TWI787903B - 用於轉導作用及細胞處理之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於細胞處理(例如用於治療用途，諸如用於授受細胞療法)之方法、系統及套組。所提供之方法包括轉導方法，其中細胞及病毒係在會導致細胞經病毒載體轉導之條件下培育。在一些實施例中，該培育在一般固定的離心室之內部空穴進行，諸如由硬塑膠製成的圓柱形離心室，該空穴具有可變體積。該等方法包括其他處理步驟，包括在此離心室中進行之步驟，包括洗滌、選擇、分離、培養及調配。詳言之，本發明係關於提供優於可用處理方法(諸如可用於大規模處理之方法)之優勢的方法。此類優勢包括例如降低成本、流線化、增加功效、增加安全性及增加在不同個體及條件中的再現性。

Description

用於轉導作用及細胞處理之方法
本發明係關於用於治療用途(諸如用於授受細胞療法)之細胞處理。所提供之方法一般包括轉導方法，其中細胞及病毒載體粒子在一定條件下培育，使得細胞轉導有病毒載體。培育可在一般固定的離心室(諸如由硬塑膠製成的圓柱形離心室)的內部空穴進行。該等方法包括其他處理步驟，包括在此離心室中進行之步驟，包括洗滌、選擇、分離、培養及調配。詳言之，本發明係關於提供優於可用處理方法(諸如可用於大規模處理之方法)之優勢的方法。此類優勢包括例如降低成本、流線化、增加功效、增加安全性及增加在不同個體及條件中的再現性。
某些方法可用於細胞處理，包括大規模方法及適用於製備用於授受細胞療法之細胞的方法。舉例而言，用於病毒載體轉移之方法，例如轉導、選擇、分離、刺激、培養、洗滌及調配為可用的。可用方法尚未完全令人滿意。舉例而言，對於用於授受細胞療法之細胞的大規模處理(例如轉導)，需要改良方法。舉例而言，需要改良功效及再現性且減少時間、成本、操作、複雜性及/或與此類生產相關聯之其他參數的方法。所提供之實施例為滿足此類需要之方法、系統及套組。
提供用於細胞處理(諸如用於病毒載體轉移及/或基於免疫親和力之細胞選擇)之方法。在一些實施例中，細胞適用於細胞療法，此類初級細胞準備用於自體或同種異體轉移，例如用於授受細胞療法。該等方法可包括額外細胞處理步驟，諸如細胞洗滌、分離(isolation)、分離(separation)。 在一些實施例中，該等方法藉由在諸如離心室之內部空穴的器皿中培育含有細胞及病毒載體粒子之組合物(視為輸入組合物)，該等病毒粒子含有重組病毒載體，藉此產生含有複數個轉導有病毒載體之細胞的輸出組合物。離心室通常可圍繞旋轉軸旋轉。在一些實施例中，旋轉軸為垂直的。該離心室通常包括端壁、自端壁延伸之側壁(諸如基本上固定側壁)及至少一個開口(諸如入口/出口或入口及出口)。側壁的至少一部分一般包圍內部空穴。至少一個開口(例如入口/出口或入口及出口)能夠允許液體引入至內部空穴中及液體自該空穴壓出。在一些實施例中，至少一個開口與離心室同軸，且在一些實施例中，處於離心室端壁中。側壁可為曲線形，例如圓柱形或大體上圓柱形。 在一些實施例中，該等方法包括在離心室之內部空穴中培育含有細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，其中該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且包括端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出，其中該離心室在培育之至少一部分期間圍繞該旋轉軸旋轉且該方法產生含有複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物。 在一些實施例中，離心室另外包括可移動構件，諸如活塞。在此類實施例中，內部空穴一般為可變體積之一，例如具有由端壁、側壁及可移動構件(例如活塞)界定之可變體積之空穴，使得可移動構件能夠在離心室內(諸如在離心室內軸向)移動以改變空穴之內部體積。在一些實施例中，液體藉助於例如自空穴抽出液體及/或將液體推入之泵、注射器及/或馬達、或用於引入及壓出液體或氣體之其他裝置而交替地移入及移出離心室，而空穴本身之體積保持恆定。 在一些實施例中，該等方法包括在離心室之內部空穴中培育含有細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且包含端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出，其中該離心室在培育之至少一部分期間圍繞該旋轉軸旋轉，在該離心室旋轉期間存在於該空穴中之該輸入組合物的總液體體積不超過每平方吋該空穴之內部表面積約5 mL，且該方法產生包含複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物。 該離心室可包含兩個端壁。在一些此類實施例中，一個端壁連同其他特徵界定內部空穴，而另一個在該空穴外。在一些實施例中，該空穴受兩個端壁限制。 該至少一個開口可包含：分別能夠允許該引入及壓出之入口及出口、或能夠允許該引入及該壓出之單一個入口/出口。 通常，培育至少部分在離心室旋轉下，諸如在離心力或加速度下進行。因此，在一些實施例中，該等方法另外包括在培育之至少一部分期間實現離心室諸如圍繞其旋轉軸之旋轉。 在一些任何此類實施例中，該旋轉包括以在空穴側壁內表面及/或在表層細胞之大於約200 g、大於約300 g、或大於約500 g的相對離心力(RCF)旋轉。在一些任何此類實施例中，該旋轉包括以在空穴側壁內表面及/或在表層細胞之如下相對離心力旋轉：1000 g、1500 g、2000 g、2100 g、2200 g、2500 g或3000 g，或約該等數值之相對離心力；或至少1000 g、1500 g、2000 g、2100 g、2200 g、2500 g或3000 g，或約該等數值之相對離心力。在一些任何此類實施例中，該旋轉包括以在空穴側壁內表面及/或在表層細胞之如下該等數值之間相對離心力或約該等數值之間相對離心力旋轉：1000至3600、1000至3200、1000至2800、1000至2000、1000至1600、1600至3600、1600至3200、1600至2800、1600至2000、2000至3600、2000至3200、2000至2800、2800至3600、2800至3200、3200至3600 (各包括端點本數)；或至少2000 g、2100、2200 g、2400 g、2600 g、2800 g、3000 g、3200 g或3600 g，或約該等數值之相對離心力；或2000 g、2100 g、2200 g、2400 g、2600 g、2800 g、3000 g、3200 g或3600 g，或約該等數值之相對離心力。 在一些任何此類實施例中，在培育之至少一部分期間，使離心室旋轉如下時間：大於5分鐘或約5分鐘，諸如大於10分鐘或約10分鐘、大於15分鐘或約15分鐘、大於20分鐘或約20分鐘、大於30分鐘或約30分鐘、大於45分鐘或約45分鐘、大於60分鐘或約60分鐘、大於90分鐘或約90分鐘、或大於120分鐘或約120分鐘；或5分鐘至60分鐘之間或約5分鐘至60分鐘之間、10分鐘至60分鐘之間或約10分鐘至60分鐘之間、15分鐘至60分鐘之間或約15分鐘至60分鐘之間、15分鐘至45分鐘之間或約15分鐘至45分鐘之間、30分鐘至60分鐘之間或約30分鐘至60分鐘之間、或45分鐘至60分鐘之間或約45分鐘至60分鐘之間(各包括端點本數)。 在一些實施例中，在培育期間(例如在任一時間或在整個培育期間)及/或藉由該等方法處理之空穴中之輸入組合物(或細胞數目)包括1×106 、5×106 、1×107 、5×107 、1×108 或5×108 個或約該等數目或至少約1×106 、5×106 、1×107 、5×107 、1×108 或5×108 個細胞。 在一些任何此類實施例中，空穴中之該輸入組合物含有至少1×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少2×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少3×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少4×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少5×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少6×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少7×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少8×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少9×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少1×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少2×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少3×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞或至少4×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞。 在一些實施例中，空穴之內部表面積為至少1×109 µm2 或1×1010 µm2 或約1×109 µm2 或1×1010 µm2 ，及/或側壁在自端壁延伸之方向的長度為至少約5 cm及/或至少約8 cm；及/或內部空穴在至少一個截面之半徑為至少約2 cm。 在一些實施例中，輸入組合物包括每個細胞至少1個或約1個感染單位(IU)、每個細胞至少2個或約2個IU、每個細胞至少3個或約3個IU、每個細胞至少4個或約4個IU、每個細胞至少5個或約5個IU、每個細胞至少10個或約10個IU、每個細胞至少20個或約20個IU、每個細胞至少30個或約30個IU、每個細胞至少40個或約40個IU、每個細胞至少50個或約50個IU、或每個細胞至少60個或約60個IU。在一些實施例中，輸入組合物包括每個細胞1個或約1個感染單位(IU)、每個細胞2個或約2個IU、每個細胞3個或約3個IU、每個細胞4個或約4個IU、每個細胞5個或約5個IU、每個細胞10個或約10個IU、每個細胞20個或約20個IU、每個細胞30個或約30個IU、每個細胞40個或約40個IU、每個細胞50個或約50個IU、或每個細胞60個或約60個IU。 在一些實施例中，輸入組合物(具有病毒載體粒子及細胞之組合物及/或在培育期間存在於空穴中之任何液體組合物)的平均液體體積或最大液體體積在培育期間不超過每平方吋空穴內部表面積約10、5或2.5毫升(mL)。在一些實施例中，在培育期間之任一時間存在於空穴中之此類液體組合物的最大總體積為細胞總體積之不超過2倍、不超過10倍、不超過100倍、不超過500倍或不超過1000倍。在一些實施例中，細胞總體積為細胞集結粒之總體積。在一些實施例中，細胞總體積為單層細胞(諸如在離心室旋轉期間存在於空穴內表面上之單層細胞)之體積。 在一些實施例中，輸入組合物之液體體積在培育之至少一部分期間佔全部或基本上全部內部空穴體積。在其他實施例中，在培育之至少一部分期間，輸入組合物之液體體積僅佔內部空穴體積之一部分，在此至少一部分期間，空穴體積另外包含例如經由該至少一個開口或另一個開口在培育之前或期間引入至空穴中之氣體。 在一些任何此類實施例中，在該旋轉期間存在於該空穴中之該輸入組合物的液體體積係介於如下數值之間或介於約如下數值之間：每平方吋空穴內部表面積0.5 mL (毫升/平方吋)至5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至1毫升/平方吋、1毫升/平方吋至5毫升/平方吋、1毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、或2.5毫升/平方吋至5毫升/平方吋。 在一些任何此類實施例中，在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大總液體體積為該空穴中該等細胞之總體積的不超過2倍、不超過10倍或不超過100倍，或該輸入組合物經培育過程之平均體積為該空穴中細胞總體積之不超過2、10或100倍。 在一些任何此類實施例中，在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大體積或經培育過程之平均體積為在該離心室以在側壁內表面2000 g或約2000 g之力旋轉期間在該空穴之內表面上形成的單層該等細胞之體積的不超過下列倍數或不超過約下列倍數：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。 在一些任何此類實施例中，輸入組合物之液體體積不超過20 mL、不超過40 mL、不超過50 mL、不超過70 mL、不超過100 mL、不超過120 mL、不超過150 mL或不超過200 mL。 在一些任何此類實施例中，在離心室中培育之至少一部分期間或在離心室旋轉期間，輸入組合物之液體體積僅佔離心室內部空穴體積之一部分，在該至少一部分期間或在該旋轉期間，空穴體積另外包含氣體，該氣體在該培育之前或期間經由該至少一個開口引入至該空穴中。 在一些實施例中，離心室包括可移動構件，其中氣體引入至離心室中實現可移動構件之移動以增加離心室內部空穴之體積，藉此與離心室中不存在氣體相比，減少在該離心室旋轉期間存在於該空穴中之該輸入組合物之每平方吋空穴內部表面積的總液體體積。 在一些實施例中，在培育期間空穴中之細胞數目為或約為足以在離心室以2000 g或約2000 g之力旋轉期間在空穴內表面上形成單層之細胞數目，及/或不超過該細胞數目之1.5倍或2倍。 在一些任何此類實施例中，該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在該離心室以在側壁內表面2000 g或約2000 g之力旋轉期間在該空穴表面上形成單層之該等細胞的數目；及/或該輸入組合物中該等細胞之數目為足以在該離心室以在側壁內表面2000 g或約2000 g之力旋轉期間在該空穴表面上形成單層之該等細胞之數目的不超過1.5倍或2倍。 在一些實施例中，離心持續120秒至7200秒，諸如120秒至3600秒，包括端點本數或在範圍內之值，諸如包括端點本數或在範圍內之整分鐘值。 在一些實施例中，該等方法包括a)向內部表面積為至少1×109 µm2 或約1×109 µm2 或至少1×1010 µm2 或約1×1010 µm2 之離心室的內部空穴提供：i)包括細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，其中：該輸入組合物中之細胞數目為至少1×107 個細胞，且該等病毒粒子以每個該等細胞至少1個或約1個感染單位(IU)存在於該輸入組合物中，且該輸入組合物之液體體積小於該離心室之內部空穴的最大體積；及ii)體積至多為該離心室內部空穴之剩餘最大體積的氣體；及b)培育該輸入組合物，其中培育之至少一部分在該離心室之該內部空穴中進行，同時實現該離心室之旋轉；且其中該方法產生含有複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物。 在一些實施例中，細胞數目至少為或約為50×106 個細胞；100×106 個細胞；或200×106 個細胞；及/或病毒粒子以至少每個細胞1.6個IU、每個細胞1.8個IU、每個細胞2.0個IU、每個細胞2.4個IU、每個細胞2.8個IU、每個細胞3.2個IU或每個細胞3.6個IU、每個細胞4.0個IU、每個細胞5.0個IU、每個細胞6.0個IU、每個細胞7.0個IU、每個細胞8.0個IU、每個細胞9.0個IU或每個細胞10.0個IU存在。 在一些任何此類實施例中，輸入組合物之液體體積小於或等於200 mL、小於或等於100 mL、或小於或等於50毫升、或小於或等於20 mL。在一些任何此類實施例中，氣體體積為至多200 mL、至多180 mL、至多140 mL或至多100 mL。 在一些任何此類實施例中，該旋轉在空穴側壁內表面或在表層細胞之相對離心力為至少或至少約1000 g、1500 g、2000 g、2400 g、2600 g、2800 g、3000 g、3200 g或3600 g。 在一些實施例中，該等方法用於大規模處理。 在一些實施例中，空穴中之組合物(例如輸入組合物)在該培育之至少一部分期間包括至少50 mL、至少100 mL或至少200 mL液體體積及/或每平方公分空穴內部表面積至少一百萬個或約一百萬個細胞。 在一些實施例中，在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大液體體積為在該離心室例如以2000 g或約2000 g之力(例如有效力)旋轉期間在該空穴之內表面上形成的單層該等細胞之體積的不超過下列倍數或不超過約下列倍數：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。 在一些實施例中，在培育之至少一部分期間，該離心室以在離心室空穴內壁及/或一層(例如表層)細胞之大於約200 g、大於約300 g、或大於約500 g(諸如大於約1000 g、1500 g、2000 g、2500 g、3000 g或3200 g)之力旋轉。在一些實施例中，該力為至少1000 g、1500 g、2000 g、或2500 g、3000 g或3200 g，或約該等數值。在一些實施例中，該力為2100 g、2200 g或3000 g，或約該等數值。 在一些實施例中，該等方法包括培育含有細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，該培育之至少一部分在旋轉條件下進行，藉此產生含有複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物，其中該輸入組合物之體積大於或約為20 mL、50 mL、至少100 mL或至少150 mL，及/或該輸入組合物包含至少1×108 個細胞；及該等旋轉條件包含在表層細胞上大於約1500 g之相對離心力。 在該等方法之一些實施例中，該輸出組合物中至少25%或至少50%之該等細胞轉導有該病毒載體；及/或該輸出組合物中至少25%或至少50%之該等細胞表現該病毒載體內所含之異源核酸的產物。 在一些任何此類實施例中，該培育在離心室之空穴中進行，且該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在該旋轉期間在該空穴之內表面上形成單層或雙層之該等細胞的數目。 在一些實施例中，該離心室包括端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。 在一些實施例中，該離心室另外包括可移動構件且該內部空穴為具有由該端壁、該基本上固定側壁及該可移動構件界定之可變體積的空穴，該可移動構件能夠在該離心室內移動以改變該空穴之內部體積。 在一些任何此類實施例中，該空穴中之輸入組合物在該培育之至少一部分期間含有至少20 mL或至少50 mL之液體體積及每平方公分空穴內部表面積一百萬個或約一百萬個細胞。 在一些任何此類實施例中，該培育之另一部分在離心室外及/或在無旋轉之情況下進行，該另一部分在於離心室中及/或在旋轉下進行至少一部分之後進行。 在一些任何此類實施例中，該培育之至少一部分在離心室之空穴中進行及/或該培育之另一部分在37℃±2℃或約37℃±2℃下實現。 在一些任何此類實施例中，該培育另外包括在該培育期間將至少複數個細胞轉移至容器且該培育之該另一部分在該容器中實現。在一些實施例中，轉移在封閉系統內進行，其中該離心室及容器與該封閉系統為一體的。 在一些任何此類實施例中，該培育進行一段介於下列之時間：1小時或約1小時至96小時或約96小時、4小時或約4小時至72小時或約72小時、8小時或約8小時至48小時或約48小時、12小時或約12小時至36小時或約36小時、6小時或約6小時至24小時或約24小時、36小時或約36小時至96小時或約96小時(包括端點本數)之時間；或該培育之另一部分進行一段介於下列之時間：1小時或約1小時至96小時或約96小時、4小時或約4小時至72小時或約72小時、8小時或約8小時至48小時或約48小時、12小時或約12小時至36小時或約36小時、6小時或約6小時至24小時或約24小時、36小時或約36小時至96小時或約96小時(包括端點本數)之時間。 在一些任何此類實施例中，該培育或該培育之另一部分進行不超過48小時、不超過36小時或不超過24小時之時間；或該培育之另一部分進行不超過48小時、不超過36小時或不超過24小時之時間。 在一些任何此類實施例中，該培育在刺激劑存在下進行；及/或該培育之另一部分在刺激劑存在下進行。 在一些任何此類實施例中，該培育進行不超過24小時之時間；該組合物中之細胞尚未經受大於30℃之溫度超過24小時；及/或該培育並非在刺激劑存在下進行。 在一些任何此類實施例中，該刺激劑為能夠誘導T細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞增殖之藥劑。 在一些任何此類實施例中，該刺激劑為選自IL-2、IL-15及IL-7之細胞激素。 在一些任何此類實施例中，含有轉導細胞之該輸出組合物含有至少1×107 個細胞或至少5×107 個細胞。 在一些任何此類實施例中，含有轉導細胞之該輸出組合物含有至少1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞。 在一些任何此類實施例中，該等細胞為T細胞。在一些實施例中，該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD4+ T細胞及/或經分離CD8+ T細胞。 在一些任何此類實施例中，該方法使得病毒載體整合於至少複數個細胞中之一或多者的宿主基因體中及/或整合於輸出組合物中至少20%或約20%、或至少30%或約30%，或至少40%或約40%之細胞的宿主基因體中。 在一些任何此類實施例中，該輸入組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞藉由該方法轉導有該病毒載體；及/或該輸出組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有該病毒載體；及/或該輸出組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞表現該病毒載體內所含之異源核酸的產物。 具體實施例包括藉由在旋轉條件下培育包含細胞及病毒載體粒子之輸入組合物進行轉導的方法，藉此接種複數個細胞用於經病毒載體轉導，其中該輸入組合物包括大於50 mL之總體積，諸如至少100 mL或至少150 mL體積，及/或該輸入組合物包含至少1×108 個細胞；及該等旋轉條件包含大於約1500 g之離心力。在一些此類實施例中，該培育在離心室之空穴中進行且該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在旋轉期間在該空穴之內表面上形成單層的該等細胞的數目。在一些此類實施例中，至少25%或至少50%之該等細胞轉導有該病毒載體。 在一些實施例中，該等方法使得該輸入組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有該病毒載體，及/或產生至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之細胞轉導有載體及/或表現由該載體編碼之重組產物的輸出組合物。在一些實施例中，轉導效率表示病毒之具體輸入量或相對量。舉例而言，在一些實施例中，此類效率藉由用於以每個細胞約1或約2個IU之比率包含病毒之輸入組合物的方法實現。 在一些實施例中，在藉由該等方法產生之該輸出組合物中的所有細胞當中，重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過約5、不超過約2.5或不超過約1.5。在一些實施例中，在含有該重組病毒載體之該輸出組合物中的細胞當中，該載體之平均複本數不超過約5、不超過約2、不超過約1.5或不超過約1。 在一些任何此類實施例中，在含有重組病毒載體或病毒載體整合於其中之該輸出組合物中的所有細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過約5、不超過約2.5或不超過約1.5；或在該輸出組合物中之細胞當中，該載體之平均複本數不超過約2、不超過約1.5或不超過約1。 在一些實施例中，離心室與封閉系統為一體的，例如其中該封閉系統包括該離心室及經由至少一個連接器可操作地連接於至少一個開口的至少一個管線，以便允許液體及氣體在該系統之至少一個組態中在該空穴與該至少一個管線之間移動。該至少一個管線通常包括一系列管線。該至少一個連接器通常包括複數個連接器。該封閉系統可另外包括可操作地連接於該一系列管線之至少一個容器，使得至少一種連接允許液體及/或氣體經由該一系列管線在該至少一個容器與該至少一個開口之間通過。 該至少一個連接器可包括選自由閥、魯爾端口(luer port)及長釘組成之群之一或多種連接器，例如旋轉閥，諸如活栓或多旋轉端口，及/或無菌連接器。 該至少一個容器可包括一或多個袋包、小瓶及/或注射器，且可包括指定為稀釋劑容器、廢料容器、產物收集容器、輸出容器及/或輸入容器之容器。 在一些實施例中，該至少一個容器包括至少一個包括病毒及/或細胞之輸入容器(其可為包含病毒及細胞之單一個輸入容器或分別包含病毒及細胞之兩個輸入容器)、廢料容器、產物容器及至少一個含稀釋劑或洗滌溶液之容器，其各經由該一系列管線及該至少一個開口連接至該空穴。 在一些任何此類實施例中，至少一個容器另外包括在該培育期間之至少一個點之前及/或期間含有氣體的容器，及/或該封閉系統另外包括能夠將氣體引入至離心室內部空穴中之微生物過濾器及/或該封閉系統含有用於實現氣體引入之注射器端口。 在一些實施例中，該等方法另外包括在培育之前及/或期間，實現該輸入組合物引入至該空穴中。該引入可包括液體自至少一個輸入容器經由該至少一個開口流入該空穴。該引入可包括病毒自一個輸入容器引入且細胞自另一個輸入容器輸入以產生用於培育之輸入組合物。 在一些實施例中，該方法包括在該培育之前及/或期間，提供或實現氣體在無菌條件下引入至該空穴中，該引入藉由(a)來自包括氣體之容器之氣體的流動、(b)來自封閉系統外部環境經過微生物過濾器之氣體的流動、或(c)來自連接至該系統之注射器在注射器端口處之氣體的流動來實現。 在一些實施例中，實現氣體引入至離心室之內部空穴中與實現輸入組合物引入至離心室之內部空穴中同時或一起進行。 在一些任何此類實施例中，該輸入組合物與氣體在該輸入組合物及氣體引入至該離心室之內部空穴中之前在該離心室外之無菌條件下合併在單一個容器中。 在一些實施例中，實現該氣體引入與實現該輸入組合物引入至該空穴中同時或依次分開進行。 在一些任何此類實施例中，該氣體引入藉由允許或引起來自含有該氣體之無菌封閉容器、來自外部環境且穿過微生物過濾器或來自含有該氣體之注射器之氣體的流動來實現。 在一些任何此類實施例中，該氣體為空氣。 在所提供之過程方法之一些實施例中，該培育為連續過程之一部分，其中該方法另外包括在該培育之至少一部分期間，實現該輸入組合物連續引入至該空穴中，通常在該離心室之旋轉期間；及在該培育之一部分期間，實現液體經由該至少一個開口自該空穴連續壓出(亦即排出)，通常在該離心室之旋轉期間。在一些實施例中，連續引入及排出同時進行。 在一些實施例中，該方法包括在該培育之一部分期間，在該離心室之旋轉期間實現氣體連續引入至該空穴中；及/或在該培育之一部分期間，實現氣體自該空穴連續壓出。 在一些實施例中，該方法包括自該空穴壓出液體及壓出氣體，其中各同時或依次壓出至不同容器中。 在一些任何此類實施例中，該連續引入及該連續壓出之至少一部分同時進行。 在一些實施例中，該培育為半連續過程之一部分，諸如其中該方法另外包括實現該輸入組合物經由該至少一個開口引入至該空穴中，進行該培育之全部或一部分(諸如離心)，接著實現液體自該空穴壓出且接著重複該過程，藉此將另一種輸入組合物引入至該空穴中，接著離心，接著壓出。該過程可反覆且包括更多輪引入、處理及壓出。 在一些任何此類實施例中，該培育為半連續過程之一部分，該方法另外包括在該培育之前，實現該輸入組合物及視情況存在之氣體經由該至少一個開口引入至該空穴中；在該培育之後，實現液體及/或視情況存在之氣體自該空穴壓出；實現包括細胞及含有重組病毒載體之該等病毒粒子之另一輸入組合物及視情況存在之氣體引入至該內部空穴中；及在該內部空穴中培育該另一輸入組合物，其中該方法產生含有複數個轉導有該病毒載體之該另一輸入組合物之細胞的另一輸出組合物。 在一些任何此類實施例中，該提供或該引入該輸入組合物至該空穴中包括引入包括細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的單一個組合物；或引入包括細胞之組合物及包括含有重組病毒載體之病毒粒子的另一組合物，藉此混合該等組合物，實現該輸入組合物之引入。 該引入可包括引入含有細胞及病毒之單一個組合物；或引入含有細胞之組合物及含有病毒中另一組合物，藉此混合該等組合物，實現該輸入組合物之引入。在連續或半連續過程之一些實施例中，經多輪或連續過程總計處理至少1×108 個細胞或至少1×109 個細胞或至少1×1010 個細胞或更多。 在一些實施例中，該方法包括在該培育之前及/或期間實現該離心室之旋轉及在該培育之後實現液體自該空穴壓出至該廢料容器中；實現液體自該至少一個稀釋劑容器經由該至少一個開口壓出至該空穴中及實現該空穴之內含物的混合；及實現液體自該空穴壓出至該產物容器中，藉此將轉導有病毒載體之細胞轉移至產物袋包中。 在一些實施例中，該方法另外包括在同一離心室及/或封閉系統內進行其他處理步驟或一或多個其他處理步驟之至少一部分。在一些實施例中，該一或多個處理步驟可包括在同一離心室及/或封閉系統內分離(諸如分離或選擇)、刺激及調配細胞之過程。在一些情況下，該一或多個其他處理步驟亦可包括洗滌細胞，其可在用於分離(諸如分離或選擇)、刺激、轉導及/或調配細胞之處理步驟中之任一或多者之前或之後進行。在一些實施例中，該一或多個其他處理步驟可在轉導方法中在細胞與病毒載體粒子一起培育之前、同時或之後進行。在一些實施例中，該一或多個其他處理步驟或該一或多個其他處理步驟之一部分可在與用於培育細胞與病毒載體粒子的離心室空穴相同或不同的離心室空穴中進行。 在所提供之處理方法當中，包括分離(例如選擇)方法、刺激方法、調配方法及其他處理方法為根據如上所述實施例中之任一者進行的方法。 舉例而言，在一些實施例中，該方法另外包括(a)在用於分離(例如選擇)細胞之培育之前及/或在用於使細胞與病毒載體粒子一起培育之培育之前，在離心室之空穴中洗滌含有細胞之生物樣品(例如全血樣品、白血球層樣品、周邊血液單核細胞(PBMC)樣品、未分離T細胞樣品、淋巴球樣品、白血球樣品、清除術產物或白血球清除術產物)，(b)在此類細胞與病毒載體粒子一起培育之前，在空穴中自樣品(例如全血樣品、白血球層樣品、周邊血液單核細胞(PBMC)樣品、未分離T細胞樣品、淋巴球樣品、白血球樣品、清除術產物或白血球清除術產物)分離(例如選擇)該等細胞及/或(c)在此類細胞與病毒載體粒子一起培育之前及/或期間，在空穴中例如藉由使細胞暴露於刺激條件來刺激細胞，藉此誘導輸入組合物之細胞增殖。在一些實施例中，該分離包括基於免疫親和力之選擇。 在一些任何此類實施例中，該方法包括(a)在該培育之前，在離心室之內部空穴中洗滌含有該等細胞之生物樣品；及/或(b)自生物樣品分離該等細胞，其中該分離步驟之至少一部分在該培育之前在離心室之內部空穴中進行；及/或(c)在該培育之前及/或期間刺激細胞，該刺激包括使該等細胞暴露於刺激條件，藉此誘導輸入組合物之細胞增殖，其中該刺激細胞步驟之至少一部分在離心室之內部空穴中進行。 在一些實施例中，該等方法可另外包括在離心室中例如藉由基於免疫親和力之選擇來分離(例如選擇)細胞。在一些實施例中，該分離(例如選擇)細胞在轉導方法中在細胞與病毒載體粒子一起培育之前進行，藉此經分離(諸如經選擇)之細胞為輸入組合物中存在及/或與病毒載體粒子一起培育之細胞。在一些實施例中，該分離(例如選擇)包括細胞與選擇試劑(諸如免疫親和力試劑)一起培育。在一些實施例中，該分離(例如選擇)步驟之至少一部分，諸如細胞與選擇試劑(例如免疫親和力試劑)一起培育在離心室之空穴中進行，其在一些情況下可包括旋轉該離心室，例如以便混合該試劑及細胞。 在一些實施例中，該等方法可另外包括在細胞與病毒載體粒子一起培育之前、期間及/或之後刺激細胞，其中至少全部或一部分刺激可在離心室之空穴中進行。在一些實施例中，刺激條件可包括在能夠活化TCR複合物之一或多種組分的一或多個細胞內信號傳導結構域之藥劑存在下培育細胞，諸如特異性結合至TCR複合物成員(例如CD3)之初級藥劑及特異性結合至T細胞協同刺激分子(例如CD28、CD137 (4-1-BB)、OX40或ICOS)之二級藥劑，包括抗體，諸如存在於固體支撐物(諸如珠粒)之表面上的抗體。在一些實施例中，刺激之至少一部分，諸如在刺激條件存在下培育細胞在離心室之空穴中進行，其在一些情況下可包括旋轉該離心室，例如以便混合該試劑及細胞。 在一些任何此類實施例中，該方法包括在離心室之內部空穴中將細胞(諸如根據所提供之方法產生或生成之細胞，包括藉由該方法轉導之細胞)調配於醫藥學上可接受之緩衝液中，藉此產生調配組合物。在一些實施例中，該等方法另外包括實現該調配組合物壓出至一個或複數個容器中。在一些實施例中，該等方法包括實現該調配組合物之壓出，包括實現以單一個單位劑量存在之許多細胞壓出至該一個或複數個容器中之一者或每一者中。 在一些任何此類實施例中，該離心室之空穴中之每一者與用於一或多個其他步驟及/或用於培育及/或旋轉含有細胞及病毒粒子之輸入組合物的離心空穴相同或不同。 在一些任何此類實施例中，該等離心室中之每一者與封閉系統為一體的，該封閉系統包括該離心室及經由至少一個連接器可操作地連接於至少一個開口的至少一個管線，藉此允許液體及氣體在該系統之至少一個組態中在該空穴與該至少一個管線之間移動。 藉由該等方法處理之細胞通常為初級細胞，諸如自個體(通常人類)獲得之細胞。細胞可來源於投與療法之個體，諸如患有由藉由轉導載體表現之重組分子(例如重組抗原受體，諸如嵌合抗原受體或轉殖基因TCR)靶向之疾病或病狀的個體。或者，細胞可來自不同個體。因此，該等方法涵蓋處理用於自體及同種異體轉移。細胞可包括懸浮細胞，例如白血球，例如T細胞，諸如經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞或其亞群，或NK細胞。 在一些實施例中，在培育期間，離心室與感測器(例如能夠監測可移動構件位置之感測器)及控制電路(諸如能夠接收來自感測器之資訊及傳輸資訊至感測器、引起可移動構件之移動及/或與離心機進一步聯合且因此能夠在該培育期間引起該離心室之旋轉的電路)聯合。 在一些實施例中，該離心室含有可移動構件且在培育期間位於離心機內，並與能夠監測可移動構件位置之感測器及能夠接收及傳輸來自該感測器之資訊且引起可移動構件移動、經由該一或多個管線引入液體至該空穴及自該空穴壓出液體及經由該離心機旋轉該離心室之控制電路聯合。 在一些實施例中，該離心室、控制電路、離心機及/或感測器例如在培育期間容納在機櫃內。 在病毒轉移(例如轉導方法)中之任一者的一些實施例中，重組病毒載體編碼重組受體，其藉此藉由輸出組合物之細胞表現。在一些實施例中，重組受體為重組抗原受體，諸如功能性非T細胞受體，例如嵌合抗原受體(CAR)，或轉殖基因T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，重組受體為含有特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。 在一些任何此類實施例中，細胞包括自人類個體獲得之初級人類T細胞，且在與病毒載體粒子一起培育之前及/或在轉導完成之前及/或(若該方法包括調配)在調配之前，初級人類T細胞尚未在大於30℃之溫度下存在於個體外大於1小時、大於6小時、大於24小時或大於48小時，或在培育之前及/或在轉導完成之前及/或(若該方法包括調配)在調配之前，初級人類T細胞尚未在特異性針對CD3之抗體及/或特異性針對CD28之抗體及/或細胞激素之存在下培育大於1小時、大於6小時、大於24小時或大於48小時。 本文提供用於分離(例如選擇)細胞之方法，包括(a)在離心室之內部空穴中在混合條件下培育選擇試劑及初級細胞，藉此複數個初級細胞結合至該選擇試劑及(b)基於與該選擇試劑之結合，使該複數個初級細胞與另外一或多種初級細胞分離，藉此基於與該選擇試劑之結合富集初級細胞，其中該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且該內部空穴之最大體積為至少50 mL、至少100 mL或至少200 mL。