CN107109438A - 用于转导及细胞处理的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于细胞处理(例如用于治疗用途，例如用于过继细胞疗法)的方法、系统及试剂盒。所提供的方法包括转导方法，其中细胞和病毒在会导致细胞经病毒载体转导的条件下孵育。在一些实施方式中，该孵育在一般刚性的离心室的内部空腔进行，例如由硬塑料制成的圆柱形腔室，该空腔具有可变体积。所述方法包括其他处理步骤，包括在此腔室中进行的步骤，包括洗涤、选择、分离、孵育及配制。具体地，本发明是关于提供优于可用处理方法(例如可用于大规模处理的方法)的优势的方法。此类优势包括例如降低成本、流线化、增加功效、增加安全性及增加在不同对象及条件中的再现性。

Description

用于转导及细胞处理的方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2014年11月05日提交的名称为“用于转导及细胞处理的方法(Methodsfor Transduction and Cell Processing)”的美国临时申请第62/075,801号及2015年3月05日提交的名称为“用于转导及细胞处理的方法(Methods for Transduction and CellProcessing)”的美国临时申请第62/129,023号的优先权，所述临时申请的内容以全文引用的方式并入。
技术领域
本发明涉及用于治疗用途(例如用于过继细胞疗法)的细胞处理。所提供的方法一般包括转导方法，其中细胞和病毒载体颗粒在一定条件下孵育，使得细胞转导有病毒载体。孵育可在一般刚性的离心室(例如由硬塑料制成的圆柱形离心室)的内部空腔进行。所述方法包括其他处理步骤，包括在此离心室中进行的步骤，包括洗涤、选择、分离、培养及配制。具体地，本发明涉及提供优于可用处理方法(例如可用于大规模处理的方法)的优势的方法。此类优势包括例如降低成本、流线化、增加功效、增加安全性及增加在不同对象及条件中的再现性。
背景技术
某些方法可用于细胞处理，包括大规模方法及适用于制备用于过继细胞疗法的细胞的方法。举例而言，用于病毒载体转移的方法，例如转导、选择、分离、刺激、培养、洗涤及配制为可用的。可用方法尚未完全令人满意。举例而言，对于用于过继细胞疗法的细胞的大规模处理(例如转导)，需要改良方法。举例而言，需要改良功效及再现性且减少时间、成本、操作、复杂性和/或与此类生产相关联的其他参数的方法。所提供的实施方式为满足此类需要的方法、系统及试剂盒。
发明内容
提供用于细胞处理(例如用于病毒载体转移和/或基于免疫亲和力的细胞选择)的方法。在一些实施方式中，细胞适用于细胞疗法，此类原代细胞准备用于自体或同种异体转移，例如用于过继细胞疗法。所述方法可包括额外细胞处理步骤，例如细胞洗涤、分离(isolation)、分离(separation)。
在一些实施方式中，所述方法通过在例如离心室的内部空腔的器皿中孵育含有细胞和病毒载体颗粒的组合物(视为输入组合物)，所述病毒颗粒含有重组病毒载体，从而产生含有多个转导有病毒载体的细胞的输出组合物。离心室通常能围绕旋转轴旋转。在一些实施方式中，旋转轴为垂直的。该离心室通常包括端壁、自端壁延伸的侧壁(例如基本上刚性侧壁)及至少一个开口(例如入口/出口或入口及出口)。侧壁的至少一部分一般包围内部空腔。至少一个开口(例如入口/出口或入口及出口)能够允许液体引入至内部空腔中及液体自该空腔压出。在一些实施方式中，至少一个开口与离心室同轴，且在一些实施方式中，处于离心室端壁中。侧壁可为曲线形，例如圆柱形或大体上圆柱形。
在一些实施方式中，所述方法包括在离心室的内部空腔中孵育含有细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，其中该离心室能围绕旋转轴旋转且包括端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出，其中该离心室在孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转且该方法产生含有多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物。
在一些实施方式中，离心室还包括可移动构件，例如活塞。在此类实施方式中，内部空腔一般为可变体积之一，例如具有由端壁、侧壁及可移动构件(例如活塞)限定的可变体积的空腔，使得可移动构件能够在离心室内(例如在离心室内轴向)移动以改变空腔的内部体积。在一些实施方式中，液体通过例如自空腔抽出液体和/或将液体推入的泵、注射器和/或发动机、或用于引入及压出液体或气体的其他装置而交替地移入及移出离心室，而空腔本身的体积保持恒定。
在一些实施方式中，所述方法包括在离心室的内部空腔中孵育含有细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，该离心室能围绕旋转轴旋转且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出，其中该离心室在孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转，在该离心室旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的总液体体积不超过每平方英寸该空腔的内部表面积约5mL，且该方法产生包含多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物。
该室可包含两个端壁。在一些此类实施方式中，一个端壁连同其他特征界定内部空腔，而另一个在该空腔外。在一些实施方式中，该空腔受两个端壁限制。
该至少一个开口可包含：分别能够允许该引入及压出的入口及出口、或能够允许该引入及该压出的单一入口/出口。
通常，孵育至少部分在离心室旋转下，例如在离心力或加速度下进行。因此，在一些实施方式中，所述方法还包括在孵育的至少一部分期间实现离心室例如围绕其旋转轴的旋转。
在一些任何此类实施方式中，该旋转包括以在空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的大于约200g、大于约300g、或大于约500g的相对离心力(RCF)旋转。在一些任何此类实施方式中，该旋转包括以在空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的如下相对离心力旋转：在或约在1000g、1500g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g；或至少或至少约1000g、1500g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g。在一些任何此类实施方式中，该旋转包括以在空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的如下或约如下相对离心力旋转：1000至3600、1000至3200、1000至2800、1000至2000、1000至1600、1600至3600、1600至3200、1600至2800、1600至2000、2000至3600、2000至3200、2000至2800、2800至3600、2800至3200、3200至3600(各包括端点)；或至少或至少约2000g、2100、2200g、2400g、2600g、2800g、3000g、3200g或3600g；或在或约在2000g、2100g、2200g、2400g、2600g、2800g、3000g、3200g或3600g。
在一些任何此类实施方式中，在孵育的至少一部分期间，使离心室旋转如下时间：大于5分钟或约5分钟，例如大于10分钟或约10分钟、大于15分钟或约15分钟、大于20分钟或约20分钟、大于30分钟或约30分钟、大于45分钟或约45分钟、大于60分钟或约60分钟、大于90分钟或约90分钟、或大于120分钟或约120分钟；或5分钟至60分钟之间或约5分钟至60分钟之间、10分钟至60分钟之间或约10分钟至60分钟之间、15分钟至60分钟之间或约15分钟至60分钟之间、15分钟至45分钟之间或约15分钟至45分钟之间、30分钟至60分钟之间或约30分钟至60分钟之间、或45分钟至60分钟之间或约45分钟至60分钟之间(各包括端点)。
在一些实施方式中，在孵育期间(例如在任一时间或在整个孵育期间)和/或通过所述方法处理的空腔中的输入组合物(或细胞数目)包括1×106、5×106、1×107、5×107、1×108或5×108个或约所述数目或至少约1×106、5×106、1×107、5×107、1×108或5×108个细胞。
在一些任何此类实施方式中，空腔中的该输入组合物含有至少或至少约1×107个所述细胞、至少或至少约2×107个所述细胞、至少或至少约3×107个所述细胞、至少或至少约4×107个所述细胞、至少或至少约5×107个所述细胞、至少或至少约6×107个所述细胞、至少或至少约7×107个所述细胞、至少或至少约8×107个所述细胞、至少或至少约9×107个所述细胞、至少或至少约1×108个所述细胞、至少或至少约2×108个所述细胞、至少或至少约3×108个所述细胞或至少或至少约4×108个所述细胞。
在一些实施方式中，空腔的内部表面积为至少1×109μm2或1×1010μm2或约1×109μm2或1×1010μm2，和/或侧壁在自端壁延伸的方向的长度为至少约5cm和/或至少约8cm；和/或内部空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。
在一些实施方式中，输入组合物包括每个细胞至少或至少约1个感染单位(IU)、每个细胞至少或至少约2个IU、每个细胞至少或至少约3个IU、每个细胞至少或至少约4个IU、每个细胞至少或至少约5个IU、每个细胞至少或至少约10个IU、每个细胞至少或至少约20个IU、每个细胞至少或至少约30个IU、每个细胞至少或至少约40个IU、每个细胞至少或至少约50个IU、或每个细胞至少或至少约60个IU。在一些实施方式中，输入组合物包括每个细胞1个或约1个感染单位(IU)、每个细胞2个或约2个IU、每个细胞3个或约3个IU、每个细胞4个或约4个IU、每个细胞5个或约5个IU、每个细胞10个或约10个IU、每个细胞20个或约20个IU、每个细胞30个或约30个IU、每个细胞40个或约40个IU、每个细胞50个或约50个IU、或每个细胞60个或约60个IU。
在一些实施方式中，输入组合物(具有病毒载体颗粒及细胞的组合物和/或在孵育期间存在于空腔中的任何液体组合物)的平均液体体积或最大液体体积在孵育期间不超过每平方英寸空腔内部表面积约10、5或2.5毫升(mL)。在一些实施方式中，在孵育期间的任何时间存在于空腔中的此类液体组合物的最大总体积为细胞总体积的不超过2倍、不超过10倍、不超过100倍、不超过500倍或不超过1000倍。在一些实施方式中，细胞总体积为细胞集结粒的总体积。在一些实施方式中，细胞总体积为单层细胞(例如在离心室旋转期间存在于空腔内表面上的单层细胞)的体积。
在一些实施方式中，输入组合物的液体体积在孵育的至少一部分期间占全部或基本上全部内部空腔体积。在其他实施方式中，在孵育的至少一部分期间，输入组合物的液体体积仅占内部空腔体积的一部分，在此至少一部分期间，空腔体积还包含例如通过该至少一个开口或另一个开口在孵育之前或期间引入至空腔中的气体。
在一些任何此类实施方式中，在该旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的液体体积为或约为每平方英寸空腔内部表面积0.5mL(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。
在一些任何此类实施方式中，在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大总液体体积为该空腔中所述细胞的总体积的不超过2倍、不超过10倍或不超过100倍，或该输入组合物经孵育过程的平均体积为该空腔中细胞总体积的不超过2、10或100倍。
在一些任何此类实施方式中，在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大体积或经孵育过程的平均体积为在该离心室以在侧壁内表面2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的内表面上形成的单层所述细胞的体积的不超过下列倍数或不超过约下列倍数：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。
在一些任何此类实施方式中，输入组合物的液体体积不超过20mL、不超过40mL、不超过50mL、不超过70mL、不超过100mL、不超过120mL、不超过150mL或不超过200mL。
在一些任何此类实施方式中，在离心室中孵育的至少一部分期间或在离心室旋转期间，输入组合物的液体体积仅占离心室内部空腔体积的一部分，在该至少一部分期间或在该旋转期间，空腔体积还包含气体，该气体在该孵育之前或期间通过该至少一个开口引入至该空腔中。
在一些实施方式中，离心室包括可移动构件，其中气体引入至离心室中实现可移动构件的移动以增加离心室内部空腔的体积，从而与离心室中不存在气体相比，减少在该离心室旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的每平方英寸空腔内部表面积的总液体体积。
在一些实施方式中，在孵育期间空腔中的细胞数目为或约为足以在离心室以2000g或约2000g的力旋转期间在空腔内表面上形成单层的细胞数目，和/或不超过该细胞数目的1.5倍或2倍。
在一些任何此类实施方式中，该输入组合物中所述细胞的数目为或约为足以在该离心室以在侧壁内表面2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔表面上形成单层的所述细胞的数目；和/或该输入组合物中所述细胞的数目为足以在该离心室以在侧壁内表面2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔表面上形成单层的所述细胞的数目的不超过1.5倍或2倍。
在一些实施方式中，离心持续120秒至7200秒，例如120秒至3600秒，包括端点或在范围内的值，例如包括端点或在范围内的整分钟值。
在一些实施方式中，所述方法包括a)向内部表面积为至少1×109μm2或约1×109μm2或至少1×1010μm2或约1×1010μm2的离心室的内部空腔提供：i)包括细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，其中：该输入组合物中的细胞数目为至少1×107个细胞，且所述病毒颗粒以每个所述细胞至少或至少约1个感染单位(IU)存在于该输入组合物中，且该输入组合物的液体体积小于该离心室的内部空腔的最大体积；及ii)体积至多为该离心室内部空腔的剩余最大体积的气体；及b)孵育该输入组合物，其中孵育的至少一部分在该离心室的该内部空腔中进行，同时实现该离心室的旋转；且其中该方法产生含有多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物。
在一些实施方式中，细胞数目至少或至少约为50×106个细胞；100×106个细胞；或200×106个细胞；和/或病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU或每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU存在。
在一些任何此类实施方式中，输入组合物的液体体积小于或等于200mL、小于或等于100mL、或小于或等于50毫升、或小于或等于20mL。在一些任何此类实施方式中，气体体积为至多200mL、至多180mL、至多140mL或至多100mL。
在一些任何此类实施方式中，该旋转在空腔侧壁内表面或在表层细胞的相对离心力为至少或至少约1000g、1500g、2000g、2400g、2600g、2800g、3000g、3200g或3600g。
在一些实施方式中，所述方法用于大规模处理。
在一些实施方式中，空腔中的组合物(例如输入组合物)在该孵育的至少一部分期间包括至少50mL、至少100mL或至少200mL液体体积和/或每平方公分空腔内部表面积至少一百万个或约一百万个细胞。
在一些实施方式中，在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积为在该离心室例如以2000g或约2000g的力(例如有效力)旋转期间在该空腔的内表面上形成的单层所述细胞的体积的不超过下列倍数或不超过约下列倍数：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。
在一些实施方式中，在孵育的至少一部分期间，该离心室以在离心室空腔内壁和/或一层(例如表层)细胞的大于约200g、大于约300g、或大于约500g(例如大于约1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力旋转。在一些实施方式中，该力为至少1000g、1500g、2000g、或2500g、3000g或3200g，或约所述数值。在一些实施方式中，该力为2100g、2200g或3000g，或约所述数值。
在一些实施方式中，所述方法包括孵育含有细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，该孵育的至少一部分在旋转条件下进行，从而产生含有多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物，其中该输入组合物的体积大于或约为20mL、50mL、至少100mL或至少150mL，和/或该输入组合物包含至少1×108个细胞；及所述旋转条件包含在表层细胞上大于约1500g的相对离心力。
在所述方法的一些实施方式中，该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞转导有该病毒载体；和/或该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞表达该病毒载体内所含的异源核酸的产物。
在一些任何此类实施方式中，该孵育在离心室的空腔中进行，且该输入组合物中所述细胞的数目为或约为足以在该旋转期间在该空腔的内表面上形成单层或双层的所述细胞的数目。
在一些实施方式中，该离心室包括端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
在一些实施方式中，该离心室还包括可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性的侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
在一些任何此类实施方式中，该空腔中的输入组合物在该孵育的至少一部分期间含有至少20mL或至少50mL的液体体积及每平方公分空腔内部表面积一百万个或约一百万个细胞。
在一些任何此类实施方式中，该孵育的另一部分在离心室外和/或在无旋转的情况下进行，该另一部分在于离心室中和/或在旋转下进行至少一部分之后进行。
在一些任何此类实施方式中，该孵育的至少一部分在离心室的空腔中进行和/或该孵育的另一部分在37℃±2℃或约37℃±2℃下实现。
在一些任何此类实施方式中，该孵育还包括在该孵育期间将至少多个细胞转移至容器且该孵育的该另一部分在该容器中实现。在一些实施方式中，转移在封闭系统内进行，其中该离心室及容器与该封闭系统为一体的。
在一些任何此类实施方式中，该孵育进行一段介于下列的时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时(包括端点)的时间；或该孵育的另一部分进行一段介于下列的时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时(包括端点)的时间。
在一些任何此类实施方式中，该孵育或该孵育的另一部分进行不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的时间；或该孵育的另一部分进行不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的时间。
在一些任何此类实施方式中，该孵育在刺激剂存在下进行；和/或该孵育的另一部分在刺激剂存在下进行。
在一些任何此类实施方式中，该孵育进行不超过24小时的时间；该组合物中的细胞尚未经受大于30℃的温度超过24小时；和/或该孵育并非在刺激剂存在下进行。
在一些任何此类实施方式中，该刺激剂为能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的药剂。
在一些任何此类实施方式中，该刺激剂为选自IL-2、IL-15及IL-7的细胞因子。
在一些任何此类实施方式中，含有转导细胞的该输出组合物含有至少1×107个细胞或至少5×107个细胞。
在一些任何此类实施方式中，含有转导细胞的该输出组合物含有至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
在一些任何此类实施方式中，所述细胞为T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞为未分级分离(unfractionated)T细胞、经分离的CD4+T细胞和/或经分离CD8+T细胞。
在一些任何此类实施方式中，该方法使得病毒载体整合于至少多个细胞中一个或多个的宿主基因组中和/或整合于输出组合物中至少20％或约20％、或至少30％或约30％，或至少40％或约40％的细胞的宿主基因组中。
在一些任何此类实施方式中，该输入组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞通过该方法转导有该病毒载体；和/或该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有该病毒载体；和/或该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞表达该病毒载体内所含的异源核酸的产物。
具体实施方式包括通过在旋转条件下孵育包含细胞和病毒载体颗粒的输入组合物进行转导的方法，从而接种多个细胞用于经病毒载体转导，其中该输入组合物包括大于50mL的总体积，例如至少100mL或至少150mL体积，和/或该输入组合物包含至少1×108个细胞；及所述旋转条件包含大于约1500g的离心力。在一些此类实施方式中，该孵育在离心室的空腔中进行且该输入组合物中所述细胞的数目为或约为足以在旋转期间在该空腔的内表面上形成单层的所述细胞的数目。在一些此类实施方式中，至少25％或至少50％的所述细胞转导有该病毒载体。
在一些实施方式中，所述方法使得该输入组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有该病毒载体，和/或产生至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的细胞转导有载体和/或表达由该载体编码的重组产物的输出组合物。在一些实施方式中，转导效率表示病毒的具体输入量或相对量。举例而言，在一些实施方式中，此类效率通过用于以每个细胞约1或约2个IU的比率包含病毒的输入组合物的方法实现。
在一些实施方式中，在通过所述方法产生的该输出组合物中的所有细胞当中，重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过约5、不超过约2.5或不超过约1.5。在一些实施方式中，在含有该重组病毒载体的该输出组合物中的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约5、不超过约2、不超过约1.5或不超过约1。
在一些任何此类实施方式中，在含有重组病毒载体或病毒载体整合于其中的该输出组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过约5、不超过约2.5或不超过约1.5；或在该输出组合物中的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约2、不超过约1.5或不超过约1。
在一些实施方式中，离心室与封闭系统为一体的，例如其中该封闭系统包括该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于至少一个开口的至少一个管线，以便允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。该至少一个管线通常包括一系列管线。该至少一个连接器通常包括多个连接器。该封闭系统可还包括操作性地连接于该一系列管线的至少一个容器，使得至少一种连接允许液体和/或气体通过该一系列管线在该至少一个容器与该至少一个开口之间通过。
该至少一个连接器可包括选自阀、鲁尔端口(luer port)及刺突的一种或多种连接器，例如旋转阀，例如活栓(stopcock)或多旋转端口，和/或无菌连接器。
该至少一个容器可包括一个或多个袋、小瓶和/或注射器，且可包括指定为稀释剂容器、废料容器、产物收集容器、输出容器和/或输入容器的容器。
在一些实施方式中，该至少一个容器包括至少一个包括病毒和/或细胞的输入容器(其可为包含病毒及细胞的单一输入容器或分别包含病毒及细胞的两个输入容器)、废料容器、产物容器及含稀释剂或洗涤溶液的至少一个容器，其各通过该一系列管线及该至少一个开口连接至该空腔。
在一些任何此类实施方式中，至少一个容器还包括在该孵育期间的至少一个点之前和/或期间含有气体的容器，和/或该封闭系统还包括能够将气体引入至离心室内部空腔中的微生物过滤器和/或该封闭系统含有用于实现气体引入的注射器端口。
在一些实施方式中，所述方法还包括在孵育之前和/或期间，实现该输入组合物引入至该空腔中。该引入可包括液体自至少一个输入容器通过该至少一个开口流入该空腔。该引入可包括病毒自一个输入容器引入且细胞自另一个输入容器输入以产生用于孵育的输入组合物。
在一些实施方式中，该方法包括在该孵育之前和/或期间，提供或实现气体在无菌条件下引入至该空腔中，该引入通过(a)来自包括气体的容器的气体的流动、(b)来自封闭系统外部环境经过微生物过滤器的气体的流动、或(c)来自连接至该系统的注射器在注射器端口处的气体的流动来实现。
在一些实施方式中，实现气体引入至离心室的内部空腔中与实现输入组合物引入至离心室的内部空腔中同时或一起进行。
在一些任何此类实施方式中，该输入组合物与气体在该输入组合物及气体引入至该离心室的内部空腔中之前在该离心室外的无菌条件下合并在单一容器中。
在一些实施方式中，实现该气体引入与实现该输入组合物引入至该空腔中同时或依次分开进行。
在一些任何此类实施方式中，该气体引入通过允许或引起来自含有该气体的无菌封闭容器、来自外部环境且穿过微生物过滤器或来自含有该气体的注射器的气体的流动来实现。
在一些任何此类实施方式中，该气体为空气。
在所提供的过程方法的一些实施方式中，该孵育为连续过程的一部分，其中该方法还包括在该孵育的至少一部分期间，实现该输入组合物连续引入(intake)至该空腔中，通常在该离心室的旋转期间；及在该孵育的一部分期间，实现液体通过该至少一个开口自该空腔连续压出(expression)(也即排出(outtake))，通常在该离心室的旋转期间。在一些实施方式中，连续引入及排出同时进行。
在一些实施方式中，该方法包括在该孵育的一部分期间，在该离心室的旋转期间实现气体连续引入至该空腔中；和/或在该孵育的一部分期间，实现气体自该空腔连续压出。
在一些实施方式中，该方法包括自该空腔压出液体及压出气体，其中各自同时或依次压出至不同容器中。
在一些任何此类实施方式中，该连续引入及该连续压出的至少一部分同时进行。
在一些实施方式中，该孵育为半连续过程的一部分，例如其中该方法还包括实现该输入组合物通过该至少一个开口引入至该空腔中，进行该孵育的全部或一部分(例如离心)，接着实现液体自该空腔压出且接着重复该过程，从而将另一种输入组合物引入至该空腔中，接着离心，接着压出。该过程可反复且包括更多轮引入、处理及压出。
在一些任何此类实施方式中，该孵育为半连续过程的一部分，该方法还包括在该孵育之前，实现该输入组合物及任选地气体通过该至少一个开口引入至该空腔中；在该孵育之后，实现液体和/或任选地气体自该空腔压出；实现包括细胞及含有重组病毒载体的所述病毒颗粒的另一输入组合物及任选地气体引入至该内部空腔中；及在该内部空腔中孵育该另一输入组合物，其中该方法产生含有多个转导有该病毒载体的该另一输入组合物的细胞的另一输出组合物。
在一些任何此类实施方式中，该提供或该引入该输入组合物至该空腔中包括引入包括细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的单一组合物；或引入包括细胞的组合物及包括含有重组病毒载体的病毒颗粒的另一组合物，从而混合所述组合物，实现该输入组合物的引入。
该引入可包括引入含有细胞和病毒的单一组合物；或引入含有细胞的组合物及含有病毒中另一组合物，从而混合所述组合物，实现该输入组合物的引入。在连续或半连续过程的一些实施方式中，经多轮或连续过程总计处理至少1×108个细胞或至少1×109个细胞或至少1×1010个细胞或更多。
在一些实施方式中，该方法包括在该孵育之前和/或期间实现该离心室的旋转及在该孵育之后实现液体自该空腔压出至该废料容器中；实现液体自该至少一个稀释剂容器通过该至少一个开口压出至该空腔中及实现该空腔的内含物的混合；及实现液体自该空腔压出至该产物容器中，从而将转导有病毒载体的细胞转移至产物袋中。
在一些实施方式中，该方法还包括在同一离心室和/或封闭系统内进行其他处理步骤或一个或多个其他处理步骤的至少一部分。在一些实施方式中，该一个或多个处理步骤可包括在同一离心室和/或封闭系统内分离(例如分离或选择)、刺激及配制细胞的过程。在一些情况下，该一个或多个其他处理步骤亦可包括洗涤细胞，其可在用于分离(例如分离或选择)、刺激、转导和/或配制细胞的处理步骤中的任一或多者之前或之后进行。在一些实施方式中，该一个或多个其他处理步骤可在转导方法中在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前、同时或之后进行。在一些实施方式中，该一个或多个其他处理步骤或该一个或多个其他处理步骤的一部分可在与用于孵育细胞与病毒载体颗粒的离心室空腔相同或不同的离心室空腔中进行。
在所提供的处理方法当中，包括分离(例如选择)方法、刺激方法、配制方法及其他处理方法，有根据如上所述实施方式中的任一进行的方法。
举例而言，在一些实施方式中，该方法还包括(a)在用于分离(例如选择)细胞的孵育之前和/或在用于使细胞与病毒载体颗粒一起孵育的孵育之前，在离心室的空腔中洗涤含有细胞的生物样品(例如全血样品、白细胞层(buffy coat)样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级分离的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、清血法(apheresis)产物或白细胞清血法产物)，(b)在此类细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前，在空腔中自样品(例如全血样品、白细胞层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级分离的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、清血法产物或白细胞清血法产物)分离(例如选择)所述细胞和/或(c)在此类细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前和/或期间，在空腔中例如通过使细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，从而诱导输入组合物的细胞增殖。在一些实施方式中，该分离包括基于免疫亲和力的选择。
在一些任何此类实施方式中，该方法包括(a)在该孵育之前，在离心室的内部空腔中洗涤含有所述细胞的生物样品；和/或(b)自生物样品分离所述细胞，其中该分离步骤的至少一部分在该孵育之前在离心室的内部空腔中进行；和/或(c)在该孵育之前和/或期间刺激细胞，该刺激包括使所述细胞暴露于刺激条件，从而诱导输入组合物的细胞增殖，其中该刺激细胞步骤的至少一部分在离心室的内部空腔中进行。
在一些实施方式中，所述方法可还包括在离心室中例如通过基于免疫亲和力的选择来分离(例如选择)细胞。在一些实施方式中，该分离(例如选择)细胞在转导方法中在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前进行，从而经分离(例如经选择)的细胞为输入组合物中存在和/或与病毒载体颗粒一起孵育的细胞。在一些实施方式中，该分离(例如选择)包括细胞与选择试剂(例如免疫亲和力试剂)一起孵育。在一些实施方式中，该分离(例如选择)步骤的至少一部分，例如细胞与选择试剂(例如免疫亲和力试剂)一起孵育在离心室的空腔中进行，其在一些情况下可包括旋转该离心室，例如以便混合该试剂及细胞。
在一些实施方式中，所述方法可还包括在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前、期间和/或之后刺激细胞，其中至少全部或一部分刺激可在离心室的空腔中进行。在一些实施方式中，刺激条件可包括在能够活化TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域的药剂存在下孵育细胞，例如特异性结合至TCR复合物成员(例如CD3)的初级试剂及特异性结合至T细胞协同刺激分子(T cell costimulatory molecule)(例如CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS)的二级试剂，包括抗体，例如存在于固体支持物(例如珠)的表面上的抗体。在一些实施方式中，刺激的至少一部分，例如在刺激条件存在下孵育细胞，在离心室的空腔中进行，其在一些情况下可包括旋转该离心室，例如以便混合该试剂及细胞。
在一些任何此类实施方式中，该方法包括在离心室的内部空腔中将细胞(例如根据所提供的方法产生或生成的细胞，包括通过该方法转导的细胞)配制于医药学上可接受的缓冲液中，从而产生配制组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括实现该配制组合物压出至一个或多个容器中。在一些实施方式中，所述方法包括实现该配制组合物的压出，包括实现以单一单位剂量存在的许多细胞压出至该一个或多个容器中的一个或每个中。
在一些任何此类实施方式中，该离心室的空腔中的每个与用于一个或多个其他步骤和/或用于孵育和/或旋转含有细胞和病毒颗粒的输入组合物的离心空腔相同或不同。
在一些任何此类实施方式中，所述离心室中的每个与封闭系统为一体的，该封闭系统包括该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于至少一个开口的至少一个管线，从而允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。
通过所述方法处理的细胞通常为原代细胞，例如自对象(通常人类)获得的细胞。细胞可来源于给予疗法的对象，例如患有由通过转导载体表达的重组分子(例如重组抗原受体，例如嵌合抗原受体或转基因TCR)靶向的疾病或病症的对象。或者，细胞可来自不同对象。因此，所述方法涵盖处理用于自体及同种异体转移。细胞可包括悬浮细胞，例如白细胞，例如T细胞，例如经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞或其亚群，或NK细胞。
在一些实施方式中，在孵育期间，离心室与传感器(例如能够监测可移动构件位置的传感器)及控制电路(例如能够接收来自传感器的信息及传输信息至传感器、引起可移动构件的移动和/或与离心机进一步联合且因此能够在该孵育期间引起该离心室的旋转的电路)联合。
在一些实施方式中，该离心室含有可移动构件且在孵育期间位于离心机内，并与能够监测可移动构件位置的传感器及能够接收及传输来自该传感器的信息且引起可移动构件移动、通过该一个或多个管线引入液体至该空腔及自该空腔压出液体及通过该离心机旋转该离心室的控制电路联合。
在一些实施方式中，该离心室、控制电路、离心机和/或传感器例如在孵育期间容纳在柜体中。
在病毒转移(例如转导方法)中的任一者的一些实施方式中，重组病毒载体编码重组受体，其从而通过输出组合物的细胞表达。在一些实施方式中，重组受体为重组抗原受体，例如功能性非T细胞受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，或转基因T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，重组受体为含有特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。
在一些任何此类实施方式中，细胞包括自人类对象获得的原代人类T细胞，且在与病毒载体颗粒一起孵育之前和/或在转导完成之前和/或(若该方法包括配制)在配制之前，原代人类T细胞尚未在高于30℃的温度下存在于对象外大于1小时、大于6小时、大于24小时或大于48小时，或在孵育之前和/或在转导完成之前和/或(若该方法包括配制)在配制之前，原代人类T细胞尚未在特异性针对CD3的抗体和/或特异性针对CD28的抗体和/或细胞因子的存在下孵育大于1小时、大于6小时、大于24小时或大于48小时。
本文提供用于分离(例如选择)细胞的方法，包括(a)在离心室的内部空腔中在混合条件下孵育选择试剂及原代细胞，从而多个原代细胞结合至该选择试剂及(b)基于与该选择试剂的结合，使该多个原代细胞与另外一种或多种原代细胞分离，从而基于与该选择试剂的结合富集原代细胞，其中该离心室能围绕旋转轴旋转且该内部空腔的最大体积为至少50mL、至少100mL或至少200mL。在一些实施方式中，用于分离(例如选择)的方法在封闭系统中进行。在一些实施方式中，在分离多个细胞的步骤之前，与选择试剂一起孵育的细胞自离心室压出或转移出，但保持在封闭系统中。在一些实施方式中，任选地，与选择试剂一起孵育之后且在分离细胞之前，该方法还包括一个或多个洗涤步骤，其在一些情况下，可根据所提供的方法在离心室的空腔中进行。在一些实施方式中，分离细胞的步骤可使用固体支持物，例如使用免疫亲和力柱(包括用于磁分离的柱)来实现，该固体支持物可为封闭系统中所含。
本文提供用于刺激细胞的方法，包括在一定条件下孵育刺激剂及原代细胞，从而使刺激剂结合至由多个原代细胞表达的分子且活化或刺激该多个细胞，其中该孵育的至少一部分在离心室的内部空腔中在混合条件下进行，其中该离心室能围绕旋转轴旋转且该内部空腔的最大体积为至少50mL、至少100mL或至少200mL。
在一些实施方式中，所述刺激方法作为包括转导细胞的过程的一部分来进行，因而此类过程的全部或一部分在离心室中和/或作为同一封闭系统的一部分来进行。在一些实施方式中，用刺激剂刺激的原代细胞包括或为在例如根据所提供的方法自生物样品分离(例如选择)细胞后所获得的细胞。在一些实施方式中，该刺激的至少一部分在细胞与病毒载体颗粒一起孵育的同时或期间进行，使得原代细胞包括或为输入组合物中存在的细胞和/或为已发生转导或开始转导的细胞。在一些实施方式中，该刺激的至少一部分在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前进行，使得与病毒载体颗粒一起孵育的细胞为受刺激的细胞，其在一些情况下包括增殖性细胞。
在一些实施方式中，该方法的更多其他处理步骤(包括分离(例如选择)、刺激、洗涤和/或配制)中之一者的至少一部分在离心室中进行，其中该离心室包括端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
本文提供含有通过以上实施方式中的任一者的方法产生的转导细胞的组合物。在一些任何此类实施方式中，该组合物含有以下细胞：原代细胞和/或人类细胞和/或包括白细胞和/或T细胞和/或NK细胞。在一些任何此类实施方式中，该组合物含有至少5×107个细胞、1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。在一些任何此类实施方式中，该组合物含有治疗有效数目的适用于过继T细胞疗法的细胞。在一些任何此类实施方式中，细胞为T细胞且在转导之后，该组合物中的细胞并未在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞并未在高于30℃的温度下孵育超过24小时，或该组合物不含细胞因子或该组合物不含特异性结合至CD3或TCR复合物的刺激剂。
本文提供含有至少1×107个或至少5×107个T细胞的组合物，其中至少多个转导有重组病毒载体，其中在转导之后，该组合物中的细胞尚未在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞尚未在高于30℃的温度下孵育超过24小时和/或该组合物中至少30、40、50、60、70或80％的T细胞含有CD69或TGF-β-II的高表面表达。在一些实施方式中，该组合物含有至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
在一些任何此类实施方式中，所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
