EA035618B1 - Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков - Google Patents

Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков Download PDF

Info

Publication number
EA035618B1
EA035618B1 EA201792420A EA201792420A EA035618B1 EA 035618 B1 EA035618 B1 EA 035618B1 EA 201792420 A EA201792420 A EA 201792420A EA 201792420 A EA201792420 A EA 201792420A EA 035618 B1 EA035618 B1 EA 035618B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
domain
cells
cell
tfp
tcr
Prior art date
Application number
EA201792420A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201792420A1 (ru
Inventor
Патрик Баеуерле
Грегори Сичкевич
Роберт Хофмайстер
Original Assignee
Тср2 Терапьютикс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=57320750&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA035618(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Тср2 Терапьютикс Инк. filed Critical Тср2 Терапьютикс Инк.
Publication of EA201792420A1 publication Critical patent/EA201792420A1/ru
Publication of EA035618B1 publication Critical patent/EA035618B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая Т-клетку, модифицированную для экспрессии гибридного белка (TFP) Т-клеточного рецептора (TCR), и способ лечения рака с использованием фармацевтической композиции.

Description

Перекрестная ссылка
Заявка на настоящий патент испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент
США № 62/163342, поданной 18 мая 2015 г., которая полностью включена в настоящее изобретение посредством ссылки.
Уровень техники
Большинство пациентов с гематологическими злокачественными опухолями или солидными опухолями на поздней стадии не излечиваются с использованием стандартной терапии. Кроме того, традиционные способы лечения часто имеют серьезные побочные эффекты. Были предприняты многочисленные попытки задействовать иммунную систему пациента для отторжения раковых клеток, этот подход обобщенно называется иммунотерапией рака. Однако ряд обстоятельств затрудняет достижение клинической эффективности. Несмотря на то что были выявлены сотни так называемых опухолевых антигенов, они часто происходят из аутоантигенов и, соответственно, могут направлять иммунотерапию рака против здоровой ткани или обладают низкой иммуногенностью. Кроме того, раковые клетки используют множество механизмов, чтобы сделать себя невидимыми или враждебными по отношению к инициации и распространению иммунной атаки в результате действия иммунотерапевтических способов лечения рака. Последние разработки с использованием терапии на основе аутологичных Т-клеток, модифицированных химерным антигенным рецептором (CAR), которая опирается на перенаправление генетически модифицированных Т-клеток на подходящую молекулу на поверхности раковых клеток, демонстрируют обнадеживающие результаты в использовании возможностей иммунной системы для лечения Bклеточных злокачественных опухолей (см., например, Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)). Клинические результаты, полученные при использовании CD19-специфичных CAR Т-клеток (называемых CTL019), продемонстрировали полную ремиссию у пациентов, страдающих хроническим лимфобластным лейкозом (CLL), а также при детском остром лимфобластном лейкозе (ALL) (см., например, Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)). Альтернативный подход заключается в применении альфа-цепи и бета-цепи Тклеточного рецептора (TCR), выбранных на основании специфичности в отношении ассоциированного с опухолью пептидного антигена, для генетической модификации аутологичных Т-клеток. Указанные цепи TCR будут образовывать полные комплексы TCR и обеспечат получение Т-клеток, несущих TCR со вторым видом определенной специфичности. Обнадеживающие результаты были получены при использовании модифицированных аутологичных Т-клеток, экспрессирующих NY-ESO-1-специфичные альфацепи и бета-цепи TCR, у пациентов с синовиальной карциномой. Помимо способности генетически модифицированных Т-клеток, экспрессирующих CAR или второй TCR, распознавать и вызывать гибель соответствующих клеток-мишеней в условиях in vitro/ex vivo, успешное лечение пациентов с использованием модифицированных Т-клеток требует наличия Т-клеток, которые способны к сильной активации, пролиферации и устойчивости в течение продолжительного периода времени и, в случае рецидивирующего заболевания, генерации ответа памяти. Высокая и контролируемая клиническая эффективность Тклеток, несущих CAR, в настоящее время ограничена CD19-положительными В-клеточными злокачественными опухолями и возможностью применения у пациентов с синовиальной саркомой, экспрессирующей пептид NY-ESO-1 и HLA-A2. Существует очевидная потребность в улучшении генетически модифицированных Т-клеток для более широкого применения против различных злокачественных опухолей человека. В настоящем изобретении предложены новые гибридные белки субъединиц TCR, включая CD3-эпсилон, CD3-гамма и CD3-дельта, а также альфа-цепи и бета-цепи TCR со связывающими доменами, специфичными в отношении клеточных поверхностных антигенов, которые могут преодолеть ограничения существующих подходов. В настоящем изобретении предложены новые гибридные белки, которые более эффективно вызывают гибель клеток-мишеней, чем CAR, однако высвобождают сопоставимые или более низкие уровни провоспалительных цитокинов. Указанные гибридные белки и способы их применения обеспечивают преимущества для TFP по сравнению с CAR, поскольку повышенные уровни указанных цитокинов связаны с ограничивающей дозу токсичностью для ряда видов адоптивной CAR-T терапии.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении предложены гибридные белки (TFP) Т-клеточного рецептора (TCR), Тклетки, модифицированные для экспрессии одного или более TFP, и способы их применения для лечения заболеваний.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR, содержащую по меньшей мере часть внеклеточного домена TCR, и внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена CD3-эпсилон; и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, причем указанная субъединица TCR и домен антитела функционально связаны и при этом указанный TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR, содержащую по
- 1 035618 меньшей мере часть внеклеточного домена TCR, и внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена CD3-гамма; и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, причем указанная субъединица TCR и домен антитела функционально связаны и при этом указанный TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR, содержащую по меньшей мере часть внеклеточного домена TCR, и внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена CD3-дельта; и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, причем указанная субъединица TCR и домен антитела функционально связаны и при этом указанный TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR, содержащую по меньшей мере часть внеклеточного домена TCR, и внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена TCR-альфа; и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, причем указанная субъединица TCR и домен антитела функционально связаны и при этом TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR, содержащую по меньшей мере часть внеклеточного домена TCR, и внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена TCR-бета; и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, причем указанная субъединица TCR и домен антитела функционально связаны и при этом TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, который представляет собой CD19-связывающий домен.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок (TFP) T-клеточного рецептора (TCR), содержащий субъединицу TCR и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий В-клеточный антиген созревания (ВСМА). В некоторых случаях субъединица TCR и домен антитела функционально связаны. В некоторых случаях TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке. В некоторых случаях кодируемый антигенсвязывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR посредством линкерной последовательности. В некоторых случаях кодируемая линкерная последовательность содержит (G4S)n где n=1-4. В некоторых случаях субъединица TCR содержит внеклеточный домен TCR. В некоторых случаях субъединица TCR содержит трансмембранный домен TCR. В некоторых случаях субъединица TCR содержит внутриклеточный домен TCR. В некоторых случаях субъединица TCR содержит (i) внеклеточный домен TCR, (ii) трансмембранный домен TCR, и (iii) внутриклеточный домен TCR, причем по меньшей мере два из (i), (ii) и (iii) получены из одной и той же субъединицы TCR. В некоторых случаях субъединица TCR содержит внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен, выбранный из внутриклеточного сигнального домена СОЗ-эпсилон. CD3-гамма или CD3-дельта, или аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации. В некоторых случаях субъединица TCR содержит внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен, выбранный из функционального сигнального домена 4-1ВВ и/или функционального сигнального домена СОЗ-дзета, или аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну модификацию. В некоторых случаях домен антитела человека или гуманизированного антитела содержит фрагмент антитела. В некоторых случаях домен антитела человека или гуманизированного антитела содержит scFv или домен VH. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует (i) гипервариабельный участок (CDR) 1 легкой цепи (LC), LC CDR2 и LC CDR3 аминокислотной последовательности СО19-связывающего домена легкой цепи, которые на 70-100% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 29, соответственно, и/или (ii) CDR1 тяжелой цепи (НС), НС CDR2 и НС CDR3 аминокислотной последовательности СО19-связывающего домена тяжелой цепи, которые на 70-100% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 35 соответственно. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 49, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 49. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой
- 2 035618 кислоты кодирует вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 51, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 51. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует (i) CDR1 легкой цепи (LC), LC CDR2 и LC CDR3 аминокислотной последовательности ВСМА-связывающего домена легкой цепи, которая на 70-100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 41, соответственно, и/или (ii) CDR1 тяжелой цепи (НС), НС CDR2 и НС CDR3 аминокислотной последовательности ВСМА-связывающего домена тяжелой цепи, которая на 70-100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 47 соответственно. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 53, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 53. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 55, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 55. В некоторых случаях TFP содержит внеклеточный домен субъединицы TCR, который содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, субъединицы СЭЗ-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR, субъединицы CD3-дельта TCR, их функциональных фрагментов и аминокислотных последовательностей, содержащих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях кодируемый TFP содержит трансмембранный домен, который содержит трансмембранный домен белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, субъединицы CD3-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR, субъединицы CD3-дельта TCR, их функциональных фрагментов и аминокислотных последовательностей, содержащих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях кодируемый TFP содержит трансмембранный домен, который содержит трансмембранный домен из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, дзета-цепи TCR, субъединицы С.'О3-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR, субъединицы CD3-дельта TCR, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, их функциональных фрагментов и их аминокислотных последовательностей, содержащих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В некоторых случаях костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из ОХ40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1ВВ (CD137), и их аминокислотных последовательностей, содержащих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит лидерную последовательность. В некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой иРНК.