在一些實施例中，用於分離(例如選擇)之方法在封閉系統中進行。在一些實施例中，在分離複數個細胞之步驟之前，與選擇試劑一起培育之細胞自離心室壓出或轉移出，但保持在封閉系統中。在一些實施例中，視情況在與選擇試劑一起培育之後且在分離細胞之前，該方法另外包括一或多個洗滌步驟，其在一些情況下，可根據所提供之方法在離心室之空穴中進行。在一些實施例中，分離細胞之步驟可使用固體支撐物，諸如使用免疫親和力管柱(包括用於磁分離之管柱)來實現，該固體支撐物可為封閉系統中所含。 本文提供用於刺激細胞之方法，包括在一定條件下培育刺激劑及初級細胞，藉此使刺激劑結合至由複數個初級細胞表現之分子且活化或刺激該複數個細胞，其中該培育之至少一部分在離心室之內部空穴中在混合條件下進行，其中該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且該內部空穴的最大體積為至少50 mL、至少100 mL或至少200 mL。 在一些實施例中，該等刺激方法作為包括轉導細胞之過程的一部分來進行，因而此類過程之全部或一部分在離心室中及/或作為同一封閉系統之一部分來進行。在一些實施例中，用刺激劑刺激之初級細胞包括或為在諸如根據所提供之方法自生物樣品分離(例如選擇)細胞後所獲得之細胞。在一些實施例中，該刺激之至少一部分在細胞與病毒載體粒子一起培育的同時或期間進行，使得初級細胞包括或為輸入組合物中存在之細胞及/或為已發生轉導或開始轉導之細胞。在一些實施例中，該刺激之至少一部分在細胞與病毒載體粒子一起培育之前進行，使得與病毒載體粒子一起培育之細胞為受刺激之細胞，其在一些情況下包括增殖性細胞。 在一些實施例中，該方法之更多其他處理步驟(包括分離(例如選擇)、刺激、洗滌及/或調配)中之一者的至少一部分在離心室中進行，其中該離心室包括端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。 本文提供含有藉由以上實施例中之任一者的方法產生的轉導細胞的組合物。在一些任何此類實施例中，該組合物含有以下細胞：初級細胞及/或人類細胞及/或包括白血球及/或T細胞及/或NK細胞。在一些任何此類實施例中，該組合物含有至少5×107 個細胞、1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞。在一些任何此類實施例中，該組合物含有治療有效數目之適用於授受T細胞療法的細胞。在一些任何此類實施例中，細胞為T細胞且在轉導之後，該組合物中之細胞並未在刺激劑存在下進行細胞擴增及/或該等細胞並未在大於30℃之溫度下培育超過24小時，或該組合物不含細胞激素或該組合物不含特異性結合至CD3或TCR複合物的刺激劑。 本文提供含有至少1×107 個或至少5×107 個T細胞之組合物，其中至少複數個轉導有重組病毒載體，其中在轉導之後，該組合物中之細胞尚未在刺激劑存在下進行細胞擴增及/或該等細胞尚未在大於30℃之溫度下培育超過24小時及/或該組合物中至少30、40、50、60、70或80%之T細胞含有CD69或TGF-β-II之高表面表現。在一些實施例中，該組合物含有至少1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞。 在一些任何此類實施例中，該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 在一些任何此類實施例中，該組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有病毒載體。 在一些任何此類實施例中，該病毒載體編碼重組受體且該組合物中之轉導細胞表現該重組受體。在一些實施例中，該重組受體為重組抗原受體。在一些實施例中，該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。在一些實施例中，該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，該重組受體為含有特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。在一些實施例中，該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 在一些任何此類實施例中，在該組合物中之所有細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2，或在該組合物中轉導有該重組病毒載體之細胞當中，該載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2。 在一些任何此類實施例中，該組合物含有醫藥學上可接受之賦形劑。 本文提供治療方法，包括向患有疾病或病狀之個體投與以上實施例中之任一者的組合物。在一些實施例中，該組合物中之轉導T細胞與以下組合物中之轉導T細胞相比在個體體內展現增加或較長擴增及/或持久性，其中在轉導之後，該組合物中之細胞已在刺激劑存在下進行細胞擴增及/或該等細胞已在大於30℃之溫度下培育超過24小時。 在一些任何此類實施例中，該重組受體、嵌合抗原受體或轉殖基因TCR特異性結合至與疾病或病狀相關聯之抗原。在一些實施例中，該疾病或病狀為癌症、自體免疫疾病或病症、或感染性疾病。 本文提供含有至少1×107 個細胞及每個細胞至少1個或約1個感染單位(IU)之含有重組病毒載體之病毒粒子的組合物。在一些實施例中，該等細胞含有至少或約50×106 個細胞、100×106 個細胞或200×106 個細胞，及/或該等病毒粒子以至少每個細胞1.6個IU、每個細胞1.8個IU、每個細胞2.0個IU、每個細胞2.4個IU、每個細胞2.8個IU、每個細胞3.2個IU、每個細胞3.6個IU、每個細胞4.0個IU、每個細胞5.0個IU、每個細胞6.0個IU、每個細胞7.0個IU、每個細胞8.0個IU、每個細胞9.0個IU或每個細胞10.0個IU的量存在於該組合物中。 在此類實施例中之任一者中，該組合物之液體體積小於或等於220 mL、小於或等於200 mL、小於或等於100 mL、小於或等於50 mL、或小於或等於20 mL。 在一些任何此類實施例中，該等細胞為初級細胞。在一些任何此類實施例中，該等細胞為人類細胞。在一些任何此類實施例中，該等細胞包括懸浮細胞，該等細胞包括白血球及/或該等細胞包括T細胞或NK細胞。在一些實施例中，該等細胞為T細胞且該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 在一些任何此類實施例中，該病毒載體編碼重組受體。在一些實施例中，該重組受體為重組抗原受體。在一些實施例中，該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。在一些實施例中，該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，該重組受體為含有特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。在一些實施例中，該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 本文提供可圍繞旋轉軸旋轉之離心室，其包括含有以上實施例中之任一者之組合物的內部空穴。 本文提供可圍繞旋轉軸旋轉之離心室，其包括含有(a)含有至少5×107 個轉導有重組病毒載體之初級T細胞的組合物及/或(b)含有至少5×107 個初級T細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的組合物的內部空穴。 在一些任何此類實施例中，該離心室另外含有端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。 在一些任何此類實施例中，該空穴中之該組合物含有至少1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞。 在一些任何此類實施例中，該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 在該離心室之一些任何此類實施例中，該組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有病毒載體。 在該離心室之一些任何此類實施例中，該病毒載體編碼重組受體且該組合物中之細胞表現該重組受體。在一些實施例中，該重組受體為重組抗原受體。在一些實施例中，該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。在一些實施例中，該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，該重組受體為含有特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。在一些實施例中，該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 在該離心室之一些任何此類實施例中，在該組合物中之所有細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2，或在該組合物中轉導有該重組病毒載體之細胞當中，該載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2。 本文提供可圍繞旋轉軸旋轉之離心室，其包括含有以上實施例中之任一者之組合物的內部空穴。在一些實施例中，該離心室另外含有至多該離心室之內部空穴最大體積的氣體體積。在一些實施例中，該氣體為空氣。 在該離心室之一些任何此類實施例中，該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且包括端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。在一些實施例中，該側壁為曲線形。在一些實施例中，該側壁為大體上圓柱形。 在該離心室之一些任何此類實施例中，該至少一個開口包括分別能夠允許該引入及壓出之入口及出口，或該至少一個開口包括能夠允許該引入及該壓出之單一個入口/出口。在該離心室之一些任何此類實施例中，該至少一個開口與該離心室同軸且位於該端壁中。 在一些任何此類實施例中，該離心室另外包括可移動構件且該內部空穴為具有由該端壁、該基本上固定側壁及該可移動構件界定之可變體積的空穴，該可移動構件能夠在該離心室內移動以改變該空穴之內部體積。在一些實施例中，該可移動構件為活塞及/或該可移動構件能夠在該離心室內軸向移動以改變該空穴之內部體積。 在一些任何此類實施例中，該空穴之內部表面積為至少1×109 µm2 或約1×109 µm2 ，該空穴之內部表面積為至少1×1010 µm2 或約1×1010 µm2 ，該固定壁在自該端壁延伸之方向的長度為至少約5 cm，該固定壁在自該端壁延伸之方向的長度為至少約8 cm及/或該空穴在至少一個截面之半徑為至少約2 cm。 在該離心室之一些任何此類實施例中，存在於該空穴中之該組合物的液體體積係介於如下數值之間或介於約如下數值之間：每平方吋該空穴之內部表面積0.5 mL (毫升/平方吋)至5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至1毫升/平方吋、1毫升/平方吋至5毫升/平方吋、1毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、或2.5毫升/平方吋至5毫升/平方吋。在一些任何此類實施例中，存在於該空穴中之該組合物的液體體積為至少0.5毫升/平方吋、1毫升/平方吋、2.5毫升/平方吋或5毫升/平方吋。 本文提供含有以上實施例中之任一者之離心室的封閉系統。在該封閉系統之一些任何此類實施例中，該離心室能夠在至多8000 g之速度下旋轉，其中該離心室能夠承受500、1000、1500、2000、2500、3000或3200 g之力而無基本上屈服、彎曲或斷裂或以其他方式導致該離心室之損壞及/或同時在此類力下基本上保持大體上圓柱形。
相關申請案的交叉參考 本申請案主張2014年11月05日提交之名稱為「Methods for Transduction and Cell Processing」的美國臨時申請案第62/075,801號及2015年3月05日提交之名稱為「Methods for Transduction and Cell Processing」的美國臨時申請案第62/129,023號的優先權，該等臨時申請案之內容以全文引用之方式併入。 除非另有定義，否則本文所用之所有技術術語、標記法及其他技術及科學術語意欲具有與一般熟習所主張標的物所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，出於清楚起見及/或方便參考，在本文中定義具有通常所理解含義之術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中一般所理解存在實質性差異。 本申請案提及的所有公開案，包括專利文件、科學論文及資料庫，均以全文引用之方式併入本文中用於所有目的，其引用的程度如同各個別公開案以引用的方式個別地併入一般。若本文所闡述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所述之定義相反或另外不一致，則以本文所闡述之定義為準，而非以以引用方式併入本文中的定義為準。 本文中所用之部分標題僅出於組織目的而不應理解為限制所述標的物。I. 細胞處理方法及相關系統、套組及裝置 提供用於處理細胞之方法，例如以產生適用於授受細胞療法之細胞組合物。該等方法包括諸如藉由病毒轉導將重組病毒載體轉移至細胞之方法。病毒載體一般編碼欲在細胞中表現之重組分子以例如用於細胞療法。該等方法之處理步驟亦可或替代地包括細胞洗滌、稀釋、選擇、分離、分離、培養、刺激、封裝及/或調配之全部或一部分。該等方法一般允許大規模(諸如在體積大於約50 mL之組合物中)處理(例如選擇或分離及/或轉導)細胞。細胞處理步驟中之一或多者一般在離心室(諸如大體上圓柱形且可圍繞旋轉軸旋轉之基本上固定離心室)之內部空穴中進行，其與其他可用方法相比可提供某些優勢。在一些實施例中，所有處理步驟在同一離心室中進行。在一些實施例中，一或多個處理步驟在不同離心室(諸如多個相同類型之離心室)中進行。 所提供之方法與可用於細胞處理(包括轉導及選擇)之方法，尤其用於大規模細胞處理之方法相比，提供各種優勢。某些可用方法尚未完全令人滿意，例如歸因於低於最佳功效、精確性、再現性、成本及時間消耗、錯誤風險、複雜性及需要使用者操作及生物安全設施。在一些實施例中，所提供之方法適於大規模及/或臨床級細胞生產，同時仍提供另外僅使用小規模生產方法可獲得之所需特徵且提供可用方法未提供之額外優勢。舉例而言，用於細胞轉導及/或基於親和力之選擇的方法與在可撓性塑膠袋包或塑膠多孔盤中進行之可用方法相比提供優勢。 在一些實施例中，處理細胞之離心室及/或其內部空穴至少部分由固定或基本上固定材料包圍或界定。在由諸如硬塑膠之此類材料限制的空穴中培育允許在某些條件下離心，諸如高於可在用於其他大規模細胞處理方法之袋包下使用之力。舉例而言，在一些實施例中，該離心室及空穴承受在如例如在該離心室或空穴之內壁或外壁或在一或多個細胞(諸如細胞層)量測之最小500 g、1000 g、1500 g、2000 g、2500 g、3000 g或3200 g，或約該等數值之力(例如相對離心力)下離心，而不基本上屈服、彎曲或斷裂或以其他方式導致容納該等細胞之離心室或空穴損壞，使得該離心室及/或空穴基本上在此類力下保持其形狀。 因此，該離心室及/或其內部空穴通常由固定或半固定側壁(諸如由硬塑膠製成之側壁)之全部或一部分包圍，其在所施加之離心力下保持其形狀。側壁一般為曲線形，例如圓柱形或大體上圓柱形，且通常自該離心室之一個或兩個端壁延伸，其中一或兩者之內側亦可界定該內部空穴之界限。端壁在一些實施例中亦由固定材料製成，且在一些實施例中可包括更多可撓性材料。在一些實施例中，雖然壁面由固定材料或基本上固定材料製成，但其仍可內襯有及/或塗有可撓性材料及/或含有更可撓的小部分，只要作為整體之空穴在該等方法之條件期間維持其總體形狀即可。 離心室一般可圍繞旋轉軸旋轉且空穴通常與該離心室同軸。在一些實施例中，離心室另外包括可移動構件，諸如活塞，其一般能夠在該離心室內移動(例如軸向移動)以改變空穴之體積。因此，在具體實施例中，內部空穴受離心室之側壁及端壁以及可移動構件限制且具有可藉由移動該可移動構件調節之可變體積。可移動構件可由固定、基本上或大體上固定、可撓性材料或其組合製成。 離心室一般亦包括一或多個開口，諸如一或多個入口、一或多個出口及/或一或多個入口/出口，其可允許液體及/或氣體引入至空穴及自空穴壓出。在一些情況下，開口可為液體及/或氣體之引入及壓出均發生的入口/出口。在一些情況下，一或多個入口可與一或多個出口分開或不同。開口可處於端壁中之一者中。在一些實施例中，液體及/或氣體藉由可移動構件之移動以增加及/或減小空穴之體積而引入至空穴中及/或自空穴中壓出。在其他實施例中，液體及/或氣體可經由與開口相連或相連置放之管線或其他通道，例如藉由將該管線或通道與泵、注射器或其他機械相連置放且控制泵、注射器或其他機械而引入至空穴中及/或自空穴壓出，該泵、注射器或其他機械可以自動化方式加以控制。 在一些實施例中，離心室為進行處理步驟之封閉系統(諸如無菌系統)之一部分，該系統具有各種額外組件，諸如管線及連接器及封蓋。因此，在一些實施例中，所提供之方法及/或其步驟在完全封閉或半封閉環境(諸如封閉或半封閉無菌系統)中進行，有助於生產治療性投與個體之細胞而無需另一無菌環境，諸如生物安全機櫃或房間。在一些實施例中，該等方法以自動化或部分自動化方式進行。 在一些實施例中，離心室與離心機聯合，其能夠實現該離心室諸如圍繞其旋轉軸之旋轉。旋轉可在處理步驟中之一或多者中在培育之前、期間及/或之後進行。因此，在一些實施例中，各種處理步驟中之一或多者在旋轉下，例如在具體力下進行。離心室通常能夠垂直或大體上垂直旋轉，使得離心室在離心期間垂直擱置且側壁及軸為垂直或大體上垂直的，而端壁水平或大體上水平。一個例示性離心室描繪在圖5、圖7或圖11中所描繪之例示性封閉系統內。 該等方法之處理步驟(例如全部或部分在離心室中進行之步驟)可包括許多細胞處理步驟中之任一或多者(單獨或組合)。在具體實施例中，處理步驟包括用含有反轉錄病毒載體之病毒載體粒子(諸如編碼在細胞中表現之重組產物的病毒載體粒子)轉導細胞，其中與該等病毒載體粒子一起培育之至少一部分在離心室中進行以引發轉導。該等方法可另外及/或替代地包括其他處理步驟，諸如用於分離、分離、選擇、培養(例如刺激細胞以例如誘導其增殖及/或活化)、洗滌、懸浮、稀釋、濃縮及/或調配細胞之步驟。在一些實施例中，該方法包括以如下次序進行之處理步驟，其中：首先自生物樣品分離(諸如選擇或分離)細胞(例如初級細胞)；在刺激劑存在下刺激所得經分離或選擇之細胞；受刺激之細胞與病毒載體粒子一起培育以便轉導；及將轉導細胞調配於組合物中。在一些實施例中，刺激另外或替代地在與病毒載體粒子一起培育之至少一部分期間進行。在一些情況下，刺激另外或替代地在細胞與病毒載體粒子一起培育之後進行。在一些情況下，該等方法不包括刺激細胞之步驟。在一些實施例中，該方法可包括洗滌、懸浮、稀釋及/或濃縮細胞當中的一或多個處理步驟，其可在分離(諸如分離或選擇)、刺激、轉導及/或調配步驟中之一或多者之前、期間或同時或之後進行。處理步驟中之每一者的全部或一部分可在封閉系統中，諸如在離心室中進行。在該等方法之態樣中，處理無需在同一封閉系統中，諸如在同一離心室中進行，而是可在不同封閉系統下，諸如在不同離心室中進行；在一些實施例中，此類不同離心室在該等方法中處於與同一系統聯合置放，諸如與同一離心機聯合置放之相應點。在一些實施例中，所有處理步驟在封閉系統中進行，其中各一或多個處理步驟的全部或一部分在同一或不同離心室中進行。 在一些實施例中，該等方法提供與可用方法相比在較高轉導效率下轉導細胞之能力，例如藉由在較高離心力/速度下進行轉導之全部或一部分及/或藉由允許容易、自動化及/或獨立控制或調節各種參數，諸如試劑之體積或量、速度及/或溫度。在一些實施例中，該等方法例如藉由流線化及/或減少使用者交互及/或操作步驟之數目，諸如藉由提供各種步驟之自動化或半自動化控制來增加功效及/或減小可變性(增加再現性)。 在一些實施例中，藉助於在封閉系統(諸如無菌封閉系統)內進行一或多個(例如全部或一部分)處理步驟，所提供之方法允許大規模製備用於臨床用途之細胞而不使細胞暴露於非無菌條件且無需使用另一無菌房間或機櫃。在一些實施例中，細胞在封閉系統內例如以自動化方式分離、分離或選擇、刺激、轉導、洗滌及調配。在一些實施例中，該等方法為有利的，因為其例如藉由在單一個封閉系統中及/或以自動化方式進行而流線化，例如需要較少步驟、較少使用者操作或干預。舉例而言，在一些實施例中，該等方法藉由在生物安全機櫃中以適當比率混合病毒載體粒子及細胞，接著運輸盤或袋包至離心機用於轉導或其他處理步驟及亦可能需要操作之額外步驟而提供優於可能需要在袋包中在離心機或盤中轉導之處理用於臨床應用之細胞之方法的改良。在一些實施例中，所提供之方法與此類可用方法相比手工及/或勞動較不密集，需要減小程度或數量的操作及使用者交互。 在一些實施例中，該等方法與可用方法相比允許更大程度的過程控制。舉例而言，在一些實施例中，該等方法允許例如以自動化方式獨立控制各種參數。舉例而言，該等方法可允許獨立控制該等方法中所用且在該等方法下處理之各種組分及試劑的體積、量及/或濃度或該等處理或方法中之一或多者中所用的各種條件。其一般允許控制該等方法中之一或多個不同步驟的持續時間及/或控制具體培育物或組合物中細胞之比率、液體體積及/或處理所用器皿(諸如離心室或空穴)之表面積。獨立(詳言之以自動化方式且彼此獨立地)控制此類參數之能力可允許使用者易於優化及進行用於個別條件之方法。 亦提供適用於此類方法之系統、裝置及設備、含有其之套組及使用藉由該等方法產生之組合物及細胞的方法。舉例而言，提供藉由該等方法產生之細胞及組合物之治療方法及治療用途，諸如用於授受細胞療法。亦提供適用於此類療法之醫藥組合物及調配物。II. 離心室及相關系統及裝置 在一些實施例中，處理步驟中之一或多者的全部或一部分，諸如與病毒一起培育以引發或實現轉導及/或與用於基於免疫親和力之分離的珠粒一起培育及/或所述一或多個其他處理步驟在離心室中進行。詳言之，此類步驟及培育一般在此類離心室之內部空穴中進行，其可為用於該一或多個處理中之每一者的相同或不同離心室。 離心室一般能夠在培育期間例如藉由可與該離心室聯合之離心機而旋轉。在一些實施例中，離心室可圍繞旋轉軸(諸如垂直或大體上或基本上垂直的旋轉軸)旋轉。在一些實施例中，離心室包括端壁及側壁，該側壁之至少一部分包圍或環繞該離心室之內部空穴。離心室一般亦包括另一端壁，側壁自其沿相反方向延伸。 內部空穴一般在其外側由離心室之端壁之全部或一部分、側壁之全部或一部分及另一端壁之全部或一部分或另一表面或物體(諸如離心室內之可移動構件，諸如活塞)之內側限制。在一些態樣中，空穴為中空的。在其他態樣中，固體或中空物體包含在空穴(諸如管道或通道)內部空間之一部分內。 在一些態樣中，空穴具有可變體積，意味著空穴內可例如由液體或氣體佔據之可用總體積可例如藉由可移動構件(例如活塞)之移動而改變。在一些實施例中，此類移動可能出現在該等方法之各種步驟期間，諸如在培育以引發或實現轉導或選擇或在其之後及/或之前的步驟期間。在一些實施例中，移動可以自動化方式，諸如藉由藉助於與離心室聯合之電路及機械運行的預先指定程序實現，該電路及機械諸如感測及控制可移動構件位置及該過程之其他態樣的感測器及馬達及用於連通感測器與一或多個組件之間的電路。 離心室之側壁或其包圍離心室內部空穴(且因此使空穴成形)之部分通常為曲線形，諸如圓柱形、基本上圓柱形或大體上圓柱形。術語圓柱形一般理解為在此項技術中指由距視為圓柱形之軸的給定線段固定距離之點形成的具體類型的曲線表面。「大體上圓柱形」係指具有形狀或結構近似圓柱形之組態的形狀或表面，諸如相對於眼睛呈現圓柱形或接近圓柱形，但允許一定程度可變性的形狀或表面。舉例而言，該術語涵蓋並非每一點距軸的距離相同且允許一定程度梯化及/或漸狹的形狀及表面，只要該形狀或表面呈現圓柱形及/或具有基本上圓柱形即可。其亦涵蓋大部分形狀為圓柱形，諸如離心室之大部分外壁形狀為圓柱形或基本上圓柱形，但其相對較小部分採用另一組態，例如在或接近壁面之一或多個末端漸狹或梯化的形狀。在一些實施例中，離心室側壁包圍空穴之部分為圓柱形，而該壁面之其他部分可不為圓柱形。 在一些實施例中，離心室及/或空穴之全部或部分為固定或基本上固定。舉例而言，側壁之全部或一部分可為固定或基本上固定，例如以允許離心室及空穴承受例如在以下力(相對離心力(RCF))的高速離心期間所施加之力：例如在空穴側壁內表面及/或在表層細胞之大於約200 g、大於約300 g或大於約500 g，諸如大於約600 g、800 g、1100 g、1000 g、1500 g、1600 g、2000 g、2200 g、2500 g、3000 g或3200 g；或至少600 g、800 g、1000 g、1100 g、1500 g、1600 g、2000 g、2200 g、2500 g、3000 g或3200 g，或約該等數值，諸如2100 g或2200 g，或約2100 g或2200 g。在一些實施例中，在空穴側壁內表面及/或在表層細胞之RCF大於約或為1100 g、1200 g、1400 g、1600 g、1800 g、2000 g、2200 g，或約該等數值或更大。相比之下，使用可撓性袋包之大規模(例如大於50或100 mL體積)處理細胞的可用方法僅可允許在不超過200 g、500 g或1000 g之相對離心力下離心。因此，所提供之方法與此類方法相比可產生更大功效。 術語「相對離心力」或RCF一般理解為在空間中相較於旋轉軸之具體點，相對於地球重力賦予物體或物質(諸如細胞、樣品或集結粒及/或旋轉之離心室或其他容器中之點)的有效力。該值可使用熟知公式，考慮重力力、旋轉速度及旋轉半徑(旋轉軸與量測RCF之物體、物質或粒子的距離)來確定。 可指定在給定情況中表示或確定RCF之物體、粒子或位置(或其平均值)。舉例而言，在本文中之一些情形中，給定此類方法中所用之離心室內的具體部分或位置的RCF值或近似值或範圍，諸如在處理細胞之離心室空穴的側壁內表面處，諸如在沿著空穴圓柱形側壁表面之任何點處或在其平均徑向距離處。類似地，可給定處理細胞之另一容器(諸如袋包)內相對於旋轉軸之徑向距離或平均徑向距離的RCF值。在其他實施例中，給定在旋轉期間作為整體之樣品或組合物之位置或在其一或多個具體細胞或平均值或層處之RCF。舉例而言，該值可為在旋轉期間在離心室或其他容器中之表層細胞，諸如在細胞於其中旋轉之液體與細胞本身之間介面處之細胞表面的RCF。 一般而言，RCF藉由公式1.119×10-5 (rpm)2 r (或1.12×10-5 ×(rpm)2 * r)計算得到，其中r =半徑(亦即給定粒子、物體或物質距旋轉軸之距離(cm))，rpm=轉/分。舉例而言，在一些實施例中，在處理細胞之內部處理空穴之側壁內表面的RCF可使用此公式計算得到，其中r為側壁內表面上之點與旋轉軸之間的距離。或者，在細胞或表層細胞(諸如在旋轉期間在細胞層與液體之間的介面)之RCF可使用該公式計算得到，其中r為細胞、表層及/或介面之間的距離或其平均值。舉例而言，在一些實施例中，側壁RCF之半徑(r)值可基於沿著離心室側壁長度之最大及最小可能半徑或全部可能半徑之平均值。在一些實施例中，由Biosafe AG出售之適用於Sepax®系統之例示性離心室(例如A-200/F)的半徑為2.6 cm或約2.6 cm或2.7 cm或約2.7 cm。在此類例示性離心室中，用於確定在旋轉期間此類離心室中之細胞層與液體之間介面之RCF的半徑可藉由空穴內部側壁與在旋轉期間由細胞層佔據之離心室之間的精確或近似徑向距離相加計算得到。此類值可使用已知方法，例如在離心室旋轉期間，例如基於所處理細胞中之一者的直徑及/或此類細胞中之平均直徑來計算或估計。此類值可基於細胞之原尺寸，但通常將考慮旋轉或力本身對由各細胞佔據之相對體積的影響，其一般而言將減小此類體積。在一些實例中，使用細胞核之尺寸(或其平均值)來確定估計值。 因此，在具體旋轉期間在具體離心室或裝置中，給定點或區域之RCF或平均RCF可使用熟知方法基於轉/分(rpm)及該點與旋轉軸之間的距離計算得到。可使用已知方法，例如使用適合於具體裝置、系統或離心室之轉速計，測定各種裝置及離心室之轉/分(rpm)。舉例而言，在一些實施例中，在離心機、系統或裝置具有自環境至離心室或空穴之窗口(諸如Sepax®，其透明或以其他方式允許光在轉速計至離心室之間通過)之情況下，手持式光電或雷射轉速計可例如與反射帶組合使用。對於不透明系統，可使用其他轉速計，諸如振盪簧片型轉速計。 如熟悉此項技術者所理解，當在用於細胞處理及離心之各種器皿及容器(諸如離心室、盤、管及袋包)及其材料的上下文中使用時，固定一般描述物體、其部分或材料在置於一定環境中，諸如在一定程度的力、溫度或其他條件下時基本上保持其形狀及/或體積，其中固定將通常期望存在於使用該物體之過程中。舉例而言，在此項技術中應理解，諸如由硬塑膠製成之固定離心室及管可與以下可撓性器皿區別開，諸如細胞處理及細胞培養袋包，諸如由軟塑料及橡膠(例如氟乙烯丙烯及類似材料)製成之袋包，其形狀在手動施加或藉由引入液體或氣體引起袋包膨脹施加壓力時變化。因此，在一些實施例中，固定材料包括硬塑膠、金屬、碳纖維、複合材料、陶瓷及玻璃，及/或區別於用於製造可撓性袋包之可撓性材料，諸如軟橡膠、聚矽氧及塑膠，該等可撓性袋包之形狀及體積易於藉由正常壓力，例如手動壓力或在環境溫度或正常條件下用液體填充器皿而變化。 舉例而言，在一些實施例中，固定離心室及/或其部分或材料，諸如固定側壁或其包圍中心空穴之部分，能夠在具體條件下保持其形狀及/或體積及/或不以使其將不再含有液體或氣體之方式破裂或破壞。在一些實施例中，此類條件包括手動壓力，諸如能夠由人類手動施加之壓力。在一些實施例中，此類條件包括指定離心力，諸如在空穴側壁內表面之大於約200 g、大於約300 g或大於約500 g，諸如大於約1000 g、1500 g、2000 g、2500 g、3000 g或3200 g；或至少1000 g、1500 g、2000 g或2500 g、3000 g或3200 g，或約該等數值，諸如2100或2200 g或約2100或2200 g之力(RCF)，例如有效力。在一些實施例中，環境包括具體條件，諸如下至-80℃或約-80℃之溫度及/或上至生理溫度或細胞保持成活之溫度及/或更高溫度，諸如18℃至42℃之溫度，諸如22℃至39℃，例如至少25℃±2℃或37℃±2℃。 如此項技術中所理解，將物體描述為固定或基本上固定不排除物體或材料之形狀或體積將諸如在過度或出人意料的力下發生任何改變的可能性。舉例而言，在過度力或極端環境條件下，諸如完全在通常與本文所述之轉導方法結合使用之力或環境條件以外的力或環境條件。 離心室一般包括至少一個開口，諸如入口、出口及/或入口/出口，以允許物質在離心室之空穴或其他部分與其他空間之間通過。舉例而言，此類開口一般包括在離心室之至少一個壁面中。離心室一般包括至少一個入口及至少一個出口，其在一些實施例中可為同一開口(入口/出口)，經由其液體及/或氣體可引入至空穴中及自空穴壓出。開口一般經由通道(例如管線或管線系統)，在一些實施例中諸如經由一或多個連接器與另一環境相關聯。 在一些實施例中，離心室作為系統之一部分而被包括及/或與系統為一體的，諸如封閉或部分封閉系統，其另外包括額外組件，諸如管線、連接器及容器。在一些實施例中，離心室直接及/或間接預先連接至一或多個額外組件。此類離心室可作為預先組裝套組(例如封裝用於與所提供之方法結合而單次無菌使用之套組)之一部分提供。在一些實施例中，單獨封裝各種組件，例如以允許定製組態，其中使用者連接及配置組件用於處理方法之具體實施例。 組件通常包括至少一個管線及一般一套管線或管線系統及至少一個連接器。例示性連接器包括閥、端口、長釘、焊接點、密封件及軟管夾具。連接器及/或其他組件可為無菌的，例如以允許整個過程在封閉無菌系統中進行，其可消除或減少對清潔房間、無菌櫥櫃及/或層流系統之需要。 在一些實施例中，該至少一個管線包括一系列管線。管可由諸如聚碳酸酯之塑膠製成且可具有各種尺寸及/或體積，一般經設計以允許所需液體/氣體在適當速率下流動且與離心室及/或其他組件連接。該一系列管線一般允許液體及氣體在離心室及/或系統之一或多個組件(諸如另一容器)之間流動，其在一些態樣中藉由連接器促成。在一些實施例中，系統包括使各種組件中之每一者連接至該等組件中之至少另一者的管線，其中液體允許在容器中之每一者(諸如袋包)與離心室之間流動，其可藉由各種連接器(諸如閥及/或夾具)之組態允許或停止。 在一些態樣中，連接器為如下這般：其可置於替代性組態中或引導至替代性組態，分別阻斷、允許及/或引導流體及氣體流經各種組件，諸如在各種容器之間及經過連接各種組件之某些管線，諸如旋轉閥及閘閥。在其他實施例中，某些連接器及/或其他組件具有允許、引導或阻斷液體或氣體通過之單一個組態，諸如密封件、封蓋及/或開放端口或通道。系統中之各種組件可包括閥、端口、密封件及夾具。閥可包括旋轉閥，諸如活栓、轉閥及閘閥。閥可配置於歧管陣列中或作為單一個多端口旋轉閥。端口可包括魯爾端口或長釘端口。密封件可包括O形環、密封墊、黏著密封件及耦接件。夾具可包括彈簧夾。 系統之其他組件包括能夠容納或儲存液體及/或氣體之容器。容器可包括袋包、小瓶、盒、注射器、球狀物、儲槽、瓶子、燒杯、桶、燒瓶及管線。此類組件可容納該等方法中所用及藉由該等方法產生之組合物，包括副產物及臨時產物及廢料。此類組合物可包括液體，包括緩衝液、生長培養基、轉導培養基、水、稀釋劑、洗液及/或生理鹽水，且亦可包括細胞、病毒及/或適用於處理步驟(諸如轉導)之其他藥劑。容器亦可包括廢料容器及容納一或多種輸出產物的容器，該等產物諸如含有藉由本文方法之一或多個處理步驟選擇及/或轉導之細胞的產物。 在該等系統之一些實施例中，複數個容器可在一或多個位置處連接於系統管線上。在所提供之實施例中，該等容器可在細胞處理方法期間同時及/或依次連接。在一些實施例中，該等容器為自連接器可拆卸或可卸除的，使得該等容器可自系統卸除及/或在同一位置處經適用於系統之另一容器置換。在一些實施例中，系統之連接器位置並非全部連接至容器，使得系統可含有空連接器。在一些此類實施例中，封閉系統藉由手動或自動操作一或多個活栓、閥或夾具來維持，以便封閉管線與空連接器(例如端口)之間的連通。在一些實施例中，封閉系統藉由密封或拆卸空連接器(例如端口)來維持。 在該等系統(諸如圖5、圖7或圖11中所描繪之例示性系統)之一些實施例中，容器可在對應於輸入袋包位置、稀釋劑袋包1位置、稀釋劑袋包2位置、廢料袋包位置及/或輸出袋包位置之位置處諸如經由連接器可操作地連接至管線。參照圖式，此等位置之名稱僅用於例證說明且並不意欲限制容器之具體類型或在位置處可連接之容器的內含物。另外，在所提供之方法的實施例中，並非諸如圖式中所描繪之系統的全部位置需要用於執行所提供之方法的處理步驟。在一些此類實施例中，服務於空連接器(例如端口)之管線可藉由活栓或閥之操作而釋放或封閉。在一些實施例中，空連接器可經密封或拆卸。 在一些實施例中，系統(諸如封閉系統)為無菌的。在一些實施例中，系統組件(諸如在管線與容器之間)經由連接器之全部連接均在無菌條件下進行。在一些實施例中，連接在層流下進行。在一些實施例中，在管與容器之間使用產生無菌連接(諸如無菌焊接點)之無菌連接裝置進行連接。在一些實施例中，無菌連接裝置在足夠高的熱力條件下實現連接以維持無菌性，諸如至少200℃之溫度，諸如至少260℃或300℃。 在一些實施例中，系統可為拋棄式的，諸如單次使用套組。在一些實施例中，單次使用套組可在複數個循環過程中，例如在以連續或半連續方式進行的過程中，使用諸如至少2次、3次、4次、5次或5次以上。在一些實施例中，諸如單次使用套組之系統用於處理來自單一個患者之細胞。 例示性離心室包括由Biosafe SA生產及出售之離心室，包括適用於Sepax®及Sepax® 2系統之離心室，包括A-200/F及A-200離心室及適用於此類系統之各種套組。例示性離心室、系統及處理儀器及櫥櫃描述於例如美國專利第6,123,655號、美國專利第6,733,433號及公開美國專利申請案公開案號：US 2008/0171951及公開國際專利申請案公開案號WO 00/38762中，其中之每一者的內容以全文引用的方式併入本文中。視具體過程(例如稀釋、洗滌、轉導、調配)而定，選擇適合於該過程之具體套組在熟習此項技術者之水準內。適用於此類系統之例示性套組包括(但不限於)以產品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2由BioSafe SA出售之單次使用套組。 在一些實施例中，系統包含一系列容器，例如袋包、管、活栓、夾具、連接器及離心室。