在一些任何此类实施方式中，该组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有病毒载体。
在一些任何此类实施方式中，该病毒载体编码重组受体且该组合物中的转导细胞表达该重组受体。在一些实施方式中，该重组受体为重组抗原受体。在一些实施方式中，该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。在一些实施方式中，该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，该重组受体为含有特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。在一些实施方式中，该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
在一些任何此类实施方式中，在该组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2，或在该组合物中转导有该重组病毒载体的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2。
在一些任何此类实施方式中，该组合物含有医药学上可接受的赋形剂。
本文提供治疗方法，包括向患有疾病或病症的对象给予以上实施方式中的任一者的组合物。在一些实施方式中，该组合物中的转导T细胞与，在转导之后，其中的细胞已在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞已在高于30℃的温度下孵育超过24小时的组合物，中的转导T细胞相比在对象体内展现增加或较长扩增和/或持久性。
在一些任何此类实施方式中，该重组受体、嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合至与疾病或病症相关联的抗原。在一些实施方式中，该疾病或病症为癌症、自体免疫疾病或病症、或感染性疾病。
本文提供含有至少1×107个细胞及每个细胞至少或至少约1个感染单位(IU)的含有重组病毒载体的病毒颗粒的组合物。在一些实施方式中，所述细胞含有至少或至少约50×106个细胞、100×106个细胞或200×106个细胞，和/或所述病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU、每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU的量存在于该组合物中。
在此类实施方式中的任一者中，该组合物的液体体积小于或等于220mL、小于或等于200mL、小于或等于100mL、小于或等于50mL、或小于或等于20mL。
在一些任何此类实施方式中，所述细胞为原代细胞。在一些任何此类实施方式中，所述细胞为人类细胞。在一些任何此类实施方式中，所述细胞包括悬浮细胞，所述细胞包括白细胞和/或所述细胞包括T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，所述细胞为T细胞且所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
在一些任何此类实施方式中，该病毒载体编码重组受体。在一些实施方式中，该重组受体为重组抗原受体。在一些实施方式中，该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。在一些实施方式中，该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，该重组受体为含有特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。在一些实施方式中，该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
本文提供能围绕旋转轴旋转的离心室，其包括含有以上实施方式中的任一者的组合物的内部空腔。
本文提供能围绕旋转轴旋转的离心室，其包括含有(a)含有至少5×107个转导有重组病毒载体的原代T细胞的组合物和/或(b)含有至少5×107个原代T细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的组合物的内部空腔。
在一些任何此类实施方式中，该离心室还含有端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
在一些任何此类实施方式中，该空腔中的该组合物含有至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
在一些任何此类实施方式中，所述T细胞为未分级分离的T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
在该离心室的一些任何此类实施方式中，该组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有病毒载体。
在该离心室的一些任何此类实施方式中，该病毒载体编码重组受体且该组合物中的细胞表达该重组受体。在一些实施方式中，该重组受体为重组抗原受体。在一些实施方式中，该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。在一些实施方式中，该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，该重组受体为含有特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。在一些实施方式中，该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
在该离心室的一些任何此类实施方式中，在该组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2，或在该组合物中转导有该重组病毒载体的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2。
本文提供能围绕旋转轴旋转的离心室，其包括含有以上实施方式中的任一者的组合物的内部空腔。在一些实施方式中，该离心室还含有至多该离心室的内部空腔最大体积的气体体积。在一些实施方式中，该气体为空气。
在该离心室的一些任何此类实施方式中，该离心室能围绕旋转轴旋转且包括端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。在一些实施方式中，该侧壁为曲线形。在一些实施方式中，该侧壁为大体上圆柱形。
在该离心室的一些任何此类实施方式中，该至少一个开口包括分别能够允许该引入及压出的入口及出口，或该至少一个开口包括能够允许该引入及该压出的单一入口/出口。在该离心室的一些任何此类实施方式中，该至少一个开口与该离心室同轴且位于该端壁中。
在一些任何此类实施方式中，该离心室还包括可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。在一些实施方式中，该可移动构件为活塞和/或该可移动构件能够在该离心室内轴向移动以改变该空腔的内部体积。
在一些任何此类实施方式中，该空腔的内部表面积为至少或至少约1×109μm2，该空腔的内部表面积为至少或至少约1×1010μm2，该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约5cm，该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约8cm和/或该空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。
在该离心室的一些任何此类实施方式中，存在于该空腔中的该组合物的液体体积为或约为：0.5mL/平方英寸该空腔的内部表面积(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。在一些任何此类实施方式中，存在于该空腔中的该组合物的液体体积为至少0.5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸、2.5毫升/平方英寸或5毫升/平方英寸。
本文提供含有以上实施方式中的任一者的离心室的封闭系统。在该封闭系统的一些任何此类实施方式中，该离心室能够在至多8000g的速度下旋转，其中该离心室能够承受500、1000、1500、2000、2500、3000或3200g的力而无实质屈服、弯曲或断裂或以其他方式导致该离心室的受损和/或同时在此类力下基本上保持大体上圆柱形。
附图说明
图1A展示在如实施例1中所述在各种条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的嵌合抗原受体(CAR)的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。图1B展示在实施例1中所述的转导研究期间经六天时间的群体倍增。
图2展示在如实施例2中所述在指定条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。
图3展示在如实施例3中所述在各种条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。
图4展示在如实施例4中所述在各种条件下转导后，指定细胞群体中病毒载体的平均载体拷贝数(VCN)。
图5提供适用于所提供的方法的实施方式的封闭系统(处理试剂盒)的实施方式的示意图。所描绘的示例性系统包括大体上圆柱形离心室(1)，其能围绕旋转轴旋转且包括端壁(13)、刚性侧壁(14)及活塞(2)，从而界定该离心室的内部空腔(7)。该离心室还包括入口/出口开口(6)以允许液体及气体在该系统的至少一些构型中流入及流出该空腔。开口(6)与一系列管线(3)及连接器(包括活栓阀(4))及各种其他容器操作性地连接。还描绘夹具(5)。
图6A展示在实施例6中所述的研究期间经十天时间的群体倍增。图6B展示在实施例6中所述的研究期间经十天时间的细胞活力百分比。
图7提供适用于所提供的方法的实施方式的封闭系统(处理试剂盒)的实施方式的示意图。所描绘的示例性系统包括大体上圆柱形离心室(1)，其能围绕旋转轴旋转且包括端壁(13)、刚性侧壁(14)及活塞(2)，从而界定该离心室的内部空腔(7)。该离心室还包括入口/出口开口(6)以允许液体及气体在该系统的至少一些构型中流入及流出该空腔。开口(6)与一系列管线(3)及连接器(包括活栓阀(4))、各种其他容器及偶联至可移除式封盖(16)的空气过滤器(15)操作性地连接。还描绘夹具(5)。
图8A展示在如实施例8A中所述在指定条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。图8B展示在如实施例8B中所述在指定条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。图8C展示在如实施例8B中所述在各种条件下转导后，指定细胞群体中病毒载体的平均载体拷贝数(VCN)。
图9A展示在如实施例9中所述在指定条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。图9B展示在如实施例9中所述在各种条件下转导后，指定细胞群体中病毒载体的平均载体拷贝数(VCN)。
图10展示在如实施例10中所述在指定条件下孵育后，以表面表达由病毒载体编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算的转导效率。
图11提供适用于所提供的方法的实施方式的封闭系统(处理试剂盒)的实施方式的示意图。所描绘的示例性系统包括大体上圆柱形离心室(1)，其能围绕旋转轴旋转且包括端壁(13)、刚性侧壁(14)及活塞(2)，从而界定该离心室的内部空腔(7)。该离心室还包括入口/出口开口(6)以允许液体及气体在该系统的至少一些构型中流入及流出该空腔。开口(6)与一系列管线(3)及连接器(包括活栓阀(4))及端口(18)及各种其他容器(包括多个输出袋(17))操作性地连接。还描绘夹具(5)。
发明详述
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语、表示法及其他技术及科学术语旨在具有与权利要求主题所属领域的常规技术人员通常所理解相同的含义。在一些情况下，出于清楚起见和/或方便参考，在本文中定义具有通常所理解含义的术语，且本文中包括此类定义不应必然解释为表示与本领域中一般所理解存在实质性差异。
本申请提及的所有公开文本，包括专利文件、科学论文及数据库，均以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用的程度如同各个别公开案以引用的方式个别地并入一般。若本文所阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、申请、公开申请及其他公开案中所述的定义相反或不一致，则以本文所阐述的定义为准，而非以以引用方式并入本文中的定义为准。
本文中所用的部分标题仅出于组织目的而不应理解为限制所述主题。
I.处理细胞的方法以及附属系统、试剂盒和设备
提供用于处理细胞的方法，例如以产生适用于过继细胞疗法的细胞组合物。所述方法包括例如通过病毒转导将重组病毒载体转移至细胞的方法。病毒载体一般编码欲在细胞中表达的重组分子以例如用于细胞疗法。所述方法的处理步骤亦可或替代地包括细胞洗涤、稀释、选择、分离、分开、培养、刺激、封装和/或配制的全部或一部分。所述方法一般允许大规模(例如在体积大于约50mL的组合物中)处理(例如选择或分离和/或转导)细胞。细胞处理步骤中一个或多个一般在离心室(例如大体上圆柱形且能围绕旋转轴旋转的基本上固定离心室)的内部空腔中进行，其与其他可用方法相比可提供某些优势。在一些实施方式中，所有处理步骤在同一离心室中进行。在一些实施方式中，一个或多个处理步骤在不同离心室(例如多个相同类型的离心室)中进行。
所提供的方法与可用于细胞处理(包括转导及选择)的方法，尤其用于大规模细胞处理的方法相比，提供各种优势。某些可用方法尚未完全令人满意，例如归因于低于最佳功效、精确性、再现性、成本及时间消耗、错误风险、复杂性及需要使用者操作及生物安全设施。在一些实施方式中，所提供的方法适于大规模和/或临床级细胞生产，同时仍提供另外仅使用小规模生产方法可获得的所需特征且提供可用方法未提供的额外优势。举例而言，用于细胞转导和/或基于亲和力的选择的方法与在挠性塑料袋或塑料多孔盘中进行的可用方法相比提供优势。
在一些实施方式中，处理细胞的离心室和/或其内部空腔至少部分由固定或基本上固定材料包围或界定。在由例如硬塑料的此类材料限制的空腔中孵育允许在某些条件下离心，例如高于可在用于其他大规模细胞处理方法的袋下使用的力。举例而言，在一些实施方式中，该离心室及空腔承受在例如下述力下离心：如在该离心室或空腔的内壁或外壁或在一个或多个细胞(例如细胞层)处所测量的最小或约500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g的力(例如相对离心力)，而不实质屈服、弯曲或断裂或以其他方式导致容纳所述细胞的离心室或空腔受损，使得该离心室和/或空腔基本上在此类力下保持其形状。
因此，该离心室和/或其内部空腔通常由固定或半刚性侧壁(例如由硬塑料制成的侧壁)的全部或一部分包围，其在所施加的离心力下保持其形状。侧壁一般为曲线形，例如圆柱形或大体上圆柱形，且通常自该离心室之一个或两个端壁延伸，其中一或两者的内侧亦可界定该内部空腔的界限。端壁在一些实施方式中亦由固定材料制成，且在一些实施方式中可包括更多挠性材料。在一些实施方式中，虽然壁面由固定材料或基本上固定材料制成，但其仍可内衬有和/或涂有挠性材料和/或含有更可挠的小部分，只要作为整体的空腔在所述方法的条件期间维持其总体形状即可。
离心室一般能围绕旋转轴旋转且空腔通常与该离心室同轴。在一些实施方式中，离心室还包括可移动构件，例如活塞，其一般能够在该离心室内移动(例如轴向移动)以改变空腔的体积。因此，在具体实施方式中，内部空腔受离心室的侧壁及端壁以及可移动构件限制且具有可通过移动该可移动构件调节的可变体积。可移动构件可由固定、基本上或大体上固定、挠性材料或其组合制成。
离心室一般亦包括一个或多个开口，例如一个或多个入口、一个或多个出口和/或一个或多个入口/出口，其可允许液体和/或气体引入至空腔及自空腔压出。在一些情况下，开口可为液体和/或气体的引入及压出均发生的入口/出口。在一些情况下，一个或多个入口可与一个或多个出口分开或不同。开口可处于端壁中之一者中。在一些实施方式中，液体和/或气体通过可移动构件的移动以增加和/或减小空腔的体积而引入至空腔中和/或自空腔中压出。在其他实施方式中，液体和/或气体可通过与开口相连或相连放置的管线或其他通道而引入至空腔中和/或自空腔压出，例如通过将该管线或通道与泵、注射器或其他机械相连放置且控制泵、注射器或其他机械，该泵、注射器或其他机械可以自动化方式加以控制。
在一些实施方式中，离心室为进行处理步骤的封闭系统(例如无菌系统)的一部分，该系统具有各种额外组件，例如管线及连接器及封盖。因此，在一些实施方式中，所提供的方法和/或其步骤在完全封闭或半封闭环境(例如封闭或半封闭无菌系统)中进行，有助于生产治疗性给予对象的细胞而无需另一无菌环境，例如生物安全柜体或房间。在一些实施方式中，所述方法以自动化或部分自动化方式进行。
在一些实施方式中，离心室与离心机联合，其能够实现该离心室例如围绕其旋转轴的旋转。旋转可在处理步骤中一个或多个中在孵育之前、期间和/或之后进行。因此，在一些实施方式中，各种处理步骤中一个或多个在旋转下，例如在具体力下进行。离心室通常能够垂直或大体上垂直旋转，使得离心室在离心期间垂直搁置且侧壁及轴为垂直或大体上垂直的，而端壁水平或大体上水平。一个示例性离心室描绘在图5、图7或图11中所描绘的示例性封闭系统内。
所述方法的处理步骤(例如全部或部分在离心室中进行的步骤)可包括许多细胞处理步骤中的任一或多者(单独或组合)。在具体实施方式中，处理步骤包括用含有反转录病毒载体的病毒载体颗粒(例如编码在细胞中表达的重组产物的病毒载体颗粒)转导细胞，其中与所述病毒载体颗粒一起孵育的至少一部分在离心室中进行以引发转导。所述方法可另外和/或替代地包括其他处理步骤，例如用于分离、分离、选择、孵育(例如刺激细胞以例如诱导其增殖和/或活化)、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤。在一些实施方式中，该方法包括以如下次序进行的处理步骤，其中：首先自生物样品分离(例如选择或分离)细胞(例如原代细胞)；在刺激剂存在下刺激所得经分离或选择的细胞；受刺激的细胞与病毒载体颗粒一起孵育以便转导；及将转导细胞配制于组合物中。在一些实施方式中，刺激另外或替代地在与病毒载体颗粒一起孵育的至少一部分期间进行。在一些情况下，刺激另外或替代地在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之后进行。在一些情况下，所述方法不包括刺激细胞的步骤。在一些实施方式中，该方法可包括洗涤、悬浮、稀释和/或浓缩细胞当中的一个或多个处理步骤，其可在分离(例如分离或选择)、刺激、转导和/或配制步骤中一个或多个之前、期间或同时或之后进行。处理步骤中的每个的全部或一部分可在封闭系统中，例如在离心室中进行。在所述方法的方面中，处理无需在同一封闭系统中，例如在同一离心室中进行，而是可在不同封闭系统下，例如在不同离心室中进行；在一些实施方式中，此类不同离心室在所述方法中处于与同一系统联合放置，例如与同一离心机联合放置的相应点。在一些实施方式中，所有处理步骤在封闭系统中进行，其中各一个或多个处理步骤的全部或一部分在同一或不同离心室中进行。
在一些实施方式中，所述方法提供与可用方法相比在较高转导效率下转导细胞的能力，例如通过在较高离心力/速度下进行转导的全部或一部分和/或通过允许容易、自动化和/或独立控制或调节各种参数，例如试剂的体积或量、速度和/或温度。在一些实施方式中，所述方法例如通过流线化和/或减少使用者交互和/或操作步骤的数目，例如通过提供各种步骤的自动化或半自动化控制来增加功效和/或减小可变性(增加再现性)。
在一些实施方式中，通过在封闭系统(例如无菌封闭系统)内进行一个或多个(例如全部或一部分)处理步骤，所提供的方法允许大规模制备用于临床用途的细胞而不使细胞暴露于非无菌条件且无需使用另一无菌房间或柜体。在一些实施方式中，细胞在封闭系统内例如以自动化方式分离、分离或选择、刺激、转导、洗涤及配制。在一些实施方式中，所述方法为有利的，因为其例如通过在单一封闭系统中和/或以自动化方式进行而流线化，例如需要较少步骤、较少使用者操作或干预。举例而言，在一些实施方式中，所述方法通过在生物安全柜体中以适当比率混合病毒载体颗粒及细胞，接着运输盘或袋至离心机用于转导或其他处理步骤及还可能需要操作的额外步骤而提供优于可能需要在袋中在离心机或盘中转导的处理用于临床应用的细胞的方法的改良。在一些实施方式中，所提供的方法与此类可用方法相比手工和/或劳动较不密集，需要减小程度或数量的操作及使用者交互。
在一些实施方式中，所述方法与现有方法相比允许更大程度的过程控制。举例而言，在一些实施方式中，所述方法允许例如以自动化方式独立控制各种参数。举例而言，所述方法可允许独立控制所述方法中所用且在所述方法下处理的各种组分及试剂的体积、量和/或浓度或所述处理或方法中一个或多个中所用的各种条件。其一般允许控制所述方法中之一个或多个不同步骤的持续时间和/或控制具体培养物或组合物中细胞的比率、液体体积和/或处理所用器皿(例如离心室或空腔)的表面积。独立(具体地以自动化方式且彼此独立地)控制此类参数的能力可允许使用者易于优化及进行用于个别条件的方法。
还提供适用于此类方法的系统、装置及设备、含有其的试剂盒及使用通过所述方法产生的组合物及细胞的方法。举例而言，提供通过所述方法产生的细胞及组合物的治疗方法及治疗用途，例如用于过继细胞疗法。还提供适用于此类疗法的医药组合物及配制物。
II.离心室以及附属系统和设备
在一些实施方式中，一个或多个处理步骤的全部或一部分，例如与病毒一起孵育以引发或实现转导和/或与用于基于免疫亲和力的分离的珠一起孵育和/或所述一个或多个其他处理步骤在离心室中进行。具体地，此类步骤及孵育一般在此类离心室的内部空腔中进行，其可为用于该一个或多个处理中的每个的相同或不同离心室。
离心室一般能够在孵育期间例如通过可与该离心室联合的离心机而旋转。在一些实施方式中，离心室可围绕旋转轴(例如垂直或大体上或基本上垂直的旋转轴)旋转。在一些实施方式中，离心室包括端壁及侧壁，该侧壁的至少一部分包围或环绕该离心室的内部空腔。离心室一般亦包括另一端壁，侧壁自端壁沿相反方向延伸。
内部空腔一般在其外侧由离心室的端壁的全部或一部分、侧壁的全部或一部分及另一端壁的全部或一部分或另一表面或物体(例如离心室内的可移动构件，例如活塞)的内侧限制。在一些方面中，空腔为中空的。在其他方面中，固体或中空物体包含在空腔(例如管道或通道)内部空间的一部分内。
在一些方面中，空腔具有可变体积，意味着空腔内可例如由液体或气体占据的可用总体积可例如通过可移动构件(例如活塞)的移动而改变。在一些实施方式中，此类移动可能出现在所述方法的各种步骤期间，例如在孵育以引发或实现转导或选择或在其之后和/或之前的步骤期间。在一些实施方式中，移动可以自动化方式，例如通过通过与离心室联合的电路及机械运行的预先指定程序实现，该电路及机械例如感测及控制可移动构件位置及该过程的其他方面的传感器及发动机及用于连通传感器与一个或多个组件之间的电路。
离心室的侧壁或其包围离心室内部空腔(且因此使空腔成形)的部分通常为曲线形，例如圆柱形、基本上圆柱形或大体上圆柱形。术语圆柱形一般理解为在本领域中指由距视为圆柱形的轴的给定线段固定距离的点形成的具体类型的曲线表面。“大体上圆柱形”是指具有形状或结构近似圆柱形的构型的形状或表面，例如相对于眼睛呈现圆柱形或接近圆柱形，但允许一定程度可变性的形状或表面。举例而言，该术语涵盖并非每一点距轴的距离都相同且允许一定程度梯化和/或渐狭的形状及表面，只要该形状或表面呈现圆柱形和/或具有基本上圆柱形即可。其还涵盖大部分形状为圆柱形，例如离心室的大部分外壁形状为圆柱形或基本上圆柱形，但其相对较小部分采用另一构型，例如在或接近壁面的一个或多个末端渐狭或梯化的形状。在一些实施方式中，离心室侧壁包围空腔的部分为圆柱形，而该壁面的其他部分可不为圆柱形。
在一些实施方式中，离心室和/或空腔的全部或部分为固定或基本上固定。举例而言，侧壁的全部或一部分可为固定或基本上固定，例如以允许离心室及空腔承受例如在以下力(相对离心力(RCF))的高速离心期间所施加的力：例如在空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的大于或大于约200g、大于或大于约300g或大于或大于约500g，例如大于或大于约600g、800g、1100g、1000g、1500g、1600g、2000g、2200g、2500g、3000g或3200g；或至少或至少约600g、800g、1000g、1100g、1500g、1600g、2000g、2200g、2500g、3000g或3200g，例如2100g或2200g，或约2100g或2200g。在一些实施方式中，在空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的RCF大于或大于约或是或约1100g、1200g、1400g、1600g、1800g、2000g、2200g或更大。相比之下，使用挠性袋的大规模(例如大于50或100mL体积)处理细胞的可用方法仅可允许在不超过200g、500g或1000g的相对离心力下离心。因此，所提供的方法与此类方法相比可产生更大功效。
术语“相对离心力”或RCF一般理解为在空间中相较于旋转轴的具体点，相对于地球重力赋予物体或物质(例如细胞、样品或集结粒和/或旋转的离心室或其他容器中的点)的有效力。该值可使用熟知公式，考虑重力、旋转速度及旋转半径(旋转轴与测量RCF的物体、物质或颗粒的距离)来确定。
可指定在给定情况中表示或确定RCF的物体、颗粒或位置(或其平均值)。举例而言，在本文中的一些情形中，给定此类方法中所用的离心室内的具体部分或位置的RCF值或近似值或范围，例如在处理细胞的离心室空腔的侧壁内表面处，例如在沿着空腔圆柱形侧壁表面的任何点处或在其平均径向距离处。类似地，可给定处理细胞的另一容器(例如袋)内相对于旋转轴的径向距离或平均径向距离的RCF值。在其他实施方式中，给定在旋转期间作为整体的样品或组合物的位置或在其一个或多个具体细胞或平均值或层处的RCF。举例而言，该值可为在旋转期间在离心室或其他容器中的表层细胞，例如在细胞于其中旋转的液体与细胞本身之间的界面处的细胞表面的RCF。
一般而言，RCF通过公式1.119×10-5(rpm)2r(或1.12×10-5×(rpm)2*r)计算得到，其中r＝半径(也即给定颗粒、物体或物质距旋转轴的距离(cm))，rpm＝转/分。举例而言，在一些实施方式中，在处理细胞的内部处理空腔的侧壁内表面的RCF可使用此公式计算得到，其中r为侧壁内表面上的点与旋转轴之间的距离。或者，在细胞或表层细胞(例如在旋转期间在细胞层与液体之间的界面)的RCF可使用该公式计算得到，其中r为细胞、表层和/或界面之间的距离或其平均值。举例而言，在一些实施方式中，侧壁RCF的半径(r)值可基于沿着离心室侧壁长度的最大及最小可能半径或全部可能半径的平均值。在一些实施方式中，由Biosafe AG出售的适用于系统的示例性离心室(例如A-200/F)的半径为2.6cm或约2.6cm或2.7cm或约2.7cm。在此类示例性离心室中，用于确定在旋转期间此类离心室中的细胞层与液体之间界面的RCF的半径可通过空腔内部侧壁与在旋转期间由细胞层占据的离心室之间的精确或近似径向距离相加计算得到。此类值可使用已知方法，例如在离心室旋转期间，例如基于所处理细胞中之一者的直径和/或此类细胞中的平均直径来计算或估计。此类值可基于细胞的原尺寸，但通常将考虑旋转或力本身对由各细胞占据的相对体积的影响，其一般而言将减小此类体积。在一些实施例中，使用细胞核的尺寸(或其平均值)来确定估计值。
因此，在具体旋转期间在具体离心室或装置中，给定点或区域的RCF或平均RCF可使用熟知方法基于转/分(rpm)及该点与旋转轴之间的距离计算得到。可使用已知方法，例如使用适合于具体装置、系统或离心室的转速计，测定各种装置及离心室的转/分(rpm)。举例而言，在一些实施方式中，在离心机、系统或装置具有自环境至离心室或空腔的窗口(例如其透明或以其他方式允许光在转速计至离心室之间通过)的情况下，手持式光电或激光转速计可例如与反射带组合使用。对于不透明系统，可使用其他转速计，例如振荡簧片型转速计。
如本领域技术人员所理解，当在用于细胞处理及离心的各种器皿及容器(例如离心室、盘、管及袋)及其材料的上下文中使用时，固定一般描述物体、其部分或材料在置于一定环境中，例如在一定程度的力、温度或其他条件下时基本上保持其形状和/或体积，其中固定将通常期望存在于使用该物体的过程中。举例而言，在本领域中应理解，例如由硬塑料制成的固定离心室及管可与以下挠性器皿区别开，例如细胞处理及细胞培养袋，例如由软塑料及橡胶(例如氟乙烯丙烯及类似材料)制成的袋，其形状在手动施加或通过引入液体或气体引起袋膨胀施加压力时变化。因此，在一些实施方式中，固定材料包括硬塑料、金属、碳纤维、复合材料、陶瓷及玻璃，和/或区别于用于制造挠性袋的挠性材料，例如软橡胶、聚硅氧及塑料，所述挠性袋的形状及体积易于通过正常压力，例如手动压力或在环境温度或正常条件下用液体填充器皿而变化。
举例而言，在一些实施方式中，固定离心室和/或其部分或材料，例如刚性侧壁或其包围中心空腔的部分，能够在具体条件下保持其形状和/或体积和/或不以使其将不再含有液体或气体的方式破裂或破坏。在一些实施方式中，此类条件包括手动压力，例如能够由人类手动施加的压力。在一些实施方式中，此类条件包括指定离心力，例如在空腔侧壁内表面的大于约200g、大于约300g或大于约500g，例如大于约1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g；或至少1000g、1500g、2000g或2500g、3000g或3200g，或约所述数值，例如2100或2200g或约2100或2200g的力(RCF)，例如有效力。在一些实施方式中，环境包括具体条件，例如下至-80℃或约-80℃的温度和/或上至生理温度或细胞保持成活的温度和/或更高温度，例如18℃至42℃的温度，例如22℃至39℃，例如至少25℃±2℃或37℃±2℃。
如本领域中所理解，将物体描述为固定或基本上固定不排除物体或材料的形状或体积将例如在过度或出人意料的力下发生任何改变的可能性。举例而言，在过度力或极端环境条件下，例如完全在通常与本文所述的转导方法结合使用的力或环境条件以外的力或环境条件。
离心室一般包括至少一个开口，例如入口、出口和/或入口/出口，以允许物质在离心室的空腔或其他部分与其他空间之间通过。举例而言，此类开口一般包括在离心室的至少一个壁面中。离心室一般包括至少一个入口及至少一个出口，其在一些实施方式中可为同一开口(入口/出口)，通过其液体和/或气体可引入至空腔中及自空腔压出。开口一般通过通道(例如管线或管线系统)，在一些实施方式中例如通过一个或多个连接器与另一环境相关联。
在一些实施方式中，离心室作为系统的一部分而被包括和/或与系统为一体的，例如封闭或部分封闭系统，其还包括额外组件，例如管线、连接器及容器。在一些实施方式中，离心室直接和/或间接预先连接至一个或多个额外组件。此类离心室可作为预先组装试剂盒(例如封装用于与所提供的方法结合而单次无菌使用的试剂盒)的一部分提供。在一些实施方式中，单独封装各种组件，例如以允许定制构型，其中用户连接及配置组件用于处理方法的具体实施方式。
组件通常包括至少一个管线及一般一套管线或管线系统及至少一个连接器。示例性连接器包括阀、端口、刺突、焊接点、密封件及软管夹具。连接器和/或其他组件可为无菌的，例如以允许整个过程在封闭无菌系统中进行，其可消除或减少对清洁房间、无菌橱柜和/或层流系统的需要。
在一些实施方式中，该至少一个管线包括一系列管线。管可由例如聚碳酸酯的塑料制成且可具有各种尺寸和/或体积，一般经设计以允许所需液体/气体在适当速率下流动且与离心室和/或其他组件连接。该一系列管线一般允许液体及气体在离心室和/或系统之一个或多个组件(例如另一容器)之间流动，其在一些方面中通过连接器促成。在一些实施方式中，系统包括使各种组件中的每个连接至所述组件中的至少另一者的管线，其中液体允许在容器中的每个(例如袋)与离心室之间流动，其可通过各种连接器(例如阀和/或夹具)的构型允许或停止。
在一些方面中，连接器为如下这样：其可置于替代性构型中或引导至替代性构型，分别阻断、允许和/或引导流体及气体流经各种组件，例如在各种容器之间及经过连接各种组件的某些管线，例如旋转阀与门阀。在其他实施方式中，某些连接器和/或其他组件具有允许、引导或阻断液体或气体通过的单一构型，例如密封件、封盖和/或开放端口或通道。系统中的各种组件可包括阀、端口、密封件及夹具。阀可包括旋转阀，例如活栓、转阀与门阀。阀可配置于歧管组中或作为单一多端口旋转阀。端口可包括鲁尔端口或刺突端口。密封件可包括O形环、密封垫、黏着密封件及偶联件。夹具可包括弹簧夹。
系统的其他组件包括能够容纳或储存液体和/或气体的容器。容器可包括袋、小瓶、盒、注射器、球状物、储槽、瓶子、烧杯、桶、烧瓶及管线。此类组件可容纳所述方法中所用及通过所述方法产生的组合物，包括副产物及临时产物及废料。此类组合物可包括液体，包括缓冲液、生长培养基、转导培养基、水、稀释剂、洗液和/或生理盐水，且亦可包括细胞、病毒和/或适用于处理步骤(例如转导)的其他药剂。容器亦可包括废料容器及容纳一种或多种输出产物的容器，所述产物例如含有通过本文方法之一个或多个处理步骤选择和/或转导的细胞的产物。
在所述系统的一些实施方式中，多个容器可在一个或多个位置处连接于系统管在线。在所提供的实施方式中，所述容器可在细胞处理方法期间同时和/或依次连接。在一些实施方式中，所述容器为自连接器可拆卸或可移除的，使得所述容器可自系统移除和/或在同一位置处经适用于系统的另一容器置换。在一些实施方式中，系统的连接器位置并非全部连接至容器，使得系统可含有空连接器。在一些此类实施方式中，封闭系统通过手动或自动操作一个或多个活栓、阀或夹具来维持，以便封闭管线与空连接器(例如端口)之间的连通。在一些实施方式中，封闭系统通过密封或拆卸空连接器(例如端口)来维持。
在所述系统(例如图5、图7或图11中所描绘的示例性系统)的一些实施方式中，容器可在对应于输入袋位置、稀释剂袋1位置、稀释剂袋2位置、废料袋位置和/或输出袋位置的位置处例如通过连接器操作性地连接至管线。参照图式，这些位置的名称仅用于例证说明且并不旨在限制容器的具体类型或在位置处可连接的容器的内含物。另外，在所提供的方法的实施方式中，并非例如图式中所描绘的系统的全部位置需要用于执行所提供的方法的处理步骤。在一些此类实施方式中，服务于空连接器(例如端口)的管线可通过活栓或阀的操作而释放或封闭。在一些实施方式中，空连接器可经密封或拆卸。
在一些实施方式中，系统(例如封闭系统)为无菌的。在一些实施方式中，系统组件(例如在管线与容器之间)通过连接器的全部连接均在无菌条件下进行。在一些实施方式中，连接在层流下进行。在一些实施方式中，在管与容器之间使用产生无菌连接(例如无菌焊接点)的无菌连接装置进行连接。在一些实施方式中，无菌连接装置在足够高的热力条件下实现连接以维持无菌性，例如至少200℃的温度，例如至少260℃或 300℃。
在一些实施方式中，系统可为抛弃式的，例如单次使用试剂盒。在一些实施方式中，单次使用试剂盒可在多个循环过程中，例如在以连续或半连续方式进行的过程中，使用例如至少2次、3次、4次、5次或5次以上。在一些实施方式中，例如单次使用试剂盒的系统用于处理来自单一患者的细胞。
示例性离心室包括由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括适用于及2系统的离心室，包括A-200/F及A-200离心室及适用于此类系统的各种试剂盒。示例性离心室、系统及处理仪器及橱柜描述于例如美国专利第6,123,655号、美国专利第6,733,433号及公开美国专利申请公开案号：US 2008/0171951及公开国际专利申请公开案号WO 00/38762中，其中的每个的内容以全文引用的方式并入本文中。根据具体过程(例如稀释、洗涤、转导、配制)，选择适合于该过程的具体试剂盒在本领域技术人员的水平内。适用于此类系统的示例性试剂盒包括(但不限于)以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2由BioSafe SA出售的单次使用试剂盒。
在一些实施方式中，系统包含一系列容器，例如袋、管、活栓、夹具、连接器及离心室。在一些实施方式中，容器(例如袋)包括一个或多个容器(例如袋)，在同一容器或单独容器(例如同一袋或单独袋)中含有待转导细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方式中，系统还包括一个或多个含有例如稀释剂和/或洗涤溶液的介质的容器(例如袋)，该介质在所述方法期间引入至离心室和/或其他组件中以稀释、再悬浮和/或洗涤组分和/或组合物。容器可连接在系统中之一个或多个位置处，例如在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废料管线和/或输出管线的位置处。
在所提供的方法的实施方式中，适用于进行该过程之一个或多个或全部部分的示例性系统描绘于图5、图7及图11中。在如图5中所示之一个示例性实施方式中，离心室(1)为至少大体上圆柱形且能围绕旋转轴旋转。该离心室包括端壁(13)及刚性侧壁(14)及可移动构件，该可移动构件为活塞(2)。端壁(13)、刚性侧壁(14)及活塞(2)的内表面共同界定该离心室的内部空腔(7)的界限。空腔(7)具有可变体积且与该离心室同轴，并经设计以含有在处理步骤期间包括在该离心室内的液体和/或气体。活塞(2)可在离心室(1)内轴向移动以改变内部空腔(7)的体积。该离心室还包括入口/出口开口(6)以允许液体及气体在该系统的至少一些构型中流入及流出该空腔。开口(6)与一系列管线(3)及连接器操作性地连接，所述连接器包括活栓阀(4)，其能够控制流体和/或气体在该系统的各种组件之间的移动。该一系列管线(3)还与各种其他容器连接，所述其他容器在所描绘的构型中包括标记物为输入袋、稀释剂袋1及2、废料袋及输出袋的袋。夹具(5)可打开及封闭以允许及阻断流体移动经过该一系列管线(3)的指定部分，从而允许在该系统的各种组件之间流动。在一些实施方式中，各容器通过端口(例如鲁尔端口或刺突端口)操作性地连接至管线。举例而言，参照图5，在展示容器的各点处，在一些方面中，容器通过端口间接连接。
虽然图5展示容器在各位置或管线处的连接，但在替代性实施方式中，在一些方面中，容器并非连接在该系统的各位置或管线处。在所提供的系统的一些实施方式中，端口可在各位置或管线处用于连接且容器连接至全部位置或管线或少于全部位置或管线。在一些实施方式中，系统的连接器位置并非全部连接至容器，使得该系统可在各位置或管线处含有空连接器。
在一些实施方式中，系统(例如图5中所示的系统)可包括无菌或微生物过滤器。此类系统的示例展示于图7中，其描绘过滤器(15)。在一些实施方式中，过滤器包括具有阻断例如细菌或病毒的微生物体通过的孔径的过滤膜。在一些实施方式中，孔径为0.1μm至0.45μm，例如0.1μm至0.22μm，例如约为或为0.20μm。在一些实施方式中，该膜由硝化纤维素(硝酸纤维素)、乙酸纤维素、再生纤维素、聚酰胺、聚四氟乙烯(PTFE)或聚醚砜(PES)组成。在一些实施方式中，过滤器包括封盖(16)以封闭或密封过滤器的膜以防暴露于封闭系统外的环境。在一些实施方式中，该封盖为封闭或不排气的。在一些实施方式中，该封盖为可拆卸的。在一些实施方式中，该封盖通过鲁尔固定配件装配至过滤器。如下文更详细地描述，在一些实施方式中，过滤器可用于实现气体(例如空气)通过到达系统离心室及自系统离心室通过。在一些此类实施方式中，空气的通过维持在无菌或无微生物条件下。
在一个实施方式中，输入袋包括用于通过所提供的方法处理(例如转导)的细胞。在一个实施方式中，稀释剂袋1包括用于转导细胞的含有载体的病毒载体颗粒。因此，在一些实施方式中，通过实现引入来自输入袋的流体及实现引入来自稀释剂袋1的流体来产生含有病毒载体颗粒及细胞的输入组合物。在一些实施方式中，稀释剂袋2含有洗涤溶液。输出袋一般经设计以在一个或多个处理步骤后引入细胞，例如通过在与病毒载体颗粒一起孵育之后将输出组合物自离心室的空腔转移至输出袋。因此，在一些实施方式中，输出袋含有经病毒载体颗粒转导和/或开始用病毒载体颗粒转导的转移细胞。在一些实施方式中，处理包含用病毒载体转导细胞。
在一些实施方式中，多路歧管(17)可用于将一个或多个容器通过连接至管线歧管的多个端口(18)操作性地连接至系统。多路歧管可含有馈至离心室入口/出口的一系列管线以允许在离心室与连接容器之间流动。在一些此类实施方式中，歧管在系统的同一位置或管线处连接多个容器，例如至少2、3、4、5、6、7、8个或8个以上容器。在一些实施方式中，多路歧管(17)的全部端口连接至容器(例如袋)。在一些实施方式中，多路歧管(17)的端口并非全部连接至容器(例如袋)，使得所连接的容器少于端口位置的总数，例如连接少于8、7、6、5、4、3或2个容器(例如袋)。在一些实施方式中，与歧管相关联的管线可含有夹具或活栓，其可根据需要打开或封闭以控制通过管线至容器中的移动。多路歧管(17)可连接至系统上可用的任何位置或管线，例如连接至名为输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废料管线和/或输出管线的位置或管线。
