JP2021505168A - 操作されたｔ細胞の組成物を製造するための方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、細胞療法に使用するために、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞などのT細胞を遺伝子操作するための方法を提供する。いくつかの局面では、提供される方法は、1:1の比などで、濃縮されたCD4＋細胞およびCD8＋細胞をプールし、次いで、刺激条件下で細胞をインキュベートし、形質導入またはトランスフェクションを通じて細胞に組換えポリペプチドを導入し、かつ/または増殖および/もしくは拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養するための1つまたは複数の工程を含む。いくつかの局面では、提供される方法は、成功の度合いの高い、遺伝子操作されたT細胞を作製するための効率的で信頼性の高い手段である。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年12月8日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/596,774号;2018年1月8日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/614,965号;2018年8月9日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/716,971号;2018年8月22日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/721,604号;2018年10月3日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/740,903号;2018年11月1日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/754,564号;2018年11月30日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/774,165号;および2018年12月3日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/774,855号に対する優先権を主張し、あらゆる目的のために参照によりその内容全体を組み入れる。
本出願は、2017年12月8日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/596,774号;2018年1月8日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/614,965号;2018年8月9日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/716,971号;2018年8月22日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/721,604号;2018年10月3日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/740,903号;2018年11月1日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/754,564号;2018年11月30日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/774,165号;および2018年12月3日に出願され、「PROCESS FOR PRODUCING A COMPOSITION OF ENGINEERED T CELLS」と題された米国仮出願第62/774,855号に対する優先権を主張し、あらゆる目的のために参照によりその内容全体を組み入れる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2018年12月7日に作成された735042014340SeqList.txtと題されたファイルとして提供され、そのサイズは68キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み入れられる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2018年12月7日に作成された735042014340SeqList.txtと題されたファイルとして提供され、そのサイズは68キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み入れられる。
分野
本開示は、細胞療法に使用するために、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞などのT細胞を遺伝子操作するための方法を提供する。いくつかの局面では、提供される方法は、1:1の比などで、濃縮されたCD4＋細胞およびCD8＋細胞をプールし、次いで、刺激条件下で細胞をインキュベートし、形質導入またはトランスフェクションを通じて細胞に組換えポリペプチドを導入し、かつ/または増殖および/もしくは拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養するための1つまたは複数の工程を含む。いくつかの局面では、提供される方法は、成功の度合いの高い、遺伝子操作されたT細胞を作製するための効率的で信頼性の高い手段である。
本開示は、細胞療法に使用するために、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞などのT細胞を遺伝子操作するための方法を提供する。いくつかの局面では、提供される方法は、1:1の比などで、濃縮されたCD4＋細胞およびCD8＋細胞をプールし、次いで、刺激条件下で細胞をインキュベートし、形質導入またはトランスフェクションを通じて細胞に組換えポリペプチドを導入し、かつ/または増殖および/もしくは拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養するための1つまたは複数の工程を含む。いくつかの局面では、提供される方法は、成功の度合いの高い、遺伝子操作されたT細胞を作製するための効率的で信頼性の高い手段である。
背景
疾患および症状の治療には、様々な細胞療法の方法を利用することができる。細胞療法には、キメラ抗原受容体などの組換え受容体を用いて遺伝子操作されたT細胞などの免疫細胞が関与する方法がある。さらに効率的なプロセスおよび/または改善された細胞組成物製品を提供することを含む、そのような細胞療法を製造および/または操作するための改善された方法が必要である。
疾患および症状の治療には、様々な細胞療法の方法を利用することができる。細胞療法には、キメラ抗原受容体などの組換え受容体を用いて遺伝子操作されたT細胞などの免疫細胞が関与する方法がある。さらに効率的なプロセスおよび/または改善された細胞組成物製品を提供することを含む、そのような細胞療法を製造および/または操作するための改善された方法が必要である。
概要
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、（a）CD4＋T細胞の組成物とCD8＋T細胞の組成物とを2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比で組み合わせ、それにより、インプット組成物を生成する工程、（b）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含み、インプット組成物は、5×106細胞/ml未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、（a）CD4＋T細胞の組成物とCD8＋T細胞の組成物とを2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比で組み合わせ、それにより、インプット組成物を生成する工程、（b）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含み、インプット組成物は、5×106細胞/ml未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程を含み、インプット組成物は、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物は、5×106細胞/ml未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、T細胞組成物の細胞に組換え受容体を導入する工程を含み、T細胞組成物は、1mL当たり少なくとも1×106個または少なくとも約1×106個の生存細胞の濃度を有し、T細胞組成物の細胞の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である。
特定の態様では、インキュベーションは無血清培地中で行われる。特定の態様では、インプット組成物は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の細胞を含む。特定の態様では、インプット組成物は、100×106〜500×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。特定の態様では、インプット組成物は、300×106個または約300×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。特定の態様では、総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は生存細胞である。特定の態様では、インプット組成物は、1×106細胞/mL〜5×106細胞/mLの濃度を有する。特定の態様では、インプット組成物は、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの濃度を有する。特定の態様では、インプット組成物は、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する。特定の態様では、インプット組成物は、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する。
特定の態様では、インプット組成物は、1:1または約1:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する。特定の態様では、インプット組成物は、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性（surface positive）であるCD4＋およびCD8＋を含む。
特定の態様では、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比は、1.1:1または約1.1:1である。
特定の態様では、インプット組成物は、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む。
特定の態様では、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比は、1.69:1または約1.69:1である。
特定の態様では、インプット組成物は、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性（surface negative）であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を、任意で2.0:1〜1.5:1の比で含む。
いくつかの態様は、刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程をさらに含み、導入は、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む作用物質とを接触させる工程を含む。いくつかの態様は、刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程をさらに含み、導入は、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入する工程を含む。いくつかの態様では、導入は無血清培地中で行われる。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、（a）CD4＋T細胞の組成物とCD8＋T細胞の組成物とを2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比で組み合わせ、それにより、インプット組成物を生成する工程、（b）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含み、インプット組成物は、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞は、対象から得られた初代試料から濃縮または選択され、任意で、インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞は、対象から得られた初代試料から別々に濃縮または選択される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD4＋T細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD8＋T細胞を含む。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程を含み、インプット組成物は、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物は、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、インキュベーションは無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、100×106〜500×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、300×106個または約300×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は生存細胞である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、1×106細胞/mL〜5×106細胞/mLの濃度を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの濃度を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インプット組成物は、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、1:1または約1:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比は、1.1:1または約1.1:1である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比は、1.69:1または約1.69:1である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インプット組成物は、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を、任意で2.0:1〜1.5:1の比で含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、方法は、刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程をさらに含み、導入は、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む作用物質とを接触させる工程を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、接触は、ベクターを用いたトランスフェクションによる接触であり、ベクターは、トランスポゾン、任意でスリーピングビューティー（SB）トランスポゾンまたはピギーバックトランスポゾンであるか、接触は、ウイルスベクターを用いた形質導入による接触である。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、方法は、刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程をさらに含み、導入は、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入する工程を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入は無血清培地中で行われる。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、刺激された組成物の導入は、300×106個未満の細胞を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入のために、刺激された組成物は50×106個の細胞〜200×106個の細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入のために、刺激された組成物は100×106個または約100×106個の細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入のために、刺激された組成物は3×106細胞/mL未満の濃度を有する。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入のために、刺激された組成物は0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mLの濃度を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入のために、刺激された組成物は1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する。
提供される方法のいずれかの特定の態様は、刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する工程を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、刺激された組成物の細胞は生存細胞である。特定の態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、T細胞組成物の細胞に組換え受容体を導入する工程を含み、T細胞組成物は、1mL当たり少なくとも1×106個または少なくとも約1×106個の生存細胞の濃度を有し、T細胞組成物の細胞の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞組成物の濃度は、1mL当たり5×106個未満の生存細胞である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、T細胞組成物は、少なくとも100×106個または少なくとも約100×106個または約100×106個の生存細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞組成物は、300×106個未満の生存細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することによってT細胞に接触する工程を含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入は無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞組成物の1つまたは複数の細胞は、活性化され、かつ/またはLDL受容体の表面発現を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、細胞組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％は、（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または（iv）増殖することができる。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、組成物の細胞は、導入前に、刺激条件下でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程を含むプロセスによって生成され、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インキュベーションは、無血清培地中で行われた。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程、ここで、インプット組成物は、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、5x106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100x106個のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含み、ならびに（b）刺激された組成物の300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程を含み、導入は、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターとを接触させる工程を含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インキュベーションおよび/または導入は、無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は生存細胞である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、刺激された組成物からの細胞は生存細胞である。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後2日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後2日以内に、開始される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後36時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後36時間以内に、開始される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後30時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後30時間以内に、開始される。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様は、操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養し、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を製造する工程をさらに含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は無血清培地中で行われる。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、操作された細胞の組成物を製造する方法であり、方法は、（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程、ここで、インプット組成物は、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物は、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含み、（b）刺激された組成物からの300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程、ここで、導入は、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入する工程を含み、ならびに（c）操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養し、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を製造する工程を含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インキュベーション、導入および/または培養は、無血清培地中で行われる。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、任意で1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比は、1.1:1または約1.1:1である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比は、1.69:1または約1.69:1である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インプット組成物は、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入のために、刺激された組成物は300×106個未満の細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入のために、刺激された組成物は50×106個の細胞〜200×106個の細胞、任意で100×106個または約100×106個の細胞を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入のために、刺激された組成物は3×106細胞/mL未満の濃度を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、導入のために、刺激された組成物は0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mL、任意で1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、方法は、刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する工程を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、インキュベーションは、1つまたは複数のサイトカインの存在下で、例えば無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、刺激された組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％は、（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または（iv）増殖することができる。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、刺激試薬は、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する主剤を含み、この主剤は任意でCD3に特異的に結合する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、刺激試薬は、T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤をさらに含み、任意で、共刺激分子は、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、主剤および/または副剤は抗体を含み、任意で、刺激試薬は、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはその抗原結合断片とのインキュベーションを構成する。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、主剤および/または副剤は、固体支持体の表面上に存在する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、固体支持体は、ビーズであるかビーズを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、ビーズは、3.5μmを超えるか約3.5μmを超えるが約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を有する。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、ビーズは、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する。提供される方法のいずれかの特定の態様では、ビーズは不活性である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、ビーズはポリスチレン表面であるかポリスチレン表面を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、ビーズは磁性または超常磁性である。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、ビーズ：細胞の比は3:1未満である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、ビーズ：細胞の比は、2:1〜0.5:1または約2:1〜約0.5:1である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、ビーズ：細胞の比は、1:1または約1:1である。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、刺激条件下で48時間未満インキュベートされる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、刺激条件下で、12時間以上36時間以下インキュベートされる。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、インプット組成物は、刺激条件下で、18時間以上30時間以下インキュベートされる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、インプット組成物は、刺激条件下で、24時間または約24時間インキュベートされる。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、接触、任意で形質導入は、48時間未満行われる。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、接触、任意で形質導入は、12時間以上36時間以下行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、接触、任意で形質導入は、18時間以上30時間以下行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、接触、任意で形質導入は、24時間または約24時間行われる。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。提供される方法のいずれかの特定の態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。提供される方法のいずれかの特定の態様では、接触、任意で形質導入は、形質導入アジュバントの非存在下で行われる。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、導入は、1つまたは複数のサイトカインの存在下で、例えば無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養の少なくとも一部は、混合および/または灌流を用いて行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養の少なくとも一部は、500mL/日、600mL/日、700mL/日、750mL/日、800mL/日、900mL/日、1,000mL/日、1,200mL/日、1,400mL/日、1,500mL/日、1,600mL/日、1,800mL/日および/または2,000mL/日、約500mL/日、約600mL/日、約700mL/日、約750mL/日、約800mL/日、約900mL/日、約1,000mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日、約1,500mL/日、約1,600mL/日、約1,800mL/日および/または約2,000mL/日、あるいは少なくとも500mL/日、少なくとも600mL/日、少なくとも700mL/日、少なくとも750mL/日、少なくとも800mL/日、少なくとも900mL/日、少なくとも1,000mL/日、少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日、少なくとも1,500mL/日、少なくとも1,600mL/日、少なくとも1,800mL/日および/または少なくとも2,000mL/日の速度の灌流を用いて行われる。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、培養の少なくとも第1の部分は、500mL/日、750mL/日もしくは1,000mL/日、約500mL/日、約750mL/日もしくは約1,000mL/日、または少なくとも500mL/日、少なくとも750mL/日もしくは少なくとも1,000mL/日の灌流速度により行われ、培養の少なくとも第2の部分は、1,200mL/日、1,400mL/日もしくは1,500mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日もしくは約1,500mL/日、または少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日もしくは少なくとも1,500mL/日の灌流速度により行われる。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、細胞が特定の密度に達すると、灌流が開始されかつ/または増加される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、特定の密度は、0.4×106個の細胞、0.5×106個の細胞、0.6×106個の細胞、0.8×106個の細胞、1.0×106個の細胞、1.2×106個の細胞、1.4x106個の細胞、1.6x106個の細胞、1.8x106個の細胞、2.0x106個の細胞、2.2x106個の細胞もしくは2.4x106個の細胞、約0.4×106個の細胞、約0.5×106個の細胞、約0.6×106個の細胞、約0.8×106個の細胞、約1.0×106個の細胞、約1.2×106個の細胞、約1.4x106個の細胞、約1.6x106個の細胞、約1.8x106個の細胞、約2.0x106個の細胞、約2.2x106個の細胞もしくは約2.4x106個の細胞、または少なくとも0.4×106個の細胞、少なくとも0.5×106個の細胞、少なくとも0.6×106個の細胞、少なくとも0.8×106個の細胞、少なくとも1.0×106個の細胞、少なくとも1.2×106個の細胞、少なくとも1.4x106個の細胞、少なくとも1.6x106個の細胞、少なくとも1.8x106個の細胞、少なくとも2.0x106個の細胞、少なくとも2.2x106個の細胞もしくは少なくとも2.4x106個の細胞である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、細胞が0.6×106細胞/mLまたは約0.6×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または750mL/日または約750mL/日の速度に増加される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、細胞が2.0×106細胞/mLまたは約2.0×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または1500mL/日または約1500mL/日の速度に増加される。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、1つまたは複数のサイトカインの存在下で、例えば無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜2,000IU/mLの組換えIL-7および/または50〜400IU/mLの組換えIL-15を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜2,000IU/mLの組換えIL-7および50〜400IU/mLの組換えIL-15の存在下で、例えば無血清培地中で行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、培養は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後3日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後3日以内に、開始される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後60時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後60時間以内に、開始される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後48時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後48時間以内に、開始される。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、培養は、少なくとも組成物が閾値数のT細胞を含むまで行われる。提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞の閾値数は、2400×106個、約2400×106個または少なくとも2400×106個の細胞である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞の閾値数は、5500×106個、約5500×106個または少なくとも5500×106個の細胞である。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、T細胞の閾値数に達した後、少なくとも1日間継続される。提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞の閾値数は、900×106個、約900×106個または少なくとも900×106個の細胞である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、T細胞の閾値数は、1200×106個、約1200×106個または少なくとも1200×106個の細胞である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、T細胞の数が2400×106個、約2400×106個または少なくとも2400×106個の細胞である時に終了する。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、T細胞の閾値数は、3500×106個、約3500×106個または少なくとも3500×106個の細胞である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、培養は、T細胞の数が5500×106個、約5500×106個または少なくとも5500×106個の細胞である時に終了する。
提供される方法のいずれかの特定の態様は、培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様は、培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも9日の時点で収集される。提供される方法のいずれかの特定の態様は、培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞は、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも10日の時点で収集される。
提供される方法のいずれかの特定の態様は、8日〜25日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様は、9日〜21日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様は、9日〜16日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様は、任意で薬学的に許容される賦形剤の存在下で、凍結保存および/または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化する工程をさらに含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、アウトプット組成物の細胞は、凍結保護物質の存在下で製剤化される。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、凍結保護物質はDMSOを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、アウトプット組成物の細胞は、容器、任意でバイアルまたはバッグ内で製剤化される。
提供される方法のいずれかの特定の態様は、インキュベーション前に生体試料からCD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞を単離する工程を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、単離は、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて、任意で陽性選択または陰性選択により、細胞を選択することを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、単離は、免疫親和性に基づく選択を行うことを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、生体試料は、対象から得られた初代T細胞を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、対象はヒト対象である。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、生体試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であるかまたはそれを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞または組織に関連し、特異的であり、かつ/または発現する標的抗原に、結合することができる。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、疾患、障害または症状は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患または腫瘍もしくはがんである。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、標的抗原は腫瘍抗原である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、標的抗原は、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん-精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原（dual antigen）、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体α、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体（fetal acetylcholine receptor）、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原、およびユニバーサルタグに関連する抗原から選択される。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、組換え受容体は、機能的非TCR抗原受容体もしくはTCRまたはその抗原結合断片であるかまたはそれを含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、組換え受容体はキメラ抗原受容体（CAR）である。提供される方法のいずれかの特定の態様では、組換え受容体は抗BCMA CARである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、抗原結合ドメインは、抗体、または任意で一本鎖断片であるその抗体断片であるかまたはそれを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、断片は、柔軟なリンカーによって結合された抗体可変領域を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、断片はscFvを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、キメラ抗原受容体は、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達領域を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞内で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分であるかまたはそれを含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に位置する膜貫通ドメインをさらに含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、細胞内シグナル伝達領域は、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。提供される方法のいずれかの特定の態様では、共刺激シグナル伝達領域は、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、共刺激シグナル伝達領域は、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある。提供される方法のいずれかの特定の態様では、閾値数以上の数の細胞を含むアウトプット組成物は、方法の85％超もしくは約85％超、90％超もしくは約90％超または95％超もしくは約95％超の反復の間で製造される。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、無血清培地は、基本培地中の0.5mM〜5mMのL-グルタミンのジペプチド形態、0.5mM〜5mMのL-グルタミン、および少なくとも1つのタンパク質を含み、培地は血清を含まない。提供される方法のいずれかの特定の態様では、L-グルタミンのジペプチド形態は、L-アラニル-L-グルタミンである。
提供される方法のいずれかの特定の態様では、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態の濃度は、2mMまたは約2mMである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様では、無血清培地中のL-グルタミンの濃度は、2mMまたは約2mMである。提供される方法のいずれかの特定の態様では、少なくとも1つのタンパク質は、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンのうちの1つまたは複数、任意でヒトもしくは組換えアルブミン、ヒトもしくは組換えインスリンまたはヒトもしくは組換えトランスフェリンのうちの1つまたは複数を含む。
本明細書において提供される方法のいずれかの態様のいくつかでは、培養の少なくとも一部の間、細胞は、細胞生存率、濃度、密度、数またはそれらの組合せについてモニタリングされる。そのようないずれかの態様のいくつかでは、モニタリングは、光学的方法、任意で顕微鏡観察によって行われる。そのようないずれかの態様のいくつかでは、モニタリングは、明視野顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、微分干渉顕微鏡観察、位相差顕微鏡観察、デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DHM）、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（differential digital holography microscopy）（DDHM）またはそれらの組合せによって行われる。そのようないずれかの態様のいくつかでは、モニタリングは、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）によって行われる。そのようないずれかの態様のいくつかでは、モニタリングは、培養の少なくとも一部の間、断続的または連続的に行われ、任意で、培養中、少なくとも1時間ごと、少なくとも6時間ごと、少なくとも12時間ごと、少なくとも18時間ごと、少なくとも24時間ごとまたは少なくとも26時間ごとに行われる。そのようないずれかの態様のいくつかでは、モニタリングは、細胞がT細胞の閾値数、生存T細胞の閾値数、T細胞の閾値濃度または生存T細胞の閾値濃度に達するまで行われる。そのようないずれかの態様のいくつかでは、モニタリングおよび培養は閉鎖系で行われる。
本明細書において提供される方法のいずれかの態様のいくつかでは、アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋であり、かつ/あるいはアウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である。
本明細書において提供される方法のいずれかの態様のいくつかでは、方法の反復により、任意で、方法が複数の異なる個々の対象間で行われるヒト生体試料から、複数のアウトプット組成物が製造され、複数のアウトプット組成物中のメモリー表現型の細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、複数のアウトプット組成物中のセントラルメモリー表現型の細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、複数のアウトプット組成物中のCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、複数のアウトプット組成物中のCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、複数のアウトプット組成物の操作されたCD4＋T細胞、任意でCAR＋CD4＋T細胞内のセントラルメモリーCD4＋T細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、複数のアウトプット組成物の操作されたCD8＋T細胞、任意でCAR＋CD8＋T細胞内のセントラルメモリーCD8＋T細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、かつ/あるいは複数のアウトプット組成物の操作されたT細胞、任意でCAR＋T細胞内のセントラルメモリーT細胞、任意でCD4＋セントラルメモリーT細胞およびCD8＋セントラルメモリーT細胞の平均割合は、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％である。
本明細書において提供される方法のいずれかの態様のいくつかでは、方法は、方法が複数の異なる個々の対象間で行われるヒト生体試料の少なくとも約80％、約90％、約95％、約97％、約99％、約100％または100％において、アウトプット組成物中でCARを発現する細胞の所定の特徴、任意で閾値数を示すアウトプット組成物を製造する。そのようないずれかの態様のいくつかでは、複数の異なる個々の対象は、疾患または症状を有する対象を含む。そのようないずれかの態様のいくつかでは、疾患または症状はがんである。そのようないずれかの態様のいくつかでは、がんは、血液がんであり、任意で多発性骨髄腫である。そのようないずれかの態様のいくつかでは、組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、グランザイムB-および/またはCD127＋であり、かつ/あるいはアウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供される任意の方法によって作製される操作された細胞を含む組成物である。提供される組成物のいずれかのいくつかの態様は、薬学的に許容される担体を含む。提供される組成物のいずれかの特定の態様は、凍結保護物質、任意でDMSOを含む。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供される任意の組成物と、対象にアウトプット組成物を投与するための指示書とを含む製造物品である。提供される製造物品のいずれかの特定の態様では、対象は、疾患または症状を有し、任意で、組換え受容体は、疾患もしくは症状に関連するまたは疾患もしくは症状の細胞上に発現するもしくは存在する抗原を特異的に認識するかまたはその抗原に特異的に結合する。
詳細な説明
本明細書において提供されるのは、組換え受容体を発現する操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞などの操作された細胞の組成物を生成または製造する方法である。特定の態様では、方法は、刺激条件下で、インプット細胞の組成物などの細胞をインキュベートする工程、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを形質導入またはトランスフェクトすることにより、および/または細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で操作された細胞を培養することにより、細胞を遺伝子操作する工程を含むプロセスに関連して使用される。
本明細書において提供されるのは、組換え受容体を発現する操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞などの操作された細胞の組成物を生成または製造する方法である。特定の態様では、方法は、刺激条件下で、インプット細胞の組成物などの細胞をインキュベートする工程、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを形質導入またはトランスフェクトすることにより、および/または細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で操作された細胞を培養することにより、細胞を遺伝子操作する工程を含むプロセスに関連して使用される。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、2:1〜1:2の比でCD4＋T細胞とCD8＋T細胞とを組み合わせてインプット組成物を生成する工程、および刺激条件下でインプット組成物をインキュベートする工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法である。特定の態様では、方法は、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有するインプット組成物をインキュベートする工程を含む。特定の態様では、インプット組成物は、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、設定されたまたは固定された量の細胞、例えば、細胞組成物の少なくとも1×106個、少なくとも10×106個、少なくとも100×106個もしくは少なくとも1,000×106個または約1×106個、約10×106個、約100×106個もしくは約1,000×106個の細胞に組換え受容体を導入する工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法である。いくつかの態様では、細胞は刺激された細胞である。特定の態様では、細胞は生存細胞である。特定の態様では、導入は、刺激された組成物のT細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入する工程を含む。特定の態様では、細胞組成物は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の細胞を含む。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、（i）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程、ここで、インプット組成物は、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物は、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、（ii）刺激された組成物からの300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程、ここで、導入は、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入する工程を含み、ならびに（iii）操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養し、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を製造する工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法である。
キメラ抗原受容体を発現する操作されたT細胞を生成することを含め、遺伝子操作されたT細胞集団を生成するための様々なプロセスが利用可能である。ただし、いくつかの態様では、これらのプロセスのいくつかは、操作された細胞を生成するために長いまたは比較的長い期間を必要とし得る。特定の態様では、これらのプロセスのいくつかは、異なる対象全体から得られた、治療に適した操作された細胞を首尾よく生成する能力が異なり得る。特定の態様では、これらのプロセスのいくつかは、細胞の健康、生存率、形質導入効率、および/または細胞活性などのパラメータについて高度の変動を伴う遺伝子操作されたT細胞組成物を製造し得る。
提供される態様は、これらの問題のうちの1つまたは複数に対処する。特定の態様では、提供される方法は、いくつかの既存のプロセスと比較して、短い時間または比較的短い期間で、例えば自己細胞療法などの治療に適した操作されたT細胞を生成する。さらに、いくつかの態様では、提供される方法は、異なる対象から収集された試料から操作された細胞を作製するために必要な期間に関して、一貫性が高く、変動が少ないプロセスをもたらす。特定の態様では、提供される方法は、高い割合の対象から、細胞療法に適した操作されたT細胞を首尾よく生成することができる。特定の態様では、得られた細胞組成物は、健康な細胞、例えば、生存可能および/またはアポトーシスマーカーを発現しない細胞の高いまたは比較的高い部分、組換え受容体を発現する細胞、および/または抗原刺激に応答して、例えば細胞毒性、抗腫瘍および/またはサイトカイン産生などの高いまたは比較的高い活性を有する細胞の高いまたは比較的高い部分を含有する。いくつかの態様では、提供される方法は、操作された細胞産物を作製するためのプロセスを提供し、いくつかの局面では、例えば、（例えば、自己細胞療法の文脈では）治療組成物を用いて治療される対象または患者などの異なる個々の対象または患者に各々由来するすべてのまたは高い割合の試料についてなど、多数のまたは大きな割合の試料について、治療用細胞組成物を生成することができる、例えば、特定の必要なまたは所望の特徴を有するそのような組成物を生成することができるものなど、閾値率を超える高い成功率などの特定の成功率を有する。いくつかの局面では、対象または患者は、疾患または症状、例えば、がん、例えば、血液がん、例えば、多発性骨髄腫を有する。いくつかの局面では、試料（その高い割合のために、それから治療用細胞組成物を生成することが可能である）は、例えば、試料またはその細胞の細胞表現型または他のパラメータに関して可変であるものを含む患者試料である。
いくつかの態様では、提供される方法は、例えば、他のプロセスを介して生成された細胞組成物と比較して、改善されたまたは高度の細胞の健康を有する操作されたT細胞組成物を生成する。いくつかの態様では、組成物は、アポトーシスマーカー陰性である細胞を高い割合で含む。いくつかの態様では、提供される方法は、ロバストにサイトカインを産生する多機能細胞を含むT細胞組成物を生成する。いくつかの態様では、提供される方法は、メモリー表現型が豊富であり、セントラルメモリー表現型が豊富であり、かつ/またはCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である細胞が豊富であるT細胞組成物を生成する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも20％以上、少なくとも25％以上、少なくとも30％以上、少なくとも35％以上、少なくとも40％以上、少なくとも45％以上、少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上もしくは少なくとも80％以上（または、方法を使用して製造された試料の少なくとも半分もしくは大部分について、または平均で、方法を使用して製造された試料について、組成物中の細胞の少なくとも20％以上、少なくとも25％以上、少なくとも30％以上、少なくとも35％以上、少なくとも40％以上、少なくとも45％以上、少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上または少なくとも80％以上）、組成物中のT細胞の少なくとも20％以上、少なくとも25％以上、少なくとも30％以上、少なくとも35％以上、少なくとも40％以上、少なくとも45％以上、少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上もしくは少なくとも80％以上、または組成物中の操作されたT細胞の少なくとも20％以上、少なくとも25％以上、少なくとも30％以上、少なくとも35％以上、少なくとも40％以上、少なくとも45％以上、少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上もしくは少なくとも80％以上は、セントラルメモリー表現型のT細胞であり、CD27＋、CD28＋であり、CCR7＋、CD45RA-であり、および/またはCCR7＋、CD45RO＋である。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、もしくは少なくとも80％以上もしくは少なくとも85％以上もしくは少なくとも90％以上もしくは少なくとも95％以上（または、方法を使用して製造された試料の少なくとも半分もしくは大部分について、または平均で、方法を使用して製造された試料について、組成物中の細胞の少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、もしくは少なくとも80％以上もしくは少なくとも85％以上もしくは少なくとも90％以上もしくは少なくとも95％以上）、組成物中のT細胞の少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、もしくは少なくとも80％以上もしくは少なくとも85％以上もしくは少なくとも90％以上もしくは少なくとも95％以上、または組成物中の操作されたT細胞の少なくとも50％以上、少なくとも55％以上、少なくとも60％以上、少なくとも65％以上、少なくとも70％以上、少なくとも75％以上、もしくは少なくとも80％以上もしくは少なくとも85％以上もしくは少なくとも90％以上もしくは少なくとも95％以上は、メモリー表現型のT細胞であり、CD45RA-であり、および/またはCD45RO＋である。
特定の態様では、提供される方法は、細胞療法に使用するのに適した操作された細胞を効率的に作製または生成するためのプロセスに関連して使用される。特定の態様では、プロセスの各工程に使用されるタイミング、条件および試薬は、後続の各工程および/またはプロセス全体の効率を改善する。例えば、いくつかの態様では、細胞は、所望の効果、例えば、細胞の刺激、または形質導入効率の改善を達成するのに十分高い細胞濃度であるが、後続の処理工程での増殖の遅延または生存率の低下を回避するのに十分低い濃度で、インキュベート、形質導入および/または培養され得る。さらに、いくつかの態様では、プロセスの工程は、後続のプロセス工程および/またはプロセス全体の効率を改善するために、特定の時点で開始または終了するようにタイミングが取られる。例えば、いくつかの態様では、インキュベーションおよび操作のための工程（例えば、細胞の形質導入またはトランスフェクション）は、別の方法よりもプロセスの早い段階で完了し、これにより、特定の態様では、後続の培養工程中の細胞の生存率および/または健康、および/または増殖および拡大増殖の速度が改善される。したがって、一局面では、各工程の特定のタイミング、条件および試薬は、個々の工程を越えて細胞に影響を及ぼし、特定の態様では、プロセス全体の性能に影響を与える。
いくつかの態様では、方法は、代替プロセスよりも高速かつ効率が高くなり得る方法で、細胞療法に適した遺伝子操作された細胞を生成または作製するプロセスに関連して使用される。特定の態様では、本明細書において提供される方法は、代替プロセスから可能であり得るものよりも広い対象集団から、操作された細胞の組成物を生成または製造することについて高い成功率を有する。特定の態様では、提供される方法によって作製または生成された操作された細胞は、別の方法によって作製された細胞よりも、健康、生存率、活性化が増大し得、組換え受容体の発現が増大し得る。したがって、いくつかの局面では、細胞療法のために操作された細胞を生成するための提供される方法の速度および効率は、いくつかの別の方法によって可能であり得るものよりも広い対象集団に対して、自己療法などの細胞療法をさらに容易に計画および調整することを可能にする。
本出願で言及される特許文書、科学論文およびデータベースを含むすべての刊行物は、あたかも各個々の刊行物が参照により個別に組み入れられるのと同程度に、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み入れられる。本明細書において記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開された出願および他の刊行物に記載される定義と相反するか、そうでなければ矛盾する場合、本明細書において記載される定義は、参照により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。
本明細書において用いられるセクションの見出しは、編成のみを目的としたものであり、記述されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。
I.操作細胞を生成するためのプロセス
本明細書において提供されるのは、組換えタンパク質、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの組換え受容体を発現する操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞などの操作された細胞のアウトプット組成物を生成する方法である。特定の態様では、本明細書において提供される方法は、細胞療法の製造、生成または作製に関連して使用され、細胞の単離、分離、選択、活性化または刺激、形質導入、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および/または製剤化のための工程などの追加の処理工程に関連して使用され得る。いくつかの態様では、操作された細胞、例えば、操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を生成または作製する方法は、対象から得られた細胞の単離、刺激条件下での細胞の調製、処理、インキュベーション、および/または細胞の操作（例えば形質導入）のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、方法は、生体試料から、インプット細胞、例えば、初代CD4＋細胞および初代CD8＋細胞を最初に単離、例えば、選択または分離し;インプット細胞を刺激条件下でインキュベートし、ベクター粒子、例えば、ウイルスベクター粒子を用いて操作して、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって細胞に組換えポリヌクレオチドを導入し;操作された細胞、例えば、形質導入された細胞を培養して、例えば、細胞を拡大増殖させ;容器、例えば、バッグまたはバイアルに、細胞の全部または一部を収集し、採取し、および/または充填して、細胞をアウトプット組成物に製剤化する順序で行われる処理工程を含む。いくつかの態様では、生成されたアウトプット組成物の細胞は、凍結保存の前または後に、同じ対象に再導入される。いくつかの態様では、操作された細胞のアウトプット組成物は、自己細胞療法などの療法に使用するのに適している。
本明細書において提供されるのは、組換えタンパク質、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの組換え受容体を発現する操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞などの操作された細胞のアウトプット組成物を生成する方法である。特定の態様では、本明細書において提供される方法は、細胞療法の製造、生成または作製に関連して使用され、細胞の単離、分離、選択、活性化または刺激、形質導入、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および/または製剤化のための工程などの追加の処理工程に関連して使用され得る。いくつかの態様では、操作された細胞、例えば、操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を生成または作製する方法は、対象から得られた細胞の単離、刺激条件下での細胞の調製、処理、インキュベーション、および/または細胞の操作（例えば形質導入）のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、方法は、生体試料から、インプット細胞、例えば、初代CD4＋細胞および初代CD8＋細胞を最初に単離、例えば、選択または分離し;インプット細胞を刺激条件下でインキュベートし、ベクター粒子、例えば、ウイルスベクター粒子を用いて操作して、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって細胞に組換えポリヌクレオチドを導入し;操作された細胞、例えば、形質導入された細胞を培養して、例えば、細胞を拡大増殖させ;容器、例えば、バッグまたはバイアルに、細胞の全部または一部を収集し、採取し、および/または充填して、細胞をアウトプット組成物に製剤化する順序で行われる処理工程を含む。いくつかの態様では、生成されたアウトプット組成物の細胞は、凍結保存の前または後に、同じ対象に再導入される。いくつかの態様では、操作された細胞のアウトプット組成物は、自己細胞療法などの療法に使用するのに適している。
特定の態様では、提供される方法は、細胞の初期組成物またはインプット組成物から、組換え受容体を発現する細胞のアウトプット組成物を生成することに関連して使用される。特定の態様では、インプット組成物は、濃縮T細胞、濃縮CD4＋T細胞および/または濃縮CD8＋T細胞（本明細書において、以降、それぞれ、濃縮T細胞の組成物、濃縮CD4＋T細胞の組成物、および濃縮CD8＋T細胞の組成物とも呼ばれる）を含有する細胞組成物からの細胞を組み合わせ、混合し、および/またはプールすることによって、製造され、生成され、および/または作製される。いくつかの態様では、細胞のインプット組成物は、組み合わせられた、混合された、および/またはプールされたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の組成物である。特定の態様では、提供される方法は、以下のうちの1つまたは複数、すなわち、細胞、例えば、インプット組成物の細胞を活性化および/または刺激すること;活性化および/または刺激された細胞を遺伝子操作して、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入すること;および/または、例えば、増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された細胞を培養することに関連して使用される。特定の態様では、方法はまた、生体試料から細胞を単離または選択して、例えば、対象から採取され、収集され、および/または得られた生体試料から濃縮T細胞のインプット組成物を生成することに関連して使用され得る。特定の態様では、提供される方法は、細胞がインキュベート、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクトおよび/または培養された後に、濃縮T細胞の組成物を採取、収集および/または製剤化することに関連して使用され得る。
いくつかの態様では、刺激条件下での細胞のインキュベーションは、刺激試薬、例えば、セクションI-B-1などの本明細書において記載される刺激試薬とともに細胞をインキュベートすることであるか、それを含む。特定の態様では、刺激条件下で、5×106細胞/mL未満の濃度などの設定されたまたは固定された濃度で、少なくとも100×106個の細胞を超える量の細胞などの設定されたまたは固定された量の細胞がインキュベートされる。特定の態様では、インキュベーションは、2日未満の期間などの設定されたもしくは固定された期間にわたり、または18時間〜30時間の期間にわたり行われる。
特定の態様では、本明細書において提供される方法は、細胞の操作、例えば、形質導入またはトランスフェクションに関連して行われる。いくつかの態様では、設定されたまたは固定された量の細胞、例えば、生存CD4＋細胞および生存CD8＋細胞が操作される。いくつかの態様では、刺激条件下で、3×106細胞/mL未満の濃度などの設定されたまたは固定された濃度で、少なくとも10×106個の細胞を超える量の細胞がインキュベートされる。特定の態様では、操作は、2日未満の期間などの設定されたもしくは固定された期間にわたり、または18時間〜30時間の期間にわたり行われる。
特定の態様では、培養工程の少なくとも一部は、例えば、閉鎖系のバイオリアクターを用いて、一定の混合および/または灌流を用いて行われる。特定の態様では、混合および/または灌流には、使用済みまたは古い細胞培地または溶液を新鮮な培地または溶液に安定しておよび/または段階的に交換することが組み込まれる。いくつかの態様では、培養は、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの着手または開始から2日以内、3日以内、4日以内または5日以内;インプット組成物を生成するために、細胞、例えば、CD4＋細胞およびCD8＋細胞を混合し、プールし、および/または組み合わせてから2日以内、3日以内、4日以内または5日以内;生体試料が収集されてから3日以内、4日以内、5日以内または6日以内;および/または生体試料由来の濃縮T細胞、例えば、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞の組成物の単離、選択および/または濃縮から3日以内、4日以内、5日以内または6日以内の期間内に開始される。
いくつかの態様では、1つまたは複数のプロセス工程は、少なくとも部分的に、無血清培地中で行われる。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたおよび/または正確に規定された細胞培養培地である。特定の態様では、無血清培地は、処理された、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過された、制御された培地である。いくつかの態様では、無血清培地はタンパク質を含有する。特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
いくつかの態様では、提供される方法は、例えば、養子細胞療法などの臨床用途のための細胞の調製での1つもしくは複数の、またはあらゆる工程が、細胞を非無菌状態に曝すことなく行われるように行われる。そのようなプロセスのいくつかの態様では、細胞は、いずれも閉鎖系内で、単離、分離または選択、形質導入、洗浄、任意で活性化または刺激および製剤化される。いくつかの態様では、工程のうちの1つまたは複数は、閉鎖系または密閉された装置とは別に行われる。いくつかのそのような態様では、濃縮細胞の組成物は、別個の閉鎖系への無菌移送などにより、無菌条件下で閉鎖系または密閉された装置から離れて移送される。
特定の態様では、濃縮T細胞の組成物は、組換え受容体を発現する濃縮T細胞のアウトプット組成物を生成するためのプロセスの任意の段階または工程の前、最中または後に、0°C未満、-20°C未満、または-70°Cもしくは-80°C、もしくは-70°C未満もしくは-80°C未満で、収集され、凍結保護のために製剤化され、クライオ凍結され（cryofrozen）、および/または保存され得る。いくつかの態様では、細胞は、1日未満、2日未満、3日未満、4日未満、5日未満、6日未満、7日未満、8日未満、9日未満もしくは10日未満の期間にわたり、または1週間未満、2週間未満、3週間未満、4週間未満、5週間未満、6週間未満、7週間未満、8週間未満の期間にわたり、または少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間もしくは少なくとも8週間にわたり、または8週間超にわたり保存され得る。保存後、濃縮T細胞の組成物を解凍してもよく、プロセスの同じ時点から処理を再開してもよい。いくつかの態様では、濃縮T細胞のインプット組成物は、その後の処理、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの前にクライオ凍結および保存される。特定の態様では、濃縮T細胞の培養および/または製剤化された組成物は、例えば、自己細胞療法として対象に投与される前にクライオ凍結および保存される。
特定の態様では、本明細書において提供される方法は、刺激条件下で細胞をインキュベートし、細胞を形質導入して組換え受容体、例えば、CARを発現させ、増殖または拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養する工程を含むプロセスによって、操作された細胞が生成されるプロセスに関連して使用される。特定の態様では、インキュベーションは、18〜30時間、例えば、24時間または約24時間行われ、続いて、18〜30時間、例えば、24時間または約24時間にわたり形質導入が行われる。特定の態様では、細胞は、細胞が刺激および形質導入された後に刺激および/または拡大増殖を促進する条件下で培養される。特定の態様では、細胞と刺激試薬とを接触させることなどによってインキュベーションが開始され、形質導入は、インキュベーションが開始された後48時間以内、36時間以内または30時間以内に開始される。いくつかの態様では、培養は、インキュベーションおよび形質導入後に行われ、培養は、インキュベーションが開始された後72時間以内、66時間以内または60時間以内に開始される。特定の態様では、培養は、細胞の閾値の量、密度および/または拡大増殖が達成されるまで、細胞の閾値の量、密度および/または拡大増殖が達成されてから少なくとも1日後まで、および/またはインキュベーションの開始から少なくとも8日後、少なくとも9日後、少なくとも10日後、少なくとも11日後または少なくとも12日後まで行われる。
特定の態様では、プロセスの任意の段階または工程で、細胞の一部がサンプリングまたは収集されてもよく、例えば、組成物が閉鎖系に留まる間に、例えば、単離、インキュベーション、操作、培養および/または製剤化中に、濃縮T細胞の組成物から細胞が採取されてもよい。特定の態様では、そのような細胞は、限定されることなく、生存率、アポトーシス、活性化、刺激、成長および/または消耗を含むメーカー、特徴または特性について分析されてもよい。いくつかの態様では、濃縮T細胞の組成物が閉鎖系に留まる間に、自動化されたプロセスによって細胞がサンプリングまたは収集される。いくつかの態様では、サンプリングまたは収集された細胞の分析は自動化されている。特定の態様では、分析は、無菌条件下で閉鎖系で行われる。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、（例えば、組成物中のT細胞を活性化するために）刺激条件下でインプット細胞組成物をインキュベートして、細胞組成物を操作して（例えば形質導入）、組換え受容体、例えば、CARを発現させる工程、細胞の増殖または拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養する工程、および/または細胞を採取または収集して、操作された細胞、例えば、細胞療法のための操作されたT細胞を含む細胞組成物を生成する工程を含む、操作された細胞が生成されるプロセスである。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、以下を含む刺激条件下でインキュベートされる:刺激試薬（例えば、セクションI-B-1に記載されるようなビーズ試薬）：細胞の比が、1:1または約1:1である;インプット組成物が、1:1または約1:1の比でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む（例えば、CD4＋T細胞が濃縮された組成物およびCD8＋T細胞が濃縮された組成物を1:1または約1:1の比でプールし、混合し、および/または組み合わせて、インプット組成物を生成することができる）;刺激条件下での、例えば、刺激試薬とのインキュベーションの総持続時間が、約12時間〜約36時間、例えば、約18時間〜約30時間である;刺激試薬の存在下などの刺激条件下で、約5×105細胞/mL〜約5×107細胞/mLの密度、例えば、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLで、細胞、例えば、インプット組成物の細胞をインキュベートする;および/または無血清培地（例えば、IL-2、IL-7およびIL-15などの1つまたは複数の組換えサイトカインを含む無血清培地）中で細胞、例えば、インプット組成物の細胞を刺激および/または活性化する。いくつかの態様では、細胞は、以下を含む条件下で操作される:例えば、スピノキュレーション（例えば遠心分離接種）などの遠心分離下、例えば、約1600×gで約60分にわたり、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子と細胞を接触させる;約5×105細胞/mL〜約5×107細胞/mLの密度、例えば、1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLで細胞を操作する;刺激条件下で培養した組成物からの約100×106個の細胞を操作する;操作工程、例えば、形質導入の総持続時間が、約12時間〜約36時間、例えば、約18時間〜約30時間である;および/または無血清培地（例えば、IL-2、IL-7およびIL-15などの1つまたは複数の組換えサイトカインを含む無血清培地）中で細胞を操作する。いくつかの態様では、細胞は、以下を含む、細胞の増殖または拡大増殖を促進する条件下で培養される:揺動および/または灌流条件下で細胞を培養する;および/または無血清培地（例えば、IL-2、IL-7およびIL-15などの1つまたは複数の組換えサイトカインを含み、任意で、刺激/活性化および/または操作に使用される無血清培地よりも高濃度の組換えサイトカインを含む無血清培地）中で細胞を培養する。いくつかの態様では、細胞が閾値の量、濃度および/または拡大増殖、例えば、少なくとも約3500×106個の細胞または約5500×106個の細胞の閾値細胞数（例えば、総有核細胞数）に達した際に、培養が終了し、細胞が採取される。いくつかの態様では、細胞が刺激/活性化、操作、培養および/または採取プロセス中の所与の時点で標的または閾値を達成していない場合、標的または閾値に達する後の時点まで、細胞を刺激/活性化し、操作し、および/または培養してもよい。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、（例えば、組成物中のT細胞を活性化するために）刺激条件下でインプット細胞組成物をインキュベートして、細胞組成物を操作して（例えば形質導入）、組換え受容体、例えば、CARを発現させる工程、細胞の増殖または拡大増殖を促進する条件下で細胞を培養する工程、および/または細胞を採取または収集して、操作された細胞、例えば、細胞療法のための操作されたT細胞を含む細胞組成物を生成する工程を含む、操作された細胞が生成されるプロセスである。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、以下を含む刺激条件下でインキュベートされる:刺激試薬（例えば、セクションI-B-1に記載されるようなビーズ試薬）：細胞の比が、1:1または約1:1である;インプット組成物が、1:1または約1:1の比でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む（例えば、CD4＋T細胞が濃縮された組成物およびCD8＋T細胞が濃縮された組成物を1:1または約1:1の比でプールし、混合し、および/または組み合わせて、インプット組成物を生成することができる）;刺激条件下での、例えば、刺激試薬とのインキュベーションの総持続時間が、約12時間〜約36時間、例えば、約18時間〜約30時間である;刺激試薬の存在下などの刺激条件下で、約5×105細胞/mL〜約5×107細胞/mLの密度、例えば、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLで、細胞、例えば、インプット組成物の細胞をインキュベートする;および/または無血清培地（例えば、IL-2、IL-7およびIL-15などの1つまたは複数の組換えサイトカインを含む無血清培地）中で細胞、例えば、インプット組成物の細胞を刺激および/または活性化する。いくつかの態様では、細胞は、以下を含む条件下で操作される:例えば、スピノキュレーション（例えば遠心分離接種）などの遠心分離下、例えば、約1600×gで約60分にわたり、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子と細胞を接触させる;約5×105細胞/mL〜約5×107細胞/mLの密度、例えば、1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLで細胞を操作する;刺激条件下で培養した組成物由来の少なくとも約100×106個の細胞かつ最大約200x106個の細胞を操作する;操作工程、例えば、形質導入の総持続時間が、約12時間〜約36時間、例えば、約18時間〜約30時間である;および/または無血清培地（例えば、IL-2、IL-7およびIL-15などの1つまたは複数の組換えサイトカインを含む無血清培地）中で細胞を操作する。いくつかの態様では、細胞は、以下を含む、細胞の増殖または拡大増殖を促進する条件下で培養される:揺動および/または灌流条件下で細胞を培養する;および/または無血清培地（例えば、IL-2、IL-7およびIL-15などの1つまたは複数の組換えサイトカインを含み、任意で、刺激/活性化および/または操作に使用される無血清培地よりも高濃度の組換えサイトカインを含む無血清培地）中で細胞を培養する。いくつかの態様では、細胞が閾値の量、濃度および/または拡大増殖、例えば、少なくとも約2400×106個の細胞の閾値細胞数（例えば、総有核細胞数）を達成した際に、および細胞が閾値生存率を達成し、例えば、細胞の少なくとも約75％または少なくとも約85％が生存可能である場合に、培養が終了し、細胞が採取される。いくつかの態様では、細胞が刺激/活性化、操作、培養および/または採取プロセス中の所与の時点で標的または閾値を達成していない場合、標的または閾値に達する後の時点まで、細胞を刺激/活性化し、操作し、および/または培養してもよい。
いくつかの態様では、提供される方法によって作製および/または処理される細胞または細胞組成物は、例示的なプロセスおよび/または代替プロセスによって処理または作製された細胞または細胞組成物と比較され得る。いくつかの態様では、代替プロセスおよび/または例示的なプロセスは、1つまたは複数の特定の局面では異なり得るが、そうでなければ、比較される提供される方法の態様または局面の類似または同一の特徴、局面、工程、段階、試薬および/または条件を含む。例えば、提供される方法が試薬の存在下で細胞をインキュベートすることに関連して使用される場合、そのような細胞は、例示的なプロセスおよび/または代替プロセスでは試薬とともにインキュベートされない細胞と比較され得る。いくつかの態様では、別段の指定がない限り、提供される方法および例示的なプロセスおよび/または代替プロセスは、単離、選択、濃縮、活性化、刺激、操作、トランスフェクション、形質導入、培養および/または製剤化のための類似または同一の工程を用いるなど、他の点では類似している、および/または同一であろう。いくつかの態様では、別段の指定がない限り、提供される方法および代替プロセスは、同一または類似のタイプの生体試料から細胞を単離、選択および/または濃縮し、および/または同一の細胞型の細胞および/またはインプット細胞を処理する。
薬学的組成物および製剤を含む、方法によって調製された細胞および組成物、ならびに方法を行うためのキット、システムおよび装置も提供される。また、養子細胞療法のための方法などの治療法を含む、細胞の使用方法、および方法によって調製された組成物、ならびに対象に投与するための薬学的組成物も提供される。
A.試料および細胞調製
特定の態様では、提供される方法は、生体試料から細胞を単離、選択および/または濃縮して、濃縮細胞、例えば、T細胞の1つまたは複数のインプット組成物を生成することに関連して使用される。いくつかの態様では、提供される方法は、特定の疾患または症状を有するか、細胞療法を必要とするか、細胞療法が行われる対象などの対象から得られるまたは対象に由来するものなどの生体試料から得られた細胞またはその組成物の単離を含む。いくつかの局面では、対象は、ヒト、例えば、特定の治療的介入、例えば、細胞がそのために単離、処理および/または操作される養子細胞療法を必要とする患者である対象である。したがって、いくつかの態様では、細胞は、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料には、組織、体液、および対象から直接採取された他の試料が含まれる。生体試料は、生物学的供給源から直接得られる試料、または処理される試料であり得る。生体試料には、限定されることなく、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器の試料が含まれ、これらに由来する処理済み試料が含まれる。
特定の態様では、提供される方法は、生体試料から細胞を単離、選択および/または濃縮して、濃縮細胞、例えば、T細胞の1つまたは複数のインプット組成物を生成することに関連して使用される。いくつかの態様では、提供される方法は、特定の疾患または症状を有するか、細胞療法を必要とするか、細胞療法が行われる対象などの対象から得られるまたは対象に由来するものなどの生体試料から得られた細胞またはその組成物の単離を含む。いくつかの局面では、対象は、ヒト、例えば、特定の治療的介入、例えば、細胞がそのために単離、処理および/または操作される養子細胞療法を必要とする患者である対象である。したがって、いくつかの態様では、細胞は、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料には、組織、体液、および対象から直接採取された他の試料が含まれる。生体試料は、生物学的供給源から直接得られる試料、または処理される試料であり得る。生体試料には、限定されることなく、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器の試料が含まれ、これらに由来する処理済み試料が含まれる。
いくつかの局面では、試料は、血液または血液由来試料であるか、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であるか、それらに由来する。例示的な試料には、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、大腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃または他の臓器、および/またはそれらに由来する細胞が含まれる。細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈では、試料には、自家および同種の供給源由来の試料が含まれる。
いくつかの例では、対象の循環血液由来の細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面では、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球、血小板を含むリンパ球を含有し、いくつかの局面では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。
いくつかの態様では、対象から収集された血球は、例えば、血漿画分を除去するために、および後続の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄される。いくつかの態様では、細胞はリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄される。いくつかの態様では、洗浄溶液は、カルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多くのまたはあらゆる二価カチオンを欠く。いくつかの局面では、洗浄工程は、製造業者の指示に従って、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサー、Baxter）によって達成される。いくつかの局面では、洗浄工程は、製造業者の指示に従って、接線流濾過（TFF）によって達成される。いくつかの態様では、細胞は、洗浄後、例えば、Ca2＋/Mg2＋を含まないPBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の態様では、血球試料の成分が除去され、細胞が培地に直接再懸濁される。
いくつかの態様では、調製方法は、形質導入および操作のための単離、選択および/または濃縮および/またはインキュベーションの前または後のいずれかに、細胞を凍結、例えば、凍結保存する工程を含む。いくつかの態様では、凍結および後続の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球を、およびある程度まで単球を除去する。いくつかの態様では、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液に懸濁される。いくつかの局面では、様々な公知の凍結溶液およびパラメータのいずれかが使用され得る。いくつかの態様では、細胞は、例えば、12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％もしくは5.0％、もしくは約12.5％、約12.0％、約11.5％、約11.0％、約10.5％、約10.0％、約9.5％、約9.0％、約8.5％、約8.0％、約7.5％、約7.0％、約6.5％、約6.0％、約5.5％もしくは約5.0％のDMSO、または1％〜15％もしくは約1％〜約15％、6％〜12％もしくは約6％〜約12％、5％〜10％もしくは約5％〜約10％、もしくは6％〜8％もしくは約6％〜約8％のDMSOの最終濃度を有する培地および/または溶液中で凍結、例えば、クライオ凍結または凍結保存される。特定の態様では、細胞は、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％もしくは0.25％、もしくは約5.0％、約4.5％、約4.0％、約3.5％、約3.0％、約2.5％、約2.0％、約1.5％、約1.25％、約1.0％、約0.75％、約0.5％もしくは約0.25％のHSA、または0.1％〜-5％、0.25％〜4％、0.5％〜2％もしくは1％〜2％のHSAの最終濃度を有する培地および/または溶液中で凍結、例えば、クライオ凍結または凍結保存される。一例には、20％のDMSOおよび8％のヒト血清アルブミン（HSA）、または他の好適な細胞凍結培地を含有するPBSを使用することが含まれる。次いで、これを培地で1:1に希釈し、DMSOおよびHSAの最終濃度をそれぞれ10％および4％にする。次いで、一般に、毎分1°または約1°の速度で-80℃までまたは約-80℃まで細胞を凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵する。
いくつかの態様では、細胞または集団の単離は、1つまたは複数の調製および/または非親和性に基づく細胞分離工程を含む。いくつかの例では、細胞を洗浄、遠心分離および/または1つまたは複数の試薬の存在下でインキュベートして、例えば、不要な成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性のある細胞を溶解または除去する。いくつかの例では、密度、付着特性、サイズ、感度および/または特定の成分に対する耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて細胞が分離される。いくつかの態様では、方法は、赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球細胞の調製、およびパーコール勾配またはフィコール勾配による遠心分離などの密度に基づく細胞分離方法を含む。
いくつかの態様では、選択工程の少なくとも一部は、細胞と選択試薬とのインキュベーションを含む。表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸などの1つまたは複数の特異的分子の細胞内または細胞上の発現または存在に基づいて1つまたは複数の異なる細胞型を選択するための1つまたは複数の選択試薬を使用して行われ得る選択方法の一部としての単数または複数の選択試薬とのインキュベーション。いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づく分離のための単数または複数の選択試薬を使用する任意の公知の方法が使用され得る。いくつかの態様では、単数または複数の選択試薬は、親和性または免疫親和性に基づく分離である分離をもたらす。例えば、いくつかの局面では、選択は、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団を分離するための単数または複数の試薬とのインキュベーションを含み、これは、例えば、抗体とのインキュベーション、またはそのようなマーカーと特異的に結合する結合パートナーとのインキュベーション、続いて、一般に洗浄工程、および抗体または結合パートナーに結合していない細胞から抗体または結合パートナーに結合した細胞を分離することによる。
そのようなプロセスのいくつかの局面では、ある体積の細胞が、ある量の所望の親和性に基づく選択試薬と混合される。免疫親和性に基づく選択は、分離される細胞と、細胞上のマーカー、例えば、固体表面の抗体または他の結合パートナー、例えば、粒子に特異的に結合する分子との間の有利なエネルギー的な相互作用をもたらす任意のシステムまたは方法を使用して行うことができる。いくつかの態様では、方法は、細胞のマーカーに特異的な選択剤（例えば抗体）によってコーティングされたビーズ、例えば、磁性ビーズなどの粒子を使用して行われる。粒子（例えばビーズ）は、エネルギー的に有利な相互作用を促進するために一定の細胞密度と粒子（例えばビーズ）との比で、チューブまたはバッグなどの容器内の細胞とともに、振盪または混合しながら、インキュベートまたは混合することができる。他の場合では、方法は、選択の全部または一部が、例えば、遠心回転下で、遠心チャンバの内部キャビティ内で行われる、細胞の選択を含む。いくつかの態様では、細胞と、選択試薬、例えば、免疫親和性に基づく選択試薬とのインキュベーションは、遠心チャンバ内で行われる。特定の態様では、単離または分離は、国際特許出願公開番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載されているシステム、デバイスまたは装置を使用して行われる。一例では、システムは、国際公開番号WO2016/073602に記載されているシステムである。
いくつかの態様では、遠心チャンバのキャビティ内でそのような選択工程またはその一部（例えば、抗体被覆粒子、例えば、磁性ビーズとのインキュベーション）を行うことによって、使用者は、様々な溶液の体積、処理中の溶液の追加、およびそのタイミングなどの特定のパラメータを制御することができ、これは、他の利用可能な方法と比較して利点を提供することができる。例えば、インキュベーション中にキャビティ内の液体の体積を減少させる機能により、キャビティ内の細胞の総数に影響を与えることなく、選択に使用される粒子（例えばビーズ試薬）の濃度、ひいては溶液の化学ポテンシャルを増加させることができる。これにより、処理されている細胞と選択に使用される粒子との間の対の相互作用を強化することができる。いくつかの態様では、例えば、本明細書において記載されるシステム、回路および制御と関連する場合にチャンバ内でインキュベーション工程を行うことにより、使用者はインキュベーション中の所望の時間に溶液を撹拌することができ、これにより、相互作用を改善することもできる。
いくつかの態様では、細胞と選択試薬とのインキュベーションを含む選択工程の少なくとも一部は、遠心チャンバ内で行われる。そのようなプロセスのいくつかの局面では、ある体積の細胞と、製造業者の指示に従って同一の数の細胞および/または体積の細胞を選択するためにチューブまたは容器内で同様の選択を行う際に通常使用される量よりもはるかに少ない量の所望の親和性に基づく選択試薬とが混合される。いくつかの態様では、製造業者の指示に従って、同一の数の細胞および/または同一の体積の細胞について、チューブまたは容器ベースのインキュベーションでの細胞の選択に使用される同一の選択試薬の量の5％以下もしくは約5％以下、10％以下もしくは約10％以下、15％以下もしくは約15％以下、20％以下もしくは約20％以下、25％以下もしくは約25％以下、50％以下もしくは約50％以下、60％以下もしくは約60％以下、70％以下もしくは約70％以下、または80％以下もしくは約80％以下である単数または複数の選択試薬の量が使用される。
いくつかの態様では、選択、例えば、細胞の免疫親和性に基づく選択のために、チャンバのキャビティ内で、濃縮および/または枯渇が望まれる細胞上の表面マーカーに特異的に結合するが、組成物中の他の細胞上の表面マーカーには結合しない分子、例えば、ポリマーまたは表面、例えばビーズ、例えば磁性ビーズ、例えば、CD4およびCD8に特異的なモノクローナル抗体に結合した磁性ビーズなどの足場に任意で結合した抗体などの選択試薬を含む選択緩衝液も含有する組成物中で細胞がインキュベートされる。いくつかの態様では、記載されるように、振盪または回転させながらチューブ内で選択が行われる場合に、同一の数の細胞または同一の体積の細胞を選択するのとほぼ同じまたは類似の効率を達成するのに通常使用されるか、必要であろう選択試薬の量と比較して、実質的にそれよりも少ない量またはほぼ少ない量（例えば、その量の5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下もしくは80％以下、または約5％以下、約10％以下、約20％以下、約30％以下、約40％以下、約50％以下、約60％以下、約70％以下もしくは約80％以下）で、チャンバのキャビティ内で細胞に選択試薬が加えられる。いくつかの態様では、インキュベーションは、細胞および選択試薬に選択緩衝液を加えることにより行われて、例えば、10mL〜200mLまたは約10mL〜約200mL、例えば、少なくとも10mL、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、少なくとも100mL、少なくとも150mLもしくは少なくとも200mL、または少なくとも約10mL、少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、少なくとも約100mL、少なくとも約150mLもしくは少なくとも約200mL、または約10mL、約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、約100mL、約150mLもしくは約200mL、または10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mLの試薬のインキュベーションにより標的体積を達成する。いくつかの態様では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に加える前に予め混合される。いくつかの態様では、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に別個に加えられる。いくつかの態様では、選択インキュベーションは、エネルギー的に有利な相互作用を促進するのを助け、それにより、高い選択効率を達成しながら比較的少ない全体的な選択試薬の使用を可能にし得る、周期的な穏やかな混合条件により行われる。
いくつかの態様では、選択試薬とのインキュベーションの総持続時間は、5分〜6時間または約5分〜約6時間、例えば、30分〜3時間、例えば、少なくとも30分、少なくとも60分、少なくとも120分もしくは少なくとも180分、または少なくとも約30分、少なくとも約60分、少なくとも約120分もしくは少なくとも約180分である。
いくつかの態様では、インキュベーションは、一般に、スピンの存在下などの混合条件下で、一般に、細胞をペレット化するのに使用される速度よりも遅い速度などの比較的低い力または速度で、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）で、例えば、80g〜100gまたは約80g〜約100g（例えば、80g、85g、90g、95gもしくは100g、または約80g、約85g、約90g、約95gもしくは約100g、または少なくとも80g、少なくとも85g、少なくとも90g、少なくとも95gもしくは少なくとも100g）の試料またはチャンバもしくは他の容器の壁でのRCFで行われる。いくつかの態様では、スピンは、静止期間が後に続くこのような低速でのスピンの繰り返される間欠期を使用して、例えば、1秒間、2秒間、3秒間、4秒間、5秒間、6秒間、7秒間、8秒間、9秒間または10秒間のスピンおよび/または静止、例えば、約1秒または2秒のスピンの後に約5秒間、約6秒間、約7秒間または約8秒間静止することを使用して行われる。
いくつかの態様では、そのようなプロセスは、チャンバが一体化されている完全閉鎖系内で行われる。いくつかの態様では、このプロセス（およびいくつかの局面ではまた、アフェレーシス試料などの細胞を含有する試料を洗浄する先行する洗浄工程などの1つまたは複数の追加の工程）は、自動プログラムを使用して、細胞、試薬および他の成分を適当な時間にチャンバに引き込み、押し出し、遠心分離を行って、単一の閉鎖系で洗浄および結合工程を完了するように、自動的に行われる。
いくつかの態様では、細胞および選択試薬および/または試薬のインキュベーションおよび/または混合の後、インキュベートされた細胞は、特定の単数または複数の試薬の有無に基づいて細胞を選択するために分離される。いくつかの態様では、分離は、細胞と選択試薬とのインキュベーションが行われたのと同じ閉鎖系内で行われる。いくつかの態様では、選択試薬とのインキュベーション後、選択試薬が結合した細胞を含むインキュベートされた細胞は、細胞の免疫親和性に基づく分離のための系に移される。いくつかの態様では、免疫親和性に基づく分離のための系は、磁気分離カラムであるか、それを含む。
そのような分離工程は、抗体または結合パートナーなどの試薬と結合した細胞がその後の使用のために保持される陽性選択、および/または抗体または結合パートナーなどの試薬に結合していない細胞が保持される陰性選択に基づくことができる。いくつかの例では、両画分がその後の使用のために保持される。いくつかの局面では、所望の集団以外の細胞が発現させるマーカーに基づいて分離が最もよく行われるように、異種集団内の細胞型を特異的に同定する陰性選択が、抗体が利用可能でない場合に特に有用であり得る。
いくつかの態様では、プロセス工程は、例えば、親和性に基づく選択を行うことができる系または装置を使用する、インキュベートされた細胞の陰性選択および/または陽性選択をさらに含む。いくつかの態様では、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの態様では、陽性選択または陰性選択は、それぞれ陽性または陰性に選択された細胞に発現した、または比較的高いレベル（マーカーhigh）で発現（マーカー＋）した1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つもしくは複数の抗体または他の結合剤と細胞をインキュベートすることによって達成される。
分離は、特定の細胞集団、または特定のマーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数または割合を増加させることを示すが、マーカーを発現しない細胞が完全な不在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数または割合を減少させることを示すが、そのような細胞いずれもが完全に除去される必要はない。
いくつかの例では、複数回の分離工程が行われ、この分離工程では、1つの工程から陽性または陰性に選択された画分が、後続の陽性選択または陰性選択などの別の分離工程に供される。いくつかの例では、単一の分離工程によって、陰性選択の標的となるマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させることができる。同様に、様々な細胞型に発現された複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型を同時に陽性に選択することができる。特定の態様では、分離工程は繰り返され、およびまたは2回以上行われ、この分離工程では、1つの工程から陽性または陰性に選択された画分が、繰り返される陽性選択または陰性選択などの同じ分離工程に供される。いくつかの例では、例えば、選択された細胞の純度を高めるため、および/または陰性に選択された画分から陰性に選択された細胞をさらに除去する、および/または枯渇させるために、単一の分離工程が繰り返され、および/または2回以上行われる。特定の態様では、1つまたは複数の分離工程は、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、または10回超行われる。特定の態様では、1つまたは複数の選択工程は、1回〜10回、1回〜5回または3回〜5回行われ、および/または繰り返される。
例えば、いくつかの局面では、T細胞、例えば、1つまたは複数の表面マーカーが陽性であるか発現レベルが高い細胞、例えば、CD28＋T細胞、CD62L＋T細胞、CCR7＋T細胞、CD27＋T細胞、CD95＋T細胞、CD127＋T細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、CD45RA＋T細胞および/またはCD45RO＋T細胞の特定の亜集団が、陽性選択技術または陰性選択技術によって単離される。いくつかの態様では、そのような細胞は、そのようなマーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または結合パートナーとのインキュベーションによって選択される。いくつかの態様では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズなど、選択をもたらすための固体支持体またはマトリックスに、例えば、直接または間接的にコンジュゲートすることができる。例えば、CD3＋T細胞、CD28＋T細胞は、抗CD3/抗CD28がコンジュゲートした磁性ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander、および/またはExp ACT（登録商標）ビーズ）を使用して陽性に選択することができる。
いくつかの態様では、T細胞は、B細胞、単球または他の白血球細胞、例えば、CD14などの非T細胞に発現されるマーカーの陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4＋ヘルパーT細胞およびCD8＋細胞傷害性T細胞を分離するために、CD4＋またはCD8＋選択工程が使用される。そのようなCD4＋およびCD8＋集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリーおよび/またはエフェクターT細胞亜集団に発現されるか比較的高度に発現されるマーカーに対する陽性選択または陰性選択によって、亜集団にさらに分類することができる。
いくつかの態様では、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択によって、CD8＋細胞では、ナイーブ幹細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー幹細胞および/またはセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮または枯渇される。いくつかの態様では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、投与後の長期生存、拡大増殖および/または生着を改善するなど、効果を高めるために行われ、これはいくつかの局面では、そのような亜集団において特にロバストである。例えば、Terakura et al.,（2012）Blood.1:72-82;Wang et al.（2012）J Immunother.35（9）:689-701を参照されたい。いくつかの態様では、TCMに富むCD8＋T細胞とCD4＋T細胞とを組み合わせると、効果がさらに高まる。
いくつかの態様では、メモリーT細胞は、CD8＋末梢血リンパ球のCD62L＋およびCD62L-の両サブセットに存在する。PBMCでは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用するなどして、CD62L-CD8＋画分および/またはCD62L＋CD8＋画分を濃縮または枯渇させることができる。
いくつかの態様では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD95、CD3および/またはCD127の陽性発現または高い表面発現に基づき、いくつかの局面では、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するか、高度に発現する細胞の陰性選択に基づく。いくつかの局面では、TCM細胞が濃縮されたCD8＋集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択、または濃縮によって行われる。一局面では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択と、CD62Lに基づく陽性選択とに供される、CD4の発現に基づいて選択された細胞の陰性の画分から開始して行われる。そのような選択は、いくつかの局面では同時に行われ、他の局面ではいずれかの順序で連続して行われる。いくつかの局面では、CD8＋細胞集団または亜集団を調製するのに使用されたのと同じCD4の発現に基づく選択工程はまた、CD4に基づく分離からの陽性および陰性の画分の両方が保持され、方法の後続の工程に使用されるように、CD4＋細胞集団または亜集団を生成するために使用され、任意で、1つまたは複数の追加の陽性選択または陰性選択の工程が続く。いくつかの態様では、CD4＋細胞集団の選択およびCD8＋細胞集団の選択は同時に行われる。いくつかの態様では、CD4＋細胞集団、およびCD8＋細胞集団の選択は、いずれかの順序で連続して行われる。いくつかの態様では、細胞を選択するための方法は、公開された米国特許出願第20170037369号に記載のものを含み得る。いくつかの態様では、選択されたCD4＋細胞集団および選択されたCD8＋細胞集団を選択後に組み合わせてもよい。いくつかの局面では、選択されたCD4＋細胞集団および選択されたCD8＋細胞集団は、本明細書において記載されるバイオリアクターバッグ内で組み合わされてもよい。
いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CD27＋、CD28＋、CD62L＋、CCR7＋、CD45RA-および/またはCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CD62L＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CCR7＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CCR7＋およびCD45RA-である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CD62L＋およびCCR7＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CD62L＋/CD45RA-、CCR7＋/CD45RA-、CD62L＋/CCR7＋またはCD62L＋/CCR7＋/CD45RA-であり、CD44を中程度から高度に発現する。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD8＋細胞は、CD27＋/CD28＋/CD62L＋/CD45RA-、CD27＋/CD28＋/CCR7＋/CD45RA-、CD27＋/CD28＋/CD62L＋/CCR7＋またはCD27＋/CD28＋/CD62L＋/CCR7＋/CD45RA-である。
特定の態様では、生体試料、例えば、PBMCまたは他の白血球細胞の試料は、陰性および陽性の画分の両方が保持されるCD4＋T細胞の選択に供される。特定の態様では、CD8＋T細胞は陰性の画分から選択される。いくつかの態様では、生体試料は、陰性および陽性の画分の両方が保持されるCD8＋T細胞の選択に供される。特定の態様では、CD4＋T細胞は陰性の画分から選択される。
特定の例では、PBMCの試料または他の白血球細胞試料は、陰性および陽性の画分の両方が保持されるCD4＋細胞の選択に供される。次いで、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に、陰性の画分を供し、この場合、陽性選択および陰性選択は、いずれかの順序で行われる。
いくつかの態様では、CD4＋Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞およびエフェクター細胞に分類される。CD4＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様では、ナイーブCD4＋Tリンパ球は、CD45RO-T細胞、CD45RA＋T細胞、CD62L＋T細胞またはCD4＋T細胞である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD62L＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD27＋、CD28＋、CD62L＋、CCR7＋、CD45RA-および/またはCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD62L＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CCR7＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CCR7＋およびCD45RA-である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD62L＋およびCCR7＋である。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD62L＋/CD45RA-、CCR7＋/CD45RA-、CD62L＋/CCR7＋またはCD62L＋/CCR7＋/CD45RA-であり、CD44を中程度から高度に発現する。いくつかの態様では、セントラルメモリーCD4＋細胞は、CD27＋/CD28＋/CD62L＋/CD45RA-、CD27＋/CD28＋/CCR7＋/CD45RA-、CD27＋/CD28＋/CD62L＋/CCR7＋またはCD27＋/CD28＋/CD62L＋/CCR7＋/CD45RA-である。いくつかの態様では、エフェクターCD4＋細胞は、CD62L-およびCD45RO-である。
一例では、陰性選択によってCD4＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルが、典型的にはCD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DRおよびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合して、陽性選択および/または陰性選択のための細胞分離を可能にする。例えば、いくつかの態様では、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気（affinitymagnetic））分離技術を使用して、分離または単離される（Methods in Molecular Medicine,vol.58:Metastasis Research Protocols,Vol.2:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,p 17-25 Edited by:S.A.Brooks and U.Schumacher（著作権）Humana Press Inc.,Totowa,NJに概説される）。
いくつかの局面では、インキュベートされる試料、または分離される細胞組成物は、磁気応答性粒子または微小粒子、例えば、常磁性ビーズ（例えば、DynalbeadsまたはMACS（登録商標）ビーズなど）などの小さな磁化可能材料または磁気応答性材料を含有する選択試薬とともにインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば、粒子は、一般に、分離することが望ましい、例えば、陰性または陽性に選択することが望ましい1つの細胞、複数の細胞、または細胞集団に存在する表面マーカーなどの分子に特異的に結合する抗体などの結合パートナーに、直接または間接的に結合している。
いくつかの態様では、磁性粒子または磁性ビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法に使用される多くの周知の磁気応答性材料が存在する。好適な磁性粒子には、参照により本明細書に組み入れられるMoldayの米国特許第4,452,773号、および欧州特許明細書EP 452342 Bに記載の磁性粒子が含まれる。Owenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものなどのコロイドサイズの粒子が他の例である。
インキュベーションは、一般に、抗体もしくは結合パートナー、または分子、例えば、磁性粒子もしくは磁性ビーズに付着しているそのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する二次抗体もしくは他の試薬が、試料内の細胞に存在する場合に細胞表面分子に特異的に結合する条件下で行われる。
特定の態様では、磁気応答性粒子は、一次抗体もしくは他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素またはストレプトアビジンでコーティングされる。特定の態様では、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着している。特定の態様では、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーにより標識し、次いで、細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）によりコーティングされた磁性粒子を加える。特定の態様では、ストレプトアビジンによりコーティングされた磁性粒子は、ビオチン化一次抗体またはビオチン化二次抗体と併せて使用される。
いくつかの局面では、磁場に試料を置き、磁気応答性粒子または磁化可能粒子を付着させた細胞を磁石に引きつけて、未標識細胞から分離する手順で分離が達成される。陽性選択の場合、磁石に引きつけられる細胞が保持される。陰性選択の場合、引きつけられない細胞（未標識細胞）が保持される。いくつかの局面では、陽性選択および陰性選択の組合せは、同じ選択工程の間に行われ、ここで、陽性および陰性の画分は保持され、さらに処理されるか、追加の分離工程に供される。
いくつかの態様では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotech,Auburn,CA）によるものである。磁気活性化細胞選別（MACS）、例えば、CliniMACSシステムでは、それに付着した磁化粒子を有する細胞の高純度選択が可能である。特定の態様では、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種および標的種が連続的に溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出されている間、適所に保持される。次いで、この最初の溶出工程が完了した後、磁場に閉じ込められて溶出が妨げられた種は、それらを溶出し、回収することができるように何らかの方法で解放される。特定の態様では、非標的細胞は標識され、不均一な細胞集団から枯渇させられる。
いくつかの態様では、磁気応答性粒子は、後にインキュベート、培養および/または操作される細胞に付着したままである。いくつかの局面では、粒子は、患者に投与するために細胞に付着したままである。いくつかの態様では、磁化可能粒子または磁気応答性粒子は、細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去する方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化可能粒子、または切断可能なリンカーにコンジュゲートした抗体などの使用を含む。いくつかの態様では、磁化可能粒子は生分解性である。
いくつかの局面では、分離および/または他の工程は、例えば、閉鎖した無菌系における臨床規模レベルで細胞を自動分離するために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotec）を使用して行われる。構成要素には、内蔵型マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプおよび様々なピンチ弁を含めることができる。内蔵型コンピュータは、いくつかの局面では、機器の全構成要素を制御し、反復手順を統一された順序で行うようにシステムに命令する。磁気分離ユニットは、いくつかの局面では、可動性の永久磁石と、選択カラム用のホルダとを含む。蠕動ポンプは、チューブセット全体にわたる流速を制御し、ピンチ弁とともに、緩衝液がシステムを制御されて流れ、細胞が継続的に懸濁されることを確実にする。
CliniMACSシステムは、いくつかの局面では、無菌の非発熱性の溶液に溶解して供給される、抗体に結合した磁化可能粒子を使用する。いくつかの態様では、磁性粒子により細胞を標識した後、細胞を洗浄して過剰な粒子を除去する。次いで、チューブセットに細胞調製バッグを接続し、緩衝液含有バッグおよび細胞収集バッグにチューブセットを接続する。チューブセットは、プレカラムおよび分離カラムを含む予め組み立てられた滅菌チューブからなり、使い捨て専用である。分離プログラムの開始後、システムは、分離カラムに細胞試料を自動的にアプライする。標識された細胞はカラム内に保持されるのに対して、未標識細胞は一連の洗浄工程によって除去される。いくつかの態様では、本明細書において記載される方法とともに使用するための細胞集団は標識されておらず、カラムに保持されない。いくつかの態様では、本明細書において記載される方法とともに使用するための細胞集団は標識され、カラムに保持される。いくつかの態様では、本明細書において記載される方法とともに使用するための細胞集団は、磁場が取り除かれた後にカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。
特定の態様では、分離および/または他の工程は、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を使用して行われる。CliniMACS Prodigyシステムは、いくつかの局面では、細胞を自動洗浄し、遠心分離によって分画する細胞処理ユニットを備える。CliniMACS Prodigyシステムはまた、内蔵カメラと、供給源の細胞産物の巨視的な層を識別することによって最適な細胞分画エンドポイントを決定する画像認識ソフトウェアとを含むことができる。例えば、末梢血は、赤血球、白血球細胞および血漿の層に自動的に分離される。CliniMACS Prodigyシステムはまた、細胞培養プロトコル、例えば、細胞分化および拡大増殖、抗原添加、ならびに長期細胞培養を行う内臓型細胞培養チャンバを含むことができる。インプットポートにより、培地を無菌的に取り出し、補充することができ、細胞は、内臓型顕微鏡を使用してモニタリングすることができる。例えば、Klebanoff et al.（2012）J Immunother.35（9）:651-660、Terakura et al.（2012）Blood.1:72-82、およびWang et al.（2012）J Immunother.35（9）:689-701を参照されたい。
いくつかの態様では、本明細書において記載される細胞集団は、フローサイトメトリーを介して収集および濃縮（または枯渇）され、フローサイトメトリーでは、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体の流れに入って運ばれる。いくつかの態様では、本明細書において記載される細胞集団は、分取スケール（preparative scale）（FACS）選別を介して収集および濃縮（または枯渇）される。特定の態様では、本明細書において記載される細胞集団は、FACSに基づく検出系と組み合わせて微小電気機械システム（MEMS）チップを使用することによって収集および濃縮（または枯渇）される（例えば、WO2010/033140、Cho et al.（2010）Lab Chip 10,1567-1573;およびGodin et al.（2008）J Biophoton.1（5）:355-376を参照されたい。いずれの場合も、複数のマーカーにより細胞を標識することができ、それにより、正確に規定されたT細胞サブセットを高純度で単離することが可能になる。
いくつかの態様では、1つまたは複数の検出可能なマーカーにより抗体または結合パートナーを標識して、陽性選択および/または陰性選択のための分離を容易にする。例えば、分離は、蛍光標識された抗体に対する結合に基づいてもよい。いくつかの例では、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、流体の流れの中で、例えば、分取スケール（FACS）および/または微小電気機械システム（MEMS）チップを含む蛍光標示式細胞分取器（FACS）によって、例えば、フローサイトメトリー検出系と組み合わせて行われる。そのような方法により、複数のマーカーに基づいて陽性選択および陰性選択を同時に行うことが可能になる。
いくつかの態様では、単離および/または選択により、濃縮T細胞、例えば、CD3＋T細胞、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞の1つまたは複数の組成物がもたらされる。いくつかの態様では、濃縮T細胞の2つ以上の別個の組成物が、単一の生体試料から単離されるか、選択されるか、濃縮されるか、得られる。いくつかの態様では、別個の組成物は、同じ対象から収集され、採取され、および/または得られた別個の生体試料から単離され、選択され、濃縮され、および/または得られる。
特定の態様では、単離および/または選択により、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD3＋T細胞を含む、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物がもたらされる。特定の態様では、濃縮T細胞の組成物は、CD3＋T細胞から本質的になる。
特定の態様では、単離および/または濃縮により、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む、濃縮CD4＋T細胞の組成物がもたらされる。特定の態様では、CD4＋T細胞のインプット組成物は、40％未満もしくは約40％、35％未満もしくは約35％、30％未満もしくは約30％、25％未満もしくは約25％、20％未満もしくは約20％、15％未満もしくは約15％、10％未満もしくは約10％、5％未満もしくは約5％、1％未満もしくは約1％、0.1％未満もしくは約0.1％、または0.01％未満もしくは約0.01％のCD8＋T細胞を含み、および/またはCD8＋T細胞を含有せず、および/またはCD8＋T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、濃縮T細胞の組成物は、CD4＋T細胞から本質的になる。
特定の態様では、単離および/または濃縮により、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む、濃縮CD8＋T細胞の組成物がもたらされる。特定の態様では、CD8＋T細胞の組成物は、40％未満もしくは約40％、35％未満もしくは約35％、30％未満もしくは約30％、25％未満もしくは約25％、20％未満もしくは約20％、15％未満もしくは約15％、10％未満もしくは約10％、5％未満もしくは約5％、1％未満もしくは約1％、0.1％未満もしくは約0.1％、または0.01％未満もしくは約0.01％のCD4＋T細胞を含有し、および/またはCD4＋T細胞を含有せず、および/またはCD4＋T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、濃縮T細胞の組成物は、CD8＋T細胞から本質的になる。
いくつかの態様では、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/またはクライオ凍結される。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/またはクライオ凍結される。特定の態様では、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、単離、選択および/または濃縮の後に、凍結、例えば、凍結保存および/またはクライオ凍結される。いくつかの態様では、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、細胞の組成物のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/またはクライオ凍結される。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、細胞の組成物のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/またはクライオ凍結される。いくつかの態様では、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、細胞の組成物のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大増殖、採取および/または製剤化の任意の工程の前に、凍結、例えば、凍結保存および/またはクライオ凍結される。特定の態様では、1つまたは複数のクライオ凍結インプット組成物は、例えば、-80℃または約-80℃で、12時間〜7日間、24時間〜120時間または2日〜5日間保存される。特定の態様では、1つまたは複数のクライオ凍結インプット組成物は、-80℃または約-80℃で、10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、または5日未満、4日未満、3日未満、2日未満、または1日未満の期間にわたり保存される。いくつかの態様では、1つまたは複数のクライオ凍結インプット組成物は、-80℃または約-80℃で、1日もしくは約1日、2日もしくは約2日、3日もしくは約3日、4日もしくは約4日、5日もしくは約5日、または6日もしくは約6日にわたり保存される。
いくつかの態様では、細胞を含有する試料（例えば、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物）は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス中に加えられたヘパリンなどの1つまたは複数の抗凝固剤を除去するために洗浄される。
いくつかの態様では、細胞を含有する試料（例えば、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物）は、凍結保存および/または凍結保護（例えば、凍結）され、次いで、細胞集団の単離、選択、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または対象に対する製剤化された細胞集団の投与の任意の工程の前に解凍される。
特定の態様では、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、以下に記載されるように、凍結保存および/または凍結保護（例えば、凍結）され、次いで、細胞の選択または単離工程（例えば、T細胞の選択または単離工程）に供される前に解凍される。いくつかの態様では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物がT細胞選択または単離工程に供された後、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または対象に対する製剤化された細胞集団の投与の工程などの後続の工程の最中または間に、追加の凍結保存および/または凍結保護工程は行われない。例えば、解凍された凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物から選択されたT細胞は、T細胞活性化/刺激または形質導入などの下流プロセスのために解凍される前に、再び凍結保存および/または凍結保護されることはない。
特定の態様では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物がバンクされ（例えば、試料を凍結する前にT細胞を選択せずに）、これにより、いくつかの局面では、後続の製造工程にさらに多くの柔軟性を与えることができる。一局面では、選択前に細胞をバンクすることにより、下流プロセスの細胞収量が増加し、細胞を早期にバンクすることは、それらの健康が向上し、製造成功基準を満たすのがさらに容易になることを意味し得る。別の局面では、凍結保存および/または凍結保護されたアフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物は、解凍されると、1つまたは複数の異なる選択方法に供され得る。このアプローチの利点は、とりわけ、試料のドナーおよび/または別のレシピエントなどの対象の疾患または症状の治療のための細胞療法の細胞の利用可能性、効果および/または他の側面を強化することである。
いくつかの態様では、試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）は、ドナーが何らかの疾患または症状と診断された後の時点で、細胞選択の前に、または事前の細胞選択を伴わず（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わず）収集され、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの局面では、凍結保存の時期はまた、疾患もしくは症状に対する任意の初期治療、疾患もしくは症状に対する治療のために標識された任意の標的化治療もしくは任意の治療、または放射線および/または化学療法以外の任意の治療のうちの1つもしくは複数をドナーが受ける前である。いくつかの態様では、試料は、疾患の初期治療後の疾患の最初の再発の後、およびドナーまたは対象が疾患のためのその後の治療を受ける前に収集される。初期治療および/またはその後の治療は、細胞療法以外の療法であってよい。いくつかの態様では、収集された細胞は、初期治療および/またはその後の治療後の細胞療法に使用されてもよい。一局面では、事前の細胞選択を伴わず凍結保存および/または凍結保護された試料は、クロスオーバーして後に治療を必要とし得る無作為化臨床試験の非治療患者に関連するものなどの初期費用の削減に役立ち得る。
いくつかの態様では、試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）は、疾患の第2選択治療後、およびドナーまたは対象が疾患のためのその後の治療を受ける前の疾患の第2の再発後の時点で、細胞選択の前に、または事前の細胞選択を伴わず（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わず）収集され、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの態様では、患者は、例えば、特定の危険因子を評価することによって、第2選択治療の後に再発する可能性が高いと識別される。いくつかの態様では、危険因子は、ダブルヒットリンパ腫、原発性の難治性がん、または活性化B細胞リンパ腫などの疾患タイプおよび/または遺伝的特質に基づく。いくつかの態様では、危険因子は、第1選択治療後の早期再発、または治療後の他の予後不良指標（例えば、IPI（国際予後指数）＞2）などの臨床像に基づく。
いくつかの態様では、試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）は、ドナーまたは対象が何らかの疾患と診断される前の時点で、細胞選択の前に、または事前の細胞選択を伴わず（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わず）収集され、凍結保存および/または凍結保護される。いくつかの局面では、ドナーまたは対象は、何らかの疾患を発症するリスクがあると決定され得る。いくつかの局面では、ドナーまたは対象は、健康な対象であり得る。場合によっては、ドナーまたは対象は、何らかの疾患を発症するリスクまたは何らかの疾患と診断されるリスクがあると考えられることがなくても、細胞療法が人生のさらに後の段階で必要とされる場合に、細胞をバンクまたは保存することを選択してもよい。いくつかの態様では、ドナーまたは対象は、遺伝子変異、遺伝子異常、遺伝子破壊、家族歴、タンパク質異常（タンパク質産生および/または処理の欠陥など）、および何らかの疾患を発症するリスクを高め得るライフスタイルの選択などの因子に基づいて、何らかの疾患を発症するリスクがあると考えられる場合がある。いくつかの態様では、細胞は予防薬として収集される。
いくつかの態様では、細胞の凍結保存および/または凍結保護された試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）、例えば、事前の細胞選択に供されていない（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わない）細胞試料は、12時間以上、24時間以上、36時間以上もしくは48時間以上、または約12時間、約24時間、約36時間もしくは約48時間の期間にわたり保存またはバンクされる。いくつかの態様では、試料は、1週間以上、2週間以上、3週間以上または4週間以上の期間にわたり保存またはバンクされる。いくつかの態様では、試料は、長期保存または長期バンクされる。いくつかの局面では、試料は、1カ月以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上、5カ月以上、6カ月以上、7カ月以上、8カ月以上、9カ月以上、10カ月以上、11カ月以上、1年以上、2年以上、3年以上、4年以上、5年以上、6年以上、7年以上、8年以上、9年以上、10年以上、11年以上、12年以上、13年以上、14年以上、15年以上、16年以上、17年以上、18年以上、19年以上、20年以上、25年以上、30年以上、35年以上、40年以上もしくはそれ以上、または約1カ月、約2カ月、約3カ月、約4カ月、約5カ月、約6カ月、約7カ月、約8カ月、約9カ月、約10カ月、約11カ月、約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年、約11年、約12年、約13年、約14年、約15年、約16年、約17年、約18年、約19年、約20年、約25年、約30年、約35年、約40年もしくはそれ以上の期間にわたり保存される。
いくつかの態様では、ドナーから採取されたアフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料は、冷却環境で保存施設または処理施設に輸送され、および/または保存施設で極低温保存されるか、処理施設で処理される。いくつかの態様では、試料は、輸送前に、例えば、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞などのT細胞を選択することによって処理される。いくつかの態様では、そのような処理は、輸送後、および試料を極低温保存する前に行われる。いくつかの態様では、処理は、極低温保存に続いて試料を解凍した後に行われる。
ドナー、ひいてはその細胞が、疾患に対する広範囲な治療を受けておらず、および/または疾患もしくは症状の発症またはその診断の前の段階で、ドナーがその細胞を保存することを可能にすることによって、そのような細胞は、1回または複数回の治療の後に採取された細胞と比較して、細胞療法に使用するための特定の利点を有し得る。例えば、1回または複数回の治療の前に採取された細胞の方が、数回の治療を受けた細胞よりも健康であり得、高いレベルの特定の細胞活性を示し得、迅速に増殖し得、および/または遺伝子操作に対して受容的であり得る。本明細書において記載される態様による利点の別の例には、利便性が含まれ得る。例えば、細胞療法に必要とされる前にドナーの細胞を収集し、任意で処理し、保存することにより、レシピエントが後にそれらを必要とする場合に、細胞は容易に利用可能となる。これにより、アフェレーシス検査室の容量が増加し、技術者がアフェレーシス収集プロセスの予定を決める際の柔軟性が高まる。
アフェレーシス試料などの試料から得られた細胞の極低温保存および処理のための例示的な方法およびシステムは、国際公開出願番号WO2018170188に記載されているものを含み得る。いくつかの態様では、方法およびシステムは、患者が細胞療法を必要とする前にアフェレーシスを収集し、その後、組換え受容体（例えばCAR）を用いて細胞、例えばT細胞を操作するプロセスに後に使用するためにアフェレーシス試料を凍結保存することを含む。場合によっては、そのようなプロセスは、本明細書において記載されるものを含むことができる。いくつかの態様では、対象からアフェレーシス試料を収集し、その後のT細胞選択、細胞集団の活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、採取、製剤化、および/または対象に対する製剤化された細胞集団の投与の前に凍結保存する。そのような例では、凍結保存されたアフェレーシス試料は、本明細書において記載されるものなどの1つまたは複数の選択工程に試料を供する前に解凍される。
いくつかの態様では、細胞の凍結保存および/または凍結保護された試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）、例えば、事前の細胞選択に供されていない（例えば、クロマトグラフィーによる選択などの事前のT細胞選択を伴わない）細胞試料は、細胞療法のための細胞集団、例えば、CAR＋T細胞を含有するT細胞集団を製造するための下流プロセスに使用する前に解凍される。いくつかの態様では、そのような細胞の凍結保存および/または凍結保護された試料（例えば、アフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料）は、CAR＋T細胞療法などの操作されたT細胞療法のための、本明細書において提供されるプロセスに関連して使用される。特定の例では、採取/製剤化工程の前または最中に、凍結保存の追加の工程は行われない。
1.インプット組成物
特定の態様では、提供される方法は、細胞のインプット組成物を製造および/または調製することに関連して使用される。特定の態様では、インプット細胞組成物は、遺伝子操作に使用するための細胞、例えば、遺伝子操作される、および/または遺伝子操作された細胞を作製するプロセスを受ける細胞の組成物である。特定の態様では、細胞は、組換え受容体をコードする核酸を用いて処理され、それと接触され、および/またはそれとともにインキュベートされる。特定の態様では、インプット細胞組成物は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、ナイーブT細胞および/またはナイーブ様T細胞であるCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する。
特定の態様では、提供される方法は、細胞のインプット組成物を製造および/または調製することに関連して使用される。特定の態様では、インプット細胞組成物は、遺伝子操作に使用するための細胞、例えば、遺伝子操作される、および/または遺伝子操作された細胞を作製するプロセスを受ける細胞の組成物である。特定の態様では、細胞は、組換え受容体をコードする核酸を用いて処理され、それと接触され、および/またはそれとともにインキュベートされる。特定の態様では、インプット細胞組成物は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、ナイーブT細胞および/またはナイーブ様T細胞であるCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する。
いくつかの態様では、所望の、固定された、および/または制御された比は、インキュベーションおよび/または操作工程または他の処理工程の完了時、および/または解凍時および/または対象への投与の直前に、操作されたCD4＋T細胞対CD8＋T細胞の所望の、規定された、および/または制御された比、または許容エラー率もしくはその差の範囲内の比を有するアウトプット細胞組成物をもたらすように設計されたインプット細胞組成物に含まれる2つのタイプの細胞または単離された細胞集団の比または数である。
特定の態様では、インプット組成物は、濃縮CD3＋T細胞の組成物である。いくつかの態様では、インプット組成物は、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD3＋T細胞であるか、それを含む。いくつかの態様では、インプット組成物はCD3＋T細胞から本質的になる。特定の態様では、インプット組成物は、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞について濃縮された、細胞の組成物である。特定の態様では、インプット組成物は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％の細胞であるか、それを含む。いくつかの態様では、インプット組成物は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞から本質的になる。
特定の態様では、インプット組成物は、30％〜70％もしくは約30％〜約70％、35％〜65％もしくは約35％〜約65％、40％〜60％もしくは約40％〜約60％、45％〜55％もしくは約45％〜約55％、または約50％もしくは50％のCD4＋T細胞と、30％〜70％もしくは約30％〜約70％、35％〜65％もしくは約35％〜約65％、40％〜60％もしくは約40％〜約60％、45％〜55％もしくは約45％〜約55％、または約50％もしくは50％のCD8＋T細胞とを含有する。特定の態様では、インプット組成物は、45％〜55％もしくは約45％〜約55％、約50％または50％のCD4＋T細胞と、45％〜55％もしくは約45％〜約55％、約50％または50％のCD8＋T細胞とを含有する。
いくつかの態様では、濃縮CD4＋T細胞の少なくとも1つの別個の組成物と濃縮CD8＋T細胞の少なくとも1つの別個の組成物とは、単一の生体試料、例えば、患者または健康な個体などの同じドナー由来のPBMCまたは他の白血球細胞の試料から単離されるか、選択されるか、濃縮されるか、得られる。いくつかの態様では、例えば、起源となる濃縮CD4＋T細胞の別個の組成物と濃縮CD8＋T細胞の別個の組成物とは、同じ生体試料、例えば、単一の対象から得られ、収集され、および/または採取された単一の生体試料から最初に単離され、選択され、および/または濃縮された。いくつかの態様では、生体試料は、CD4＋T細胞の選択に最初に供され、ここで、陰性および陽性の画分の両方が保持され、陰性の画分はCD8＋T細胞の選択にさらに供される。他の態様では、生体試料は、CD8＋T細胞の選択に最初に供され、ここで、陰性および陽性の画分の両方が保持され、陰性の画分はCD4＋T細胞の選択にさらに供される。いくつかの態様では、選択方法は、国際PCT公開番号WO2015/164675に記載されているように行われる。いくつかの局面では、濃縮CD8＋T細胞の少なくとも1つの組成物と濃縮CD4＋T細胞の少なくとも1つの組成物とが、同じ生体試料由来の、例えば、同じドナー患者または健康な個体由来の別個の組成物であるように、CD8＋T細胞について生体試料が最初に陽性に選択されて、濃縮CD8＋T細胞の少なくとも1つの組成物が生成され、次いで、CD4＋T細胞に対して陰性の画分が陽性に選択されて、濃縮CD4＋T細胞の少なくとも1つの組成物が生成される。いくつかの局面では、少なくとも1つが濃縮CD4＋T細胞の組成物であり、少なくとも1つが同じドナー由来の濃縮CD8＋T細胞の別個の組成物であるような濃縮T細胞の2つ以上の別個の組成物が、別個に凍結され、例えば、凍結保存培地中でクライオ凍結または凍結保存される。いくつかの局面では、別個に凍結保存された細胞組成物は、1回または複数回の輸送で別個の容器内で保存および/または輸送される。いくつかの局面では、別個に凍結保存された細胞組成物は解凍され、任意で洗浄される。
いくつかの局面では、少なくとも1つが濃縮CD4＋T細胞の組成物であり、少なくとも1つが同じ生体試料由来の濃縮CD8＋T細胞の別個の組成物であるような濃縮T細胞の2つ以上の別個の組成物は、解凍および混合され、組み合わされ、および/またはプールされ、組成物は、混合、組み合わせ、および/またはプールの前または後に任意で洗浄されてもよい。いくつかの局面では、濃縮T細胞の混合された、組み合わせられた、および/またはプールされた、および任意で洗浄された組成物は、インプット組成物を形成する。いくつかの局面では、インプット組成物（例えば、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を1:1または約1:1の比率で含む）は、刺激試薬との接触によって（例えば、T細胞活性化のためのCD3/CD28コンジュゲート磁性ビーズとのインキュベーションによって）活性化および/または刺激され、活性化/刺激からの細胞組成物の体積は、標的体積を達成するために、任意で調整、例えば、低減される。いくつかの局面では、活性化/刺激された細胞組成物は、例えば、組換えタンパク質（例えばCAR）をコードするレトロウイルスベクターを使用して、細胞組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞内で同じ組換えタンパク質が発現されるように操作、形質導入および/またはトランスフェクトされる。いくつかの局面では、操作からの細胞組成物の体積は、標的体積を達成するために、任意選択で調整、例えば、低減される。いくつかの局面では、方法は、細胞組成物から刺激試薬、例えば磁性ビーズを除去することを含む。いくつかの局面では、操作されたCD4＋T細胞および操作されたCD8＋T細胞を含有する細胞組成物は、例えば、その中のCD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞集団の拡大増殖のために培養される。特定の態様では、培養からの細胞組成物は、例えば、製剤化緩衝液中で細胞組成物を洗浄することによって、採取および/または収集および/または製剤化される。特定の態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む製剤化された細胞組成物は、凍結、例えば、凍結保存培地中でクライオ凍結または凍結保存される。いくつかの局面では、凍結保存された製剤は、1つまたは複数の容器内で保存および/または輸送されてもよい。いくつかの局面では、製剤中の操作されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は、同じドナーまたは生体試料に由来し、同じ組換えタンパク質（例えばCAR）を発現し、製剤は、同じドナーなど、それを必要とする対象に投与される。
特定の態様では、インプット組成物は、3:1〜1:3、2:1〜1:2、1.5〜0.75、1.25〜0.75または1.2〜0.8のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する。特定の態様では、インプット組成物は、1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する。