В некоторых случаях TFP содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) субъединицы TCR, которая содержит ITAM или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из субъединицы CD3-дзета TCR, субъединицы CD3-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гαмма TCR, субъединицы CD3-дельта TCR, дзета-цепи TCR, цепи рецептора Fc-эпсилон 1, цепи рецептора Fcэпсилон 2, цепи рецептора Fc-гамма 1, цепи рецептора Fc-гамма 2а, цепи рецептора Fc-гамма 2b1, цепи рецептора Fc-гамма 2b2, цепи рецептора Fc-гамма 3а, цепи рецептора Fc-гамма 3b, цепи рецептора Fcбета 1, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79B, CD89, CD278, CD66d, их функциональных фрагментов и их аминокислотных последовательностей, которые содержат по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях ITAM заменяет ITAM CD3гамма, CD3-дельта или CD3-эпсилон. В некоторых случаях ITAM выбран из группы, состоящей из субъединицы CD3-дзетa TCR, субъединицы СО3-эпси.тон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR и субъединицы CD3-дельта TCR, и заменяет различные ITAM, выбранные из группы, состоящей из субъединицы CD3дзета TCR, субъединицы С.'О3-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR и субъединицы CD3-дельта TCR.
В некоторых случаях нуклеиновая кислота содержит аналог нуклеотида. В некоторых случаях аналог нуклеотида выбран из группы, состоящей из 2'-О-метил, 2'-О-метоксиэтил (2'-О-МОЕ), 2'-Оаминопропил, 2'-дезокси, Т-дезокси-2'-фтор, 2'-О-аминопропил (2'-О-АР), 2'-О-диметиламиноэтил (2'-ODMAOE), 2'-O-диметиламинопропил (2'-O-DMAP), Т-О-диметиламиноэтилоксиэтил (2'-O-DMAEOE), 2'O-N-метилацетамидо (2'-O-NMA)-модифицировαнной, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), соединен- 3 035618 ной этиленовыми мостиками нуклеиновой кислоты (ENA), пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), 1',5'ангидрогекситоловой нуклеиновой кислоты (HNA), морфолино, метилфосфонатного нуклеотида, тиолфосфонатного нуклеотида и 2'-фтор-Н3-Р5'-фосфорамидита.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула полипептида, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула TFP, содержащая человеческий или гуманизированный CD19-связывαющий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула TFP, содержащая человеческий или гуманизированный CD19связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR, причем указанная молекула TFP способна функционально взаимодействовать с эндогенным комплексом TCR и/или по меньшей мере одним эндогенным полипептидом TCR.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула TFP, содержащая человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR, причем указанная молекула TFP способна функционально интегрироваться в эндогенный комплекс TCR.
В некоторых случаях выделенная молекула TFP содержит антитело или фрагмент антитела, содержащий человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR. В некоторых случаях CD19-связывающий домен представляет собой scFv или домен VH. В некоторых случаях CD19-связывающий домен содержит тяжелую цепь, которая на 95-100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 51, ее функциональный фрагмент или ее аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций. В некоторых случаях CD19-связывающий домен содержит легкую цепь, которая на 95-100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 49, ее функциональный фрагмент или ее аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций. В некоторых случаях выделенная молекула TFP содержит внеклеточный домен TCR, который содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, субъединицы СЭЗ-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR, субъединицы CD3-дельта TCR, их функциональных фрагментов и их аминокислотных последовательностей, содержащих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях CD19-связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR посредством линкерной последовательности. В некоторых случаях линкерная область содержит (G4S)n, где n=1-4.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула TFP, содержащая человеческий или гуманизированный ВСМА-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула TFP, содержащая человеческий или гуманизированный ВСМАсвязывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR, причем указанная молекула TFP способна функционально взаимодействовать с эндогенным комплексом TCR и/или по меньшей мере одним эндогенным полипептидом TCR.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена выделенная молекула TFP, содержащая человеческий или гуманизированный ВСМА-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR, причем указанная молекула TFP способна функционально интегрироваться в эндогенный комплекс TCR.
В некоторых случаях выделенная молекула TFP содержит антитело или фрагмент антитела, содержащий человеческий или гуманизированный ВСМА-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR. В некоторых случаях ВСМА-связывающий домен представляет собой scFv или домен VH. В некоторых случаях ВСМА-связывающий домен содержит тяжелую цепь, которая на 95-100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 55, ее функциональный фрагмент или ее аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций. В некоторых случаях ВСМА-связывающий домен содержит легкую цепь, которая на 95-100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 53, ее функциональный фрагмент или ее аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, но не более 30 модификаций. В некоторых случаях выделенная молекула TFP содержит внеклеточный домен TCR, который содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, субъединицы СЭЗ-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR, субъединицы CD3-дельта TCR, их функциональных фрагментов и аминокислотных последовательностей, содержащих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций. В некоторых случаях ВСМА-связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR посредством линкерной последовательности. В некоторых случаях линкерная область содержит (G4S)n, где n=1-4. В некоторых случаях выделенная молекула TFP дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В некоторых случаях выделенная молекула TFP дополнительно содержит последовательность, кодирующую внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых случаях выде- 4 035618 ленная молекула TFP дополнительно содержит лидерную последовательность.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TFP согласно настоящему изобретению. В некоторых случаях вектор выбран из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора, вектора на основе вируса саркомы Рауса (RSV) или ретровирусного вектора. В некоторых случаях вектор дополнительно содержит промотор. В некоторых случаях вектор представляет собой вектор, транскрибируемый в условиях in vitro. В некоторых случаях последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит поли(А)-хвост. В некоторых случаях последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит 3'-нетранслируемую область (НТО).
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена клетка, содержащая вектор согласно настоящему изобретению. В некоторых случаях клетка представляет собой Т-клетку человека. В некоторых случаях Т-клетка представляет собой CD8+ или CD4+ Т-клетку. В некоторых случаях клетка дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибирующую молекулу, которая содержит первый полипептид, который содержит по меньшей мере часть ингибирующей молекулы, связанный со вторым полипептидом, который содержит положительный сигнал из внутриклеточного сигнального домена. В некоторых случаях ингибирующая молекула содержит первый полипептид, который содержит по меньшей мере часть PD1, и второй полипептид, содержащий костимулирующий домен и первичный сигнальный домен. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена CD8+ или CD4+ Тклетка человека, содержащая по меньшей мере две молекулы TFP, причем указанные молекулы TFP содержат человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR, при этом указанная молекула TFP способна функционально взаимодействовать с эндогенным комплексом TCR и/или по меньшей мере одним эндогенным полипептидом TCR внутри, вблизи и/или на поверхности CD8+ или CD4+ Т-клетки человека.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен белковый комплекс, содержащий молекулу TFP, содержащую человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR; и по меньшей мере один эндогенный комплекс TCR. В некоторых случаях TCR содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, субъединицы CD3-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR и субъединицы CD3-дельта TCR. В некоторых случаях CD19связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR посредством линкерной последовательности. В некоторых случаях линкерная область содержит (G4S)n, где n=1-4.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен белковый комплекс, содержащий молекулу TFP, содержащую человеческий или гуманизированный ВСМА-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR; и по меньшей мере один эндогенный комплекс TCR.
В некоторых случаях TCR содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR, субъединицы CD3-эпсилон TCR, субъединицы CD3-гамма TCR и субъединицы CD3-дельта TCR. В некоторых случаях ВСМА-связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR посредством линкерной последовательности. В некоторых случаях линкерная область содержит (G4S)n, где n=1-4.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена CD8+ или CD4+ Т-клетка человека, содержащая по меньшей мере два различных белка TFP на белковый комплекс согласно настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ изготовления клетки, включающий трансдукцию Т-клетки вектором согласно настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ получения популяции РНКмодифицированных клеток, включающий введение транскрибируемой в условиях in vitro РНК или синтетической РНК в клетку, причем РНК содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу TFP согласно настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества клетки, экспрессирующей молекулу TFP согласно настоящему изобретению или экспрессирующей полипептидную молекулу согласно настоящему изобретению.