在一些实施方式中，用于连接容器的多路歧管(17)的示例展示于图11中，其用于连接一个或多个容器，例如一个或多个袋，例如一个或多个输出袋。如所示，在一些实施方式中，多路歧管(17)可连接至输出位置或管线，该输出位置或管线包括一系列各以例如端口(18)的连接器结束的歧管管线，用于操作性连接至容器(例如袋)。一个或多个端口，例如全部端口或少于全部端口，可连接至容器。在如图11中所示例的一个实施方式中，至多3个容器可通过端口连接至歧管的各管线。在其他实施方式中，至多1、2、3、4、5、6、7或8个容器(例如输出袋)可连接在输出管线处。在一些实施方式中，与管线(例如歧管管线)相关联之一个或多个夹具(5)可打开或封闭以允许或控制液体移动至该多个输出袋中一个或多个中。在一些实施方式中，单一夹具可控制液体同时移动至全部输出袋中。在一些实施方式中，液体至该多个袋中的每个中的移动通过操作性地连接至仅与一个相应容器相关联的管线的夹具分开调节，使得液体至相应容器中的移动可与液体至全部其他容器中的移动分开进行。在一些实施方式中，液体至各容器(例如各袋，例如各输出袋)中的移动可依次进行。
在一些实施方式中，系统包括其他仪器和/或经放置而与其他仪器联合，该仪器包括操作、自动化、控制和/或监测在该系统中进行的各种处理步骤的方面的仪器。在一些实施方式中，此仪器包含在柜体中。
在一些实施方式中，仪器包括柜体，其包括含有控制电路、离心机、盖、发动机、泵、传感器、显示器及用户界面的外壳。示例性装置描述于美国专利第6,123,655号、美国专利第6,733,433号及US 2008/0171951中。
在一些方面中，控制电路监测来自该系统的其他仪器及各种组件的信息及指令及传达信息及指令至该系统的其他仪器及各种组件。在一些实施方式中，柜体含有用户界面装置，该用户界面装置包含显示器及输入设备，例如键盘、鼠标或触摸屏。来自控制电路的用户界面显示器信息允许用户停止及开始过程或步骤，例如以实现转导方案。该界面亦可提示用户在处理步骤(例如转导方案)期间输入由控制电路使用的变量的设置。此类变量可包括待添加和/或来各种容器和/或离心室的空腔移除的各种溶液的的体积、沈降、离心、搅拌、混合和/或其他过程步骤的时间/持续时间、旋转力、活塞移动和/或程序选择。
仪器一般还包括离心机，将离心室置于其中以便实现该离心室的旋转。在一些实施方式中，离心室与离心机设备上的旋转驱动单元啮合，使得该离心室能围绕旋转轴旋转。在一些实施方式中，盖在离心室顶部上封闭且使该离心室保持原地。在一些实施方式中，该盖包括可在铰链上旋转的两个半圆形圆盘。示例性离心机及盖描述于美国专利第6,123,655号或美国专利第6,733,433号中。离心机将离心室锁定到位且通过接触该离心室的侧面或端部而使离心室旋转。
在一些实施方式中，离心机中的传感器或传感器组可测量离心室的旋转速度、可移动构件的位置或内部空腔中所含的体积。离心机外部的传感器可检测流至离心室及自离心室流出的液体及气体的颜色及流动速率。传感器亦可检测空管或离心室。传感器包括光学传感器，例如美国专利第6,123,655号、美国专利第6,733,433号及US 2008/0171951中所述的光学传感器。在一些实施方式中，来自传感器的信息可由控制电路接收。在一些实施方式中，控制电路可基于所传输的信息实现以下中一个或多个的变化：离心室的旋转速度、可移动构件的位置、空腔中所含的体积、一个或多个阀、端口、密封件或夹具的取向及离心机、离心室或系统的其他过程。
在一些实施方式中，柜体包括发动机或发动机组。发动机可与控制电路连通信息，该控制电路操作性或调节发动机。
在一些实施方式中，发动机或发动机组可使离心室在离心机内旋转。控制电路可开始、停止或调节发动机使离心室在离心机内旋转的速度。
在一些实施方式中，发动机或发动机组可使可移动构件在离心室内移动。移动可移动构件改变内部空腔体积，使得液体或气体引入至内部空腔或自内部空腔压出。
在一些实施方式中，发动机或发动机组操作性本文所述的阀、端口、密封件及夹具。控制电路可使得发动机打开、关闭或将流体通过一系列管引导至容器或离心室或自容器或离心室引导出。
在一些实施方式中，发动机为电动发动机、气动发动机或液压发动机。在一些实施方式中，柜体包括用于操作一些方面的电动发动机及用于操作其他方面的气动发动机。在一些实施方式中，柜体包括用于离心的电动发动机及用于控制可移动构件移动的气动发动机。
III.病毒核酸通过例如转导而转移至细胞
在一些实施方式中，所述方法的处理步骤包括将病毒颗粒转移至细胞的步骤，所述病毒颗粒例如编码欲在细胞中表达的重组产物的病毒载体。病毒载体颗粒一般包括含有重组核酸(例如编码此类产物的转基因)的基因组。在一些实施方式中，病毒载体颗粒编码重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，从而转导细胞可产生重组受体(例如CAR)表达细胞。核酸自病毒载体转移至细胞可使用许多已知方法中的任一者。通常通过转导进行转移。病毒载体转移至细胞的替代性方法包括转座子和/或电穿孔。此类处理步骤可根据所提供的方法的实施方式在离心室中进行。在一些实施方式中，离心室与封闭系统为一体的，使得此类处理步骤在封闭系统中进行。
转移一般通过转导来进行。病毒转移(例如转导)的方法一般涉及通过在一定条件下在离心室中孵育包含待转导细胞及含有载体的病毒载体颗粒的输入组合物，从而转导细胞或在输入组合物中的至少一些细胞中引发转导，其中该方法产生包含转导细胞的输出组合物。
在一些实施方式中，用于转导的细胞和/或转导细胞含有适用于过继免疫疗法的免疫细胞，例如T细胞。在一些实施方式中，在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前，通过包括分离(例如选择)生物样品中存在的具体细胞亚群的方法获得用于转导的细胞。下文描述与分离及选择用于转导的细胞相关的方法及所得细胞。在一些实施方式中，在开始转导过程之前，T细胞例如通过如下所述孵育及刺激而活化。在一些实施方式中，与分离(例如选择)及活化相关的全部或一部分步骤中一个或多个亦可根据如下所述提供的实施方式在离心室的空腔中进行。
在一些实施方式中，在转导方法的方面中所使用的病毒载体颗粒为适用于转导细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)的任何病毒载体颗粒。在一些实施方式中，病毒载体颗粒为反转录病毒载体颗粒，例如慢病毒载体颗粒或γ-反转录病毒载体颗粒。在一些此类实施方式中，病毒载体颗粒含有包含重组核酸的基因组，也即重组病毒载体。此类病毒载体颗粒的示例在下文加以描述。
输入组合物(在转导步骤期间含有病毒载体颗粒及细胞的组合物)可还包括一种或多种额外药剂，例如提高转导效率的药剂，例如聚阳离子，包括鱼精蛋白(例如硫酸鱼精蛋白)、海地美溴铵(hexadimethrine bromide)(Abbott实验室公司)及CH-296(Clontech公司)。在一些实施方式中，聚阳离子可以1μg/mL至100μg/mL，例如5μg/mL至50μg/mL的最终浓度存在于输入组合物中。该组合物亦可包括培养基，包括细胞培养基，包括经设计用于培养待处理细胞类型的培养基，例如造血干细胞培养基，例如无血清培养基。
在所提供的方法中，用于细胞转导的全部或一部分处理步骤可在离心室中，例如在离心或旋转下进行。在一些此类实施方式中，将含有细胞和病毒载体颗粒的输入组合物提供于或引入至离心室的内部空腔中。在一些实施方式中，输入组合物在包含旋转离心室的条件下孵育。在一些实施方式中，旋转可在大于可使用挠性塑料袋或塑料多孔盘实现的相对离心力下实现。
在一些实施方式中实现更大转导效率，部分归因于所述方法与大规模处理细胞的其他方法相比在更大相对离心力(RCF)下进行转导的能力。举例而言，使用挠性袋的大规模(例如大于50或100mL体积)处理细胞的某些可用方法仅可允许在不超过200、500或1000g的相对离心力下离心。通过允许在更大加速度或例如约为或至少约为1000、1500、2000、2100、2200、2500、3000g、3200g或3600g的相对力离心，所提供的方法可改良或允许组合物中的病毒及细胞在转导期间共沈降，改良病毒与细胞相互作用的速率，从而改良转导。
所述方法一般能够进行大规模转导。因此，在转导期间孵育的输入组合物和/或输出组合物可含有至少一定体积和/或数目的细胞。在一些实施方式中，在孵育期间输入组合物的液体体积或至少一个点的液体体积为至少或大于约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL或500mL。在一些实施方式中，输入组合物、转导组合物和/或通过所述方法转导的全部细胞包括至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109或1×1010个或约所述数目的细胞。在一些实施方式中，对于孵育的至少一部分，转导细胞的器皿(例如离心室或其空腔)含有至少1×105、1×106、1×107、1×108、1×109或1×1010个或约所述数目的细胞。此类数目及体积亦可应用于在系统中，例如在离心室的空腔中进行的其他处理步骤，例如细胞分离和/或洗涤步骤。
在一些实施方式中，在描述离心室的空腔中的各种过程步骤，包括转导过程，例如输入组合物的制备或如后续部分中所述的其他过程时，提及的任何体积为目标体积。在一些实施方式中，各种步骤(例如洗涤、稀释或配制)中所用的精确体积可不同于所需目标体积，其在一些方面中归因于管线中的怠体积(dead volume)、管线的抗原接触、传感器敏感性、使用者控制及与维持或监测体积相关联的其他因素。在一些方面中，所述方法可允许例如通过包括传感器作为与系统相关联的电路的一部分来精确控制体积。在一些实施方式中，体积变化不超过所需目标体积的10％，例如不超过9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施方式中，体积在目标体积的2mL或3mL内和/或变化不超过目标体积的2mL或3mL。
在一些实施方式中，通过组合细胞和病毒载体颗粒产生输入组合物来进行处理步骤。在所述方法的方面中，以一定方式制备细胞和病毒载体颗粒的组合物，使得所得经组合输入组合物的总液体体积与离心室的空腔内部表面积的比率低。在一些实施方式中，总液体体积足以覆盖或恰好超过在离心室旋转之后在空腔内表面上以单层形式存在的细胞的体积，同时使覆盖所述细胞的液体厚度减至最小。在一些实施方式中，减小液体厚度可减少病毒载体颗粒与细胞接触所需的沈降时间，因为病毒载体颗粒行进距离较小和/或经受来自黏稠培养基的阻力较小。
在一些实施方式中，例如改良转导效率的优势至少部分归因于尤其与其他大规模生产方法相比，在转导过程期间，例如在旋转期间，每体积细胞、细胞数目或细胞集结粒尺寸使用相对较少体积液体的能力。
在一些实施方式中，在旋转期间器皿(例如空腔)中所存在的输入组合物(含有细胞和病毒载体颗粒)的液体体积不超过每平方英寸在旋转期间空腔的内部表面积或空腔的最大内部表面积约0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7毫升(mL)。
在具体实施方式中，开始转导的器皿(例如空腔)中所存在的输入组合物的平均液体体积，例如在该方法周期中所进行的全部过程的液体体积的平均值不超过每平方英寸在孵育期间空腔的内部表面积或空腔的最大内部表面积约0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7毫升(mL)。在一些实施方式中，开始转导的器皿(例如空腔)中所存在的输入组合物(含有细胞和病毒载体颗粒)的最大液体体积，例如在该方法周期中所进行的全部过程的液体体积的最大值不超过每平方英寸离心室的空腔的内部表面积约0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7毫升(mL)。在一些实施方式中，在旋转期间器皿(例如空腔)中所存在的液体体积(例如输入组合物的液体体积)不超过在旋转期间空腔的内部表面积或空腔的最大内部表面积的体积的50％，例如不超过40％、不超过30％、不超过20％或不超过10％。在一些实施方式中，剩余体积可为气体，例如空气。
在一些实施方式中，在孵育期间，例如在旋转期间离心室中的输入组合物(含有细胞和病毒载体颗粒)的总液体体积为至少5mL或至少10mL，但不超过220mL，例如不超过200mL。在一些实施方式中，在孵育期间，例如在旋转期间输入组合物的液体体积不超过100mL、90mL、80mL、70mL、60mL、50mL、40mL、30mL或20mL。在所提供的方法的方面中，在此类总体积下制备输入组合物以达到所需浓度、量和/或细胞与病毒载体颗粒的比率，例如下文所述。
在一些实施方式中，所述方法允许使用者例如通过改变空腔体积和/或所添加的细胞数目来控制细胞与空腔表面的比率。在一些实施方式中，与其他方法(尤其可用于在离心力下大规模转导的方法，例如在离心袋中进行的方法)相比，此允许空腔表面上的细胞(例如细胞集结粒)层减少。在一些实施方式中，在转导期间控制离心室的空腔中细胞层厚度的能力可使得在其他可比条件下的转导效率增加和/或拷贝数没有增加而病毒转导效率增加。
在一些实施方式中，所提供的方法中的细胞在孵育期间以单一单层或约单一单层或不超过单一单层1.5倍或2倍或约1.5倍或2倍或基本上不比单层厚的形式存在于空腔中以便在离心力下转导。此减少在离心期间可有助于且改良病毒与细胞之间的相互作用且避免病毒拷贝数(VCN)增加，病毒拷贝数增加可尤其在高相对病毒或感染单位(IU)的情形下，例如当外层或上层细胞优先转导时发生。
在一些实施方式中，输入组合物在该孵育的至少一部分期间，例如在输入组合物在离心室中旋转期间，含有每平方公分空腔的内部表面积至少一百万个细胞。在一些实施方式中，输入组合物在该孵育的至少一部分期间，例如在输入组合物在离心室中旋转期间，含有每平方公分空腔的内部表面积至少二百万个细胞、三百万个细胞、四百万个细胞、五百万个细胞、六百万个细胞、七百万个细胞、八百万个细胞、九百万个细胞、一千万个细胞或二千万个细胞。在一些实施方式中，在该孵育的至少一部分期间，例如在旋转期间，空腔的内部表面积为至少1×109μm2或约1×109μm2或为至少1×1010μm2或约1×1010μm2。
在一些实施方式中，在该孵育的至少一部分期间，例如在输入组合物在离心室中旋转期间，输入组合物中的细胞总数为至少10×106个细胞、20×106个细胞、30×106个细胞、40×106个细胞、50×106个细胞、60×106个细胞、70×106个细胞、80×106个细胞、100×106个细胞、200×106个细胞、300×106个细胞或400×106个细胞。
在一些实施方式中，在离心系统的封闭空腔中的处理步骤亦可用于在转导之前处理细胞，例如活化细胞。在一些实施方式中，处理可包括稀释或浓缩细胞至所需浓度或数目。在一些实施方式中，处理步骤可包括减少体积从而根据需要增加细胞浓度。在一些实施方式中，处理包括将培养基更换成转导可接受或所需的培养基。
在一些实施方式中，输入组合物包含一定比率的病毒载体颗粒或其感染单位(IU)的拷贝/输入组合物中的细胞总数或待转导细胞的总数(IU/细胞)。举例而言，在一些实施方式中，输入组合物包括每个细胞为或约为或至少为或至少约为1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60个IU病毒载体颗粒。
在某些实施方式中，在本发明方法中使用较高IU的能力与其他方法相比提供优势。在另外相同的条件下，使用较高IU/细胞比率一般产生较高转导效率，或如此直至IU/细胞的某一上限，在此效率的相应增加可处于平线区。尽管如此，但在某些可用方法下，增加IU/细胞且因此增加转导效率亦导致载体拷贝数(VCN)增加，其可能存在安全风险且可能不符合监管标准。
在一些实施方式中，在所提供的方法下，输出组合物中转导细胞(例如含有病毒载体的细胞或表达由病毒载体编码的分子的细胞)的平均VCN并未随着输入组合物中IU/细胞的增加而增加。在一些实施方式中，在所提供的方法中，转导细胞的平均VCN随着输入组合物中IU/细胞比率的增加而降低。
在一些实施方式中，病毒载体颗粒的效价为或约为1×106IU/mL至1×108IU/mL，例如为或约为5×106IU/mL至5×107IU/mL，例如至少6×106IU/mL、7×106IU/mL、8×106IU/mL、9×106IU/mL、1×107IU/mL、2×107IU/mL、3×107IU/mL、4×107IU/mL或5×107IU/mL。
在一些实施方式中，输入组合物在该孵育的至少一部分期间，例如在输入组合物在离心室中旋转期间含有一定浓度的病毒载体颗粒，也即在该孵育的至少一部分期间，例如在旋转期间具有一定比率的病毒载体颗粒或其感染单位(IU)的拷贝/输入组合物中的细胞总数或待转导细胞的总数(IU/细胞)/所存在的输入组合物的总液体体积，也即IU/细胞/毫升。在一些实施方式中，输入组合物在该孵育的至少一部分期间，例如在旋转期间包括至少0.01IU、0.05IU、0.1IU、0.5IU或0.1IU病毒载体颗粒/细胞/毫升输入组合物的液体体积。
在一些实施方式中，形成输入组合物(细胞和病毒载体颗粒)的步骤可在离心室中进行。在一些实施方式中，形成输入组合物的步骤在离心室外进行。因此，术语“输入组合物”并不旨在暗示整个组合物一次性引入至相应器皿(例如管、袋或空腔)中或排除自不同容器或管线引入组合物部分。输入组合物可包括通过将两种不同组合物引入至离心室空腔中及使两者混合来形成，从而形成输入组合物。
输入组合物可自同一容器或一个以上单独容器引入至或以其他方式转移至进行孵育(例如旋转)的器皿中。举例而言，输入组合物可通过引入含有细胞的组合物及含有病毒载体颗粒的另一组合物而引入至离心室中，所述步骤可依次或同时进行。或者，将含有病毒载体颗粒及细胞的输入组合物引入至将进行转导的空腔或其他器皿中。
在一些实施方式中，若转导在离心室的内部空腔中进行，此通过仅允许空腔的某一部分包括液体输入组合物来实现。此可例如通过将空气或气体引入至一部分空腔中和/或通过在空腔内的空间(例如内部空间)中包括一个或多个固体物体来实现。在一些实施方式中，与空腔中不存在气体和/或空腔空间中不存在一个或多个固体物体相比，此可使得在该离心室孵育期间，例如在旋转期间每平方英寸空腔内部表面积该空腔中所存在的该输入组合物的总液体体积减至最少或减少。因此，与其他方法相比，其中病毒通过相较于细胞体积的大体积液体扩散可限制转导功效，所提供的方法可为有利的。因此，鉴于在一些实施方式中，输入组合物在孵育的至少一部分期间占据内部空腔的全部或基本上全部体积，在一些实施方式中，在孵育的至少一部分期间，输入组合物在该孵育期间仅占据内部空腔的一部分体积。
在一些此类实施方式中，在此孵育的至少一部分期间空腔的体积可还包括例如在该孵育之前或期间通过空腔中之一个或多个开口(例如入口)引入至该空腔中的气体。在该方法的一些实施方式中，空气经灭菌或为无菌空气。在一些实施方式中，空气不含或基本上不含微生物污染物或其他可能的病原体。
在一些实施方式中，提供或引入气体(例如空气)可以允许空气通入至离心室的内部空腔中，而例如在一些方面中不损害封闭系统的无菌性的任何方式来实现。在一些实施方式中，气体(例如空气)可在无菌条件下添加至容器中，且容器可无菌连接在系统上用于转移至离心室中的位置处。在一些实施方式中，添加气体(例如空气)至容器(例如袋)在层流条件下，例如在生物安全柜体或通风橱中实现。在一些此类实施方式中，气体(例如空气)连同液体体积一起添加至容器中，例如含有细胞组合物的液体体积和/或含有病毒载体颗粒组合物的液体体积。因此，在一些实施方式中，提供或引入气体(例如空气)至离心室的内部空腔中与提供或引入构成输入组合物的细胞或病毒载体颗粒中的一个或两个一起或同时进行。
在一些实施方式中，提供或引入气体(例如空气)至离心室中使用可连接至与系统相关联的任何鲁尔锁且操作性地连接至离心室的内部空腔的注射器来实现。在一些实施方式中，空气在无菌条件下，例如在层流下转移至注射器中。在一些实施方式中，注射器为无菌注射器，例如在一些方面中，含有未暴露于周围非无菌环境的可移动柱塞的注射器。在一些实施方式中，注射器在其末端含有过滤器以实现气体(例如空气)无菌转移至离心室的内部空腔中。
在一些实施方式中，提供或引入气体(例如空气)至离心室的内部空腔中通过使用通过无菌管线操作性地连接至离心室的内部空腔的过滤器来实现。在一些此类实施方式中，该过滤器为如参照示例性系统所述的无菌或微生物过滤器，例如在一些方面中，如图7中所示例的过滤器。在一些实施方式中，装置例如通过鲁尔锁连接件连接至过滤器以转移空气。在一些此类实施方式中，该装置为注射器、泵或其他输注装置。在一些实施方式中，气体为空气且直接自周围环境通过过滤器引入空气。在一些实施方式中，该过滤器含有封盖，例如不排气封盖，其可根据需要移除或拆卸以控制空气转移至过滤器中。
因此，在一些实施方式中，所述方法包括提供或引入液体输入组合物及一定体积的气体(例如空气)至离心室的内部空腔中。提供或引入的气体(例如空气)的体积为构成输入组合物的含有细胞的组合物及含有病毒载体颗粒的组合物的体积函数。在一些实施方式中，气体体积为内部空腔总体积与输入组合物的液体体积的差。在一些实施方式中，气体及液体的总体积不超过200mL，因此所提供或引入至内部空腔中的气体的体积为200mL与输入组合物(细胞和病毒载体颗粒)的液体体积的差。
在所提供的方法的一示例性方面中，该转导方法包括向封闭离心室系统的内部空腔中提供在不超过100mL的体积中含有至少或至少约50×106个细胞的组合物，其中该内部空腔的表面积为至少1×109μm2或约1×109μm2或至少1×1010μm2或约1×1010μm2。在一些实施方式中，细胞组合物在不超过50mL、40mL、30mL、20mL、10mL或5mL的体积中含有至少或至少约100×106个细胞或至少或至少约200×106个细胞。在一些实施方式中，在提供细胞至内部空腔的前，将细胞组合物稀释或浓缩至不超过100mL的体积，例如不超过50mL、40mL、30mL、20mL、10mL或5mL。除细胞组合物以外，在一些方面中，该方法亦包括提供一定体积的含有至少1IU/细胞的量的病毒载体颗粒的组合物，使得包括含有细胞的组合物的总液体体积小于离心室的内部空腔的最大体积，例如不超过200mL，从而产生输入组合物。在一些实施方式中，含有病毒载体颗粒的组合物以至少1.6IU/细胞、1.8IU/细胞、2.0IU/细胞、2.4IU/细胞、2.8IU/细胞、3.2IU/细胞或3.6IU/细胞的量提供。在一些实施方式中，输入组合物的总液体体积小于100mL、小于90mL、小于80mL、小于60mL、小于40mL、小于20mL。任选地，该方法亦可包括提供至多例如内部空腔总体积的气体(例如空气)，使得离心室的内部空腔中所占据的总体积为至多或约200mL。
在一些实施方式中，含有细胞的组合物及含有病毒载体颗粒的组合物及任选地空气可在提供组合物至空腔的前组合或混合。在一些实施方式中，含有细胞的组合物及含有病毒载体颗粒的组合物及任选地空气分开提供且在空腔中组合并混合。在一些实施方式中，含有细胞的组合物、含有病毒载体颗粒的组合物及任选地空气可按任何次序提供至内部空腔。在此类一些实施方式中的任一者中，含有细胞和病毒载体颗粒的组合物为一次组合或混合在一起的输入组合物，不论此类输入组合物在离心室内部或外部组合或混合和/或不论细胞和病毒载体颗粒一起或分开(例如同时或依次)提供至离心室。
在一些实施方式中，引入一定体积的气体(例如空气)在转导方法中发生在孵育(例如旋转)之前。在一些实施方式中，引入一定体积的气体(例如空气)在转导方法中发生在孵育(例如旋转)期间。
在一些实施方式中，构成输入组合物的细胞或病毒载体颗粒的液体体积及任选地空气的体积可为预先确定的体积。该体积可为经程序化和/或受与系统相关联的电路控制的体积。
在一些实施方式中，引入输入组合物及任选地气体(例如空气)为手动、半自动和/或自动控制，直至所需或预先确定的体积已引入至离心室的内部空腔中为止。在一些实施方式中，与系统相关联的传感器可例如通过颜色、流动速率和/或密度检测流至离心室及自离心室流出的液体和/或气体，且可与相关电路连通以根据需要停止或继续引入，直至已实现此类所需或预先确定的体积的引入为止。在一些方面中，经程序化或仅能够检测系统中的液体而非气体(例如空气)的传感器可能够允许气体(例如空气)在不停止引入的情况下通入至系统中。在一些此类实施方式中，在需要引入气体(例如空气)时，一段不透明管可置于接近传感器的管线中。在一些实施方式中，可手动控制气体(例如空气)的引入。
在所提供的方法的方面中，离心室的内部空腔进行高速旋转。在一些实施方式中，旋转在引入液体输入组合物及任选地空气之前、同时、随后或间歇地实现。在一些实施方式中，旋转在引入液体输入组合物及任选地空气之后实现。在一些实施方式中，旋转是通过使离心室以在内部空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的如下或至少如下的相对离心力离心：800g、1000g、1100g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3500g或4000g或约所述数目。在一些实施方式中，旋转是通过以大于或约1100g，例如大于或约1200g、大于或约1400g、大于或约1600g、大于或约1800g、大于或约2000g、大于或约2400g、大于或约2800g、大于或约3000g或大于或约3200g的力离心。
在一些实施方式中，该转导方法包括输入组合物及任选地空气在离心室中旋转或离心大于或约5分钟，例如大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟。在一些实施方式中，输入组合物及任选地空气在离心室中旋转或离心大于5分钟，但不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。
在一些实施方式中，该转导方法包括输入组合物及任选地空气在离心室中以在内部空腔侧壁内表面和/或在表层细胞的至少或大于或约1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g的力旋转或离心10分钟至60分钟之间或约10分钟至60分钟之间、15分钟至60分钟之间或约15分钟至60分钟之间、15分钟至45分钟之间或约15分钟至45分钟之间、30分钟至60分钟之间或约30分钟至60分钟之间，45分钟至60分钟之间或约45分钟至60分钟之间(各包括端点)。
在一些实施方式中，该方法包括实现自离心室的内部空腔压出输出组合物，该输出组合物为在以上所述实施方式中的任一者中细胞与病毒载体颗粒一起在包括于离心室中旋转或离心的条件下孵育的所得组合物。在该方法的方面中，输出组合物包括转导有病毒载体或已开始用病毒载体转导的细胞。在一些实施方式中，输出组合物压出至作为封闭系统的一部分与离心室操作性地连接的输出袋。在一些实施方式中，在旋转或离心之后压出输出组合物。在一些实施方式中，压出输出组合物与旋转或离心同时或部分同时，例如在半连续或连续过程中。
在一些实施方式中，离心室的空腔中的气体(例如空气)自离心室排出。在一些实施方式中，气体(例如空气)排出至作为封闭系统的一部分与离心室操作性地连接的容器。在一些实施方式中，该容器为空闲或空容器。在一些实施方式中，离心室的空腔中的空气(例如气体)通过过滤器排出，该过滤器通过无菌管线操作性地连接至离心室的内部空腔。在一些实施方式中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方式中，空气在自离心室的空腔压出含有经孵育细胞和病毒载体颗粒(例如已开始转导的细胞或已转导有病毒载体的细胞)的输出组合物之前、同时、间歇地或之后自离心室排出。
在一些实施方式中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为连续或半连续过程的一部分来进行。在一些实施方式中，连续过程涉及在孵育的至少一部分期间，例如在离心时，自器皿连续引入细胞和病毒载体颗粒，例如输入组合物(以单一预先存在的组合物形式或通过将其组成部分连续引入同一器皿，例如空腔，且从而混合)，和/或自器皿连续压出或排出液体及任选地排出气体(例如空气)。在一些实施方式中，连续引入及连续压出至少部分同时进行。在一些实施方式中，连续引入发生在孵育的一部分期间，例如在离心的一部分期间，且连续压出发生在孵育的另一部分期间。两者可交替。因此，在进行孵育时连续引入及压出可允许处理(例如转导)总体积更大的样品。
在一些实施方式中，孵育为连续过程的一部分，该方法包括在该孵育的至少一部分期间，实现在离心室旋转期间连续引入该输入组合物至空腔中，及在该孵育的一部分期间，实现在离心室旋转期间通过至少一个开口自空腔连续压出液体及任选地排出气体(例如空气)。
在一些实施方式中，半连续孵育通过在实现组合物引入至空腔中、孵育、液体自空腔压出及任选地自空腔排出气体(例如空气)例如至输出容器与接着引入含有更多细胞及其他处理试剂(例如病毒载体颗粒)的后续(例如第二、第三等)组合物之间交替且重复该过程来进行。举例而言，在一些实施方式中，孵育为半连续过程的一部分，该方法包括在孵育之前，实现输入组合物通过该至少一个开口引入至空腔中及在孵育之后，实现流体自空腔压出；实现包含细胞和病毒载体颗粒的另一输入组合物引入至该内部空腔中；及在该内部空腔中在一定条件下孵育该另一输入组合物，从而该另一输入组合物中的所述细胞经该载体转导。该过程可以反复方式再继续数轮。在此方面，半连续或连续方法可允许生产甚至更大体积和/或数目的细胞。
在一些实施方式中，转导孵育的一部分在离心室中进行，其在包括旋转或离心的条件下进行。
在一些实施方式中，该方法包括孵育，其中细胞和病毒载体颗粒的孵育的另一部分在无旋转或离心的情况下进行，其一般在包括离心室旋转或离心的至少部分孵育之后进行。在一些此类实施方式中，在一定条件下进一步孵育以使得病毒载体整合至一个或多个细胞的宿主基因组中。评定或确定孵育是否已使得病毒载体颗粒整合至宿主基因组中且因此凭经验确定进一步孵育的条件在本领域技术人员的水平内。在一些实施方式中，病毒载体整合至宿主基因组中可通过测量在孵育后由病毒载体颗粒的基因组中所含的核酸编码的重组蛋白质(例如异源蛋白质)的表达量来评定。可使用许多用于评定重组分子表达量的熟知方法，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)，例如在细胞表面蛋白质的情形下，例如通过流动式细胞测量术来检测。在一些实施例中，表达通过检测转导标记物和/或报告构建体来测量。在一些实施方式中，编码截短表面蛋白质的核酸包括在载体内且用作其表达和/或增强的标记物。
在一些实施方式中，进一步孵育在离心室中，但在无旋转的情况下进行。在一些实施方式中，进一步孵育在离心室外进行。在一些实施方式中，进一步孵育在大于室温的温度下实现，例如大于或约25℃，例如一般大于或约32℃、35℃或37℃。在一些实施方式中，进一步孵育在或约在37℃±2℃的温度下，例如在或约在37℃的温度下实现。在一些实施方式中，进一步孵育持续1小时或约1小时至48小时或约48小时、4小时或约4小时至36小时或约36小时、8小时或约8小时至30小时或约30小时或12小时或约12小时至24小时或约24小时(包括端点)的时间。
在一些实施方式中，进一步孵育发生在封闭系统中。在一些实施方式中，在输出组合物自离心室压出例如至容器(例如袋)中之后，含有输出组合物的容器再孵育一部分时间。在一些实施方式中，容器(例如袋)在或约在37℃±2℃的温度下孵育1小时或约1小时至48小时或约48小时、4小时或约4小时至36小时或约36小时、8小时或约8小时至30小时或约30小时或12小时或约12小时至24小时或约24小时(包括端点)的时间。
在一些实施方式中，所述方法实现输入和/或输出(转导)组合物中一定数目或百分比的细胞或其亚群的转导。举例而言，在一些实施方式中，输入组合物和/或输出(例如转导)组合物中全部细胞(或具体目标细胞类型，例如T细胞)的至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％转导有该病毒载体和/或表达由该病毒载体编码的重组基因产物。在一些实施方式中，该转导方法产生以下输出组合物，其中该组合物中全部细胞(例如T细胞)的至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％转导有病毒载体和/或表达由该病毒载体编码的重组基因产物。
在一些实施方式中，所述方法能够在某些条件下实现此类至少一个具体转导效率。举例而言，在一些实施方式中，若输入组合物以每个细胞1个或约1个感染单位(IU)至每个细胞10个或约10个IU，例如每个细胞1个或约1个感染单位(IU)、或每个细胞2个或约2个IU、每个细胞5个或约5个IU、或每个细胞10个或约10个IU的比率包括病毒及细胞，则该方法能够产生以下转导组合物，其中通过该方法产生的该转导组合物中至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的细胞包含、例如已转导有重组病毒载体。细胞的转导可通过检测载体中包括的重组核酸(例如转基因)或其在细胞中的产物的存在来检测。在一些实施方式中，在细胞表面上检测到产物，表明细胞已成功转导。在一些实施方式中，检测转导涉及检测转导标记物，例如出于标记转导的细胞的目的而包括的另一转基因或产物和/或其他选择标记物。
在一些实施方式中，由转导方法产生的输出组合物包括每个细胞具体平均数目的转导载体拷贝(载体拷贝数(VCN))。VCN可依据单一细胞中的拷贝数来表示。或者，其可表示为整个细胞群体或例如输出或转导组合物的组合物(包括该组合物内的任何未转导细胞，其将不包括任何载体拷贝)的平均数。或者，VCN可依据仅转导细胞当中的平均拷贝数来表示。在一些实施方式中，在通过所述方法产生的转导或输出组合物中的全部细胞当中，平均VCN不超过10、5、4、2.5、1.5或1或约所述数目。在一些实施方式中，在含有重组病毒载体或表达重组基因产物的转导或输出组合物中的细胞当中，平均VCN不超过4、3、2、2.5、1.5或1或约所述数目。
还提供通过以上方法中的任一者产生的组合物。在一些实施方式中，该组合物含有至少1×107个细胞或5×107个细胞，例如至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞，其中至少多个细胞转导有重组病毒载体。在一些实施方式中，所述细胞为T细胞。
在一些实施方式中，通过实践本文所提供的方法，有可能产生大数目含有多个转导细胞的输出组合物，例如在一些方面中，可达到适用于过继免疫疗法的T细胞治疗有效剂量的数目。在一些实施方式中，此可不仅由于大规模转导细胞的能力，而且在一些方面中，通过以连续或半连续方式重复该过程来实现。
相比之下，本领域中现有的以较小规模(例如在盘中)进行转导的方法需要在转导之后大规模扩增细胞以达到获得治疗有效剂量所必需的细胞数目。用一种或多种刺激剂扩增细胞(例如T细胞)可活化细胞和/或改变细胞表型，例如通过导致具有衰竭T细胞表型的效应细胞产生。举例而言，活化或刺激T细胞可导致T细胞分化或活化状态的改变，其可在向对象给予遗传工程改造细胞时导致和/或使得活体内持久性减小。在一些情况下，可出现的分化状态的改变包括天然表型丧失、记忆T细胞表型丧失和/或产生具有衰竭T细胞表型的效应细胞。T细胞衰竭可导致T细胞功能进行性丧失和/或细胞耗尽(Yi等人(2010)Immunology,129：474-481)。T细胞耗尽和/或T细胞持久性缺失为过继细胞疗法的功效及治疗性结果的障碍；临床试验已揭露更大和/或更长程度暴露于抗原受体(例如CAR)表达细胞与治疗结果之间的相关性。
在一些实施方式中，在本文所提供的方法中无需在转导之后刺激和/或活化细胞至与本领域中的其他已知方法所需的相同程度。在一些实施方式中，在转导之后，组合物中的细胞并未在刺激剂(例如细胞因子，例如IL-2)存在下进行扩增和/或并未在大于或约30℃或大于或约37℃的温度下孵育超过24小时。在一些实施方式中，组合物中的T细胞和/或输出组合物中的转导T细胞的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％包含高表面表达的CD69或TGF-β-II。在一些实施方式中，组合物中的T细胞或转导T细胞的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％不包含CD62L的表面表达和/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8和/或IL-2的高表达。
在一些实施方式中，通过以上方法或通过包括例如产生配制组合物的另一处理步骤的方法产生的输出组合物的经工程改造的细胞，例如经编码欲在细胞中表达的重组产物的病毒载体转导的细胞，在活体内给予对象时展现增加的持久性。在一些实施方式中，所提供的细胞，例如受体(例如CAR)表达细胞在给予后于对象体内的持久性与通过以下替代性转导方法所实现的相比更大，例如涉及给予通过涉及较小规模转导的方法经遗传工程改造的细胞的方法，其中T细胞在转导之前和/或之后经活化和/或刺激以扩增达到治疗有效剂量的细胞数目。举例而言，在一些方面中，所提供的细胞(例如通过所提供的方法产生的细胞)的持久性与通过给予经遗传工程改造的重组受体(例如CAR)表达群体所实现的相比更大，该群体的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有较低表达量的CD69或TGF-βII。在一些实施方式中，所提供的细胞(例如通过所提供的方法产生的细胞)的持久性与通过给予经遗传工程改造的重组受体(例如CAR)表达群体所实现的相比更大，该群体的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％展现CD62L的表面表达和/或包含低表面表达的CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8和/或IL-2。
在一些实施方式中，该持久性增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或约所述倍数或100倍以上。
在一些实施方式中，所给予细胞的持久性程度可在给予对象之后检测或定量。举例而言，在一些方面中，使用定量PCR(qPCR)评定对象的血液或血清或器官或组织(例如疾病部位)中表达重组受体的细胞(例如CAR表达细胞)的数量。在一些方面中，持久性定量为每微克DNA编码受体(例如CAR)的DNA或质体的拷贝、或每微升样品(例如血液或血清)受体表达(例如CAR表达)细胞的数目、或每微升样品外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数。在一些实施方式中，亦可进行一般使用特异性针对受体的抗体检测表达该受体的细胞的流式细胞学分析。基于细胞的分析亦可用于检测以下功能性细胞的数目或百分比，例如能够结合至疾病或病症的细胞或表达由受体识别的抗原的细胞和/或中和和/或诱导针对所述细胞的反应(例如细胞毒性反应)的细胞在此类实施方式中的任一者中，与重组受体(例如CAR表达细胞)相关联的另一标记物的表达程度或含量可用于区分所给予的细胞与对象体内的内源细胞。
在一些实施方式中，通过使T细胞活化和/或刺激减至最小，所提供的实施方式可产生由于在一些方面中持久性增加而更有效适用于过继免疫疗法的经遗传工程改造的T细胞。在一些实施方式中，所提供的细胞(例如通过所提供的方法中的任一者产生的细胞)的效能增加和/或持久性增加允许以较低剂量给予细胞的方法。此类方法可使过继免疫疗法可出现的毒性减至最小。
其他细胞处理事件
在一些实施方式中，除转导步骤以外，所提供的方法的处理方法包括其他处理步骤及方法，以例如用于分开、分离、选择、孵育(例如刺激细胞例如以诱导其增殖和/或活化)、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞。在一些实施方式中，一个或多个其他处理步骤的至少一部分和/或多个步骤的至少一部分全部或部分在离心室(例如与转导方法所用相同或不同的离心室)的空腔内进行。在一些实施方式中，此一个或多个其他处理步骤的全部或一部分在含有离心室的封闭系统中，例如在无菌封闭系统中进行。
在一些实施方式中，所述方法包括以下中一个或多个：(a)在离心室的空腔中洗涤含有细胞的生物样品(例如全血样品、白细胞层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级分离T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、清血法产物或白细胞清血法产物)，(b)在离心室的空腔中例如通过使细胞与用于基于免疫亲和力的分离的选择或免疫亲和力试剂一起孵育而自样品分离(例如选择)所需细胞亚群或群体(例如CD4+或CD8+T细胞)；c)例如根据上文所述的方法使经分离(例如经选择)的细胞与病毒载体颗粒一起孵育及d)将转导细胞配制于例如医药学上可接受的缓冲液、低温保存剂或其他适合的培养基中。在一些实施方式中，所述方法可还包括(e)在离心室的空腔中通过使细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，从而诱导细胞增殖。在一些实施方式中，刺激细胞的步骤在细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前、期间和/或之后进行。在一些实施方式中，洗涤或悬浮步骤之一个或多个其他步骤，例如用于细胞稀释、浓缩和/或缓冲液更换的步骤，亦可在以上步骤中的任一者之前或之后进行。
因此，在一些实施方式中，所述方法在制备用于临床使用，例如用于过继细胞疗法的细胞时，在不使细胞暴露于非无菌条件的情况下及在无需使用无菌房间或柜体的情况下进行一个、多个或全部步骤。在此过程的一些实施方式中，分离、分离或选择、刺激、转导、洗涤及配制细胞全部在封闭系统内进行。在一些实施方式中，所述方法以自动化方式进行。在一些实施方式中，一个或多个步骤在离心室系统外进行。
样品