いくつかの態様では、濃縮CD4＋T細胞の組成物からの細胞と濃縮CD8＋T細胞の組成物からの細胞とが混合され、組み合わせられ、および/またはプールされて、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有するインプット組成物が生成される。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物は、刺激条件下で細胞をインキュベートする前に、プールされ、混合され、および/または組み合わせられる。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物は、生体試料からCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を単離、濃縮および/または選択した後、プールされ、混合され、および/または組み合わせられる。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物は、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物の凍結、例えば、クライオ凍結および解凍に続いて、プールされ、混合され、および/または組み合わせられる。
特定の態様では、インプット組成物は、濃縮CD4＋細胞の組成物からの細胞を濃縮CD8＋細胞の組成物からの細胞と混合し、プールし、および/または組み合わせることにより、製造、生成または作製される。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％、または約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99％もしくは約99.9％のCD4＋T細胞を含有する。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、100％のCD4＋T細胞を含有するか、約100％のCD4＋T細胞を含有する。特定の態様では、濃縮T細胞の組成物は、20％未満もしくは約20％、10％未満もしくは約10％、5％未満もしくは約5％、1％未満もしくは約1％、0.1％未満もしくは約0.1％、または0.01％未満もしくは約0.01％のCD8＋T細胞を含むか、含有し、および/またはCD8＋T細胞を含有せず、および/またはCD8＋T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、細胞集団は、CD4＋T細胞から本質的になる。特定の態様では、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％、または約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99％もしくは約99.9％のCD8＋T細胞を含有するか、100％のCD8＋T細胞を含有するか、約100％のCD8＋T細胞を含有する。特定の態様では、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、20％未満もしくは約20％、10％未満もしくは約10％、5％未満もしくは約5％、1％未満もしくは約1％、0.1％未満もしくは約0.1％、または0.01％未満もしくは約0.01％のCD4＋T細胞を含むか、含有し、および/またはCD4＋T細胞を含有せず、および/またはCD4＋T細胞を含まないか実質的に含まない。いくつかの態様では、細胞集団は、CD8＋T細胞から本質的になる。
特定の態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は、1:10〜10:1、1:5〜5:1、4:1〜1:4、3:1の間、1:3〜3:1、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.2:1〜1:1.2、1.1:1〜1:1.1、または約1:1もしくは1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比でプールされ、混合され、および/または組み合わせられる。特定の態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.2:1〜1:1.2、1.1:1〜1:1.1、または約1:1もしくは1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比でプールされ、混合され、および/または組み合わせられる。いくつかの態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は、1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比でプールされ、混合され、および/または組み合わせられる。
いくつかの態様では、濃縮CD4＋T細胞の組成物および濃縮CD8＋T細胞の組成物からの細胞は、1:10〜10:1、1:5〜5:1、4:1〜1:4、3:1の間、1:3〜3:1、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.2:1〜1:1.2、1.1:1〜1:1.1、または約1:1もしくは1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比でプールされ、混合され、および/または組み合わせられる。特定の態様では、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物からの細胞は、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.2:1〜1:1.2、1.1:1〜1:1.1、または約1:1もしくは1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比でプールされ、混合され、および/または組み合わせられる。いくつかの態様では、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物からの細胞は、1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比でプールされ、混合され、および/または組み合わせられる。
特定の態様では、インプット組成物は、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の比、例えば、規定、制御および/または固定された比を有する。特定の態様では、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の比は、10:1以上0.05:1以下、8:1以上0.1:1以下、5:1以上0.2:1以下、2.5:1以上0.25:1以下、2.2:1以上0.8:1以下、2:1以上0.5:1以下または1.5:1以上1:1以下である。特定の態様では、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の比は、2:1以上0.8:1以下、1.6:1以上0.8:1以下、1.4:1以上0.8:1以下、1.2:1以上0.8:1以下または1.2:1以上0.8:1以下である。いくつかの態様では、比は、2.2:1以上0.8:1以下である。特定の態様では、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の比は、2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1もしくは0.8:1、または約2.2:1、約2.1:1、約2.0:1、約1.9:1、約1.8:1、約1.7:1、約1.6:1、約1.5:1、約1.4:1、約1.3:1、約1.2:1、約1.1:1、約1.0:1、約0.9:1もしくは約0.8:1である。特定の態様では、比は、1.1:1または約1.1:1である。
特定の態様では、インプット組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量のナイーブ様CD4＋T細胞およびナイーブ様CD8＋T細胞を有する。
特定の態様では、インプット組成物は、1×106個〜1×1010個もしくは約1×106個〜約1×1010個、1×107個〜1×109個もしくは約1×107個〜約1×109個、5×107個〜5x108個もしくは約5×107個〜約5x108個、または1x108個〜3x108個もしくは約1x108個〜約3x108個の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット組成物は、1×106〜1×1010もしくは約1×106〜約1×1010、1×107〜1×109もしくは約1×107〜約1×109、5×107〜5x108もしくは約5×107〜約5x108、または1x108〜3x108もしくは約1x108〜約3x108の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット組成物は、1×106〜1×1010もしくは約1×106〜約1×1010、1×107〜1×109もしくは約1×107〜約1×109、5×107〜5x108もしくは約5×107〜約5x108、または1x108〜3x108もしくは約1x108〜約3x108の量のナイーブ様CD4＋T細胞およびナイーブ様CD8＋T細胞を有する。
いくつかの態様では、インプット組成物は、少なくとも1％もしくは約1％、少なくとも5％もしくは約5％、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも20％もしくは約20％、少なくとも30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のナイーブ様細胞を有するか、含有する。特定の態様では、インプット組成物は、100％以下もしくは約100％、99％以下もしくは約99％、98％以下もしくは約98％、97％以下もしくは約97％、96％以下もしくは約96％、95％以下もしくは約95％、90％以下もしくは約90％、または85％以下もしくは約85％のナイーブ様細胞を含有するか、含む。
特定の態様では、本明細書において提供される方法は、インプット組成物を製造、生成および/または作製する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、インプット組成物の製造、生成および/または作製は、CD4＋T細胞の組成物の細胞とCD8＋T細胞の組成物の細胞とを混合するか組み合わせる1つまたは複数の工程を含む。
いくつかの態様では、インプット組成物の細胞、例えば、CD4＋T細胞CD8＋T細胞は、試料、例えば生体試料から単離および/または選択されている。特定の態様では、インプット組成物の細胞の供給源は、細胞の組成物、例えば、試料から単離および/または選択されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の組成物である。特定の態様では、CD4＋T細胞の組成物およびCD8＋T細胞の組成物は、試料、例えば生体試料から単離および/または選択される。特定の態様では、CD4＋T細胞の組成物およびCD8＋T細胞の組成物は、同じ試料から単離および/または選択される。特定の態様では、CD4＋T細胞の組成物およびCD8＋T細胞の組成物は、同じ対象から採取されたか得られた試料から単離および/または選択される。
特定の態様では、CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含有するか、含む。いくつかの態様では、CD4＋T細胞の組成物は、100％以下もしくは約100％、99％以下もしくは約99％、98％以下もしくは約98％、97％以下もしくは約97％、96％以下もしくは約96％、95％以下もしくは約95％、90％以下もしくは約90％、または85％以下もしくは約85％のCD4＋T細胞を含有するか、含む。
特定の態様では、CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含有するか、含む。特定の態様では、CD8＋T細胞の組成物は、100％以下もしくは約100％、99％以下もしくは約99％、98％以下もしくは約98％、97％以下もしくは約97％、96％以下もしくは約96％、95％以下もしくは約95％、90％以下もしくは約90％、または85％以下もしくは約85％のCD8＋T細胞を含有するか、含む。
特定の態様では、インプット組成物の製造、生成および/または作製は、例えば、細胞組成物の細胞を組み合わせるか混合する前に、CD4＋T細胞の組成物および/またはCD8＋T細胞の組成物中に存在する生存CD4＋T細胞および/または生存CD8＋T細胞の量、部分、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合を測定、決定および/または定量する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、インプット組成物の製造、生成および/または作製は、CD4＋T細胞の組成物および/またはCD8＋T細胞の組成物中に存在するナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞の量、部分、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合を測定、決定および/または定量する1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様では、ナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞は、生存ナイーブ様細胞である。
特定の態様では、インプット組成物の製造、生成および/または作製は、試料、例えば生体試料中に存在する生存CD4＋T細胞および/または生存CD8＋T細胞の量、部分、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合を測定、決定および/または定量する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、インプット組成物の製造、生成および/または作製は、試料中に存在するナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞の量、部分、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合を測定、決定および/または定量する1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様では、ナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞は、生存ナイーブ様細胞である。
いくつかの態様では、インプット組成物の細胞は、試料、例えば生体試料から単離および/または選択される。特定の態様では、試料中のナイーブ様細胞の部分、例えば、ナイーブ様CD4＋T細胞およびナイーブ様CD8＋T細胞の部分は、分かっているか、決定、測定または評価されている。いくつかの態様では、試料からの細胞が単離および/または選択されて、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の規定、固定または制御された比を有する細胞組成物、例えばインプット組成物が直接製造される。特定の態様では、細胞は、免疫親和性ビーズ選択により単離および/または選択される。いくつかの態様では、細胞は、アフィニティーカラムを用いて単離および/または選択される。特定の態様では、試料からの細胞は、WO2015/164675に記載されている方法のいずれかに従って単離または選択されて、ナイーブ様CD4＋細胞対ナイーブ様CD8＋細胞の規定、制御および/または固定された比を有する細胞組成物が製造される。
特定の態様では、インプット組成物は、第1および第2の単離または選択によって試料から直接単離および/または選択された細胞を含有する。特定の態様では、インプット組成物は、第1および第2の選択を行って、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の規定、固定および/または制御された比をもたらすのに十分な量、数または濃度のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を単離することによって製造される。
いくつかの態様では、試料からの細胞が直接単離、選択および/または濃縮されて、CD4＋細胞およびCD8＋細胞が濃縮されたインプット組成物が製造される。いくつかの態様では、ナイーブ様CD4＋細胞およびナイーブ様CD8＋細胞の量、数、割合、体積当たりの数および/または重量当たりの数は、試料中で測定、評価および/または決定されており、CD4＋細胞およびCD8＋細胞は、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の規定、固定および/または制御された比を有するインプット組成物を得るのに十分な量で単離、選択および/または濃縮される。いくつかの態様では、試料から直接単離、選択および/または濃縮された細胞は、インプット組成物であり、後続の処理工程、例えば、濃縮細胞のインキュベーション、刺激、活性化、操作および/または製剤化を含む後続の処理工程で使用される。
いくつかの態様では、インプット組成物などの試料から単離、選択および/または濃縮された細胞は、ナイーブ様CD4＋細胞対ナイーブ様CD8＋細胞の規定、固定または制御された比でCD4＋細胞対CD8＋細胞の比を有する。本明細書において提供される方法の態様では、試料の第1および/または第2の選択、またはそれらの亜集団の選択は、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋細胞の所望の比を有するインプット組成物をもたらすような方法で行うことができる。
いくつかの態様では、試料からの第1および/または第2の選択を行う前に、試料、例えば生体試料中のCD4＋T細胞対CD8＋T細胞の比が決定される。特定の態様では、第1および/または第2の選択を行う前に、試料中のナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の比が決定される。試料間で異なり得る、試料中のCD4＋T細胞対CD8＋T細胞および/またはナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の特定の比に基づいて、例えば、クロマトグラフィーカラムのサイズ決定、または免疫親和性試薬の量もしくは濃度の選択によって、特定の選択様式を試料に適合させて、所望の、固定された、または制御された比を達成することができる。対象における様々な細胞集団の相対レベルまたは頻度は、そのような集団または亜集団に存在する単数または複数のマーカーの表面発現を評価することに基づいて決定することができる。例えば、フローサイトメトリーなどによる細胞表面タンパク質の観点から、表面マーカーまたはタンパク質の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば親和性ベースの方法、例えば免疫親和性ベースの方法による検出が使用されてもよい。
いくつかの状況では、ナイーブ様CD4＋T細胞およびナイーブ様CD8＋T細胞の適切な比は、状況、例えば、細胞が由来する対象の特定の疾患、症状、または以前の治療、および/または細胞の特定の抗原特異性、様々な亜集団の特定の型（例えばCD4＋細胞）の細胞間の相対的な表現、例えば、エフェクター細胞対メモリー細胞対ナイーブ細胞、および/または細胞がインキュベートされる1つまたは複数の条件、例えば、培地、刺激剤、培養時間、緩衝液、酸素含有量二酸化炭素含有量、抗原、サイトカイン、抗体および他の成分に依存して変化し得る。したがって、典型的または一般に、他の細胞型よりも急速に増殖または拡大増殖することが知られている細胞型は、必ずしもあらゆる状況でそのような特性を有するとは限らない。したがって、いくつかの局面では、ナイーブ様CD4＋T細胞とナイーブ様CD8＋T細胞との比は、細胞、または細胞が由来する対象の表現型または状態の評価、および/または経験的証拠と相まって、正常または典型的な状況における細胞型の公知の能力に基づいて決定される。
いくつかの態様では、分離および/または工程は、免疫磁性ビーズを使用して行われる。いくつかの態様では、CD4＋細胞およびCD8＋細胞を含有する細胞試料と、CD4またはCD8に結合する第1の免疫親和性試薬を含有する磁性ビーズ、およびCD4またはCD8の他方に結合する第2の免疫親和性試薬を含有する磁性ビーズとを接触させる。分離および/または工程は、同時におよび/または連続的に行われ得る。
いくつかの態様では、第1および/または第2の免疫親和性試薬は、最適以下収量濃度でインキュベーション組成物中に存在し、それにより、濃縮された組成物は、インキュベーション組成物中の総CD4＋細胞の全部よりも少ない、例えば70％および/またはインキュベーション組成物中のCD8＋細胞の全部よりも少ない、例えば70％を含有し、それにより、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が濃縮された組成物が製造される。
いくつかの態様では、親和性試薬の最適以下収量濃度とは、細胞を試薬とともにインキュベートし、試薬に結合した細胞を回収または分離することを含む、所与の選択または濃縮において結合細胞の最適または最大収量を達成するために使用または必要とされる濃度未満の濃度である（「収量」とは、例えば、試薬によって標的化されるか、それに対して試薬が特異的であるか、それに対して試薬が特異的であり、かつ結合することができるマーカーを有する、インキュベーション中の細胞の総数と比較した、そのように回収または選択された細胞の数である）。最適以下収量濃度とは、一般に、そのようなプロセスまたは工程で、試薬に結合した細胞の回収時に、結合細胞、例えば、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞の全部よりも少ない、例えば70％以下の収量を達成する試薬の濃度または量である。いくつかの態様では、親和性試薬の最適以下濃度によって、50％以下、45％以下、40％以下、30％以下もしくは25％以下、または約50％、約45％、約40％、約30％もしくは約25％の収量が達成される。濃度は、細胞1個当たりの粒子または表面の数または質量、および/または細胞1個当たりの作用物質（例えば、抗体断片などの抗体）の質量または分子の数に関して表され得る。特定の態様では、最適以下収量濃度は、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の固定、制御および/または規定された比を導出または達成するのに十分である。
いくつかの態様では、例えば、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞に親和性を有する2つ以上の選択試薬のそれぞれまたは1つもしくは複数について最適以下収量濃度で操作する場合、そのような試薬のうちの1つまたは複数が、他のそのような試薬のうちの1つまたは複数よりも高い濃度で使用されて、そのような試薬によって認識される細胞型の比を、他方によって認識される細胞型と比較してバイアスする。例えば、比をバイアスすることが望まれるマーカーに特異的に結合する試薬は、比を増加させることが望まれる程度に応じて、他のものと比較して、半分、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍またはそれ以上増加した濃度（例えば、作用物質、または細胞1個当たりの質量）で含まれてもよい。
いくつかの態様では、最適以下の範囲で、および/または試薬の飽和を達成するのに十分な細胞を用いて操作する場合、免疫親和性試薬の量は、濃縮細胞のおおよその収量に比例する。特定の態様では、濃縮または選択されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する生成された組成物の所望の比に依存する免疫親和性試薬の適切な量または濃度は、常用的な問題として決定することができる。
いくつかの態様では、分離および/または単離工程は、免疫親和性試薬が可逆的に結合した磁性ビーズを使用して、例えば、WO2015/164675に記載されているストレプトアビジンムテインとのペプチドリガンド相互作用を介して行われる。そのような磁性ビーズの例は、Streptamers（登録商標）である。いくつかの態様では、分離および/または工程は、Miltenyi Biotecから市販されているものなどの磁性ビーズを使用して行われる。
いくつかの態様では、試料からのCD4＋細胞およびCD8＋細胞の第1の選択または濃縮は、抗体が固定化された少なくとも第1および第2のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスをそれぞれ含む免疫親和性ベースの試薬を使用して行われる。いくつかの態様では、第1および/または第2の選択の一方または両方は、複数のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/または抗体を使用することができ、それにより、同じ選択、すなわち、第1の選択または第2の選択に使用される複数のマトリックスおよび/または抗体は直列に接続される。いくつかの態様では、第1および/または第2の選択に使用される単数または複数のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、少なくとも50×106細胞/mL、少なくとも100×106細胞/mL、少なくとも200×106細胞/mLもしくは少なくとも400x106細胞/mL、または約50×106細胞/mL、約100×106細胞/mL、約200×106細胞/mLもしくは約400x106細胞/mLを吸着するか、選択または濃縮することができる。いくつかの態様では、吸着容量は、カラムの直径および/または長さに基づいて調整することができる。いくつかの態様では、選択または濃縮された組成物の培養開始比は、例えば、細胞を選択するための単数または複数のカラムの吸着容量に基づいて仮定して、培養開始比を達成するのに十分な量のマトリックスおよび/または十分な相対量を選択することによって達成される。
1つの例示的な態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞は、ナイーブ様細胞の等しいまたは類似の部分を有し、単数または複数のマトリックスの吸着容量は、第1の選択と第2の選択との間で同じ、例えば、ともに1x108細胞/mLまたは約1x108細胞/mLであり、これにより、第1の選択および第2の選択での細胞の濃縮または選択により、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞を含むCD4＋細胞対CD8＋細胞の1:1または約1:1の比を有する組成物がもたらされる。特定の態様では、ナイーブ様細胞の部分と、生成されたインプット組成物の所望の比とに応じて、第1および/または第2の選択のためのアフィニティーマトリックスクロマトグラフィーカラムの適切な容量、直径または数を常用的な問題として選択または決定することができる。
いくつかの態様では、単数または複数のカラムマトリックスの吸着容量は、対象由来の出発試料中のそれぞれのCD4＋親集団またはCD8＋親集団の細胞の頻度と比較した、ナイーブ様細胞、例えば、ナイーブ様CD4＋細胞またはナイーブ様CD8＋細胞の頻度の差を明らかにするように調整される。対象における様々な細胞集団の相対レベルまたは頻度は、そのような集団または亜集団に存在する単数または複数のマーカーの表面発現を評価することに基づいて決定することができる。例えば、フローサイトメトリーなどによる細胞表面タンパク質の観点から、表面マーカーまたはタンパク質の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば親和性ベースの方法、例えば免疫親和性ベースの方法による検出が使用されてもよい。
いくつかの態様では、ナイーブ様細胞、例えば、ナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞は、細胞組成物、例えば、CD4＋T細胞組成物および/またはCD8＋T細胞組成物、または試料、例えば生体試料中で評価、測定および/または検出される。いくつかの態様では、ナイーブ様T細胞は、細胞がナイーブ細胞である、および/またはナイーブ様細胞であることを示す1つまたは複数のマーカーの発現に対して陽性であるT細胞である。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、T細胞のナイーブ状態またはナイーブ様状態に関連するマーカーの発現に対して陽性である細胞である。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、細胞がナイーブ細胞ではない、および/またはナイーブ様細胞ではないことを示す1つまたは複数のマーカーの発現に対して陰性であるT細胞である。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、T細胞の非ナイーブ状態または非ナイーブ様状態に関連するマーカーの発現に対して陰性である細胞である。特定の態様では、T細胞内の非ナイーブ状態または非ナイーブ様状態には、例えば、限定されることなく、エフェクターT（TEFF）細胞、メモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）細胞およびそれらの組合せが含まれる。
いくつかの態様では、ナイーブ様T細胞は、細胞がナイーブ細胞である、および/またはナイーブ様細胞であることを示し、および/またはT細胞のナイーブ状態またはナイーブ様状態に関連する少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、または10個超のマーカーの発現に対して陽性である。いくつかの態様では、マーカーは細胞表面に発現される。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、細胞が非ナイーブ細胞である、および/または非ナイーブ様細胞であることを示し、および/またはT細胞の非ナイーブ状態または非ナイーブ様状態に関連する少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、または10個超のマーカーの発現に対して陰性である。
T細胞がナイーブT細胞であること、および/またはナイーブ様T細胞であることを示し、および/またはT細胞のナイーブ状態またはナイーブ様状態に関連するマーカーには、限定されることなく、CD27、CD28、CD45RA、CD62Lおよび/またはCCR7が含まれる。いくつかの態様では、ナイーブ様T細胞、例えば、ナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞は、CD27、CD28、CD45RA、CD62Lおよび/またはCCR7の発現に対して陽性である。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、CD27、CD28、CD45RA、CD62Lおよび/またはCCR7のうちの1つまたは複数の表面発現に対して陽性である。
細胞が非ナイーブT細胞であること、および/または非ナイーブ様T細胞であることを示し、および/またはT細胞の非ナイーブ状態または非ナイーブ様状態に関連するマーカーには、限定されることなく、CD25、CD45RO、CD56、KLRG1および/またはCD95が含まれる。いくつかの態様では、ナイーブ様T細胞、例えば、ナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞は、CD25、CD45RO、CD56および/またはKLRG1の発現に対して陰性である。特定の態様では、ナイーブ様T細胞、例えば、ナイーブ様CD4＋T細胞および/またはナイーブ様CD8＋T細胞では、非ナイーブ細胞または非ナイーブ様細胞に関連するマーカーの発現が低い。特定の態様では、ナイーブ様T細胞では、CD95の発現が低い。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、CD25、CD45RO、CD56および/またはKLRG1のうちの1つまたは複数の表面発現に対して陰性である。
いくつかの態様では、非ナイーブ細胞または非ナイーブ様細胞に関連するマーカーの低発現は、非ナイーブ様細胞である細胞内、および/または細胞が非ナイーブT細胞および/または非ナイーブ様T細胞であることを示し、および/またはT細胞の非ナイーブ状態または非ナイーブ様状態に関連する1つまたは複数のマーカーに対して陽性である細胞内のマーカーの発現よりも、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％少ない発現であるか、それを含む。特定の態様では、非ナイーブ細胞または非ナイーブ様細胞に関連するマーカーの低発現は、エフェクターT（TEFF）細胞、メモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞（TCM）および/またはエフェクターメモリーT（TEM）細胞内のマーカーの発現よりも、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも20％もしくは約20％、少なくとも30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、または少なくとも99％もしくは約99％少ない発現であるか、それを含む。
いくつかの態様では、細胞が非ナイーブT細胞および/または非ナイーブ様T細胞であることを示し、および/またはT細胞の非ナイーブ状態または非ナイーブ様状態に関連するマーカーには、1つまたは複数のサイトカインが含まれる。例えば、特定の態様では、非ナイーブT細胞または非ナイーブ様T細胞は、IL-2、IFN-γ、IL-4およびIL-10のうちの1つまたは複数の発現および/または産生に対して陰性である。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインが分泌される。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、例えば、分泌を防止、阻害または低減する作用物質を用いた治療の最中または後に、非ナイーブ様T細胞によって内部的に発現される。
特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、CD45RAおよびCCR7の発現、例えば表面発現に対して陽性である。特定の態様では、ナイーブ様CD4＋T細胞は、CD45RAおよびCCR7の発現、例えば表面発現に対して陽性である。いくつかの態様では、ナイーブ様CD8＋T細胞は、CD45RAおよびCCR7の発現、例えば表面発現に対して陽性である。特定の態様では、ナイーブ様T細胞は、CD45RA、CD27およびCCR7の発現、例えば表面発現に対して陽性であり、CD45ROの発現、例えば表面発現に対して陰性である。特定の態様では、ナイーブ様CD4＋T細胞は、CD45RA、CD27およびCCR7の発現、例えば表面発現に対して陽性であり、CD45ROの発現、例えば表面発現に対して陰性である。いくつかの態様では、ナイーブ様CD8＋T細胞は、CD45RA、CD27およびCCR7の発現、例えば表面発現に対して陽性であり、CD45ROの発現、例えば表面発現に対して陰性である。
特定の態様では、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞は生存細胞である。特定の態様では、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞は、生存ナイーブ様細胞である。生存細胞は、細胞が正常な機能的な細胞過程を経ていること、および/または壊死またはプログラム細胞死を経ていないか、壊死またはプログラム細胞死の進行中でないことを示すマーカーの発現に対して陽性である。いくつかの態様では、生存能力は、細胞の酸化還元電位、細胞膜の完全性、またはミトコンドリアの活性もしくは機能によって評価することができる。いくつかの態様では、生存能力は、細胞死に関連する特定の分子の欠如、またはアッセイでの細胞死の兆候の欠如である。
特定の態様では、細胞生存能力は、限定されることなく、色素取り込みアッセイ（例えば、カルセインAMアッセイ）、XTT細胞生存率アッセイ、および色素排除アッセイ（例えば、トリパンブルー色素排除アッセイ、エオシン色素排除アッセイまたはプロピジウム色素排除アッセイ）が含まれ得るアッセイに関連する。特定の態様では、生存細胞は、1つまたは複数のアポトーシスマーカー、例えばアネキシンVまたは活性型カスパーゼ3の陰性発現を有する。いくつかの態様では、生存細胞は、限定されることなく、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ10、Bcl-2ファミリーメンバー、例えば、Bax、BadおよびBid、アネキシンVおよび/またはTUNEL染色を含み得る1つまたは複数のアポトーシスマーカーの発現に対して陰性である。
いくつかの態様では、発現は、マーカーの量、レベル、濃度および/または存在であるか、それを含む。特定の態様では、マーカーはポリペプチドである。いくつかの態様では、マーカーはmRNAである。いくつかの態様では、発現は、ポリペプチド、例えばマーカーポリペプチドの量、レベル、濃度および/または存在であるか、それを含む。特定の態様では、マーカーをコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNA、またはmRNAに由来するcDNAの量、レベル、濃度および/または存在。特定の態様では、発現は、細胞表面上のマーカー、もしくは細胞表面上に露出したマーカー、または細胞膜内のマーカーの量、レベル、濃度および/または存在であるか、それを含む。特定の態様では、発現は、細胞表面上のマーカー、もしくは細胞表面上に露出したマーカー、または細胞膜内のマーカーの量、レベル、濃度および/または存在であるか、それを含む。特定の態様では、発現は、内部発現、例えば、サイトゾル内、核内、小胞体内および/またはゴルジ装置内などの内部の細胞内のマーカーの量、レベル、濃度および/または存在であるか、それを含む。
いくつかの態様では、マーカーは、インビトロアッセイを行うことによって測定、評価および/または定量される。いくつかの例では、インビトロアッセイは、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的もしくは細胞学的アッセイ、またはmRNA発現レベルアッセイである。場合によっては、使用されるインビトロアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、イムノブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫染色、フローサイトメトリーアッセイ、表面プラズモン共鳴（SPR）、化学発光アッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、阻害アッセイまたはアビディティーアッセイであり得る。いくつかの態様では、マーカーの発現は、RNA-seqによって測定、評価および/または定量される。特定の態様では、マーカーの発現は、免疫染色技術によって測定、評価および/または定量される。特定の態様では、マーカーの発現は、フローサイトメトリー分析によって測定、評価および/または定量される。いくつかの態様では、マーカーの発現は、内部サイトカイン染色によって測定、評価および/または定量される。
いくつかの態様では、マーカーは、CD4＋T細胞組成物の細胞内で測定、評価および/または定量される。特定の態様では、少なくとも1％もしくは約1％、少なくとも5％もしくは約5％、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも15％もしくは約15％、少なくとも20％もしくは約20％、少なくとも25％もしくは約25％、少なくとも30％もしくは約30％、少なくとも35％もしくは約35％、少なくとも40％もしくは約40％、少なくとも45％もしくは約45％、少なくとも50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも97％もしくは約97％、または少なくとも99％もしくは約99％のCD4＋T細胞がナイーブ様CD4＋T細胞である。特定の態様では、10％〜50％もしくは約10％〜約50％、20％〜60％もしくは約20％〜約60％、25％〜75％もしくは約25％〜約75％、30％〜80％もしくは約30％〜約80％、40％〜90％もしくは約40％〜約90％、50％〜100％もしくは約50％〜約100％、30％〜50％もしくは約30％〜約50％、40％〜60％もしくは約40％〜約60％、50％〜70％もしくは約50％〜約70％、60％〜80％もしくは約60％〜約80％、70％〜90％もしくは約70％〜約90％、80％〜100％もしくは約80％〜約100％、5％〜25％もしくは約5％〜約25％、25％〜50％もしくは約25％〜約50％、50％〜75％もしくは約50％〜約75％、または75％〜99％もしくは約75％〜約99％のCD4＋T細胞がナイーブ様CD4＋T細胞である。特定の態様では、ナイーブ様CD4＋T細胞は、生存ナイーブ様CD4＋T細胞である。
特定の態様では、マーカーは、CD8＋T細胞組成物の細胞内で測定、評価および/または定量される。特定の態様では、少なくとも1％もしくは約1％、少なくとも5％もしくは約5％、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも15％もしくは約15％、少なくとも20％もしくは約20％、少なくとも25％もしくは約25％、少なくとも30％もしくは約30％、少なくとも35％もしくは約35％、少なくとも40％もしくは約40％、少なくとも45％もしくは約45％、少なくとも50％もしくは約50％、少なくとも55％もしくは約55％、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも65％もしくは約65％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも97％もしくは約97％、または少なくとも99％もしくは約99％のCD8＋T細胞がナイーブ様CD8＋T細胞である。特定の態様では、10％〜50％もしくは約10％〜約50％、20％〜60％もしくは約20％〜約60％、25％〜75％もしくは約25％〜約75％、30％〜80％もしくは約30％〜約80％、40％〜90％もしくは約40％〜約90％、50％〜100％もしくは約50％〜約100％、30％〜50％もしくは約30％〜約50％、40％〜60％もしくは約40％〜約60％、50％〜70％もしくは約50％〜約70％、60％〜80％もしくは約60％〜約80％、70％〜90％もしくは約70％〜約90％、80％〜100％もしくは約80％〜約100％、5％〜25％もしくは約5％〜約25％、25％〜50％もしくは約25％〜約50％、50％〜75％もしくは約50％〜約75％、または75％〜99％もしくは約75％〜約99％のCD8＋T細胞がナイーブ様CD4＋T細胞である。特定の態様では、ナイーブ様CD8＋T細胞は、生存ナイーブ様CD8＋T細胞である。
いくつかの態様では、CD4＋T細胞の組成物からの細胞は、10:1以上0.05:1以下、8:1以上0.1:1以下、5:1以上0.2:1以下、2.5:1以上0.25:1以下、2.2:1以上0.8:1以下、2:1以上0.5:1以下または1.5:1以上1:1以下のCD4＋ナイーブ様T細胞：CD8＋ナイーブ様T細胞比を有するインプット組成物を製造するのに十分な量および/または割合で、CD8＋T細胞の組成物からの細胞と混合または組み合わせられる。いくつかの態様では、細胞は、2.2:1以上0.8:1以下のCD4＋ナイーブ様T細胞：CD8＋ナイーブ様T細胞比に十分な量および/または割合で混合される。特定の態様では、細胞は、2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1もしくは0.8:1、または約2.2:1、約2.1:1、約2.0:1、約1.9:1、約1.8:1、約1.7:1、約1.6:1、約1.5:1、約1.4:1、約1.3:1、約1.2:1、約1.1:1、約1.0:1、約0.9:1もしくは約0.8:1のCD4＋ナイーブ様T細胞：CD8＋ナイーブ様T細胞比になるように混合または組み合わせられる。特定の態様では、細胞は、1.1:1または約1.1:1の比になるように混合または組み合わせられる。
いくつかの態様では、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5.5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5.5x108もしくは約1x109の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の規定された比を有するインプット組成物が製造される。特定の態様では、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108または1x108〜3x108の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の規定された比を有するインプット組成物が製造される。
いくつかの態様では、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量のナイーブ様CD4＋T細胞が、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5.5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5.5x108もしくは約1x109の量のナイーブ様CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の規定された比を有するインプット組成物が製造される。特定の態様では、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108または1x108〜3x108のナイーブ様CD4＋T細胞が、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量のナイーブ様CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD4＋ナイーブ様T細胞対CD8＋ナイーブ様T細胞の規定された比を有するインプット組成物が製造される。
特定の態様では、インプット組成物のナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の比は、試料、例えば生体試料のナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の比と比較して調整、変化および/または変更されている。特定の態様では、ナイーブ様CD4＋T細胞対ナイーブ様CD8＋T細胞の比は、生体試料から、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、または約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約100％、約1倍、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、約100倍、または少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍調整、変化または変更されている。特定の態様では、試料は、インプット組成物の細胞が由来し、単離され、選択され、および/または得られた試料である。
いくつかの態様では、インプット組成物の製造、生成および/または作製は、CD4＋T細胞組成物の細胞とCD8＋T細胞組成物の細胞とを混合するか組み合わせて、2.2:1〜0.8:1のナイーブ様CD4＋T細胞：ナイーブ様CD8＋T細胞比を有するインプット組成物を製造する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、混合するか組み合わせる前に、ナイーブ様細胞の数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または量、レベルまたは割合が、CD4＋T細胞組成物およびCD8＋T細胞組成物中で測定、評価および/または定量される。いくつかの態様では、ナイーブ様細胞の量、レベル、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合が、CD45RA＋;CCR7＋T細胞を検出することによって測定、評価および/または定量される。特定の態様では、インプット組成物は、2.2:1〜0.8:1のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。いくつかの態様では、インプット組成物は、1.1:1または約1.1:1のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比、例えば、規定、制御および/または固定された比を有する。特定の態様では、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、10:1以上0.05:1以下、8:1以上0.1:1以下、5:1以上0.2:1以下、2.5:1以上0.25:1以下、2.2:1以上0.8:1以下、2:1以上0.5:1以下または1.5:1以上1:1以下である。特定の態様では、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、2:1以上0.8:1以下、1.6:1以上0.8:1以下、1.4:1以上0.8:1以下、1.2:1以上0.8:1以下または1.2:1以上0.8:1以下である。いくつかの態様では、比は、2.2:1以上0.8:1以下である。特定の態様では、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1もしくは0.8:1、または約2.2:1、約2.1:1、約2.0:1、約1.9:1、約1.8:1、約1.7:1、約1.6:1、約1.5:1、約1.4:1、約1.3:1、約1.2:1、約1.1:1、約1.0:1、約0.9:1もしくは約0.8:1である。特定の態様では、比は、1.1:1または約1.1:1である。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞およびCD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞を有する。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、1×106〜1×1010個、1×107〜1×109個、5×107〜5×108個または1×108〜3×108個の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞およびCD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞を有する。
いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD45RA＋/CCR7＋細胞を有するか、含有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、100％以下、99％以下、98％以下、97％以下、96％以下、95％以下、90％以下または85％以下のCD45RA＋/CCR7＋細胞を含有するか、含む。
いくつかの態様では、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5.5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5.5x108もしくは約1x109の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の規定された比を有するインプット細胞組成物が製造される。特定の態様では、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108または1x108〜3x108の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の規定された比を有するインプット細胞組成物が製造される。
特定の態様では、インプット細胞組成物のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、試料、例えば生体試料のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比と比較して調整、変化および/または変更されている。特定の態様では、CD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、生体試料から、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、または約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約100％、約1倍、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、約100倍、または少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍調整、変化または変更されている。特定の態様では、試料は、インプット細胞組成物の細胞が由来し、単離され、選択され、および/または得られた試料である。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比、例えば、規定、制御および/または固定された比を有する。特定の態様では、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、10:1以上0.05:1以下、8:1以上0.1:1以下、5:1以上0.2:1以下、2.5:1以上0.25:1以下、2.2:1以上0.8:1以下、2:1以上0.5:1以下または2:1以上1:1以下である。特定の態様では、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、2:1以上0.8:1以下、1.8:1以上1:1以下、1.8:1以上1.2:1以下、1.2:1以上1.4:1以下または1.8:1以上1.6:1以下である。いくつかの態様では、比は、1.8:1以上1.6:1以下である。特定の態様では、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.69:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1もしくは1.3:1、または約2.2:1、約2.1:1、約2.0:1、約1.9:1、約1.8:1、約1.7:1、約1.69:1、約1.6:1、約1.5:1、約1.4:1もしくは約1.3:1である。特定の態様では、比は、1.69:1または約1.69:1である。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞およびCD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞を有する。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、1×106〜1×1010個、1×107〜1×109個、5×107〜5×108個または1×108〜3×108個の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞およびCD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞を有する。
いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、少なくとも1％もしくは約1％、少なくとも5％もしくは約5％、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも20％もしくは約20％、少なくとも30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD27＋/CCR7＋細胞を有するか、含有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、100％以下もしくは約100％、99％以下もしくは約99％、98％以下もしくは約98％、97％以下もしくは約97％、96％以下もしくは約96％、95％以下もしくは約95％、90％以下もしくは約90％、または85％以下もしくは約85％のCD27＋/CCR7＋細胞を含有するか、含む。
いくつかの態様では、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5.5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5.5x108もしくは約1x109の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の規定された比を有するインプット細胞組成物が製造される。特定の態様では、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108または1x108〜3x108の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の規定された比を有するインプット細胞組成物が製造される。
特定の態様では、インプット細胞組成物のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、試料、例えば生体試料のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比と比較して調整、変化および/または変更されている。特定の態様では、CD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、生体試料から、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、または約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約100％、約1倍、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、約100倍、または少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍調整、変化または変更されている。特定の態様では、試料は、インプット細胞組成物の細胞が由来し、単離され、選択され、および/または得られた試料である。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比、例えば、規定、制御および/または固定された比を有する。特定の態様では、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、10:1以上0.05:1以下、8:1以上0.1:1以下、5:1以上0.2:1以下、2.5:1以上0.25:1以下、2.2:1以上0.8:1以下、2:1以上0.5:1以下または1.5:1以上1:1以下である。特定の態様では、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、2:1以上0.8:1以下、1.6:1以上0.8:1以下、1.4:1以上0.8:1以下、1.2:1以上0.8:1以下または1.2:1以上0.8:1以下である。いくつかの態様では、比は、2.2:1以上0.8:1以下である。特定の態様では、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、2.2:1、2.1:1、2.0:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1もしくは0.8:1、または約2.2:1、約2.1:1、約2.0:1、約1.9:1、約1.8:1、約1.7:1、約1.6:1、約1.5:1、約1.4:1、約1.3:1、約1.2:1、約1.1:1、約1.0:1、約0.9:1もしくは約0.8:1である。特定の態様では、比は、1.1:1または約1.1:1である。
特定の態様では、インプット細胞組成物は、1×106〜1×1010個、1×107〜1×109個、5×107〜5×108個または1×108〜3×108個の総細胞または総生存細胞を有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の、CD4またはCD8を発現する細胞を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量のCD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞およびCD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞を有する。
いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、少なくとも1％もしくは約1％、少なくとも5％もしくは約5％、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも20％もしくは約20％、少なくとも30％もしくは約30％、少なくとも40％もしくは約40％、少なくとも50％もしくは約50％、少なくとも60％もしくは約60％、少なくとも70％もしくは約70％、少なくとも75％もしくは約75％、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしくは約99％、少なくとも99.5％もしくは約99.5％、少なくとも99.9％もしくは約99.9％、または100％もしくは約100％のCD62L-/CCR7＋細胞を有するか、含有する。特定の態様では、インプット細胞組成物は、100％以下もしくは約100％、99％以下もしくは約99％、98％以下もしくは約98％、97％以下もしくは約97％、96％以下もしくは約96％、95％以下もしくは約95％、90％以下もしくは約90％、または85％以下もしくは約85％のCD62L-/CCR7＋細胞を含有するか、含む。
いくつかの態様では、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5x108もしくは約1x109の量の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106、5x106、1x107、5x107、1.0x108、1.1x108、1.2x108、1.3x108、1.4x108、1.5x108、1.6x108、1.7x108、1.8x108、1.9x108、2.0x108、2.1x108、2.2x108、2.3x108、2.4x108、2.5x108、2.6x108、2.7x108、2.8x108、2.9x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5x108、5.5x108もしくは1x109、または約1x106、約5x106、約1x107、約5x107、約1.0x108、約1.1x108、約1.2x108、約1.3x108、約1.4x108、約1.5x108、約1.6x108、約1.7x108、約1.8x108、約1.9x108、約2.0x108、約2.1x108、約2.2x108、約2.3x108、約2.4x108、約2.5x108、約2.6x108、約2.7x108、約2.8x108、約2.9x108、約3.0x108、約3.5x108、約4.0x108、約4.5x108、約5x108、約5.5x108もしくは約1x109の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の規定された比を有するインプット細胞組成物が製造される。特定の態様では、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108または1x108〜3x108の総CD4＋T細胞または総生存CD4＋T細胞が、1x106〜1x1010、1x107〜1x109、5x107〜5x108もしくは1x108〜3x108、または約1x106〜約1x1010、約1x107〜約1x109、約5x107〜約5x108もしくは約1x108〜約3x108の量の総CD8＋T細胞または総生存CD8＋T細胞と混合されるか組み合わせられて、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の規定された比を有するインプット細胞組成物が製造される。
特定の態様では、インプット細胞組成物のCD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、試料、例えば生体試料のCD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比と比較して調整、変化および/または変更されている。特定の態様では、CD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞対CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞の比は、生体試料から、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、または約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約100％、約1倍、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、約100倍、または少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍調整、変化または変更されている。特定の態様では、試料は、インプット細胞組成物の細胞が由来し、単離され、選択され、および/または得られた試料である。
いくつかの態様では、インプット細胞組成物の製造、生成および/または作製は、CD4＋T細胞組成物の細胞とCD8＋T細胞組成物の細胞とを混合するか組み合わせて、2.2:1〜0.8:1のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有するインプット細胞組成物を製造する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、混合するか組み合わせる前に、CD45RA＋/CCR7＋細胞の数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または量、レベルまたは割合が、CD4＋T細胞組成物およびCD8＋T細胞組成物中で測定、評価および/または定量される。いくつかの態様では、CD45RA＋/CCR7＋細胞の量、レベル、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合が、CD45RA＋;CCR7＋T細胞を検出することによって測定、評価および/または定量される。特定の態様では、インプット細胞組成物は、2.2:1〜0.8:1のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1.1:1または約1.1:1のCD45RA＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD45RA＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。
いくつかの態様では、インプット細胞組成物の製造、生成および/または作製は、CD4＋T細胞組成物の細胞とCD8＋T細胞組成物の細胞とを混合するか組み合わせて、2.4:1〜1:1のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有するインプット細胞組成物を製造する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、混合するか組み合わせる前に、CD27＋/CCR7＋細胞の数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または量、レベルまたは割合が、CD4＋T細胞組成物およびCD8＋T細胞組成物中で測定、評価および/または定量される。いくつかの態様では、CD27＋/CCR7＋細胞の量、レベル、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合が、CD45RA＋;CCR7＋T細胞を検出することによって測定、評価および/または定量される。特定の態様では、インプット細胞組成物は、2.4:1〜1:1のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1.69:1または約1.69:1のCD27＋/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD27＋/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。
いくつかの態様では、インプット細胞組成物の製造、生成および/または作製は、CD4＋T細胞組成物の細胞とCD8＋T細胞組成物の細胞とを混合するか組み合わせて、2.2:1〜0.8:1のCD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有するインプット細胞組成物を製造する1つまたは複数の工程を含む。特定の態様では、混合するか組み合わせる前に、CD62L-/CCR7＋細胞の数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または量、レベルまたは割合が、CD4＋T細胞組成物およびCD8＋T細胞中で測定、評価および/または定量される。いくつかの態様では、CD62L-/CCR7＋細胞の量、レベル、数、体積当たりの数、重量当たりの数、および/または割合が、CD62L-/CCR7＋T細胞を検出することによって測定、評価および/または定量される。特定の態様では、インプット細胞組成物は、2.2:1〜0.8:1のCD62L-/CCR7＋/CD4＋T細胞：CD62L-/CCR7＋/CD8＋T細胞比を有する。いくつかの態様では、インプット細胞組成物は、1.1:1または約1.1:1のCD62L-/CCR7/CD4＋T細胞：CD62L-/CCR7/CD8＋T細胞比を有する。
B.活性化および刺激
いくつかの態様では、提供される方法は、刺激条件下で細胞をインキュベートすることに関連して使用される。いくつかの態様では、刺激条件は、TCRおよび/または共受容体から生成されるシグナルなど、細胞、例えばCD4＋T細胞内のシグナルを活性化または刺激する、および/または活性化または刺激することができる条件を含む。いくつかの態様では、刺激条件は、刺激試薬、例えば、細胞内のシグナルを活性化または刺激する、および/または活性化または刺激することができる試薬を用いて、および/またはその存在下で細胞を培養する（culturing）、培養する（cultivating）、インキュベートする、活性化する、増殖する1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、TCRおよび/または共受容体を刺激および/または活性化する。特定の態様では、刺激試薬は、例えばセクションI-B-1に記載されているように、本明細書において提供される試薬である。
いくつかの態様では、提供される方法は、刺激条件下で細胞をインキュベートすることに関連して使用される。いくつかの態様では、刺激条件は、TCRおよび/または共受容体から生成されるシグナルなど、細胞、例えばCD4＋T細胞内のシグナルを活性化または刺激する、および/または活性化または刺激することができる条件を含む。いくつかの態様では、刺激条件は、刺激試薬、例えば、細胞内のシグナルを活性化または刺激する、および/または活性化または刺激することができる試薬を用いて、および/またはその存在下で細胞を培養する（culturing）、培養する（cultivating）、インキュベートする、活性化する、増殖する1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、TCRおよび/または共受容体を刺激および/または活性化する。特定の態様では、刺激試薬は、例えばセクションI-B-1に記載されているように、本明細書において提供される試薬である。
特定の態様では、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、例えば、本明細書において提供される方法または技術、例えば、セクションI-Cに記載されている方法または技術によって、細胞を遺伝子操作する、例えば、細胞をトランスフェクトおよび/または形質導入する前に、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様では、刺激条件下でインキュベートされる濃縮T細胞の組成物は、インプット組成物である。特定の態様では、インプット組成物の細胞は、生体試料から前もって単離されているか、選択されているか、濃縮されているか、得られている。特定の態様では、インプット組成物からの細胞は、前もってクライオ凍結され保存されており、インキュベーション前に解凍される。
いくつかの態様では、提供される方法は、インプット組成物からの細胞などの細胞を刺激する工程を含む1つまたは複数の処理工程に関連して使用される。特定の態様では、インキュベーションは、本明細書において記載される形質導入の態様、例えば、セクションI-Cに記載されている方法から生じる遺伝子操作などの遺伝子操作の前であり得るか、これに関連し得る。いくつかの態様では、刺激は、例えば、操作、例えば形質導入の前に、細胞の活性化および/または増殖をもたらす。
いくつかの態様では、処理工程は、インプット細胞および/またはインプット組成物の細胞などの細胞のインキュベーションを含み、インキュベーション工程は、細胞の培養（culture）、培養（cultivation）、刺激、活性化および/または増殖を含むことができる。いくつかの態様では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団内の細胞の増殖、拡大増殖、活性化および/または生存を誘導し、抗原曝露を模倣し、および/または組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のために細胞をプライミングするように設計された条件が含まれる。
特定の態様では、細胞、例えば、インプット組成物の細胞は、例えば、刺激試薬の存在下などの刺激条件下で、5x107細胞/mL未満、4x107細胞/mL未満、3x107細胞/mL未満、2x107細胞/mL未満、1x107細胞/mL未満、9x106細胞/mL未満、8x106細胞/mL未満、7x106細胞/mL未満、6x106細胞/mL未満、5x106細胞/mL未満、4x106細胞/mL未満もしくは3x106細胞/mL未満、または約5x107細胞/mL、約4x107細胞/mL、約3x107細胞/mL、約2x107細胞/mL、約1x107細胞/mL、約9x106細胞/mL、約8x106細胞/mL、約7x106細胞/mL、約6x106細胞/mL、約5x106細胞/mL、約4x106細胞/mLもしくは約3x106細胞/mLの密度でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、5×106細胞/mL未満の密度でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、1×103細胞/mL〜1×109細胞/mL、1×104細胞/mL〜1×108細胞/mL、1×105細胞/mL〜1×107細胞/mL、5x105細胞/mL〜1x107細胞/mL、1x106細胞/mL〜5x106細胞/mLまたは3x106細胞/mL〜5x106細胞/mLの密度でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、1×106細胞/mL、1.5×106細胞/mL、2×106細胞/mL、2.5×106細胞/mL、3×106細胞/mL、3.5x106細胞/mL、4x106細胞/mL、4.5x106細胞/mLもしくは5x106細胞/mL、または約1×106細胞/mL、約1.5×106細胞/mL、約2×106細胞/mL、約2.5×106細胞/mL、約3×106細胞/mL、約3.5x106細胞/mL、約4x106細胞/mL、約4.5x106細胞/mLもしくは約5x106細胞/mLの密度でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの密度でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は生存細胞である。特定の態様では、細胞は、アポトーシスマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3に対して陰性である。特定の態様では、細胞は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞であるか、それらを含む。
特定の態様では、生存能力の指標には、限定されることなく、細胞複製、ミトコンドリア機能、エネルギーバランス、膜完全性および細胞死の指標が含まれる。特定の態様では、生存能力の指標には、酸化ストレス、代謝活性化、代謝安定性、酵素誘導、酵素阻害、および細胞膜輸送体との相互作用の指標がさらに含まれる。いくつかの態様では、生存細胞には、正常な機能的な細胞過程を経ている細胞および/または壊死またはプログラム細胞死を経ていないか、壊死またはプログラム細胞死の進行中でない細胞が含まれる。いくつかの態様では、生存能力は、細胞の酸化還元電位、細胞膜の完全性、またはミトコンドリアの活性もしくは機能によって評価することができる。いくつかの態様では、生存能力は、細胞死に関連する特定の分子の欠如、またはアッセイでの細胞死の兆候の欠如である。特定の態様では、細胞の生存能力は、いくつかの常用的な手段によって検出、測定および/または評価することができる。そのような生存能力アッセイの非限定的な例には、限定されることなく、色素取り込みアッセイ（例えば、カルセインAMアッセイ）、XTT細胞生存率アッセイ、および色素排除アッセイ（例えば、トリパンブルー色素排除アッセイ、エオシン色素排除アッセイまたはプロピジウム色素排除アッセイ）が含まれる。生存能力アッセイは、細胞用量、細胞組成物および/または細胞試料中の生存細胞の数または割合（例えば頻度）を決定するのに有用である。
特定の態様では、アポトーシスマーカーには、アポトーシスに関連する任意の公知のマーカーが含まれ得、遺伝子、タンパク質もしくは活性型タンパク質の発現、または小疱形成および/または核破壊などのアポトーシスに関連する特徴の出現が含まれ得る。特定の態様では、アポトーシスマーカーは、限定されることなく、アポトーシスを開始することが知られているアポトーシス促進因子、死受容体経路のメンバー、ミトコンドリア（固有の）経路の活性化メンバー、Bax、Bad、およびBid、Fas、FADDなどのBcl-2ファミリーメンバー、核収縮の存在（例えば、顕微鏡によりモニタリングして）、染色体DNA断片化の存在（例えば、染色体DNAラダーの存在）、またはTUNEL染色およびアネキシンV染色などのアポトーシスアッセイに関連するマーカーが含まれ得る、アポトーシスに関連するマーカーである。いくつかの態様では、アポトーシスのマーカーは、カスパーゼ発現、例えば、活性型のカスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-10および/またはカスパーゼ-13の発現である。いくつかの態様では、アポトーシスマーカーはアネキシンVである。特定の態様では、アポトーシスマーカーは活性型カスパーゼ-3である。
いくつかの態様では、1×105〜500,000×106個または約1×105〜約500,000×106個、1×106〜50,000×106個または約1×106〜約50,000×106個、10×106〜5,000×106個または約10×106〜約5,000×106個、1x106〜1,000x106個または約1x106〜約1,000x106個、50x106〜5,000x106個または約50x106〜約5,000x106個、10x106〜1,000x106個または約10x106〜約1,000x106個、100×106〜2500×106個または約100×106〜約2500×106個の細胞、例えば、インプット組成物の細胞が、例えば、刺激試薬の存在下などの刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様では、少なくとも50x106個もしくは約50x106個の細胞、少なくとも100x106個もしくは約100x106個の細胞、少なくとも150x106個もしくは約150x106個の細胞、少なくとも200x106個もしくは約200x106個の細胞、少なくとも250x106個もしくは約250x106個の細胞、少なくとも300x106個もしくは約300x106個の細胞、少なくとも350x106個もしくは約350x106個の細胞、少なくとも400x106個もしくは約400x106個の細胞、少なくとも450×106個もしくは約450×106個の細胞、または少なくとも500×106個もしくは約500×106個の細胞が、例えば刺激条件下でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は生存細胞である。特定の態様では、細胞は、アポトーシスのマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3に対して陰性である。特定の態様では、細胞は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞であるか、それらを含む。
いくつかの態様では、1×105〜25,000×106個または約1×105〜約25,000×106個、1×106〜25,000×106個または約1×106〜約25,000×106個、10×106〜2,500×106個または約10×106〜約2,500×106個、1x106〜500x106個または約1x106〜約500x106個、50x106〜2,500x106個または約50x106〜約2,500x106個、10x106〜500x106個または約10x106〜約500x106個、50x106〜300x106個または約50x106〜約300x106個のCD4＋T細胞、例えば、インプット組成物のCD4＋T細胞が、例えば、刺激試薬の存在下などの刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様では、少なくとも25x106個もしくは約25x106個、少なくとも50x106個もしくは約50x106個、少なくとも75x106個もしくは約75x106個、少なくとも100x106個もしくは約100x106個、少なくとも125x106個もしくは約125x106個、少なくとも150x106個もしくは約150x106個、少なくとも175x106個もしくは約175x106個、少なくとも200x106個もしくは約200x106個、少なくとも225x106個もしくは約225x106個、または少なくとも250x106個もしくは約250x106個のCD4＋T細胞が、例えば刺激条件下でインキュベートされる。いくつかの態様では、CD4＋T細胞は生存CD4＋T細胞である。特定の態様では、CD4＋T細胞は、アポトーシスのマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3に対して陰性である。
特定の態様では、1×105〜25,000×106個または約1×105〜約25,000×106個、1×106〜25,000×106個または約1×106〜約25,000×106個、10×106〜2,500×106個または約10×106〜約2,500×106個、1x106〜500x106個または約1x106〜約500x106個、50x106〜2,500x106個または約50x106〜約2,500x106個、10x106〜500x106個または約10x106〜約500x106個、50x106〜300x106個または約50x106〜約300x106個のCD8＋T細胞、例えば、インプット組成物のCD8＋T細胞が、例えば、刺激試薬の存在下などの刺激条件下でインキュベートされる。いくつかの態様では、少なくとも25x106個もしくは約25x106個、少なくとも50x106個もしくは約50x106個、少なくとも75x106個もしくは約75x106個、少なくとも100x106個もしくは約100x106個、少なくとも125x106個もしくは約125x106個、少なくとも150x106個もしくは約150x106個、少なくとも175x106個もしくは約175x106個、少なくとも200x106個もしくは約200x106個、少なくとも225x106個もしくは約225x106個、または少なくとも250x106個もしくは約250x106個のCD8＋T細胞が、例えば刺激条件下でインキュベートされる。いくつかの態様では、CD8＋T細胞は生存CD8＋T細胞である。特定の態様では、CD8＋T細胞は、アポトーシスのマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3に対して陰性である。
いくつかの態様では、刺激および/または活性化の条件には、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの1つまたは複数が含まれ得る。
いくつかの態様では、刺激条件または刺激試薬は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを刺激または活性化することができる1つまたは複数の試薬、例えばリガンドを含む。いくつかの局面では、一次シグナルを送達するのに適した、例えば、ITAM誘導シグナルの活性化を開始するのに適した作用物質、例えば、TCR成分に特異的な作用物質、例えば抗CD3、および/または共刺激シグナルを促進する作用物質、例えば、T細胞共刺激受容体に特異的な作用物質、例えば、ビーズなどの固体支持体に結合している抗CD28、または抗4-1BBなど、および/または1つまたは複数のサイトカインなどの作用物質は、T細胞内でTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードをオンにするか、開始する。刺激試薬の中には、抗CD3ビーズ/抗CD28ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander、および/またはExpACT（登録商標）ビーズ）がある。任意で、拡大増殖方法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培地に加える工程をさらに含み得る。いくつかの態様では、刺激剤はサイトカインを含む。
特定の態様では、刺激条件は、細胞を刺激試薬とともにインキュベートすること、培養すること（culturing）、および/または培養すること（cultivating）を含む。特定の態様では、刺激試薬は、本明細書において提供される試薬、例えば、セクションI-B-1に記載されている試薬である。特定の態様では、刺激試薬は、ビーズを含有するか、含む。特定の態様では、刺激条件下での細胞のインキュベーション、培養（culturing）および/または培養（cultivating）の着手およびまたは開始は、細胞が刺激試薬と接触する、および/または刺激試薬とともにインキュベートされると起こる。特定の態様では、細胞は、細胞を遺伝子操作する、例えば、形質導入またはトランスフェクションなどによって組換えポリヌクレオチドを細胞に導入する前、最中および/または後にインキュベートされる。
いくつかの態様では、濃縮T細胞の組成物は、刺激試薬および/またはビーズ：細胞の比が3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1もしくは0.2:1、または約3:1、約2.5:1、約2:1、約1.5:1、約1.25:1、約1.2:1、約1.1:1、約1:1、約0.9:1、約0.8:1、約0.75:1、約0.67:1、約0.5:1、約0.3:1もしくは約0.2:1でインキュベートされる。特定の態様では、刺激試薬および/またはビーズ：細胞の比は、2.5:1〜0.2:1、2:1〜0.5:1、1.5:1〜0.75:1、1.25:1〜0.8:1、1.1:1〜0.9:1である。特定の態様では、刺激試薬：細胞の比は、約1:1または1:1である。
特定の態様では、刺激条件は、1つまたは複数のサイトカインを用いて、および/またはその存在下で、細胞、例えば、インプット組成物からの細胞をインキュベートすること、培養すること（culturing）、および/または培養すること（cultivating）を含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現される、および/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合する、および/または結合することができる。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-α-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、それを含む。いくつかの態様では、サイトカインの4-α-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーには、限定されることなく、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれる。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるか、それを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7であるか、それを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-2であるか、それを含む。
特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインの量または濃度は、国際単位（IU）を用いて測定および/または定量される。国際単位を使用して、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、血液製剤および類似の生物活性物質を定量してもよい。いくつかの態様では、IUは、特定の重量および強度の国際参照標準、例えば、ヒトIL-2のためのWHO第1国際標準、86/504と比較することによる生物学的調製物の効力の測定単位であるか、それを含む。国際単位は、公開され、国際的な共同研究活動から得られた生物活性単位を報告するための唯一認められ、標準化された方法である。特定の態様では、サイトカインの組成物、試料または供給源のIUは、類似のWHO標準製品を用いた製品比較試験によって得ることができる。例えば、いくつかの態様では、ヒト組換えIL-2、IL-7またはIL-15の組成物、試料または供給源のIU/mgは、WHO標準IL-2製品（NIBSCコード:86/500）、WHO標準IL-17製品（NIBSCコード:90/530）およびWHO標準IL-15製品（NIBSCコード:95/554）とそれぞれ比較される。
いくつかの態様では、IU/mg単位の生物活性は、（ng/mL単位のED50）-1x106に等しい。特定の態様では、組換えヒトIL-2またはIL-15のED50は、CTLL-2細胞による細胞増殖の半最大刺激（XTT切断）に必要な濃度に等しい。特定の態様では、組換えヒトIL-7のED50は、PHA活性化ヒト末梢血リンパ球の増殖のための半最大刺激に必要な濃度に等しい。IL-2のIUのアッセイおよび計算に関する詳細は、Wadhwa et al.,Journal of Immunological Methods（2013）,379（1-2）:1-7;およびGearing and Thorpe,Journal of Immunological Methods（1988）,114（1-2）:3-9で説明されており、IL-15のIUのアッセイおよび計算に関する詳細は、Soman et al.Journal of Immunological Methods（2009）348（1-2）:83-94で説明されている。
いくつかの態様では、細胞、例えばインプット細胞は、サイトカイン、例えば組換えヒトサイトカインとともに、1IU/mL〜1,000IU/mLもしくは約1IU/mL〜約1,000IU/mL、10IU/mL〜50IU/mLもしくは約10IU/mL〜約50IU/mL、50IU/mL〜100IU/mLもしくは約50IU/mL〜約100IU/mL、100IU/mL〜200IU/mLもしくは約100IU/mL〜約200IU/mL、100IU/mL〜500IU/mLもしくは約100IU/mL〜約500IU/mL、250IU/mL〜500IU/mLもしくは約250IU/mL〜約500IU/mL、または500IU/mL〜1,000IU/mLもしくは約500IU/mL〜約1,000IU/mLの濃度でインキュベートされる。
いくつかの態様では、細胞、例えばインプット細胞は、IL-2、例えばヒト組換えIL-2とともに、1IU/mL〜500IU/mLもしくは約1IU/mL〜約500IU/mL、10IU/mL〜250IU/mLもしくは約10IU/mL〜約250IU/mL、50IU/mL〜200IU/mLもしくは約50IU/mL〜約200IU/mL、50IU/mL〜150IU/mLもしくは約50IU/mL〜約150IU/mL、75IU/mL〜125IU/mLもしくは約75IU/mL〜約125IU/mL、100IU/mL〜200IU/mLもしくは約100IU/mL〜約200IU/mL、または10IU/mL〜100IU/mLもしくは約10IU/mL〜約100IU/mLの濃度で、例えば無血清培地中でインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、インプット組成物の細胞は、組換えIL-2とともに、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mL、または約50IU/mL、約60IU/mL、約70IU/mL、約80IU/mL、約90IU/mL、約100IU/mL、約110IU/mL、約120IU/mL、約130IU/mL、約140IU/mL、約150IU/mL、約160IU/mL、約170IU/mL、約180IU/mL、約190IU/mLもしくは約100IU/mLの濃度でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞、例えばインプット細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-2、例えばヒト組換えIL-2の存在下でインキュベートされる。
いくつかの態様では、細胞、例えばインプット細胞は、組換えIL-7、例えばヒト組換えIL-7とともに、100IU/mL〜2,000IU/mLもしくは約100IU/mL〜約2,000IU/mL、500IU/mL〜1,000IU/mLもしくは約500IU/mL〜約1,000IU/mL、100IU/mL〜500IU/mLもしくは約100IU/mL〜約500IU/mL、500IU/mL〜750IU/mLもしくは約500IU/mL〜約750IU/mL、750IU/mL〜1,000IU/mLもしくは約750IU/mL〜約1,000IU/mL、または550IU/mL〜650IU/mLもしくは約550IU/mL〜約650IU/mLの濃度で、例えば無血清培地中でインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えばインプット細胞は、IL-7とともに、50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mLもしくは1,000IU/mL、または約50IU/mL、約100IU/mL、約150IU/mL、約200IU/mL、約250IU/mL、約300IU/mL、約350IU/mL、約400IU/mL、約450IU/mL、約500IU/mL、約550IU/mL、約600IU/mL、約650IU/mL、約700IU/mL、約750IU/mL、約800IU/mL、約750IU/mL、約750IU/mL、約750IU/mLもしくは約1,000IU/mLの濃度でインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えばインプット細胞は、600IU/mLまたは約600IU/mLのIL-7、例えばヒト組換えIL-7の存在下でインキュベートされる。
いくつかの態様では、細胞、例えばインプット細胞は、組換えIL-15、例えばヒト組換えIL-15とともに、1IU/mL〜500IU/mLもしくは約1IU/mL〜約500IU/mL、10IU/mL〜250IU/mLもしくは約10IU/mL〜約250IU/mL、50IU/mL〜200IU/mLもしくは約50IU/mL〜約200IU/mL、50IU/mL〜150IU/mLもしくは約50IU/mL〜約150IU/mL、75IU/mL〜125IU/mLもしくは約75IU/mL〜約125IU/mL、100IU/mL〜200IU/mLもしくは約100IU/mL〜約200IU/mL、または10IU/mL〜100IU/mLもしくは約10IU/mL〜約100IU/mLの濃度で、例えば無血清培地中でインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、インプット組成物の細胞は、組換えIL-15とともに、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは200IU/mL、または約50IU/mL、約60IU/mL、約70IU/mL、約80IU/mL、約90IU/mL、約100IU/mL、約110IU/mL、約120IU/mL、約130IU/mL、約140IU/mL、約150IU/mL、約160IU/mL、約170IU/mL、約180IU/mL、約190IU/mLもしくは約200IU/mLの濃度でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞、例えばインプット細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-15、例えばヒト組換えIL-15の存在下でインキュベートされる。
特定の態様では、細胞、例えば、インプット組成物からの細胞は、刺激条件下で、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下で、例えば無血清培地中でインキュベートされる。いくつかの態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は組換え型である。特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15はヒトである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15であるか、それらを含む。特定の態様では、細胞は、刺激条件下で、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下で、例えば無血清培地中でインキュベートされる。
条件には、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの1つまたは複数が含まれ得る。
いくつかの局面では、インキュベーションは、Riddell et al.の米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al.（2012）J Immunother.35（9）:651-660、Terakura et al.（2012）Blood.1:72-82、および/またはWang et al.（2012）J Immunother.35（9）:689-701に記載されているものなどの技術に従って行われる。
いくつかの態様では、インキュベーションは無血清培地中で行われる。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたおよび/または正確に規定された細胞培養培地である。特定の態様では、無血清培地は、処理された、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過された、制御された培地である。いくつかの態様では、無血清培地はタンパク質を含有する。特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
いくつかの態様では、1つまたは複数の刺激条件または刺激試薬の存在下でのインキュベーションの少なくとも一部は、例えば、国際公開番号WO2016/073602に記載されているような遠心回転下で、遠心チャンバの内部キャビティ内で行われる。いくつかの態様では、遠心チャンバ内で行われるインキュベーションの少なくとも一部は、刺激および/または活性化を誘導するための単数または複数の試薬と混合することを含む。いくつかの態様では、選択された細胞などの細胞は、遠心チャンバ内で刺激条件または刺激剤と混合される。そのようなプロセスのいくつかの局面では、細胞培養プレートまたは他のシステムで同様の刺激を行う際に通常使用されるよりもはるかに少ない量の1つまたは複数の刺激条件または作用物質と一定体積の細胞が混合される。
いくつかの態様では、周期的に振盪または回転させながらチューブまたはバッグ内などで遠心チャンバ内で混合せずに選択が行われる場合に、同一の数の細胞または同一の体積の細胞を選択するのとほぼ同じまたは類似の効率を達成するのに通常使用されるか、必要であろう刺激剤の量と比較して、実質的にそれよりも少ない量（例えば、その量の5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下または80％以下）で、チャンバのキャビティ内で細胞に刺激剤が加えられる。いくつかの態様では、インキュベーションは、細胞および刺激剤にインキュベーション緩衝液を加えることにより行われて、例えば、10mL〜200mL、例えば、少なくとも10mL、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、少なくとも100mL、少なくとも150mLもしくは少なくとも200mL、または少なくとも約10mL、少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、少なくとも約100mL、少なくとも約150mLもしくは少なくとも約200mL、または約10mL、約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、約100mL、約150mLもしくは約200mL、または10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mLもしくは200mLの試薬のインキュベーションにより標的体積を達成する。いくつかの態様では、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞に加える前に予め混合される。いくつかの態様では、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞に別個に加えられる。いくつかの態様では、刺激インキュベーションは、エネルギー的に有利な相互作用を促進するのを助け、それにより、細胞の刺激および活性化を達成しながら比較的少ない全体的な刺激剤の使用を可能にし得る、周期的な穏やかな混合条件により行われる。
いくつかの態様では、インキュベーションは、一般に、スピンの存在下などの混合条件下で、一般に、細胞をペレット化するのに使用される速度よりも遅い速度などの比較的低い力または速度で、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）で、例えば、80g〜100gまたは約80g〜約100g（例えば、80g、85g、90g、95gもしくは100g、または約80g、約85g、約90g、約95gもしくは約100g、または少なくとも80g、少なくとも85g、少なくとも90g、少なくとも95gもしくは少なくとも100g）の試料またはチャンバもしくは他の容器の壁でのRCFで行われる。いくつかの態様では、スピンは、静止期間が後に続くこのような低速でのスピンの繰り返される間欠期を使用して、例えば、1秒間、2秒間、3秒間、4秒間、5秒間、6秒間、7秒間、8秒間、9秒間または10秒間のスピンおよび/または静止、例えば、約1秒または2秒のスピンの後に約5秒間、約6秒間、約7秒間または約8秒間静止することを使用して行われる。
いくつかの態様では、例えば、刺激試薬との刺激条件下でのインキュベーションの総持続時間は、1時間〜96時間、1時間〜72時間、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、12時間〜24時間、18時間〜30時間、または約1時間〜約96時間、約1時間〜約72時間、約1時間〜約48時間、約4時間〜約36時間、約8時間〜約30時間、約12時間〜約24時間、約18時間〜約30時間、例えば、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間もしくは少なくとも72時間、または少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間もしくは少なくとも約72時間である。いくつかの態様では、例えば、刺激試薬とのインキュベーションの総持続時間は、18時間〜約30時間または約18時間〜約30時間である。
いくつかの態様では、細胞は、例えば、セクションI-Cによって説明されているような形質導入および/またはトランスフェクションによって、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを細胞に導入する工程の前および/または最中に、刺激条件下で培養（cultured）、培養（cultivated）および/またはインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、遺伝子操作の前に、30分〜2時間、1時間〜8時間、6時間〜12時間、12時間〜18時間、16時間〜24時間、18時間〜30時間、24時間〜48時間、24時間〜72時間、42時間〜54時間、60時間〜120時間96時間〜120時間、90時間の間、および1日〜7日、3日〜8日、1日〜3日、4日〜6日または4日〜5日の期間にわたり、刺激条件下で培養（cultured）、培養（cultivated）および/またはインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、刺激条件下で18時間〜30時間または約18時間〜約30時間インキュベートされる。特定の態様では、細胞は、刺激条件下で24時間または約24時間インキュベートされる。
いくつかの態様では、刺激条件下で細胞をインキュベートすることは、セクションI-B-1に記載されている刺激試薬とともに細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、常磁性ビーズなどのビーズを含有するか含み、細胞は、1:1の比などの3:1未満（ビーズ:細胞）の比で刺激試薬とともにインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、1つまたは複数のサイトカインの存在下で刺激試薬とともにインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下で、1:1（ビーズ:細胞）の比で刺激試薬とともにインキュベートされる。
特定の態様では、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含有する細胞のインプット組成物は、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、無血清培地中でインキュベートされる。特定の態様では、インプット組成物は、1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する。特定の態様では、少なくとも100×106個または約100×106個の細胞、例えば、インプット組成物からの細胞が、例えば、5×106細胞/mL未満または約5×106細胞/mLの密度で、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様では、少なくとも50×106個または約50×106個のCD4＋T細胞および少なくとも50×106個または約50×106個のCD8＋T細胞が、刺激条件下でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、18時間〜30時間インキュベートされる。特定の態様では、刺激条件下で細胞をインキュベートすることは、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下で刺激試薬とともに細胞をインキュベートすることを含む。特定の態様では、細胞は、3:1未満の刺激試薬：細胞比で刺激試薬とともにインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞は、50IU/mL〜200IU/mLまたは約50IU/mL〜約200IU/mLのIL-2、400〜1,000IU/mLまたは約400〜約1,000IU/mLのIL-7および/または50IU/mL〜200IU/mLまたは約50IU/mL〜約200IU/mLのIL-15とともにインキュベートされる。
特定の態様では、CD4＋TおよびCD8＋Tを1:1または約1:1の比で含有するインプット組成物の100×106〜500×106個の細胞が、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、生存細胞であり、および/またはアポトーシスマーカーに対して陰性である。いくつかの態様では、インプット組成物の300×106個または約300×106個の細胞がインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、無血清培地中でインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの密度でインキュベートされる。いくつかの態様では、150×106個または約150×106個のCD4＋T細胞および150×106個または約150×106個のCD8＋T細胞がインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、1:1または約1:1の刺激試薬：細胞比で刺激試薬とともにインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLのIL-2、600IU/mLまたは約600IU/mLのIL-7、および50IU/mLの間および/または200IU/mLまたは約200IU/mLのIL-15の存在下でインキュベートされる。
1.刺激試薬
いくつかの態様では、刺激条件下で濃縮細胞の組成物をインキュベートすることは、濃縮細胞の組成物をT細胞を活性化および/または拡大増殖させることができる刺激試薬とインキュベートする、および/または接触させることであるか、それらを含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞内の1つまたは複数のシグナルを刺激および/または活性化することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数のシグナルは、受容体によって媒介される。特定の態様では、1つまたは複数のシグナルは、シグナル伝達および/または二次メッセンジャー、例えば、cAMPおよび/または細胞内カルシウムのレベルまたは量の変化、1つまたは複数の細胞タンパク質の量、細胞局在、確認、リン酸化、ユビキチン化および/または切断の変化、および/または細胞活性、例えば、転写、翻訳、タンパク質分解、細胞形態、活性化状態および/または細胞分裂の変化であるか、それらに関連する。特定の態様では、刺激条件は、細胞を刺激試薬とともにインキュベートすること、培養すること（culturing）、および/または培養すること（cultivating）を含む。特定の態様では、刺激試薬は、ビーズを含有するか、含む。特定の態様では、細胞が刺激試薬とインキュベートされるか接触すると刺激の開始が起こる。特定の態様では、刺激試薬は、オリゴマー試薬、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーを含有するか、含む。特定の態様では、刺激試薬は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化する、および/または活性化することができる。
いくつかの態様では、刺激条件下で濃縮細胞の組成物をインキュベートすることは、濃縮細胞の組成物をT細胞を活性化および/または拡大増殖させることができる刺激試薬とインキュベートする、および/または接触させることであるか、それらを含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞内の1つまたは複数のシグナルを刺激および/または活性化することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数のシグナルは、受容体によって媒介される。特定の態様では、1つまたは複数のシグナルは、シグナル伝達および/または二次メッセンジャー、例えば、cAMPおよび/または細胞内カルシウムのレベルまたは量の変化、1つまたは複数の細胞タンパク質の量、細胞局在、確認、リン酸化、ユビキチン化および/または切断の変化、および/または細胞活性、例えば、転写、翻訳、タンパク質分解、細胞形態、活性化状態および/または細胞分裂の変化であるか、それらに関連する。特定の態様では、刺激条件は、細胞を刺激試薬とともにインキュベートすること、培養すること（culturing）、および/または培養すること（cultivating）を含む。特定の態様では、刺激試薬は、ビーズを含有するか、含む。特定の態様では、細胞が刺激試薬とインキュベートされるか接触すると刺激の開始が起こる。特定の態様では、刺激試薬は、オリゴマー試薬、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーを含有するか、含む。特定の態様では、刺激試薬は、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化する、および/または活性化することができる。
いくつかの態様では、刺激条件または刺激試薬は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドを含む。いくつかの態様では、本明細書において企図される作用物質には、限定されることなく、RNA、DNA、タンパク質（例えば酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質レクチン、または所望の標的に対する親和性を有する任意の他の生体分子が含まれ得る。いくつかの態様では、所望の標的は、T細胞受容体および/またはT細胞受容体の成分である。特定の態様では、所望の標的はCD3である。特定の態様では、所望の標的は、T細胞共刺激分子、例えば、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSである。当技術分野において公知であり利用可能な様々な方法によって、1つまたは複数の作用物質をビーズに直接または間接的に付着させてもよい。付着は、共有、非共有、静電または疎水性であり得、例えば、化学的手段、機械的手段または酵素的手段を含む様々な付着手段によって達成され得る。いくつかの態様では、作用物質は、抗体またはその抗原結合断片、例えばFabである。いくつかの態様では、ビーズに直接付着している別の生体分子（例えば抗ビオチン抗体）を介して、生体分子（例えばビオチン化抗CD3抗体）をビーズに間接的に付着させてもよい。
いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子、すなわち、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54（ICAM-1）、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L（CD70）、4-1BB（CD137）、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R;IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CD11a（LFA-1）、CD62L（L-セレクチン）、CD29/CD49d（VLA-4）、Notchリガンド（例えば、Delta様1/4、Jagged 1/2など）、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7およびCXCR3、またはこれらの高分子もしくはその断片に対する対応するリガンドを含むその断片のうちの1つまたは複数に特異的に結合する1つまたは複数の作用物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片、例えばFab）を含有する。いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子、すなわち、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RAおよび/またはCD45ROのうちの1つまたは複数に特異的に結合する1つまたは複数の作用物質（例えば、抗体またはその抗原結合断片、例えばFab）を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）であるか、それに付着することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、オリゴマー試薬、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーであるか、それに付着する（例えば、可逆的に付着する）ことができる。
いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片、例えばFabを含む。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディおよび単鎖分子）、ならびに抗体断片（例えば、Fab、F（ab'）2およびFv）が含まれ得る。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、Fab、Fab'-SH、Fv、scFvまたは（Fab'）2断片であるか、それらを含む。IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含め、本明細書において企図される抗体に、任意のアイソタイプの定常領域を使用することができ、そのような定常領域は任意のヒトまたは動物種（例えばマウス種）から得ることができることが理解される。いくつかの態様では、作用物質は、T細胞受容体の1つまたは複数の成分に結合する、および/またはそれを認識する抗体であるか、それを含む。特定の態様では、作用物質は、抗CD3抗体であるか、それを含む。特定の態様では、作用物質は、共受容体に結合する、および/またはそれを認識する抗体であるか、それを含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗CD28抗体であるか、それを含む。
いくつかの態様では、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1もしくは0.2:1、または約3:1、約2.5:1、約2:1、約1.5:1、約1.25:1、約1.2:1、約1.1:1、約1:1、約0.9:1、約0.8:1、約0.75:1、約0.67:1、約0.5:1、約0.3:1もしくは約0.2:1の刺激試薬：細胞比の存在下で刺激される。特定の態様では、刺激試薬：細胞比は、2.5:1〜0.2:1、2:1〜0.5:1、1.5:1〜0.75:1、1.25:1〜0.8:1、1.1:1〜0.9:1である。特定の態様では、刺激試薬：細胞比は、約1:1または1:1である。
いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μg、約0.01μg、約0.02μg、約0.03μg、約0.04μg、約0.05μg、約0.1μg、約0.2μg、約0.3μg、約0.4μg、約0.5μg、約0.75μg、約1μg、約2μg、約3μg、約4μg、約5μg、約6μg、約7μg、約8μg、約9μgもしくは約10μg、または少なくとも0.01μg、少なくとも0.02μg、少なくとも0.03μg、少なくとも0.04μg、少なくとも0.05μg、少なくとも0.1μg、少なくとも0.2μg、少なくとも0.3μg、少なくとも0.4μg、少なくとも0.5μg、少なくとも0.75μg、少なくとも1μg、少なくとも2μg、少なくとも3μg、少なくとも4μg、少なくとも5μg、少なくとも6μg、少なくとも7μg、少なくとも8μg、少なくとも9μgもしくは少なくとも10μgの刺激試薬の存在下で刺激される。いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり4μgまたは約4μgの存在下で刺激される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり0.8μgまたは約0.8μgの存在下で刺激される。様々な態様では、細胞は、細胞106個当たり0.8μgまたは約0.8μgの存在下で刺激される。
a.ビーズ試薬
特定の態様では、刺激試薬は、細胞、例えばT細胞を活性化および/または拡大増殖させることができる1つまたは複数の作用物質、例えば生体分子にコンジュゲートまたは結合する粒子、例えばビーズを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、ビーズに結合している。いくつかの態様では、ビーズは生体適合性であり、すなわち、生物学的使用に適した材料から構成される。いくつかの態様では、ビーズは、培養細胞、例えば培養T細胞に対して非毒性である。いくつかの態様では、ビーズは、作用物質と細胞との間の相互作用を可能にする方法で作用物質を付着させることができる任意の粒子であり得る。
特定の態様では、刺激試薬は、細胞、例えばT細胞を活性化および/または拡大増殖させることができる1つまたは複数の作用物質、例えば生体分子にコンジュゲートまたは結合する粒子、例えばビーズを含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、ビーズに結合している。いくつかの態様では、ビーズは生体適合性であり、すなわち、生物学的使用に適した材料から構成される。いくつかの態様では、ビーズは、培養細胞、例えば培養T細胞に対して非毒性である。いくつかの態様では、ビーズは、作用物質と細胞との間の相互作用を可能にする方法で作用物質を付着させることができる任意の粒子であり得る。
いくつかの態様では、刺激試薬は、ビーズ、例えば、ビーズの表面に結合しているか、そうでなければ付着している細胞、例えばT細胞を活性化および/または拡大増殖させることができる1つまたは複数の作用物質を含有する。特定の態様では、ビーズは非細胞粒子である。特定の態様では、ビーズは、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、磁性ビーズなどを含み得る。いくつかの態様では、ビーズはアガロースビーズである。特定の態様では、ビーズはセファロースビーズである。
特定の態様では、刺激試薬は単分散であるビーズを含有する。特定の態様では、単分散であるビーズは、互いから5％未満の直径標準偏差を有するサイズ分散を有する。
いくつかの態様では、ビーズは、ビーズの表面に（直接または間接的に）カップリング、コンジュゲートまたは結合する作用物質などの1つまたは複数の作用物質を含有する。いくつかの態様では、本明細書において企図される作用物質には、限定されることなく、RNA、DNA、タンパク質（例えば酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質レクチン、または所望の標的に対する親和性を有する任意の他の生体分子が含まれ得る。いくつかの態様では、所望の標的は、T細胞受容体および/またはT細胞受容体の成分である。特定の態様では、所望の標的はCD3である。特定の態様では、所望の標的は、T細胞共刺激分子、例えば、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSである。当技術分野において公知であり利用可能な様々な方法によって、1つまたは複数の作用物質をビーズに直接または間接的に付着させてもよい。付着は、共有、非共有、静電または疎水性であり得、例えば、化学的手段、機械的手段または酵素的手段を含む様々な付着手段によって達成され得る。いくつかの態様では、ビーズに直接付着している別の生体分子（例えば抗ビオチン抗体）を介して、生体分子（例えばビオチン化抗CD3抗体）をビーズに間接的に付着させてもよい。
いくつかの態様では、刺激試薬は、ビーズと、細胞の表面上の高分子と直接相互作用する1つまたは複数の作用物質とを含有する。特定の態様では、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）は、細胞上の1つまたは複数の高分子（例えば、1つまたは複数の細胞表面タンパク質）に特異的な1つまたは複数の作用物質（例えば抗体）を介して細胞と相互作用する。特定の態様では、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）は、一次抗体（例えば抗ビオチン抗体）または他の生体分子などの本明細書において記載される第1の作用物質により標識され、次いで、二次抗体（例えばビオチン化抗CD3抗体）または他の第2の生体分子（例えばストレプトアビジン）などの第2の作用物質が加えられ、それにより、二次抗体または他の第2の生体分子が、粒子上のそのような一次抗体または他の生体分子に特異的に結合する。
いくつかの態様では、刺激試薬は、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）に付着し、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子、すなわち、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54（ICAM-1）、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L（CD70）、4-1BB（CD137）、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R;IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CD11a（LFA-1、αLβ2）、CD62L（L-セレクチン）、CD29/CD49d（VLA-4）、Notchリガンド（例えば、Delta様1/4、Jagged 1/2など）、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7およびCXCR3、またはこれらの高分子もしくはその断片に対する対応するリガンドを含むその断片のうちの1つまたは複数に特異的に結合する1つまたは複数の作用物質（例えば抗体）を含有する。いくつかの態様では、ビーズに付着した作用物質（例えば抗体）は、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子、すなわち、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RAおよび/またはCD45ROのうちの1つまたは複数に特異的に結合する。
いくつかの態様では、ビーズに付着した作用物質のうちの1つまたは複数は抗体である。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディおよび単鎖分子）、ならびに抗体断片（例えば、Fab、F（ab'）2およびFv）が含まれ得る。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、Fab、Fab'-SH、Fv、scFvまたは（Fab'）2断片である。IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含め、本明細書において企図される抗体に、任意のアイソタイプの定常領域を使用することができ、そのような定常領域は任意のヒトまたは動物種（例えばマウス種）から得ることができることが理解される。いくつかの態様では、作用物質は、T細胞受容体の1つまたは複数の成分に結合する、および/またはそれを認識する抗体である。特定の態様では、作用物質は抗CD3抗体である。特定の態様では、作用物質は、共受容体に結合する、および/またはそれを認識する抗体である。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗CD28抗体を含む。いくつかの態様では、ビーズは、0.001μm超もしくは約0.001μm、0.01μm超もしくは約0.01μm、0.1μm超もしくは約0.1μm、1.0μm超もしくは約1.0μm、10μm超もしくは約10μm、50μm超もしくは約50μm、100μm超もしくは約100μm、または1000μm超もしくは約1000μm、および1500μm以下もしくは約1500μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、1.0μmもしくは約1.0μm〜500μmもしくは約500μm、1.0μmもしくは約1.0μm〜150μmもしくは約150μm、1.0μmもしくは約1.0μm〜30μmもしくは約30μm、1.0μmもしくは約1.0μm〜10μmもしくは約10μm、1.0μmもしくは約1.0μm〜5.0μmもしくは約5.0μm、2.0μmもしくは約2.0μm〜5.0μmもしくは約5.0μm、または3.0μmもしくは約3.0μm〜5.0μmもしくは約5.0μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、3μmまたは約3μm〜5μmまたは約5μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも0.001μm、少なくとも0.01μm、少なくとも0.1μm、少なくとも0.5μm、少なくとも1.0μm、少なくとも1.5μm、少なくとも2.0μm、少なくとも2.5μm、少なくとも3.0μm、少なくとも3.5μm、少なくとも4.0μm、少なくとも4.5μm、少なくとも5.0μm、少なくとも5.5μm、少なくとも6.0μm、少なくとも6.5μm、少なくとも7.0μm、少なくとも7.5μm、少なくとも8.0μm、少なくとも8.5μm、少なくとも9.0μm、少なくとも9.5μm、少なくとも10μm、少なくとも12μm、少なくとも14μm、少なくとも16μm、少なくとも18μmもしくは少なくとも20μm、または少なくとも約0.001μm、少なくとも約0.01μm、少なくとも約0.1μm、少なくとも約0.5μm、少なくとも約1.0μm、少なくとも約1.5μm、少なくとも約2.0μm、少なくとも約2.5μm、少なくとも約3.0μm、少なくとも約3.5μm、少なくとも約4.0μm、少なくとも約4.5μm、少なくとも約5.0μm、少なくとも約5.5μm、少なくとも約6.0μm、少なくとも約6.5μm、少なくとも約7.0μm、少なくとも約7.5μm、少なくとも約8.0μm、少なくとも約8.5μm、少なくとも約9.0μm、少なくとも約9.5μm、少なくとも約10μm、少なくとも約12μm、少なくとも約14μm、少なくとも約16μm、少なくとも約18μmもしくは少なくとも約20μm、または約0.001μm、約0.01μm、約0.1μm、約0.5μm、約1.0μm、約1.5μm、約2.0μm、約2.5μm、約3.0μm、約3.5μm、約4.0μm、約4.5μm、約5.0μm、約5.5μm、約6.0μm、約6.5μm、約7.0μm、約7.5μm、約8.0μm、約8.5μm、約9.0μm、約9.5μm、約10μm、約12μm、約14μm、約16μm、約18μmもしくは約20μmの直径を有する。特定の態様では、ビーズは、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する。特定の態様では、ビーズは、2.8μmまたは約2.8μmの直径を有する。
いくつかの態様では、ビーズは、0.001g/cm3超もしくは約0.001g/cm3、0.01g/cm3超もしくは約0.01g/cm3、0.05g/cm3超もしくは約0.05g/cm3、0.1g/cm3超もしくは約0.1g/cm3、0.5g/cm3超もしくは約0.5g/cm3、0.6g/cm3超もしくは約0.6g/cm3、0.7g/cm3超もしくは約0.7g/cm3、0.8g/cm3超もしくは約0.8g/cm3、0.9g/cm3超もしくは約0.9g/cm3、1g/cm3超もしくは約1g/cm3、1.1g/cm3超もしくは約1.1g/cm3、1.2g/cm3超もしくは約1.2g/cm3、1.3g/cm3超もしくは約1.3g/cm3、1.4g/cm3超もしくは約1.4g/cm3、1.5g/cm3超もしくは約1.5g/cm3、2g/cm3超もしくは約2g/cm3、3g/cm3超もしくは約3g/cm3、4g/cm3超もしくは約4g/cm3、または5g/cm3超もしくは約5g/cm3の密度を有する。いくつかの態様では、ビーズは、0.001g/cm3〜100g/cm3もしくは約0.001g/cm3〜約100g/cm3、0.01g/cm3〜50g/cm3もしくは約0.01g/cm3〜約50g/cm3、0.1g/cm3〜10g/cm3もしくは約0.1g/cm3〜約10g/cm3、0.1g/cm3〜5g/cm3もしくは約0.1g/cm3〜約5g/cm3、0.5g/cm3〜1g/cm3もしくは約0.5g/cm3〜約1g/cm3、0.5g/cm3〜1.5g/cm3もしくは約0.5g/cm3〜約1.5g/cm3、1g/cm3〜1.5g/cm3もしくは約1g/cm3〜約1.5g/cm3、1g/cm3〜2g/cm3もしくは約1g/cm3〜約2g/cm3、または1g/cm3〜5g/cm3もしくは約1g/cm3〜約5g/cm3の密度を有する。いくつかの態様では、ビーズは、0.5g/cm3もしくは約0.5g/cm3、0.5g/cm3もしくは約0.5g/cm3、0.6g/cm3もしくは約0.6g/cm3、0.7g/cm3もしくは約0.7g/cm3、0.8g/cm3もしくは約0.8g/cm3、0.9g/cm3もしくは約0.9g/cm3、1.0g/cm3もしくは約1.0g/cm3、1.1g/cm3もしくは約1.1g/cm3、1.2g/cm3もしくは約1.2g/cm3、1.3g/cm3もしくは約1.3g/cm3、1.4g/cm3もしくは約1.4g/cm3、1.5g/cm3もしくは約1.5g/cm3、1.6g/cm3もしくは約1.6g/cm3、1.7g/cm3もしくは約1.7g/cm3、1.8g/cm3もしくは約1.8g/cm3、1.9g/cm3もしくは約1.9g/cm3、または2.0g/cm3もしくは約2.0g/cm3の密度を有する。特定の態様では、ビーズは、1.6g/cm3または約1.6g/cm3の密度を有する。特定の態様では、ビーズまたは粒子は、1.5g/cm3または約1.5g/cm3の密度を有する。特定の態様では、粒子は、1.3g/cm3または約1.3g/cm3の密度を有する。
特定の態様では、複数のビーズが均一な密度を有する。特定の態様では、均一な密度は、平均ビーズ密度の10％未満もしくは約10％、5％未満もしくは約5％、または1％未満もしくは約1％の密度標準偏差を有する。
いくつかの態様では、ビーズは、粒子の各グラム当たり0.001m2（m2/g）〜1,000m2/gもしくは約0.001m2（m2/g）〜約1,000m2/g、.010m2/g〜100m2/gもしくは約.010m2/g〜約100m2/g、0.1m2/g〜10m2/gもしくは約0.1m2/g〜約10m2/g、0.1m2/g〜1m2/gもしくは約0.1m2/g〜約1m2/g、1m2/g〜10m2/gもしくは約1m2/g〜約10m2/g、10m2/g〜100m2/gもしくは約10m2/g〜約100m2/g、0.5m2/g〜20m2/gもしくは約0.5m2/g〜約20m2/g、0.5m2/g〜5m2/gもしくは約0.5m2/g〜約5m2/g、または1m2/g〜4m2/gもしくは約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。いくつかの態様では、粒子またはビーズは、1m2/g〜4m2/gまたは約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。
いくつかの態様では、ビーズは、ビーズ表面またはその近くに、作用物質にカップリング、結合またはコンジュゲートすることができる少なくとも1つの材料を含有する。いくつかの態様では、ビーズは、表面官能化されている、すなわち、結合分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共有結合を形成することができる官能基を含む。特定の態様では、ビーズは、表面に露出したカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、トシル基、エポキシ基および/またはクロロメチル基を含む。特定の態様では、ビーズは、表面に露出したアガロースおよび/またはセファロースを含む。特定の態様では、ビーズ表面は、結合分子を結合または付着することができる付着刺激試薬を含む。特定の態様では、生体分子はポリペプチドである。いくつかの態様では、ビーズは、表面に露出したプロテインA、プロテインGまたはビオチンを含む。
いくつかの態様では、ビーズは、磁場内で反応する。いくつかの態様では、ビーズは磁性ビーズである。いくつかの態様では、磁性ビーズは常磁性である。特定の態様では、磁性ビーズは超常磁性である。特定の態様では、ビーズは、磁場に曝露されない限り、いかなる磁性特性も示さない。
特定の態様では、ビーズは、磁性コア、常磁性コアまたは超常磁性コアを含む。いくつかの態様では、磁性コアは金属を含有する。いくつかの態様では、金属は、限定されることなく、鉄、ニッケル、銅、コバルト、ガドリニウム、マンガン、タンタル、亜鉛、ジルコニウムまたはそれらの任意の組合せであり得る。特定の態様では、磁性コアは、金属酸化物（例えば酸化鉄）、フェライト（例えば、マンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライトなど）、ヘマタイトおよび金属合金（例えばCoTaZn）を含む。いくつかの態様では、磁性コアは、フェライト、金属、金属合金、酸化鉄または二酸化クロムのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、磁性コアは、元素状鉄またはその化合物を含む。いくつかの態様では、磁性コアは、マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γFe2O3）またはグレイジャイト（Fe3S4）のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、内部コアは酸化鉄（例えばFe3O4）を含む。
特定の態様では、ビーズは、表面官能化コートまたはコーティングによって覆われた磁性コア、常磁性コアおよび/または超常磁性コアを含有する。いくつかの態様では、コートは、限定されることなく、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、タンパク質、炭素、アガロース、セファロースまたはそれらの組合せを含むことができる材料を含有することができる。いくつかの態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレンまたはポリビニルアルコールであり得る。特定の態様では、外側コートまたは外側コーティングはポリスチレンを含む。特定の態様では、外側コーティングは表面官能化されている。
いくつかの態様では、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば酸化鉄コア）およびコートを含有するビーズを含み、金属酸化物コアは、少なくとも1つの多糖（例えばデキストラン）を含み、コートは、少なくとも1つの多糖（例えばアミノデキストラン）、少なくとも1つのポリマー（例えばポリウレタン）およびシリカを含む。いくつかの態様では、金属酸化物コアはコロイド状酸化鉄コアである。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。いくつかの態様では、刺激試薬は、抗CD3抗体、抗CD28抗体および抗ビオチン抗体を含む。いくつかの態様では、刺激試薬は抗ビオチン抗体を含む。いくつかの態様では、ビーズは、約3μm〜約10μmの直径を有する。いくつかの態様では、ビーズは、約3μm〜約5μmの直径を有する。特定の態様では、ビーズは、約3.5μmの直径を有する。
いくつかの態様では、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば酸化鉄内部コア）およびコート（例えば保護コート）を含むビーズに付着する1つまたは複数の作用物質を含み、コートはポリスチレンを含む。特定の態様では、ビーズは、常磁性（例えば超常磁性）鉄コア、例えば、マグネタイト（Fe3O4）および/またはマグヘマイト（γFe2O3）cおよびポリスチレンコートまたはコーティングを含むコアを含む単分散、常磁性（例えば超常磁性）ビーズである。いくつかの態様では、ビーズは非多孔性である。いくつかの態様では、ビーズは、1つまたは複数の作用物質が付着する官能化表面を含有する。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、表面でビーズに共有結合している。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体、および標識抗体（例えばビオチン化抗体）、例えば、標識抗CD3抗体または標識抗CD28抗体に結合することができる抗体またはその抗原断片を含む。特定の態様では、ビーズは、約1.5g/cm3の密度および約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。特定の態様では、ビーズは、約4.5μmの直径および約1.5g/cm3の密度を有する単分散超常磁性ビーズである。いくつかの態様では、ビーズは、約2.8μmの平均直径および約1.3g/cm3の密度を有する単分散超常磁性ビーズである。
いくつかの態様では、濃縮T細胞の組成物は、ビーズ：細胞の比が3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1もしくは0.2:1、または約3:1、約2.5:1、約2:1、約1.5:1、約1.25:1、約1.2:1、約1.1:1、約1:1、約0.9:1、約0.8:1、約0.75:1、約0.67:1、約0.5:1、約0.3:1もしくは約0.2:1で刺激試薬とともにインキュベートされる。特定の態様では、ビーズ：細胞の比は、2.5:1〜0.2:1、2:1〜0.5:1、1.5:1〜0.75:1、1.25:1〜0.8:1、1.1:1〜0.9:1である。特定の態様では、ビーズ：細胞の比は、約1:1または1:1である。
b.オリゴマー試薬
特定の態様では、刺激試薬は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドにコンジュゲート、結合または付着するオリゴマー試薬、例えばストレプトアビジンムテイン試薬を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、特定の結合部位（例えば結合部位Z）でオリゴマー試薬に結合することができる付着した結合ドメインまたは結合パートナー（例えば結合パートナーC）を有する。いくつかの態様では、複数の作用物質が、オリゴマー試薬に可逆的に結合している。様々な態様では、オリゴマー試薬は、特定の態様では結合ドメイン（例えば結合パートナーC）で複数の作用物質に可逆的に結合している複数の特定の結合部位を有する。いくつかの態様では、結合した作用物質の量は、競合試薬、例えば、特定の結合部位（例えば結合部位Z）に結合することもできる試薬の存在下で低減されるか減少する。抗CD3/抗CD28オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬を含むオリゴマー刺激試薬が、国際PCT公開番号WO2018/197949に記載されている。
特定の態様では、刺激試薬は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドにコンジュゲート、結合または付着するオリゴマー試薬、例えばストレプトアビジンムテイン試薬を含有する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、特定の結合部位（例えば結合部位Z）でオリゴマー試薬に結合することができる付着した結合ドメインまたは結合パートナー（例えば結合パートナーC）を有する。いくつかの態様では、複数の作用物質が、オリゴマー試薬に可逆的に結合している。様々な態様では、オリゴマー試薬は、特定の態様では結合ドメイン（例えば結合パートナーC）で複数の作用物質に可逆的に結合している複数の特定の結合部位を有する。いくつかの態様では、結合した作用物質の量は、競合試薬、例えば、特定の結合部位（例えば結合部位Z）に結合することもできる試薬の存在下で低減されるか減少する。抗CD3/抗CD28オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬を含むオリゴマー刺激試薬が、国際PCT公開番号WO2018/197949に記載されている。
いくつかの態様では、刺激試薬は、少なくとも1つの作用物質（例えば、T細胞などの細胞内でシグナルを生成することができる作用物質）がオリゴマー試薬に会合する、例えば、可逆的に会合する可逆的な系であるか、それらを含む。いくつかの態様では、試薬は、作用物質に結合する、例えば、可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む。場合によっては、試薬は、T細胞などの細胞内でシグナルを生成することができる少なくとも1つの付着した作用物質を有するオリゴマー粒子試薬である。いくつかの態様では、作用物質は、分子のエピトープまたは領域に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合部位、例えば結合部位Bを含み、試薬の少なくとも1つの結合部位、例えば、試薬の結合部位Zに特異的に結合する、本明細書において結合パートナーCとも呼ばれる結合パートナーも含む。いくつかの態様では、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の結合相互作用は、非共有相互作用である。場合によっては、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の結合相互作用は、共有相互作用である。いくつかの態様では、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の非共有相互作用などの結合相互作用は、可逆的である。
そのような可逆的な系でオリゴマー試薬として使用され得る物質は公知であり、例えば、米国特許第5,168,049号、米国特許第5,506,121号、米国特許第6,103,493号、米国特許第7,776,562号、米国特許第7,981,632号、米国特許第8,298,782号、米国特許第8,735,540号、米国特許第9,023,604号ならびに国際公開PCT出願番号WO2013/124474および国際公開PCT出願番号WO2014/076277を参照されたい。可逆的相互作用を形成することができる試薬および結合パートナーの非限定的な例、ならびにそのような結合を逆にすることができる物質（例えば競合試薬）は、以下に記載される。
いくつかの態様では、オリゴマー試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジン、アビジンムテインもしくは類似体（ニュートラアビジンなど）またはそれらの混合物のオリゴマーであり、そのようなオリゴマー試薬は、作用物質の結合ドメインと可逆的に会合するための1つまたは複数の結合部位（例えば結合パートナーC）を含む。いくつかの態様では、作用物質の結合ドメインは、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンもしくはアビジンムテインもしくは類似体に特異的に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドもしくは他の分子であり得る。
特定の態様では、1つまたは複数の作用物質（例えば、T細胞などの細胞内でシグナルを生成することができる作用物質）は、オリゴマー試薬上に存在する複数の特定の結合部位（例えば結合部位Z）などを介して、オリゴマー試薬と会合する、例えば可逆的に結合している。場合によっては、これにより、作用物質によって結合されるか認識される細胞表面分子（の少なくとも2コピー）を有する標的細胞が作用物質と接触する場合にアビディティー効果が生じることができるように、作用物質が互いに密接に配置される。
いくつかの態様では、オリゴマー試薬は、ストレプトアビジンオリゴマー、ストレプトアビジンムテインオリゴマー、ストレプトアビジン類似体オリゴマー、アビジンオリゴマー、アビジンムテインもしくはアビジン類似体（ニュートラアビジンなど）から構成されるオリゴマー、またはそれらの混合物である。特定の態様では、オリゴマー試薬は、作用物質の結合ドメイン（例えば結合パートナーC）に結合することができる特定の結合部位を含む。いくつかの態様では、結合ドメインは、ビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体、またはストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくは類似体、アビジンもしくはアビジンムテインもしくは類似体に特異的に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドもしくは他の分子であり得る。
いくつかの態様では、ストレプトアビジンは、野生型ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインまたは類似体、例えばストレプトアビジン様ポリペプチドであり得る。同様に、いくつかの局面では、アビジンには、野生型アビジンまたはアビジンのムテインもしくは類似体、例えばニュートラアビジン、典型的にはさらに中性のpiを示し、天然のアビジンの代替として利用可能な修飾アルギニンを有する脱グリコシル化アビジンが含まれる。一般に、脱グリコシル化された中性形態のアビジンには、例えば、Sigma Aldrichを通じて入手可能な「Extravidin」、またはThermo ScientificもしくはInvitrogenから入手可能な「NeutrAvidin」などの市販形態が含まれる。
いくつかの態様では、試薬は、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインもしくは類似体である。いくつかの態様では、野生型ストレプトアビジン（wt-ストレプトアビジン）は、Argarana et al,Nucleic Acids Res.14（1986）1871-1882（SEQ ID NO:72）によって開示されたアミノ酸配列を有する。一般に、ストレプトアビジンは、4つの同一のサブユニットの四量体として天然に存在し、すなわち、それはホモ四量体であり、各サブユニットは、ビオチン、ビオチン誘導体または類似体またはビオチン模倣体に対する単一の結合部位を含む。ストレプトアビジンサブユニットの例示的な配列は、SEQ ID NO:72に記載のアミノ酸の配列であるが、そのような配列はまた、他のストレプトマイセス（Streptomyces）種由来のそのホモログに存在する配列を含み得る。特に、ストレプトアビジンの各サブユニットはビオチンに対して強い結合親和性を示し、その平衡解離定数（KD）は10-14M程度または約10-14Mであり得る。場合によっては、ストレプトアビジンは、4つの結合部位のうちの1つのみが機能的である一価の四量体（Howarth et al.（2006）Nat.Methods,3:267-73;Zhang et al.（2015）Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63））、4つの結合部位のうちの2つが機能的である二価の四量体（Fairhead et al.（2013）J.Mol.Biol.,426:199-214）として存在し得るか、単量体または二量体の形態で存在し得る（Wu et al.（2005）J.Biol.Chem.,280:23225-31;Lim et al.（2010）Biochemistry,50:8682-91）。
いくつかの態様では、ストレプトアビジンは、野生型または未修飾ストレプトアビジン、例えば、ストレプトマイセス種由来のストレプトアビジン、またはビオチン、ビオチン誘導体もしくは類似体もしくはビオチン模倣体の結合部位を含む少なくとも1つの機能性サブユニットを含む、例えば、一般にSEQ ID NO:72に記載のストレプトマイセス・アビジニイ（Streptomyces avidinii）由来の野生型ストレプトアビジンの少なくとも1つの機能性サブユニットもしくはその機能的に活性な断片を含むその機能的に活性な断片などの任意の形態であり得る。例えば、いくつかの態様では、ストレプトアビジンは、N末端および/またはC末端で短縮される野生型ストレプトアビジンの断片を含むことができる。そのような最小のストレプトアビジンには、SEQ ID NO:72のアミノ酸位置10〜16の領域でN末端で始まり、SEQ ID NO:72のアミノ酸位置133〜142の領域でC末端で終わる任意のものが含まれる。いくつかの態様では、ストレプトアビジンの機能的に活性な断片は、SEQ ID NO:73に記載のアミノ酸の配列を含む。いくつかの態様では、SEQ ID NO:73に記載されるようなストレプトアビジンは、SEQ ID NO:72に記載の番号付けによりAla13に対応する位置にN末端メチオニンをさらに含むことができる。ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインにおける残基の位置への言及は、SEQ ID NO:72における残基の番号付けに関するものである。
ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの例は、例えば、WO86/02077、DE19641876 Al、US6,022,951、WO98/40396またはWO96/24606に記載されている。ストレプトアビジンムテインの例は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,168,049号、米国特許第5,506,121号、米国特許第6,022,951号、米国特許第6,156,493号、米国特許第6,165,750号、米国特許第6,103,493号もしくは米国特許第6,368,813号または国際公開PCT出願番号WO2014/076277を参照されたい。
いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、未修飾または野生型ストレプトアビジンの一部ではないアミノ酸を含むことができるか、野生型または未修飾ストレプトアビジンの一部のみを含むことができる。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、未修飾または野生型ストレプトアビジンのサブユニットと比較して、例えば、SEQ ID NO:72に記載の野生型ストレプトアビジンサブユニット、またはSEQ ID NO:73もしくはSEQ ID NO:94に記載されるようなその機能的に活性な断片と比較して、もう1つのアミノ酸置換（substitution）（置換（replacement））を有し得る少なくとも1つのサブユニットを含む。
いくつかの態様では、結合ドメインに対するストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの解離定数（Kd）などの結合親和性は、1x10-4M未満、5x10-4M未満、1x10-5M未満、5x10-5M未満、1x10-6M未満、5x10-6M未満もしくは1x10-7M未満、または約1x10-4M、約5x10-4M、約1x10-5M、約5x10-5M、約1x10-6M、約5x10-6Mもしくは約1x10-7Mであるが、一般に1x10-13M超、1x10-12M超または1x10-11M超である。例えば、米国特許第5,506,121号に開示されているようなペプチド配列（Strep-タグ）は、ビオチン模倣体として作用し、ストレプトアビジンに対する結合親和性、例えば、約10-4M〜約10-5MのKDを示すことができる。場合によっては、ストレプトアビジン分子内に変異を起こすことによって結合親和性をさらに改善することができ、例えば、米国特許第6,103,493号および国際公開PCT出願番号WO2014/076277を参照されたい。いくつかの態様では、結合親和性は、本明細書において記載されるものなど、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。
いくつかの態様では、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインなどの試薬は、ペプチドリガンド結合パートナーに対する結合親和性を示し、このペプチドリガンド結合パートナーは、作用物質（例えば、受容体結合剤または選択剤）に存在する結合パートナーCであり得る。いくつかの態様では、ペプチド配列は、一般式His-Pro-Xaaを有する配列を含み、式中、Xaaは、SEQ ID NO:89に記載の配列を含むようなグルタミン、アスパラギンまたはメチオニンである。いくつかの態様では、ペプチド配列は、SEQ ID NO:80に記載されるような、SEQ ID NO:90に記載の一般式を有する。一例では、ペプチド配列は、Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly（Strep-tag（登録商標）とも呼ばれ、SEQ ID NO:81に記載される）である。一例では、ペプチド配列は、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys（Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:75に記載される）である。いくつかの態様では、ペプチドリガンドは、少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含み、2つのモジュール間の距離は、少なくとも0および50アミノ酸以下であり、1つの結合モジュールは、3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列His-Pro-Xaaを含み、式中、Xaaはグルタミン、アスパラギンまたはメチオニンであり、他の結合モジュールは、SEQ ID NO:90に記載されるような同じまたは異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する（例えば、国際公開PCT出願番号WO02/077018、米国特許第7,981,632号を参照）。いくつかの態様では、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO:82または83のいずれかに記載の式を有する配列を含む。いくつかの態様では、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO:76〜78および84〜85のいずれかに記載のアミノ酸の配列を有する。ほとんどの場合、これらのストレプトアビジン結合ペプチドはいずれも、同じ結合部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。そのようなストレプトアビジン結合ペプチドのうちの1つまたは複数が結合パートナーC、例えば、C1およびC2として使用される場合、結合パートナーCを介して1つまたは複数の作用物質に結合した多量体化試薬および/またはオリゴマー粒子試薬は、典型的に1つまたは複数のストレプトアビジンムテインから構成される。
いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、米国特許第6,103,493号に記載されるような変異体である。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、SEQ ID NO:72に記載されるような野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸位置44〜53の領域内に少なくとも1つの変異を含む。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、1つまたは複数の残基44、45、46および/または47に変異を含む。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、疎水性脂肪族アミノ酸、例えば、Val、Ala、IleまたはLeu、45位の任意のアミノ酸、脂肪族アミノ酸、例えば、46位の疎水性脂肪族アミノ酸による野生型ストレプトアビジンの44位のGluの置換および/または塩基性アミノ酸、例えば、ArgまたはLys、例えば一般にArgによる47位のValの置換を含む。いくつかの態様では、Alaは46位にあり、および/またはArgは47位にあり、および/またはValまたはIleは44位にある。いくつかの態様では、ストレプトアビジン変異体は、SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:87もしくは88に記載のアミノ酸の配列を含む例示的なストレプトアビジンムテインに示されるような、残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47を含む（ストレプトアビジン変異体1、SAM1としても知られる）。いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、SEQ ID NO:91、74または79に記載のアミノ酸の配列を含む例示的なストレプトアビジンムテインに示されるような、残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47を含む（SAM2としても知られる）。場合によっては、そのようなストレプトアビジンムテインは、例えば、米国特許第6,103,493号に記載されており、商標Strep-Tactin（登録商標）の下に市販されている。いくつかの態様では、ムテインストレプトアビジンは、SEQ ID NO:92またはSEQ ID NO:93に記載のアミノ酸の配列を含む。特定の態様では、分子は、SEQ ID NO:73、87、74、92、94、88または79のいずれかに記載の配列を含むストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの四量体であり、四量体としては、単量体1個当たり1個のN末端アミンおよび4個のリジンを含む20個の第一級アミンを含む分子である。
いくつかの態様では、ストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly;Strep-tag（登録商標）とも呼ばれ、SEQ ID NO:81に記載されている）について3.7x10-5Mまたは3.7x10-5M未満または約3.7x10-5Mであり、および/またはペプチドリガンド（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys;Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:75に記載されている）について7.1x10-5Mまたは7.1x10-5M未満または約7.1x10-5Mであり、および/またはSEQ ID NO:75、82〜85、76〜78、80、81、89および90のいずれかに記載のペプチドリガンドについて7.0x10-5M、5.0x10-5M、1.0x10-5M、5.0x10-6M、1.0x10-6M、5.0x10-7Mもしくは1.0x10-7M、または7.0x10-5M未満、5.0x10-5M未満、1.0x10-5M未満、5.0x10-6M未満、1.0x10-6M未満、5.0x10-7M未満もしくは1.0x10-7M未満、または約7.0x10-5M、約5.0x10-5M、約1.0x10-5M、約5.0x10-6M、約1.0x10-6M、約5.0x10-7Mもしくは約1.0x10-7Mであるが、一般に1x10-13M超、1x10-12M超もしくは1x10-11M超、または約1x10-13M、約1x10-12Mもしくは約1x10-11Mである平衡解離定数（KD）を特徴とする結合親和性を示す。
いくつかの態様では、得られるストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly;Strep-tag（登録商標）とも呼ばれ、SEQ ID NO:81に記載されている）について2.7x104M-1または2.7x104M-1超または約2.7x104M-1であり、および/またはペプチドリガンド（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys;Strep-tag（登録商標）IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:75に記載されている）について1.4x104M-1または1.4x104M-1超または約1.4x104M-1であり、および/またはSEQ ID NO:75、82〜85、76〜78、80、81、89および90のいずれかに記載のペプチドリガンドについて1.43x104M-1、1.67x104M-1、2x104M-1、3.33x104M-1、5x104M-1、1x105M-1、1.11x105M-1、1.25x105M-1、1.43x105M-1、1.67x105M-1、2x105M-1、3.33x105M-1、5x105M-1、1x106M-1、1.11x106M-1、1.25x106M-1、1.43x106M-1、1.67x106M-1、2x106M-1、3.33x106M-1、5x106M-1、1x107M-1、または1.43x104M-1超、1.67x104M-1超、2x104M-1超、3.33x104M-1超、5x104M-1超、1x105M-1超、1.11x105M-1超、1.25x105M-1超、1.43x105M-1超、1.67x105M-1超、2x105M-1超、3.33x105M-1超、5x105M-1超、1x106M-1超、1.11x106M-1超、1.25x106M-1超、1.43x106M-1超、1.67x106M-1超、2x106M-1超、3.33x106M-1超、5x106M-1超、1x107M-1超、または約1.43x104M-1、約1.67x104M-1、約2x104M-1、約3.33x104M-1、約5x104M-1、約1x105M-1、約1.11x105M-1、約1.25x105M-1、約1.43x105M-1、約1.67x105M-1、約2x105M-1、約3.33x105M-1、約5x105M-1、約1x106M-1、約1.11x106M-1、約1.25x106M-1、約1.43x106M-1、約1.67x106M-1、約2x106M-1、約3.33x106M-1、約5x106M-1、約1x107M-1であるが、一般に1x1013M-1未満、1x1012M-1未満または1x1011M-1未満である平衡会合定数（KA）を特徴とする結合親和性を示す。
特定の態様では、本明細書において提供されるのは、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体から構成される、および/またはそれらを含有するオリゴマー粒子試薬である。特定の態様では、本明細書において提供されるオリゴマー粒子試薬は、1つまたは複数の作用物質、例えば、刺激剤および/または選択剤に可逆的に結合するか、可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む。いくつかの態様では、オリゴマー粒子は、70nm以上125nm以下または約70nm以上約125nm以下の半径、例えば、平均（average）半径または平均（mean）半径;1x107g/mol以上1x109g/mol以下または約1x107g/mol以上約1x109g/mol以下の分子量;および/または1,000以上5,000以下または約1,000以上約5,000以下のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を有する。いくつかの態様では、オリゴマー粒子試薬は、細胞の表面上の分子、例えば受容体に結合する作用物質などの1つまたは複数の作用物質に結合している、例えば、可逆的に結合している。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片、例えばFabであるか、それを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子、すなわち、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54（ICAM-1）、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L（CD70）、4-1BB（CD137）、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R;IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CD11a（LFA-1）、CD62L（L-セレクチン）、CD29/CD49d（VLA-4）、Notchリガンド（例えば、Delta様1/4、Jagged 1/2など）、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7およびCXCR3、またはこれらの高分子もしくはその断片に対する対応するリガンドを含むその断片のうちの1つまたは複数に特異的に結合する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子、すなわち、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RAおよび/またはCD45ROのうちの1つまたは複数に特異的に結合する。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、抗体またはその抗原結合断片、例えばFabを含み、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディおよび単鎖分子）、ならびに抗体断片（例えば、Fab、F（ab'）2およびFv）が含まれ得る。いくつかの態様では、1つまたは複数の試薬は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、Fab、Fab'-SH、Fv、scFvまたは（Fab'）2断片であるか、それらを含む。IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含め、本明細書において企図される抗体に、任意のアイソタイプの定常領域を使用することができ、そのような定常領域は任意のヒトまたは動物種（例えばマウス種）から得ることができることが理解される。いくつかの態様では、1つまたは複数の試薬は、T細胞受容体の1つまたは複数の成分に結合する、および/またはそれを認識する抗体であるか、それを含む。特定の態様では、1つまたは複数の試薬は、抗CD3抗体であるか、それを含む。特定の態様では、1つまたは複数の試薬は、共受容体に結合する、および/またはそれを認識する抗体であるか、それを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の試薬は、抗CD28抗体であるか、それを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の試薬は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体またはその抗原結合断片、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えばStrep-tag（登録商標）IIなどの結合パートナーを含有する抗体またはその抗原断片などであるか、それらを含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、結合パートナー、例えばストレプトアビジン結合ペプチド、例えばStrep-tag（登録商標）IIを含有する抗CD3 Fabおよび/または抗CD28 Fabであるか、それらを含む。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体から構成される、および/またはそれらを含有するオリゴマー粒子試薬である。特定の態様では、本明細書において提供されるオリゴマー粒子試薬は、1つまたは複数の作用物質、例えば、刺激剤および/または選択剤に可逆的に結合するか、可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む。いくつかの態様では、オリゴマー粒子は、80nm以上120nm以下または約80nm以上約120nm以下の半径、例えば、平均半径;7.5x106g/mol以上2x108g/mol以下または約7.5x106g/mol以上約2x108g/mol以下の分子量;および/または500以上10,000以下または約500以上約10,000以下のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体の量、例えば平均量を有する。いくつかの態様では、オリゴマー粒子試薬は、細胞の表面上の分子、例えば受容体に結合する作用物質などの1つまたは複数の作用物質に結合している、例えば、可逆的に結合している。いくつかの態様では、作用物質は、抗CD3 Fabおよび/または抗CD28 Fab、例えば、結合パートナー、例えばストレプトアビジン結合ペプチド、例えばStrep-tag（登録商標）IIを含有するFabである。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、結合パートナー、例えばストレプトアビジン結合ペプチド、例えばStrep-tag（登録商標）IIを含有する抗CD3 Fabおよび/または抗CD28 Fabである。
いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μgもしくは10μg、約0.01μg、約0.02μg、約0.03μg、約0.04μg、約0.05μg、約0.1μg、約0.2μg、約0.3μg、約0.4μg、約0.5μg、約0.75μg、約1μg、約2μg、約3μg、約4μg、約5μg、約6μg、約7μg、約8μg、約9μgもしくは約10μg、または少なくとも0.01μg、少なくとも0.02μg、少なくとも0.03μg、少なくとも0.04μg、少なくとも0.05μg、少なくとも0.1μg、少なくとも0.2μg、少なくとも0.3μg、少なくとも0.4μg、少なくとも0.5μg、少なくとも0.75μg、少なくとも1μg、少なくとも2μg、少なくとも3μg、少なくとも4μg、少なくとも5μg、少なくとも6μg、少なくとも7μg、少なくとも8μg、少なくとも9μgもしくは少なくとも10μg、もしくは少なくとも約0.01μg、少なくとも約0.02μg、少なくとも約0.03μg、少なくとも約0.04μg、少なくとも約0.05μg、少なくとも約0.1μg、少なくとも約0.2μg、少なくとも約0.3μg、少なくとも約0.4μg、少なくとも約0.5μg、少なくとも約0.75μg、少なくとも約1μg、少なくとも約2μg、少なくとも約3μg、少なくとも約4μg、少なくとも約5μg、少なくとも約6μg、少なくとも約7μg、少なくとも約8μg、少なくとも約9μgもしくは少なくとも約10μgのオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激される。いくつかの態様では、細胞は、細胞106個当たり4μgまたは約4μgの存在下で刺激される。特定の態様では、細胞は、細胞106個当たり0.8μgまたは約0.8μgの存在下で刺激される。特定の局面では、4μgのオリゴマー刺激試薬は、3μgまたは約3μgのオリゴマー粒子、ならびに1μgまたは約1μgの付着した作用物質、例えば、0.5μgまたは約0.5μgの抗CD3 Fabおよび0.5μgまたは約0.5μgの抗CD28 Fabであるか、それらを含む。
2.細胞からの刺激試薬の除去
いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-Dなどの本明細書において記載されるインキュベーションの後または最中に、細胞または細胞集団から除去または分離される。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後、細胞を収集、採取または製剤化するための工程の前に、刺激試薬を除去するためのプロセス、手順、工程または技術を受ける。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に刺激試薬を除去するためのプロセス、手順、工程または技法を受ける。いくつかの局面では、インキュベーション中に刺激試薬が細胞から分離または除去される場合、細胞は、インキュベーションの残りの期間にわたって、分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。
いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-Dなどの本明細書において記載されるインキュベーションの後または最中に、細胞または細胞集団から除去または分離される。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後、細胞を収集、採取または製剤化するための工程の前に、刺激試薬を除去するためのプロセス、手順、工程または技術を受ける。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に刺激試薬を除去するためのプロセス、手順、工程または技法を受ける。いくつかの局面では、インキュベーション中に刺激試薬が細胞から分離または除去される場合、細胞は、インキュベーションの残りの期間にわたって、分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。
特定の態様では、刺激試薬は、細胞から除去および/または分離される。特定の態様では、刺激試薬と細胞との間の結合および/または会合は、いくつかの状況では、インキュベーション中に経時的に減少し得る。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質を加えて、刺激試薬と細胞との間の結合および/または会合を減少させてもよい。特定の態様では、細胞培養条件の変化、例えば、作用物質の添加および/または培地の温度および/またはpHの変化が、刺激試薬と細胞との間の結合および/または会合を減少させ得る。したがって、いくつかの態様では、例えば、細胞をインキュベーション、細胞培養系および/または溶液から細胞を除去することなく、細胞とは別個に、インキュベーション、細胞培養系および/または溶液から刺激試薬が除去されてもよい。
特定の態様では、刺激試薬は、一定期間後に細胞から分離および/または除去される。特定の態様では、期間は、刺激の開始からの期間である。特定の態様では、インキュベーションの開始は、細胞が刺激試薬および/または刺激試薬を含有する培地または溶液と接触した時点またはほぼその時点であると考えられる。特定の態様では、刺激試薬は、刺激の開始の120時間以内、108時間以内、96時間以内、84時間以内、72時間以内、60時間以内、48時間以内、36時間以内、24時間以内もしくは12時間以内、または約120時間以内、約108時間以内、約96時間以内、約84時間以内、約72時間以内、約60時間以内、約48時間以内、約36時間以内、約24時間以内もしくは約12時間以内に細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激試薬は、刺激が開始された後48時間または約48時間の時点で細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激試薬は、刺激が開始された後72時間または約72時間の時点で細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、刺激が開始された後96時間または約96時間の時点で細胞から除去または分離される。
細胞から刺激試薬（例えば、ビーズ粒子または磁化可能粒子などの粒子であるかそれを含有する刺激試薬）を除去する方法は公知である。特定の態様では、ビーズ刺激試薬、例えば、抗CD3抗体/抗CD28抗体コンジュゲート常磁性ビーズが、細胞または細胞集団から分離または除去される。いくつかの態様では、例えば、刺激試薬の一次抗体に結合し、細胞上のその抗原に対するその親和性を変化させる非標識抗体などの競合する抗体の使用を使用することができ、それにより、穏やかな分離が可能になる。場合によっては、分離後、競合する抗体は、粒子（例えばビーズ粒子）と会合したままであり得るが、未反応抗体は洗い流されるか、洗い流され得、細胞は、抗体を単離、選択、濃縮および/または活性化しない。そのような試薬の例は、DETACaBEAD（Friedl et al.1995;Entschladen et al.1997）である。いくつかの態様では、切断可能なリンカー（例えばDNAリンカー）の存在下で粒子（例えばビーズ粒子）が除去され得、それにより、粒子結合抗体がリンカー（例えばCELLection,Dynal）にコンジュゲートされる。場合によっては、リンカー領域は、例えば、DNaseまたは他の放出緩衝液を加えることにより、単離後に細胞から粒子（例えばビーズ粒子）を除去するための切断可能な部位を提供する。いくつかの態様では、細胞からの粒子（例えばビーズ粒子）の放出のために、他の酵素的方法も使用することができる。いくつかの態様では、粒子（例えば、ビーズ粒子または磁化可能粒子）は生分解性である。
いくつかの態様では、刺激試薬は、磁性、常磁性および/または超常磁性であり、および/または磁性、常磁性および/または超常磁性であるビーズを含有し、刺激試薬は、磁場に細胞を曝露することによって細胞から除去され得る。磁場を生成するための磁石を含む好適な機器の例には、DynaMag CTS（Thermo Fisher）、Magnetic Separator（Takara）およびEasySep Magnet（Stem Cell Technologies）が挙げられる。
特定の態様では、刺激試薬は、提供される方法の完了前、例えば、本明細書において提供される方法によって作製された操作された細胞を採取、収集および/または製剤化する前に、細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞を操作、例えば、形質導入またはトランスフェクトした後に、細胞から除去および/または分離される。特定の態様では、刺激試薬は、細胞の培養後、例えば、増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された、例えばトランスフェクトまたは形質導入された細胞の培養前に除去される。特定の態様では、刺激試薬は、細胞の培養中に細胞が閾値数、密度および/または拡大増殖を達成した後に除去される。いくつかの態様では、刺激試薬は、細胞を製剤化する前に、例えば、閾値数、濃度または拡大増殖を達成した培養細胞などの培養細胞を形成する前に除去される。
いくつかの態様では、刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-Dなどの本明細書において記載されるインキュベーション中またはその後に磁場に曝露することによって、細胞または細胞集団から除去または分離される。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後、細胞の収集、採取または製剤化の工程の前に刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬を除去するために、磁場に曝露される。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後に刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬を除去するために磁場に曝露される。いくつかの局面では、インキュベーション中に刺激ビーズ試薬が細胞または細胞集団から分離または除去される場合、細胞または細胞集団は、インキュベーションの残りの期間にわたって、磁場に対する曝露の前と同じインキュベーション条件に戻される。
特定の態様では、刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬は、例えば、刺激の開始の120時間以内、108時間以内、96時間以内、84時間以内、72時間以内、60時間以内、48時間以内、36時間以内、24時間以内もしくは12時間以内、または約120時間以内、約108時間以内、約96時間以内、約84時間以内、約72時間以内、約60時間以内、約48時間以内、約36時間以内、約24時間以内もしくは約12時間以内に磁場に曝露することによって、細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬は、例えば、刺激が開始された後72時間または約72時間の時点で磁場に曝露することによって、細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激ビーズ試薬、例えば刺激磁性ビーズ試薬は、例えば、刺激が開始された後96時間または約96時間の時点で磁場に曝露することによって、細胞から除去または分離される。
特定の態様では、刺激試薬は、一定期間後に細胞から分離および/または除去される。特定の態様では、期間は、刺激条件下でのインキュベーションの着手および/または開始からの期間である。特定の態様では、インキュベーションの開始は、細胞が刺激試薬および/または刺激試薬を含有する培地または溶液と接触した時点またはほぼその時点であると考えられる。特定の態様では、刺激試薬は、インキュベーションの着手または開始後28日以内、21日以内、20日以内、19日以内、18日以内、17日以内、16日以内、15日以内、14日以内、13日以内、12日以内、11日以内、10日以内および9日以内、または約28日以内、約21日以内、約20日以内、約19日以内、約18日以内、約17日以内、約16日以内、約15日以内、約14日以内、約13日以内、約12日以内、約11日以内、約10日以内および約9日以内に細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激試薬は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞をプールし、組み合わせ、および/またはインプット組成物に混合した後28日以内、21日以内、20日以内、19日以内、18日以内、17日以内、16日以内、15日以内、14日以内、13日以内、12日以内、11日以内、10日以内、9日以内、または約28日以内、約21日以内、約20日以内、約19日以内、約18日以内、約17日以内、約16日以内、約15日以内、約14日以内、約13日以内、約12日以内、約11日以内、約10日以内、約9日以内に細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激試薬は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生体試料から得られ、単離され、濃縮され、および/または選択された後28日以内、21日以内、20日以内、19日以内、18日以内、17日以内、16日以内、15日以内、14日以内、13日以内、12日以内、11日以内、10日以内、9日以内、または約28日以内、約21日以内、約20日以内、約19日以内、約18日以内、約17日以内、約16日以内、約15日以内、約14日以内、約13日以内、約12日以内、約11日以内、約10日以内、約9日以内に細胞から除去または分離される。
いくつかの態様では、単数または複数の刺激剤のシグナル伝達を破壊する、例えば、減少および/または停止させるために、インキュベートされたT細胞の集団に競合剤などの物質を加えることを含めた、記載されたオリゴマー刺激試薬などの刺激剤の除去をT細胞に加えた。いくつかの態様では、インキュベートされたT細胞の集団は、競合剤、例えばビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンなどの物質の存在を含む。いくつかの態様では、競合剤、例えばビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンなどの物質は、物質がインキュベーション中に外因的に加えられなかった培養T細胞の参照集団または調製物中の物質の量よりも少なくとも1.5倍多い量、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍以上多い量で存在する。いくつかの態様では、培養T細胞の集団中の競合剤、例えばビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンなどの物質の量は、約10μM〜約100μM、約100μΜ〜約1mM、約100μΜ〜約500μΜもしくは約10μΜ〜約100μΜ、または10μM〜100μM、100μΜ〜1mM、100μΜ〜500μΜもしくは10μΜ〜100μΜである。いくつかの態様では、10μMまたは約10μMのビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンを細胞または細胞集団に加えて、細胞または細胞集団からオリゴマー刺激試薬を分離または除去する。
特定の態様では、1つまたは複数の作用物質（例えば、TCRおよび/または共受容体を刺激または活性化する作用物質）は、例えば、オリゴマー試薬上に存在する複数の特定の結合部位（例えば結合部位Z）を介して、オリゴマー試薬と会合する、例えば可逆的に結合している。場合によっては、これにより、作用物質によって結合されるか認識される細胞表面分子（の少なくとも2コピー）を有する標的細胞が作用物質と接触する場合にアビディティー効果が生じることができるように、作用物質が互いに密接に配置される。いくつかの局面では、受容体結合試薬は、結合部位Bで細胞の受容体分子に対して低い親和性を有し、その結果、受容体結合試薬は、競合試薬の存在下で細胞から解離する。したがって、いくつかの態様では、作用物質は、競合試薬の存在下で細胞から除去される。
いくつかの態様では、オリゴマー刺激試薬は、可逆的に付着した抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabを有するストレプトアビジンムテインオリゴマーである。いくつかの態様では、付着したFabは、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーへの可逆的付着を可能にするストレプトアビジン結合ドメインを含む。場合によっては、抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabは、CD3および/またはCD28を発現するT細胞が、可逆的に付着したFabを有するオリゴマー刺激試薬と接触した場合に、アビディティー効果が生じることができるように、互いに密接に配置される。いくつかの局面では、Fabは、CD3およびCD28に対して低い親和性を有し、その結果、Fabは、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン変異体もしくは類似体の存在下で細胞から解離する。したがって、いくつかの態様では、Fabは、競合試薬、例えばD-ビオチンの存在下で細胞から除去または解離される。
いくつかの態様では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、細胞を収集、採取または製剤化する前に、細胞または細胞集団から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、インキュベーション、例えば、セクションI-Dなどの本明細書において記載されるインキュベーションの後または最中に、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露することによって、細胞または細胞集団から除去または分離される。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後、細胞を収集、採取または製剤化する工程の前に、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬を除去するために、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させられるか曝露される。特定の態様では、細胞または細胞集団は、インキュベーション後、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬を除去するために、競合試薬、例えばビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させられるか曝露される。いくつかの局面では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬が、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンに接触させるか曝露することによって、インキュベーション中に細胞から分離または除去される場合、細胞は、インキュベーションの残りの期間にわたって、分離または除去前と同じインキュベーション条件に戻される。
いくつかの態様では、細胞は、細胞からオリゴマー刺激試薬を除去または分離するために、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mM、約0.01μM、約0.05μM、約0.1μM、約0.5μM、約1μM、約2μM、約3μM、約4μM、約5μM、約10μM、約100μM、約500μM、約0.01μM、約1mMもしくは約10mM、または少なくとも0.01μM、少なくとも0.05μM、少なくとも0.1μM、少なくとも0.5μM、少なくとも1μM、少なくとも2μM、少なくとも3μM、少なくとも4μM、少なくとも5μM、少なくとも10μM、少なくとも100μM、少なくとも500μM、少なくとも0.01μM、少なくとも1mMもしくは少なくとも10mM、もしくは少なくとも約0.01μM、少なくとも約0.05μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約1μM、少なくとも約2μM、少なくとも約3μM、少なくとも約4μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μm、少なくとも約100μM、少なくとも約500μM、少なくとも約0.01μM、少なくとも約1mMもしくは少なくとも約10mMの競合試薬と接触させられる。様々な態様では、細胞は、可逆的に付着した抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabを有する刺激ストレプトアビジンムテインオリゴマーを細胞から除去または分離するために、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mMもしくは10mM、約0.01μM、約0.05μM、約0.1μM、約0.5μM、約1μM、約2μM、約3μM、約4μM、約5μM、約10μM、約100μM、約500μM、約0.01μM、約1mMもしくは約10mM、または少なくとも0.01μM、少なくとも0.05μM、少なくとも0.1μM、少なくとも0.5μM、少なくとも1μM、少なくとも2μM、少なくとも3μM、少なくとも4μM、少なくとも5μM、少なくとも10μM、少なくとも100μM、少なくとも500μM、少なくとも0.01μM、少なくとも1mMもしくは少なくとも10mM、もしくは少なくとも約0.01μM、少なくとも約0.05μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約1μM、少なくとも約2μM、少なくとも約3μM、少なくとも約4μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μm、少なくとも約100μM、少なくとも約500μM、少なくとも約0.01μM、少なくとも約1mMもしくは少なくとも約10mMのビオチンまたはビオチン類似体、例えばD-ビオチンと接触させられる。
特定の態様では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激の開始の120時間以内、108時間以内、96時間以内、84時間以内、72時間以内、60時間以内、48時間以内、36時間以内、24時間以内もしくは12時間以内、または約120時間以内、約108時間以内、約96時間以内、約84時間以内、約72時間以内、約60時間以内、約48時間以内、約36時間以内、約24時間以内もしくは約12時間以内に細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激が開始された後48時間または約48時間の時点で細胞から除去または分離される。特定の態様では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激が開始された後72時間または約72時間の時点で細胞から除去または分離される。いくつかの態様では、刺激オリゴマー試薬、例えば刺激オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、刺激が開始された後96時間または約96時間の時点で細胞から除去または分離される。
C.細胞の操作
いくつかの態様では、処理工程は、組換えタンパク質をコードする核酸分子を1つまたは複数の細胞に導入するための条件下などで、細胞、例えば刺激された細胞を操作することを含む。そのような組換えタンパク質の例は、セクションIIに記載されているものなどの組換え受容体である。細胞を操作する、例えば、細胞に組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸分子を導入する方法は、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたは他の作用物質を使用するなど、いくつかの公知の方法のいずれかを使用して行われてもよい。そのようなベクターには、レンチウイルス系およびガンマレトロウイルス系を含むウイルス系および非ウイルス系、ならびにピギーバックまたはスリーピングビューティーをベースとする遺伝子導入系などのトランスポゾンベースの系が含まれる。例示的な方法には、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾンおよびエレクトロポレーションを含む、受容体をコードする核酸の導入のための方法が含まれる。
いくつかの態様では、処理工程は、組換えタンパク質をコードする核酸分子を1つまたは複数の細胞に導入するための条件下などで、細胞、例えば刺激された細胞を操作することを含む。そのような組換えタンパク質の例は、セクションIIに記載されているものなどの組換え受容体である。細胞を操作する、例えば、細胞に組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸分子を導入する方法は、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたは他の作用物質を使用するなど、いくつかの公知の方法のいずれかを使用して行われてもよい。そのようなベクターには、レンチウイルス系およびガンマレトロウイルス系を含むウイルス系および非ウイルス系、ならびにピギーバックまたはスリーピングビューティーをベースとする遺伝子導入系などのトランスポゾンベースの系が含まれる。例示的な方法には、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾンおよびエレクトロポレーションを含む、受容体をコードする核酸の導入のための方法が含まれる。
特定の態様では、細胞および/または濃縮T細胞の組成物は、細胞を培養する前に、例えば、細胞の形質導入またはトランスフェクションを含むプロセスによって操作される。場合によっては、培養は、本明細書、例えばセクションI-Dにおいて提供される方法などによって、増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で行われる。特定の態様では、細胞は、本明細書、例えば、セクションI-Bにおいて提供される方法のいずれかなどによって、刺激条件下で細胞が刺激、活性化および/またはインキュベートされた後に操作される。特定の態様では、細胞は刺激された細胞であり、および/または細胞の組成物は、例えばセクションI-Bに記載されるような刺激条件下での事前のインキュベーションなどによる細胞の刺激された組成物である。特定の態様では、1つまたは複数の刺激された組成物は、前もってクライオ凍結され保存されており、操作の前に解凍される。
いくつかの態様では、設定されたおよび/または固定された数の細胞、例えば、刺激された細胞は、例えば、形質導入またはトランスフェクションなどによる細胞の操作のために、そのような細胞と、組換えタンパク質（例えばCAR）をコードするポリヌクレオチドを含有する作用物質（例えばレンチウイルスベクター）とを接触させることなどによって操作される。特定の態様では、1×105〜50,000×106個または約1×105〜約50,000×106個、1×106〜50,000×106個または約1×106〜約50,000×106個、10×106〜5,000×106個または約10×106〜約5,000×106個、1x106〜1,000x106個または約1x106〜約1,000x106個、50x106〜5,000x106個または約50x106〜約5,000x106個、10x106〜1,000x106個または約10x106〜約1,000x106個、50×106〜500×106個または約50×106〜約500×106個の細胞、例えば、刺激された細胞が、例えば、形質導入またはトランスフェクションなどによって操作される。特定の態様では、少なくとも50×106個の細胞、少なくとも100×106個の細胞、少なくとも150×106個の細胞、少なくとも200×106個の細胞もしくは少なくとも250×106個の細胞、50×106個の細胞、100×106個の細胞、150×106個の細胞、200×106個の細胞もしくは250×106個の細胞、または約50×106個の細胞、約100×106個の細胞、約150×106個の細胞、約200×106個の細胞もしくは約250×106個の細胞が操作される。特定の態様では、少なくとも約100×106個の細胞が操作される。特定の態様では、最大200×106個の細胞が操作される。特定の態様では、約100×106〜約200×106個の細胞が操作される。いくつかの態様では、細胞は刺激された細胞である。特定の態様では、細胞は生存細胞である。特定の態様では、細胞は、アポトーシスのマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3に対して陰性である。特定の態様では、細胞は、刺激条件下でのインキュベーションなどによって刺激されている生存細胞である。
いくつかの態様では、例えば、形質導入またはトランスフェクションなどによって、そのような細胞と組換えタンパク質（例えばCAR）をコードするポリヌクレオチドを含有する作用物質（例えばレンチウイルスベクター）とを接触させることなどにより操作される細胞（例えば、刺激された細胞）の数は、活性化または刺激後の細胞の総数であり、最大で合計200x106個までの細胞である。いくつかの態様では、異なるドナーに由来するインプット組成物について、活性化または刺激後の異なる数の細胞が、例えば、形質導入またはトランスフェクションなどの操作に供されてもよい。いくつかの態様では、活性化または刺激後の細胞の総数が200×106個であるか200×106個を超える場合、最大200×106個までの細胞が操作されるが、活性化または刺激後の細胞の総数が200x106個未満の場合、活性化後または刺激後の全細胞が操作される。いくつかの態様では、細胞は刺激された細胞である。特定の態様では、細胞は生存細胞である。特定の態様では、細胞は、アポトーシスのマーカー、例えば、アネキシンVまたは活性型カスパーゼ3に対して陰性である。特定の態様では、細胞は、刺激条件下でのインキュベーションなどによって刺激されている生存細胞である。
いくつかの態様では、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるような、増殖、生存率および/または活性化などの応答を誘発する刺激と細胞を組み合わせることなどによって細胞を最初に刺激し、続いて、活性化された細胞を形質導入し、臨床応用に十分な数まで培養で拡大増殖させることによって、遺伝子導入が達成される。特定の態様では、遺伝子導入は、本明細書、例えばセクションI-Bにおいて記載される方法のいずれかなどによる刺激条件下で細胞を最初にインキュベートすることによって達成される。
特定の態様では、遺伝子操作のための方法は、組成物の1つまたは複数の細胞と、組換えタンパク質、例えば組換え受容体をコードする核酸分子とを接触させることによって行われる。いくつかの態様では、組換え核酸は、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して細胞に導入される。いくつかの態様では、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクターを使用してT細胞に導入される（例えば、Koste et al.（2014）Gene Therapy 2014 Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25;Carlens et al.（2000）Exp Hematol 28（10）:1137-46;Alonso-Camino et al.（2013）Mol Ther Nucl Acids 2,e93;Park et al.,Trends Biotechnol.2011 November 29（11）:550-557を参照。
いくつかの態様では、レトロウイルスベクターは、長末端反復配列（LTR）、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）またはアデノ随伴ウイルス（AAV）由来のレトロウイルスベクターを有する。ほとんどのレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様では、レトロウイルスは、鳥類または哺乳類の細胞源に由来するものを含む。レトロウイルスは典型的には両種指向性であり、これは、ヒトを含む数種の宿主細胞に感染することができることを意味する。一態様では、発現される遺伝子は、レトロウイルスのgag、polおよび/またはenv配列を置換する。多くの例示的なレトロウイルス系が記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号、米国特許第6,207,453号、米国特許第5,219,740号、Miller and Rosman（1989）BioTechniques 7:980-990;Miller,A.D.（1990）Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpa et al.（1991）Virology 180:849-852;Burns et al.（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin（1993）Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
レンチウイルス形質導入の方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Wang et al.（2012）J.Immunother.35（9）:689-701;Cooper et al.（2003）Blood.101:1637-1644;Verhoeyen et al.（2009）Methods Mol Biol.506:97-114;およびCavalieri et al.（2003）Blood.102（2）:497-505に記載されている。
いくつかの態様では、組換え核酸は、エレクトロポレーションを介してT細胞に導入される（例えば、Chicaybam et al,（2013）PLoS ONE 8（3）:e60298 and Van Tedeloo et al.（2000）Gene Therapy 7（16）:1431-1437を参照）。いくつかの態様では、組換え核酸は転位を介してT細胞に導入される（例えば、Manuri et al.（2010）Hum Gene Ther 21（4）:427-437;Sharma et al.（2013）Molec Ther Nucl Acids 2,e74;およびHuang et al.（2009）Methods Mol Biol 506:115-126を参照）。免疫細胞に遺伝物質を導入して発現させる他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,New York.N.Y.に記載されている）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション;タングステン粒子促進微小粒子衝撃法（tungsten particle-facilitated microparticle bombardment）（Johnston,Nature,346:776-777（1990））;およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿物（Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034（1987））が含まれる。
組換え産物をコードする核酸の導入のための他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際特許出願公開番号WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
いくつかの態様では、操作、例えば、形質導入またはトランスフェクションは、無血清培地中で行われる。いくつかの態様では、無血清培地は、規定されたおよび/または正確に規定された細胞培養培地である。特定の態様では、無血清培地は、処理された、例えば、阻害物質および/または成長因子を除去するために濾過された、制御された培地である。いくつかの態様では、無血清培地はタンパク質を含有する。特定の態様では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質および/または付着因子を含有し得る。
いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、形質導入アジュバントの存在下で操作される、例えば、形質導入またはトランスフェクトされる。例示的な形質導入アジュバントには、限定されることなく、ポリカチオン、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン由来の断片もしくは変異体、およびRetroNectinが含まれる。特定の態様では、細胞は、ポリカチオン、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン由来の断片もしくは変異体、および/またはRetroNectinの存在下で操作される。特定の態様では、細胞は、ポリブレン、DEAE-デキストラン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジンまたはカチオン性リポソームであるポリカチオンの存在下で操作される。特定の態様では、細胞は、硫酸プロタミンの存在下で操作される。
いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、形質導入アジュバントの非存在下で操作される、例えば、形質導入またはトランスフェクトされる。したがって、特定の態様では、細胞は、ポリカチオン、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン由来の断片もしくは変異体、およびRetroNectinの非存在下で操作される。特定の態様では、細胞は、ポリブレン、DEAE-デキストラン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジンまたはカチオン性リポソームであるポリカチオンの非存在下で操作される。特定の態様では、細胞は、硫酸プロタミンの非存在下で操作される。
いくつかの態様では、細胞、例えばT細胞は、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を用いて、活性化、刺激および/または拡大増殖の最中または後に形質導入され得る。所望の受容体の遺伝子の導入のためのこの形質導入は、例えば、任意の好適なレトロウイルスベクターを用いて行うことができる。次いで、遺伝的に改変された細胞集団は、最初の刺激（例えばCD3/CD28刺激）から開放され得、次いで、例えば、新規に導入された受容体を介して、第2のタイプの刺激によって刺激され得る）。この第2のタイプの刺激には、ペプチド/MHC分子、遺伝的に導入された受容体（例えばCARの天然リガンド）の同種の（架橋）リガンド、または（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新規受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（抗体など）の形態の抗原刺激が含まれ得る。例えば、Cheadle et al,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol.2012;907:645-66またはBarrett et al.,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347（2014）を参照されたい。
いくつかの局面では、細胞はさらに、サイトカインまたは他の因子の発現を促進するために操作される。追加の核酸、例えば、導入のための遺伝子の中には、導入された細胞の生存率および/または機能を促進することなどによって、治療の効果を改善する遺伝子;例えば、インビボでの生存率または局在を評価するための、細胞の選択および/または評価のための遺伝的マーカーを提供する遺伝子;例えば、Lupton S.D.et al.,Mol.and Cell Biol.,11:6（1991）およびRiddell et al.,Human Gene Therapy 3:319-338（1992）に記載されているように、インビボで細胞を陰性選択に感受性にすることによって安全性を改善する遺伝子があり、優性陽性選択マーカーと陰性選択マーカーとの融合に由来する二機能性選択融合遺伝子の使用について記載されている、Lupton et al.によるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の刊行物も参照されたい。例えば、Riddell et al.の米国特許第6,040,177号、14〜17段を参照されたい。
いくつかの態様では、導入は、組成物の1つまたは複数の細胞と、組換えタンパク質、例えば組換え受容体をコードする核酸分子とを接触させることによって行われる。いくつかの態様では、接触は、遠心分離、例えばスピノキュレーション（例えば遠心分離接種）を用いて行うことができる。そのような方法には、国際公開番号WO2016/073602に記載されている方法のいずれかが含まれる。例示的な遠心チャンバには、A-200/FおよびA-200遠心チャンバを含むSepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムとともに使用するための遠心チャンバ、ならびにそのようなシステムとともに使用するための様々なキットを含む、Biosafe SAによって製造および販売される遠心チャンバが含まれる。例示的なチャンバ、システムならびに処理機器およびキャビネットは、例えば、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および公開された米国特許出願公開番号US2008/0171951、ならびに公開された国際特許出願公開番号WO00/38762に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。このようなシステムとともに使用するためのキットの例には、限定されることなく、製品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2の下にBioSafe SAによって販売されている使い捨てキットが挙げられる。
いくつかの態様では、システムには、本明細書または国際公開番号WO2016/073602において記載されている遠心チャンバシステムとともに、またはそれに関連して行われ得る1つまたは複数の処理工程など、システム内で行われる形質導入工程および1つまたは複数の様々な他の処理工程の局面を操作、自動化、制御および/またはモニタリングするための機器を含む他の機器が含まれ、および/またはシステムは、それに関連して配置される。いくつかの態様では、この機器は、キャビネット内に含まれる。いくつかの態様では、機器は、制御回路を含むハウジング、遠心分離機、カバー、モータ、ポンプ、センサ、ディスプレイおよびユーザインターフェースを含むキャビネットを含む。例示的な装置は、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許第2008/0171951号に記載されている。
いくつかの態様では、システムは、一連の容器、例えば、バッグ、チューブ、ストップコック、クランプ、コネクタおよび遠心分離チャンバを含む。いくつかの態様では、バッグなどの容器は、同じ容器または別個の容器、例えば、同じバッグまたは別個のバッグ内に、形質導入される細胞とウイルスベクター粒子とを含むバッグなどの1つまたは複数の容器を含む。いくつかの態様では、システムは、方法中に成分および/または組成物を希釈、再懸濁および/または洗浄するためにチャンバおよび/または他の成分に引き込まれる媒体、例えば、希釈剤および/または洗浄溶液を含むバッグなどの1つまたは複数の容器をさらに含む。容器は、システム内の1つまたは複数の位置、例えば、投入ライン、希釈剤ライン、洗浄ライン、廃棄物ラインおよび/または排出ラインに対応する位置に接続され得る。
いくつかの態様では、チャンバは、その回転軸の周りなどでチャンバを回転させることができる遠心分離機と関連付けられる。回転は、細胞の形質導入に関連するインキュベーションの前、最中および/または後に、および/または他の処理工程のうちの1つまたは複数で行われ得る。したがって、いくつかの態様では、様々な処理工程のうちの1つまたは複数が、回転下で、例えば特定の力で行われる。チャンバは、典型的には垂直方向またはほぼ垂直方向に回転することができ、その結果、チャンバは遠心分離中に垂直に位置し、側壁および軸は垂直またはほぼ垂直であり、端壁は水平またはほぼ水平である。
いくつかの態様では、組成物をキャビティに提供する前に、細胞を含有する組成物と、ウイルスベクター粒子および任意で空気を含有する組成物とを組み合わせるか混合することができる。いくつかの態様では、細胞を含有する組成物と、ウイルスベクター粒子および任意で空気を含有する組成物とを別個に提供し、キャビティ内で組み合わせ混合する。いくつかの態様では、細胞を含有する組成物、ウイルスベクター粒子および任意で空気を含有する組成物を任意の順序で内部キャビティに提供することができる。そのようないくつかの態様のいずれかでは、細胞およびウイルスベクター粒子を含有する組成物は、遠心チャンバの内部または外部で組み合わされているまたは混合されているかどうか、および/または細胞およびウイルスベクター粒子が、同時または順次のように、一緒にまたは別個に遠心チャンバに提供されるかどうかにかかわらず、一度一緒に組み合わされるか混合されたインプット組成物である。
いくつかの態様では、空気などの気体の体積の取り込みは、形質導入法での回転など、細胞およびウイルスベクター粒子をインキュベートする前に行われる。いくつかの態様では、空気などの気体の体積の取り込みは、形質導入法での回転など、細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベーション中に行われる。
いくつかの態様では、形質導入組成物を構成する細胞またはウイルスベクター粒子の液体体積、および任意で空気の体積は、所定の体積であり得る。体積は、システムに関連する回路にプログラムされた体積および/またはその回路によって制御された体積であり得る。
いくつかの態様では、形質導入組成物、および任意で空気などの気体の取り込みは、所望または所定の体積がチャンバの内部キャビティに取り込まれるまで、手動、半自動および/または自動で制御される。いくつかの態様では、システムに関連付けられたセンサは、遠心分離チャンバに出入りする液体および/または気体を、その色、流量および/または密度などを介して検出することができ、関連する回路と通信して、そのような所望または所定の体積の取り込みが達成されるまで、必要に応じて取り込みを停止または続行させることができる。いくつかの局面では、プログラムされているか、システム内の液体のみを検出することができ、気体（例えば空気）は検出することができないセンサは、取り込みを停止することなく、空気などの気体をシステムに通過させることができる。いくつかのそのような態様では、空気などの気体の取り込みが望まれている間、非透明なチューブ片をセンサ近くのラインに配置することができる。いくつかの態様では、空気などの気体の取り込みは手動で制御することができる。
提供される方法の局面では、遠心分離チャンバの内部キャビティは高速回転に供される。いくつかの態様では、回転は、液体インプット組成物および任意で空気の取り込みの前に、それと同時に、その後に、またはそれを用いて間欠的に行われる。いくつかの態様では、回転は、液体インプット組成物および任意で空気の取り込みの後に行われる。いくつかの態様では、回転は、内部キャビティの側壁の内面での、および/または細胞の表面層での800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3500gもしくは4000g、または約800g、約1000g、約1100g、約1500、約1600g、約1800g、約2000g、約2200g、約2500g、約3000g、約3500gもしくは約4000g、または少なくとも800g、少なくとも1000g、少なくとも1100g、少なくとも1500、少なくとも1600g、少なくとも1800g、少なくとも2000g、少なくとも2200g、少なくとも2500g、少なくとも3000g、少なくとも3500gもしくは少なくとも4000g、または少なくとも約800g、少なくとも約1000g、少なくとも約1100g、少なくとも約1500、少なくとも約1600g、少なくとも約1800g、少なくとも約2000g、少なくとも約2200g、少なくとも約2500g、少なくとも約3000g、少なくとも約3500gもしくは少なくとも約4000gの相対遠心力での遠心チャンバの遠心分離によるものである。いくつかの態様では、回転は、1200g超、1400g超、1600g超、1800g超、2000g超、2400g超、2800g超、3000g超もしくは3200g超、または約1200g、約1400g、約1600g、約1800g、約2000g、約2400g、約2800g、約3000gもしくは約3200gなどによる、1100g超または約1100gである力での遠心分離によるものである。いくつかの態様では、回転は、1600gまたは約1600gである力での遠心分離によるものである。
いくつかの態様では、形質導入の方法は、5分超、10分超、15分超、20分超、30分超、45分超、60分超、90分超もしくは120分超、または約5分、約10分、約15分、約20分、約30分、約45分、約60分、約90分もしくは約120分にわたり遠心チャンバ内で、形質導入組成物および任意で空気を回転または遠心分離することを含む。いくつかの態様では、形質導入組成物および任意で空気は、5分を超えるが60分以下、45分以下、30分以下または15分以下にわたり遠心チャンバ内で回転または遠心分離される。特定の態様では、形質導入は、60分または約60分にわたる回転または遠心分離を含む。
いくつかの態様では、形質導入の方法は、10分以上60分以下、15分以上60分以下、15分以上45分以下、30分以上60分以下もしくは45分以上60分以下、または約10分以上約60分以下、約15分以上約60分以下、約15分以上約45分以下、約30分以上約60分以下もしくは約45分以上約60分以下にわたり、内部キャビティの側壁の内面での、および/または細胞の表面層での少なくとも1000g、少なくとも1100g、少なくとも1200g、少なくとも1400g、少なくとも1500g、少なくとも1600g、少なくとも1800g、少なくとも2000g、少なくとも2200g、少なくとも2400g、少なくとも2800g、少なくとも3200gもしくは少なくとも3600g、または1000g超、1100g超、1200g超、1400g超、1500g超、1600g超、1800g超、2000g超、2200g超、2400g超、2800g超、3200g超もしくは3600g超、または約1000g、約1100g、約1200g、約1400g、約1500g、約1600g、約1800g、約2000g、約2200g、約2400g、約2800g、約3200gもしくは約3600gの力で、遠心チャンバ内で形質導入組成物および任意で空気を回転または遠心分離することを含む。特定の態様では、形質導入の方法は、1600gまたは約1600gで60分または約60分にわたり、形質導入組成物、例えば、細胞およびウイルスベクター粒子を回転または遠心分離することを含む。
いくつかの態様では、チャンバのキャビティ内の空気などの気体は、チャンバから排出される。いくつかの態様では、空気などの気体は、閉鎖系の一部として遠心チャンバと動作可能に連結された容器に排出される。いくつかの態様では、容器は、空いている、または空の容器である。いくつかの態様では、チャンバのキャビティ内の気体などの空気は、無菌の管路を介してチャンバの内部キャビティに動作可能に接続されたフィルタを通して排出される。いくつかの態様では、空気は、手動、半自動または自動プロセスを使用して排出される。いくつかの態様では、インキュベートされた細胞およびウイルスベクター粒子、例えば、形質導入が開始された細胞、または細胞がウイルスベクターにより形質導入された細胞を含有するアウトプット組成物の発現の前に、それと同時に、それを用いて間欠的に、またはその後に、チャンバのキャビティから、チャンバから空気が排出される。
いくつかの態様では、形質導入および/または他のインキュベーションは、連続的または半連続的なプロセスとして、またはその一部として行われる。いくつかの態様では、連続的なプロセスは、インキュベーションの少なくとも一部の間、例えば遠心分離の間に、細胞およびウイルスベクター粒子、例えば形質導入組成物の連続的な取り込み（単一の既存の組成物として、または同じ容器、例えばキャビティに連続的に引き込み、それによってその部分を混合することによって）、および/または液体の連続的な発現または排出、および任意で容器からの気体（例えば空気）の排出を含む。いくつかの態様では、連続的な取り込みおよび連続的な発現は、少なくとも部分的に同時に行われる。いくつかの態様では、連続的な取り込みは、インキュベーションの一部の間に、例えば、遠心分離の一部の間に行われ、連続的な発現は、インキュベーションの別個の部分の間に行われる。2つは交互に行われ得る。したがって、連続的な取り込みおよび発現により、インキュベーションを行いながら、試料のさらに大きな全体積を処理する、例えば形質導入することができる。
いくつかの態様では、インキュベーションは、連続的なプロセスの一部であり、方法は、インキュベーションの少なくとも一部の間に、チャンバの回転の間およびインキュベーションの一部の間に、キャビティへの形質導入組成物の連続的な取り込みを行う工程、液体の連続的な発現を行う工程、および任意で、チャンバの回転の間に、少なくとも1つの開口部を通してキャビティから気体（例えば空気）を排出する工程を含む。
いくつかの態様では、半連続的なインキュベーションは、キャビティへの組成物の取り込み、インキュベーション、キャビティからの液体の発現、および任意で、アウトプット容器などに対するキャビティからの気体（例えば空気）の排出、次いで、さらに多くの細胞、および処理のための他の試薬、例えばウイルスベクター粒子を含有する後続の（例えば、第2、第3などの）組成物の取り込み、ならびにプロセスの反復を交互に行うことによって行われる。例えば、いくつかの態様では、インキュベーションは半連続的なプロセスの一部であり、方法は、インキュベーションの前に、少なくとも1つの開口部を通して形質導入組成物のキャビティへの取り込みを行う工程、インキュベーションに続いて、キャビティからの流体の発現を行う工程;細胞およびウイルスベクター粒子を含む別の形質導入組成物の内部キャビティへの取り込みを行う工程;ならびに別の形質導入組成物中の細胞がベクターによって形質導入される条件下で、内部キャビティ内で別の形質導入組成物をインキュベートする工程を含む。このプロセスは、いくつかの追加ラウンドにわたって反復的に継続され得る。この点で、半連続的または連続的な方法は、さらに大きな体積および/または数の細胞の作製を可能にし得る。
いくつかの態様では、形質導入インキュベーションの一部は、遠心チャンバ内で行われ、回転または遠心分離を含む条件下で行われる。
いくつかの態様では、方法は、回転および遠心分離を用いず細胞およびウイルスベクター粒子のインキュベーションの追加の部分が行われるインキュベーションを含み、これは一般に、チャンバの回転または遠心分離を含むインキュベーションの少なくとも一部の後に行われる。いくつかのそのような態様では、追加のインキュベーションは、1つまたは複数の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組み込みをもたらす条件下で行われる。インキュベーションが宿主ゲノムへのウイルスベクター粒子の組み込みをもたらしたかどうかを評価または決定し、ひいては追加のインキュベーションの条件を経験的に決定することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの態様では、宿主ゲノムへのウイルスベクターの組み込みは、インキュベーション後にウイルスベクター粒子のゲノムに含まれる核酸によってコードされる異種タンパク質などの組換えタンパク質の発現レベルを測定することによって評価することができる。例えば、フローサイトメトリーなどによる細胞表面タンパク質の観点から、組換え分子の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば、親和性ベースの方法、例えば、免疫親和性ベースの方法による検出が使用されてもよい。いくつかの例では、発現は、形質導入マーカーおよび/またはレポーター構築物の検出によって測定される。いくつかの態様では、切断された表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含まれ、発現および/またはその増強のマーカーとして使用される。
いくつかの態様では、細胞およびウイルス粒子を含有する組成物は、一般に、細胞をペレット化するために使用される速度よりも低い速度、例えば、600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）などの比較的低い力または速度で回転させることができる。いくつかの態様では、回転は、例えば、チャンバまたはキャビティの内壁または外壁で測定した場合、100g〜3200gまたは約100g〜3200g（例えば、100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000gもしくは3200g、または約100g、約200g、約300g、約400g、約500g、約1000g、約1500g、約2000g、約2500g、約3000gもしくは約3200g、または少なくとも100g、少なくとも200g、少なくとも300g、少なくとも400g、少なくとも500g、少なくとも1000g、少なくとも1500g、少なくとも2000g、少なくとも2500g、少なくとも3000gもしくは少なくとも3200g、または少なくとも約100g、少なくとも約200g、少なくとも約300g、少なくとも約400g、少なくとも約500g、少なくとも約1000g、少なくとも約1500g、少なくとも約2000g、少なくとも約2500g、少なくとも約3000gもしくは少なくとも約3200g）の力、例えば相対遠心力で行われる。用語「相対遠心力」すなわちRCFは、一般に、地球の重力に対して、回転軸と比較して空間の特定の点で、物体または物質（例えば、細胞、試料またはペレットおよび/または回転しているチャンバまたは他の容器内の点）に与えられる有効な力であると理解される。この値は、重力、回転速度および回転半径（回転軸、およびRCFが測定されている物体、物質または粒子からの距離）を考慮して、周知の式を使用して決定され得る。
特定の態様では、細胞およびウイルス粒子を含有する組成物は、5分超または約5分、例えば、10分超、15分超、20分超、30分超、45分超、60分超、90分超もしくは120分超、もしくは約10分、約15分、約20分、約30分、約45分、約60分、約90分もしくは約120分、または5分以上120分以下、30分以上90分以下、15分以上60分以下、15分以上45分以下、30分以上60分以下もしくは45分以上60分以下、もしくは約5分以上約120分以下、約30分以上約90分以下、約15分以上約60分以下、約15分以上約45分以下、約30分以上約60分以下もしくは約45分以上約60分以下にわたり回転される。いくつかの態様では、組成物は60分または約60分にわたり回転される。
特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、操作、例えば、形質導入またはトランスフェクション中に、1×107細胞/mL未満、9×106細胞/mL未満、8×106細胞/mL未満、7x106細胞/mL未満、6x106細胞/mL未満、5x106細胞/mL未満、4x106細胞/mL未満もしくは3x106細胞/mL未満、または約1×107細胞/mL、約9×106細胞/mL、約8×106細胞/mL、約7x106細胞/mL、約6x106細胞/mL、約5x106細胞/mL、約4x106細胞/mLもしくは約3x106細胞/mLの密度で培養される。いくつかの態様では、細胞は、1×103細胞/mL〜1×109細胞/mL、1×104細胞/mL〜1×108細胞/mL、1×105細胞/mL〜1×107細胞/mLもしくは5×105細胞/mL〜1×107細胞/mL、または約1×103細胞/mL〜約1×109細胞/mL、約1×104細胞/mL〜約1×108細胞/mL、約1×105細胞/mL〜約1×107細胞/mLもしくは約5×105細胞/mL〜約1×107細胞/mLの密度で操作される。特定の態様では、細胞は、5×105細胞/mL、1×106細胞/mL、2×106細胞/mL、3×106細胞/mL、4×106細胞/mLもしくは5x106細胞/mL、または約5×105細胞/mL、約1×106細胞/mL、約2×106細胞/mL、約3×106細胞/mL、約4×106細胞/mLもしくは約5x106細胞/mLの密度で操作される。特定の態様では、細胞は、1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの密度で操作される。特定の態様では、細胞は、回転、例えば、細胞およびウイルス粒子を含有する組成物の回転後に培養される。特定の態様では、細胞はウイルス粒子とともに回転されている。
いくつかの態様では、細胞の操作は、ベクター、例えば、非ウイルスベクターのウイルスベクターとの培養、接触またはインキュベーションを含む。特定の態様では、細胞とベクターとの培養、接触および/またはインキュベーションは、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、18時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、54時間、60時間、72時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日、約4時間、約6時間、約8時間、約12時間、約16時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約40時間、約48時間、約54時間、約60時間、約72時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日もしくは約7日、もしくは少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも30時間、少なくとも36時間、少なくとも40時間、少なくとも48時間、少なくとも54時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日もしくは少なくとも7日、または7日超にわたり行われる。いくつかの態様では、細胞とベクターとの培養、接触および/またはインキュベーションは、遺伝子操作の前に、30分〜2時間、1時間〜8時間、6時間〜12時間、12時間〜18時間、16時間〜24時間、18時間〜30時間、24時間〜48時間、24時間〜72時間、42時間〜54時間、60時間〜120時間96時間〜120時間、90時間の間、および1日〜7日、3日〜8日、1日〜3日、4日〜6日または4日〜5日の期間にわたり行われる。いくつかの態様では、細胞は、18時間〜30時間または約18時間〜約30時間ベクターと培養、接触および/またはインキュベートされる。特定の態様では、細胞は、24時間または約24時間ベクターと培養、接触および/またはインキュベートされる。
いくつかの態様では、遺伝子操作、例えば形質導入の少なくとも一部の最中に、および/または遺伝子操作に続いて、細胞は、上記のように、遺伝子操作された細胞の培養のために、例えば、細胞の培養または拡大増殖のために、バイオリアクターバッグアセンブリに移される。
特定の態様では、細胞は、1つまたは複数のサイトカインの存在下で操作される。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは組換えサイトカインである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインはヒト組換えサイトカインである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現される、および/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合する、および/または結合することができる。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-α-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、それを含む。いくつかの態様では、サイトカインの4-α-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーには、限定されることなく、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれる。いくつかの態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるか、それを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7であるか、それを含む。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2であるか、それを含む。
いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、1つまたは複数のサイトカイン、例えば組換えヒトサイトカインの存在下で、1IU/mL〜1,000IU/mLもしくは約1IU/mL〜約1,000IU/mL、10IU/mL〜50IU/mLもしくは約10IU/mL〜約50IU/mL、50IU/mL〜100IU/mLもしくは約50IU/mL〜約100IU/mL、100IU/mL〜200IU/mLもしくは約100IU/mL〜約200IU/mL、100IU/mL〜500IU/mLもしくは約100IU/mL〜約500IU/mL、250IU/mL〜500IU/mLもしくは約250IU/mL〜約500IU/mL、または500IU/mL〜1,000IU/mLもしくは約500IU/mL〜約1,000IU/mLの濃度で、操作、例えば、形質導入またはトランスフェクトされる。
いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、IL-2、例えばヒト組換えIL-2の存在下で、1IU/mL〜500IU/mLもしくは約1IU/mL〜約500IU/mL、10IU/mL〜250IU/mLもしくは約10IU/mL〜約250IU/mL、50IU/mL〜200IU/mLもしくは約50IU/mL〜約200IU/mL、50IU/mL〜150IU/mLもしくは約50IU/mL〜約150IU/mL、75IU/mL〜125IU/mLもしくは約75IU/mL〜約125IU/mL、100IU/mL〜200IU/mLもしくは約100IU/mL〜約200IU/mL、または10IU/mL〜100IU/mLもしくは約10IU/mL〜約100IU/mLの濃度で、操作、例えば、トランスフェクトまたは形質導入される。特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞および/または刺激された細胞組成物の細胞は、組換えIL-2とともに、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mL、または約50IU/mL、約60IU/mL、約70IU/mL、約80IU/mL、約90IU/mL、約100IU/mL、約110IU/mL、約120IU/mL、約130IU/mL、約140IU/mL、約150IU/mL、約160IU/mL、約170IU/mL、約180IU/mL、約190IU/mLもしくは約100IU/mLの濃度でインキュベートされる。いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-2、例えばヒト組換えIL-2の存在下でインキュベートされる。
いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、IL-7、例えばヒト組換えIL-7の存在下で、100IU/mL〜2,000IU/mL、500IU/mL〜1,000IU/mL、100IU/mL〜500IU/mL、500IU/mL〜750IU/mL、750IU/mL〜1,000IU/mLもしくは500IU/mL〜700IU/mL、または約100IU/mL〜約2,000IU/mL、約500IU/mL〜約1,000IU/mL、約100IU/mL〜約500IU/mL、約500IU/mL〜約750IU/mL、約750IU/mL〜約1,000IU/mLもしくは約500IU/mL〜約700IU/mLの濃度で、操作、例えば、トランスフェクトまたは形質導入される。特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、IL-7を用いて、50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mLもしくは1,000IU/mL、または約50IU/mL、約100IU/mL、約150IU/mL、約200IU/mL、約250IU/mL、約300IU/mL、約350IU/mL、約400IU/mL、約450IU/mL、約500IU/mL、約550IU/mL、約600IU/mL、約650IU/mL、約700IU/mL、約750IU/mL、約800IU/mL、約750IU/mL、約750IU/mL、約750IU/mLもしくは約1,000IU/mLの濃度で、操作、例えば、形質導入またはトランスフェクトされる。特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、600IU/mLまたは約600IU/mLのIL-7の存在下でインキュベートされる。
特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、IL-15、例えばヒト組換えIL-15の存在下で、1IU/mL〜500IU/mLもしくは約1IU/mL〜約500IU/mL、10IU/mL〜250IU/mLもしくは約10IU/mL〜約250IU/mL、50IU/mL〜200IU/mLもしくは約50IU/mL〜約200IU/mL、50IU/mL〜150IU/mLもしくは約50IU/mL〜約150IU/mL、75IU/mL〜125IU/mLもしくは約75IU/mL〜約125IU/mL、100IU/mL〜200IU/mLもしくは約100IU/mL〜約200IU/mLまたは10IU/mL〜100IU/mLもしくは約10IU/mL〜約100IU/mLの濃度で、操作、例えば、トランスフェクトまたは形質導入される。いくつかの態様では、細胞、例えば、刺激された細胞および/または刺激された細胞組成物の細胞は、組換えIL-15とともに、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mLもしくは100IU/mL、または約50IU/mL、約60IU/mL、約70IU/mL、約80IU/mL、約90IU/mL、約100IU/mL、約110IU/mL、約120IU/mL、約130IU/mL、約140IU/mL、約150IU/mL、約160IU/mL、約170IU/mL、約180IU/mL、約190IU/mLもしくは約100IU/mLの濃度でインキュベートされる。特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、100IU/mLまたは約100IU/mLの組換えIL-15、例えばヒト組換えIL-15の存在下でインキュベートされる。
特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞は、刺激条件下で、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下で操作される。特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15は組換え型である。特定の態様では、IL-2、IL-7および/またはIL-15はヒトである。特定の態様では、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15であるか、それらを含む。特定の態様では、細胞は、刺激条件下で、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下で、操作、例えば、形質導入またはトランスフェクトされる。
いくつかの態様では、提供される方法は、300×106個未満の細胞、例えば、刺激された細胞組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することに関連して使用される。特定の態様では、100×106個または約100×106個の細胞、例えば、刺激された細胞組成物の細胞が形質導入される。特定の態様では、細胞は生存細胞である。いくつかの態様では、形質導入は無血清培地中で行われる。いくつかの態様では、形質導入は、IL-2、IL-7およびIL-15の存在下で行われる。特定の態様では、細胞、例えば、刺激された細胞組成物の細胞は、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である、少なくとも80％もしくは約80％、少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも90％もしくは約90％、または少なくとも95％もしくは約95％の細胞を含有する。いくつかの態様では、形質導入は、24〜48時間、36〜12時間、18〜30時間、または24時間もしくは約24時間行われる。特定の態様では、形質導入工程は、インキュベーション、例えば、刺激条件下でのインキュベーションの着手または開始の2日以内、36時間以内または30時間以内に開始される。
1.形質導入のためのウイルスベクター粒子の調製
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージング、または産生する細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミドの形態で構築される。そのような例のいずれでも、組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸は、一般にウイルスゲノムの非必須領域などのウイルスベクターの領域に挿入または配置される。いくつかの態様では、核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスを産生する。
ウイルスベクターゲノムは、典型的には、パッケージング、または産生する細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミドの形態で構築される。そのような例のいずれでも、組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸は、一般にウイルスゲノムの非必須領域などのウイルスベクターの領域に挿入または配置される。いくつかの態様では、核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスを産生する。
様々な公知の方法のいずれかを使用して、ゲノムがウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含むレトロウイルス粒子を生成することができる。いくつかの態様では、第1に、構造タンパク質と、ウイルスベクター粒子を生成するのに必要な酵素とを包含するパッケージングプラスミド、第2に、ウイルスベクター自体、すなわち、導入される遺伝物質である少なくとも2つの成分がウイルスベースの遺伝子送達系の作製に関与する。これらの構成要素の一方または両方の設計に、バイオセーフティのためのセーフガードを導入することができる。
いくつかの態様では、パッケージングプラスミドは、エンベロープタンパク質以外のHIV-1などのあらゆるレトロウイルスタンパク質を含むことができる（Naldini et al.,1998）。他の態様では、ウイルスベクターは、HIVの一次トランスアクチベーターであるvpr、vif、vpuおよびnef、および/またはTatなどの病原性に関連するものなどの追加のウイルス遺伝子を欠き得る。いくつかの態様では、HIVベースのレンチウイルスベクターなどのレンチウイルスベクターは、親ウイルスの3つの遺伝子、gag、polおよびrevのみを含み、これにより、組換えによる野生型ウイルスの再構成の可能性が減少するか排除される。
いくつかの態様では、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするのに必要なあらゆる成分を含むパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、目的の1つまたは複数の配列、例えば組換え核酸に加えて、ウイルス成分をコードする1つまたは複数の遺伝子を含み得る。ただし、いくつかの局面では、標的細胞内でのゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株に別個に提供される。
いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、粒子を生成するために必要な成分を含む1つまたは複数のプラスミドベクターによりトランスフェクトされる。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、シス作用パッケージング配列であるLTRと、目的の配列、すなわちCARなどの抗原受容体をコードする核酸とを含むウイルスベクターゲノムを含むプラスミド;およびGag、polおよび/またはrevなどのウイルスの酵素的および/または構造的成分をコードする1つまたは複数のヘルパープラスミドによりトランスフェクトされる。いくつかの態様では、レトロウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝的成分を分離するために複数のベクターが利用される。いくつかのそのような態様では、パッケージング細胞に別個のベクターを提供することにより、普通なら複製能力のあるウイルスを生成する可能性がある組換え事象の可能性が減少する。いくつかの態様では、あらゆるレトロウイルス成分を有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。
いくつかの態様では、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を高めるために偽型化される。例えば、いくつかの態様では、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、VSV-G糖タンパク質を用いて偽型化され、これにより、形質導入され得る細胞型を拡大する広い細胞宿主範囲が提供される。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、例えば、シンドビスウイルスエンベロープ、GALVまたはVSV-Gなどの異種指向性の、ポリトロピックなまたは両種指向性のエンベロープを含むように、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドによりトランスフェクトされる。
いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAをレンチウイルスベクター粒子にパッケージングするためにトランスで必要とされる、ウイルス調節タンパク質および構造タンパク質を含む成分を提供する。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的なレンチウイルスベクター粒子を生成することができる任意の細胞株であり得る。いくつかの局面では、好適なパッケージング細胞株には、293（ATCC CCL X）細胞、293T細胞、HeLa（ATCC CCL 2）細胞、D17（ATCC CCL 183）細胞、MDCK（ATCC CCL 34）細胞、BHK（ATCC CCL-10）細胞およびCf2Th（ATCC CRL 1430）細胞が含まれる。
いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質を安定に発現する。例えば、いくつかの局面では、gag、pol、revおよび/または他の構造遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築することができる。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、異種タンパク質をコードする核酸分子および/またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターゲノムとともに、1つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子により一過性にトランスフェクトされ得る。
いくつかの態様では、ウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドおよび/またはヘルパープラスミドは、トランスフェクションまたは感染を介してパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含むウイルスベクター粒子を生成する。トランスフェクションまたは感染の方法は周知である。非限定的な例には、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる。
組換えプラスミドならびにレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列を特別な細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入すると、パッケージング配列は、培地に分泌され得るウイルス粒子に、組換えプラスミドのRNA転写物をパッケージングすることを可能にし得る。次いで、いくつかの態様では、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意で濃縮し、遺伝子導入に使用する。例えば、いくつかの局面では、パッケージング細胞株へのパッケージングプラスミドおよび導入ベクターのコトランスフェクションの後、ウイルスベクター粒子が培地から回収され、当業者が使用している標準的な方法によって滴定される。
いくつかの態様では、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入により、例示的なHEK 293T細胞株などのパッケージング細胞株内で産生させることができる。いくつかの態様では、パッケージング細胞は、トランスフェクトされ、および/またはgagおよびpolをコードするポリヌクレオチド、ならびに抗原受容体、例えばCARなどの組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、revタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより任意でおよび/またはさらにトランスフェクトされ、および/またはrevタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、パッケージング細胞株は、VSV-Gなどの非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより任意でおよび/またはさらにトランスフェクトされ、および/またはVSV-Gなどの非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような態様では、細胞、例えばHEK 293T細胞のトランスフェクションの約2日後、細胞上清には組換えレンチウイルスベクターが含まれ、これを回収し、滴定することができる。
回収および/または生成されたレトロウイルスベクター粒子は、記載された方法を使用して標的細胞を形質導入するために使用され得る。標的細胞に入ると、ウイルスRNAは逆転写され、核に移入され、宿主ゲノムに安定して組み込まれる。ウイルスRNAの組み込みの1日後または2日後に、組換えタンパク質、例えば、CARなどの抗原受容体の発現を検出することができる。
2.非ウイルスベクター
いくつかの態様では、組換え核酸は、エレクトロポレーションを介してT細胞に導入される（例えば、Chicaybam et al,（2013）PLoS ONE 8（3）:e60298 and Van Tedeloo et al.（2000）Gene Therapy 7（16）:1431-1437を参照）。いくつかの態様では、組換え核酸は転位を介してT細胞に導入される（例えば、Manuri et al.（2010）Hum Gene Ther 21（4）:427-437;Sharma et al.（2013）Molec Ther Nucl Acids 2,e74;およびHuang et al.（2009）Methods Mol Biol 506:115-126を参照）。免疫細胞に遺伝物質を導入して発現させる他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,New York.N.Y.に記載されている）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション;タングステン粒子促進微小粒子衝撃法（tungsten particle-facilitated microparticle bombardment）（Johnston,Nature,346:776-777（1990））;およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿物（Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034（1987））が含まれる。
いくつかの態様では、組換え核酸は、エレクトロポレーションを介してT細胞に導入される（例えば、Chicaybam et al,（2013）PLoS ONE 8（3）:e60298 and Van Tedeloo et al.（2000）Gene Therapy 7（16）:1431-1437を参照）。いくつかの態様では、組換え核酸は転位を介してT細胞に導入される（例えば、Manuri et al.（2010）Hum Gene Ther 21（4）:427-437;Sharma et al.（2013）Molec Ther Nucl Acids 2,e74;およびHuang et al.（2009）Methods Mol Biol 506:115-126を参照）。免疫細胞に遺伝物質を導入して発現させる他の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,New York.N.Y.に記載されている）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション;タングステン粒子促進微小粒子衝撃法（tungsten particle-facilitated microparticle bombardment）（Johnston,Nature,346:776-777（1990））;およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿物（Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034（1987））が含まれる。
組換え産物をコードする核酸の導入のための他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際特許出願公開番号WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
いくつかの態様では、組換え核酸は、トランスポゾンを介してT細胞に導入される。トランスポゾン（転位因子）は、ゲノム内の1つの遺伝子座から別の遺伝子座に移動することができる、DNAの可動セグメントである。これらの因子は、保存的な「カットアンドペースト」機構を介して移動する。トランスポザーゼは、トランスポゾンの元の位置からの切り出しを触媒し、ゲノムの他の場所で再組み込みを促進する。トランスポザーゼ欠損因子は、トランスポザーゼが別のトランスポザーゼ遺伝子から提供された場合に動員され得る。したがって、トランスポゾンを利用して、ウイルス形質導入系を使用せずに宿主ゲノムに外来DNAを組み込むことができる。哺乳動物細胞、例えば、ヒト初代白血球とともに使用するのに適したトランスポゾンの例には、限定されることなく、スリーピングビューティーおよびピギーバックが挙げられる。
トランスポゾンベースのトランスフェクションは、トランスポザーゼおよびトランスポゾンからなる2成分系である。いくつかの態様では、系は、外来DNA（本明細書においてカーゴDNAとも呼ばれる）、例えば、付随するトランスポザーゼによって認識される逆方向反復/直接反復（IR/DR）配列が隣接する、組換え受容体をコードする遺伝子を含むように操作されるトランスポゾンを含む。いくつかの態様では、非ウイルスプラスミドは、プロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする。宿主細胞にプラスミドをトランスフェクションすると、トランスポザーゼが一時的に発現するため、トランスフェクション後の初期にはトランスポザーゼが十分なレベルで発現して、トランスポゾンがゲノムDNAに組み込まれる。いくつかの態様では、トランスポザーゼ自体はゲノムDNAに組み込まれていないため、トランスポザーゼの発現は経時的に減少する。いくつかの態様では、トランスポザーゼの発現は、約4時間未満、約8時間未満、約12時間未満、約24時間未満、約2日未満、約3日未満、約4日未満、約5日未満、約6日未満、約7日未満、約2週間未満、約3週間未満、約4週間未満、約数週間未満または約8週間未満かけて、対応するトランスポゾンを組み込むのに十分なレベルで宿主細胞によって発現される。いくつかの態様では、少なくとも宿主が、カーゴDNAを切り出すことができる内因性トランスポザーゼを発現しないため、宿主のゲノムに導入されたカーゴDNAは、宿主のゲノムからその後除去されない。
スリーピングビューティー（SB）は、サケ科魚類ゲノムに含まれる休眠因子（dormant element）から再構築される、トランスポゾンのTc/1‐マリナースーパーファミリーの合成メンバーである。SBトランスポゾンベースのトランスフェクションは、トランスポザーゼと、TAジヌクレオチドへの正確な組み込みをもたらす逆方向反復/直接反復（IR/DR）配列を含むトランスポゾンとからなる2成分系である。トランスポゾンは、IR/DRが隣接する目的の発現カセットを用いて設計される。SBトランスポザーゼは、スリーピングビューティートランスポゾンのIRに位置する特異的な結合部位に結合する。SBトランスポザーゼは、触媒酵素（SB）の結合部位を含む逆方向末端反復が両側に隣接するカーゴ配列をコードする可動性因子であるトランスポゾンの組み込みを媒介する。SBがカットアンドペースト機構を介して脊椎動物染色体のTA標的ジヌクレオチドに遺伝子配列を挿入すると、安定な発現が得られる。この系は、初代ヒト末梢血白血球を含む様々な脊椎動物細胞型を操作するために使用されてきた。いくつかの態様では、細胞は、カーゴ遺伝子、例えば、SB IR配列が隣接する組換え受容体またはCARをコードする遺伝子を含むSBトランスポゾンと接触し、インキュベートされ、および/またはそれを用いて処理される。特定の態様では、トランスフェクトされる細胞は、カーゴ遺伝子、例えば、SB IR配列が隣接するCARをコードする遺伝子を含むSBトランスポゾンを含むプラスミドと接触し、インキュベートされ、および/またはそれを用いて処理される。特定の態様では、プラスミドは、SB IR配列が隣接しないSBトランスポザーゼをコードする遺伝子をさらに含む。
ピギーバック（PB）は、宿主、例えばヒトのゲノムDNAにカーゴDNAを組み込むために使用することができる別のトランスポゾン系である。PBトランスポザーゼは、トランスポゾンの両端に位置するPBトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、内容物を元の部位から効率的に移動させ、それらをTTAA染色体部位に効率的に組み込む。PBトランスポゾン系は、PBベクター内の2つのITR間の目的の遺伝子を標的ゲノムに動員することを可能にする。PB系は、初代ヒト細胞を含む様々な脊椎動物細胞型を操作するために使用されてきた。いくつかの態様では、トランスフェクトされる細胞は、カーゴ遺伝子、例えば、PB IR配列が隣接するCARをコードする遺伝子を含むPBトランスポゾンと接触し、インキュベートされ、および/またはそれを用いて処理される。特定の態様では、トランスフェクトされる細胞は、カーゴ遺伝子、例えば、PB IR配列が隣接するCARをコードする遺伝子を含むPBトランスポゾンを含むプラスミドと接触し、インキュベートされ、および/またはそれを用いて処理される。特定の態様では、プラスミドは、PB IR配列が隣接しないSBトランスポザーゼをコードする遺伝子をさらに含む。
いくつかの態様では、主題の方法で使用されるトランスポゾン/トランスポザーゼの様々な要素、例えば、SBベクターまたはPBベクターは、制限酵素切断、ライゲーションおよび分子クローニングの標準的な方法によって作製され得る。主題のベクターを構築するための1つのプロトコルには、以下の工程が含まれる。まず、最初の供給源、例えば、トランスポザーゼ遺伝子を含むベクターから、制限エンドヌクレアーゼを用いて、所望の成分のヌクレオチド配列ならびに外来配列を含む精製された核酸断片を切断する。次いで、従来の分離方法を使用して、例えば、アガロースゲル電気泳動によって、異なるサイズの不要な断片から、所望のヌクレオチド配列を含む断片を分離する。所望の断片をゲルから切り出し、適切な構成で一緒にライゲーションして、所望の配列、例えば、上記のような主題のベクターの様々な要素に対応する配列を含む環状核酸またはプラスミドを作製する。所望であれば、その後、原核宿主、例えば大腸菌（E.coli）内で、そのように構築された環状分子を増幅する。これらの工程に含まれる切断、プラスミド構築、細胞形質転換およびプラスミド作製の手順は当業者に周知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販されている。（例えば、R.Wu,Ed.,Methods in Enzymology,Vol.68,Academic Press,N.Y.（1979）;T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）;Catalog 1982-83,New England Biolabs,Inc.;Catalog 1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc.を参照されたい。主題の方法で使用されるベクターを構築する方法の例は、以下の実験のセクションに提供される。代表的なスリーピングビューティートランスポゾン系の調製は、WO98/40510およびWO99/25817にも開示されている）。
いくつかの態様では、トランスポゾンによる形質導入は、トランスポザーゼ遺伝子を含むプラスミドと、トランスポザーゼによって認識される逆方向反復/直接反復（IR/DR）配列が隣接するカーゴDNA配列を含むトランスポゾンを含むプラスミドとを用いて行われる。特定の態様では、カーゴDNA配列は、異種タンパク質、例えば、組換えT細胞受容体またはCARをコードする。いくつかの態様では、プラスミドは、トランスポザーゼおよびトランスポゾンを含む。いくつかの態様では、トランスポザーゼは、ユビキタスプロモーター、または標的細胞内のトランスポザーゼの発現を促進するのに適した任意のプロモーターの制御下にある。ユビキタスプロモーターには、限定されることなく、EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、ヒトβ-アクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIaおよびU6が含まれる。いくつかの態様では、カーゴDNAは、ゲノムDNAへのカーゴDNAの安定した組み込みを伴う細胞の選択を可能にする選択カセットを含む。好適な選択カセットには、限定されることなく、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子およびポリミキシンB耐性遺伝子をコードする選択カセットが含まれる。
いくつかの態様では、トランスポゾンによる形質導入のための成分、例えば、SBトランスポザーゼおよびSBトランスポゾンを含むプラスミドが、標的細胞に導入される。標的細胞の位置に応じて、標的細胞への系成分のインビトロまたはインビボ導入を提供し得る任意の簡便なプロトコルを使用してもよい。例えば、標的細胞が単離された細胞である場合、例えば、標準的な形質転換技術を使用することによって、標的細胞の生存能力を許容する細胞培養条件下で細胞に系が直接導入され得る。そのような技術には、必ずしも限定されることなく、ウイルス感染、形質転換、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクター送達などが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類と、形質転換が行われている状況（すなわち、インビトロ、エクスビボまたはインビボ）とに依存する。これらの方法の一般的な説明は、Ausubel,et al,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley＆Sons,1995に見出すことができる。
いくつかの態様では、トランスポゾンを運ぶベクターから逆方向反復隣接核酸を切り出し、その後、切り出された核酸を標的細胞のゲノムに組み込むのに十分な条件下で、多細胞生物、例えば、哺乳動物またはヒトの標的細胞に、SBトランスポゾンおよびSBトランスポザーゼの供給源が導入される。いくつかの態様は、必要なトランスポザーゼ活性が、導入されたトランスポゾンとともに標的細胞に存在することを確実にする工程をさらに含む。トランスポゾンベクター自体の構造、すなわち、ベクターがトランスポザーゼ活性を有する産物をコードする領域を含むかどうかに応じて、方法は、必要なトランスポザーゼ活性をコードする第2のベクターを標的細胞に導入することをさらに含み得る。
いくつかの態様では、細胞に導入されるトランスポゾンを含むベクター核酸の量およびトランスポザーゼをコードするベクター核酸の量は、標的細胞ゲノムへのトランスポゾン核酸の所望の切り出しおよび挿入を提供するのに十分である。このように、導入されるベクター核酸の量は、十分な量のトランスポザーゼ活性、および標的細胞に挿入されることが望まれる核酸の十分なコピー数を提供すべきである。標的細胞に導入されるベクター核酸の量は、使用される特定の導入プロトコル、例えば、使用される特定のエクスビボ投与プロトコルの効率に応じて変化する。
ベクターDNAが、必要なトランスポザーゼと組み合わせて標的細胞に入ると、逆方向反復が隣接するベクターの核酸領域、すなわち、スリーピングビューティートランスポザーゼが認識する逆方向反復の間に位置するベクター核酸が、提供されたトランスポザーゼを介してベクターから切り出され、標的細胞のゲノムに挿入される。このように、標的細胞へのベクターDNAの導入に続いて、続いて、トランスポザーゼ媒介性の切り出し、および標的細胞のゲノムへのベクターによって運ばれる外因性核酸の挿入が行われる。特定の態様では、ベクターは、SBトランスポゾンおよび/またはSBトランスポザーゼによりトランスフェクトされる細胞の少なくとも1％もしくは約1％、少なくとも2％もしくは約2％、少なくとも3％もしくは約3％、少なくとも4％もしくは約4％、少なくとも5％もしくは約5％、少なくとも6％もしくは約6％少なくとも7％もしくは約7％少なくとも8％もしくは約8％、少なくとも9％もしくは約9％、少なくとも10％もしくは約10％、少なくとも15％もしくは約15％、または少なくとも20％もしくは約20％のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様では、標的細胞ゲノムへの核酸の組み込みは安定であり、すなわち、ベクター核酸は、一過性の期間を超えて標的細胞ゲノム中に存在し続け、染色体遺伝物質の一部を標的細胞の子孫に伝える。
特定の態様では、トランスポゾンは、様々なサイズの核酸、すなわちポリヌクレオチドを標的細胞ゲノムに組み込むために使用される。いくつかの態様では、主題の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、0.1kb〜200kbもしくは約0.1kb〜約200kb、0.5kb〜100kbもしくは約0.5kb〜約100kb、1.0kb〜8.0kbもしくは約1.0kb〜約8.0kb、1.0〜200kbもしくは約1.0〜約200kb、1.0〜10kbもしくは約1.0〜約10kb、10kb〜50kbもしくは約10kb〜約50kb、50kb〜100kbもしくは約50kb〜約100kb、または100kb〜200kbもしくは約100kb〜約200kbの範囲である。いくつかの態様では、主題の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、1.0kb〜8.0kbまたは約1.0kb〜約8.0kbの範囲である。いくつかの態様では、主題の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、1.0〜200kbまたは約1.0〜約200kbの範囲である。特定の態様では、主題の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、1.0kb〜8.0kbまたは約1.0kb〜約8.0kbの範囲である。
D. 細胞の培養および/または拡大増殖
いくつかの態様において、提供される方法は、例えば増殖および/または拡大増殖を促進する条件の下で細胞を培養することによって、細胞を培養するための1つまたは複数の段階を含む。いくつかの態様において、細胞、例えば操作されたCD4+およびCD8+ T細胞は、細胞を遺伝子操作した後に、例えば、形質導入またはトランスフェクションにより組み換えポリペプチドを細胞に導入した後に、増殖および/または拡大増殖を促進する条件の下で培養される。特定の態様において、細胞は、刺激条件の下でインキュベートされた後に、および/または組み換えポリヌクレオチド、例えば組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドで形質導入またはトランスフェクションされた後に培養される。いくつかの態様において、培養は培養細胞を産生する。ある種の態様において、培養は、培養された組成物、例えば、培養された細胞の組成物を産生する。いくつかの態様において、1つまたは複数の処理段階は、選択された細胞集団のような、単離された細胞を刺激する段階を含む。インキュベーションは、本明細書において、例えば、I〜C項に記述される形質導入法の態様から生じる遺伝子工学のような、遺伝子工学の前であっても、またはそれに関連してもよい。いくつかの態様において、刺激は、例えば形質導入の前に、細胞の活性化および/または増殖をもたらす。
いくつかの態様において、提供される方法は、例えば増殖および/または拡大増殖を促進する条件の下で細胞を培養することによって、細胞を培養するための1つまたは複数の段階を含む。いくつかの態様において、細胞、例えば操作されたCD4+およびCD8+ T細胞は、細胞を遺伝子操作した後に、例えば、形質導入またはトランスフェクションにより組み換えポリペプチドを細胞に導入した後に、増殖および/または拡大増殖を促進する条件の下で培養される。特定の態様において、細胞は、刺激条件の下でインキュベートされた後に、および/または組み換えポリヌクレオチド、例えば組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドで形質導入またはトランスフェクションされた後に培養される。いくつかの態様において、培養は培養細胞を産生する。ある種の態様において、培養は、培養された組成物、例えば、培養された細胞の組成物を産生する。いくつかの態様において、1つまたは複数の処理段階は、選択された細胞集団のような、単離された細胞を刺激する段階を含む。インキュベーションは、本明細書において、例えば、I〜C項に記述される形質導入法の態様から生じる遺伝子工学のような、遺伝子工学の前であっても、またはそれに関連してもよい。いくつかの態様において、刺激は、例えば形質導入の前に、細胞の活性化および/または増殖をもたらす。
ある種の態様において、操作されたT細胞の細胞および/または組成物は、例えば本明細書において提供される方法、例えばI〜E項によって、細胞を回収および配合する前に、例えば、拡大増殖および/または増殖を促進する条件の下で培養される。特定の態様において、細胞は、例えば、本明細書において、例えばI〜C項において、提供される方法のいずれかによって、操作、形質導入、および/またはトランスフェクションされた後に培養される。特定の態様において、操作された組成物は、あらかじめ冷凍凍結および貯蔵されており、培養前に融解される。
ある種の態様において、細胞の組成物が培養される。特定の態様において、組成物の細胞の約もしくは少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ98%、少なくともおよそ99%、少なくともおよそ99.5%、少なくともおよそ99.9%、またはおよそ(at or at about) 100%がT CD3+細胞である。ある種の態様において、組成物の細胞の約もしくは少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ98%、少なくともおよそ99%、少なくともおよそ99.5%、少なくともおよそ99.9%、またはおよそ(at or at about) 100%が、CD4+またはCD8+ T細胞である細胞である。
いくつかの態様において、操作、トランスフェクション、および/または形質導入を受ける、または受けている細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%が培養される。特定の態様において、操作、トランスフェクション、および/または形質導入を受ける、または受けている細胞の全てまたはほぼ全てが培養される。
いくつかの態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mL、もしくは2,400 mLであるか、約100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mL、もしくは2,400 mLであるか、または少なくとも100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mL、もしくは2,400 mLである培地の容量中で培養される。いくつかの態様において、細胞は、異なる容量に後で調整される初期容量で培養される。特定の態様において、容量は培養中に後で調整される。特定の態様において、容量は、培養中に初期容量から増やされる。ある種の態様において、培養中に細胞が密度を達成すると、容量は増やされる。ある種の態様において、初期容量は500 mLであるか、または約500 mLである。
特定の態様において、細胞が培養中に密度または濃度を達成すると、容量は初期容量から増やされる。特定の態様において、細胞が0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mL、もしくは10×106個の細胞/mL、約0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mL、もしくは10×106個の細胞/mL、または少なくともおよそ0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mL、もしくは10×106個の細胞/mLの密度および/または濃度を達成すると、容量は増やされる。いくつかの態様において、密度および/または濃度は、培養物中の生存細胞のものである。いくつかの態様において、細胞が0.6×106個の細胞/mL、少なくとも0.6×106個の細胞/mL、または約0.6×106個の細胞/mLの密度および/または濃度を達成すると、容量は初期容量から増やされる。
いくつかの態様において、細胞は密度および/または濃度を達成し、容量は、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLだけ、約100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLだけ、または少なくともおよそ100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLだけ増やされる。いくつかの態様において、容量は500 mLだけ増やされる。特定の態様において、容量は500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mL、約500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mL、または少なくともおよそ500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLの容量に増やされる。ある種の態様において、容量は1,000 mLの容量に増やされる。ある種の態様において、容量は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10分ごとに、5 mL、10 mL、20 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、75 mL、80 mL、90 mLもしくは100 mL、少なくともおよそ5 mL、10 mL、20 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、75 mL、80 mL、90 mLもしくは100 mL、または約5 mL、10 mL、20 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、75 mL、80 mL、90 mLもしくは100 mLの速度で増やされる。ある種の態様において、速度は8分ごとに50 mLであるか、または約50 mLである。
いくつかの態様において、細胞、例えば、操作された細胞は最初に500 mLの容量で培養される。特定の態様において、培養中に細胞が0.6×106個の細胞/mLの密度または濃度に達すると、容量は1,000 mLに増やされる。
いくつかの態様において、培養は無血清培地中で実施される。いくつかの態様において、無血清培地は、規定されたおよび/または十分に規定された細胞培地である。ある種の態様において、無血清培地は、例えば阻害剤および/または成長因子を除去するためにろ過された、処理されている制御された培地である。いくつかの態様において、無血清培地はタンパク質を含有する。ある種の態様において、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質、および/または付着因子を含有しうる。
いくつかの態様において、提供される方法は、拡大増殖および/または増殖を促進する条件の下で細胞を培養するための段階に関連して用いられる。そのような条件には、集団における細胞の増殖、拡大増殖、活性化、および/もしくは生存を誘導するために、抗原曝露を模倣するために、ならびに/または組み換え抗原受容体の導入のためなどの、遺伝子操作のために細胞を刺激するためにデザインされた条件が含まれる。
いくつかの態様において、培養の条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組み換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するようにデザインされた任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
いくつかの態様において、刺激試薬は、培養に続いておよび/または培養の後に細胞から除去および/または分離される。ある種の態様において、刺激剤は、培養の後におよび/または培養に続いて、かつ細胞を配合する前に、例えば、培養されたアウトプット細胞のアウトプット組成物を配合する前に、細胞から除去および/または分離される。いくつかの態様において、刺激試薬は、本明細書において、例えばI-B-1項に記述される刺激試薬である。特定の態様において、刺激試薬は、本明細書において、例えばI-B-2項に記述されるように細胞から除去および/または分離される。
条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組み換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するようにデザインされた任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
いくつかの局面において、インキュベーションは、Riddellらの米国特許第6,040,1 77号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および/またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記述されているものなどの技法にしたがって実行される。
いくつかの態様において、培養の少なくとも一部分は、例えば、国際公開番号WO2016/073602に記述されているような、遠心回転の下で、遠心チャンバの内部空洞内で実行される。いくつかの態様において、遠心チャンバ内で実施されるインキュベーションの少なくとも一部分は、刺激および/または活性化を誘導するための1つまたは複数の試薬との混合を含む。いくつかの態様において、選択された細胞のような、細胞は、遠心チャンバ内で刺激条件または刺激剤と混合される。そのようなプロセスのいくつかの局面において、細胞培養プレートまたは他のシステムで同様の刺激を実施する場合に通常利用されるよりもはるかに少ない量の1つまたは複数の刺激条件または刺激剤と一定量の細胞が混合される。
いくつかの態様において、刺激剤は、遠心チャンバ内で、例えばチューブまたはバッグ内で定期的に振盪または回転させながら混合させることなく選択が実施される場合に同じ数の細胞または同じ容量の細胞の選択のほぼ同じまたは同様の効率を達成するために通常用いられるまたは必要であるものと考えられる刺激剤の量と比較して実質的に少ない(例えば5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%または80%以下の量である)量でチャンバの空洞内の細胞に添加される。いくつかの態様において、培養は、細胞および刺激剤への培養緩衝液の添加により実施され、例えば、10 mL〜2,000 mL、例えば少なくとももしくは少なくとも約10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、150 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLあるいは約10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、150 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLまたは10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、150 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1,000 mL、1,200 mL、1,400 mL、1,600 mL、1,800 mL、2,000 mL、2,200 mLもしくは2,400 mLの標的容量を達成する。いくつかの態様において、細胞への添加前に、インキュベーション緩衝液および刺激剤が予め混合される。いくつかの態様において、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞に別々に添加される。いくつかの態様において、刺激インキュベーションは、周期的に穏やかな混合条件で実行され、エネルギー的に有利な相互作用を促進するのに役立ち、それにより、細胞の刺激および活性化を達成しながら、より少ない全体的な刺激剤の使用を可能にすることができる。
いくつかの態様において、インキュベーションは、概して、混合条件下、例えば、概ね比較的低い力または速度、例えば、細胞をペレットにするために用いられるものよりも低い速度、例えば、600 rpmまたは約600 rpm〜1700 rpmまたは約1700 rpm (例えば、600 rpmもしくは約600 rpmもしくは少なくとも600 rpm、1000 rpmもしくは約1000 rpmもしくは少なくとも1000 rpm、または1500 rpmもしくは約1500 rpmもしくは少なくとも1500 rpm、または1700 rpmもしくは約1700 rpmもしくは少なくとも1700 rpm)、例えば、チャンバまたは他の容器のサンプルまたは壁における、80 gまたは約80 g〜100 gまたは約100 g (例えば、80 gもしくは約80 gもしくは少なくとも80 g、85 gもしくは約85 gもしくは少なくとも85 g、90 gもしくは約90 gもしくは少なくとも90 g、95 gもしくは約95 gもしくは少なくとも95 g、または100 gもしくは約100 gもしくは少なくとも100 g)のRCFでのスピンの存在下で実行される。いくつかの態様において、そのような低い速度でのスピンと、それに続く静止時期との期間(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10秒間のスピンおよび/または静止、例えば、約1または2秒間のスピンと、それに続く約5、6、7、または8秒間の静止)を順々に繰り返してスピンが実行される。
いくつかの態様において、例えば刺激剤との、インキュベーションの全持続時間は、1時間〜96時間、1時間〜72時間、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間もしくは12時間〜24時間または約1時間〜96時間、1時間〜72時間、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間もしくは12時間〜24時間、例えば少なくともまたは少なくとも約6時間、12時間、18時間、24時間、36時間または72時間である。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、境界も含めて1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間もしくは12時間〜24時間または約1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間もしくは12時間〜24時間の時間である。
特定の態様において、濃縮T細胞の組成物は、1つまたは複数のサイトカインの存在下で培養される。ある種の態様において、1つまたは複数のサイトカインは組み換えサイトカインである。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組み換えサイトカインである。ある種の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合するおよび/または結合することができる。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン-2 (IL-2)、インターロイキン-4 (IL-4)、インターロイキン-7 (IL-7)、インターロイキン-9 (IL-9)、インターロイキン12 (IL-12)、インターロイキン15 (IL-15)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるか、またはそれを含む。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7あるか、またはそれを含む。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、組み換えIL-2であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、サイトカイン、例えば、組み換えヒトサイトカインの存在下、およそ1 IU/mL〜およそ2,000 IU/mL、およそ10 IU/mL〜およそ100 IU/mL、およそ50 IU/mL〜およそ200 IU/mL、およそ100 IU/mL〜およそ500 IU/mL、およそ100 IU/mL〜およそ1,000 IU/mL、およそ500 IU/mL〜およそ2,000 IU/mL、またはおよそ100 IU/mL〜およそ1,500 IU/mLの濃度で培養される。
いくつかの態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、例えば、無血清培地中、およそ1 IU/mL〜およそ500 IU/mL、およそ10 IU/mL〜およそ400 IU/mL、およそ100 IU/mL〜およそ300 IU/mL、およそ100 IU/mL〜およそ250 IU/mL、およそ150 IU/mL〜およそ300 IU/mL、およそ200 IU/mL〜およそ400 IU/mL、またはおよそ150 IU/mL〜およそ300 IU/mLの濃度で、IL-2、例えば、ヒト組み換えIL-2とともに培養される。特定の態様において、細胞、例えば、インプット組成物の細胞は、100 IU/mL、120 IU/mL、140 IU/mL、160 IU/mL、180 IU/mL、200 IU/mL、220 IU/mL、240 IU/mL、260 IU/mL、280 IU/mL、300 IU/mL、320 IU/mL、340 IU/mL、360 IU/mL、380 IU/mL、もしくは400 IU/mLの、約100 IU/mL、120 IU/mL、140 IU/mL、160 IU/mL、180 IU/mL、200 IU/mL、220 IU/mL、240 IU/mL、260 IU/mL、280 IU/mL、300 IU/mL、320 IU/mL、340 IU/mL、360 IU/mL、380 IU/mL、もしくは400 IU/mLの、または少なくともおよそ100 IU/mL、120 IU/mL、140 IU/mL、160 IU/mL、180 IU/mL、200 IU/mL、220 IU/mL、240 IU/mL、260 IU/mL、280 IU/mL、300 IU/mL、320 IU/mL、340 IU/mL、360 IU/mL、380 IU/mL、もしくは400 IU/mLの濃度の組み換えIL-2とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞、例えば、インプット細胞は、200 IU/mLまたは約200 IU/mLの組み換えIL-2、例えば、ヒト組み換えIL-2の存在下で培養される。
いくつかの態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、例えば、無血清培地中、およそ100 IU/mL〜およそ2,000 IU/mL、およそ500 IU/mL〜およそ1,500 IU/mL、およそ600 IU/mL〜およそ1200 IU/mL、およそ800 IU/mL〜およそ1600 IU/mL、およそ900 IU/mL〜およそ1,800 IU/mL、またはおよそ1,000 IU/mL〜およそ1,500 IU/mLの濃度で、組み換えIL-7、例えば、ヒト組み換えIL-7とともに培養される。特定の態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、200 IU/mL、300 IU/mL、400 IU/mL、500 IU/mL、600 IU/mL、700 IU/mL、800 IU/mL、900 IU/mL、1,000 IU/mL、1,200 IU/mL、1,400 IU/mL、1,600 IU/mL、1,800 IU/mL、2,000 IU/mL、2,200 IU/mLもしくは2,400 IU/mL、少なくともおよそ200 IU/mL、300 IU/mL、400 IU/mL、500 IU/mL、600 IU/mL、700 IU/mL、800 IU/mL、900 IU/mL、1,000 IU/mL、1,200 IU/mL、1,400 IU/mL、1,600 IU/mL、1,800 IU/mL、2,000 IU/mL、2,200 IU/mLもしくは2,400 IU/mL、または約200 IU/mL、300 IU/mL、400 IU/mL、500 IU/mL、600 IU/mL、700 IU/mL、800 IU/mL、900 IU/mL、1,000 IU/mL、1,200 IU/mL、1,400 IU/mL、1,600 IU/mL、1,800 IU/mL、2,000 IU/mL、2,200 IU/mLもしくは2,400 IU/mLの濃度でIL-7とともにインキュベートされる。特定の態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、1,200 IU/mLまたは約1,200 IU/mLのIL-7の存在下で培養される。
いくつかの態様において、細胞、例えば、操作された細胞は、例えば、無血清培地中、およそ1 IU/mL〜およそ500 IU/mL、およそ10 IU/mL〜およそ400 IU/mL、およそ100 IU/mL〜およそ300 IU/mL、およそ100 IU/mL〜およそ250 IU/mL、およそ150 IU/mL〜およそ300 IU/mL、およそ200 IU/mL〜およそ400 IU/mL、またはおよそ150 IU/mL〜およそ150 IU/mLの濃度で、IL-15、例えば、ヒト組み換えIL-15とともに培養される。特定の態様において、細胞、例えば、操作された組成物の細胞は、100 IU/mL、120 IU/mL、140 IU/mL、160 IU/mL、180 IU/mL、200 IU/mL、220 IU/mL、240 IU/mL、260 IU/mL、280 IU/mL、300 IU/mL、320 IU/mL、340 IU/mL、360 IU/mL、380 IU/mL、もしくは400 IU/mL、約100 IU/mL、120 IU/mL、140 IU/mL、160 IU/mL、180 IU/mL、200 IU/mL、220 IU/mL、240 IU/mL、260 IU/mL、280 IU/mL、300 IU/mL、320 IU/mL、340 IU/mL、360 IU/mL、380 IU/mL、もしくは400 IU/mL、または少なくともおよそ100 IU/mL、120 IU/mL、140 IU/mL、160 IU/mL、180 IU/mL、200 IU/mL、220 IU/mL、240 IU/mL、260 IU/mL、280 IU/mL、300 IU/mL、320 IU/mL、340 IU/mL、360 IU/mL、380 IU/mL、もしくは400 IU/mLの濃度の組み換えIL-15とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞、例えば、操作されたT細胞は、200 IU/mLまたは約200 IU/mLの組み換えIL-15、例えば、ヒト組み換えIL-15の存在下で培養される。
特定の態様において、細胞、例えば、操作された細胞および/または操作された組成物由来の細胞は、例えば、無血清培地中、IL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下で培養される。いくつかの態様において、IL-2、IL-7、および/またはIL-15は組み換えである。ある種の態様において、IL-2、IL-7、および/またはIL-15はヒトのものである。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組み換えIL-2、IL-7、および/またはIL-15であるか、またはそれらを含む。ある種の態様において、細胞は、組み換えIL-2、IL-7、およびIL-15の存在下で培養される。
特定の態様において、培養は閉鎖システムで実施される。ある種の態様において、培養は無菌条件下、閉鎖システムで実施される。特定の態様において、培養は、提供されたシステムの1つまたは複数の段階と同じ閉鎖システムで実施される。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の組成物は、閉鎖システムから取り除かれ、培養のためにバイオリアクタに配置および/または接続される。培養に適したバイオリアクタの例としては、GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20 | 50、Finesse SmartRocker Bioreactor Systems、およびPall XRS Bioreactor Systemsが挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、バイオリアクタは、培養段階の少なくとも一部分の間に細胞を灌流および/または混合するために用いられる。
いくつかの態様において、閉鎖されながら、接続されながら、および/またはバイオリアクタの制御下で培養された細胞は、バイオリアクタなしで培養された細胞、例えば、混合、揺動、運動、および/または灌流なしなどの静的条件下で培養された細胞よりも急速に培養中に拡大増殖を受ける。いくつかの態様において、閉鎖されながら、接続されながら、および/またはバイオリアクタの制御下で培養された細胞は、21日、14日、10日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日、60時間、48時間、36時間、24時間、または12時間以内に閾値の拡大増殖、細胞数、濃度および/または密度に到達するか、またはそれらを達成する。いくつかの態様において、閉鎖されながら、接続されながら、および/またはバイオリアクタの制御下で培養された細胞は、閉鎖されながら、接続されながら、および/またはバイオリアクタの制御下で細胞が培養されない例示的および/または代替的プロセスで培養される細胞よりも少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ100%、少なくともおよそ150%、少なくともおよそ1倍、少なくともおよそ2倍、少なくともおよそ3倍、少なくともおよそ4倍、少なくともおよそ5倍での閾値の拡大増殖、濃度、細胞数および/または密度に到達するか、またはそれらを達成する。
いくつかの態様において、混合は、揺動および/または運動であるか、またはそれらを含む。場合によっては、バイオリアクタは運動または揺動に供することができ、いくつかの局面において、酸素移動を増加させることができる。バイオリアクタの運動は、水平軸に沿った回転、垂直軸に沿った回転、バイオリアクタの傾いたもしくは斜めになった水平軸に沿った揺動運動、またはそれらの任意の組み合わせを含みうるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分は、揺動しながら実行される。揺動速度および揺動角度は、所望の攪拌を達成するように調整されうる。いくつかの態様において、揺動角度は、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°または1°である。ある種の態様において、揺動角度は6〜16°である。他の態様において、揺動角度は7〜16°である。他の態様において、揺動角度は8〜12°である。いくつかの態様において、揺動速度は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 rpmである。いくつかの態様において、揺動速度は境界を含めて、4〜12 rpm、例えば4〜6 rpmである。
いくつかの態様において、バイオリアクタは、0.01 L/分、0.05 L/分、0.1 L/分、0.2 L/分、0.3 L/分、0.4 L/分、0.5 L/分、1.0 L/分、1.5 L/分もしくは2.0 L/分または2.0 L/分超、約0.01 L/分、0.05 L/分、0.1 L/分、0.2 L/分、0.3 L/分、0.4 L/分、0.5 L/分、1.0 L/分、1.5 L/分もしくは2.0 L/分または2.0 L/分超、あるいは少なくともおよそ0.01 L/分、0.05 L/分、0.1 L/分、0.2 L/分、0.3 L/分、0.4 L/分、0.5 L/分、1.0 L/分、1.5 L/分もしくは2.0 L/分または2.0 L/分超の定常空気流で37℃または37℃付近の温度および5%または5%付近のCO2レベルを維持する。ある種の態様において、培養の少なくとも一部分は、例えば、培養の開始に関するタイミングおよび/または培養細胞の密度に依り、750 mL/日および/または1500 mL/日の速度でなどの、灌流で実施される。いくつかの態様において、細胞培養物拡大増殖の少なくとも一部分は、6 RMPまたは10 RPMなどの、5〜15 RPMの速度のような、一定の揺動速度で、6°などの、5°〜10°の角度のような、揺動運動で実施される。
いくつかの態様において、培養段階の少なくとも一部分は、一定の灌流、例えば遅い定常速度での灌流の下で実施される。いくつかの態様において、灌流は、液体、例えば使用された培地の流出、および新鮮な培地の流入であるか、またはそれらを含む。ある種の態様において、灌流は、使用された培地を新鮮な培地と交換する。いくつかの態様において、培養の少なくとも一部分は灌流下、100 mL/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1500 mL 日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日または約100 mL/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1500 mL 日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日あるいは少なくともおよそ100 mL/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1500 mL 日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日の定常速度で実施される。
特定の態様において、培養は灌流のない条件下で開始され、灌流は培養の開始または始動後12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間もしくは72時間超または約12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間もしくは72時間超または少なくとも12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間もしくは72時間超のような、設定のおよび/または所定の時間後に開始される。特定の態様において、細胞の密度または濃度が設定または所定の密度または濃度に達した場合に灌流が開始される。いくつかの態様において、培養された細胞が0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、約0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、あるいは少なくともおよそ0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞の密度または濃度に達した場合に灌流が開始される。
特定の態様において、灌流は、培養中に異なる速度で実施される。例えば、いくつかの態様において、灌流の速度が培養細胞の密度および/または濃度に依存する場合。ある種の態様において、細胞が設定または所定の密度または濃度に到達した場合に灌流速度が増やされる。灌流速度は変化し、例えば、培養中に1回、2回、3回、4回、5回、5回超、10回超、15回超、20回超、25回超、50回超、または100回超、1つの定常灌流速度から増加した定常灌流速度に変化しうる。いくつかの態様において、細胞が0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、約0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、あるいは少なくともおよそ0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞の設定または所定の細胞密度または濃度に到達した場合に定常灌流速度が増やされる。
いくつかの態様において、培養は灌流のない条件下で開始され、細胞の密度または濃度が設定または所定の密度または濃度に達した場合に灌流が開始される。いくつかの態様において、細胞の密度または濃度が設定または所定の密度または濃度に達した場合に100 mL/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日、約100 mL/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日、または少なくともおよそ100 mL/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日の速さで灌流が開始される。いくつかの態様において、培養された細胞が0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、約0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、あるいは少なくともおよそ0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞の密度または濃度に達した場合に灌流が開始される。いくつかの態様において、細胞が300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mLもしくは1000 mL、約300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mLもしくは1000 mL、または少なくともおよそ300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mLもしくは1000 mLの容量で培養される場合に灌流が実施される。いくつかの態様において、容量は1000 mLである。
ある種の態様において、培養の少なくとも一部はある種の速さでの灌流で実施され、細胞の密度または濃度が設定または所定の密度または濃度に達した場合に灌流速度が100 ml/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日、約100 ml/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日、または少なくともおよそ100 ml/日、200 mL/日、250 mL/日、275 mL/日、290 mL/日、300 mL/日、350 mL/日、400 mL/日、450 mL/日、500 mL/日、550 mL/日、575 mL/日、580 mL/日、600 mL/日、650 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、850 mL/日、900 mL/日、950 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1160 mL/日、1200 mL/日、1400 mL/日、1600 mL/日、1800 mL/日、2000 mL/日、2200 mL/日もしくは2400 mL/日に増やされる。いくつかの態様において、培養された細胞が0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、約0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞、あるいは少なくともおよそ0.1×106個の細胞/mL、0.2×106個の細胞/mL、0.4×106個の細胞/mL、0.6×106個の細胞/mL、0.8×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mL、1.2×106個の細胞/mL、1.4×106個の細胞/mL、1.6×106個の細胞/mL、1.8×106個の細胞/mL、2.0×106個の細胞/mL、2.5×106個の細胞/mL、3.0×106個の細胞/mL、3.5×106個の細胞/mL、4.0×106個の細胞/mL、4.5×106個の細胞/mL、5.0×106個の細胞/mL、6×106個の細胞/mL、8×106個の細胞/mLもしくは10×106個の細胞/mL、またはその生存細胞の密度または濃度に達した場合に灌流が開始される。
いくつかの態様において、ある種の態様において、培養は灌流のないまたはある種の速さでの灌流のいずれかの条件下で開始され、細胞の密度または濃度が0.61×106個の細胞/mL、約0.61×106個の細胞/mL、または少なくとも0.61×106個の細胞/mLの濃度に達した場合に灌流速度が750 mL/日、約750 mL/日、または少なくとも750 mL/日に増やされる。ある種の態様において、細胞が1000 mL、約1000 mL、または少なくとも1000 mLの容量で培養される場合に細胞の密度または濃度が0.61×106個の細胞/mL、約0.61×106個の細胞/mL、または少なくとも0.61×106個の細胞/mLの濃度に達した場合に750 mL/日、約750 mL/日、または少なくとも750 mL/日の速さで細胞が灌流される。いくつかの態様において、細胞の密度または濃度が2×106個の細胞/mL、約2×106個の細胞/mL、または少なくとも2×106個の細胞/mLの濃度に達した場合に灌流速度が1500 mL/日、約1500 mL/日、または少なくとも1500 mL/日に増やされる。
いくつかの局面において、例えば、500 mL/日、600 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、900 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1200 mL/日、1300 mL/日、1400 mL/日、1500 mL/日、1600 mL/日、1700 mL/日、1800 mL/日、1900 mL/日もしくは2000 mL/日、約500 mL/日、600 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、900 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1200 mL/日、1300 mL/日、1400 mL/日、1500 mL/日、1600 mL/日、1700 mL/日、1800 mL/日、1900 mL/日もしくは2000 mL/日、または少なくともおよそ500 mL/日、600 mL/日、700 mL/日、750 mL/日、800 mL/日、900 mL/日、1000 mL/日、1100 mL/日、1200 mL/日、1300 mL/日、1400 mL/日、1500 mL/日、1600 mL/日、1700 mL/日、1800 mL/日、1900 mL/日もしくは2000 mL/日での、高速の灌流でなどの、灌流での培養は、例えば細胞に対しての栄養素の利用可能性を増加および/もしくは最適化すること、pHを維持すること、ならびに/または細胞老廃物を最小限に抑えることにより、細胞の健全性、生存性、生存、増殖、拡大増殖、および/または機能を改善する。
いくつかの局面において、灌流での培養は、残留プロセス試薬の除去および/または低減を改善しうる。ある種の態様において、残留プロセス試薬は、プロセス中またはプロセス後に実施されるアッセイ法、測定、および/または試験の解釈を妨害および/または複雑化する可能性がある。そのようなアッセイ法は、無菌性、内毒素、残留ビーズ、ウイルスDNA、例えば複製可能なウイルスDNA、細胞数、生存性アッセイ、細胞健常性アッセイ、および細胞活性アッセイに対する測定を含みうるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、より高い灌流速度は、より低い灌流速度よりも多くの残留プロセス試薬を取り除く。