В некоторых случаях клетка представляет собой аутологичную Т-клетку. В некоторых случаях клетка представляет собой аллогенную Т-клетку. В некоторых случаях млекопитающее представляет собой человека. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества молекулы TFP согласно настоящему изобретению, клетки согласно настоящему изобретению или молекулы полипептида согласно настоящему изобретению.
В некоторых случаях заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, выбрано из группы, состоящей из пролиферативного заболевания, рака, злокачественной опухоли, миелодисплазии, миело
- 5 035618 диспластического синдрома, предлейкоза, показания, не относящегося к раку, связанного с экспрессией CD19. В некоторых случаях заболевание представляет собой гематологический рак, выбранный из группы, состоящей из острой В-клеточной лимфоидной лейкемииз (B-ALL), острой Т-клеточной лимфоидной лейкемии (T-ALL), острой лимфобластной лейкемии (ALL); хронической миелогенной лейкемии (CML), хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL), В-клеточной пролимофоцитарной лейкемии, новообразования из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лейкоза ворсистых клеток, мелкоклеточной фолликулярной лимфомы, крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, лимфомы MALT-типа, лимфомы из клеток мантийной зоны, лимфомы из клеток маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии, миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластической лимфомы, новообразования плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, предлейкоза, заболевания, связанного с экспрессией CD19 или ВСМА, и их комбинаций. В некоторых случаях клетки, экспрессирующие молекулу TFP, вводят в комбинации с агентом, который повышает эффективность клетки, экспрессирующей молекулу TFP. В некоторых случаях у млекопитающего высвобождается меньшее количество цитокинов, по сравнению с млекопитающим, которому вводят эффективное количество Т-клетки, экспрессирующей CD19связывающий химерный антигенный рецептор (CAR) или ВСМА-связывающий CAR. В некоторых случаях клетки, экспрессирующие молекулу TFP, вводят в комбинации с агентом, который улучшает один или более побочных эффектов, связанных с введением клетки, экспрессирующей молекулу TFP. В некоторых случаях клетки, экспрессирующие молекулу TFP, вводят в комбинации с агентом, который лечит заболевание, связанное с CD19 или ВСМА.
Согласно одному аспекту выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, выделенная полипептидная молекула согласно настоящему изобретению, выделенный TFP согласно настоящему изобретению, комплекс согласно настоящему изобретению, вектор согласно настоящему изобретению или клетка согласно настоящему изобретению предназначены для использования в качестве лекарственного средства.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения млекопитающего, имеющего заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества молекулы TFP согласно настоящему изобретению, клетки согласно настоящему изобретению или молекулы полипептида согласно настоящему изобретению, причем у указанного млекопитающего высвобождается меньшее количество цитокинов, по сравнению с млекопитающим, которому вводили эффективное количество Т-клетки, экспрессирующей CD19связывающий химерный антигенный рецептор (CAR) или ВСМА-связывающий CAR.
Включение посредством ссылки
Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее изобретение посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была специально и индивидуально указана для включения посредством ссылки.
Краткое описание чертежей
Новые признаки настоящего изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Признаки и преимущества настоящего изобретения будут более понятны на основании нижеследующего подробного описания, в котором представлены иллюстративные варианты реализации, в которых используются принципы настоящего изобретения, и сопровождающие их чертежи.
На фиг. 1 представлена схема, демонстрирующая использование гибридных полипептидов Тклеточного рецептора (TFP) согласно настоящему изобретению. Типичный TFP содержит CD19связывающий scFv и полноразмерный полипептид CD3-эпсилон, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3. При выработке или введении в Т-клетку TFP связывается с другими полипептидами эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR) (показано, что TCR содержит два полипептида CD3-эпсилон, один полипептид CD3-гамма, один полипептид CD3-дельта, два полипептида CD3-дзета, одну альфа-субъединицу TCR и одну бета-субъединицу TCR, где горизонтальный серый сегмент представляет плазматическую мембрану) с образованием перепрограммированного TCR, в котором один или оба эндогенных полипептида СЭЗ-эпсилон замещены TFP.
На фиг. 2А представлена схема, демонстрирующая примерные варианты гибридных полипептидов перепрограммированного Т-клеточного рецептора (TFP) согласно настоящему изобретению. На фиг. 2А представлен примерный перепрограммированный TCR, содержащий TFP, который содержит CD19связывающий scFv и полноразмерный полипептид TCR Va, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3.
На фиг. 2В представлено несколько примерных перепрограммированных TCR, которые содержат несколько TFP, включая i) CD19-связывающий scFv и полноразмерный полипептид TCR Va, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3, и ii) CD19-связывающий scFv и полноразмерный полипептид TCR VP, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3.
- 6 035618
На фиг. 2С представлен примерный перепрограммированный TCR, который содержит несколько
TFP, включая i) CD19-связывающий scFv и усеченный (Δ) полипептид TCR, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3, и ii) CD19-связывαющий scFv и полноразмерный полипептид
CD3-эпсилон, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3. Усеченный (Δ) полипептид TCR усечен путем делеции Va.
На фиг. 2D представлен примерный перепрограммированный TCR, который содержит несколько TFP, включая i) CD19-связывающий scFv и усеченный (Δ) полипептид TCR Va, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3, и ii) CD19-связывaющий scFv и усеченный (Δ) полипептид TCR Υβ, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3. Усеченный (Δ) полипептид TCR усечен путем делеции Υβ.
На фиг. 3 представлена схема, демонстрирующая использование гибридных полипептидов Тклеточных рецепторов (TFP) согласно настоящему изобретению. Примерный TFP содержит CD19связывающий домен VH и полноразмерный полипептид CD3-эпсилон, гибридизованный посредством линкерной последовательности (G4S)3. При выработке Т-клеткой или при введении в Т-клетку TFP связывается с другими полипептидами эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR) (показано, что TCR содержит два полипептида CD3-эпсилон, один полипептид CD3-гамма, один полипептид CD3-дельта, два полипептида CD3-дзета, одну альфа-субъединицу TCR и одну бета-субъединицу TCR, где горизонтальный серый сегмент представляет плазматическую мембрану) с образованием перепрограммированного TCR, в котором один или оба эндогенных полипептида CD3-эпсилон замещены TFP.
На фиг. 4 представлено несколько схем, демонстрирующих конструкции ДНК, кодирующие различные TFP.
На фиг. 5 представлена типичная столбиковая диаграмма поверхностной экспрессии CD19связывающего LL (длинный линкер) TFP на Т-клетках после трансдукции лентивирусом. Эффекторные Т-клетки представляли собой нетрансдуцированные контрольные клетки или были трансдуцированы анти-CD19-28ζ CAR или указанными конструкциями анти-CD19 LL TFP. После размножения в течение 10 дней в присутствии ИЛ-2 экспрессию соответствующего CAR или конструкции TFP на поверхности указанных клеток определяли методом проточной цитометрии.
На фиг. 6 представлена типичная столбиковая диаграмма поверхностной экспрессии CD19связывающего SL (короткий линкер) TFP на Т-клетках после трансдукции лентивирусом. Эффекторные Т-клетки представляли собой нетрансдуцированные контрольные клетки или были трансдуцированы анти-CD19-28ζ CAR или указанными конструкциями анти-CD19 SL TFP. После размножения в течение 7 дней в присутствии ИЛ-2 экспрессию соответствующего CAR или конструкции TFP на поверхности указанных клеток определяли методом проточной цитометрии.
На фиг. 7 представлена типичная столбиковая диаграмма поверхностной экспрессии ВСМАсвязывающего TFP на Т-клетках после трансдукции лентивирусом. Эффекторные Т-клетки представляли собой нетрансдуцированные контрольные клетки или были трансдуцированы конструкциями антиBCMA-CD3ε или αнти-ВСМА-CD3γ TFP. После размножения в течение 10 дней в присутствии ИЛ-2 экспрессию TFP на поверхности указанных клеток определяли методом проточной цитометрии.
На фиг. 8 представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19экспрессирующих клеток-мишеней Raji под действием анти-CD19 LL TFP. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед началом инкубации в течение 18 ч с 1х 104 клетокмишеней Raji при соотношении эффекторные клетки:клетки-мишени (Е:Т), равном 20:1, 10:1 или 5:1. Процент цитотоксичности определяли с помощью количественного исследования цитотоксичности методом проточной цитометрии.