在一些实施方式中，处理步骤包括自以下生物样品分离细胞或其组合物，例如自对象获得或来源于对象的生物样品，该对象为例如患有具体疾病或病症或需要细胞疗法或将给予细胞疗法的对象。在一些方面中，该对象为人类，例如作为需要具体治疗性干预(例如过继细胞疗法)而对其进行细胞分离、处理和/或工程改造的患者的对象。因此，在一些实施方式中，细胞为原代细胞，例如原代人类细胞。样品包括直接自对象获取的组织、流体及其他样品，以及由一个或多个处理步骤(例如分离、离心、遗传工程改造(例如经病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)产生的样品。生物样品可为直接自生物来源获得的样品或经处理的样品。生物样品包括(但不限于)体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液及汗液、组织及器官样品，包括来源于其的经处理样品。
在一些方面中，样品为血液样品或来源于血液的样品，或为清血法或白细胞清血法产物或来源于清血法或白细胞清血法产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织生物检体、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰脏、乳房、骨骼、前列腺、子宫颈、睪丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或来源于其的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的情形中，样品包括自体及同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和力的细胞分离步骤。在一些实施例中，将细胞洗涤、离心和/或在一种或多种试剂存在下孵育，以例如移除不想要的组分、富集所需组分、溶解或移除对具体试剂敏感的细胞。在一些实施例中，根据一种或多种特性(例如密度、黏附特性、尺寸、敏感性和/或对具体组分的耐受性)分离细胞。在一些实施例中，来自对象循环血液的细胞例如通过清血法或白细胞清血法来获得。样品可含有淋巴细胞，包括T细胞、单核球、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红血球和/或血小板。
在一些实施方式中，所提供的方法包括在封闭系统中，例如在离心室中整体或部分处理一种或多种样品。在一些实施方式中，处理步骤可涉及洗涤来自对象的样品(例如含有血细胞的样品)以例如移除血浆部分，和/或将细胞更换在适当缓冲液或培养基中以便后续处理步骤，和/或进行基于密度的细胞分离方法，例如在通过裂解红血球及通过Percoll或Ficoll梯度离心而自外周血制备白细胞时。此类处理步骤的示例可使用与一个或多个与细胞处理系统相关联的系统结合的离心室来进行，例如由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括适用于或Sepax 细胞处理系统的离心室。
基于亲和力的选择
处理步骤(例如在离心室中进行)可包括自混合群体和/或组合物分离细胞，例如使用各种选择步骤中之一者，包括基于密度或基于其他物理特性的分离方法及基于亲和力的选择。在一些实施方式中，所述方法包括选择，其中该选择的全部或一部分在离心室的内部空腔中，例如在离心旋转下进行。在一些实施方式中，细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育在离心室中进行。此类方法与其他可用选择方法相比可提供某些优势。
举例而言，基于免疫亲和力的选择可取决于所分离的细胞与固体表面(例如颗粒)上特异性结合至细胞上的标记物的分子(例如抗体或其他结合搭配物)之间的有利能量相互作用。在使用颗粒(例如珠)的基于亲和力的分离的某些可用方法中，颗粒及细胞在容器(例如管或袋)中孵育，同时震荡或混合，使得细胞密度与颗粒(例如珠)比率恒定以帮助促进能量上有利的相互作用。此类途径用于大规模生产可能不理想，例如因为其可能需要使用大体积以维持最佳或所需细胞与颗粒比率，同时维持所需细胞数目。因此，此类途径可能需要以分批模式或型式处理，其可能需要增加时间、步骤数及操作、增加成本及使用者错误风险。
在一些实施方式中，通过在离心室的空腔中进行此类选择步骤或其部分(例如与经抗体涂布的颗粒(例如磁性珠)一起孵育)，使用者能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理及其时序期间溶液的添加，其与其他可用方法相比可提供优势。举例而言，在孵育期间减少空腔中的液体体积的能力可增加用于选择的颗粒(例如珠试剂)的浓度且因此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。此继而可增强所处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方式中，在离心室中进行孵育步骤，例如当与如本文所述的系统、电路及控制器相关联时，允许使用者在孵育期间的所需时间实现溶液搅拌，其亦可改良相互作用。
在一些实施方式中，选择步骤的至少一部分在离心室中进行，其包括细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面中，一定体积的细胞与一定量的所需基于亲和力的选择试剂混合，该量远小于当根据制造商说明书在管或容器中进行类似选择以选择相同数目的细胞和/或相同体积的细胞时通常所采用的量。在一些实施方式中，所采用的选择试剂的量为根据制造商说明书在基于管或容器孵育相同数目的细胞和/或相同体积的细胞时用于选择细胞的相同选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
例如作为选择方法的一部分、可在离心室空腔中进行的与选择试剂一起孵育包括使用一种或多种选择试剂，以基于细胞内或细胞上一种或多种特异性分子的表达或存在选择一种或多种不同细胞类型，所述特异性分子例如表面标记物(例如表面蛋白质)、细胞内标记物或核酸。在一些实施方式中，可使用基于此类标记物使用选择试剂分离的任何已知方法。在一些实施方式中，选择试剂产生分离，也即基于亲和力或免疫亲和力的分离。举例而言，在一些方面中，选择包括与基于一种或多种标记物的细胞表达或表达量分离细胞及细胞群体的试剂一起孵育，通常细胞表面标记物例如通过与特异性结合至此类标记物的抗体或结合搭配物一起孵育，一般随后为洗涤步骤及分离已结合该抗体或结合搭配物的细胞与尚未结合至该抗体或结合搭配物的那些细胞。
在一些实施方式中，关于细胞的选择(例如基于免疫亲和力的选择)，将细胞孵育在离心室空腔中的组合物中，该组合物亦含有选择缓冲液与选择试剂，例如特异性结合至组合物中需要富集和/或耗尽的细胞上而非其他细胞上的表面标记物的分子，例如抗体，该选择试剂任选地偶合至例如聚合物或表面的架构，例如珠，例如磁性珠，例如偶合至特异性针对CD4及CD8的单抗的磁性珠。在一些实施方式中，如所述，选择试剂以与当在震荡或旋转下于管中进行选择时为达到选择相同数目细胞或相同体积细胞的大约相同或类似的效率所通常使用或必需的选择试剂的量相比基本上较小(例如不超过该量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)的量添加至离心室空腔中的细胞。在一些实施方式中，孵育通过添加选择缓冲液至细胞及选择试剂以达到例如10mL至200mL的目标体积而与试剂一起孵育来进行，例如至少为或为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL或约所述数目。在一些实施方式中，选择缓冲液及选择试剂在添加至细胞之前预混合。在一些实施方式中，选择缓冲液及选择试剂分开添加至细胞。在一些实施方式中，选择孵育在周期性温和混合条件下进行，其可帮助促进能量上有利的相互作用且从而允许使用较少总选择试剂同时实现高选择效率。
在一些实施方式中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为5分钟或约5分钟至6小时或约6小时，例如30分钟至3小时，例如至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟或约所述时间。
在一些实施方式中，孵育一般在混合条件下，例如在旋转存在下，以一般相对较低的力或速度来进行，例如低于用于使细胞集结的速度，例如600rpm或约600rpm至1700rpm或约1700rpm(例如为或约为或至少为600rpm、1000rpm、1500rpm或1700rpm)，例如以在样品或离心室或其他容器的壁面的80g或约80g至100g或约100g的RCF(例如为或约为或至少为80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方式中，使用在此类低速下旋转随后为静止时间的重复间隔来进行旋转，例如旋转和/或静止1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大致1或2秒，随后静止大致5、6、7或8秒。
在一些实施方式中，此类过程在与离心室一体的完全封闭系统内进行。在一些实施方式中，此过程(及在一些方面中另外一个或多个额外步骤，例如先前洗涤含有细胞的样品(例如清血法样品)的洗涤步骤)以自动化方式进行，使得细胞、试剂及其他组分在适当时间吸入离心室及自离心室推出且实现离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤及结合步骤。
在一些实施方式中，在细胞及选择试剂孵育和/或混合之后，对经孵育的细胞进行分离以基于具体试剂是否存在来选择细胞。在一些实施方式中，其他选择在离心室外进行。在一些实施方式中，在存在离心室且进行细胞与选择试剂的孵育的同一封闭系统中进行分离。在一些实施方式中，在与选择试剂一起孵育之后，经孵育的细胞，包括已结合选择试剂的细胞，自离心室压出，例如自离心室转移出，进入基于免疫亲和力分离细胞的系统中。在一些实施方式中，基于免疫亲和力分离的系统为或含有磁性分离柱。在一些实施方式中，在分离之前，可在离心室中进行一个或多个其他处理步骤，例如洗涤。
此类分离步骤可基于阳性选择，其中保留已结合试剂(例如抗体或结合搭配物)的细胞以供进一步使用；和/或阴性选择，其中保留尚未结合至试剂(例如抗体或结合搭配物)的细胞。在一些实施例中，两个部分皆保留以供进一步使用。在一些方面中，阴性选择可为特别适用的，其中无法获得特异性鉴别非均质群体中的细胞类型的抗体，使得分离最佳基于除所需群体以外的细胞所表达的标记物来进行。
分离无需使得具体细胞群体或表达具体标记物的细胞100％富集或移除。举例而言，具体类型的细胞(例如表达标记物的细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数目或百分比，但无需使得不表达该标记物的细胞完全不存在。同样，具体类型的细胞(例如表达标记物的细胞)的阴性选择、移除或耗尽是指减少此类细胞的数目或百分比，但无需使得全部此类细胞完全移除。
在一些实施例中，进行多轮分离步骤，其中对来自一个步骤的经阳性或阴性选择的部分进行另一分离步骤，例如后续阳性或阴性选择。在一些实施例中，单一分离步骤可耗尽同时表达多个标记物的细胞，例如通过使细胞与各特异性针对阴性选择所靶向的标记物的多种抗体或结合搭配物一起孵育。同样，多种细胞类型可通过使细胞与各种细胞类型上所表达的多种抗体或结合搭配物一起孵育而同时经阳性选择。在此类实施例中的任一者中，其他选择或选择步骤的至少一部分在离心室中进行，其如上所述包括细胞与选择试剂一起孵育。
举例而言，在一些方面中，特定T细胞亚群，例如一种或多种表面标记物(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)的阳性或高表达量细胞，通过阳性或阴性选择技术加以分离。在一些实施方式中，此类细胞通过与一种或多种特异性结合至此类标记物的抗体或结合搭配物一起孵育来选择。在一些实施方式中，抗体或结合搭配物可例如直接或间接结合至固体支持物或基质以实现选择，例如磁性珠或顺磁珠。举例而言，CD3+、CD28+T细胞可使用经CD3/CD28结合的磁性珠(例如M-450CD3/CD28T Cell Expander和/或珠)来进行阳性选择。
在一些实施方式中，过程步骤还包括例如使用可进行基于亲和力的选择的系统或设备阴性和/或阳性选择经孵育的细胞。在一些实施方式中，分离如下进行：通过阳性选择富集具体细胞群体或通过阴性选择耗尽具体细胞群体。在一些实施方式中，阳性或阴性选择分别通过使细胞与一种或多种特异性结合至在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记物+)或以相对高含量(高标记物)表达之一个或多个表面标记物的抗体或其他结合剂一起孵育来实现。
在一些实施方式中，T细胞通过阴性选择非T细胞(例如B细胞、单核球或其他白细胞)上所表达的标记物(例如CD14)而与PBMC样品分离。在一些方面中，使用CD4+或CD8+选择步骤分离CD4+辅助细胞与CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+及CD8+群体可通过对在一种或多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达至相对较高程度的标记物的阳性或阴性选择而进一步分选成亚群。
在一些实施方式中，CD8+细胞例如通过基于与相应亚群相关联的表面抗原的阳性或阴性选择而相对于初始、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方式中，对中心记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，例如在给予后改良长期存活率、扩增和/或移植，在一些方面中，功效在此类亚群中尤其稳固。参见Terakura等人(2012)Blood.1：72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9)：689-701。在一些实施方式中，组合TCM富集的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+及CD62L-亚群中。可例如使用抗CD8及抗CD62L抗体富集或耗尽CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分的PBMC。
在一些实施方式中，中心记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面中，其是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面中，通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来分离TCM细胞富集的CD8+群体。在一个方面中，以基于CD4表达选择的阴性细胞部分为起始物质对中心记忆T(TCM)细胞进行富集，其进行基于CD14及CD45RA的表达的阴性选择及基于CD62L的阳性选择。此类选择在一些方面中同时进行且在其他方面中按任一次序依次进行。在一些方面中，用于制备CD8+细胞群体或亚群的基于CD4表达的相同选择步骤亦用于产生CD4+细胞群体或亚群，使得基于CD4分离的阳性及阴性部分均保留且用于所述方法的后续步骤，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在一具体实施例中，对PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中阴性及阳性部分均保留。阴性部分接着基于CD14及CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，及基于中心记忆T细胞的标记物特征(例如CD62L或CCR7)进行阳性选择，其中阳性及阴性选择按任一次序进行。
CD4+T辅助细胞可通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群体而分选成初始、中心记忆及效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，初始CD4+T淋巴细胞为CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4+细胞为CD62L+及CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞为CD62L-及CD45RO-。
在一个实施例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单抗混合液通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合搭配物结合至固体支持物或基质，例如磁性珠或顺磁珠，以允许分离阳性和/或阴性选择的细胞。举例而言，在一些实施方式中，细胞及细胞群体使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分离(回顾于Methods in Molecular Medicine，第58卷：Metastasis Research Protocols，第2卷：Cell Behavior In Vitro and In Vivo，第17-25页，编辑：S.A.Brooks及U.SchumacherHumana Press Inc.,Totowa,NJ)。
在一些方面中，具有待分离细胞的经孵育样品或组合物与含有小可磁化或磁性反应材料(例如磁性反应颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如Dynalbeads或珠))的选择试剂一起孵育。磁性反应材料(例如颗粒)一般直接或间接连接至结合搭配物(例如抗体)，该结合搭配物特异性结合至需要分离(例如需要阴性或阳性选择)的细胞或细胞群体上所存在的分子，例如表面标记物。
在一些实施方式中，磁性颗粒或珠包含结合至特异性结合成员(例如抗体或其他结合搭配物)的磁性反应材料。许多适用于磁性分离方法的熟知磁性反应材料为已知的，例如Molday的美国专利第4,452,773号及欧洲专利说明书EP 452342B中所述的磁性反应材料，其以引用的方式并入本文中。亦可使用胶态尺寸化颗粒，例如Owen的美国专利第4,795,698号及Liberti等人的美国专利第5,200,084号中所述的胶态尺寸化颗粒。
孵育一般在一定条件下进行，从而连接至磁性颗粒或珠的抗体或结合搭配物或特异性结合至此类抗体或结合搭配物的分子(例如二级抗体或其他试剂)特异性结合至样品内的细胞的细胞表面分子(若存在)。
在某些实施方式中，磁性反应颗粒经初级抗体或其他结合搭配物、二级抗体、凝集素、酶或抗生蛋白链菌素涂布。在某些实施方式中，磁性颗粒通过特异性针对一个或多个标记物的初级抗体涂层而连接至细胞。在某些实施方式中，细胞(而非珠)经初级抗体或结合搭配物标记物，且接着添加经细胞类型特异性二级抗体或其他结合搭配物(例如抗生蛋白链菌素)涂布的磁性颗粒。在某些实施方式中，经抗生蛋白链菌素涂布的磁性颗粒与经生物素标记物的初级或二级抗体结合使用。
在一些方面中，在以下程序中实现分离，其中将样品置于磁场中且具有磁性反应或连接有可磁化颗粒的那些细胞将吸引至磁体并与未标记物的细胞分离。对于阳性选择，保留吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未吸引的细胞(未标记物的细胞)。在一些方面中，在同一选择步骤期间进行阳性及阴性选择的组合，其中阳性及阴性部分保留且进一步处理或进行其他分离步骤。
在一些实施方式中，基于亲和力的选择是通过磁性活化细胞分选(MACS)(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)。磁性活化细胞分选(MACS)，例如CliniMACS系统能够高纯度选择连接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以一定模式操作，其中非目标物质及目标物质在施加外部磁场之后依次溶离。也即，连接至磁化颗粒的细胞保持在适当位置，而溶离未连接的物质。接着，在此第一溶离步骤完成之后，在磁场中捕获且防止溶离的物质以某一方式释放，使其可溶离及回收。在某些实施方式中，非目标细胞经标记且自非均质细胞群体耗尽。
在一些实施方式中，处理步骤包括自离心室压出与一种或多种选择试剂一起孵育的细胞。在一些实施方式中，细胞可在一个或多个洗涤步骤之后和/或与一个或多个洗涤步骤连续压出，其可在一些方面中在离心室中进行。
在一些实施方式中，磁性反应颗粒保持连接至待随后孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面中，所述颗粒保持连接至向患者给予的细胞。在一些实施方式中，可磁化或磁性反应颗粒自细胞移除。自细胞移除可磁化颗粒的方法为已知的且包括例如使用未经标记的竞争性抗体、可磁化颗粒或结合至可裂解连接符的抗体等。在一些实施例中，可磁化颗粒可生物降解。
冷冻及低温保存
在一些实施方式中，例如在洗涤步骤移除血浆及血小板后，将细胞(例如经选择的细胞)悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可使用多种已知冷冻溶液及参数中的任一者。一个实施例涉及使用含有20％DMSO及8％人类血清白蛋白(HSA)的PBS或其他适合的细胞冷冻培养基。接着用培养基1:1稀释，使得DMSO及HSA的最终浓度分别为10％及4％。
在一些实施方式中，细胞(例如经选择的细胞)可使用与一个或多个与细胞处理系统相关联的系统结合的离心室转移至低温保存培养基，例如由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括适用于或Sepax细胞处理系统的离心室。在一些实施方式中，转移至低温保存培养基与一个或多个处理步骤相关联，该一个或多个处理步骤可涉及洗涤样品(例如经选择的细胞样品)，例如以移除选择培养基和/或将细胞更换于适当低温保存缓冲液或用于后续冷冻的培养基中。
在一些实施方式中，细胞在所述处理方法之前、期间或之后冷冻，例如低温保存。在一些实施方式中，冷冻及后续解冻步骤移除细胞群体中的粒细胞及在一定程度上移除单核球。细胞一般接着以每分钟1°的速率冷冻至-80℃且储存于液氮储槽的气相中。
孵育及刺激
在一些实施方式中，处理步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行的处理步骤)包括孵育、刺激和/或活化细胞，例如通过孵育和/或培养细胞。举例而言，在一些实施方式中，提供用于刺激经分离的细胞(例如经选择的细胞群体)的方法。在一些实施方式中，处理步骤包括孵育含有细胞(例如经选择的细胞)的组合物，其中该孵育的至少一部分在离心室和/或其他器皿中，例如在刺激下条件。孵育可在遗传工程改造之前或与遗传工程改造结合，例如由上文所述的转导方法的实施方式引起的遗传工程改造。在一些实施方式中，刺激使得细胞例如在转导之前活化和/或增殖。
在一些实施方式中，处理步骤包括孵育细胞(例如经选择的细胞)，其中孵育步骤可包括培养(culture)、培养(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖细胞。在一些实施方式中，组合物或细胞在刺激条件或刺激剂存在下孵育。此类条件包括经设计以诱导群体中的细胞增殖、扩增、活化和/或存活、模拟抗原暴露和/或使用于遗传工程改造的细胞致敏，例如引入重组抗原受体。
在一些实施方式中，刺激和/或活化的条件可包括以下中一个或多个：具体培养基；温度；氧气含量；二氧化碳含量；时间；药剂，例如营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化激素、抗原、结合搭配物、融合蛋白、重组可溶性受体；及经设计以活化细胞的任何其他药剂。
在一些实施方式中，刺激条件或药剂包括一种或多种能够活化TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂，例如配体。在一些方面中，药剂打开或引发T细胞中的TCR/CD3细胞内信号级联，例如适于传递初级信号例如以引发ITAM诱导的信号活化的药剂，例如特异性针对TCR组分的药剂和/或促进协同刺激信号的药剂，例如特异性针对T细胞协同刺激受体的药剂，例如抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如结合至固体支持物，例如珠)和/或一种或多种细胞因子。抗CD3/抗CD28珠(例如 M-450CD3/CD28T Cell Expander和/或珠)属于刺激剂。任选地，扩增方法可进一步包含添加抗CD3和/或抗CD28抗体至培养基的步骤。在一些实施方式中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如至少约10个单位/毫升浓度的IL-2。在一些实施方式中，根据以下技术进行孵育，例如Riddell等人的美国专利第6,040,177号、Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9)：651-660、Terakura等人(2012)Blood.1：72-82和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9)：689-701中所述的技术。
在一些实施方式中，通过向组合物中添加饲养细胞，例如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如使得所得细胞群体含有每个T淋巴细胞至少约5、10、20或40个或40个以上PBMC饲养细胞于待扩增的初始群体中)；且孵育培养物(例如足以扩增T细胞数目的时间)来扩增T细胞。在一些方面中，非分裂饲养细胞可包含γ辐射PBMC饲养细胞。在一些实施方式中，PBMC经约3000rads至3600rads范围内的γ射线辐射以防止细胞分裂。在一些方面中，饲养细胞在添加T细胞群体之前添加至培养基中。
在一些实施方式中，刺激条件一般包括适于人类T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，一般至少约30度且一般37摄氏度或约37摄氏度。任选地，孵育可进一步包含添加非分裂EBV转型类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。LCL可经约6000rads至10,000rads范围内的γ射线辐射。在一些方面中，LCL饲养细胞以任何适合量提供，例如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率至少约10：1。
在实施方式中，抗原特异性T细胞，例如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，通过用抗原刺激初始或抗原特异性T淋巴细胞来获得。举例而言，针对细胞巨大病毒抗原的抗原特异性T细胞株或纯系可通过自感染对象分离T细胞且用相同抗原活体外刺激细胞来产生。
在一些实施方式中，在一种或多种刺激条件或刺激剂(例如上文所述的任一者)下孵育的至少一部分在离心室中进行。在一些实施方式中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与诱导刺激和/或活化的试剂混合。在一些实施方式中，细胞(例如经选择的细胞)在离心室中与刺激条件或刺激剂混合。在此类过程的一些方面中，一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，该量远小于当在细胞培养盘或其他系统中进行类似刺激时通常所采用的。
在一些实施方式中，刺激剂以与当在周期性震荡或旋转下于离心室(例如管或袋)中在未混合的情况下进行选择时为达到选择相同数目细胞或相同体积细胞的大约相同或类似的效率所通常使用或必需的刺激剂的量相比基本上较小(例如不超过该量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)的量添加至离心室空腔中的细胞。在一些实施方式中，孵育通过添加孵育缓冲液至细胞及刺激剂以达到例如10mL至200mL的目标体积而与试剂一起孵育来进行，例如至少为或为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL或约所述数目。在一些实施方式中，孵育缓冲液及刺激剂在添加至细胞之前预混合。在一些实施方式中，孵育缓冲液及刺激剂分开添加至细胞。在一些实施方式中，刺激孵育在周期性温和混合条件下进行，其可帮助促进能量上有利的相互作用且从而允许使用较少总刺激剂同时实现细胞的刺激及活化。
在一些实施方式中，与刺激剂一起孵育的总持续时间为或约为：1小时至72小时、1小时至48小时、4小时至36小时、8小时至30小时或12小时至24小时，例如至少或至少约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些情况下，在离心室中孵育的总持续时间为5分钟或约5分钟至6小时或约6小时，例如30分钟至3小时，例如至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟或约所述时间。在一些情况下，孵育的另一部分可在离心室外进行。
在一些实施方式中，孵育一般在混合条件下，例如在旋转存在下，以一般相对较低的力或速度来进行，例如低于用于使细胞集结的速度，例如600rpm或约600rpm至1700rpm或约1700rpm(例如为或约为或至少为600rpm、1000rpm、1500rpm或1700rpm)，例如以在样品或离心室或其他容器的壁面的80g或约80g至100g或约100g的RCF(例如为或约为或至少为80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方式中，使用在此类低速下旋转随后为静止时间的重复间隔来进行旋转，例如旋转和/或静止1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大致1或2秒，随后静止大致5、6、7或8秒。
在一些实施方式中，细胞在离心室中与细胞刺激剂一起孵育，该/所述细胞刺激剂为能够诱导细胞内信号传导和/或细胞增殖的细胞结合剂，例如抗原结合剂，例如抗体。在一些实施方式中，细胞根据所提供的方法的过程方面在离心室中与抗CD3/抗CD28珠一起孵育，包括与其混合。
在一些实施方式中，处理步骤包括自离心室压出与一种或多种刺激条件或刺激剂一起孵育(例如与其混合)的细胞。在一些实施方式中，一个或多个其他额外处理步骤可在离心室中进行，例如洗涤，其可在刺激孵育之前、之后和/或与其连续。在一些实施方式中，在例如对经选择或解冻的细胞进行刺激之前进行洗涤，以用适于刺激及孵育细胞的培养基移除且更换培养基。
在一些实施方式中，自离心室压出的已与一种或多种刺激条件或刺激剂一起孵育(例如与其混合)的细胞在离心室外进一步孵育。在一些实施方式中，进一步孵育在大于室温的温度下实现，例如大于25℃或约25℃，例如一般大于32℃、35℃或37℃或约32℃、35℃或37℃。在一些实施方式中，进一步孵育在37℃±2℃或约37℃±2℃的温度下，例如在37℃或约37℃的温度下实现。在一些实施方式中，进一步孵育持续12小时或约12小时至96小时或约96小时，例如至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时或约所述时间。
在一些实施方式中，进一步孵育发生在封闭系统中。在一些实施方式中，在与一种或多种刺激条件或刺激剂一起孵育(例如混合)的细胞自离心室压出例如至容器(例如袋)中之后，含有所述细胞的容器再孵育一部分时间。在一些实施方式中，容器(例如袋)在37℃±2℃或约37℃±2℃的温度下孵育1小时或约1小时至48小时或约48小时、4小时或约4小时至36小时或约36小时、8小时或约8小时至30小时或约30小时或12小时或约12小时至24小时或约24小时(包括端点)的时间。
配制
在一些实施方式中，过程步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行的)可包括细胞配制，例如配制由所提供的转导处理步骤和/或所述一个或多个其他处理步骤产生的经遗传工程改造的细胞。在一些实施方式中，所提供的与细胞配制相关联的方法包括在例如在离心室中或与离心室相关联的封闭系统中，使用上文所述的处理步骤处理转导细胞，例如经转导和/或扩增的细胞。
在一些实施方式中，细胞配制于医药学上可接受的缓冲液中，该缓冲液可在一些方面中包括医药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方式中，处理包括将培养基更换成医药学上可接受或给予对象所需的培养基或配制缓冲液。在一些实施方式中，处理步骤可涉及洗涤经转导和/或扩增的细胞以将所述细胞置换于医药学上可接受的缓冲液中，该缓冲液可包括一种或多种任选地选用的医药学上可接受的载剂或赋形剂。包括医药学上可接受的载剂或赋形剂的此类医药形式的示例可为下文所述与向对象给予细胞及组合物可接受的形式结合的任何形式。在一些实施方式中，医药组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量，例如治疗有效或预防有效量的细胞。
在一些实施方式中，配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方式中，细胞用含有1.0％至30％DMSO溶液(例如5％至20％DMSO溶液或 5％至10％DMSO溶液)的低温保存溶液配制。在一些实施方式中，低温保存溶液为或含有例如含有20％DMSO及8％人类血清白蛋白(HSA)的PBS或其他适合的细胞冷冻培养基。在一些实施方式中，低温保存溶液为或含有例如至少或至少约7.5％DMSO。在一些实施方式中，处理步骤可涉及洗涤经转导和/或扩增的细胞以将所述细胞置换于低温保存溶液中。
在一些实施方式中，处理可包括稀释或浓缩细胞至所需浓度或数目，例如包括以给定剂量或其部分给予的细胞数目的单位剂型组合物。在一些实施方式中，处理步骤可包括减少体积从而根据需要增加细胞浓度。在一些实施方式中，处理步骤可包括增加体积从而根据需要减小细胞浓度。
在一些实施方式中，处理包括添加一定体积的配制缓冲液至经转导和/或扩增的细胞。在一些实施方式中，配制缓冲液的体积为10mL或约10mL至1000mL或约1000mL，例如至少为或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL或约所述数目。
此类处理步骤的示例可使用与一个或多个与细胞处理系统相关联的系统或试剂盒结合的离心室来进行，例如由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括适用于或Sepax细胞处理系统的离心室。
在一些实施方式中，该方法包括实现自离心室的内部空腔压出配制组合物，该配制组合物为在所述以上实施方式中的任一者中，在配制缓冲液(例如医药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方式中，配制组合物压出至作为封闭系统的一部分与离心室操作性地连接的容器(例如袋)。在一些实施方式中，容器(例如袋)如图5或图7中描绘的示例性系统中所示例，在输出管线或输出位置处连接至系统。
在一些实施方式中，例如与细胞处理系统相关联的封闭系统(例如离心室)包括多端口输出试剂盒，该试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，该端口可连接至一个或多个容器以供配制组合物压出。在一些方面中，所需数目或多个输出容器(例如袋)可无菌连接至多端口输出之一个或多个，一般两个或更多，例如至少3、4、5、6、7、8个或8个以上端口。举例而言，在一些实施方式中，一个或多个容器(例如袋)可连接至端口或不到全部的端口。因此，在一些实施方式中，该系统可实现输出组合物压出至多个输出袋中。
在一些方面中，细胞可以用于剂量给予(例如用于单一单位剂量给予或多个剂量给予)的量压出至多个输出袋中一个或多个中。举例而言，在一些实施方式中，输出袋可各含有以给定剂量或其部分给予的细胞数目。因此，在一些方面中，各袋可含有单一单位给予剂量或可含有所需剂量的一部分，使得多个输出袋中之一个以上，例如两个输出袋或3个输出袋一起构成给予剂量。
因此，容器(例如袋)一般含有待给予的细胞，例如其一个或多个单位剂量。单位剂量可为待给予对象的细胞的量或数目或待给予的细胞的数目的两倍(或更多)。其可为将给予对象的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方式中，容器(例如袋)中的每个单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方式中，容器中的每个包含相同或大致或基本上相同数目的细胞。在一些实施方式中，单位剂量包括每公斤待治疗和/或细胞所来源的对象小于约1×108个、小于约5×107个、小于约1×106个或小于约5×105个细胞。在一些实施方式中，各单位剂量含有至少或至少约1×106个、2×106个、5×106个、1×107个、5×107个或1×108个经工程改造的细胞、全部细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方式中，各袋中的配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，例如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。
在一些实施方式中，多个输出袋中一个或多个可用于测试，例如用于评定转导效率。举例而言，在一些方面中，转导效率可通过测量在使用所提供的方法的实施方式转导后，由病毒载体颗粒的基因组中所含的核酸编码的重组蛋白质(例如异源蛋白质)的表达量来评定。因此，在一些实施方式中，重组分子的表达量可通过许多熟知方法中的任一来评定，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)，例如在细胞表面蛋白质的情形下，例如通过流动式细胞测量术来检测。在一些方面中，通过检测转导标记物和/或报告构建体来测试多个容器(例如袋)中一个或多个中所含的细胞的重组分子表达量。在其他实施方式中，使用载体内所包括的编码截短表面蛋白质的核酸作为标记物来评定表达。
在一些实施方式中，细胞压出至其中的多个容器的全部或基本上全部含有相同数目的细胞且在相同或基本上相同的浓缩下。在一些实施方式中，在细胞压出至多个容器中之一者之前，管线经活化(primed)。
IV.细胞和组合物
细胞、细胞群体及组合物属于待用于所述方法(例如处理步骤，例如转移病毒核酸，例如转导)的细胞。
细胞一般为哺乳动物细胞且通常为人类细胞。在一些实施方式中，细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些方面中，细胞为免疫系统细胞，例如具有先天性或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，例如多潜能及多能干细胞，包括经诱导的多能干细胞(iPSC)。细胞通常为原代细胞，例如直接自对象分离和/或自对象分离且冷冻的细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型之一个或多个亚群，例如完整T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，例如根据以下定义的细胞：功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在具体器官或区室中存在、标记物或细胞因子分泌概况和/或分化程度。提及所治疗的对象时，细胞可为同种异体细胞和/或自体细胞。在一些实施方式中，所述方法包括自对象分离细胞，对其进行制备、处理、孵育和/或工程改造，在低温保存之前或之后将其再引入至同一对象体内，所述方法在一些方面中可使用所提供的处理步骤中一个或多个在封闭系统中实现。
T细胞和/或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的亚型及亚群为初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或末期分化效应记忆T细胞；肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在及适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，例如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞；α/βT细胞及δ/γT细胞。
在一些实施方式中，细胞为自然杀手(NK)细胞。在一些实施方式中，细胞为单核球或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性球、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
V.病毒载体颗粒，病毒载体和编码的重组产物
转导方法一般涉及用病毒载体，例如编码欲在细胞中表达的重组产物的病毒载体转导。如本文所用，术语“载体”是指一种核酸分子，其能够传播其所连接的另一核酸。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入其已引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导其操作性地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，例如反转录病毒载体，例如慢病毒或γ-反转录病毒载体，其具有携带另一核酸的基因组且能够插人至宿主基因组中以便其传播。