いくつかの態様において、濃縮された細胞の組成物は、界面活性剤の存在下で培養される。特定の態様において、組成物の細胞の培養は、例えば、混合、揺動、運動、および/または灌流のために、培養中に起こりうるせん断応力の量を低減する。いくつかの態様において、界面活性剤は、液体および/または固体の表面張力を低減する作用物質であるか、またはそれを含む。例えば、界面活性剤は、脂肪アルコール(例えば、ステリルアルコール)、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル(例えば、Triton X-100)、またはポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル(例えば、ポリソルベート20、40、60)を含む。いくつかの態様において、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、またはそれらに添加される非イオン性界面活性剤であるか、またはそれらを含む。ある種の態様において、界面活性剤は、ポリソルベート80 (PS80)、ポリソルベート20 (PS20)、ポロキサマー188 (P188)からなる群より選択される。ある種の態様において、界面活性剤は、ポロキサマー、例えば、ポロキサマー188である。
ある種の態様において、培養は、界面活性剤の非存在下で実施される。
特定の態様において、細胞が閾値量、濃度、および/または拡大増殖を達成した場合に培養が終了する。いくつかの態様において、細胞が細胞の閾値全量、例えば、閾値細胞数を達成した場合に培養が終了する。いくつかの態様において、閾値細胞数は、50×106個の細胞、100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞、5000×106個の細胞、3500×106個の細胞、10,000×106個の細胞、12,000×106個の細胞、15,000×106個の細胞もしくは20,000×106個の細胞、またはその生存細胞であるか、あるいは約50×106個の細胞、100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞、5000×106個の細胞、3500×106個の細胞、10,000×106個の細胞、12,000×106個の細胞、15,000×106個の細胞もしくは20,000×106個の細胞、またはその生存細胞であるか、あるいは少なくともおよそ50×106個の細胞、100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞、5000×106個の細胞、3500×106個の細胞、10,000×106個の細胞、12,000×106個の細胞、15,000×106個の細胞もしくは20,000×106個の細胞、またはその生存細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、3500×106個の細胞もしくは5500×106個の細胞であるか、または約3500×106個の細胞もしくは5500×106個の細胞であるか、または少なくとも3500×106個の細胞もしくは5500×106個の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、5500×106個の細胞であるか、または約5500×106個の細胞であるか、または約5500×106個未満の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、3500×106個の細胞であるか、または約3500×106個の細胞であるか、または約3500×106個未満の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、3000×106個の細胞であるか、または約3000×106個の細胞であるか、または約3000×106個未満の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、2500×106個の細胞であるか、または約2500×106個の細胞であるか、または少なくとも2500×106個の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、2000×106個の細胞であるか、または約2000×106個の細胞であるか、または少なくとも2000×106個の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、3000×106個の細胞であるか、または約3000×106個の細胞であるか、または少なくとも3000×106個の細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数は、およそ3000×106個の細胞〜およそ(about at or) 2000×106個の細胞である。特定の態様において、細胞が閾値細胞数を達成した場合に培養が終了する。いくつかの態様において、閾値細胞数が達成された後、培養は6時間、12時間、24時間、36時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日またはそれ以上の日数で、約6時間、12時間、24時間、36時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日またはそれ以上の日数で、あるいはおよそ6時間、12時間、24時間、36時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日またはそれ以上の日数以内に終了する。特定の態様において、閾値細胞数が達成された後、培養は1日または約1日で終了する。ある種の態様において、閾値細胞数が活性になった後、培養は18〜30時間で終了する。
特定の態様において、細胞が閾値細胞密度または濃度を達成した場合に培養が終了する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の閾値細胞密度または濃度は、1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞であるか、または約1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞であるか、または少なくともおよそ1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物に対する平均または中央値の閾値細胞密度または濃度は、1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞であるか、または約1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞であるか、または少なくともおよそ1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞である。
特定の態様において、細胞が閾値量、濃度、および/または拡大増殖を達成する約1日前または約24時間前(例えば、細胞が細胞の閾値全量、例えば、閾値細胞数を達成する前)、細胞の全量は50×106個の細胞、100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞、5000×106個の細胞、3500×106個の細胞、10,000×106個の細胞、12,000×106個の細胞、15,000×106個の細胞もしくは20,000×106個の細胞またはその生存細胞であるか、あるいは約50×106個の細胞、100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞、5000×106個の細胞、3500×106個の細胞、10,000×106個の細胞、12,000×106個の細胞、15,000×106個の細胞もしくは20,000×106個の細胞またはその生存細胞であるか、あるいは少なくともおよそ50×106個の細胞、100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞、5000×106個の細胞、3500×106個の細胞、10,000×106個の細胞、12,000×106個の細胞、15,000×106個の細胞もしくは20,000×106個の細胞またはその生存細胞である。いくつかの態様において、細胞が閾値細胞数を達成する約1日前または約24時間前、細胞の全量はおよそ100×106個の細胞〜およそ4000×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞が閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ3000×106個未満の細胞である。いくつかの態様において、細胞が閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ500×106個の細胞〜およそ1500×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞が閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ500×106個の細胞〜およそ1000×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞が閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ900×106個の細胞であるか、または少なくとも900×106個の細胞である。
特定の態様において、閾値細胞数は、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞もしくはその生存細胞であるか、または約1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞もしくはその生存細胞であるか、または少なくともおよそ1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞、1600×106個の細胞、1800×106個の細胞、2000×106個の細胞、2500×106個の細胞、3000×106個の細胞、3500×106個の細胞もしくはその生存細胞であるが、細胞が閾値細胞数を達成する約1日前または約24時間前、細胞の全量は100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞もしくは1600×106個の細胞、またはその生存細胞であるか、あるいは約100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞もしくは1600×106個の細胞、またはその生存細胞であるか、あるいは少なくとも100×106個の細胞、200×106個の細胞、300×106個の細胞、400×106個の細胞、600×106個の細胞、800×106個の細胞、1000×106個の細胞、1200×106個の細胞、1400×106個の細胞もしくは1600×106個の細胞、またはその生存細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数はおよそ2000×106個の細胞〜およそ3000×106個の細胞、またはその生存細胞であるが、細胞が閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ500×106個の細胞〜およそ1500×106個の細胞、またはその生存細胞である。いくつかの態様において、閾値細胞数はおよそ2500×106個の細胞、またはその生存細胞であるが、細胞が閾値細胞数を達成する約1日前または約24時間前、細胞の全量はおよそ900×106個の細胞、またはその生存細胞である。
いくつかの態様において、培養は、細胞が閾値量、密度、および/または拡大増殖を達成するのに必要な時間量にわたって実施される段階である。いくつかの態様において、培養は、6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、5.5日間、6日間、7日間、7.5日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間または約6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、5.5日間、6日間、7日間、7.5日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間実施されるか、あるいはおよそ6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、5.5日間、6日間、7日間、7.5日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間未満実施される。特定の態様において、異なる生体サンプルから単離、濃縮、および/または選択された濃縮T細胞の複数の別個の組成物の細胞が閾値密度を達成するために必要とされる平均時間量は、6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、6日間、7日間、7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間であるか、約6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、6日間、7日間、7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間であるか、またはおよそ6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、6日間、7日間、7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間未満である。ある種の態様において、異なる生体サンプルから単離、濃縮、および/または選択された濃縮T細胞の複数の別個の組成物の細胞が閾値密度を達成するために必要とされる平均時間量は、6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、6日間、7日間、7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間であるか、約6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、6日間、7日間、7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間であるか、またはおよそ6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、2日間、3日間4日間、5日間、6日間、7日間、7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間もしくは4週間未満である。
いくつかの態様において、細胞が約5500×106個の細胞の、細胞の閾値全量、例えば閾値細胞数を達成した場合に培養が終了し、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量は、約6日〜約7日または6日〜7日である。
いくつかの態様において、細胞がおよそ5500×106個の細胞の、細胞の閾値全量、例えば閾値細胞数を達成した場合に(例えば、細胞を収集する準備ができている場合に)培養が終了する。いくつかの態様において、細胞が細胞の閾値量、例えば、閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ3000×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞がおよそ5500×106個の細胞の閾値細胞数を達成する前日に、細胞の全量はおよそ3000×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量は、およそ6日〜およそ10日または6日〜10日、例えばおよそ7日〜およそ10日または7日〜10日である。いくつかの態様において、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量の中央値は、およそ8日であるか、または8日である。
いくつかの態様において、細胞がおよそ2000×106個の細胞、およそ2500×106個の細胞、またはおよそ3000×106個の細胞の、細胞の閾値全量、例えば閾値細胞数を達成した場合に培養が終了し、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量は、およそ4日〜およそ5日、およそ5日、または5日である。いくつかの態様において、閾値細胞数はおよそ3000×106個の細胞〜およそ2000×106個の細胞であり、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量は、およそ4日〜およそ5日、およそ5日、または5日である。
いくつかの態様において、細胞がおよそ2500×106個の細胞の、細胞の閾値全量、例えば閾値細胞数を達成した場合に(例えば、細胞を収集する準備ができている場合に)培養が終了する。いくつかの態様において、細胞が細胞の閾値量、例えば、閾値細胞数を達成するおよそ1日前またはおよそ24時間前、細胞の全量はおよそ900×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞がおよそ2500×106個の細胞の閾値細胞数を達成する前日に、細胞の全量はおよそ900×106個の細胞である。いくつかの態様において、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量は、およそ6日〜およそ9日または6日〜9日である。いくつかの態様において、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量は、およそ5日〜およそ9日または5日〜9日である。いくつかの態様において、細胞が培養の開始から閾値量を達成するために必要とされる時間量の中央値は、およそ7日であるか、または7日である。
いくつかの態様において、培養は、少なくとも最低限の時間量の間実施される。いくつかの態様において、培養は、最低限の時間量の前に閾値が達成される場合でさえも、少なくとも14日、少なくとも12日、少なくとも10日、少なくとも7日、少なくとも6日、少なくとも5日、少なくとも4日、少なくとも3日、少なくとも2日、少なくとも36時間、少なくとも24時間、少なくとも12時間、または少なくとも6時間実施される。いくつかの態様において、最低限の時間量は7日、8日、9日もしくは10日であるか、約7日、8日、9日もしくは10日であるか、または少なくとも7日、8日、9日もしくは10日である。ある種の態様において、最低限の時間量は8日である。
ある種の態様において、培養は、少なくとも最低限の時間量の間実施される。ある種の態様において、培養は、刺激試薬下でのインキュベーションの開始または始動から、例えば、細胞が刺激試薬と接触されたときから; インプット組成物を作出するために、細胞および/または細胞の組成物、例えば、CD4+およびCD8+細胞が混合されたときから、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日が経過するまでか、約8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日が経過するまでか、または少なくとも8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日が経過するまで実施される。
ある種の態様において、培養細胞はアウトプット細胞である。いくつかの態様において、培養された濃縮T細胞の組成物は、濃縮T細胞のアウトプット組成物である。特定の態様において、培養されたCD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞は、アウトプットCD4+および/またはCD8+ T細胞である。
ある種の態様において、1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、培養もしくは拡大増殖の間に行われる倍加の前に、約1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、培養もしくは拡大増殖の間に行われる倍加の前に、または少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、培養もしくは拡大増殖の間に行われる倍加の前に、細胞が収集される。特定の態様において、細胞倍加の量は、培養または拡大増殖プロセスの異なる時間または段階でのような、異なる時点で集団中の生存細胞の数を測定することによって計算されうる。特定の態様において、細胞倍加は、ある時点での生存細胞の全量を、より早い時点で存在する生存細胞の総数と比較することによって計算することができる。ある種の態様において、1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、培養もしくは拡大増殖の間に行われる倍加の前に、約1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、培養もしくは拡大増殖の間に行われる倍加の前に、または少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、8回、10回、20回もしくはそれ以上の細胞集団の細胞倍加、例えば、培養もしくは拡大増殖の間に行われる倍加の前に、培養または拡大増殖が完了する。ある種の局面において、培養または拡大増殖の始動時のおよび培養または拡大増殖の完了時の全有核細胞数(TNC)を決定し、次いで始動時のTNCで割った完了時のTNC産物の自然対数を決定し、次いで産物の該自然対数を2の自然対数で割ることにより、細胞倍加が計算される。
さまざまな態様において、細胞は、インプット集団の細胞が3回、2回、または1回を超えて倍加する前の時点で回収または収集される。いくつかの局面において、培養または拡大増殖プロセス中に起こりうる倍加を低減することで、いくつかの態様において、ナイーブ様であるおよび/または中央記憶表現型のような、記憶表現型である操作されたT細胞の部分が増加されよう。いくつかの態様において、培養または拡大増殖プロセス中に倍加を増加させることで、培養または拡大増殖プロセス中に起こりうるT細胞分化が増加される。いくつかの局面において、操作された細胞組成物を作出または産生するためのプロセスの場合、プロセス中に、例えば、培養または拡大増殖中に行われる拡大増殖または細胞倍加を低減させることで、得られる操作された細胞組成物の、ナイーブ様T細胞および/または中央記憶表現型のような、記憶表現型のT細胞の量または部分が増加されることが企図される。特定の局面において、プロセス中に行われる拡大増殖または細胞倍加を増加させることで、得られる操作された細胞組成物の分化したT細胞の量または部分が増加される。いくつかの局面において、得られる操作された細胞組成物において、ナイーブ様細胞および/または記憶表現型、例えば中央記憶表現型のT細胞の部分を増大または拡大する、本明細書において提供されるプロセスのような、プロセスが操作された細胞組成物の、効力、有効性および持続性を、例えば投与後インビボで、増加させうることが企図される。
いくつかの局面において、集団において行われる倍加の数は、次式を用いて決定される。
ある種の態様において、本式を用いて決定される細胞組成物の集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、約3.0〜約9.0、または約5〜約7.5である。
いくつかの局面において、集団において行われる倍加の数は、次式を用いて決定される。
ある種の態様において、本式を用いて決定される細胞組成物の集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、約3.0〜約9.0、または約5〜約7.5である。
ある種の態様において、集団において行われる倍加の数は、次式を用いて決定される。
ある種の態様において、本式を用いて決定される細胞組成物の集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、約3.0〜約9.0、または約5〜約7.5である。
さまざまな態様において、集団において行われる倍加の数は、次式を用いて決定される。
ある種の態様において、本式を用いて決定される細胞組成物の集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、約3.0〜約9.0、または約5〜約7.5である。
特定の態様において、集団において行われる倍加の数は、次式を用いて決定される。
ある種の態様において、本式を用いて決定される細胞組成物の集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、約3.0〜約9.0、または約5〜約7.5である。
ある種の態様において、培養または拡大増殖は、細胞の総数、例えば、拡大増殖中の培養細胞または細胞の総数がインプット集団の細胞数、例えば、刺激試薬と接触された細胞の総数の1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超えるか、または約1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前に完了する。ある種の態様において、培養または拡大増殖は、細胞の総数、例えば、拡大増殖中の培養細胞または細胞の総数がインプット集団の細胞数、例えば、刺激試薬と接触された細胞の総数の2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍超である前に完了する。さまざまな態様において、培養または拡大増殖は、培養細胞の総数が形質転換、形質導入、またはスピノキュレートされた細胞の総数、例えばウイルスベクターと接触された細胞の総数の1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超えるか、または約1、2、3、4、5、6、8、10、20倍もしくは20倍より多くを超える前に完了する。ある種の態様において、培養または拡大増殖は、細胞の総数、例えば、拡大増殖中の培養細胞または細胞の総数が形質転換、形質導入、またはスピノキュレートされた細胞の総数、例えばウイルスベクターと接触された細胞の総数の2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0倍超である前に完了する。ある種の態様において、細胞組成物の集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、あるいは2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0超である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0であるか、または約2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5もしくは10.0である。ある種の態様において、複数の細胞組成物の平均集団倍加は、約3.0〜約9.0、または約5〜約7.5である。ある種の態様において、細胞はT細胞、生存T細胞、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CAR発現T細胞、または前記のいずれかの組み合わせである。
特定の態様において、培養が終了する場合に、アウトプット組成物中の細胞は1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞または約1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞の細胞密度もしくは濃度を達成するか、または複数のアウトプット組成物中の細胞は1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞または約1×106個の細胞/mL、5×106個の細胞/mL、10×106個の細胞/mL、15×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、40×106個の細胞/mL、45×106個の細胞/mL、50×106個の細胞/mL、55×106個の細胞/mL、60×106個の細胞/mL、65×106個の細胞/mL、70×106個の細胞/mL、75×106個の細胞/mL、80×106個の細胞/mL、85×106個の細胞/mL、90×106個の細胞/mL、95×106個の細胞/mL、100×106個の細胞/mLもしくはその生存細胞の平均もしくは中央値の細胞密度もしくは濃度を達成する。特定の態様において、培養が終了する場合に、アウトプット組成物中の細胞は15×106個の細胞/mL〜約45×106個の細胞/mLまたは約15×106個の細胞/mL〜約45×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL〜約40×106個の細胞/mLもしくは約20×106個の細胞/mL〜約40×106個の細胞/mL、例えば約21×106個の細胞/mL、22×106個の細胞/mL、23×106個の細胞/mL、24×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、26×106個の細胞/mL、27×106個の細胞/mL、28×106個の細胞/mL、29×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、31×106個の細胞/mL、32×106個の細胞/mL、33×106個の細胞/mL、34×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、36×106個の細胞/mL、37×106個の細胞/mL、38×106個の細胞/mLもしくは39×106個の細胞/mLの細胞密度もしくは濃度を達成するか、または複数のアウトプット組成物中の細胞は15×106個の細胞/mL〜約45×106個の細胞/mLまたは約15×106個の細胞/mL〜約45×106個の細胞/mL、20×106個の細胞/mL〜約40×106個の細胞/mLもしくは約20×106個の細胞/mL〜約40×106個の細胞/mL、例えば約21×106個の細胞/mL、22×106個の細胞/mL、23×106個の細胞/mL、24×106個の細胞/mL、25×106個の細胞/mL、26×106個の細胞/mL、27×106個の細胞/mL、28×106個の細胞/mL、29×106個の細胞/mL、30×106個の細胞/mL、31×106個の細胞/mL、32×106個の細胞/mL、33×106個の細胞/mL、34×106個の細胞/mL、35×106個の細胞/mL、36×106個の細胞/mL、37×106個の細胞/mL、38×106個の細胞/mLもしくは39×106個の細胞/mLの平均もしくは中央値の細胞密度もしくは濃度を達成する。いくつかの態様において、平均もしくは中央値の細胞密度もしくは濃度は、約30×106個の細胞/mL〜約40×106個の細胞/mL、約15×106個の細胞/mL〜約25×106個の細胞/mL、約35×106個の細胞/mL〜約40×106個の細胞/mLもしくは約20×106個の細胞/mL〜約25×106個の細胞/mLである。
培養中の細胞のモニタリング
いくつかの態様において、細胞は培養段階中にモニタリングされる。モニタリングは、例えば、細胞形態、細胞生存性、細胞死、および/または細胞濃度(例えば、生存細胞濃度、生存細胞数)を究明する(例えば、測定する、定量化する)ために実施されうる。いくつかの態様において、モニタリングは、例えばヒト操作者によって、手動で実施される。いくつかの態様において、モニタリングは自動システムによって実施される。自動システムは、培養細胞をモニタリングするために最低限の手動インプットを必要としえるか、または手動インプットを必要としえない。いくつかの態様において、モニタリングは手動および自動システムの両方で実施される。
いくつかの態様において、細胞は培養段階中にモニタリングされる。モニタリングは、例えば、細胞形態、細胞生存性、細胞死、および/または細胞濃度(例えば、生存細胞濃度、生存細胞数)を究明する(例えば、測定する、定量化する)ために実施されうる。いくつかの態様において、モニタリングは、例えばヒト操作者によって、手動で実施される。いくつかの態様において、モニタリングは自動システムによって実施される。自動システムは、培養細胞をモニタリングするために最低限の手動インプットを必要としえるか、または手動インプットを必要としえない。いくつかの態様において、モニタリングは手動および自動システムの両方で実施される。
ある種の態様において、細胞は、手動インプットを必要としない自動システムによってモニタリングされる。いくつかの態様において、自動システムは、バイオリアクタ、例えば、培養中の細胞をバイオリアクタから取り出し、モニタリングし、続いてバイオリアクタに戻すことができるような、本明細書において記述されるバイオリアクタと互換性がある。いくつかの態様において、モニタリングおよび培養は、閉ループ構成で行われる。いくつかの局面において、閉ループ構成では、自動システムおよびバイオリアクタは無菌のままである。態様において、自動システムは無菌である。 いくつかの態様において、自動システムはインラインシステムである。
いくつかの態様において、自動システムは、細胞形態、細胞生存性、細胞死、および/または細胞濃度(例えば、生存細胞濃度、生存細胞数)を検出するための光学技法(例えば、顕微鏡法)の使用を含む。例えば、細胞の特徴、生存性、ならびに濃度および数を決定するのに適した任意の光学技法が本明細書において企図される。有用な光学技法の非限定的な例としては、明視野顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、デジタルホログラフィー顕微鏡法(DHM)、微分デジタルホログラフィー顕微鏡法(DDHM)、またはそれらの組み合わせが挙げられる。微分デジタルホログラフィー顕微鏡法、DDHM、および微分DHMは、本明細書において互換的に用いられうる。ある種の態様において、自動システムは、微分デジタルホログラフィー顕微鏡を含む。ある種の態様において、自動システムは、照明手段(例えば、レーザー、led)を含む微分デジタルホログラフィー顕微鏡を含む。DDHM方法論および使用の記述は、例えば、US 7,362,449; EP 1,631,788; US 9,904,248; およびUS 9,684,281において見出すことができ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
DDHMは、標識なしの、非破壊的な細胞画像化を可能にし、高コントラストのホログラフィック画像をもたらす。画像はオブジェクトのセグメンテーションおよびさらなる分析を受けて、画像化されたオブジェクト(例えば、培養細胞、細胞残屑)を定量的に記述する複数の形態学的特徴を取得しうる。そのため、さまざまな特徴(例えば、細胞形態、細胞生存性、細胞濃度、細胞数)が、例えば、画像取得、画像処理、画像セグメンテーション、および特徴抽出の段階を用いて、DDHMから直接評価または計算されうる。いくつかの態様において、自動システムは、ホログラフィック画像を記録するためのデジタル記録装置を含む。いくつかの態様において、自動システムは、ホログラフィック画像を分析するためのアルゴリズムを含んだコンピュータを含む。いくつかの態様において、自動システムは、ホログラフィック画像分析の結果を表示するためのモニタおよび/またはコンピュータを含む。いくつかの態様において、分析は自動化される(すなわち、利用者インプットがない場合に実施されることができる)。培養段階中に細胞をモニタリングするのに適した自動システムの例としては、Ovizio iLine F (Ovizio Imaging Systems NV/SA, Brussels, Belgium)が挙げられるが、これに限定されることはない。
ある種の態様において、モニタリングは培養段階中に連続的に実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階中にリアルタイムで実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階中の別々の時点で実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも15分ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも30分ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも45分ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも1時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも2時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも4時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも6時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも8時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも10時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも12時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも14時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも16時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも18時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも20時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも22時間ごとに実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも1日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも2日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも3日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも4日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも5日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも6日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも7日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも8日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも9日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階の期間中、少なくとも10日に1回実施される。いくつかの態様において、モニタリングは培養段階中に少なくとも1回実施される。
いくつかの態様において、DHMまたはDDHMのような光学技法の使用を含む、モニタリングによって決定できる細胞の特徴は、細胞生存性、細胞濃度、細胞数および/または細胞密度を含む。いくつかの態様において、細胞生存性が特徴付けまたは決定される。いくつかの態様において、細胞濃度、密度および/または数が特徴付けまたは決定される。いくつかの態様において、生存細胞濃度、生存細胞数および/または生存細胞密度が特徴付けまたは決定される。いくつかの態様において、培養細胞は、上記のように、拡大増殖の閾値に到達するまで自動システムによってモニタリングされる。いくつかの態様において、拡大増殖の閾値に到達したら、培養細胞は、例えば、自動または手動の方法によって、例えば、ヒト操作者によって収集される。拡大増殖の閾値は、自動システムによって決定される培養細胞の全濃度、密度、および/または数に依存しうる。あるいは、拡大増殖の閾値は、生存細胞濃度、密度および/または数に依存しうる。数および計数は、本明細書において互換的に用いられうる。
いくつかの態様において、収集された細胞は、例えば薬学的に許容される担体の存在下で、記述されるように配合される。いくつかの態様において、収集された細胞は、抗凍結剤の存在下で配合される。
E. 細胞の配合
いくつかの態様において、細胞療法および/または操作された細胞を製造、作出または産生するための1つまたは複数のプロセス段階(例えば、遠心チャンバおよび/または閉鎖システムで実行される)は、培養段階、例えば培養および拡大増殖の前もしくは後の提供される形質導入処理段階、ならびに/または記述されるように1つもしくは複数の他の処理段階から得られる遺伝子操作された細胞の配合のような、細胞の配合を含みうる。いくつかの態様において、細胞の配合に関連した提供される方法は、閉鎖システムで、上記の処理段階を用いて形質導入および/または拡大増殖された細胞のような、形質導入された細胞を処理する段階を含む。
いくつかの態様において、細胞療法および/または操作された細胞を製造、作出または産生するための1つまたは複数のプロセス段階(例えば、遠心チャンバおよび/または閉鎖システムで実行される)は、培養段階、例えば培養および拡大増殖の前もしくは後の提供される形質導入処理段階、ならびに/または記述されるように1つもしくは複数の他の処理段階から得られる遺伝子操作された細胞の配合のような、細胞の配合を含みうる。いくつかの態様において、細胞の配合に関連した提供される方法は、閉鎖システムで、上記の処理段階を用いて形質導入および/または拡大増殖された細胞のような、形質導入された細胞を処理する段階を含む。
いくつかの態様において、刺激試薬は、配合の前に細胞から除去および/または分離される。特定の態様において、刺激試薬は、培養後に細胞から除去および/または分離される。ある種の態様において、刺激剤は、培養の後に、および例えば増殖かつ/または拡大増殖を促進する条件の下で、培養細胞を配合する前に、細胞から除去および/または分離される。ある種の態様において、刺激試薬は、本明細書において、例えばI-B-1項に記述される刺激試薬である。特定の態様において、刺激試薬は、本明細書において、例えばI-B-2項に記述されるように、細胞から除去および/または分離される。
いくつかの態様において、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成されてから0日〜10日、0〜5日、2日〜7日、0.5日〜4日、または1日〜3日後に、細胞が配合される。ある種の態様において、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成されてから12時間、18時間、24時間、1日、2日もしくは3日後にまたはおよそ12時間、18時間、24時間、1日、2日もしくは3日後に、あるいは12時間、18時間、24時間、1日、2日もしくは3日後以内に細胞が配合される。いくつかの態様において、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成されてから1日後以内にまたは約1日後以内に細胞が配合される。
いくつかの態様において、細胞療法および/または操作された細胞を製造、作出または産生するための提供される方法は、インキュベートする段階、操作する段階、および培養段階の前もしくは後の提供される処理段階、ならびに/または記述されるように1つもしくは複数の他の処理段階から得られる遺伝子操作された細胞の配合のような、細胞の配合を含みうる。いくつかの態様において、細胞の配合に関連した提供される方法は、閉鎖システムで、上記の処理段階を用いて形質導入および/または拡大増殖された細胞のような、形質導入された細胞を処理する段階を含む。いくつかの態様において、組み換え抗原受容体、例えばCARまたはTCRで操作された細胞を含む細胞の用量は、薬学的組成物または配合物のような、組成物または配合物として提供される。そのような組成物は、例えば疾患、状態および障害の予防または処置において、または検出、診断および予後診断の方法において、提供される方法にしたがって用いることができる。
場合によっては、細胞は、細胞療法および/または操作された細胞を製造、作出または産生するための1つまたは複数の段階(例えば、遠心チャンバおよび/または閉鎖システムで実行される)で処理され、培養段階、例えば培養および拡大増殖の前もしくは後の提供される形質導入処理段階、ならびに/または記述されるように1つもしくは複数の他の処理段階から得られる遺伝子操作された細胞の配合のような、細胞の配合を含みうる。場合によっては、細胞は、単回投与量の投与または複数回投与量の投与のためのような、投与量の投与のための量で配合することができる。いくつかの態様において、細胞の配合に関連した提供される方法は、閉鎖システムで、上記の処理段階を用いて形質導入および/または拡大増殖された細胞のような、形質導入された細胞を処理する段階を含む。
ある種の態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物が配合される。特定の態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、1つまたは複数の組成物が操作および/または培養された後に配合される。特定の態様において、1つまたは複数の組成物は、インプット組成物である。いくつかの態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、あらかじめ冷凍凍結および貯蔵されており、インキュベーション前に融解される。
ある種の態様において、配合細胞はアウトプット細胞である。いくつかの態様において、濃縮T細胞の配合組成物は、濃縮T細胞のアウトプット組成物である。特定の態様において、配合CD4+ T細胞および配合CD8+ T細胞は、アウトプットCD4+およびCD8+ T細胞である。特定の態様において、配合細胞組成物、例えば、濃縮CD4+およびCD8+細胞の配合組成物は、アウトプット細胞組成物、例えば、濃縮CD4+およびCD8+細胞のアウトプット組成物である。
いくつかの態様において、細胞はバッグまたはバイアルのような、容器中に配合することができる。いくつかの態様において、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成されてから0日〜10日、0〜5日、2日〜7日、0.5日〜4日、または1日〜3日後に、細胞が配合される。ある種の態様において、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成されてから12時間、18時間、24時間、1日、2日もしくは3日後にまたはおよそ12時間、18時間、24時間、1日、2日もしくは3日後に、あるいは12時間、18時間、24時間、1日、2日もしくは3日後以内に細胞が配合される。いくつかの態様において、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成されてから1日後以内にまたは約1日後以内に細胞が配合される。
ある種の態様において、細胞は、例えば、閾値が達成されるときに関係なく、培養中のより早い時点で配合された場合よりも活性化されていない状態で細胞が収集されるように、最低限の持続時間または時間量にわたって培養される。いくつかの態様において、細胞は、培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖が達成された後、0日〜3日、例えば、0〜3日、1〜2日、1日もしくは約1日、2日もしくは約2日、または3日もしくは約3日培養される。ある種の態様において、細胞は、閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖を活性化し、配合前の最低限の時間または持続時間、培養されたままである。いくつかの態様において、閾値を達成した細胞は、最低限の持続時間および/または時間量、例えば1日〜14日、2日〜7日または3日〜6日の最低限の時間または持続時間、あるいは2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくは7日超または約2日、3日、4日、5日、6日、7日もしくは7日超の培養の最低限の時間または持続時間、培養されるまで配合されない。いくつかの態様において、培養の最低限の時間または持続時間は、3日〜6日である。
いくつかの態様において、細胞は、いくつかの局面では、薬学的に許容される担体または賦形剤を含みうる薬学的に許容される緩衝液中に配合される。いくつかの態様において、処理は、対象への投与のために薬学的に許容されるかまたは望ましい媒体または配合緩衝液への媒体の交換を含む。いくつかの態様において、処理する段階は、形質導入および/または拡大増殖された細胞を洗浄して、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含みうる薬学的に許容される緩衝液の中に細胞を置き換える段階を伴うことができる。薬学的に許容される担体または賦形剤を含むそのような薬学的形態の例は、細胞および組成物を対象に投与するために許容される形態に関連して以下に記述される任意のものでありうる。いくつかの態様における薬学的組成物は、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば治療上有効または予防上有効な量の細胞を含有する。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒性である、活性成分以外の、薬学的配合物中の成分をいう。薬学的に許容される担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料を含むが、これらに限定されることはない。
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には特定の細胞によって、および/または投与方法によって決定される。したがって、種々の適当な配合物が存在する。例えば、薬学的組成物は保存料を含みうる。適当な保存料としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられうる。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の保存料の混合物が用いられる。保存料またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.0001重量%から約2重量%の量で存在する。担体は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記述されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、以下のものが含まれるが、これらに限定されることはない: リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存料(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾールなど); 低分子量(約10残基未満)ポリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質; ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体; グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸; 単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物; EDTAなどのキレート剤; スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類; ナトリウムなどの塩形成対イオン; 金属錯体(例えばZn-タンパク質錯体); ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン界面活性剤。
いくつかの局面において緩衝剤が組成物に含まれる。適当な緩衝剤としては、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他のさまざまな酸および塩が挙げられる。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.001重量%〜約4重量%の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)においてより詳細に記述されている。
配合物は水溶液を含むことができる。配合物または組成物はまた、各活性が互いに悪影響を及ぼさない場合、細胞で処置される特定の適応症、疾患、または状態に有用な2つ以上の活性成分、好ましくは細胞に補完的な活性を有するものを含有しうる。そのような活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適当に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンのような他の薬学的に活性な作用物質または薬物をさらに含む。
いくつかの態様において組成物は、いくつかの局面では、選択されたpHに緩衝されうる、滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供される。液体組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。滅菌注射溶液は、適当な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物などの溶媒中に細胞を組み込むことによって調製することができる。組成物は、所望される投与経路および製剤に依存して、湿潤剤、分散剤または乳化剤(例えばメチルセルロース)、pH緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存料、香味剤、および/または着色剤のような補助物質を含有することができる。いくつかの局面において標準的なテキストを参考にして適当な調製物を調製してもよい。
抗菌保存料、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を高めるさまざまな添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確実にすることができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
いくつかの態様において、配合緩衝液は凍結保存料を含有する。いくつかの態様において、細胞は、5%〜20% DMSO溶液または5%〜10% DMSO溶液のような、1.0%〜30% DMSO溶液を含有する凍結保存溶液で配合される。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、例えば、20% DMSOおよび8%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBS、または他の適当な細胞凍結培地であるか、またはそれを含有する。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、例えば、少なくともまたは約7.5% DMSOであるか、またはそれを含有する。いくつかの態様において、処理段階は、形質導入および/または拡大増殖された細胞を洗浄して、凍結保存料溶液中の細胞と置き換える段階を伴うことができる。いくつかの態様において、細胞は、12.5%、12.0%、11.5%、11.0%、10.5%、10.0%、9.5%、9.0%、8.5%、8.0%、7.5%、7.0%、6.5%、6.0%、5.5%もしくは5.0% DMSOまたは約12.5%、12.0%、11.5%、11.0%、10.5%、10.0%、9.5%、9.0%、8.5%、8.0%、7.5%、7.0%、6.5%、6.0%、5.5%もしくは5.0% DMSO、あるいは1%〜15%、6%〜12%、5%〜10%または6%〜8% DMSOの終濃度を有する培地および/または溶液の中で、凍結、例えば、冷凍凍結または凍結保存される。特定の態様において、細胞は、例えば、5.0%、4.5%、4.0%、3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.25%、1.0%、0.75%、0.5%もしくは0.25% HSAまたは約5.0%、4.5%、4.0%、3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.25%、1.0%、0.75%、0.5%もしくは0.25% HSA、あるいは0.1%〜-5%、0.25%〜4%、0.5%〜2%または1%〜2% HSAの終濃度を有する培地および/または溶液の中で、凍結、例えば、冷凍凍結または凍結保存される。
特定の態様において、濃縮されたT細胞、例えば、刺激され、操作され、および/または培養されたT細胞の組成物は、配合され、冷凍凍結され、その後にある量の時間の間、貯蔵される。ある種の態様において、配合された冷凍凍結細胞は、細胞が注入のために放出されるまで貯蔵される。特定の態様において、配合された冷凍凍結細胞は、1日〜6ヶ月、1ヶ月〜3ヶ月、1日〜14日、1日〜7日、3日〜6日、6ヶ月〜12ヶ月、または12ヶ月よりも長い間貯蔵される。いくつかの態様において、細胞は1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日間、約1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日間、または1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日未満の間、冷凍凍結および貯蔵される。ある種の態様において、貯蔵後に細胞は融解され、対象に投与される。ある種の態様において、細胞は5日間または約5日間貯蔵される。
いくつかの態様において、配合は、培養細胞または拡大増殖細胞のような、細胞の洗浄、希釈または濃縮を含む1つまたは複数の処理段階を用いて実行される。いくつかの態様において、処理は、所与の用量またはその一部での投与のための細胞の数を含む単位用量形態組成物のような、所望の濃度または数への細胞の希釈または濃度を含むことができる。いくつかの態様において、処理段階は、容量低減を含み、それにより、必要に応じて細胞の濃度を増加させることができる。いくつかの態様において、処理段階は、容量追加を含み、それにより、必要に応じて細胞の濃度を減少させることができる。いくつかの態様において、処理は、形質導入および/または拡大増殖された細胞にある量の配合緩衝液を加えることを含む。いくつかの態様において、配合緩衝液の容量は、少なくともまたは少なくとも約または約50 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700 mL、800 mL、900 mLまたは1000 mLのような、10 mL〜1000 mLまたは約10 mL〜1000 mLである。
いくつかの態様において、細胞組成物を配合するためのそのような処理段階は、閉鎖システムで実行される。そのような処理段階の例は、Sepax（登録商標）またはSepax 2（登録商標）細胞処理システムを伴う使用のためのものを含む、Biosafe SAによって製造され販売されている遠心分離チャンバのような、細胞処理システムに関連する1つまたは複数のシステムまたはキットと組み合わせた遠心分離チャンバを用いて実施されうる。例示的なシステムおよび方法は、国際公開WO2016/073602に記述されている。いくつかの態様において、方法は、上述の態様のいずれかにおいて、遠心分離チャンバの内部キャビティからの、薬学的に許容される緩衝液などの配合緩衝液中に配合された細胞の成果組成物である配合化組成物の取り出しを行うことを含む。いくつかの態様において、配合化組成物の取り出しは、閉鎖システムの一部として遠心分離チャンバと機能的に連結されているバッグなどの容器に対するものである。いくつかの態様において、バッグなどの容器は、アウトプットラインまたはアウトプット位置でシステムに接続されている。
いくつかの態様において、遠心分離チャンバまたは細胞処理システムに関連するものなどの閉鎖システムは、チューブラインの各端部に、ポートと接続された多方向のチューブマニホールドを含む多ポートアウトプットキットを含み、配合化組成物の取り出しのために、ポートに1つまたは複数の容器を接続することができる。いくつかの局面において、所望の数または複数のアウトプット容器、例えばバッグを、少なくとも3、4、5、6、7、8つまたはそれ以上のような、1つまたは複数、一般には2つまたはそれ以上の多ポートアウトプットのポートに、滅菌して接続することができる。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数の容器、例えばバッグをポートに取り付けることができ、または全ポートよりも少ないポートに取り付けることができる。したがって、いくつかの態様において、システムは、アウトプット組成物の複数のアウトプットバッグ内への取り出しを行うことができる。
いくつかの局面において、単回投与量の投与または複数回投与量の投与などの投与量の投与の量で、細胞は複数のアウトプットバッグの1つまたは複数に取り出されることができる。例えば、いくつかの態様において、アウトプットバッグはそれぞれ、所与の用量またはその分割量で投与するための細胞数を含有しうる。したがって、いくつかの局面において、各バッグは、投与のための単回用量を含んでいても、2つのアウトプットバッグ、または3つのアウトプットバッグのような、複数のアウトプットバッグのうちの2つ以上が、総合して投与のための1用量を構成するように、所望の用量の分割量を含有していてもよい。
したがって、容器、例えばアウトプットバッグは、一般に、投与される細胞、例えばその1つまたは複数のその単位用量を含む。単位用量は、対象に投与されるべき細胞の量もしくは数、または投与されるべき細胞の数の2倍(もしくはそれ以上)でありうる。それは、対象に投与される細胞の最低の用量または最低可能用量でありうる。
いくつかの態様において、容器、例えば、バッグの各々は、単位用量の細胞を個別に含む。したがって、いくつかの態様において、各容器は、同じ、またはほぼ同じ、もしくは実質的に同じ数の細胞を含む。いくつかの態様において、各単位用量は、少なくともまたは少なくとも約1×106、2×106、5×106、1×107、5×107、または1×108個の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。いくつかの態様において、各バッグの配合化細胞組成物の容量は、10 mL〜100 mL、例えば少なくともまたは少なくとも約20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mLもしくは100 mLである。
いくつかの態様において、この方法によって産生されたそのような細胞、またはそのような細胞を含む組成物は、疾患または状態を処置するために対象に投与される。
F. プロセスの例示的な特徴
特定の態様において、提供される方法は、1つもしくは複数のインプット組成物からおよび/または単一の生体サンプルから濃縮T細胞のアウトプット組成物を産生または作出するプロセスに関連して用いられる。ある種の態様において、アウトプット組成物は、組み換え受容体、例えばTCRまたはCARを発現する細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、治療、例えば自己細胞療法として対象に投与するのに適している。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、濃縮されたCD4+およびCD8+ T細胞の組成物である。
特定の態様において、提供される方法は、1つもしくは複数のインプット組成物からおよび/または単一の生体サンプルから濃縮T細胞のアウトプット組成物を産生または作出するプロセスに関連して用いられる。ある種の態様において、アウトプット組成物は、組み換え受容体、例えばTCRまたはCARを発現する細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、治療、例えば自己細胞療法として対象に投与するのに適している。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、濃縮されたCD4+およびCD8+ T細胞の組成物である。
いくつかの態様において、提供される方法は、以下の段階: 生体サンプルを回収するもしくは得る段階; 生体サンプルからインプット細胞を分離、選択もしくは濃縮する段階; インプット細胞を冷凍凍結および貯蔵する段階; インプット細胞を刺激条件の下で融解および/もしくはインキュベートする段階; 刺激された細胞を操作して、組み換えポリヌクレオチド、例えば、CARのような組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現または含有させる段階; 操作された細胞を閾値量、密度もしくは拡大増殖まで培養する段階; 培養細胞をアウトプット組成物中に配合する段階; ならびに/または細胞が注入のために放出されるまで、および/もしくは対象に投与されるのに適するまで、配合されたアウトプット細胞を冷凍凍結および貯蔵する段階の一部または全部を含むプロセスのような、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット組成物を作出または産生するための全プロセスに関連して用いられる。いくつかの態様において、全プロセスは、濃縮されたT細胞、例えば、CD4+およびCD8+ T細胞の単一組成物で実施される。ある種の態様において、プロセスは、濃縮T細胞の単一アウトプット組成物を作出または産生するためにプロセスの前および/または間に組み合わされる濃縮T細胞の2つまたはそれ以上のインプット組成物で実施される。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞は、操作されたT細胞、例えば、組み換え受容体を発現するように形質導入されたT細胞であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、提供される方法に関連したプロセスは、代替プロセスと比較される。特定の態様において、代替プロセスは、1つまたは複数の特定の局面が異なりうるが、もしそうでなければ、提供される方法に関連したプロセスの類似のまたは同じ特徴、局面、段階、ステージ、試薬、および/または条件を含む。いくつかの態様において、代替プロセスは、提供される方法に関連したプロセスと類似であるが、以下の1つまたは複数を含むが、これらに限定されない、やり方が異なる; 異なる試薬および/もしくは培地配合; インキュベーション、形質導入、トランスフェクション、および/もしくは培養中の血清の存在; インプット組成の異なる細胞構成、例えば、CD4+とCD8+ T細胞の比率; 刺激条件の下でインキュベートされるインプット細胞の異なる量および/もしくは濃度; 異なる刺激条件および/もしくは異なる刺激試薬; 刺激試薬と細胞の異なる比率; 異なるベクターおよび/もしくは形質導入方法; 細胞をインキュベート、形質導入、および/もしくはトランスフェクションするための異なるタイミングもしくは順序; インキュベーション、形質導入、トランスフェクション、および/もしくは培養中に存在する1つもしくは複数の組み換えサイトカインの欠如もしくは差異; 形質導入される細胞の異なる量および/もしくは濃度; 培養中の異なる揺動および/もしくは灌流条件; ならびに/または培養中に達成される異なる閾値量、密度、もしくは拡大増殖。
ある種の態様において、プロセスは、35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満または約35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満の持続時間および/または時間量以内に完了する。いくつかの態様において、プロセスは25日以内に完了する。ある種の態様において、プロセスは21日以内に完了する。特定の態様において、プロセスは、14日〜18日の持続時間および/または時間量以内に完了する。いくつかの態様において、プロセスは、冷凍凍結組成物の貯蔵時間を含めて、組成物が収集および/もしくは配合される; 組成物が収集および/もしくは配合される状態にある; 組成物が収集の標的閾値に達した; 組成物が放出され、および/もしくは配合後試験に向けた状態にある; 組成物が対象に投与される状態にある、ならびに/または組成物が対象に投与される場合に完了したと見なされる。特定の態様において、同じ生体サンプルから得られた濃縮T細胞の2つ以上の組成物に対してプロセスが実施される場合、同じ生体サンプルからのありとあらゆる組成物の少なくとも1つの代表的なサンプルがプロセスを完了すると、プロセスは完了する。
いくつかの態様において、プロセスは、生体サンプルの回収の開始、ならびに/または生体サンプルからのインプット細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が注入のために放出されるときまで測定される場合、21日以内に完了する。特定の態様において、プロセスは、生体サンプルの回収の開始、ならびに/または生体サンプルからのインプット細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が配合後試験に向けた状態にある、注入のために放出される、および/もしくは対象に投与される状態にあるときまで測定される場合、14日〜18日で完了する。
ある種の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、5日または約5日、5日〜25日、7日〜18日、8〜15日、14〜18日、8〜14日、8〜15日、例えば8〜13日または9日〜13日である。特定の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、7日〜10日、6日〜9日または5日〜8日である。
ある種の態様において、インキュベーションの開始または始動から、閾値が達成される時間まで行われるプロセスの時間量および/または持続時間の中央値は、約5日、5日〜25日、7日〜18日、9日〜13日、14日〜18日または約5日、5日〜25日、7日〜18日、9日〜13日、14日〜18日未満であるか、あるいは5日、5.5日、6日、6.5日、7日、7.5日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日であるか、5日、5.5日、6日、6.5日、7日、7.5日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日未満であるか、または約5日、5.5日、6日、6.5日、7日、7.5日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日である。特定の態様において、インキュベーションの開始または始動から、閾値が達成される時間まで行われるプロセスの時間量および/または持続時間の中央値は、約5日、5日〜25日、7日〜18日、14〜18日、8日〜13日もしくは9日〜13日または約5日、5日〜25日、7日〜18日、14〜18日、8日〜13日もしくは9日〜13日未満であるか、あるいは5日、5.5日、6日、6.5日、7日、7.5日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日であるか、5日、5.5日、6日、6.5日、7日、7.5日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日未満であるか、または約5日、5.5日、6日、6.5日、7日、7.5日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日である。特定の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、閾値が達成される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、5日または約5日、5日〜7日、7日〜10日、6日〜9日または5日〜8日である。
いくつかの態様において、操作された細胞(例えば、CAR T細胞)が提供されるプロセスによって成功裏に製造されうる成功率は、少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%である。いくつかの局面において、成功率は、提供されるプロセスによる操作のために、例えばアフェレーシスによって、サンプルが回収された対象の割合として決定され、そのなかでそのような細胞は、刺激試薬による刺激の始動後、約5日、5日〜10日、例えば7日〜10日、6日〜9日もしくは5日〜8日、例えば5日、5.5日、6日、6.5日、7日もしくは7.5日または約5日、5日〜10日、例えば7日〜10日、6日〜9日もしくは5日〜8日、例えば5日、5.5日、6日、6.5日、7日もしくは7.5日未満である時点で、アウトプット細胞の回収、配合および/または凍結保存を含めて、アウトプット細胞の収集に関するプロセス基準を満たす。いくつかの局面において、成功率は、提供されるプロセスによる操作のために、例えばアフェレーシスによって、サンプルが回収された対象の割合として決定され、そのなかでそのような細胞は、刺激試薬による刺激の始動後21日以内である時点で、配合後試験、注入のための放出、および/または対象に投与される状態にあることを含めて、対象への操作された細胞の再注入に関するプロセス基準を満たす。
いくつかの態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、または少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について9日〜15日である。ある種の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、または少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について14日〜18日である。特定の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、または少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について7〜10日である。特定の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、または少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について6〜9日である。特定の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について、または少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%について5〜8日である。いくつかの態様において、そのような対象は、多発性骨髄腫のような、がんなどの、疾患または状態を有する患者である。
いくつかの態様において、生体サンプルからの濃縮CD4+およびCD8+細胞の組成物の単離、濃縮および/または選択、例えばアフェレーシスおよび/または白血球アフェレーシスから、アウトプット細胞が回収され、配合され、および/または冷凍凍結される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、5日〜25日、7日〜18日、14〜18日、8〜19日、8〜14日、または10〜16日である。ある種の態様において、アウトプット細胞は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%について単離、濃縮および/または選択後10〜16日に回収され、配合され、および/または回収される。特定の態様において、アウトプット細胞は、細胞を製造するための提供されるプロセスに供された複数の対象のうち対象の少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%について単離、濃縮および/または選択後14〜18日に回収され、配合され、および/または回収される。
いくつかの態様において、プロセスは、冷凍凍結された組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプル、例えばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスサンプルの回収の開始から、アウトプット組成物が対象に投与されるもしくは投与される状態にある、アウトプット組成物が収集および/もしくは配合される; アウトプット組成物が収集および/もしくは配合される状態にある; アウトプット組成物が収集の標的閾値に達した; アウトプット組成物が試験のために放出されるときまで測定される場合、35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満または約35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満の持続時間および/または時間量以内に完了する。いくつかの態様において、プロセスは、生体サンプルの回収の開始から、アウトプット細胞が例えば対象への、注入に向けた状態にあるおよび/または注入に向けて放出されるときまで測定される場合、21日以内に完了する。
いくつかの態様において、プロセスは、冷凍凍結された組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプルの回収の開始ならびに/または生体サンプルからのインプット細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が注入のために放出されるときまで測定される場合、35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満または約35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満の持続時間および/または時間量以内に、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%または少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%の信頼区間以内で、完了する。ある種の態様において、プロセスは、冷凍凍結された組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプルの回収の開始ならびに/または生体サンプルからのインプット細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が注入のために放出されるときまで測定される場合、14日〜18日以内に、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%または少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%の信頼区間以内で、完了する。
ある種の態様において、プロセスは、冷凍凍結された細胞組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプルの回収ならびに/または生体サンプルからのT細胞、例えば、インプットT細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が対象に投与されるおよび/または対象に投与される状態にあるときまで測定される場合、35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満または約35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満の持続時間および/または時間量以内に、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%または少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%の信頼区間以内で、完了する。ある種の態様において、プロセスは、冷凍凍結された細胞組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプルの回収ならびに/または生体サンプルからのT細胞、例えば、インプットT細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が対象に投与されるおよび/または対象に投与される状態にあるときまで測定される場合、14日〜18日の持続時間および/または時間量以内に、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%または少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%の信頼区間以内で、完了する。
ある種の態様において、プロセスは、冷凍凍結された細胞組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプルの回収ならびに/または生体サンプルからのT細胞、例えば、インプットT細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が配合後試験に向けた状態にあるときまで測定される場合、35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満または約35日、34日、33日、32日、31日、30日、29日、28日、27日、26日、25日、24日、23日、22日、21日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日もしくは9日未満の持続時間および/または時間量以内に、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%または少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%の信頼区間以内で、完了する。ある種の態様において、プロセスは、冷凍凍結された細胞組成物の貯蔵時間を含めて、生体サンプルの回収ならびに/または生体サンプルからのT細胞、例えば、インプットT細胞の単離、選択、刺激、および/もしくは濃縮から、アウトプット細胞が配合後試験に向けた状態にあるときまで測定される場合、14日〜18日の持続時間および/または時間量以内に、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%または少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは99.9%の信頼区間以内で、完了する。
ある種の態様において、プロセスを完了する持続時間および/または時間量は、複数の対象からの、および/または特定の適応症もしくは疾患を有する者などの、少なくともある種の割合の対象に対しての、例えば少なくともおよそ85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%もしくは95%超のそのような対象に対してのサンプルについて、例えば、貯蔵時間が含まれる場合に、10日〜35日、12日〜33日、17日〜25日、14日〜18日、または19日〜23日である。ある種の態様において、異なる生体サンプルからの複数の出発組成物に対してプロセスを完了する(例えば、対象由来のサンプルの採取より測定したときから製品が対象への注入に向けた状態にあるまたは注入に向けて放出されるときまでの)持続時間および/または時間量の中央値は、例えば、貯蔵時間が含まれる場合に、15日〜27日、17日〜25日、14〜18日もしくは19日〜23日であるか、あるいは14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日であるか、約14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日であるか、または14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日未満である。特定の態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物に対してプロセスを完了する平均時間量および/または持続時間は、例えば、輸送および/または貯蔵時間が含まれる場合に、15日〜27日、17日〜25日、14日〜18日もしくは19日〜23日であるか、あるいは14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日であるか、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日未満であるか、または約14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日である。特定の態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物に対してプロセスを完了する持続時間は、例えば、貯蔵時間が含まれる場合に、15日〜27日、17日〜25日、14〜18日もしくは19日〜23日であるか、あるいは14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日であるか、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日未満であるか、または約14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日もしくは23日である。
ある種の態様において、異なる生体サンプルおよび/または異なる疾患を有する対象からなどの、ある範囲の出発組成物にわたるような、プロセスの持続時間は、21日未満または21日以下であり; いくつかの局面において、そのような結果は、そのようなサンプルまたは患者にわたって製品を製造する際におよそ85%、90%、91%、92%、93%、94%または95%超の成功率で達成される。特定の態様において、例えば、異なる生体サンプルおよび/または異なる疾患を有する対象からの、ある範囲の出発組成物にわたるような、プロセスの持続時間は、14日〜18日である; いくつかの局面において、そのような結果は、そのようなサンプルまたは患者にわたって製品を製造する際に85%、90%、91%、92%、93%、94%または95%超の成功率で達成される。
いくつかの態様において、プロセスを完了する持続時間および/または時間量は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めないまたは考慮に入れない場合に7日〜27日、9日〜25日、11日〜18日、14日〜18日、または11日〜15日である。ある種の態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物に対してプロセスを完了するのに必要とされる時間量および/または持続時間の中央値は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めないまたは考慮に入れない場合に7日〜27日、9日〜25日、11日〜18日、14日〜18日もしくは11日〜15日であるか、あるいは11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日であるか、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日未満であるか、または約11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日である。特定の態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物に対してプロセスを完了するのに必要とされる平均時間量および/または持続時間は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めないまたは考慮に入れない場合に7日〜27日、9日〜25日、11日〜18日、14日〜18日もしくは11日〜15日であるか、あるいは11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日であるか、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日未満であるか、または約11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日である。いくつかの態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物に対してプロセスを完了するのに必要とされる平均時間量および/または持続時間は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めない場合に21日未満である。
特定の態様において、異なる供給源、例えば、異なる生体サンプルから得られた複数の組成物ならびに/または異なる生体サンプルから単離、濃縮、および/もしくは選択された濃縮T細胞の異なるインプット組成物の少なくとも10%に対してプロセスを完了する時間量は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めないまたは考慮に入れない場合に7日〜18日、14日〜18日、10日〜17日もしくは11日〜15日であるか、あるいは11日、12日もしくは13日であるか、または約11日、12日もしくは13日である。特定の態様において、異なる生物学的供給源からの複数の組成物の少なくとも50%に対してプロセスを完了するのに必要とされる時間量は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めないまたは考慮に入れない場合に7日〜27日、9日〜25日、11日〜18日、14日〜18日もしくは11日〜15日であるか、あるいは11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日であるか、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日未満であるか、または約11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日である。ある種の態様において、異なる供給源からの複数の組成物の少なくとも90%に対してプロセスを完了するのに必要とされる時間量は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めないまたは考慮に入れない場合に7日〜27日、9日〜25日、11日〜18日、14日〜18日もしくは11日〜15日であるか、あるいは11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日であるか、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日未満であるか、または約11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日もしくは18日である。ある種の態様において、異なる供給源からの複数の組成物の少なくとも90%に対してプロセスを完了するのに必要とされる時間量は、冷凍凍結された細胞の貯蔵時間を含めない場合に21日未満である。
いくつかの態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、閾値量、密度、および/または拡大増殖度(例えば4倍または特定の用量のような特定の拡大増殖倍率)が培養中に達成される時点まで行われるプロセス中の持続時間および/または時間量は、5日〜25日、7日〜18日、14日〜18日または8〜15日、例えば8〜13日または9日〜13日である。ある種の態様において、インキュベーションの開始または始動から、閾値が達成される時点まで行われるプロセスの時間量および/または持続時間の中央値は、5日〜25日、7日〜18日、14〜18日もしくは9日〜13日であるか、あるいは8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日であるか、8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日未満であるか、または約8日、9日、10日、11日、12日もしくは13日である。特定の態様において、インキュベーションの開始または始動から、閾値が達成される時点まで行われるプロセスの平均時間量および/または持続時間は、5日〜25日、7日〜18日、14日〜18日もしくは9日〜13日であるか、あるいは9日、10日、11日、12日もしくは13日であるか、または約9日、10日、11日、12日もしくは13日である。
いくつかの態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、閾値量、密度、および/または拡大増殖が培養中に達成される時点までのプロセスの持続時間および/または時間量は、代替プロセスの時間よりも少なくともおよそ5%、少なくともおよそ10%、少なくともおよそ15%、少なくともおよそ20%、少なくともおよそ25%、少なくともおよそ30%、少なくともおよそ35%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、または少なくともおよそ90%少ない時間である。特定の態様において、刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、閾値量、密度、および/または拡大増殖が培養中に達成される時点までのプロセス中の持続時間および/または時間量は、代替プロセスの持続時間および/または時間量よりも0.5日、1日、1.5日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、もしくは14日超だけ、約0.5日、1日、1.5日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、もしくは14日超だけ、または少なくとも0.5日、1日、1.5日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、もしくは14日超だけ短い。
ある種の態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物の少なくとも10%が刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から、閾値量、密度、および/または拡大増殖が培養中に達成される時間までの、閾値量、密度、および/または拡大増殖に到達するのに必要とされる時間量は、5日〜20日、7日〜15日もしくは9日〜11日であるか、あるいは7日、8日、9日もしくは10日であるか、7日、8日、9日もしくは10日未満であるか、または約7日、8日、9日もしくは10日である。特定の態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物の少なくとも50%が刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から閾値量、密度、および/または拡大増殖に到達するのに必要とされる時間量は、5日〜25日、7日〜18日もしくは9日〜13日であるか、あるいは7日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは(of)13日であるか、7日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは(of)13日未満であるか、または約7日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは(of)13日である。いくつかの態様において、異なる生体サンプルからの複数の組成物の少なくとも90%が刺激条件の下でのインキュベーションの開始または始動から閾値量、密度、および/または拡大増殖に到達するのに必要とされる時間量は、5日〜25日、7日〜18日もしくは9日〜13日であるか、あるいは7日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは(of)13日であるか、または約7日、8日、9日、10日、11日、12日もしくは(of)13日である。
いくつかの態様において、提供される方法は、細胞療法で用いるのに適した操作されたT細胞のアウトプット組成物を成功裏に作出または産生することに関連して用いられる。いくつかの態様において、組成物の細胞が培養中に閾値細胞数、密度、および/または拡大増殖を達成する場合、アウトプット組成物は成功裏に作出される。特定の態様において、細胞の少なくともおよそ40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%もしくは95%の細胞が組み換え受容体を発現する場合にアウトプット組成物は成功裏に作出される。特定の態様において、アウトプット組成物が、例えば自己細胞療法としての、治療用途に適している場合、アウトプット組成物は成功裏に産生または作出される。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞が1つまたは複数の基準を満たす場合、アウトプット組成物は治療用途に適している。いくつかの態様において、細胞療法で用いるのに適した細胞および/または細胞組成物は、無菌(例えば、検出可能な微生物混入がない)であり、内毒素がなく、複製可能なウイルスがなく、生存可能であり、活性であり(例えば、細胞溶解活性を保有するおよび/もしくは標的抗原に応答してサイトカインを放出する)、ならびに/または組み換え受容体を発現する細胞の高い部分を含有する。
いくつかの態様において、アウトプット細胞の一部分、サンプル、および/または画分は、例えば冷凍凍結の前に、回収され、1つまたは複数のアッセイ法で試験される。いくつかの態様において、1つまたは複数のアッセイ法は、アウトプット細胞を評定する、例えば、アウトプット細胞の特徴、表現型および/または特性を評価、評定および/または定量化する、例えば、アウトプット細胞の安全性および/または生物学的特性を決定または検証するためのアッセイ法を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のアッセイ法は、アウトプット細胞の一部分、サンプル、および/または画分が無菌であることを検証するためのアッセイ法を含みうる。特定の態様において、アッセイ法は、微生物混入、細菌内毒素、残留試薬、および/または複製可能なウイルスの存在についての試験を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のアッセイ法は、1つまたは複数の生物学的特性を測定、検出、および/または定量化する。ある種の態様において、1つまたは複数のアッセイ法は、細胞数、細胞密度、細胞表現型、例えば、CD3、CD4および/もしくはCD8の表面発現、生存性、ならびに/または活性、例えば、サイトカイン放出および/もしくは細胞溶解活性を測定、検出、および/または定量化する。
特定の態様において、1つまたは複数のアッセイ法は、アウトプット細胞が注入のために放出され、対象への投与の状態にあり、および/または対象に投与される前に実施される。特定の態様において、例えば、アウトプット細胞の一部分、画分、および/またはサンプルに対して1つまたは複数のアッセイ法が実施された後に、アウトプット細胞が注入のために放出され、対象への投与の状態にあり、および/または対象に投与される。特定の態様において、1つまたは複数のアッセイ法の完了後にアウトプット細胞が安全である、例えば、無菌および/もしくは遊離状態である、ならびに/または所望の生物学的特性を有すると決定された後に、アウトプット細胞が注入のために放出され、対象への投与の状態にあり、および/または対象に投与される。
特定の態様において、提供される方法は、インプット細胞および/または生体サンプルの組成物から濃縮T細胞のアウトプット組成物を成功裏に作出または産生する少なくともおよそ80%、少なくともおよそ81%、少なくともおよそ82%、少なくともおよそ83%、少なくともおよそ84%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ86%、少なくともおよそ87%、少なくともおよそ88%、少なくともおよそ89%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ91%、少なくともおよそ92%、少なくともおよそ93%、少なくともおよそ94%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ96%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ98%、または少なくともおよそ99%の確率または可能性を有する。ある種の態様において、確率または可能性は85%〜100%、90%〜95%、または92%〜94%である。ある種の態様において、提供される方法は、インプット細胞の複数の組成物由来のおよび/または複数の生体サンプルの少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ81%、少なくともおよそ82%、少なくともおよそ83%、少なくともおよそ84%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ86%、少なくともおよそ87%、少なくともおよそ88%、少なくともおよそ89%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ91%、少なくともおよそ92%、少なくともおよそ93%、少なくともおよそ94%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ96%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ98%、または少なくともおよそ99%の組成物および/またはサンプルから濃縮T細胞のアウトプット組成物を成功裏に作出または産生する。いくつかの態様において、提供される方法は、インプット細胞の複数の組成物由来のおよび/または複数の生体サンプルのおよそ85%〜およそ100%、およそ90%〜およそ95%、またはおよそ92%〜およそ94%の組成物および/またはサンプルから濃縮T細胞のアウトプット組成物を成功裏に作出または産生する。
いくつかの態様において、プロセスは、異なる対象由来のサンプルの少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または少なくとも99.9%から得られ、選択され、または濃縮された細胞について21日以内に完了し、少なくとも80%、85%、90%、95%、99%またはそれ以上の成功率を有する。いくつかの態様において、プロセスは、異なる対象由来のサンプルの90%もしくは少なくともおよそ90%、91%もしくは少なくともおよそ91%、92%もしくは少なくともおよそ92%、93%もしくは少なくともおよそ93%、94%もしくは少なくともおよそ94%、95%もしくは少なくともおよそ95%、96%もしくは少なくともおよそ96%、97%もしくは少なくともおよそ97%、98%もしくは少なくともおよそ98%、99%もしくは少なくともおよそ99%、あるいは100%から得られ、選択され、または濃縮された細胞について21日以内に完了する。いくつかの態様において、プロセスは、対象から細胞を得る、選択するまたは濃縮することから21日以内に対象への注入の状態にある操作された細胞を産生するために90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%または少なくともおよそ90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の成功率を有する。ある種の態様において、プロセスは、異なる対象由来のサンプルの少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または少なくとも99.9%から得られ、選択され、または濃縮された細胞について21日以内に完了し、少なくとも80%、85%、90%、95%、99%またはそれ以上の成功率を有する。
特定の態様において、プロセスは、異なる対象由来のサンプルの少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または少なくとも99.9%から得られ、選択され、または濃縮された細胞について14日〜18日に完了し、少なくとも80%、85%、90%、95%、99%またはそれ以上の成功率を有する。ある種の態様において、プロセスは、異なる対象由来のサンプルの少なくともおよそ75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または少なくとも99.9%から得られ、選択され、または濃縮された細胞について14日〜18日に完了し、少なくとも80%、85%、90%、95%、99%またはそれ以上の成功率を有する。
特定の態様において、提供される方法に関連するプロセスは、少なくともおよそ0.5%、少なくともおよそ1%、少なくともおよそ1.5%、少なくともおよそ2%、少なくともおよそ2.5%、少なくともおよそ3%、少なくともおよそ3.5%、少なくともおよそ4.0%、少なくともおよそ4.5%、少なくともおよそ5%、少なくともおよそ5.5%、少なくともおよそ6%、少なくともおよそ6.5%、少なくともおよそ7%、少なくともおよそ7.5%、少なくともおよそ8%、少なくともおよそ8.5%、少なくともおよそ9%、少なくともおよそ9.5%、または少なくともおよそ10%だけ、あるいは10%超だけアウトプット組成物を成功裏に作出または産生する代替的および/または例示的プロセスの確率または可能性よりも高いアウトプット組成物を成功裏に作出または産生する確率または可能性を有する。
G. アウトプット組成物の例示的な特徴
ある種の態様において、提供される方法は、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット組成物を作出または産生するためのプロセスに関連して用いられる。特定の態様において、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット組成物は、血液サンプルもしくは白血球アフェレーシスサンプルのような、生体サンプルから回収され、得られ、単離され、選択され、および/もしくは濃縮され; 刺激条件の下でインキュベートされ; 組み換えポリヌクレオチド、例えば、CARのような組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現もしくは含有するように、操作され、例えば、形質導入され; 閾値量、密度もしくは拡大増殖まで培養され; ならびに/または配合された細胞であるかまたはそれらを含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、例えば、プロセスの1つまたは複数の段階の間、前、および/または後に、あらかじめ冷凍凍結および融解されている。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、組み換え受容体、例えば、CARを発現するT細胞、例えば、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含有する。
ある種の態様において、提供される方法は、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット組成物を作出または産生するためのプロセスに関連して用いられる。特定の態様において、アウトプット細胞および/または濃縮T細胞のアウトプット組成物は、血液サンプルもしくは白血球アフェレーシスサンプルのような、生体サンプルから回収され、得られ、単離され、選択され、および/もしくは濃縮され; 刺激条件の下でインキュベートされ; 組み換えポリヌクレオチド、例えば、CARのような組み換え受容体をコードするポリヌクレオチドを発現もしくは含有するように、操作され、例えば、形質導入され; 閾値量、密度もしくは拡大増殖まで培養され; ならびに/または配合された細胞であるかまたはそれらを含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、例えば、プロセスの1つまたは複数の段階の間、前、および/または後に、あらかじめ冷凍凍結および融解されている。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、組み換え受容体、例えば、CARを発現するT細胞、例えば、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含有する。
特定の態様において、アウトプット組成物は、濃縮CD3+ T細胞について濃縮された細胞の組成物である。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ98%、少なくともおよそ99%、少なくともおよそ99.5%、少なくともおよそ99.9%、またはおよそ(at or at about) 100%のCD3+ T細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、CD3+ T細胞から本質的になる。ある種の態様において、アウトプット組成物は、濃縮CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞について濃縮された細胞の組成物である。特定の態様において、アウトプット組成物は、CD4+またはCD8+T細胞である少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ98%、少なくともおよそ99%、少なくともおよそ99.5%、少なくともおよそ99.9%、またはおよそ(at or at about) 100%の細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、CD4+およびCD8+ T細胞から本質的になる。
特定の態様において、アウトプット組成物は、10%〜90%、20%〜80%、25%〜75%、30%〜70%、35%〜65%、40%〜60%、55%〜45%、または約10%〜約90%、約20%〜約80%、約25%〜約75%、約30%〜約70%、約35%〜約65%、約40%〜約60%、約55%〜約45%、または約50%もしくは50% CD4+ T細胞と、10%〜90%、20%〜80%、25%〜75%、30%〜70%、35%〜65%、40%〜60%、55%〜45%、または約10%〜約90%、約20%〜約80%、約25%〜約75%、約30%〜約70%、約35%〜約65%、約40%〜約60%、約55%〜約45%、または約50%もしくは50% CD8+ T細胞とを含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、およそ35%〜およそ65%、およそ40%〜およそ60%、およそ55%〜およそ45%、または約50%もしくは50% CD4+ T細胞およびおよそ35%〜およそ65%、およそ40%〜およそ60%、およそ55%〜およそ45%、または約50%もしくは50% CD8+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプットは、およそ35%〜およそ65% CD4+ T細胞およびおよそ35%〜およそ65% CD8+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比率のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、細胞の組成物は、3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1,1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3または約3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1,1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3の比率を有する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ98%、または少なくともおよそ99%は、10:90〜90:10、20:80〜80:20、75:25〜25:75、70:30〜30:70、35:65〜65:35、40:60〜60:40、45:55〜55:45、または約50:50もしくは50:50のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞の比率を有する。特定の態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも80%、少なくとも85%、または少なくとも90%は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比率のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞を有する。ある種の態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90%は、1:2〜2:1のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞の比率を有する。特定の態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90%は、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.1:1〜1:1.1のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞の比率を有する。
いくつかの態様において、アウトプット組成物は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比率の、組み換え受容体、例えば、CARを発現するCD4+ T細胞と、組み換え受容体、例えば、CARを発現するCD8+ T細胞とを含有する。いくつかの態様において、細胞の組成物は、3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1,1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3または約3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1,1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3の比率を有する。
特定の態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも80%、少なくとも85%、または少なくとも90%は、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の比率の、組み換え受容体、例えば、CARを発現するCD4+ T細胞と、組み換え受容体、例えば、CARを発現するCD8+ T細胞とを有する。ある種の態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90%は、1:2〜2:1のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞の比率を有する。特定の態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット組成物の少なくとも90%は、1.5:1〜1:1.5、1.25:1〜1:1.25、1.1:1〜1:1.1のCD4+ T細胞 対 CD8+ T細胞の比率を有する。
いくつかの態様において、提供される方法に関連して作出または産生されたアウトプット組成物は、組み換え受容体、例えば、TCRまたはCARを発現する細胞を含有する。いくつかの態様において、組み換え受容体を発現することは、細胞膜および/もしくは細胞表面に局在する1つもしくは複数の組み換え受容体タンパク質を有すること、検出可能な量の組み換え受容体タンパク質を有すること、組み換え受容体をコードする検出可能な量のmRNAを有すること、組み換え受容体をコードする組み換えポリヌクレオチドを有することもしくは含有すること、ならびに/または組み換え受容体発現の代用マーカーであるmRNAもしくはタンパク質を有することもしくは含有することを含みうるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ99%、または99%超が組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ50%が組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ99%、または99%超が組み換え受容体を発現する。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ50%が組み換え受容体を発現する。特定の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ99%、または99%超が組み換え受容体を発現する。特定の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくともおよそ50%が組み換え受容体を発現する。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ65%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ97%、少なくともおよそ99%、または99%超が組み換え受容体を発現する。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくともおよそ50%が組み換え受容体を発現する。
特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%の生存細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ75%の生存細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%の生存細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%の生存CD3+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ75%の生存CD3+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%の生存CD3+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%の生存CD4+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ75%の生存CD4+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%の生存CD4+ T細胞を含有する。特定の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%の生存CD8+ T細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ75%の生存CD8+ T細胞を含有する。ある種の態様において、アウトプット組成物は、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%の生存CD8+ T細胞を含有する。
特定の態様において、アウトプット細胞は、アポトーシスを起こしている、および/もしくはアポトーシス調製されている、刺激されている、ならびに/またはアポトーシスに入っている細胞の割合および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット細胞は、アポトーシスマーカーに対して陽性である細胞の割合および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ40%未満、およそ35%未満、およそ30%未満、およそ25%未満、およそ20%未満、およそ15%未満、およそ10%未満、およそ5%未満、またはおよそ1%未満がアポトーシスマーカーを発現し、アポトーシスマーカーを含有し、および/またはアポトーシスマーカー陽性である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ25%未満がアポトーシスのマーカーを発現し、アポトーシスのマーカーを含有し、および/またはアポトーシスのマーカー陽性である。ある種の態様において、アウトプット組成物のおよそ10%未満の細胞がアポトーシスマーカーを発現し、アポトーシスマーカーを含有し、および/またはアポトーシスマーカー陽性である。
特定の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくともおよそ90%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ90%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくともおよそ90%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。
特定の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+)細胞の少なくともおよそ90%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD3+ T細胞の少なくともおよそ90%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、少なくともおよそ99%、または少なくともおよそ99.9%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。特定の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の組み換え受容体発現(例えば、CAR+) CD3+ T細胞の少なくとも90%が生存細胞、例えば、カスパーゼ(例えば、活性化カスパーゼ-3)のような、アポトーシスマーカー陰性の細胞である。前記の(proceeding)態様のいずれにおいても、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物は、同じまたは異なるドナーに由来しうる。いくつかの局面において、複数のアウトプット組成物の少なくとも2つは、異なるドナーに由来する。いくつかの局面において、複数のアウトプット組成物の各々は、いくつかの異なるドナーの1人、例えば、約2人、約5人、約10人、約15人、約20人、約25人、約30人、約35人、約40人、約45人、約50人、約55人、約60人、または約60人超の異なるドナー、例えば、CAR-T細胞療法のような細胞療法を必要としている患者に由来する。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の大部分は、ナイーブ、中央記憶、および/またはエフェクタ記憶細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の大部分は、ナイーブまたは中央記憶細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の大部分は、中央記憶細胞である。いくつかの局面において、低分化細胞、例えば、中央記憶細胞は、より長く生存し、急速に排出されないため、持続性および耐久性が増している。いくつかの局面において、CAR-T細胞療法のような、細胞療法に対する応答者は、中央記憶遺伝子の発現が増加している。例えば、Fraietta et al. (2018) Nat Med. 24(5):563-571を参照されたい。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、中央記憶細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は中央記憶T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%は記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のT細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のT細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のT細胞のおよそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%は記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は中央記憶CD4+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は、中央記憶CD4+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+ T細胞のおよそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%は、中央記憶CD4+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は、中央記憶CD4+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は、中央記憶CD4+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD4+CAR+ T細胞のおよそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%は、中央記憶CD4+CAR+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は、中央記憶CD8+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は、中央記憶CD8+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+ T細胞のおよそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%は、中央記憶CD8+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は、中央記憶CD8+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は、中央記憶CD8+CAR+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCD8+CAR+ T細胞のおよそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%は、中央記憶CD8+CAR+ T細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物のCAR+ T細胞(例えば、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞)の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超は、中央記憶CD4+またはCD8+ T細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物のCAR+ T細胞(例えば、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞)の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%は中央記憶CD4+またはCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、組成物中の細胞の少なくとももしくはおよそ30%、少なくとももしくはおよそ40%、少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ60%、少なくとももしくはおよそ70%、少なくとももしくはおよそ75%、少なくとももしくはおよそ80%、少なくとももしくはおよそ85%、少なくとももしくはおよそ90%、少なくとももしくはおよそ95%、または95%超はCD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。いくつかの態様において、組成物中のCAR+ T細胞の少なくとももしくはおよそ50%、少なくとももしくはおよそ55%、少なくとももしくはおよそ60%、または少なくとももしくはおよそ65%はCD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。
いくつかの態様において、方法の反復により、複数の異なる個々の対象間で方法が実行される任意でヒト生体サンプル由来の、複数のアウトプット組成物が産生される。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物における記憶表現型の細胞の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物における中央記憶表現型の細胞の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物におけるCD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である細胞の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物におけるCCR7+/CD45RA-またはCCR7+/CD45RO+である細胞の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物の操作されたCD4+ T細胞(例えば、CAR+CD4+ T細胞)における中央記憶CD4+ T細胞の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物の操作されたCD8+ T細胞(例えば、CAR+CD8+ T細胞)における中央記憶CD8+ T細胞の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。いくつかの態様において、複数のアウトプット組成物の操作されたT細胞(例えば、CAR+ T細胞)における中央記憶T細胞(例えば、CD4+中央記憶T細胞およびCD8+中央記憶T細胞)の平均(average) (すなわち、平均(mean))または中央値の割合は、およそ40%〜およそ65%、およそ40%〜およそ45%、およそ45%〜およそ50%、およそ50%〜およそ55%、およそ55%〜およそ60%、またはおよそ60%〜およそ65%である。
いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超は、記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、または少なくともおよそ65%は、記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超は、CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。いくつかの態様において、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、または少なくともおよそ65%は、CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、グランザイムB-、および/またはCD127+である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のT細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超は、記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のT細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、または少なくともおよそ65%は、記憶表現型のものであるか、中央記憶表現型のものであるか、または中央記憶T細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超は、中央記憶CD4+ T細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD4+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、または少なくともおよそ65%は、中央記憶CD4+ T細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超は、中央記憶CD8+ T細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD8+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、または少なくともおよそ65%は、中央記憶CD8+ T細胞である。いくつかの態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超は、中央記憶CD4+またはCD8+ T細胞である。ある種の態様において、平均して、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、または少なくともおよそ65%は、中央記憶CD4+またはCD8+ T細胞である。前記の(proceeding)態様のいずれにおいても、本明細書において開示される方法によって産生された複数のアウトプット組成物は、同じまたは異なるドナーに由来しうる。いくつかの局面において、複数のアウトプット組成物の少なくとも2つは、異なるドナーに由来する。いくつかの局面において、複数のアウトプット組成物の各々は、いくつかの異なるドナーの1人、例えば、約2人、約5人、約10人、約15人、約20人、約25人、約30人、約35人、約40人、約45人、約50人、約55人、約60人、または約60人超の異なるドナー、例えば、CAR-T細胞療法のような細胞療法を必要としている患者に由来する。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、消耗したおよび/または老化した細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、消耗したおよび/または老化した細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ40%未満、およそ35%未満、およそ30%未満、およそ25%未満、およそ20%未満、およそ15%未満、およそ10%未満、およそ5%未満、またはおよそ1%未満が消耗および/または老化している。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ25%未満が消耗および/または老化している。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ10%未満が消耗および/または老化している。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27およびCD28の発現、例えば表面発現について陰性である細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27-CD28-細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ40%未満、およそ35%未満、およそ30%未満、およそ25%未満、およそ20%未満、およそ15%未満、およそ10%未満、およそ5%未満、またはおよそ1%未満がCD27-CD28-細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ25%未満がCD27-CD28-細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ10%未満がCD27-CD28-細胞である。態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ5%未満がCD27-CD28-細胞である。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27およびCD28の発現、例えば表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CD27+CD28+細胞の部分および/または頻度が高い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ75%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ85%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ95%、またはおよそ95%超がCD27+CD28+細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ25%未満がCD27-CD28-細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ50%がCD27+CD28+細胞である。態様において、アウトプット組成物の細胞の少なくともおよそ75%がCD27+CD28+細胞である。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、TEMRA細胞である細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、TEMRA細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ40%未満、およそ35%未満、およそ30%未満、およそ25%未満、およそ20%未満、およそ15%未満、およそ10%未満、およそ5%未満、またはおよそ1%未満がTEMRA細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ25%未満がTEMRA細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ10%未満がTEMRA細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ5%未満がTEMRA細胞である。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、CCR7発現について陰性であり、かつCD45RA発現、例えば表面発現について陽性である細胞の部分および/または頻度が低い。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、CCR7-CD45RA+細胞の部分および/または頻度が低い。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ40%未満、およそ35%未満、およそ30%未満、およそ25%未満、およそ20%未満、およそ15%未満、およそ10%未満、およそ5%未満、またはおよそ1%未満がCCR7-CD45RA+細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ25%未満がCCR7-CD45RA+細胞である。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ10%未満がCCR7-CD45RA+細胞である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞のおよそ5%未満がCCR7-CD45RA+細胞である。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、代替プロセスによって産生されるアウトプット細胞と同様に抗原刺激に応答したサイトカイン産生を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞と同様に、抗原刺激に応答したサイトカイン、例えば、TNF-α、IFN-γ、および/またはIL-2の産生を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は代替プロセスと比較して、抗原による刺激に応答した1つまたは複数のサイトカインの産生の50%、60%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍の増加を有するか、約50%、60%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍の増加を有するか、または少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍の増加を有する。いくつかの態様において、サイトカインの産生は、ELISAおよび/または抗体に基づく検出方法を含むがこれらに限定されない、標準的な公知の技法によって測定または評価されうる。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、代替プロセスによって産生されるアウトプット細胞の部分、割合および/または量と同様に、抗原刺激に応答して1つまたは複数のサイトカインを産生する細胞の部分、割合および/または量を有する。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞の約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%もしくは100%または少なくとも10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%もしくは100%が抗原刺激に応答して1つまたは複数のサイトカイン、例えば、TNF-α、IFN-γ、および/またはIL-2を産生する。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインを産生するアウトプット組成物の細胞の部分、割合および/または量は、1つまたは複数のサイトカインを産生する代替プロセスによって産生されるアウトプット細胞の部分、割合および/または量よりも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、75%、100%、125%、150%もしくは1倍、2倍、3倍または少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、75%、100%、125%、150%もしくは1倍、2倍、3倍大きい。ある種の態様において、サイトカインを産生する細胞の部分、割合および/または量は、細胞内サイトカイン染色(ICS)アッセイ法を含む、任意の公知のまたは標準的な技法によって測定または評価されうる。
特定の態様において、アウトプット組成物は、組み換え受容体、例えばCARを発現する機能細胞を含有する。いくつかの態様において、組み換え受容体を発現する細胞の少なくとも一部分は、抗原刺激に応答して1つまたは複数のサイトカインを産生する。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-2、TNF-α、および/またはIFN-γを含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞、例えば、サンプルおよび/またはアウトプット細胞の一部分は、抗原刺激機能および/または活性について試験、評価、および/または測定される。ある種の態様において、細胞は、サイトカイン産生、発現、および/または分泌を測定することができる任意の公知のアッセイ法によって、抗原刺激の後または間にサイトカイン産生について試験される。いくつかの態様において、細胞は内部サイトカイン染色(ICS)アッセイ法で試験される。特定の態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも25%のCD4+細胞および少なくとも15%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、抗原刺激後にIL-2陽性である。いくつかの態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも5%のCD4+細胞および少なくとも5%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、抗原刺激後にIFN-γ陽性である。ある種の態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも40%のCD4+細胞および少なくとも20%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、抗原刺激後にTNF-α陽性である。ある種の態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも2.5%のCD4+細胞および少なくとも2%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、抗原刺激後にIL-2、IFN-γ、およびTNF-αの全てについて陽性である。
ある種の態様において、組み換え受容体を発現する細胞の少なくとも一部分は、活性化または刺激、例えば、一般的な活性化または刺激、T細胞活性化もしくは刺激および/またはPMAおよびイオノマイシンによる活性化もしくは刺激に応答して1つまたは複数のサイトカインを産生する。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-2、TNF-α、および/またはIFN-γを含むが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞、例えば、サンプルおよび/またはアウトプット細胞の一部分は、例えばPMAおよびイオノマイシンによる、活性化または刺激により機能および/または活性について試験、評価、および/または測定される。ある種の態様において、細胞は、ICSアッセイ法でのような、サイトカイン産生、発現、および/または分泌を測定することができる任意の公知のアッセイ法によって、活性化または刺激の後または間にサイトカイン産生について試験される。いくつかの態様において、細胞は、PMAおよびイオノマイシンで刺激され、ICSアッセイ法で評価される。いくつかの態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも50%のCD4+細胞および少なくとも25%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、PMAおよびイオノマイシンによる刺激または活性化の後にIL-2陽性である。いくつかの態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも30%のCD4+細胞および少なくとも10%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、PMAおよびイオノマイシンでの刺激または活性化の後にIFN-γ陽性である。ある種の態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも50%のCD4+細胞および少なくとも15%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、PMAおよびイオノマイシンでの刺激または活性化の後にTNF-α陽性である。ある種の態様において、組み換え受容体を発現する少なくとも10%のCD4+細胞および少なくとも5%のCD8+細胞は、ICSによって測定される場合、PMAおよびイオノマイシンでの刺激または活性化の後にIL-2、IFN-γ、およびTNF-αの全てについて陽性である。
いくつかの態様において、対象、例えば、がんのような疾患または状態を有する対象へのアウトプット組成物の細胞の投与は、生存の確率および/または可能性を改善する。例えば、いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、疾患または状態を有する対象に投与され、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヶ月にわたる、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヶ月にわたる、または少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヶ月にわたる、あるいは1、2、3、4、5、10年もしくは10年超にわたる生存の確率および/または可能性は、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%である。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞を用いた投与は、代替プロセスのアウトプット細胞を用いた投与よりも少なくとも10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、または少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍高い生存の確率および/または可能性を提供する。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、対象に投与される。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、疾患または状態を処置するために投与される。いくつかの態様において、疾患または状態はがんである。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は対象に投与され、対象は、がん細胞および/または腫瘍体積の低減を経験する。いくつかの態様において、対象は、例えば、投与前の対象におけるがん細胞の量および/または腫瘍体積と比較して、アウトプット組成物の細胞の投与後に25%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%のがん細胞の量および/または腫瘍体積の低減を有するか、約25%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%のがん細胞の量および/または腫瘍体積の低減を有するか、あるいは少なくとも25%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%のがん細胞の量および/もしくは腫瘍体積の低減を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の投与は、例示的な代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞の投与後の対象における腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低減と比較して対象における腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低減の増加をもたらす。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の投与は、例示的な代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞の投与後の対象における腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低減と比較して、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、3倍、4倍もしくは(of) 5倍、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、3倍、4倍もしくは(of) 5倍、または少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、3倍、4倍もしくは(of) 5倍の対象における腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低減の増加をもたらす。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞、例えば、アウトプット組成物の細胞の一部分および/または用量が対象に投与される。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、完全寛解(CR)を達成および/または経験する確率および/または可能性を有する。ある種の態様において、CRを達成および/または経験する可能性および/または確率は、少なくともおよそ10%、少なくともおよそ15%、少なくともおよそ20%、少なくともおよそ25%、少なくともおよそ30%、少なくともおよそ35%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%である。ある種の態様において、CRを達成および/または経験する確率および/または可能性は、少なくともおよそ25%である。特定の態様において、CRを達成する確率および/または可能性は、少なくともおよそ50%である。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、ORRを達成および/または経験する確率および/または可能性を有する。ある種の態様において、ORRを達成および/または経験する可能性および/または確率は、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ45%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ55%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ90%、または少なくともおよそ95%である。ある種の態様において、ORRを達成および/または経験する確率および/または可能性は、少なくともおよそ80%である。特定の態様において、ORRを達成する確率および/または可能性は、少なくともおよそ90%である。ある種態様において、ORRを達成する確率および/または可能性は、100%であるか、または約100%である。
いくつかの態様において、アウトプット細胞の有効性、例えば、対象がアウトプット組成物の細胞の投与後にCRまたはORRを達成および/または経験する確率は、代替プロセスによって産生される組み換え受容体を発現する細胞を含有する治療用細胞組成物のそれよりも大きい。ある種の態様において、代替プロセスによって産生される治療用細胞組成物の細胞の投与と比較してアウトプット細胞の投与後にCRまたはORRを達成する確率は少なくともおよそ5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、1倍、2倍、5倍、10倍、50倍または100倍高い。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞と、組み換え受容体(例えば、標的細胞)によって結合および/または認識される抗原を発現する細胞に対して類似の細胞溶解活性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞が抗原を発現する細胞、例えば標的細胞に曝露される場合、アウトプット組成物の細胞は、抗原を発現する細胞の25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%もしくは100%を死滅化するか、約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%もしくは100%を死滅化するか、または少なくともおよそ25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%もしくは100%を死滅化する。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞は、類似のまたは同じ条件の下で例示的な代替プロセスによって産生されたアウトプット細胞よりも、抗原を発現する細胞、例えば標的細胞の少なくともおよそ25%、50%、75%、100%、150%、または1倍、2倍、3倍、4倍もしくは5倍高い量を死滅化する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法によって産生されるアウトプット細胞は、高いおよび/または比較的高い安全度を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞、例えば、アウトプット組成物の細胞の一部分および/または用量は、対象に投与される。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、およそ80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%または5%未満である、毒性、例えば、CRSまたは神経毒性を経験するリスク、確率、および/または可能性を有する。いくつかの態様において、毒性は、任意のグレードの神経毒性またはCRSである。ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、任意のグレードのCRSまたは神経毒性を経験することについて80%未満のリスク、確率、および/または可能性を有する。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、任意のグレードのCRSまたは神経毒性を経験することについて80%未満のリスク、確率、および/または可能性を有する。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、およそ50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、または5%未満であるグレード3またはそれ以上のCRSを経験するリスク、確率、および/または可能性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、グレード3またはそれ以上のCRSを経験することについて10%未満のリスク、確率、および/または可能性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、グレード3またはそれ以上のCRSを経験することについて5%未満のリスク、確率、および/または可能性を有する。