На фиг. 9 представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис ВСМАэкспрессирующих клеток-мишеней RPMI8226 под действием ВСМА-связывающих TFP. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 12 дней перед началом инкубации в течение 4 ч с 1х104 клеток-мишеней RPMI8226 при соотношении Е:Т, равном 10:1 или 5:1. Процент цитотоксичности определяли с помощью количественного исследования цитотоксичности методом проточной цитометрии.
На фиг. 10А представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции αнти-CD19-28ζ CAR в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 CD19-трaнсдуцировaнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 10В представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции анти-CD19-CD3ε LL TFP в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1 х 104 CD19-трαнсдуцировαнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 10С представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19- 7 035618 трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции aHTu-CD19-CD3Y LL TFP в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1 х 104 CD19-трαнсдуцировαнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 10D представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции анти-CD19-TCRα LL TFP в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 CD19-трансдуцировaнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 10Е представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции анти-CD19-TCRβc LL TFP в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 CD19-трансдуцировαнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 10F представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции анти-CD19-TCRα LL TFP в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 CD19-трансдуцировaнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 10G представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции анти-CD19-TCRβ LL TFP в зависимости от времени. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 CD19-трансдуцировαнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 11 представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием конструкции CD19-связывающих TFP. Трансдуцированные эффекторные Т-клетки размножали в течение 7 дней перед инкубацией с 1х104 CD19-трансдуцuровaнных клеток-мишеней линии HeLa. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 12 представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая лизис ВСМАтрансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa под действием ВСМА-связывающих TFP в зависимости от времени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные контрольные клетки или клетки, трансдуцированные анти-BCMA-CD3ε или анти-ВСМА-CD3γ TFP, размножали в течение 7 дней перед инкубацией с 1х104 клеток-мишеней линии HeLa или клеток-мишеней линии HeLaBCMA. Клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности, определяли с помощью количественного исследования RTCA.
На фиг. 13 представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая цитолитическую активность Т-клеток, трансдуцированных различными количествами лентивируса, кодирующего анти-CD19CD3ε LL TFP, в зависимости от времени. Т-клетки, трансдуцированные указанными MOI лентивируса, кодирующего αнти-CD19-CD3ε LL TFP, размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х 104 CD19трансдуцированных клеток-мишеней линии HeLa. Определяли клеточный индекс, свидетельствующий о цитотоксичности.
На фиг. 14 представлена типичная столбиковая диаграмма, отражающая цитолитическую активность Т-клеток, трансфецированных путем электропорации с использованием транскрибируемой в условиях in vitro (IVT) иРНК, кодирующей анти-CD19-CD3ε SL или анти-CD19-CD3γ SL TRuC. Эффекторные Т-клетки трансфецировали путем электропорации активированных мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) транскрибируемой в условиях in vitro (IVT) иРНК, кодирующей контрольный белок GFP, анти-CD19-CD3ε SL или анти-CD19-CD3γ SL TRuC. После размножения в течение 3 дней эффекторные клетки инкубировали в течение 4 ч с 1х 104 клеток Raji или клеток К562 при соотношении Е:Т, равном 10:1. Процент цитотоксичности определяли с помощью количественного исследования цитотоксичности методом проточной цитометрии.
На фиг. 15А представлен типичный график высвобождения ИЛ-2 из Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 LL TFP, в ответ на CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные контрольным CAR, анти-CD19-28ζ, CAT или указанным aнти-CD19 LL TFP, размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х 104 Raji или клеток-мишеней К562. Уровни ИЛ-2 определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
На фиг. 15В представлен типичный график высвобождения ИФН-γ из Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 LL TFP, в ответ на CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные контрольным CAR,
- 8 035618 aHTu-CD19-28Z CAT или указанным aHTu-CD19 LL TFP, размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х 104 клеток-мишеней линии Raji или линии К562. Уровни ИФН-γ определяли с помощью ИФА.
На фиг. 15С представлен типичный график высвобождения ИЛ-2 из Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 LL TFP, в ответ на CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные контрольным CAR, анти-CD19-28ζ CAT или указанным анти-CD19 LL TFP, размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1 х 104 клеток-мишеней линии HeLa или линии CD19-HeLa. Уровни ИЛ-2 определяли с помощью ИФА.
На фиг. 15D представлен типичный график высвобождения ИФН-γ Т-клетками, трансдуцированными анти-CD19 LL TFP, в ответ на CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные контрольным CAR, αнти-CD19-28ζ CAT или указанным анти-CD19 LL TFP, размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 клеток-мишеней линии HeLa или линии CD19-HeLa. Уровни ИФН-γ определяли с помощью ИФА.
На фиг. 16 представлен типичный график высвобождения ИФН-γ Т-клетками, трансдуцированными CD19-связывαющими TFP, в ответ на CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные указанным CD19-связывaющим TFP, размножали в течение 7 дней перед инкубацией с 1 х 104 клеток-мишеней линии HeLa или линии CD19-HeLa. Уровни ИФН-γ определяли с помощью ИФА.
На фиг. 17А представлен типичный график высвобождения ИЛ-2 Т-клетками, трансдуцированными ВСМА-связывающими TFP, в ответ на ВСМА-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Тклетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные антиBCMA-CD3ε или анти-ВСМА-CD3γ TFP, размножали в течение 7 дней перед инкубацией с 1 х 104 клетокмишеней линии HeLa или линии HeLa-BCMA. Выработку ИЛ-2 определяли с помощью платформы 2Plex Luminex.
На фиг. 17В представлен типичный график высвобождения ИФН-γ Т-клетками, трансдуцированными ВСМА-связывающими TFP, в ответ на ВСМА-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Тклетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные антиBCMA-CD3ε или анти-ВСМА-CD3γ TFP, размножали в течение 7 дней перед инкубацией с 1 х 104 клетокмишеней линии HeLa или линии BCMA-HeLa. Выработку ИФН-γ определяли с помощью платформы 2Plex Luminex™.
На фиг. 18 представлен типичный график оценки дегрануляции Т-клеток, трансдуцированных CD19-связывающими TFP, в ответ на CD19-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Т-клетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные анти-CD1928ζ CAR, анти-BCMA-CD3ε LL TFP или анти-ВСМА-CD3γ LL TFP, размножали в течение 14 дней перед инкубацией с 1х104 указанных клеток-мишеней CD19+ve или CD19-ve. Определяли процент CD107+ клеток в пропущенной популяции CD3+CD8+ клеток. Клетки-мишени и эффекторные клетки совместно культивировали в присутствии флуоресцентно-меченного антитела к CD107а. Процент Т-клеток в пропущенной популяции CD3 и CD4/CD8 клеток, которые имели положительные результаты окрашивания поверхностного CD107а, затем определяли методом проточной цитометрии.
На фиг. 19 представлен типичный график оценки дегрануляции Т-клеток, трансдуцированных ВСМА-связывающими TFP, в ответ на ВСМА-экспрессирующие клетки-мишени. Эффекторные Тклетки, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные с использованием 50 MOI анти-ВСМА-CD3ε или анти-ВСМА-CD3γ TFP, размножали в течение 13 дней перед инкубацией с 1х 104 указанных клеток-мишеней BCMA+ve RPMI8226. Определяли процент CD107+ клеток в пропущенной популяции CD3+CD8+ клеток.
На фиг. 20А представлены типичные графики эффективности в условиях in vivo Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 LL TFP, в ксенотрансплантатных моделях генерализованного лейкоза человека. Мышей линии NSG иммунизировали путем внутривенного введения 5х 105 клеток Raji за три дня до адоптивного переноса 5х106 Т-клеток, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные конструкциями анти-CD19-28ζ CAR, анти-CD19-CD3ε LL TFP или αнти-CD19CD3y LL TFP.
На фиг. 20В представлены типичные графики эффективности в условиях in vivo Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19 LL TFP, в ксенотрансплантатных моделях генерализованного лейкоза человека. Мышей линии NSG иммунизировали путем внутривенного введения 1 х 106 клеток Nalm-6 (справа) за три дня до адоптивного переноса 5х106 Т-клеток, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки или клетки, трансдуцированные конструкциями анти-CD19-28ζ CAR, анти-CD19-CD3ε LL TFP или антиCD19-CD3y LL TFP. Сравнение кривых выживания с помощью логарифмического рангового критерия (Мантеля-Кокса) выявило р=0,0001 (группа 4 по сравнению с 1, 2, 3), р=0,0001 (группа 1 по сравнению с 2, 3) и р=0,0004 (группа 2 по сравнению с 3). Сравнение кривых выживания с использованием критерия Грехана-Бреслоу-Уилкоксона выявило р=0,0001 (группа 4 по сравнению с 1, 2, 3), р=0,0001 (группа 1 по
- 9 035618 сравнению с 2, 3) и р=0,000 5 (группа 2 по сравнению с 3).