在一些实施方式中，病毒载体在载剂中(也即病毒载体颗粒)转移至细胞，该病毒载体颗粒包括包封和/或封装病毒载体基因组的病毒颗粒。在一些此类实施方式中，除编码重组分子的核酸以外，病毒载体的基因组通常亦包括允许基因组封装至病毒颗粒中的序列。
在一些实施方式中，病毒载体含有重组核酸，例如编码重组和/或异源分子(例如重组或异源蛋白质)的核酸。在一些实施方式中，例如在所提供的方法的方面中，用病毒载体转导产生输出组合物，其中的细胞已经转导且表达此类核酸的重组产物或经遗传工程改造的产物。在一些实施方式中，核酸为异源核酸，也即细胞或自细胞获得的样品中通常不存在的核酸，例如自另一生物体或细胞获得的核酸，此类核酸例如在经转导的细胞和/或此类细胞所来源的生物体中通常未发现。在一些实施方式中，核酸并非天然存在的核酸，例如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的不同结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方式中，使用重组病毒或病毒载体颗粒(例如来源于猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方式中，使用重组慢病毒载体或反转录病毒载体(例如γ-反转录病毒载体)将重组核酸转移至细胞(例如T细胞)中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi：10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10)：1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人，Trends Biotechnol.2011年11月29(11)：550-557。
在一些实施方式中，反转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如来源于莫罗尼鼠类白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠类胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、脾脏病灶形成病毒(SFFV)或腺伴随病毒(AAV)的反转录病毒载体。大部分反转录病毒载体来源于鼠类反转录病毒。在一些实施方式中，反转录病毒包括来源于任何禽类或哺乳动物细胞来源的反转录病毒。反转录病毒通常为双嗜性，意味着其能够感染数个物种(包括人类)的宿主细胞。在一个实施方式中，待表达的基因置换反转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多说明性反转录病毒系统(例如美国专利第5,219,740号；第6,207,453号；第5,219,740号；Miller及Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180：849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；及Boris-Lawrie及Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
病毒载体一般包括重组核酸，例如编码欲由细胞表达的重组产物的转基因。重组产物包括重组受体，包括抗原受体，例如功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)；及其他抗原结合受体，例如转基因T细胞受体(TCR)。其他嵌合受体亦属于重组受体。
示例性抗原受体(包括CAR)及工程改造此类受体并将其引入至细胞中的方法包括例如国际专利申请公开案第WO200014257号、第WO2013126726号、第WO2012/129514号、第WO2014031687号、第WO2013/166321号、第WO2013/071154号、第WO2013/123061号、美国专利申请公开案第US2002131960号、第US2013287748号、第US20130149337号、美国专利第6,451,995号、第7,446,190号、第8,252,592号、第8,339,645号、第8,398,282号、第7,446,179号、第6,410,319号、第7,070,995号、第7,265,209号、第7,354,762号、第7,446,191号、第8,324,353号及第8,479,118号以及欧洲专利申请第EP2537416号中所述的那些内容和/或由Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4)：388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338；Turtle等人，Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5)：633-39；Wu等人，Cancer,2012年3月18(2)：160-75所述的那些内容。在一些方面中，抗原受体包括如美国专利第7,446,190号中所述的CAR及国际专利申请公开案第WO/2014055668A1号中所述的那些受体。CAR的实施例包括如上述公开案中的任一者，例如WO2014031687、US 8,339,645、US7,446,179、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号、美国专利第8,389,282号；Kochenderfer等人，2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9)：689-701；及Brentjens等人，Sci Transl Med.2013 5(177)中所揭示的CAR。还参见WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号及美国专利第8,389,282号。嵌合受体(例如CAR)一般包括细胞外抗原结合域，例如抗体分子的一部分，一般为抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方式中，重组受体(例如汽车)的抗体部分还包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，例如铰链区，例如IgG4铰链区和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方式中，恒定区或部分来自人类IgG，例如IgG4或IgG1。在一些方面中，恒定区的一部分充当抗原识别组分(例如scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。间隔子的长度可使得细胞在抗原结合后的反应性与间隔子不存在的情况相比增加。示例性间隔子(例如铰链区)包括国际专利申请公开案第WO2014031687号中所述之间隔子。在一些实施例中，间隔子长度为或约为12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(包括任一所列范围的端点之间的任何整数)的间隔子。在一些实施方式中，间隔区具有约12或少于12个氨基酸、约119个或少于119个氨基酸，或约229个或少于229个氨基酸。示例性间隔子包括单独IgG4铰链、连接至CH2及CH3结构域的IgG4铰链，或连接至CH3结构域的IgG4铰链。
该抗原识别结构域一般连接至一种或多种细胞内信号传导组分，例如在CAR的情况下通过抗原受体复合物(例如TCR复合物)模拟活化和/或通过另一细胞表面受体传导信号的信号传导组分。因此，在一些实施方式中，抗原结合组分(例如抗体)连接至一种或多种跨膜及细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方式中，使用与受体(例如CAR)中之一个结构域天然关联的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可经选择或通过氨基酸取代修饰以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白质的跨膜结构域，以使与受体复合物的其他成员的相互作用降至最低。
在一些实施方式中，跨膜结构域来源于天然或合成来源。在天然来源的情况下，在一些方面中，结构域来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下各者的跨膜区(也即包含至少以下各者的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。或者，在一些实施方式中，跨膜结构域为合成的。在一些方面中，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸及缬氨酸。在一些方面中，在合成跨膜结构域的各端发现苯丙氨酸、色氨酸及缬氨酸的三联体。在一些实施方式中，通过连接符、间隔子和/或跨膜结构域连接。
细胞内信号传导结构域为通过天然抗原受体仿真或接近信号、经从而受体与协同刺激受体的组合仿真或接近信号和/或通过单独协同刺激受体仿真或接近信号的那些结构域。在一些实施方式中，存在短寡肽或多肽连接符(例如长度在2个与10个氨基酸之间的连接符，例如含有甘氨酸及丝氨酸的连接符，例如甘氨酸-丝氨酸二联体)且形成CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间的连接。
受体(例如CAR)一般包括至少一种细胞内信号传导组分。在一些实施方式中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，例如介导T细胞活化及细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面中，抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方式中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方式中，受体(例如CAR)还包括一种或多种其他分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。举例而言，在一些方面中，CAR或其他嵌合受体包括CD3-ζ或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方式中，在接合CAR或其他嵌合受体后，受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域活化免疫细胞(例如经工程改造以表达CAR的T细胞)的正常效应功能或反应中的至少一者。举例而言，在一些情形下，CAR诱导T细胞功能，例如细胞溶解活性；或T辅助细胞活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方式中，抗原受体组分或协同刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分例如若转导效应功能信号，则代替完整的免疫刺激链使用。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，且在一些方面中，亦包括在天然情形中与此类受体协同起作用以在抗原受体参与后引发信号转导的共受体的细胞质序列。
在天然TCR的情形下，完全活化一般不仅需要通过TCR传导信号，而且需要协同刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，CAR中亦包括用于产生二级或协同刺激信号的组分。在其他实施方式中，CAR不包括产生协同刺激信号的组分。在一些方面中，另一种CAR表达于相同细胞中且提供产生二级或协同刺激信号的组分。
T细胞活化在一些方面中描述为由两类细胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的细胞质信号传导序列(原代细胞质信号传导序列)，及以抗原非依赖性方式起作用以提供二级或协同刺激信号的细胞质信号传导序列(二级细胞质信号传导序列)。在一些方面中，CAR包括此类信号传导组分中之一者或两者。
在一些方面中，CAR包括调节TCR复合物初级活化的原代细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的原代细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。含有ITAM的原代细胞质信号传导序列的实施例包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b及CD66d的原代细胞质信号传导序列。在一些实施方式中，CAR中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或来源于CD3ξ的序列。
在一些实施方式中，CAR包括协同刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、DAP10及ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面中，同一CAR包括活化组分及协同刺激组分。
在一些实施方式中，活化结构域包括在一个CAR内，而协同刺激组分由识别另一抗原的另一CAR提供。在一些实施方式中，CAR包括活化或刺激CAR、协同刺激CAR，其均表达于同一细胞上(参见WO2014/055668)。在一些方面中，细胞包括一个或多个刺激或活化CAR和/或协同刺激CAR。在一些实施方式中，细胞还包括抑制CAR(iCAR，参见Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，例如识别除与疾病或病症相关联和/或对疾病或病症具有特异性的抗原以外的抗原的CAR，从而通过靶向疾病的CAR传递的活化信号通过抑制CAR结合至其配体而减弱或抑制，例如以减小脱靶效应。
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜及信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28及CD137(4-1BB、TNFRSF9)协同刺激结构域。
在一些实施方式中，CAR涵盖在细胞质部分中的一个或多个(例如两个或更多)协同刺激结构域及活化结构域(例如初级活化结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28及4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方式中，CAR或其他抗原受体还包括标记物，例如细胞表面标记物，其可用于证实细胞的转导或工程改造表达受体，例如截短型细胞表面受体，例如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面中，标记物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如tEGFR)的全部或一部分(例如截短形式)。在一些实施方式中，编码标记物的核酸操作性地连接于编码连接符序列(例如可裂解连接符序列，例如T2A)的聚核苷酸。参见WO2014031687。
在一些实施方式中，标记物为非天然发现于T细胞上或非天然发现于T细胞表面上的分子，例如细胞表面蛋白质，或其一部分。
在一些实施方式中，分子为非自身分子，例如非自身蛋白质，也即未由细胞所过继性转移的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方式中，标记物不提供治疗功能和/或除作为遗传工程改造的标记物例如用于选择成功地经工程改造的细胞以外不产生作用。在其他实施方式中，标记物可为治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，例如活体内所遇到的细胞的配体，例如协同刺激或免疫检查点分子，以在过继性转移及与配体相遇时增强和/或减弱细胞反应。
在一些情况下，CAR称为第一、第二和/或第三代CAR。在一些方面中，第一代CAR为仅在抗原结合时提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面中，第二代CAR为提供此信号及协同刺激信号的CAR，例如包括来自协同刺激受体(例如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面中，第三代CAR为包括不同协同刺激受体的多个协同刺激结构域的CAR。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面中，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分及细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，抗体或片段包括scFv且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面中，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域及细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面中，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有T细胞协同刺激分子的细胞内结构域。在一些方面中，T细胞协同刺激分子为CD28或41BB。
术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用且是指氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体及其他多肽，例如连接符或肽)可包括具有天然和/或非天然氨基酸残基的氨基酸残基。术语亦包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化及磷酸化。在一些方面中，多肽可含有相对于原生或天然序列的修饰，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可为有意的，如通过定点突变诱发；或可为偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变或因PCR扩增所致的错误。
由向对象给予的细胞所表达的重组受体(例如CAR)一般识别或特异性结合至所治疗的疾病或病症或其细胞中所表达、与该疾病或病症或其细胞相关联和/或特异性针对该疾病或病症或其细胞的分子。在特异性结合至例如抗原的分子后，受体一般传递免疫刺激信号(例如ITAM转导的信号)至细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫反应。举例而言，在一些实施方式中，细胞表达特异性结合至由疾病或病症的细胞或组织或与疾病或病症相关联的细胞或组织所表达的抗原的CAR。
在一些情形中，刺激因子(例如淋巴激素或细胞因子)的过度表达可对对象具有毒性。因此，在一些情形中，病毒载体引入至细胞基因区段中，使得细胞易于进行活体内(例如在过继免疫疗法中给予后)阴性选择。举例而言，在一些方面中，在细胞经此类基因区段转导后，细胞由于其所给予的对象的活体内条件变化而消除。阴性可选表型可由赋予对所给予药剂(例如化合物)的敏感性的基因的插入产生。阴性可选基因包括赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯性疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人，CellII：223,I977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因、细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：33(1992))。
可包括在病毒载体中用于转导及在细胞中表达的额外核酸为编码以下产物的核酸，所述产物例如通过促进所转移细胞的活力和/或功能而改良疗法功效；提供用于细胞选择和/或评估的遗传标记物，例如以活体内评定存活或定位；和/或例如通过使细胞易于进行活体内阴性选择而改良安全性，如由Lupton S.D.等人，Mol.and Cell Biol.,11：6(1991)；及Riddell等人，Human Gene Therapy 3：319-338(1992)所述；亦参见Lupton等人的公开案PCT/US91/08442及PCT/US94/05601，描述由显性阳性可选标记物与阴性可选标记物融合衍生的双功能可选融合基因的用途。参见例如Riddell等人的美国专利第6,040,177号的第14-17行。
VI.治疗方法和组合物
在一些方面中，所述方法的产物用于治疗方法，例如治疗性方法，例如用于在过继细胞疗法中向对象给予细胞及组合物。还提供此类方法及通过所述方法处理且产生的细胞的用途，及其中使用的医药组合物及配制物。所提供的方法一般涉及向对象给予细胞或组合物，例如输出组合物和/或配制组合物。
在一些实施方式中，细胞表达重组受体，例如CAR，或其他抗原受体，例如转基因TCR，例如在本文所提供的转导方法中转移的重组受体。此类细胞一般给予患有由该受体特异性识别的疾病或病症的对象。在一个实施方式中，细胞表达特异性结合至与疾病或病症相关联或由其细胞或组织表达的配体的重组受体或嵌合受体，例如抗原受体，例如CAR或TCR。举例而言，在一些实施方式中，受体为抗原受体且配体为特异性针对疾病或病症和/或与疾病或病症相关联的抗原。给予一般实现疾病或病症的一种或多种症状的改良和/或治疗或预防疾病或病症或其症状。疾病、病症及病症为肿瘤，包括实体肿瘤、血液科恶性疾病及黑素瘤，且包括局部及转移性肿瘤；感染性疾病，例如经病毒或其他病原体感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV及寄生虫疾病；及自体免疫及发炎疾病。在一些实施方式中，疾病或病症为肿瘤、癌症、恶性病、赘瘤或其他增生性疾病或病症。此类疾病包括(但不限于)白血病、淋巴瘤，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、ALL、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性病、结肠癌、肺癌、肝癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑素瘤、骨癌及脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、子宫颈癌、结肠直肠癌、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、神经管胚细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
在一些实施方式中，疾病或病症为感染性疾病或病症，例如(但不限于)病毒、反转录病毒、细菌及原虫感染、免疫缺陷、细胞巨大病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方式中，疾病或病症为自体免疫或发炎疾病或病症，例如关节炎，例如类风湿性关节炎(RA)；I型糖尿病、全身性红斑狼疮(SLE)、发炎性肠病、牛皮癣、硬皮病、自体免疫甲状腺疾病、格雷氏疾病(Grave's disease)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关联的疾病或病症。
在一些实施方式中，由细胞或组合物所靶向的与疾病或病症相关联的抗原是选自下组：孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA及B型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1细胞黏附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2及MAGE A3、CE7、威尔姆斯肿瘤1(Wilms Tumor 1，WT-1)、细胞周期素，例如细胞周期素A1(CCNA1)和/或生物素标记物分子和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方式中，细胞或组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效或预防有效量)给予。因此，在一些实施方式中，给予方法包括给予有效量的细胞及组合物。在一些实施方式中，治疗或预防功效通过定期评定所治疗的对象来监测。对于经数天或更长时间的重复给予，根据病症而定，重复治疗直至出现疾病症状的所需抑制为止。然而，其他给药方案可为适用的且可加以确定。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其文法变化形式，例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指疾病或病症或病症、或症状、不良作用或后果、或与其相关联的表型完全或部分改善或减轻。所需治疗作用包括(但不限于)预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性后果、预防癌转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病况及缓解或改善预后。所述术语不表示疾病的完全治愈或任何症状的完全消除或对所有症状或后果均有作用。
如本文所用，“推迟疾病发展”意指延迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或推迟疾病(例如癌症)的发展。此推迟可具有不同时间长度，根据所治疗的疾病和/或对象的病史而定。如本领域技术人员显而易见，足够或显着推迟可实际上涵盖预防，从而使对象不出现疾病。举例而言，可推迟晚期癌症，例如出现癌转移。
如本文所用，“预防”包括在对象疾病的发病或复发方面提供预防作用，该对象可能易患该疾病，但尚未诊断患有该疾病。在一些实施方式中，所提供的细胞及组合物用于推迟疾病发展或减缓疾病进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性为当与除所关注的条件或参数以外原本相同的条件相比或与其他条件相比时，减小功能或活性。举例而言，抑制肿瘤生长的细胞与在不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，减小肿瘤生长速率。
在给予情形下，试剂(例如医药配制物、细胞或组合物)的“有效量”是指在所必需的剂量/量及时段下，有效达成所需结果(例如治疗性或预防性结果)的量。
药剂(例如医药配制物或细胞)的“治疗有效量”是指在所必需的剂量及时段下，有效达成所需治疗性结果(例如治疗疾病、病症或病症和/或治疗的药物动力学或药力学作用)的量。治疗有效量可根据以下因素而变化：例如对象的疾病病况、年龄、性别及体重以及所给予的细胞群体。
“预防有效量”是指在所必需的剂量及时段下，有效达成所需预防结果的量。通常但不一定，由于对象在患病之前或在疾病早期使用预防剂量，故预防有效量将低于治疗有效量。
用于过继细胞疗法的细胞的给予方法为已知的且可结合所提供的方法及组合物加以使用。举例而言，过继T细胞疗法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开案第2003/0170238号；Rosenberg的美国专利第4,690,915号；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10)：577-85)中。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10)：928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1)：84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338。
在一些实施方式中，细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)通过自体转移来进行，其中所述细胞自将接受该细胞疗法的对象或自来源于此对象的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面中，细胞来源于需要治疗及所述细胞的对象(例如患者)，且在分离及处理后，将所述细胞给予同一对象。
在一些实施方式中，细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)通过同种异体转移来进行，其中所述细胞自除将接受或最终接受该细胞疗法的对象以外的对象(例如第一对象)分离或以其他方式制备。在此类实施方式中，细胞接着给予相同物种的不同对象(例如第二对象)。在一些实施方式中，第一及第二对象在遗传上相同。在一些实施方式中，第一及第二对象在遗传上类似。在一些实施方式中，第二对象表达与第一对象相同的HLA类别或超型(supertype)。
细胞可通过任何适合的方式给予，例如通过快速输注；通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射(subconjectval injection)、结膜下注射(subconjuntival injection)、眼筋膜下注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方式中，其通过非经肠、肺内及鼻内投药，且若需要用于局部治疗，通过病灶内投药来给予。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下投药。在一些实施方式中，给定剂量通过单次快速给予细胞、通过多次快速给予细胞或通过连续输注给予细胞来给予。
对于疾病的预防或治疗，适当剂量可根据待治疗的疾病的类型、细胞或重组受体的类型、该疾病的严重程度及病程、细胞是否出于预防性或治疗性目的给予、先前疗法、对象的临床病史及对细胞的反应及主治医师的判断而定。在一些实施方式中，组合物及细胞适宜一次性或经一系列治疗给予对象。
在一些实施方式中，细胞作为组合治疗的一部分给予，例如与另一治疗性干预(例如抗体或经工程改造的细胞或受体或药剂，例如细胞毒性剂或治疗剂)同时或按任何次序依次给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种额外治疗剂一起共给予或与另一治疗性干预结合同时或按任何次序依次给予。在一些情形中，细胞与另一疗法在足够接近的时间上共给予，使得细胞群体增强一种或多种额外治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种额外治疗剂之前给予。在一些实施方式中，细胞在一种或多种额外治疗剂之后给予。在一些实施例中，一种或多种额外试剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。
在细胞给予对象(例如人类)后，在一些方面中，通过许多已知方法中的任一者测量细胞群体的生物活性。评定参数包括细胞与抗原的特异性结合，活体内例如通过成像或离体例如通过ELISA或流动式细胞测量术来评定。在某些实施方式中，细胞破坏目标细胞的能力可使用本领域中已知的任何适合方法来测量，例如Kochenderfer等人，J.Immunotherapy,32(7)：689-702(2009)及Herman等人J.Immunological Methods,285(1)：25-40(2004)中所述的细胞毒性分析。在某些实施方式中，细胞的生物活性亦可通过分析某些细胞因子(例如CD 107a、IFNγ、IL-2及TNF)的表达和/或分泌来测量。在一些方面中，通过评定临床结果(例如肿瘤负荷的减小)来测量生物活性。在一些方面中，评定毒性结果、细胞的持久性和/或扩增和/或是否存在宿主免疫反应。
在某些实施方式中，细胞以任意数目的方式加以修饰，使其治疗性或预防性功效增加。举例而言，由群体表达的经工程改造的CAR或TCR可直接或通过连接符间接结合至靶向部分。使化合物(例如CAR或TCR)结合至靶向部分的实践为本领域中已知的。参见例如Wadwa等人，J.Drug Targeting 3：1 1 1(1995)及美国专利5,087,616。
还提供适用于此类方法的医药组合物或配制物，其在一些实施方式中结合所提供的处理方法来配制，例如在封闭系统中例如以自动化或部分自动化方式进行其他处理步骤。
在一些实施方式中，细胞及组合物以医药组合物或配制物形式给予对象，例如包含细胞或细胞群体及医药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物。
术语“医药配制物”是指所呈形式允许其中所含活性成分的生物活性有效发挥的制剂，且其不含对配制物将给予的对象具有不可接受毒性的其他组分。
在一些实施方式中，医药组合物还包含其他医药活性剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨喋呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。在一些实施方式中，药剂以盐形式给予，例如医药学上可接受的盐。适合的医药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸及有机酸的盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸及硫酸，有机酸例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、丁二酸及芳基磺酸，例如对甲苯磺酸。
“医药学上可接受的载剂”是指医药配制物中除活性成分外的对对象无毒的成分。医药学上可接受的载剂包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，载剂的选择在某种程度上由具体细胞和/或给予方法决定。因此，存在多种适合配制物。举例而言，医药组合物可含有防腐剂。适合的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠及苯扎氯铵(benzalkonium chloride)。在一些方面中，使用两种或两种以上防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载剂例如由Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)所述。医药学上可接受的载剂在所用剂量及浓度下一般对接受者无毒，且包括(但不限于)：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、麸酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或离氨酸；单醣、双醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，例如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面中，组合物中包括缓冲剂。适合的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸及盐。在一些方面中，使用两种或两种以上缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可给予的医药组合物的方法为已知的。示例性方法更详细地描述于例如《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)Lippincott Williams&Wilkins出版；第21版(2005年5月1日)中。
配制物可包括水溶液。配制物或组合物亦可含有一种以上适用于用细胞治疗的具体适应症、疾病或病症的活性成分，优选为具有与细胞互补的活性的活性成分，其中各自活性并未彼此不利地影响。此类活性成分适合以对预期目的有效的量存在于组合中。因此，在一些实施方式中，医药组合物还包括其他医药活性剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨喋呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱和/或长春新碱。
在一些实施方式中，医药组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量，例如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，治疗或预防功效通过定期评定所治疗的对象来监测。所需剂量可通过单次快速给予细胞、通过多次快速给予细胞或通过连续输注给予细胞来递送。
细胞及组合物可使用标准给予技术、配制物和/或装置来给予。细胞的给予可为自体或异源的。举例而言，免疫反应性细胞或祖细胞可自一位对象获得且给予同一对象或不同的相容对象。来源于外周血的免疫反应性细胞或其后代(例如活体内、离体或活体外来源)可通过局部注射给予，包括导管给予、全身性注射、局部注射、静脉内注射或非经肠给予。当给予治疗性组合物(例如含有经基因修饰的免疫反应性细胞的医药组合物)时，其一般配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制物包括用于经口、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、经皮、肌肉内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的配制物。在一些实施方式中，细胞群体是非经肠给予。如本文所用，术语“非经肠”包括静脉内、肌肉内、皮下、经直肠、经阴道及腹膜内给予。在一些实施方式中，细胞通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用周边全身性递送来给予对象。
在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂形式提供，例如等张性水溶液、悬浮液、乳液、分散液或黏稠组合物，在一些方面中，其可缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他黏稠组合物及固体组合物更容易制备。另外，液体组合物的给予在某种程度上更方便，尤其通过注射给予。另一方面，黏稠组合物可在适当黏度范围内配制以使得与特定组织接触的时段更长。液体或黏稠组合物可包含载剂，载剂可为含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其适合混合物的溶剂或分散介质。
无菌可注射溶液可通过将细胞并入溶剂中，例如使细胞与适合的载剂、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖或其类似物)混合来制备。根据投药途径及所需制剂而定，组合物可含有辅助物质，例如湿润剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或黏度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料。在一些方面中，可查询标准本文以制备适合制剂。
可添加增强组合物的稳定性及无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂及缓冲剂。可通过各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚及山梨酸)来确保防止微生物的作用。可注射医药形式的延长吸收可通过使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现。
用于活体内给予的配制物一般为无菌的。无菌性可容易通过例如通过无菌过滤膜过滤来实现。
处理步骤可包括配制此类组合物。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一(a/an)”及“该”和“所述”包括多个指示物。举例而言，“一(a/an)”意指“至少一个/种”或“一个或多个/种”。应了解，本文所述的方面及变化形式包括“组成”和/或“主要组成”方面及变化形式。
在本发明通篇，所主张的目标物的各种方面均以范围型式呈现。应了解，范围型式的描述仅为了方便及简洁起见且不应解释为对所主张的目标物范围的不灵活限制。因此，范围的描述应视为已特定揭示所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。举例而言，在提供值范围的情况下，应了解该范围的上限与下限之间的每个中间值及该所陈述范围内的任何其他所陈述值或中间值均涵盖于所主张的目标物内。这些较小范围的上限及下限可独立地包括于较小范围内且亦涵盖于所主张的目标物内，在所陈述范围内受到任何特定排他性限制。在所陈述的范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制中的任一者或两者的范围亦包括于所主张的目标物中。这些均适用而不管范围的宽度。