在一些實施例中，容器(諸如袋包)包括一或多個容器(諸如袋包)，在同一容器或單獨容器(諸如同一袋包或單獨袋包)中含有待轉導細胞及病毒載體粒子。在一些實施例中，系統另外包括一或多個含有諸如稀釋劑及/或洗滌溶液之介質的容器(諸如袋包)，該介質在該等方法期間引入至離心室及/或其他組件中以稀釋、再懸浮及/或洗滌組分及/或組合物。容器可連接在系統中之一或多個位置處，諸如在對應於輸入管線、稀釋劑管線、洗滌管線、廢料管線及/或輸出管線之位置處。 在所提供之方法的實施例中，適用於進行該過程之一或多個或全部部分的例示性系統描繪於圖5、圖7及圖11中。在如圖5中所示之一個例示性實施例中，離心室(1 )為至少大體上圓柱形且可圍繞旋轉軸旋轉。該離心室包括端壁(13 )及固定側壁(14 )及可移動構件，該可移動構件為活塞(2 )。端壁(13 )、固定側壁(14 )及活塞(2 )之內表面共同界定該離心室之內部空穴(7 )的界限。空穴(7 )具有可變體積且與該離心室同軸，並經設計以含有在處理步驟期間包括在該離心室內之液體及/或氣體。活塞(2 )可在離心室(1 )內軸向移動以改變內部空穴(7 )之體積。該離心室另外包括入口/出口開口(6 )以允許液體及氣體在該系統之至少一些組態中流入及流出該空穴。開口(6 )與一系列管線(3 )及連接器可操作地連接，該等連接器包括活栓閥(4 )，其能夠控制流體及/或氣體在該系統之各種組件之間的移動。該一系列管線(3 )另外與各種額外容器連接，該等額外容器在所描繪之組態中包括標記為輸入袋包、稀釋劑袋包1及2、廢料袋包及輸出袋包之袋包。夾具(5 )可打開及封閉以允許及阻斷流體移動經過該一系列管線(3 )之指定部分，從而允許在該系統之各種組件之間流動。在一些實施例中，各容器經由端口(諸如魯爾端口或長釘端口)可操作地連接至管線。舉例而言，參照圖5，在展示容器之各點處，在一些態樣中，容器經由端口間接連接。 雖然圖5展示容器在各位置或管線處之連接，但在一替代性實施例中，在一些態樣中，容器並非連接在該系統之各位置或管線處。在所提供之系統的一些實施例中，端口可在各位置或管線處用於連接且容器連接至全部位置或管線或少於全部位置或管線。在一些實施例中，系統之連接器位置並非全部連接至容器，使得該系統可在各位置或管線處含有空連接器。 在一些實施例中，系統(諸如圖5中所示之系統)可包括無菌或微生物過濾器。此類系統之例示展示於圖7中，其描繪過濾器(15 )。在一些實施例中，過濾器包括具有阻斷諸如細菌或病毒之微生物體通過之孔徑的過濾膜。在一些實施例中，孔徑為0.1 µm至0.45 µm，諸如0.1 µm至0.22 µm，諸如約為或為0.20 µm。在一些實施例中，該膜由硝化纖維素(硝酸纖維素)、乙酸纖維素、再生纖維素、聚醯胺、聚四氟乙烯(PTFE)或聚醚碸(PES)組成。在一些實施例中，過濾器包括封蓋(16 )以封閉或密封過濾器之膜以防暴露於封閉系統外之環境。在一些實施例中，該封蓋為封閉或不排氣的。在一些實施例中，該封蓋為可拆卸的。在一些實施例中，該封蓋藉由魯爾固定配件裝配至過濾器。如下文更詳細地描述，在一些實施例中，過濾器可用於實現氣體(諸如空氣)通過到達系統離心室及自系統離心室通過。在一些此類實施例中，空氣之通過維持在無菌或無微生物條件下。 在一個實施例中，輸入袋包包括用於藉由所提供之方法處理(諸如轉導)之細胞。在一個實施例中，稀釋劑袋包1包括用於轉導細胞之含有載體的病毒載體粒子。因此，在一些實施例中，藉由實現引入來自輸入袋包之流體及實現引入來自稀釋劑袋包1之流體來產生含有病毒載體粒子及細胞之輸入組合物。在一些實施例中，稀釋劑袋包2含有洗滌溶液。輸出袋包一般經設計以在一或多個處理步驟後引入細胞，諸如藉由在與病毒載體粒子一起培育之後將輸出組合物自離心室之空穴轉移至輸出袋包。因此，在一些實施例中，輸出袋包含有經病毒載體粒子轉導及/或開始用病毒載體粒子轉導之轉移細胞。在一些實施例中，處理包含用病毒載體轉導細胞。 在一些實施例中，多路歧管(17 )可用於將一個或複數個容器經由連接至管線歧管之複數個端口(18 )可操作地連接至系統。多路歧管可含有饋至離心室入口/出口之一系列管線以允許在離心室與連接容器之間流動。在一些此類實施例中，歧管在系統之同一位置或管線處連接複數個容器，諸如至少2、3、4、5、6、7、8個或8個以上容器。在一些實施例中，多路歧管(17 )之全部端口連接至容器(諸如袋包)。在一些實施例中，多路歧管(17 )之端口並非全部連接至容器(諸如袋包)，使得所連接之容器少於端口位置之總數，例如連接少於8、7、6、5、4、3或2個容器(諸如袋包)。在一些實施例中，與歧管相關聯之管線可含有夾具或活栓，其可視需要打開或封閉以控制經由管線至容器中之移動。多路歧管(17 )可連接至系統上可用的任何位置或管線，諸如連接至名為輸入管線、稀釋劑管線、洗滌管線、廢料管線及/或輸出管線之位置或管線。 在一些實施例中，用於連接容器之多路歧管(17 )的例示展示於圖11中，其用於連接一個或複數個容器，諸如一個或複數個袋包，例如一個或複數個輸出袋包。如所示，在一些實施例中，多路歧管(17 )可連接至輸出位置或管線，該輸出位置或管線包括一系列各以諸如端口(18 )之連接器結束的歧管管線，用於可操作連接至容器(諸如袋包)。一或多個端口，諸如全部端口或少於全部端口，可連接至容器。在如圖11中所例示之一個實施例中，至多3個容器可經由端口連接至歧管之各管線。在其他實施例中，至多1、2、3、4、5、6、7或8個容器(諸如輸出袋包)可連接在輸出管線處。在一些實施例中，與管線(諸如歧管管線)相關聯之一個或複數個夾具(5 )可打開或封閉以允許或控制液體移動至該複數個輸出袋包中之一或多者中。在一些實施例中，單一個夾具可控制液體同時移動至全部輸出袋包中。在一些實施例中，液體至該複數個袋包中之每一者中之移動藉由可操作地連接至僅與一個相應容器相關聯之管線的夾具分開調節，使得液體至相應容器中之移動可與液體至全部其他容器中之移動分開進行。在一些實施例中，液體至各容器(諸如各袋包，例如各輸出袋包)中之移動可依次進行。 在一些實施例中，系統包括其他儀器及/或經置放而與其他儀器聯合，該儀器包括操作、自動化、控制及/或監測在該系統中進行之各種處理步驟的態樣的儀器。在一些實施例中，此儀器包含在機櫃內。 在一些實施例中，儀器包括機櫃，其包括含有控制電路、離心機、罩蓋、馬達、泵、感測器、顯示器及使用者介面的外殼。例示性裝置描述於美國專利第6,123,655號、美國專利第6,733,433號及US 2008/0171951中。 在一些態樣中，控制電路監測來自該系統之其他儀器及各種組件之資訊及指令及傳達資訊及指令至該系統之其他儀器及各種組件。在一些實施例中，機櫃含有使用者介面裝置，該使用者介面裝置包含顯示器及輸入裝置，諸如鍵盤、滑鼠或觸控式螢幕。來自控制電路之使用者介面顯示器資訊允許使用者停止及開始過程或步驟，諸如以實現轉導方案。該介面亦可提示使用者在處理步驟(諸如轉導方案)期間輸入由控制電路使用之變數的設置。此類變數可包括待添加及/或來各種容器及/或離心室之空穴移除的各種溶液的的體積、沈降、離心、攪拌、混合及/或其他過程步驟之時間/持續時間、旋轉力、活塞移動及/或程序選擇。 儀器一般另外包括離心機，將離心室置於其中以便實現該離心室之旋轉。在一些實施例中，離心室與離心機設備上之旋轉驅動單元嚙合，使得該離心室可圍繞旋轉軸旋轉。在一些實施例中，罩蓋在離心室頂部上封閉且使該離心室保持原地。在一些實施例中，該罩蓋包括可在鉸鏈上旋轉之兩個半圓形圓盤。例示性離心機及罩蓋描述於美國專利第6,123,655號或美國專利第6,733,433號中。離心機將離心室鎖定到位且藉由接觸該離心室之側面或端部而使離心室旋轉。 在一些實施例中，離心機中之感測器或感測器陣列可量測離心室之旋轉速度、可移動構件之位置或內部空穴中所含之體積。離心機外部之感測器可偵測流至離心室及自離心室流出之液體及氣體的顏色及流動速率。感測器亦可偵測空管或離心室。感測器包括光學感測器，諸如美國專利第6,123,655號、美國專利第6,733,433號及US 2008/0171951中所述之光學感測器。在一些實施例中，來自感測器之資訊可由控制電路接收。在一些實施例中，控制電路可基於所傳輸之資訊實現以下中之一或多者的變化：離心室之旋轉速度、可移動構件之位置、空穴中所含之體積、一或多個閥、端口、密封件或夾具之取向及離心機、離心室或系統之其他過程。 在一些實施例中，機櫃包括馬達或馬達陣列。馬達可與控制電路連通資訊，該控制電路可操作或調節馬達。 在一些實施例中，馬達或馬達陣列可使離心室在離心機內旋轉。控制電路可開始、停止或調節馬達使離心室在離心機內旋轉的速度。 在一些實施例中，馬達或馬達陣列可使可移動構件在離心室內移動。移動可移動構件改變內部空穴體積，使得液體或氣體引入至內部空穴或自內部空穴壓出。 在一些實施例中，馬達或馬達陣列可操作本文所述之閥、端口、密封件及夾具。控制電路可使得馬達打開、關閉或將流體經由一系列管引導至容器或離心室或自容器或離心室引導出。 在一些實施例中，馬達為電動馬達、氣動馬達或液壓馬達。在一些實施例中，機櫃包括用於操作一些態樣之電動馬達及用於操作其他態樣之氣動馬達。在一些實施例中，機櫃包括用於離心之電動馬達及用於控制可移動構件移動之氣動馬達。III. 病毒核酸例如藉由轉導轉移至細胞 在一些實施例中，該等方法之處理步驟包括將病毒粒子轉移至細胞之步驟，該等病毒粒子諸如編碼欲在細胞中表現之重組產物的病毒載體。病毒載體粒子一般包括含有重組核酸(諸如編碼此類產物之轉殖基因)之基因體。在一些實施例中，病毒載體粒子編碼重組受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)，藉此轉導細胞可產生重組受體(例如CAR)表現細胞。核酸自病毒載體轉移至細胞可使用許多已知方法中之任一者。通常藉由轉導進行轉移。病毒載體轉移至細胞之替代性方法包括轉座子及/或電穿孔。此類處理步驟可根據所提供之方法的實施例在離心室中進行。在一些實施例中，離心室與封閉系統為一體的，使得此類處理步驟在封閉系統中進行。 轉移一般藉由轉導來進行。病毒轉移(例如轉導)之方法一般涉及藉由在一定條件下在離心室中培育包含待轉導細胞及含有載體之病毒載體粒子的輸入組合物，藉此轉導細胞或在輸入組合物中之至少一些細胞中引發轉導，其中該方法產生包含轉導細胞之輸出組合物。 在一些實施例中，用於轉導之細胞及/或轉導細胞含有適用於授受免疫療法之免疫細胞，諸如T細胞。在一些實施例中，在細胞與病毒載體粒子一起培育之前，藉由包括分離(諸如選擇)生物樣品中存在之具體細胞亞群之方法獲得用於轉導之細胞。下文描述與分離及選擇用於轉導之細胞相關的方法及所得細胞。在一些實施例中，在開始轉導過程之前，T細胞諸如藉由如下所述培養及刺激而活化。在一些實施例中，與分離(例如選擇)及活化相關之全部或一部分步驟中之一或多者亦可根據如下所述提供之實施例在離心室之空穴中進行。 在一些實施例中，在轉導方法之態樣中所使用之病毒載體粒子為適用於轉導細胞(諸如免疫細胞，例如T細胞)之任何病毒載體粒子。在一些實施例中，病毒載體粒子為反轉錄病毒載體粒子，諸如慢病毒載體粒子或γ-反轉錄病毒載體粒子。在一些此類實施例中，病毒載體粒子含有包含重組核酸之基因體，亦即重組病毒載體。此類病毒載體粒子之例示在下文加以描述。 輸入組合物(在轉導步驟期間含有病毒載體粒子及細胞之組合物)可另外包括一或多種額外藥劑，諸如提高轉導效率之藥劑，諸如聚陽離子，包括魚精蛋白(例如硫酸魚精蛋白)、海地美溴銨(hexadimethrine bromide) (POLYBRENE®，Abbott Laboratories Corp)及CH-296 (RETRONECTIN®，Clontech)。在一些實施例中，聚陽離子可以1 μg/mL至100 μg/mL，諸如5 μg/mL至50 μg/mL之最終濃度存在於輸入組合物中。該組合物亦可包括培養基，包括細胞培養基，包括經設計用於培養待處理細胞類型之培養基，諸如造血幹細胞培養基，例如無血清培養基。 在所提供之方法中，用於細胞轉導之全部或一部分處理步驟可在離心室中，諸如在離心或旋轉下進行。在一些此類實施例中，將含有細胞及病毒載體粒子之輸入組合物提供於或引入至離心室之內部空穴中。在一些實施例中，輸入組合物在包含旋轉離心室之條件下培育。在一些實施例中，旋轉可在大於可使用可撓性塑膠袋包或塑膠多孔盤實現之相對離心力下實現。 在一些實施例中實現更大轉導效率，部分歸因於該等方法與大規模處理細胞之其他方法相比在更大相對離心力(RCF)下進行轉導之能力。舉例而言，使用可撓性袋包之大規模(例如大於50或100 mL體積)處理細胞的某些可用方法僅可允許在不超過200、500或1000 g之相對離心力下離心。藉由允許在更大加速度或例如約為或至少約為1000、1500、2000、2100、2200、2500、3000 g、3200 g或3600 g之相對力離心，所提供之方法可改良或允許組合物中之病毒及細胞在轉導期間共沈降，改良病毒與細胞相互作用之速率，藉此改良轉導。 該等方法一般能夠進行大規模轉導。因此，在轉導期間培育之輸入組合物及/或輸出組合物可含有至少一定體積及/或數目之細胞。在一些實施例中，在培育期間輸入組合物之液體體積或至少一個點之液體體積為至少或大於約10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL、350 mL、400 mL、450 mL或500 mL。在一些實施例中，輸入組合物、轉導組合物及/或藉由該等方法轉導之全部細胞包括至少1×105 、1×106 、1×107 、1×108 、1×109 或1×1010 個或約該等數目之細胞。在一些實施例中，對於培育之至少一部分，轉導細胞之器皿(例如離心室或其空穴)含有至少1×105 、1×106 、1×107 、1×108 、1×109 或1×1010 個或約該等數目之細胞。此類數目及體積亦可應用於在系統中，例如在離心室之空穴中進行之其他處理步驟，諸如細胞分離及/或洗滌步驟。 在一些實施例中，在描述離心室之空穴中之各種過程步驟，包括轉導過程，諸如輸入組合物之製備或如後續部分中所述之其他過程時，提及的任何體積為目標體積。在一些實施例中，各種步驟(例如洗滌、稀釋或調配)中所用之精確體積可不同於所需目標體積，其在一些態樣中歸因於管線中之怠體積(dead volume)、管線之抗原接觸、感測器敏感性、使用者控制及與維持或監測體積相關聯之其他因素。在一些態樣中，該等方法可允許諸如藉由包括感測器作為與系統相關聯之電路的一部分來精確控制體積。在一些實施例中，體積變化不超過所需目標體積之10%，諸如不超過9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一些實施例中，體積在目標體積之2 mL或3 mL內及/或變化不超過目標體積之2 mL或3 mL。 在一些實施例中，藉由組合細胞及病毒載體粒子產生輸入組合物來進行處理步驟。在該等方法之態樣中，以一定方式製備細胞及病毒載體粒子之組合物，使得所得經組合輸入組合物之總液體體積與離心室之空穴內部表面積之比率低。在一些實施例中，總液體體積足以覆蓋或恰好超過在離心室旋轉之後在空穴內表面上以單層形式存在之細胞的體積，同時使覆蓋該等細胞之液體厚度減至最小。在一些實施例中，減小液體厚度可減少病毒載體粒子與細胞接觸所需之沈降時間，因為病毒載體粒子行進距離較小及/或經受來自黏稠培養基之阻力較小。 在一些實施例中，諸如改良轉導效率之優勢至少部分歸因於尤其與其他大規模生產方法相比，在轉導過程期間，諸如在旋轉期間，每體積細胞、細胞數目或細胞集結粒尺寸使用相對較少體積液體之能力。 在一些實施例中，在旋轉期間器皿(例如空穴)中所存在之輸入組合物(含有細胞及病毒載體粒子)的液體體積不超過每平方吋在旋轉期間空穴之內部表面積或空穴之最大內部表面積約0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7毫升(mL)。 在具體實施例中，開始轉導之器皿(例如空穴)中所存在之輸入組合物的平均液體體積，諸如在該方法週期中所進行之全部過程之液體體積的平均值不超過每平方吋在培育期間空穴之內部表面積或空穴之最大內部表面積約0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7毫升(mL)。在一些實施例中，開始轉導之器皿(例如空穴)中所存在之輸入組合物(含有細胞及病毒載體粒子)的最大液體體積，諸如在該方法週期中所進行之全部過程之液體體積的最大值不超過每平方吋離心室之空穴之內部表面積約0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7毫升(mL)。在一些實施例中，在旋轉期間器皿(例如空穴)中所存在之液體體積(諸如輸入組合物之液體體積)不超過在旋轉期間空穴之內部表面積或空穴之最大內部表面積之體積的50%，諸如不超過40%、不超過30%、不超過20%或不超過10%。在一些實施例中，剩餘體積可為氣體，諸如空氣。 在一些實施例中，在培育期間，諸如在旋轉期間離心室中之輸入組合物(含有細胞及病毒載體粒子)的總液體體積為至少5 mL或至少10 mL，但不超過220 mL，諸如不超過200 mL。在一些實施例中，在培育期間，諸如在旋轉期間輸入組合物之液體體積不超過100 mL、90 mL、80 mL、70 mL、60 mL、50 mL、40 mL、30 mL或20 mL。在所提供之方法的態樣中，在此類總體積下製備輸入組合物以達到所需濃度、量及/或細胞與病毒載體粒子之比率，諸如下文所述。 在一些實施例中，該等方法允許使用者例如藉由改變空穴體積及/或所添加之細胞數目來控制細胞與空穴表面之比率。在一些實施例中，與其他方法(尤其可用於在離心力下大規模轉導之方法，諸如在離心袋包中進行之方法)相比，此允許空穴表面上之細胞(例如細胞集結粒)層減少。在一些實施例中，在轉導期間控制離心室之空穴中細胞層厚度的能力可使得在其他可比條件下之轉導效率增加及/或複本數沒有增加而病毒轉導效率增加。 在一些實施例中，所提供之方法中的細胞在培育期間以單一個單層或約單一個單層或不超過單一個單層1.5倍或2倍或約1.5倍或2倍或基本上不比單層厚的形式存在於空穴中以便在離心力下轉導。此減少在離心期間可有助於且改良病毒與細胞之間的相互作用且避免病毒複本數(VCN)增加，病毒複本數增加可尤其在高相對病毒或感染單位(IU)之情形下，例如當外層或上層細胞優先轉導時發生。 在一些實施例中，輸入組合物在該培育之至少一部分期間，諸如在輸入組合物在離心室中旋轉期間，含有每平方公分空穴之內部表面積至少一百萬個細胞。在一些實施例中，輸入組合物在該培育之至少一部分期間，諸如在輸入組合物在離心室中旋轉期間，含有每平方公分空穴之內部表面積至少二百萬個細胞、三百萬個細胞、四百萬個細胞、五百萬個細胞、六百萬個細胞、七百萬個細胞、八百萬個細胞、九百萬個細胞、一千萬個細胞或二千萬個細胞。在一些實施例中，在該培育之至少一部分期間，諸如在旋轉期間，空穴之內部表面積為至少1×109 µm2 或約1×109 µm2 或為至少1×1010 µm2 或約1×1010 µm2 。 在一些實施例中，在該培育之至少一部分期間，諸如在輸入組合物在離心室中旋轉期間，輸入組合物中之細胞總數為至少10×106 個細胞、20×106 個細胞、30×106 個細胞、40×106 個細胞、50×106 個細胞、60×106 個細胞、70×106 個細胞、80×106 個細胞、100×106 個細胞、200×106 個細胞、300×106 個細胞或400×106 個細胞。 在一些實施例中，在離心系統之封閉空穴中的處理步驟亦可用於在轉導之前處理細胞，諸如活化細胞。在一些實施例中，處理可包括稀釋或濃縮細胞至所需濃度或數目。在一些實施例中，處理步驟可包括減少體積以藉此視需要增加細胞濃度。在一些實施例中，處理包括將培養基更換成轉導可接受或所需之培養基。 在一些實施例中，輸入組合物包含一定比率之病毒載體粒子或其感染單位(IU)之複本/輸入組合物中之細胞總數或待轉導細胞之總數(IU/細胞)。舉例而言，在一些實施例中，輸入組合物包括每個細胞以下數目或至少以下數目之病毒載體粒子：1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60個或約該等數目。 在某些實施例中，在本發明方法中使用較高IU之能力與其他方法相比提供優勢。在另外相同的條件下，使用較高IU/細胞比率一般產生較高轉導效率，或如此直至IU/細胞之某一上限，在此效率之相應增加可處於平線區。儘管如此，但在某些可用方法下，增加IU/細胞且因此增加轉導效率亦導致載體複本數(VCN)增加，其可能存在安全風險且可能不符合監管標準。 在一些實施例中，在所提供之方法下，輸出組合物中轉導細胞(諸如含有病毒載體之細胞或表現由病毒載體編碼之分子的細胞)之平均VCN並未隨著輸入組合物中IU/細胞之增加而增加。在一些實施例中，在所提供之方法中，轉導細胞之平均VCN隨著輸入組合物中IU/細胞比率之增加而降低。 在一些實施例中，病毒載體粒子之效價為或約為1×106 IU/mL至1×108 IU/mL，諸如為或約為5×106 IU/mL至5×107 IU/mL，諸如至少6×106 IU/mL、7×106 IU/mL、8×106 IU/mL、9×106 IU/mL、1×107 IU/mL、2×107 IU/mL、3×107 IU/mL、4×107 IU/mL或5×107 IU/mL。 在一些實施例中，輸入組合物在該培育之至少一部分期間，諸如在輸入組合物在離心室中旋轉期間含有一定濃度之病毒載體粒子，亦即在該培育之至少一部分期間，諸如在旋轉期間具有一定比率之病毒載體粒子或其感染單位(IU)之複本/輸入組合物中之細胞總數或待轉導細胞之總數(IU/細胞)/所存在之輸入組合物的總液體體積，亦即IU/細胞/毫升。在一些實施例中，輸入組合物在該培育之至少一部分期間，諸如在旋轉期間包括至少0.01 IU、0.05 IU、0.1 IU、0.5 IU或0.1 IU病毒載體粒子/細胞/毫升輸入組合物之液體體積。 在一些實施例中，形成輸入組合物(細胞及病毒載體粒子)之步驟可在離心室中進行。在一些實施例中，形成輸入組合物之步驟在離心室外進行。因此，術語「輸入組合物」並不意欲暗示整個組合物一次性引入至相應器皿(例如管、袋包或空穴)中或排除自不同容器或管線引入組合物部分。輸入組合物可包括藉由將兩種不同組合物引入至離心室空穴中及使兩者混合來形成，藉此形成輸入組合物。 輸入組合物可自同一容器或一個以上單獨容器引入至或以其他方式轉移至進行培育(諸如旋轉)之器皿中。舉例而言，輸入組合物可藉由引入含有細胞之組合物及含有病毒載體粒子之另一組合物而引入至離心室中，該等步驟可依次或同時進行。或者，將含有病毒載體粒子及細胞之輸入組合物引入至將進行轉導之空穴或其他器皿中。 在一些實施例中，若轉導在離心室之內部空穴中進行，此藉由僅允許空穴之某一部分包括液體輸入組合物來實現。此可例如藉由將空氣或氣體引入至一部分空穴中及/或藉由在空穴內之空間(諸如內部空間)中包括一或多個固體物體來實現。在一些實施例中，與空穴中不存在氣體及/或空穴空間中不存在一或多個固體物體相比，此可使得在該離心室培育期間，諸如在旋轉期間每平方吋空穴內部表面積該空穴中所存在之該輸入組合物的總液體體積減至最少或減少。因此，與其他方法相比，其中病毒經由相較於細胞體積之大體積液體擴散可限制轉導功效，所提供之方法可為有利的。因此，鑒於在一些實施例中，輸入組合物在培育之至少一部分期間佔據內部空穴之全部或基本上全部體積，在一些實施例中，在培育之至少一部分期間，輸入組合物在該培育期間僅佔據內部空穴之一部分體積。 在一些此類實施例中，在此培育之至少一部分期間空穴之體積可另外包括諸如在該培育之前或期間藉由空穴中之一或多個開口(例如入口)引入至該空穴中之氣體。在該方法之一些實施例中，空氣經滅菌或為無菌空氣。在一些實施例中，空氣不含或基本上不含微生物污染物或其他可能的病原體。 在一些實施例中，提供或引入氣體(諸如空氣)可以允許空氣通入至離心室之內部空穴中，而諸如在一些態樣中不損害封閉系統之無菌性的任何方式來實現。在一些實施例中，氣體(諸如空氣)可在無菌條件下添加至容器中，且容器可無菌連接在系統上用於轉移至離心室中之位置處。在一些實施例中，添加氣體(諸如空氣)至容器(諸如袋包)在層流條件下，諸如在生物安全機櫃或通風櫥中實現。在一些此類實施例中，氣體(諸如空氣)連同液體體積一起添加至容器中，諸如含有細胞組合物之液體體積及/或含有病毒載體粒子組合物之液體體積。因此，在一些實施例中，提供或引入氣體(諸如空氣)至離心室之內部空穴中與提供或引入構成輸入組合物之細胞或病毒載體粒子中之一者或兩者一起或同時進行。 在一些實施例中，提供或引入氣體(諸如空氣)至離心室中使用可附接至與系統相關聯之任何魯爾鎖且可操作地連接至離心室之內部空穴的注射器來實現。在一些實施例中，空氣在無菌條件下，諸如在層流下轉移至注射器中。在一些實施例中，注射器為無菌注射器，諸如在一些態樣中，含有未暴露於周圍非無菌環境之可移動柱塞的注射器。在一些實施例中，注射器在其末端含有過濾器以實現氣體(諸如空氣)無菌轉移至離心室之內部空穴中。 在一些實施例中，提供或引入氣體(諸如空氣)至離心室之內部空穴中藉由使用經由無菌管線可操作地連接至離心室之內部空穴的過濾器來實現。在一些此類實施例中，該過濾器為如參照例示性系統所述之無菌或微生物過濾器，諸如在一些態樣中，如圖7中所例示之過濾器。在一些實施例中，裝置諸如經由魯爾鎖連接件連接至過濾器以轉移空氣。在一些此類實施例中，該裝置為注射器、泵或其他輸注裝置。在一些實施例中，氣體為空氣且直接自周圍環境經由過濾器引入空氣。在一些實施例中，該過濾器含有封蓋，諸如不排氣封蓋，其可視需要卸除或拆卸以控制空氣轉移至過濾器中。 因此，在一些實施例中，該等方法包括提供或引入液體輸入組合物及一定體積之氣體(諸如空氣)至離心室之內部空穴中。提供或引入之氣體(諸如空氣)的體積為構成輸入組合物之含有細胞之組合物及含有病毒載體粒子之組合物的體積函數。在一些實施例中，氣體體積為內部空穴總體積與輸入組合物之液體體積的差。在一些實施例中，氣體及液體之總體積不超過200 mL，因此所提供或引入至內部空穴中之氣體的體積為200 mL與輸入組合物(細胞及病毒載體粒子)之液體體積的差。 在所提供之方法的一例示性態樣中，該轉導方法包括向封閉離心室系統之內部空穴中提供在不超過100 mL之體積中含有至少或約50×106 個細胞的組合物，其中該內部空穴之表面積為至少1×109 µm2 或約1×109 µm2 或至少1×1010 µm2 或約1×1010 µm2 。在一些實施例中，細胞組合物在不超過50 mL、40 mL、30 mL、20 mL、10 mL或5 mL之體積中含有至少或約100×106 個細胞或至少或約200×106 個細胞。在一些實施例中，在提供細胞至內部空穴之前，將細胞組合物稀釋或濃縮至不超過100 mL之體積，諸如不超過50 mL、40 mL、30 mL、20 mL、10 mL或5 mL。除細胞組合物以外，在一些態樣中，該方法亦包括提供一定體積之含有至少1 IU/細胞之量之病毒載體粒子的組合物，使得包括含有細胞之組合物的總液體體積小於離心室之內部空穴的最大體積，諸如不超過200 mL，藉此產生輸入組合物。在一些實施例中，含有病毒載體粒子之組合物以至少1.6 IU/細胞、1.8 IU/細胞、2.0 IU/細胞、2.4 IU/細胞、2.8 IU/細胞、3.2 IU/細胞或3.6 IU/細胞之量提供。在一些實施例中，輸入組合物之總液體體積小於100 mL、小於90 mL、小於80 mL、小於60 mL、小於40 mL、小於20 mL。視情況，該方法亦可包括提供至多例如內部空穴總體積之氣體(諸如空氣)，使得離心室之內部空穴中所佔據之總體積為至多或約200 mL。 在一些實施例中，含有細胞之組合物及含有病毒載體粒子之組合物及視情況存在之空氣可在提供組合物至空穴之前組合或混合。在一些實施例中，含有細胞之組合物及含有病毒載體粒子之組合物及視情況存在之空氣分開提供且在空穴中組合並混合。在一些實施例中，含有細胞之組合物、含有病毒載體粒子之組合物及視情況存在之空氣可按任何次序提供至內部空穴。在此類一些實施例中之任一者中，含有細胞及病毒載體粒子之組合物為一次組合或混合在一起之輸入組合物，不論此類輸入組合物在離心室內部或外部組合或混合及/或不論細胞及病毒載體粒子一起或分開(諸如同時或依次)提供至離心室。 在一些實施例中，引入一定體積之氣體(諸如空氣)在轉導方法中發生在培育(諸如旋轉)之前。在一些實施例中，引入一定體積之氣體(諸如空氣)在轉導方法中發生在培育(諸如旋轉)期間。 在一些實施例中，構成輸入組合物之細胞或病毒載體粒子的液體體積及視情況存在之空氣的體積可為預先確定的體積。該體積可為經程式化及/或受與系統相關聯之電路控制的體積。 在一些實施例中，引入輸入組合物及視情況存在之氣體(諸如空氣)為手動、半自動及/或自動控制，直至所需或預先確定的體積已引入至離心室之內部空穴中為止。在一些實施例中，與系統相關聯之感測器可諸如經由顏色、流動速率及/或密度偵測流至離心室及自離心室流出之液體及/或氣體，且可與相關電路連通以視需要停止或繼續引入，直至已實現此類所需或預先確定的體積的引入為止。在一些態樣中，經程式化或僅能夠偵測系統中之液體而非氣體(例如空氣)之感測器可能夠允許氣體(諸如空氣)在不停止引入的情況下通入至系統中。在一些此類實施例中，在需要引入氣體(諸如空氣)時，一段不透明管可置於接近感測器之管線中。在一些實施例中，可手動控制氣體(諸如空氣)之引入。 在所提供之方法的態樣中，離心室之內部空穴進行高速旋轉。在一些實施例中，旋轉在引入液體輸入組合物及視情況存在之空氣之前、同時、隨後或間歇地實現。在一些實施例中，旋轉在引入液體輸入組合物及視情況存在之空氣之後實現。在一些實施例中，旋轉係藉由使離心室以在內部空穴側壁內表面及/或在表層細胞之如下或至少如下之相對離心力離心：800 g、1000 g、1100 g、1500 g、1600 g、1800 g、2000 g、2200 g、2500 g、3000 g、3500 g或4000 g或約該等數目。在一些實施例中，旋轉係藉由以大於或約1100 g，諸如大於或約1200 g、大於或約1400 g、大於或約1600 g、大於或約1800 g、大於或約2000 g、大於或約2400 g、大於或約2800 g、大於或約3000 g或大於或約3200 g之力離心。 在一些實施例中，該轉導方法包括輸入組合物及視情況存在之空氣在離心室中旋轉或離心大於或約5分鐘，諸如大於或約10分鐘、大於或約15分鐘、大於或約20分鐘、大於或約30分鐘、大於或約45分鐘、大於或約60分鐘、大於或約90分鐘或大於或約120分鐘。在一些實施例中，輸入組合物及視情況存在之空氣在離心室中旋轉或離心大於5分鐘，但不超過60分鐘、不超過45分鐘、不超過30分鐘或不超過15分鐘。 在一些實施例中，該轉導方法包括輸入組合物及視情況存在之空氣在離心室中以在內部空穴側壁內表面及/或在表層細胞之至少或大於或約1000 g、1100 g、1200 g、1400 g、1500 g、1600 g、1800 g、2000 g、2200 g、2400 g、2800 g、3200 g或3600 g之力旋轉或離心10分鐘至60分鐘之間或約10分鐘至60分鐘之間、15分鐘至60分鐘之間或約15分鐘至60分鐘之間、15分鐘至45分鐘之間或約15分鐘至45分鐘之間、30分鐘至60分鐘之間或約30分鐘至60分鐘之間，45分鐘至60分鐘之間或約45分鐘至60分鐘之間(各包括端點本數)。 在一些實施例中，該方法包括實現自離心室之內部空穴壓出輸出組合物，該輸出組合物為在以上所述實施例中之任一者中細胞與病毒載體粒子一起在包括於離心室中旋轉或離心之條件下培育的所得組合物。在該方法之態樣中，輸出組合物包括轉導有病毒載體或已開始用病毒載體轉導之細胞。在一些實施例中，輸出組合物壓出至作為封閉系統之一部分與離心室可操作地連接的輸出袋包。在一些實施例中，在旋轉或離心之後壓出輸出組合物。在一些實施例中，壓出輸出組合物與旋轉或離心同時或部分同時，諸如在半連續或連續過程中。 在一些實施例中，離心室之空穴中的氣體(諸如空氣)自離心室排出。在一些實施例中，氣體(諸如空氣)排出至作為封閉系統之一部分與離心室可操作地連接的容器。在一些實施例中，該容器為空閒或空容器。在一些實施例中，離心室之空穴中的空氣(諸如氣體)經由過濾器排出，該過濾器經由無菌管線可操作地連接至離心室之內部空穴。在一些實施例中，使用手動、半自動或自動過程排出空氣。在一些實施例中，空氣在自離心室之空穴壓出含有經培育細胞及病毒載體粒子(諸如已開始轉導之細胞或已轉導有病毒載體之細胞)之輸出組合物之前、同時、間歇地或之後自離心室排出。 在一些實施例中，轉導及/或其他培育作為連續或半連續過程或作為連續或半連續過程之一部分來進行。在一些實施例中，連續過程涉及在培育之至少一部分期間，例如在離心時，自器皿連續引入細胞及病毒載體粒子，例如輸入組合物(以單一個預先存在之組合物形式或藉由將其組成部分連續引入同一器皿，例如空穴，且藉此混合)，及/或自器皿連續壓出或排出液體及視情況排出氣體(例如空氣)。在一些實施例中，連續引入及連續壓出至少部分同時進行。在一些實施例中，連續引入發生在培育之一部分期間，例如在離心之一部分期間，且連續壓出發生在培育之另一部分期間。兩者可交替。因此，在進行培育時連續引入及壓出可允許處理(例如轉導)總體積更大的樣品。 在一些實施例中，培育為連續過程之一部分，該方法包括在該培育之至少一部分期間，實現在離心室旋轉期間連續引入該輸入組合物至空穴中，及在該培育之一部分期間，實現在離心室旋轉期間經由至少一個開口自空穴連續壓出液體及視情況排出氣體(例如空氣)。 在一些實施例中，半連續培育藉由在實現組合物引入至空穴中、培育、液體自空穴壓出及視情況自空穴排出氣體(例如空氣)諸如至輸出容器與接著引入含有更多細胞及其他處理試劑(例如病毒載體粒子)之後續(例如第二、第三等)組合物之間交替且重複該過程來進行。舉例而言，在一些實施例中，培育為半連續過程之一部分，該方法包括在培育之前，實現輸入組合物經由該至少一個開口引入至空穴中及在培育之後，實現流體自空穴壓出；實現包含細胞及病毒載體粒子之另一輸入組合物引入至該內部空穴中；及在該內部空穴中在一定條件下培育該另一輸入組合物，藉此該另一輸入組合物中之該等細胞經該載體轉導。該過程可以反覆方式再繼續數輪。在此方面，半連續或連續方法可允許生產甚至更大體積及/或數目的細胞。 在一些實施例中，轉導培育之一部分在離心室中進行，其在包括旋轉或離心之條件下進行。 在一些實施例中，該方法包括培育，其中細胞及病毒載體粒子之培育的另一部分在無旋轉或離心之情況下進行，其一般在包括離心室旋轉或離心之至少部分培育之後進行。在一些此類實施例中，在一定條件下進一步培育以使得病毒載體整合至一或多個細胞之宿主基因體中。評定或確定培育是否已使得病毒載體粒子整合至宿主基因體中且因此憑經驗確定進一步培育之條件在熟習此項技術者之水準內。在一些實施例中，病毒載體整合至宿主基因體中可藉由量測在培育後由病毒載體粒子之基因體中所含之核酸編碼之重組蛋白質(諸如異源蛋白質)的表現量來評定。可使用許多用於評定重組分子表現量之熟知方法，諸如藉由基於親和力之方法(例如基於免疫親和力之方法)，例如在細胞表面蛋白質之情形下，諸如藉由流動式細胞測量術來偵測。在一些實例中，表現藉由偵測轉導標記及/或報導體構築體來量測。在一些實施例中，編碼截短表面蛋白質之核酸包括在載體內且用作其表現及/或增強之標記。 在一些實施例中，進一步培育在離心室中，但在無旋轉之情況下進行。在一些實施例中，進一步培育在離心室外進行。在一些實施例中，進一步培育在大於室溫之溫度下實現，諸如大於25℃或約25℃，諸如一般大於32℃、35℃或37℃或約32℃、35℃或37℃。在一些實施例中，進一步培育在37℃±2℃或約37℃±2℃之溫度下，諸如在37℃或約37℃之溫度下實現。在一些實施例中，進一步培育持續1小時或約1小時至48小時或約48小時、4小時或約4小時至36小時或約36小時、8小時或約8小時至30小時或約30小時或12小時或約12小時至24小時或約24小時(包括端點本數)之時間。 在一些實施例中，進一步培育發生在封閉系統中。在一些實施例中，在輸出組合物自離心室壓出諸如至容器(例如袋包)中之後，含有輸出組合物之容器再培育一部分時間。在一些實施例中，容器(諸如袋包)在37℃±2℃或約37℃±2℃之溫度下培育1小時或約1小時至48小時或約48小時、4小時或約4小時至36小時或約36小時、8小時或約8小時至30小時或約30小時或12小時或約12小時至24小時或約24小時(包括端點本數)之時間。 在一些實施例中，該等方法實現輸入及/或輸出(轉導)組合物中一定數目或百分比之細胞或其亞群的轉導。舉例而言，在一些實施例中，輸入組合物及/或輸出(例如轉導)組合物中全部細胞(或具體目標細胞類型，諸如T細胞)之至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%轉導有該病毒載體及/或表現由該病毒載體編碼之重組基因產物。在一些實施例中，該轉導方法產生以下輸出組合物，其中該組合物中全部細胞(諸如T細胞)之至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%轉導有病毒載體及/或表現由該病毒載體編碼之重組基因產物。 在一些實施例中，該等方法能夠在某些條件下實現此類至少一個具體轉導效率。