Подробное описание изобретения
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении описаны выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие гибридный белок Т-клеточного рецептора (TCR) (TFP), который содержат субъединицу TCR и домен антитела человека или гуманизированного антитела, содержащий домен связывания CD19. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъединица TCR содержит внеклеточный домен TCR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъединица TCR содержит трансмембранный домен TCR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъединица TCR содержит внутриклеточный домен TCR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъединица TCR содержит (i) внеклеточный домен TCR, (ii) трансмембранный домен TCR, и (iii) внутриклеточный домен TCR, причем по меньшей мере два из (i), (ii) и (iii) получены из одной и той же субъединицы TCR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъединица TCR содержит внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен, выбранный из внутриклеточного сигнального домена CD3-эпсилон, CD3-гαмма или CD3-дельта, или аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъединица TCR содержит внутриклеточный домен, содержащий стимулирующий домен, выбранный из функционального сигнального домена 4-1ВВ и/или функционального сигнального домена CD3-дзета, или аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения домен антитела человека или гуманизированного антитела содержит фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения домен антитела человека или гуманизированного антитела содержит scFv или домен Vh. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенные молекулы нуклеиновой кислоты содержат (i) CDR1 легкой цепи (LC), LC CDR2 и LC CDR3 из любой аминокислотной последовательности CD19-связывающего домена легкой цепи согласно настоящему изобретению, и/или (ii) CDR1 тяжелой цепи (НС), НС CDR2 и НС CDR3 из любой аминокислотной последовательности CD19-связывающего домена тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 30, 20 или 10 модификаций в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи согласно настоящему изобретению, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 30, 20 или 10 модификаций в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи согласно настоящему изобретению, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения TFP содержит внеклеточный домен субъединицы TCR, который содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи или бета-цепи Тклеточного рецептора, CD3-дельта, CD3-эпсилон или CD3-гамма, или их функционального фрагмента, или аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения кодируемый TFP содержит трансмембранный домен, который содержит трансмембранный домен белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи или бета-цепи TCR, или субъединиц CD3эпсилон, CD3-гамма и CD3-дельта TCR, или их функционального фрагмента, или аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодируемый TFP содержит трансмембранный домен, который содержит трансмембранный домен из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи TCR или CD3-эпсилон, CD3-гамма и CD3-дельта, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154, или их функционального фрагмента, или аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодируемый CD19-связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR с помощью линкерной последовательности. В некоторых случаях кодируемая линкерная последовательность содержит (G4S)n где n=1-4. В некоторых случаях кодируемая линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях кодируемая длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях кодируемая линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях кодируемая короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен. В
- 10 035618 некоторых случаях костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из ОХ40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1,
LfA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1ВВ (CD137), или аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит лидерную последовательность.
В настоящем изобретении также предложены выделенные молекулы полипептида, кодируемого любой из описанных выше молекул нуклеиновых кислот. Согласно другому аспекту в настоящем изобретении также предложены выделенные молекулы гибридного белка Т-клеточного рецептора (TFP), которые содержат человеческий или гуманизированный CD19-связывαющий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенные молекулы TFP содержат антитело или фрагмент антитела, содержащий человеческий или гуманизированный CD19-связывaющий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD19-связывaющий домен представляет собой scFv или домен VH. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения CD19-связывающий домен содержит легкую цепь и тяжелую цепь аминокислотной последовательности согласно настоящем изобретению, или ее функциональный фрагмент, или аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 30, 20 или 10 модификаций в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи согласно настоящему изобретению, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенные молекулы TFP содержат внеклеточный домен TCR, который содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-или бета-цепи Тклеточного рецептора, CD3-дельта, CD3-эпсилон или CD3-гамма, или аминокислотной последовательности, содержащей по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD19-связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR с помощью линкерной последовательности. В некоторых случаях линкерная область содержит (G4S)n, где n=1-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выделенная молекула TFP дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения выделенная молекула TFP дополнительно содержит последовательность, кодирующую внутриклеточный сигнальный домен. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения выделенные молекулы TFP дополнительно содержат лидерную последовательность.
В настоящем изобретении также предложены векторы, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любую из ранее описанных молекул TFP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор выбран из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор дополнительно содержит промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой транскрибируемый в условиях in vitro вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит последовательность поли(А). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит З'-нетранслируемую область (НТО).
В настоящем изобретении также предложены клетки, которые содержат любые из описанных векторов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой Тклетку человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой CD8+ или CD4+ Т-клетку. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибирующую молекулу, которая содержит первый полипептид, который содержит по меньшей мере часть ингибирующей молекулы, связанный со вторым полипептидом, который содержит положительный сигнал из внутриклеточного сигнального домена. В некоторых случаях ингибирующие молекулы содержат первый полипептид, который содержит по меньшей мере часть PD1, и второй полипептид, содержащий костимулирующий домен и первичный сигнальный домен.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены выделенные молекулы TFP, которые содержат человеческий или гуманизированный CD19-связывαющий домен, внеклеточный домен,
- 11 035618 трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR, причем указанная молекула TFP способна функционально взаимодействовать с эндогенным комплексом TCR и/или по меньшей мере одним эндогенным полипептидом TCR.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены выделенные молекулы TFP, которые содержат человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR, причем указанная молекула TFP способна функционально интегрироваться в эндогенный комплекс TCR.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены CD8+ или CD4+ Т-клетки человека, которые содержат по меньшей мере две молекулы TFP, причем указанные молекулы TFP содержат человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR, при этом указанная молекула TFP способна функционально взаимодействовать с эндогенным комплексом TCR и/или по меньшей мере одним эндогенным полипептидом TCR внутри, возле и/или на поверхности CD8+ или CD4+ Т-клеток человека.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены белковые комплексы, которые содержат i) молекулу TFP, содержащую человеческий или гуманизированный CD19-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR; и ii) по меньшей мере один эндогенный комплекс TCR.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения TCR содержит внеклеточный домен или его часть из белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-цепи или бета-цепи Тклеточного рецептора, CD3-дельта, CD3-эпсилон или CD3-гамма. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD19-связывающий домен соединен с внеклеточным доменом TCR с помощью линкерной последовательности. В некоторых случаях линкерная область содержит (G4S)n, где n=1-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3.
В настоящем изобретении также предложены CD8+ или CD4+ Т-клетки человека, которые содержат по меньшей мере два различных белка TFP на любой из описанных белковых комплексов.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложена популяция CD8+ или CD4+ Тклеток человека, при этом Т-клетки популяции, по отдельности или вместе, содержат по меньшей мере две молекулы TFP, причем указанные молекулы TFP содержат человеческий или гуманизированный CD19-связывающий или ВСМА-связывающий домен, внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен TCR, при этом указанная молекула TFP способна функционально взаимодействовать с эндогенным комплексом TCR и/или по меньшей мере одним эндогенным полипептидом TCR внутри, возле и/или на поверхности CD8+ или CD4+ Т-клеток человека.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложена популяция CD8+ или CD4+ Тклеток человека, при этом Т-клетки популяции, по отдельности или вместе, содержат по меньшей мере две молекулы TFP, кодируемые выделенной молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены способы получения клетки, которые включают трансдукцию Т-клеток с использованием описанных векторов.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены способы получения популяции РНК-модифицированных клеток, которые включают введение транскрибируемой в условиях in vitro РНК или синтетической РНК в клетку, при этом РНК содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую описанные молекулы TFP. Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены способы обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, которые включают введение указанному млекопитающему эффективного количества клетки, экспрессирующей описанные молекулы TFP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой аутологичную Тклетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка представляет собой аллогенную Т-клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения млекопитающее представляет собой человека.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены способы лечения млекопитающего, страдающего заболеванием, связанным с экспрессией CD19, которые включают введение указанному млекопитающему эффективного количества клетки, содержащей описанные молекулы TFP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание, связанное с экспрессией CD19, выбрано из пролиферативного заболевания, такого как рак или злокачественная опухоль, или предракового состояния, такого как миелодисплазия, MDS или предлейкоз, или представляет собой показание, не относящее к раку, связанное с экспрессией CD19. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения заболевание представляет собой гематологический рак, выбранный из группы, включающей один или более видов острого лейкоза, включая, но не ограничиваясь ими, острую В-клеточную лимфоидную лейкемию (B-ALL), острую Т-клеточную лимфоидную лейкемию (Т-ALL), острую лимфобластную лейкемию (ALL); один или более видов хронического лейкоза, включая, но не ограничива- 12 035618 ясь ими, хроническую миелогенную лейкемию (CML), хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL); дополнительные виды гематологических раковых заболеваний или гематологических состояний, включая, но не ограничиваясь ими, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, новообразование бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лейкоз ворсистых клеток, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT-типа, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию, миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластическую лимфому, новообразование плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и предлейкоз, которые представляют собой различные гематологические состояния, общим признаком которых является неэффективная выработка (или дисплазия) миелоидных клеток крови, и заболевание, связанное с экспрессией CD19, включая, но не ограничиваясь ими, атипичные или неклассические виды рака, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, экспрессирующие CD19, а также их комбинации.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки, экспрессирующие любую из описанных молекул TFP, вводят в комбинации с агентом, который облегчает один или более побочных эффектов, связанных с введением клеток, экспрессирующих молекулу TFP. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетку, экспрессирующую любую из описанных молекул TFP, вводят в комбинации с агентом, который лечит заболевание, связанное с CD19. В настоящем изобретении также предложена любая из описанных выделенных молекул нуклеиновых кислот, любая из описанных выделенных молекул полипептидов, любой из описанных выделенных TFP, любой из описанных белковых комплексов, любой из описанных векторов или любая из описанных клеток для применения в качестве лекарственного средства.