如本文所用，术语“约”是指此技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见误差范围。本文中提及“约”某一值或参数包括(且描述)针对该值或参数本身的实施方式。举例而言，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，组合物是指两种或两种以上产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可为溶液、悬浮液、液体、粉末、膏剂、水溶液、非水溶液或其任何组合。
如本文所用，细胞或细胞群体对具体标记物呈“阳性”的表述是指细胞表面或细胞内可检测的存在具体标记物(通常表面标记物)。当提及表面标记物时，该术语是指如通过流动式细胞测量术所检测存在表面表达，例如通过用特异性结合至标记物的抗体染色且检测该抗体，其中该染色在基本上高于使用同型匹配对照物在其他方面相同的条件下执行相同程序所检测的染色的水平下，和/或在基本上类似于已知对标记物呈阳性的细胞的水平下，和/或在基本上高于已知对标记物呈阴性的细胞的水平下可通过流动式细胞测量术检测。
如本文所用，细胞或细胞群体对具体标记物呈“阴性”的表述是指不存在基本上可检测存在于细胞表面或细胞内的具体标记物(通常表面标记物)。当提及表面标记物时，该术语是指如通过流动式细胞测量术所检测不存在表面表达，例如通过用特异性结合至标记物的抗体染色且检测该抗体，其中该染色在基本上高于使用同型匹配对照物在其他方面相同的条件下执行相同程序所检测的染色的水平下，和/或在基本上低于已知对标记物呈阳性的细胞的水平下，和/或在基本上类似于已知对标记物呈阴性的细胞的水平下无法通过流动式细胞测量术检测。
VII.具体实施方式
本文提供的实施方式为：
1.一种转导方法，其包含在离心室的内部空腔中孵育包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，其中该离心室能围绕旋转轴旋转且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出；该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；及该方法产生包含多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物。
2.一种转导方法，其包含在离心室的内部空腔中孵育包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，该离心室能围绕旋转轴旋转且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出，其中：该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；在该离心室旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的总液体体积不超过每平方英寸该空腔的内部表面积约5mL；及该方法产生包含多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物。
3.如实施方式1或实施方式2的方法，其中该旋转包含以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处大于200g或约200g、大于300g或约300g或大于500g或约500g的相对离心力(RCF)旋转。
4.如实施方式1至3中任一项所述的方法，其中该旋转包含以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处如下相对离心力旋转：在或约在600g、800g、1000g、1100g、1600g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g；或至少或至少约600g、800g、1000g、1100g、1600g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g。
5.如实施方式1至4中任一项所述的方法，其中该旋转包含以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处如下所述数值之间相对离心力或约所述数值之间相对离心力旋转：500g至2500g、500g至2000g、500g至1600g、500g至1000g、600g至1600g、600g至1000g、1000g至2000g或1000g至1600g，各包括端点。
6.如实施方式1至5中任一项所述的方法，其中在该孵育的至少一部分期间，该离心室旋转如下时间：大于或约5分钟、大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟；或5分钟至60分钟之间或约5分钟至60分钟之间、10分钟至60分钟之间或约10分钟至60分钟之间、15分钟至60分钟之间或约15分钟至60分钟之间、15分钟至45分钟之间或约15分钟至45分钟之间、30分钟至60分钟之间或约30分钟至60分钟之间，或45分钟至60分钟之间或约45分钟至60分钟之间，各包括端点。
7.如实施方式1至6中任一项所述的转导方法，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性的侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
8.如实施方式1至7中任一项所述的方法，其中该侧壁为曲线形。
9.如实施方式8的方法，其中该侧壁为大体上圆柱形。
10.如实施方式7至9中任一项所述的方法，其中：该可移动构件为活塞；和/或该可移动构件能够在该离心室内轴向移动以改变该空腔的内部体积。
11.如实施方式1至10中任一项所述的方法，其中该至少一个开口包含分别能够允许该引入及压出的入口及出口；或该至少一个开口包含能够允许该引入及该压出的单一入口/出口。
12.如实施方式1至11中任一项所述的方法，其中该至少一个开口与该离心室同轴且位于该端壁中。
13.如实施方式1至12中任一项所述的方法，其中：该空腔的内部表面积为至少1×109μm2或约1×109μm2；该空腔的内部表面积为至少1×1010μm2或约1×1010μm2；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约5cm；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约8cm；和/或该空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。
14.如实施方式1至13中任一项所述的方法，其中：在该孵育期间存在于该空腔中的该输入组合物的平均液体体积不超过在该孵育期间每平方英寸该空腔的内部表面积约5毫升(mL)；在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积不超过每平方英寸该空腔的最大内部表面积约5mL；在该孵育期间存在于该空腔中的该输入组合物的平均液体体积不超过在该孵育期间每平方英寸该空腔的内部表面积约2.5毫升(mL)；或在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积不超过每平方英寸该空腔的最大内部表面积约2.5mL。
15.如实施方式1至14中任一项所述的方法，其中在该旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的液体体积是介于如下数值之间或介于约如下数值之间：每平方英寸该空腔的内部表面积0.5mL(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。
16.如实施方式1至15中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中所述细胞的数目为或约为足以在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的表面上形成单层的所述细胞的数目；和/或该输入组合物中所述细胞的数目为足以在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的表面上形成单层的所述细胞的数目的不超过1.5倍或2倍。
17.如实施方式1至16中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×106个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约5×106个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×107个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×108个所述细胞。
18.如实施方式1至17中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×107个所述细胞、至少或至少约2×107个所述细胞、至少或至少约3×107个所述细胞、至少或至少约4×107个所述细胞、至少或至少约5×107个所述细胞、至少或至少约6×107个所述细胞、至少或至少约7×107个所述细胞、至少或至少约8×107个所述细胞、至少或至少约9×107个所述细胞、至少或至少约1×108个所述细胞、至少或至少约2×108个所述细胞、至少3×108个所述细胞，或至少或至少约4×108个所述细胞。
19.如实施方式1至18中任一项所述的方法，其中：该输入组合物包含每个所述细胞至少或至少约1个感染单位(IU)的病毒颗粒、每个所述细胞至少或至少约2个IU、每个所述细胞至少或至少约3个IU、每个所述细胞至少或至少约4个IU、每个所述细胞至少或至少约5个IU、每个所述细胞至少或至少约10个IU、每个所述细胞至少或至少约20个IU、每个所述细胞至少或至少约30个IU、每个所述细胞至少或至少约40个IU、每个所述细胞至少或至少约50个IU或每个所述细胞至少或至少约60个IU；或该输入组合物包含每个所述细胞1个或约1个感染单位(IU)的病毒颗粒、每个所述细胞2个或约2个IU、每个所述细胞3个或约3个IU、每个所述细胞4个或约4个IU、每个所述细胞5个或约5个IU、每个所述细胞10个或约10个IU、每个所述细胞20个或约20个IU、每个所述细胞30个或约30个IU、每个所述细胞40个或约40个IU、每个所述细胞50个或约50个IU或每个所述细胞60个或约60个IU。
20.如实施方式1至19中任一项所述的方法，其中：在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大总液体体积为该空腔中所述细胞的总体积的不超过2倍、不超过10倍或不超过100倍，或该输入组合物经该孵育过程的平均体积为该空腔中细胞总体积的不超过2、10或100倍。
21.如实施方式1至20中任一项所述的方法，其中在该孵育期间的任何时间存在于该空腔中的该输入组合物的最大体积或经该孵育过程的平均体积为在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的内表面上形成的单层所述细胞的体积的不超过下列倍数或不超过约下列倍数：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。
22.如实施方式1至21中任一项所述的方法，其中该输入组合物的液体体积不超过20mL、不超过40mL、不超过50mL、不超过70mL、不超过100mL、不超过120mL、不超过150mL或不超过200mL。
23.如实施方式1至22中任一项所述的方法，其中该输入组合物在该孵育的至少一部分期间占该内部空腔的全部或基本上全部体积。
24.如实施方式1至23中任一项所述的方法，其中在该离心室中孵育的至少一部分期间或在该离心室旋转期间，该输入组合物的液体体积仅占该离心室的内部空腔体积的一部分，在该至少一部分期间或在该旋转期间，该空腔的体积还包含气体，该气体在该孵育之前或期间通过该至少一个开口引入至该空腔中。
25.如实施方式24的方法，其中该离心室包含可移动构件，其中气体引入至该离心室中实现该可移动构件的移动以增加该离心室的内部空腔的体积，从而与该离心室中不存在气体相比，减少在该离心室旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的每平方英寸该空腔的内部表面积的总液体体积。
26.一种转导方法，其包含：a)向内部表面积为至少1×109μm2或约1×109μm2或至少1×1010μm2或约1×1010μm2的离心室的内部空腔提供：i)包含细胞及包含重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，其中：该输入组合物中的细胞数目为至少1×107个细胞，及所述病毒颗粒以每个所述细胞至少或至少约1个感染单位(IU)存在于该输入组合物中，及该输入组合物的液体体积小于该离心室的内部空腔的最大体积；及ii)体积至多为该离心室的内部空腔的剩余最大体积的气体；及b)孵育该输入组合物，其中该孵育的至少一部分在该离心室的该内部空腔中进行，同时实现该离心室的旋转；及其中该方法产生包含多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物。
27.如实施方式26的方法，其中：该细胞数目为至少50×106个细胞或约50×106个细胞；至少100×106个细胞或约100×106个细胞；或至少200×106个细胞或约200×106个细胞；和/或所述病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU或每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU存在。
28.如实施方式26或实施方式27的方法，其中：该输入组合物的液体体积小于或等于200mL、小于或等于100mL、小于或等于50mL、或小于或等于20mL；和/或该输入组合物的液体体积为在旋转期间该空腔的内部表面积或该空腔的最大内部表面积的体积的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％或不超过10％。
29.如实施方式26至28中任一项所述的方法，其中该气体体积为至多200mL、至多180mL、至多140mL或至多100mL。
30.如实施方式26至29中任一项所述的方法，其中该旋转为在该空腔的侧壁内表面或在所述细胞的表层的至少或至少约下列的相对离心力：600g、800g、1000g、1100g、1500g、1600g、2000g、2400g、2600g、2800g、3000g、3200g或3600g。
31.一种转导方法，其包含孵育包含细胞及包含重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，该孵育的至少一部分在旋转条件下进行，从而产生包含多个转导有该病毒载体的细胞的输出组合物，其中：该输入组合物的体积大于或约为20mL、50mL、至少100mL或至少150mL和/或该输入组合物包含至少1×108个细胞；及所述旋转条件包含在所述细胞的表层大于约800g或大于约1000g或大于约1500g的相对离心力。
32.如实施方式31的方法，其中：该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞转导有该病毒载体；和/或该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞表达该病毒载体内所包含的异源核酸的产物。
33.如实施方式31或实施方式32的方法，其中该孵育在离心室的空腔中进行，且该输入组合物中所述细胞的数目为或约为足以在该旋转期间在该空腔的内表面上形成单层或双层的所述细胞的数目。
34.如实施方式33的方法，其中该离心室包括端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许流体引入至该内部空腔中及流体自该空腔压出。
35.如实施方式34的方法，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性的侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
36.如实施方式1至30或33至35中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物在该孵育的至少一部分期间包含至少20mL或至少50mL的液体体积及每平方公分该空腔的内部表面积一百万个或约一百万个细胞。
37.如实施方式1至36中任一项所述的方法，其中该孵育的另一部分在该离心室外和/或在无旋转的情况下进行，该另一部分在于该离心室中和/或在旋转下进行至少一部分之后进行。
38.如实施方式1至37中任一项所述的方法，其中该孵育的至少一部分在该离心室的该空腔中进行和/或该孵育的另一部分在37℃±2℃或约37℃±2℃下实现。
39.如实施方式37或实施方式38的方法，其中该孵育还包含在该孵育期间将至少多个所述细胞转移至容器中且该孵育的该另一部分在该容器中实现。
40.如实施方式39的方法，其中该转移在封闭系统内进行，其中该离心室及容器与该封闭系统为一体的。
41.如实施方式37至40中任一项所述的方法，其中：该孵育进行一段介于下列的时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时，包括端点；或该孵育的该另一部分进行一段下列时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时，包括端点。
42.如实施方式37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育进行一段不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的时间；或该孵育的该另一部分进行一段不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的时间。
43.如实施方式37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育在刺激剂存在下进行；和/或该孵育的该另一部分在刺激剂存在下进行。
44.如实施方式37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育进行一段不超过24小时的时间；该组合物中的所述细胞尚未经受大于30℃的温度超过24小时；和/或该孵育并非在刺激剂存在下进行。
45.如实施方式43或实施方式44的方法，其中该刺激剂为能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的药剂。
46.如实施方式43至45中任一项所述的方法，其中该刺激剂为选自IL-2、IL-15及IL-7的细胞因子。
47.如实施方式1至46中任一项所述的方法，其中含有转导细胞的该输出组合物包含至少或至少约1×107个细胞，或至少或至少约5×107个细胞。
48.如实施方式47的方法，其中含有转导细胞的该输出组合物包含至少或至少约1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
49.如实施方式47或实施方式48的方法，其中所述细胞为T细胞。
50.如实施方式49的方法，其中所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD4+T细胞和/或经分离的CD8+T细胞。
51.如实施方式1至50中任一项所述的方法，其中该方法使得该病毒载体整合于该至少多个细胞中一个或多个的宿主基因组中和/或整合于该输出组合物中至少20％或约20％、或至少30％或约30％，或至少40％或约40％的所述细胞的宿主基因组中。
52.如实施方式1至51中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞通过该方法转导有该病毒载体；和/或该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有该病毒载体；和/或该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞表达该病毒载体内所包含的异源核酸的产物。
53.如实施方式1至52中任一项所述的方法，其中对于以每个细胞约1或约2个IU的比率包含病毒的输入组合物，该方法能够产生以下输出组合物，其中通过该方法产生的该输出组合物中至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞包含该重组病毒载体和/或表达该载体内所包含的重组核酸的产物。
54.如实施方式1至53中任一项所述的方法，其中：在含有该重组病毒载体或该病毒载体整合于其中的该输出组合物中的所有所述细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过约5、不超过约2.5或不超过约1.5；或在该输出组合物中的所述细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约2、不超过约1.5或不超过约1。
55.如实施方式1至30及33至54中任一项所述的方法，其中该离心室与封闭系统为一体的，该封闭系统包括该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于该至少一个开口的至少一个管线，从而允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。
56.如实施方式55的方法，其中：该至少一个管线包含一系列管线；该至少一个连接器包含多个连接器；及该封闭系统还包含操作性地连接于该一系列管线的至少一个容器，该连接允许液体和/或气体通过该一系列管线在该至少一个容器与该至少一个开口之间通过。
57.如实施方式55或56的方法，其中该至少一个连接器包含选自阀、鲁尔端口及刺突的连接器。
58.如实施方式55至57中任一项所述的方法，其中该至少一个连接器包含旋转阀。
59.如实施方式58的方法，其中该旋转阀为活栓或多旋转端口。
60.如实施方式55至59中任一项所述的方法，其中该至少一个连接器包含无菌连接器。
61.如实施方式56至60中任一项所述的方法，其中该至少一个容器包含选自袋、小瓶及注射器的容器。
62.如实施方式56至61中任一项所述的方法，其中该至少一个容器包含稀释剂容器、废料容器、产物收集容器和/或输入产物容器。
63.如实施方式56至62中任一项所述的方法，其中：该至少一个容器包含至少一个包含所述病毒载体颗粒及所述细胞的输入容器、废料容器、产物容器及至少一个稀释剂容器，其各通过该一系列管线及该至少一个开口连接至该空腔。
64.如实施方式63的方法，其中该方法还包含在该孵育之前和/或期间，实现该输入组合物引入至该空腔中，该引入包含液体自该至少一个输入容器通过该至少一个开口流入该空腔中。
65.如实施方式56至64中任一项所述的方法，其中至少一个容器还包含在该孵育期间的至少一个点之前和/或期间包含气体的容器，和/或该封闭系统还包含能够将气体引入至该离心室的内部空腔中的微生物过滤器和/或该封闭系统含有用于实现气体引入的注射器端口。
66.如实施方式65的方法，其中该方法包含在该孵育之前和/或期间，提供或实现气体在无菌条件下引入至该空腔中，该引入通过(a)来自包含气体的容器的气体的流动、(b)来自该封闭系统的外部环境经过该微生物过滤器的气体的流动、或(c)来自连接至该系统的注射器在该注射器端口处的气体的流动来实现。
67.如实施方式66的方法，其中实现该气体引入至该离心室的内部空腔中与实现该输入组合物引入至该离心室的内部空腔中同时或一起进行。
68.如实施方式66或实施方式67的方法，其中该输入组合物与气体在该输入组合物及气体引入至该离心室的内部空腔中之前在该离心室外的无菌条件下合并在单一容器中。
69.如实施方式68的方法，其中实现该气体引入与实现该输入组合物引入至该空腔中同时或依次分开进行。
70.如实施方式66至69中任一项所述的方法，其中该气体引入通过允许或引起来自包含该气体的无菌封闭容器、来自外部环境且穿过微生物过滤器或来自包含该气体的注射器的该气体的流动来实现。
71.如实施方式24至70中任一项所述的方法，其中该气体为空气。
72.如实施方式1至71中任一项所述的方法，其中该孵育为连续过程的一部分，该方法还包含：在该孵育的至少一部分期间，在该离心室旋转期间实现该输入组合物连续引入至该空腔中；及在该孵育的一部分期间，在该离心室旋转期间实现液体通过该至少一个开口自该空腔连续压出。
73.如实施方式72的方法，其还包含：在该孵育的一部分期间，在该离心室的旋转期间实现气体连续引入至该空腔中；和/或在该孵育的一部分期间，实现气体自该空腔连续压出。
74.如实施方式73的方法，其中该方法包含自该空腔压出液体及压出气体，其中各自同时或依次压出至不同容器中。
75.如实施方式72至74中任一项所述的方法，其中该连续引入及该连续压出的至少一部分同时进行。
76.如实施方式1至75中任一项所述的方法，其中该孵育为半连续过程的一部分，该方法还包含：在该孵育之前，实现该输入组合物及任选地气体通过该至少一个开口引入至该空腔中；在该孵育之后，实现液体和/或任选地气体自该空腔压出；实现包含细胞及含有重组病毒载体的所述病毒颗粒及任选地气体的另一输入组合物引入至该内部空腔中；及在该内部空腔中孵育该另一输入组合物，其中该方法产生包含多个转导有该病毒载体的该另一输入组合物的细胞的另一输出组合物。
77.如实施方式64至76中任一项所述的方法，其中该提供或该引入该输入组合物至该空腔中包含：引入包含所述细胞及含有该重组病毒载体的所述病毒颗粒的单一组合物；或引入包含所述细胞的组合物及包含含有该重组病毒载体的所述病毒颗粒的另一组合物，从而混合所述组合物，实现该输入组合物的引入。
78.如实施方式64至77的方法，其中该方法还包含：在该孵育之前和/或期间实现该离心室的旋转；在该孵育之后实现液体自该空腔压出至该废料容器中；实现液体自该至少一个稀释剂容器通过该至少一个开口压出至该空腔中及实现该空腔的内含物的混合；及实现液体自该空腔压出至该产物容器中，从而将转导有该病毒载体的细胞转移至该产物容器中。
79.如实施方式1至78中任一项所述的方法，其还包含：(a)在该孵育之前，在离心室的内部空腔中洗涤包含所述细胞的生物样品；和/或(b)自生物样品分离所述细胞，其中该分离步骤的至少一部分在该孵育之前在离心室的内部空腔中进行；和/或(c)在该孵育之前和/或期间刺激细胞，该刺激包含使所述细胞暴露于刺激条件，从而诱导该输入组合物的细胞增殖，其中该刺激细胞步骤的至少一部分在离心室的内部空腔中进行。
80.如实施方式79的方法，其中该分离包含进行基于免疫亲和力的选择。
81.如实施方式79或80的方法，其中所述刺激条件包含存在能够活化TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域的药剂。
82.如实施方式81的方法，其中该药剂包含特异性结合至TCR复合物成员的初级试剂及特异性结合至T细胞协同刺激分子的二级试剂。
83.如实施方式82的方法，其中该初级试剂特异性结合至CD3；和/或该协同刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
84.如实施方式83的方法，其中所述初级试剂及二级试剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。
85.如实施方式79至84中任一项所述的方法，其中(a)和/或(b)中的该生物样品为或包含全血样品、白细胞层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级分离T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、清血法产物或白细胞清血法产物。
86.如实施方式1至85中任一项所述的方法，其还包含在离心室的内部空腔中将通过该方法转导的细胞配制于医药学上可接受的缓冲液中，从而产生配制组合物。
87.如实施方式86的方法，其还包含实现该配制组合物压出至一个或多个容器中。
88.如实施方式87的方法，其中实现该配制组合物的压出包含实现以单一单位剂量存在的许多所述细胞压出至该一个或多个容器中的一个或每个中。
89.如实施方式79至88中任一项所述的方法，其中该离心室的空腔中的每个与用于一个或多个其他步骤和/或用于孵育和/或旋转含有细胞和病毒颗粒的输入组合物的离心空腔相同或不同。
90.如实施方式79至89中任一项所述的方法，其中所述离心室中的每个与封闭系统为一体的，该封闭系统包含该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于该至少一个开口的至少一个管线，从而允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。
91.如实施方式1至90中任一项所述的方法，其中该输入组合物中的所述细胞为原代细胞。
92.如实施方式1至91中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中的所述细胞包含悬浮细胞；该输入组合物中的所述细胞包含白细胞；和/或该输入组合物中的所述细胞包含T细胞或NK细胞。
93.如实施方式1至92中任一项所述的方法，其中该输入组合物中的所述细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
94.如实施方式1至93中任一项所述的方法，其中该输入组合物中的所述细胞为人类细胞。
95.如实施方式7至94中任一项所述的方法，其中在该孵育期间，该离心室与传感器及控制电路联合，该传感器能够监测该可移动构件的位置，该电路能够接收来自该传感器的信息及传输信息至该传感器并引起该可移动构件的移动，该控制电路与能够在该孵育期间引起该离心室的旋转的离心机进一步联合。
96.如实施方式7至95中任一项所述的方法，其中该离心室包含该可移动构件且在该孵育期间，该离心室位于离心机内并与传感器及控制电路联合，该传感器能够监测该可移动构件的位置，该控制电路能够接收及传输来自该传感器的信息且引起该可移动构件移动、通过该一个或多个管线引入液体至该空腔及自该空腔压出液体及通过该离心机旋转该离心室。
97.如实施方式95或实施方式96的方法，其中该离心室、该控制电路、该离心机及该传感器在该孵育期间容纳在柜体中。
98.如实施方式1至97中任一项所述的方法，其中该重组病毒载体编码重组受体，该重组受体从而通过该输出组合物的细胞表达。
99.如实施方式98的方法，其中该重组受体为重组抗原受体。
100.如实施方式99的方法，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
101.如实施方式100的方法，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
102.如实施方式99的方法，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
103.如实施方式99的方法，其中该重组受体为包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。
104.如实施方式1至103中任一项所述的方法，其中：所述细胞包含自人类对象获得的原代人类T细胞；及在该孵育之前和/或在该转导完成之前和/或若该方法包括配制，在该配制物之前，所述原代人类T细胞尚未在大于30℃的温度下存在于该对象外大于1小时、大于6小时、大于24小时或大于48小时；或在该孵育之前和/或在该转导完成之前和/或若该方法包括配制，在该配制物之前，所述原代人类T细胞尚未在特异性针对CD3的抗体和/或特异性针对CD28的抗体和/或细胞因子的存在下孵育大于1小时、大于6小时、大于24小时或大于48小时。
105.一种用于选择的方法，该方法包含：(a)在离心室的内部空腔中在混合条件下孵育选择试剂及原代细胞，从而多个所述原代细胞结合至该选择试剂；及(b)基于与该选择试剂的结合，使该多个所述原代细胞与另外一种或多种原代细胞分离，从而基于与该选择试剂的结合富集所述原代细胞，其中该离心室能围绕旋转轴旋转且该内部空腔的最大体积为至少50mL、至少100mL或至少200mL。
106.一种用于刺激细胞的方法，该方法包含在一定条件下孵育刺激剂及原代细胞，从而使该刺激剂结合至由多个所述原代细胞表达的分子且活化或刺激该多个所述细胞，其中该孵育的至少一部分在离心室的内部空腔中在混合条件下进行，该离心室能围绕旋转轴旋转；及该内部空腔的最大体积为至少50mL、至少100mL或至少200mL。
107.如实施方式105或实施方式106的方法，其中该离心室还包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
108.一种组合物，其包含通过如实施方式1至107中任一项所述的方法产生的转导细胞。
109.如实施方式108的组合物，其中所述细胞：为原代细胞；和/或为人类细胞；和/或包含白细胞；和/或包含T细胞；和/或包含NK细胞。
110.如实施方式108或实施方式109的组合物，其中该组合物包含至少或至少约5×107个细胞、1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
111.如实施方式106至110中任一项所述的组合物，其中该组合物包含治疗有效数目的适用于过继T细胞疗法的细胞。
112.如实施方式106至111中任一项所述的组合物，其中：所述细胞为T细胞；及在转导之后，该组合物中的所述细胞并未在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞并未在大于30℃的温度下孵育超过24小时，或该组合物不含细胞因子或该组合物不含特异性结合至CD3或TCR复合物的刺激剂。
113.一种组合物，其包含至少1×107个或至少5×107个T细胞，其中至少多个转导有重组病毒载体或表达重组或经工程改造的抗原受体，其中：在转导之后，该组合物中的所述细胞尚未在刺激剂存在下进行细胞扩增；和/或在转导之后，所述细胞尚未在大于30℃的温度下孵育超过24小时。
114.一种组合物，其包含至少1×107个或至少5×107个原代人类T细胞，其中至少多个转导有重组病毒载体或表达重组或经工程改造的抗原受体，其中该组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所述T细胞包含CD69和/或TGF-β-II的高表达。
115.如实施方式114的组合物，其中该组合物中该至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所述T细胞不包含CD62L的表面表达和/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8和/或IL-2的高表达。
116.如实施方式113至115中任一项所述的组合物，其中该组合物包含至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
117.如实施方式109至116中任一项所述的组合物，其中所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
118.如实施方式108至117中任一项所述的组合物，其中该组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有该病毒载体。
119.如实施方式108至118中任一项所述的组合物，其中：该病毒载体编码重组受体；及该组合物中的转导细胞表达该重组受体。
120.如实施方式119的组合物，其中该重组受体为重组抗原受体。
121.如实施方式120的组合物，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
122.如实施方式121的组合物，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
123.如实施方式119至122中任一项所述的组合物，其中该重组受体为包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。
124.如实施方式120的组合物，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
125.如实施方式110至124中任一项所述的组合物，其中：在该组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2；或在该组合物中转导有该重组病毒载体的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2。
126.如实施方式110至125中任一项所述的组合物，其包含医药学上可接受的赋形剂。
127.一种制品，其包含一个容器或多个容器，该容器或该多个容器共同含有如实施方式113至126中任一项所述的组合物。
128.如实施方式127的制品，其中该容器或多个容器包含两个或更多或三个或更多袋且该组合物还包含医药学上可接受的赋形剂。
129.一种治疗方法，该方法包含向患有疾病或病症的对象给予如实施方式110至126中任一项所述的组合物。
130.如实施方式129的方法，其中该组合物中的转导T细胞与下述这种组合物中的转导T细胞相比在该对象体内展现增加或较长扩增和/或持久性，其中在转导之后，该种组合物中的细胞已在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞已在大于30℃的温度下孵育超过24小时。
131.如实施方式129或实施方式130的方法，其中该重组受体、嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合至与该疾病或病症相关联的抗原。
132.如实施方式129至131中任一项所述的方法，其中该疾病或病症为癌症及自体免疫疾病或病症、或感染性疾病。
133.一种组合物，其包含：至少1×107个细胞；及每个细胞至少或至少约1个感染单位(IU)的含有重组病毒载体的病毒颗粒。
134.如实施方式133的组合物，其中：所述细胞包含至少或至少约50×106个细胞；100×106个细胞；或200×106个细胞；和/或所述病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU、每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU的量存在于该组合物中。
135.如实施方式133或实施方式134的组合物，其中该组合物的液体体积小于或等于220mL、小于或等于200mL、小于或等于100mL、小于或等于50mL、或小于或等于20mL。
136.如实施方式133至135中任一项所述的组合物，其中所述细胞为原代细胞。
137.如实施方式133至136中任一项所述的组合物，其中所述细胞为人类细胞。
138.如实施方式133至137中任一项所述的组合物，其中：所述细胞包含悬浮细胞；所述细胞包含白细胞；和/或所述细胞包含T细胞或NK细胞。
139.如实施方式138的组合物，其中所述细胞为T细胞且所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
140.如实施方式133至139中任一项所述的组合物，其中该病毒载体编码重组受体。
141.如实施方式140的组合物，其中该重组受体为重组抗原受体。
142.如实施方式141的组合物，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
143.如实施方式142的组合物，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
144.如实施方式140至143中任一项所述的组合物，其中该重组受体为包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。
145.如实施方式141的组合物，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
146.一种能围绕旋转轴旋转的离心室，该离心室包含具有如实施方式110至126中任一项所述的组合物的内部空腔。
147.一种能围绕旋转轴旋转的离心室，该离心室包含具有以下的内部空腔：(a)含有至少5×107个转导有重组病毒载体的原代T细胞的组合物和/或(b)含有至少5×107个原代T细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的组合物。
148.如实施方式146或147的离心室，该离心室还包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
149.如实施方式147或148的离心室，其中该空腔中的该组合物包含至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
150.如实施方式147或实施方式148的离心室，其中所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
151.如实施方式147至150中任一项所述的离心室，其中该组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞转导有病毒载体。
