지지체에 부착된 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  130. 제 129 항에 있어서,
    상기 지지체는 고체 지지체인 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  131. 제 130 항에 있어서,
    상기 고체 지지체는 마이크로플레이트 웰 또는 비드의 표면인 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  132. 제 130 항 또는 제 131 항에 있어서,
    상기 고체 지지체는 상기 마이크로플레이트에 부착된 결합분자를 갖는 마이크로플레이트이고 상기 인큐베이션은 상기 마이크로플레이트 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  133. 제 130 항 또는 제 131 항에 있어서,
    상기 고체 지지체는 부착된 상기 결합분자를 갖는 비드이고 상기 인큐베이션은 복수의 상기 비드의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법
  134. 제 128 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  135. 제 134 항에 있어서,
    상기 재조합 항원 또는 이의 일부는 상기 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 BCMA이거나 또는 이의 일부인 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  136. 제 128 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합분자는 상기 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  137. 제 136 항에 있어서,
    상기 항원 수용체의 상기 항원-결합 도메인은 SJ25C1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  138. 제 136 항에 있어서,
    상기 항원 수용체의 상기 항원-결합 도메인은 FMC63 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  139. 제 127 항 내지 제 138 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  140. 제 127 항 내지 제 139 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투입 조성물은 재조합 사이토카인을 포함하지 않는 배지의 존재 하에 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  141. 제 127 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 연속적으로 수행되거나 또는 기간 동안 중단되지 않는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  142. 제 127 항 내지 제 140 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션하는 동안, 세포를 재플레이팅하지 않고, 배지를 교환하지 않으며 결합분자를 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  143. 제 127 항 내지 제 142 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산출 조성물 중 하나 이상의 세포의 활성, 소진 또는 분화 상태의 하나 이상의 표현형을 평가하는 것을 포함하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  144. 제 143 항에 있어서,
    상기 표현형은 소진이고 상기 평가는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA 또는 CD96으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로 표면 발현을 측정하는 것을 포함하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법
  145. 제 143 항에 있어서,
    상기 표현형은 활성이고 상기 평가는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 또는 Ki67로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로 표면 발현을 측정하는 것을 포함하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  146. 제 143 항에 있어서,
    상기 표현형은 분화 상태이고 상기 평가는
    (i) CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 중 하나 이상; 및/또는
    (ii) CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7 중 하나 이상;
    으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 측정하는 것을 포함하고,
    선택적으로 여기에서 상기 하나 이상의 마커는 나이브-유사 T 세포(na
    Figure pct00025
    ve-like T cell)와 양성으로 또는 역으로 관련된 마커인 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  147. 제 127 항 내지 제 146 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산출 조성물 중 상기 하나 이상의 세포의 하나 이상의 활성을 평가하는 것을 포함하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  148. 제 127 항 내지 제 147 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 활성은 CAR-의존 활성, 선택적으로 항원-자극 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법
  149. 제 147 항 또는 제 148 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 활성은 세포 용해 활성 또는 사이토카인 생산을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법
  150. 제 127 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기간은 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일 이상 또는 약 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일 이상인 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  151. 제 127 항 내지 제 149 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기간은 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일이거나 또는 약 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 15 일인 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  152. 제 127 항 내지 제 151 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투입 조성물은 상기 인큐베이션 전 테스트 제제 또는 화합물에 노출되거나 접촉된 적이 있는 세포를 포함하고,
    선택적으로 여기에서 상기 노출 또는 접촉은 상기 CAR을 발현하는 상기 T 세포를 포함하는 상기 투입 조성물을 생산하기 위한 하나 이상의 공정 단계 중 수행된 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  153. 제 127 항 내지 제 152 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 복수의 투입 조성물에서 수행되고, 상기 복수의 투입 조성물 각각은 상이한 공정으로 생산된 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법
  154. 제 127 항 내지 제 153 항 중 어느 한 항에있어서,
    상기 산출 조성물의 표현형 또는 활성과 대조군 조성물의 표현형 또는 활성을 비교하는 것을 추가로 포함하고,
    선택적으로 여기에서 상기 대조군 조성물은 상기 CAR-의존 활성을 자극하기 위한 같은 조건 하에서 10 일 이상 동안 인큐베이션된 T 세포 조성물이고,
    상기 T 세포 조성물은 상기 테스트 제제 또는 화합물 존재 하에 생산되지 않았거나 또는 상기 투입 조성물과 비교해서 대안적인 공정으로 생산된 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
  155. 제 127 항 내지 제 154 항 중 어느 한 항에 있어서,
    감소된 소진, 감소된 활성 또는 저하된 분화를 나타내는 산출 조성물을 확인하는 것을 추가로 포함하고,
    선택적으로 여기에서 상기 저하된 분화는 하나 이상의 나이브-유사 T 세포 마커의 발현 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법.
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