Определения.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Термин в единственном числе относится к одному или более чем одному (т.е. по меньшей мере одному) грамматическому объекту изделия. В качестве примера, элемент означает один элемент или более одного элемента.
В настоящем изобретении приблизительно может означать плюс или минус менее чем 1 или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более чем 30%, в зависимости от ситуации, и как известно или может быть понятно специалисту в данной области техники.
В настоящем изобретении термин субъект или субъекты или индивидуумы может включать, но не ограничивается ими, млекопитающих, таких как человек или другие млекопитающие, не относящиеся к человеку, например, одомашненные, сельскохозяйственные или дикие животные, а также птиц и водных животных. Пациенты являются субъектами, страдающими или подверженными риску развития заболевания, расстройства или состояния, или иначе нуждающимися в композициях и способах согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении термин лечить или лечение относится к любому из признаков успешности лечения или облегчения заболевания или состояния. Лечение может включать, например, снижение, задержку или облегчение степени тяжести одного или более симптомов заболевания или состояния, или оно может включать уменьшение частоты возникновения симптомов заболевания, дефекта, расстройства или нежелательного состояния и т.п. у пациента. В настоящем изобретении термин лечить или предотвратить иногда относится к способу, который обеспечивает определенный уровень лечения или облегчения заболевания или состояния, а также включает ряд результатов, направленных на эту цель, включая, но не ограничиваясь этим, полное предотвращение состояния.
В настоящем изобретении предотвращение относится к предотвращению заболевания или состояния, например, образования опухоли, у пациента. Например, если индивидуум, который входит в группу риска развития опухоли или другой формы рака, получает лечение с использованием способов согласно настоящему изобретению, и при этом в дальнейшем у него не развивается опухоль или другая форма рака, то у этого индивидуума заболевание было предотвращено, по меньшей мере, в течение продолжительного периода времени.
В настоящем изобретении терапевтически эффективное количество представляет собой количество композиции или ее активного компонента, которое достаточно для того чтобы обеспечить благоприятное действие или иным образом уменьшить вредное, неблагоприятное явление у индивидуума, которому вводят композицию. В настоящем изобретении термин терапевтически эффективная доза означает дозу, которая обеспечивает одно или более желаемых или желательных (например, полезных) действий, для достижения которых ее вводят, введение осуществляют один или более раз в течение заданного периода времени. Точная доза будет зависеть от цели лечения, и будет устанавливаться специалистом в данной области техники с использованием известных способов (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); и Pickar, Dosage Calculations (1999)).
- 13 035618
В настоящем изобретении термин гибридный белок Т-клеточного рецептора (TCR) или TFP включает рекомбинантный полипептид, полученный из различных полипептидов, содержащих TCR, который, как правило, способен i) связываться с поверхностным антигеном на клетках-мишенях, и ii) взаимодействовать с другими полипептидными компонентами интактного комплекса TCR, как правило, при совместном расположении внутри или на поверхности Т-клеток.
В настоящем изобретении термин CD19 относится к белку 19 кластера дифференцировки, который представляет собой антигенную детерминанту, которая детектируется на клетках-предшественниках В-клеточного лейкоза, других злокачественных В-клетках и большинстве клеток линии нормальных Вклеток. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши могут быть найдены в публичной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотная последовательность CD19 человека может быть найдена в UniProt/Swiss-Prot под номером доступа Р15391. Каноническая последовательность полипептида человека CD19 может быть найдена в UniProt под номером доступа Р15391 (или Р15391-1):
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKP
FLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSG
ELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRD
SLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPAR DMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVS AVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLS LPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEP DSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPV ARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSY ENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR (Seq id NO: 1).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая CD19 человека, может быть найдена под номером доступа NM001178098. CD19 экспрессируется на большинстве В-клеточных видов рака, включая, например, ALL, CLL и неходжкинскую лимфому (НХЛ). Другие клетки, которые экспрессируют CD19, представлены ниже в определении заболевания, связанные с экспрессией CD19. CD19 также является ранним маркером нормальных клеток-предшественников В-клеток. См., например, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В одном примере антигенсвязывающий участок TFP распознает и связывает эпитоп в пределах внеклеточного домена белка CD19, который экспрессируется на злокачественной и нормальной В-клетке.
В настоящем изобретении термин ВСМА относится к В-клеточному антигену созревания, также известному как член надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей 17 (TNFRSF17) и белок 269 кластера дифференцировки (CD269), и представляет собой белок, который у человека кодируется геном TNFRSF17. TNFRSF17 представляет собой рецептор клеточной поверхности, который принадлежит к надсемейству рецепторов ФНО, распознающий фактор активации В-клеток (BAFF) (см., например, Laabi et al., EMBO 11 (11): 3897-904 (1992). Этот рецептор экспрессируется в зрелых В-лимфоцитах и может иметь большое значение для развития В-клеток и аутоиммунных реакций. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот человека и мыши могут быть найдены в публичной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотная последовательность ВСМА человека может быть найдена в UniProt/Swiss-Prot под номером доступа Q02223. Каноническая последовательность полипептида ВСМА человека может быть найдена в UniProt под номером доступа Q02223 (или Q02223-1):
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTC
LGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEY
TVEECTCEDCtKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSIS AR (SEQ ID NO: 2).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая ВСМА человека, может быть найдена под номером доступа NM001192. ВСМА экспрессируется на большинстве В-клеточных видов рака, включая, например, лейкоз, лимфомы и множественную миелому. Другие клетки, которые экспрессируют ВСМА, представлены ниже в определении заболевания, связанные с экспрессией ВСМА. Было показано, что этот рецептор специфично связывается с членом надсемейства факторов некроза опухолей 13b (лиганд) (TNFSF13B/TALL-1/BAFF) и приводит к активации NF-kappaB и MAPK8/JNK. Этот рецептор также связывается с различными членами семейства TRAF и тем самым может передавать сигналы для выживания и пролиферации клеток (см., например, Laabi et al., Nucleic Acids Research 22 (7): 1147-54 (1994)). В одном примере антигенсвязывающий участок TFP распознает и связывает эпитоп в пределах внеклеточного домена белка ВСМА, который экспрессируется на злокачественной и нормальной В-клетке.
В настоящем изобретении термин антитело относится к белку или полипептидной последовательности, полученной из молекулы иммуноглобулина, которая специфично связывается с антигеном. Анти- 14 035618 тела могут представлять собой интактные иммуноглобулины поликлонального или моноклонального происхождения или их фрагменты, и могут быть получены из природных или рекомбинантных источников. Термины фрагмент антитела или связывающий домен антитела относятся к по меньшей мере одной части антитела или его рекомбинантных вариантов, которая содержит антигенсвязывающий домен, т.е. к вариабельной области, определяющей антигенную специфичность интактного антитела, которая является достаточной для того чтобы обеспечить распознавание и специфичное связывание фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген и его определенный эпитоп. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, одноцепочечные (sc)Fv (scFv) фрагменты антител, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (VL или VH), домены VHH верблюдовых и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.
Термин scFv относится к гибридному белку, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи непосредственно связаны с помощью короткого гибкого полипептидного мостика, и способны экспрессироваться в виде одной полипептидной цепи, и при этом scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого получен этот фрагмент.