舉例而言，在一些實施例中，若輸入組合物以每個細胞1個或約1個感染單位(IU)至每個細胞10個或約10個IU，諸如每個細胞1個或約1個感染單位(IU)、或每個細胞2個或約2個IU、每個細胞5個或約5個IU、或每個細胞10個或約10個IU之比率包括病毒及細胞，則該方法能夠產生以下轉導組合物，其中藉由該方法產生之該轉導組合物中至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之細胞包含、例如已轉導有重組病毒載體。細胞之轉導可藉由偵測載體中包括之重組核酸(例如轉殖基因)或其在細胞中之產物的存在來偵測。在一些實施例中，在細胞表面上偵測到產物，表明細胞已成功轉導。在一些實施例中，偵測轉導涉及偵測轉導標記，諸如出於標記轉導細胞之目的而包括的另一轉殖基因或產物及/或其他選擇標記。 在一些實施例中，由轉導方法產生之輸出組合物包括每個細胞具體平均數目之轉導載體複本(載體複本數(VCN))。VCN可依據單一個細胞中之複本數來表示。或者，其可表示為整個細胞群體或諸如輸出或轉導組合物之組合物(包括該組合物內之任何未轉導細胞，其將不包括任何載體複本)之平均數。或者，VCN可依據僅轉導細胞當中之平均複本數來表示。在一些實施例中，在藉由該等方法產生之轉導或輸出組合物中之全部細胞當中，平均VCN不超過10、5、4、2.5、1.5或1或約該等數目。在一些實施例中，在含有重組病毒載體或表現重組基因產物之轉導或輸出組合物中之細胞當中，平均VCN不超過4、3、2、2.5、1.5或1或約該等數目。 亦提供藉由以上方法中之任一者產生的組合物。在一些實施例中，該組合物含有至少1×107 個細胞或5×107 個細胞，諸如至少1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞，其中至少複數個細胞轉導有重組病毒載體。在一些實施例中，該等細胞為T細胞。 在一些實施例中，藉由實踐本文所提供之方法，有可能產生大數目含有複數個轉導細胞之輸出組合物，諸如在一些態樣中，可達到適用於授受免疫療法之T細胞治療有效劑量的數目。在一些實施例中，此可不僅由於大規模轉導細胞之能力，而且在一些態樣中，藉由以連續或半連續方式重複該過程來實現。 相比之下，此項技術中現有的以較小規模(諸如在盤中)進行轉導之方法需要在轉導之後大規模擴增細胞以達到獲得治療有效劑量所必需之細胞數目。用一或多種刺激劑擴增細胞(諸如T細胞)可活化細胞及/或改變細胞表型，諸如藉由導致具有衰竭T細胞表型之效應細胞產生。舉例而言，活化或刺激T細胞可導致T細胞分化或活化狀態之改變，其可在向個體投與基因工程改造細胞時導致及/或使得活體內持久性減小。在一些情況下，可出現之分化狀態的改變包括天然表型喪失、記憶T細胞表型喪失及/或產生具有衰竭T細胞表型之效應細胞。T細胞衰竭可導致T細胞功能進行性喪失及/或細胞耗盡(Yi等人(2010)Immunology , 129:474-481)。T細胞耗盡及/或T細胞持久性缺失為授受細胞療法之功效及治療性結果的障礙；臨床試驗已揭露更大及/或更長程度暴露於抗原受體(例如CAR)表現細胞與治療結果之間的相關性。 在一些實施例中，在本文所提供之方法中無需在轉導之後刺激及/或活化細胞至與此項技術中之其他已知方法所需的相同程度。在一些實施例中，在轉導之後，組合物中之細胞並未在刺激劑(例如細胞激素，諸如IL-2)存在下進行擴增及/或並未在大於或約30℃或大於或約37℃之溫度下培育超過24小時。在一些實施例中，組合物中之T細胞及/或輸出組合物中之轉導T細胞的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%包含高表面表現的CD69或TGF-β-II。在一些實施例中，組合物中之T細胞或轉導T細胞的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%不包含CD62L之表面表現及/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8及/或IL-2之高表現。 在一些實施例中，藉由以上方法或藉由包括諸如產生調配組合物之另一處理步驟之方法產生之輸出組合物的經工程改造之細胞，諸如經編碼欲在細胞中表現之重組產物的病毒載體轉導之細胞，在活體內投與個體時展現增加的持久性。在一些實施例中，所提供之細胞，諸如受體(例如CAR)表現細胞在投與後於個體體內之持久性與藉由以下替代性轉導方法所實現的相比更大，諸如涉及投與藉由涉及較小規模轉導之方法經基因工程改造之細胞的方法，其中T細胞在轉導之前及/或之後經活化及/或刺激以擴增達到治療有效劑量之細胞數目。舉例而言，在一些態樣中，所提供之細胞(諸如藉由所提供之方法產生之細胞)的持久性與藉由投與經基因工程改造之重組受體(例如CAR)表現群體所實現的相比更大，該群體之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%具有較低表現量的CD69或TGF-βII。在一些實施例中，所提供之細胞(諸如藉由所提供之方法產生之細胞)的持久性與藉由投與經基因工程改造之重組受體(例如CAR)表現群體所實現的相比更大，該群體之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%展現CD62L的表面表現及/或包含低表面表現的CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8及/或IL-2。 在一些實施例中，該持久性增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或約該等倍數或100倍以上。 在一些實施例中，所投與細胞之持久性程度可在投與個體之後偵測或定量。舉例而言，在一些態樣中，使用定量PCR (qPCR)評定個體之血液或血清或器官或組織(例如疾病部位)中表現重組受體之細胞(例如CAR表現細胞)的數量。在一些態樣中，持久性定量為每微克DNA編碼受體(例如CAR)之DNA或質體的複本、或每微升樣品(例如血液或血清)受體表現(例如CAR表現)細胞之數目、或每微升樣品周邊血液單核細胞(PBMC)或白血球或T細胞之總數。在一些實施例中，亦可進行一般使用特異性針對受體之抗體偵測表現該受體之細胞的流式細胞學分析。基於細胞之分析亦可用於偵測以下功能性細胞之數目或百分比，諸如能夠結合至疾病或病狀之細胞或表現由受體識別之抗原的細胞及/或中和及/或誘導針對該等細胞之反應(例如細胞毒性反應)的細胞 在此類實施例中之任一者中，與重組受體(例如CAR表現細胞)相關聯之另一標記的表現程度或含量可用於區分所投與之細胞與個體體內之內源細胞。 在一些實施例中，藉由使T細胞活化及/或刺激減至最小，所提供之實施例可產生由於在一些態樣中持久性增加而更有效適用於授受免疫療法之經基因工程改造之T細胞。在一些實施例中，所提供之細胞(諸如藉由所提供之方法中之任一者產生的細胞)的效能增加及/或持久性增加允許以較低劑量投與細胞之方法。此類方法可使授受免疫療法可出現之毒性減至最小。其他細胞處理事件 在一些實施例中，除轉導步驟以外，所提供之方法的處理方法包括其他處理步驟及方法，以諸如用於分離、分離、選擇、培養(例如刺激細胞例如以誘導其增殖及/或活化)、洗滌、懸浮、稀釋、濃縮及/或調配細胞。在一些實施例中，一或多個其他處理步驟之至少一部分及/或複數個步驟之至少一部分全部或部分在離心室(諸如與轉導方法所用相同或不同的離心室)之空穴內進行。在一些實施例中，此一或多個其他處理步驟之全部或一部分在含有離心室之封閉系統中，諸如在無菌封閉系統中進行。 在一些實施例中，該等方法包括以下中之一或多者：(a)在離心室之空穴中洗滌含有細胞之生物樣品(例如全血樣品、白血球層樣品、周邊血液單核細胞(PBMC)樣品、未分離T細胞樣品、淋巴球樣品、白血球樣品、清除術產物或白血球清除術產物)，(b)在離心室之空穴中例如藉由使細胞與用於基於免疫親和力之分離的選擇或免疫親和力試劑一起培育而自樣品分離(例如選擇)所需細胞亞群或群體(例如CD4+或CD8+ T細胞)；c)諸如根據上文所述之方法使經分離(諸如經選擇)之細胞與病毒載體粒子一起培育及d)將轉導細胞調配於諸如醫藥學上可接受之緩衝液、低溫保存劑或其他適合之培養基中。在一些實施例中，該等方法可另外包括(e)在離心室之空穴中藉由使細胞暴露於刺激條件來刺激細胞，藉此誘導細胞增殖。在一些實施例中，刺激細胞之步驟在細胞與病毒載體粒子一起培育之前、期間及/或之後進行。在一些實施例中，洗滌或懸浮步驟之一或多個其他步驟，諸如用於細胞稀釋、濃縮及/或緩衝液更換之步驟，亦可在以上步驟中之任一者之前或之後進行。 因此，在一些實施例中，該等方法在製備用於臨床使用，例如用於授受細胞療法之細胞時，在不使細胞暴露於非無菌條件之情況下及在無需使用無菌房間或機櫃之情況下進行一個、多個或全部步驟。在此過程之一些實施例中，分離、分離或選擇、刺激、轉導、洗滌及調配細胞全部在封閉系統內進行。在一些實施例中，該等方法以自動化方式進行。在一些實施例中，一或多個步驟在離心室系統外進行。樣品 在一些實施例中，處理步驟包括自以下生物樣品分離細胞或其組合物，諸如自個體獲得或來源於個體之生物樣品，該個體為諸如患有具體疾病或病狀或需要細胞療法或將投與細胞療法之個體。在一些態樣中，該個體為人類，諸如作為需要具體治療性干預(諸如授受細胞療法)而對其進行細胞分離、處理及/或工程改造之患者的個體。因此，在一些實施例中，細胞為初級細胞，例如初級人類細胞。樣品包括直接自個體獲取之組織、流體及其他樣品，以及由一或多個處理步驟(諸如分離、離心、基因工程改造(例如經病毒載體轉導)、洗滌及/或培育)產生之樣品。生物樣品可為直接自生物來源獲得之樣品或經處理之樣品。生物樣品包括(但不限於)體液，諸如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液及汗液、組織及器官樣品，包括來源於其的經處理樣品。 在一些態樣中，樣品為血液樣品或來源於血液之樣品，或為清除術或白血球清除術產物或來源於清除術或白血球清除術產物。例示性樣品包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織生物檢體、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸道相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎臟、胰臟、乳房、骨骼、前列腺、子宮頸、睪丸、卵巢、扁桃體或其他器官，及/或來源於其的細胞。在細胞療法(例如授受細胞療法)之情形中，樣品包括自體及同種異體來源的樣品。 在一些實施例中，細胞或群體之分離包括一或多個製備及/或不基於親和力之細胞分離步驟。在一些實例中，將細胞洗滌、離心及/或在一或多種試劑存在下培育，以例如移除不想要的組分、富集所需組分、溶解或移除對具體試劑敏感的細胞。在一些實例中，根據一或多種特性(諸如密度、黏附特性、尺寸、敏感性及/或對具體組分的耐受性)分離細胞。在一些實例中，來自個體循環血液之細胞例如藉由清除術或白血球清除術來獲得。樣品可含有淋巴球，包括T細胞、單核球、粒細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球及/或血小板。 在一些實施例中，所提供之方法包括在封閉系統中，諸如在離心室中整體或部分處理一或多種樣品。在一些實施例中，處理步驟可涉及洗滌來自個體之樣品(例如含有血細胞之樣品)以例如移除血漿部分，及/或將細胞更換在適當緩衝液或培養基中以便後續處理步驟，及/或進行基於密度之細胞分離方法，諸如在藉由裂解紅血球及經由Percoll或Ficoll梯度離心而自周邊血液製備白血球時。此類處理步驟之例示可使用與一或多個與細胞處理系統相關聯之系統結合的離心室來進行，諸如由Biosafe SA生產及出售之離心室，包括適用於Sepax®或Sepax 2®細胞處理系統之離心室。基於親和力之選擇 處理步驟(例如在離心室中進行)可包括自混合群體及/或組合物分離細胞，諸如使用各種選擇步驟中之一者，包括基於密度或基於其他物理特性之分離方法及基於親和力之選擇。在一些實施例中，該等方法包括選擇，其中該選擇之全部或一部分在離心室之內部空穴中，例如在離心旋轉下進行。在一些實施例中，細胞與選擇試劑(諸如基於免疫親和力之選擇試劑)一起培育在離心室中進行。此類方法與其他可用選擇方法相比可提供某些優勢。 舉例而言，基於免疫親和力之選擇可取決於所分離之細胞與固體表面(例如粒子)上特異性結合至細胞上之標記的分子(例如抗體或其他結合搭配物)之間的有利能量相互作用。在使用粒子(諸如珠粒)之基於親和力之分離的某些可用方法中，粒子及細胞在容器(諸如管或袋包)中培育，同時震盪或混合，使得細胞密度與粒子(例如珠粒)比率恆定以幫助促進能量上有利的相互作用。此類途徑用於大規模生產可能不理想，例如因為其可能需要使用大體積以維持最佳或所需細胞與粒子比率，同時維持所需細胞數目。因此，此類途徑可能需要以分批模式或型式處理，其可能需要增加時間、步驟數及操作、增加成本及使用者錯誤風險。 在一些實施例中，藉由在離心室之空穴中進行此類選擇步驟或其部分(例如與經抗體塗佈之粒子(例如磁性珠粒)一起培育)，使用者能夠控制某些參數，諸如各種溶液之體積、在處理及其時序期間溶液的添加，其與其他可用方法相比可提供優勢。舉例而言，在培育期間減少空穴中之液體體積的能力可增加用於選擇之粒子(例如珠粒試劑)的濃度且因此增加溶液之化學勢，而不影響空穴中之細胞總數。此繼而可增強所處理之細胞與用於選擇之粒子之間的成對相互作用。在一些實施例中，在離心室中進行培育步驟，例如當與如本文所述之系統、電路及控制器相關聯時，允許使用者在培育期間之所需時間實現溶液攪拌，其亦可改良相互作用。 在一些實施例中，選擇步驟之至少一部分在離心室中進行，其包括細胞與選擇試劑一起培育。在此類過程之一些態樣中，一定體積的細胞與一定量的所需基於親和力之選擇試劑混合，該量遠小於當根據製造商說明書在管或容器中進行類似選擇以選擇相同數目之細胞及/或相同體積之細胞時通常所採用的量。在一些實施例中，所採用之選擇試劑的量為根據製造商說明書在基於管或容器培育相同數目之細胞及/或相同體積之細胞時用於選擇細胞之相同選擇試劑之量的不超過5%、不超過10%、不超過15%、不超過20%、不超過25%、不超過50%、不超過60%、不超過70%或不超過80%。 例如作為選擇方法之一部分、可在離心室空穴中進行之與選擇試劑一起培育包括使用一或多種選擇試劑，以基於細胞內或細胞上一或多種特異性分子之表現或存在選擇一或多種不同細胞類型，該等特異性分子諸如表面標記(例如表面蛋白質)、細胞內標記或核酸。在一些實施例中，可使用基於此類標記使用選擇試劑分離之任何已知方法。在一些實施例中，選擇試劑產生分離，亦即基於親和力或免疫親和力之分離。舉例而言，在一些態樣中，選擇包括與基於一或多種標記之細胞表現或表現量分離細胞及細胞群體之試劑一起培育，通常細胞表面標記例如藉由與特異性結合至此類標記之抗體或結合搭配物一起培育，一般隨後為洗滌步驟及分離已結合該抗體或結合搭配物之細胞與尚未結合至該抗體或結合搭配物之彼等細胞。 在一些實施例中，關於細胞之選擇(例如基於免疫親和力之選擇)，將細胞培育在離心室空穴中之組合物中，該組合物亦含有選擇緩衝液與選擇試劑，諸如特異性結合至組合物中需要富集及/或耗盡之細胞上而非其他細胞上之表面標記的分子，諸如抗體，該選擇試劑視情況偶合至諸如聚合物或表面之架構，例如珠粒，例如磁性珠粒，諸如偶合至特異性針對CD4及CD8之單株抗體的磁性珠粒。在一些實施例中，如所述，選擇試劑以與當在震盪或旋轉下於管中進行選擇時為達到選擇相同數目細胞或相同體積細胞之大約相同或類似的效率所通常使用或必需的選擇試劑的量相比基本上較小(例如不超過該量之5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的量添加至離心室空穴中之細胞。在一些實施例中，培育藉由添加選擇緩衝液至細胞及選擇試劑以達到例如10 mL至200 mL的目標體積而與試劑一起培育來進行，諸如至少為或為10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、150 mL或200 mL或約該等數目。在一些實施例中，選擇緩衝液及選擇試劑在添加至細胞之前預混合。在一些實施例中，選擇緩衝液及選擇試劑分開添加至細胞。在一些實施例中，選擇培育在週期性溫和混合條件下進行，其可幫助促進能量上有利的相互作用且藉此允許使用較少總選擇試劑同時實現高選擇效率。 在一些實施例中，與選擇試劑一起培育的總持續時間為5分鐘或約5分鐘至6小時或約6小時，諸如30分鐘至3小時，例如至少30分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘或約該等時間。 在一些實施例中，培育一般在混合條件下，諸如在旋轉存在下，以一般相對較低的力或速度來進行，諸如低於用於使細胞集結之速度，諸如600 rpm或約600 rpm至1700 rpm或約1700 rpm (例如為或約為或至少為600 rpm、1000 rpm、1500 rpm或1700 rpm)，諸如以在樣品或離心室或其他容器之壁面之80 g或約80 g至100 g或約100 g之RCF(例如為或約為或至少為80 g、85 g、90 g、95 g或100 g)。在一些實施例中，使用在此類低速下旋轉隨後為靜止時間之重複間隔來進行旋轉，諸如旋轉及/或靜止1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，諸如旋轉大致1或2秒，隨後靜止大致5、6、7或8秒。 在一些實施例中，此類過程在與離心室一體之完全封閉系統內進行。在一些實施例中，此過程(及在一些態樣中另外一或多個額外步驟，諸如先前洗滌含有細胞之樣品(諸如清除術樣品)之洗滌步驟)以自動化方式進行，使得細胞、試劑及其他組分在適當時間吸入離心室及自離心室推出且實現離心，以便使用自動化程序在單一個封閉系統中完成洗滌及結合步驟。 在一些實施例中，在細胞及選擇試劑培育及/或混合之後，對經培育之細胞進行分離以基於具體試劑是否存在來選擇細胞。在一些實施例中，其他選擇在離心室外進行。在一些實施例中，在存在離心室且進行細胞與選擇試劑之培育的同一封閉系統中進行分離。在一些實施例中，在與選擇試劑一起培育之後，經培育之細胞，包括已結合選擇試劑之細胞，自離心室壓出，諸如自離心室轉移出，進入基於免疫親和力分離細胞之系統中。在一些實施例中，基於免疫親和力分離之系統為或含有磁性分離管柱。在一些實施例中，在分離之前，可在離心室中進行一或多個其他處理步驟，諸如洗滌。 此類分離步驟可基於陽性選擇，其中保留已結合試劑(例如抗體或結合搭配物)之細胞以供進一步使用；及/或陰性選擇，其中保留尚未結合至試劑(例如抗體或結合搭配物)之細胞。在一些實例中，兩個部分皆保留以供進一步使用。在一些態樣中，陰性選擇可為特別適用的，其中無法獲得特異性鑑別非均質群體中之細胞類型的抗體，使得分離最佳基於除所需群體以外之細胞所表現的標記來進行。 分離無需使得具體細胞群體或表現具體標記之細胞100%富集或移除。舉例而言，具體類型之細胞(諸如表現標記之細胞)之陽性選擇或富集係指增加此類細胞之數目或百分比，但無需使得不表現該標記之細胞完全不存在。同樣，具體類型之細胞(諸如表現標記之細胞)之陰性選擇、移除或耗盡係指減少此類細胞之數目或百分比，但無需使得全部此類細胞完全移除。 在一些實例中，進行多輪分離步驟，其中對來自一個步驟之經陽性或陰性選擇之部分進行另一分離步驟，諸如後續陽性或陰性選擇。在一些實例中，單一個分離步驟可耗盡同時表現多個標記之細胞，諸如藉由使細胞與各特異性針對陰性選擇所靶向之標記的複數種抗體或結合搭配物一起培育。同樣，多種細胞類型可藉由使細胞與各種細胞類型上所表現之複數種抗體或結合搭配物一起培育而同時經陽性選擇。在此類實例中之任一者中，其他選擇或選擇步驟之至少一部分在離心室中進行，其如上所述包括細胞與選擇試劑一起培育。 舉例而言，在一些態樣中，特定T細胞亞群，諸如一或多種表面標記(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+及/或CD45RO+ T細胞)之陽性或高表現量細胞，藉由陽性或陰性選擇技術加以分離。在一些實施例中，此類細胞藉由與一或多種特異性結合至此類標記之抗體或結合搭配物一起培育來選擇。在一些實施例中，抗體或結合搭配物可諸如直接或間接結合至固體支撐物或基質以實現選擇，諸如磁性珠粒或順磁珠粒。舉例而言，CD3+、CD28+ T細胞可使用經CD3/CD28結合之磁性珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander及/或ExpACT®珠粒)來進行陽性選擇。 在一些實施例中，過程步驟另外包括諸如使用可進行基於親和力之選擇的系統或設備陰性及/或陽性選擇經培育之細胞。在一些實施例中，分離如下進行：藉由陽性選擇富集具體細胞群體或藉由陰性選擇耗盡具體細胞群體。在一些實施例中，陽性或陰性選擇分別藉由使細胞與一或多種特異性結合至在陽性或陰性選擇之細胞上表現(標記+)或以相對高含量(高標記)表現之一或多個表面標記的抗體或其他結合劑一起培育來實現。 在一些實施例中，T細胞藉由陰性選擇非T細胞(諸如B細胞、單核球或其他白血球)上所表現之標記(諸如CD14)而與PBMC樣品分離。在一些態樣中，使用CD4+或CD8+選擇步驟分離CD4+輔助細胞與CD8+細胞毒性T細胞。此類CD4+及CD8+群體可藉由對在一或多種初始、記憶及/或效應T細胞亞群上表現或表現至相對較高程度之標記的陽性或陰性選擇而進一步分選成亞群。 在一些實施例中，CD8+細胞諸如藉由基於與相應亞群相關聯之表面抗原的陽性或陰性選擇而相對於初始、中心記憶、效應記憶及/或中心記憶幹細胞進一步富集或耗盡。在一些實施例中，對中心記憶T (TCM)細胞進行富集以增加功效，諸如在投與後改良長期存活率、擴增及/或移植，在一些態樣中，功效在此類亞群中尤其穩固。參見Terakura等人 (2012) Blood.1:72-82；Wang等人 (2012) J Immunother. 35(9):689-701。在一些實施例中，組合TCM富集之CD8+ T細胞與CD4+ T細胞進一步增強功效。 在實施例中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血液淋巴球之CD62L+及CD62L-亞群中。可諸如使用抗CD8及抗CD62L抗體富集或耗盡CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分之PBMC。 在一些實施例中，中心記憶T (TCM)細胞之富集係基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD 127之陽性或高表面表現；在一些態樣中，其係基於對表現或高度表現CD45RA及/或顆粒酶B之細胞的陰性選擇。在一些態樣中，藉由耗盡表現CD4、CD14、CD45RA之細胞及對表現CD62L之細胞的陽性選擇或富集來分離TCM細胞富集之CD8+群體。在一個態樣中，以基於CD4表現選擇之陰性細胞部分為起始物質對中心記憶T (TCM)細胞進行富集，其進行基於CD14及CD45RA之表現的陰性選擇及基於CD62L之陽性選擇。此類選擇在一些態樣中同時進行且在其他態樣中按任一次序依次進行。在一些態樣中，用於製備CD8+細胞群體或亞群之基於CD4表現之相同選擇步驟亦用於產生CD4+細胞群體或亞群，使得基於CD4分離之陽性及陰性部分均保留且用於該等方法之後續步驟，視情況在一或多個其他陽性或陰性選擇步驟之後。 在一具體實例中，對PBMC樣品或其他白血球樣品進行CD4+細胞之選擇，其中陰性及陽性部分均保留。陰性部分接著基於CD14及CD45RA或CD19之表現進行陰性選擇，及基於中心記憶T細胞之標記特徵(諸如CD62L或CCR7)進行陽性選擇，其中陽性及陰性選擇按任一次序進行。 CD4+ T輔助細胞可藉由鑑別具有細胞表面抗原之細胞群體而分選成初始、中心記憶及效應細胞。CD4+淋巴球可藉由標準方法獲得。在一些實施例中，初始CD4+ T淋巴球為CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+ T細胞。在一些實施例中，中心記憶CD4+細胞為CD62L+及CD45RO+。在一些實施例中，效應CD4+細胞為CD62L-及CD45RO-。 在一個實例中，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合液通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物結合至固體支撐物或基質，諸如磁性珠粒或順磁珠粒，以允許分離陽性及/或陰性選擇之細胞。舉例而言，在一些實施例中，細胞及細胞群體使用免疫磁性(或親和磁性)分離技術來分離(回顧於Methods in Molecular Medicine, 第58卷: Metastasis Research Protocols, 第2卷: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, 第17-25頁, 編輯: S. A. Brooks及U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ)。 在一些態樣中，具有待分離細胞之經培育樣品或組合物與含有小可磁化或磁性反應材料(諸如磁性反應粒子或微粒，諸如順磁珠粒(例如Dynalbeads或MACS®珠粒))之選擇試劑一起培育。磁性反應材料(例如粒子)一般直接或間接附接至結合搭配物(例如抗體)，該結合搭配物特異性結合至需要分離(例如需要陰性或陽性選擇)之細胞或細胞群體上所存在之分子，例如表面標記。 在一些實施例中，磁性粒子或珠粒包含結合至特異性結合成員(諸如抗體或其他結合搭配物)之磁性反應材料。許多適用於磁性分離方法之熟知磁性反應材料為已知的，例如Molday之美國專利第4,452,773號及歐洲專利說明書EP 452342 B中所述之磁性反應材料，其以引用的方式併入本文中。亦可使用膠態尺寸化粒子，諸如Owen之美國專利第4,795,698號及Liberti等人之美國專利第5,200,084號中所述之膠態尺寸化粒子。 培育一般在一定條件下進行，藉此附接至磁性粒子或珠粒之抗體或結合搭配物或特異性結合至此類抗體或結合搭配物之分子(諸如二級抗體或其他試劑)特異性結合至樣品內之細胞的細胞表面分子(若存在)。 在某些實施例中，磁性反應粒子經初級抗體或其他結合搭配物、二級抗體、凝集素、酶或抗生蛋白鏈菌素塗佈。在某些實施例中，磁性粒子經由特異性針對一或多個標記之初級抗體塗層而附接至細胞。在某些實施例中，細胞(而非珠粒)經初級抗體或結合搭配物標記，且接著添加經細胞類型特異性二級抗體或其他結合搭配物(例如抗生蛋白鏈菌素)塗佈之磁性粒子。在某些實施例中，經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性粒子與經生物素標記之初級或二級抗體結合使用。 在一些態樣中，在以下程序中實現分離，其中將樣品置於磁場中且具有磁性反應或附接有可磁化粒子之彼等細胞將吸引至磁體並與未標記之細胞分離。對於陽性選擇，保留吸引至磁體之細胞；對於陰性選擇，保留未吸引之細胞(未標記之細胞)。在一些態樣中，在同一選擇步驟期間進行陽性及陰性選擇之組合，其中陽性及陰性部分保留且進一步處理或進行其他分離步驟。 在一些實施例中，基於親和力之選擇係經由磁性活化細胞分選(MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。磁性活化細胞分選(MACS)，例如CliniMACS系統能夠高純度選擇附接有磁化粒子之細胞。在某些實施例中，MACS以一定模式操作，其中非目標物質及目標物質在施加外部磁場之後依次溶離。亦即，附接至磁化粒子之細胞保持在適當位置，而溶離未附接之物質。接著，在此第一溶離步驟完成之後，在磁場中捕獲且防止溶離之物質以某一方式釋放，使其可溶離及回收。在某些實施例中，非目標細胞經標記且自非均質細胞群體耗盡。 在一些實施例中，處理步驟包括自離心室壓出與一或多種選擇試劑一起培育之細胞。在一些實施例中，細胞可在一或多個洗滌步驟之後及/或與一或多個洗滌步驟連續壓出，其可在一些態樣中在離心室中進行。 在一些實施例中，磁性反應粒子保持附接至待隨後培育、培養及/或工程改造之細胞；在一些態樣中，該等粒子保持附接至向患者投與之細胞。在一些實施例中，可磁化或磁性反應粒子自細胞移除。自細胞移除可磁化粒子之方法為已知的且包括例如使用未經標記之競爭性抗體、可磁化粒子或結合至可裂解連接子之抗體等。在一些實施例中，可磁化粒子可生物降解。冷凍及低溫保存 在一些實施例中，例如在洗滌步驟移除血漿及血小板後，將細胞(諸如經選擇之細胞)懸浮於冷凍溶液中。在一些態樣中，可使用多種已知冷凍溶液及參數中之任一者。一個實例涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白(HSA)之PBS或其他適合之細胞冷凍培養基。接著用培養基1:1稀釋，使得DMSO及HSA的最終濃度分別為10%及4%。 在一些實施例中，細胞(諸如經選擇之細胞)可使用與一或多個與細胞處理系統相關聯之系統結合的離心室轉移至低溫保存培養基，諸如由Biosafe SA生產及出售之離心室，包括適用於Sepax®或Sepax 2®細胞處理系統之離心室。在一些實施例中，轉移至低溫保存培養基與一或多個處理步驟相關聯，該一或多個處理步驟可涉及洗滌樣品(例如經選擇之細胞樣品)，諸如以移除選擇培養基及/或將細胞更換於適當低溫保存緩衝液或用於後續冷凍之培養基中。 在一些實施例中，細胞在該等處理方法之前、期間或之後冷凍，例如低溫保存。在一些實施例中，冷凍及後續解凍步驟移除細胞群體中之粒細胞及在一定程度上移除單核球。細胞一般接著以每分鐘1°之速率冷凍至−80℃且儲存於液氮儲槽之氣相中。培養及刺激 在一些實施例中，處理步驟(例如在離心室及/或封閉系統中進行之處理步驟)包括培養、刺激及/或活化細胞，諸如藉由培育及/或培養細胞。舉例而言，在一些實施例中，提供用於刺激經分離之細胞(諸如經選擇之細胞群體)的方法。在一些實施例中，處理步驟包括培育含有細胞(諸如經選擇之細胞)的組合物，其中該培育之至少一部分在離心室及/或其他器皿中，例如在刺激下條件。培育可在基因工程改造之前或與基因工程改造結合，諸如由上文所述之轉導方法的實施例引起的基因工程改造。在一些實施例中，刺激使得細胞例如在轉導之前活化及/或增殖。 在一些實施例中，處理步驟包括培育細胞(諸如經選擇之細胞)，其中培育步驟可包括培養(culture)、培養(cultivation)、刺激、活化及/或繁殖細胞。在一些實施例中，組合物或細胞在刺激條件或刺激劑存在下培育。此類條件包括經設計以誘導群體中之細胞增殖、擴增、活化及/或存活、模擬抗原暴露及/或使用於基因工程改造之細胞致敏，諸如引入重組抗原受體。 在一些實施例中，刺激及/或活化之條件可包括以下中之一或多者：具體培養基；溫度；氧氣含量；二氧化碳含量；時間；藥劑，例如營養物、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，諸如細胞激素、趨化激素、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組可溶性受體；及經設計以活化細胞之任何其他藥劑。 在一些實施例中，刺激條件或藥劑包括一或多種能夠活化TCR複合物之細胞內信號傳導結構域之藥劑，例如配位體。在一些態樣中，藥劑打開或引發T細胞中之TCR/CD3細胞內信號級聯，諸如適於傳遞初級信號例如以引發ITAM誘導之信號活化的藥劑，諸如特異性針對TCR組分之藥劑及/或促進協同刺激信號之藥劑，諸如特異性針對T細胞協同刺激受體之藥劑，例如抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如結合至固體支撐物，諸如珠粒)及/或一或多種細胞激素。抗CD3/抗CD28珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander及/或ExpACT®珠粒)屬於刺激劑。視情況，擴增方法可進一步包含添加抗CD3及/或抗CD28抗體至培養基之步驟。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如至少約10個單位/毫升濃度的IL-2。在一些實施例中，根據以下技術進行培育，諸如Riddell等人之美國專利第6,040,177號、Klebanoff等人(2012)  J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura等人 (2012) Blood.1:72-82及/或Wang等人 (2012) J Immunother. 35(9):689-701中所述之技術。 在一些實施例中，藉由向組合物中添加飼養細胞，諸如非分裂周邊血液單核細胞(PBMC) (例如使得所得細胞群體含有每個T淋巴球至少約5、10、20或40個或40個以上PBMC飼養細胞於待擴增的初始群體中)；且培育培養物(例如足以擴增T細胞數目的時間)來擴增T細胞。在一些態樣中，非分裂飼養細胞可包含γ輻射PBMC飼養細胞。在一些實施例中，PBMC經約3000 rads至3600 rads範圍內之γ射線輻射以防止細胞分裂。在一些態樣中，飼養細胞在添加T細胞群體之前添加至培養基中。 在一些實施例中，刺激條件一般包括適於人類T淋巴球生長之溫度，例如至少約25攝氏度，一般至少約30度且一般37攝氏度或約37攝氏度。視情況，培育可進一步包含添加非分裂EBV轉型類淋巴母細胞(LCL)作為飼養細胞。LCL可經約6000 rads至10,000 rads範圍內之γ射線輻射。在一些態樣中，LCL飼養細胞以任何適合量提供，諸如LCL飼養細胞與初始T淋巴球之比率至少約10:1。 在實施例中，抗原特異性T細胞，諸如抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞，藉由用抗原刺激初始或抗原特異性T淋巴球來獲得。舉例而言，針對細胞巨大病毒抗原之抗原特異性T細胞株或純系可藉由自感染個體分離T細胞且用相同抗原活體外刺激細胞來產生。 在一些實施例中，在一或多種刺激條件或刺激劑(諸如上文所述之任一者)下培育之至少一部分在離心室中進行。在一些實施例中，在離心室中進行之培育之至少一部分包括與誘導刺激及/或活化之試劑混合。在一些實施例中，細胞(諸如經選擇之細胞)在離心室中與刺激條件或刺激劑混合。在此類過程之一些態樣中，一定體積之細胞與一定量之一或多種刺激條件或刺激劑混合，該量遠小於當在細胞培養盤或其他系統中進行類似刺激時通常所採用的。 在一些實施例中，刺激劑以與當在週期性震盪或旋轉下於離心室(例如管或袋包)中在未混合的情況下進行選擇時為達到選擇相同數目細胞或相同體積細胞之大約相同或類似的效率所通常使用或必需的刺激劑的量相比基本上較小(例如不超過該量之5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%)的量添加至離心室空穴中之細胞。在一些實施例中，培育藉由添加培育緩衝液至細胞及刺激劑以達到例如10 mL至200 mL的目標體積而與試劑一起培育來進行，諸如至少為或為10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、150 mL或200 mL或約該等數目。在一些實施例中，培育緩衝液及刺激劑在添加至細胞之前預混合。在一些實施例中，培育緩衝液及刺激劑分開添加至細胞。在一些實施例中，刺激培育在週期性溫和混合條件下進行，其可幫助促進能量上有利的相互作用且藉此允許使用較少總刺激劑同時實現細胞之刺激及活化。 在一些實施例中，與刺激劑一起培育的總持續時間為1小時或約1小時至72小時或約72小時、1小時或約1小時至48小時或約48小時、4小時或約4小時至36小時或約36小時、8小時或約8小時至30小時或約30小時或12小時或約12小時至24小時或約24小時，諸如至少6小時、12小時、18小時、24小時、36小時或72小時或約該等時間。在一些情況下，在離心室中培育的總持續時間為5分鐘或約5分鐘至6小時或約6小時，諸如30分鐘至3小時，例如至少30分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘或約該等時間。在一些情況下，培育之另一部分可在離心室外進行。 在一些實施例中，培育一般在混合條件下，諸如在旋轉存在下，以一般相對較低的力或速度來進行，諸如低於用於使細胞集結之速度，諸如600 rpm或約600 rpm至1700 rpm或約1700 rpm (例如為或約為或至少為600 rpm、1000 rpm、1500 rpm或1700 rpm)，諸如以在樣品或離心室或其他容器之壁面之80 g或約80 g至100 g或約100 g之RCF(例如為或約為或至少為80 g、85 g、90 g、95 g或100 g)。在一些實施例中，使用在此類低速下旋轉隨後為靜止時間之重複間隔來進行旋轉，諸如旋轉及/或靜止1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，諸如旋轉大致1或2秒，隨後靜止大致5、6、7或8秒。 