ある種の態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、およそ50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%もしくは5%未満であるか、または0%であるか、もしくは約0%であるか、および/または無視できるグレード3またはそれ以上の神経毒性を経験するリスク、確率、および/または可能性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、グレード3またはそれ以上の神経毒性を経験することについて5%未満のリスク、確率、および/または可能性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞を投与される対象は、グレード3またはそれ以上の神経毒性を経験することについて約0%のリスク、確率、および/もしくは可能性ならびに/または無視できるリスクを有する。
II. 無血清培地配合物および関連構成成分
本出願は、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)、および少なくとも1つのタンパク質を含有する無血清培地を提供する。本出願はまた、基礎培地がグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)およびタンパク質を含まない、少なくとも1つの合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)を含む液体基礎培地を提供する。本出願はまた、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)、および場合によっては、血清代替タンパク質などの少なくとも1つのタンパク質を含む、凍結サプリメントを提供する。血清代替タンパク質などの少なくとも1つのタンパク質、または細胞の成長および拡大増殖を支持する1つもしくは複数の他の構成成分を含有する1つまたは複数のサプリメントを含む、1つまたは複数のさらなるサプリメントを加えることができる。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5 mMまたは約0.5 mMから5 mMまたは約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、L-グルタミンの濃度は、0.5 mMまたは約0.5 mMから5 mMまたは約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、血清代替タンパク質、例えばアルブミンなどの、ヒトタンパク質または組換えタンパク質である。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数のサイトカイン(IL-2、IL-7、またはIL-15など)をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地はフェノールレッドを含まない。
本出願は、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)、および少なくとも1つのタンパク質を含有する無血清培地を提供する。本出願はまた、基礎培地がグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)およびタンパク質を含まない、少なくとも1つの合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)を含む液体基礎培地を提供する。本出願はまた、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)、および場合によっては、血清代替タンパク質などの少なくとも1つのタンパク質を含む、凍結サプリメントを提供する。血清代替タンパク質などの少なくとも1つのタンパク質、または細胞の成長および拡大増殖を支持する1つもしくは複数の他の構成成分を含有する1つまたは複数のサプリメントを含む、1つまたは複数のさらなるサプリメントを加えることができる。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5 mMまたは約0.5 mMから5 mMまたは約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、L-グルタミンの濃度は、0.5 mMまたは約0.5 mMから5 mMまたは約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、血清代替タンパク質、例えばアルブミンなどの、ヒトタンパク質または組換えタンパク質である。いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数のサイトカイン(IL-2、IL-7、またはIL-15など)をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地はフェノールレッドを含まない。
いくつかの態様において、提供される無血清培地は、液体基礎培地および1つまたは複数のサプリメントから生成または調製される。
いくつかの態様において、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミンである合成アミノ酸などの、細胞培養においてL-グルタミンに変換されることができる合成アミノ酸を含有する液体基礎培地が提供される。場合によっては、基礎培地はL-グルタミンおよびタンパク質を含まない。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5 mMまたは約0.5 mMから5 mMまたは約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質はヒト由来タンパク質、組換えタンパク質、または両方である。いくつかの態様において、基礎培地はフェノールレッドを含まない。
いくつかの態様において、サプリメントが凍結されているか、またはL-グルタミンがその構成成分になった後に凍結されている、少なくとも1つのタンパク質と、グルタミンの遊離形態、例えばL-グルタミンとを含むサプリメントが提供される。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、200 mM未満、例えば150 mM未満、100 mMまたはそれ以下、例えば20 mM〜120 mM、または40 mM〜100 mM、例えば約80 mMである。いくつかの態様において、サプリメントが基礎培地と組み合わされた後のL-グルタミンの濃度は、約0.5 mM〜約5 mM (例えば2 mM)である。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトタンパク質もしくはヒト由来タンパク質であるか、または組換えである。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質はアルブミン、例えばヒトまたは組換えヒトアルブミンを含む。
A. 基礎培地
いくつかの態様において、基礎培地はアミノ酸を含む。いくつかの態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、スレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、システイン、バリン、メチオニン、ノルバリン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、および/またはプロリンを含む。
いくつかの態様において、基礎培地はアミノ酸を含む。いくつかの態様において、アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン、スレオニン、アルギニン、アラニン、チロシン、システイン、バリン、メチオニン、ノルバリン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、および/またはプロリンを含む。
いくつかの態様において、基礎培地は、少なくとも1つの合成アミノ酸を含む。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、細胞を含む細胞培養物中でグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換することができる。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
いくつかの態様において、合成アミノ酸は、グルタミンの安定化形態(すなわち、L-グルタミン)である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、水溶液(例えば、基礎培地)中でグルタミン(すなわち、L-グルタミン)よりも安定である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に有意な量のグルタミンを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、3、5、7、9、11、13、または14日間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、または8週間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも1、2、3、4、または5年間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、3、5、7、9、11、13、または14日間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、または8週間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、基礎培地中に少なくとも1、2、3、4、または5年間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。
いくつかの態様において、合成アミノ酸は、水溶液(例えば、基礎培地)に可溶性である。いくつかの態様において、水溶液中の合成アミノ酸の溶解度は、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)よりも高い。
いくつかの態様において、合成アミノ酸は細胞に輸送されることができ、そこで合成アミノ酸はグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができる。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
いくつかの態様において、合成アミノ酸はジペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸はトリペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)である。
いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、約0.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、およそ2 mMである。いくつかの態様において、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、0.5 mM〜1 mM、0.5 mM〜1.5 mM、0.5 mM〜2 mM、0.5 mM〜2.5 mM、0.5 mM〜3 mM、0.5 mM〜3.5 mM、0.5 mM〜4 mM、0.5 mM〜4.5 mM、0.5 mM〜5 mM、1 mM〜1.5 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜2.5 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜3.5 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜4.5 mM、1 mM〜5 mM、1.5 mM〜2 mM、1.5 mM〜2.5 mM、1.5 mM〜3 mM、1.5 mM〜3.5 mM、1.5 mM〜4 mM、1.5 mM〜4.5 mM、1.5 mM〜5 mM、2 mM〜2.5 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜3.5 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜4.5 mM、2 mM〜5 mM、2.5 mM〜3 mM、2.5 mM〜3.5 mM、2.5 mM〜4 mM、2.5 mM〜4.5 mM、2.5 mM〜5 mM、3 mM〜3.5 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜4.5 mM、3 mM〜5 mM、3.5 mM〜4 mM、3.5 mM〜4.5 mM、3.5 mM〜5 mM、4 mM〜4.5 mM、4 mM〜5 mMもしくは4.5 mM〜5 mM、または約0.5 mM〜1 mM、約0.5 mM〜1.5 mM、約0.5 mM〜2 mM、約0.5 mM〜2.5 mM、約0.5 mM〜3 mM、約0.5 mM〜3.5 mM、約0.5 mM〜4 mM、約0.5 mM〜4.5 mM、約0.5 mM〜5 mM、約1 mM〜1.5 mM、約1 mM〜2 mM、約1 mM〜2.5 mM、約1 mM〜3 mM、約1 mM〜3.5 mM、約1 mM〜4 mM、約1 mM〜4.5 mM、約1 mM〜5 mM、約1.5 mM〜2 mM、約1.5 mM〜2.5 mM、約1.5 mM〜3 mM、約1.5 mM〜3.5 mM、約1.5 mM〜4 mM、約1.5 mM〜4.5 mM、約1.5 mM〜5 mM、約2 mM〜2.5 mM、約2 mM〜3 mM、約2 mM〜3.5 mM、約2 mM〜4 mM、約2 mM〜4.5 mM、約2 mM〜5 mM、約2.5 mM〜3 mM、約2.5 mM〜3.5 mM、約2.5 mM〜4 mM、約2.5 mM〜4.5 mM、約2.5 mM〜5 mM、約3 mM〜3.5 mM、約3 mM〜4 mM、約3 mM〜4.5 mM、約3 mM〜5 mM、約3.5 mM〜4 mM、約3.5 mM〜4.5 mM、約3.5 mM〜5 mM、約4 mM〜4.5 mM、約4 mM〜5 mMもしくは約4.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、5 mM〜7.5 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12.5 mM、5 mM〜15 mM、5 mM〜17.5 mM、5 mM〜20 mM、7.5 mM〜10 mM、7.5 mM〜12.5 mM、7.5 mM〜15 mM、7.5 mM〜17.5 mM、7.5 mM〜20 mM、10 mM〜12.5 mM、10 mM〜15 mM、10 mM〜17.5 mM、10 mM〜20 mM、12.5 mM〜15 mM、12.5 mM〜17.5 mM、12.5 mM〜20 mM、15 mM〜17.5 mM、15 mM〜20 mMもしくは17.5 mM〜20 mM、または約5 mM〜7.5 mM、約5 mM〜10 mM、約5 mM〜12.5 mM、約5 mM〜15 mM、約5 mM〜17.5 mM、約5 mM〜20 mM、約7.5 mM〜10 mM、約7.5 mM〜12.5 mM、約7.5 mM〜15 mM、約7.5 mM〜17.5 mM、約7.5 mM〜20 mM、約10 mM〜12.5 mM、約10 mM〜15 mM、約10 mM〜17.5 mM、約10 mM〜20 mM、約12.5 mM〜15 mM、約12.5 mM〜17.5 mM、約12.5 mM〜20 mM、約15 mM〜17.5 mM、約15 mM〜20 mMもしくは約17.5 mM〜20 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、2 mMであるか、または約2 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、多くても2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mM、または約2 mM、約2.5 mM、約3 mM、約3.5 mM、約4 mM、約4.5 mM、約5 mM、約5.5 mM、約6 mM、約6.5 mM、約7 mM、約7.5 mM、約8 mM、約8.5 mM、約9 mM、約9.5 mM、約10 mM、約12.5 mM、約15 mM、約17.5 mMもしくは約20 mMである。
いくつかの態様において、基礎培地は、L-グルタミンを含まないか、または有意な量のL-グルタミンを含まない。いくつかの態様において、基礎培地はL-グルタミンを含む。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンの濃度は、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mMもしくは0.5 mMであるか、または約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mMもしくは約0.5 mMであるか、または0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mMもしくは0.5 mM未満であるか、または約0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mMもしくは0.5 mM未満である。いくつかの態様において、基礎培地中のL-グルタミンの濃度は、1 mM、2 mM、3 mM、4 mMもしくは5 mMであるか、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約4 mMもしくは約5 mMであるか、または1 mM、2 mM、3 mM、4 mMもしくは5 mM未満であるか、または約1 mM、2 mM、3 mM、4 mMもしくは5 mM未満である。
いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸、例えばグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができる少なくとも1つの合成アミノ酸、例えばL-アラニル-L-グルタミンなどの、L-グルタミンのジペプチド形態が、基礎培地中に提供される。いくつかの態様において、基礎培地は人工または合成培地である。いくつかの態様において、基礎培地は平衡塩類溶液(例えば、PBS、DPBS、HBSS、EBSS)である。いくつかの態様において、基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(MEM)、イーグル基礎培地(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、グラスゴー最小必須培地(GMEM)、アルファ最小必須培地(アルファMEM)、イスコフ改変ダルベッコ培地およびM199から選択される。いくつかの態様において、基礎培地は複合培地(例えば、RPMI-1640、IMDM)である。いくつかの態様において、基礎培地は、OpTmizer(商標) CTS(商標) T細胞拡大増殖基礎培地(ThermoFisher)である。
いくつかの態様において、基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸の栄養混合物を含み、ビタミン、有機酸、抗酸化剤、および/または緩衝液を任意で含有してもよい。
いくつかの態様において、基礎培地は、CO3およびHCO3を含む。いくつかの態様において、基礎培地のCO3/HCO3含量は、気体CO2 (例えば、5〜10%)で平衡化され、それによって培地中の最適pHを維持する。いくつかの態様において、基礎培地は、両性イオンHEPESを含む。いくつかの態様において、基礎培地はフェノールレッドを含む。いくつかの態様において、基礎培地はフェノールレッドを含まない。
いくつかの態様において、基礎培地は無機塩を含む。いくつかの態様において、無機塩は浸透圧平衡を促進する。いくつかの態様において、無機塩は、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムイオンを提供することによって膜電位を調節する。
いくつかの態様において、基礎培地は、1つまたは複数の炭水化物を含む。いくつかの態様において、炭水化物はグルコースを含む。いくつかの態様において、炭水化物はガラクトースを含む。いくつかの態様において、炭水化物はマルトースを含む。いくつかの態様において、炭水化物はフルクトースを含む。
いくつかの態様において、基礎培地は脂肪酸を含む。いくつかの態様において、基礎培地は脂質を含む。いくつかの態様において、基礎培地はビタミン(例えば、ビタミンA、ビタミンB7、ビタミンB9、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンE)を含む。いくつかの態様において、基礎培地は微量元素を含む。いくつかの態様において、微量元素は銅を含む。いくつかの態様において、微量元素は亜鉛を含む。いくつかの態様において、微量元素はセレンを含む。いくつかの態様において、微量元素はトリカルボン酸中間体を含む。
いくつかの態様において、基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸、および任意で、ビタミン、有機酸および/もしくは緩衝液または他の周知の細胞培養栄養素の混合物を含有する。栄養素に加えて、培地はpHと浸透圧を維持するのにも役立つ。いくつかの局面において、基礎培地の試薬は、細胞の成長、増殖および/または拡大増殖を支持する。多種多様な市販の基礎培地は当業者に周知であり、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)、イスコフ改変ダルベッコ培地およびハム培地を含む。いくつかの態様において、基礎培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地、RPMI-1640、またはα-MEMである。
いくつかの態様において、基礎培地はタンパク質を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は、ヒトタンパク質(例えば、ヒト血清タンパク質)を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は無血清である。いくつかの態様において、基礎培地は、ヒト由来の血清を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は組換えタンパク質を含まない。いくつかの態様において、基礎培地は、ヒトタンパク質および組換えタンパク質を含まない。
いくつかの態様において、基礎培地はタンパク質またはペプチドを含む。いくつかの態様において、タンパク質はアルブミンまたはアルブミン代替物である。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは天然のヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組換えヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは非ヒト供給源からの組換えアルブミンである。アルブミン代替物は、任意のタンパク質またはポリペプチド源であり得る。そのようなタンパク質またはポリペプチドサンプルの例としては、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物(例えば、米加水分解物)、ウシ胎児アルブミン(フェチュイン)、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、または別の動物由来アルブミン、ニワトリ抽出物、ウシ胚抽出物、AlbuMAX(登録商標) I、およびAlbuMAX(登録商標) IIが挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドはトランスフェリンを含む。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドはフィブロネクチンを含む。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドはアプロチニンを含む。いくつかの態様において、タンパク質はフェチュインを含む。
いくつかの態様において、基礎培地(例えば、ある基礎培地)は液体配合物である。いくつかの態様において、基礎培地(例えば、ある基礎培地)は、意図された使用の前に、凍結されていないか、または(例えば、そのプロトコルに従って)凍結されないように指示される。いくつかの態様において、基礎培地は、2℃〜8℃または約2℃〜8℃で貯蔵される。いくつかの態様において、基礎培地は室温で貯蔵される。いくつかの態様において、基礎培地は、2℃〜8℃で貯蔵された場合、少なくとも1、2、3、4、5もしくは6週間または約1、2、3、4、5もしくは6週間安定である。いくつかの態様において、基礎培地は、2℃〜8℃で貯蔵された場合、少なくとも1、2、3、4、5もしくは6ヶ月間、または少なくとも約1、2、3、4、5もしくは6ヶ月間安定である。
B. サプリメント
いくつかの態様において、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む、第1のサプリメントのような、サプリメントが本明細書において提供される。いくつかの態様において、そのようなサプリメントは、使用および/または基礎培地への組み入れの前に凍結される。いくつかの態様において、本明細書において記述されるものなどのサプリメントは、培地サプリメント(例えば、基礎培地のための培地サプリメント)として用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、細胞の維持、拡大増殖、および/または活性化のためのサプリメントとして用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、細胞の拡大増殖のためのサプリメントとして用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、少なくとも1つのタンパク質およびグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む凍結されたサプリメントを含み、ここで第1のサプリメントを補充した基礎細胞培養培地は、細胞の拡大増殖を支持することができる。いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞はCD4 T 細胞またはCD8 T細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来のT細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の初代免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒトに由来する遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト由来の遺伝子操作されたT細胞(例えば、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞)である。
いくつかの態様において、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む、第1のサプリメントのような、サプリメントが本明細書において提供される。いくつかの態様において、そのようなサプリメントは、使用および/または基礎培地への組み入れの前に凍結される。いくつかの態様において、本明細書において記述されるものなどのサプリメントは、培地サプリメント(例えば、基礎培地のための培地サプリメント)として用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、細胞の維持、拡大増殖、および/または活性化のためのサプリメントとして用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、細胞の拡大増殖のためのサプリメントとして用いられることが意図されている。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、少なくとも1つのタンパク質およびグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む凍結されたサプリメントを含み、ここで第1のサプリメントを補充した基礎細胞培養培地は、細胞の拡大増殖を支持することができる。いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞はCD4 T 細胞またはCD8 T細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来のT細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト由来の初代免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒトに由来する遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト由来の遺伝子操作されたT細胞(例えば、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞)である。
いくつかの態様において、第1のサプリメントは、その意図された使用の前に、-20℃〜0℃または約-20℃〜約0℃で貯蔵されるか、または貯蔵されることが推奨される。いくつかの態様において、サプリメントは、約0℃未満で貯蔵されるか、または貯蔵されることが推奨される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった直後にまたはすぐ後に、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで凍結される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった後に大部分の時間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで凍結される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった後に1、2、3、4、5、6、または7日超の間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで液体として保持されない。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になった後に4、8、12、16、20もしくは24時間超または約4、8、12、16、20もしくは24時間超の間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで液体として保持されない。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になる前と後の両方の大部分の時間、サプリメントがその意図された用途に用いられる時まで凍結される。いくつかの態様において、サプリメントは、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)がその構成成分になる時に室温であるか、または室温未満である(例えば、サプリメントの温度は20℃、15℃、10℃、5℃もしくは0℃下または約20℃、15℃、10℃、5℃もしくは0℃下である)。
いくつかの態様において、サプリメントが解凍される場合に、サプリメント中のL-グルタミンは沈殿しない。いくつかの態様において、サプリメントが液体である場合に、サプリメント中のL-グルタミンは沈殿しない。いくつかの態様において、サプリメントが室温下で解凍される場合に、サプリメント中のL-グルタミンは沈殿しない。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、200 mM、180 mM、160 mM、140 mM、120 mM、100 mMもしくは80 mMであるか、または約200 mM、180 mM、160 mM、140 mM、120 mM、100 mMもしくは80 mMであるか、または200 mM、180 mM、160 mM、140 mM、120 mM、100 mMもしくは80 mM未満であるか、または約200 mM、180 mM、160 mM、140 mM、120 mM、100 mMもしくは80 mM未満である。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、10 mM〜30 mM、10 mM〜50 mM、10 mM〜70 mM、10 mM〜90 mM、10 mM〜110 mM、10 mM〜130 mM、10 mM〜150 mM、10 mM〜170 mM、30 mM〜50 mM、30 mM〜70 mM、30 mM〜90 mM、30 mM〜110 mM、30 mM〜130 mM、30 mM〜150 mM、30 mM〜170 mM、50 mM〜70 mM、50 mM〜90 mM、50 mM〜110 mM、50 mM〜130 mM、50 mM〜150 mM、50 mM〜170 mM、70 mM〜90 mM、70 mM〜110 mM、70 mM〜130 mM、70 mM〜150 mM、70 mM〜170 mM、90 mM〜110 mM、90 mM〜130 mM、90 mM〜150 mM、90 mM〜170 mM、110 mM〜130 mM、110 mM〜150 mM、110 mM〜170 mM、130 mM〜150 mM、130 mM〜170 mM、もしくは150 mM〜170 mM、またはおよそ10 mM〜およそ30 mM、およそ10 mM〜およそ50 mM、およそ10 mM〜およそ70 mM、およそ10 mM〜およそ90 mM、およそ10 mM〜およそ110 mM、およそ10 mM〜およそ130 mM、およそ10 mM〜およそ150 mM、およそ10 mM〜およそ170 mM、およそ30 mM〜およそ50 mM、およそ30 mM〜およそ70 mM、およそ30 mM〜およそ90 mM、およそ30 mM〜およそ110 mM、およそ30 mM〜およそ130 mM、およそ30 mM〜およそ150 mM、およそ30 mM〜およそ170 mM、およそ50 mM〜およそ70 mM、およそ50 mM〜およそ90 mM、およそ50 mM〜およそ110 mM、およそ50 mM〜およそ130 mM、およそ50 mM〜およそ150 mM、およそ50 mM〜およそ170 mM、およそ70 mM〜およそ90 mM、およそ70 mM〜およそ110 mM、およそ70 mM〜およそ130 mM、およそ70 mM〜およそ150 mM、およそ70 mM〜およそ170 mM、およそ90 mM〜およそ110 mM、およそ90 mM〜およそ130 mM、およそ90 mM〜およそ150 mM、およそ90 mM〜およそ170 mM、およそ110 mM〜およそ130 mM、およそ110 mM〜およそ150 mM、およそ110 mM〜およそ170 mM、およそ130 mM〜およそ150 mM、およそ130 mM〜およそ170 mM、もしくはおよそ150 mM〜およそ170 mMである。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、約80 mMである。
いくつかの態様において、サプリメント中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるこものなど)と組み合わされた後に、培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度が0.5 mM〜5 mMまたはおよそ0.5 mM〜5 mMであるようなものである。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、2 mMまたはおよそ2 mMである。いくつかの態様において、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、0.5 mM〜1 mM、0.5 mM〜1.5 mM、0.5 mM〜2 mM、0.5 mM〜2.5 mM、0.5 mM〜3 mM、0.5 mM〜3.5 mM、0.5 mM〜4 mM、0.5 mM〜4.5 mM、0.5 mM〜5 mM、1 mM〜1.5 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜2.5 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜3.5 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜4.5 mM、1 mM〜5 mM、1.5 mM〜2 mM、1.5 mM〜2.5 mM、1.5 mM〜3 mM、1.5 mM〜3.5 mM、1.5 mM〜4 mM、1.5 mM〜4.5 mM、1.5 mM〜5 mM、2 mM〜2.5 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜3.5 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜4.5 mM、2 mM〜5 mM、2.5 mM〜3 mM、2.5 mM〜3.5 mM、2.5 mM〜4 mM、2.5 mM〜4.5 mM、2.5 mM〜5 mM、3 mM〜3.5 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜4.5 mM、3 mM〜5 mM、3.5 mM〜4 mM、3.5 mM〜4.5 mM、3.5 mM〜5 mM、4 mM〜4.5 mM、4 mM〜5 mMもしくは4.5 mM〜5 mM、または約0.5 mM〜1 mM、約0.5 mM〜1.5 mM、約0.5 mM〜2 mM、約0.5 mM〜2.5 mM、約0.5 mM〜3 mM、約0.5 mM〜3.5 mM、約0.5 mM〜4 mM、約0.5 mM〜4.5 mM、約0.5 mM〜5 mM、約1 mM〜1.5 mM、約1 mM〜2 mM、約1 mM〜2.5 mM、約1 mM〜3 mM、約1 mM〜3.5 mM、約1 mM〜4 mM、約1 mM〜4.5 mM、約1 mM〜5 mM、約1.5 mM〜2 mM、約1.5 mM〜2.5 mM、約1.5 mM〜3 mM、約1.5 mM〜3.5 mM、約1.5 mM〜4 mM、約1.5 mM〜4.5 mM、約1.5 mM〜5 mM、約2 mM〜2.5 mM、約2 mM〜3 mM、約2 mM〜3.5 mM、約2 mM〜4 mM、約2 mM〜4.5 mM、約2 mM〜5 mM、約2.5 mM〜3 mM、約2.5 mM〜3.5 mM、約2.5 mM〜4 mM、約2.5 mM〜4.5 mM、約2.5 mM〜5 mM、約3 mM〜3.5 mM、約3 mM〜4 mM、約3 mM〜4.5 mM、約3 mM〜5 mM、約3.5 mM〜4 mM、約3.5 mM〜4.5 mM、約3.5 mM〜5 mM、約4 mM〜4.5 mM、約4 mM〜5 mMもしくは約4.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、5 mM〜7.5 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12.5 mM、5 mM〜15 mM、5 mM〜17.5 mM、5 mM〜20 mM、7.5 mM〜10 mM、7.5 mM〜12.5 mM、7.5 mM〜15 mM、7.5 mM〜17.5 mM、7.5 mM〜20 mM、10 mM〜12.5 mM、10 mM〜15 mM、10 mM〜17.5 mM、10 mM〜20 mM、12.5 mM〜15 mM、12.5 mM〜17.5 mM、12.5 mM〜20 mM、15 mM〜17.5 mM、15 mM〜20 mMもしくは17.5 mM〜20 mM、または約5 mM〜7.5 mM、約5 mM〜10 mM、約5 mM〜12.5 mM、約5 mM〜15 mM、約5 mM〜17.5 mM、約5 mM〜20 mM、約7.5 mM〜10 mM、約7.5 mM〜12.5 mM、約7.5 mM〜15 mM、約7.5 mM〜17.5 mM、約7.5 mM〜20 mM、約10 mM〜12.5 mM、約10 mM〜15 mM、約10 mM〜17.5 mM、約10 mM〜20 mM、約12.5 mM〜15 mM、約12.5 mM〜17.5 mM、約12.5 mM〜20 mM、約15 mM〜17.5 mM、約15 mM〜20 mMもしくは約17.5 mM〜20 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、基礎培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、多くても2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mM、または多くても約2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mMである。
いくつかの態様において、第1のサプリメントは、1つまたは複数のさらなる構成成分を含有する。いくつかの態様において、第2のサプリメントのような、さらなるサプリメントが、1つまたは複数のさらなる構成成分を提供するために提供される。いくつかの態様において、サプリメント、すなわち第1のサプリメントおよび任意で1つまたは複数のさらなるサプリメント、例えば第2のサプリメントは、基礎培地と組み合わされて、基礎培地に1つまたは複数のさらなる構成成分を提供する。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、少なくとも1つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトのものであるか、またはヒトに由来する。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は組換えである。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、フィブロネクチン、アプロチニンまたはフェチュインを含む。いくつかの態様において、タンパク質は、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、タンパク質はアルブミンまたはアルブミン代替物である。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは天然のヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは組換えヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは非ヒト供給源からの組換えアルブミンである。アルブミン代替物は、任意のタンパク質またはポリペプチド源であり得る。そのようなタンパク質またはポリペプチドサンプルの例としては、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物(例えば、米加水分解物)、ウシ胎児アルブミン(フェチュイン)、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、または別の動物由来アルブミン、ニワトリ抽出物、ウシ胚抽出物、AlbuMAX(登録商標) I、およびAlbuMAX(登録商標) IIが挙げられるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、アルブミンを含む。いくつかの態様において、アルブミンはヒトアルブミンであるか、またはヒトアルブミンに由来する。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清またはヒト血漿に由来する。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、サプリメントは天然アルブミンを含む。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、サプリメント中のアルブミンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のアルブミンの濃度またはおおよその濃度が、それぞれ両端を含めて、0 mg/mL〜2 mg/mL、0 mg/mL〜4 mg/mL、0 mg/mL〜6 mg/mL、0 mg/mL〜8 mg/mL、0 mg/mL〜10 mg/mL、0 mg/mL〜12 mg/mL、2 mg/mL〜4 mg/mL、2 mg/mL〜6 mg/mL、2 mg/mL〜8 mg/mL、2 mg/mL〜10 mg/mL、2 mg/mL〜12 mg/mL、4 mg/mL〜6 mg/mL、4 mg/mL〜8 mg/mL、4 mg/mL〜10 mg/mL、4 mg/mL〜12 mg/mL、6 mg/mL〜8 mg/mL、6 mg/mL〜10 mg/mL、6 mg/mL〜12 mg/mL、8 mg/mL〜10 mg/mL、8 mg/mL〜12 mg/mL、10 mg/mL〜12 mg/mL、もしくは10 mg/mL〜15 mg/mL、またはおよそ0 mg/mL〜およそ2 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ4 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ6 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ4 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ6 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ6 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ6 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ6 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ6 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ8 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ8 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ10 mg/mL〜およそ12 mg/mL、もしくはおよそ10 mg/mL〜およそ15 mg/mLであるようなものである。いくつかの態様において、培地中のおおよそのアルブミンは、5 mg/mLまたはおよそ5 mg/mLである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物を含む。いくつかの態様において、トランスフェリン代替物は、サプリメント中のトランスフェリンを置き換えて、トランスフェリンと実質的に同様の結果を与え得る化合物である。トランスフェリン代替物の例としては、任意の鉄キレート化合物が挙げられるが、これに限定されることはない。用いられ得る鉄キレート化合物は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)、メシル酸デフェロキサミン、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、およびトランス-l,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸(CDTA)の鉄キレート、ならびにクエン酸第二鉄キレートおよび硫酸第一鉄キレートを含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、トランスフェリンは鉄飽和トランスフェリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンは鉄飽和ヒトトランスフェリンである。
いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒトトランスフェリンであるか、またはヒトトランスフェリンに由来する。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒト血清または血漿に由来する。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、組換えトランスフェリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のトランスフェリンの濃度が10 mg/L〜50 mg/L、10 mg/L〜100 mg/L、10 mg/L〜150 mg/L、10 mg/L〜200 mg/L、10 mg/L〜250 mg/L、10 mg/L〜300 mg/L、10 mg/L〜350 mg/L、10 mg/L〜400 mg/L、10 mg/L〜450 mg/L、10 mg/L〜500 mg/L、10 mg/L〜550 mg/L、10 mg/L〜600 mg/L、10 mg/L〜650 mg/L、10 mg/L〜750 mg/L、50 mg/L〜100 mg/L、50 mg/L〜150 mg/L、50 mg/L〜200 mg/L、50 mg/L〜250 mg/L、50 mg/L〜300 mg/L、50 mg/L〜350 mg/L、50 mg/L〜400 mg/L、50 mg/L〜450 mg/L、50 mg/L〜500 mg/L、50 mg/L〜550 mg/L、50 mg/L〜600 mg/L、50 mg/L〜650 mg/L、50 mg/L〜750 mg/L、100 mg/L〜150 mg/L、100 mg/L〜200 mg/L、100 mg/L〜250 mg/L、100 mg/L〜300 mg/L、100 mg/L〜350 mg/L、100 mg/L〜400 mg/L、100 mg/L〜450 mg/L、100 mg/L〜500 mg/L、100 mg/L〜550 mg/L、100 mg/L〜600 mg/L、100 mg/L〜650 mg/L、100 mg/L〜750 mg/L、150 mg/L〜200 mg/L、150 mg/L〜250 mg/L、150 mg/L〜300 mg/L、150 mg/L〜350 mg/L、150 mg/L〜400 mg/L、150 mg/L〜450 mg/L、150 mg/L〜500 mg/L、150 mg/L〜550 mg/L、150 mg/L〜600 mg/L、150 mg/L〜650 mg/L、150 mg/L〜750 mg/L、200 mg/L〜250 mg/L、200 mg/L〜300 mg/L、200 mg/L〜350 mg/L、200 mg/L〜400 mg/L、200 mg/L〜450 mg/L、200 mg/L〜500 mg/L、200 mg/L〜550 mg/L、200 mg/L〜600 mg/L、200 mg/L〜650 mg/L、200 mg/L〜750 mg/L、250 mg/L〜300 mg/L、250 mg/L〜350 mg/L、250 mg/L〜400 mg/L、250 mg/L〜450 mg/L、250 mg/L〜500 mg/L、250 mg/L〜550 mg/L、250 mg/L〜600 mg/L、250 mg/L〜650 mg/L、250 mg/L〜750 mg/L、300 mg/L〜350 mg/L、300 mg/L〜400 mg/L、300 mg/L〜450 mg/L、300 mg/L〜500 mg/L、300 mg/L〜550 mg/L、300 mg/L〜600 mg/L、300 mg/L〜650 mg/L、300 mg/L〜750 mg/L、350 mg/L〜400 mg/L、350 mg/L〜450 mg/L、350 mg/L〜500 mg/L、350 mg/L〜550 mg/L、350 mg/L〜600 mg/L、350 mg/L〜650 mg/L、350 mg/L〜750 mg/L、400 mg/L〜450 mg/L、400 mg/L〜500 mg/L、400 mg/L〜550 mg/L、400 mg/L〜600 mg/L、400 mg/L〜650 mg/L、400 mg/L〜750 mg/L、450 mg/L〜500 mg/L、450 mg/L〜550 mg/L、450 mg/L〜600 mg/L、450 mg/L〜650 mg/L、450 mg/L〜750 mg/L、500 mg/L〜550 mg/L、500 mg/L〜600 mg/L、500 mg/L〜650 mg/L、500 mg/L〜750 mg/L、550 mg/L〜600 mg/L、500 mg/L〜650 mg/L、500 mg/L〜750 mg/L、550 mg/L〜600 mg/L、550 mg/L〜650 mg/L、550 mg/L〜750 mg/L、600 mg/L〜650 mg/L、600 mg/L〜750 mg/Lもしくは650 mg/L〜750 mg/L、またはおよそ10 mg/L〜およそ50 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ100 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ100 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ600 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ600 mg/L〜およそ750 mg/Lまたはおよそ650 mg/L〜およそ750 mg/Lであるようなものである。いくつかの態様において、トランスフェリンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のトランスフェリンの濃度が100 mg/Lまたはおよそ100 mg/Lであるようなものである。いくつかの態様において、トランスフェリンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のトランスフェリンの濃度が50 mg/L〜150 mg/Lまたはおよそ50 mg/L〜およそ150 mg/Lであるようなものである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、インスリンまたはインスリン代替物を含む。いくつかの態様において、インスリン代替物は、インスリンの代わりに用いられて、インスリンと実質的に同様の結果をもたらし得る亜鉛含有化合物である。インスリン代替物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛が挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかのインスリンが当業者に知られている。Gilman, A.G. et al, Eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, 1990, pp. 1463-1495を参照されたい。いくつかの態様において、インスリン代替物ではなく、インスリンがサプリメントおよび培地において用いられる。いくつかの態様において、インスリンは亜鉛インスリンである。いくつかの態様において、インスリンはヒト亜鉛インスリンである。
いくつかの態様において、インスリンはヒトインスリンであるか、またはヒトインスリンに由来する。いくつかの態様において、インスリンは組換えインスリンである。いくつかの態様において、インスリンは組換えヒトインスリンである。いくつかの態様において、インスリン(またはインスリン代替物)の濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、培地中のインスリン(またはインスリン代替物)のおおよその濃度が1 mg/L〜2.5 mg/L、1 mg/L〜5 mg/L、1 mg/L〜7.5 mg/L、1 mg/L〜10 mg/L、1 mg/L〜12.5 mg/L、1 mg/L〜15 mg/L、1 mg/L〜17.5 mg/L、1 mg/L〜20 mg/L、1 mg/L〜22.5 mg/L、1 mg/L〜25 mg/L、1 mg/L〜27.5 mg/L、1 mg/L〜30 mg/L、2.5 mg/L〜5 mg/L、2.5 mg/L〜7.5 mg/L、2.5 mg/L〜10 mg/L、2.5 mg/L〜12.5 mg/L、2.5 mg/L〜15 mg/L、2.5 mg/L〜17.5 mg/L、2.5 mg/L〜20 mg/L、2.5 mg/L〜22.5 mg/L、2.5 mg/L〜25 mg/L、2.5 mg/L〜27.5 mg/L、2.5 mg/L〜30 mg/L、5 mg/L〜7.5 mg/L、5 mg/L〜10 mg/L、5 mg/L〜12.5 mg/L、5 mg/L〜15 mg/L、5 mg/L〜17.5 mg/L、5 mg/L〜20 mg/L、5 mg/L〜22.5 mg/L、5 mg/L〜25 mg/L、5 mg/L〜27.5 mg/L、5 mg/L〜30 mg/L、7.5 mg/L〜10 mg/L、7.5 mg/L〜12.5 mg/L、7.5 mg/L〜15 mg/L、7.5 mg/L〜17.5 mg/L、7.5 mg/L〜20 mg/L、7.5 mg/L〜22.5 mg/L、7.5 mg/L〜25 mg/L、7.5 mg/L〜27.5 mg/L、7.5 mg/L〜30 mg/L、10 mg/L〜12.5 mg/L、10 mg/L〜15 mg/L、10 mg/L〜17.5 mg/L、10 mg/L〜20 mg/L、10 mg/L〜22.5 mg/L、10 mg/L〜25 mg/L、10 mg/L〜27.5 mg/L、10 mg/L〜30 mg/L、12.5 mg/L〜15 mg/L、12.5 mg/L〜17.5 mg/L、12.5 mg/L〜20 mg/L、12.5 mg/L〜22.5 mg/L、12.5 mg/L〜25 mg/L、12.5 mg/L〜27.5 mg/L、12.5 mg/L〜30 mg/L、15 mg/L〜17.5 mg/L、15 mg/L〜20 mg/L、15 mg/L〜22.5 mg/L、15 mg/L〜25 mg/L、15 mg/L〜27.5 mg/L、15 mg/L〜30 mg/L、17.5 mg/L〜20 mg/L、17.5 mg/L〜22.5 mg/L、17.5 mg/L〜25 mg/L、17.5 mg/L〜27.5 mg/L、17.5 mg/L〜30 mg/L、20 mg/L〜22.5 mg/L、20 mg/L〜25 mg/L、20 mg/L〜27.5 mg/L、20 mg/L〜30 mg/L、22.5 mg/L〜25 mg/L、22.5 mg/L〜27.5 mg/L、22.5 mg/L〜30 mg/L、25 mg/L〜27.5 mg/L、もしくは27.5 mg/L〜30 mg/L、またはおよそ1 mg/L〜およそ2.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ7.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ7.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ7.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ22.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ22.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ22.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ25 mg/L〜およそ27.5 mg/L、もしくはおよそ27.5 mg/L〜およそ30 mg/Lであるようなものである。いくつかの態様において、培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、10 mg/Lまたはおよそ10 mg/Lである。いくつかの態様において、培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、7.5 mg/L〜12.5 mg/Lまたはおよそ7.5 mg/L〜およそ12.5 mg/Lである。
いくつかの態様において、サプリメント、例えば第1のサプリメントは、L-グルタミンを、1つまたは複数の所望の構成成分を含有する既存のサプリメントに添加するか、またはそれと混合することによって調製される。いくつかの態様において、L-グルタミンは血清代替サプリメント、例えば、免疫細胞血清代替物(Immune Cell Serum Replacement) (ThermoFisher, #A2598101)に添加されるか、またはそれと混合される。いくつかの態様において、L-グルタミンは、Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記述されている免疫細胞血清代替物を含むサプリメントに添加されるか、またはそれと混合される。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、10 mM〜30 mM、10 mM〜50 mM、10 mM〜70 mM、10 mM〜90 mM、10 mM〜110 mM、10 mM〜130 mM、10 mM〜150 mM、10 mM〜170 mM、 30mM〜50 mM、30 mM〜70 mM、30 mM〜90 mM、30 mM〜110 mM、30 mM〜130 mM、30 mM〜150 mM、30 mM〜170 mM、50 mM〜70 mM、50 mM〜90 mM、50 mM〜110 mM、50 mM〜130 mM、50 mM〜150 mM、50 mM〜170 mM、70 mM〜90 mM、70 mM〜110 mM、70 mM〜130 mM、70 mM〜150 mM、70 mM〜170 mM、90 mM〜110 mM、90 mM〜130 mM、90 mM〜150 mM、90 mM〜170 mM、110 mM〜130 mM、110 mM〜150 mM、110 mM〜170 mM、130 mM〜150 mM、130 mM〜170 mM、もしくは150 mM〜170 mM、またはおよそ10 mM〜およそ30 mM、およそ10 mM〜およそ50 mM、およそ10 mM〜およそ70 mM、およそ10 mM〜およそ90 mM、およそ10 mM〜およそ110 mM、およそ10 mM〜およそ130 mM、およそ10 mM〜およそ150 mM、およそ10 mM〜およそ170 mM、およそ 30mM〜およそ50 mM、およそ30 mM〜およそ70 mM、およそ30 mM〜およそ90 mM、およそ30 mM〜およそ110 mM、およそ30 mM〜およそ130 mM、およそ30 mM〜およそ150 mM、およそ30 mM〜およそ170 mM、およそ50 mM〜およそ70 mM、およそ50 mM〜およそ90 mM、およそ50 mM〜およそ110 mM、およそ50 mM〜およそ130 mM、およそ50 mM〜およそ150 mM、およそ50 mM〜およそ170 mM、およそ70 mM〜およそ90 mM、およそ70 mM〜およそ110 mM、およそ70 mM〜およそ130 mM、およそ70 mM〜およそ150 mM、およそ70 mM〜およそ170 mM、およそ90 mM〜およそ110 mM、およそ90 mM〜およそ130 mM、およそ90 mM〜およそ150 mM、およそ90 mM〜およそ170 mM、およそ110 mM〜およそ130 mM、およそ110 mM〜およそ150 mM、およそ110 mM〜およそ170 mM、およそ130 mM〜およそ150 mM、およそ130 mM〜およそ170 mM、もしくはおよそ150 mM〜およそ170 mMである。いくつかの態様において、サプリメント中のL-グルタミンの濃度は、80 mMまたはおよそ80 mMである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は成長因子を含む。いくつかの態様において、成長因子は上皮成長因子(EGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は線維芽細胞成長因子(FGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子はインスリン様成長因子(IGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は神経成長因子(NGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は血小板由来成長因子(PDGF)を含む。いくつかの態様において、成長因子は形質転換成長因子(TGF)を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、ホルモン(例えば、成長ホルモン、インスリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン放出ペプチド)を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、アルファグロブリンまたはベータグロブリンを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、ペプチドまたはペプチド画分(例えば、動物、微生物または植物に由来するタンパク質加水分解物)を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は脂質を含む。いくつかの態様において、脂質はコレステロールを含む。いくつかの態様において、脂質はステロイドを含む。いくつかの態様において、脂質は脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸)を含む。いくつかの態様において、脂質はエタノールアミンを含む。いくつかの態様において、脂質はコリンを含む。いくつかの態様において、脂質はイノシトールを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は遷移金属を含む。いくつかの態様において、遷移金属は鉄を含む。いくつかの態様において、遷移金属は亜鉛を含む。いくつかの態様において、遷移金属は銅を含む。いくつかの態様において、遷移金属はクロムを含む。いくつかの態様において、遷移金属はヨウ素を含む。いくつかの態様において、遷移金属はコバルトを含む。いくつかの態様において、遷移金属はセレンを含む。いくつかの態様において、遷移金属はマグネシウムを含む。いくつかの態様において、遷移金属は、モリブデンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分はビタミンを含む。いくつかの態様において、ビタミンは脂溶性ビタミン(例えば、ビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK)を含む。いくつかの態様において、ビタミンは水溶性ビタミン(例えば、B1、B2、B6、B12、C、葉酸)を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分はポリアミンを含む。いくつかの態様において、ポリアミンはプトレシンを含む。いくつかの態様において、ポリアミンはスペルミジンを含む。いくつかの態様において、ポリアミンはスペルミンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は還元剤を含む。いくつかの態様において、還元剤は2-メルカプトエタノールを含む。いくつかの態様において、還元剤はアルファ-チオグリセロールを含む。いくつかの態様において、還元剤は還元グルタチオンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は保護添加剤を含む。いくつかの態様において、保護添加剤はカルボキシメチルセルロースを含む。いくつかの態様において、保護添加剤はポリビニルピロリドンを含む。いくつかの態様において、保護添加剤はプルロニックF-68を含む。いくつかの態様において、保護添加剤はTween 80を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、接着因子を含む。いくつかの態様において、接着因子はフィブロネクチンを含む。いくつかの態様において、接着因子はラミニンを含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドの1つまたは複数である。いくつかの態様において、抗酸化剤は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノールもしくはD,L-酢酸トコフェロール、またはそれらの誘導体もしくは混合物を含む。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、脂質剤は、Human Ex-Cite(登録商標)もしくはエタノールアミンまたはそれらの誘導体および混合物を含む。いくつかの態様において、インスリンはヒト亜鉛インスリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンはヒト鉄飽和トランスフェリンである。いくつかの態様において、微量元素はSe4+である。いくつかの態様において、グルココルチコイドはヒドロコルチゾンである。いくつかの態様において、サプリメントは濃縮される。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、1つまたは複数の抗酸化剤、ならびに1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドからなる群より選択される1つまたは複数の成分を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、N-アセチル-Lシステイン、ヒト血清アルブミン、Human Ex-Cyte(登録商標)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se4+、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および/または2-メルカプトエタノールの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、N-アセチル-L-システイン(NAC)を含む。いくつかの態様において、NACの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、基礎培地中のNACの濃度が10 mg/L〜50 mg/L、10 mg/L〜100 mg/L、10 mg/L〜150 mg/L、10 mg/L〜200 mg/L、10 mg/L〜250 mg/L、10 mg/L〜300 mg/L、10 mg/L〜350 mg/L、10 mg/L〜400 mg/L、10 mg/L〜450 mg/L、10 mg/L〜500 mg/L、10 mg/L〜550 mg/L、10 mg/L〜600 mg/L、10 mg/L〜650 mg/L、10 mg/L〜700 mg/L、50 mg/L〜100 mg/L、50 mg/L〜150 mg/L、50 mg/L〜200 mg/L、50 mg/L〜250 mg/L、50 mg/L〜300 mg/L、50 mg/L〜350 mg/L、50 mg/L〜400 mg/L、50 mg/L〜450 mg/L、50 mg/L〜500 mg/L、50 mg/L〜550 mg/L、50 mg/L〜600 mg/L、50 mg/L〜650 mg/L、50 mg/L〜700 mg/L、100 mg/L〜150 mg/L、100 mg/L〜200 mg/L、100 mg/L〜250 mg/L、100 mg/L〜300 mg/L、100 mg/L〜350 mg/L、100 mg/L〜400 mg/L、100 mg/L〜450 mg/L、100 mg/L〜500 mg/L、100 mg/L〜550 mg/L、100 mg/L〜600 mg/L、100 mg/L〜650 mg/L、100 mg/L〜700 mg/L、150 mg/L〜200 mg/L、150 mg/L〜250 mg/L、150 mg/L〜300 mg/L、150 mg/L〜350 mg/L、150 mg/L〜400 mg/L、150 mg/L〜450 mg/L、150 mg/L〜500 mg/L、150 mg/L〜550 mg/L、150 mg/L〜600 mg/L、150 mg/L〜650 mg/L、150 mg/L〜700 mg/L、200 mg/L〜250 mg/L、200 mg/L〜300 mg/L、200 mg/L〜350 mg/L、200 mg/L〜400 mg/L、200 mg/L〜450 mg/L、200 mg/L〜500 mg/L、200 mg/L〜550 mg/L、200 mg/L〜600 mg/L、200 mg/L〜650 mg/L、200 mg/L〜700 mg/L、250 mg/L〜300 mg/L、250 mg/L〜350 mg/L、250 mg/L〜400 mg/L、250 mg/L〜450 mg/L、250 mg/L〜500 mg/L、250 mg/L〜550 mg/L、250 mg/L〜600 mg/L、250 mg/L〜650 mg/L、250 mg/L〜700 mg/L、300 mg/L〜350 mg/L、300 mg/L〜400 mg/L、300 mg/L〜450 mg/L、300 mg/L〜500 mg/L、300 mg/L〜550 mg/L、300 mg/L〜600 mg/L、300 mg/L〜650 mg/L、300 mg/L〜700 mg/L、350 mg/L〜400 mg/L、350 mg/L〜450 mg/L、350 mg/L〜500 mg/L、350 mg/L〜550 mg/L、350 mg/L〜600 mg/L、350 mg/L〜650 mg/L、350 mg/L〜700 mg/L、400 mg/L〜450 mg/L、400 mg/L〜500 mg/L、400 mg/L〜550 mg/L、400 mg/L〜600 mg/L、400 mg/L〜650 mg/L、400 mg/L〜700 mg/L、450 mg/L〜500 mg/L、450 mg/L〜550 mg/L、450 mg/L〜600 mg/L、450 mg/L〜650 mg/L、450 mg/L〜700 mg/L、500 mg/L〜550 mg/L、500 mg/L〜600 mg/L、500 mg/L〜650 mg/L、500 mg/L〜700 mg/L、550 mg/L〜600 mg/L、550 mg/L〜650 mg/L、550 mg/L〜700 mg/L、600 mg/L〜650 mg/L、60 mg/L〜700 mg/L、もしくは650 mg/L〜700 mg/L、またはおよそ10 mg/L〜およそ50 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ100 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ100 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ700 mg/L、およそ600 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ60 mg/L〜およそ700 mg/L、もしくはおよそ650 mg/L〜およそ700 mg/Lであるようなものである。
いくつかの態様において、基礎培地中のNACの濃度は、0 mM〜1 mM、0 mM〜2 mM、0 mM〜3 mM、0 mM〜4 mM、0 mM〜5 mM、0 mM〜6 mM、0 mM〜7 mM、0 mM〜8 mM、0mM〜9 mM、0 mM〜10 mM、0 mM〜12 mM、0 mM〜14 mM、0 mM〜16 mM、0 mM〜18 mM、0 mM〜20 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜5 mM、1 mM〜6 mM、1 mM〜7 mM、1 mM〜8 mM、1 mM〜9 mM、1 mM〜10 mM、1 mM〜12 mM、1 mM〜14 mM、1 mM〜16 mM、1 mM〜18 mM、1 mM〜20 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜5 mM、2 mM〜6 mM、2 mM〜7 mM、2 mM〜8 mM、2 mM〜9 mM、2 mM〜10 mM、2 mM〜12 mM、2 mM〜14 mM、2 mM〜16 mM、2 mM〜18 mM、2 mM〜20 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜5 mM、3 mM〜6 mM、3 mM〜7 mM、3 mM〜8 mM、3 mM〜9 mM、3 mM〜10 mM、3 mM〜12 mM、3 mM〜14 mM、3 mM〜16 mM、3 mM〜18 mM、3 mM〜20 mM、4 mM〜5 mM、4 mM〜6 mM、4 mM〜7 mM、4 mM〜8 mM、4 mM〜9 mM、4 mM〜10 mM、4 mM〜12 mM、4 mM〜14 mM、4 mM〜16 mM、4 mM〜18 mM、4 mM〜20 mM、5 mM〜6 mM、5 mM〜7 mM、5 mM〜8 mM、5 mM〜9 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12 mM、5 mM〜14 mM、5 mM〜16 mM、5 mM〜18 mM、5 mM〜20 mM、6 mM〜7 mM、6 mM〜8 mM、6 mM〜9 mM、6 mM〜10 mM、6 mM〜12 mM、6 mM〜14 mM、6 mM〜16 mM、6 mM〜18 mM、6 mM〜20 mM、7 mM〜8 mM、7 mM〜9 mM、7 mM〜10 mM、7 mM〜12 mM、7 mM〜14 mM、7 mM〜16 mM、7 mM〜18 mM、7 mM〜20 mM、8 mM〜9 mM、8 mM〜10 mM、8 mM〜12 mM、8 mM〜14 mM、8 mM〜16 mM、8 mM〜18 mM、8 mM〜20 mM、9 mM〜10 mM、9 mM〜12 mM、9 mM〜14 mM、9 mM〜16 mM、9 mM〜18 mM、9 mM〜20 mM、10 mM〜12 mM、10 mM〜14 mM、10 mM〜16 mM、10 mM〜18 mM、10 mM〜20 mM、12 mM〜14 mM、12 mM〜16 mM、12 mM〜18 mM、12 mM〜20 mM、14 mM〜16 mM、14 mM〜18 mM、14 mM〜20 mM、16 mM〜18 mM、16 mM〜20 mM、もしくは18 mM〜20 mM、またはおよそ0 mM〜およそ1 mM、およそ0 mM〜およそ2 mM、およそ0 mM〜およそ3 mM、およそ0 mM〜およそ4 mM、およそ0 mM〜およそ5 mM、およそ0 mM〜およそ6 mM、およそ0 mM〜およそ7 mM、およそ0 mM〜およそ8 mM、およそ0mM〜およそ9 mM、およそ0 mM〜およそ10 mM、およそ0 mM〜およそ12 mM、およそ0 mM〜およそ14 mM、およそ0 mM〜およそ16 mM、およそ0 mM〜およそ18 mM、およそ0 mM〜およそ20 mM、およそ1 mM〜およそ2 mM、およそ1 mM〜およそ3 mM、およそ1 mM〜およそ4 mM、およそ1 mM〜およそ5 mM、およそ1 mM〜およそ6 mM、およそ1 mM〜およそ7 mM、およそ1 mM〜およそ8 mM、およそ1 mM〜およそ9 mM、およそ1 mM〜およそ10 mM、およそ1 mM〜およそ12 mM、およそ1 mM〜およそ14 mM、およそ1 mM〜およそ16 mM、およそ1 mM〜およそ18 mM、およそ1 mM〜およそ20 mM、およそ2 mM〜およそ3 mM、およそ2 mM〜およそ4 mM、およそ2 mM〜およそ5 mM、およそ2 mM〜およそ6 mM、およそ2 mM〜およそ7 mM、およそ2 mM〜およそ8 mM、およそ2 mM〜およそ9 mM、およそ2 mM〜およそ10 mM、およそ2 mM〜およそ12 mM、およそ2 mM〜およそ14 mM、およそ2 mM〜およそ16 mM、およそ2 mM〜およそ18 mM、およそ2 mM〜およそ20 mM、およそ3 mM〜およそ4 mM、およそ3 mM〜およそ5 mM、およそ3 mM〜およそ6 mM、およそ3 mM〜およそ7 mM、およそ3 mM〜およそ8 mM、およそ3 mM〜およそ9 mM、およそ3 mM〜およそ10 mM、およそ3 mM〜およそ12 mM、およそ3 mM〜およそ14 mM、およそ3 mM〜およそ16 mM、およそ3 mM〜およそ18 mM、およそ3 mM〜およそ20 mM、およそ4 mM〜およそ5 mM、およそ4 mM〜およそ6 mM、およそ4 mM〜およそ7 mM、およそ4 mM〜およそ8 mM、およそ4 mM〜およそ9 mM、およそ4 mM〜およそ10 mM、およそ4 mM〜およそ12 mM、およそ4 mM〜およそ14 mM、およそ4 mM〜およそ16 mM、およそ4 mM〜およそ18 mM、およそ4 mM〜およそ20 mM、およそ5 mM〜およそ6 mM、およそ5 mM〜およそ7 mM、およそ5 mM〜およそ8 mM、およそ5 mM〜およそ9 mM、およそ5 mM〜およそ10 mM、およそ5 mM〜およそ12 mM、およそ5 mM〜およそ14 mM、およそ5 mM〜およそ16 mM、およそ5 mM〜およそ18 mM、およそ5 mM〜およそ20 mM、およそ6 mM〜およそ7 mM、およそ6 mM〜およそ8 mM、およそ6 mM〜およそ9 mM、およそ6 mM〜およそ10 mM、およそ6 mM〜およそ12 mM、およそ6 mM〜およそ14 mM、およそ6 mM〜およそ16 mM、およそ6 mM〜およそ18 mM、およそ6 mM〜およそ20 mM、およそ7 mM〜およそ8 mM、およそ7 mM〜およそ9 mM、およそ7 mM〜およそ10 mM、およそ7 mM〜およそ12 mM、およそ7 mM〜およそ14 mM、およそ7 mM〜およそ16 mM、およそ7 mM〜およそ18 mM、およそ7 mM〜およそ20 mM、およそ8 mM〜およそ9 mM、およそ8 mM〜およそ10 mM、およそ8 mM〜およそ12 mM、およそ8 mM〜およそ14 mM、およそ8 mM〜およそ16 mM、およそ8 mM〜およそ18 mM、およそ8 mM〜およそ20 mM、およそ9 mM〜およそ10 mM、およそ9 mM〜およそ12 mM、およそ9 mM〜およそ14 mM、およそ9 mM〜およそ16 mM、およそ9 mM〜およそ18 mM、およそ9 mM〜およそ20 mM、およそ10 mM〜およそ12 mM、およそ10 mM〜およそ14 mM、およそ10 mM〜およそ16 mM、およそ10 mM〜およそ18 mM、およそ10 mM〜およそ20 mM、およそ12 mM〜およそ14 mM、およそ12 mM〜およそ16 mM、およそ12 mM〜およそ18 mM、およそ12 mM〜およそ20 mM、およそ14 mM〜およそ16 mM、およそ14 mM〜およそ18 mM、およそ14 mM〜およそ20 mM、およそ16 mM〜およそ18 mM、およそ16 mM〜およそ20 mM、もしくはおよそ18 mM〜およそ20 mMである。
いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、エタノールアミンを含む。いくつかの態様において、エタノールアミンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、基礎培地中のエタノールアミンの濃度が0 mg/L〜2 mg/L、0 mg/L〜4 mg/L、0 mg/L〜6 mg/L、0 mg/L〜8 mg/L、0 mg/L〜10 mg/L、0 mg/L〜12 mg/L、0 mg/L〜14 mg/L、0 mg/L〜16 mg/L、0 mg/L〜18 mg/L、0 mg/L〜20 mg/L、0 mg/L〜22 mg/L、0 mg/L〜24 mg/L、0 mg/L〜26 mg/L、0 mg/L〜28 mg/L、0 mg/L〜30 mg/L、2 mg/L〜4 mg/L、2 mg/L〜6 mg/L、2 mg/L〜8 mg/L、2 mg/L〜10 mg/L、2 mg/L〜12 mg/L、2 mg/L〜14 mg/L、2 mg/L〜16 mg/L、2 mg/L〜18 mg/L、2 mg/L〜20 mg/L、2 mg/L〜22 mg/L、2 mg/L〜24 mg/L、2 mg/L〜26 mg/L、2 mg/L〜28 mg/L、2 mg/L〜30 mg/L、4 mg/L〜6 mg/L、4 mg/L〜8 mg/L、4 mg/L〜10 mg/L、4 mg/L〜12 mg/L、4 mg/L〜14 mg/L、4 mg/L〜16 mg/L、4 mg/L〜18 mg/L、4 mg/L〜20 mg/L、4 mg/L〜22 mg/L、4 mg/L〜24 mg/L、4 mg/L〜26 mg/L、4 mg/L〜28 mg/L、4 mg/L〜30 mg/L、6 mg/L〜8 mg/L、6 mg/L〜10 mg/L、6 mg/L〜12 mg/L、6 mg/L〜14 mg/L、6 mg/L〜16 mg/L、6 mg/L〜18 mg/L、6 mg/L〜20 mg/L、6 mg/L〜22 mg/L、6 mg/L〜24 mg/L、6 mg/L〜26 mg/L、6 mg/L〜28 mg/L、6 mg/L〜30 mg/L、8 mg/L〜10 mg/L、8 mg/L〜12 mg/L、8 mg/L〜14 mg/L、8 mg/L〜16 mg/L、8 mg/L〜18 mg/L、8 mg/L〜20 mg/L、8 mg/L〜22 mg/L、8 mg/L〜24 mg/L、8 mg/L〜26 mg/L、8 mg/L〜28 mg/L、8 mg/L〜30 mg/L、10 mg/L〜12 mg/L、8 mg/L〜14 mg/L、8 mg/L〜16 mg/L、8 mg/L〜18 mg/L、8 mg/L〜20 mg/L、8 mg/L〜22 mg/L、8 mg/L〜24 mg/L、8 mg/L〜26 mg/L、8 mg/L〜28 mg/L、8 mg/L〜30 mg/L、10 mg/L〜12 mg/L、10 mg/L〜14 mg/L、10 mg/L〜16 mg/L、10 mg/L〜18 mg/L、10 mg/L〜20 mg/L、10 mg/L〜22 mg/L、10 mg/L〜24 mg/L、10 mg/L〜26 mg/L、10 mg/L〜28 mg/L、10 mg/L〜30 mg/L、12 mg/L〜14 mg/L、12 mg/L〜16 mg/L、12 mg/L〜18 mg/L、12 mg/L〜20 mg/L、12 mg/L〜22 mg/L、12 mg/L〜24 mg/L、12 mg/L〜26 mg/L、12 mg/L〜28 mg/L、12 mg/L〜30 mg/L、14 mg/L〜16 mg/L、14 mg/L〜18 mg/L、14 mg/L〜20 mg/L、14 mg/L〜22 mg/L、14 mg/L〜24 mg/L、14 mg/L〜26 mg/L、14 mg/L〜28 mg/L、14 mg/L〜30 mg/L、16 mg/L〜18 mg/L、16 mg/L〜20 mg/L、16 mg/L〜22 mg/L、16 mg/L〜24 mg/L、16 mg/L〜26 mg/L、16 mg/L〜28 mg/L、16 mg/L〜30 mg/L、18 mg/L〜20 mg/L、18 mg/L〜22 mg/L、18 mg/L〜24 mg/L、18 mg/L〜26 mg/L、18 mg/L〜28 mg/L、18 mg/L〜30 mg/L、20 mg/L〜22 mg/L、20 mg/L〜24 mg/L、20 mg/L〜26 mg/L、20 mg/L〜28 mg/L、20 mg/L〜30 mg/L、22 mg/L〜24 mg/L、22 mg/L〜26 mg/L、22 mg/L〜28 mg/L、22 mg/L〜30 mg/L、24 mg/L〜26 mg/L、24 mg/L〜28 mg/L、24 mg/L〜30 mg/L、26 mg/L〜28 mg/L、26 mg/L〜30 mg/L、もしくは28 mg/L〜30 mg/L、またはおよそ0 mg/L〜およそ2 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ4 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ6 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ8 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ0 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ4 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ6 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ8 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ2 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ6 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ8 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ4 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ8 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ6 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ8 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ12 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ14 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ12 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ16 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ14 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ18 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ16 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ18 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ18 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ18 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ18 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ18 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ18 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ22 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ22 mg/L〜およそ24 mg/L、およそ22 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ22 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ22 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ24 mg/L〜およそ26 mg/L、およそ24 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ24 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ26 mg/L〜およそ28 mg/L、およそ26 mg/L〜およそ30 mg/L、もしくはおよそ28 mg/L〜およそ30 mg/Lであるようなものである。
いくつかの態様において、サプリメントは液体である。いくつかの態様において、サプリメントは貯蔵のために凍結されないか、または凍結されることが推奨されない。いくつかの態様において、サプリメントはアルブミン、N-アセチル-L-システイン(NAC)およびエタノールアミンを含む。いくつかの態様において、サプリメントはアルブミン、N-アセチル-L-システイン(NAC)およびエタノールアミンを含み、ここでアルブミン、NACおよび/またはエタノールアミンの濃度は、サプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、アルブミン、NACおよび/またはエタノールアミンの濃度が、本明細書において記述されるように実質的に同じであるようなものである。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来のアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは、ヒト血漿または血清からのヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、サプリメントは液体であり、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含まないか、またはその有意な量を含まない。
いくつかの態様において、さらなるサプリメント、例えば第2のサプリメントは、基礎培地と組み合わされて、1つまたは複数のさらなる構成成分を提供する。いくつかの態様において、さらなるサプリメント、例えば第2のサプリメントは、細胞拡大増殖サプリメントである。いくつかの態様において、さらなるサプリメント、例えば第2のサプリメントは、OpTmizer(登録商標)サプリメント(Thermofisher, A1048503の一部)であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、サプリメントは、2倍〜100倍またはおよそ2倍〜およそ100倍濃縮される。いくつかの態様において、サプリメントは、40倍またはおよそ40倍の配合物である。いくつかの態様において、基礎培地の1リットルに、第1のサプリメントと場合によっては1つまたは複数のさらなるサプリメントとを含む少なくとも1つのサプリメントが、20〜30ミリリットルまたはおよそ20〜30ミリリットル、例えば25±2ミリリットル、補充される。
C. 無血清培地
いくつかの態様において、無血清培地は、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)は、細胞を含む細胞培養物中でグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができ、ここで培地は無血清である。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
いくつかの態様において、無血清培地は、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む。いくつかの態様において、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)は、細胞を含む細胞培養物中でグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができ、ここで培地は無血清である。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
いくつかの態様において、無血清培地は、少なくとも1つのタンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、無血清培地は合成アミノ酸を含み、ここで合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)は、細胞、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)、および少なくとも1つのタンパク質を含む細胞培養物中でグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができ、ここで培地は無血清である。
いくつかの態様において、合成アミノ酸は、グルタミンの安定化形態(すなわち、L-グルタミン)である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、水溶液(例えば、無血清培地)中でグルタミン(すなわち、L-グルタミン)よりも安定である。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に有意な量のグルタミンを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、3、5、7、9、11、13、もしくは14日間、または少なくとも約1、3、5、7、9、11、13、もしくは14日間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、もしくは8週間、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8週間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月間、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、2、3、4、もしくは5年間、または少なくとも約1、2、3、4、もしくは5年間、有意な量のグルタミン(すなわち、L-グルタミン)を生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、3、5、7、9、11、13、もしくは14日間、または少なくとも約1、3、5、7、9、11、13、もしくは14日間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、もしくは8週間、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、もしくは8週間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月間、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、無血清培地中に少なくとも1、2、3、4、もしくは5年間、または少なくとも約1、2、3、4、もしくは5年間、有意な量のピロリドンカルボン酸またはアンモニアを生成しない。
いくつかの態様において、合成アミノ酸は、水溶液(例えば、無血清培地)に可溶性である。いくつかの態様において、水溶液中の合成アミノ酸の溶解度は、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)よりも高い。
いくつかの態様において、合成アミノ酸は細胞に輸送されることができ、そこで合成アミノ酸はグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)に変換されることができる。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作された細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞である。
いくつかの態様において、合成アミノ酸はジペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸はトリペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)である。
いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、0.5 mM〜5 mMまたはおよそ0.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、2 mMまたはおよそ2 mMである。いくつかの態様において、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、0.5 mM〜1 mM、0.5 mM〜1.5 mM、0.5 mM〜2 mM、0.5 mM〜2.5 mM、0.5 mM〜3 mM、0.5 mM〜3.5 mM、0.5 mM〜4 mM、0.5 mM〜4.5 mM、0.5 mM〜5 mM、1 mM〜1.5 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜2.5 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜3.5 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜4.5 mM、1 mM〜5 mM、1.5 mM〜2 mM、1.5 mM〜2.5 mM、1.5 mM〜3 mM、1.5 mM〜3.5 mM、1.5 mM〜4 mM、1.5 mM〜4.5 mM、1.5 mM〜5 mM、2 mM〜2.5 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜3.5 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜4.5 mM、2 mM〜5 mM、2.5 mM〜3 mM、2.5 mM〜3.5 mM、2.5 mM〜4 mM、2.5 mM〜4.5 mM、2.5 mM〜5 mM、3 mM〜3.5 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜4.5 mM、3 mM〜5 mM、3.5 mM〜4 mM、3.5 mM〜4.5 mM、3.5 mM〜5 mM、4 mM〜4.5 mM、4 mM〜5 mMもしくは4.5 mM〜5 mM、または約0.5 mM〜1 mM、約0.5 mM〜1.5 mM、約0.5 mM〜2 mM、約0.5 mM〜2.5 mM、約0.5 mM〜3 mM、約0.5 mM〜3.5 mM、約0.5 mM〜4 mM、約0.5 mM〜4.5 mM、約0.5 mM〜5 mM、約1 mM〜1.5 mM、約1 mM〜2 mM、約1 mM〜2.5 mM、約1 mM〜3 mM、約1 mM〜3.5 mM、約1 mM〜4 mM、約1 mM〜4.5 mM、約1 mM〜5 mM、約1.5 mM〜2 mM、約1.5 mM〜2.5 mM、約1.5 mM〜3 mM、約1.5 mM〜3.5 mM、約1.5 mM〜4 mM、約1.5 mM〜4.5 mM、約1.5 mM〜5 mM、約2 mM〜2.5 mM、約2 mM〜3 mM、約2 mM〜3.5 mM、約2 mM〜4 mM、約2 mM〜4.5 mM、約2 mM〜5 mM、約2.5 mM〜3 mM、約2.5 mM〜3.5 mM、約2.5 mM〜4 mM、約2.5 mM〜4.5 mM、約2.5 mM〜5 mM、約3 mM〜3.5 mM、約3 mM〜4 mM、約3 mM〜4.5 mM、約3 mM〜5 mM、約3.5 mM〜4 mM、約3.5 mM〜4.5 mM、約3.5 mM〜5 mM、約4 mM〜4.5 mM、約4 mM〜5 mMもしくは約4.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、5 mM〜7.5 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12.5 mM、5 mM〜15 mM、5 mM〜17.5 mM、5 mM〜20 mM、7.5 mM〜10 mM、7.5 mM〜12.5 mM、7.5 mM〜15 mM、7.5 mM〜17.5 mM、7.5 mM〜20 mM、10 mM〜12.5 mM、10 mM〜15 mM、10 mM〜17.5 mM、10 mM〜20 mM、12.5 mM〜15 mM、12.5 mM〜17.5 mM、12.5 mM〜20 mM、15 mM〜17.5 mM、15 mM〜20 mMもしくは17.5 mM〜20 mM、または約5 mM〜7.5 mM、約5 mM〜10 mM、約5 mM〜12.5 mM、約5 mM〜15 mM、約5 mM〜17.5 mM、約5 mM〜20 mM、約7.5 mM〜10 mM、約7.5 mM〜12.5 mM、約7.5 mM〜15 mM、約7.5 mM〜17.5 mM、約7.5 mM〜20 mM、約10 mM〜12.5 mM、約10 mM〜15 mM、約10 mM〜17.5 mM、約10 mM〜20 mM、約12.5 mM〜15 mM、約12.5 mM〜17.5 mM、約12.5 mM〜20 mM、約15 mM〜17.5 mM、約15 mM〜20 mMもしくは約17.5 mM〜20 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、2 mMであるか、またはおよそ2 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)の濃度は、多くても2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mM、または多くても約2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mMである。
いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、約0.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、2 mMまたはおよそ2 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、0.5 mM〜1 mM、0.5 mM〜1.5 mM、0.5 mM〜2 mM、0.5 mM〜2.5 mM、0.5 mM〜3 mM、0.5 mM〜3.5 mM、0.5 mM〜4 mM、0.5 mM〜4.5 mM、0.5 mM〜5 mM、1 mM〜1.5 mM、1 mM〜2 mM、1 mM〜2.5 mM、1 mM〜3 mM、1 mM〜3.5 mM、1 mM〜4 mM、1 mM〜4.5 mM、1 mM〜5 mM、1.5 mM〜2 mM、1.5 mM〜2.5 mM、1.5 mM〜3 mM、1.5 mM〜3.5 mM、1.5 mM〜4 mM、1.5 mM〜4.5 mM、1.5 mM〜5 mM、2 mM〜2.5 mM、2 mM〜3 mM、2 mM〜3.5 mM、2 mM〜4 mM、2 mM〜4.5 mM、2 mM〜5 mM、2.5 mM〜3 mM、2.5 mM〜3.5 mM、2.5 mM〜4 mM、2.5 mM〜4.5 mM、2.5 mM〜5 mM、3 mM〜3.5 mM、3 mM〜4 mM、3 mM〜4.5 mM、3 mM〜5 mM、3.5 mM〜4 mM、3.5 mM〜4.5 mM、3.5 mM〜5 mM、4 mM〜4.5 mM、4 mM〜5 mMもしくは4.5 mM〜5 mM、または約0.5 mM〜1 mM、約0.5 mM〜1.5 mM、約0.5 mM〜2 mM、約0.5 mM〜2.5 mM、約0.5 mM〜3 mM、約0.5 mM〜3.5 mM、約0.5 mM〜4 mM、約0.5 mM〜4.5 mM、約0.5 mM〜5 mM、約1 mM〜1.5 mM、約1 mM〜2 mM、約1 mM〜2.5 mM、約1 mM〜3 mM、約1 mM〜3.5 mM、約1 mM〜4 mM、約1 mM〜4.5 mM、約1 mM〜5 mM、約1.5 mM〜2 mM、約1.5 mM〜2.5 mM、約1.5 mM〜3 mM、約1.5 mM〜3.5 mM、約1.5 mM〜4 mM、約1.5 mM〜4.5 mM、約1.5 mM〜5 mM、約2 mM〜2.5 mM、約2 mM〜3 mM、約2 mM〜3.5 mM、約2 mM〜4 mM、約2 mM〜4.5 mM、約2 mM〜5 mM、約2.5 mM〜3 mM、約2.5 mM〜3.5 mM、約2.5 mM〜4 mM、約2.5 mM〜4.5 mM、約2.5 mM〜5 mM、約3 mM〜3.5 mM、約3 mM〜4 mM、約3 mM〜4.5 mM、約3 mM〜5 mM、約3.5 mM〜4 mM、約3.5 mM〜4.5 mM、約3.5 mM〜5 mM、約4 mM〜4.5 mM、約4 mM〜5 mMもしくは約4.5 mM〜5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、それぞれ両端を含めて、5 mM〜7.5 mM、5 mM〜10 mM、5 mM〜12.5 mM、5 mM〜15 mM、5 mM〜17.5 mM、5 mM〜20 mM、7.5 mM〜10 mM、7.5 mM〜12.5 mM、7.5 mM〜15 mM、7.5 mM〜17.5 mM、7.5 mM〜20 mM、10 mM〜12.5 mM、10 mM〜15 mM、10 mM〜17.5 mM、10 mM〜20 mM、12.5 mM〜15 mM、12.5 mM〜17.5 mM、12.5 mM〜20 mM、15 mM〜17.5 mM、15 mM〜20 mMもしくは17.5 mM〜20 mM、または約5 mM〜7.5 mM、約5 mM〜10 mM、約5 mM〜12.5 mM、約5 mM〜15 mM、約5 mM〜17.5 mM、約5 mM〜20 mM、約7.5 mM〜10 mM、約7.5 mM〜12.5 mM、約7.5 mM〜15 mM、約7.5 mM〜17.5 mM、約7.5 mM〜20 mM、約10 mM〜12.5 mM、約10 mM〜15 mM、約10 mM〜17.5 mM、約10 mM〜20 mM、約12.5 mM〜15 mM、約12.5 mM〜17.5 mM、約12.5 mM〜20 mM、約15 mM〜17.5 mM、約15 mM〜20 mMもしくは約17.5 mM〜20 mMである。いくつかの態様において、培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、少なくとも0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mM、または少なくとも約0.5 mM、1 mM、1.5 mM、2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mMもしくは5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)の濃度は、多くても2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mM、または多くても約2 mM、2.5 mM、3 mM、3.5 mM、4 mM、4.5 mM、5 mM、5.5 mM、6 mM、6.5 mM、7 mM、7.5 mM、8 mM、8.5 mM、9 mM、9.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mMもしくは20 mMである。
いくつかの態様において、無血清培地中のL-アラニル-L-グルタミンなどのL-グルタミンのジペプチド形態の濃度は、0.5 mM〜5 mMまたはおよそ0.5 mM〜およそ5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-アラニル-L-グルタミンなどのL-グルタミンのジペプチド形態の濃度は、2 mMまたはおよそ2 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンの濃度は、0.5 mM〜5 mMまたはおよそ0.5 mM〜およそ5 mMである。いくつかの態様において、無血清培地中のL-グルタミンの濃度は、2 mMまたはおよそ2 mMである。
いくつかの態様において、無血清培地は少なくとも1つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトのものであるか、またはヒトに由来する。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は組換えである。いくつかの態様において、1つまたは複数のさらなる構成成分は、少なくとも1つのタンパク質を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は非哺乳動物起源のものではない。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、ヒトのものであるか、またはヒトに由来する。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は組換えである。いくつかの態様において、少なくとも1つのタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、フィブロネクチン、アプロチニンまたはフェチュインを含む。いくつかの態様において、タンパク質は、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数、任意でヒトまたは組換えアルブミン、インスリンまたはトランスフェリンの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、無血清培地はアルブミンを含む。いくつかの態様において、アルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清またはヒト血漿に由来する。いくつかの態様において、アルブミンは組換えアルブミンである。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、組換えアルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、サプリメントは天然アルブミンを含む。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来する。いくつかの態様において、天然アルブミンはヒトに由来しない。いくつかの態様において、無血清培地中のアルブミンの濃度は、それぞれ両端を含めて、0 mg/mL〜2 mg/mL、0 mg/mL〜4 mg/mL、0 mg/mL〜6 mg/mL、0 mg/mL〜8 mg/mL、0 mg/mL〜10 mg/mL、0 mg/mL〜12 mg/mL、2 mg/mL〜4 mg/mL、2 mg/mL〜6 mg/mL、2 mg/mL〜8 mg/mL、2 mg/mL〜10 mg/mL、2 mg/mL〜12 mg/mL、4 mg/mL〜6 mg/mL、4 mg/mL〜8 mg/mL、4 mg/mL〜10 mg/mL、4 mg/mL〜12 mg/mL、6 mg/mL〜8 mg/mL、6 mg/mL〜10 mg/mL、6 mg/mL〜12 mg/mL、8 mg/mL〜10 mg/mL、8 mg/mL〜12 mg/mL、10 mg/mL〜12 mg/mL、もしくは10 mg/mL〜15 mg/m、またはおよそ0 mg/mL〜およそ2 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ4 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ6 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ0 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ4 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ6 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ2 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ6 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ4 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ6 mg/mL〜およそ8 mg/mL、およそ6 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ6 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ8 mg/mL〜およそ10 mg/mL、およそ8 mg/mL〜およそ12 mg/mL、およそ10 mg/mL〜およそ12 mg/mL、もしくはおよそ10 mg/mL〜およそ15 mg/mLである。いくつかの態様において、培地中のアルブミンは5 mg/mLまたはおよそ5 mg/mLである。
いくつかの態様において、無血清培地は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物(本明細書において記述されるものなど)を含む。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒトに由来する。いくつかの態様において、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物は、ヒト血清または血漿に由来する。いくつかの態様において、無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、10 mg/L〜50 mg/L、10 mg/L〜100 mg/L、10 mg/L〜150 mg/L、10 mg/L〜200 mg/L、10 mg/L〜250 mg/L、10 mg/L〜300 mg/L、10 mg/L〜350 mg/L、10 mg/L〜400 mg/L、10 mg/L〜450 mg/L、10 mg/L〜500 mg/L、10 mg/L〜550 mg/L、10 mg/L〜600 mg/L、10 mg/L〜650 mg/L、10 mg/L〜750 mg/L、50 mg/L〜100 mg/L、50 mg/L〜150 mg/L、50 mg/L〜200 mg/L、50 mg/L〜250 mg/L、50 mg/L〜300 mg/L、50 mg/L〜350 mg/L、50 mg/L〜400 mg/L、50 mg/L〜450 mg/L、50 mg/L〜500 mg/L、50 mg/L〜550 mg/L、50 mg/L〜600 mg/L、50 mg/L〜650 mg/L、50 mg/L〜750 mg/L、100 mg/L〜150 mg/L、100 mg/L〜200 mg/L、100 mg/L〜250 mg/L、100 mg/L〜300 mg/L、100 mg/L〜350 mg/L、100 mg/L〜400 mg/L、100 mg/L〜450 mg/L、100 mg/L〜500 mg/L、100 mg/L〜550 mg/L、100 mg/L〜600 mg/L、100 mg/L〜650 mg/L、100 mg/L〜750 mg/L、150 mg/L〜200 mg/L、150 mg/L〜250 mg/L、150 mg/L〜300 mg/L、150 mg/L〜350 mg/L、150 mg/L〜400 mg/L、150 mg/L〜450 mg/L、150 mg/L〜500 mg/L、150 mg/L〜550 mg/L、150 mg/L〜600 mg/L、150 mg/L〜650 mg/L、150 mg/L〜750 mg/L、200 mg/L〜250 mg/L、200 mg/L〜300 mg/L、200 mg/L〜350 mg/L、200 mg/L〜400 mg/L、200 mg/L〜450 mg/L、200 mg/L〜500 mg/L、200 mg/L〜550 mg/L、200 mg/L〜600 mg/L、200 mg/L〜650 mg/L、200 mg/L〜750 mg/L、250 mg/L〜300 mg/L、250 mg/L〜350 mg/L、250 mg/L〜400 mg/L、250 mg/L〜450 mg/L、250 mg/L〜500 mg/L、250 mg/L〜550 mg/L、250 mg/L〜600 mg/L、250 mg/L〜650 mg/L、250 mg/L〜750 mg/L、300 mg/L〜350 mg/L、300 mg/L〜400 mg/L、300 mg/L〜450 mg/L、300 mg/L〜500 mg/L、300 mg/L〜550 mg/L、300 mg/L〜600 mg/L、300 mg/L〜650 mg/L、300 mg/L〜750 mg/L、350 mg/L〜400 mg/L、350 mg/L〜450 mg/L、350 mg/L〜500 mg/L、350 mg/L〜550 mg/L、350 mg/L〜600 mg/L、350 mg/L〜650 mg/L、350 mg/L〜750 mg/L、400 mg/L〜450 mg/L、400 mg/L〜500 mg/L、400 mg/L〜550 mg/L、400 mg/L〜600 mg/L、400 mg/L〜650 mg/L、400 mg/L〜750 mg/L、450 mg/L〜500 mg/L、450 mg/L〜550 mg/L、450 mg/L〜600 mg/L、450 mg/L〜650 mg/L、450 mg/L〜750 mg/L、500 mg/L〜550 mg/L、500 mg/L〜600 mg/L、500 mg/L〜650 mg/L、500 mg/L〜750 mg/L、550 mg/L〜600 mg/L、500 mg/L〜650 mg/L、500 mg/L〜750 mg/L、550 mg/L〜600 mg/L、550 mg/L〜650 mg/L、550 mg/L〜750 mg/L、600 mg/L〜650 mg/L、600 mg/L〜750 mg/L、もしくは650 mg/L〜750 mg/L、またはおよそ10 mg/L〜およそ50 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ100 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ100 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ50 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ150 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ100 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ200 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ150 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ250 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ200 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ300 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ250 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ350 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ300 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ400 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ350 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ450 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ400 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ500 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ450 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ550 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ500 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ600 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ550 mg/L〜およそ750 mg/L、およそ600 mg/L〜およそ650 mg/L、およそ600 mg/L〜およそ750 mg/L、もしくはおよそ650 mg/L〜およそ750 mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、100 mg/Lまたはおよそ100 mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のトランスフェリンの濃度は、50 mg/L〜150 mg/Lまたはおよそ50 mg/L〜150 mg/Lである。
いくつかの態様において、サプリメントは、インスリンまたはインスリン代替物(本明細書において記述されるものなど)を含む。いくつかの態様において、インスリンはヒトに由来する。いくつかの態様において、インスリンは組換えインスリンである。いくつかの態様において、インスリンは組換えヒトインスリンである。いくつかの態様において、無血清培地中のインスリン(またはインスリン代替物)の濃度は、1 mg/L〜2.5 mg/L、1 mg/L〜5 mg/L、1 mg/L〜7.5 mg/L、1 mg/L〜10 mg/L、1 mg/L〜12.5 mg/L、1 mg/L〜15 mg/L、1 mg/L〜17.5 mg/L、1 mg/L〜20 mg/L、1 mg/L〜22.5 mg/L、1 mg/L〜25 mg/L、1 mg/L〜27.5 mg/L、1 mg/L〜30 mg/L、2.5 mg/L〜5 mg/L、2.5 mg/L〜7.5 mg/L、2.5 mg/L〜10 mg/L、2.5 mg/L〜12.5 mg/L、2.5 mg/L〜15 mg/L、2.5 mg/L〜17.5 mg/L、2.5 mg/L〜20 mg/L、2.5 mg/L〜22.5 mg/L、2.5 mg/L〜25 mg/L、2.5 mg/L〜27.5 mg/L、2.5 mg/L〜30 mg/L、5 mg/L〜7.5 mg/L、5 mg/L〜10 mg/L、5 mg/L〜12.5 mg/L、5 mg/L〜15 mg/L、5 mg/L〜17.5 mg/L、5 mg/L〜20 mg/L、5 mg/L〜22.5 mg/L、5 mg/L〜25 mg/L、5 mg/L〜27.5 mg/L、5 mg/L〜30 mg/L、7.5 mg/L〜10 mg/L、7.5 mg/L〜12.5 mg/L、7.5 mg/L〜15 mg/L、7.5 mg/L〜17.5 mg/L、7.5 mg/L〜20 mg/L、7.5 mg/L〜22.5 mg/L、7.5 mg/L〜25 mg/L、7.5 mg/L〜27.5 mg/L、7.5 mg/L〜30 mg/L、10 mg/L〜12.5 mg/L、10 mg/L〜15 mg/L、10 mg/L〜17.5 mg/L、10 mg/L〜20 mg/L、10 mg/L〜22.5 mg/L、10 mg/L〜25 mg/L、10 mg/L〜27.5 mg/L、10 mg/L〜30 mg/L、12.5 mg/L〜15 mg/L、12.5 mg/L〜17.5 mg/L、12.5 mg/L〜20 mg/L、12.5 mg/L〜22.5 mg/L、12.5 mg/L〜25 mg/L、12.5 mg/L〜27.5 mg/L、12.5 mg/L〜30 mg/L、15 mg/L〜17.5 mg/L、15 mg/L〜20 mg/L、15 mg/L〜22.5 mg/L、15 mg/L〜25 mg/L、15 mg/L〜27.5 mg/L、15 mg/L〜30 mg/L、17.5 mg/L〜20 mg/L、17.5 mg/L〜22.5 mg/L、17.5 mg/L〜25 mg/L、17.5 mg/L〜27.5 mg/L、17.5 mg/L〜30 mg/L、20 mg/L〜22.5 mg/L、20 mg/L〜25 mg/L、20 mg/L〜27.5 mg/L、20 mg/L〜30 mg/L、22.5 mg/L〜25 mg/L、22.5 mg/L〜27.5 mg/L、22.5 mg/L〜30 mg/L、25 mg/L〜27.5 mg/L、もしくは27.5 mg/L〜30 mg/L、またはおよそ1 mg/L〜およそ2.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ7.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ1 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ7.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ2.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ7.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ10 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ7.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ12.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ10 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ15 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ12.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ17.5 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ15 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ20 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ17.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ22.5 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ20 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ22.5 mg/L〜およそ25 mg/L、およそ22.5 mg/L〜およそ27.5 mg/L、およそ22.5 mg/L〜およそ30 mg/L、およそ25 mg/L〜およそ27.5 mg/L、もしくはおよそ27.5 mg/L〜およそ30 mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、10 mg/Lまたはおよそ10 mg/Lである。いくつかの態様において、無血清培地中のインスリンまたはインスリン代替物の濃度は、7.5 mg/L〜12.5 mg/Lまたはおよそ7.5 mg/L〜およそ12.5 mg/Lである。
いくつかの態様において、無血清培地はフェノールレッドを含まない。いくつかの態様において、無血清培地はフェノールレッドを含む。
いくつかの態様において、無血清培地は、無機塩、糖、アミノ酸の栄養混合物を含み、ビタミン、有機酸、抗酸化剤、脂質、成長因子、N-アセチルシステイン、エタノールアミンおよび/または緩衝液を任意で含有してもよい。例としては、無機塩、糖、アミノ酸、ビタミン、有機酸、抗酸化剤、脂質、成長因子、N-アセチルシステイン、エタノールアミンおよび/または緩衝液を含む、上記の項におけるような、本明細書において記述されるものが挙げられる。
いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、1つまたは複数のグルココルチコイド、1つまたは複数の無機塩、1つまたは複数のエネルギー源、1つまたは複数の緩衝剤、1つまたは複数のピルビン酸塩、1つまたは複数のpH指示薬、1つまたは複数のアミノ酸、および1つまたは複数のビタミンの1つまたは複数から選択される1つまたは複数の成分を含む。いくつかの態様において、抗酸化剤は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロール、またはそれらの誘導体もしくは混合物からなる群より選択される。いくつかの態様において、アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、脂質剤は、Human Ex-Cite(登録商標)およびエタノールアミンである。いくつかの態様において、インスリンはヒト亜鉛インスリンである。いくつかの態様において、トランスフェリンはヒト鉄飽和トランスフェリンである。いくつかの態様において、グルココルチコイドはヒドロコルチゾンである。いくつかの態様において、無機塩成分は、1つまたは複数のカルシウム塩、1つまたは複数のカリウム塩、1つまたは複数のマグネシウム塩、1つまたは複数のナトリウム塩、1つまたは複数の炭酸塩、および1つまたは複数のリン酸塩からなる群より選択される1つまたは複数の無機塩を含む。いくつかの態様において、エネルギー源はD-グルコースである。いくつかの態様において、緩衝剤はHEPESである。いくつかの態様において、ピルビン酸塩はピルビン酸ナトリウムである。いくつかの態様において、pH指示薬はフェノールレッドである。いくつかの態様において、アミノ酸成分は、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リシン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ならびにそれらの塩および誘導体からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ビタミン成分は、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサルHCl、リボフラビン、チアミンHCl、ならびにビタミンB12およびその誘導体からなる群より選択される1つまたは複数のビタミンを含む。いくつかの態様において、成分は、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、Human Ex-Cite(登録商標)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se4+、ヒドロコルチゾン、Ca2+、K+、Mg2+、Na+、CO3 2-、PO4 3-、D-グルコース、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、 L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リシン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-スレオニン、L -トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサルHCl、リボフラビン、チアミンHCl、ならびにビタミンB12を含む。
いくつかの態様において、基礎培地および少なくとも1つのサプリメントを含む無血清培地が提供される。基礎培地およびサプリメントの様々な例が、上記の項においてなど、本明細書において記述されている。
いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90%〜97.5% (v/v)またはおよそ90%〜およそ97.5% (v/v)の基礎培地、2.5%〜10% (v/v)またはおよそ2.5%〜およそ10% (v/v)のサプリメント、例えば第1のサプリメントおよび/または第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90%〜97.5% (v/v)またはおよそ90%〜およそ97.5% (v/v)の基礎培地、1.25%〜5% (v/v)またはおよそ1.25%〜およそ5% (v/v)の第1のサプリメント、および1.25%〜5% (v/v)またはおよそ1.25%〜およそ5% (v/v)の第2のサプリメントを含む。
いくつかの態様において、基礎培地、第1のサプリメントおよび第2のサプリメントを含む無血清培地が提供される。いくつかの態様において、基礎培地は、合成アミノ酸(例えば、L-グルタミンのジペプチド形態、例えば、L-アラニル-L-グルタミン)を含む液体を含み、かつここで基礎培地は、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)および/またはタンパク質を含まないか、または実質的に含まない。いくつかの態様において、第1のサプリメントはグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含み、ここで第1のサプリメントは、グルタミンがその成分になった後かつ意図された用途の(例えば、基礎培地のサプリメントとして用いられる)前の大部分の時間、室温下(例えば、20、10、15、5、0、-5、-10、-15、もしくは-20℃下)の温度で凍結または貯蔵される。いくつかの態様において、第1のサプリメントはグルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含み、ここで第1のサプリメントは、培地(例えば、基礎培地)との混合の直前に室温下(例えば、20、10、15、5、0、-5、-10、-15、もしくは-20℃下)の温度で凍結または貯蔵される。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、アルブミン、N-アセチル-L-システイン(NAC)および/またはエタノールアミンを含む。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドからなる群より選択される1つまたは複数の成分を含む。
いくつかの態様において、無血清培地は、1つまたは複数のサイトカインを含む。ある種の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある種の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に対して内因性である受容体に結合するおよび/または結合することができる。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、サイトカインの4-アルファ-ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン-2 (IL-2)、インターロイキン-4 (IL-4)、インターロイキン-7 (IL-7)、インターロイキン-9 (IL-9)、インターロイキン12 (IL-12)、インターロイキン15 (IL-15)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-15であるか、またはそれを含む。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-7あるか、またはそれを含む。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、組換えIL-2であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、サイトカインはIL-2を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインは、IL-2、IL-7またはIL-15から選択される。
いくつかの態様において、サイトカインの濃度は、1 IU/ml〜2,000 IU/mlもしくはおよそ1 IU/ml〜およそ2,000 IU/ml、10 IU/ml〜100 IU/mlもしくはおよそ10 IU/ml〜およそ100 IU/ml、50 IU/ml〜500 IU/mlもしくはおよそ50 IU/ml〜およそ500 IU/ml、100 IU/ml〜200 IU/mlもしくはおよそ100 IU/ml〜およそ200 IU/ml、500 IU/ml〜1400 IU/mlまたはおよそ500 IU/ml〜およそ1400 IU/ml、250 IU/ml〜500 IU/mlもしくはおよそ250 IU/ml〜およそ500 IU/ml、または500 IU/ml〜2,500 IU/mlもしくはおよそ500 IU/ml〜およそ2,500 IU/mlである。
いくつかの態様において、無血清培地はIL-2を含む。いくつかの態様において、IL-2 (例えば、ヒト組換えIL-2)の濃度は、2 IU/ml〜500 IU/mlもしくはおよそ2 IU/ml〜およそ500 IU/ml、10 IU/ml〜250 IU/mlもしくはおよそ10 IU/ml〜およそ250 IU/ml、100 IU/ml〜500 IU/mlもしくはおよそ100 IU/ml〜およそ500 IU/ml、または100 IU/ml〜400 IU/mlもしくはおよそ100 IU/ml〜およそ400 IU/mlである。特定の態様において、IL-2の濃度は、50 IU/ml、75 IU/ml、100 IU/ml、125 IU/ml、150 IU/ml、175 IU/ml、200 IU/ml、225 IU/ml、250 IU/ml、300 IU/ml、もしくは400 IU/ml、またはおよそ50 IU/ml、75 IU/ml、100 IU/ml、125 IU/ml、150 IU/ml、175 IU/ml、200 IU/ml、225 IU/ml、250 IU/ml、300 IU/ml、もしくは400 IU/mlである。いくつかの態様において、IL-2の濃度は、100 IU/mlまたはおよそ100 IU/mlである。いくつかの態様において、IL-2の濃度は、200 IU/mlまたはおよそ200 IU/mlである。
いくつかの態様において、無血清培地はIL-7を含む。いくつかの態様において、IL-7、例えば、ヒト組換えIL-7の濃度は、10 IU/ml〜5,000 IU/mlもしくはおよそ10 IU/ml〜およそ5,000 IU/ml、500 IU/ml〜2,000 IU/mlもしくはおよそ500 IU/ml〜およそ2,000 IU/ml、600 IU/ml〜1,500 IU/mlもしくはおよそ600 IU/ml〜およそ1,500 IU/ml、500 IU/ml〜2,500 IU/mlもしくはおよそ500 IU/ml〜およそ2,500 IU/ml、750 IU/ml〜1,500 IU/mlもしくはおよそ750 IU/ml〜およそ1,500 IU/ml、または1,000 IU/ml〜2,000 IU/mlもしくはおよそ1,000 IU/ml〜およそ2,000 IU/mlである。特定の態様において、IL-7の濃度は、100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、800 IU/ml、900 IU/ml、1,000 IU/ml、1,200 IU/ml、1,400 IU/ml、もしくは1,600 IU/ml、またはおよそ100 IU/ml、200 IU/ml、300 IU/ml、400 IU/ml、500 IU/ml、600 IU/ml、700 IU/ml、800 IU/ml、900 IU/ml、1,000 IU/ml、1,200 IU/ml、1,400 IU/ml、もしくは1,600 IU/mlである。いくつかの態様において、IL-7の濃度は、600 IU/mlまたはおよそ600 IU/mlである。いくつかの態様において、IL-7の濃度は、1,200 IU/mlまたはおよそ1,200 IU/mlである。
いくつかの態様において、無血清培地はIL-15を含む。いくつかの態様において、IL-15、例えば、ヒト組換えIL-15の濃度は、2 IU/ml〜500 IU/mlもしくはおよそ2 IU/ml〜およそ500 IU/ml、0.1 IU/ml〜200 IU/mlもしくはおよそ0.1 IU/ml〜およそ200 IU/ml、1 IU/ml〜50 IU/mlもしくはおよそ1 IU/ml〜およそ50 IU/ml、5 IU/ml〜25 IU/mlもしくはおよそ5 IU/ml〜およそ25 IU/ml、25 IU/ml〜50 IU/mlもしくはおよそ25 IU/ml〜およそ50 IU/ml、5 IU/ml〜15 IU/mlもしくはおよそ5 IU/ml〜およそ15 IU/ml、または10 IU/ml〜50 IU/mlもしくはおよそ10 IU/ml〜およそ50 IU/mlである。特定の態様において、IL-15の濃度は、1 IU/ml、2 IU/ml、3 IU/ml、4 IU/ml、5 IU/ml、6 IU/ml、7 IU/ml、8 IU/ml、9 IU/ml、10 IU/ml、11 IU/ml、12 IU/ml、13 IU/ml、14 IU/ml、15 IU/ml、20 IU/ml、25 IU/ml、30 IU/ml、40 IU/ml、50 IU/ml、100 IU/ml、もしくは200 IU/ml、またはおよそ1 IU/ml、およそ2 IU/ml、およそ3 IU/ml、およそ4 IU/ml、およそ5 IU/ml、およそ6 IU/ml、およそ7 IU/ml、およそ8 IU/ml、およそ9 IU/ml、およそ10 IU/ml、およそ11 IU/ml、およそ12 IU/ml、およそ13 IU/ml、およそ14 IU/ml、およそ15 IU/ml、およそ20 IU/ml、およそ25 IU/ml、およそ30 IU/ml、およそ40 IU/ml、およそ50 IU/ml、およそ100 IU/ml、もしくはおよそ200 IU/mlである。特定の態様において、IL-15の濃度は、およそ20 IU/mlである。いくつかの態様において、IL-15の濃度は、およそ100 IU/mlである。いくつかの態様において、IL-15の濃度は、およそ200 IU/mlである。
いくつかの態様において、無血清培地は、組み換えIL-2、組み換えIL-7、および/または組み換えIL-15、例えば、ヒト組み換えIL-2、ヒト組み換えIL-7、および/またはヒト組み換えIL-15を補充した基礎培地を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、およそ2 IU/ml〜およそ500 IU/mlの組み換えIL-2、およそ10 IU/ml〜およそ5,000 IU/mlの組み換えIL-7、およびおよそ2 IU/ml〜およそ500 IU/mlの組み換えIL-15を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、およそ50 IU/ml〜およそ500 IU/mlの組み換えIL-2、およそ100 IU/ml〜およそ2,000 IU/mlの組み換えIL-7、およびおよそ50 IU/ml〜およそ500 IU/mlの組み換えIL-15を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、例えば、細胞組成物の刺激/活性化および/または操作で用いるため、およそ50 IU/ml〜およそ150 IU/mlの組み換えIL-2、およそ500 IU/ml〜およそ1,000 IU/mlの組み換えIL-7、およびおよそ50 IU/ml〜およそ150 IU/mlの組み換えIL-15を含む。いくつかの態様において、無血清培地は、例えば、細胞組成物の培養または拡大増殖で用いるため、およそ150 IU/ml〜およそ250 IU/mlの組み換えIL-2、およそ1000 IU/ml〜およそ1,500 IU/mlの組み換えIL-7、およびおよそ150 IU/ml〜およそ250 IU/mlの組み換えIL-15を含む。いくつかの態様において、細胞組成物の培養または拡大増殖で用いられる無血清培地は、細胞組成物の刺激/活性化および/または操作で用いられる無血清培地よりも高い濃度の1つまたは複数のサイトカインを含有する。いくつかの態様において、細胞組成物の培養または拡大増殖で用いられる無血清培地は、細胞組成物の刺激/活性化および/または操作で用いられる無血清培地よりも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9もしくは3.0倍または少なくとも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9もしくは3.0倍の濃度の1つまたは複数のサイトカインを含有する。
いくつかの態様において、無血清培地は濃縮培地配合物である。いくつかの態様において、無血清培地は濃縮培地配合物ではない。いくつかの態様において、無血清培地は、2倍〜100倍またはおよそ2倍〜およそ100倍濃縮される。いくつかの態様において、無血清培地は、10倍またはおよそ10倍の配合物である。いくつかの態様において、無血清培地は、2℃〜8℃またはおよそ2℃〜8℃で貯蔵することができる。
いくつかの態様において、培地は、L-グルタミン、グルタミンのジペプチド形態、またはグルタミンの他の形態のさらなるサプリメントなしに少なくとも2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日またはそれ以上の間、細胞を培養することができる。
いくつかの態様において、無血清培地は、L-グルタミン、グルタミンのジペプチド形態、またはグルタミンの他の形態のさらなるサプリメントなしに少なくとも2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日またはそれ以上の間、細胞拡大増殖を促進することができる。
いくつかの態様において、無血清培地は細胞の拡大増殖を支持または促進する。いくつかの態様において、培地は細胞の生存性を支持または促進する。いくつかの態様において、培地は細胞の活性化を支持または促進する。
いくつかの態様において、細胞は免疫細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は初代免疫細胞を含む。いくつかの態様において、初代免疫細胞は遺伝子操作された細胞を含む。いくつかの態様において、初代免疫細胞はT細胞を含む。いくつかの態様において、初代免疫細胞はCD4および/またはCD8 T細胞を含む。いくつかの態様において、CD4および/またはCD8 T細胞は、遺伝子操作されたT細胞である。いくつかの態様において、T細胞は、組換え受容体(例えば、キメラ抗原受容体)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)発現T細胞を含む。
いくつかの態様において、無血清培地は、細胞の生存性、拡大増殖、および/または活性化を支持または促進し、ここで、無血清培地で培養された細胞は、約5〜10% (v/v)のヒト血清を含有する培地などの血清含有培地で培養された細胞と同等の機能特性(例えば、生存性、拡大増殖およびサイトカインの産生)を達成する。
D. 無血清培地の調製の方法
いくつかの態様において、無血清培地配合物を調製するための方法であって、(a) 細胞培養中にグルタミンの遊離形態(例えば、L-グルタミン)に変換されることができる合成アミノ酸を含む基礎培地と; (b) グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む第1のサプリメントであって、L-グルタミンがその成分になった後かつ組み合わせる前の少なくとも一部の時間、凍結された該第1のサプリメントとを組み合わせる段階を含む、該方法が提供される。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)である。いくつかの態様において、基礎培地は無血清である。いくつかの態様において、基礎培地は液体配合物であり、かつ/または組み合わせる前に凍結されていない、および/または貯蔵保管時に凍結されることが商業的プロトコルでは推奨されていない。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、L-グルタミンがその成分になった後かつ基礎培地と組み合わせる前の大部分の時間、凍結された。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、組み合わせる前に凍結および解凍された。
いくつかの態様において、無血清培地配合物を調製するための方法であって、(a) 細胞培養中にグルタミンの遊離形態(例えば、L-グルタミン)に変換されることができる合成アミノ酸を含む基礎培地と; (b) グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含む第1のサプリメントであって、L-グルタミンがその成分になった後かつ組み合わせる前の少なくとも一部の時間、凍結された該第1のサプリメントとを組み合わせる段階を含む、該方法が提供される。いくつかの態様において、合成アミノ酸は、L-グルタミンのジペプチド形態(例えば、L-アラニル-L-グルタミン)である。いくつかの態様において、基礎培地は無血清である。いくつかの態様において、基礎培地は液体配合物であり、かつ/または組み合わせる前に凍結されていない、および/または貯蔵保管時に凍結されることが商業的プロトコルでは推奨されていない。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、L-グルタミンがその成分になった後かつ基礎培地と組み合わせる前の大部分の時間、凍結された。いくつかの態様において、第1のサプリメントは、組み合わせる前に凍結および解凍された。
いくつかの態様において、第1のサプリメントは、基礎培地と組み合わされる前に、1週間以下またはおよそ1週間以下、例えば6、5、4、3、2、もしくは1日以下またはおよそ6、5、4、3、2、もしくは1日以下、一般に12時間、6時間、2時間、1時間もしくは30分以下またはおよそ12時間、6時間、2時間、1時間もしくは30分以下、液体配合物として解凍される。いくつかの態様において、L-グルタミンを含有する第1のサプリメントは、短時間(6、12、16、24、36、48時間以内など)または組み合わせる直前に凍結保存される。いくつかの態様において、L-グルタミンを含有する第1のサプリメントは、基礎培地と組み合わされる前の48、24、16、12、8、4、もしくは2時間以下またはおよそ48、24、16、12、8、4、もしくは2時間以下の間、液体配合物であった。いくつかの態様において、合成アミノ酸はL-グルタミンのジペプチドである。いくつかの態様において、合成アミノ酸はL-アラニル-L-グルタミンである。
いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90%〜98.75% (v/v)またはおよそ90%〜98.75% (v/v)の基礎培地と、1.25%〜10% (v/v)またはおよそ1.25%〜10% (v/v)の第1のサプリメントとを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、90%〜97.5% (v/v)またはおよそ90%〜97.5% (v/v)の基礎培地と、1.25%〜5% (v/v)またはおよそ1.25%〜5% (v/v)の第1のサプリメントとを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、95% (v/v)またはおよそ95% (v/v)の基礎培地と、2.5%±0.2% (v/v)またはおよそ2.5%±0.2% (v/v)、例えば2.5% (v/v)またはおよそ2.5% (v/v)の、第1のサプリメントとを含む。いくつかの態様において、1リットルの基礎培地に、25ミリリットルまたはおよそ25ミリリットルの第1のサプリメントが補充される。
いくつかの態様において、本方法は、第2のサプリメントを組み合わせる段階をさらに含む。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、1つまたは複数の抗酸化剤、1つまたは複数のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つまたは複数の脂質剤、1つまたは複数のインスリンまたはインスリン代替物、1つまたは複数のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つまたは複数の微量元素、および1つまたは複数のグルココルチコイドを含む、上記のいずれかのような、1つまたは複数のさらなる構成成分を含む。第2のサプリメントの例示的な構成成分は前述されている。
いくつかの態様において、第2のサプリメントは、アルブミン、N-アセチルシステイン(NAC)およびエタノールアミンを含む。いくつかの態様において、第2のサプリメントは、アルブミン、N-アセチルシステイン(NAC)およびエタノールアミンを含み、ここでアルブミン、NACおよび/またはエタノールアミンの濃度は、第2のサプリメントが基礎培地(本明細書において記述されるものなど)と組み合わされた後に、アルブミン、NACおよび/またはエタノールアミンの濃度が、本明細書において記述されるように実質的に同じであるようなものである。いくつかの態様において、アルブミンはヒト由来のアルブミンである。いくつかの態様において、アルブミンは、ヒト血漿または血清からのヒト由来アルブミンである。いくつかの態様において、第2のサプリメントは液体であり、グルタミンの遊離形態(すなわち、L-グルタミン)を含まないか、またはその有意な量を含まない。
いくつかの態様において、第2のサプリメントは、OpTmizer(登録商標)サプリメント(Thermofisher, A1048503の一部)を含む。
いくつかの態様において、第2のサプリメントは液体である。いくつかの態様において、第2のサプリメントは貯蔵のために凍結されないか、または凍結されることが推奨されない。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、およそ1.25%〜およそ5% (v/v)、例えばおよそ2.5%±0.2%、例えばおよそ2.5%またはおよそ2.6%の第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、1リットルの基礎培地に、約26ミリリットルの第2のサプリメントが補充される。
いくつかの態様において、無血清培地配合物は、およそ90%〜およそ97.5% (v/v)の基礎培地、およそ1.25%〜およそ5% (v/v)の第1のサプリメント、およびおよそ1.25%〜およそ5% (v/v)の第2のサプリメントを含む。いくつかの態様において、無血清培地配合物は、およそ95% (v/v)の基礎培地、およそ2.5%±0.2% (v/v)の第1のサプリメント、およびおよそ2.5%±0.2% (v/v)の第2のサプリメントを含む。
III. 組換え受容体
いくつかの態様では、本明細書に提供される方法、例えばセクションIに記載の方法によって処理され、加工され、遺伝子操作され、かつ/または産生された細胞は、組換えタンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）などの、組換え受容体）を含むまたは発現するか、それを含むまたは発現するように遺伝子操作される。ある特定の態様では、本明細書に提供される方法は、組換えタンパク質を発現するまたは含むように遺伝子操作された細胞、あるいは該細胞を含むおよび/または該細胞が濃縮された集団もしくは組成物を産生し、かつ/または産生することができる。いくつかの態様では、T細胞、またはT細胞の集団もしくは組成物が処理され、加工され、遺伝子操作され、かつ/または産生される。
いくつかの態様では、本明細書に提供される方法、例えばセクションIに記載の方法によって処理され、加工され、遺伝子操作され、かつ/または産生された細胞は、組換えタンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）などの、組換え受容体）を含むまたは発現するか、それを含むまたは発現するように遺伝子操作される。ある特定の態様では、本明細書に提供される方法は、組換えタンパク質を発現するまたは含むように遺伝子操作された細胞、あるいは該細胞を含むおよび/または該細胞が濃縮された集団もしくは組成物を産生し、かつ/または産生することができる。いくつかの態様では、T細胞、またはT細胞の集団もしくは組成物が処理され、加工され、遺伝子操作され、かつ/または産生される。