152.如实施方式147至151中任一项所述的离心室，其中：该病毒载体编码重组受体；及该组合物中的细胞表达该重组受体。
153.如实施方式151的离心室，其中该重组受体为重组抗原受体。
154.如实施方式153的离心室，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
155.如实施方式154的离心室，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
156.如实施方式151至155中任一项所述的离心室，其中该重组受体为包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分的嵌合受体。
157.如实施方式153的离心室，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
158.如实施方式147至157中任一项所述的离心室，其中：在该组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2；或在该组合物中转导有该重组病毒载体的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2。
159.一种能围绕旋转轴旋转的离心室，该离心室包含具有如实施方式133至145中任一项所述的组合物的内部空腔。
160.如实施方式159的离心室，其还包含至多该离心室的内部空腔最大体积的气体体积。
161.如实施方式160的离心室，其中该气体为空气。
162.如实施方式146至161中任一项所述的离心室，该离心室能围绕旋转轴旋转且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性的侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
163.如实施方式146至162中任一项所述的离心室，其中该侧壁为曲线形。
164.如实施方式163的离心室，其中该侧壁为大体上圆柱形。
165.如实施方式162至164中任一项所述的离心室，其中该至少一个开口包含分别能够允许该引入及压出的入口及出口；或该至少一个开口包含能够允许该引入及该压出的单一入口/出口。
166.如实施方式162至165中任一项所述的离心室，其中该至少一个开口与该离心室同轴且位于该端壁中。
167.如实施方式162至166中任一项所述的离心室，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性的侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
168.如实施方式的167离心室，其中：该可移动构件为活塞；和/或该可移动构件能够在该离心室内轴向移动以改变该空腔的内部体积。
169.如实施方式162至168中任一项所述的离心室，其中：该空腔的内部表面积为至少或至少约1×109μm2；该空腔的内部表面积为至少或至少约1×1010μm2；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约5cm；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约8cm；和/或该空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。
170.如实施方式159至169中任一项所述的离心室，其中存在于该空腔中的该组合物的液体体积以每平方英寸该空腔的内部表面积计是介于下列数值之间或介于约下列数值之间：0.5mL(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。
171.如实施方式159至169中任一项所述的离心室，其中存在于该空腔中的该组合物的液体体积为至少0.5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸、2.5毫升/平方英寸或5毫升/平方英寸。
172.一种封闭系统，其包含如实施方式147至158及162至171中任一项所述的离心室。
173.如实施方式172的封闭系统，其还包含操作性地连接至一个或多个容器的多路歧管。
174.一种封闭系统，其包含如实施方式159至171中任一项所述的离心室。
175.如实施方式174的封闭系统，其还包含无菌过滤器。
176.如实施方式172至175中任一项所述的封闭系统，其中该离心室能够在至多8000g的速度下旋转，其中该离心室能够承受至多500g、600g、1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g或3200g的力而无实质屈服、弯曲或断裂或以其他方式导致该离心室的受损和/或同时在此类力下基本上保持大体上圆柱形。
177.如实施方式49的方法，其中该输出组合物中至少或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％或80％的所述T细胞包含CD69和/或TGF-β-II的高表达。
178.如实施方式177的方法，其中该组合物中该至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或80％的所述T细胞不包含CD62L的表面表达和/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8和/或IL-2的高表达。
179.一种方法，其包含洗涤原代人类细胞；及使所述细胞在搅拌条件下与选择试剂一起孵育，从而至少多个所述人类细胞由所述选择试剂特异性结合，其中该洗涤及孵育在封闭无菌系统内且至少部分在与该封闭无菌系统一体的离心室的内部空腔中进行。
180.如实施方式179的方法，其中所述方法步骤基于使用者关于该方法应起始的输入以自动化方式进行，使得所述方法步骤完成。
181.如实施方式105、179或180的方法，其中该孵育在混合条件下包含其至少一部分实现该离心室的旋转。
182.如实施方式181的方法，其中其至少一部分实现旋转包含在该孵育期间的多个时段实现旋转，该多个时段由一个或多个静止时段分开，在该一个或多个静止时段，该离心室不旋转。
183.如实施方式182的方法，其中实现旋转的该多个时段中一个或多个或全部持续为或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒的时间，例如1或2秒，和/或该一个或多个静止时段中一个或多个或全部持续为或约3、4、5、6、7、8、9或10或15秒的时间，例如4、5、6或7秒。
184.如实施方式105或179至183中任一项所述的方法，其中该孵育在混合条件下进行至少或大致10、15、20、30或45分钟，例如30分钟或约30分钟。
实施例
包括以下实施例仅出于说明性目的且不旨在限制本发明的范围。
实施例1：原代人T细胞在离心室中的病毒转导
此实施例展示用编码嵌合抗原受体(CAR)的重组病毒载体转导经分离的原代人类T细胞，其中根据本文所提供的实施方式，转导在基本上固定圆柱形离心室中在离心力下开始。T细胞通过阳性选择自人类清血法产物样品分离。
所得细胞使用抗CD3/CD28试剂活化。为开始转导，将细胞在活化后与含有编码抗CD19CAR的病毒载体基因组的病毒颗粒一起在各种条件下孵育。
在一组条件(“Sepax”)下，通过在2处理单元(Biosafe SA)中，在离心室(Biosafe SA,A200)的空腔中离心孵育细胞来开始转导。50mL含有50×106个经分离的细胞的液体组合物与50mL含有病毒载体颗粒的液体储备液合并在300mL转移封装中。使用系统移动离心室活塞，将组合物引入至离心室的空腔中。亦引入100mL空气，从而使空腔的体积增加至200mL且使得空腔中的液体体积与空腔内部表面积的比率减小。离心室通过在2单元斜升至大致4600rpm的速度来旋转，相当于在离心室的处理空腔内部侧壁的大致600的相对公克力(相对离心力(RCF))。在此速度下旋转的持续时间为60分钟。
对于另一组条件(“VueLife”)，含有25×106个细胞的组合物与相同的病毒载体颗粒储备液以1：1的体积比以50mL孵育在CI-50离心机配接器中的离心袋中，且以在细胞上近似1000g的估算相对离心力(RCF)旋转60分钟。使用与离心室相比具有较小体积的袋，以便允许以在细胞上1000g的相对离心力离心。对照物包括“未转导的”样品(相同细胞浓度在无病毒未离心的情况下于24孔盘中孵育相同时间及“无旋转”对照物(“0×g”)样品(相同细胞/病毒浓度在未离心的情况下于相同盘中孵育相同时间)。在每一组条件下，包括聚阳离子。在旋转后(或类似的“无旋转”孵育)，组合物在37℃下孵育24小时以完成转导。
细胞扩增且在第6天分离后以表面表达所编码的CAR的CD3+T细胞(如使用特异性针对CAR的抗体通过流动式细胞测量术检测)的百分比形式计算相应条件中的每个的转导效率。结果展示于图1A中。如所示，与在离心袋中及对照物相比，在通过在离心室的空腔中在旋转下孵育细胞开始转导后观测到更大的转导效率。图1B展示经六天时间的细胞扩增(如由群体倍增数目所指示)。
实施例2：液体体积与表面积的不同比例下原代人T细胞在离心室中的转导
使用相同数目的细胞和病毒感染单位及不同的液体体积与离心室空腔的内部表面积的比率，在各种条件下评定在离心室中开始转导后的转导效率。细胞一般如实施例1中所述制备且刺激。全部转导开始条件使用2:1的IU:细胞比率及100×106个细胞总数。
对于第一样品(“5.1mL/sq.in.”是指5.1:1mL液体/平方英寸此条件中所用的内部空腔表面)，含100×106个细胞的100mL液体体积与100mL含有病毒载体颗粒的液体组合物合并。对于第二样品(“2.5毫升/平方英寸”是指2.5mL液体/平方英寸此条件中所用的空腔表面)，50mL具有相同数目细胞的液体组合物与50mL含有病毒载体颗粒的液体组合物合并。在每种情况下，包括聚阳离子，在离心期间的最终浓度为10μg/mL。将相应的液体组合物(及对于第二样品，100mL空气)吸入至离心室容纳液体的空腔中且孵育。在每种情况下，离心室在2处理单元中(通过斜升)以大致4600rpm(相当于在内部空腔侧壁的大致600g的RCF)旋转60分钟。样品接着在37度下再孵育24小时以完成转导。
细胞扩增且在第6天分离后，通过确定表面表达CAR的CD3+T细胞(如上所述检测)的百分比来计算转导效率。结果展示于图2中。如所示，对于在离心室中使用相同数目的细胞和病毒感染单位开始转导，当使用较低的空腔中组合物的液体体积与空腔内部表面积的比率时，观测到更大转导效率。
实施例3：原代人T细胞在离心室中的转导
另一研究比较在各种条件下的转导效率，包括根据所提供的方法的实施方式，使用各种液体体积与空腔表面积的比率在离心室中转导。人类T细胞如上所述自清血法产物分离并加以刺激。
在刺激后，将80×106个细胞孵育在不同条件下，包括用编码CAR的病毒载体转导。聚阳离子包括在全部样品中。
关于在离心室中开始转导的条件，80×106个细胞与含有载体的病毒一起在离心室的空腔中以每个细胞2个IU病毒的比率孵育。在使用2处理系统以在空腔内部侧壁大致600g的RCF使离心室离心60分钟时进行孵育。在一组条件(“Sepax(0.1IU/细胞/毫升)”，每平方英寸内部空腔表面0.5mL液体体积)下，对于离心，将细胞和病毒以20mL总液体体积引入至离心室空腔中；亦将180mL空气引入至空腔中。在另一组条件(“Sepax(0.01IU/细胞/毫升)”，每平方英寸内部空腔表面5.1mL液体体积)下，将相同数目的细胞和病毒感染单位以200mL液体体积引入。
在分开的条件下，在24孔盘中在病毒(2IU/细胞)存在下，通过以在细胞上大致1000g的RCF离心60分钟开始细胞转导(“在盘中1000g”)。亦使用“未转导的”阴性对照物(在24孔盘中在无病毒或离心的情况下孵育)及“无旋转”对照物(以每个细胞2个感染单位(IU)的比率与病毒一起在无离心的情况下于相同24孔盘中孵育)。细胞在37℃下孵育24小时以完成转导。
如实施例1及2中所述，细胞扩增且以表面表达CAR的CD3+细胞的百分比形式计算各样品的转导效率。结果展示于图3中。如所示，与对照条件相比，在离心室中及在24孔盘中在旋转下开始转导后观测转导。对于在离心室中开始转导，在较低的液体体积与离心室空腔内部表面积的比率下观测到更大转导效率。
实施例4：在离心室中转导后评估载体拷贝数(VCN)
在实施例3中所述的研究中，在某些条件下开始转导后评定经整合的病毒载体的拷贝数(VCN)。通过实时定量PCR(RT-qPCR)测定来源于SGF的反转录病毒载体的每个细胞的VCN。通过特异性针对病毒基因组的qPCR测定在转导后组合物的全部细胞当中(“VCN/细胞”)及单独分开在转导细胞(表达转基因的细胞)当中(“VCN/CAR+”)的平均VCN。结果呈现于图4中。在图4所示的图形中，标注“Sepax20”是指在开始转导期间20mL液体体积用于离心室空腔；如此标注的结果来自同一研究且条件在实施例3中标注为“Sepax(0.1IU/细胞/毫升)”(其转导效率测定为25％)。类似地，标注“Sepax 200”是指在开始转导期间200mL液体体积用于离心室空腔；如此标注的结果来自同一研究且条件在实施例3中标注为“Sepax(0.01IU/细胞/毫升)”(其转导效率测定为7％)。如所示，当通过在基本上刚性的圆柱形离心室中在旋转下开始细胞转导来开始转导时，转导效率的增加与载体拷贝数的增加无关联。在此研究中，使转导效率增加的条件亦使得每个细胞的平均载体拷贝数降低。
实施例5：用2处理系统进行转导
在一个示例性过程中，T细胞在与单次使用系统及2处理系统(BiosafeSA)一体的离心室中以自动化方式用病毒载体颗粒转导。离心室与无菌抛弃式封闭系统一体，该系统为由Biosafe SA出售的适用于再生医学的单次使用处理试剂盒。该试剂盒经构型以包括将离心室连接至一系列容器的一系列管线，其中通用构型展示于图5和/或图7中。离心室(1)包括具有入口/出口开口(6)的端壁(13)、刚性侧壁(14)及活塞(2)，其共同界定该离心室的内部空腔(7)。该系统经构型以包括各种容器，所述容器标记物为：输出袋、废料袋、输入袋及两个稀释剂袋(稀释剂袋1及稀释剂袋2)；及各种连接器，包括活栓及阀。包括夹具(5)以用于阻断通过管线在该系统的不同部分之间的流动。在一些实施方式中，该系统包括公鲁尔锁无菌过滤器(15)与母鲁尔锁封盖(16)，当该封盖释放/移除时，气体(例如空气)可通过其以无菌方式吸入。该系统与2处理单元关联放置，包括离心机及外壳组件的柜体。
在该示例性过程中，输入袋含有包含待转导细胞的组合物。稀释剂袋1含有病毒载体颗粒、聚阳离子及培养基。在一些实施方式中，空气与载体颗粒一起包括于袋中。举例而言，在替代性实施方式中，具有空气和/或额外培养基的容器可连接在此位置以替代和/或添加至病毒组合物。
用户通过用户界面指示处理单元将运行的新程序且将各种参数输入至系统中，包括初始体积(在20-900mL之间)、最终体积(在20-220mL之间)、中间体积(在10-100mL之间)、稀释体积(在50-220mL之间)、公克力(在100-1600g之间或在200-3200g之间)(在离心室的处理空腔的内部侧壁的RCF))及沈降时间(在120与3600秒之间)。用户指示系统该过程应开始，输入细胞所来源的对象的鉴别信息及指示系统输入完成，其提示系统进行封闭系统试剂盒的测试。
在全部相应活栓阀处于闭合位置的情况下，打开分别阻断流体在管线与稀释剂袋1、废料袋、输入袋及输出袋(用于收集含有细胞的产物)之间移动的夹具且通过与系统连通由用户启动自动化程序。
作为响应，系统以自动化方式通过使得阀打开及关闭及移动活塞以改变空腔体积而使得液体和/或气体在封闭系统的各组件之间移动。其使得活栓复位以允许在输入袋与离心室的内部空腔的间流动，通过入口/出口打开及使活塞在离心室内下降，从而增加空腔的体积且将一定体积(使用者定义的初始体积)的细胞与病毒载体颗粒的组合物自输入袋通过离心室端壁中的入口/出口抽至处理空腔。
系统提示离心机在500g下旋转离心室120秒，提示将空腔的20mL体积吹扫至输入袋中以将其冲洗及将该体积抽回至空腔中。系统提示离心机在500g下旋转离心室180秒，从而引起沈降。系统使活栓复位以允许流体和/或气体在空腔与废料袋之间流动且实现流体自空腔抽取至废料袋中，从而在空腔中保留使用者定义的中间体积。
系统使得活栓旋转以阻断流体在管与废料袋之间移动。系统使得含病毒载体颗粒的液体组合物及(若适用)空气(统共，以使用者定义的稀释体积)自稀释剂袋1引入至离心室的空腔。这些步骤共同实现含有待转导细胞和病毒载体颗粒的输入组合物及(在一些情况中)空气引入至空腔中。在一些实施方式中，空腔的总体积为200mL，例如包括200mL液体体积或包括不到200mL液体体积且剩余空腔体积包括空气。
在使用者定义的克力(g-force)下进行离心室离心，持续使用者定义的沈降时间，导致输入组合物中的细胞开始经病毒载体颗粒转导。在替代性实施方式中，在离心之前，将一定体积的空气和/或培养基自在稀释剂袋1及2的位置处的另一袋引入至空腔中。在替代性实施方式中，空气在离心之前通过鲁尔锁过滤器(15)吸入，例如通过使用者打开阻断流体在过滤器(15)与管线及空腔(7)之间移动的夹具(5)及释放母封盖(16)，使得离心室中剩余的空气通过过滤器自环境通入。在一些实施方式中，空气的移动通过系统而自动化，例如基于另外输入至系统中的用户定义的空气输入体积及用户指示系统可引入定义的空气体积的空气。在一些实施方式中，空气(若存在)在离心后通过类似程序释放经过管线及未封盖的过滤器(15)。
当由系统提示时，用户关闭阻断流体在稀释剂袋1与管线之间移动的夹具且打开阻断流体在稀释剂袋2与管线之间移动的夹具。系统通过打开适当活栓阀使得流体自稀释剂袋2移动至处理空腔且移动活塞以将一定体积的流体自稀释剂袋2抽至空腔中，该体积等于使得离心室中的总液体体积等于使用者定义的最终体积所需的量。系统接着使得流体在空腔中混合60秒且随后将内部空腔中的流体转移至输出袋，该输出袋从而含有已结合病毒颗粒和/或感染有病毒载体的细胞的输出组合物。这些细胞接着一般例如在37℃下孵育例如24小时以完成转导。
实施例6：评估不同离心力下的细胞生长和活力
根据某些提供的实施方式，在用于引发细胞在离心室中转导的离心期间，评定离心力对于细胞的作用。在暴露于不同离心力时，评定细胞扩增及细胞活力。
T细胞基本上如实施例1中所述分离且刺激。在第4天，将各种各自单独含有细胞的样品引入至2处理单元(Biosafe SA)中的离心室的空腔中且在各种离心力下进行离心。具体地，使用2处理系统使样品在与单次使用试剂盒一体的离心室(A-200F)中分别在大致4600rpm、大致6000rpm及大致7400rpm下旋转60分钟，其分别达到在空腔侧壁内表面大致600g、1000g及1600g的RCF。作为对照物，将细胞样品单独引入至离心空腔中，但未旋转(0g条件)。在每种情况下，在旋转之后(或在无旋转的情况下孵育)，细胞在37℃、5％CO2下孵育至第10天。在整个过程中的不同点，监测细胞扩增(与第0天的细胞数目相比群体倍增)及活力。具体地，在第0天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天及第10天进行这些测量。结果展示于图6中。
分别如图6A及图6B中所示，经10天观测到在各种速度下的离心对细胞扩增(“群体倍增”)或活力无实质性作用。结果证明在本文所提供的实施方式中用于开始转导的条件下，T细胞可耐受如在离心室空腔的侧壁所测量在至少达到或约1600g的相对离心力下离心，相当于在细胞表面：液体界面处的细胞上大致相同的平均力，而无扩增或活力的可检测的实质性变化。
实施例7：使用普通圆柱离心室中转导起始来进行转导处理步骤
此实施例描述用于实施例8-10中所述的研究的转导处理步骤的通用参数。根据所提供的实施方式，在离心室中开始用编码嵌合抗原受体(CAR)的重组病毒载体转导细胞。
CD4+/CD8+T细胞通过阳性选择自人类清血法产物样品分离。经分离的细胞冷冻保存且在37℃下解冻。解冻细胞在开始转导之前使用CD3/CD28珠在IL-2(100IU/mL)存在下在37℃下活化72小时。在一些情况下，清血法制备、分离和/或活化步骤的各种方面亦根据所提供的实施方式，联合2系统在离心室的空腔中进行，如实施例11中所述。
在准备转导时，将基本上如图7中所描绘的与由Biosafe SA出售用于再生医学用途的无菌单次使用抛弃式试剂盒一体的离心处理离心室(1)(A-200F)联合2处理单元放置，其因此可向离心室提供离心力及轴向移位(允许控制内部空腔尺度)。(美国专利第6,733,433号)。
为起始转导，进行以下步骤。
为产生含有病毒载体颗粒的组合物与离心室中的活化细胞无菌混合，将完全培养基(含有补充有5％人类血清及IL-2的无血清造血细胞培养基及足以在开始转导期间最终浓度为10μg/mL的量的聚阳离子)、在指定数目或相对数目的感染单位(IU)(例如1.8IU/细胞或3.6IU/细胞)的病毒载体颗粒及(若适用)空气无菌转移至离心袋，其最终将在稀释剂袋位置处与试剂盒无菌连接以便如下所述引入。
含有活化细胞的培养袋通过管线在图5及图7中所示的“输入袋”位置处无菌连接至单次使用抛弃式试剂盒。在2处理单元上运行自动化“稀释”方案。因此，通过移动活塞，所需数目的细胞(如所述个别研究中所指出，例如50×106、100×106或200×106个细胞)通过离心室空腔自培养袋转移至在图5及图7中所示的“输出袋”位置处的产物袋。
为产生具有细胞和病毒(及适用时，空气)的输入组合物以便引入至离心室中并转导，含有所需数目活化细胞的产物袋接着无菌连接在如图5及图7中所示的输入袋位置处。含有病毒颗粒、培养基及任选地空气的离心袋无菌连接在图式中所示的稀释袋1的位置处。在2上运行自动化洗涤循环，有助于含有细胞的组合物吸入至离心室空腔中，组合物在2上以在空腔内壁大致500g的RCF旋转以使细胞集结及为达到所需体积(例如10mL)需要移除适当体积液体。在稀释剂袋1位置处的离心袋的内含物(包括病毒颗粒、培养基、聚阳离子及(若适用)空气)接着与细胞一起吸入至离心室空腔中。此过程因此实现细胞组合物的体积减少且使体积减少的细胞与含病毒的组合物及(若适用)空气组合。所得200mL体积(含有细胞、病毒及任选地空气)接着转移至如图5及图7中所示的试剂盒的“输出袋”位置处的离心袋中。
为起始转导，接着移除含有200mL病毒、细胞及空气(若适用)的离心袋且无菌连接在试剂盒的输入袋位置处。含有完全培养基的袋在“稀释剂袋”位置处无菌连接至试剂盒。细胞培养袋在“输出袋”位置处无菌连接至系统。用户通过界面指示应在系统上运行的自动化方案以便开始转导。具体地，程序使得含有细胞、病毒及(若指示)空气的200mL体积通过活塞移动通过管线转移至离心室空腔。程序继续使内含物在离心室空腔(总体积200mL)中在指定力下离心以开始用病毒载体颗粒转导细胞。在一些实施方式中，手持式激光转速计用于在单元上的不同设定点处使用已知方法验证转/分(rpm)。除在特定指示的情况的外，在指定速度下进行旋转1小时(3600秒)，外加斜升及斜降时间。在旋转后且当由系统提示时，使用者关闭允许流体在空腔与输入袋之间移动的夹具且打开阻断流体在空腔与输出袋位置处的产物袋之间移动的夹具。在用户输入后，程序通过实现液体来离心室至输出袋的移动而继续。
适用时，为了排出空气，当由系统提示时，用户打开阻断流体在离心室空腔与过滤器之间移动的夹具，从而程序使得空气通过过滤器压出。
稀释程序接着在2系统上运行，使得阻断流体在具有培养基的稀释剂袋与离心室之间移动的夹具打开且程序使得适当量的液体自该袋移动至离心室(通过打开活栓及移动活塞)，混合60秒且接着将流体自处理空腔转移至输出袋，该适当量为达到使用者定义的200mL最终体积所需的，考虑到在离心期间空气(若存在)的存在。
输出袋位置处的培养袋从而含有输出组合物，该输出组合物的细胞含有结合病毒颗粒和/或经病毒基因组接种。细胞接着在该袋中在37℃、5％CO2下孵育约24小时以便完成转导。在转导开始及完成期间，如由个别实施例中关于转导效率及拷贝数的各种测量所指示，接种细胞的病毒载体颗粒及其基因组已整合至细胞基因组中。
实施例8：具有恒定体积和病毒颗粒数量和不同细胞浓度的离心室中的转导起始
对恒定液体体积的具有不同细胞数目及病毒颗粒感染单位(IU)的组合物进行实施例7中所述的转导方法。在每种情况下，在开始转导之前，如实施例11中所述收集、洗涤、分离、冷冻保存及活化细胞。
实施例8A
如实施例7中所述开始转导且进一步孵育以完成转导，详情如下。
在两个单独研究中的两个单独条件下，在70mL总液体体积(空腔的剩余130mL体积在旋转期间含有空气)中开始转导过程。单独条件分别对200×106个细胞及100×106个细胞执行。使用相同单位总数的含有编码抗CD19CAR的载体的病毒载体颗粒，分别关于两个条件产生1.8IU/细胞及3.6IU/细胞。在转导程序期间，3600秒旋转在大致7400rpm下，相当于在处理空腔侧壁大致1600g的RCF。
在约24小时孵育之后，在生物反应器系统中通过灌注扩增细胞。在第6天以如实施例1中所述检测的表面表达所编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算相应组合物的转导效率且与作为对照物的未转导的细胞群体(“未转导”)相比。结果展示于图8A中。如所示，在相同总体积及总数的感染单位下在旋转孵育期间，对于在孵育期间在空腔中使用较少量100×106个细胞的条件观测到更大转导效率。
实施例8B
在另一研究中，如实施例7中所述开始转导且进一步孵育以完成转导，详情如下。
在三个单独条件下，在70mL总液体体积(空腔的剩余130mL体积在旋转期间含有空气)中开始转导过程。单独条件分别对200×106个细胞、100×106个细胞及50×106个细胞执行。使用相同单位总数的含有编码抗CD19CAR的载体的病毒载体颗粒，其为关于200×106个细胞的条件产生1.8IU/细胞所需的单位数目。在转导程序期间，在2系统上在大致7400rpm下进行3600秒旋转，相当于在处理空腔侧壁大致1600g的RCF。
在约24小时孵育之后，在生物反应器系统中通过灌注扩增细胞。在第6天以如实施例1中所述检测的表面表达所编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算相应组合物的转导效率且与作为对照物的未转导的细胞群体(“未转导”)相比。结果展示于图8B中。如所示，在相同总体积及总数的感染单位下在旋转孵育期间，对于在孵育期间在空腔中使用较少量100×106个细胞的条件观测到更大转导效率。
如实施例4中所述，亦在第6天评定转导细胞中的载体拷贝数(VCN)，同时确定转导细胞(在基因组中含有SGF+病毒载体核酸的细胞)当中的平均VCN。亦评定未转导的细胞对照物(“PD UnTD”)及阳性对照细胞(“2拷贝阳性对照”)。结果呈现于图8C中。
实施例9：具有不同体积和病毒载体颗粒单位的离心室中的转导起始
对具有增加数目的病毒颗粒感染单位(IU)及液体体积(细胞数目恒定(100×106个))的组合物进行实施例7中所述的转导方法，详情如下。在每种情况下，在开始转导之前，如实施例11中所述收集、洗涤、分离、冷冻保存及活化细胞。
在实施例7中所述的过程中，对于不同条件，通过稀释方案自稀释剂袋位置吸入而与细胞组合的含有病毒颗粒、培养基及空气的组合物分别包括60、90及120mL液体体积(对于个别条件，10mL含细胞组合物分别产生70、100及130mL液体体积)，而引入离心室进行旋转的200mL总体积的其余部分由空气构成。这些液体体积中的每个包括每毫升液体体积6×106IU病毒载体颗粒，产生关于各条件增加的IU及IU/细胞。3600秒旋转在大致7400rpm的速度下进行，相当于在单元空腔内壁大致1600g的RCF。还使用未转导的(“模拟”)对照物。
在约24小时孵育之后，在生物反应器系统中通过灌注扩增细胞。在第6天以如实施例1中所述检测的表面表达所编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算相应组合物的转导效率。结果展示于图9A中。如所示，对于相同数目的细胞，增加量的病毒及相应增加的体积使得此研究中的转导效率增加。
如实施例4中所述，还在第6天通过实时定量PCR(RT-qPCR)测定各条件的每个转导细胞(表达转基因的细胞)的平均载体拷贝数(VCN)。结果呈现于图9B中。
实施例10：使用离心室的离心时间对转导功效的影响
如实施例7中所述对100×106个细胞进行转导，而用于在离心下孵育的持续时间不同。具体地，在离心室的处理空腔中用于离心的总液体体积为70mL(200mL总体积的剩余130mL由空气组成)。含有编码抗CD19CAR的载体的病毒载体颗粒以3.6IU/细胞的比率包括于此体积中。在每种情况下，在开始转导之前，如实施例11中所述收集、洗涤、分离、冷冻保存及活化细胞。
起始转导的旋转在大致7400rpm下进行，相当于在处理离心室内部侧壁大致1600g的相对离心力。对于一个条件，在此速度下旋转的持续时间为10分钟，而对于另一条件为60分钟。
在约24小时孵育之后，在生物反应器系统中通过灌注扩增细胞。在第6天以如实施例1中所述检测的表面表达所编码的CAR的CD3+T细胞的百分比形式计算相应组合物的转导效率。亦评定未转导的对照物(“未转导”)。结果展示于图10中。如所示，在此研究中，在离心室的处理空腔中离心60分钟与10分钟相比，在开始转导100×106个细胞后观测到更大转导效率。
实施例11：制备遗传工程改造的细胞
此实施例描述已根据本文所提供的某些实施方式，由生物样品制备通过病毒载体编码的核酸转导的经遗传工程改造的T细胞的示例性过程。如个别实施例中所述，在本文各种实施例中所述的研究中进行转导步骤之前，如此实施例中所述，进行此过程的一些步骤，例如收集、洗涤、低温保存、选择及活化步骤。
该过程的各种步骤在离心室的处理空腔内进行，该离心室具有大体上圆柱形的刚性侧壁及能够在离心室内移动以改变空腔体积的活塞(单次使用试剂盒内所含的离心室的处理空腔)。具体地，在离心室中进行的步骤包括细胞洗涤、稀释/缓冲液更换、用于基于亲和力的选择的步骤(例如与免疫特异性结合剂一起孵育)、转导起始、配制及用于活化/扩增的步骤(例如与刺激剂一起孵育)。
1.样品收集及白细胞清血法
使用白细胞清血法收集系统自对象的全血样品获得富含单核细胞的人类白细胞清血法样品。白细胞清血法样品密封储存在2-8℃下，不超过约48小时。
2.白细胞清血法洗涤
将白细胞清血法样品无菌转移至转移封装。洗涤白细胞清血法样品的细胞且再悬浮于适用于基于亲和力的选择的缓冲液中，该缓冲液含有PBS、EDTA及人类血清白蛋白。在由Biosafe SA出售的适用于再生医学的无菌单次使用抛弃式试剂盒内进行洗涤，该试剂盒包括离心室(1)，基本上如图7中所描绘。将含有细胞的转移封装及含有缓冲液的袋无菌连接至试剂盒，该试剂盒联合2处理单元放置。在该单元上使用标准细胞洗涤方案进行洗涤及再悬浮，使得细胞在方案结束时保留在离心室的处理空腔(7)中，随后与用于基于亲和力的选择的试剂一起孵育(参见3)。
3.基于亲和力的选择
对于T细胞的基于免疫亲和力的阳性选择，继续相同自动化程序以在具有偶合至特异性针对CD4及CD8的单抗的磁性珠的选择缓冲液中孵育经洗涤的细胞。在上文所述的洗涤(参见2)之后，在室温下在保留细胞的同一离心室(1)中进行孵育。具体地，珠在转移封装中混合于选择缓冲液中，接着将转移封装无菌连接在单次使用试剂盒用于洗涤步骤的稀释剂袋位置处。在2单元上运行程序，使得珠混合物及选择缓冲液与经洗涤的细胞一起吸入至离心室中，且离心室的内含物(总液体体积100mL)通过半连续过程混合30分钟。在重复间隔下进行混合，每一间隔包括在低速(大致1700rpm)下的短持续时间(大致1秒)离心，接着为短静止时间(大致6秒)。
在程序结束时，2单元使得细胞集结且排出过量缓冲液/珠至废料袋位置处的袋中，洗涤经集结的细胞且再悬浮于选择缓冲液中。在上以在空腔内壁大致200g的RCF进行洗涤180秒。程序使得经洗涤的细胞收集于放置在图7中所示的示例性试剂盒中的输出袋位置处的转移封装中，其内含物可通过管线转移至封闭系统内用于磁性分离的柱。因此，通过使液体及细胞传递至离心室的空腔及自离心室的空腔传出，细胞洗涤及与基于亲和力的选择试剂一起孵育完全在同一封闭无菌系统内进行。控制及调节液体体积的能力及使细胞在旋转下在离心室中混合的能力允许使用与在管中在震荡或旋转下孵育相比每个细胞基本上较少的选择试剂加以处理。
细胞接着自转移封装传递经过封闭无菌系统的管线及分离柱，在磁场存在下使用标准方法分离已结合CD4特异性试剂和/或CD8特异性试剂的细胞。这些磁性标记物细胞接着收集于转移封装中用于进一步处理。
4.低温保存
将具有经标记、经选择的细胞的转移封装无菌连接至由Biosafe AS出售的用于再生医学的单次使用抛弃式试剂盒以便与2系统一起使用。试剂盒基本上如图7中所示，不同的处在于在图7中所示的示例性系统中连接输出袋的位置处存在两个端口(相对于一个)，而收集袋以无菌方式连接在各端口处；在图7中连接输入袋的位置处存在两个端口(相对于一个)；及在图7中稀释剂袋1及2的位置处存在单一端口(相对于两个)。在2单元上进行标准洗涤循环以减小经洗涤细胞的体积。将具有低温培养基的袋以无菌方式连接至试剂盒且运行稀释方案两次，以将低温培养基转移至细胞组合物及将所得组合物排出至两个输出低温保存袋中。将低温保存袋中的细胞低温保存且储存于液氮中直至另外使用为止。
5.解冻及活化
将低温保存的细胞解冻。经解冻的细胞一般在37℃下使用抗CD3/CD28试剂活化一段如个别研究所指示的时间。在与该试剂一起孵育之前，使用2系统，使用标准细胞洗涤程序且在基本上如图7中所示的试剂盒中洗涤细胞且再悬浮于完全培养基中。在同一试剂盒中，通过在室温下如关于选择的珠孵育所述在低速离心及静止之间隔下混合30分钟而使细胞在离心室空腔中与抗CD3/28试剂组合。在孵育后，孵育材料通过2单元转移至输出细胞培养袋中，接着在37℃下孵育持续剩余活化时间。
6.转导
如实施例7中所述，在与试剂盒一体的与处理单元联合放置的离心室中进行转导，特定详情在具体实施例中给出。
7.扩增
在一些情况下，在转导后，细胞一般在37℃下进一步孵育以便扩增。
8.洗涤、配制
在一些情况下，进一步洗涤、稀释和/或配制经扩增和/或转导的细胞以便测试、储存和/或给予。在一些实施例中，经扩增和/或转导的细胞在与单次使用试剂盒一体的与2系统一起使用的离心室中洗涤，例如，如关于低温保存所述。在一些情况下，含有经洗涤细胞的袋以无菌方式连接至例如图7中所示的试剂盒，或连接至在图7中所示的输出袋位置处具有多个可用于连接容器(例如袋)的端口的此类试剂盒。
此类多端口输出试剂盒的一个实施例示于图11中，其展示多个端口(17)，其中一个或多个可连接容器(例如袋)用于收集输出组合物。连接可为无菌焊接所需数目的容器，根据例如需要通过给定方法产生的细胞单位剂型的数目而定。为产生图11中所示的试剂盒，将具有多个端口(在图11中所示的实施例中，八个)的多路管歧管无菌焊接至由BiosafeAS出售用于再生医学用途的单次使用试剂盒的输出管线。所需数目的多个输出袋以无菌方式连接至这些端口中一个或多个，一般两个或两个以上。在一些实施例中，此类袋连接至少于全部的端口。将夹具(5)置于管在线防止流体移动至个别袋中直至需要。含有所需液体(例如配制、分析和/或低温保存培养基)的袋以无菌方式连接至试剂盒且在2单元上运行稀释方案多次，使用者打开及关闭引导至适当数目的袋的相应夹具，从而在所需配制下产生分成所需数目袋的输出组合物。在一些实施方式中，单一单位剂量的细胞收集在相应袋中的每个中，配制用于给予对象，例如获得白细胞清血法产物的对象。
本发明不旨在限制在具体揭示的实施方式的范围中，提供所述实施方式用于例如说明本发明的各种方面。对所述组合物及方法的各种修改将由本文中的描述及教导而变得显而易见。此类变化形式可在不背离本发明的实质范围及精神的情况下加以实践且旨在属于本发明的范围内。

Claims (180)

1.一种转导方法，其包括：在离心室的内部空腔中孵育输入组合物，该输入组合物包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒，其中
该离心室能围绕旋转轴旋转，并且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，该侧壁的至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出；
该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；及
该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。
2.一种转导方法，其包括：在离心室的内部空腔中孵育输入组合物，该输入组合物包含细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒，
该离心室能围绕旋转轴旋转，并且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出，其中：
该离心室在该孵育的至少一部分期间围绕该旋转轴旋转；
在该离心室旋转期间，存在于该空腔中的该输入组合物的总液体体积不超过约5mL/平方英寸该空腔的内部表面积；及
该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该旋转包括以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的大于约200g、大于约300g或大于约500g的相对离心力(RCF)旋转。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该旋转包括以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的如下相对离心力旋转：在或约在600g、800g、1000g、1100g、1600g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g；或至少或至少约600g、800g、1000g、1100g、1600g、2000g、2100g、2200g、2500g或3000g。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该旋转包括以在该空腔侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的如下数值范围的相对离心力或约如下数值范围的相对离心力旋转：500g至2500g、500g至2000g、500g至1600g、500g至1000g、600g至1600g、600g至1000g、1000g至2000g或1000g至1600g，各包括端点。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在该孵育的至少一部分期间，该室旋转如下时间：大于或约5分钟、大于或约10分钟、大于或约15分钟、大于或约20分钟、大于或约30分钟、大于或约45分钟、大于或约60分钟、大于或约90分钟或大于或约120分钟；或，5分钟至60分钟之间或约5分钟至60分钟之间、10分钟至60分钟之间或约10分钟至60分钟之间、15分钟至60分钟之间或约15分钟至60分钟之间、15分钟至45分钟之间或约15分钟至45分钟之间、30分钟至60分钟之间或约30分钟至60分钟之间，或45分钟至60分钟之间或约45分钟至60分钟之间，各包括端点。
7.如权利要求1至6中任一项所述的转导方法，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性的侧壁及该可移动构件限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该侧壁为曲线形。
9.如权利要求8所述的方法，其中该侧壁为大体上的圆柱形。