在一些實施例中，細胞在離心室中與細胞刺激劑一起培育，該/該等細胞刺激劑為能夠誘導細胞內信號傳導及/或細胞增殖之細胞結合劑，諸如抗原結合劑，諸如抗體。在一些實施例中，細胞根據所提供之方法的過程態樣在離心室中與抗CD3/抗CD28珠粒一起培育，包括與其混合。 在一些實施例中，處理步驟包括自離心室壓出與一或多種刺激條件或刺激劑一起培育(諸如與其混合)之細胞。在一些實施例中，一或多個其他額外處理步驟可在離心室中進行，諸如洗滌，其可在刺激培育之前、之後及/或與其連續。在一些實施例中，在諸如對經選擇或解凍之細胞進行刺激之前進行洗滌，以用適於刺激及培養細胞之培養基移除且更換培養基。 在一些實施例中，自離心室壓出之已與一或多種刺激條件或刺激劑一起培育(諸如與其混合)之細胞在離心室外進一步培育。在一些實施例中，進一步培育在大於室溫之溫度下實現，諸如大於25℃或約25℃，諸如一般大於32℃、35℃或37℃或約32℃、35℃或37℃。在一些實施例中，進一步培育在37℃±2℃或約37℃±2℃之溫度下，諸如在37℃或約37℃之溫度下實現。在一些實施例中，進一步培育持續12小時或約12小時至96小時或約96小時，諸如至少12小時、24小時、36小時、48小時、72小時或96小時或約該等時間。 在一些實施例中，進一步培育發生在封閉系統中。在一些實施例中，在與一或多種刺激條件或刺激劑一起培育(諸如混合)之細胞自離心室壓出諸如至容器(例如袋包)中之後，含有該等細胞之容器再培育一部分時間。在一些實施例中，容器(諸如袋包)在37℃±2℃或約37℃±2℃之溫度下培育1小時或約1小時至48小時或約48小時、4小時或約4小時至36小時或約36小時、8小時或約8小時至30小時或約30小時或12小時或約12小時至24小時或約24小時(包括端點本數)之時間。調配 在一些實施例中，過程步驟(例如在離心室及/或封閉系統中進行的)可包括細胞調配，諸如調配由所提供之轉導處理步驟及/或所述一或多個其他處理步驟產生之經基因工程改造之細胞。在一些實施例中，所提供之與細胞調配相關聯之方法包括在諸如在離心室中或與離心室相關聯之封閉系統中，使用上文所述之處理步驟處理轉導細胞，諸如經轉導及/或擴增之細胞。 在一些實施例中，細胞調配於醫藥學上可接受之緩衝液中，該緩衝液可在一些態樣中包括醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，處理包括將培養基更換成醫藥學上可接受或投與個體所需的培養基或調配緩衝液。在一些實施例中，處理步驟可涉及洗滌經轉導及/或擴增之細胞以將該等細胞置換於醫藥學上可接受之緩衝液中，該緩衝液可包括一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。包括醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之此類醫藥形式的例示可為下文所述與向個體投與細胞及組合物可接受之形式結合的任何形式。在一些實施例中，醫藥組合物含有有效治療或預防疾病或病狀之量，諸如治療有效或預防有效量之細胞。 在一些實施例中，調配緩衝液含有低溫保存劑。在一些實施例中，細胞用含有1.0%至30% DMSO溶液(諸如5%至20% DMSO溶液或5%至10% DMSO溶液)之低溫保存溶液調配。在一些實施例中，低溫保存溶液為或含有例如含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白(HSA)之PBS或其他適合之細胞冷凍培養基。在一些實施例中，低溫保存溶液為或含有例如至少或約7.5% DMSO。在一些實施例中，處理步驟可涉及洗滌經轉導及/或擴增之細胞以將該等細胞置換於低溫保存溶液中。 在一些實施例中，處理可包括稀釋或濃縮細胞至所需濃度或數目，諸如包括以給定劑量或其部分投與之細胞數目的單位劑型組合物。在一些實施例中，處理步驟可包括減少體積以藉此視需要增加細胞濃度。在一些實施例中，處理步驟可包括增加體積以藉此視需要減小細胞濃度。 在一些實施例中，處理包括添加一定體積之調配緩衝液至經轉導及/或擴增之細胞。在一些實施例中，調配緩衝液之體積為10 mL或約10 mL至1000 mL或約1000 mL，諸如至少為或為50 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL或1000 mL或約該等數目。 此類處理步驟之例示可使用與一或多個與細胞處理系統相關聯之系統或套組結合的離心室來進行，諸如由Biosafe SA生產及出售之離心室，包括適用於Sepax®或Sepax 2®細胞處理系統之離心室。 在一些實施例中，該方法包括實現自離心室之內部空穴壓出調配組合物，該調配組合物為在所述以上實施例中之任一者中，在調配緩衝液(諸如醫藥學上可接受之緩衝液)中調配之所得細胞組合物。在一些實施例中，調配組合物壓出至作為封閉系統之一部分與離心室可操作地連接的容器(諸如袋包)。在一些實施例中，容器(諸如袋包)如圖5或圖7中描繪之例示性系統中所例示，在輸出管線或輸出位置處連接至系統。 在一些實施例中，諸如與細胞處理系統相關聯之封閉系統(諸如離心室)包括多端口輸出套組，該套組含有在管線各末端與端口相關聯之多路管歧管，該端口可連接至一個或複數個容器以供調配組合物壓出。在一些態樣中，所需數目或複數個輸出容器(例如袋包)可無菌連接至多端口輸出之一或多個，一般兩個或兩個以上，諸如至少3、4、5、6、7、8個或8個以上端口。舉例而言，在一些實施例中，一或多個容器(例如袋包)可附接至端口或不到全部的端口。因此，在一些實施例中，該系統可實現輸出組合物壓出至複數個輸出袋包中。 在一些態樣中，細胞可以用於劑量投與(諸如用於單一個單位劑量投與或多個劑量投與)之量壓出至複數個輸出袋包中之一或多者中。舉例而言，在一些實施例中，輸出袋包可各含有以給定劑量或其部分投與之細胞數目。因此，在一些態樣中，各袋包可含有單一個單位投與劑量或可含有所需劑量之一部分，使得複數個輸出袋包中之一個以上，諸如兩個輸出袋包或3個輸出袋包一起構成投與劑量。 因此，容器(例如袋包)一般含有待投與之細胞，例如其一或多個單位劑量。單位劑量可為待投與個體之細胞的量或數目或待投與之細胞的數目的兩倍(或更多)。其可為將投與個體之細胞的最低劑量或最低可能劑量。 在一些實施例中，容器(例如袋包)中之每一者單獨包含單位劑量之細胞。因此，在一些實施例中，容器中之每一者包含相同或大致或基本上相同數目之細胞。在一些實施例中，單位劑量包括每公斤待治療及/或細胞所來源之個體小於約1×108 個、小於約5×107 個、小於約1×106 個或小於約5×105 個細胞。在一些實施例中，各單位劑量含有至少或約至少1×106 個、2×106 個、5×106 個、1×107 個、5×107 個或1×108 個經工程改造之細胞、全部細胞、T細胞或PBMC。在一些實施例中，各袋包中之調配細胞組合物的體積為10 mL至100 mL，諸如至少或約至少20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL或100 mL。 在一些實施例中，複數個輸出袋包中之一或多者可用於測試，諸如用於評定轉導效率。舉例而言，在一些態樣中，轉導效率可藉由量測在使用所提供之方法的實施例轉導後，由病毒載體粒子之基因體中所含之核酸編碼的重組蛋白質(諸如異源蛋白質)的表現量來評定。因此，在一些實施例中，重組分子之表現量可藉由許多熟知方法中之任一者來評定，諸如藉由基於親和力之方法(例如基於免疫親和力之方法)，例如在細胞表面蛋白質之情形下，諸如藉由流動式細胞測量術來偵測。在一些態樣中，藉由偵測轉導標記及/或報導體構築體測試複數個容器(例如袋包)中之一或多者中所含之細胞的重組分子表現量。在其他實施例中，使用載體內所包括之編碼截短表面蛋白質的核酸作為標記來評定表現。 在一些實施例中，細胞壓出至其中之複數個容器之全部或基本上全部含有相同數目之細胞且在相同或基本上相同之濃縮下。在一些實施例中，在細胞壓出至複數個容器中之一者之前，管線係經接觸過抗原。IV. 細胞及組合物 細胞、細胞群體及組合物屬於待用於該等方法(諸如處理步驟，例如轉移病毒核酸，例如轉導)之細胞。 細胞一般為哺乳動物細胞且通常為人類細胞。在一些實施例中，細胞來源於血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些態樣中，細胞為免疫系統細胞，諸如具有先天性或適應性免疫之細胞，例如骨髓或淋巴細胞，包括淋巴球，通常為T細胞及/或NK細胞。其他例示性細胞包括幹細胞，諸如多潛能及多能幹細胞，包括經誘導之多能幹細胞(iPSC)。細胞通常為初級細胞，諸如直接自個體分離及/或自個體分離且冷凍之細胞。在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個亞群，諸如完整T細胞群體、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群，諸如根據以下定義之細胞：功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、定位及/或持久能力、抗原特異性、抗原受體類型、具體器官或區室中之存在、標記或細胞激素分泌概況及/或分化程度。提及所治療之個體時，細胞可為同種異體細胞及/或自體細胞。在一些實施例中，該等方法包括自個體分離細胞，對其進行製備、處理、培養及/或工程改造，在低溫保存之前或之後將其再引入至同一個體體內，該等方法在一些態樣中可使用所提供之處理步驟中之一或多者在封閉系統中實現。 T細胞及/或CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞的亞型及亞群為初始T (TN )細胞、效應T細胞(TEFF )、記憶T細胞及其亞型，諸如幹細胞記憶T (TSCM )、中心記憶T (TCM )、效應記憶T (TEM )或末期分化效應記憶T細胞；腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T (MAIT)細胞、天然存在及適應性調節T (Treg)細胞、輔助T細胞，諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡性輔助T細胞；α/β T細胞及δ/γ T細胞。 在一些實施例中，細胞為自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，細胞為單核球或粒細胞，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜伊紅血球及/或嗜鹼性血球。V. 病毒載體粒子、病毒載體及所編碼之重組產物 轉導方法一般涉及用病毒載體，諸如編碼欲在細胞中表現之重組產物之病毒載體轉導。如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳播其所連接之另一核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞之基因體中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。載體包括病毒載體，諸如反轉錄病毒載體，例如慢病毒或γ-反轉錄病毒載體，其具有攜帶另一核酸之基因體且能夠插入至宿主基因體中以便其傳播。 在一些實施例中，病毒載體以載具(亦即病毒載體粒子)轉移至細胞，該病毒載體粒子包括囊封及/或封裝病毒載體基因體之病毒粒子。在一些此類實施例中，除編碼重組分子之核酸以外，病毒載體之基因體通常亦包括允許基因體封裝至病毒粒子中之序列。 在一些實施例中，病毒載體含有重組核酸，諸如編碼重組及/或異源分子(諸如重組或異源蛋白質)之核酸。在一些實施例中，諸如在所提供之方法的態樣中，用病毒載體轉導產生輸出組合物，其中之細胞已經轉導且表現此類核酸之重組產物或經基因工程改造之產物。在一些實施例中，核酸為異源核酸，亦即細胞或自細胞獲得之樣品中通常不存在的核酸，諸如自另一生物體或細胞獲得的核酸，此類核酸例如在經轉導之細胞及/或此類細胞所來源之生物體中通常未發現。在一些實施例中，核酸並非天然存在之核酸，諸如自然界中未發現之核酸，包括包含編碼來自多種不同細胞類型之不同結構域之核酸之嵌合組合的核酸。 在一些實施例中，使用重組病毒或病毒載體粒子(諸如來源於猴病毒40 (SV40)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)之載體)將重組核酸轉移至細胞中。在一些實施例中，使用重組慢病毒載體或反轉錄病毒載體(諸如γ-反轉錄病毒載體)將重組核酸轉移至細胞(諸如T細胞)中(參見例如Koste等人 (2014) Gene Therapy 2014年4月3日. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens等人 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino等人 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park等人, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557。 在一些實施例中，反轉錄病毒載體具有長末端重複序列(LTR)，例如來源於莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠類胚胎幹細胞病毒(MESV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、脾臟病灶形成病毒(SFFV)或腺相關病毒(AAV)之反轉錄病毒載體。大部分反轉錄病毒載體來源於鼠類反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒包括來源於任何禽類或哺乳動物細胞來源之反轉錄病毒。反轉錄病毒通常為雙嗜性，意味著其能夠感染數個物種(包括人類)之宿主細胞。在一個實施例中，待表現之基因置換反轉錄病毒gag、pol及/或env序列。已描述許多說明性反轉錄病毒系統(例如美國專利第5,219,740號；第6,207,453號；第5,219,740號；Miller及Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人 (1991) Virology 180:849-852；Burns等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；及Boris-Lawrie及Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109。 病毒載體一般包括重組核酸，諸如編碼欲由細胞表現之重組產物的轉殖基因。重組產物包括重組受體，包括抗原受體，諸如功能性非TCR抗原受體，例如嵌合抗原受體(CAR)；及其他抗原結合受體，諸如轉殖基因T細胞受體(TCR)。其他嵌合受體亦屬於重組受體。 例示性抗原受體(包括CAR)及工程改造此類受體並將其引入至細胞中之方法包括例如國際專利申請公開案第WO200014257號、第WO2013126726號、第WO2012/129514號、第WO2014031687號、第WO2013/166321號、第WO2013/071154號、第WO2013/123061號、美國專利申請公開案第US2002131960號、第US2013287748號、第US20130149337號、美國專利第6,451,995號、第7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號以及歐洲專利申請案第EP2537416號中所述之彼等內容及/或由Sadelain等人, Cancer Discov. 2013年4月; 3(4): 388-398；Davila等人 (2013)PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle等人,Curr. Opin. Immunol. , 2012年10月; 24(5): 633-39；Wu等人,Cancer , 2012年3月 18(2): 160-75所述之彼等內容。在一些態樣中，抗原受體包括如美國專利第7,446,190號中所述之CAR及國際專利申請公開案第WO/2014055668 A1號中所述之彼等受體。CAR之實例包括如上述公開案中之任一者，諸如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美國專利第7,446,190號、美國專利第8,389,282號；Kochenderfer等人, 2013,Nature Reviews Clinical Oncology , 10, 267-276 (2013)；Wang等人 (2012)J. Immunother. 35(9): 689-701；及Brentjens等人,Sci Transl Med. 2013 5(177)中所揭示之CAR。亦參見WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美國專利第7,446,190號及美國專利第8,389,282號。嵌合受體(諸如CAR)一般包括細胞外抗原結合域，諸如抗體分子之一部分，一般為抗體之可變重(VH )鏈區及/或可變輕(VL )鏈區，例如scFv抗體片段。 在一些實施例中，重組受體(例如汽車)之抗體部分另外包括免疫球蛋白恆定區之至少一部分，諸如鉸鏈區，例如IgG4鉸鏈區及/或CH1/CL及/或Fc區。在一些實施例中，恆定區或部分來自人類IgG，諸如IgG4或IgG1。在一些態樣中，恆定區之一部分充當抗原識別組分(例如scFv)與跨膜結構域之間的間隔區。間隔子之長度可使得細胞在抗原結合後之反應性與間隔子不存在之情況相比增加。例示性間隔子(例如鉸鏈區)包括國際專利申請公開案第WO2014031687號中所述之間隔子。在一些實例中，間隔子長度為或約為12個胺基酸或長度不超過12個胺基酸。例示性間隔子包括具有至少約10至229個胺基酸、約10至200個胺基酸、約10至175個胺基酸、約10至150個胺基酸、約10至125個胺基酸、約10至100個胺基酸、約10至75個胺基酸、約10至50個胺基酸、約10至40個胺基酸、約10至30個胺基酸、約10至20個胺基酸或約10至15個胺基酸(包括任一所列範圍之端點本數之間的任何整數)之間隔子。在一些實施例中，間隔區具有約12或少於12個胺基酸、約119個或少於119個胺基酸，或約229個或少於229個胺基酸。例示性間隔子包括單獨IgG4鉸鏈、連接至CH2及CH3結構域的IgG4鉸鏈，或連接至CH3結構域的IgG4鉸鏈。 此抗原識別結構域一般連接至一或多種細胞內信號傳導組分，諸如在CAR之情況下經由抗原受體複合物(諸如TCR複合物)模擬活化及/或經由另一細胞表面受體傳導信號的信號傳導組分。因此，在一些實施例中，抗原結合組分(例如抗體)連接至一或多種跨膜及細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，跨膜結構域與細胞外結構域融合。在一個實施例中，使用與受體(例如CAR)中之一個結構域天然關聯的跨膜結構域。在一些情況下，跨膜結構域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白質之跨膜結構域，以使與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。 在一些實施例中，跨膜結構域來源於天然或合成來源。在天然來源的情況下，在一些態樣中，結構域來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。跨膜區包括來源於以下各者之跨膜區(亦即包含至少以下各者之跨膜區)：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154。或者，在一些實施例中，跨膜結構域為合成的。在一些態樣中，合成跨膜結構域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些態樣中，在合成跨膜結構域之各端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施例中，藉由連接子、間隔子及/或跨膜結構域連接。 細胞內信號傳導結構域為經由天然抗原受體模擬或接近信號、經藉此受體與協同刺激受體之組合模擬或接近信號及/或經由單獨協同刺激受體模擬或接近信號之彼等結構域。在一些實施例中，存在短寡肽或多肽連接子(例如長度在2個與10個胺基酸之間的連接子，諸如含有甘胺酸及絲胺酸的連接子，例如甘胺酸-絲胺酸二聯體)且形成CAR之跨膜結構域與細胞質信號傳導結構域之間的連接。 受體(例如CAR)一般包括至少一種細胞內信號傳導組分。在一些實施例中，受體包括TCR複合物之細胞內組分，諸如介導T細胞活化及細胞毒性的TCR CD3鏈，例如CD3 ζ鏈。因此，在一些態樣中，抗原結合部分連接至一或多個細胞信號傳導模組。在一些實施例中，細胞信號傳導模組包括CD3跨膜結構域、CD3細胞內信號傳導結構域及/或其他CD跨膜結構域。在一些實施例中，受體(例如CAR)另外包括一或多種其他分子(諸如Fc受體γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。舉例而言，在一些態樣中，CAR或其他嵌合受體包括CD3-ζ或Fc受體γ與CD8、CD4、CD25或CD16之間的嵌合分子。 在一些實施例中，在接合CAR或其他嵌合受體後，受體之細胞質結構域或細胞內信號傳導結構域活化免疫細胞(例如經工程改造以表現CAR之T細胞)的正常效應功能或反應中之至少一者。舉例而言，在一些情形下，CAR誘導T細胞功能，諸如細胞溶解活性；或T輔助細胞活性，諸如細胞激素或其他因子之分泌。在一些實施例中，抗原受體組分或協同刺激分子之細胞內信號傳導結構域的截短部分例如若轉導效應功能信號，則代替完整的免疫刺激鏈使用。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括T細胞受體(TCR)之細胞質序列，且在一些態樣中，亦包括在天然情形中與此類受體協同起作用以在抗原受體參與後引發信號轉導之共受體的細胞質序列。 在天然TCR之情形下，完全活化一般不僅需要經由TCR傳導信號，而且需要協同刺激信號。因此，在一些實施例中，為了促進完全活化，CAR中亦包括用於產生二級或協同刺激信號的組分。在其他實施例中，CAR不包括產生協同刺激信號的組分。在一些態樣中，另一種CAR表現於相同細胞中且提供產生二級或協同刺激信號的組分。 T細胞活化在一些態樣中描述為由兩類細胞質信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性初級活化的細胞質信號傳導序列(初級細胞質信號傳導序列)，及以抗原非依賴性方式起作用以提供二級或協同刺激信號的細胞質信號傳導序列(二級細胞質信號傳導序列)。在一些態樣中，CAR包括此類信號傳導組分中之一者或兩者。 在一些態樣中，CAR包括調節TCR複合物初級活化的初級細胞質信號傳導序列。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列可含有信號傳導基元，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括來源於TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之初級細胞質信號傳導序列。在一些實施例中，CAR中之細胞質信號傳導分子含有細胞質信號傳導結構域、其部分或來源於CD3ξ之序列。 在一些實施例中，CAR包括協同刺激受體(諸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10及ICOS)之信號傳導結構域及/或跨膜部分。在一些態樣中，同一CAR包括活化組分及協同刺激組分。 在一些實施例中，活化結構域包括在一個CAR內，而協同刺激組分由識別另一抗原之另一CAR提供。在一些實施例中，CAR包括活化或刺激CAR、協同刺激CAR，其均表現於同一細胞上(參見WO2014/055668)。在一些態樣中，細胞包括一或多個刺激或活化CAR及/或協同刺激CAR。在一些實施例中，細胞另外包括抑制CAR (iCAR，參見Fedorov等人,Sci. Transl. Medicine , 5(215) (2013年12月)，諸如識別除與疾病或病狀相關聯及/或對疾病或病狀具有特異性之抗原以外之抗原的CAR，藉此經由靶向疾病之CAR傳遞的活化信號藉由抑制CAR結合至其配位體而減弱或抑制，例如以減小脫靶效應。 在某些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含連接至CD3 (例如CD3-ζ)細胞內結構域之CD28跨膜及信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含連接至CD3ζ細胞內結構域之嵌合CD28及CD137 (4-1BB、TNFRSF9)協同刺激結構域。 在一些實施例中，CAR涵蓋在細胞質部分中之一或多個(例如兩個或兩個以上)協同刺激結構域及活化結構域(例如初級活化結構域)。例示性CAR包括CD3-ζ、CD28及4-1BB之細胞內組分。 在一些實施例中，CAR或其他抗原受體另外包括標記，諸如細胞表面標記，其可用於證實細胞之轉導或工程改造表現受體，諸如截短型細胞表面受體，諸如截短之EGFR (tEGFR)。在一些態樣中，標記包括CD34、NGFR或表皮生長因子受體(例如tEGFR)之全部或一部分(例如截短形式)。在一些實施例中，編碼標記之核酸可操作地連接於編碼連接子序列(諸如可裂解連接子序列，例如T2A)之聚核苷酸。參見WO2014031687。 在一些實施例中，標記為非天然發現於T細胞上或非天然發現於T細胞表面上的分子，例如細胞表面蛋白質，或其一部分。 在一些實施例中，分子為非自身分子，例如非自身蛋白質，亦即未由細胞所授受性轉移之宿主的免疫系統識別為「自身」的分子。 在一些實施例中，標記不提供治療功能及/或除作為基因工程改造之標記例如用於選擇成功地經工程改造之細胞以外不產生作用。在其他實施例中，標記可為治療性分子或以其他方式發揮一些所需作用之分子，諸如活體內所遇到之細胞的配位體，諸如協同刺激或免疫檢查點分子，以在授受性轉移及與配位體相遇時增強及/或減弱細胞反應。 在一些情況下，CAR稱為第一、第二及/或第三代CAR。在一些態樣中，第一代CAR為僅在抗原結合時提供CD3鏈誘導信號之CAR；在一些態樣中，第二代CAR為提供此信號及協同刺激信號之CAR，諸如包括來自協同刺激受體(諸如CD28或CD137)之細胞內信號傳導結構域的CAR；在一些態樣中，第三代CAR為包括不同協同刺激受體之多個協同刺激結構域的CAR。 在一些實施例中，嵌合抗原受體包括含有抗體或抗體片段之細胞外部分。在一些態樣中，嵌合抗原受體包括含有抗體或片段之細胞外部分及細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，抗體或片段包括scFv且細胞內結構域含有ITAM。在一些態樣中，細胞內信號傳導結構域包括CD3ζ鏈之ζ鏈的信號傳導結構域。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括連接細胞外結構域及細胞內信號傳導結構域的跨膜結構域。在一些態樣中，跨膜結構域含有CD28之跨膜部分。在一些實施例中，嵌合抗原受體含有T細胞協同刺激分子的細胞內結構域。在一些態樣中，T細胞協同刺激分子為CD28或41BB。 術語「多肽」與「蛋白質」可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。多肽(包括所提供之受體及其他多肽，例如連接子或肽)可包括具有天然及/或非天然胺基酸殘基之胺基酸殘基。術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化及磷酸化。在一些態樣中，多肽可含有相對於原生或天然序列的修飾，只要蛋白質維持所需活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發；或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或因PCR擴增所致的錯誤。 由向個體投與之細胞所表現的重組受體(諸如CAR)一般識別或特異性結合至所治療之疾病或病狀或其細胞中所表現、與該疾病或病狀或其細胞相關聯及/或特異性針對該疾病或病狀或其細胞的分子。在特異性結合至例如抗原之分子後，受體一般傳遞免疫刺激信號(諸如ITAM轉導之信號)至細胞中，藉此促進靶向疾病或病狀之免疫反應。舉例而言，在一些實施例中，細胞表現特異性結合至由疾病或病狀之細胞或組織或與疾病或病狀相關聯之細胞或組織所表現之抗原的CAR。 在一些情形中，刺激因子(例如淋巴激素或細胞激素)之過度表現可對個體具有毒性。因此，在一些情形中，病毒載體引入至細胞基因區段中，使得細胞易於進行活體內(諸如在授受免疫療法中投與後)陰性選擇。舉例而言，在一些態樣中，在細胞經此類基因區段轉導後，細胞由於其所投與之個體的活體內條件變化而消除。陰性可選表型可由賦予對所投與藥劑(例如化合物)之敏感性之基因的插入產生。陰性可選基因包括賦予更昔洛韋(ganciclovir)敏感性的單純性疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人, Cell II:223, I977)；細胞次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、細胞腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)基因、細菌胞嘧啶脫胺酶(Mullen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))。 可包括在病毒載體中用於轉導及在細胞中表現之額外核酸為編碼以下產物之核酸，該等產物諸如藉由促進所轉移細胞之成活力及/或功能而改良療法功效；提供用於細胞選擇及/或評估之遺傳標記，諸如以活體內評定存活或定位；及/或例如藉由使細胞易於進行活體內陰性選擇而改良安全性，如由Lupton S. D.等人,Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991)；及Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)所述；亦參見Lupton等人之公開案PCT/US91/08442及PCT/US94/05601，描述由顯性陽性可選標記與陰性可選標記融合衍生之雙功能可選融合基因之用途。參見例如Riddell等人之美國專利第6,040,177號的第14-17行。VI. 治療方法及組合物 在一些態樣中，該等方法之產物用於治療方法，例如治療性方法，諸如用於在授受細胞療法中向個體投與細胞及組合物。亦提供此類方法及藉由該等方法處理且產生之細胞的用途，及其中使用之醫藥組合物及調配物。所提供之方法一般涉及向個體投與細胞或組合物，例如輸出組合物及/或調配組合物。 在一些實施例中，細胞表現重組受體，諸如CAR，或其他抗原受體，諸如轉殖基因TCR，例如在本文所提供之轉導方法中轉移之重組受體。此類細胞一般投與患有由該受體特異性識別之疾病或病狀的個體。在一個實施例中，細胞表現特異性結合至與疾病或病狀相關聯或由其細胞或組織表現之配位體的重組受體或嵌合受體，諸如抗原受體，例如CAR或TCR。舉例而言，在一些實施例中，受體為抗原受體且配位體為特異性針對疾病或病狀及/或與疾病或病狀相關聯之抗原。投與一般實現疾病或病狀之一或多種症狀的改良及/或治療或預防疾病或病狀或其症狀。疾病、病狀及病症為腫瘤，包括實體腫瘤、血液科惡性疾病及黑素瘤，且包括局部及轉移性腫瘤；感染性疾病，諸如經病毒或其他病原體感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV及寄生蟲疾病；及自體免疫及發炎疾病。在一些實施例中，疾病或病狀為腫瘤、癌症、惡性病、贅瘤或其他增生性疾病或病症。此類疾病包括(但不限於)白血病、淋巴瘤，例如慢性淋巴球性白血病(CLL)、ALL、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、急性骨髓白血病、多發性骨髓瘤、難治性濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、惰性B細胞淋巴瘤、B細胞惡性病、結腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌、黑素瘤、骨癌及腦癌、卵巢癌、上皮癌、腎細胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、子宮頸癌、結腸直腸癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、神經管胚細胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤及/或間皮瘤。 在一些實施例中，疾病或病狀為感染性疾病或病狀，諸如(但不限於)病毒、反轉錄病毒、細菌及原蟲感染、免疫缺陷、細胞巨大病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些實施例中，疾病或病狀為自體免疫或發炎疾病或病狀，諸如關節炎，例如類風濕性關節炎(RA)；I型糖尿病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、發炎性腸病、牛皮癬、硬皮病、自體免疫甲狀腺疾病、格雷氏疾病(Grave's disease)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、多發性硬化症、哮喘及/或與移植相關聯之疾病或病狀。 在一些實施例中，由細胞或組合物所靶向之與疾病或病症相關聯的抗原係選自由以下組成之群：孤兒酪胺酸激酶受體RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、間皮素、CEA及B型肝炎表面抗原、抗葉酸受體、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎兒乙醯膽鹼e受體、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ輕鏈、Lewis Y、L1細胞黏附分子、MAGE-A1、間皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配位體、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受體、孕酮受體、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2及MAGE A3、CE7、威爾姆斯腫瘤1 (Wilms Tumor 1，WT-1)、細胞週期素，諸如細胞週期素A1 (CCNA1)及/或生物素標記分子及/或由HIV、HCV、HBV或其他病原體表現之分子。 在一些實施例中，細胞或組合物以有效治療或預防疾病或病狀之量(諸如治療有效或預防有效量)投與。因此，在一些實施例中，投與方法包括投與有效量之細胞及組合物。在一些實施例中，治療或預防功效藉由定期評定所治療之個體來監測。對於經數天或更長時間之重複投與，視病狀而定，重複治療直至出現疾病症狀之所需抑制為止。然而，其他給藥方案可為適用的且可加以確定。 如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指疾病或病狀或病症、或症狀、不良作用或後果、或與其相關聯之表型完全或部分改善或減輕。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防癌轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。該等術語不表示疾病之完全治癒或任何症狀之完全消除或對所有症狀或後果均有作用。 如本文所用，「延緩疾病發展」意指延遲、阻礙、減緩、扼止、穩定、抑制及/或推遲疾病(諸如癌症)之發展。此延緩可具有不同時間長度，視所治療之疾病及/或個體的病史而定。如熟習此項技術者顯而易見，足夠或顯著延緩可實際上涵蓋預防，從而使個體不出現疾病。舉例而言，可延緩晚期癌症，諸如出現癌轉移。 如本文所用，「預防」包括在個體疾病之發病或復發方面提供預防作用，該個體可能易患該疾病，但尚未診斷患有該疾病。在一些實施例中，所提供之細胞及組合物用於延緩疾病發展或減緩疾病進展。 如本文所用，「抑制」功能或活性為當與除所關注之條件或參數以外原本相同的條件相比或與其他條件相比時，減小功能或活性。