いくつかの態様では、細胞は、遺伝子操作を介して導入された1つまたは複数の核酸を含み、それにより、そのような核酸の組換え産物または遺伝子改変産物を発現する。いくつかの態様では、遺伝子導入は、最初に、増殖、生存率および/または活性化などの応答（例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現により測定される）を誘発する刺激と細胞とを組み合わせるなどにより、細胞を刺激し、続いて、活性化された細胞の形質導入を行い、臨床応用に十分な数にまで培養下で拡大増殖することによって達成される。
受容体には、抗原受容体およびその1つまたは複数の成分を含む受容体がある。組換え受容体には、キメラ受容体、例えばそのリガンド結合ドメインまたは結合フラグメントと細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域を含むもの、機能的非TCR抗原受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、およびT細胞受容体（TCR）、例えば組換えまたはトランスジェニックTCR、キメラ自己抗体受容体（CAAR）および前述のいずれかの成分が含まれる。CARなどの組換え受容体は、一般に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に、いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメイン（複数可）を介して、連結された細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。
1. キメラ抗原受容体（CAR）
いくつかの態様では、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば特定の細胞タイプの表面に発現される抗原、に対する特異性を有するCARを発現する、T細胞などの、遺伝子操作された細胞が提供される。いくつかの態様では、該抗原はポリペプチドである。いくつかの態様では、該抗原は炭水化物または他の分子である。いくつかの態様では、該抗原は、正常または非標的細胞もしくは組織と比較して、疾患または症状の細胞（例えば、腫瘍または病原性細胞）上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様では、該抗原は正常細胞に発現され、かつ/または遺伝子操作された細胞に発現される。
いくつかの態様では、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば特定の細胞タイプの表面に発現される抗原、に対する特異性を有するCARを発現する、T細胞などの、遺伝子操作された細胞が提供される。いくつかの態様では、該抗原はポリペプチドである。いくつかの態様では、該抗原は炭水化物または他の分子である。いくつかの態様では、該抗原は、正常または非標的細胞もしくは組織と比較して、疾患または症状の細胞（例えば、腫瘍または病原性細胞）上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様では、該抗原は正常細胞に発現され、かつ/または遺伝子操作された細胞に発現される。
特定の態様では、キメラ受容体などの組換え受容体は、細胞内シグナル伝達領域を含み、それは、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することができる細胞質（細胞内）領域などの、細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域（細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域とも交換可能に呼ばれる）、例えば、T細胞受容体（TCR）成分の細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域、またはその機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）を含み、かつ/またはそれは免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む。
いくつかの態様では、キメラ受容体はさらに、リガンド（例えば、抗原）抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様では、キメラ受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含むCARである。いくつかの態様では、抗原などのリガンドは、細胞の表面に発現されるタンパク質である。いくつかの態様では、CARはTCR様CARであり、抗原はプロセシングされたペプチド抗原、例えば、細胞内タンパク質のペプチド抗原であり、これは、TCRと同様に、主要組織適合性複合体（MHC）分子の状況下にあって細胞表面で認識される。
例示的な抗原受容体（例えば、CAR）、および遺伝子操作により該受容体を細胞に導入する方法は、例えば、以下に記載されているものを含む：国際特許出願公開番号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開番号：US2002131960、US2013287748、US20130149337、米国特許番号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、8,479,118、およびヨーロッパ特許出願番号EP2537416、および/またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75。いくつかの局面では、抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されるCAR、および国際特許出願公開番号WO/2014055668 A1に記載されるものを含む。CARの例には、前述の刊行物、例えば、WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)のいずれかに開示されるCARが含まれる。また、WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、および米国特許第8,389,282号も参照されたい。
いくつかの態様では、CARは、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば、養子免疫療法の標的となる特定の細胞タイプに発現される抗原（例えば、がんマーカー）、および/または抑制応答（dampening response）を誘発することを目的とした抗原（例えば、正常または非罹患細胞タイプで発現される抗原）、に対する特異性を示すように構築される。したがって、CARは一般に、その細胞外部分に、1つ以上の抗原結合分子、例えば、1つ以上の抗原結合フラグメント、ドメイン、もしくは部分、または1つ以上の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様では、CARは、抗体分子の抗原結合部分（複数可）、例えば、モノクローナル抗体（mAb）の可変重鎖（VH）と可変軽鎖（VL）から誘導される一本鎖抗体フラグメント（scFv）を含む。
いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの組換え受容体の一部として、細胞上に発現される。抗原受容体の中には、キメラ抗原受容体（CAR）などの、機能的な非TCR抗原受容体がある。一般に、ペプチド-MHC複合体に対するTCR様特異性を示す抗体または抗原結合フラグメントを含むCARは、TCR様CARと呼ばれることもある。いくつかの態様では、TCR様CARのMHC-ペプチド複合体に特異的な細胞外抗原結合ドメインは、いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメイン（複数可）を介して、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結される。いくつかの態様では、そのような分子は、典型的には、TCRなどの天然の抗原受容体を介したシグナル、および任意で、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介したシグナルをまねたり、そのようなシグナルに近づいたりすることができる。
いくつかの態様では、キメラ受容体（例えば、CAR）などの組換え受容体は、抗原（またはリガンド）に結合する、例えば特異的に結合する、リガンド結合ドメインを含む。キメラ受容体によって標的化される抗原の中には、疾患、症状、または養子細胞療法により標的化される細胞タイプの状況下で発現される抗原がある。疾患および症状の中には、増殖性、腫瘍性、および悪性の疾患および障害があり、例えば、血液のがん、免疫系のがん、例えば、リンパ腫、白血病、および/または骨髄腫、例えばB細胞性、T細胞性、および骨髄性白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が含まれる。
いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）はポリペプチドである。いくつかの態様では、それは炭水化物または他の分子である。いくつかの態様では、該抗原（またはリガンド）は、正常または非標的細胞もしくは組織と比較して、疾患または症状の細胞（例えば、腫瘍または病原性細胞）上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様では、該抗原は正常細胞上に発現され、かつ/または遺伝子操作された細胞上に発現される。
いくつかの態様では、CARは、細胞の表面に発現された、インタクトの抗原などの、抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合フラグメント（例えば、scFv）を含む。
いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）は腫瘍抗原またはがんマーカーである。いくつかの態様では、抗原（またはリガンド）は、以下であるか、または以下を含む：αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、別名CAIXまたはG250）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、別名NY-ESO-1およびLAGE-2）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、タイプIII上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；別名Fc受容体ホモログ5またはFCRH5）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体α、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体α（IL-22Rα）、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A：LRRC8A）、Lewis Y、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メラン（melan）A（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、がん胎児抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、トロホブラスト（Trophoblast）糖タンパク質（TPBG、別名5T4）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、別名TYRP1またはgp75）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、別名ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼまたはDCT）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR2）、Wilms Tumor 1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子。いくつかの態様における該受容体によって標的化される抗原には、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば、多くの公知のB細胞マーカーのいずれかが含まれる。いくつかの態様では、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79bまたはCD30であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様では、CARは、BCMA、例えばヒトBCMAに特異的な抗BCMA CARである。マウス抗ヒトBCMA抗体およびヒト抗ヒト抗体などの抗BCMA抗体を含むキメラ抗原受容体、ならびにそのようなキメラ受容体を発現する細胞は、以前に記載されている。Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060；WO 2016/090320；WO2016/090327；WO2010104949A2およびWO2017173256を参照されたい。いくつかの態様において、抗原または抗原結合ドメインはBCMAである。いくつかの態様において、scFvは、BCMAに特異的な抗体または抗体断片に由来するVHおよびVLを含有する。いくつかの態様において、BCMAに結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号WO 2016/090327およびWO 2016/090320に記載されている抗体または抗体断片由来のVHおよびVLであるか、またはそれらを含有する。
いくつかの態様では、抗BCMA CARは、WO 2016/090320またはWO2016090327に記載される抗体に由来する可変重鎖（VH）および/または可変軽鎖（VL）領域を含む、scFvなどの抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 30に示されるVHおよびSEQ ID NO: 31に示されるVLを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 32に示されるVHおよびSEQ ID NO: 33に示されるVLを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 34に示されるVHおよびSEQ ID NO: 35に示されるVLを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 27に示されるVHおよびSEQ ID NO: 28に示されるVLを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 41に示されるVHおよびSEQ ID NO: 42に示されるVLを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 43に示されるVHおよびSEQ ID NO: 44に示されるVLを含む。いくつかの態様では、scFvなどの抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 45に示されるVHおよびSEQ ID NO: 46に示されるVLを含む。いくつかの態様では、VHまたはVLは、前述のVHまたはVL配列のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつBCMAへの結合を保持する。いくつかの態様では、VH領域はVL領域のアミノ末端側である。いくつかの態様では、VH領域はVL領域のカルボキシ末端側である。
いくつかの態様では、抗原または抗原結合ドメインはCD19である。いくつかの態様では、scFvは、CD19に特異的な抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様では、CD19に結合する抗体または抗体フラグメントは、マウス由来の抗体、例えばFMC63およびSJ25C1である。いくつかの態様では、該抗体または抗体フラグメントは、例えば、米国特許公開番号US 2016/0152723に記載されるような、ヒト抗体である。
いくつかの態様では、CARは、CD19、例えばヒトCD19に特異的な抗CD19 CARである。いくつかの態様では、scFvおよび/またはVHドメインは、FMC63に由来する。FMC63は一般に、ヒト起源のCD19を発現するNalm-1および-16細胞に対して作製されたマウスモノクローナルIgG1抗体を指す（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。いくつかの態様では、FMC63抗体は、それぞれSEQ ID NO: 50および51に示されるCDR-H1およびCDR-H2、およびSEQ ID NO: 52または66に示されるCDR-H3、ならびにSEQ ID NO: 47に示されるCDR-L1、SEQ ID NO: 48または67に示されるCDR-L2、およびSEQ ID NO: 49または68に示されるCDR-L3を含む。いくつかの態様では、FMC63抗体は、SEQ ID NO: 53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）およびSEQ ID NO: 54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:47のCDR-L1とSEQ ID NO:48のCDR-L2とSEQ ID NO:49のCDR-L3を含む可変軽鎖、および/またはSEQ ID NO:50のCDR-H1とSEQ ID NO:51のCDR-H2とSEQ ID NO:52のCDR-H3を含む可変重鎖を含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:53に示される可変重鎖領域およびSEQ ID NO:54に示される可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様では、可変重鎖と可変軽鎖はリンカーにより連結されている。いくつかの態様では、リンカーはSEQ ID NO:70に示される。いくつかの態様では、scFvは、順に、VH、リンカー、およびVLを含む。いくつかの態様では、scFvは、順に、VL、リンカー、およびVHを含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:69に示されるヌクレオチドの配列、またはSEQ ID NO:69に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列によりコードされる。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:55に示されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:55に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を含む。
いくつかの態様では、scFvは、SJ25C1に由来する。SJ25C1は、ヒト起源のCD19を発現するNalm-1および-16細胞に対して作製されたマウスモノクローナルIgG1抗体である（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。いくつかの態様では、SJ25C1抗体は、それぞれSEQ ID NO: 59〜61に示されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3配列と、それぞれSEQ ID NO: 56〜58に示されるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3配列を含む。いくつかの態様では、SJ25C1抗体は、SEQ ID NO: 62のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）およびSEQ ID NO: 63のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:56のCDR-L1配列とSEQ ID NO:57のCDR-L2配列とSEQ ID NO:58のCDR-L3配列を含む可変軽鎖、および/またはSEQ ID NO:59のCDR-H1配列とSEQ ID NO:60のCDR-H2配列とSEQ ID NO:61のCDR-H3配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:62に示される可変重鎖領域およびSEQ ID NO:63に示される可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様では、可変重鎖と可変軽鎖はリンカーにより連結されている。いくつかの態様では、リンカーはSEQ ID NO:64に示される。いくつかの態様では、scFvは、順に、VH、リンカー、およびVLを含む。いくつかの態様では、scFvは、順に、VL、リンカー、およびVHを含む。いくつかの態様では、scFvは、SEQ ID NO:65に示されるアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:65に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を示す配列を含む。
いくつかの態様では、抗原はCD20である。いくつかの態様では、scFvは、CD20に特異的な抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様では、CD20に結合する抗体または抗体フラグメントは、リツキシマブであるか、またはリツキシマブに由来する抗体であり、例えば、リツキシマブscFvである。
いくつかの態様では、抗原はCD22である。いくつかの態様では、scFvは、CD22に特異的な抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様では、CD22に結合する抗体または抗体フラグメントは、m971であるか、またはm971に由来する抗体であり、例えば、m971 scFvである。
いくつかの態様では、抗原または抗原結合ドメインはGPRC5Dである。いくつかの態様では、scFvは、GPRC5Dに特異的な抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様では、GPRC5Dに結合する抗体または抗体フラグメントは、国際特許出願、公開番号WO 2016/090329およびWO 2016/090312に記載される抗体または抗体フラグメントに由来するVHおよびVLであるか、またはそれらを含む。
いくつかの態様では、抗体は、2つの抗体ドメインまたは領域、例えば重鎖可変（VH）領域と軽鎖可変（VL）領域、をつなぐ1つ以上のリンカーを含む、scFvなどの抗原結合フラグメントである。リンカーは、典型的には、ペプチドリンカー、例えば、柔軟性および/または可溶性のペプチドリンカーである。リンカーの中には、グリシンおよびセリンおよび/または場合によってはスレオニンに富むリンカーがある。いくつかの態様では、リンカーは、溶解性を改善できるリシンおよび/またはグルタミン酸などの荷電残基をさらに含む。いくつかの態様では、リンカーは、1個または複数のプロリンをさらに含む。いくつかの局面では、グリシンおよびセリン（および/またはスレオニン）に富むリンカーは、少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％のそのようなアミノ酸を含む。いくつかの態様では、それらは少なくとも50％、55％、60％、70％、もしくは75％、または少なくとも約50％、55％、60％、70％、もしくは75％のグリシン、セリン、および/またはスレオニンを含む。いくつかの態様では、リンカーは、実質的に完全にグリシン、セリン、および/またはスレオニンから構成される。リンカーは一般に、約5〜約50アミノ酸長、典型的には10〜30または約10〜約30、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30、いくつかの例では、10〜25アミノ酸長である。例示的なリンカーには、配列GGGGS（4GS; SEQ ID NO:36）またはGGGS（3GS; SEQ ID NO:37）の様々な数の反復、例えば、そのような配列の2、3、4、および5反復を有するリンカーが含まれる。例示的なリンカーとして、
に示される配列を有するか、またはそれからなるものが挙げられる。
いくつかの態様では、抗原は、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、抗原は、ウイルス抗原（例えば、HIV、HCV、HBVなどのウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。いくつかの態様では、CARは、TCR様抗体、例えば、細胞表面にMHC-ペプチド複合体として提示される、腫瘍関連抗原などの、細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合フラグメント（例えば、scFv）を含む。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体などの、組換え受容体の一部として細胞上に発現させることができる。抗原受容体の中には、キメラ抗原受容体（CAR）などの、機能的な非TCR抗原受容体がある。一般的に、ペプチド-MHC複合体に対するTCR様特異性を示す抗体または抗原結合フラグメントを含むCARは、TCR様CARともいうことができる。
「主要組織適合性複合体」（MHC）への言及は、ポリペプチドのペプチド抗原（細胞内機構によってプロセシングされたペプチド抗原を含む）と場合により複合体化し得る、多型ペプチド結合部位または結合溝を含むタンパク質、一般的には糖タンパク質を指す。いくつかの場合には、MHC分子は、TCRなどのT細胞上の抗原受容体またはTCR様抗体によって認識されるコンフォメーションで抗原を提示するために、例えばペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体として、細胞表面にディスプレイまたは発現され得る。一般的に、MHCクラスI分子は、場合により3つのαドメインを含む膜貫通α鎖と、非共有結合したβ2ミクログロブリンを有する、ヘテロ二量体である。一般的に、MHCクラスII分子は、2つの膜貫通糖タンパク質αおよびβで構成され、両方とも通常は膜にまたがっている。MHC分子は、ペプチドを結合するための抗原結合部位（複数可）および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含む、MHCの有効な部分を含み得る。いくつかの態様では、MHCクラスI分子は、細胞質ゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達する；この場合には、MHC-ペプチド複合体はT細胞、例えば一般にはCD8+ T細胞によって認識されるが、場合によってはCD4+ T細胞によって認識される。いくつかの態様では、MHCクラスII分子は、小胞系（vesicular system）に由来するペプチドを細胞表面に送達する；この場合には、それらは通常CD4+ T細胞によって認識される。一般に、MHC分子は、マウスではH-2、ヒトではヒト白血球抗原（HLA）と総称される、連鎖している遺伝子座のグループによってコードされる。それゆえ、一般的に、ヒトMHCはヒト白血球抗原（HLA）と称されることもある。
用語「MHC-ペプチド複合体」または「ペプチド-MHC複合体」またはその変形は、一般に、MHC分子の結合溝または裂け目に収まったペプチドの非共有結合的相互作用などによる、ペプチド抗原とMHC分子の複合体または会合を指す。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するか、または提示される。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体は、抗原受容体、例えば、TCR、TCR様CAR、またはその抗原結合部分によって特異的に認識され得る。
いくつかの態様では、ポリペプチドの、ペプチド抗原またはエピトープなどのペプチドは、例えば抗原受容体による認識のために、MHC分子と会合することができる。一般に、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質などのより長い生体分子に由来するか、またはその断片に基づく。いくつかの態様では、ペプチドは、典型的には約8〜約24アミノ酸長である。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスII複合体での認識のために、9〜22または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、ペプチドは、MHCクラスI複合体での認識のために、8〜13または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体などの、MHC分子との関連でペプチドが認識されると、TCRまたはTCR様CARなどの抗原受容体は、T細胞応答、例えば、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答または他の応答を誘導するT細胞への活性化シグナルをもたらすか、または引き起こす。
いくつかの態様では、TCR様抗体または抗原結合部分は、公知であるか、または公知の方法により作製することができる（例えば、米国特許出願公開番号US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; および国際PCT公開番号WO 03/068201を参照されたい）。
いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体を含む有効量の免疫原で宿主を免疫することによって作製され得る。いくつかの場合では、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、MHCに結合することができる抗原、例えば、腫瘍抗原、例えば、ユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原、または以下に記載される他の抗原、のエピトープである。いくつかの態様では、次いで、免疫応答を誘発するために、有効量の免疫原が宿主に投与される；その場合、免疫原は、MHC分子の結合溝内のペプチドの三次元表現に対する免疫応答を引き出すのに十分な期間にわたってその三次元形態を保持する。その後、宿主から回収された血清をアッセイして、MHC分子の結合溝内のペプチドの三次元表現を認識する所望の抗体が産生されているかどうかを判定する。いくつかの態様では、産生された抗体をアッセイして、該抗体がMHC-ペプチド複合体をMHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと無関係のペプチドとの複合体から区別し得ることを確認することができる。その後、所望の抗体を単離することができる。
いくつかの態様では、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、ファージ抗体ライブラリーなどの、抗体ライブラリーディスプレイ法を使用することによって取得することができる。いくつかの態様では、変異型Fab、scFvまたは他の抗体形態のファージディスプレイライブラリーが作製され、例えば、該ライブラリーではそのメンバーがCDR（複数可）の1つまたは複数の残基で変異している。例えば、米国特許出願公開番号US20020150914; US2014/0294841; およびCohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい。
本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味において用いられ、インタクトな抗体および機能的な(抗原結合)抗体断片などのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含み、これには、抗原結合断片(Fab)断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組み換えIgG (rIgG)断片、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖(VH)領域、単鎖可変断片(scFv)などの単鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体(例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ)断片が含まれる。この用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異的、例えば二重特異的抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムジ-scFv、タンデムトリ-scFvのような、遺伝子操作されおよび/またはそれ以外に改変された形態の免疫グロブリンを包含する。別段の言及がなければ、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、ならびにIgDなどの任意のクラスまたはサブクラスの抗体などの、インタクトなまたは全長の抗体を包含する。
「相補性決定領域」および「CDR」という用語が「超可変領域」または「HVR」と同義であって、抗原特異性および/または結合親和性を付与する抗体可変領域内の不連続なアミノ酸配列をいうことは、当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域中に3つのCDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)が存在し、各軽鎖可変領域中に3つのCDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)が存在する。「フレームワーク領域」および「FR」が、重鎖および軽鎖の可変領域の非CDR部分をいうことは、当技術分野において公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域中に4つのFR (FR-H1、FR-H2、FR-H3およびFR-H4)が存在し、各完全長軽鎖可変領域中に4つのFR (FR-L1、FR-L2、FR-L3およびFR-L4)が存在する。
所定のCDRまたはFRの正確なアミノ酸配列の境界は、いくつかのよく知られたスキームのいずれかを用いて簡単に決定することができ、そうしたスキームには、以下に記載されるものが含まれる：Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Kabat」ナンバリングスキーム）；Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Chothia」ナンバリングスキーム）；MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.”（「Contact」ナンバリングスキーム）；Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77（「IMGT」ナンバリングスキーム）；Honegger A and Plueckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70（「Aho」ナンバリングスキーム）；およびMartin et al., “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,” PNAS, 1989, 86(23):9268-9272（「AbM」ナンバリングスキーム）。
特定のCDRまたはFRの境界は、識別に使用したスキームによって異なることがある。例えば、Kabatスキームは構造的アラインメントに基づいており、一方Chothiaスキームは構造的情報に基づいている。KabatとChothiaの両スキームの番号付けは、最も一般的な抗体領域の配列の長さに基づいており、挿入文字（例えば「30a」）に対応する挿入および欠失が一部の抗体に現れる。これらの2つのスキームは、特定の挿入と欠失（「インデル」）を異なる位置に配置し、その結果として異なった番号付けをもたらす。Contactスキームは、複雑な結晶構造の解析に基づいており、多くの点でChothiaナンバリングスキームと類似している。AbMスキームは、Oxford Molecular社のAbM抗体モデリングソフトウェアで使用されたものに基づく、KabatとChothiaの定義の間の妥協案である。
以下の表1は、それぞれKabat、Chothia、AbM、およびContactスキームで識別されるCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3の例示的な位置境界を示す。CDR-H1の場合は、残基の番号付けが、KabatとChothiaの両方のナンバリングスキームを用いて示されている。FRはCDR間に位置し、例えば、FR-L1はCDR-L1の前に位置し、FR-L2はCDR-L1とCDR-L2の間に位置し、FR-L3はCDR-L2とCDR-L3の間に位置する、といった具合である。示されるKabatナンバリングスキームはH35AとH35Bに挿入を配置するため、示されるKabatナンバリング規則を用いて番号付けされた場合のChothia CDR-H1ループの終わりは、ループの長さに応じてH32とH34の間で異なることに留意されたい。
（表１）各種のナンバリングスキームによるCDRの境界
1 - Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
したがって、他に指定されない限り、所与の抗体またはその領域（その可変領域など）の「CDR」または「相補性決定領域」または個々の特定されたCDR（例えば、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3）は、前述のスキームまたは他の公知のスキームのいずれかによって定義された相補性決定領域（または具体的な相補性決定領域）を含むと理解されるべきである。例えば、特定のCDR（例えば、CDR-H3）が、所定のVHまたはVL領域のアミノ酸配列中に対応するCDRのアミノ酸配列を含むことが述べられている場合、そのようなCDRは、前述のスキームまたは他の公知のスキームのいずれかによって定義された対応するCDR（例えば、CDR-H3）の配列を可変領域内にもつことが理解される。いくつかの態様では、具体的なCDR配列が指定される。抗体の例示的なCDR配列は、各種のナンバリングスキームを用いて記載されるが、抗体は、前述の他のナンバリングスキームまたは当業者に公知の他のナンバリングスキームのいずれかに従って記載されるCDRを含み得ることが理解されよう。
同様に、他に指定されない限り、所与の抗体またはその領域（その可変領域など）の「FR」または個々の特定されたFR（例えば、FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4）は、公知のスキームのいずれかによって定義されたフレームワーク領域（または具体的なフレームワーク領域）を含むと理解されるべきである。いくつかの場合には、Kabat、Chothia、AbMもしくはContactの方法、または他の公知のスキームによって定義されたCDRなど、特定のCDRまたはFR（複数可）を識別するためのスキームが指定される。他の場合には、CDRまたはFRの特定のアミノ酸配列が示される。
いくつかの態様では、抗原結合タンパク質、抗体およびその抗原結合フラグメントは、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様では、抗体の重鎖および軽鎖は、完全長であるか、または抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fvまたは一本鎖Fvフラグメント（scFv））であり得る。他の態様では、抗体重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選択され、特に、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、より具体的には、IgG1（例えば、ヒトIgG1）から選択される。別の態様では、抗体軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ、特にカッパから選択される。
抗体の中には、抗体フラグメントが含まれる。「抗体フラグメント」は、インタクトの抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、限定するものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線形抗体；可変重鎖（VH）領域、一本鎖抗体分子、例えばscFvおよび単一ドメインVH単一抗体；抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。特定の態様では、抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメント、例えばscFvである。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体が抗原に結合する際に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つのCDRを含む。例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを用いて、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより、単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様では、CARは、抗原に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む；該抗原は、腫瘍細胞、がん細胞などの、標的となる細胞または疾患のがんマーカーもしくは細胞表面抗原、例えば、本明細書に記載のまたは公知の標的抗原のいずれかである。
抗体フラグメントは、インタクトの抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限らない、様々な技術によって作製することができる。いくつかの態様では、抗体は、組換えにより作製されたフラグメントであり、例えば、天然には存在しない配置を含むフラグメント、例えば、ペプチドリンカーなどの合成リンカーによって連結された2つ以上の抗体領域または鎖を有するもの、および/または天然に存在するインタクトの抗体の酵素消化によっては生じないものなどである。いくつかの態様では、抗体フラグメントはscFvである。
「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、全てまたは実質的に全てのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、典型的にはヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化を受けた、非ヒト抗体のバリアントを指す。いくつかの態様では、ヒト化抗体の一部のFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させるかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置き換えられる。
したがって、いくつかの態様では、TCR様CARなどのキメラ抗原受容体は、抗体または抗体フラグメントを含む細胞外部分を含む。いくつかの態様では、その抗体またはフラグメントにはscFvが含まれる。いくつかの局面では、キメラ抗原受容体は、抗体またはフラグメントを含む細胞外部分と細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞で一次活性化シグナルを誘導できるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。
いくつかの態様では、CAR、例えばその抗体部分などの、組換え受容体はさらに、スペーサーを含み、該スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは修飾バージョンの少なくとも一部、例えば、IgG4ヒンジ領域などのヒンジ領域、および/またはCH1/CLおよび/またはFc領域であっても、それを含んでもよい。いくつかの態様では、組換え受容体はさらに、スペーサーおよび/またはヒンジ領域を含む。いくつかの態様では、定常領域または部分は、ヒトIgG、例えばIgG4またはIgG1、のものである。いくつかの局面では、定常領域の部分は、抗原認識成分（例えば、scFv）と膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として機能する。スペーサーは、スペーサーがない場合と比較して、抗原結合後の細胞の応答性を増加させる長さのものであり得る。
いくつかの例では、スペーサーは、12アミノ酸または約12アミノ酸の長さであるか、またはわずか12アミノ酸の長さであるにすぎない。例示的なスペーサーには、以下が含まれる：少なくとも約10〜229アミノ酸、約10〜200アミノ酸、約10〜175アミノ酸、約10〜150アミノ酸、約10〜125アミノ酸、約10〜100アミノ酸、約10〜75アミノ酸、約10〜50アミノ酸、約10〜40アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約10〜20アミノ酸、または約10〜15アミノ酸を有するもの（上記範囲のいずれかの両端間の任意の整数を含む）。いくつかの態様では、スペーサー領域は、約12アミノ酸以下、約119アミノ酸以下、または約229アミノ酸以下を有する。例示的なスペーサーには、IgG4ヒンジ単独、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジが含まれる。例示的なスペーサーには、限定するものではないが、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153; Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135または国際特許出願公開番号WO2014031687; 米国特許第8,822,647号または米国特許出願公開番号US2014/0271635に記載されるものが含まれる。いくつかの態様では、スペーサーは、免疫グロブリンヒンジ領域、CH2およびCH3領域の配列を含む。いくつかの態様では、ヒンジ、CH2およびCH3の1つまたは複数は、全部または一部がIgG4またはIgG2に由来する。いくつかの場合には、ヒンジ、CH2およびCH3はIgG4に由来する。いくつかの局面では、ヒンジ、CH2およびCH3の1つまたは複数はキメラであり、IgG4およびIgG2に由来する配列を含む。いくつかの例では、スペーサーは、IgG4/2キメラヒンジ、IgG2/4 CH2、およびIgG4 CH3領域を含む。
いくつかの態様では、スペーサーは、全部または一部がIgG4および/またはIgG2に由来することができ、1つ以上のドメインに1つまたは複数の単一アミノ酸変異などの変異を含むことができる。いくつかの例では、アミノ酸の改変は、IgG4のヒンジ領域におけるセリン（S）のプロリン（P）による置換である。いくつかの態様では、アミノ酸の改変は、グリコシル化の不均一性を低減させるためのアスパラギン（N）のグルタミン（Q）による置換、例えば、全長IgG4 Fc配列のCH2領域の177位でのN177Q変異、または全長IgG4 Fc配列のCH2領域の176位でのN176Qなどである。
いくつかの態様では、スペーサーは配列ESKYGPPCPPCP（SEQ ID NO: 1に示される）を有し、SEQ ID NO: 2に示される配列によりコードされる。いくつかの態様では、スペーサーはSEQ ID NO: 3に示される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーはSEQ ID NO: 4に示される配列を有する。いくつかの態様では、コードされるスペーサーは、SEQ ID NO: 29に示される配列であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、定常領域または部分はIgDのものである。いくつかの態様では、スペーサーはSEQ ID NO: 5に示される配列を有する。いくつかの態様では、スペーサーは、SEQ ID NO: 1、3、4、5または29のいずれかに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。
いくつかの態様において、定常領域または部分はIgDのものである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO: 5に記載された配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO: 1、3、4および5のいずれかと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性または少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。
抗原認識ドメインは一般に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成成分、例えば、CARの場合であればTCR複合体などの抗原受容体複合体を介する活性化を模倣し、かつ/または別の細胞表面受容体を通してシグナル伝達するシグナル伝達構成成分などに、連結される。したがって、いくつかの態様において、抗原結合構成成分（例えば、抗体）は、1つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達領域に連結される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは細胞外ドメインに融合される。1つの態様では、受容体、例えばCAR中のドメインの1つに天然で付随している膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するように選択され、またはアミノ酸置換によって修飾される。
膜貫通ドメインはいくつかの態様において、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、ドメインはいくつかの局面において、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、T細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む）ものが含まれる。あるいは、膜貫通ドメインはいくつかの態様において合成による。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインは、主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインの各末端には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見いだされるであろう。いくつかの態様において、連結はリンカー、スペーサー、および／または膜貫通ドメインによる。
細胞内シグナル伝達領域には、天然抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体と組み合わされたそのような受容体を介するシグナル、および／または共刺激受容体のみを介するシグナルを模倣するか、またはそれらに近似するものが含まれる。いくつかの態様では、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば2〜10アミノ酸長のリンカー、例えばグリシンおよびセリン（例えば、グリシン-セリンダブレット）を含有するものなどが存在し、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成する。
受容体、例えばCARは、一般に、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達構成成分または細胞内シグナル伝達構成成分群を含む。いくつかの態様において、受容体は、TCR複合体の細胞内構成成分、例えばT細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖など、例えばCD3ゼータ鎖を含む。したがって、いくつかの局面において、ROR1結合抗体は1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの態様において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えばCARは、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16などの1つまたは複数の付加的な分子の一部をさらに含む。例えば、いくつかの局面において、CARは、CD3-ゼータ (CD3-ζ) またはFc受容体γとCD8、CD4、CD25、またはCD16とのキメラ分子を含む。
いくつかの態様では、CARの連結時に、CARの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達領域は、免疫細胞、例えばCARを発現するように操作されたT細胞、の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、状況によっては、CARは、細胞溶解活性またはTヘルパー活性などといったT細胞の機能、例えばサイトカインまたは他の因子の分泌などを誘導する。いくつかの態様では、例えば、抗原受容体構成成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域の切断された部分が、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、インタクトな免疫刺激鎖の代わりにそれが使用される。いくつかの態様において、例えば1つまたは複数の細胞内ドメインを含む、細胞内シグナル伝達領域は、T細胞受容体 (TCR) の細胞質配列を含み、いくつかの局面では、天然状況においてそのような受容体と協調して作用して抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始させる共受容体の細胞質配列、および/またはそのような分子の任意の派生物もしくは変種の細胞質配列、および/または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も、含む。
天然のTCRの状況において、完全な活性化は一般に、TCRを介するシグナル伝達のみならず、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの態様では、完全な活性化を促進するために、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための構成成分もまたCARに含まれる。他の態様において、CARは、共刺激シグナルを生成するための構成成分を含まない。いくつかの局面では、同じ細胞中で付加的なCARが発現され、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための構成成分を提供する。
T細胞活性化は、いくつかの局面において、2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：TCRを介する抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）；および抗原非依存的様式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると説明される。いくつかの局面において、CARは、そのようなシグナル伝達構成成分の一方または両方を含む。
いくつかの局面において、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有し得る。ITAM含有一次細胞質シグナル伝達配列の例には、TCRもしくはCD3ゼータ、FcRガンマ、またはFcRベータに由来するものが含まれる。いくつかの態様において、CAR中の細胞質シグナル伝達分子は、CD3ゼータ由来の、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部、または配列を含有する。
いくつかの態様において、CARは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、およびICOSなどの共刺激受容体のシグナル伝達領域および／または膜貫通部分を含む。いくつかの局面では、同じCARが、シグナル伝達領域と共刺激構成成分の両方を含む。
いくつかの態様では、シグナル伝達領域が1つのCAR内に含まれる一方で、共刺激構成成分は、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。いくつかの態様において、CARは、いずれも同じ細胞上に発現される活性化または刺激CAR、および共刺激CARを含む（WO2014/055668を参照されたい）。
ある特定の態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3（例えば、CD3-ゼータ）細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3ゼータ細胞内ドメインに連結されたキメラCD28およびCD137（4-1BB、TNFRSF9）共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様において、CARは、細胞質部分において、1つまたは複数の、例えば2つまたはそれ以上の、共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを包含する。例示的なCARは、CD3-ゼータ、CD28、および4-1BBの細胞内構成成分を含む。
場合により、CARは、第1世代CAR、第2世代CAR、および／または第3世代CARと称される。いくつかの局面において、第1世代CARは、抗原結合時にCD3鎖誘導性シグナルを単に提供するものであり；いくつかの局面において、第2世代CARは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するもの、例えばCD28またはCD137などの共刺激受容体からの細胞内シグナリングドメインを含むものであり；いくつかの局面において、第3世代CARは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体または断片を含有する細胞外部分を含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体または断片を含有する細胞外部分、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体または断片はscFvまたは単一ドメインVH抗体を含み、細胞内ドメインはITAMを含有する。いくつかの局面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ (CD3ζ) 鎖のゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に配置された膜貫通ドメインを含む。
いくつかの局面では、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含む。細胞外ドメインと膜貫通ドメインは直接または間接的に連結され得る。いくつかの態様では、細胞外ドメインと膜貫通ドメインは、本明細書に記載されるような、スペーサーによって連結される。いくつかの態様では、キメラ抗原受容体は、例えば膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間に、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または4-1BBである。
いくつかの態様では、CARは、抗体、例えば抗体フラグメント、CD28の膜貫通部分またはその機能的変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメイン、およびCD28のシグナル伝達部分またはその機能的変異体とCD3ゼータのシグナル伝達部分またはその機能的変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、CARは、抗体、例えば抗体フラグメント、CD28の膜貫通部分またはその機能的変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメイン、および4-1BBのシグナル伝達部分またはその機能的変異体とCD3ゼータのシグナル伝達部分またはその機能的変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかのそのような態様では、該受容体は、ヒトIg分子などのIg分子の一部を含むスペーサー、例えばIgG4ヒンジなどのIgヒンジを含むスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
いくつかの態様では、該受容体、例えばCAR、の膜貫通ドメイン、は、ヒトCD28の膜貫通ドメインまたはその変異体、例えばヒトCD28の27アミノ酸膜貫通ドメイン（アクセッション番号：P10747.1）であるか、またはSEQ ID NO: 8に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO: 8に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインである；いくつかの態様では、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、SEQ ID NO: 9に示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、キメラ抗原受容体はT細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または4-1BBである。
いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体もしくは部分、例えば、その41アミノ酸ドメインおよび/または天然CD28タンパク質の186-187位にLLからGGへの置換を有するそのようなドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 10または11に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 10または11に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの態様では、細胞内領域は、4-1BBの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体もしくは部分、例えば、ヒト4-1BBの42アミノ酸細胞質ドメイン（アクセッション番号Q07011.1）またはその機能的変異体もしくは部分、例えば、SEQ ID NO: 12に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトCD3鎖、任意でCD3ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3の112アミノ酸細胞質ドメイン（アクセッション番号：P20963.2）または米国特許第7,446,190号または米国特許第8,911,993号に記載されるCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、SEQ ID NO: 13、14または15に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 13、14または15に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの局面では、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えばSEQ ID NO:1に示されるヒンジのみのスペーサーを含む。他の態様では、スペーサーは、CH2および/またはCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、例えばSEQ ID NO:3に示される、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、例えばSEQ ID NO:4に示される、CH3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様では、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または他の柔軟性のリンカー、例えば公知の柔軟性リンカーであるか、またはそれを含む。
2. T細胞受容体（TCR）
いくつかの態様では、腫瘍、ウイルスまたは自己免疫タンパク質の抗原などの、標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはT細胞エピトープを認識する、T細胞受容体（TCR）またはその抗原結合部分を発現する、操作された細胞、例えばT細胞が提供される。
いくつかの態様では、腫瘍、ウイルスまたは自己免疫タンパク質の抗原などの、標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはT細胞エピトープを認識する、T細胞受容体（TCR）またはその抗原結合部分を発現する、操作された細胞、例えばT細胞が提供される。
いくつかの態様では、「T細胞受容体」または「TCR」は、可変α鎖およびβ鎖（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても知られる）もしくは可変γ鎖およびδ鎖（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても知られる）、またはその抗原結合部分を含み、かつMHC分子に結合されたペプチドに特異的に結合することができる分子である。いくつかの態様では、TCRはαβ型である。典型的には、αβ型およびγδ型で存在するTCRは一般に構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は異なる解剖学的位置または機能をもつ可能性がある。TCRは細胞の表面上に、または可溶性の形態で存在し得る。一般に、TCRはT細胞（またはTリンパ球）の表面に見られ、そこでは一般的に主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識に関与している。
特に明記しない限り、用語「TCR」は、完全なTCRだけでなく、その抗原結合部分または抗原結合フラグメントを包含すると理解されるべきである。いくつかの態様では、TCRは、αβ型またはγδ型のTCRを含めて、インタクトまたは完全長のTCRである。いくつかの態様では、TCRは完全長のTCRに満たない抗原結合部分であるが、それは、MHC-ペプチド複合体に結合するなど、MHC分子に結合した特定のペプチドに結合する。いくつかの場合には、TCRの抗原結合部分またはフラグメントは、完全長またはインタクトのTCRの構造ドメインの一部のみを含んでいてよいが、完全なTCRが結合するMHC-ペプチド複合体などのペプチドエピトープに結合することができる。いくつかの場合には、抗原結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なTCRの可変ドメイン、例えば、TCRの可変α鎖および可変β鎖を含む。一般に、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHCおよび/またはMHC-ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含む。
いくつかの態様では、TCRの可変ドメインは超可変ループまたは相補性決定領域（CDR）を含み、これらは一般に、抗原認識ならびに結合能および結合特異性に対する主要な寄与因子である。いくつかの態様では、TCRの1つのCDRまたはその組み合わせは、所与のTCR分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。TCR鎖の可変領域内の様々なCDRは一般に、フレームワーク領域（FR）によって分離されており、このFRは通常、CDRと比較して、TCR分子間でより少ない可変性（変動性）を示す（例えば、Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照されたい；また、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照されたい）。いくつかの態様では、CDR3は、抗原結合または特異性に関与する主要なCDRであるか、または抗原認識にとって、および/またはペプチド-MHC複合体のプロセシングされたペプチド部分との相互作用にとって、所与のTCR可変領域の3つのCDRの中で最も重要である。ある状況下では、α鎖のCDR1は、特定の抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することができる。ある状況下では、β鎖のCDR1は、該ペプチドのC末端部分と相互作用することができる。ある状況下では、CDR2は、MHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用またはMHC部分の認識に最も強く寄与するか、またはそれに関与する主要なCDRである。いくつかの態様では、β鎖の可変領域は、さらなる超可変領域（CDR4またはHVR4）を含むことができ、これは一般に、スーパー抗原の結合に関与し、抗原認識には関与しない（Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426）。
いくつかの態様では、TCRはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または短い細胞質テイルを含むことができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照されたい）。いくつかの局面では、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端の短い細胞質テイルを保有することができる。いくつかの態様では、TCRは、シグナル伝達を媒介するのに関与するCD3複合体の不変タンパク質と会合する。
いくつかの態様では、TCR鎖は1つまたは複数の定常ドメインを含む。例えば、所与のTCR鎖（例えば、α鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン（例えば、VαまたはVβ；典型的にはKabatナンバリング（Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.）に基づいてアミノ酸1-116）、および細胞膜に隣接する定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインつまりCα、典型的にはKabatナンバリングに基づいて117-259位、またはβ鎖定常ドメインつまりCβ、典型的にはKabatナンバリングに基づいて117-295位）を含むことができる。例えば、場合により、2本の鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインと、2つの膜遠位可変ドメインを含み、その可変ドメインにはそれぞれCDRが含まれる。TCRの定常ドメインは短い接続配列を含んでもよく、その場合には、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってTCRの2本の鎖を連結する。いくつかの態様では、TCRは、α鎖とβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基をもつことができ、その結果、TCRは定常ドメインに2つのジスルフィド結合を含むようになる。
いくつかの態様では、TCR鎖は膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは正に帯電している。いくつかの場合には、TCR鎖は細胞質テイルを含む。場合によっては、この構造は、TCRを、CD3およびそのサブユニットなどの他の分子と会合させることができる。例えば、膜貫通領域と共に定常ドメインを含むTCRは、該タンパク質を細胞膜に固定して、CD3シグナル伝達装置または複合体の不変サブユニットと会合し得る。CD3シグナル伝達サブユニット（例えば、CD3γ、CD3δ、CD3ε、およびCD3ζ鎖）の細胞内テイルは、TCR複合体のシグナル伝達能力に関与する1つまたは複数の免疫受容活性化チロシンモチーフつまりITAMを含む。
いくつかの態様では、TCRは、2本の鎖αとβ（または任意でγとδ）のヘテロ二量体であるか、または一本鎖TCR構築物であり得る。いくつかの態様では、TCRは、1つまたは複数のジスルフィド結合などによって連結された2本の別個の鎖（α鎖とβ鎖、またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。
いくつかの態様では、TCRは、Vα、Vβ鎖の配列などの、公知のTCR配列から作製することができ、それらの実質的に完全長のコード配列は容易に入手可能である。細胞源から、V鎖配列を含めて、完全長TCR配列を取得する方法はよく知られている。いくつかの態様では、TCRをコードする核酸は、例えば、所与の細胞内のまたは細胞から単離された、TCRをコードする核酸のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、または公開されているTCR DNA配列の合成によって、様々なソースから取得可能である。
いくつかの態様では、TCRは、生物学的供給源から、例えば細胞から、例えばT細胞（例えば細胞傷害性T細胞）、T細胞ハイブリドーマ、または他の公表されている供給源から得られる。いくつかの態様では、T細胞はインビボ単離された細胞から得ることができる。いくつかの態様では、TCRは胸腺で選択されたTCRである。いくつかの態様では、TCRはネオエピトープ制限TCRである。いくつかの態様では、T細胞は、培養したT細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分もしくはその抗原結合フラグメントは、TCRの配列の知識から合成的に作製され得る。
いくつかの態様では、TCRは、標的ポリペプチド抗原またはその標的T細胞エピトープに対する候補TCRのライブラリーのスクリーニングから同定または選択されたTCRから作製される。TCRライブラリーは、対象から単離されたT細胞（PBMC、脾臓または他のリンパ器官に存在する細胞を含む）からのVαおよびVβのレパートリーの増幅によって作製され得る。場合によっては、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）からT細胞を増幅することができる。いくつかの態様では、TCRライブラリーは、CD4+またはCD8+細胞から作製され得る。いくつかの態様では、TCRは、正常または健常な対象のT細胞源、すなわち正常TCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様では、TCRは、罹患した対象のT細胞源、すなわち罹患TCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様では、縮重プライマーは、ヒトから得られたT細胞などのサンプルにおけるRT-PCRなどによって、VαおよびVβの遺伝子レパートリーを増幅するために使用される。いくつかの態様では、scTvライブラリーは、増幅産物がリンカーによって分離されるようにクローン化またはアセンブルされたナイーブVαおよびVβライブラリーから組み立てることができる。対象と細胞の供給源に応じて、該ライブラリーはHLAアレル特異的であり得る。あるいは、いくつかの態様では、TCRライブラリーは、親または足場TCR分子の突然変異誘発または多様化によって作製することができる。いくつかの局面では、TCRは、例えばα鎖またはβ鎖の、突然変異誘発などによる定方向進化に供される。いくつかの局面では、TCRのCDR内の特定の残基が変更される。いくつかの態様では、選択されたTCRは、親和性成熟によって改変され得る。いくつかの態様では、ペプチドに対するCTL活性を評価するためのスクリーニングなどによって、抗原特異的T細胞を選択することができる。いくつかの局面では、TCR、例えば抗原特異的T細胞上に存在するTCRは、例えば、抗原に対する特定の親和性または結合力などの結合活性によって、選択することができる。
いくつかの態様では、遺伝子操作された抗原受容体には、組換えT細胞受容体（TCR）および/または天然に存在するT細胞からクローン化されたTCRが含まれる。いくつかの態様では、標的抗原（例えば、がん抗原）に対する高親和性T細胞クローンが同定され、患者から単離されて、細胞に導入される。いくつかの態様では、標的抗原に対するTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、つまりHLA）により操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されてきた。例えば、腫瘍抗原については、Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180およびCohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808を参照されたい。いくつかの態様では、標的抗原に対するTCRを単離するために、ファージディスプレイが使用される（例えば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395およびLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354を参照されたい）。
いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分は、改変または操作されたものである。いくつかの態様では、改変された特性を有するTCR、例えば、特定のMHC-ペプチド複合体に対する親和性がより高いTCRを作製するために、定方向進化法が使用される。いくつかの態様では、定方向進化は、以下を含むがこれらに限定されないディスプレイ法によって達成される：酵母ディスプレイ（Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92）、ファージディスプレイ（Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54）、またはT細胞ディスプレイ（Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84）。いくつかの態様では、ディスプレイアプローチには、既知の親または基準TCRを操作または改変することが含まれる。例えば、いくつかの場合には、野生型TCRが、CDRの1個または複数の残基を変異させた変異型TCRを作製するためのテンプレートとして使用され、所望の標的抗原に対するより高い親和性などの、望ましい改変特性を備えた変異体が選択される。
いくつかの態様では、関心対象のTCRの産生または作製に使用するための標的ポリペプチドのペプチドは知られているか、または当業者により容易に同定され得る。いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分の作製に使用するのに適したペプチドは、関心対象の標的ポリペプチド、例えば以下に記載する標的ポリペプチドなど、におけるHLA制限モチーフの存在に基づいて決定され得る。いくつかの態様では、ペプチドは、利用可能なコンピュータ予測モデルを用いて同定される。いくつかの態様では、MHCクラスI結合部位を予測するための、そのようなモデルには、ProPred1（Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237）およびSYFPEITHI（Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、MHC拘束性エピトープはHLA-A0201である；これは、全白人の約39〜46％に発現されるため、TCRまたは他のMHC-ペプチド結合分子の調製に使用するためのMHC抗原の適切な選択を表している。
コンピュータ予測モデルを使用したHLA-A0201結合モチーフおよびプロテアソームと免疫プロテアソームの切断部位は、公知である。MHCクラスI結合部位を予測するための、そのようなモデルには、ProPred1（Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001に詳述される）およびSYFPEITHI（Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分は、1つ以上の特性、例えば結合特性が変更されている、組換えにより作製された天然タンパク質またはその変異形態であり得る。いくつかの態様では、TCRは、様々な動物種の1つ、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物に由来することができる。TCRは細胞結合形態であっても可溶性形態であってもよい。いくつかの態様では、提供される方法の目的のために、TCRは、細胞の表面上に発現される細胞結合形態である。
いくつかの態様では、TCRは完全長TCRである。いくつかの態様では、TCRは抗原結合部分である。いくつかの態様では、TCRは二量体TCR（dTCR）である。いくつかの態様では、TCRは一本鎖TCR（sc-TCR）である。いくつかの態様では、dTCRまたはscTCRは、WO 03/020763、WO 04/033685、WO2011/044186に記載される構造を有する。
いくつかの態様では、TCRは膜貫通配列に対応する配列を含む。いくつかの態様では、TCRは細胞質配列に対応する配列を含む。いくつかの態様では、TCRはCD3とのTCR複合体を形成することができる。いくつかの態様では、dTCRまたはscTCRを含めて、TCRはどれも、T細胞の表面に活性TCRを生成するシグナル伝達ドメインに連結され得る。いくつかの態様では、TCRは細胞の表面に発現される。
いくつかの態様では、dTCRは、TCRα鎖可変領域配列に対応する配列がTCRα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第1のポリペプチドと、TCRβ鎖可変領域配列に対応する配列がTCRβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第2のポリペプチドとを含み、第1および第2のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの態様では、その結合は、天然の二量体αβTCRに存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。いくつかの態様では、その鎖間ジスルフィド結合は、天然のTCRには存在しない。例えば、いくつかの態様では、1個または複数のシステインをdTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込むことができる。場合によっては、天然および非天然の両方のジスルフィド結合が望ましいかもしれない。いくつかの態様では、TCRは、膜に固定するための膜貫通配列を含む。
いくつかの態様では、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に結合した第1の二量体化モチーフを含むTCRα鎖と、可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に結合した第1の二量体化モチーフを含むTCRβ鎖とを含み、この場合には、第1および第2の二量体化モチーフが容易に相互作用して、第1の二量体化モチーフのアミノ酸と第2の二量体化モチーフのアミノ酸の間に共有結合を形成することによりTCRα鎖とTCRβ鎖を連結する。
いくつかの態様では、TCRはscTCRである。一般的に、scTCRは公知の方法を用いて作製することができ、例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wuelfing, C. and Plueckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); 国際公開PCT番号WO 96/13593、WO 96/18105、WO99/60120、WO99/18129、WO 03/020763、WO2011/044186; およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照されたい。いくつかの態様では、scTCRは、TCR鎖同士の会合を容易にするために導入された非天然ジスルフィド鎖間結合を含む（例えば、国際公開PCT番号WO 03/020763を参照されたい）。いくつかの態様では、scTCRは、非ジスルフィド結合型のトランケートされたTCRであり、そのC末端に融合した異種ロイシンジッパーが鎖会合を促進する（例えば、国際公開PCT番号WO99/60120を参照されたい）。いくつかの態様では、scTCRは、TCRβ可変ドメインにペプチドリンカーを介して共有結合されたTCRα可変ドメインを含む（例えば、国際公開PCT番号WO99/18129を参照されたい）。
いくつかの態様では、scTCRは、TCRα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第1のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成された第2のセグメント、および第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。
いくつかの態様では、scTCRは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成された第1のセグメントと、β鎖細胞外定常および膜貫通配列のN末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成された第2のセグメントと、任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列、を含む。
いくつかの態様では、scTCRは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列で構成された第1のセグメントと、α鎖細胞外定常および膜貫通配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成された第2のセグメントと、任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列、を含む。
いくつかの態様では、第1および第2のTCRセグメントを連結するscTCRのリンカーは、TCR結合特異性を保持しながら、単一のポリペプチド鎖を形成することができる任意のリンカーであり得る。いくつかの態様では、リンカー配列は、例えば、式-P-AA-P-で表すことができ、ここで、Pはプロリンであり、AAは、アミノ酸がグリシンとセリンであるアミノ酸配列を表す。いくつかの態様では、第1および第2のセグメントは、その可変領域配列がそのような結合のために正しく配向されるように対合される。それゆえ、いくつかの場合には、リンカーは、第1のセグメントのC末端と第2のセグメントのN末端の間、またはその逆の間の距離にまたがるのに十分な長さがあるが、標的リガンドへのscTCRの結合をブロックまたは低減させるほど長すぎない。いくつかの態様では、リンカーは、10〜45アミノ酸または約10〜45アミノ酸、例えば10〜30アミノ酸または26〜41アミノ酸残基、例えば29、30、31または32アミノ酸を含み得る。いくつかの態様では、リンカーは、式-PGGG-(SGGGG)5-P-を有し、ここで、Pはプロリン、Gはグリシン、Sはセリンである（SEQ ID NO:22）。いくつかの態様では、リンカーは、配列
を有する。
いくつかの態様では、scTCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する、共有ジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、天然TCR中の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、いくつかの態様では、1個または複数のシステインを、scTCRポリペプチドの第1および第2のセグメントの定常領域細胞外配列に組み込むことができる。場合によっては、天然および非天然の両方のジスルフィド結合が望ましいかもしれない。
導入された鎖間ジスルフィド結合を含むdTCRまたはscTCRのいくつかの態様では、天然のジスルフィド結合は存在しない。いくつかの態様では、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成している天然システインの1個または複数は、セリンまたはアラニンなどの別の残基に置き換えられる。いくつかの態様では、導入されたジスルフィド結合は、第1および第2のセグメントの非システイン残基をシステインに変異させることによって形成することができる。TCRの非天然ジスルフィド結合の例は、公開された国際PCT番号WO2006/000830に記載されている。
いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合フラグメントは、標的抗原に対する平衡結合定数が10-5〜10-12Mまたは約10-5〜10-12M（およびその間の全ての個々の値と範囲）の親和性を示す。いくつかの態様では、標的抗原はMHC-ペプチド複合体またはリガンドである。
いくつかの態様では、α鎖およびβ鎖などのTCRをコードする核酸（複数可）は、PCR、クローニングまたは他の適切な手段で増幅して、適切な発現ベクター（複数可）にクローン化することができる。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターとすることができ、適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用される。適切なベクターには、増殖と拡大増殖のために、または発現のために、またはその両方のためにデザインされたもの、例えばプラスミドおよびウイルスなど、が含まれる。
いくつかの態様では、ベクターは、pUCシリーズ（Fermentas Life Sciences社）、pBluescriptシリーズ（Stratagene社，LaJolla，カリフォルニア州）、pETシリーズ（Novagen社，Madison，ウィスコンシン州）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech社，Uppsala，スウェーデン）、またはpEXシリーズ（Clontech社，Palo Alto，カリフォルニア州）であり得る。場合によっては、λG10、λGT11、λZapII（Stratagene社）、λEMBL4、λNM1149などのバクテリオファージベクターも使用できる。いくつかの態様では、植物発現ベクターが使用され、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121およびpBIN19（Clontech社）が含まれる。いくつかの態様では、動物発現ベクターには、pEUK-Cl、pMAMおよびpMAMneo（Clontech社）が含まれる。いくつかの態様では、レトロウイルスベクターなどの、ウイルスベクターが使用される。
いくつかの態様では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えDNA技術を用いて作製することができる。いくつかの態様では、ベクターは、ベクターを導入しようとする宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物または動物）に固有の調節配列、例えば転写および翻訳の開始および終止コドンを含むことができ、必要に応じて、該ベクターがDNAベースかRNAベースかを考慮する。いくつかの態様では、ベクターは、TCRまたは抗原結合部分（または他のMHC-ペプチド結合分子）をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された非天然プロモーターを含むことができる。いくつかの態様では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復に見られるプロモーターであり得る。その他の公知のプロモーターも考えられる。
いくつかの態様では、T細胞クローンが得られた後、TCRαおよびβ鎖を単離して、遺伝子発現ベクターにクローニングする。いくつかの態様では、TCRαおよびβ遺伝子は、両方の鎖が共発現するように、ピコルナウイルスの2Aリボソームスキップペプチドを介して連結される。いくつかの態様では、TCRの遺伝子導入は、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンを介して達成される（例えば、Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; およびHackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683を参照されたい）。
いくつかの態様では、TCRをコードするベクターを作製するために、関心対象のTCRを発現するT細胞クローンから単離された全cDNAからα鎖およびβ鎖をPCR増幅して、発現ベクターにクローニングする。いくつかの態様では、α鎖とβ鎖を同じベクターにクローニングする。いくつかの態様では、α鎖とβ鎖を異なるベクターにクローニングする。いくつかの態様では、作製されたα鎖とβ鎖は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに組み込まれる。
3. キメラ自己抗体受容体（CAAR）
いくつかの態様では、組換え受容体はキメラ自己抗体受容体（CAAR）である。いくつかの態様では、CAARは自己抗体に特異的である。いくつかの態様では、CAARを発現するように操作されたT細胞などの、CAARを発現する細胞は、正常な抗体発現細胞ではなく、自己抗体発現細胞に特異的に結合して、それを死滅させるために使用することができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、自己免疫疾患などの、自己抗原の発現に関連する自己免疫疾患を治療するために使用できる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、最終的に自己抗体を産生して細胞表面に自己抗体を提示するB細胞を標的とし、これらのB細胞を治療的介入のための疾患特異的標的としてマークすることができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、抗原特異的キメラ自己抗体受容体を使用して疾患原因のB細胞を標的とすることにより、自己免疫疾患における病原性B細胞を効率的に標的とし、かつ殺傷するために使用できる。いくつかの態様では、組換え受容体は、米国特許出願公開第US 2017/0051035号に記載されるような、CAARである。
いくつかの態様では、組換え受容体はキメラ自己抗体受容体（CAAR）である。いくつかの態様では、CAARは自己抗体に特異的である。いくつかの態様では、CAARを発現するように操作されたT細胞などの、CAARを発現する細胞は、正常な抗体発現細胞ではなく、自己抗体発現細胞に特異的に結合して、それを死滅させるために使用することができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、自己免疫疾患などの、自己抗原の発現に関連する自己免疫疾患を治療するために使用できる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、最終的に自己抗体を産生して細胞表面に自己抗体を提示するB細胞を標的とし、これらのB細胞を治療的介入のための疾患特異的標的としてマークすることができる。いくつかの態様では、CAAR発現細胞は、抗原特異的キメラ自己抗体受容体を使用して疾患原因のB細胞を標的とすることにより、自己免疫疾患における病原性B細胞を効率的に標的とし、かつ殺傷するために使用できる。いくつかの態様では、組換え受容体は、米国特許出願公開第US 2017/0051035号に記載されるような、CAARである。
いくつかの態様では、CAARは、自己抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達領域は、二次または共刺激シグナル伝達領域（二次細胞内シグナル伝達領域）を含む。
いくつかの態様では、自己抗体結合ドメインは、自己抗原またはその断片を含む。自己抗原の選択は、標的とされる自己抗体のタイプに依存し得る。例えば、自己抗原は、それが特定の疾患状態（例えば、自己抗体媒介自己免疫疾患などの自己免疫疾患）と関連する標的細胞（例えば、B細胞）上の自己抗体を認識するので、選択され得る。いくつかの態様では、自己免疫疾患には尋常性天疱瘡（pemphigus vulgaris：PV）が含まれる。例示的な自己抗原には、デスモグレイン1（Dsg1）およびDsg3が含まれる。
4. マルチターゲティング
いくつかの態様において、細胞および方法は、それぞれが同じまたは異なる抗原を認識し、典型的にはそれぞれが異なる細胞内シグナル伝達構成成分を含む、2種またはそれ以上の遺伝子操作された受容体を細胞上に発現させるなどのマルチターゲティング戦略を含む。そのようなマルチターゲティング戦略は、例えば、国際特許出願公開番号WO2014055668 A1（例えば、オフターゲット細胞、例えば正常細胞上には個々に存在するが、処置されるべき疾患または状態の細胞上にのみ共に存在する2種類の異なる抗原を標的とする、活性化CARと共刺激CARとの組み合わせを記載している）、およびFedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)（活性化CARおよび阻害性CARを発現する細胞、例えば、活性化CARが、正常細胞または非罹患細胞と処置されるべき疾患または状態の細胞との両方に発現されるある抗原に結合し、阻害性CARが、正常細胞または処置が望ましくない細胞にのみ発現される別の抗原に結合する細胞などを記載している）に記載されている。
いくつかの態様において、細胞および方法は、それぞれが同じまたは異なる抗原を認識し、典型的にはそれぞれが異なる細胞内シグナル伝達構成成分を含む、2種またはそれ以上の遺伝子操作された受容体を細胞上に発現させるなどのマルチターゲティング戦略を含む。そのようなマルチターゲティング戦略は、例えば、国際特許出願公開番号WO2014055668 A1（例えば、オフターゲット細胞、例えば正常細胞上には個々に存在するが、処置されるべき疾患または状態の細胞上にのみ共に存在する2種類の異なる抗原を標的とする、活性化CARと共刺激CARとの組み合わせを記載している）、およびFedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)（活性化CARおよび阻害性CARを発現する細胞、例えば、活性化CARが、正常細胞または非罹患細胞と処置されるべき疾患または状態の細胞との両方に発現されるある抗原に結合し、阻害性CARが、正常細胞または処置が望ましくない細胞にのみ発現される別の抗原に結合する細胞などを記載している）に記載されている。
例えば、いくつかの態様において、細胞は、一般的に、第1受容体によって認識される抗原、例えば第1抗原に特異的に結合した際に、細胞に対して活性化または刺激シグナルを誘導することができる第1の遺伝子操作された抗原受容体（例えば、CARまたはTCR）を発現する受容体を含む。いくつかの態様において、細胞は、一般的に、第2受容体によって認識される第2抗原に特異的に結合した際に、免疫細胞に対して共刺激シグナルを誘導することができる第2の遺伝子操作された抗原受容体（例えば、CARまたはTCR）、例えばキメラ共刺激受容体をさらに含む。いくつかの態様において、第1抗原と第2抗原は同じである。いくつかの態様において、第1抗原と第2抗原は異なる。
いくつかの態様において、第1および／または第2の遺伝子操作された抗原受容体（例えば、CARまたはTCR）は、細胞に対して活性化または刺激シグナルを誘導することができる。いくつかの態様において、受容体は、ITAMまたはITAM様モチーフを含有する細胞内シグナル伝達構成成分を含む。いくつかの態様において、第1受容体によって誘導される活性化は、免疫応答の開始をもたらす、細胞におけるシグナル伝達またはタンパク質発現の変化、例えばITAMリン酸化および／もしくはITAM媒介性シグナル伝達カスケードの開始など、免疫シナプスの形成および／もしくは結合した受容体の近傍での分子（例えば、CD4もしくはCD8等）のクラスター化、1種もしくは複数種の転写因子、例えばNF-κBおよび／もしくはAP-1などの活性化、ならびに／またはサイトカインなどの因子の遺伝子発現の誘導、増殖、および／もしくは生存を伴う。
いくつかの態様において、第1および／または第2受容体は、CD28、CD137 (4-1 BB) 、OX40、および／またはICOSなどの共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、第1および2受容体は、異なる共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、第1受容体はCD28共刺激シグナル伝達領域を含有し、第2受容体は4-1BB共刺激シグナル伝達領域を含有し、またはその逆である。
いくつかの態様において、第1および／または第2受容体は、ITAMまたはITAM様モチーフを含有する細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインの両方を含む。
いくつかの態様において、第1受容体はITAMまたはITAM様モチーフを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有し、第2受容体は共刺激受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。同じ細胞内での活性化または刺激シグナルと共刺激シグナルとの組み合わせは、免疫応答、例えば強力でかつ持続的な免疫応答など、例えば、遺伝子発現の増加、サイトカインおよび他の因子の分泌、ならびに細胞死滅などのT細胞媒介性エフェクター機能などをもたらすものである。
いくつかの態様において、第1受容体のみの連結によっても第2受容体のみの連結によっても、強力な免疫応答は誘導されない。いくつかの局面において、一方の受容体のみが連結された場合には、細胞は寛容化する、もしくは抗原に対して応答しなくなる、または阻害される、および／または増殖するように、もしくは因子を分泌するように、もしくはエフェクター機能を実行するように誘導されない。しかしながら、いくつかのそのような態様において、第1抗原および第2抗原を発現する細胞に遭遇した際など、複数の受容体が連結された場合には、例えば、1種もしくは複数種のサイトカインの分泌、増殖、持続、および／または標的細胞の細胞傷害性死滅などの免疫エフェクター機能の実行によって示されるような、完全な免疫活性化または刺激などの望ましい応答が達成される。
いくつかの態様において、2種類の受容体はそれぞれ、受容体の一方がその抗原に結合することで細胞が活性化されるかまたは応答が誘導され、第2の阻害性受容体がその抗原に結合することで、その応答を抑制するかまたは減衰させるシグナルが誘導されるように、細胞に対して活性化シグナルおよび阻害シグナルを誘導する。例として、活性化CARと阻害性CARまたはiCARとの組み合わせがある。このような戦略を使用することができ、例えばこの場合、活性化CARは、疾患または状態において発現されるが、正常細胞上でも発現される抗原と結合し、阻害性受容体は、正常細胞上で発現されるが、疾患または状態の細胞上では発現されない別の抗原に結合する。
いくつかの態様では、組換え受容体を発現する細胞はさらに、疾患または症状に関連する抗原および/またはそれに固有の抗原以外の抗原を認識するCARなどの、抑制性CAR（iCAR；Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013)を参照）を含む；それによって、疾患標的化CARを介して送達される活性化シグナルは、抑制性CARのそのリガンドへの結合によって減少または抑制されて、例えば、オフターゲット効果を低減する。
いくつかの態様では、前記2つの受容体は、それぞれ、細胞への活性化シグナルと抑制シグナルを誘導し、その結果、該受容体の一方がその抗原に連結すると、細胞が活性化するか、または応答が誘導されるが、他方の抑制性受容体がその抗原に連結すると、その応答を抑制または弱めるシグナルが誘導される。例は、活性化CARと抑制性CAR（iCAR）の組み合わせである。そのような戦略は、例えば、オフターゲット効果の可能性を低減するために、次のような状況下で使用され得る：すなわち、活性化CARが、疾患または症状で発現されるが正常細胞でも発現される抗原に結合し、かつ抑制性受容体が、正常細胞には発現するが疾患または症状の細胞には発現しない別の抗原に結合する状況である。
いくつかの局面では、キメラ受容体は、抑制性CAR（例えば、iCAR）であるか、またはそれを含み、かつ細胞におけるITAMおよび/または共刺激により促進される応答などの、免疫応答を弱めるまたは抑制する細胞内成分を含む。そのような細胞内シグナル伝達成分の例は、免疫チェックポイント分子に見られるもの、例えば、PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受容体、A2ARを含むEP2/4アデノシン受容体などである。いくつかの局面では、遺伝子操作された細胞は、そのような抑制性分子の、または該分子に由来するシグナル伝達ドメインを含む抑制性CARを含み、その結果、それは、例えば活性化および/または共刺激CARによって誘導される、細胞の応答を弱める働きをするようになる。
いくつかの態様において、特定の疾患または状態と関連した抗原が、一過性に（例えば、遺伝子操作と関連した刺激時に）または恒久的に非罹患細胞上で発現され、かつ／または操作された細胞自体において発現される場合に、マルチターゲティング戦略が用いられる。そのような場合、2つの別々の、かつ個々に特異的な抗原受容体の連結を必要とすることによって、特異性、選択性、および／または有効性が改善され得る。
いくつかの態様において、複数種の抗原、例えば第1抗原および第2抗原は、標的とされる細胞、組織、または疾患もしくは状態において、例えばがん細胞などにおいて発現される。いくつかの局面において、細胞、組織、疾患、または状態は多発性骨髄腫または多発性骨髄腫細胞である。いくつかの態様において、複数種の抗原のうちの1種または複数種は一般に、細胞療法で標的とすることが望ましくない細胞、例えば正常なもしくは非罹患の細胞もしくは組織、および／または操作された細胞自体においても発現される。そのような態様では、細胞の応答を達成するために複数種の受容体の連結を必要とすることによって、特異性および／または有効性が達成される。
B. 核酸、ベクターおよび遺伝子操作方法
いくつかの態様では、T細胞などの細胞は、組換え受容体を発現するように遺伝子操作される。いくつかの態様では、遺伝子操作は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを導入することによって行われる。組換え受容体をコードするポリヌクレオチドならびにそのような核酸および/またはポリヌクレオチドを含むベクターまたは構築物も提供される。
いくつかの態様では、T細胞などの細胞は、組換え受容体を発現するように遺伝子操作される。いくつかの態様では、遺伝子操作は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを導入することによって行われる。組換え受容体をコードするポリヌクレオチドならびにそのような核酸および/またはポリヌクレオチドを含むベクターまたは構築物も提供される。
いくつかの場合には、組換え受容体をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含む。ある局面では、シグナル配列は、天然のポリペプチドに由来するシグナルペプチドをコードし得る。他の局面では、シグナル配列は、異種または非天然シグナルペプチドをコードしてもよく、例えば、SEQ ID NO:24に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、SEQ ID NO:25に示されるGMCSFRアルファ鎖の例示的なシグナルペプチドをコードし得る。場合によっては、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含む。シグナルペプチドの非限定的な例示的な例として、例えば、SEQ ID NO:24に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、SEQ ID NO:25に示されるGMCSFRアルファ鎖シグナルペプチド、またはSEQ ID NO:26に示されるCD8アルファシグナルペプチドが挙げられる。
いくつかの態様では、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。いくつかの例では、該ポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように機能的に連結された2つ、3つ、またはそれ以上のプロモーターを含む。
核酸分子が2つ以上の異なるポリペプチド鎖、例えば組換え受容体とマーカー、をコードする特定の場合において、ポリペプチド鎖のそれぞれは別個の核酸分子によってコードされ得る。例えば、2つの別個の核酸を提供して、細胞内での発現のためにそれぞれを細胞に個別に移入または導入することができる。いくつかの態様では、組換え受容体をコードする核酸とマーカーをコードする核酸は、同じプロモーターに機能的に連結され、任意で、内部リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド（任意で、T2A、P2A、E2A、またはF2Aである）をコードする核酸によって分離される。いくつかの態様では、マーカーをコードする核酸と組換え受容体をコードする核酸は、2つの異なるプロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様では、マーカーをコードする核酸と組換え受容体をコードする核酸は、細胞のゲノム内の異なる位置に存在するか、または挿入される。いくつかの態様では、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換によって、培養細胞を含む組成物に導入される。
ポリヌクレオチドが第1および第2の核酸配列を含むような、いくつかの態様では、異なるポリペプチド鎖のそれぞれをコードするコード配列は、同じでも異なっていてもよいプロモーターに機能的に連結され得る。いくつかの態様では、核酸分子は、2つ以上の異なるポリペプチド鎖の発現を駆動する1つのプロモーターを含むことができる。いくつかの態様では、そのような核酸分子はマルチシストロニック（バイシストロニックまたはトリシストロニック；例えば、米国特許第6,060,273号を参照）であり得る。いくつかの態様では、転写ユニットは、IRES（内部リボソーム進入部位）を含むバイシストロニックなユニットとして作製することができ、IRESは、単一のプロモーターからのメッセージによる遺伝子産物（例えば、マーカーをコードする、および組換え受容体をコードする）の共発現を可能にする。あるいは、場合によっては、単一のオープンリーディングフレーム（ORF）に、自己切断ペプチド（例えば、2A配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フリン）をコードする配列によって互いに分離された2個または3個の遺伝子（例えば、マーカーをコードする、および組換え受容体をコードする）を含むRNAの発現を、単一のプロモーターが指令してもよい。したがって、該ORFは、翻訳中（2Aの場合）または翻訳後に、個々のタンパク質にプロセシングされる、単一のポリペプチドをコードする。場合によっては、T2Aなどのペプチドは、2AエレメントのC末端でのペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせることができ（リボソームスキッピング）、これは2A配列の該末端と下流の次のペプチドの間の分離につながる（例えば、de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびde Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照されたい）。様々な2Aエレメントが知られている。本明細書に開示される方法およびシステムで使用できる2A配列の例は、限定なしに、米国特許公開第20070116690号に記載されるような、口蹄疫ウイルス（F2A、例えばSEQ ID NO: 21）、ウマ鼻炎ウイルスA（E2A、例えばSEQ ID NO: 20）、Thosea asignaウイルス（T2A、例えばSEQ ID NO: 6または17）、および豚テッショウウイルス-1（P2A、例えばSEQ ID NO: 18または19）由来の2A配列。
本明細書に記載の組換え受容体はいずれも、組換え受容体をコードする1つまたは複数の核酸配列を任意の組み合わせまたは配置で含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、1、2、3またはそれ以上のポリヌクレオチドが、1、2、3またはそれ以上の異なるポリペプチド、例えば組換え受容体、をコードすることができる。いくつかの態様では、1つのベクターまたは構築物は、マーカーをコードする核酸配列を含み、別のベクターまたは構築物は、組換え受容体、例えばCAR、をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、2つの異なるプロモーターに機能的に連結される。いくつかの態様では、組換え受容体をコードする核酸は、マーカーをコードする核酸の下流に存在する。
いくつかの態様では、ベクター骨格は、1つまたは複数のマーカーをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のマーカーは、形質導入マーカー、サロゲートマーカーおよび/または選択マーカーである。
いくつかの態様では、マーカーは形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーである。形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーは、ポリヌクレオチド、例えば組換え受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を検出するために使用され得る。いくつかの態様では、形質導入マーカーは、細胞の改変を示すかまたは確認することができる。いくつかの態様では、サロゲートマーカーは、細胞表面上に組換え受容体、例えばCAR、と共発現するようにされたタンパク質である。特定の態様では、そのようなサロゲートマーカーは、活性をほとんどまたはまったく持たないように修飾された表面タンパク質である。ある特定の態様では、サロゲートマーカーは、組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチド上にコードされる。いくつかの態様では、組換え受容体をコードする核酸配列は、マーカーをコードする核酸配列に機能的に連結され、任意で、内部リボソーム進入部位（IRES）によって、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド（例えば、T2A、P2A、E2A、F2Aなどの2A配列）によって分離される。外来性マーカー遺伝子を、いくつかの場合には遺伝子操作された細胞に関連して利用して、細胞の検出または選択を可能にしたり、場合によっては細胞自殺を促進したりすることもできる。
例示的なサロゲートマーカーは、細胞表面ポリペプチドのトランケート形態を含むことができ、例えば、該トランケート形態は、非機能的であり、シグナルもしくは細胞表面ポリペプチドの完全長形態によって通常は伝達されるシグナルを伝達しないか、伝達できず、かつ/または内部移行しないか、内部移行できない。例示的なトランケート型細胞表面ポリペプチドには、成長因子または他の受容体のトランケート形態、例えば、トランケート型ヒト上皮成長因子受容体2（tHER2）、トランケート型上皮成長因子受容体（EGFRt、SEQ ID NO:7または16に示される例示的なEGFRt配列）、または前立腺特異的膜抗原（PSMA）もしくはその修飾形態が含まれる。EGFRtは、抗体セツキシマブ（Erbitux（登録商標））または他の治療用抗EGFR抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含むことができ、これらの抗体または分子は、EGFRt構築物および組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）、で操作された細胞を同定または選択するために、かつ/または該受容体を発現する細胞を排除または分離するために使用され得る。米国特許第8,802,374号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434)を参照されたい。いくつかの局面では、マーカー、例えば、サロゲートマーカーには、全部または一部（例えば、トランケート形態）のCD34、NGFR、CD19もしくはトランケート型CD19、例えばトランケート型非ヒトCD19、または上皮成長因子受容体（例えば、tEGFR）が含まれる。いくつかの態様では、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えばT2Aなどの切断可能なリンカー配列、をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカー、および任意でリンカー配列は、PCT公開番号WO2014031687に開示される任意のものであり得る。例えば、マーカーは、任意で、T2A切断可能リンカー配列などのリンカー配列に連結された、トランケート型EGFR（tEGFR）であり得る。トランケート型EGFR（tEGFR）の例示的なポリペプチドは、SEQ ID NO: 7または16に示されるアミノ酸配列、あるいはSEQ ID NO: 7または16に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、マーカーは、以下のような蛍光タンパク質であるか、またはそれを含む：緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、例えばスーパーフォールドGFP、赤色蛍光タンパク質（RFP）、例えばtdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRedまたはDsRed2、シアン色蛍光タンパク質（CFP）、青緑色蛍光タンパク質（BFP）、高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）、および黄色蛍光タンパク質（YFP）、ならびにそれらのバリアント、例えば、種バリアント、単量体バリアント、および蛍光タンパク質のコドン最適化および/または高感度バリアント。いくつかの態様では、マーカーは、以下のような酵素であるか、またはそれを含む：ルシフェラーゼ、大腸菌由来のlacZ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）。例示的な発光レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（luc）、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-グルクロニダーゼ（GUS）またはそれらのバリアントが含まれる。
いくつかの態様では、マーカーは選択マーカーである。いくつかの態様では、選択マーカーは、外因性の薬剤または薬物に対する耐性を付与するポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様では、選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様では、選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子、またはその改変形態であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、組換え核酸は、例えばシミアンウイルス40 (SV40)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス (AAV) 由来のベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を用いて、細胞に導入される。いくつかの態様において、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ-レトロウイルスベクターなどを用いて、T細胞に導入される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい）。
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス (MoMLV)、骨髄増殖性肉腫ウイルス (MPSV)、マウス胚性幹細胞ウイルス (MESV)、マウス幹細胞ウイルス (MSCV)、または脾フォーカス形成ウイルス (SFFV)、由来のレトロウイルスベクターは、長い末端反復配列 (LTR) を有する。大部分のレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスには、任意の鳥類細胞または哺乳動物細胞供給源に由来するものが含まれる。レトロウイルスは典型的に広宿主性であり、広宿主性とは、それらが、ヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染する能力を有することを意味する。1つの態様では、発現されるべき遺伝子でレトロウイルスのgag、pol、および／またはenv配列を置き換える。実例となるレトロウイルス系がいくつか記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号；第6,207,453号；第5,219,740号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852；Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。
レンチウイルス形質導入の方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701；Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644；Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506:97-114；およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。
いくつかの態様において、組換え核酸は、エレクトロポレーションによってT細胞に導入される（例えば、Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298、およびVan Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照されたい）。いくつかの態様において、組換え核酸は、転位によってT細胞に導入される（例えば、Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437；Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74；およびHuang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照されたい）。免疫細胞に遺伝物質を導入し発現させる他の方法には、（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されているような）リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション；タングステン粒子促進性微粒子銃（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）、およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）が含まれる。
組換え産物をコードする核酸を導入するための他のアプローチおよびベクターは、例えば国際特許出願公開番号WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
いくつかの態様では、拡大増殖中または拡大増殖後のいずれかに、細胞、例えばT細胞に、T細胞受容体 (TCR) またはキメラ抗原受容体 (CAR) をトランスフェクトしてもよい。所望の受容体の遺伝子を導入するためのこのトランスフェクションは、例えば任意の適切なレトロウイルスベクターを用いて行うことができる。次いで、遺伝子改変された細胞集団を初期刺激（例えば、抗CD3/抗CD28刺激）から解放し、その後、例えば新規に導入された受容体を通して第2の型の刺激で刺激することができる。この第2の型の刺激は、ペプチド／MHC分子、遺伝子導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、CARの天然リガンド）、または（例えば、受容体内の定常領域を認識することにより）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合する任意のリガンド（抗体など）の形態の抗原刺激を含み得る。例えば、Cheadle et al, 「Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy」 Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66またはBarrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014) を参照されたい。
場合によっては、細胞、例えばT細胞が活性化されることを必要としないベクターが使用され得る。そのような場合には、細胞は、活性化の前に選択および／または形質導入され得る。したがって、細胞は、細胞培養の前または後に操作されてもよく、場合によっては、培養の少なくとも一部分と同時にまたはその最中に操作されてもよい。
付加的な核酸、例えば導入するための遺伝子には、移植された細胞の生存度および／または機能を促進することなどによって、治療の有効性を改善するためのもの；インビボでの生存または局在性を評価するためなどの、細胞の選択および／または評価のための遺伝子マーカーを提供するための遺伝子；例えば、Lupton S.D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991)；およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992) に記載されているように、細胞がインビボで陰性選択を受け得るようにすることによって、安全性を改善するための遺伝子が含まれる。優性陽性選択可能マーカーを陰性選択可能マーカーと融合することによって得られる二機能性選択可能融合遺伝子の使用を記載している、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の刊行物もまた参照されたい。例えば、Riddellらの米国特許第6,040,177号の第14〜17欄を参照されたい。
IV. 治療方法
いくつかの態様では、セクションIに記載されたような本明細書に提供される方法により製造された濃縮T細胞のアウトプット組成物は、細胞療法、例えば養子細胞療法、として投与される。遺伝子操作された細胞は、様々な治療、診断および予防の状況において有用である。例えば、遺伝子操作された細胞または該細胞を含む組成物は、対象における様々な疾患および障害を治療するのに有用である。そのような方法および使用は、例えば、腫瘍またはがんなどの疾患、症状、または障害を有する対象に遺伝子操作された細胞またはそれを含む組成物を投与することを含む、治療上の方法および使用を含む。いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞またはそれを含む組成物は、疾患または障害の治療を達成するのに有効な量で投与される。使用には、そのような方法および治療における、およびそのような治療方法を実施するための医薬の製造における、遺伝子操作された細胞または組成物の使用が含まれる。いくつかの態様では、該方法は、遺伝子操作された細胞またはそれを含む組成物を、疾患または症状を有するかまたは有すると疑われる対象に投与することによって実施される。いくつかの態様では、該方法は、それによって、対象における疾患または症状または障害を治療する。
いくつかの態様では、セクションIに記載されたような本明細書に提供される方法により製造された濃縮T細胞のアウトプット組成物は、細胞療法、例えば養子細胞療法、として投与される。遺伝子操作された細胞は、様々な治療、診断および予防の状況において有用である。例えば、遺伝子操作された細胞または該細胞を含む組成物は、対象における様々な疾患および障害を治療するのに有用である。そのような方法および使用は、例えば、腫瘍またはがんなどの疾患、症状、または障害を有する対象に遺伝子操作された細胞またはそれを含む組成物を投与することを含む、治療上の方法および使用を含む。いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞またはそれを含む組成物は、疾患または障害の治療を達成するのに有効な量で投与される。使用には、そのような方法および治療における、およびそのような治療方法を実施するための医薬の製造における、遺伝子操作された細胞または組成物の使用が含まれる。いくつかの態様では、該方法は、遺伝子操作された細胞またはそれを含む組成物を、疾患または症状を有するかまたは有すると疑われる対象に投与することによって実施される。いくつかの態様では、該方法は、それによって、対象における疾患または症状または障害を治療する。
特定の態様において、1つまたは複数の細胞組成物、例えば、本明細書において記述されるアウトプット細胞組成物は、細胞療法として投与される。ある種の態様において、本明細書において提供される方法は、細胞療法として投与される単一の生体サンプルから単離、選択および/または濃縮されたインプット細胞から濃縮T細胞の単一のアウトプット組成物を産生する。ある種の態様において、単一のアウトプット組成物は、濃縮されたCD4+およびCD8+ T細胞の組成物である。養子細胞療法のために細胞を投与する方法は公知であり、提供される方法および組成物と関連して使用され得る。例えば、養子T細胞療法は、例えば、Gruenberg et alの米国特許出願公開番号2003/0170238；Rosenbergの米国特許第4,690,915号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara et al.(2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照されたい。処置される疾患または状態は、抗原の発現が疾患状態または障害の病因、例えば原因に関連する、および/もしくは関与するか、そのような疾患、状態もしくは障害を悪化させるか、またはそのような疾患、状態もしくは障害に関与する任意のものであることができる。例示的な疾患および状態は、悪性腫瘍もしくは細胞の形質転換(例えば、がん)、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または、例えば細菌の、ウイルスのもしくはその他の病原体によって引き起こされる、感染性疾患に関連する疾患または状態を含むことができる。処置することができるさまざまな疾患および状態に関連する抗原を含む例示的な抗原は、上述されている。特定の態様において、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックTCRは、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。
処置される疾患または状態は、抗原の発現が疾患状態または障害の病因、例えば原因に関連する、および/もしくは関与するか、そのような疾患、状態もしくは障害を悪化させるか、またはそのような疾患、状態もしくは障害に関与する任意のものであることができる。例示的な疾患および状態は、悪性腫瘍もしくは細胞の形質転換(例えば、がん)、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または、例えば細菌の、ウイルスのもしくはその他の病原体によって引き起こされる、感染性疾患に関連する疾患または状態を含むことができる。処置することができるさまざまな疾患および状態に関連する抗原を含む例示的な抗原は、上述されている。特定の態様において、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックTCRは、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。
疾患、症状および障害の中には、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および黒色腫を含み、限局性および転移性腫瘍を含む腫瘍、感染症、例えばウイルスまたは他の病原体（例えばHIV、HCV、HBV、CMV、HPV）による感染、および寄生虫症、ならびに自己免疫疾患および炎症性疾患がある。いくつかの態様では、疾患、障害または症状は、腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物、または他の増殖性疾患もしくは障害である。そのような疾患には、限定するものではないが、以下が含まれる：白血病、リンパ腫、例えば、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、有毛細胞白血病（HCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、辺縁帯（Marginal zone）リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫（HL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）、濾胞性リンパ腫、難治性濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）および多発性骨髄腫（MM）。いくつかの態様では、疾患または症状は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、成人ALL、慢性リンパ芽球性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）の中から選択されるB細胞悪性腫瘍である。いくつかの態様では、疾患または症状はNHLであり、NHLは、アグレッシブ（中悪性度）NHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）・NOS（非特定型）（デノボおよび低悪性度から進展）、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫（PMBCL）、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫（TCHRBCL）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、および/または濾胞性リンパ腫（FL）、任意で濾胞性リンパ腫グレード3B（FL3B）からなる群より選択される。
いくつかの態様では、疾患または症状は、感染性の疾患または症状であり、例えば、ウイルス性、レトロウイルス性、細菌性、および原虫性感染症、免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、疾患または症状は、自己免疫性または炎症性の疾患または症状であり、例えば、関節リウマチ（RA）などの関節炎、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、および/または移植に関連する疾患もしくは症状である。
いくつかの態様では、疾患または障害に関連する抗原は、以下であるか、または以下を含む：αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、別名CAIXまたはG250）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、別名NY-ESO-1およびLAGE-2）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、タイプIII上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリン（ephrin）B2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；別名Fc受容体ホモログ5またはFCRH5）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体α、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体α（IL-22Rα）、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、Lewis Y、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メラン（melan）A（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、がん胎児抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、トロホブラスト（Trophoblast）糖タンパク質（TPBG、別名5T4）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、別名TYRP1またはgp75）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、別名ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼまたはDCT）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR2）、Wilms Tumor 1（WT-1）、病原体特異的または病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子。いくつかの態様における該受容体によって標的化される抗原は、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかを含む。いくつかの態様では、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79bまたはCD30であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様では、疾患または症状はB細胞悪性腫瘍である。いくつかの態様では、B細胞悪性腫瘍は白血病またはリンパ腫である。いくつかの態様では、疾患または症状は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、成人ALL、慢性リンパ芽球性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、またはびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）である。いくつかの場合には、疾患または症状はNHLであり、例えば、アグレッシブ（中悪性度）NHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）・NOS（非特定型）（デノボおよび低悪性度から進展）、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫（PMBCL）、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫（TCHRBCL）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、および/または濾胞性リンパ腫（FL）、任意で濾胞性リンパ腫グレード3B（FL3B）であるNHLを含む。いくつかの局面では、CARなどの組換え受容体は、該疾患または症状に関連する抗原、またはB細胞悪性腫瘍に関連する病変の環境の細胞に発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの態様における該受容体によって標的化される抗原には、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば、多くの公知のB細胞マーカーのいずれかが含まれる。いくつかの態様では、該受容体によって標的化される抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、CD30、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様では、疾患または症状は、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫である。いくつかの局面では、CARなどの組換え受容体は、該疾患または症状に関連する抗原、または多発性骨髄腫に関連する病変の環境の細胞に発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの態様における該受容体によって標的化される抗原には、多発性骨髄腫に関連する抗原が含まれる。いくつかの局面では、該抗原、例えば第2のまたは追加の抗原（疾患特異的抗原および/または関連抗原など）は、多発性骨髄腫で発現され、例えば、B細胞成熟抗原（BCMA）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、CD38（環状ADPリボースヒドロラーゼ）、CD138（シンデカン-1、シンデカン、SYN-1）、CS-1（CS1、CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24）、BAFF-R、TACIおよび/またはFcRH5である。他の例示的な多発性骨髄腫抗原には、CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-ミクログロブリン、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1、およびアクチビン受容体タイプIIA（ActRIIA）が含まれる。Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058; Chu et al., Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17(91):37-46を参照されたい。いくつかの態様では、該抗原には、リンパ系腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫、および/または移植後リンパ球増殖症に存在するもの、例えばCD38、が含まれる。そのような抗原に対する抗体または抗原結合フラグメントは知られており、例えば、米国特許第8,153,765号、第8,603477号、第8,008,450号；米国特許出願公開第US20120189622号または第US20100260748号；および/または国際PCT公開番号WO2006099875、WO2009080829、WO2012092612またはWO2014210064に記載されるものが含まれる。いくつかの態様では、そのような抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、scFv）は、多重特異性抗体、多重特異性キメラ受容体、例えば多重特異性CAR、および/または多重特異性細胞に含まれる。
いくつかの態様において、疾患または障害は、Gタンパク質共役受容体クラスC群5メンバーD (GPRC5D)の発現および/またはB細胞成熟抗原(BCMA)の発現に関連する。
いくつかの態様において、疾患または障害は、B細胞関連障害である。提供される方法の提供される態様のいずれかのいくつかにおいて、BCMAに関連する疾患または障害は、自己免疫疾患または障害である。提供される方法の提供される態様のいずれかのいくつかにおいて、自己免疫疾患または障害は、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、ANCA関連血管炎、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、抗リン脂質症候群、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、または進行性糸球体腎炎である。
いくつかの態様において、疾患または障害はがんである。いくつかの態様において、がんはGPRC5D発現がんである。いくつかの態様において、がんは形質細胞悪性腫瘍であり、形質細胞悪性腫瘍は多発性骨髄腫(MM)または形質細胞腫である。いくつかの態様において、がんは多発性骨髄腫(MM)である。いくつかの態様において、がんは再発性/難治性多発性骨髄腫である。
いくつかの態様では、抗原は、病原体特異的抗原または病原体発現抗原であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、抗原は、ウイルス抗原（例えば、HIV、HCV、HBV由来のウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。
いくつかの態様において、細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞療法を受ける予定の対象から、またはそのような対象に由来する試料から細胞が単離され、かつ／またはその他の方法で調製される自家移植によって行われる。したがって、いくつかの局面において、細胞は、処置および細胞を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および処理後に同じ対象に投与される。
いくつかの態様において、細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞療法を受ける予定であるかまたは最終的に細胞療法を受ける対象以外の対象、例えば第1対象から細胞が単離され、かつ／またはその他の方法で調製される同種移植によって行われる。そのような態様において、この細胞は次いで、同じ種の異なる対象、例えば第2対象に投与される。いくつかの態様において、第1対象と第2対象は遺伝子的に同一である。いくつかの態様において、第1対象と第2対象は遺伝子的に類似している。いくつかの態様において、第2対象は第1対象と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。
細胞は、任意の適切な手段によって投与することができ、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば静脈内または皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下（subconjectval）注射、結膜下（subconjuntival）注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射、または後強膜近傍（posterior juxtascleral）送達によって投与される。いくつかの態様では、それらは、非経口、肺内、および鼻腔内、局所治療が望ましい場合は病変内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。いくつかの態様では、投与量は、細胞の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの態様では、それは、例えばせいぜい3日間にわたる、細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって投与される。いくつかの態様では、細胞用量の投与または任意の追加の療法、例えば、リンパ球除去療法、介入療法および/または併用療法は、外来通院による送達を介して行われる。
疾患の予防または治療の場合、適切な投与量は、治療する疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、細胞が予防または治療目的で投与されるか、以前の治療、対象の病歴および細胞に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存し得る。組成物および細胞は、いくつかの態様では、一度にまたは一連の治療にわたって対象に適切に投与される。
いくつかの態様において、細胞は、併用処置の一部として、例えば、別の治療的介入、例えば抗体または操作された細胞または受容体または作用物質など、例えば細胞毒性剤または治療剤などと同時に、または任意の順序で逐次的に、投与される。細胞はいくつかの態様において、1種または複数種の付加的な治療剤と、または別の治療的介入と関連して、同時にまたは任意の順序で逐次的に共投与される。状況によっては、細胞は、細胞集団が1種もしくは複数種の付加的な治療剤の効果を増強するように、またはその逆になるように、十分に近い時間内に別の治療法と共投与される。いくつかの態様において、細胞は、1種または複数種の付加的な治療剤の前に投与される。いくつかの態様において、細胞は、1種または複数種の付加的な治療剤の後に投与される。いくつかの態様において、1種または複数種の付加的な作用物質には、例えば持続性を増強するための、IL-2などのサイトカインが含まれる。いくつかの態様において、本方法は、化学療法剤の投与を含む。
いくつかの態様では、前記方法は、例えば投与前に腫瘍組織量を減らすための、化学療法剤、例えばコンディショニング化学療法剤、の投与を含む。
いくつかの局面における免疫枯渇（例えば、リンパ球除去）療法による対象のプレコンディショニングは、養子細胞療法（ACT）の効果を改善することができる。
したがって、いくつかの態様では、該方法は、細胞療法を開始する前に、プレコンディショニング剤、例えばリンパ球除去剤または化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、フルダラビン、またはそれらの組み合わせ）を対象に投与することを含む。例えば、細胞療法の開始の少なくとも2日前に、例えば少なくとも3、4、5、6、または7日前に、プレコンディショニング剤を対象に投与することができる。いくつかの態様では、細胞療法の開始のせいぜい7日前までに、例えば6、5、4、3、または2日前までに、プレコンディショニング剤を対象に投与する。
いくつかの態様では、対象は、20mg/kg〜100mg/kgまたは約20mg/kg〜100mg/kg、例えば40mg/kg〜80mg/kgまたは約40mg/kg〜80mg/kgの用量のシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの局面では、対象は60mg/kgまたは約60mg/kgのシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの態様では、シクロホスファミドは、単回投与されるか、または毎日、隔日、または3日ごとの投与など、複数回投与される。いくつかの態様では、シクロホスファミドは、1日1回、1日または2日間投与される。いくつかの態様では、リンパ球除去剤がシクロホスファミドを含む場合、対象はシクロホスファミドを約または100mg/m2〜500mg/m2、例えば約または200mg/m2〜400mg/m2または250mg/m2〜350mg/m2の用量で投与される。ある場合には、対象は約300mg/m2のシクロホスファミドを投与される。いくつかの態様では、シクロホスファミドは、単回投与されるか、または毎日、隔日、または3日ごとの投与など、複数回投与される。いくつかの態様では、シクロホスファミドは、例えば1〜5日間、例えば3〜5日間、毎日投与される。ある場合には、対象は、細胞療法を開始する前に、約300mg/m2のシクロホスファミドを3日間毎日投与される。
いくつかの態様では、リンパ球除去剤がフルダラビンを含む場合、対象はフルダラビンを1mg/m2〜100mg/m2または約1mg/m2〜100mg/m2、例えば、約または10mg/m2〜75mg/m2、15mg/m2〜50mg/m2、20mg/m2〜40mg/m2、または24mg/m2〜35mg/m2の用量で投与される。ある場合には、対象は約30mg/m2のフルダラビンを投与される。いくつかの態様では、フルダラビンは、単回投与されるか、または毎日、隔日、または3日ごとの投与など、複数回投与される。いくつかの態様では、フルダラビンは、例えば1〜5日間、例えば3〜5日間、毎日投与される。ある場合には、対象は、細胞療法を開始する前に、約30mg/m2のフルダラビンを3日間毎日投与される。
いくつかの態様では、リンパ球除去剤は、シクロホスファミドとフルダラビンの組み合わせなどの、薬剤の組み合わせを含む。したがって、薬剤の組み合わせは、上記のような任意の用量または投与スケジュールでのシクロホスファミドと、上記のような任意の用量または投与スケジュールでのフルダラビンを含み得る。例えば、いくつかの局面では、対象は、初回投与またはその後の投与の前に、60mg/kg（約2g/m2）のシクロホスファミドおよび3〜5回の25mg/m2のフルダラビンを投与される。
細胞の投与後、操作された細胞集団の生物学的活性はいくつかの態様において、例えばいくつかの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメータには、例えばイメージングによるインビボでの、または例えばELISAもしくはフローサイトメトリーによるエクスビボでの、抗原に対する操作されたT細胞もしくは天然T細胞または他の免疫細胞の特異的結合が含まれる。ある特定の態様において、標的細胞を破壊する操作された細胞の能力は、例えばKochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004) に記載されている細胞傷害性アッセイなどの、任意の公知の適切な方法を用いて測定され得る。ある特定の態様において、細胞の生物学的活性は、CD107a、IFNγ、IL-2、およびTNFなどの1種または複数種のサイトカインの発現および／または分泌をアッセイすることによって測定される。いくつかの局面において、生物学的活性は、腫瘍量または腫瘍負荷量の減少などの臨床転帰を評価することによって測定される。
ある特定の態様において、操作された細胞は、それらの治療有効性または予防有効性が増加するように、いくつもの方法でさらに改変される。例えば、集団によって発現される操作されたCARまたはTCRは、ターゲティング部分に直接的に、またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートされ得る。化合物、例えばCARまたはTCRをターゲティング部分にコンジュゲートする実践は、公知である。例えば、Wadwa et al., J.Drug Targeting 3:1 1 1 (1995) および米国特許第5,087,616号を参照されたい。
いくつかの態様では、細胞は、併用療法の一部として、例えば、抗体、遺伝子操作された細胞もしくは受容体、または薬剤（例えば、細胞傷害薬または治療薬）などの、別の治療的介入と同時に、または任意の順序で連続して、投与される。いくつかの態様における細胞は、1つ以上の追加の治療薬と一緒に、または別の治療的介入に関連して、同時にまたは任意の順序で連続して、共投与される。ある状況では、細胞は、細胞集団が1つ以上の追加の治療薬の効果を増強するかまたはその逆であるように時間的に十分に接近して、別の療法と共投与される。ある態様では、細胞を1つ以上の追加の治療薬の前に投与する。ある態様では、細胞を1つ以上の追加の治療薬の後に投与する。いくつかの態様では、1つ以上の追加の治療薬は、例えば持続性を高めるために、IL-2などのサイトカインを含む。
A. 投薬
いくつかの態様では、1回量の細胞、例えばセクションI〜Gにおいて本明細書に記載されるアウトプット細胞、は、提供される方法、および/または提供される製造物品もしくは組成物に従って、対象に投与される。いくつかの態様では、該用量のサイズまたは投与のタイミングは、対象における特定の疾患または症状に応じて決定される。場合によっては、提供される明細記述を考慮して、特定の疾患のための該用量のサイズまたは投与のタイミングを経験的に決定することができる。
いくつかの態様では、1回量の細胞、例えばセクションI〜Gにおいて本明細書に記載されるアウトプット細胞、は、提供される方法、および/または提供される製造物品もしくは組成物に従って、対象に投与される。いくつかの態様では、該用量のサイズまたは投与のタイミングは、対象における特定の疾患または症状に応じて決定される。場合によっては、提供される明細記述を考慮して、特定の疾患のための該用量のサイズまたは投与のタイミングを経験的に決定することができる。