10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中：该可移动构件为活塞；和/或该可移动构件能够在该离心室内轴向性地移动以改变该空腔的内部体积。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该至少一个开口包括入口及出口，其分别能够允许该引入及该压出；或该至少一个开口包含单一入口/出口，其能够允许该引入及该压出。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该至少一个开口与该室是同轴的且位于该端壁中。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中：该空腔的内部表面积为至少或至少约1×109μm2；该空腔的内部表面积为至少或至少约1×1010μm2；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约5cm；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约8cm；和/或该空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中：在该孵育期间，存在于该空腔中的该输入组合物的平均液体体积不超过约5毫升(mL)/平方英寸该孵育期间的该空腔的内部表面积；在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积不超过约5mL/平方英寸该空腔的最大内部表面积；在该孵育期间，存在于该空腔中的该输入组合物的平均液体体积不超过约2.5毫升(mL)/平方英寸该孵育期间的该空腔的内部表面积；或，在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大液体体积不超过约2.5mL/平方英寸该空腔的最大内部表面积。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在该旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的液体体积介于如下数值之间或介于约如下数值之间：0.5mL/平方英寸该空腔的内部表面积(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中所述细胞的数目是或约是足以在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的表面上形成单层的所述细胞的数目；和/或该输入组合物中所述细胞的数目是足以在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的表面上形成单层的所述细胞的数目的不超过1.5倍或2倍。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×106个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约5×106个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×107个所述细胞；或该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×108个所述细胞。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该空腔中的该输入组合物包含至少或至少约1×107个所述细胞、至少或至少约2×107个所述细胞、至少或至少约3×107个所述细胞、至少或至少约4×107个所述细胞、至少或至少约5×107个所述细胞、至少或至少约6×107个所述细胞、至少或至少约7×107个所述细胞、至少或至少约8×107个所述细胞、至少或至少约9×107个所述细胞或约所述数目的所述细胞、至少或至少约1×108个所述细胞、至少或至少约2×108个所述细胞、至少或至少约3×108个所述细胞，或至少或至少约4×108个所述细胞。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中：该输入组合物包含每个所述细胞至少或至少约1个感染单位(infectious unit；IU)的病毒颗粒、每个所述细胞至少或至少约2个IU、每个所述细胞至少或至少约3个IU、每个所述细胞至少或至少约4个IU、每个所述细胞至少或至少约5个IU、每个所述细胞至少或至少约10个IU、每个所述细胞至少或至少约20个IU、每个所述细胞至少或至少约30个IU、每个所述细胞至少或至少约40个IU、每个所述细胞至少或至少约50个IU或每个所述细胞至少或至少约60个IU；或该输入组合物包含每个所述细胞1个或约1个感染单位(IU)的病毒颗粒、每个所述细胞2个或约2个IU、每个所述细胞3个或约3个IU、每个所述细胞4个或约4个IU、每个所述细胞5个或约5个IU、每个所述细胞10个或约10个IU、每个所述细胞20个或约20个IU、每个所述细胞30个或约30个IU、每个所述细胞40个或约40个IU、每个所述细胞50个或约50个IU或每个所述细胞60个或约60个IU。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中：在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大总液体体积为该空腔中所述细胞的总体积的不超过2倍、不超过10倍或不超过100倍，或该输入组合物在该孵育过程中的平均体积为该空腔中细胞总体积的不超过2、10或100倍。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在该孵育期间的任何时间处，存在于该空腔中的该输入组合物的最大体积或在该孵育过程中的平均体积为在该离心室以在该侧壁的内表面和/或在所述细胞的表层处的1000g或约1000g或2000g或约2000g的力旋转期间在该空腔的内表面上形成的所述细胞的单层的体积的不超过下列倍数或不超过约下列倍数：2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该输入组合物的液体体积不超过20mL、不超过40mL、不超过50mL、不超过70mL、不超过100mL、不超过120mL、不超过150mL或不超过200mL。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该输入组合物在该孵育的至少一部分期间占该内部空腔的全部或基本上全部体积。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中在该室中孵育的至少一部分期间或在该室旋转期间，该输入组合物的液体体积仅占该室的内部空腔体积的一部分，在该至少一部分期间或在该旋转期间，该空腔的体积还包含气体，该气体在该孵育之前或期间通过该至少一个开口引入至该空腔中。
25.如权利要求24所述的方法，其中该离心室包含可移动构件，从而气体向该离心室中的引入实现该可移动构件的移动以增加该室的内部空腔的体积，从而与该室中不存在气体时相比，减少在该离心室旋转期间存在于该空腔中的该输入组合物的每平方英寸该空腔的内部表面积的总液体体积。
26.一种转导方法，其包括：a)向内部表面积为至少1×109μm2或约1×109μm2或至少1×1010μm2或约1×1010μm2的离心室的内部空腔提供：i)输入组合物，其包含细胞及包含重组病毒载体的病毒颗粒，其中：该输入组合物中的细胞数目为至少1×107个细胞，及所述病毒颗粒以每个所述细胞至少是或约是1个感染单位(IU)存在于该输入组合物中，及该输入组合物的液体体积小于该离心室的内部空腔的最大体积；及ii)体积至多为该离心室的内部空腔的剩余最大体积的气体；及b)孵育该输入组合物，其中该孵育的至少一部分在该离心室的该内部空腔中进行，同时实现该离心室的旋转；及其中该方法产生输出组合物，该输出组合物包含用该病毒载体转导的多个细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中：该细胞数目为至少或至少约50×106个细胞；至少或至少约100×106个细胞；或至少或至少约200×106个细胞；和/或所述病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU或每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU存在。
28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中：该输入组合物的液体体积小于或等于200mL、小于或等于100mL、小于或等于50mL、或小于或等于20mL；和/或，该输入组合物的液体体积是旋转期间该空腔的内部表面积或该空腔的最大内部表面积的体积的不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％或不超过10％。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中该气体体积为至多200mL、至多180mL、至多140mL或至多100mL。
30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中该旋转为在该空腔的侧壁内表面或在所述细胞的表层处的至少或至少约下列数值的相对离心力：600g、800g、1000g、1100g、1500g、1600g、2000g、2400g、2600g、2800g、3000g、3200g或3600g。
31.一种转导方法，其包括，孵育包含细胞及包含重组病毒载体的病毒颗粒的输入组合物，该孵育的至少一部分在旋转条件下进行，从而产生包含用该病毒载体转导的多个细胞的输出组合物，其中：该输入组合物的体积大于或约20mL、50mL、至少100mL或至少150mL和/或该输入组合物包含至少1×108个细胞；及所述旋转条件包含在所述细胞的表层处的大于约800g或大于约1000g或大于约1500g的相对离心力。
32.如权利要求31所述的方法，其中：该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞经该病毒载体转导；和/或该输出组合物中至少25％或至少50％的所述细胞表达该病毒载体内所包含的异源核酸的产物。
33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其中该孵育在离心室的空腔中进行，且该输入组合物中的所述细胞的数目为或约为足以在该旋转期间在该空腔的内表面上形成单层或双层的所述细胞的数目。
34.如权利要求33所述的方法，其中该离心室包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁至少一部分包围该内部空腔，且该至少一个开口能够允许流体引入至该内部空腔中及流体自该空腔压出。
35.如权利要求34所述的方法，其中该离心室还包含可移动构件且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性侧壁及该可移动构件所限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
36.如权利要求1至30或33至35中任一项所述的方法，其中该空腔中该输入组合物在该孵育的至少一部分期间包含至少20mL或至少50mL的液体体积，以及一百万个或约一百万个细胞/cm2该空腔的内部表面积。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中该孵育的另一部分在该离心室外面和/或在无旋转的情况下进行，该另一部分在该室中和/或在旋转下进行至少一部分之后进行。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中该孵育的至少一部分在该室的该空腔中进行和/或该孵育的另一部分在37℃±2℃或约37℃±2℃下实现。
39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中该孵育还包含在该孵育期间将至少多个所述细胞转移至容器中，并且该孵育的该另一部分在该容器中实现。
40.如权利要求39所述的方法，其中该转移在封闭系统内进行，其中该离心室及容器与该封闭系统是一体的。
41.如权利要求37至40中任一项所述的方法，其中：该孵育进行一段介于下列的时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时，包括端点；或，该孵育的该另一部分进行一段下列时间：1小时或约1小时至96小时或约96小时、4小时或约4小时至72小时或约72小时、8小时或约8小时至48小时或约48小时、12小时或约12小时至36小时或约36小时、6小时或约6小时至24小时或约24小时、36小时或约36小时至96小时或约96小时，包括端点。
42.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育进行不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的一段时间；或该孵育的该另一部分进行不超过48小时、不超过36小时或不超过24小时的一段时间。
43.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育在刺激剂存在下进行；和/或该孵育的该另一部分在刺激剂存在下进行。
44.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中：该孵育进行不超过24小时的一段时间；该组合物中的所述细胞尚未经受高于30℃的温度超过24小时；和/或该孵育并非在刺激剂存在下进行。
45.如权利要求43或权利要求44所述的方法，其中该刺激剂为能够诱导T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞增殖的药剂。
46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其中该刺激剂为选自IL-2、IL-15及IL-7的细胞因子。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中含有转导细胞的该输出组合物包含至少或至少约1×107个细胞，或至少或至少约5×107个细胞。
48.如权利要求47所述的方法，其中含有转导细胞的该输出组合物包含至少或至少约1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
49.如权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述细胞为T细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述T细胞为未分级分离T细胞、经分离的CD4+T细胞和/或经分离的CD8+T细胞。
51.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中该方法使得该病毒载体整合至该至少多个细胞中一个或多个的宿主基因组中和/或整合至该输出组合物中至少20％或约20％、或至少30％或约30％，或至少40％或约40％的所述细胞的宿主基因组中。
52.如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞通过该方法经该病毒载体转导；和/或，该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞经该病毒载体转导；和/或，该输出组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞表达该病毒载体内所包含的异源核酸的产物。
53.如权利要求1至52中任一项所述的方法，其中，对于以每个细胞约1或约2个IU的比率包含病毒的输入组合物而言，该方法能够产生以下的输出组合物，其中通过该方法产生的该输出组合物中至少10％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞包含该重组病毒载体和/或表达该载体内所包含的重组核酸的产物。
54.如权利要求1至53中任一项所述的方法，其中：在含有该重组病毒载体或该病毒载体整合至其中该输出组合物中的所有所述细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过约5、不超过约2.5或不超过约1.5；或在该输出组合物中的所述细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约2、不超过约1.5或不超过约1。
55.如权利要求1至30及33至54中任一项所述的方法，其中该离心室与封闭系统是一体的，该封闭系统包含该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于该至少一个开口的至少一个管线，从而允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。
56.如权利要求55所述的方法，其中：该至少一个管线包含一系列管线；该至少一个连接器包含多个连接器；及该封闭系统还包含操作性地连接于该一系列管线的至少一个容器，该连接允许液体和/或气体通过该一系列管线在该至少一个容器与该至少一个开口之间通过。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中该至少一个连接器包含选自阀、鲁尔端口及刺突的连接器。
58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中该至少一个连接器包含旋转阀。
59.如权利要求58所述的方法，其中该旋转阀为活栓或多旋转端口。
60.如权利要求55至59中任一项所述的方法，其中该至少一个连接器包含无菌连接器。
61.如权利要求56至60中任一项所述的方法，其中该至少一个容器包含选自袋、小瓶及注射器的容器。
62.如权利要求56至61中任一项所述的方法，其中该至少一个容器包含稀释剂容器、废料容器、产物收集容器和/或输入产物容器。
63.如权利要求56至62中任一项所述的方法，其中：该至少一个容器包含含有所述病毒载体颗粒及所述细胞的至少一个输入容器、废料容器、产物容器及至少一个稀释剂容器，其各通过该一系列管线及该至少一个开口连接至该空腔。
64.如权利要求63所述的方法，其中该方法还包括在该孵育之前和/或期间，实现该输入组合物引入至该空腔中，该引入包括液体从该至少一个输入容器通过该至少一个开口流入该空腔中。
65.如权利要求56至64中任一项所述的方法，其中至少一个容器还包含在该孵育期间的至少一个点之前和/或期间包含气体的容器，和/或该封闭系统还包含能够将气体引入至该离心室的内部空腔中的微生物过滤器和/或该封闭系统含有用于实现气体引入的注射器端口。
66.如权利要求65所述的方法，其中该方法包括在该孵育之前和/或期间，提供或实现气体在无菌条件下引入至该空腔中，该引入通过(a)来自包含气体的容器的气体的流动、(b)来自该封闭系统的外部环境经过该微生物过滤器的气体的流动、或(c)来自连接至该系统的注射器在该注射器端口处的气体的流动来实现。
67.如权利要求66所述的方法，其中实现该气体引入至该离心室的内部空腔中与实现该输入组合物引入至该离心室的内部空腔中同时或一起进行。
68.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中该输入组合物与气体是在该输入组合物及气体引入至该离心室的内部空腔中之前，于该离心室外面的无菌条件下组合在单一容器中。
69.如权利要求68所述的方法，其中实现该气体引入与实现该输入组合物引入至该空腔中同时地或依次地分开进行。
70.如权利要求66至69中任一项所述的方法，其中该气体引入是通过允许或引起来自包含该气体的无菌封闭容器、来自外部环境且穿过微生物过滤器或来自包含该气体的注射器的该气体的流动来实现。
71.如权利要求24至70中任一项所述的方法，其中该气体为空气。
72.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中该孵育为连续过程的一部分，该方法还包括：在该孵育的至少一部分期间，于该离心室旋转期间实现该输入组合物连续引入至该空腔中；及在该孵育的一部分期间，实现液体在该离心室旋转期间通过该至少一个开口自该空腔连续压出。
73.如权利要求72所述的方法，其还包括：在该孵育的一部分期间，于该离心室的旋转期间实现气体连续引入至该空腔中；和/或在该孵育的一部分期间，实现气体自该空腔连续压出。
74.如权利要求73所述的方法，其中该方法包括自该空腔压出液体及压出气体，其中，其各自被同时或依次压出至不同容器中。
75.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中该连续引入及该连续压出的至少一部分是同时进行的。
76.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中该孵育为半连续过程的一部分，该方法还包括：在该孵育之前，实现该输入组合物，和任选的气体，通过该至少一个开口引入至该空腔中；在该孵育之后，实现液体和/或任选的气体自该空腔压出；实现包含细胞及含有重组病毒载体的所述病毒颗粒，和任选的气体，的另一输入组合物引入至该内部空腔中；及，在该内部空腔中孵育该另一输入组合物，其中该方法产生另一输出组合物，该另一输出组合物包含经该病毒载体转导的该另一输入组合物的多个细胞。
77.如权利要求64至76中任一项所述的方法，其中该提供或该引入该输入组合物至该空腔中包括：引入单一组合物，该组合物包含所述细胞及含有该重组病毒载体的所述病毒颗粒；或引入包含所述细胞的组合物及包含含有该重组病毒载体的所述病毒颗粒的另一组合物，从而混合这些组合物，实现该输入组合物的引入。
78.如权利要求64至77所述的方法，其中该方法还包括：在该孵育之前和/或期间实现该离心室的旋转；在该孵育之后实现液体自该空腔压出至该废料容器中；实现液体自该至少一个稀释剂容器通过该至少一个开口压出至该空腔中及实现该空腔的内含物的混合；及实现液体自该空腔压出至该产物容器中，从而将经该病毒载体转导的细胞转移至该产物容器中。
79.如权利要求1至78中任一项所述的方法，其还包括：(a)在该孵育之前，在离心室的内部空腔中洗涤包含所述细胞的生物样品；和/或(b)自生物样品分离所述细胞，其中该分离步骤的至少一部分在该孵育之前，于离心室的内部空腔中进行；和/或(c)在该孵育之前和/或期间刺激细胞，该刺激包括使所述细胞暴露于刺激条件，从而诱导该输入组合物的细胞增殖，其中该刺激细胞步骤的至少一部分在离心室的内部空腔中进行。
80.如权利要求79所述的方法，其中该分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
81.如权利要求79或80所述的方法，其中所述刺激条件包括存在能够活化TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域的药剂。
82.如权利要求81所述的方法，其中该药剂包含特异性结合至TCR复合物成员的初级试剂及特异性结合至T细胞协同刺激分子的二级试剂。
83.如权利要求82所述的方法，其中该初级试剂特异性结合至CD3；和/或该协同刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述初级试剂及二级试剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。
85.如权利要求79至84中任一项所述的方法，其中(a)和/或(b)中的该生物样品是或包含全血样品、白细胞层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级分离的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、清血法产物或白细胞清血法产物。
86.如权利要求1至85中任一项所述的方法，其还包括在离心室的内部空腔中将通过该方法转导的细胞配制于医药学上可接受的缓冲液中，从而产生配制组合物。
87.如权利要求86所述的方法，其还包括实现该配制组合物压出至一个或多个容器中。
88.如权利要求87所述的方法，其中实现该配制组合物的压出包含实现以单一单位剂量存在的许多所述细胞压出至该一个或多个容器中之一或每个中。
89.如权利要求79至88中任一项所述的方法，其中该离心室的空腔中的每个与用于一个或多个其他步骤和/或用于孵育和/或旋转含有细胞和病毒颗粒的输入组合物的离心空腔是相同的或不同的。
90.如权利要求79至89中任一项所述的方法，其中所述离心室中的每个与封闭系统是一体的，该封闭系统包含该离心室及通过至少一个连接器操作性地连接于该至少一个开口的至少一个管线，从而允许液体及气体在该系统的至少一个构型中在该空腔与该至少一个管线之间移动。
91.如权利要求1至90中任一项所述的方法，其中该输入组合物中的所述细胞为原代细胞。
92.如权利要求1至91中任一项所述的方法，其中：该输入组合物中的所述细胞包含悬浮细胞；该输入组合物中的所述细胞包含白细胞；和/或，该输入组合物中的所述细胞包含T细胞或NK细胞。
93.如权利要求1至92中任一项所述的方法，其中该输入组合物中的所述细胞为未分级分离的T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
94.如权利要求1至93中任一项所述的方法，其中该输入组合物中的所述细胞为人类细胞。
95.如权利要求7至94中任一项所述的方法，其中在该孵育期间，该离心室与传感器及控制电路联合，该传感器能够监测该可移动构件的位置，该电路能够接收来自该传感器的信息及传输信息至该传感器并引起该可移动构件的移动，该控制电路与能够在该孵育期间引起该离心室的旋转的离心机进一步联合。
96.如权利要求7至95中任一项所述的方法，其中该离心室包含该可移动构件且在该孵育期间，该离心室位于离心机内并与传感器及控制电路联合，该传感器能够监测该可移动构件的位置，该控制电路能够接收及传输来自该传感器的信息且引起该可移动构件移动、通过该一个或多个管线引入液体至该空腔及自该空腔压出液体及通过该离心机旋转该离心室。
97.如权利要求95或权利要求96所述的方法，其中该离心室、该控制电路、该离心机及该传感器在该孵育期间置于柜体中。
98.如权利要求1至97中任一项所述的方法，其中该重组病毒载体编码重组受体，该重组受体从而通过该输出组合物的细胞表达。
99.如权利要求98所述的方法，其中该重组受体为重组抗原受体。
100.如权利要求99所述的方法，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
101.如权利要求100所述的方法，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
102.如权利要求99所述的方法，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
103.如权利要求99所述的方法，其中该重组受体为嵌合受体，该嵌合受体包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分。
104.如权利要求1至103中任一项所述的方法，其中：所述细胞包含获自人类对象的原代人类T细胞；及在该孵育之前和/或在该转导完成之前和/或，若该方法包括配制，则在该配制物之前，所述原代人类T细胞未在高于30℃的温度下存在于该对象外部大于1小时、大于6小时、大于24小时或大于48小时；或在该孵育之前和/或在该转导完成之前和/或，若该方法包括配制，则在该配制物之前，所述原代人类T细胞尚未在特异性针对CD3的抗体和/或特异性针对CD28的抗体和/或细胞因子的存在下孵育大于1小时、大于6小时、大于24小时或大于48小时。
105.一种用于选择的方法，该方法包括：(a)在离心室的内部空腔中，于混合条件下孵育选择试剂及原代细胞，从而多个所述原代细胞结合至该选择试剂；及(b)基于与该选择试剂的结合，使该多个所述原代细胞与另外一种或多种原代细胞分离，从而基于与该选择试剂的结合富集所述原代细胞，其中该离心室能围绕旋转轴旋转且该内部空腔的最大体积为至少50mL、至少100mL或至少200mL。
106.一种用于刺激细胞的方法，该方法包括：在一定条件下孵育刺激剂及原代细胞，从而使该刺激剂结合至经多个所述原代细胞表达的分子并活化或刺激该多个所述细胞，其中该孵育的至少一部分在离心室的内部空腔中于混合条件下进行，该离心室能围绕旋转轴旋转；及该内部空腔的最大体积为至少50mL、至少100mL或至少200mL。
107.如权利要求105或权利要求106所述的方法，其中该室还包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
108.一种组合物，其包含通过如权利要求1至107中任一项所述的方法所产生的经转导细胞。
109.如权利要求108所述的组合物，其中所述细胞：为原代细胞；和/或为人类细胞；和/或包含白细胞；和/或包含T细胞；和/或包含NK细胞。
110.如权利要求108或权利要求109所述的组合物，其中该组合物包含至少或至少约5×107个细胞、1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
111.如权利要求106至110中任一项所述的组合物，其中该组合物包含用于过继T细胞疗法的治疗有效数目的细胞。
112.如权利要求106至111中任一项所述的组合物，其中：所述细胞为T细胞；及在转导之后，该组合物中的所述细胞并未在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞并未在高于30℃的温度下孵育超过24小时，或该组合物不含细胞因子或该组合物不含特异性结合至CD3或TCR复合物的刺激剂。
113.一种组合物，其包含至少1×107个或至少5×107个T细胞，其中至少多个是经重组病毒载体转导的或表达重组或经工程改造的抗原受体，其中：在转导之后，该组合物中的所述细胞尚未在刺激剂存在下进行细胞扩增；和/或在转导之后，所述细胞尚未在高于30℃的温度下孵育超过24小时。
114.一种组合物，其包含至少1×107个或至少5×107个原代人类T细胞，其中至少多个是经重组病毒载体转导的或表达重组或经工程改造的抗原受体，其中该组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所述T细胞包含TGF-β-II和/或CD69的高表达。
115.如权利要求114所述的组合物，其中该组合物中该至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的所述T细胞不包含CD62L的表面表达和/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8和/或IL-2的高表达。
116.如权利要求113至115中任一项所述的组合物，其中该组合物包含至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
117.如权利要求109至116中任一项所述的组合物，其中所述T细胞为未分级分离的T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
118.如权利要求108至117中任一项所述的组合物，其中该组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞经该病毒载体转导。
119.如权利要求108至118中任一项所述的组合物，其中：该病毒载体编码重组受体；及该组合物中的转导细胞表达该重组受体。
120.如权利要求119所述的组合物，其中该重组受体为重组抗原受体。
121.如权利要求120所述的组合物，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
122.如权利要求121所述的组合物，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
123.如权利要求119至122中任一项所述的组合物，其中该重组受体为嵌合受体，该嵌合受体包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分。
124.如权利要求120所述的组合物，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
125.如权利要求110至124中任一项所述的组合物，其中：在该组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2；或在该组合物中经该重组病毒载体转导的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2。
126.如权利要求110至125中任一项所述的组合物，其包含医药学上可接受的赋形剂。
127.一种制品，其包含一个容器或多个容器，该容器或该多个容器共同含有如权利要求113至126中任一项所述的组合物。
128.如权利要求127所述的制品，其中该容器或多个容器包含两个或更多或三个或更多袋，且该组合物还包含医药学上可接受的赋形剂。
129.一种治疗方法，该方法包括向患有疾病或病症的对象给予如权利要求110至126中任一项所述的组合物。
130.如权利要求129所述的方法，其中，该组合物中的经转导T细胞与下述这种组合物中的经转导T细胞相比在该对象体内展现增加或较长扩增和/或持久性：其中在转导之后，该种组合物中的细胞已在刺激剂存在下进行细胞扩增和/或所述细胞已在高于30℃的温度下孵育超过24小时。
131.如权利要求129或权利要求130所述的方法，其中该重组受体、嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合至与该疾病或病症相关联的抗原。
132.如权利要求129至131中任一项所述的方法，其中该疾病或病症为癌症及自体免疫疾病或病症、或感染性疾病。
133.一种组合物，其包含：至少1×107个细胞；及每个细胞至少或至少约1个感染单位(IU)的含有重组病毒载体的病毒颗粒。
134.如权利要求133所述的组合物，其中：包含至少下列数目或约下列数目的所述细胞：50×106个细胞；100×106个细胞；或200×106个细胞；和/或所述病毒颗粒以至少每个细胞1.6个IU、每个细胞1.8个IU、每个细胞2.0个IU、每个细胞2.4个IU、每个细胞2.8个IU、每个细胞3.2个IU、每个细胞3.6个IU、每个细胞4.0个IU、每个细胞5.0个IU、每个细胞6.0个IU、每个细胞7.0个IU、每个细胞8.0个IU、每个细胞9.0个IU或每个细胞10.0个IU的量存在于该组合物中。
135.如权利要求133或权利要求134所述的组合物，其中该组合物的液体体积小于或等于220mL、小于或等于200mL、小于或等于100mL、小于或等于50mL，或小于或等于20mL。
136.如权利要求133至135中任一项所述的组合物，其中所述细胞为原代细胞。
137.如权利要求133至136中任一项所述的组合物，其中所述细胞为人类细胞。
138.如权利要求133至137中任一项所述的组合物，其中：所述细胞包含悬浮细胞；所述细胞包含白细胞；和/或所述细胞包含T细胞或NK细胞。
139.如权利要求138所述的组合物，其中所述细胞为T细胞且所述T细胞为未分级分离的T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
140.如权利要求133至139中任一项所述的组合物，其中该病毒载体编码重组受体。
141.如权利要求140所述的组合物，其中该重组受体为重组抗原受体。
142.如权利要求141所述的组合物，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
143.如权利要求142所述的组合物，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
144.如权利要求140至143中任一项所述的组合物，其中该重组受体为嵌合受体，该嵌合受体包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分。
145.如权利要求141所述的组合物，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
146.一种能围绕旋转轴旋转的离心室，该离心室包含具有如权利要求110至126中任一项所述的组合物的内部空腔。
147.一种能围绕旋转轴旋转的离心室，该离心室包含具有以下的内部空腔：(a)含有至少5×107个经重组病毒载体转导的原代T细胞的组合物和/或(b)含有至少5×107个原代T细胞及含有重组病毒载体的病毒颗粒的组合物。
148.如权利要求146或147所述的离心室，该室还包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
149.如权利要求147或148所述的离心室，其中该空腔中的该组合物包含至少1×108个细胞、2×108个细胞、4×108个细胞、6×108个细胞、8×108个细胞或1×109个细胞。
150.如权利要求147或权利要求148所述的离心室，其中所述T细胞是未分级分离的T细胞、经分离的CD8+T细胞或经分离的CD4+T细胞。
151.如权利要求147至150中任一项所述的离心室，其中该组合物中至少2.5％、至少5％、至少6％、至少8％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的所述细胞经病毒载体转导。
152.如权利要求147至151中任一项所述的离心室，其中：该病毒载体编码重组受体；及该组合物中的细胞表达该重组受体。
153.如权利要求151所述的离心室，其中该重组受体为重组抗原受体。
154.如权利要求153所述的离心室，其中该重组抗原受体为功能性非T细胞受体。
155.如权利要求154所述的离心室，其中该功能性非T细胞受体为嵌合抗原受体(CAR)。
156.如权利要求151至155中任一项所述的离心室，其中该重组受体为嵌合受体，该嵌合受体包含特异性结合至配体的细胞外部分及含有活化结构域及协同刺激结构域的细胞内信号传导部分。
157.如权利要求153所述的离心室，其中该重组抗原受体为转基因T细胞受体(TCR)。
158.如权利要求147至157中任一项所述的离心室，其中：在该组合物中的所有细胞当中，该重组病毒载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2；或在该组合物中转导有该重组病毒载体的细胞当中，该载体的平均拷贝数不超过约10、不超过8、不超过6、不超过4或不超过约2。
159.一种能围绕旋转轴旋转的离心室，该室包含具有如权利要求133至145中任一项所述的组合物的内部空腔。
160.如权利要求159所述的离心室，其还包含至多至该离心室的内部空腔最大体积的气体体积。
161.如权利要求160所述的离心室，其中该气体为空气。
162.如权利要求146至161中任一项所述的离心室，该室能围绕旋转轴旋转且包含端壁、自该端壁延伸的基本上刚性侧壁及至少一个开口，其中该侧壁的至少一部分包围该内部空腔且该至少一个开口能够允许液体引入至该内部空腔中及液体自该空腔压出。
163.如权利要求146至162中任一项所述的离心室，其中该侧壁为曲线形。
164.如权利要求163所述的离心室，其中该侧壁为大体上圆柱形的。
165.如权利要求162至164中任一项所述的离心室，其中该至少一个开口包含入口及出口，其分别能够允许该引入及压出；或该至少一个开口包含单一入口/出口，其能够允许该引入及该压出。
166.如权利要求162至165中任一项所述的离心室，其中该至少一个开口是与该离心室同轴性的且位于该端壁中。
167.如权利要求162至166中任一项所述的离心室，其中该离心室还包含可移动构件，且该内部空腔为具有由该端壁、该基本上刚性侧壁及该可移动构件所限定的可变体积的空腔，该可移动构件能够在该离心室内移动以改变该空腔的内部体积。
168.如权利要求的167所述的离心室，其中：该可移动构件为活塞；和/或该可移动构件能够在该离心室内轴向性地移动以改变该空腔的内部体积。
169.如权利要求162至168中任一项所述的离心室，其中：该空腔的内部表面积为至少或至少约1×109μm2；该空腔的内部表面积为至少或至少约1×1010μm2；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约5cm；该刚性壁在自该端壁延伸的方向的长度为至少约8cm；和/或该空腔在至少一个截面的半径为至少约2cm。
170.如权利要求159至169中任一项所述的离心室，其中存在于该空腔中的该组合物的液体体积在或约在如下范围：0.5mL/平方英寸该空腔的内部表面积(毫升/平方英寸)至5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸、0.5毫升/平方英寸至1毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸至2.5毫升/平方英寸，或2.5毫升/平方英寸至5毫升/平方英寸。
171.如权利要求159至169中任一项所述的离心室，其中存在于该空腔中的该组合物的液体体积为至少0.5毫升/平方英寸、1毫升/平方英寸、2.5毫升/平方英寸，或5毫升/平方英寸。
172.一种封闭系统，其包含如权利要求147至158及162至171中任一项所述的离心室。
173.如权利要求172所述的封闭系统，其还包含操作性地连接至一个或多个容器的多路歧管。
174.一种封闭系统，其包含如权利要求159至171中任一项所述的离心室。
175.如权利要求174所述的封闭系统，其还包含无菌过滤器。
176.如权利要求172至175中任一项所述的封闭系统，其中该离心室能够在至多8000g的速度下旋转，其中该离心室能够承受至多500g、600g、1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g或3200g的力而无实质屈服、弯曲或断裂或以其他方式导致该离心室受损，和/或同时在此力下基本上保持大体上圆柱形。
177.如权利要求49所述的方法，其中该输出组合物中至少或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％或80％的所述T细胞包含CD69和/或TGF-β-II的高表达。
178.如权利要求177所述的方法，其中该组合物中该至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或80％的所述T细胞不包含CD62L的表面表达和/或包含CD25、ICAM、GM-CSF、IL-8和/或IL-2的高表达。
179.一种方法，其包括：(a)洗涤原代人类细胞；及(b)使所述细胞在搅拌条件下与选择试剂一起孵育，从而至少多个所述人类细胞被所述选择试剂特异性结合，其中该洗涤及孵育在封闭无菌系统内且至少部分在与该封闭无菌系统一体的离心室的内部空腔中进行。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述方法步骤以基于来自用户的该方法应启动的输入的自动化方式进行，从而导致所述方法步骤的完成。
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