舉例而言，抑制腫瘤生長之細胞與在不存在該等細胞之情況下的腫瘤生長速率相比，減小腫瘤生長速率。 在投與情形下，藥劑(例如醫藥調配物、細胞或組合物)之「有效量」係指在所必需之劑量/量及時段下，有效達成所需結果(諸如治療性或預防性結果)的量。 藥劑(例如醫藥調配物或細胞)之「治療有效量」係指在所必需的劑量及時段下，有效達成所需治療性結果(諸如治療疾病、病狀或病症及/或治療之藥物動力學或藥力學作用)的量。治療有效量可根據以下因素而變化：諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及所投與之細胞群體。 「預防有效量」係指在所必需的劑量及時段下，有效達成所需預防結果之量。通常但不一定，由於個體在患病之前或在疾病早期使用預防劑量，故預防有效量將低於治療有效量。 用於授受細胞療法之細胞的投與方法為已知的且可結合所提供之方法及組合物加以使用。舉例而言，授受T細胞療法描述於例如Gruenberg等人之美國專利申請公開案第2003/0170238號；Rosenberg之美國專利第4,690,915號；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)中。參見例如Themeli等人 (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara等人 (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila等人 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338。 在一些實施例中，細胞療法(例如授受細胞療法，例如授受T細胞療法)藉由自體轉移來進行，其中該等細胞自將接受該細胞療法之個體或自來源於此個體之樣品分離及/或以其他方式製備。因此，在一些態樣中，細胞來源於需要治療及該等細胞之個體(例如患者)，且在分離及處理後，將該等細胞投與同一個體。 在一些實施例中，細胞療法(例如授受細胞療法，例如授受T細胞療法)藉由同種異體轉移來進行，其中該等細胞自除將接受或最終接受該細胞療法之個體以外的個體(例如第一個體)分離或以其他方式製備。在此類實施例中，細胞接著投與相同物種之不同個體(例如第二個體)。在一些實施例中，第一及第二個體在遺傳上相同。在一些實施例中，第一及第二個體在遺傳上類似。在一些實施例中，第二個體表現與第一個體相同的HLA類別或超型。 細胞可藉由任何適合之方式投與，例如藉由快速輸注；藉由注射，例如靜脈內或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下注射(subconjectval injection)、結膜下注射(subconjuntival injection)、眼筋膜下注射、眼球後注射、眼球周注射或後近鞏膜遞送。在一些實施例中，其藉由非經腸、肺內及鼻內投藥，且若需要用於局部治療，藉由病灶內投藥來投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。在一些實施例中，給定劑量藉由單次快速投與細胞、藉由多次快速投與細胞或藉由連續輸注投與細胞來投與。 對於疾病之預防或治療，適當劑量可視待治療之疾病的類型、細胞或重組受體之類型、該疾病之嚴重程度及病程、細胞是否出於預防性或治療性目的投與、先前療法、個體之臨床病史及對細胞之反應及主治醫師的判斷而定。在一些實施例中，組合物及細胞適宜一次性或經一系列治療投與個體。 在一些實施例中，細胞作為組合治療之一部分投與，諸如與另一治療性干預(諸如抗體或經工程改造之細胞或受體或藥劑，諸如細胞毒性劑或治療劑)同時或按任何次序依次投與。在一些實施例中，細胞與一或多種額外治療劑一起共投與或與另一治療性干預結合同時或按任何次序依次投與。在一些情形中，細胞與另一療法在足夠接近的時間上共投與，使得細胞群體增強一或多種額外治療劑之作用，或反之亦然。在一些實施例中，細胞在一或多種額外治療劑之前投與。在一些實施例中，細胞在一或多種額外治療劑之後投與。在一些實施例中，一或多種額外藥劑包括細胞激素(諸如IL-2)以例如增強持久性。 在細胞投與個體(例如人類)後，在一些態樣中，藉由許多已知方法中之任一者量測細胞群體之生物活性。評定參數包括細胞與抗原之特異性結合，活體內例如藉由成像或離體例如藉由ELISA或流動式細胞測量術來評定。在某些實施例中，細胞破壞目標細胞之能力可使用此項技術中已知的任何適合方法來量測，諸如例如Kochenderfer等人, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)及Herman等人 J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)中所述之細胞毒性分析。在某些實施例中，細胞之生物活性亦可藉由分析某些細胞激素(諸如CD 107a、IFNγ、IL-2及TNF)之表現及/或分泌來量測。在一些態樣中，藉由評定臨床結果(諸如腫瘤負荷之減小)來量測生物活性。在一些態樣中，評定毒性結果、細胞之持久性及/或擴增及/或是否存在宿主免疫反應。 在某些實施例中，細胞以任意數目之方式加以修飾，使其治療性或預防性功效增加。舉例而言，由群體表現之經工程改造之CAR或TCR可直接或經由連接子間接結合至靶向部分。使化合物(例如CAR或TCR)結合至靶向部分之實踐為此項技術中已知的。參見例如Wadwa等人, J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)及美國專利5,087,616。 亦提供適用於此類方法之醫藥組合物或調配物，其在一些實施例中結合所提供之處理方法來調配，諸如在封閉系統中諸如以自動化或部分自動化方式進行其他處理步驟。 在一些實施例中，細胞及組合物以醫藥組合物或調配物形式投與個體，諸如包含細胞或細胞群體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的組合物。 術語「醫藥調配物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。 在一些實施例中，醫藥組合物另外包含其他醫藥活性劑或藥物，諸如化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、甲胺喋呤(methotrexate)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)等。在一些實施例中，藥劑以鹽形式投與，例如醫藥學上可接受之鹽。適合的醫藥學上可接受之酸加成鹽包括衍生自無機酸及有機酸的鹽，無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸及硫酸，有機酸諸如酒石酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、丁二酸及芳基磺酸，例如對甲苯磺酸。 「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。 在一些態樣中，載劑之選擇在某種程度上由具體細胞及/或投與方法決定。因此，存在多種適合調配物。舉例而言，醫藥組合物可含有防腐劑。適合的防腐劑可包括例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及苯紮氯銨(benzalkonium chloride)。在一些態樣中，使用兩種或兩種以上防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常以總組合物重量之約0.0001%至約2%的量存在。載劑例如由Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編 (1980)所述。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。 在一些態樣中，組合物中包括緩衝劑。適合的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀以及各種其他酸及鹽。在一些態樣中，使用兩種或兩種以上緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物通常以總組合物重量之約0.001%至約4%的量存在。製備可投與之醫藥組合物的方法為已知的。例示性方法更詳細地描述於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 第21版 (2005年5月1日)中。 調配物可包括水溶液。調配物或組合物亦可含有一種以上適用於用細胞治療之具體適應症、疾病或病狀之活性成分，較佳為具有與細胞互補之活性的活性成分，其中各自活性並未彼此不利地影響。此類活性成分適合以對預期目的有效之量存在於組合中。因此，在一些實施例中，醫藥組合物另外包括其他醫藥活性劑或藥物，諸如化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、道諾黴素、阿黴素、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲胺喋呤、太平洋紫杉醇、利妥昔單抗、長春花鹼及/或長春新鹼。 在一些實施例中，醫藥組合物含有有效治療或預防疾病或病狀之量，諸如治療有效或預防有效量之細胞。在一些實施例中，治療或預防功效藉由定期評定所治療之個體來監測。所需劑量可藉由單次快速投與細胞、藉由多次快速投與細胞或藉由連續輸注投與細胞來遞送。 細胞及組合物可使用標準投與技術、調配物及/或裝置來投與。細胞之投與可為自體或異源的。舉例而言，免疫反應性細胞或祖細胞可自一位個體獲得且投與同一個體或不同的相容個體。來源於周邊血液的免疫反應性細胞或其後代(例如活體內、離體或活體外來源)可經由局部注射投與，包括導管投與、全身性注射、局部注射、靜脈內注射或非經腸投與。當投與治療性組合物(例如含有經基因修飾之免疫反應性細胞的醫藥組合物)時，其一般調配成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。 調配物包括用於經口、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、經皮、肌肉內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投與的調配物。在一些實施例中，細胞群體係非經腸投與。如本文所用，術語「非經腸」包括靜脈內、肌肉內、皮下、經直腸、經陰道及腹膜內投與。在一些實施例中，細胞藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射使用周邊全身性遞送來投與個體。 在一些實施例中，組合物以無菌液體製劑形式提供，例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏稠組合物，在一些態樣中，其可緩衝至選定的pH。液體製劑通常比凝膠、其他黏稠組合物及固體組合物更容易製備。另外，液體組合物的投與在某種程度上更方便，尤其藉由注射投與。另一方面，黏稠組合物可在適當黏度範圍內調配以使得與特定組織接觸的時段更長。液體或黏稠組合物可包含載劑，載劑可為含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其適合混合物的溶劑或分散介質。 無菌可注射溶液可藉由將細胞併入溶劑中，諸如使細胞與適合之載劑、稀釋劑或賦形劑(諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或其類似物)混合來製備。視投藥途徑及所需製劑而定，組合物可含有輔助物質，諸如濕潤劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑及/或顏料。在一些態樣中，可查詢標準本文以製備適合製劑。 可添加增強組合物之穩定性及無菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚及山梨酸)來確保防止微生物之作用。可注射醫藥形式之延長吸收可藉由使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。 用於活體內投與之調配物一般為無菌的。無菌性可容易藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。 處理步驟可包括調配此類組合物。 除非上下文另外明確規定，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，「一(a/an)」意指「至少一個/種」或「一或多個/種」。應瞭解，本文所述之態樣及變化形式包括「組成」及/或「主要組成」態樣及變化形式。 在本發明通篇，所主張之標的物的各種態樣均以範圍型式呈現。應瞭解，範圍型式之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對所主張之標的物範疇的不靈活限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能的子範圍以及該範圍內之個別數值。舉例而言，在提供值範圍的情況下，應瞭解該範圍之上限與下限之間的每個中間值及該所陳述範圍內的任何其他所陳述值或中間值均涵蓋於所主張之標的物內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內且亦涵蓋於所主張之標的物內，在所陳述範圍內受到任何特定排他性限制。在所陳述之範圍包括一個或兩個限制之情況下，排除彼等所包括之限制中之任一者或兩者的範圍亦包括於所主張之標的物中。不管範圍之寬度此均適用。 如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。 如本文所用，組合物係指兩種或兩種以上產物、物質或化合物(包括細胞)之任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、膏劑、水溶液、非水溶液或其任何組合。 如本文所用，細胞或細胞群體對具體標記呈「陽性」之表述係指細胞表面或細胞內可偵測的存在具體標記(通常表面標記)。當提及表面標記時，該術語係指如藉由流動式細胞測量術所偵測存在表面表現，例如藉由用特異性結合至標記之抗體染色且偵測該抗體，其中該染色在基本上高於使用同型匹配對照物在其他方面相同的條件下執行相同程序所偵測之染色的水準下，及/或在基本上類似於已知對標記呈陽性之細胞的水準下，及/或在基本上高於已知對標記呈陰性之細胞的水準下可藉由流動式細胞測量術偵測。 如本文所用，細胞或細胞群體對具體標記呈「陰性」之表述係指不存在基本上可偵測存在於細胞表面或細胞內之具體標記(通常表面標記)。當提及表面標記時，該術語係指如藉由流動式細胞測量術所偵測不存在表面表現，例如藉由用特異性結合至標記之抗體染色且偵測該抗體，其中該染色在基本上高於使用同型匹配對照物在其他方面相同的條件下執行相同程序所偵測之染色的水準下，及/或在基本上低於已知對標記呈陽性之細胞的水準下，及/或在基本上類似於已知對標記呈陰性之細胞的水準下無法藉由流動式細胞測量術偵測。VII. 例示性實施例 本文提供之實施例為： 1.   一種轉導方法，其包含在離心室之內部空穴中培育包含細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，其中 該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且包含端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出； 該離心室在該培育之至少一部分期間圍繞該旋轉軸旋轉；及 該方法產生包含複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物。 2.   一種轉導方法，其包含在離心室之內部空穴中培育包含細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物， 該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且包含端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出，其中： 該離心室在該培育之至少一部分期間圍繞該旋轉軸旋轉； 在該離心室旋轉期間存在於該空穴中之該輸入組合物的總液體體積不超過每平方吋該空穴之內部表面積約5 mL；及 該方法產生包含複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物。 3.   如實施例1或實施例2之方法，其中該旋轉包含以在該空穴側壁之內表面及/或在表層該等細胞之大於200 g或約200 g、大於300 g或約300 g或大於500 g或約500 g的相對離心力(RCF)旋轉。 4.   如實施例1至3中任一項之方法，其中該旋轉包含以在該空穴側壁之內表面及/或在表層該等細胞之如下相對離心力旋轉： 600 g、800 g、1000 g、1100 g、1600 g、2000 g、2100 g、2200 g、2500 g或3000 g，或約該等數值之相對離心力；或 至少600 g、800 g、1000 g、1100 g、1600 g、2000 g、2100 g、2200 g、2500 g或3000 g，或約該等數值之相對離心力。 5.   如實施例1至4中任一項之方法，其中該旋轉包含以在該空穴側壁之內表面及/或在表層該等細胞之如下該等數值之間相對離心力或約該等數值之間相對離心力旋轉：500 g至2500 g、500 g至2000 g、500 g至1600 g、500 g至1000 g、600 g至1600 g、600 g至1000 g、1000 g至2000 g或1000 g至1600 g，各包括端點本數。 6.   如實施例1至5中任一項之方法，其中在該培育之至少一部分期間，該離心室旋轉如下時間： 大於或約5分鐘、大於或約10分鐘、大於或約15分鐘、大於或約20分鐘、大於或約30分鐘、大於或約45分鐘、大於或約60分鐘、大於或約90分鐘或大於或約120分鐘；或 5分鐘至60分鐘之間或約5分鐘至60分鐘之間、10分鐘至60分鐘之間或約10分鐘至60分鐘之間、15分鐘至60分鐘之間或約15分鐘至60分鐘之間、15分鐘至45分鐘之間或約15分鐘至45分鐘之間、30分鐘至60分鐘之間或約30分鐘至60分鐘之間，或45分鐘至60分鐘之間或約45分鐘至60分鐘之間，各包括端點本數。 7.   如實施例1至6中任一項之轉導方法，其中該離心室另外包含可移動構件且該內部空穴為具有由該端壁、該基本上固定側壁及該可移動構件界定之可變體積的空穴，該可移動構件能夠在該離心室內移動以改變該空穴之內部體積。 8.   如實施例1至7中任一項之方法，其中該側壁為曲線形。 9.   如實施例8之方法，其中該側壁為大體上圓柱形。 10.  如實施例7至9中任一項之方法，其中： 該可移動構件為活塞；及/或 該可移動構件能夠在該離心室內軸向移動以改變該空穴之內部體積。 11.  如實施例1至10中任一項之方法，其中 該至少一個開口包含分別能夠允許該引入及壓出之入口及出口；或 該至少一個開口包含能夠允許該引入及該壓出之單一個入口/出口。 12.  如實施例1至11中任一項之方法，其中該至少一個開口與該離心室同軸且位於該端壁中。 13.  如實施例1至12中任一項之方法，其中： 該空穴之內部表面積為至少1×109 µm2 或約1×109 µm2 ； 該空穴之內部表面積為至少1×1010 µm2 或約1×1010 µm2 ； 該固定壁在自該端壁延伸之方向的長度為至少約5 cm； 該固定壁在自該端壁延伸之方向的長度為至少約8 cm；及/或 該空穴在至少一個截面之半徑為至少約2 cm。 14.  如實施例1至13中任一項之方法，其中： 在該培育期間存在於該空穴中之該輸入組合物的平均液體體積不超過在該培育期間每平方吋該空穴之內部表面積約5毫升(mL)； 在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大液體體積不超過每平方吋該空穴之最大內部表面積約5 mL； 在該培育期間存在於該空穴中之該輸入組合物的平均液體體積不超過在該培育期間每平方吋該空穴之內部表面積約2.5毫升(mL)；或 在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大液體體積不超過每平方吋該空穴之最大內部表面積約2.5 mL。 15.  如實施例1至14中任一項之方法，其中在該旋轉期間存在於該空穴中之該輸入組合物的液體體積係介於如下數值之間或介於約如下數值之間：每平方吋該空穴之內部表面積0.5 mL (毫升/平方吋)至5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至1毫升/平方吋、1毫升/平方吋至5毫升/平方吋、1毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、或2.5毫升/平方吋至5毫升/平方吋。 16.  如實施例1至15中任一項之方法，其中： 該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在該離心室以在該側壁之內表面及/或在表層該等細胞1000 g或約1000 g或2000 g或約2000 g之力旋轉期間在該空穴之表面上形成單層之該等細胞的數目；及/或 該輸入組合物中該等細胞之數目為足以在該離心室以在該側壁之內表面及/或在表層該等細胞1000 g或約1000 g或2000 g或約2000 g之力旋轉期間在該空穴之表面上形成單層之該等細胞之數目的不超過1.5倍或2倍。 17.  如實施例1至16中任一項之方法，其中 該空穴中之該輸入組合物包含至少1×106 個該等細胞或約該數目之該等細胞；或 該空穴中之該輸入組合物包含至少5×106 個該等細胞或約該數目之該等細胞；或 該空穴中之該輸入組合物包含至少1×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞；或 該空穴中之該輸入組合物包含至少1×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞。 18.  如實施例1至17中任一項之方法，其中該空穴中之該輸入組合物包含至少1×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少2×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少3×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少4×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少5×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少6×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少7×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少8×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少9×107 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少1×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少2×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞、至少3×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞，或至少4×108 個該等細胞或約該數目之該等細胞。 19.  如實施例1至18中任一項之方法，其中： 該輸入組合物包含每個該等細胞至少1個或約1個感染單位(IU)之病毒粒子、每個該等細胞至少2個或約2個IU、每個該等細胞至少3個或約3個IU、每個該等細胞至少4個或約4個IU、每個該等細胞至少5個或約5個IU、每個該等細胞至少10個或約10個IU、每個該等細胞至少20個或約20個IU、每個該等細胞至少30個或約30個IU、每個該等細胞至少40個或約40個IU、每個該等細胞至少50個或約50個IU或每個該等細胞至少60個或約60個IU；或 該輸入組合物包含每個該等細胞1個或約1個感染單位(IU)之病毒粒子、每個該等細胞2個或約2個IU、每個該等細胞3個或約3個IU、每個該等細胞4個或約4個IU、每個該等細胞5個或約5個IU、每個該等細胞10個或約10個IU、每個該等細胞20個或約20個IU、每個該等細胞30個或約30個IU、每個該等細胞40個或約40個IU、每個該等細胞50個或約50個IU或每個該等細胞60個或約60個IU。 20.  如實施例1至19中任一項之方法，其中： 在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大總液體體積為該空穴中該等細胞之總體積的不超過2倍、不超過10倍或不超過100倍，或該輸入組合物經該培育過程之平均體積為該空穴中細胞總體積之不超過2、10或100倍。 21.  如實施例1至20中任一項之方法，其中在該培育期間之任一時間存在於該空穴中之該輸入組合物的最大體積或經該培育過程之平均體積為在該離心室以在該側壁之內表面及/或在表層該等細胞1000 g或約1000 g或2000 g或約2000 g之力旋轉期間在該空穴之內表面上形成的單層該等細胞之體積的不超過下列倍數或不超過約下列倍數：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。 22.  如實施例1至21中任一項之方法，其中該輸入組合物之液體體積不超過20 mL、不超過40 mL、不超過50 mL、不超過70 mL、不超過100 mL、不超過120 mL、不超過150 mL或不超過200 mL。 23.  如實施例1至22中任一項之方法，其中該輸入組合物在該培育之至少一部分期間佔該內部空穴之全部或基本上全部體積。 24.  如實施例1至23中任一項之方法，其中在該離心室中培育之至少一部分期間或在該離心室旋轉期間，該輸入組合物之液體體積僅佔該離心室之內部空穴體積之一部分，在該至少一部分期間或在該旋轉期間，該空穴之體積另外包含氣體，該氣體在該培育之前或期間經由該至少一個開口引入至該空穴中。 25.  如實施例24之方法，其中該離心室包含可移動構件，其中氣體引入至該離心室中實現該可移動構件之移動以增加該離心室之內部空穴的體積，藉此與該離心室中不存在氣體相比，減少在該離心室旋轉期間存在於該空穴中之該輸入組合物之每平方吋該空穴之內部表面積的總液體體積。 26.  一種轉導方法，其包含： a)向內部表面積為至少1×109 µm2 或約1×109 µm2 或至少1×1010 µm2 或約1×1010 µm2 之離心室的內部空穴提供： i)包含細胞及包含重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，其中： 該輸入組合物中之細胞數目為至少1×107 個細胞，及 該等病毒粒子以每個該等細胞至少1個或約1個感染單位(IU)存在於該輸入組合物中，及 該輸入組合物之液體體積小於該離心室之內部空穴的最大體積；及 ii)體積至多為該離心室之內部空穴之剩餘最大體積的氣體；及 b)培育該輸入組合物，其中該培育之至少一部分在該離心室之該內部空穴中進行，同時實現該離心室之旋轉；及 其中該方法產生包含複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物。 27.  如實施例26之方法，其中： 該細胞數目為至少50×106 個細胞或約50×106 個細胞；至少100×106 個細胞或約100×106 個細胞；或至少200×106 個細胞或約200×106 個細胞；及/或 該等病毒粒子以至少每個細胞1.6個IU、每個細胞1.8個IU、每個細胞2.0個IU、每個細胞2.4個IU、每個細胞2.8個IU、每個細胞3.2個IU或每個細胞3.6個IU、每個細胞4.0個IU、每個細胞5.0個IU、每個細胞6.0個IU、每個細胞7.0個IU、每個細胞8.0個IU、每個細胞9.0個IU或每個細胞10.0個IU存在。 28.  如實施例26或實施例27之方法，其中： 該輸入組合物之液體體積小於或等於200 mL、小於或等於100 mL、小於或等於50 mL、或小於或等於20 mL；及/或 該輸入組合物之液體體積為在旋轉期間該空穴之內部表面積或該空穴之最大內部表面積之體積的不超過50%、不超過40%、不超過30%、不超過20%或不超過10%。 29.  如實施例26至28中任一項之方法，其中該氣體體積為至多200 mL、至多180 mL、至多140 mL或至多100 mL。 30.  如實施例26至29中任一項之方法，其中該旋轉為在該空穴之側壁內表面或在表層該等細胞之至少或至少約下列的相對離心力：600 g、800 g、1000 g、1100 g、1500 g、1600 g、2000 g、2400 g、2600 g、2800 g、3000 g、3200 g或3600 g。 31.  一種轉導方法，其包含培育包含細胞及包含重組病毒載體之病毒粒子的輸入組合物，該培育之至少一部分在旋轉條件下進行，藉此產生包含複數個轉導有該病毒載體之細胞的輸出組合物，其中： 該輸入組合物之體積大於或約為20 mL、50 mL、至少100 mL或至少150 mL及/或該輸入組合物包含至少1×108 個細胞；及 該等旋轉條件包含在表層該等細胞大於約800 g或大於約1000 g或大於約1500 g之相對離心力。 32.  如實施例31之方法，其中： 該輸出組合物中至少25%或至少50%之該等細胞轉導有該病毒載體；及/或 該輸出組合物中至少25%或至少50%之該等細胞表現該病毒載體內所包含之異源核酸的產物。 33.  如實施例31或實施例32之方法，其中該培育在離心室之空穴中進行，且該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在該旋轉期間在該空穴之內表面上形成單層或雙層之該等細胞的數目。 34.  如實施例33之方法，其中該離心室包括端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許流體引入至該內部空穴中及流體自該空穴壓出。 35.  如實施例34之方法，其中該離心室另外包含可移動構件且該內部空穴為具有由該端壁、該基本上固定側壁及該可移動構件界定之可變體積的空穴，該可移動構件能夠在該離心室內移動以改變該空穴之內部體積。 36.  如實施例1至30或33至35中任一項之方法，其中該空穴中之該輸入組合物在該培育之至少一部分期間包含至少20 mL或至少50 mL之液體體積及每平方公分該空穴之內部表面積一百萬個或約一百萬個細胞。 37.  如實施例1至36中任一項之方法，其中該培育之另一部分在該離心室外及/或在無旋轉之情況下進行，該另一部分在於該離心室中及/或在旋轉下進行至少一部分之後進行。 38.  如實施例1至37中任一項之方法，其中該培育之至少一部分在該離心室之該空穴中進行及/或該培育之另一部分在37℃±2℃或約37℃±2℃下實現。 39.  如實施例37或實施例38之方法，其中該培育另外包含在該培育期間將至少複數個該等細胞轉移至容器中且該培育之該另一部分在該容器中實現。 40.  如實施例39之方法，其中該轉移在封閉系統內進行，其中該離心室及容器與該封閉系統為一體的。 41.  如實施例37至40中任一項之方法，其中： 該培育進行一段介於下列之時間：1小時或約1小時至96小時或約96小時、4小時或約4小時至72小時或約72小時、8小時或約8小時至48小時或約48小時、12小時或約12小時至36小時或約36小時、6小時或約6小時至24小時或約24小時、36小時或約36小時至96小時或約96小時，包括端點本數；或 該培育之該另一部分進行一段下列時間：1小時或約1小時至96小時或約96小時、4小時或約4小時至72小時或約72小時、8小時或約8小時至48小時或約48小時、12小時或約12小時至36小時或約36小時、6小時或約6小時至24小時或約24小時、36小時或約36小時至96小時或約96小時，包括端點本數。 42.  如實施例37至41中任一項之方法，其中： 該培育進行一段不超過48小時、不超過36小時或不超過24小時之時間；或 該培育之該另一部分進行一段不超過48小時、不超過36小時或不超過24小時之時間。 43.  如實施例37至41中任一項之方法，其中： 該培育在刺激劑存在下進行；及/或 該培育之該另一部分在刺激劑存在下進行。 44.  如實施例37至41中任一項之方法，其中： 該培育進行一段不超過24小時之時間； 該組合物中之該等細胞尚未經受大於30℃之溫度超過24小時；及/或 該培育並非在刺激劑存在下進行。 45.  如實施例43或實施例44之方法，其中該刺激劑為能夠誘導T細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞增殖之藥劑。 46.  如實施例43至45中任一項之方法，其中該刺激劑為選自IL-2、IL-15及IL-7之細胞激素。 47.  如實施例1至46中任一項之方法，其中含有轉導細胞之該輸出組合物包含至少1×107 個細胞或約該數目之細胞，或至少5×107 個細胞或約該數目之細胞。 48.  如實施例47之方法，其中含有轉導細胞之該輸出組合物包含至少1×108 個細胞或約該數目之細胞、2×108 個細胞或約該數目之細胞、4×108 個細胞或約該數目之細胞、6×108 個細胞或約該數目之細胞、8×108 個細胞或約該數目之細胞或1×109 個細胞或約該數目之細胞。 49.  如實施例47或實施例48之方法，其中該等細胞為T細胞。 50.  如實施例49之方法，其中該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD4+ T細胞及/或經分離CD8+ T細胞。 51.  如實施例1至50中任一項之方法，其中該方法使得該病毒載體整合於該至少複數個細胞中之一或多者的宿主基因體中及/或整合於該輸出組合物中至少20%或約20%、或至少30%或約30%，或至少40%或約40%之該等細胞的宿主基因體中。 52.  如實施例1至51中任一項之方法，其中： 該輸入組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞藉由該方法轉導有該病毒載體；及/或 該輸出組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有該病毒載體；及/或 該輸出組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞表現該病毒載體內所包含之異源核酸的產物。 53.  如實施例1至52中任一項之方法，其中對於以每個細胞約1或約2個IU之比率包含病毒之輸入組合物，該方法能夠產生以下輸出組合物，其中藉由該方法產生之該輸出組合物中至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞包含該重組病毒載體及/或表現該載體內所包含之重組核酸的產物。 54.  如實施例1至53中任一項之方法，其中： 在含有該重組病毒載體或該病毒載體整合於其中之該輸出組合物中的所有該等細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過約5、不超過約2.5或不超過約1.5；或 在該輸出組合物中之該等細胞當中，該載體之平均複本數不超過約2、不超過約1.5或不超過約1。 55.  如實施例1至30及33至54中任一項之方法，其中該離心室與封閉系統為一體的，該封閉系統包括該離心室及經由至少一個連接器可操作地連接於該至少一個開口的至少一個管線，藉此允許液體及氣體在該系統之至少一個組態中在該空穴與該至少一個管線之間移動。 56.  如實施例55之方法，其中： 該至少一個管線包含一系列管線； 該至少一個連接器包含複數個連接器；及 該封閉系統另外包含可操作地連接於該一系列管線之至少一個容器，該連接允許液體及/或氣體經由該一系列管線在該至少一個容器與該至少一個開口之間通過。 57.  如實施例55或56之方法，其中該至少一個連接器包含選自由閥、魯爾端口及長釘組成之群之連接器。 58.  如實施例55至57中任一項之方法，其中該至少一個連接器包含旋轉閥。 59.  如實施例58之方法，其中該旋轉閥為活栓或多旋轉端口。 60.  如實施例55至59中任一項之方法，其中該至少一個連接器包含無菌連接器。 