いくつかの態様では、該用量の細胞は、2×105細胞/kg〜2×106細胞/kgまたは約2×105細胞/kg〜約2×106細胞/kg、例えば、4×105細胞/kg〜1×106細胞/kgもしくは約4×105細胞/kg〜約1×106細胞/kg、または6×105細胞/kg〜約8×105細胞/kgもしくは約6×105細胞/kg〜約8×105細胞/kgを含む。いくつかの態様では、該用量の細胞は、対象の体重1キログラムあたりわずか2×105の細胞（例えば、CAR発現細胞などの抗原発現細胞）（細胞/kg）を含み、例えば、わずか3×105細胞/kgもしくはわずか約3×105細胞/kg、わずか4×105細胞/kgもしくはわずか約4×105細胞/kg、わずか5×105細胞/kgもしくはわずか約5×105細胞/kg、わずか6×105細胞/kgもしくはわずか約6×105細胞/kg、わずか7×105細胞/kgもしくはわずか約7×105細胞/kg、わずか8×105細胞/kgもしくはわずか約8×105細胞/kg、わずか9×105細胞/kgもしくはわずか約9×105細胞/kg、わずか1×106細胞/kgもしくはわずか約1×106細胞/kg、またはわずか2×106細胞/kgもしくはわずか約2×106細胞/kgを含む。いくつかの態様では、該用量の細胞は、対象の体重1キログラムあたり少なくとも2×105または少なくとも約2×105または2×105または約2×105の細胞（例えば、CAR発現細胞などの抗原発現細胞）（細胞/kg）を含み、例えば、少なくとも3×105細胞/kgもしくは少なくとも約3×105細胞/kgもしくは3×105細胞/kgもしくは約3×105細胞/kg、少なくとも4×105細胞/kgもしくは少なくとも約4×105細胞/kgもしくは4×105細胞/kgもしくは約4×105細胞/kg、少なくとも5×105細胞/kgもしくは少なくとも約5×105細胞/kgもしくは5×105細胞/kgもしくは約5×105細胞/kg、少なくとも6×105細胞/kgもしくは少なくとも約6×105細胞/kgもしくは6×105細胞/kgもしくは約6×105細胞/kg、少なくとも7×105細胞/kgもしくは少なくとも約7×105細胞/kgもしくは7×105細胞/kgもしくは約7×105細胞/kg、少なくとも8×105細胞/kgもしくは少なくとも約8×105細胞/kgもしくは8×105細胞/kgもしくは約8×105細胞/kg、少なくとも9×105細胞/kgもしくは少なくとも約9×105細胞/kgもしくは9×105細胞/kgもしくは約9×105細胞/kg、少なくとも1×106細胞/kgもしくは少なくとも約1×106細胞/kgもしくは1×106細胞/kgもしくは約1×106細胞/kg、または少なくとも2×106細胞/kgもしくは少なくとも約2×106細胞/kgもしくは2×106細胞/kgもしくは約2×106細胞/kgを含む。
特定の態様では、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、対象に、10万〜1000億または約10万〜約1000億の細胞の範囲、および/または対象の体重1キログラムあたりの細胞のその量で投与され、例えば、10万〜500億または約10万〜約500億の細胞（例えば、500万もしくは約500万の細胞、2500万もしくは約2500万の細胞、5億もしくは約5億の細胞、10億もしくは約10億の細胞、50億もしくは約50億の細胞、200億もしくは約200億の細胞、300億もしくは約300億の細胞、400億もしくは約400億の細胞、または前述の値のいずれか2つによって定義された範囲）、100万〜500億または約100万〜約500億の細胞（例えば、500万もしくは約500万の細胞、2500万もしくは約2500万の細胞、5億もしくは約5億の細胞、10億もしくは約10億の細胞、50億もしくは約50億の細胞、200億もしくは約200億の細胞、300億もしくは約300億の細胞、400億もしくは約400億の細胞、または前述の値のいずれか2つによって定義された範囲）、例えば、1000万〜1000億または約1000万〜約1000億の細胞（例えば、2000万もしくは約2000万の細胞、3000万もしくは約3000万の細胞、4000万もしくは約4000万の細胞、6000万もしくは約6000万の細胞、7000万もしくは約7000万の細胞、8000万もしくは約8000万の細胞、9000万もしくは約9000万の細胞、100億もしくは約100億の細胞、250億もしくは約250億の細胞、500億もしくは約500億の細胞、750億もしくは約750億の細胞、900億もしくは約900億の細胞、または前述の値のいずれか2つによって定義される範囲）、場合によっては、1億〜500億または約1億〜約500億の細胞（例えば、1億2000万もしくは約1億2000万の細胞、2億5000万もしくは約2億5000万の細胞、3億5000万もしくは約3億5000万の細胞、6億5000万もしくは約6億5000万の細胞、8億もしくは約8億の細胞、9億もしくは約9億の細胞、30億もしくは約30億の細胞、300億もしくは約300億の細胞、450億もしくは約450億の細胞）、またはこれらの範囲の中間の任意の値および/または対象の体重1キログラムあたりで投与される。投与量は、疾患もしくは障害および/または患者および/または他の治療に特有の属性に応じて変化し得る。ある態様では、細胞用量が対象の体表面積または体重に結び付けられないまたは基づかないように、細胞用量は一律の細胞用量または固定された細胞用量である。
いくつかの態様では、例えば、対象がヒトである場合、該用量は、約5×108未満の総組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）を含み、例えば、1×106〜5×108または約1×106〜約5×108の範囲のそのような細胞を含み、例えば、2×106、5×106、1×107、5×107、1×108、1.5×108、もしくは5×108、または約2×106、約5×106、約1×107、約5×107、約1×108、約1.5×108、もしくは約5×108、または前述の値のいずれか2つの間の範囲のそのような総細胞を含む。いくつかの態様では、例えば、対象がヒトである場合、該用量は、1×106または約1×106より多く、かつ2×109または約2×109より少ない総組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）を含み、例えば、2.5×107〜1.2×109または約2.5×107〜約1.2×109の範囲のそのような細胞、例えば、2.5×107、5×107、1×108、1.5×108、8×108、もしくは1.2×109、または約2.5×107、約5×107、約1×108、約1.5×108、約8×108、もしくは約1.2×109、または前述の値のいずれか2つの間の範囲のそのような総細胞を含む。
いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞の該用量は、以下を含む：1×105〜5×108または約1×105〜約5×108の総CAR発現（CAR発現）T細胞、1×105〜2.5×108または約1×105〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、1×105〜1×108または約1×105〜約1×108の総CAR発現T細胞、1×105〜5×107または約1×105〜約5×107の総CAR発現T細胞、1×105〜2.5×107または約1×105〜約2.5×107の総CAR発現T細胞、1×105〜1×107または約1×105〜約1×107の総CAR発現T細胞、1×105〜5×106または約1×105〜約5×106の総CAR発現T細胞、1×105〜2.5×106または約1×105〜約2.5×106の総CAR発現T細胞、1×105〜1×106または約1×105〜約1×106の総CAR発現T細胞、1×106〜5×108または約1×106〜約5×108の総CAR発現T細胞、1×106〜2.5×108または約1×106〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、1×106〜1×108または約1×106〜約1×108の総CAR発現T細胞、1×106〜5×107または約1×106〜約5×107の総CAR発現T細胞、1×106〜2.5×107または約1×106〜約2.5×107の総CAR発現T細胞、1×106〜1×107または約1×106〜約1×107の総CAR発現T細胞、1×106〜5×106または約1×106〜約5×106の総CAR発現T細胞、1×106〜2.5×106または約1×106〜約2.5×106の総CAR発現T細胞、2.5×106〜5×108または約2.5×106〜約5×108の総CAR発現T細胞、2.5×106〜2.5×108または約2.5×106〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、2.5×106〜1×108または約2.5×106〜約1×108の総CAR発現T細胞、2.5×106〜5×107または約2.5×106〜約5×107の総CAR発現T細胞、2.5×106〜2.5×107または約2.5×106〜約2.5×107の総CAR発現T細胞、2.5×106〜1×107または約2.5×106〜約1×107の総CAR発現T細胞、2.5×106〜5×106または約2.5×106〜約5×106の総CAR発現T細胞、5×106〜5×108または約5×106〜約5×108の総CAR発現T細胞、5×106〜2.5×108または約5×106〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、5×106〜1×108または約5×106〜約1×108の総CAR発現T細胞、5×106〜5×107または約5×106〜約5×107の総CAR発現T細胞、5×106〜2.5×107または約5×106〜約2.5×107の総CAR発現T細胞、5×106〜1×107または約5×106〜約1×107の総CAR発現T細胞、1×107〜5×108または約1×107〜約5×108の総CAR発現T細胞、1×107〜2.5×108または約1×107〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、1×107〜1×108または約1×107〜約1×108の総CAR発現T細胞、1×107〜5×107または約1×107〜約5×107の総CAR発現T細胞、1×107〜2.5×107または約1×107〜約2.5×107の総CAR発現T細胞、2.5×107〜5×108または約2.5×107〜約5×108の総CAR発現T細胞、2.5×107〜2.5×108または約2.5×107〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、2.5×107〜1×108または約2.5×107〜約1×108の総CAR発現T細胞、2.5×107〜5×107または約2.5×107〜約5×107の総CAR発現T細胞、約5×107〜約5×108の総CAR発現T細胞、約5×107〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、約5×107〜約1×108の総CAR発現T細胞、1×108〜5×108または約1×108〜約5×108の総CAR発現T細胞、1×108〜2.5×108または約1×108〜約2.5×108の総CAR発現T細胞、2.5×108〜5×108または約2.5×108〜約5×108の総CAR発現T細胞。いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞の該用量は、2.5×107〜1.5×108または約2.5×107〜約1.5×108の総CAR発現T細胞、例えば、5×107〜1×108または約5×107〜約1×108の総CAR発現T細胞を含む。
いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞の該用量は、少なくとも1×105または約1×105のCAR発現細胞、少なくとも2.5×105または約2.5×105のCAR発現細胞、少なくとも5×105または約5×105のCAR発現細胞、少なくとも1×106または約1×106のCAR発現細胞、少なくとも2.5×106または約2.5×106のCAR発現細胞、少なくとも5×106または約5×106のCAR発現細胞、少なくとも1×107または約1×107のCAR発現細胞、少なくとも2.5×107または約2.5×107のCAR発現細胞、少なくとも5×107または約5×107のCAR発現細胞、少なくとも1×108または約1×108のCAR発現細胞、少なくとも1.5×108または約1.5×108のCAR発現細胞、少なくとも約5×106のCAR発現細胞、少なくともまたは少なくとも約1×107のCAR発現細胞、少なくともまたは少なくとも約2.5×107のCAR発現細胞、少なくともまたは少なくとも約5×107のCAR発現細胞、少なくともまたは少なくとも約1×108のCAR発現細胞、少なくとも2.5×108または約2.5×108のCAR発現細胞、あるいは少なくとも5×108または約5×108のCAR発現細胞を含む。
いくつかの態様では、細胞療法は、1×105〜5×108もしくは約1×105〜約5×108の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞（PBMC）、5×105〜1×107もしくは約5×105〜約1×107の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞（PBMC）、または1×106〜1×107もしくは約1×106〜約1×107の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞（PBMC）の数の細胞を含む用量の投与を含む。いくつかの態様では、細胞療法は、少なくとも1×105または約1×105の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、または総末梢血単核細胞（PBMC）、例えば、少なくとも1×106または約1×106、少なくとも1×107または約1×107、少なくとも1×108または約1×108のそのような細胞の数を含む細胞の用量の投与を含む。いくつかの態様では、その数は、CD3発現またはCD8発現の総数を基準にし、場合によっては、組換え受容体発現（例えば、CAR発現）細胞の総数をも基準にする。いくつかの態様では、細胞療法は、1×105〜5×108もしくは約1×105〜約5×108のCD3発現もしくはCD8発現総T細胞またはCD3発現もしくはCD8発現組換え受容体発現細胞、5×105〜1×107もしくは約5×105〜約1×107のCD3発現もしくはCD8発現総T細胞またはCD3発現もしくはCD8発現組換え受容体発現細胞、あるいは1×106〜1×107もしくは約1×106〜約1×107のCD3発現もしくはCD8発現総T細胞またはCD3発現もしくはCD8発現組換え受容体発現細胞の数の細胞を含む用量の投与を含む。いくつかの態様では、細胞療法は、1×105〜5×108もしくは約1×105〜約5×108の総CD3発現/CAR発現またはCD8発現/CAR発現細胞、5×105〜1×107もしくは約5×105〜約1×107の総CD3発現/CAR発現またはCD8発現/CAR発現細胞、または1×106〜1×107もしくは約1×106〜約1×107の総CD3発現/CAR発現またはCD8発現/CAR発現細胞の数の細胞を含む用量の投与を含む。
いくつかの態様では、該用量のT細胞には、CD4発現T細胞、CD8発現T細胞、またはCD4発現およびCD8発現T細胞が含まれる。
いくつかの態様では、例えば、対象がヒトである場合、該用量のCD8発現T細胞（CD4発現およびCD8発現T細胞を含む用量を含む）は、1×106〜5×108または約1×106〜約5×108の総組換え受容体（例えば、CAR）発現CD8発現細胞を含み、例えば、5×106〜1×108または約5×106〜約1×108の範囲のそのような細胞、例えば、1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、1.5×108、または5×108のそのような総細胞、または前述の値のいずれか2つの間の範囲を含む。いくつかの態様では、患者は複数回の投与を受け、各用量または総用量は前述の値のいずれかの範囲内であり得る。いくつかの態様では、細胞の該用量は、1×107〜0.75×108または約1×107〜約0.75×108の総組換え受容体発現CD8発現T細胞、1×107〜5×107または約1×107〜約5×107の総組換え受容体発現CD8発現T細胞、1×107〜0.25×108または約1×107〜約0.25×108の総組換え受容体発現CD8発現T細胞の投与を含む。いくつかの態様では、細胞の該用量は、1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、1.5×108、2.5×108、もしくは5×108、または約1×107、約2.5×107、約5×107、約7.5×107、約1×108、約1.5×108、約2.5×108、もしくは約5×108の総組換え受容体発現CD8発現T細胞の投与を含む。
いくつかの態様では、細胞、例えば組換え受容体発現T細胞の用量は、対象に1回量として投与されるか、または2週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年またはそれ以上の期間内に1回だけ投与される。
養子細胞療法との関係において、所定の「用量」の投与は、単一の組成物としての細胞の所定の量もしくは数の投与および/または中断のない単回投与（例えば、単回注射または連続注入としての投与）を包含し、さらに、分割用量または複数の組成物としての細胞の所定の量もしくは数の投与（特定の期間、例えばせいぜい3日間にわたって、複数の個別の組成物または注入として提供される）を包含する。したがって、いくつかの状況では、該用量は、単一時点で投与または開始される、指定された数の細胞の単回投与または連続投与である。しかしながら、状況によっては、該用量は、1日1回3日間もしくは2日間など、せいぜい3日間にわたる複数回の注射または注入として、あるいは1日にわたる複数回の注入により投与される。
したがって、いくつかの局面では、該用量の細胞は単一の薬学的組成物として投与される。いくつかの態様では、該用量の細胞は複数の組成物（集合的に該用量の細胞を含有する）として投与される。
いくつかの態様では、用語「分割用量」は、2日以上にわたって投与されるように分割された用量を指す。このタイプの投薬は、本方法により包含され、1回量であるとみなされる。
したがって、細胞の用量は、分割用量として、例えば経時的に投与される分割用量として、投与され得る。例えば、いくつかの態様では、該用量を2日間または3日間にわたって対象に投与することができる。代表的な分割投与法には、初日に該用量の25％を投与し、2日目に該用量の残り75％を投与することが含まれる。他の態様では、該用量の33％を初日に投与して、残り67％を2日目に投与してもよい。いくつかの局面では、該用量の10％を初日に投与し、該用量の30％を2日目に投与し、該用量の60％を3日目に投与する。いくつかの態様では、分割用量が3日を超えて広がることはない。
いくつかの態様では、該用量の細胞は、例えば第1および第2の、任意でそれ以上の、複数の組成物または溶液の投与によって投与され、各組成物または溶液は該用量の一部の細胞を含有する。いくつかの局面では、それぞれが異なる細胞の集団および/またはサブタイプを含有する複数の組成物は、任意で一定期間内に、別々にまたは独立して投与される。例えば、細胞の集団またはサブタイプは、それぞれCD8+およびCD4+ T細胞、および/またはそれぞれCD8+およびCD4+濃縮集団、例えば、それぞれが組換え受容体を発現するように遺伝子操作された細胞を個別に含むCD4+および/またはCD8+ T細胞、を含むことができる。いくつかの態様では、該用量の投与は、1回量のCD8+ T細胞または1回量のCD4+ T細胞を含む第1の組成物の投与と、該用量のCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の他方を含む第2の組成物の投与を含む。
いくつかの態様では、前記組成物または用量の投与、例えば、複数の細胞組成物の投与は、細胞組成物の別々の投与を含む。いくつかの局面では、別々の投与は、同時に、または任意の順序で連続して行われる。いくつかの態様では、該用量は第1の組成物および第2の組成物を含み、第1の組成物と第2の組成物を0〜12時間間隔で、0〜6時間間隔で、または0〜2時間間隔で投与する。いくつかの態様では、第1の組成物の投与開始と第2の組成物の投与開始を、2時間以内、1時間以内、30分以内、15分以内、10分以内、または5分以内の間隔で行う。いくつかの態様では、第1の組成物の投与の開始および/または完了と、第2の組成物の投与の完了および/または開始を、2時間以内、1時間以内、30分以内、15分以内、10分以内、または5分以内の間隔で行う。
いくつかの態様では、第1の組成物、例えば、該用量の第1の組成物は、CD4+ T細胞を含む。いくつかの態様では、第1の組成物、例えば、該用量の第1の組成物は、CD8+ T細胞を含む。いくつかの態様では、第1の組成物は、第2の組成物の前に投与される。
いくつかの態様では、細胞の該用量または組成物は、規定されたまたは目標の比率の組換え受容体を発現するCD4+細胞と組換え受容体を発現するCD8+細胞、および/またはCD4+細胞とCD8+細胞を含み、この比は、任意で約1：1であるか、または約1：3〜約3：1であり、例えば約1：1である。いくつかの局面では、異なる細胞集団の目標のまたは所望の比率（例えば、CD4+：CD8+比またはCAR+ CD4+：CAR+ CD8+比、例えば1：1）での組成物または用量の投与は、該集団の一方を含む細胞組成物の投与、次いで該集団の他方を含む別個の細胞組成物の投与を含み、その場合、該投与を目標または所望の比率で行う。いくつかの局面では、規定された比率での細胞の用量または組成物の投与は、T細胞療法の拡大増殖、持続性および/または抗腫瘍活性の改善につながる。
いくつかの態様では、対象は、細胞の複数回の用量、例えば、2回以上の用量または複数回の連続用量を受け取る。いくつかの態様では、2回の用量が対象に投与される。いくつかの態様では、対象は連続用量を受け取り、例えば、初回用量の約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日後に2回目の用量を投与される。いくつかの態様では、初回用量の後に複数回の連続用量が投与され、その連続用量の投与後に1回または複数回の追加の用量が投与されるようにする。いくつかの局面では、追加の用量で対象に投与される細胞の数は、初回用量および/または連続用量と同じであるか、または同様である。いくつかの態様では、1回または複数回の追加の用量は、前の用量よりも多い。
いくつかの局面では、初回用量および/または連続用量のサイズは、以下のような、1つまたは複数の基準に基づいて決定される：以前の治療（例えば化学療法）に対する対象の反応、対象における疾病負荷、例えば、腫瘍の量、大きさ、サイズ、または転移の程度、範囲、もしくはタイプ、ステージ（病期）、および/または毒性の結果（例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性）を発症する対象の可能性もしくは発生率、ならびに/または投与される細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫反応。
いくつかの局面では、初回用量の投与と連続用量の投与との間の期間は、約9〜約35日、約14〜約28日、または15〜27日である。いくつかの態様では、連続用量の投与は、初回用量の投与から約14日以上で約28日未満の時点である。いくつかの局面では、初回用量と連続用量との間の期間は、約21日である。いくつかの態様では、その連続用量の投与後に、1回または複数回の追加の用量、例えば連続用量が投与される。いくつかの局面では、1回または複数回の追加の連続用量は、前回の用量の投与から少なくとも約14日で約28日未満に投与される。いくつかの態様では、追加の用量は、前回の投与から約14日未満に投与され、例えば、前回の投与の4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13日後に投与される。いくつかの態様では、用量は、前回の投与から約14日未満には投与されず、かつ/または前回の投与から約28日を超えて投与されない。
いくつかの態様では、細胞、例えば組換え受容体発現細胞、の用量は、T細胞の初回用量およびT細胞の連続用量を含む2回の用量（例えば、2回量）を含み、ここで、初回の用量と2回目の用量の一方または両方は、T細胞の分割用量の投与を含む。
いくつかの態様では、細胞の前記用量は一般に、疾病負荷を軽減するのに効果的な、十分な量である。
いくつかの態様では、前記細胞は、細胞もしくは細胞タイプ（複数可）の所望の用量もしくは数、および/または細胞タイプの所望の比率を含む、所望の投与量で投与される。したがって、いくつかの態様での細胞の投与量は、細胞の総数（または体重1kgあたりの数）、および個々の集団またはサブタイプの所望の比、例えばCD4+対CD8+比、に基づいている。いくつかの態様では、細胞の投与量は、個々の集団中の細胞のまたは個々の細胞タイプの所望の総数（または体重1kgあたりの数）に基づいている。いくつかの態様では、投与量は、例えば、総細胞の所望の数、所望の比率、個々の集団中の細胞の所望の総数などの、そのような特徴の組み合わせに基づいている。
いくつかの態様では、細胞の集団またはサブタイプ、例えばCD8+およびCD4+ T細胞は、総細胞の所望の用量（例えば、T細胞の所望の用量）の許容差（tolerated difference）で、または許容差の範囲内で投与される。いくつかの局面では、所望の用量は、細胞の所望の数、または細胞が投与される対象の体重の単位あたりの細胞の所望の数、例えば細胞数/kgである。いくつかの局面では、所望の用量は、細胞の最小数または体重の単位あたりの細胞の最小数であるか、それを上回る数である。いくつかの局面では、所望の用量で投与される総細胞の中で、個々の集団またはサブタイプは、所望の出力比（例えば、CD4+対CD8+比）で、またはそれに近い比率で存在し、例えば、そのような比率の一定の許容差または誤差の範囲内で存在する。
いくつかの態様では、前記細胞は、細胞の個々の集団またはサブタイプの1つまたは複数の所望の用量（例えば、CD4+細胞の所望の用量および/またはCD8+細胞の所望の用量）の許容差の範囲内で投与される。いくつかの局面では、所望の用量は、サブタイプまたは集団の細胞の所望の数、または細胞が投与される対象の体重の単位あたりのそのような細胞の所望の数、例えば細胞数/kgである。いくつかの局面では、所望の用量は、集団またはサブタイプの細胞の最小数、あるいは体重の単位あたりの集団またはサブタイプの細胞の最小数であるか、それを上回る数である。
したがって、いくつかの態様では、投与量は、総細胞の所望の固定用量および所望の比率に基づき、かつ/または個々のサブタイプもしくはサブ集団の1つまたは複数、例えばそれぞれ、の所望の固定用量に基づく。こうして、いくつかの態様では、投与量は、T細胞の所望の固定もしくは最小用量およびCD4+対CD8+細胞の所望の比率に基づき、かつ/またはCD4+および/またはCD8+細胞の所望の固定もしくは最小用量に基づく。
いくつかの態様では、細胞は、複数の細胞集団またはサブタイプ、例えばCD4+およびCD8+細胞またはサブタイプ、の所望の出力比の許容範囲内で投与される。いくつかの局面では、所望の比は、特定の比であるか、ある範囲の比であり得る。例えば、いくつかの態様では、所望の比（例えば、CD4+対CD8+細胞の比）は、1：5〜5：1または約1：5〜約5：1（または約1：5以上かつ約5：1以下）、1：3〜3：1または約1：3〜約3：1（または約1：3以上かつ約3：1以下）、例えば、2：1〜1：5または約2：1〜約1：5（または約1：5以上かつ約2：1以下）、例えば、5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、もしくは1：5、または約5：1、約4.5：1、約4：1、約3.5：1、約3：1、約2.5：1、約2：1、約1.9：1、約1.8：1、約1.7：1、約1.6：1、約1.5：1、約1.4：1、約1.3：1、約1.2：1、約1.1：1、約1：1、約1：1.1、約1：1.2、約1：1.3、約1：1.4、約1：1.5、約1：1.6、約1：1.7、約1：1.8、約1：1.9、約1：2、約1：2.5、約1：3、約1：3.5、約1：4、約1：4.5、もしくは約1：5である。いくつかの局面では、許容差は、所望の比の約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％以内である（これらの範囲内の任意の値を含む）。
特定の態様では、細胞の数および/または濃度は、組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞の数を指す。他の態様では、細胞の数および/または濃度は、投与される全ての細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）の数または濃度を指す。
いくつかの局面では、用量のサイズは、以下のような、1つまたは複数の基準に基づいて決定される：以前の治療（例えば化学療法）に対する対象の反応、対象における疾病負荷、例えば、腫瘍の量、大きさ、サイズ、または転移の程度、範囲、もしくはタイプ、ステージ（病期）、および/または毒性の結果（例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性）を発症する対象の可能性もしくは発生率、ならびに/または投与される細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫反応。
いくつかの態様では、前記方法はまた、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞の1回または複数回の追加の用量を投与し、かつ/またはリンパ球除去療法を施す工程を含み、かつ/または該方法の1つまたは複数の工程は繰り返される。ある態様では、1回または複数回の追加の用量は、初期用量と同じである。ある態様では、1回または複数回の追加の用量は、初期用量と異なり、例えば、初期用量よりも高く、例えば、初期用量よりも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍またはそれ以上高いか、または初期用量よりも低く、例えば、初期用量よりも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍またはそれ以上低い。いくつかの態様では、1回または複数回の追加の用量の投与は、初期治療または以前の治療に対する対象の反応、対象における疾病負荷、例えば、腫瘍の量、大きさ、サイズ、または転移の程度、範囲、もしくはタイプ、ステージ（病期）、および/または毒性の結果（例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性）を発症する対象の可能性もしくは発生率、ならびに/または投与される細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫反応に基づいて決定される。
B. 応答、効力および生存
いくつかの態様において、例えば、I項に記述されているような、本明細書において提供される方法によって産生される細胞、例えば、アウトプット細胞は対象に投与され、対象は応答、生存、および/または毒性の徴候もしくは症状についてモニタリングされる。
いくつかの態様において、例えば、I項に記述されているような、本明細書において提供される方法によって産生される細胞、例えば、アウトプット細胞は対象に投与され、対象は応答、生存、および/または毒性の徴候もしくは症状についてモニタリングされる。
いくつかの態様において、細胞の組成物、例えば、CAR+ CD4+およびCD8+ T細胞を含有する治療用細胞組成物で処置された対象の少なくとも35%、少なくとも40%または少なくとも50%が寛解(CR)をもたらし; および/または本方法によって処置された対象の少なくとも50%、少なくとも60%または少なくとも70%は、客観的奏効率(objective response rate; ORR)を達成する。いくつかの態様において、本方法によって処置された対象の少なくとももしくは少なくとも約50%、対象の少なくとももしくは少なくとも約60%、対象の少なくとももしくは少なくとも約70%、対象の少なくとももしくは少なくとも約80%、または対象の少なくとももしくは少なくとも約90%がCRを達成し、および/あるいは客観的応答(OR)を達成する。いくつかの態様において、有効な処置について評価される基準は、全奏効率(overall response rate; ORR)、完全寛解(CR)、奏効期間(DOR) 無進行生存(PFS)、および/または全生存(OS)を含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法によって処置された対象の少なくとも40%または少なくとも50%は、完全寛解(CR)を達成し、およそ3ヶ月、6ヶ月もしくは12ヶ月超の無進行生存(PFS)および/もしくは全生存(OS)を示し; 平均して、本方法によって処置された対象は、およそ6ヶ月、12ヶ月もしくは18ヶ月超のPFSもしくはOS中央値を示し; ならびに/または対象は少なくともおよそ6ヶ月、12ヶ月、18ヶ月もしくはそれ以上の月数の間、治療後にPFSもしくはOSを示す。
いくつかの点で、無進行生存(PFS)は、対象が疾患を抱えながら生きるが、悪化することのない、がんのような、疾患の処置中および処置後の時間の長さと記述される。いくつかの局面において、客観的応答(OR)は測定可能な応答と記述される。いくつかの局面において、客観的奏効率(ORR)は、CRまたはPRを達成した患者の比率と記述される。いくつかの局面において、全生存(OS)は、疾患と診断された対象がまだ生きている、がんのような、疾患の診断の日または処置の開始からの時間の長さと記述される。いくつかの局面において、無症候生存(EFS)は、処置が予防または遅延することを意図したある種の合併症または事象が対象にないままであるがんの処置終了後の時間の長さと記述される。これらの事象は、がんの再発またはある種の症状の発症、例えば骨に転移したがんによる骨の痛み、または死亡を含みうる。
いくつかの態様において、応答期間(DOR)の尺度は、腫瘍応答の文書化から疾患の進行までの時間を含む。いくつかの態様において、応答を評価するためのパラメータは、持続的応答、例えば、治療の開始からある期間後に持続する応答を含むことができる。いくつかの態様において、持続的応答は、治療の開始後およそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、または24ヶ月時の応答率によって示される。いくつかの態様において、応答は、3ヶ月超または6ヶ月超の間、持続する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法によって産生される細胞の投薬または組成物を投与することで、疾患もしくは状態の負担、例えば、腫瘍細胞の数、腫瘍のサイズ、患者の生存期間もしくは無症候生存が代替プロセスによって作出された細胞を用いた同等の方法で観察されるものと思われる低減と比較してさらに大きくおよび/またはさらに長い期間、低減される。いくつかの態様において、対象における疾患または状態の負担が検出、評価、または測定される。疾患の負担は、いくつかの局面において、対象において、または血液もしくは血清のような、対象の臓器、組織、もしくは体液において疾患または疾患関連細胞、例えば腫瘍細胞の総数を検出することによって検出されうる。いくつかの局面において、対象の生存、ある種の期間内の生存、生存の程度、無症候もしくは無症状生存、または無再発生存の存在または期間が評価される。いくつかの態様において、疾患または状態の任意の症状が評価される。いくつかの態様において、疾患または状態の負担の尺度が指定される。
いくつかの態様において、対象の無症候生存率または全生存率は、代替方法によって作出された細胞と比較して、提供される方法、例えば、I項に記述される方法から産生された細胞を投与することによって改善される。例えば、いくつかの態様において、投薬後6ヶ月の時点で本方法により処置された対象の無症候生存率または確率は、およそ40%超、およそ50%超、およそ60%超、およそ70%超、およそ80%超、およそ90%超、またはおよそ95%超である。いくつかの局面において、全生存率は、およそ40%超、およそ50%超、およそ60%超、およそ70%超、およそ80%超、およそ90%超、またはおよそ95%超である。いくつかの態様において、提供される方法によって産生された細胞で処置された対象は、少なくとも6ヶ月、または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10年までの無症候生存、無再発生存、または生存を示す。いくつかの態様において、約もしくはおよそ6ヶ月超、または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10年の進行までの時間のような、進行までの時間が改善される。
いくつかの態様において、本方法による処置後、再発の確率は、他の方法、例えば、対象が代替方法によって産生された細胞を含有する細胞療法を受ける方法と比較して低減される。例えば、いくつかの態様において、最初の投薬後6ヶ月の時点の再発の確率は、およそ80%未満、およそ70%未満、およそ60%未満、およそ50%未満、およそ40%未満、およそ30%未満、およそ20%未満、またはおよそ10%未満である。
C. 毒性
ある種の態様において、例えば、I項に記述されているような、本明細書において提供される方法によって産生される細胞、例えばアウトプット細胞が対象に投与され、対象は毒性の徴候または症状についてモニタリングされる。
ある種の態様において、例えば、I項に記述されているような、本明細書において提供される方法によって産生される細胞、例えばアウトプット細胞が対象に投与され、対象は毒性の徴候または症状についてモニタリングされる。
ある種の態様において、細胞、例えば、提供される方法によって産生されるアウトプット細胞の投薬または組成物は、例えば、代替プロセスによって産生されたCAR+ T細胞組成物のような、代替細胞療法の投与と比較して、さらに低い毒性率および/またはさらに低い毒性度、毒性の結果または症状、毒性促進性のプロファイル、因子または特性、例えばサイトカイン放出症候群(CRS)または神経毒性に関連するまたはそれを示す症状または結果をもたらす。
いくつかの態様において、提供される方法によって産生された細胞の投与は、例えばある種の他の細胞療法および/または代替方法によって産生された細胞と比較して、高い率もしくは可能性の毒性もしくは毒性の結果の高率または可能性をもたらさないか、または神経毒性(NT)、サイトカイン放出症候群(CRS)のような、毒性もしくは毒性の結果の率もしくは可能性を低減する。いくつかの態様において、提供される方法によって産生された細胞、例えばアウトプット細胞の投与は、重度のNT (sNT)、重度のCRS (sCRS)、マクロファージ活性化症候群、腫瘍溶解症候群、3日もしくはそれ以上の日数間の少なくともおよそ38℃の発熱および少なくともおよそ20 mg/dLのCRPの血漿レベルをもたらすか、またはそのリスクを増加させない。いくつかの態様において、提供される方法によって処置された対象の30%、35%、40%、50%、55%、60%もしくはそれ以上超または約30%、35%、40%、50%、55%、60%もしくはそれ以上超は、いずれのグレードのCRSもまたはいずれのグレードの神経毒性も示さない。いくつかの態様において、処置された対象の50%以下(例えば処置される対象の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれ以上)は、グレード2よりも高いサイトカイン放出症候群(CRS)および/またはグレード2よりも高い神経毒性を示す。いくつかの態様において、本方法によって処置された対象の少なくとも50% (例えば処置された対象の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれ以上)は、重度の毒性の結果(例えば重度のCRSもしくは重度の神経毒性)を示さず、例えば、グレード3もしくはそれ以上の神経毒性を示さず、および/または重度のCRSを示さず、あるいは細胞の投与1週間、2週間、または1ヶ月以内のような、処置後のある期間内にそうしない。いくつかの態様において、ある種の毒性を決定するために評価されるパラメータは、有害事象(AE)、用量制限毒性(DLT)、CRSおよびNTを含む。
キメラ抗原受容体を発現するT細胞による処置のような、養子T細胞療法の投与は、サイトカイン放出症候群および神経毒性のような毒性作用または結果を誘発しうる。いくつかの例では、そのような作用または結果は、観察された毒性の根底にありうる高レベルの循環血中サイトカインと並行している。
いくつかの局面において、毒性の結果は、サイトカイン放出症候群(CRS)または重度のCRS (sCRS)であるか、それらに関連するか、またはそれらを示す。CRS、例えば、sCRSは、養子T細胞療法および他の生物学的産物の対象への投与後、いくつかの場合に起こりうる。Davila et al., Sci Transl Med 6, 224ra25 (2014); Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38 (2013); Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368, 1509-1518 (2013); およびKochenderfer et al., Blood 119, 2709-2720 (2012); Xu et al., Cancer Letters 343 (2014) 172-78を参照されたい。
典型的には、CRSは、例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、および/またはマクロファージによって媒介される過剰な全身性免疫応答によって引き起こされる。そのような細胞は、サイトカインおよびケモカインのような炎症性メディエータを大量に放出しうる。サイトカインは、急性の炎症応答を引き起こし、および/または内皮臓器の損傷を誘発しうるが、その結果、微小血管漏出、心不全、または死を引き起こすことがある。重篤な、生命を脅かすCRSは、肺浸潤および肺損傷、腎不全、または播種性血管内凝固につながりうる。他の重篤な、生命を脅かす毒性は、心臓毒性、呼吸困難、神経学的毒性および/または肝不全を含むことができる。
CRSは、抗IL-6療法、例えば抗IL-6抗体、例えばトシリズマブ、または抗生物質もしくは記述されている他の作用物質のような抗炎症療法を用いて処置されうる。CRSの結果、徴候および症状は公知であり、本明細書において記述されているものを含む。いくつかの態様において、特定の投与計画または投与が所与のCRS関連の結果、徴候、または症状に影響を与えるかまたは影響を与えない場合、特定の結果、徴候、および症状ならびに/またはその量もしくは程度が特定されうる。
CARを発現する細胞を投与する状況において、CRSは通常、CARを発現する細胞の注入後6〜20日で起こる。Xu et al., Cancer Letters 343 (2014) 172-78を参照されたい。場合によっては、CAR T細胞注入後、CRSは6日未満または20日超、起こる。CRSの発生率およびタイミングは、注入時のベースラインのサイトカインレベルまたは腫瘍量に関連しうる。一般に、CRSは、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、および/またはインターロイキン(IL)-2の血清レベルの上昇を伴う。CRSで急速に誘発されうる他のサイトカインは、IL-1β、IL-6、IL-8、およびIL-10である。
CRSに関連する例示的な結果には、発熱、硬直、悪寒、低血圧、呼吸困難、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脳症、ALT/AST上昇、腎不全、心疾患、低酸素症、神経障害、および死が含まれる。神経学的合併症には、せん妄、発作様の動作、混乱、喚語困難、失語症、および/または鈍くなることが含まれる。他のCRS関連の結果には、疲労、吐き気、頭痛、発作、頻脈、筋肉痛、発疹、急性血管漏出症候群、肝機能障害、および腎不全が含まれる。いくつかの局面において、CRSは、血清フェリチン、d-二量体、アミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびトリグリセリドのような1つまたは複数の因子の増加に関連し、または低フィブリノゲン血症もしくは肝脾腫大症に関連する。
どの患者がsCRSを発症するリスクがある可能性が最も高いかを予測するために、CRSの発症と相関すると思われるCRS基準が開発された(Davilla et al. Science translational medicine. 2014;6(224):224ra25を参照のこと)。要因には、発熱、低酸素症、低血圧、神経学的変化、処置により誘発される重症が処置前の腫瘍量およびsCRS症状の両方とよく相関しうる、7種のサイトカイン(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、フラクタルカイン、およびGM-CSFなど)のセットのような、炎症性サイトカインの血清レベルの上昇が含まれる。CRSの診断および管理に関する他のガイドラインは公知である(例えば、Lee et al, Blood. 2014;124(2):188-95を参照のこと)。いくつかの態様において、CRSグレードを反映する基準は、以下の表2に詳述されるものである。
（表２）CRSの例示的なグレーディング基準
いくつかの態様において、CRSグレードを反映する基準は、以下の表3に詳述されるものである。
（表３）CRSの例示的なグレーディング基準
いくつかの態様において、投与後、対象が以下を呈する場合、対象は細胞療法の投与またはその細胞の投薬に応答してまたはそれらに続いて「重度のCRS」(「sCRS」)を発症するとみなされる: (1) 少なくとも3日間の少なくとも38℃の発熱; (2) (a) 投与直後のレベルと比較して以下7つのサイトカインの群: インターフェロンガンマ(IFNγ)、GM-CSF、IL -6、IL-10、Flt-3L、フラクタルカインおよびIL-5の少なくとも2つについて少なくとも75の最大倍変化および/または(b) 投与直後のレベルと比較して以下7つのサイトカインの群: インターフェロンガンマ(IFNγ)、GM-CSF、IL -6、IL-10、Flt-3L、フラクタルカインおよびIL-5の少なくとも1つについて少なくとも250の最大倍変化; ならびに(c) 低血圧(少なくとも1つの静脈血管作動性昇圧薬を要する)もしくは低酸素症(PO2 < 90%)または1つもしくは複数の神経障害(精神状態の変化、鈍麻および/もしくは発作)のような毒性の少なくとも1つの臨床徴候のいずれかを含むサイトカイン上昇。いくつかの態様において、重度のCRSは、表2または表3に記載されているような、3またはそれ以上のグレードを有するCRSを含む。
いくつかの態様において、グレード4またはそれ以上のような、重度のCRSまたはグレード3のCRSもしくはそれ以上に関連する結果は、以下の1つまたは複数を含む: 2日もしくはそれ以上、例えば3日もしくはそれ以上、例えば4日もしくはそれ以上の日数の間または少なくとも連続3日間の、持続性発熱、例えば特定の温度の、例えばおよそ38℃超の、発熱; およそ38℃超の発熱; 少なくとも2つのサイトカイン(例えば、インターフェロンガンマ(IFNγ)、GM-CSF、IL -6、IL-10、Flt-3L、フラクタルカインおよびIL-5、ならびに/または腫瘍壊死因子α(TNFα)からなる群の少なくとも2つ)の処置前のレベルと比較して、例えば少なくともおよそ75の、最大倍変化のような、サイトカインの上昇、または例えばそのようなサイトカインの少なくとも1つの少なくともおよそ250の、最大倍変化; ならびに/あるいは低血圧(例えば、少なくとも1つの静脈血管作動性昇圧薬によって測定される); 低酸素症(例えば、およそ90%未満の血漿酸素(PO2)レベル); および/または1つもしくは複数の神経障害(精神状態の変化、鈍麻および発作を含む)のような、毒性の少なくとも1つの臨床徴候。いくつかの態様において、重度のCRSは、集中治療室(ICU)での管理またはケアを要するCRSを含む。
いくつかの態様において、重度のCRSのような、CRSは、(1) 持続性発熱(少なくとも3日間の少なくとも38℃の発熱)および(2) 少なくともおよそ20 mg/dLのCRP血清レベルの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、CRSは、2つまたはそれ以上の昇圧薬の使用を要する低血圧または機械的換気を要する呼吸不全を包含する。いくつかの態様において、昇圧薬の投与量は、2回目またはその後の投与で増やされる。
いくつかの態様において、重度のCRSまたはグレード3のCRSは、アラニンアミノトランスフェラーゼの増加、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加、悪寒、発熱性好中球減少症、頭痛、左心室機能不全、脳症、水頭症、および/または振戦を包含する。
さまざまな結果を測定または検出する方法が指定されうる。
いくつかの局面において、毒性の結果は神経毒性であるか、または神経毒性と関連している。いくつかの態様において、神経毒性の臨床リスクに関連する症状には、錯乱、せん妄、表出性失語症、鈍麻、ミオクローヌス、昏睡、精神状態の変化、けいれん、発作様の動作、発作(任意で脳波図[EEG]により確認される)、βアミロイド(Aβ)のレベル上昇、グルタミン酸のレベル上昇、および酸素ラジカルのレベル上昇が含まれる。いくつかの態様において、神経毒性は、重症度に基づいて等級付けされる(例えば、グレード1〜5のスケールを用いる(例えば、Guido Cavaletti & Paola Marmiroli Nature Reviews Neurology 6, 657-666 (December 2010); National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria version 4.03 (NCI-CTCAE v4.03)を参照のこと)。
場合によっては、神経学的症状がsCRSの最も初期の症状でありうる。いくつかの態様において、神経学的症状は、細胞療法注入の5〜7日後に始まるのを見られる。いくつかの態様において、神経学的変化の持続時間は、3〜19日の範囲でありうる。場合によっては、sCRSの他の症状が解消した後に神経学的変化の回復が起こる。いくつかの態様において、神経学的変化の解消の時間または程度は、抗IL-6および/またはステロイドを用いた処置によって加速されない。
いくつかの態様において、投与後、以下: 1) 末梢運動神経の炎症もしくは変性を含む、末梢運動神経障害の症状; 2) 末梢感覚神経の炎症もしくは変性を含む、末梢感覚神経障害の症状、異常および不快感をもたらす、感覚知覚の歪みのような、感覚異常、神経もしくは神経の群に沿った激しい痛い感覚のような、神経痛、ならびに/または刺激なしでもチクチク感、しびれ感、圧迫感、冷たさおよび暖かさの異常な皮膚感覚をもたらす感覚ニューロンの機能障害のような、知覚異常の中からのセルフケア(例えば、入浴、着衣および脱衣、給餌、トイレの使用、薬の服用)を制限する症状を対象が呈する場合に、対象は細胞療法の投与またはその細胞の投薬に応答してまたはそれらに続いて「重度の神経毒性」を発症するとみなされる。いくつかの態様において、重度の神経毒性には、表4に記載されているような、3またはそれ以上のグレードを有する神経毒性が含まれる。
（表４）神経毒性の例示的なグレーディング基準
いくつかの態様において、本方法は、他の方法と比較してCRSまたは神経毒性に関連する症状を低減する。いくつかの局面において、提供される方法は、他の方法と比較して、重度のCRSまたはグレード3もしくはそれ以上のCRSに関連する症状、結果または因子を含む、CRSに関連する症状、結果または因子を低減する。例えば、本発明の方法によって処置された対象は、記述されている、例えば表2または表3に記載されているいずれかのような、CRS、例えば重度のCRSまたはグレード3もしくはそれ以上のCRSの症状、結果または因子を検出できないか、および/または低減しうる。いくつかの態様において、本発明の方法によって処置された対象は、他の方法によって処置された対象と比較して、四肢の衰弱もしくはしびれ、記憶力、視力および/もしくは知力の喪失、制御不能な強迫行動および/もしくは強制行動、妄想、頭痛、運動制御の喪失、認知力低下、および自律神経系機能障害、ならびに性機能障害を含む認知および行動の問題のような、神経特性の症状を低減しうる。いくつかの態様において、本発明の方法によって処置された対象は、末梢運動神経障害、末梢感覚神経障害、感覚異常、神経痛または知覚障害に関連する症状を低減しうる。
いくつかの態様において、提供される方法によって産生される細胞を投与することで、ニューロンの死のような、神経系および/または脳への損傷を含む神経毒性に関連する結果が低減される。いくつかの局面において、本方法は、βアミロイド(Aβ)、グルタミン酸、および酸素ラジカルのような神経毒性に関連する因子のレベルを低減する。
いくつかの態様において、毒性を標的とする治療法のような、毒性を処置するための1つまたは複数の介入または作用物質は、対象は、例えば、前述の態様のいずれかによって測定されるように、持続性発熱を示すと決定または確認された(例えば最初に決定または確認された)時点または直後に投与される。いくつかの態様において、1つまたは複数の毒性を標的とする治療法は、そのような確認または決定のある時間内に、例えばその30分、1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、または8時間以内に投与される。
V. 組成物および配合物
本明細書において提供される方法によって産生された組み換え受容体を発現する操作された細胞を含有する組成物および配合物も提供される。いくつかの態様において、組成物および配合物は、本明細書において、例えばI項において記述される方法によって産生された、細胞の組成物または用量のような、細胞を含有する。いくつかの態様において、組成物および配合物は、細胞のアウトプット組成物、および任意で使用のための説明書、例えば、本明細書において、例えばIII項において記述される方法によるような、操作された細胞を対象に投与するための説明書であるか、またはそれらを含む。
本明細書において提供される方法によって産生された組み換え受容体を発現する操作された細胞を含有する組成物および配合物も提供される。いくつかの態様において、組成物および配合物は、本明細書において、例えばI項において記述される方法によって産生された、細胞の組成物または用量のような、細胞を含有する。いくつかの態様において、組成物および配合物は、細胞のアウトプット組成物、および任意で使用のための説明書、例えば、本明細書において、例えばIII項において記述される方法によるような、操作された細胞を対象に投与するための説明書であるか、またはそれらを含む。
いくつかの態様において、組み換え抗原受容体、例えばCARまたはTCRで操作された細胞を含む細胞の用量は、薬学的組成物または配合物のような、組成物または配合物として提供される。ある種の態様において、用量は、I-G項におけるような、本明細書において記述されるアウトプット組成物の細胞を含有する。特定の態様において、用量は、本明細書において、例えばI項に記述された方法によって産生された細胞を含有する。そのような組成物は、例えば疾患、状態および障害の予防もしくは処置で、検出、診断および予後診断の方法で、提供される方法、および/または提供される製造物品もしくは組成物によって用いることができる。
「薬学的配合物」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態にあり、かつ配合物が投与された対象にとって許容されないほど有毒であるさらなる構成成分を含有しない調製物をいう。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒性である、活性成分以外の、薬学的配合物中の成分をいう。薬学的に許容される担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料を含むが、これらに限定されることはない。
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には特定の細胞もしくは作用物質によって、および/または投与方法によって決定される。したがって、種々の適当な配合物が存在する。例えば、薬学的組成物は保存料を含みうる。適当な保存料としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられうる。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の保存料の混合物が用いられる。保存料またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.0001重量%から約2重量%の量で存在する。担体は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記述されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、以下のものが含まれるが、これらに限定されることはない: リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存料(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾールなど); 低分子量(約10残基未満)ポリペプチド; 血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質; ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体; グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸; 単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物; EDTAなどのキレート剤; スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類; ナトリウムなどの塩形成対イオン; 金属錯体(例えばZn-タンパク質錯体); ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン界面活性剤。
いくつかの局面において緩衝剤が組成物に含まれる。適当な緩衝剤としては、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他のさまざまな酸および塩が挙げられる。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.001重量%〜約4重量%の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)においてより詳細に記述されている。
配合物または組成物はまた、各活性が互いに悪影響を及ぼさない、細胞または作用物質で予防または処置される特定の適応症、疾患、または状態に有用な2つ以上の活性成分を含有しうる。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適当に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどのような、他の薬学的に活性な作用物質または薬物をさらに含む。いくつかの態様において、作用物質または細胞は、塩、例えば薬学的に許容される塩の形態で投与される。適当な薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸のような鉱酸、ならびに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸およびアリールスルホン酸、例えばp-トルエンスルホン酸のような有機酸に由来するものを含む。
いくつかの態様における薬学的組成物は、治療的に有効な量または予防的に有効な量のような、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量で作用物質または細胞を含有する。いくつかの態様における治療的または予防的有効性は、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。数日またはそれ以上の反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで処置が繰り返される。しかしながら、他の投与計画が有用でありえ、決定することができる。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の連続注入投与によって送達することができる。
作用物質または細胞は、任意の適当な手段により、例えば、ボーラス注入により、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下(subconjectval)注射、結膜下(subconjuntival)注射、テノン嚢下注射、球後注射、球周囲注射、または後強膜近傍送達により投与することができる。いくつかの態様において、それらは、非経口、肺内、および鼻腔内投与、ならびに局所処置が望ましい場合、病変内投与により投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。いくつかの態様において、所与の用量は、細胞または作用物質の単回ボーラス投与により投与される。いくつかの態様において、それは、例えば3日以下の期間にわたる、細胞もしくは作用物質の複数回ボーラス投与により、または細胞もしくは作用物質の連続注入投与により投与される。
疾患の予防または処置の場合、適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、作用物質のタイプ、細胞または組み換え受容体のタイプ、疾患の重症度および経過、作用物質または細胞が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、対象の病歴および作用物質または細胞に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存しうる。組成物は、いくつかの態様において、一度にまたは一連の処置にわたって対象に適当に投与される。
細胞または作用物質は、標準的な投与技法、配合、および/または装置を用いて投与されうる。組成物の貯蔵および投与のための、シリンジおよびバイアルのような、配合物および装置が提供される。細胞に関して、投与は自家または異種であることができる。例えば、免疫応答性細胞または前駆細胞を、1つの対象から得て、同じ対象または異なる適合性の対象に投与することができる。末梢血由来の免疫応答性細胞またはそれらの子孫(例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来)を、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射によって投与することができる。治療用組成物(例えば、遺伝子改変された免疫応答性細胞または神経毒性の症状を処置もしくは改善する作用物質を含有する薬学的組成物)を投与する場合、それは一般に、単位用量の注射可能な形態(溶液、懸濁液、乳濁液)で配合されよう。
配合物には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔、舌下、または坐薬投与のためのものが含まれる。いくつかの態様において、作用物質または細胞集団は非経口的に投与される。本明細書において用いられる「非経口」という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、および腹腔内投与が含まれる。いくつかの態様において、作用物質または細胞集団は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達(peripheral systemic delivery)を用いて対象に投与される。
いくつかの態様において組成物は、いくつかの局面では、選択されたpHに緩衝されうる、滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供される。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射により、投与するのが幾分便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘性の範囲内で配合することができる。液体または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であることができる。
滅菌注射溶液は、適当な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物などの溶媒中に作用物質または細胞を組み込むことによって調製することができる。
インビボ投与に用いられる配合物は一般に無菌である。無菌性は、例えば、無菌ろ過膜によるろ過により、容易に達成されうる。
VI. 製造物品およびキット
本明細書において提供される方法によって産生された組み換え受容体を発現する操作された細胞を含む製造物品およびキットも提供される。いくつかの態様において、製造物品は、本明細書において、例えばI項において記述される方法によって産生された、細胞の組成物または用量のような、細胞を含有する。いくつかの態様において、キットおよび/または製造物品は、細胞のアウトプット組成物、および任意で使用のための説明書、例えば、本明細書において、例えばIII項において記述される方法によるような、操作された細胞を対象に投与するための説明書であるか、またはそれらを含む。
本明細書において提供される方法によって産生された組み換え受容体を発現する操作された細胞を含む製造物品およびキットも提供される。いくつかの態様において、製造物品は、本明細書において、例えばI項において記述される方法によって産生された、細胞の組成物または用量のような、細胞を含有する。いくつかの態様において、キットおよび/または製造物品は、細胞のアウトプット組成物、および任意で使用のための説明書、例えば、本明細書において、例えばIII項において記述される方法によるような、操作された細胞を対象に投与するための説明書であるか、またはそれらを含む。
いくつかの態様において、本明細書において記述される操作された細胞のいずれかの治療的有効量を含む組成物および疾患または状態を処置するために対象に投与するための説明書を含む製造物品および/またはキットが本明細書において提供される。いくつかの態様において、説明書は、本明細書において提供される細胞を投与するための方法の要素の一部または全部を指定することができる。いくつかの態様において、説明書は、細胞療法のための細胞の投与のための特定の説明書、例えば、投与のための用量、タイミング、対象の選択および/または識別ならびに投与のための条件を指定する。いくつかの態様において、製造物品および/またはキットは、リンパ球除去療法のための作用物質をさらに含み、任意でリンパ球除去療法を投与するための説明書をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、説明書は、投与のための組成物に付随するラベルまたは添付文書として含めることができる。
いくつかの態様において、製造物品は、組み換え受容体を発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含有する組成物を含有する、容器、任意でバイアルを有してもよい。いくつかの態様において、製造物品またはキットは、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1のCD4+ T細胞とCD8+ T細胞との比率を有する細胞の組成物を含有する。いくつかの態様において、細胞の組成物は、3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1,1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3または約3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1,1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3のCD4+ T細胞とCD8+ T細胞との比率を有する。特定の態様において、製造物品またはキットは、3:1〜1:3、2.5:1〜1:2.5、2:1〜1:2、1.5:1〜1:1.5、1.4:1〜1:1.4、1.3:1〜1:1.3、1.2:1〜1:1.2、または1.1:1〜1:1.1の、組み換え受容体、例えばCARを発現するCD4+ T細胞と、組み換え受容体、例えばCARを発現するCD8+ T細胞との比率を有する細胞の組成物を含有する。いくつかの態様において、細胞の組成物は、3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3または約3:1、2.8:1、2.5:1、2.25:1、2:1、1.8:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.8、1:3の、組み換え受容体、例えばCARを発現するCD4+ T細胞と、組み換え受容体、例えばCARを発現するCD8+ T細胞との比率を有する。
いくつかの態様において、説明書は、投与される細胞の用量を指定する。例えば、いくつかの態様において、説明書で指定された用量は、例えば、およそ1×106〜およそ3×108個の全組み換え受容体(例えばCAR)発現細胞、例えば、およそ1×107〜およそ2×108個の範囲内のそのような細胞、例えばおよそ1×107、5×107、1×108または1.5×108個、または前記の値のいずれか2つの間の範囲のそのような全細胞を含む。いくつかの態様において、患者に複数回用量が投与され、各用量または全用量は、前記の値のいずれか内であることができる。
いくつかの態様において、バイアルのような容器は、10×106個超またはおよそ10×106個超のT細胞または組み換え受容体発現T細胞、15×106個超またはおよそ15×106個超のT細胞または組み換え受容体発現T細胞、25×106個超またはおよそ25×106個超のT細胞または組み換え受容体発現T細胞を含む。いくつかの局面において、バイアルは、1 mLあたりおよそ1000万個の細胞〜1 mLあたりおよそ7000万個の細胞、1 mLあたりおよそ1000万個の細胞〜1 mLあたりおよそ5000万個の細胞、1 mLあたりおよそ1000万個の細胞〜1 mLあたりおよそ2500万個の細胞、1 mLあたりおよそ1000万個の細胞〜1 mLあたりおよそ1500万個の細胞、1 mLあたり1500万個の細胞〜1 mLあたりおよそ7000万個の細胞、1 mLあたりおよそ1500万個の細胞〜1 mLあたりおよそ5000万個の細胞、1 mLあたりおよそ1500万個の細胞〜1 mLあたりおよそ2500万個の細胞、1 mLあたりおよそ2500万個の細胞〜1 mLあたりおよそ7000万個の細胞、1 mLあたりおよそ2500万個の細胞〜1 mLあたりおよそ5000万個の細胞、および1 mLあたりおよそ5000万個の細胞〜1 mLあたりおよそ7000万個の細胞を含む。
いくつかの態様において、投与のために指定された複数のバイアルまたは複数の細胞または細胞の単位用量は、集合的に、各境界を含めて、1×105〜5×108もしくは約1×105〜約5×108個の全組み換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、1×105〜1×109もしくは1×105〜約1×109個の全組み換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、5×105〜1×109もしくは約5×105〜約1×109個の全組み換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または1×106〜1×1010もしくは約1×106〜約1×1010個の全組み換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞を含む細胞の用量を含む。いくつかの局面において、物品は、CD4+およびCD8+ T細胞の1つまたは複数の単位用量またはCD4+受容体+ T細胞およびCD8+受容体+ T細胞の1つまたは複数の単位用量を含み、ここで単位用量は、およそ1×107〜およそ2×108個の組み換え受容体発現T細胞、およそ5×107〜およそ1.5×108個の組み換え受容体発現T細胞、およそ5×107個の組み換え受容体発現T細胞、およそ1×108個の組み換え受容体発現T細胞、またはおよそ1.5×108個の組み換え受容体発現T細胞を含み、任意によりここで物品中の情報は、1つもしくは複数の単位用量および/またはそのような1つもしくは複数の単位用量に対応する容量の投与を指定する。
いくつかの態様において、説明書は、投与計画および投与のタイミングを指定することができる。例えば、いくつかの態様において、説明書は、対象に細胞の複数回用量、例えば2回またはそれ以上の用量を投与することを指定することができる。いくつかの態様において、説明書は、複数回用量のタイミング、例えば、第2の用量は第1の用量からおよそ4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくは21日後に投与されることを指定する; および/または各用量における投与量を指定する。
いくつかの態様において、説明書は、細胞の用量もしくは数または細胞型および/あるいは細胞型、例えば、個々の集団またはサブタイプの比率、例えばCD4+ 対 CD8+の比率を指定する。いくつかの態様において、細胞の集団またはサブタイプ、例えばCD8+およびCD4+ T細胞。例えば、いくつかの態様において、説明書は、およそ5:1〜およそ5:1 (もしくは約1:5超および約5:1未満)、またはおよそ1:3〜およそ3:1 (もしくは約1:3超および約3:1未満)、例えばおよそ2:1〜およそ1:5 (もしくは約1:5超および約2:1未満、例えばおよそ5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9: 1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、または1:5の、複数の細胞集団またはサブタイプ、例えばCD4+およびCD8+ T細胞またはサブタイプのアウトプット比の許容範囲でまたは許容範囲内で細胞が投与されることを指定する。ある種の態様において、説明書は、濃縮CD4+ T細胞および濃縮CD8+ T細胞の組成物が所望の比率で組み合わされ、単一細胞組成物として対象に投与されることを指定する。特定の態様において、説明書は、濃縮CD4+ T細胞および濃縮CD8+ T細胞の組成物が所望の比率で別個の組成物として投与されることを指定する。いくつかの局面において、許容される差異は、所望の比率の約1%、約2%、約3%、約4%約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%内であり、これらの範囲内の任意の値を含む。
VII. 定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語、表記、ならびに他の技術用語および科学用語または用語法は全て、特許請求される主題が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語を、明確にするためにおよび／またはすぐに参照できるように本明細書において定義するが、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野において一般に理解されているものとの実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語、表記、ならびに他の技術用語および科学用語または用語法は全て、特許請求される主題が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語を、明確にするためにおよび／またはすぐに参照できるように本明細書において定義するが、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野において一般に理解されているものとの実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
本明細書で用いられる場合、単数形「1つの (a)」、「1つの (an)」、および「その」は、特に文脈によって明白に指示されていない限り、その対象物の複数形も含む。例えば、「1つの (a)」または「1つの (an)」は、「少なくとも1つの」または「1つまたは複数の」を意味する。本明細書に記載される局面および変形は、局面および変形「からなる」ならびに／または局面および変形「から本質的になる」を含むと理解される。
本開示を通して、特許請求される主題の様々な局面は、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔化のためであり、特許請求される主題の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきでないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を全て具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、ある値域が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値、およびその規定範囲内の任意の他の規定値または介在値が、特許請求される主題内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、独立的にそのより小さな範囲内に含まれてよく、これらもまた、規定範囲における任意の具体的に除外される限界値に従って、特許請求される主題内に包含される。規定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それら含まれた限界値の一方または両方を除外する範囲もまた、特許請求される主題内に含まれる。このことは、範囲の幅とは無関係に適用される。
本明細書で用いられる「約」という用語は、当業者にとっては明白な、各値に関する通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそのものに向けられた態様を含む（および記載する）。例えば、「約X」に言及する記載は「X」の記載を含む。
本明細書で使用する場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が、配列表に示されるような開示された配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置に「対応する」という記載は、GAPアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムを用いて同一性を最大化するように開示された配列とアラインメントさせたときに同定される、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置を指す。配列同士をアラインメントさせることにより、当業者は、例えば保存された同一のアミノ酸残基をガイドとして用いて、対応する残基を同定することができる。一般的に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最上位のマッチが得られるようにアラインメントされる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G.編, Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を参照されたい）。
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。本用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。ベクターには、ウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクターといったレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターなどが含まれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞には「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これには初代形質転換細胞、および継代数に関係なくそれらに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の内容が親細胞と完全に一致していなくてもよく、変異を含有してもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書に含まれる。
本明細書で用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定マーカーに関して「陽性」であるという記述は、特定マーカー、典型的には表面マーカーが、細胞上または細胞中に検出可能な程度に存在することを指す。表面マーカーに言及する場合、本用語は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体で染色し該抗体を検出することによって、検出される表面発現の存在を指し、この場合、染色は、アイソタイプ一致対照を他の点では同一の条件下で用いて同じ手順を行って検出される染色を実質的に上回るレベルで、および／またはそのマーカーに関して陽性であることが公知である細胞のレベルと実質的に類似するレベルで、および／またはそのマーカーに関して陰性であることが公知である細胞のレベルよりも実質的に高いレベルで、フローサイトメトリーによって検出可能である。
本明細書で用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定マーカーに関して「陰性」であるという記述は、特定マーカー、典型的には表面マーカーが、細胞上または細胞中に実質的に検出可能な程度に存在しないことを指す。表面マーカーに言及する場合、本用語は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体で染色し該抗体を検出することによって、検出される表面発現の非存在を指し、この場合、染色は、アイソタイプ一致対照を他の点では同一の条件下で用いて同じ手順を行って検出される染色を実質的に上回るレベルで、および／またはそのマーカーに関して陽性であることが公知である細胞のレベルよりも実質的に低いレベルで、および／またはそのマーカーに関して陰性であることが公知である細胞のレベルと比較して実質的に類似するレベルで、フローサイトメトリーによって検出されない。
本明細書で使用する場合、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して使用するときの「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「同一性パーセント」とは、配列をアラインメントさせて、必要に応じて、最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部とみなさないで、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列（例えば、対象の抗体またはフラグメント）のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当業者の技能の範囲内にある様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR社）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含めて、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸の置換は、ポリペプチド中のあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを含む。置換は、保存的アミノ酸置換であっても、非保存的アミノ酸置換であってもよい。アミノ酸の置換は、対象となる結合分子（例えば抗体）に導入されるか、または所望の活性（例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下、またはADCCもしくはCDCの改善）についてスクリーニングされる産物に導入することができる。
アミノ酸は一般に、次の共通の側鎖特性に従ってグループに分けることができる：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖の向きに影響を与える残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖の向きに影響を与える残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
いくつかの態様では、保存的置換には、これらのクラスのうちのあるクラスのメンバーを同じクラスの別のメンバーと交換することが含まれる。いくつかの態様では、非保存的アミノ酸置換には、これらのクラスのうちのあるクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することが含まれる。
本明細書で使用する場合、組成物は、細胞を含めて、2つ以上の産物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書で使用する場合、「対象」は、哺乳動物、例えばヒトまたは他の動物であり、典型的にはヒトである。
他に定義されていない限り、本明細書において用いられる、技術分野の全ての用語、表記、ならびに他の技術的および科学的な用語または専門用語は、主張される対象物が関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することを意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確さのためにおよび/または容易な参照のために本明細書において定義され、かつ本明細書におけるそのような定義の内包は、必ずしも、当技術分野において一般的に理解されるものと比較した実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。
VIII. 例示的態様
提供される態様には以下が含まれる：
1.
（a）CD4＋T細胞の組成物とCD8＋T細胞の組成物とを、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比で組み合わせ、それにより、インプット組成物を生成する工程、
（b）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程であって、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、工程
を含み、
インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、
操作された細胞の組成物を製造する方法。
2.
インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞が、対象から得られた初代試料から濃縮または選択され、任意で、インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞が、対象から得られた初代試料から別々に濃縮または選択される、請求項1の方法。
3.
CD4＋T細胞の組成物が、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD4＋T細胞を含む、請求項1または請求項2の方法。
4.
CD8＋T細胞の組成物が、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD8＋T細胞を含む、請求項1または2の方法。
5.
刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程
を含み、
インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、
刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、
操作された細胞の組成物を製造する方法。
6.
インキュベーションが無血清培地中で行われる、請求項1〜5のいずれかの方法。
7.
インプット組成物が、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の細胞を含む、請求項1〜6のいずれかの方法。
8.
インプット組成物が、100×106〜500×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項1〜7のいずれかの方法。
9.
インプット組成物が、300×106個または約300×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項1〜8のいずれかの方法。
10.
総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生存細胞である、請求項9の方法。
11.
インプット組成物が、1×106細胞/mL〜5×106細胞/mLの濃度を有する、請求項1〜10のいずれかの方法。
12.
インプット組成物が、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの濃度を有する、請求項1〜11のいずれかの方法。
13.
インプット組成物が、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜12のいずれかの方法。
14.
インプット組成物が、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜13のいずれかの方法。
15.
インプット組成物が、1:1または約1:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜14のいずれかの方法。
16.
インプット組成物が、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む、請求項1〜15のいずれかの方法。
17.
CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.1:1または約1.1:1である、請求項16の方法。
18.
インプット組成物が、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、請求項1〜17のいずれかの方法。
19.
CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.69:1または約1.69:1である、請求項18の方法。
20.
インプット組成物が、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を、任意で2.0:1〜1.5:1の比で含む、請求項1〜19のいずれかの方法。
21.
刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む作用物質とを接触させることを含む、工程
をさらに含む、請求項1〜20のいずれかの方法。
22.
接触が、ベクターを用いたトランスフェクションによる接触であり、ベクターが、トランスポゾン、任意でスリーピングビューティー（SB）トランスポゾンまたはピギーバックトランスポゾンであるか、
接触が、ウイルスベクターを用いた形質導入による接触である、
請求項21の方法。
23.
刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することを含む、工程
をさらに含む、請求項1〜22のいずれかの方法。
24.
導入が無血清培地中で行われる、請求項21〜23のいずれかの方法。
25.
導入のために、刺激された組成物が300×106個未満の細胞を含む、態様21〜24のいずれかの方法。
26.
導入のために、刺激された組成物が50×106個の細胞〜200×106個の細胞を含む、態様21〜25のいずれかの方法。
27.
導入のために、刺激された組成物が約100×106個の細胞を含む、態様21〜26のいずれかの方法。
28.
導入のために、刺激された組成物が3×106細胞/mL未満の濃度を有する、態様21〜27のいずれかの方法。
29.
導入のために、刺激された組成物が0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mLの濃度を有する、態様21〜28のいずれかの方法。
30.
導入のために、刺激された組成物が1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する、態様21〜29のいずれかの方法。
31.
刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する工程を含む、態様21〜30のいずれかの方法。
32.
刺激された組成物の細胞が生存細胞である、態様21〜32のいずれかの方法。
33.
操作された細胞の組成物を製造する方法であって、T細胞組成物の細胞に組換え受容体を導入する工程を含み、T細胞組成物が、1mL当たり少なくとも1×106個または少なくとも約1×106個の生存細胞の濃度を有し、T細胞組成物の細胞の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％が、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である、前記方法。
34.
T細胞組成物の濃度が、1mL当たり5×106個未満の生存細胞である、態様33の方法。
35.
T細胞組成物が、少なくとも100×106個または少なくとも約100×106個または約100×106個の生存細胞を含む、態様33または34のいずれかの方法。
36.
T細胞組成物が、300×106個未満の生存細胞を含む、態様33〜35のいずれかの方法。
37.
導入が、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することによってT細胞に接触させることを含む、態様33〜36のいずれかの方法。
38.
導入が無血清培地中で行われる、態様33〜37のいずれかの方法。
39.
T細胞組成物の1つまたは複数の細胞が、活性化され、かつ/またはLDL受容体の表面発現を含む、態様33〜38のいずれかの方法。
40.
前記細胞組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％が、
（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、
（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、
（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または
（iv）増殖することができる、
態様33〜39のいずれかの方法。
41.
導入前に、前記組成物の細胞が、刺激条件下でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程を含むプロセスによって生成され、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、態様33〜40のいずれかの方法。
42.
インキュベーションが無血清培地中で行われる、態様41の方法。
43.
以下の工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法：
（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程であって、
インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、
刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、
工程、ならびに
（b）刺激された組成物の300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターとを接触させることを含む、工程。
44.
インキュベーションおよび/または導入が無血清培地中で行われる、態様43のいずれかの方法。
45.
CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生存細胞である、態様43または44のいずれかの方法。
46.
刺激された組成物からの細胞が生存細胞である、態様44のいずれかの方法。
47.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後2日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後2日以内に、導入が開始される、態様33〜46のいずれかの方法。
48.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後36時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後36時間以内に、導入が開始される、態様33〜47のいずれかの方法。
49.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後30時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後30時間以内に、導入が開始される、態様33〜48のいずれかの方法。
50.
操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養し、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を製造する工程
をさらに含む、態様33〜49のいずれかの方法。
51.
培養が無血清培地中で行われる、態様50の方法。
52.
以下の工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法：
（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートする工程であって、それにより、刺激された組成物が生成され、インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、工程、
（b）刺激された組成物からの300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入する工程であって、それにより、操作された細胞組成物が生成され、導入が、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することを含む、工程、ならびに
（c）操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養する工程であって、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物が製造される、工程。
53.
インキュベーション工程、導入工程および/または培養工程が、無血清培地中で行われる、態様52の方法。
54.
インプット組成物が、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、任意で1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する、態様41〜53のいずれかの方法。
55.
インプット組成物が、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む、態様41〜54のいずれかの方法。
56.
CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.1:1または約1.1:1である、態様55の方法。
57.
インプット組成物が、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、態様41〜56のいずれかの方法。
58.
CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.69:1または約1.69:1である、態様57の方法。
59.
インプット組成物が、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、態様41〜58のいずれかの方法。
60.
導入のために、刺激された組成物が300×106個未満の細胞を含む、態様43〜59のいずれかの方法。
61.
導入のために、刺激された組成物が50×106個〜200×106個の細胞、任意で100×106個または約100×106個の細胞を含む、態様43〜60のいずれかの方法。
62.
導入のために、刺激された組成物が3×106細胞/mL未満の濃度を有する、態様43〜61のいずれかの方法。
63.
導入のために、刺激された組成物が0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mL、任意で1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する、態様43〜62のいずれかの方法。
64.
刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する、態様43〜63のいずれかの方法。
65.
インキュベーションが、1つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる、請求項1〜64のいずれかの方法。
66.
1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、請求項65の方法。
67.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項66の方法。
68.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項66または67の方法。
69.
刺激された組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％が、
（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、
（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、
（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または
（iv）増殖することができる、
態様1〜68のいずれかの方法。
70.
刺激試薬が、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する主剤を含み、該主剤は任意でCD3に特異的に結合する、態様1〜69のいずれかの方法。
71.
刺激試薬が、T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤をさらに含み、任意で、該共刺激分子が、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される、態様70の方法。
72.
主剤および/または副剤が抗体を含み、任意で、刺激試薬が、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはその抗原結合断片とのインキュベーションを構成する、態様70または態様71の方法。
73.
主剤および/または副剤が固体支持体の表面上に存在する、態様71〜72のいずれかの方法。
74.
固体支持体がビーズであるかビーズを含む、態様73の方法。
75.
ビーズが、3.5μmを超えるか約3.5μmを超えるが約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を有する、態様74の方法。
76.
ビーズが、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する、態様74または態様75の方法。
77.
ビーズが不活性である、態様74〜76のいずれかの方法。
78.
ビーズがポリスチレン表面であるかポリスチレン表面を含む、態様74〜77のいずれかの方法。
79.
ビーズが磁性または超常磁性である、態様74〜78のいずれかの方法。
80.
ビーズ：細胞の比が3:1未満である、態様74〜79のいずれかの方法。
81.
ビーズ：細胞の比が2:1〜0.5:1または約2:1〜約0.5:1である、態様74〜80のいずれかの方法。
82.
ビーズ：細胞の比が1:1または約1:1である、態様74〜81のいずれかの方法。
83.
インプット組成物が、刺激条件下で48時間未満インキュベートされる、態様1〜82のいずれかの方法。
84.
インプット組成物が、刺激条件下で、12時間以上36時間以下インキュベートされる、態様1〜83のいずれかの方法。
85.
インプット組成物が、刺激条件下で、18時間以上30時間以下インキュベートされる、態様1〜84のいずれかの方法。
86.
インプット組成物が、刺激条件下で、24時間または約24時間インキュベートされる、態様1〜85のいずれかの方法。
87.
接触、任意で形質導入が、48時間未満行われる、態様23〜86のいずれかの方法。
88.
接触、任意で形質導入が、12時間以上36時間以下行われる、態様23〜87のいずれかの方法。
89.
接触、任意で形質導入が、18時間以上30時間以下行われる、態様23〜88のいずれかの方法。
90.
接触、任意で形質導入が、24時間または約24時間行われる、態様23〜89のいずれかの方法。
91.
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様23〜90のいずれかの方法。
92.
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、態様23〜91のいずれかの方法。
93.
接触、任意で形質導入が、形質導入アジュバントの非存在下で行われる、態様23〜92のいずれかの方法。
94.
導入が、1つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる、態様23〜93のいずれかの方法。
95.
1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、態様94の方法。
96.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様94または95の方法。
97.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様94〜96のいずれかの方法。
98.
培養の少なくとも一部が、混合および/または灌流を用いて行われる、態様50〜97のいずれかの方法。
99.
培養の少なくとも一部が、500mL/日、600mL/日、700mL/日、750mL/日、800mL/日、900mL/日、1,000mL/日、1,200mL/日、1,400mL/日、1,500mL/日、1,600mL/日、1,800mL/日および/または2,000mL/日、約500mL/日、約600mL/日、約700mL/日、約750mL/日、約800mL/日、約900mL/日、約1,000mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日、約1,500mL/日、約1,600mL/日、約1,800mL/日および/または約2,000mL/日、あるいは少なくとも500mL/日、少なくとも600mL/日、少なくとも700mL/日、少なくとも750mL/日、少なくとも800mL/日、少なくとも900mL/日、少なくとも1,000mL/日、少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日、少なくとも1,500mL/日、少なくとも1,600mL/日、少なくとも1,800mL/日および/または少なくとも2,000mL/日の速度の灌流を用いて行われる、態様98の方法。
100.
培養の少なくとも第1の部分が、500mL/日、750mL/日もしくは1,000mL/日、約500mL/日、約750mL/日もしくは約1,000mL/日、または少なくとも500mL/日、少なくとも750mL/日もしくは少なくとも1,000mL/日の灌流速度により行われ、培養の少なくとも第2の部分が、1,200mL/日、1,400mL/日もしくは1,500mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日もしくは約1,500mL/日、または少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日もしくは少なくとも1,500mL/日の灌流速度により行われる、態様98または99の方法。
101.
細胞が特定の密度に達すると、灌流が開始されかつ/または増加される、態様98〜100のいずれかの方法。
102.
特定の密度が、0.4×106個の細胞、0.5×106個の細胞、0.6×106個の細胞、0.8×106個の細胞、1.0×106個の細胞、1.2×106個の細胞、1.4×106個の細胞、1.6×106個の細胞、1.8×106個の細胞、2.0×106個の細胞、2.2×106個の細胞もしくは2.4×106個の細胞、約0.4×106個の細胞、約0.5×106個の細胞、約0.6×106個の細胞、約0.8×106個の細胞、約1.0×106個の細胞、約1.2×106個の細胞、約1.4×106個の細胞、約1.6×106個の細胞、約1.8×106個の細胞、約2.0×106個の細胞、約2.2×106個の細胞もしくは約2.4×106個の細胞、または少なくとも0.4×106個の細胞、少なくとも0.5×106個の細胞、少なくとも0.6×106個の細胞、少なくとも0.8×106個の細胞、少なくとも1.0×106個の細胞、少なくとも1.2×106個の細胞、少なくとも1.4×106個の細胞、少なくとも1.6×106個の細胞、少なくとも1.8×106個の細胞、少なくとも2.0×106個の細胞、少なくとも2.2×106個の細胞もしくは少なくとも2.4×106個の細胞である、態様101の方法。
103.
細胞が0.6×106細胞/mLまたは約0.6×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または750mL/日または約750mL/日の速度に増加される、態様98〜102のいずれかの方法。
104.
細胞が2.0×106細胞/mLまたは約2.0×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または1500mL/日もしくは約1500mL/日の速度に増加される、態様98の方法。
105.
培養が、1つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる、態様50〜104のいずれかの方法。
106.
1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、態様105の方法。
107.
1つまたは複数のサイトカインが、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様105または106の方法。
108.
1つまたは複数のサイトカインが、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様105〜107のいずれかの方法。
109.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後3日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後3日以内に、培養が開始される、態様50〜108のいずれかの方法。
110.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後60時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後60時間以内に、培養が開始される、態様50〜109のいずれかの方法。
111.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後48時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後48時間以内に、培養が開始される、態様50〜110のいずれかの方法。
112.
少なくとも組成物が閾値数のT細胞を含むまで、培養が行われる、態様50〜111のいずれかの方法。
113.
T細胞の閾値数に達した後、培養が少なくとも1日間継続される、態様112の方法。
114.
T細胞の閾値数が1200×106個または約1200×106個または少なくとも1200×106個の細胞である、態様113の方法。
115.
T細胞の閾値数が3500×106個または約3500×106個または少なくとも3500×106個の細胞である、態様50〜114のいずれかの方法。
116.
T細胞の閾値数が、5500×106個または約5500×106個または少なくとも5500×106個の細胞である、態様50〜115のいずれかの方法。
117.
培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含む、態様50〜116のいずれかの方法。
118.
培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞が、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも9日の時点で収集される、態様50〜117のいずれかの方法。
119.
培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞が、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも10日の時点で収集される、態様50〜118のいずれかの方法。
120.
8日〜25日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、態様118または119の方法。
121.
9日〜21日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、態様118または119の方法。
122.
9日〜16日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、態様118または119の方法。
123.
任意で薬学的に許容される賦形剤の存在下で、凍結保存および/または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化する工程をさらに含む、態様52〜122のいずれかの方法。
124.
アウトプット組成物の細胞が、凍結保護物質の存在下で製剤化される、態様123の方法。
125.
凍結保護物質がDMSOを含む、態様124の方法。
126.
アウトプット組成物の細胞が、容器、任意でバイアルまたはバッグ内で製剤化される、態様122〜124のいずれかの方法。
127.
インキュベーション前に生体試料からCD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞を単離する工程をさらに含む、態様1〜126のいずれかの方法。
128.
単離が、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて、任意で陽性選択または陰性選択により、細胞を選択することを含む、態様127の方法。
129.
単離が、免疫親和性に基づく選択を行うことを含む、態様127または態様128の方法。
130.
生体試料が、対象から得られた初代T細胞を含む、態様127〜129のいずれかの方法。
131.
対象がヒト対象である、態様130の方法。
132.
生体試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であるかまたはそれを含む、態様127〜131のいずれかの方法。
133.
疾患、障害または症状の細胞または組織に関連し、特異的であり、かつ/または発現する標的抗原に、組換え受容体が結合することができる、態様1〜132のいずれかの方法。
134.
疾患、障害または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患または腫瘍もしくはがんである、態様133の方法。
135.
標的抗原が腫瘍抗原である、態様133または134の方法。
136.
標的抗原が、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん-精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体α、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原、およびユニバーサルタグに関連する抗原から選択される、態様133〜135のいずれかの方法。
137.
組換え受容体が、機能的非TCR抗原受容体もしくはTCRまたはその抗原結合断片であるかまたはそれを含む、態様1〜136のいずれかの方法。
138.
組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、態様1〜137のいずれかの方法。
139.
組換え受容体が抗BCMA CARである、態様1〜138のいずれかの方法。
140.
キメラ抗原受容体が、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む、態様138または139の方法。
141.
抗原結合ドメインが、抗体、または任意で一本鎖断片であるその抗体断片であるかまたはそれを含む、態様140の方法。
142.
前記断片が、柔軟なリンカーによって結合された抗体可変領域を含む、態様141の方法。
143.
前記断片がscFvを含む、態様141または態様142の方法。
144.
キメラ抗原受容体が、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む、態様138〜143のいずれかの方法。
145.
キメラ抗原受容体が、細胞内シグナル伝達領域を含む、態様138〜144のいずれかの方法。
146.
細胞内シグナル伝達領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様145の方法。
147.
細胞内シグナル伝達ドメインが、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞内で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む、態様146の方法。
148.
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分であるかまたはそれを含む、態様146または147の方法。
149.
キメラ抗原受容体が、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に位置する膜貫通ドメインをさらに含む、態様145〜148のいずれかの方法。
150.
細胞内シグナル伝達領域が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、態様145〜149のいずれかの方法。
151.
共刺激シグナル伝達領域が、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、態様150の方法。
152.
共刺激シグナル伝達領域が、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、態様150または態様151の方法。
153.
共刺激シグナル伝達領域が、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある、態様150〜152のいずれかの方法。
154.
閾値数以上の数の細胞を含むアウトプット組成物が、方法の85％超もしくは約85％超、90％超もしくは約90％超または95％超もしくは約95％超の反復の間で製造される、態様113〜153のいずれかの方法。
155.
無血清培地が、
基本培地中の0.5mM〜5mMのL-グルタミンのジペプチド形態、
0.5mM〜5mMのL-グルタミン、および
少なくとも1つのタンパク質
を含み、該培地が血清を含まない、態様1〜154のいずれかの方法。
156.
L-グルタミンのジペプチド形態がL-アラニル-L-グルタミンである、態様155の無血清培地。
157.
無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態の濃度が、2mMまたは約2mMである、態様155または態様156の無血清培地。
158.
無血清培地中のL-グルタミンの濃度が、2mMまたは約2mMである、態様155〜157のいずれかの無血清培地。
159.
少なくとも1つのタンパク質が、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンのうちの1つまたは複数、任意でヒトもしくは組換えアルブミン、ヒトもしくは組換えインスリンまたはヒトもしくは組換えトランスフェリンのうちの1つまたは複数を含む、態様155〜158のいずれかの無血清培地。
160.
態様1〜159のいずれかの方法により作製された操作された細胞を含む、組成物。
161.
薬学的に許容される担体をさらに含む、態様160の組成物。
162.
凍結保護物質、任意でDMSOを含む、態様160または態様161の組成物。
163.
態様160〜162のいずれかの組成物と、対象にアウトプット組成物を投与するための指示書とを含む、製造物品。
164.
対象が、疾患または症状を有し、任意で、組換え受容体が、疾患もしくは症状に関連するまたは疾患もしくは症状の細胞上に発現するもしくは存在する抗原を特異的に認識するかまたはその抗原に特異的に結合する、態様163の製造物品。
165.
培養の少なくとも一部の間、細胞が、細胞生存率、濃度、密度、数またはそれらの組合せについてモニタリングされる、態様55〜159のいずれかの方法。
166.
モニタリングが、光学的方法、任意で顕微鏡観察によって行われる、態様165の方法。
167.
モニタリングが、明視野顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、微分干渉顕微鏡観察、位相差顕微鏡観察、デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DHM）、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）またはそれらの組合せによって行われる、態様165または態様166の方法。
168.
モニタリングが、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）によって行われる、態様165〜167のいずれかの方法。
169.
モニタリングが、培養の少なくとも一部の間、断続的または連続的に行われ、任意で、培養中、少なくとも1時間ごと、少なくとも6時間ごと、少なくとも12時間ごと、少なくとも18時間ごと、少なくとも24時間ごとまたは少なくとも26時間ごとに行われる、態様165〜168のいずれかの方法。
170.
モニタリングが、細胞がT細胞の閾値数、生存T細胞の閾値数、T細胞の閾値濃度または生存T細胞の閾値濃度に達するまで行われる、態様165〜169のいずれかの方法。
171.
モニタリングおよび培養が閉鎖系で行われる、態様165〜170のいずれかの方法。
172.
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、かつ/あるいは
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である、
態様50〜159および165〜171のいずれかの方法。
173.
前記方法の反復により、任意でヒト生体試料から、複数のアウトプット組成物が製造され、前記方法が複数の異なる個々の対象間で行われ、
複数のアウトプット組成物中のメモリー表現型の細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のセントラルメモリー表現型の細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物の操作されたCD4＋T細胞、任意でCAR＋CD4＋T細胞内のセントラルメモリーCD4＋T細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物の操作されたCD8＋T細胞、任意でCAR＋CD8＋T細胞内のセントラルメモリーCD8＋T細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、かつ/あるいは
複数のアウトプット組成物の操作されたT細胞、任意でCAR＋T細胞内のセントラルメモリーT細胞、任意でCD4＋セントラルメモリーT細胞およびCD8＋セントラルメモリーT細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％である、
態様50〜159および165〜172のいずれかの方法。
174.
前記方法が、ヒト生体試料の少なくとも約80％、約90％、約95％、約97％、約99％、約100％または100％において、アウトプット組成物中でCARを発現する細胞の所定の特徴、任意で閾値数を示すアウトプット組成物を製造し、前記方法が、複数の異なる個々の対象間で行われる、態様1〜159および165〜173のいずれかの方法。
175.
複数の異なる個々の対象が、疾患または症状を有する対象を含む、態様174の方法。
176.
疾患または症状ががんである、態様175の方法。
177.
がんが、血液がんであり、任意で多発性骨髄腫である、態様176の方法。
178.
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、グランザイムB-および/またはCD127＋であり、かつ/あるいは
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である、
態様160の組成物。
提供される態様には以下が含まれる：
1.
（a）CD4＋T細胞の組成物とCD8＋T細胞の組成物とを、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比で組み合わせ、それにより、インプット組成物を生成する工程、
（b）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程であって、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、工程
を含み、
インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、
操作された細胞の組成物を製造する方法。
2.
インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞が、対象から得られた初代試料から濃縮または選択され、任意で、インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞が、対象から得られた初代試料から別々に濃縮または選択される、請求項1の方法。
3.
CD4＋T細胞の組成物が、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD4＋T細胞を含む、請求項1または請求項2の方法。
4.
CD8＋T細胞の組成物が、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD8＋T細胞を含む、請求項1または2の方法。
5.
刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程
を含み、
インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、
刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、
操作された細胞の組成物を製造する方法。
6.
インキュベーションが無血清培地中で行われる、請求項1〜5のいずれかの方法。
7.
インプット組成物が、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の細胞を含む、請求項1〜6のいずれかの方法。
8.
インプット組成物が、100×106〜500×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項1〜7のいずれかの方法。
9.
インプット組成物が、300×106個または約300×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項1〜8のいずれかの方法。
10.
総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生存細胞である、請求項9の方法。
11.
インプット組成物が、1×106細胞/mL〜5×106細胞/mLの濃度を有する、請求項1〜10のいずれかの方法。
12.
インプット組成物が、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの濃度を有する、請求項1〜11のいずれかの方法。
13.
インプット組成物が、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜12のいずれかの方法。
14.
インプット組成物が、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜13のいずれかの方法。
15.
インプット組成物が、1:1または約1:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜14のいずれかの方法。
16.
インプット組成物が、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む、請求項1〜15のいずれかの方法。
17.
CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.1:1または約1.1:1である、請求項16の方法。
18.
インプット組成物が、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、請求項1〜17のいずれかの方法。
19.
CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.69:1または約1.69:1である、請求項18の方法。
20.
インプット組成物が、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を、任意で2.0:1〜1.5:1の比で含む、請求項1〜19のいずれかの方法。
21.
刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む作用物質とを接触させることを含む、工程
をさらに含む、請求項1〜20のいずれかの方法。
22.
接触が、ベクターを用いたトランスフェクションによる接触であり、ベクターが、トランスポゾン、任意でスリーピングビューティー（SB）トランスポゾンまたはピギーバックトランスポゾンであるか、
接触が、ウイルスベクターを用いた形質導入による接触である、
請求項21の方法。
23.
刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することを含む、工程
をさらに含む、請求項1〜22のいずれかの方法。
24.
導入が無血清培地中で行われる、請求項21〜23のいずれかの方法。
25.
導入のために、刺激された組成物が300×106個未満の細胞を含む、態様21〜24のいずれかの方法。
26.
導入のために、刺激された組成物が50×106個の細胞〜200×106個の細胞を含む、態様21〜25のいずれかの方法。
27.
導入のために、刺激された組成物が約100×106個の細胞を含む、態様21〜26のいずれかの方法。
28.
導入のために、刺激された組成物が3×106細胞/mL未満の濃度を有する、態様21〜27のいずれかの方法。
29.
導入のために、刺激された組成物が0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mLの濃度を有する、態様21〜28のいずれかの方法。
30.
導入のために、刺激された組成物が1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する、態様21〜29のいずれかの方法。
31.
刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する工程を含む、態様21〜30のいずれかの方法。
32.
刺激された組成物の細胞が生存細胞である、態様21〜32のいずれかの方法。
33.
操作された細胞の組成物を製造する方法であって、T細胞組成物の細胞に組換え受容体を導入する工程を含み、T細胞組成物が、1mL当たり少なくとも1×106個または少なくとも約1×106個の生存細胞の濃度を有し、T細胞組成物の細胞の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％が、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である、前記方法。
34.
T細胞組成物の濃度が、1mL当たり5×106個未満の生存細胞である、態様33の方法。
35.
T細胞組成物が、少なくとも100×106個または少なくとも約100×106個または約100×106個の生存細胞を含む、態様33または34のいずれかの方法。
36.
T細胞組成物が、300×106個未満の生存細胞を含む、態様33〜35のいずれかの方法。
37.
導入が、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することによってT細胞に接触させることを含む、態様33〜36のいずれかの方法。
38.
導入が無血清培地中で行われる、態様33〜37のいずれかの方法。
39.
T細胞組成物の1つまたは複数の細胞が、活性化され、かつ/またはLDL受容体の表面発現を含む、態様33〜38のいずれかの方法。
40.
前記細胞組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％が、
（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、
（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、
（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または
（iv）増殖することができる、
態様33〜39のいずれかの方法。
41.
導入前に、前記組成物の細胞が、刺激条件下でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程を含むプロセスによって生成され、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、態様33〜40のいずれかの方法。
42.
インキュベーションが無血清培地中で行われる、態様41の方法。
43.
以下の工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法：
（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程であって、
インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、
刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、
工程、ならびに
（b）刺激された組成物の300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターとを接触させることを含む、工程。
44.
インキュベーションおよび/または導入が無血清培地中で行われる、態様43のいずれかの方法。
45.
CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生存細胞である、態様43または44のいずれかの方法。
46.
刺激された組成物からの細胞が生存細胞である、態様44のいずれかの方法。
47.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後2日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後2日以内に、導入が開始される、態様33〜46のいずれかの方法。
48.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後36時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後36時間以内に、導入が開始される、態様33〜47のいずれかの方法。
49.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後30時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後30時間以内に、導入が開始される、態様33〜48のいずれかの方法。
50.
操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養し、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を製造する工程
をさらに含む、態様33〜49のいずれかの方法。
51.
培養が無血清培地中で行われる、態様50の方法。
52.
以下の工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法：
（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートする工程であって、それにより、刺激された組成物が生成され、インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、工程、
（b）刺激された組成物からの300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入する工程であって、それにより、操作された細胞組成物が生成され、導入が、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することを含む、工程、ならびに
（c）操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養する工程であって、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物が製造される、工程。
53.
インキュベーション工程、導入工程および/または培養工程が、無血清培地中で行われる、態様52の方法。
54.
インプット組成物が、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、任意で1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する、態様41〜53のいずれかの方法。
55.
インプット組成物が、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む、態様41〜54のいずれかの方法。
56.
CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.1:1または約1.1:1である、態様55の方法。
57.
インプット組成物が、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、態様41〜56のいずれかの方法。
58.
CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.69:1または約1.69:1である、態様57の方法。
59.
インプット組成物が、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、態様41〜58のいずれかの方法。
60.
導入のために、刺激された組成物が300×106個未満の細胞を含む、態様43〜59のいずれかの方法。
61.
導入のために、刺激された組成物が50×106個〜200×106個の細胞、任意で100×106個または約100×106個の細胞を含む、態様43〜60のいずれかの方法。
62.
導入のために、刺激された組成物が3×106細胞/mL未満の濃度を有する、態様43〜61のいずれかの方法。
63.
導入のために、刺激された組成物が0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mL、任意で1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する、態様43〜62のいずれかの方法。
64.
刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する、態様43〜63のいずれかの方法。
65.
インキュベーションが、1つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる、請求項1〜64のいずれかの方法。
66.
1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、請求項65の方法。
67.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項66の方法。
68.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項66または67の方法。
69.
刺激された組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％が、
（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、
（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、
（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または
（iv）増殖することができる、
態様1〜68のいずれかの方法。
70.
刺激試薬が、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する主剤を含み、該主剤は任意でCD3に特異的に結合する、態様1〜69のいずれかの方法。
71.
刺激試薬が、T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤をさらに含み、任意で、該共刺激分子が、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される、態様70の方法。
72.
主剤および/または副剤が抗体を含み、任意で、刺激試薬が、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはその抗原結合断片とのインキュベーションを構成する、態様70または態様71の方法。
73.
主剤および/または副剤が固体支持体の表面上に存在する、態様71〜72のいずれかの方法。
74.
固体支持体がビーズであるかビーズを含む、態様73の方法。
75.
ビーズが、3.5μmを超えるか約3.5μmを超えるが約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を有する、態様74の方法。
76.
ビーズが、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する、態様74または態様75の方法。
77.
ビーズが不活性である、態様74〜76のいずれかの方法。
78.
ビーズがポリスチレン表面であるかポリスチレン表面を含む、態様74〜77のいずれかの方法。
79.
ビーズが磁性または超常磁性である、態様74〜78のいずれかの方法。
80.
ビーズ：細胞の比が3:1未満である、態様74〜79のいずれかの方法。
81.
ビーズ：細胞の比が2:1〜0.5:1または約2:1〜約0.5:1である、態様74〜80のいずれかの方法。
82.
ビーズ：細胞の比が1:1または約1:1である、態様74〜81のいずれかの方法。
83.
インプット組成物が、刺激条件下で48時間未満インキュベートされる、態様1〜82のいずれかの方法。
84.
インプット組成物が、刺激条件下で、12時間以上36時間以下インキュベートされる、態様1〜83のいずれかの方法。
85.
インプット組成物が、刺激条件下で、18時間以上30時間以下インキュベートされる、態様1〜84のいずれかの方法。
86.
インプット組成物が、刺激条件下で、24時間または約24時間インキュベートされる、態様1〜85のいずれかの方法。
87.
接触、任意で形質導入が、48時間未満行われる、態様23〜86のいずれかの方法。
88.
接触、任意で形質導入が、12時間以上36時間以下行われる、態様23〜87のいずれかの方法。
89.
接触、任意で形質導入が、18時間以上30時間以下行われる、態様23〜88のいずれかの方法。
90.
接触、任意で形質導入が、24時間または約24時間行われる、態様23〜89のいずれかの方法。
91.
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様23〜90のいずれかの方法。
92.
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、態様23〜91のいずれかの方法。
93.
接触、任意で形質導入が、形質導入アジュバントの非存在下で行われる、態様23〜92のいずれかの方法。
94.
導入が、1つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる、態様23〜93のいずれかの方法。
95.
1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、態様94の方法。
96.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様94または95の方法。
97.
1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様94〜96のいずれかの方法。
98.
培養の少なくとも一部が、混合および/または灌流を用いて行われる、態様50〜97のいずれかの方法。
99.
培養の少なくとも一部が、500mL/日、600mL/日、700mL/日、750mL/日、800mL/日、900mL/日、1,000mL/日、1,200mL/日、1,400mL/日、1,500mL/日、1,600mL/日、1,800mL/日および/または2,000mL/日、約500mL/日、約600mL/日、約700mL/日、約750mL/日、約800mL/日、約900mL/日、約1,000mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日、約1,500mL/日、約1,600mL/日、約1,800mL/日および/または約2,000mL/日、あるいは少なくとも500mL/日、少なくとも600mL/日、少なくとも700mL/日、少なくとも750mL/日、少なくとも800mL/日、少なくとも900mL/日、少なくとも1,000mL/日、少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日、少なくとも1,500mL/日、少なくとも1,600mL/日、少なくとも1,800mL/日および/または少なくとも2,000mL/日の速度の灌流を用いて行われる、態様98の方法。
100.
培養の少なくとも第1の部分が、500mL/日、750mL/日もしくは1,000mL/日、約500mL/日、約750mL/日もしくは約1,000mL/日、または少なくとも500mL/日、少なくとも750mL/日もしくは少なくとも1,000mL/日の灌流速度により行われ、培養の少なくとも第2の部分が、1,200mL/日、1,400mL/日もしくは1,500mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日もしくは約1,500mL/日、または少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日もしくは少なくとも1,500mL/日の灌流速度により行われる、態様98または99の方法。
101.
細胞が特定の密度に達すると、灌流が開始されかつ/または増加される、態様98〜100のいずれかの方法。
102.
特定の密度が、0.4×106個の細胞、0.5×106個の細胞、0.6×106個の細胞、0.8×106個の細胞、1.0×106個の細胞、1.2×106個の細胞、1.4×106個の細胞、1.6×106個の細胞、1.8×106個の細胞、2.0×106個の細胞、2.2×106個の細胞もしくは2.4×106個の細胞、約0.4×106個の細胞、約0.5×106個の細胞、約0.6×106個の細胞、約0.8×106個の細胞、約1.0×106個の細胞、約1.2×106個の細胞、約1.4×106個の細胞、約1.6×106個の細胞、約1.8×106個の細胞、約2.0×106個の細胞、約2.2×106個の細胞もしくは約2.4×106個の細胞、または少なくとも0.4×106個の細胞、少なくとも0.5×106個の細胞、少なくとも0.6×106個の細胞、少なくとも0.8×106個の細胞、少なくとも1.0×106個の細胞、少なくとも1.2×106個の細胞、少なくとも1.4×106個の細胞、少なくとも1.6×106個の細胞、少なくとも1.8×106個の細胞、少なくとも2.0×106個の細胞、少なくとも2.2×106個の細胞もしくは少なくとも2.4×106個の細胞である、態様101の方法。
103.
細胞が0.6×106細胞/mLまたは約0.6×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または750mL/日または約750mL/日の速度に増加される、態様98〜102のいずれかの方法。
104.
細胞が2.0×106細胞/mLまたは約2.0×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または1500mL/日もしくは約1500mL/日の速度に増加される、態様98の方法。
105.
培養が、1つまたは複数のサイトカインの存在下で行われる、態様50〜104のいずれかの方法。
106.
1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、態様105の方法。
107.
1つまたは複数のサイトカインが、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様105または106の方法。
108.
1つまたは複数のサイトカインが、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、態様105〜107のいずれかの方法。
109.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後3日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後3日以内に、培養が開始される、態様50〜108のいずれかの方法。
110.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後60時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後60時間以内に、培養が開始される、態様50〜109のいずれかの方法。
111.
刺激条件下でのインキュベーションの開始後48時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後48時間以内に、培養が開始される、態様50〜110のいずれかの方法。
112.
少なくとも組成物が閾値数のT細胞を含むまで、培養が行われる、態様50〜111のいずれかの方法。
113.
T細胞の閾値数に達した後、培養が少なくとも1日間継続される、態様112の方法。
114.
T細胞の閾値数が1200×106個または約1200×106個または少なくとも1200×106個の細胞である、態様113の方法。
115.
T細胞の閾値数が3500×106個または約3500×106個または少なくとも3500×106個の細胞である、態様50〜114のいずれかの方法。
116.
T細胞の閾値数が、5500×106個または約5500×106個または少なくとも5500×106個の細胞である、態様50〜115のいずれかの方法。
117.
培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含む、態様50〜116のいずれかの方法。
118.
培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞が、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも9日の時点で収集される、態様50〜117のいずれかの方法。
119.
培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞が、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも10日の時点で収集される、態様50〜118のいずれかの方法。
120.
8日〜25日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、態様118または119の方法。
121.
9日〜21日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、態様118または119の方法。
122.
9日〜16日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、態様118または119の方法。
123.
任意で薬学的に許容される賦形剤の存在下で、凍結保存および/または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化する工程をさらに含む、態様52〜122のいずれかの方法。
124.
アウトプット組成物の細胞が、凍結保護物質の存在下で製剤化される、態様123の方法。
125.
凍結保護物質がDMSOを含む、態様124の方法。
126.
アウトプット組成物の細胞が、容器、任意でバイアルまたはバッグ内で製剤化される、態様122〜124のいずれかの方法。
127.
インキュベーション前に生体試料からCD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞を単離する工程をさらに含む、態様1〜126のいずれかの方法。
128.
単離が、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて、任意で陽性選択または陰性選択により、細胞を選択することを含む、態様127の方法。
129.
単離が、免疫親和性に基づく選択を行うことを含む、態様127または態様128の方法。
130.
生体試料が、対象から得られた初代T細胞を含む、態様127〜129のいずれかの方法。
131.
対象がヒト対象である、態様130の方法。
132.
生体試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であるかまたはそれを含む、態様127〜131のいずれかの方法。
133.
疾患、障害または症状の細胞または組織に関連し、特異的であり、かつ/または発現する標的抗原に、組換え受容体が結合することができる、態様1〜132のいずれかの方法。
134.
疾患、障害または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患または腫瘍もしくはがんである、態様133の方法。
135.
標的抗原が腫瘍抗原である、態様133または134の方法。
136.
標的抗原が、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん-精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体α、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、メソセリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原、およびユニバーサルタグに関連する抗原から選択される、態様133〜135のいずれかの方法。
137.
組換え受容体が、機能的非TCR抗原受容体もしくはTCRまたはその抗原結合断片であるかまたはそれを含む、態様1〜136のいずれかの方法。
138.
組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、態様1〜137のいずれかの方法。
139.
組換え受容体が抗BCMA CARである、態様1〜138のいずれかの方法。
140.
キメラ抗原受容体が、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む、態様138または139の方法。
141.
抗原結合ドメインが、抗体、または任意で一本鎖断片であるその抗体断片であるかまたはそれを含む、態様140の方法。
142.
前記断片が、柔軟なリンカーによって結合された抗体可変領域を含む、態様141の方法。
143.
前記断片がscFvを含む、態様141または態様142の方法。
144.
キメラ抗原受容体が、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む、態様138〜143のいずれかの方法。
145.
キメラ抗原受容体が、細胞内シグナル伝達領域を含む、態様138〜144のいずれかの方法。
146.
細胞内シグナル伝達領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様145の方法。
147.
細胞内シグナル伝達ドメインが、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞内で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む、態様146の方法。
148.
細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分であるかまたはそれを含む、態様146または147の方法。
149.
キメラ抗原受容体が、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に位置する膜貫通ドメインをさらに含む、態様145〜148のいずれかの方法。
150.
細胞内シグナル伝達領域が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、態様145〜149のいずれかの方法。
151.
共刺激シグナル伝達領域が、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、態様150の方法。
152.
共刺激シグナル伝達領域が、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、態様150または態様151の方法。
153.
共刺激シグナル伝達領域が、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある、態様150〜152のいずれかの方法。
154.
閾値数以上の数の細胞を含むアウトプット組成物が、方法の85％超もしくは約85％超、90％超もしくは約90％超または95％超もしくは約95％超の反復の間で製造される、態様113〜153のいずれかの方法。
155.