61.  如實施例56至60中任一項之方法，其中該至少一個容器包含選自由袋包、小瓶及注射器組成之群之容器。 62.  如實施例56至61中任一項之方法，其中該至少一個容器包含稀釋劑容器、廢料容器、產物收集容器及/或輸入產物容器。 63.  如實施例56至62中任一項之方法，其中： 該至少一個容器包含至少一個包含該等病毒載體粒子及該等細胞之輸入容器、廢料容器、產物容器及至少一個稀釋劑容器，其各經由該一系列管線及該至少一個開口連接至該空穴。 64.  如實施例63之方法，其中該方法另外包含在該培育之前及/或期間，實現該輸入組合物引入至該空穴中，該引入包含液體自該至少一個輸入容器經由該至少一個開口流入該空穴中。 65.  如實施例56至64中任一項之方法，其中至少一個容器另外包含在該培育期間之至少一個點之前及/或期間包含氣體的容器，及/或該封閉系統另外包含能夠將氣體引入至該離心室之內部空穴中之微生物過濾器及/或該封閉系統含有用於實現氣體引入之注射器端口。 66.  如實施例65之方法，其中該方法包含在該培育之前及/或期間，提供或實現氣體在無菌條件下引入至該空穴中，該引入藉由(a)來自包含氣體之容器之氣體的流動、(b)來自該封閉系統之外部環境經過該微生物過濾器之氣體的流動、或(c)來自連接至該系統之注射器在該注射器端口處之氣體的流動來實現。 67.  如實施例66之方法，其中實現該氣體引入至該離心室之內部空穴中與實現該輸入組合物引入至該離心室之內部空穴中同時或一起進行。 68.  如實施例66或實施例67之方法，其中該輸入組合物與氣體在該輸入組合物及氣體引入至該離心室之內部空穴中之前在該離心室外之無菌條件下合併在單一個容器中。 69.  如實施例68之方法，其中實現該氣體引入與實現該輸入組合物引入至該空穴中同時或依次分開進行。 70.  如實施例66至69中任一項之方法，其中該氣體引入藉由允許或引起來自包含該氣體之無菌封閉容器、來自外部環境且穿過微生物過濾器或來自包含該氣體之注射器之該氣體的流動來實現。 71.  如實施例24至70中任一項之方法，其中該氣體為空氣。 72.  如實施例1至71中任一項之方法，其中該培育為連續過程之一部分，該方法另外包含： 在該培育之至少一部分期間，在該離心室旋轉期間實現該輸入組合物連續引入至該空穴中；及 在該培育之一部分期間，在該離心室旋轉期間實現液體經由該至少一個開口自該空穴連續壓出。 73.  如實施例72之方法，其另外包含： 在該培育之一部分期間，在該離心室之旋轉期間實現氣體連續引入至該空穴中；及/或 在該培育之一部分期間，實現氣體自該空穴連續壓出。 74.  如實施例73之方法，其中該方法包含自該空穴壓出液體及壓出氣體，其中各同時或依次壓出至不同容器中。 75.  如實施例72至74中任一項之方法，其中該連續引入及該連續壓出之至少一部分同時進行。 76.  如實施例1至75中任一項之方法，其中該培育為半連續過程之一部分，該方法另外包含： 在該培育之前，實現該輸入組合物及視情況存在之氣體經由該至少一個開口引入至該空穴中； 在該培育之後，實現液體及/或視情況存在之氣體自該空穴壓出； 實現包含細胞及含有重組病毒載體之該等病毒粒子及視情況存在之氣體的另一輸入組合物引入至該內部空穴中；及 在該內部空穴中培育該另一輸入組合物， 其中該方法產生包含複數個轉導有該病毒載體之該另一輸入組合物之細胞的另一輸出組合物。 77.  如實施例64至76中任一項之方法，其中該提供或該引入該輸入組合物至該空穴中包含： 引入包含該等細胞及含有該重組病毒載體之該等病毒粒子的單一個組合物；或 引入包含該等細胞之組合物及包含含有該重組病毒載體之該等病毒粒子的另一組合物，藉此混合該等組合物，實現該輸入組合物之引入。 78.  如實施例64至77之方法，其中該方法另外包含： 在該培育之前及/或期間實現該離心室之旋轉； 在該培育之後實現液體自該空穴壓出至該廢料容器中； 實現液體自該至少一個稀釋劑容器經由該至少一個開口壓出至該空穴中及實現該空穴之內含物的混合；及 實現液體自該空穴壓出至該產物容器中，藉此將轉導有該病毒載體之細胞轉移至該產物容器中。 79.  如實施例1至78中任一項之方法，其另外包含： (a)在該培育之前，在離心室之內部空穴中洗滌包含該等細胞之生物樣品；及/或 (b)自生物樣品分離該等細胞，其中該分離步驟之至少一部分在該培育之前在離心室之內部空穴中進行；及/或 (c)在該培育之前及/或期間刺激細胞，該刺激包含使該等細胞暴露於刺激條件，藉此誘導該輸入組合物之細胞增殖，其中該刺激細胞步驟之至少一部分在離心室之內部空穴中進行。 80.  如實施例79之方法，其中該分離包含進行基於免疫親和力之選擇。 81.  如實施例79或80之方法，其中該等刺激條件包含存在能夠活化TCR複合物之一或多種組分的一或多個細胞內信號傳導結構域之藥劑。 82.  如實施例81之方法，其中該藥劑包含特異性結合至TCR複合物成員之初級藥劑及特異性結合至T細胞協同刺激分子之二級藥劑。 83.  如實施例82之方法，其中該初級藥劑特異性結合至CD3；及/或 該協同刺激分子係選自由CD28、CD137 (4-1-BB)、OX40或ICOS組成之群。 84.  如實施例83之方法，其中該等初級藥劑及二級藥劑包含抗體及/或存在於固體支撐物之表面上。 85.  如實施例79至84中任一項之方法，其中(a)及/或(b)中之該生物樣品為或包含全血樣品、白血球層樣品、周邊血液單核細胞(PBMC)樣品、未分離T細胞樣品、淋巴球樣品、白血球樣品、清除術產物或白血球清除術產物。 86.  如實施例1至85中任一項之方法，其另外包含在離心室之內部空穴中將藉由該方法轉導之細胞調配於醫藥學上可接受之緩衝液中，藉此產生調配組合物。 87.  如實施例86之方法，其另外包含實現該調配組合物壓出至一個或複數個容器中。 88.  如實施例87之方法，其中實現該調配組合物之壓出包含實現以單一個單位劑量存在之許多該等細胞壓出至該一個或複數個容器中之一者或每一者中。 89.  如實施例79至88中任一項之方法，其中該離心室之空穴中之每一者與用於一或多個其他步驟及/或用於培育及/或旋轉含有細胞及病毒粒子之輸入組合物的離心空穴相同或不同。 90.  如實施例79至89中任一項之方法，其中該等離心室中之每一者與封閉系統為一體的，該封閉系統包含該離心室及經由至少一個連接器可操作地連接於該至少一個開口的至少一個管線，藉此允許液體及氣體在該系統之至少一個組態中在該空穴與該至少一個管線之間移動。 91.  如實施例1至90中任一項之方法，其中該輸入組合物中之該等細胞為初級細胞。 92.  如實施例1至91中任一項之方法，其中： 該輸入組合物中之該等細胞包含懸浮細胞； 該輸入組合物中之該等細胞包含白血球；及/或 該輸入組合物中之該等細胞包含T細胞或NK細胞。 93.  如實施例1至92中任一項之方法，其中該輸入組合物中之該等細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 94.  如實施例1至93中任一項之方法，其中該輸入組合物中之該等細胞為人類細胞。 95.  如實施例7至94中任一項之方法，其中在該培育期間，該離心室與感測器及控制電路聯合，該感測器能夠監測該可移動構件之位置，該電路能夠接收來自該感測器之資訊及傳輸資訊至該感測器及引起該可移動構件之移動，該控制電路與能夠在該培育期間引起該離心室之旋轉的離心機進一步聯合。 96.  如實施例7至95中任一項之方法，其中該離心室包含該可移動構件且在該培育期間，該離心室位於離心機內並與感測器及控制電路聯合，該感測器能夠監測該可移動構件之位置，該控制電路能夠接收及傳輸來自該感測器之資訊且引起該可移動構件移動、經由該一或多個管線引入液體至該空穴及自該空穴壓出液體及經由該離心機旋轉該離心室。 97.  如實施例95或實施例96之方法，其中該離心室、該控制電路、該離心機及該感測器在該培育期間容納在機櫃內。 98.  如實施例1至97中任一項之方法，其中該重組病毒載體編碼重組受體，該重組受體藉此藉由該輸出組合物之細胞表現。 99.  如實施例98之方法，其中該重組受體為重組抗原受體。 100. 如實施例99之方法，其中該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。 101. 如實施例100之方法，其中該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。 102. 如實施例99之方法，其中該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 103. 如實施例99之方法，其中該重組受體為包含特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。 104. 如實施例1至103中任一項之方法，其中： 該等細胞包含自人類個體獲得之初級人類T細胞；及 在該培育之前及/或在該轉導完成之前及/或若該方法包括調配，在該調配物之前，該等初級人類T細胞尚未在大於30℃之溫度下存在於該個體外大於1小時、大於6小時、大於24小時或大於48小時；或 在該培育之前及/或在該轉導完成之前及/或若該方法包括調配，在該調配物之前，該等初級人類T細胞尚未在特異性針對CD3之抗體及/或特異性針對CD28之抗體及/或細胞激素之存在下培育大於1小時、大於6小時、大於24小時或大於48小時。 105. 一種用於選擇之方法，該方法包含： (a)在離心室之內部空穴中在混合條件下培育選擇試劑及初級細胞，藉此複數個該等初級細胞結合至該選擇試劑；及 (b)基於與該選擇試劑之結合，使該複數個該等初級細胞與另外一或多種初級細胞分離， 藉此基於與該選擇試劑之結合富集該等初級細胞， 其中該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且該內部空穴之最大體積為至少50 mL、至少100 mL或至少200 mL。 106. 一種用於刺激細胞之方法，該方法包含在一定條件下培育刺激劑及初級細胞，藉此使該刺激劑結合至由複數個該等初級細胞表現之分子且活化或刺激該複數個該等細胞，其中 該培育之至少一部分在離心室之內部空穴中在混合條件下進行， 該離心室可圍繞旋轉軸旋轉；及 該內部空穴的最大體積為至少50 mL、至少100 mL或至少200 mL。 107. 如實施例105或實施例106之方法，其中該離心室另外包含端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。 108. 一種組合物，其包含藉由如實施例1至107中任一項之方法產生的轉導細胞。 109. 如請求項108之組合物，其中該等細胞： 為初級細胞；及/或 為人類細胞；及/或 包含白血球；及/或 包含T細胞；及/或 包含NK細胞。 110. 如實施例108或實施例109之組合物，其中該組合物包含至少5×107 個細胞或約該數目之細胞、1×108 個細胞或約該數目之細胞、2×108 個細胞或約該數目之細胞、4×108 個細胞或約該數目之細胞、6×108 個細胞或約該數目之細胞、8×108 個細胞或約該數目之細胞或1×109 個細胞或約該數目之細胞。 111. 如實施例106至110中任一項之組合物，其中該組合物包含治療有效數目之適用於授受T細胞療法的細胞。 112. 如實施例106至111中任一項之組合物，其中： 該等細胞為T細胞；及 在轉導之後，該組合物中之該等細胞並未在刺激劑存在下進行細胞擴增及/或該等細胞並未在大於30℃之溫度下培育超過24小時，或該組合物不含細胞激素或該組合物不含特異性結合至CD3或TCR複合物的刺激劑。 113. 一種組合物，其包含至少1×107 個或至少5×107 個T細胞，其中至少複數個轉導有重組病毒載體或表現重組或經工程改造之抗原受體，其中： 在轉導之後，該組合物中之該等細胞尚未在刺激劑存在下進行細胞擴增；及/或 在轉導之後，該等細胞尚未在大於30℃之溫度下培育超過24小時。 114. 一種組合物，其包含至少1×107 個或至少5×107 個初級人類T細胞，其中至少複數個轉導有重組病毒載體或表現重組或經工程改造之抗原受體，其中該組合物中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之該等T細胞包含CD69及/或TGF-β-II之高表現。 115. 如實施例114之組合物，其中該組合物中該至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之該等T細胞不包含CD62L之表面表現及/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8及/或IL-2之高表現。 116. 如實施例113至115中任一項之組合物，其中該組合物包含至少1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞。 117. 如實施例109至116中任一項之組合物，其中該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 118. 如實施例108至117中任一項之組合物，其中該組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有該病毒載體。 119. 如實施例108至118中任一項之組合物，其中： 該病毒載體編碼重組受體；及 該組合物中之轉導細胞表現該重組受體。 120. 如實施例119之組合物，其中該重組受體為重組抗原受體。 121. 如實施例120之組合物，其中該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。 122. 如實施例121之組合物，其中該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。 123. 如實施例119至122中任一項之組合物，其中該重組受體為包含特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。 124. 如實施例120之組合物，其中該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 125. 如實施例110至124中任一項之組合物，其中： 在該組合物中之所有細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2；或 在該組合物中轉導有該重組病毒載體之細胞當中，該載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2。 126. 如請求項110至125中任一項之組合物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑。 127. 一種製品，其包含一個容器或複數個容器，該容器或該複數個容器共同含有如實施例113至126中任一項之組合物。 128. 如實施例127之製品，其中該容器或複數個容器包含兩個或兩個以上或三個或三個以上袋包且該組合物另外包含醫藥學上可接受之賦形劑。 129. 一種治療方法，該方法包含向患有疾病或病狀之個體投與如實施例110至126中任一項之組合物。 130. 如實施例129之方法，其中該組合物中之轉導T細胞與以下組合物中之轉導T細胞相比在該個體體內展現增加或較長擴增及/或持久性，其中在轉導之後，該組合物中之細胞已在刺激劑存在下進行細胞擴增及/或該等細胞已在大於30℃之溫度下培育超過24小時。 131. 如實施例129或實施例130之方法，其中該重組受體、嵌合抗原受體或轉殖基因TCR特異性結合至與該疾病或病狀相關聯之抗原。 132. 如實施例129至131中任一項之方法，其中該疾病或病狀為癌症及自體免疫疾病或病症、或感染性疾病。 133. 一種組合物，其包含： 至少1×107 個細胞；及 每個細胞至少1個或約1個感染單位(IU)之含有重組病毒載體之病毒粒子。 134. 如請求項133之組合物，其中： 該等細胞包含至少或約50×106 個細胞；100×106 個細胞；或200×106 個細胞；及/或 該等病毒粒子以至少每個細胞1.6個IU、每個細胞1.8個IU、每個細胞2.0個IU、每個細胞2.4個IU、每個細胞2.8個IU、每個細胞3.2個IU、每個細胞3.6個IU、每個細胞4.0個IU、每個細胞5.0個IU、每個細胞6.0個IU、每個細胞7.0個IU、每個細胞8.0個IU、每個細胞9.0個IU或每個細胞10.0個IU的量存在於該組合物中。 135. 如實施例133或實施例134之組合物，其中該組合物之液體體積小於或等於220 mL、小於或等於200 mL、小於或等於100 mL、小於或等於50 mL、或小於或等於20 mL。 136. 如實施例133至135中任一項之組合物，其中該等細胞為初級細胞。 137. 如實施例133至136中任一項之組合物，其中該等細胞為人類細胞。 138. 如實施例133至137中任一項之組合物，其中： 該等細胞包含懸浮細胞； 該等細胞包含白血球；及/或 該等細胞包含T細胞或NK細胞。 139. 如實施例138之組合物，其中該等細胞為T細胞且該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 140. 如實施例133至139中任一項之組合物，其中該病毒載體編碼重組受體。 141. 如實施例140之組合物，其中該重組受體為重組抗原受體。 142. 如實施例141之組合物，其中該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。 143. 如實施例142之組合物，其中該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。 144. 如實施例140至143中任一項之組合物，其中該重組受體為包含特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。 145. 如實施例141之組合物，其中該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 146. 一種可圍繞旋轉軸旋轉之離心室，該離心室包含具有如實施例110至126中任一項之組合物的內部空穴。 147. 一種可圍繞旋轉軸旋轉之離心室，該離心室包含具有以下之內部空穴：(a)含有至少5×107 個轉導有重組病毒載體之初級T細胞的組合物及/或(b)含有至少5×107 個初級T細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子的組合物。 148. 如實施例146或147之離心室，該離心室另外包含端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。 149. 如實施例147或148之離心室，其中該空穴中之該組合物包含至少1×108 個細胞、2×108 個細胞、4×108 個細胞、6×108 個細胞、8×108 個細胞或1×109 個細胞。 150. 如實施例147或實施例148之離心室，其中該等T細胞為未分離T細胞、經分離CD8+ T細胞或經分離CD4+ T細胞。 151. 如實施例147至150中任一項之離心室，其中該組合物中至少2.5%、至少5%、至少6%、至少8%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%或至少75%之該等細胞轉導有病毒載體。 152. 如實施例147至151中任一項之離心室，其中： 該病毒載體編碼重組受體；及 該組合物中之細胞表現該重組受體。 153. 如實施例151之離心室，其中該重組受體為重組抗原受體。 154. 如實施例153之離心室，其中該重組抗原受體為功能性非T細胞受體。 155. 如實施例154之離心室，其中該功能性非T細胞受體為嵌合抗原受體(CAR)。 156. 如實施例151至155中任一項之離心室，其中該重組受體為包含特異性結合至配位體之細胞外部分及含有活化結構域及協同刺激結構域之細胞內信號傳導部分的嵌合受體。 157. 如實施例153之離心室，其中該重組抗原受體為轉殖基因T細胞受體(TCR)。 158. 如實施例147至157中任一項之離心室，其中： 在該組合物中之所有細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2；或 在該組合物中轉導有該重組病毒載體之細胞當中，該載體之平均複本數不超過約10、不超過8、不超過6、不超過4或不超過約2。 159. 一種可圍繞旋轉軸旋轉之離心室，該離心室包含具有如實施例133至145中任一項之組合物的內部空穴。 160. 如實施例159之離心室，其另外包含至多該離心室之內部空穴最大體積的氣體體積。 161. 如實施例160之離心室，其中該氣體為空氣。 162. 如實施例146至161中任一項之離心室，該離心室可圍繞旋轉軸旋轉且包含端壁、自該端壁延伸之基本上固定側壁及至少一個開口，其中該側壁之至少一部分包圍該內部空穴且該至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出。 163. 如實施例146至162中任一項之離心室，其中該側壁為曲線形。 164. 如實施例163之離心室，其中該側壁為大體上圓柱形。 165. 如實施例162至164中任一項之離心室，其中 該至少一個開口包含分別能夠允許該引入及壓出之入口及出口；或 該至少一個開口包含能夠允許該引入及該壓出之單一個入口/出口。 166. 如實施例162至165中任一項之離心室，其中該至少一個開口與該離心室同軸且位於該端壁中。 167. 如實施例162至166中任一項之離心室，其中該離心室另外包含可移動構件且該內部空穴為具有由該端壁、該基本上固定側壁及該可移動構件界定之可變體積的空穴，該可移動構件能夠在該離心室內移動以改變該空穴之內部體積。 168. 如實施例之167離心室，其中： 該可移動構件為活塞；及/或 該可移動構件能夠在該離心室內軸向移動以改變該空穴之內部體積。 169. 如實施例162至168中任一項之離心室，其中： 該空穴之內部表面積為至少1×109 µm2 或約該數值； 該空穴之內部表面積為至少1×1010 µm2 或約該數值； 該固定壁在自該端壁延伸之方向的長度為至少約5 cm； 該固定壁在自該端壁延伸之方向的長度為至少約8 cm；及/或 該空穴在至少一個截面之半徑為至少約2 cm。 170. 如實施例159至169中任一項之離心室，其中存在於該空穴中之該組合物的液體體積以每平方吋該空穴之內部表面積計係介於下列數值之間或介於約下列數值之間：0.5 mL (毫升/平方吋)至5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、0.5毫升/平方吋至1毫升/平方吋、1毫升/平方吋至5毫升/平方吋、1毫升/平方吋至2.5毫升/平方吋、或2.5毫升/平方吋至5毫升/平方吋。 171. 如實施例159至169中任一項之離心室，其中存在於該空穴中之該組合物的液體體積為至少0.5毫升/平方吋、1毫升/平方吋、2.5毫升/平方吋或5毫升/平方吋。 172. 一種封閉系統，其包含如實施例147至158及162至171中任一項之離心室。 173. 如實施例172之封閉系統，其另外包含可操作地連接至一個或複數個容器之多路歧管。 174. 一種封閉系統，其包含如實施例159至171中任一項之離心室。 175. 如實施例174之封閉系統，其另外包含無菌過濾器。 176. 如實施例172至175中任一項之封閉系統，其中該離心室能夠在至多8000 g之速度下旋轉，其中該離心室能夠承受至多500 g、600 g、1000 g、1100 g、1200 g、1400 g、1500 g、1600 g、2000 g、2500 g、3000 g或3200 g之力而無基本上屈服、彎曲或斷裂或以其他方式導致該離心室之損壞及/或同時在此類力下基本上保持大體上圓柱形。 177. 如實施例49之方法，其中該輸出組合物中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或80%或約該數目之該等T細胞包含CD69及/或TGF-β-II之高表現。 178. 如實施例177之方法，其中該組合物中該至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或80%之該等T細胞不包含CD62L之表面表現及/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8及/或IL-2之高表現。 179. 一種方法，其包含 洗滌初級人類細胞；及 使該等細胞在攪拌條件下與選擇試劑一起培育，藉此至少複數個該等人類細胞由該等選擇試劑特異性結合， 其中該洗滌及培育在封閉無菌系統內且至少部分在與該封閉無菌系統一體的離心室之內部空穴中進行。 180. 如請求項179之方法，其中該等方法步驟基於使用者關於該方法應起始之輸入以自動化方式進行，使得該等方法步驟完成。 181. 如實施例105、179或180之方法，其中該培育在混合條件下包含其至少一部分實現該離心室之旋轉。 182. 如實施例181之方法，其中其至少一部分實現旋轉包含在該培育期間之複數個時段實現旋轉，該複數個時段由一或多個靜止時段分開，在該一或多個靜止時段，該離心室不旋轉。 183. 如實施例182之方法，其中實現旋轉之該複數個時段中之一或多者或全部持續1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒或約該數目之時間，諸如1或2秒，及/或該一或多個靜止時段中之一或多者或全部持續3、4、5、6、7、8、9或10或15秒或約該數目之時間，諸如4、5、6或7秒。 184. 如實施例105或179至183中任一項之方法，其中該培育在混合條件下進行至少或大致10、15、20、30或45分鐘，諸如30分鐘或約30分鐘。實例 包括以下實例僅出於說明性目的且不意欲限制本發明之範疇。 實例 1 ： 在離心室中初級人類 T 細胞之病毒轉導 此實例展示用編碼嵌合抗原受體(CAR)之重組病毒載體轉導經分離之初級人類T細胞，其中根據本文所提供之實施例，轉導在基本上固定圓柱形離心室中在離心力下開始。T細胞經由陽性選擇自人類清除術產物樣品分離。 所得細胞使用抗CD3/CD28試劑活化。為開始轉導，將細胞在活化後與含有編碼抗CD19 CAR之病毒載體基因體的病毒粒子一起在各種條件下培育。 在一組條件(「Sepax」)下，藉由在Sepax® 2處理單元(Biosafe SA)中，在離心室(Biosafe SA, A200)之空穴中離心培育細胞來開始轉導。50 mL含有50×106 個經分離之細胞的液體組合物與50 mL含有病毒載體粒子之液體儲備液合併在300 mL轉移封裝中。使用Sepax®系統移動離心室活塞，將組合物引入至離心室之空穴中。亦引入100 mL空氣，藉此使空穴之體積增加至200 mL且使得空穴中之液體體積與空穴內部表面積之比率減小。離心室藉由在Sepax® 2單元斜升至大致4600 rpm之速度來旋轉，相當於在離心室之處理空穴內部側壁之大致600之相對公克力(相對離心力(RCF))。在此速度下旋轉之持續時間為60分鐘。 對於另一組條件(「VueLife」)，含有25×106 個細胞之組合物與相同的病毒載體粒子儲備液以1:1之體積比以50 mL培育在CI-50離心機配接器中之離心袋包中，且以在細胞上近似1000 g的估算相對離心力(RCF)旋轉60分鐘。使用與離心室相比具有較小體積之袋包，以便允許以在細胞上1000 g之相對離心力離心。對照物包括「未轉導之」樣品(相同細胞濃度在無病毒未離心的情況下於24孔盤中培育相同時間及「無旋轉」對照物(「0×g」)樣品(相同細胞/病毒濃度在未離心的情況下於相同盤中培育相同時間)。在每一組條件下，包括聚陽離子。在旋轉後(或類似的「無旋轉」培育)，組合物在37℃下培育24小時以完成轉導。 細胞擴增且在第6天分離後以表面表現所編碼之CAR的CD3+ T細胞(如使用特異性針對CAR之抗體藉由流動式細胞測量術偵測)的百分比形式計算相應條件中之每一者的轉導效率。結果展示於圖1A中。如所示，與在離心袋包(VueLife®)中及對照物相比，在藉由在離心室之空穴中在旋轉下培育細胞開始轉導後觀測到更大的轉導效率。圖1B展示經六天時間之細胞擴增(如由群體倍增數目所指示)。 實例 2 ： 在離心室中在不同的液體體積與表面積之比率下初級人類 T 細胞之轉導 使用相同數目之細胞及病毒感染單位及不同的液體體積與離心室空穴之內部表面積的比率，在各種條件下評定在離心室中開始轉導後的轉導效率。細胞一般如實例1中所述製備且刺激。全部轉導開始條件使用2:1之IU:細胞比率及100×106 個細胞總數。 對於第一樣品(「5.1mL/sq.in.」係指每平方吋此條件中所用之內部空穴表面5.1 :1 mL液體)，含100×106 個細胞之100 mL液體體積與100 mL含有病毒載體粒子之液體組合物合併。對於第二樣品(「2.5毫升/平方吋」係指每平方吋此條件中所用之空穴表面2.5 mL液體)，50 mL具有相同數目細胞之液體組合物與50 mL含有病毒載體粒子之液體組合物合併。在每種情況下，包括聚陽離子，在離心期間之最終濃度為10 μg/mL。將相應的液體組合物(及對於第二樣品，100 mL空氣)吸入至離心室容納液體之空穴中且培育。在每種情況下，離心室在Sepax® 2處理單元中(藉由斜升)以大致4600 rpm (相當於在內部空穴側壁之大致600 g的RCF)旋轉60分鐘。樣品接著在37度下再培育24小時以完成轉導。 細胞擴增且在第6天分離後，藉由確定表面表現CAR之CD3+ T細胞(如上所述偵測)的百分比來計算轉導效率。結果展示於圖2中。如所示，對於在離心室中使用相同數目之細胞及病毒感染單位開始轉導，當使用較低的空穴中組合物之液體體積與空穴內部表面積之比率時，觀測到更大轉導效率。實例 3 ： 在離心室中初級人類 T 細胞之轉導 另一研究比較在各種條件下之轉導效率，包括根據所提供之方法的實施例，使用各種液體體積與空穴表面積之比率在離心室中轉導。人類T細胞如上所述自清除術產物分離並加以刺激。 在刺激後，將80×106 個細胞培育在不同條件下，包括用編碼CAR之病毒載體轉導。聚陽離子包括在全部樣品中。 關於在離心室中開始轉導的條件，80×106 個細胞與含有載體之病毒一起在離心室之空穴中以每個細胞2個IU病毒之比率培育。在使用Sepax® 2處理系統以在空穴內部側壁大致600 g之RCF使離心室離心60分鐘時進行培育。在一組條件(「Sepax (0.1 IU/細胞/毫升)」，每平方吋內部空穴表面0.5 mL液體體積)下，對於離心，將細胞及病毒以20 mL總液體體積引入至離心室空穴中；亦將180 mL空氣引入至空穴中。在另一組條件(「Sepax (0.01 IU/細胞/毫升)」，每平方吋內部空穴表面5.1 mL液體體積)下，將相同數目之細胞及病毒感染單位以200 mL液體體積引入。 在各別條件下，在24孔盤中在病毒(2 IU/細胞)存在下，藉由以在細胞上大致1000 g之RCF離心60分鐘開始細胞轉導(「在盤中1000 g」)。亦使用「未轉導之」陰性對照物(在24孔盤中在無病毒或離心之情況下培育)及「無旋轉」對照物(以每個細胞2個感染單位(IU)之比率與病毒一起在無離心之情況下於相同24孔盤中培育)。細胞在37℃下培育24小時以完成轉導。 如實例1及2中所述，細胞擴增且以表面表現CAR之CD3+ 細胞的百分比形式計算各樣品的轉導效率。結果展示於圖3中。如所示，與對照條件相比，在離心室中及在24孔盤中在旋轉下開始轉導後觀測轉導。對於在離心室中開始轉導，在較低的液體體積與離心室空穴內部表面積之比率下觀測到更大轉導效率。實例 4 ： 在離心室中轉導後評定載體複本數 (VCN) 在實例3中所述之研究中，在某些條件下開始轉導後評定經整合之病毒載體的複本數(VCN)。藉由即時定量PCR (RT-qPCR)測定來源於SGF之反轉錄病毒載體之每個細胞的VCN。藉由特異性針對病毒基因體之qPCR測定在轉導後組合物之全部細胞當中(「VCN/細胞」)及單獨分開在轉導細胞(表現轉殖基因之細胞)當中(「VCN/CAR+ 」)的平均VCN。結果呈現於圖4中。在圖4所示之圖形中，標註「Sepax 20」係指在開始轉導期間20 mL液體體積用於離心室空穴；如此標註之結果來自同一研究且條件在實例3中標註為「Sepax (0.1 IU/細胞/毫升)」(其轉導效率測定為25%)。類似地，標註「Sepax 200」係指在開始轉導期間200 mL液體體積用於離心室空穴；如此標註之結果來自同一研究且條件在實例3中標註為「Sepax (0.01 IU/細胞/毫升)」(其轉導效率測定為7%)。如所示，當藉由在基本上固定的圓柱形離心室中在旋轉下開始細胞轉導來開始轉導時，轉導效率的增加與載體複本數的增加無關聯。在此研究中，使轉導效率增加的條件亦使得每個細胞的平均載體複本數降低。實例 5 ：使用 Sepax® 2 處理系統轉導 在一個例示性過程中，T細胞在與單次使用系統及Sepax® 2處理系統(Biosafe SA)一體的離心室中以自動化方式用病毒載體粒子轉導。離心室與無菌拋棄式封閉系統一體，該系統為由Biosafe SA出售的適用於再生醫學的單次使用處理套組。該套組經組態以包括將離心室連接至一系列容器的一系列管線，其中通用組態展示於圖5及/或圖7中。離心室(1 )包括具有入口/出口開口(6 )之端壁(13 )、固定側壁(14 )及活塞(2 )，其共同界定該離心室之內部空穴(7 )。該系統經組態以包括各種容器，該等容器標記為：輸出袋包、廢料袋包、輸入袋包及兩個稀釋劑袋包(稀釋劑袋包1及稀釋劑袋包2)；及各種連接器，包括活栓及閥。包括夾具(5 )以用於阻斷經由管線在該系統之不同部分之間的流動。在一些實施例中，該系統包括公魯爾鎖無菌過濾器(15 )與母魯爾鎖封蓋(16 )，當該封蓋釋放/移除時，氣體(例如空氣)可經由其以無菌方式吸入。該系統與Sepax® 2處理單元關聯置放，包括離心機及外殼組件之機櫃。 在該例示性過程中，輸入袋包含有包含待轉導細胞之組合物。稀釋劑袋包1含有病毒載體粒子、聚陽離子及培養基。在一些實施例中，空氣與載體粒子一起包括於袋包中。舉例而言，在一替代性實施例中，具有空氣及/或額外培養基之容器可連接在此位置以替代及/或添加至病毒組合物。 使用者經由使用者介面指示處理單元將運行之新程序且將各種參數輸入至系統中，包括初始體積(在20-900 mL之間)、最終體積(在20-220 mL之間)、中間體積(在10-100 mL之間)、稀釋體積(在50-220 mL之間)、公克力(在100-1600 g之間或在200-3200 g之間) (在離心室之處理空穴的內部側壁的RCF))及沈降時間(在120與3600秒之間)。使用者指示系統該過程應開始，輸入細胞所來源之個體的鑑別資訊及指示系統輸入完成，其提示系統進行封閉系統套組之測試。 在全部相應活栓閥處於閉合位置之情況下，打開分別阻斷流體在管線與稀釋劑袋包1、廢料袋包、輸入袋包及輸出袋包(用於收集含有細胞之產物)之間移動的夾具且藉由與系統連通由使用者啟動自動化程序。 作為回應，系統以自動化方式藉由使得閥打開及關閉及移動活塞以改變空穴體積而使得液體及/或氣體在封閉系統之各組件之間移動。其使得活栓復位以允許在輸入袋包與離心室之內部空穴之間流動，經由入口/出口打開及使活塞在離心室內下降，藉此增加空穴之體積且將一定體積(使用者定義之初始體積)之細胞與病毒載體粒子之組合物自輸入袋包經由離心室端壁中之入口/出口抽至處理空穴。 系統提示離心機在500 g下旋轉離心室120秒，提示將空穴之20 mL體積吹掃至輸入袋包中以將其沖洗及將該體積抽回至空穴中。系統提示離心機在500 g下旋轉離心室180秒，從而引起沈降。系統使活栓復位以允許流體及/或氣體在空穴與廢料袋包之間流動且實現流體自空穴抽取至廢料袋包中，從而在空穴中保留使用者定義之中間體積。 系統使得活栓旋轉以阻斷流體在管與廢料袋包之間移動。系統使得含病毒載體粒子之液體組合物及(若適用)空氣(合起來在使用者定義之稀釋體積下)自稀釋劑袋包1引入至離心室之空穴。此等步驟共同實現含有待轉導細胞及病毒載體粒子之輸入組合物及(在一些情況中)空氣引入至空穴中。在一些實施例中，空穴之總體積為200 mL，例如包括200 mL液體體積或包括不到200 mL液體體積且剩餘空穴體積包括空氣。 在使用者定義之公克力下進行離心室離心，持續使用者定義之沈降時間，導致輸入組合物中之細胞開始經病毒載體粒子轉導。在一替代性實施例中，在離心之前，將一定體積的空氣及/或培養基自在稀釋劑袋包1及2之位置處的另一袋包引入至空穴中。在一替代性實施例中，空氣在離心之前經由魯爾鎖過濾器(15 )吸入，例如藉由使用者打開阻斷流體在過濾器(15 )與管線及空穴(7 )之間移動的夾具(5 )及釋放母封蓋(16 )，使得離心室中剩餘的空氣經由過濾器自環境通入。在一些實施例中，空氣之移動藉由系統而自動化，例如基於另外輸入至系統中之使用者定義之空氣輸入體積及使用者指示系統可引入定義之空氣體積的空氣。在一些實施例中，空氣(若存在)在離心後藉由類似程序釋放經過管線及未封蓋的過濾器(15 )。 當由系統提示時，使用者關閉阻斷流體在稀釋劑袋包1與管線之間移動的夾具且打開阻斷流體在稀釋劑袋包2與管線之間移動的夾具。系統藉由打開適當活栓閥使得流體自稀釋劑袋包2移動至處理空穴且移動活塞以將一定體積的流體自稀釋劑袋包2抽至空穴中，該體積等於使得離心室中之總液體體積等於使用者定義之最終體積所需的量。系統接著使得流體在空穴中混合60秒且隨後將內部空穴中之流體轉移至輸出袋包，該輸出袋包藉此含有已結合病毒粒子及/或感染有病毒載體之細胞的輸出組合物。此等細胞接著一般例如在37℃下培育例如24小時以完成轉導。實例 6 ： 在不同離心力下評定細胞生長及成活力 根據某些所提供之實施例，在用於引發細胞在離心室中轉導之離心期間，評定離心力對於細胞之作用。在暴露於不同離心力時，評定細胞擴增及細胞成活力。 T細胞基本上如實例1中所述分離且刺激。在第4天，將各種各自單獨含有細胞之樣品引入至Sepax® 2處理單元(Biosafe SA)中之離心室的空穴中且在各種離心力下進行離心。特定言之，使用Sepax® 2處理系統使樣品在與單次使用套組一體的離心室(A-200F)中分別在大致4600 rpm、大致6000 rpm及大致7400 rpm下旋轉60分鐘，其分別達到在空穴側壁內表面大致600 g、1000 g及1600 g之RCF。作為對照物，將細胞樣品單獨引入至離心空穴中，但未旋轉(0 g條件)。在每種情況下，在旋轉之後(或在無旋轉之情況下培育)，細胞在37℃、5% CO2 下培育至第10天。在整個過程中之不同點，監測細胞擴增(與第0天之細胞數目相比群體倍增)及成活力。特定言之，在第0天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天及第10天進行此等量測。結果展示於圖6中。 分別如圖6A及圖6B中所示，經10天觀測到在各種速度下之離心對細胞擴增(「群體倍增」)或成活力無實質性作用。結果證明在本文所提供之實施例中用於開始轉導的條件下，T細胞可耐受如在離心室空穴之側壁所量測在至少達到或約1600 g的相對離心力下離心，相當於在細胞表面:液體介面處之細胞上大致相同的平均力，而無擴增或成活力之可偵測的實質性變化。實例 7 ： 使用在大體上圓柱形離心室中開始轉導之轉導處理步驟 此實例描述用於實例8-10中所述之研究的轉導處理步驟的通用參數。根據所提供之實施例，在離心室中開始用編碼嵌合抗原受體(CAR)之重組病毒載體轉導細胞。 CD4+ /CD8+ T細胞經由陽性選擇自人類清除術產物樣品分離。經分離之細胞冷凍保存且在37℃下解凍。解凍細胞在開始轉導之前使用CD3/CD28珠粒在IL-2 (100 IU/mL)存在下在37℃下活化72小時。在一些情況下，清除術製備、分離及/或活化步驟之各種態樣亦根據所提供之實施例，聯合Sepax® 2系統在離心室之空穴中進行，如例如實例11中所述。 在準備轉導時，將基本上如圖7中所描繪之與由Biosafe SA出售用於再生醫學用途之無菌單次使用拋棄式套組一體的離心處理離心室(1 ) (A-200F)聯合Sepax® 2處理單元置放，其因此可向離心室提供離心力及軸向移位(允許控制內部空穴尺度)。(美國專利第6,733,433號)。 為開始轉導，進行以下步驟。 為產生含有病毒載體粒子之組合物與離心室中之活化細胞無菌混合，將完全培養基(含有補充有5%人類血清及IL-2之無血清造血細胞培養基及足以在開始轉導期間最終濃度為10 μg/mL之量的聚陽離子)、在指定數目或相對數目之感染單位(IU) (例如1.8 IU/細胞或3.6 IU/細胞)之病毒載體粒子及(若適用)空氣無菌轉移至離心袋包，其最終將在稀釋劑袋包位置處與套組無菌連接以便如下所述引入。 含有活化細胞之培養袋包經由管線在圖5及圖7中所示之「輸入袋包」位置處無菌連接至單次使用拋棄式套組。在Sepax® 2處理單元上運行自動化「稀釋」方案。因此，經由移動活塞，所需數目之細胞(如所述個別研究中所指出，例如50×106 、100×106 或200×106 個細胞)藉助於離心室空穴自培養袋包轉移至在圖5及圖7中所示之「輸出袋包」位置處的產物袋包。 為產生具有細胞及病毒(及若適用，空氣)之輸入組合物以便引入至離心室中並轉導，含有所需數目活化細胞之產物袋包接著無菌連接在如圖5及圖7中所示之輸入袋包位置處。含有病毒粒子、培養基及視情況存在之空氣的離心袋包無菌連接在圖式中所示之稀釋袋包1的位置處。在Sepax® 2上運行自動化洗滌循環，有助於含有細胞之組合物吸入至離心室空穴中，組合物在Sepax® 2上以在空穴內壁大致500 g的RCF旋轉以使細胞集結及為達到所需體積(例如10 mL)需要移除適當體積液體。在稀釋劑袋包1位置處之離心袋包的內含物(包括病毒粒子、培養基、聚陽離子及(若適用)空氣)接著與細胞一起吸入至離心室空穴中。此過程因此實現細胞組合物之體積減少且使體積減少之細胞與含病毒之組合物及(若適用)空氣組合。所得200 mL體積(含有細胞、病毒及視情況存在之空氣)接著轉移至如圖5及圖7中所示之套組的「輸出袋包」位置處的離心袋包中。 為開始轉導，接著卸除含有200 mL病毒、細胞及空氣(若適用)之離心袋包且無菌連接在套組之輸入袋包位置處。含有完全培養基之袋包在「稀釋劑袋包」位置處無菌連接至套組。細胞培養袋包在「輸出袋包」位置處無菌連接至系統。使用者經由介面指示應在系統上運行的自動化方案以便開始轉導。特定言之，程序使得含有細胞、病毒及(若指示)空氣之200 mL體積藉由活塞移動經由管線轉移至離心室空穴。程序繼續使內含物在離心室空穴(總體積200 mL)中在指定力下離心以開始用病毒載體粒子轉導細胞。在一些實施例中，手持式雷射轉速計用於在Sepax®單元上之不同設定點處使用已知方法驗證轉/分(rpm)。除在特定指示之情況之外，在指定速度下進行旋轉1小時(3600秒)，外加斜升及斜降時間。在旋轉後且當由系統提示時，使用者關閉允許流體在空穴與輸入袋包之間移動的夾具且打開阻斷流體在空穴與輸出袋包位置處之產物袋包之間移動的夾具。在使用者輸入後，程序藉由實現液體來離心室至輸出袋包之移動而繼續。 若適用，為了排出空氣，當由系統提示時，使用者打開阻斷流體在離心室空穴與過濾器之間移動的夾具且程序使得空氣經由過濾器壓出。 稀釋程序接著在Sepax® 2系統上運行，使得阻斷流體在具有培養基之稀釋劑袋包與離心室之間移動的夾具打開且程序使得適當量之液體自該袋包移動至離心室(藉由打開活栓及移動活塞)，混合60秒且接著將流體自處理空穴轉移至輸出袋包，該適當量為達到使用者定義之200 mL最終體積所需的，考慮到在離心期間空氣(若存在)之存在。 輸出袋包位置處之培養袋包藉此含有輸出組合物，該輸出組合物之細胞含有結合病毒粒子及/或經病毒基因體接種。細胞接著在該袋包中在37℃、5% CO2 下培育~24小時以便完成轉導。在轉導開始及完成期間，如由個別實例中關於轉導效率及複本數之各種量測所指示，接種細胞之病毒載體粒子及其基因體已整合至細胞基因體中。實例 8 ： 在離心室中在恆定體積及病毒粒子數目以及不同細胞濃度下開始轉導 對恆定液體體積之具有不同細胞數目及病毒粒子感染單位(IU)之組合物進行實例7中所述之轉導方法。在每種情況下，在開始轉導之前，如實例11中所述收集、洗滌、分離、冷凍保存及活化細胞。實例 8A. 如實例7中所述開始轉導且進一步培養以完成轉導，詳情如下。 在兩個單獨研究中的兩個單獨條件下，在70 mL總液體體積(空穴之剩餘130 mL體積在旋轉期間含有空氣)中開始轉導過程。單獨條件分別對200×106 個細胞及100×106 個細胞執行。使用相同單位總數的含有編碼抗CD19 CAR之載體的病毒載體粒子，分別關於兩個條件產生1.8 IU/細胞及3.6 IU/細胞。在轉導程序期間，3600秒旋轉在大致7400 rpm下，相當於在處理空穴側壁大致1600 g之RCF。 在~24小時培育之後，在生物反應器系統中藉由灌注擴增細胞。在第6天以如實例1中所述偵測之表面表現所編碼之CAR的CD3+ T細胞的百分比形式計算相應組合物之轉導效率且與作為對照物之未轉導之細胞群體(「未轉導」)相比。結果展示於圖8A中。如所示，在相同總體積及總數之感染單位下在旋轉培育期間，對於在培育期間在空穴中使用較少量100×106 個細胞之條件觀測到更大轉導效率。實例 8B . 在另一研究中，如實例7中所述開始轉導且進一步培養以完成轉導，詳情如下。 在三個單獨條件下，在70 mL總液體體積(空穴之剩餘130 mL體積在旋轉期間含有空氣)中開始轉導過程。單獨條件分別對200×106 個細胞、100×106 個細胞及50×106 個細胞執行。使用相同單位總數的含有編碼抗CD19 CAR之載體的病毒載體粒子，其為關於200×106 個細胞之條件產生1.8 IU/細胞所需的單位數目。在轉導程序期間，在Sepax® 2系統上在大致7400 rpm下進行3600秒旋轉，相當於在處理空穴側壁大致1600 g之RCF。 在~24小時培育之後，在生物反應器系統中藉由灌注擴增細胞。在第6天以如實例1中所述偵測之表面表現所編碼之CAR的CD3+ T細胞的百分比形式計算相應組合物之轉導效率且與作為對照物之未轉導之細胞群體(「未轉導」)相比。結果展示於圖8B中。如所示，在相同總體積及總數之感染單位下在旋轉培育期間，對於在培育期間在空穴中使用較少量100×106 個細胞之條件觀測到更大轉導效率。 如實例4中所述，亦在第6天評定轉導細胞中之載體複本數(VCN)，同時確定轉導細胞(在基因體中含有SGF+病毒載體核酸之細胞)當中的平均VCN。亦評定未轉導之細胞對照物(「PD UnTD」)及陽性對照細胞(「2複本陽性對照」)。結果呈現於圖8C中。實例 9 ： 在具有不同體積及單位病毒載體粒子之離心室中開始轉導 對具有增加數目之病毒粒子感染單位(IU)及液體體積(細胞數目恆定(100×106 個))之組合物進行實例7中所述之轉導方法，詳情如下。在每種情況下，在開始轉導之前，如實例11中所述收集、洗滌、分離、冷凍保存及活化細胞。 在實例7中所述之過程中，對於不同條件，經由稀釋方案自稀釋劑袋包位置吸入而與細胞組合之含有病毒粒子、培養基及空氣的組合物分別包括60、90及120 mL液體體積(對於個別條件，10 mL含細胞組合物分別產生70、100及130 mL液體體積)，而引入離心室進行旋轉之200 mL總體積的其餘部分由空氣構成。此等液體體積中之每一者包括每毫升液體體積6×106 IU病毒載體粒子，產生關於各條件增加之IU及IU/細胞。3600秒旋轉在大致7400 rpm之速度下進行，相當於在Sepax®單元空穴內壁大致1600 g之RCF。亦使用未轉導之(「模擬」)對照物。 在~24小時培育之後，在生物反應器系統中藉由灌注擴增細胞。在第6天以如實例1中所述偵測之表面表現所編碼之CAR的CD3+ T細胞的百分比形式計算相應組合物的轉導效率。結果展示於圖9A中。如所示，對於相同數目之細胞，增加量之病毒及相應增加之體積使得此研究中之轉導效率增加。 如實例4中所述，亦在第6天藉由即時定量PCR (RT-qPCR)測定各條件之每個轉導細胞(表現轉殖基因之細胞)的平均載體複本數(VCN)。結果呈現於圖9B中。實例 10 ： 使用離心室之離心時間對於轉導效率之作用 如實例7中所述對100×106 個細胞進行轉導，而用於在離心下培育之持續時間不同。特定言之，在離心室之處理空穴中用於離心之總液體體積為70 mL (200 mL總體積之剩餘130 mL由空氣組成)。含有編碼抗CD19 CAR之載體的病毒載體粒子以3.6 IU/細胞之比率包括於此體積中。在每種情況下，在開始轉導之前，如實例11中所述收集、洗滌、分離、冷凍保存及活化細胞。 開始轉導之旋轉在大致7400 rpm下進行，相當於在處理離心室內部側壁大致1600 g之相對離心力。對於一個條件，在此速度下旋轉之持續時間為10分鐘，而對於另一條件為60分鐘。 在~24小時培育之後，在生物反應器系統中藉由灌注擴增細胞。在第6天以如實例1中所述偵測之表面表現所編碼之CAR的CD3+ T細胞的百分比形式計算相應組合物的轉導效率。亦評定未轉導之對照物(「未轉導」)。結果展示於圖10中。如所示，在此研究中，在離心室之處理空穴中離心60分鐘與10分鐘相比，在開始轉導100×106 個細胞後觀測到更大轉導效率。實例 11 ： 製備經基因工程改造之細胞 此實例描述已根據本文所提供之某些實施例，由生物樣品製備經由病毒載體編碼之核酸轉導的經基因工程改造之T細胞的例示性過程。如個別實例中所述，在本文各種實例中所述之研究中進行轉導步驟之前，如此實例中所述，進行此過程之一些步驟，例如收集、洗滌、低溫保存、選擇及活化步驟。 該過程之各種步驟在離心室之處理空穴內進行，該離心室具有大體上圓柱形的固定側壁及能夠在離心室內移動以改變空穴體積之活塞(單次使用套組內所含之Sepax®離心室的處理空穴)。特定言之，在離心室中進行之步驟包括細胞洗滌、稀釋/緩衝液更換、用於基於親和力之選擇的步驟(例如與免疫特異性結合劑一起培育)、開始轉導、調配及用於活化/擴增之步驟(例如與刺激劑一起培育)。1. 樣品收集及白血球清除術 使用白血球清除術收集系統自個體之全血樣品獲得富含單核細胞之人類白血球清除術樣品。白血球清除術樣品密封儲存在2-8℃下，不超過約48小時。2. 白血球清除術洗滌 將白血球清除術樣品無菌轉移至轉移封裝。洗滌白血球清除術樣品之細胞且再懸浮於適用於基於親和力之選擇的緩衝液中，該緩衝液含有PBS、EDTA及人類血清白蛋白。在由Biosafe SA出售之適用於再生醫學的無菌單次使用拋棄式套組內進行洗滌，該套組包括離心室(1 )，基本上如圖7中所描繪。將含有細胞之轉移封裝及含有緩衝液之袋包無菌連接至套組，該套組聯合Sepax® 2處理單元置放。在該單元上使用標準細胞洗滌方案進行洗滌及再懸浮，使得細胞在方案結束時保留在離心室之處理空穴(7 )中，隨後與用於基於親和力之選擇的試劑一起培育(參見3)。3. 基於親和力之選擇 對於T細胞之基於免疫親和力之陽性選擇，繼續相同自動化程序以在具有偶合至特異性針對CD4及CD8之單株抗體的磁性珠粒的選擇緩衝液中培育經洗滌之細胞。在上文所述之洗滌(參見2)之後，在室溫下在保留細胞之同一離心室(1 )中進行培育。特定言之，珠粒在轉移封裝中混合於選擇緩衝液中，接著將轉移封裝無菌連接在單次使用套組用於洗滌步驟之稀釋劑袋包位置處。在Sepax® 2單元上運行程序，使得珠粒混合物及選擇緩衝液與經洗滌之細胞一起吸入至離心室中，且離心室之內含物(總液體體積100 mL)經由半連續過程混合30分鐘。在重複間隔下進行混合，每一間隔包括在低速(大致1700 rpm)下之短持續時間(大致1秒)離心，接著為短靜止時間(大致6秒)。 在程序結束時，Sepax® 2單元使得細胞集結且排出過量緩衝液/珠粒至廢料袋包位置處之袋包中，洗滌經集結之細胞且再懸浮於選擇緩衝液中。在Sepax®上以在空穴內壁大致200 g之RCF進行洗滌180秒。程序使得經洗滌之細胞收集於置放在圖7中所示之例示性套組中之輸出袋包位置處的轉移封裝中，其內含物可經由管線轉移至封閉系統內用於磁性分離之管柱。因此，藉由使液體及細胞傳遞至離心室之空穴及自離心室之空穴傳出，細胞洗滌及與基於親和力之選擇試劑一起培育完全在同一封閉無菌系統內進行。控制及調節液體體積之能力及使細胞在旋轉下在離心室中混合之能力允許使用與在管中在震盪或旋轉下培育相比每個細胞基本上較少的選擇試劑加以處理。 細胞接著自轉移封裝傳遞經過封閉無菌系統之管線及分離管柱，在磁場存在下使用標準方法分離已結合CD4特異性試劑及/或CD8特異性試劑之細胞。此等磁性標記細胞接著收集於轉移封裝中用於進一步處理。 4.低溫保存 將具有經標記、經選擇之細胞的轉移封裝無菌連接至由Biosafe AS出售之用於再生醫學之單次使用拋棄式套組以便與Sepax® 2系統一起使用。套組基本上如圖7中所示，不同之處在於在圖7中所示之例示性系統中附接輸出袋包之位置處存在兩個端口(相對於一個)，而收集袋包以無菌方式連接在各端口處；在圖7中連接輸入袋包之位置處存在兩個端口(相對於一個)；及在圖7中稀釋劑袋包1及2之位置處存在單一個端口(相對於兩個)。在Sepax® 2單元上進行標準洗滌循環以減小經洗滌細胞之體積。將具有低溫培養基之袋包以無菌方式連接至套組且運行稀釋方案兩次，以將低溫培養基轉移至細胞組合物及將所得組合物排出至兩個輸出低溫保存袋包中。將低溫保存袋包中之細胞低溫保存且儲存於液氮中直至另外使用為止。 5.解凍及活化 將低溫保存之細胞解凍。經解凍之細胞一般在37℃下使用抗CD3/CD28試劑活化一段如個別研究所指示之時間。在與該試劑一起培育之前，使用Sepax® 2系統，使用標準細胞洗滌程序且在基本上如圖7中所示之套組中洗滌細胞且再懸浮於完全培養基中。在同一套組中，藉由在室溫下如關於選擇之珠粒培育所述在低速離心及靜止之間隔下混合30分鐘而使細胞在離心室空穴中與抗CD3/28試劑組合。在培育後，培育材料經由Sepax® 2單元轉移至輸出細胞培養袋包中，接著在37℃下培育持續剩餘活化時間。 6.轉導 如實例7中所述，在與套組一體的聯合Sepax®處理單元置放之離心室中進行轉導，特定詳情在具體實例中給出。 7.擴增 在一些情況下，在轉導後，細胞一般在37℃下進一步培育以便擴增。 8.洗滌、調配 在一些情況下，進一步洗滌、稀釋及/或調配經擴增及/或轉導之細胞以便測試、儲存及/或投與。在一些實例中，經擴增及/或轉導之細胞如例如關於低溫保存所述在與單次使用套組一體的與Sepax® 2系統一起使用之離心室中洗滌。在一些情況下，含有經洗滌細胞之袋包以無菌方式連接至諸如圖7中所示之套組，或在圖7中所示之輸出袋包位置處具有複數個可用於連接容器(例如袋包)之端口的此類套組。 此類多端口輸出套組之一個實例展示於圖11中，其展示複數個端口(17 )，其中之一或多者可連接容器(諸如袋包)以收集輸出組合物。連接可為無菌焊接所需數目之容器，視例如需要藉由給定方法產生之細胞單位劑型的數目而定。為產生圖11中所示之套組，將具有複數個端口(在圖11中所示之實例中，八個)之多路管歧管無菌焊接至由Biosafe AS出售用於再生醫學用途之單次使用套組的輸出管線。所需數目之複數個輸出袋包以無菌方式連接至此等端口中之一或多者，一般兩者或兩者以上。在一些實例中，此類袋包附接至少於全部的端口。將夾具(5 )置於管線上防止流體移動至個別袋包中直至需要。含有所需液體(諸如調配、分析及/或低溫保存培養基)之袋包以無菌方式連接至套組且在Sepax® 2單元上運行稀釋方案複數次，使用者打開及關閉引導至適當數目之袋包的相應夾具，藉此在所需調配下產生分成所需數目袋包之輸出組合物。在一些實施例中，單一個單位劑量之細胞收集在相應袋包中之每一者中，調配用於投與個體，諸如獲得白血球清除術產物之個體。 本發明不意欲限制在具體揭示之實施例的範疇中，該等實施例被提供用於例如說明本發明之各種態樣。對所述組合物及方法之各種修改將由本文中之描述及教示而變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下加以實踐且意欲屬於本發明之範疇內。
1:離心室 2:活塞 3:管線 4:活栓閥 5:夾具 6:入口/出口開口 7:內部空穴 13:端壁 14:固定側壁 15:公魯爾鎖無菌過濾器 16:母魯爾鎖封蓋 18:端口
圖 1A 展示在如實例1中所述在各種條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之嵌合抗原受體(CAR)之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 1B 展示在實例1中所述之轉導研究期間經六天時間之群體倍增。圖 2 展示在如實例2中所述在指定條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之CAR之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 3 展示在如實例3中所述在各種條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之CAR之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 4 展示在如實例4中所述在各種條件下轉導後，指定細胞群體中病毒載體之平均載體複本數(VCN)。圖 5 提供適用於所提供之方法之實施例的封閉系統(處理套組)之實施例的示意圖。所描繪之例示性系統包括大體上圓柱形離心室(1 )，其可圍繞旋轉軸旋轉且包括端壁(13 )、固定側壁(14 )及活塞(2 )，從而界定該離心室之內部空穴(7 )。該離心室另外包括入口/出口開口(6 )以允許液體及氣體在該系統之至少一些組態中流入及流出該空穴。開口(6 )與一系列管線(3 )及連接器(包括活栓閥(4 ))及各種額外容器可操作地連接。亦描繪夾具(5 )。圖 6A 展示在實例6中所述之研究期間經十天時間之群體倍增。圖 6B 展示在實例6中所述之研究期間經十天時間之成活力百分比。圖 7 提供適用於所提供之方法之實施例的封閉系統(處理套組)之實施例的示意圖。所描繪之例示性系統包括大體上圓柱形離心室(1 )，其可圍繞旋轉軸旋轉且包括端壁(13 )、固定側壁(14 )及活塞(2 )，從而界定該離心室之內部空穴(7 )。該離心室另外包括入口/出口開口(6 )以允許液體及氣體在該系統之至少一些組態中流入及流出該空穴。開口(6 )與一系列管線(3 )及連接器(包括活栓閥(4 ))、各種額外容器及耦接至可卸除式封蓋(16 )之空氣過濾器(15 )可操作地連接。亦描繪夾具(5 )。圖 8A 展示在如實例8A中所述在指定條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之CAR之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 8B 展示在如實例8B中所述在指定條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之CAR之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 8C 展示在如實例8B中所述在各種條件下轉導後，指定細胞群體中病毒載體之平均載體複本數(VCN)。圖 9A 展示在如實例9中所述在指定條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之CAR之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 9B 展示在如實例9中所述在各種條件下轉導後，指定細胞群體中病毒載體之平均載體複本數(VCN)。圖 10 展示在如實例10中所述在指定條件下培育後，以表面表現由病毒載體編碼之CAR之CD3+ T細胞的百分比形式計算的轉導效率。圖 11 提供適用於所提供之方法之實施例的封閉系統(處理套組)之實施例的示意圖。所描繪之例示性系統包括大體上圓柱形離心室(1 )，其可圍繞旋轉軸旋轉且包括端壁(13 )、固定側壁(14 )及活塞(2 )，從而界定該離心室之內部空穴(7 )。該離心室另外包括入口/出口開口(6 )以允許液體及氣體在該系統之至少一些組態中流入及流出該空穴。開口(6 )與一系列管線(3 )及連接器(包括活栓閥(4 ))及端口(18 )及各種額外容器(包括複數個輸出袋包(17 ))可操作地連接。亦描繪夾具(5 )。

Claims (54)

  1. 一種轉導方法，其包含在離心室之內部空穴中培育輸入組合物，該輸入組合物包含細胞及含有重組病毒載體之病毒粒子，其中：該內部空穴具有可變體積，且進一步包含至少一個開口能夠允許液體引入至該內部空穴中及液體自該空穴壓出；該離心室可圍繞旋轉軸旋轉，且在該培育之至少一部分期間係圍繞該旋轉軸旋轉；及該方法產生輸出組合物，該輸出組合物包含複數個經以該病毒載體轉導之細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中該離心室包含可移動構件，且該可變體積係由該可移動構件產生，該可移動構件能夠在該離心室內移動以改變該內部空穴之體積。
  3. 如請求項2之方法，其中該方法進一步包含在該培育之前或期間，使該可移動構件之移動，藉此增加該內部空穴之內部體積。
  4. 如請求項3之方法，其中該可移動構件之移動係在該離心室內之軸向移動。
  5. 如請求項2至4中任一項之方法，其中該可移動構件為活塞。
  6. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該離心室或該內部空穴為基本上固定。
  7. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該旋轉包含在該等細胞之表層以介於500g至2500g包括端點之相對離心力(relative centrifugal force)旋轉。
  8. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該旋轉包含在該等細胞之表層以介於1000g至3600g包括端點之相對離心力旋轉。
  9. 如請求項1至4中任一項之方法，其中在該培育之至少一部分期間，該離心室旋轉介於5分鐘至60分鐘包括端點。
  10. 如請求項1至4中任一項之方法，其中：在該培育期間，存在於該內部空穴中之該輸入組合物的平均液體體積不超過在該培育期間每平方吋該內部空穴之內部表面積約5毫升(mL)；及/或在該培育期間之任一時間，存在於該內部空穴中之該輸入組合物的最大液體體積不超過每平方吋該內部空穴之最大內部表面積約5mL。
  11. 如請求項1至4中任一項之方法，其中：該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在該離心室內 在該等細胞之表層以1000g或約1000g或2000g或約2000g之力旋轉期間，在該內部空穴之表面上形成單層細胞之數目；該輸入組合物中該等細胞之數目為足以在該離心室內在該等細胞表層以1000g或約1000g或2000g或約2000g之力旋轉期間，在該內部空穴之表面上形成單層細胞之數目的不超過2倍；及/或該輸入組合物中該等細胞之數目為或約為足以在該旋轉期間在該內部空穴之內表面上形成單層細胞或雙層細胞的數目。
  12. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該輸入組合物包含每個該等細胞中1個或約1個感染單位(IU)之病毒粒子、每個該等細胞中2個或約2個IU之病毒粒子、每個該等細胞中3個或約3個IU之病毒粒子、每個該等細胞中4個或約4個IU之病毒粒子、每個該等細胞中5個或約5個IU之病毒粒子、每個該等細胞中10個或約10個IU之病毒粒子、每個該等細胞中20個或約20個IU之病毒粒子、每個該等細胞中30個或約30個IU之病毒粒子、每個該等細胞中40個或約40個IU之病毒粒子、每個該等細胞中50個或約50個IU之病毒粒子或每個該等細胞中60個或約60個IU之病毒粒子。
  13. 如請求項1至4中任一項之方法，其中病毒粒子之效價係介於1×106IU/mL至1×108IU/mL。
  14. 如請求項1至4中任一項之方法，其中： 在該培育期間之任一時間，存在於該內部空穴中之該輸入組合物的最大總液體體積為該內部空穴中該等細胞之總體積的不超過100倍；該輸入組合物經該培育過程之平均體積為該內部空穴中細胞總體積之不超過100倍；及/或其中該輸入組合物之液體體積不超過200mL。
  15. 如請求項1至4中任一項之方法，其中在該離心室中培育之至少一部分期間或在該離心室旋轉期間，該輸入組合物之液體體積僅佔該離心室之內部空穴體積之一部分，在該至少一部分期間或在該旋轉期間，該內部空穴之體積另外包含氣體，該氣體在該培育之前或期間係經由該至少一個開口引入至該內部空穴中。
  16. 如請求項15之方法，其中該氣體為空氣。
  17. 如請求項15之方法，其中該離心室包含可移動構件，其中氣體引入至該離心室中造成該可移動構件之移動以增加該離心室之內部空穴的體積，藉此與該離心室中不存在氣體時相比，減少在該離心室旋轉期間存在於該內部空穴中之該輸入組合物之每平方吋該空穴之內部表面積的總液體體積。
  18. 如請求項15之方法，其中該可移動構件之移動改變該離心室之內部空穴之體積，使得液體或氣體引入至該內部空穴或自該內部空穴 壓出。
  19. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該培育之另一部分係在該離心室外面及/或在無旋轉之情況下進行，該另一部分係在該離心室中及/或在旋轉下進行至少一部分之後進行。
  20. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該培育係在選自下列之刺激劑存在下進行：IL-2、IL-15及IL-7之細胞激素。
  21. 如請求項1至4中任一項之方法，其中：在含有該重組病毒載體或該病毒載體整合至其中之該輸出組合物中的所有該等細胞當中，該重組病毒載體之平均複本數不超過約10；或在該輸出組合物中之該等細胞當中，該載體之平均複本數不超過約2。
  22. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該離心室與封閉系統係為一體的，該封閉系統包含該離心室及經由至少一個連接器可操作地連接於該至少一個開口的至少一個管線，藉此允許液體及氣體在該系統之至少一個組態中，在該內部空穴與該至少一個管線之間移動。
  23. 如請求項22之方法，其中：該至少一個管線包含一系列管線； 該至少一個連接器包含複數個連接器；及該封閉系統另外包含可操作地連接於該一系列管線之至少一個容器，該連接允許液體及/或氣體經由該一系列管線在該至少一個容器與該至少一個開口之間通過。
  24. 如請求項23之方法，其中該至少一個容器包含至少一個包含該等病毒粒子及該等細胞之輸入容器、廢料容器、產物容器及至少一個稀釋劑容器，其各經由該一系列管線及該至少一個開口連接至該內部空穴。
  25. 如請求項24之方法，其中：至少一個容器另外包含在該培育期間之至少一個時間點之前及/或期間包含氣體的容器；該封閉系統另外包含能夠將氣體引入至該離心室之內部空穴中之微生物過濾器；及/或該封閉系統含有用於將氣體引入之注射器端口。
  26. 如請求項24之方法，其中該方法進一步包含在該培育之前及/或期間，將該輸入組合物引入至該內部空穴中，該引入包含經由該至少一個開口將液體自該至少一個輸入容器流入該內部空穴中。
  27. 如請求項25之方法，其中該方法進一步包含在該培育之前及/或期間，提供或將氣體在無菌條件下引入至該內部空穴中，該引入係藉 由(a)來自包含氣體之容器之氣體的流動、(b)來自該封閉系統之外部環境經過該微生物過濾器之氣體的流動、或(c)來自連接至該系統之注射器在該注射器端口處之氣體的流動來達成。
  28. 如請求項27之方法，其中將該氣體引入至該離心室之內部空穴中與將該輸入組合物引入至該離心室之內部空穴中係同時或一起進行。
  29. 如請求項27之方法，其中該氣體引入與將該輸入組合物引入至該內部空穴中係同時或依次分開進行。
  30. 如請求項26之方法，其中該方法進一步包含：在該培育之前及/或期間將該離心室之旋轉；在該培育之後將液體自該內部空穴壓出至該廢料容器中；將液體經由該至少一個開口自該至少一個稀釋劑容器壓出至該內部空穴中及將該內部空穴之內含物的混合；及將液體自該內部空穴壓出至該產物容器中，藉此將經該病毒載體轉導之細胞轉移至該產物容器中。
  31. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該培育為連續過程之一部分，該方法進一步包含：在該培育之至少一部分期間，於該離心室旋轉期間實現將該輸入組合物連續引入至該內部空穴中；及 在該培育之一部分期間，將液體在該離心室旋轉期間經由該至少一個開口自該內部空穴連續壓出。
  32. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該培育為半連續過程之一部分，該方法進一步包含：在該培育之前，將該輸入組合物經由該至少一個開口引入至該內部空穴中；在該培育之後，將液體自該內部空穴壓出；將包含細胞及含有重組病毒載體之該等病毒粒子的另一輸入組合物引入至該內部空穴中；及在該內部空穴中培育該另一輸入組合物，其中該方法產生另一輸出組合物，其包含複數個經該病毒載體轉導之該另一輸入組合物之細胞。
  33. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該方法係處理之一部分，其進一步包含在該離心室之內部空穴中進行之一或多個額外之細胞處理步驟，該一或多個額外之細胞處理步驟係選自由下列組成之群：細胞洗滌、細胞選擇、細胞單離(isolation)、細胞分離(separation)、細胞培養、細胞刺激、細胞封裝及細胞調配。
  34. 如請求項1至4中任一項之方法，其進一步包含：(a)在該培育之前，在離心室之內部空穴中洗滌包含該等細胞之生物樣品； (b)自生物樣品單離該等細胞，其中該單離步驟之至少一部分係在該培育之前於離心室之內部空穴中進行；及/或(c)在該培育之前及/或期間刺激細胞，該刺激包含使該等細胞暴露於刺激條件，藉此誘導該輸入組合物之細胞增殖，其中該刺激細胞步驟之至少一部分係在離心室之內部空穴中進行。
  35. 如請求項1至4中任一項之方法，其進一步包含在離心室之內部空穴中將藉由該方法轉導之細胞調配於醫藥學上可接受之緩衝液中，藉此產生調配組合物。
  36. 如請求項1至4中任一項之方法，其中：該輸入組合物中之該等細胞包含懸浮細胞；該輸入組合物中之該等細胞包含白血球；及/或該輸入組合物中之該等細胞包含T細胞或NK細胞。
  37. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該輸入組合物中之該等細胞為未經分離(fractionated)之T細胞、經單離之CD8+ T細胞或經單離之CD4+ T細胞。
  38. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該輸入組合物中之該等細胞係T細胞，且其中在該轉導起始前，T細胞係藉由在刺激條件或刺激劑之存在下培育以經活化。
  39. 如請求項38之方法，其中該刺激條件或刺激劑引發ITAM誘導之信號，其特異性針對TCR組分及/或促進T細胞協同刺激受體之協同刺激信號。
  40. 如請求項38之方法，其中該刺激劑係抗CD3抗體及/或抗CD28抗體。
  41. 如請求項38之方法，其中該刺激劑係選自IL-2、IL-15及IL-7之細胞激素。
  42. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該輸入組合物進一步包含一或多種額外試劑以提高轉導效率。
  43. 如請求項42之方法，其中該一或多種額外試劑係聚陽離子。
  44. 如請求項43之方法，其中：該聚陽離子係硫酸魚精蛋白；及/或該聚陽離子之濃度係自1μg/mL至100μg/mL。
  45. 如請求項42之方法，其中該一或多種額外試劑係海地美溴銨(hexadimethrine bromide)。
  46. 如請求項42之方法，其中該一或多種額外試劑係CH-296。
  47. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該離心室係與感測器結合，該感測器可量測離心室之旋轉速度或該內部空穴中所含之體積。
  48. 如請求項2至4中任一項之方法，其中該離心室係與感測器結合，該感測器可量測該可移動構件之位置。
  49. 如請求項48之方法，其中來自該感測器之資訊可由控制電路接收，且基於該資訊，該控制電路係經配置以改變所量測之位置。
  50. 如請求項2至4中任一項之方法，其中在該培育期間，該離心室與感測器及控制電路結合，該感測器能夠監測該可移動構件之位置，該電路能夠接收來自該感測器之資訊及傳輸資訊至該感測器及引起該可移動構件之移動，該控制電路與能夠在該培育期間引起該離心室之旋轉的離心機進一步結合。
  51. 如請求項22之方法，其中該離心室包含該可移動構件且在該培育期間，該離心室位於離心機內並與感測器及控制電路結合，該感測器能夠監測該可移動構件之位置，該控制電路能夠接收及傳輸來自該感測器之資訊且引起該可移動構件移動、經由該至少一個管線引入液體至該空穴及自該空穴壓出液體及經由該離心機旋轉該離心室。
  52. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該重組病毒載體編碼重組 受體，該重組受體藉此經由該輸出組合物之細胞表現。
  53. 如請求項52之方法，其中該重組受體為嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)或轉殖基因T細胞受體(transgenic T cell receptor；TCR)。
  54. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該重組病毒載體為重組慢病毒載體。
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