無血清培地が、
基本培地中の0.5mM〜5mMのL-グルタミンのジペプチド形態、
0.5mM〜5mMのL-グルタミン、および
少なくとも1つのタンパク質
を含み、該培地が血清を含まない、態様1〜154のいずれかの方法。
156.
L-グルタミンのジペプチド形態がL-アラニル-L-グルタミンである、態様155の無血清培地。
157.
無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態の濃度が、2mMまたは約2mMである、態様155または態様156の無血清培地。
158.
無血清培地中のL-グルタミンの濃度が、2mMまたは約2mMである、態様155〜157のいずれかの無血清培地。
159.
少なくとも1つのタンパク質が、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンのうちの1つまたは複数、任意でヒトもしくは組換えアルブミン、ヒトもしくは組換えインスリンまたはヒトもしくは組換えトランスフェリンのうちの1つまたは複数を含む、態様155〜158のいずれかの無血清培地。
160.
態様1〜159のいずれかの方法により作製された操作された細胞を含む、組成物。
161.
薬学的に許容される担体をさらに含む、態様160の組成物。
162.
凍結保護物質、任意でDMSOを含む、態様160または態様161の組成物。
163.
態様160〜162のいずれかの組成物と、対象にアウトプット組成物を投与するための指示書とを含む、製造物品。
164.
対象が、疾患または症状を有し、任意で、組換え受容体が、疾患もしくは症状に関連するまたは疾患もしくは症状の細胞上に発現するもしくは存在する抗原を特異的に認識するかまたはその抗原に特異的に結合する、態様163の製造物品。
165.
培養の少なくとも一部の間、細胞が、細胞生存率、濃度、密度、数またはそれらの組合せについてモニタリングされる、態様55〜159のいずれかの方法。
166.
モニタリングが、光学的方法、任意で顕微鏡観察によって行われる、態様165の方法。
167.
モニタリングが、明視野顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、微分干渉顕微鏡観察、位相差顕微鏡観察、デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DHM）、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）またはそれらの組合せによって行われる、態様165または態様166の方法。
168.
モニタリングが、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）によって行われる、態様165〜167のいずれかの方法。
169.
モニタリングが、培養の少なくとも一部の間、断続的または連続的に行われ、任意で、培養中、少なくとも1時間ごと、少なくとも6時間ごと、少なくとも12時間ごと、少なくとも18時間ごと、少なくとも24時間ごとまたは少なくとも26時間ごとに行われる、態様165〜168のいずれかの方法。
170.
モニタリングが、細胞がT細胞の閾値数、生存T細胞の閾値数、T細胞の閾値濃度または生存T細胞の閾値濃度に達するまで行われる、態様165〜169のいずれかの方法。
171.
モニタリングおよび培養が閉鎖系で行われる、態様165〜170のいずれかの方法。
172.
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、かつ/あるいは
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である、
態様50〜159および165〜171のいずれかの方法。
173.
前記方法の反復により、任意でヒト生体試料から、複数のアウトプット組成物が製造され、前記方法が複数の異なる個々の対象間で行われ、
複数のアウトプット組成物中のメモリー表現型の細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のセントラルメモリー表現型の細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物の操作されたCD4＋T細胞、任意でCAR＋CD4＋T細胞内のセントラルメモリーCD4＋T細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物の操作されたCD8＋T細胞、任意でCAR＋CD8＋T細胞内のセントラルメモリーCD8＋T細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、かつ/あるいは
複数のアウトプット組成物の操作されたT細胞、任意でCAR＋T細胞内のセントラルメモリーT細胞、任意でCD4＋セントラルメモリーT細胞およびCD8＋セントラルメモリーT細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％である、
態様50〜159および165〜172のいずれかの方法。
174.
前記方法が、ヒト生体試料の少なくとも約80％、約90％、約95％、約97％、約99％、約100％または100％において、アウトプット組成物中でCARを発現する細胞の所定の特徴、任意で閾値数を示すアウトプット組成物を製造し、前記方法が、複数の異なる個々の対象間で行われる、態様1〜159および165〜173のいずれかの方法。
175.
複数の異なる個々の対象が、疾患または症状を有する対象を含む、態様174の方法。
176.
疾患または症状ががんである、態様175の方法。
177.
がんが、血液がんであり、任意で多発性骨髄腫である、態様176の方法。
178.
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、グランザイムB-および/またはCD127＋であり、かつ/あるいは
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である、
態様160の組成物。
IX. 実施例
以下の実施例は例示の目的においてのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
以下の実施例は例示の目的においてのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例1：抗BCMA CARを発現する操作されたT細胞の治療組成物を生成するためのプロセス
抗BCMAキメラ抗原受容体（CAR）を発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含む初代T細胞の遺伝子操作された組成物は、次の例示的なプロセスによって産生された；そのプロセスは、サンプルからCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を別々に選択した後、後続の処理工程のために、選択された細胞を規定の比率で組み合わせることを含んでいた。CD4+細胞とCD8+細胞の別個の組成物は、例えば多発性骨髄腫（MM）の患者からの、ヒト白血球アフェレーシスサンプルから分離されたPBMCより選択して、選択された細胞組成物を凍結させた。続いて、選択されたCD4+およびCD8+ T細胞組成物を解凍し、生存CD4+ T細胞と生存CD8+ T細胞を1：1の比で混合し、その後、刺激、形質導入および拡大増殖の工程を実施した。
抗BCMAキメラ抗原受容体（CAR）を発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含む初代T細胞の遺伝子操作された組成物は、次の例示的なプロセスによって産生された；そのプロセスは、サンプルからCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を別々に選択した後、後続の処理工程のために、選択された細胞を規定の比率で組み合わせることを含んでいた。CD4+細胞とCD8+細胞の別個の組成物は、例えば多発性骨髄腫（MM）の患者からの、ヒト白血球アフェレーシスサンプルから分離されたPBMCより選択して、選択された細胞組成物を凍結させた。続いて、選択されたCD4+およびCD8+ T細胞組成物を解凍し、生存CD4+ T細胞と生存CD8+ T細胞を1：1の比で混合し、その後、刺激、形質導入および拡大増殖の工程を実施した。
混合した細胞組成物からの約300×106のT細胞（150×106のCD4+ T細胞と150×106のCD8+ T細胞）を、約3×106細胞/mLの密度で、抗CD3抗体と抗CD28抗体が結合した常磁性ポリスチレン被覆ビーズの存在下、1：1のビーズ：細胞比で、例示的な無血清培地中で刺激した（例えば、実施例3を参照）。この培地はまた、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を含んでいた。18〜30時間のインキュベーションによって刺激を行った。
インキュベーション後、刺激した細胞組成物からの約100×106の生存細胞を洗浄し、組換えIL-2、IL-7、およびIL-15を含有する例示的な無血清培地に再懸濁した。形質導入用のアジュバントは何も加えなかった。この細胞に、抗BCMA CARをコードするレンチウイルスベクターを、60分間のスピノキュレーションとその後の約37℃での約18〜30時間のインキュベーションにより形質導入した。スピノキュレーション後の細胞の密度は、約1×106細胞/mLであった。該CARは、BCMAに特異的なscFv抗原結合ドメイン、CD28膜貫通領域、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、およびCD3ゼータ由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいた。
次に、形質導入された細胞を、バイオリアクター（例えば、揺動運動バイオリアクター）に移すことにより拡大増殖させるために、インキュベーションおよび形質導入工程の間に使用したIL-2、IL-7およびIL-15の濃度の2倍の濃度を含む、約500mLの例示的な無血清培地中で培養した。この例示的なプロセスにおいて、培地はポロキサマーを含まなかった。約0.6×106細胞/mL以上の閾値細胞密度に達した後、新鮮な培地のショットを定期的に加えて培地を段階的に追加し、例えば約2〜約15分で1000mLの量にし、約0.6×106細胞/mL以上の閾値生細胞密度が達成されるまで、細胞を一定の揺動条件（非灌流）下で培養した。生細胞密度が0.8×106細胞/mLより高い場合は、充填/灌流の組み合わせ工程を開始し、最初に培地を1000mLの目標量まで上記のように段階的に追加し、その後、以下で説明するように灌流を開始した。次に、連続混合を伴う半連続灌流により培地を交換した。細胞密度が増加する拡大増殖期の間に、灌流速度および/または揺動速度を少なくとも1回増加させた。細胞密度が増加する拡大増殖期の間に、灌流速度を少なくとも1回増加させた。培地を培養物に段階的に加え、1日あたりの総量を生細胞密度により測定して（ある密度に達すると、より高い速度）、例えば、1日あたり約750mLまたは1500mLの総新鮮培地が培養物に追加される速度まで（より高い細胞密度に達すると、より高い速度）、新鮮培地のショットを1日を通して定期的に、例えば約0.5時間ごと〜約1.5または2時間ごとに、追加した。有核細胞の総数（TNC）が少なくとも約3500×106に達した後、およびTNC数が少なくとも約5500×106の総有核細胞に達した時点で、細胞を1日1度回収した。回収に続いて、抗CD3および抗CD28抗体結合ビーズを、磁場への曝露により細胞組成物から除去した。
次に、細胞を配合し、組成物のアリコートを、例えば、下流の貯蔵または使用のために容器に移した。いくつかの態様において、配合された組成物またはその一部分は、細胞組成物の凍結保存および貯蔵、例えば、対象への潜在的な投与に適した冷凍バッグ(CryoStore Freezing Bagのような)に移され、および/または組成物もしくはその一部分は、細胞のさらなる分析のためのような、バイアルまたは他の容器に移された。細胞は、例えば、下流の融解および投与のための使用に適切な条件の下で、冷凍凍結された。場合によっては、30 mLの容量の配合された細胞が個々のバッグ中で用いられた。いくつかの例では、例えば、細胞をさまざまな全細胞濃度で凍結保存して、投与のための細胞との関連で、各用量におけるCAR+ T細胞の一貫した数または濃度を可能にした。いくつかの態様において、標的CAR+ CD3+細胞数は、30 mLあたりまたはバッグあたり所望の数またはおよそ所望の数の(およそ37.5×106などの) CAR+CD3+細胞であり、これはいくつかの態様において、異なるドナーまたは患者から作出された組成物の間でさまざまな全細胞濃度を伴う。
ある範囲の多発性骨髄腫患者から得られた個々の白血球アフェレーシスサンプルについて、この例示的なプロセスを用いて、そのようなサンプルから操作された細胞組成物を作出し、活性化の開始から収集までのプロセスの部分の期間の範囲は7〜10日、およびこれらのサンプル間の平均期間およそ7.5日であることが観察された。異なるサンプル間のプロセスの過程での累積集団倍加の平均数はおよそ7.5であることがさらに確認された。図6Aおよび6Bは、それぞれ、操作された細胞組成物におけるCD4+CAR+細胞(図6A)およびCD8+CAR+細胞(図6B)の中での、表示された表現型(CD45RAおよびCCR7表面発現に基づく)の細胞の割合に対しての中央値(水平線)、四分位範囲(ボックス)、および1.5×四分位範囲(ひげ)を示す。図6Cおよび6Dは、それぞれ、操作された細胞組成物におけるCD4+CAR+細胞(図6C)およびCD8+CAR+細胞(図6D)の中での、表示された表現型(CD27およびCD28表面発現に基づく)の細胞の割合に対しての中央値(水平線)、四分位範囲(ボックス)、および1.5×四分位範囲(ひげ)を示す。
実施例2: CD4+およびCD8+ CAR-T細胞の作出された治療用組成物の特徴の評価
抗BCMA CARを発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含む複数の操作された細胞組成物は、実施例1に記述された例示的なプロセスによって健常ドナーから作出された。細胞を生存性、抗BCMA CAR発現、およびCAR抗原特異的刺激について、組み換えヒトBCMA試薬を用いて評価した。例示的なプロセスによって作出された、操作された細胞組成物は、一貫して低い割合のカスパーゼ陽性細胞および高い細胞生存性を示した(アクリジンオレンジ(AO)およびヨウ化プロピジウム染色によって測定した場合)。さらに、CAR+細胞の割合は、CD4+およびCD8+細胞で同様であった。抗原発現標的細胞との操作された細胞組成物の24時間のインキュベーション後の、IFN-γ、TNF-α、IL2、グランザイムB、およびパーフォリンを含む、サイトカインの産生は、本発明者らの経験では、活性な操作された細胞組成物と一致する値でサイトカインの産生をもたらした。これらの結果は、実施例1に記述されるプロセスを用いて、活性なCAR操作細胞を一貫して産生できることを実証した。
抗BCMA CARを発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含む複数の操作された細胞組成物は、実施例1に記述された例示的なプロセスによって健常ドナーから作出された。細胞を生存性、抗BCMA CAR発現、およびCAR抗原特異的刺激について、組み換えヒトBCMA試薬を用いて評価した。例示的なプロセスによって作出された、操作された細胞組成物は、一貫して低い割合のカスパーゼ陽性細胞および高い細胞生存性を示した(アクリジンオレンジ(AO)およびヨウ化プロピジウム染色によって測定した場合)。さらに、CAR+細胞の割合は、CD4+およびCD8+細胞で同様であった。抗原発現標的細胞との操作された細胞組成物の24時間のインキュベーション後の、IFN-γ、TNF-α、IL2、グランザイムB、およびパーフォリンを含む、サイトカインの産生は、本発明者らの経験では、活性な操作された細胞組成物と一致する値でサイトカインの産生をもたらした。これらの結果は、実施例1に記述されるプロセスを用いて、活性なCAR操作細胞を一貫して産生できることを実証した。
実施例3: 細胞を操作するプロセスで用いるための無血清培地
治療用T細胞組成物を作出するための実施例1に記述された例示的な方法は、細胞を拡大増殖させるための活性化、形質導入および培養が、以下から調製された無血清培地中で実行された段階を含む: (1) 約2 mMのL-アラニル-L-グルタミンを含有する液体基礎培地(GlutaMax); (2) 使用前に凍結保持された、80 mMグルタミンおよび血清代替タンパク質を含有する、第1のサプリメント; および(3) 液体溶液として提供される第2のサプリメント、例えばOpTmizer(商標) T細胞拡大増殖サプリメント。基礎培地は、栄養素混合物および緩衝液を含有し、フェノールレッドを含有しなかった。凍結サプリメントを融解した後、構成成分を約95.0% +/-0.2% (v/v)の基礎培地、約2.5%+/-0.2% (v/v)の第1のサプリメントおよび約2.5%+/-0.2% (v/v)の第2のサプリメントで組み合わせ、それによって例示的な無血清細胞成長培地(「SFM-A」と指定した)を作出した。凍結サプリメント中のL-グルタミンの存在により、基礎培地への添加前にその安定性が確保されて、L-グルタミンの不安定性が原因で起こりうる無血清培地配合物でのグルタミン濃度の変動および/またはアンモニア濃度の増加が最小限に抑えられた。L-グルタミンは、L-アラニル-L-グルタミンの存在により、第1のサプリメント中で可溶性のままであった。培地にはさらに、IL-2、IL-7および/またはIL-15のような、サイトカインが補充された。
治療用T細胞組成物を作出するための実施例1に記述された例示的な方法は、細胞を拡大増殖させるための活性化、形質導入および培養が、以下から調製された無血清培地中で実行された段階を含む: (1) 約2 mMのL-アラニル-L-グルタミンを含有する液体基礎培地(GlutaMax); (2) 使用前に凍結保持された、80 mMグルタミンおよび血清代替タンパク質を含有する、第1のサプリメント; および(3) 液体溶液として提供される第2のサプリメント、例えばOpTmizer(商標) T細胞拡大増殖サプリメント。基礎培地は、栄養素混合物および緩衝液を含有し、フェノールレッドを含有しなかった。凍結サプリメントを融解した後、構成成分を約95.0% +/-0.2% (v/v)の基礎培地、約2.5%+/-0.2% (v/v)の第1のサプリメントおよび約2.5%+/-0.2% (v/v)の第2のサプリメントで組み合わせ、それによって例示的な無血清細胞成長培地(「SFM-A」と指定した)を作出した。凍結サプリメント中のL-グルタミンの存在により、基礎培地への添加前にその安定性が確保されて、L-グルタミンの不安定性が原因で起こりうる無血清培地配合物でのグルタミン濃度の変動および/またはアンモニア濃度の増加が最小限に抑えられた。L-グルタミンは、L-アラニル-L-グルタミンの存在により、第1のサプリメント中で可溶性のままであった。培地にはさらに、IL-2、IL-7および/またはIL-15のような、サイトカインが補充された。
遺伝子操作されたT細胞の79の個々の組成物が、上記の例示的なプロセスから産生された。健康なドナーおよび多発性骨髄腫患者からのものを含めて、79回の製造ランのそれぞれから、生細胞の総数によって評価されるように、培養中のロバストな拡大増殖が観察された。全てのランで、培養開始から6日以内に、細胞密度が合計5.5×109個の細胞である目標閾値を超える細胞組成物を産生することができた。培養開始から6日以内に、全ての製造ランで生細胞数の27倍超の増加が観察され、製造ランの85％以上は5日目までにそのような拡大増殖を達成した。全体として、これらのデータは、健康なドナーおよび患者ドナー由来の細胞の全体にわたって、無血清培地配合物のロバスト性能を支持している。
実施例4：無血清培地を含むプロセスにより産生されたCAR+ T細胞組成物の評価
キメラ抗原受容体（CAR）を発現する遺伝子操作されたヒトT細胞は、実質的に実施例1に記載されるプロセスによって、例示的なSFM-Aの存在下で産生された。この研究では、CARを発現するT細胞を産生するために、CD4+およびCD8+ T細胞を、イムノアフィニティに基づいた濃縮によってドナーの白血球アフェレーシスサンプルから個別に分離し、約1：1で混合し、抗CD3/抗CD28磁気ビーズの存在下で活性化し、抗BCMA CARをコードするウイルスベクターを形質導入し、約37℃でのインキュベーションにより培養して該細胞を増殖させた。活性化、形質導入、および細胞の拡大増殖のための培養は、5％（v/v）ヒト血清含有培地または実施例3に記載のSFM-A培地のいずれかで、それぞれサイトカインの存在下で実施した。産生された遺伝子操作T細胞組成物の例示的な特徴を、SFM-Aまたは血清含有培地の存在下で同じドナーから生成された一致した細胞組成物間で比較した。
キメラ抗原受容体（CAR）を発現する遺伝子操作されたヒトT細胞は、実質的に実施例1に記載されるプロセスによって、例示的なSFM-Aの存在下で産生された。この研究では、CARを発現するT細胞を産生するために、CD4+およびCD8+ T細胞を、イムノアフィニティに基づいた濃縮によってドナーの白血球アフェレーシスサンプルから個別に分離し、約1：1で混合し、抗CD3/抗CD28磁気ビーズの存在下で活性化し、抗BCMA CARをコードするウイルスベクターを形質導入し、約37℃でのインキュベーションにより培養して該細胞を増殖させた。活性化、形質導入、および細胞の拡大増殖のための培養は、5％（v/v）ヒト血清含有培地または実施例3に記載のSFM-A培地のいずれかで、それぞれサイトカインの存在下で実施した。産生された遺伝子操作T細胞組成物の例示的な特徴を、SFM-Aまたは血清含有培地の存在下で同じドナーから生成された一致した細胞組成物間で比較した。
A. 生存率
活性化の後、活性化と形質導入の後、および培養開始（日数＝0）後から6日目までの各日のT細胞の生存率を評価した。培養開始後2日目までのこのプロセスの早い段階では、血清含有培地と比較して、SFM-Aの存在下で培養した細胞組成物には、より低い細胞数と生存率が観察された。しかしながら、増殖の3日目までに、SFM-Aおよび血清含有配合物の存在下で培養した細胞間で生存率は同じくらいになった。この結果は、無血清培地の存在下でのT細胞の増殖の遅れと一致しており、それは、例えば、細胞がこのプロセスの初期段階の間に無血清条件に順応するためである。初期のより低い細胞数にもかかわらず、SFM-Aの存在下での細胞の培養は、5日目と6日目までにやや多い数の生存細胞をもたらし、血清含有培地に匹敵するパーセントの生存細胞をもたらした。
活性化の後、活性化と形質導入の後、および培養開始（日数＝0）後から6日目までの各日のT細胞の生存率を評価した。培養開始後2日目までのこのプロセスの早い段階では、血清含有培地と比較して、SFM-Aの存在下で培養した細胞組成物には、より低い細胞数と生存率が観察された。しかしながら、増殖の3日目までに、SFM-Aおよび血清含有配合物の存在下で培養した細胞間で生存率は同じくらいになった。この結果は、無血清培地の存在下でのT細胞の増殖の遅れと一致しており、それは、例えば、細胞がこのプロセスの初期段階の間に無血清条件に順応するためである。初期のより低い細胞数にもかかわらず、SFM-Aの存在下での細胞の培養は、5日目と6日目までにやや多い数の生存細胞をもたらし、血清含有培地に匹敵するパーセントの生存細胞をもたらした。
B. CAR-T細胞の活性
増殖後のT細胞組成物中のCAR+ T細胞の機能活性は、ゴルジ体阻害剤の存在下でのホルボールミリステートアセテート（PMA）/イオノマイシンによる刺激後にサイトカイン蓄積をモニタリングすることによって評価した。サイトカインの多機能蓄積は、表面CD4、CD8または抗BCMA CARについて共染色された細胞でのIL-2、IFN-γおよびTNF-αの細胞内サイトカイン染色（ICS）によって評価した。血清含有培地で培養した細胞と比較して、SFM-Aの存在下で培養した細胞では、機能的なCAR+ CD4+ T細胞またはCAR+ CD8+ T細胞の同等の割合（IL-2、IFN-γおよびTNF-αの多機能蓄積により評価される）が観察された。
増殖後のT細胞組成物中のCAR+ T細胞の機能活性は、ゴルジ体阻害剤の存在下でのホルボールミリステートアセテート（PMA）/イオノマイシンによる刺激後にサイトカイン蓄積をモニタリングすることによって評価した。サイトカインの多機能蓄積は、表面CD4、CD8または抗BCMA CARについて共染色された細胞でのIL-2、IFN-γおよびTNF-αの細胞内サイトカイン染色（ICS）によって評価した。血清含有培地で培養した細胞と比較して、SFM-Aの存在下で培養した細胞では、機能的なCAR+ CD4+ T細胞またはCAR+ CD8+ T細胞の同等の割合（IL-2、IFN-γおよびTNF-αの多機能蓄積により評価される）が観察された。
作製された抗BCMA CAR+ T細胞組成物と抗原発現細胞との共培養後に、Luminex Multiplexアッセイを用いて、サイトカインIL-2、IFN-γ、TNF-α、さらにGM-CSFの産生を上清で測定した。炎症性サイトカイン（IL-2、TNF-α、GM-CSFおよびIFN-γ）の分泌は、血清含有培地と比べると、SFM-Aの存在下で作製された培養物間で同等であった。
C. アポトーシスマーカー
抗BCMA CAR+ T細胞組成物（血清含有培地または例示的なSFM-Aのいずれかを用いたプロセスで産生し、続いて凍結保存し、分析前に解凍したもの）を活性カスパーゼ3の表面発現について評価した。SFM-Aの存在下で培養した、遺伝子操作されたCD3+ CAR+細胞の5％未満は、活性カスパーゼ-3が陽性であった。活性カスパーゼ-3が陽性であったCD3+CAR+細胞の頻度は、血清含有培地と比べると、SFM-Aの存在下で培養した場合に、例示的ドナーから産生された一致したT細胞組成物においてより低かった。
抗BCMA CAR+ T細胞組成物（血清含有培地または例示的なSFM-Aのいずれかを用いたプロセスで産生し、続いて凍結保存し、分析前に解凍したもの）を活性カスパーゼ3の表面発現について評価した。SFM-Aの存在下で培養した、遺伝子操作されたCD3+ CAR+細胞の5％未満は、活性カスパーゼ-3が陽性であった。活性カスパーゼ-3が陽性であったCD3+CAR+細胞の頻度は、血清含有培地と比べると、SFM-Aの存在下で培養した場合に、例示的ドナーから産生された一致したT細胞組成物においてより低かった。
D. 形質導入頻度
作製されたT細胞組成物の形質導入頻度は、フローサイトメトリーにより決定された。抗BCMA CARの表面発現を、CAR特異的試薬を用いて測定した。ドナーが一致した例示的なT細胞組成物では、SFM-Aを含むプロセスによって産生された細胞は、血清含有培地を含むプロセスによって産生された細胞と比較して、形質導入効率の増加を示した。例示的な実験では、形質導入効率は約53％から約68％に増加した。
作製されたT細胞組成物の形質導入頻度は、フローサイトメトリーにより決定された。抗BCMA CARの表面発現を、CAR特異的試薬を用いて測定した。ドナーが一致した例示的なT細胞組成物では、SFM-Aを含むプロセスによって産生された細胞は、血清含有培地を含むプロセスによって産生された細胞と比較して、形質導入効率の増加を示した。例示的な実験では、形質導入効率は約53％から約68％に増加した。
実施例5：無血清培地プロセスにより産生されたCAR発現T細胞の抗腫瘍効果
抗BCMA CAR+ T細胞組成物は、実質的に実施例1および3に記載される例示的なSFM-Aを含むプロセスによって産生された。比較として、一致したドナーからのT細胞組成物を、血清含有培地を使用することを除いて、同様のプロセスによって産生した。生成されたCAR+ T組成物の抗腫瘍効果は、腫瘍担持動物モデル、例えばOPM2ヒト多発性骨髄腫播種異種移植マウスモデルに細胞を養子移入した後で腫瘍をモニタリングすることによって評価した。
抗BCMA CAR+ T細胞組成物は、実質的に実施例1および3に記載される例示的なSFM-Aを含むプロセスによって産生された。比較として、一致したドナーからのT細胞組成物を、血清含有培地を使用することを除いて、同様のプロセスによって産生した。生成されたCAR+ T組成物の抗腫瘍効果は、腫瘍担持動物モデル、例えばOPM2ヒト多発性骨髄腫播種異種移植マウスモデルに細胞を養子移入した後で腫瘍をモニタリングすることによって評価した。
腫瘍担持マウスを作製するために、6〜8週齢の雌NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウスに、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした2×106のOPM2（多発性骨髄腫）細胞（OPM2-ffluc）を注入した。腫瘍サイズを13日目に生物発光イメージングを使用してモニタリングし、14日目に、マウスに、SFM-Aを含むプロセスによって産生された、または血清含有培地を含むプロセスによって産生された抗BCMA CAR+ T細胞組成物の単回静脈内（i.v.）注入を行った。評価対象の抗BCMA CAR+ T細胞組成物は、同じヒトドナーから作製されたものであった。1×106、5×105、または2.5×105細胞の用量でCAR発現T細胞を投与した。CARを発現しない細胞（モック）を陰性対照として使用した。細胞の投与後、腫瘍の成長とマウスの生存を、100日間にわたって監視した。
養子移入されたCAR発現細胞の抗腫瘍活性は、CAR T細胞注入後100日目までの様々な日に、生物発光イメージングによってモニタリングした。生物発光イメージングのために、PBSに再懸濁したルシフェリン基質（CaliperLife Sciences社, Hopkinton, MA）（15μg/g体重）の腹腔内（i.p.）注射をマウスに施した。本質的にWO2015/095895に記載されるように、マウスを麻酔し、画像化した。各時点で全フラックス（光子/秒）を測定した。陰性対照で処置されたマウスについては、腫瘍量が大きいため、CAR-T移入後22〜26日で動物を屠殺した。SFM-Aまたは血清含有培地のいずれかを用いて産生されたCAR発現T細胞は、腫瘍の成長を遅らせて、生存を長引かせた；これは、全ての評価された用量でおおむね同等であった。
実施例6: 例示的なプロセス条件
実施例1に記述された例示的なプロセスと同様であるが、異なるプロセス段階のさまざまな局面が変えられた例示的なプロセスにおいて用いられる条件に関連するさまざまなパラメータが評価された。変えられた局面には、活性化密度およびインキュベーション時間、形質導入パラメータ、使用するサイトカインのタイプおよび濃度、ならびに灌流率の局面が含まれた。これらの異なる変えられたプロセスによって作出された細胞組成物の結果が評価された。
実施例1に記述された例示的なプロセスと同様であるが、異なるプロセス段階のさまざまな局面が変えられた例示的なプロセスにおいて用いられる条件に関連するさまざまなパラメータが評価された。変えられた局面には、活性化密度およびインキュベーション時間、形質導入パラメータ、使用するサイトカインのタイプおよび濃度、ならびに灌流率の局面が含まれた。これらの異なる変えられたプロセスによって作出された細胞組成物の結果が評価された。
本実施例6における各プロセスには、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞がドナー対象の白血球アフェレーシスサンプルから選択される選択段階が含まれ、その結果、それぞれ、CD4+およびCD8+ T細胞の2つの別々の組成が得られ、その後におよそ1:1の比率の生存CD4+および生存CD8+細胞での生存細胞の混合、その後に抗CD3/抗CD28磁気ビーズおよび無血清培地中の1つまたは複数のサイトカインの存在下での混合細胞の活性化、例示的なCARをコードするウイルスベクターによる形質導入ならびに抗CD3/抗CD28磁気ビーズおよび無血清培地中の1つまたは複数のサイトカインの存在下での培養、その後に異なるプロセス間で変えられたある種の特定のパラメータを用いた配合および凍結保存が行われた。
A. 活性化インキュベーション時間
1つの研究では、選択後および形質導入前の(抗CD3/抗CD28コーティングビーズ、サイトカインおよび無血清培地の存在下での)インキュベーション持続時間を変化させた。具体的には、インキュベーションは、24時間(3個体ドナーからのn = 5の細胞組成物)または48時間(2個体ドナーからのn = 2の細胞組成物)のいずれかで実行された。
1つの研究では、選択後および形質導入前の(抗CD3/抗CD28コーティングビーズ、サイトカインおよび無血清培地の存在下での)インキュベーション持続時間を変化させた。具体的には、インキュベーションは、24時間(3個体ドナーからのn = 5の細胞組成物)または48時間(2個体ドナーからのn = 2の細胞組成物)のいずれかで実行された。
プロセスによって作出された最終的な細胞組成物におけるT細胞の形質導入の効率はフローサイトメトリーによって、CD3 (抗CD3試薬を使用)およびCAR (組み換えBCMA-Fc試薬を使用)の表面発現の染色により評価された。形質導入開始前のインキュベーション24時間の持続時間を用いるプロセスによって作出された、操作された細胞組成物は、形質導入開始前のインキュベーション48時間の持続時間を用いるプロセスによって作出された細胞組成物と比較して、およそ2倍高い割合の形質導入T (CD3+CAR+)細胞を有することが観察された。
さらに、異なるインキュベーション持続時間でのプロセスによって産生された、操作された細胞は、K562-BCMAと4日間共培養された。増殖をモニタリングするために、細胞を増殖マーカー色素CELLTRACE VIOLET (CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA) =で標識した。共培養後、細胞を抗BCMA CAR、CD4、およびCD8の表面発現について染色し、フローサイトメトリーで測定した。
結果を表E1にまとめる。CD4+およびCD8+ T細胞の両方で、平均蛍光強度(MFI)によって決定されるCAR +細胞でのCAR表面発現のレベルがさらに高いこと、およびこのアッセイ法での抗原発現細胞誘導性増殖の程度がさらに高いこと(CTV色素での希釈により測定され、CTV MFIの低下によって示される)が、48時間のインキュベーションを用いたプロセスと比べて抗CD3/抗CD28磁気ビーズとの24時間の形質導入前のインキュベーションを用いたプロセスで作出された、操作された細胞組成物において観察された。これらの結果は、およそ24時間の持続時間のような、48時間未満の選択後、形質導入前のインキュベーション持続時間を含む例示的なプロセスによる、CAR形質導入効率およびCAR抗原特異的機能性の向上と一致している。
（表Ｅ１）K562-BCMA標的細胞とのインキュベーション後のCARおよびCTV染色
B. 活性化細胞密度
抗CD3/抗CD28磁気ビーズ、サイトカインおよび培地との形質導入前のインキュベーション中の細胞密度の影響も、インキュベーションが細胞1.5×106個/mLの初期細胞密度の細胞で開始されたプロセスによって作出された、操作された細胞組成物の特徴を、インキュベーションが細胞3×106個/mLの細胞で開始されたプロセスによって作出されたものと対比して、インキュベーション段階が細胞5×106個/mLの初期密度の細胞で開始されたプロセスによって作出されたものと対比して比較することにより評価された。いずれの場合にも、インキュベーション持続時間はおよそ24時間であった。
抗CD3/抗CD28磁気ビーズ、サイトカインおよび培地との形質導入前のインキュベーション中の細胞密度の影響も、インキュベーションが細胞1.5×106個/mLの初期細胞密度の細胞で開始されたプロセスによって作出された、操作された細胞組成物の特徴を、インキュベーションが細胞3×106個/mLの細胞で開始されたプロセスによって作出されたものと対比して、インキュベーション段階が細胞5×106個/mLの初期密度の細胞で開始されたプロセスによって作出されたものと対比して比較することにより評価された。いずれの場合にも、インキュベーション持続時間はおよそ24時間であった。
そのようなプロセスによって作出された細胞の機能的活性に対する細胞密度の影響を評価するために、作出された抗BCMA CAR-T細胞が7日またはそれ以上の日数の間の複数ラウンドの抗原曝露にわたって照射K562-BCMA標的細胞との共培養でインキュベートされる連続刺激アッセイ法に、そのような細胞を供した。共培養の4日目に、細胞を収集し、カウントして、細胞数を初期播種密度にリセットした後、同じ培養条件下で新しい標的細胞と再インキュベートした。T細胞を4日目および7日目に回収し、上記のように増殖について評価した。
一般に、形質導入前のインキュベーションが細胞1.5×106個/mLまたは細胞3×106個/mLの細胞密度で開始されたプロセスは、インキュベーション段階が細胞5×106個/mLの細胞密度で開始されたプロセスによって作出された例示的な操作された細胞組成物と比較して、本アッセイ法において複数ラウンドの刺激にわたり一貫した抗原特異的機能性および増殖能で、複数のヒトドナーにわたって細胞組成物を産生することが観察された。これらの結果は、形質導入前のインキュベーションが細胞5×106個/mL未満の細胞密度で開始されたプロセスによって作出された、操作された細胞組成物において、複数ラウンドの刺激にわたり増殖および抗原特異的機能を示す能力の一貫性の向上という結論と一致していた。
C. 形質導入条件
形質導入条件の影響を評価した。形質導入条件を変えて上記のプロセスによって細胞組成物を作出した。具体的には、異なるプロセスで、スピノキュレーション有りまたは無しで(例えば、垂直遠心分離機を用いて1600 gで60分間)、および形質導入アジュバント有りまたは無しで、形質導入を実行した。スピノキュレーションによる形質導入は、スピノキュレーション無しで形質導入が実行された細胞と比べて大幅に高い頻度のCD3+CAR+ 細胞を有することが観察された。形質導入段階中に形質導入アジュバントが存在しなかった場合でさえも、これらのプロセスで同様の形質導入効率が観察された。
形質導入条件の影響を評価した。形質導入条件を変えて上記のプロセスによって細胞組成物を作出した。具体的には、異なるプロセスで、スピノキュレーション有りまたは無しで(例えば、垂直遠心分離機を用いて1600 gで60分間)、および形質導入アジュバント有りまたは無しで、形質導入を実行した。スピノキュレーションによる形質導入は、スピノキュレーション無しで形質導入が実行された細胞と比べて大幅に高い頻度のCD3+CAR+ 細胞を有することが観察された。形質導入段階中に形質導入アジュバントが存在しなかった場合でさえも、これらのプロセスで同様の形質導入効率が観察された。
実施例7: 拡大増殖中の抗CD3/抗CD28ビーズ:細胞の比率
血清含有培地中1:1または3:1のいずれかのビーズと細胞との比率で、拡大増殖段階において血清含有培地が用いられたことを除き、実施例1に記述されるプロセスの形質導入後インキュベーション(拡大増殖)段階中に抗CD3/抗CD28磁気ビーズと細胞との比率を変化させることの、実施例1および実施例6に記述されるものと同様のプロセスによって産生された操作細胞の特徴に及ぼす影響。プロセスの形質導入後の拡大増殖段階中に、細胞の組成物を、拡大増殖、生存性、ならびに細胞外pHおよび乳酸レベルについて毎日評価した。本アッセイ法において、3:1のビーズ:細胞の比率を用いてこのインキュベーション段階が実行された細胞は、揺動運動バイオリアクタへの接種後5日の時点でより大きな程度の拡大増殖を呈したが、接種後3日に細胞生存性の減少傾向を示した。細胞外pHおよび乳酸レベルは逆相関していることが観察された。1:1の比率でインキュベートされた細胞の場合、細胞が拡大増殖し続けたとしても、細胞外乳酸の蓄積およびpHの低下は3日後に鈍化した。3:1の比率でインキュベートされた細胞の場合、細胞生存性の低下と一致して、細胞外の乳酸レベルは蓄積し続け、pHは3日目以降も低下し続けた。
血清含有培地中1:1または3:1のいずれかのビーズと細胞との比率で、拡大増殖段階において血清含有培地が用いられたことを除き、実施例1に記述されるプロセスの形質導入後インキュベーション(拡大増殖)段階中に抗CD3/抗CD28磁気ビーズと細胞との比率を変化させることの、実施例1および実施例6に記述されるものと同様のプロセスによって産生された操作細胞の特徴に及ぼす影響。プロセスの形質導入後の拡大増殖段階中に、細胞の組成物を、拡大増殖、生存性、ならびに細胞外pHおよび乳酸レベルについて毎日評価した。本アッセイ法において、3:1のビーズ:細胞の比率を用いてこのインキュベーション段階が実行された細胞は、揺動運動バイオリアクタへの接種後5日の時点でより大きな程度の拡大増殖を呈したが、接種後3日に細胞生存性の減少傾向を示した。細胞外pHおよび乳酸レベルは逆相関していることが観察された。1:1の比率でインキュベートされた細胞の場合、細胞が拡大増殖し続けたとしても、細胞外乳酸の蓄積およびpHの低下は3日後に鈍化した。3:1の比率でインキュベートされた細胞の場合、細胞生存性の低下と一致して、細胞外の乳酸レベルは蓄積し続け、pHは3日目以降も低下し続けた。
細胞に対する抗CD3/抗CD28磁気ビーズの比率が異なる操作された細胞を作出するためのプロセスを評価した。操作された細胞組成物を、ドナー対象由来の白血球アフェレーシスサンプルからのCD4+およびCD8+ T細胞の選択を含むプロセスによって作出し、引き続いて約1:1の比率で細胞を混合後に血清含有培地中1:1または3:1のビーズと細胞との比率での抗CD3/抗CD28磁気ビーズによる活性化、例示的な抗BCMA CARによる形質導入、および細胞を拡大増殖させるための培養を行った。
操作された組成物からの細胞をフローサイトメトリーで調べた。組み換えBCMA-Fc試薬を用いCAR発現について、ならびにCD3、CD4、CD8および活性カスパーゼ3、つまり例示的なアポトーシスマーカーの表面発現について細胞を染色した。3:1のビーズと細胞との比率で刺激されたおよそ50%のCD3+細胞が活性化カスパーゼ3陽性であり、そのおよそ半分が抗BCMA CAR発現陽性であった。対照的に、1:1の比率で刺激されたCD3+細胞のおよそ10%が活性カスパーゼ3陽性であり、そのうちの31%がCARを発現していた。活性カスパーゼ3陽性であるCD4+細胞とCD8+細胞との同様の比率が観察された。
これらの結果は、1:1の抗CD3および抗CD28抗体結合ビーズと細胞との比率で刺激された操作細胞組成物での生存性の改善と一致している。
実施例8: CAR-T細胞を含有する細胞組成物を作出するための製造プロセス中のサイトカインの包含
培地中に存在するサイトカインのタイプを変えることを除き、実施例1および実施例6に記述されたものと同様のプロセスによって産生された操作細胞の特徴に対する影響を評価した。抗BCMA CARを発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含有する操作された組成物は、IL-2、IL-7、およびIL-15の異なる組み合わせの存在下で、単離されたT細胞から作出された。多発性骨髄腫を有する6個体ドナーからのT細胞を試験した。
培地中に存在するサイトカインのタイプを変えることを除き、実施例1および実施例6に記述されたものと同様のプロセスによって産生された操作細胞の特徴に対する影響を評価した。抗BCMA CARを発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含有する操作された組成物は、IL-2、IL-7、およびIL-15の異なる組み合わせの存在下で、単離されたT細胞から作出された。多発性骨髄腫を有する6個体ドナーからのT細胞を試験した。
CD4+およびCD8+ T細胞は、多発性骨髄腫を有する患者に由来するサンプルから単離された。抗CD3/抗CD28磁気ビーズの存在下で細胞を刺激し、抗BCMA CARをコードするウイルスベクターで形質導入し、培養して細胞を拡大増殖させた。刺激、形質導入および拡大増殖の各段階は、IL-2のみ; IL-2、IL-7およびIL-15; IL-2およびIL-15; またはIL-2およびIL-7のいずれかの、サイトカインの存在下、無血清培地中で実施された。
組み換えBCMA-Fc試薬を用い抗BCMA CARの発現について、ならびにCD3、CD4、CD8および活性カスパーゼ3の表面発現についてフローサイトメトリーにより、操作された組成物からの細胞を評価した。
高い頻度のCD3+CAR+細胞が、異なるサイトカインの組み合わせの存在下で産生された全ての操作された細胞組成物において観察された。全3つのサイトカインの組み合わせは、活性カスパーゼ3陽性のCD3+ T細胞の割合が最も低く一貫していることを示した。
抗原刺激活性を細胞内サイトカイン染色(ICS)で評価した。操作された組成物由来の細胞を、ゴルジ阻害剤の存在下で、BCMAを発現するヒト多発性骨髄腫細胞株である照射MM.1S細胞と共培養した。IL-2、IFN-γもしくはTNF-αの細胞内サイトカインの蓄積について、または全3つのサイトカインの多機能染色について、細胞を評定した。結果から、各ドナーより産生された、操作された細胞組成物が機能的なCD4+CAR+およびCD8+CAR+ T細胞を含んでいたことが示された。内部IL-2、IFN-γ、TNF-α陽性であった抗原刺激CD4+およびCD8+細胞、ならびに全3つ陽性の多機能細胞が、サイトカインの各組み合わせで産生された、操作された細胞組成物において観察された。
操作された組成物の細胞を、CD45RA、CCR7、CD27およびCD28で染色することで、フローサイトメトリーによりサブ表現型について評価した。CD45RAおよびCCR7染色の結果は、各条件下で作出された、操作された細胞組成物が主にCD45RA+CCR7+CD4+およびCD8+ T細胞で構成されていることを示していた。低レベルのCD45RA+CCR7-細胞が、操作された細胞組成物の全てで観察された。CD27およびCD28染色の結果は、各条件下で作出された、操作された細胞組成物が、主にCD27+CD28+ CD4+およびCD8+ T細胞を含むことを示していた。低レベルのCD27-CD28- CD4+およびCD8+ T細胞が、操作された細胞組成物の全てで観察された。
実施例9: 出発組成物の表現型とCAR+ T細胞組成物におけるCD4+ 対 CD8+ CAR発現細胞の比率との相関
キメラ抗原受容体(CAR)を発現する自己T細胞を含むCAR+ T細胞組成物は、11名の別々のドナーから回収されたアフェレーシスより作出され、各ドナーサンプルから4つの試験サンプルが別々に処理された。1名のドナーは、骨髄腫を有する患者で、残りのドナーは健常な対象であった。各アフェレーシスサンプルを洗浄した後、アポトーシスマーカーを用い細胞生存性についてならびにCD4およびCD8の表面発現についてフローサイトメトリーにより各サンプルを評価して、各アフェレーシスサンプルの実行での生存CD4+ T細胞とCD8+ T細胞との比率(CD4/CD8比)を決定した。
キメラ抗原受容体(CAR)を発現する自己T細胞を含むCAR+ T細胞組成物は、11名の別々のドナーから回収されたアフェレーシスより作出され、各ドナーサンプルから4つの試験サンプルが別々に処理された。1名のドナーは、骨髄腫を有する患者で、残りのドナーは健常な対象であった。各アフェレーシスサンプルを洗浄した後、アポトーシスマーカーを用い細胞生存性についてならびにCD4およびCD8の表面発現についてフローサイトメトリーにより各サンプルを評価して、各アフェレーシスサンプルの実行での生存CD4+ T細胞とCD8+ T細胞との比率(CD4/CD8比)を決定した。
CD4+およびCD8+ T細胞は、免疫親和性に基づく選択により、アフェレーシスサンプルから選択された。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を、生存CD4+細胞とCD8+細胞との比率1:1で組み合わせた。組み合わせた細胞のサンプルをフローサイトメトリーにより、アポトーシス特異的マーカーを用い細胞生存性について、ならびにCD4、CD8、CD45RAおよびCCR7を含んだマーカーの表面発現について評価した。選択したCD4およびCD8細胞の混合物中の生存CD45RA+/CCR7+CD4+と生存CD45RA+/CCR7+CD8+との比率(CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比)を決定した。
CAR+ T細胞組成物を作出するために、サイトカインの存在下で抗CD3および抗CD28抗体でコーティングされたビーズとのインキュベーションにより、CD4+およびCD8+ T細胞を組み合わせて活性化し、その後、抗BCMA CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。CARには、BCMAに特異的なscFv抗原結合ドメイン、スペーサー、CD28膜貫通領域、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、およびCD3ゼータ由来の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれていた。形質導入後、細胞を拡大増殖させ、次いで凍結保存により凍結した。凍結組成物中の細胞を融解し、生存性、CD4およびCD8の表面発現、ならびにCAR発現についてBCMA-Fc試薬を用いフローサイトメトリーによって評価した。CD8+であった生存CAR+細胞に対する、CD4+であった生存CAR+細胞の比率を決定した(CAR+ CD4/CD8比)。
アフェレーシスサンプルでのCD4/CD8比、または選択されたCD4およびCD8細胞の混合物でのCD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比を、事後、操作されたCAR-T細胞組成物でのCAR+ CD4/CD8比と比較した。各対象からの平均比の相関の程度を二変量分析によって評価し、プロットされたデータの0.990確率領域を表す二変量正規楕円を、それぞれ図1Aおよび1Bに示す。表E2Aおよび表E2Bは、それぞれ図1Aおよび図1Bにプロットされたデータに関して実行されたピアソン相関分析の結果を示す。
（表Ｅ２Ａ）二変量正規楕円P = 0.990; アフェレーシスサンプルでのCD4/CD8比
（表Ｅ２Ｂ）二変量正規楕円P = 0.990; 選択されたCD4およびCD8細胞の混合物でのCD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比
図1Aおよび表E2Aに示されるように、この実験では、アフェレーシスサンプルからのCD4+およびCD8+ T細胞の生存CD4/CD8比は、最終組成物におけるCAR+ CD4/CD8比と相関しなかった。この結果は、全生存細胞に基づく活性化前1:1の比率での精製CD4およびCD8 T細胞の混合が、アウトプットT細胞組成物におけるCD4+およびCD8+ T細胞の1:1の比率と必ずしも相関しないという所見と一致している。
図1Bおよび表E2Bに示されるように、この実験において、最終T細胞組成物でのCAR+ CD4/CD8比は、CD4およびCD8細胞の混合物でのCD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比によって決定される、開始ナイーブ様細胞CD4/CD8 T細胞比と正の相関があった。特に、図1Bにおける結果は、ピアソン相関係数およびp値 <0.0001に基づいて、開始サンプルでのCD45RA+/CCR7+/CD4+細胞とCD45RA+/CCR7+/CD8+細胞との比率とT細胞組成物でのCAR+ CD4/CD8比の相関が高いことを示す。この相関は、インプット組成物のおよびプロセス実行間のばらつきにもかかわらず保持された。この例示的なサンプルセットからのこのモデル適合に基づいて、約1.1:1のCD45RA+/CCR7+/CD4+ 対 CD45RA+/CCR7+/CD8+比がアウトプットT細胞組成物での約1:1のCAR+ CD4/CD8比をもたらすものと決定付けられた。
これらのデータは、例えばCD45RA+およびCCR7+表面発現によって決定される、ナイーブ様CD4+サブセットとナイーブ様CD8+ T細胞サブセットとの比率を制御することにより、アウトプットT細胞組成物でのCD4+細胞およびCD8+細胞の比率および/または組成を制御および/または調整することが可能であるという仮説を裏付ける。
実施例10: 開始T細胞集団の表現型と、操作されたCAR+ T細胞組成物でのCAR+CD4+とCAR+CD8+ T細胞との比率の相関
計50の操作されたCAR+ T細胞組成物を、15名の健常ドナーおよび1名の多発性骨髄腫患者から回収されたアフェレーシスサンプルから作出した。CAR-T組成物を作出するために、生存可能な選択されたCD4+およびCD8+ T細胞を1:1の比率で開始細胞組成物中に組み合わせ、その後、実施例9に記述されているように活性化し、形質導入し、および拡大増殖させた。組み合わせた生存CD4+およびCD8+ T細胞の出発組成物からのサンプルをフローサイトメトリーにより、生存性についてならびにCD4、CD8、CD27、CD45RA、CCR7およびCD62Lを含めたマーカーの表面発現について評価した。
計50の操作されたCAR+ T細胞組成物を、15名の健常ドナーおよび1名の多発性骨髄腫患者から回収されたアフェレーシスサンプルから作出した。CAR-T組成物を作出するために、生存可能な選択されたCD4+およびCD8+ T細胞を1:1の比率で開始細胞組成物中に組み合わせ、その後、実施例9に記述されているように活性化し、形質導入し、および拡大増殖させた。組み合わせた生存CD4+およびCD8+ T細胞の出発組成物からのサンプルをフローサイトメトリーにより、生存性についてならびにCD4、CD8、CD27、CD45RA、CCR7およびCD62Lを含めたマーカーの表面発現について評価した。
操作されたCAR+ T細胞組成物からのサンプルを、CAR発現についてならびにCD4およびCD8を含めたマーカーの表面発現について評価した。ある種のプロセスパラメータを変化させたことを除き、実施例9に記述されるのと同じ例示的なプロセスを用いて作出された、同じドナーの個々のCAR+ T細胞組成物のCD4+CAR+ T細胞とCD8+CAR+T細胞との比率(CAR+ CD4/CD8比)について平均を計算した。平均のCAR+ CD4/CD8比を、組み合わせた生存CD4+ 対 CD8+細胞の出発組成物のさまざまな表現型との相関について分析した。選択されたCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を、活性化前に1:1の比率で組み合わせても、作出されるアウトプット細胞組成物での1:1のCAR+ CD4/CD8比とは必ずしも相関しなかった。
平均のCAR+ CD4/CD8比と各ドナーの表現型との間の相関の程度を二変量分析により評価した。0.950の確率を表す二変量正規楕円をCD45RA+/CCR7+/CD4+ T細胞 対 CD45RA+/CCR7+/CD8+比(CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比; 図2A); CD62L-/CCR7+/CD4+ 対 CD62L-/CCR7+/CD8+比(CD62L-/CCR7+ CD4/CD8比; 図2B); およびCD27+/CCR7+/CD4+ 対 CD27+/CCR7+/CD8+比(CD27+/CCR7+ CD4/CD8比; 図2C)について示す。表E3は、図2A〜2Cにプロットされたデータに関して実行されたピアソン相関分析の結果を示す。
（表Ｅ３）例示的な表現型の二変量正規楕円P=0.950
この分析から、実施例9に記述される例示的なプロトコルを用いて、CAR+ CD4/CD8比が健常ドナーのCD45RA+ /CCR7+ CD4/CD8 T細胞比と正に相関するが、この実験において、1名の患者のサンプルではそうでないことが示された。CAR+ CD4/CD8比は、健常ドナーおよび患者サンプル出発細胞組成物の両方においてCD62L-/CCR7+ CD4/CD8およびCD27+/CCR7+ CD4/CD8の比率と正に相関することが示された。モデル適合に基づき、1.69:1の出発CD27+/CCR7+ CD4/CD8比によって、およそ1:1のCAR+ CD4/CD8比を有するアウトプット細胞組成物が作出されると予測されるものと計算された。これらの結果は、CD27+CCR7+ CD4/CD8比を出発細胞組成物において調整し、操作された細胞組成物の結果的に得られるCAR+ CD4/CD8比を制御および/または予測できるという知見と一致した。
実施例11: 出発組成物の表現型に基づいてCAR+ T細胞組成物を産生するプロセス
CARを発現する自己T細胞を含む10例のCAR+ T細胞組成物を、2名の健常ドナーおよび1名の多発性骨髄腫患者を含む、3名の別々のドナーから回収されたアフェレーシスより作出した。CD4+およびCD8+ T細胞を、実施例9に記述されているようにアフェレーシスサンプルから選択した。アフェレーシスサンプルおよび選択されたCD4+およびCD8+ T細胞をフローサイトメトリーにより、生存性ならびにCD27、CCR7、CD4およびCD8を含む表面マーカーについて評価した。選択されたCD4+およびCD8+ T細胞のなかでCD27+/CCR7+細胞の頻度を決定し、各ドナーはアフェレーシスサンプルにおいてCD27+/CCR7+ CD4+細胞とCD27+/CCR7+ CD8+細胞とのさまざまな比率を示していた。例えば、患者のサンプルでは、およそ12.2:1のCD27+/CCR7+ CD4+細胞とCD27+/CCR7+ CD8+細胞との比率が示されたが、2名の健常ドナーサンプルでは、3.56:1および2.15:1のCD27+/CCR7+ CD4+細胞とCD27+/CCR7+ CD8+細胞との比率が示された。インプット細胞組成物は、(1) 選択されたCD4+およびCD8+細胞を1:1の生存CD4+ 対 CD8+比(生存CD4/CD8)で組み合わせ、(2) CD4+およびCD8+細胞をCD27+/CCR7+CD4+細胞およびCD27+/CCR7+ CD8+細胞の比率(CD27+/CCR7+ CD4/CD8) 1.69:1で組み合わせた後に活性化することにより作出された。インプット組成物からの計300×106個の細胞または100×106個の細胞のいずれかを活性化し、形質導入し、および拡大増殖させて、実質的に実施例9に記述されるようにアウトプット細胞組成物を作出した。
CARを発現する自己T細胞を含む10例のCAR+ T細胞組成物を、2名の健常ドナーおよび1名の多発性骨髄腫患者を含む、3名の別々のドナーから回収されたアフェレーシスより作出した。CD4+およびCD8+ T細胞を、実施例9に記述されているようにアフェレーシスサンプルから選択した。アフェレーシスサンプルおよび選択されたCD4+およびCD8+ T細胞をフローサイトメトリーにより、生存性ならびにCD27、CCR7、CD4およびCD8を含む表面マーカーについて評価した。選択されたCD4+およびCD8+ T細胞のなかでCD27+/CCR7+細胞の頻度を決定し、各ドナーはアフェレーシスサンプルにおいてCD27+/CCR7+ CD4+細胞とCD27+/CCR7+ CD8+細胞とのさまざまな比率を示していた。例えば、患者のサンプルでは、およそ12.2:1のCD27+/CCR7+ CD4+細胞とCD27+/CCR7+ CD8+細胞との比率が示されたが、2名の健常ドナーサンプルでは、3.56:1および2.15:1のCD27+/CCR7+ CD4+細胞とCD27+/CCR7+ CD8+細胞との比率が示された。インプット細胞組成物は、(1) 選択されたCD4+およびCD8+細胞を1:1の生存CD4+ 対 CD8+比(生存CD4/CD8)で組み合わせ、(2) CD4+およびCD8+細胞をCD27+/CCR7+CD4+細胞およびCD27+/CCR7+ CD8+細胞の比率(CD27+/CCR7+ CD4/CD8) 1.69:1で組み合わせた後に活性化することにより作出された。インプット組成物からの計300×106個の細胞または100×106個の細胞のいずれかを活性化し、形質導入し、および拡大増殖させて、実質的に実施例9に記述されるようにアウトプット細胞組成物を作出した。
活性化段階における細胞の総数が、CAR+ CD4/CD8比に影響を与えることは観察されなかった。患者サンプル由来を含めて、約1.69:1の比率で混合されたCD27+/CCR7+ CD4/CD8細胞を含有する出発組成物から作出されたアウトプット細胞組成物は、1:1の所望の標的比率のものに近いCAR+CD4/CD8比(例えばおよそ1.86:1〜1:1.86)を示した。1:1の比率で混合された生存CD4/CD8細胞を含有するインプット組成物から作出されたアウトプット細胞組成物は、CD27+/CCR7+ CD4+細胞およびCD27+/CCR7+ CD8+細胞の比率1.69:1でCD4+およびCD8+細胞を含有するインプット組成物から作出された組成物と比較して、CAR+ CD4/CAR+ CD8比の大きなばらつきを示した。この実験では、例示的なプロセスにおいて患者材料を用いて作出されたアウトプット組成物は、それぞれ、100×106個の細胞または300×106個の細胞が活性化された場合に、およそ7.6および8.6のCAR+ CD4/CAR+ CD8比を示した。同様のプロセスで表現型に基づき混合されると、例えば比率1.69:1のCD27+CCR7+ CD4+: CD27+CCR7+ CD8+ T細胞では、それぞれ、100×106個の細胞または300×106個の細胞が活性化された場合に、最終的なCAR+ CD4/CAR+ CD8比は1.6および1.3であった。これらの結果は、特定の表現型、例えばCD27+/CCR7+細胞が健常ドナーおよび患者の両方のサンプルから作出されたアウトプット組成物において結果的に得られるCAR+ CD4/CAR+ CD8比と相関しうるという知見と一致している。
実施例12: 出発組成物の表現型とCAR+ T細胞組成物中のCD4+ 対 CD8+ CAR発現細胞の比率との間の相関の罹患対象由来サンプルの評価
キメラ抗原受容体(CAR)を発現する自己T細胞を含有するCAR+ T細胞組成物は、多発性骨髄腫を有する7名の別々のドナーから回収されたアフェレーシスより作出された。
キメラ抗原受容体(CAR)を発現する自己T細胞を含有するCAR+ T細胞組成物は、多発性骨髄腫を有する7名の別々のドナーから回収されたアフェレーシスより作出された。
CD4+およびCD8+ T細胞は、免疫親和性に基づく選択により、アフェレーシスサンプルから選択された。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を、生存CD4+ 対 CD8+細胞の比率1:1で組み合わせた。組み合わせた細胞のサンプルを、CD4、CD8、CD27、CD45RA、CCR7およびCD62Lを含めたマーカーの表面発現について評価した。選択されたCD4およびCD8細胞の混合物において、以下の細胞表現型の比率を決定した(1) CD27+/CCR7+ CD4+細胞 対 CD27+/CCR7+ CD8+ 細胞 (CD27+/CCR7+ CD4/CD8比)、(2) CD45RA+/CCR7+ CD4+細胞 対 CD45RA+/CCR7+ CD8+細胞 (CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比)、および(3) CD62L-/CCR7+ CD4+細胞 対 CD62L-/CCR7+ CD8+細胞 (CD62L-/CCR7+ CD4/CD8比)。
抗BCMA CARを発現するCAR+ T細胞組成物は、作出された細胞の活性化、形質導入、拡大増殖および凍結保存を含めて、実質的に実施例9に記述されるプロセスを用いて作出された。凍結組成物中の細胞を融解し、生存性、CD4およびCD8の表面発現、ならびにCAR発現についてBCMA-Fc試薬を用いフローサイトメトリーによって評価した。CD8+であった生存CAR+細胞に対する、CD4+であった生存CAR+細胞の比率を決定した(CAR+ CD4/CD8比)。
選択CD4およびCD8細胞の混合物でのCD27+/CCR7+ CD4/CD8比、CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比、またはCD62L-/CCR7+ CD4/CD8比を、事後、操作されたCAR-T細胞組成物でのCAR+ CD4/CD8比と比較した。各対象からの平均比の相関の程度を、プロットされたデータの0.950確率領域を表す二変量正規楕円によって評価し、これを図3A〜3Cに示す。示されるように、T細胞組成物でのCAR+ CD4/CD8比に対する出発サンプルでのCD27+/CCR7+ CD4/CD8比、CD45RA+/CCR7+ CD4/CD8比、またはCD62L-/CCR7+ CD4/CD8比の相関は、ピアソン相関分析に基づいて有意であった。表E4A〜E4Cは、図3A〜3Cにプロットされたデータに関して実行された相関分析の結果を示す。有意性 <0.05は＊で示されている。
（表Ｅ４Ａ）二変量正規楕円P = 0.950; 出発サンプルおよびアウトプット細胞組成物におけるCD4/CD8比
（表Ｅ４Ｂ）二変量正規楕円P = 0.950; 出発サンプルおよびアウトプット細胞組成物におけるCD4/CD8比
（表Ｅ４Ｃ）二変量正規楕円P = 0.950; 出発サンプルおよびアウトプット細胞組成物におけるCD4/CD8比
実施例13: 培養中の細胞生存性の決定のための連続インライン画像化
組み換え受容体の発現を操作するプロセスでのT細胞のさまざまな光学パラメータは、インライン微分デジタルホログラフィー顕微鏡法(differential digital holography microscopy; DHM)を用いて取得された。微分DHMは、オブジェクトセグメント化のための高コントラスト画像を用いて、細胞の無標識画像化を可能にし、例えば、細胞数および生存性を決定するために、画像化されたオブジェクトを定量的に記述する複数の光学的または形態学的特徴を取得することを可能にする。
組み換え受容体の発現を操作するプロセスでのT細胞のさまざまな光学パラメータは、インライン微分デジタルホログラフィー顕微鏡法(differential digital holography microscopy; DHM)を用いて取得された。微分DHMは、オブジェクトセグメント化のための高コントラスト画像を用いて、細胞の無標識画像化を可能にし、例えば、細胞数および生存性を決定するために、画像化されたオブジェクトを定量的に記述する複数の光学的または形態学的特徴を取得することを可能にする。
健常ヒトドナー由来の初代T細胞は、全体として上記の実施例1および6に記述されている、例示的な操作プロセスを用いて、抗BCMAキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作された。2回の実験的実行が実施された(実行(Run) 1, 実行2)。細胞は、バイオリアクタ(例えば、揺動運動バイオリアクタ)への移入により拡大増殖のために培養された。培養には、半連続的灌流および連続的混合による培地交換が含まれた。
インライン微分DHM画像化システム(「連続」)、例えばOvizio iLine F (Ovizio Imaging Systems NV/SA, Brussels, Belgium)を用いて、細胞のホログラフィー像および光学パラメータを最大およそ120時間の培養の間に連続的に捉えた。インライン微分DHMシステムには、サンプルがバイオリアクタから、チューブシステムを通って流れ出し、そこを通過する細胞のホログラフィー像および光学パラメータを画像化システムが捉え、サンプルをバイオリアクタに戻すことができるように、バイオリアクタに接続された使い捨てのチューブシステムが含まれた。細胞生存性および生存細胞数(VCC)が、画像から決定された。操作された細胞の生存性は、手動サンプリング(「手動」)および最大およそ120時間の培養の間のさまざまな時点でサンプリングされる、自動細胞計数器を用いた細胞計数による結果とも比較された。時間経過分析および線形回帰に基づいて2つの方法を比較した。
図4Aおよび4Bは、実験的実行1 (図4A)および実行2 (図4B)において、微分DHMまたは手動サンプリングによる連続モニタリングを用いて評価された、生存細胞数(VCC)および生存性の比較を示す。比較のR2および傾きを以下の表E5に示す。2つの方法を用いて測定されたVCCの差異は、手動サンプリング方法の予想される分散内に収まった。
（表Ｅ５）サンプリング方法間の比較のR2および傾き
結果から、連続モニタリングおよび手動サンプリングとしてのVCCおよび生存性は高度に相関していることが示された。この結果は、細胞操作プロセスにおける細胞拡大増殖のための培養中の微分DHMによる連続モニタリングの有用性と一致していた。
実施例14: 連続インライン画像化を用いた手動拡大増殖および自動拡大増殖の比較
インライン画像化および自動灌流による細胞の連続モニタリングによる、完全に自動化された操作者不要の細胞拡大増殖法を、手動拡大増殖法と比較した。
インライン画像化および自動灌流による細胞の連続モニタリングによる、完全に自動化された操作者不要の細胞拡大増殖法を、手動拡大増殖法と比較した。
例示的な操作プロセスを用い、健常ヒトドナー由来の初代T細胞を活性化し、ベクターで形質導入して、例示的なキメラ抗原受容体(CAR)を発現させた。形質導入後、細胞をプールし、1つは微分DHMを用いた連続インライン画像化に基づく自動拡大増殖で、1つは手動拡大増殖法で、2つの異なる培養物に接種した。
自動拡大増殖培養では、半連続灌流および連続混合により培地交換しながら、揺動運動バイオリアクタ中で細胞を培養した。全体として上記の実施例13に記述されているように、自動微分DHM画像化システムを用いて、細胞生存性および生存細胞数(VCC)をモニタリングした。接種時の最初のVCCは両方の培養で類似していた(自動培養では0.12×106個の細胞/mL、手動培養では0.14×106個の細胞/mL)。自動拡大増殖の灌流は、ソフトウェアアルゴリズムによって計算された4時間のVCCローリング平均に基づいており、ここで方法の進行には標的VCCよりも大きいVCC平均が必要とされた。標的VCCは、3回の灌流段階で0.6×106個の細胞/mL、1×106個の細胞/mLおよび4×106個の細胞/mLであった。接種後、追加の操作者介入は行われなかった。手動の拡大増殖培養では、灌流は、全体として上記の実施例1に記述されているように、毎日1回のサンプリングで実施された。フローサイトメトリーによりマーカーの細胞表面発現についても細胞を評価した。
図5に示されるように、より高いT細胞の成長が自動拡大増殖システムで観察された。連続微分DHM画像化によって評価された細胞生存性、およびフローサイトメトリーによって評価された細胞表現型は、自動拡大増殖プロセス vs 手動拡大増殖プロセスの間で類似していた。
この結果は、ヒト操作者を必要とせずに、T細胞操作プロセス中の細胞の培養およびモニタリングのための、連続DHM画像化および自動拡大増殖プロセスの有用性と一致していた。いくつかの局面において、そのような方法は、初代T細胞の成長動態を決定するために、および投与の操作のため細胞の収集の時間を決定するために用いることができる。
実施例15：例示的な製造プロセスで作製されたT細胞組成物の評価
本質的に実施例1に記載される例示的なプロセスにおいて、10名の健康なドナーと40名の多発性骨髄腫患者とを含む50名のヒト対象から別々に収集されたアフェレーシス（各対象から1つのアフェレーシス）から、抗BCMA CARを発現する自己T細胞を含む50のCAR+ T細胞組成物を作製した。CD4+およびCD8+ T細胞をアフェレーシスサンプルから選択し、別々に凍結保存した。次に、該細胞を解凍し、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を、生存CD4+細胞対CD8+細胞の比が1：1になるように組み合わせた。組み合わせたCD4+およびCD8+ T細胞を、本質的に実施例1に記載されるように、活性化し、CARをコードするベクターを形質導入し、拡大増殖させて、凍結保存した。
本質的に実施例1に記載される例示的なプロセスにおいて、10名の健康なドナーと40名の多発性骨髄腫患者とを含む50名のヒト対象から別々に収集されたアフェレーシス（各対象から1つのアフェレーシス）から、抗BCMA CARを発現する自己T細胞を含む50のCAR+ T細胞組成物を作製した。CD4+およびCD8+ T細胞をアフェレーシスサンプルから選択し、別々に凍結保存した。次に、該細胞を解凍し、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を、生存CD4+細胞対CD8+細胞の比が1：1になるように組み合わせた。組み合わせたCD4+およびCD8+ T細胞を、本質的に実施例1に記載されるように、活性化し、CARをコードするベクターを形質導入し、拡大増殖させて、凍結保存した。
例示的な代替プロセスでは、治療用T細胞組成物は、55名の各ヒトがん対象からの白血球アフェレーシスサンプルからのT細胞のイムノアフィニティに基づいた選択を含むプロセスによって作製された。バルクT細胞を活性化、CARをコードするウイルスベクターによる形質導入、拡大増殖および凍結保存に供した。
凍結組成物中の細胞を解凍し、生存率、活性カスパーゼ3（CAS）などのアポトーシスマーカーの発現、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7およびCD45RA、ならびにCARの表面発現についてフローサイトメトリーで評価した。該組成物中のCD3+細胞の割合、CD3+ CAR+細胞中のCAR+アポトーシスマーカー陰性細胞の割合、および該組成物中のセントラルメモリーCD4+ CAR+細胞とセントラルメモリーCD8+ CAR+細胞の割合を決定した。前記製造プロセスで作製された細胞組成物の細胞表現型を評価し、いくつかの局面では、代替プロセスで作製された細胞組成物の細胞表現型と比較した。
この実施例の製造プロセスは、所定の特徴を満たす遺伝子操作された細胞組成物をもたらした；そのような特徴には、患者に細胞組成物を投与したときの（それが実施されたヒト生物学的サンプルを100％として）CARを発現する細胞の閾値数が含まれる。図6Aおよび6Bは、40名の多発性骨髄腫対象由来のサンプルのグループから個別に作製された組成物についての、それぞれ、CD4+ CAR+細胞（図6A）のうちの、およびCD8+ CAR+細胞（図6B）のうちの、示された表現型（CD45RAおよびCCR7表面発現に基づく）の細胞のパーセントの中央値（水平線）、四分位範囲（箱）、および1.5×四分位範囲（ひげ）を示す。図6Cおよび6Dは、40名の多発性骨髄腫対象由来のサンプルのグループから個別に作製された組成物についての、それぞれ、該組成物中のCD4+ CAR+細胞（図6C）のうちの、およびCD8+ CAR+細胞（図6D）のうちの、示された表現型（CD27およびCD28表面発現に基づく）の細胞のパーセントの中央値（水平線）、四分位範囲（箱）、および1.5×四分位範囲（ひげ）を示す。広範な多発性骨髄腫患者から得られた個々の白血球アフェレーシスサンプルの場合、そのようなサンプルから遺伝子操作された細胞組成物を作製するためのこの例示的なプロセスを使用すると、活性化の開始から回収までの該プロセスの部分の持続期間の範囲は7〜10日であり、これらのサンプル間の平均持続期間は約7.5日であることが観察された。さらに、異なるサンプル間の該プロセスの過程での平均の累積集団倍加数は約7.5であることが判明した。
この研究では、例示的なプロセスで産生された細胞組成物中の遺伝子操作されたT細胞集団は、15％未満のアポトーシスマーカー発現細胞を含み、かつ出発サンプルと比較して、および例示的な代替プロセスを用いて産生された細胞組成物と比較して、セントラルメモリー表現型が濃縮されていた。
実施例16: 抗BCMA CARを発現する操作されたT細胞の治療用組成物を作出するためのプロセス
抗BCMAキメラ抗原受容体(CAR)を発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含有する操作された組成物を産生するために、実施例1に記述されたプロセスと同様の例示的なプロセスを実行した。多発性骨髄腫(MM)を有する対象由来を含めて、ヒト白血球アフェレーシスサンプル由来のPBMCを含有する生体サンプルから初代CD4+およびCD8+細胞を濃縮した。濃縮したCD4+および濃縮したCD8+細胞組成物を、別々に冷凍凍結し、その後、融解し、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞1:1の比率で混合した後に、刺激、形質導入および拡大増殖の段階を実行した。
抗BCMAキメラ抗原受容体(CAR)を発現するCD4+およびCD8+ T細胞を含有する操作された組成物を産生するために、実施例1に記述されたプロセスと同様の例示的なプロセスを実行した。多発性骨髄腫(MM)を有する対象由来を含めて、ヒト白血球アフェレーシスサンプル由来のPBMCを含有する生体サンプルから初代CD4+およびCD8+細胞を濃縮した。濃縮したCD4+および濃縮したCD8+細胞組成物を、別々に冷凍凍結し、その後、融解し、生存CD4+ T細胞および生存CD8+ T細胞1:1の比率で混合した後に、刺激、形質導入および拡大増殖の段階を実行した。
混合された細胞組成物からのおよそ300×106個のT細胞(例えば、150×106個のCD4+および150×106個のCD8+ T細胞)を、約3×106個の細胞/mLの密度で、組み換えIL-2、IL-7およびIL-15を含有する例示的な無血清培地(例えば、実施例3を参照のこと)中1:1のビーズ 対 細胞の比率にて抗CD3抗体および抗CD28抗体が付着した常磁性ポリスチレンコーティングビーズの存在下において18〜30時間インキュベートした。
インキュベーション後、インキュベートされた細胞組成物からの少なくともおよそ100×106個および最大でおよそ200×106個の生存細胞を、サイトカインを有する例示的な無血清培地中で、60分間のスピノキュレーションにより抗BCMA CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、その後に約37℃で約18〜30時間のインキュベーションを行った。CARには、BCMAに特異的なscFv抗原結合ドメイン、CD28膜貫通領域、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、およびCD3ゼータ由来の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれていた。
次に、形質導入された細胞を、インキュベーションおよび形質導入の段階中に用いられるIL-2、IL-7およびIL-15の2倍の濃度を含有する例示的な無血清培地約500 mL中、バイオリアクタ(例えば揺動運動バイオリアクタ)内での培養により拡大増殖した。培地にはポロキサマーが含有されていなかった。およそ0.6×106個の細胞/mL超の細胞密度が達成されたと見なされた後に、1000 mLの容量まで周期的に、例えば約2〜約15分、新鮮培地のショットを加えるように培地を段階的に加え、0.6×106個の細胞/mL超または約0.6×106個の細胞/mL超の閾値生存細胞密度が達成されるまで、細胞を定常揺動状態(非灌流)の下で培養した。生存細胞密度が0.8×106個の細胞/mLを超える場合、充填/灌流の組み合わせ段階を開始し、ここでは1000 mLの標的容量まで、最初の培地を上記のように段階的に加え、その後、以下で説明されるように灌流を開始した。その後、培地を、連続混合を伴う半連続灌流により交換した。細胞密度が増加するにつれて、灌流速度および/または揺動速度は、拡大増殖段階の間に少なくとも1回増やされた。細胞密度が増加するにつれて、灌流速度は、拡大増殖段階の間に少なくとも1回増やされた。1日あたりの総容量を生存細胞密度によって決定しながら(ある密度に達したらさらに高速度で)、最大で、例えば1日あたり培養物におよそ750 mLまたは1500 mLの総新鮮培地が加えられるようにする速度まで(さらに高い細胞濃度に達した場合にはさらに高速度で)、段階的に培養物に培地を加え、約0.5時間ごと〜約1.5時間または2時間ごとなど、定期的に1日を通して新鮮培地のショットを加えた。有核細胞の総数(TNC)が少なくともまたは少なくともおよそ1000×106個に達した1日後におよびTNC数が少なくともまたは少なくともおよそ2400×106個の総有核細胞に達した時点で、少なくとも85%の生存性で、一度に細胞を収集した。収集後、抗CD3および抗CD28抗体結合ビーズを細胞組成物から除去した。
次に、細胞を配合し、組成物のアリコートを、例えば、下流の貯蔵または使用のために容器に移した。いくつかの態様において、配合された組成物またはその一部分は、細胞組成物の凍結保存および貯蔵、例えば、対象への潜在的な投与に適した冷凍バッグ(CryoStore Freezing Bagのような)に移され、および/または組成物もしくはその一部分は、細胞のさらなる分析のためのような、バイアルまたは他の容器に移された。細胞は、例えば、下流の融解および投与のための使用に適切な条件の下で、冷凍凍結された。場合によっては、30 mLの容量の配合された細胞が個々のバッグ中で用いられた。いくつかの例では、例えば、細胞をさまざまな全細胞濃度で凍結保存して、投与のための細胞との関連で、各用量におけるCAR+ T細胞の一貫した数または濃度を可能にした。いくつかの態様において、標的CAR+ CD3+細胞数は、30 mLあたりまたはバッグあたり所望の数またはおよそ所望の数の(およそ37.5×106などの) CAR+CD3+細胞であり、これはいくつかの態様において、異なるドナーまたは患者から作出された組成物の間でさまざまな全細胞濃度を伴う。
ある範囲の多発性骨髄腫患者から得られた個々の白血球アフェレーシスサンプルについて、この例示的なプロセスを用いて、そのようなサンプルから操作された細胞組成物を作出することで、活性化の開始から収集までのプロセスの部分の期間の範囲5〜8日、およびこれらのサンプル間の平均期間5.5日が得られるものと確認された。このサンプル群のプロセスにわたる累積集団倍加の平均数はおよそ5であることがさらに確認された。
本実施例における例示的なプロセスを用いて、いくつかのヒト多発性骨髄腫白血球アフェレーシスサンプルから操作されたT細胞組成物を作出した。細胞表現型、機能および細胞操作を反映するものを含めて、さまざまなパラメータを評価した。T細胞の純度、T細胞系統の再現(representation)、形質導入の頻度および機能性は、実施例1に記述されるプロセスを用いてこれらの白血球アフェレーシス製品で作出された組成物の場合と実質的に同様であることが観察された。実施例1の例示的なプロセスと比較して、本実施例の例示的なプロセスを用いた産生では、活性化の開始と収集との間に低減された集団倍加数および平均持続日数が観察された。一般に、中央記憶表現型細胞の類似のまたは増加した割合(およびエフェクタ記憶表現型細胞の類似のまたは減少した割合)が、実施例1におけるものと比較して、本実施例における例示的なプロセスによって産生された、操作された細胞組成物において観察された。
本発明は、例えば、本発明のさまざまな局面を例示するために提供される特定の開示された態様に範囲が限定されるものと意図されない。記述された組成物および方法に対するさまざまな変形は、本明細書における記述および教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実践されることができ、本開示の範囲内に含まれるものと意図される。
配列
Claims (178)
- （a）CD4＋T細胞の組成物とCD8＋T細胞の組成物とを、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比で組み合わせ、それにより、インプット組成物を生成する工程、
（b）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程であって、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、工程
を含み、
インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、
操作された細胞の組成物を製造する方法。 - インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞が、対象から得られた初代試料から濃縮または選択され、任意で、インプット組成物中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞が、対象から得られた初代試料から別々に濃縮または選択される、請求項1記載の方法。
- CD4＋T細胞の組成物が、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD4＋T細胞を含む、請求項1または請求項2記載の方法。
- CD8＋T細胞の組成物が、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％のCD8＋T細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程
を含み、
インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、
刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、
操作された細胞の組成物を製造する方法。 - インキュベーションが無血清培地中で行われる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％の細胞を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、100×106〜500×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、300×106個または約300×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生存細胞である、請求項9記載の方法。
- インプット組成物が、1×106細胞/mL〜5×106細胞/mLの濃度を有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、3×106細胞/mLまたは約3×106細胞/mLの濃度を有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、1:1または約1:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比を有する、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.1:1または約1.1:1である、請求項16記載の方法。
- インプット組成物が、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.69:1または約1.69:1である、請求項18記載の方法。
- インプット組成物が、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を、任意で2.0:1〜1.5:1の比で含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
- 刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む作用物質とを接触させることを含む、工程
をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。 - 接触が、ベクターを用いたトランスフェクションによる接触であり、ベクターが、トランスポゾン、任意でスリーピングビューティー（SB）トランスポゾンまたはピギーバックトランスポゾンであるか、
接触が、ウイルスベクターを用いた形質導入による接触である、
請求項21記載の方法。 - 刺激された組成物からの細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することを含む、工程
をさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。 - 導入が無血清培地中で行われる、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が300×106個未満の細胞を含む、請求項21〜24のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が50×106個の細胞〜200×106個の細胞、任意で約100×106個の細胞、例えば、約100×106個のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項21〜25のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が少なくとも約100×106個の細胞かつ最大約200×106個の細胞、例えば、少なくとも約100×106個かつ最大約200×106個のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含む、請求項21〜25のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が3×106細胞/mL未満の濃度を有する、請求項21〜27のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mLの濃度を有する、請求項21〜28のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する、請求項21〜29のいずれか一項記載の方法。
- 刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する工程を含む、請求項21〜30のいずれか一項記載の方法。
- 刺激された組成物の細胞が生存細胞である、請求項21〜31のいずれか一項記載の方法。
- 操作された細胞の組成物を製造する方法であって、T細胞組成物の細胞に組換え受容体を導入する工程を含み、T細胞組成物が、1mL当たり少なくとも1×106個または少なくとも約1×106個の生存細胞の濃度を有し、T細胞組成物の細胞の少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％が、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞である、前記方法。
- T細胞組成物の濃度が、1mL当たり5×106個未満の生存細胞である、請求項33記載の方法。
- T細胞組成物が、少なくとも100×106個または少なくとも約100×106個または約100×106個の生存細胞を含むか、T細胞組成物が、少なくとも約100×106個の生存細胞かつ最大約200×106個の生存細胞を含む、請求項33または34のいずれか一項記載の方法。
- T細胞組成物が、300×106個未満の生存細胞を含む、請求項33〜35のいずれか一項記載の方法。
- 導入が、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することによってT細胞に接触させることを含む、請求項33〜36のいずれか一項記載の方法。
- 導入が無血清培地中で行われる、請求項33〜37のいずれか一項記載の方法。
- T細胞組成物の1つまたは複数の細胞が、活性化され、かつ/またはLDL受容体の表面発現を含む、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
- 前記細胞組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％が、
（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、
（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、
（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または
（iv）増殖することができる、
請求項33〜39のいずれか一項記載の方法。 - 導入前に、前記組成物の細胞が、刺激条件下でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程を含むプロセスによって生成され、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、請求項33〜40のいずれか一項記載の方法。
- インキュベーションが無血清培地中で行われ、任意で、導入が、インキュベーション用の無血清培地と同じまたは異なる組成の無血清培地中で行われる、請求項41記載の方法。
- 以下の工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法：
（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートし、それにより、刺激された組成物を生成する工程であって、
インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、
刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、
工程、ならびに
（b）刺激された組成物の300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入し、それにより、操作された細胞組成物を生成する工程であって、導入が、刺激された組成物の細胞と、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターとを接触させることを含む、工程。 - インキュベーションおよび/または導入が無血清培地中で行われる、請求項43のいずれか一項記載の方法。
- CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が生存細胞である、請求項43または44のいずれか一項記載の方法。
- 刺激された組成物からの細胞が生存細胞である、請求項44のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でのインキュベーションの開始後2日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後2日以内に、導入が開始される、請求項33〜46のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でのインキュベーションの開始後36時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後36時間以内に、導入が開始される、請求項33〜47のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でのインキュベーションの開始後30時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わされた後30時間以内に、導入が開始される、請求項33〜48のいずれか一項記載の方法。
- 操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養し、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を製造する工程
をさらに含む、請求項33〜49のいずれか一項記載の方法。 - 培養が無血清培地中で行われる、請求項50記載の方法。
- 以下の工程を含む、操作された細胞の組成物を製造する方法：
（a）刺激条件下でインプット組成物をインキュベートする工程であって、それにより、刺激された組成物が生成され、インプット組成物が、2:1〜1:2のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有し、インプット組成物が、5×106細胞/mL未満の濃度で少なくとも100×106個の総CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を含み、刺激条件が、TCR複合体の1つまたは複数の成分の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/あるいは1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる刺激試薬の存在を含む、工程、
（b）刺激された組成物からの300×106個未満の細胞に組換え受容体を導入する工程であって、それにより、操作された細胞組成物が生成され、導入が、刺激された組成物の細胞に、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを形質導入することを含む、工程、ならびに
（c）操作された細胞の増殖および/または拡大増殖を促進する条件下で、操作された組成物を培養する工程であって、それにより、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物が製造される、工程。 - インキュベーション工程、導入工程および培養工程の1つ、2つまたは全部が、1つの無血清培地または複数の無血清培地中で行われ、任意で、複数の無血清培地が同じ組成または異なる組成を有する、請求項52記載の方法。
- インプット組成物が、1.5:1〜1:1.5のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、1.2:1〜0.8:1のCD4＋細胞：CD8＋細胞比、任意で1:1または約1:1のCD4＋T細胞：CD8＋T細胞比を有する、請求項41〜53のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋およびCD8＋を含む、請求項41〜54のいずれか一項記載の方法。
- CD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD4＋細胞とCD45RAおよびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.1:1または約1.1:1である、請求項55記載の方法。
- インプット組成物が、CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、請求項41〜56のいずれか一項記載の方法。
- CD27およびCCR7に対して表面陽性であるCD4＋細胞とCD27およびCCR7に対して表面陽性のCD8＋細胞との比が、1.69:1または約1.69:1である、請求項57記載の方法。
- インプット組成物が、CCR7に対して表面陽性でありかつCD62Lに対して表面陰性であるCD4＋細胞およびCD8＋細胞を含む、請求項41〜58のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が300×106個未満の細胞、任意で50×106個の生存細胞〜200×106個の生存細胞、および任意で100×106個または約100×106個の生存細胞を含む、請求項43〜59のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が少なくとも約100×106個の生存細胞かつ最大約200×106個の生存細胞を含む、請求項43〜59のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が3×106細胞/mL未満の濃度を有する、請求項43〜61のいずれか一項記載の方法。
- 導入のために、刺激された組成物が0.5×106細胞/mL〜2×106細胞/mL、任意で1×106細胞/mLまたは約1×106細胞/mLの濃度を有する、請求項43〜62のいずれか一項記載の方法。
- 刺激された組成物の細胞に組換え受容体を導入する前に、刺激条件下でインキュベートした後、刺激された組成物の組成を調整する、請求項43〜63のいずれか一項記載の方法。
- インキュベーションが、1つまたは複数のサイトカインの存在下で、任意で無血清培地中で行われる、請求項1〜64のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、請求項65記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項66記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項66または67記載の方法。
- 刺激された組成物の細胞の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％または少なくとも60％が、
（i）HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40Lおよび4-1BBからなる群より選択される表面マーカーを発現し、
（ii）IL-2、IFN-γ、TNF-αからなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現を含み、
（iii）細胞周期のG1以降の段階にあり、かつ/または
（iv）増殖することができる、
請求項1〜68のいずれか一項記載の方法。 - 刺激試薬が、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する主剤を含み、該主剤は任意でCD3に特異的に結合する、請求項1〜69のいずれか一項記載の方法。
- 刺激試薬が、T細胞共刺激分子に特異的に結合する副剤をさらに含み、任意で、該共刺激分子が、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される、請求項70記載の方法。
- 主剤および/または副剤が抗体を含み、任意で、刺激試薬が、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはその抗原結合断片とのインキュベーションを構成する、請求項70または請求項71記載の方法。
- 主剤および/または副剤が固体支持体の表面上に存在する、請求項71〜72のいずれか一項記載の方法。
- 固体支持体がビーズであるかビーズを含む、請求項73記載の方法。
- ビーズが、3.5μmを超えるか約3.5μmを超えるが約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を有する、請求項74記載の方法。
- ビーズが、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する、請求項74または請求項75記載の方法。
- ビーズが不活性である、請求項74〜76のいずれか一項記載の方法。
- ビーズがポリスチレン表面であるかポリスチレン表面を含む、請求項74〜77のいずれか一項記載の方法。
- ビーズが磁性または超常磁性である、請求項74〜78のいずれか一項記載の方法。
- ビーズ：細胞の比が3:1未満である、請求項74〜79のいずれか一項記載の方法。
- ビーズ：細胞の比が2:1〜0.5:1または約2:1〜約0.5:1であり、任意で、ビーズ：細胞の比が1:1または約1:1である、請求項74〜80のいずれか一項記載の方法。
- 主剤および副剤が、複数のストレプトアビジン分子またはストレプトアビジンムテイン分子を含むオリゴマー粒子試薬の表面に可逆的に結合される、請求項71〜72のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、刺激条件下で48時間未満インキュベートされる、請求項1〜82のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、刺激条件下で、12時間以上36時間以下インキュベートされる、請求項1〜83のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、刺激条件下で、18時間以上30時間以下インキュベートされる、請求項1〜84のいずれか一項記載の方法。
- インプット組成物が、刺激条件下で、24時間または約24時間インキュベートされる、請求項1〜85のいずれか一項記載の方法。
- 接触、任意で形質導入が、48時間未満行われる、請求項23〜86のいずれか一項記載の方法。
- 接触、任意で形質導入が、12時間以上36時間以下行われる、請求項23〜87のいずれか一項記載の方法。
- 接触、任意で形質導入が、18時間以上30時間以下行われる、請求項23〜88のいずれか一項記載の方法。
- 接触、任意で形質導入が、24時間または約24時間行われる、請求項23〜89のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項23〜90のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項23〜91のいずれか一項記載の方法。
- 接触、任意で形質導入が、形質導入アジュバントの非存在下で行われる、請求項23〜92のいずれか一項記載の方法。
- 導入が、1つまたは複数のサイトカインの存在下で、任意で無血清培地中で行われる、請求項23〜93のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、請求項94記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および/または10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項94または95記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、10〜200IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜1,000IU/mLの組換えIL-7および10〜200IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項94〜96のいずれか一項記載の方法。
- 培養の少なくとも一部が、混合および/または灌流を用いて行われる、請求項50〜97のいずれか一項記載の方法。
- 培養の少なくとも一部が、500mL/日、600mL/日、700mL/日、750mL/日、800mL/日、900mL/日、1,000mL/日、1,200mL/日、1,400mL/日、1,500mL/日、1,600mL/日、1,800mL/日および/または2,000mL/日、約500mL/日、約600mL/日、約700mL/日、約750mL/日、約800mL/日、約900mL/日、約1,000mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日、約1,500mL/日、約1,600mL/日、約1,800mL/日および/または約2,000mL/日、あるいは少なくとも500mL/日、少なくとも600mL/日、少なくとも700mL/日、少なくとも750mL/日、少なくとも800mL/日、少なくとも900mL/日、少なくとも1,000mL/日、少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日、少なくとも1,500mL/日、少なくとも1,600mL/日、少なくとも1,800mL/日および/または少なくとも2,000mL/日の速度の灌流を用いて行われる、請求項98記載の方法。
- 培養の少なくとも第1の部分が、500mL/日、750mL/日もしくは1,000mL/日、約500mL/日、約750mL/日もしくは約1,000mL/日、または少なくとも500mL/日、少なくとも750mL/日もしくは少なくとも1,000mL/日の灌流速度により行われ、培養の少なくとも第2の部分が、1,200mL/日、1,400mL/日もしくは1,500mL/日、約1,200mL/日、約1,400mL/日もしくは約1,500mL/日、または少なくとも1,200mL/日、少なくとも1,400mL/日もしくは少なくとも1,500mL/日の灌流速度により行われる、請求項98または99記載の方法。
- 細胞が特定の密度に達すると、灌流が開始されかつ/または増加される、請求項98〜100のいずれか一項記載の方法。
- 特定の密度が、0.4×106個の細胞、0.5×106個の細胞、0.6×106個の細胞、0.8×106個の細胞、1.0×106個の細胞、1.2×106個の細胞、1.4×106個の細胞、1.6×106個の細胞、1.8×106個の細胞、2.0×106個の細胞、2.2×106個の細胞もしくは2.4×106個の細胞、約0.4×106個の細胞、約0.5×106個の細胞、約0.6×106個の細胞、約0.8×106個の細胞、約1.0×106個の細胞、約1.2×106個の細胞、約1.4×106個の細胞、約1.6×106個の細胞、約1.8×106個の細胞、約2.0×106個の細胞、約2.2×106個の細胞もしくは約2.4×106個の細胞、または少なくとも0.4×106個の細胞、少なくとも0.5×106個の細胞、少なくとも0.6×106個の細胞、少なくとも0.8×106個の細胞、少なくとも1.0×106個の細胞、少なくとも1.2×106個の細胞、少なくとも1.4×106個の細胞、少なくとも1.6×106個の細胞、少なくとも1.8×106個の細胞、少なくとも2.0×106個の細胞、少なくとも2.2×106個の細胞もしくは少なくとも2.4×106個の細胞である、請求項101記載の方法。
- 細胞が0.6×106細胞/mLまたは約0.6×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または750mL/日または約750mL/日の速度に増加される、請求項98〜102のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が2.0×106細胞/mLまたは約2.0×106細胞/mLの密度に達すると、灌流が開始されかつ/または1500mL/日もしくは約1500mL/日の速度に増加される、請求項98記載の方法。
- 培養が、1つまたは複数のサイトカインの存在下で、任意で無血清培地中で行われる、請求項50〜104のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、組換えIL-2、組換えIL-7および/または組換えIL-15から選択される、請求項105記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜2,000IU/mLの組換えIL-7および/または50〜400IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項105または106記載の方法。
- 1つまたは複数のサイトカインが、50〜400IU/mLの組換えIL-2、100IU/mL〜2,000IU/mLの組換えIL-7および50〜400IU/mLの組換えIL-15を含む、請求項105〜107のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でのインキュベーションの開始後3日以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後3日以内に、培養が開始される、請求項50〜108のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でのインキュベーションの開始後60時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後60時間以内に、培養が開始される、請求項50〜109のいずれか一項記載の方法。
- 刺激条件下でのインキュベーションの開始後48時間以内かつ/またはインプット組成物のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞が組み合わせられた後48時間以内に、培養が開始される、請求項50〜110のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも組成物が閾値数のT細胞、閾値数の生存T細胞、閾値濃度のT細胞、閾値濃度の生存T細胞を含むまで、培養が行われる、請求項50〜111のいずれか一項記載の方法。
- T細胞の閾値数または生存T細胞の閾値数が、2400×106個もしくは5500×106個、約2400×106個もしくは約5500×106個、または少なくとも2400×106個もしくは少なくとも5500×106個の有核細胞総数であり、任意で、有核細胞総数の生存率が、約75％もしくは少なくとも約75％または約85％もしくは少なくとも約85％である、請求項112記載の方法。
- T細胞の閾値数、生存T細胞の閾値数、T細胞の閾値濃度、生存T細胞の閾値濃度に達した後、培養が少なくとも1日間継続され、任意で、T細胞の閾値数または生存T細胞の閾値数が、900×106個、1200×106個もしくは3500×106個、約900×106個、約1200×106個もしくは約3500×106個、または少なくとも900×106個、少なくとも1200×106個もしくは少なくとも3500×106個の有核細胞総数である、請求項112記載の方法。
- T細胞の閾値数が、約85％または少なくとも約85％の生存率を有する2400×106個または約2400×106個の有核細胞総数である、請求項50〜114のいずれか一項記載の方法。
- T細胞の閾値数が、5500×106個または約5500×106個の有核細胞総数である、請求項50〜114のいずれか一項記載の方法。
- 培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含む、請求項50〜116のいずれか一項記載の方法。
- 培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞が、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも9日の時点で収集される、請求項50〜117のいずれか一項記載の方法。
- 培養後にアウトプット組成物の細胞を収集する工程を含み、アウトプット組成物の細胞が、刺激条件下でのインキュベーションの開始後少なくとも10日の時点で収集される、請求項50〜118のいずれか一項記載の方法。
- 8日〜25日以内、任意で14日〜18日である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、請求項118または119記載の方法。
- 9日〜21日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、請求項118または119記載の方法。
- 9日〜16日以内である、インキュベーションの開始とアウトプット組成物の細胞の収集との間の期間の95％信頼区間を含む、請求項118または119記載の方法。
- 任意で薬学的に許容される賦形剤の存在下で、凍結保存および/または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化する工程をさらに含む、請求項52〜122のいずれか一項記載の方法。
- アウトプット組成物の細胞が、凍結保護物質の存在下で製剤化される、請求項123記載の方法。
- 凍結保護物質がDMSOを含む、請求項124記載の方法。
- アウトプット組成物の細胞が、容器、任意でバイアルまたはバッグ内で製剤化される、請求項122〜125のいずれか一項記載の方法。
- インキュベーション前に生体試料からCD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1〜126のいずれか一項記載の方法。
- 単離が、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて、任意で陽性選択または陰性選択により、細胞を選択することを含む、請求項127記載の方法。
- 単離が、免疫親和性に基づく選択を行うことを含む、請求項127または請求項128記載の方法。
- 生体試料が、対象から得られた初代T細胞を含む、請求項127〜129のいずれか一項記載の方法。
- 対象がヒト対象である、請求項130記載の方法。
- 生体試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物であるかまたはそれを含む、請求項127〜131のいずれか一項記載の方法。
- 疾患、障害または症状の細胞または組織に関連し、特異的であり、かつ/または発現する標的抗原に、組換え受容体が結合することができる、請求項1〜132のいずれか一項記載の方法。
- 疾患、障害または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患または腫瘍もしくはがんである、請求項133記載の方法。
- 標的抗原が腫瘍抗原である、請求項133または134記載の方法。
- 標的抗原が、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん-精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体α、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、グリピカン3（GPC3）、Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1;TYRP1またはgp75としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2;ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムδイソメラーゼまたはDCTとしても知られる）、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原、およびユニバーサルタグに関連する抗原から選択される、請求項133〜135のいずれか一項記載の方法。
- 組換え受容体が、機能的非TCR抗原受容体もしくはTCRまたはその抗原結合断片であるかまたはそれを含む、請求項1〜136のいずれか一項記載の方法。
- 組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項1〜137のいずれか一項記載の方法。
- 組換え受容体が抗BCMA CARである、請求項1〜138のいずれか一項記載の方法。
- キメラ抗原受容体が、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む、請求項138または139記載の方法。
- 抗原結合ドメインが、抗体、または任意で一本鎖断片であるその抗体断片であるかまたはそれを含む、請求項140記載の方法。
- 前記断片が、柔軟なリンカーによって結合された抗体可変領域を含む、請求項141記載の方法。
- 前記断片がscFvを含む、請求項141または請求項142記載の方法。
- キメラ抗原受容体が、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む、請求項138〜143のいずれか一項記載の方法。
- キメラ抗原受容体が、細胞内シグナル伝達領域を含む、請求項138〜144のいずれか一項記載の方法。
- 細胞内シグナル伝達領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項145記載の方法。
- 細胞内シグナル伝達ドメインが、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞内で一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む、請求項146記載の方法。
- 細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分であるかまたはそれを含む、請求項146または147記載の方法。
- キメラ抗原受容体が、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間に位置する膜貫通ドメインをさらに含む、請求項145〜148のいずれか一項記載の方法。
- 細胞内シグナル伝達領域が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項145〜149のいずれか一項記載の方法。
- 共刺激シグナル伝達領域が、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、請求項150記載の方法。
- 共刺激シグナル伝達領域が、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、請求項150または請求項151記載の方法。
- 共刺激シグナル伝達領域が、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある、請求項150〜152のいずれか一項記載の方法。
- 閾値数以上の数の細胞を含むアウトプット組成物が、方法の85％超もしくは約85％超、90％超もしくは約90％超または95％超もしくは約95％超の反復の間で製造される、請求項113〜153のいずれか一項記載の方法。
- 無血清培地が、
基本培地中の0.5mM〜5mMのL-グルタミンのジペプチド形態、
0.5mM〜5mMのL-グルタミン、および
少なくとも1つのタンパク質
を含み、該培地が血清を含まない、請求項1〜154のいずれか一項記載の方法。 - L-グルタミンのジペプチド形態がL-アラニル-L-グルタミンである、請求項155記載の方法。
- 無血清培地中のL-グルタミンのジペプチド形態の濃度が、2mMまたは約2mMである、請求項155または請求項156記載の方法。
- 無血清培地中のL-グルタミンの濃度が、2mMまたは約2mMである、請求項155〜157のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも1つのタンパク質が、アルブミン、インスリンまたはトランスフェリンのうちの1つまたは複数、任意でヒトもしくは組換えアルブミン、ヒトもしくは組換えインスリンまたはヒトもしくは組換えトランスフェリンのうちの1つまたは複数を含む、請求項155〜158のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜159または165〜177のいずれか一項記載の方法により作製された操作された細胞を含む、組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項160記載の組成物。
- 凍結保護物質、任意でDMSOを含む、請求項160または請求項161記載の組成物。
- 請求項160〜162のいずれか一項記載の組成物と、対象にアウトプット組成物を投与するための指示書とを含む、製造物品。
- 対象が、疾患または症状を有し、任意で、組換え受容体が、疾患もしくは症状に関連するまたは疾患もしくは症状の細胞上に発現するもしくは存在する抗原を特異的に認識するかまたはその抗原に特異的に結合する、請求項163記載の製造物品。
- 培養の少なくとも一部の間、細胞が、細胞生存率、濃度、密度、数またはそれらの組合せについてモニタリングされる、請求項55〜159のいずれか一項記載の方法。
- モニタリングが、光学的方法、任意で顕微鏡観察によって行われる、請求項165記載の方法。
- モニタリングが、明視野顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、微分干渉顕微鏡観察、位相差顕微鏡観察、デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DHM）、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）またはそれらの組合せによって行われる、請求項165または請求項166記載の方法。
- モニタリングが、微分デジタルホログラフィー顕微鏡観察（DDHM）によって行われる、請求項165〜167のいずれか一項記載の方法。
- モニタリングが、培養の少なくとも一部の間、断続的または連続的に行われ、任意で、培養中、少なくとも1時間ごと、少なくとも6時間ごと、少なくとも12時間ごと、少なくとも18時間ごと、少なくとも24時間ごとまたは少なくとも26時間ごとに行われる、請求項165〜168のいずれか一項記載の方法。
- モニタリングが、細胞がT細胞の閾値数、生存T細胞の閾値数、T細胞の閾値濃度または生存T細胞の閾値濃度に達するまで行われる、請求項165〜169のいずれか一項記載の方法。
- モニタリングおよび培養が閉鎖系で行われる、請求項165〜170のいずれか一項記載の方法。
- アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋であり、かつ/あるいは
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である、
請求項50〜159および165〜171のいずれか一項記載の方法。 - 前記方法の反復により、任意でヒト生体試料から、複数のアウトプット組成物が製造され、前記方法が複数の異なる個々の対象間で行われ、
複数のアウトプット組成物中のメモリー表現型の細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のセントラルメモリー表現型の細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、CD95＋、グランザイムB-および/またはCD127＋である細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物中のCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物の操作されたCD4＋T細胞、任意でCAR＋CD4＋T細胞内のセントラルメモリーCD4＋T細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、
複数のアウトプット組成物の操作されたCD8＋T細胞、任意でCAR＋CD8＋T細胞内のセントラルメモリーCD8＋T細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％であり、かつ/あるいは
複数のアウトプット組成物の操作されたT細胞、任意でCAR＋T細胞内のセントラルメモリーT細胞、任意でCD4＋セントラルメモリーT細胞およびCD8＋セントラルメモリーT細胞の平均割合が、約40％〜約65％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％または約60％〜約65％である、
請求項50〜159および165〜172のいずれか一項記載の方法。 - 前記方法が、ヒト生体試料の少なくとも約80％、約90％、約95％、約97％、約99％、約100％または100％において、アウトプット組成物中でCARを発現する細胞の所定の特徴、任意で閾値数を示すアウトプット組成物を製造し、前記方法が、複数の異なる個々の対象間で行われる、請求項1〜159および165〜173のいずれか一項記載の方法。
- 複数の異なる個々の対象が、疾患または症状を有する対象を含む、請求項174記載の方法。
- 疾患または症状ががんである、請求項175記載の方法。
- がんが、血液がんであり、任意で多発性骨髄腫である、請求項176記載の方法。
- 組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がメモリー表現型であり、
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がセントラルメモリー表現型であり、
組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCD27＋、CD28＋、CCR7＋、CD45RA-、CD45RO＋、CD62L＋、CD3＋、グランザイムB-および/またはCD127＋であり、かつ/あるいは
アウトプット組成物中の細胞の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または95％超がCCR7＋/CD45RA-またはCCR7＋/CD45RO＋である、
請求項160記載の組成物。
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