Термин вариабельная область тяжелой цепи или VH применительно к антителу относится к фрагменту тяжелой цепи, которая содержит три CDR, расположенные между фланкирующими участками, известными как каркасные участки, причем указанные каркасные участки, как правило, более высококонсервативны, чем CDR, и образуют каркас для поддержки CDR.
Если не указано иное, в настоящем патенте scFv может содержать вариабельные области VL и VH в любом порядке, например, по отношению к N-концу и С-концу полипептида, scFv может содержать VLлинкер-VH или может содержать VH глинкер-VL.
Часть композиции TFP согласно настоящему изобретению, содержащая антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется как часть непрерывной полипептидной цепи, содержащей, например, фрагмент однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечное антитело (scFv), полученное из мышиного антитела, гуманизированного антитела или антитела человека (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Согласно одному аспекту антигенсвязывающий домен композиции TFP согласно настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В дополнительном аспекте TFP содержит фрагмент антитела, который содержит scFv или sdAb.
Термин тяжелая цепь антитела относится к большей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в природных конформациях, и обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.
Термин легкая цепь антитела относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в природных конформациях. Каппа (к) и лямбда (λ) легкие цепи относятся к двум основным изотипам легкой цепи антитела.
Термин рекомбинантное антитело означает антитело, которое получено с использованием технологии рекомбинантной ДНК, такое как, например, антитело, которое экспрессируется системой экспрессии в бактериофагах или дрожжах. Термин также означает антитело, которое было получено путем синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело и обеспечивающей экспрессию указанного антитела, или аминокислотной последовательности, определяющей антитело, причем последовательность ДНК или аминокислотная последовательность была получена с использованием технологии рекомбинантной ДНК или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области техники. Термин антиген или Ag относится к молекуле, которая способна специфично связываться с антителом или иным образом провоцировать иммунный ответ. Иммунный ответ может включать выработку антител или активацию специфичных иммунологически компетентных клеток или и то и другое.
Специалист в данной области техники поймет, что любая макромолекула, включая практически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Кроме того, антигены могут быть получены из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалист в данной области техники поймет, что любая ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вызывает иммунный ответ, следовательно, кодирует антиген, в соответствии с использованием данного термина в настоящем документе. Кроме того, специалист в данной области техники поймет, что антиген не должен кодироваться исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Очевидно, что настоящее изобретение включает, но не ограничивается ими, применение частичных нуклеотидных последовательностей более чем одного гена, и что подходящие нуклеотидные последовательности сгруппированы в различные комбинации, чтобы кодировать полипептиды, которые вызывают желаемую иммунную реакцию. Кроме того, специалист в данной области техники поймет, что антиген не должен кодироваться геном вообще. Очевидно, что антиген может быть синтезирован или может быть получен из биологического образца, или может представлять собой
- 15 035618 макромолекулу, помимо полипептида. Подходящий биологический образец может включать, но не ограничивается ими, образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами.
Термин противоопухолевое действие относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, например, уменьшение объема опухоли, уменьшение количества опухолевых клеток, уменьшение числа метастазов, увеличение продолжительности жизни, уменьшение пролиферации опухолевых клеток, уменьшение выживаемости опухолевых клеток или улучшение различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. Противоопухолевое действие также может проявляться в виде способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител согласно настоящему изобретению в первую очередь предотвращать возникновение опухоли. Термин аутологичный относится к любому материалу, полученному от одного и того же индивидуума, которому он будет повторно введен позже. Термин аллогенный относится к любому материалу, полученному из разных животных одного и того же вида или от пациента, который не является индивидуумом, которому вводят материал. Двое или более индивидуумов являются аллогенным по отношению друг к другу, когда гены в одном или более локусов не являются идентичными. В некоторых аспектах аллогенный материал от индивидуумов одного и того же вида может отличаться в достаточной степени генетически, чтобы вызвать антигенное взаимодействие.
Термин ксеногенный относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.
Термин рак относится к заболеванию, которое характеризуется быстрым и неконтролируемым размножением аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему к другим частям тела. Примеры различных видов рака описаны в настоящем документе и включают, но не ограничиваются ими, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почек, рак печени, рак мозга, лимфому, лейкоз, рак легких и т.п. Выражения заболевание, связанное с экспрессией CD19 и заболевание, связанное с экспрессией ВСМА включают, но не ограничиваются ими, заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, или состояние, связанное с клетками, которые экспрессируют CD19 или ВСМА, включая, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественная опухоль, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или показание, не относящееся к раку, связанное с клетками, которые экспрессируют CD19 или ВСМА. Согласно одному аспекту рак, связанный с экспрессией CD19 или ВСМА, представляет собой гематологический рак. Согласно одному аспекту гематологический рак представляет собой лейкоз или лимфому. Согласно одному аспекту рак, связанный с экспрессией CD19 или ВСМА, включает различные виды рака и злокачественные опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, например, один или более видов острой лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, например, острую Вклеточную лимфоидную лейкемию, острую Т-клеточную лимфоидную лейкомию (T-ALL); один или более видов хронической лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, CLL или хроническую миелогенную лейкемию (CML). Другие гематологические раковые заболевания или гематологические состояния, связанные с экспрессией CD19, включают, но не ограничиваются ими, например, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, новообразование бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лейкоз ворсистых клеток, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT-типа, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию, миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластическую лимфому, новообразование плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и предлейкоз, которые представляют собой разнородную совокупность гематологических состояний, общим признаком которых является неэффективная выработка (или дисплазия) миелоидных клеток крови, и т.п. Другие заболевания, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА, включают, но не ограничиваются ими, атипичные и/или неклассические виды рака, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА. Показания, не относящие к раку, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА, включают, но не ограничиваются ими, аутоиммунное заболевание (например, волчанку, ревматоидный артрит, колит), воспалительные расстройства (аллергию и астму) и трансплантацию.
Термин консервативные модификации последовательности относится к модификациям аминокислот, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Подходящие консервативные модификации включают замены, добавления и делеции аминокислот. Модификации могут быть введены в антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению с помощью стандартных способов, известных в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот включают те, в которых остаток аминокислоты заменен остатком аминокислоты, имеющим сходную боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислот- 16 035618 ными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Следовательно, один или более остатков аминокислот в TFP согласно настоящему изобретению могут быть заменены другими остатками аминокислот из семейства, имеющего сходные боковые цепи, и измененный TFP может быть исследован с помощью функциональных количественных исследований, описанных в настоящем документе.
Термин стимуляция относится к первичной реакции, индуцируемой путем связывания стимулирующего домена или стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) с его когнатным лигандом, что приводит к передаче сигнала, включая, но не ограничиваясь этим, передачу сигнала с участием комплекса TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать измененную экспрессию определенных молекул и/или реорганизацию структур цитоскелета и т.п.
Термин стимулирующая молекула или стимулирующий домен относится к молекуле или ее части, экспрессируемой Т-клеткой, которая обеспечивает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность(и), которая регулирует первичную активацию комплекса TCR, тем самым стимулируя его, по меньшей мере в отношении некоторых аспектов пути передачи сигналов с участием Т-клеток. Согласно одному аспекту первичный сигнал инициируется, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, нагруженной пептидом, что ведет к индукции Т-клеточного ответа, включая, но не ограничиваясь ими, пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая первичный сигнальный домен), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив пути, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив ITAM. Примеры ITAM, содержащего первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которую можно применять в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, ITAM, полученные из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79B, CD278 (также известного как ICOS) и CD66d.
Термин антигенпредставляющая клетка или АПК относится к клетке иммунной системы, такой как вспомогательная клетка (например, В-клетка, дендритная клетка и т.п.), которая представляет чужеродный антиген в комплексе с молекулами основного комплекса гистосовместимости (ГКГС) на ее поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с использованием своих Т-клеточных рецепторов (TCR). АПК обрабатывают антигены и представляют их Т-клеткам.
В настоящем изобретении термин внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части молекулы. Внутриклеточный сигнальный домен создает сигнал, который стимулирует иммунную эффекторную функцию клетки, содержащей TFP, например, TFP-экспрессирующей Т-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в TFP-экспрессирующей Т-клетке, включают цитолитическую активность и активность Т-хелперов, включая секрецию цитокинов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Типичные первичные внутриклеточные сигнальные домены включают те, которые получены из молекул, ответственных за первичную стимуляцию, или антигензависимую стимуляцию. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий внутриклеточный домен. Типичные костимулирующие внутриклеточные сигнальные домены включают те, которые получены из молекул, ответственных за костимулирующие сигналы, или антигеннезависимую стимуляцию.
Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать ITAM (иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив). Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают, но не ограничиваются ими, ITAM, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гαмма, CD3-дельта, СПЗ-эпсилон. CD5, CD22, CD79a, Cd79B и CD66d DAP10 и DAP12. Термин костимулирующая молекула относится к когнатному партнеру по связыванию на Тклетке, который специфично связывается с костимулирующим лигандом, инициируя тем самым костимулирующий ответ со стороны Т-клеток, такой как, но не ограничиваясь им, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от рецепторов антигена или их лигандов, которые необходимы для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают, но не ограничиваются ими, молекулы ГКГС класса 1, BTLA и лиганд Tollрецептора, а также ОХ40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) и 4-1ВВ (CD137). Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может представлять собой внутриклеточную часть костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула может быть представлена в следующих семействах белков: белки рецептора ФНО, иммуноглобулин-подобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные активирующие лимфоциты молекулы (белки SLAM) и активирующие рецепторы NK-клеток. Примеры подходящих молекул включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), 0x40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7,
- 17 035618
LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 и лиганд, который специфично связывается с CD83, и т.п. Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которой он получен, или его функциональный фрагмент. Термин 4-1ВВ относится к члену надсемейства рецепторов факторов некроза опухолей с аминокислотной последовательностью, представленной в GenBank под номером доступа ААА62478.2, или эквивалентными остатками из вида, отличного от человека, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п.; и костимулирующий домен 4-1ВВ определяют как аминокислотные остатки 214-255 из последовательности, представленной в GenBank под номером доступа ААА62478.2, или эквивалентные остатки из вида, отличного от человека, например мыши, грызуна, обезьяны, человекообразной обезьяны и т.п.
Термин кодирующий относится к природному свойству специфичных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или иРНК, служить в биологических процессах в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (например, рРНК, тРНК и иРНК) или определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, обусловленные указанной аминокислотной последовательностью. Следовательно, ген, кДНК, или РНК, кодирует белок, если транскрипция и трансляция иРНК, соответствующей этому гену, приводит к выработке белка в клетке или другой биологической системе. Кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности иРНК и, как правило, представлена в перечне последовательностей, и некодирующая цепь, использованная в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут быть отнесены к кодирующим белок или другой продукт указанного гена или кДНК.
Если не указано иное, то нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Выражение нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК также может включать интроны в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, в некоторых вариантах, содержит один или более интронов.
Термины эффективное количество или терапевтически эффективное количество используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, описанному в настоящем документе, которое является эффективным для достижения конкретного биологического или терапевтического результата.
Термин эндогенный относится к любому материалу, который получен из организма, клетки, ткани или системы или произведен внутри них.
Термин экзогенный относится к любому материалу, поступившему из организма, клетки, ткани или системы или произведенному вне их.
Термин экспрессия относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности, управляемой промотором.
Термин вектор для переноса относится к композиции соединений, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту и которую можно применять для доставки выделенной нуклеиновой кислоты во внутреннее содержимое клетки. Многочисленные векторы известны в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, связанные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Следовательно, термин вектор для переноса включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Термин также дополнительно включает неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизин, липосома и т.п. Примеры вирусных векторов для переноса включают, но не ограничиваются ими, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированных вирусов, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т.п.
Термин вектор экспрессии относится к вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности, контролирующие экспрессию, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которую экспрессируют. Вектор экспрессии содержит достаточное количество цис-действующих элементов для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут обеспечиваться клеткой-хозяином или в системе экспрессии в условиях in vitro. Векторы экспрессии включают все векторы, которые известны в данной области техники, в том числе космиды, плазмиды (например, лишенные оболочки или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые включают рекомбинантный полинуклеотид.
Термин лентивирус относится к роду семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов, поскольку они способны инфицировать не делящиеся клетки; они могут доставить значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они являются одними из наиболее эффективных векторов для доставки генов. ВИЧ, SIV и FIV являются примерами лентивирусов.
Термин лентивирусный вектор относится к вектору, полученному из по меньшей мере части генома лентивируса, в частности, включая самоинактивирующийся лентивирусный вектор, описанный в
- 18 035618
Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые могут быть использованы в клинических условиях, включают, но не ограничиваются ими, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR™ от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от
Lentigen, и т.п. Неклинические типы лентивирусных векторов также доступны и должны быть известны специалистам в данной области техники.
Термин гомологичный или идентичность относится к идентичности последовательностей субъединиц между двумя полимерными молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновых кислот, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя молекулами полипептидов. В случае если положение субъединицы в обеих молекулах занято аналогичной мономерной субъединицей, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными в этом положении. Гомология между двумя последовательностями является прямой функцией числа совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере, который содержит десять субъединиц в длину) положений в двух последовательностях являются гомологичными, то две последовательности на 50% гомологичны; если 90% положений (например, 9 из 10) совпадают или гомологичны, то две последовательности на 90% гомологичны.
Гуманизированные формы антител из вида, отличного от человека (например, мыши), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина вида, отличного от человека. По большей части, гуманизированные антитела и фрагменты таких антител представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из гипервариабельного участка (CDR) реципиента заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющим требуемую специфичность, аффинность и активность. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками из вида, отличного от человека. Кроме того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемых CDR или каркасных последовательностях. Эти модификации могут дополнительно улучшить и оптимизировать функциональность антитела или фрагмента. В целом гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из областей CDR соответствуют таковым иммуноглобулина из вида, отличного от человека, и все или значительная часть FR представляют собой участки из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.
Термин человеческий или полностью человеческий относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, когда вся молекула получена от человека или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной антителу или иммуноглобулину человека.
Термин выделенный означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, которые обнаруживаются у живого животного в природных условиях, не являются выделенными, однако аналогичная нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сопутствующих материалов в его природном состоянии, являются выделенными. Выделенная нуклеиновая кислота или белок может существовать в по существу очищенной форме или может существовать в неприродной среде, такой как, например, клетка-хозяин.
Применительно к настоящему изобретению для часто встречающихся оснований нуклеиновых кислот используются следующие сокращения. А относится к аденозину, С относится к цитозину, G относится к гуанозину, Т относится к тимидину и U относится к уридину.
Термин функционально связанный или транскрипционный контроль относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, что приводит к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут быть смежными друг с другом и, например, если необходимо соединить две области, кодирующие белки, находятся в одной и той же рамке считывания.
Термин парентеральное введение иммуногенной композиции включает, например, подкожную (п/к), внутривенную (в/в), внутримышечную (в/м) или интрастернальную инъекцию, внутриопухолевое введение или методики инфузий. Термин нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одно- 19 035618 или двухцепочечной форме. Если конкретно не ограничено, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют аналогичные связывающие свойства, как и эталонная нуклеиновая кислота, и которые метаболизируются аналогично природным нуклеотидам.
Если не указано иное, то конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно включает консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также последовательность, указанную в явном виде. В частности, замены вырожденных кодонов могут быть достигнуты путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или более из выбранных (или всех) кодонов заменено неоднозначными основаниями и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:9198 (1994)).
Термины пептид полипептид и белок используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из остатков аминокислот, ковалентно соединенных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, при этом максимальное количество аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида, не ограничено. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. В настоящем изобретении термин относится к коротким цепям, которые также обычно называются в данной области техники пептидами, олигопептидами и олигомерами, например, и к более длинным цепям, которые обычно называются в данной области техники белками, которых существует много типов. Полипептиды содержат, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, гибридные белки, помимо всего прочего. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.
Термин промотор относится к последовательности ДНК, которая распознается аппаратом транскрипции клетки или введенным синтетическим молекулярным аппаратом, и необходима для инициирования специфичной транскрипции полинуклеотидной последовательности.
Термин промотор/регуляторная последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая необходима для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях указанная последовательность может быть основной промоторной последовательностью, при этом в других случаях указанная последовательность также может включать последовательность энхансера и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Промотор/регуляторная последовательность может, например, представлять собой последовательность, которая экспрессирует продукт гена в ткани специфичным образом.
Термин конститутивный промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, при наличии функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает выработку генного продукта в клетке в большинстве или во всех физиологических условиях клетки.
Термин индуцируемый промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, при наличии функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает выработку генного продукта в клетке по существу, только если в клетке присутствует индуктор, который соответствует промотору.
Термин тканеспецифичный промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая, при наличии функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, вызывает выработку генного продукта в клетке по существу, только если клетка представляет собой клетку из типа ткани, соответствующей промотору.
Термины линкер и гибкий полипептидный линкер, применительно к scFv, относятся к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как остатки глицина и/или серина, используемых по отдельности или в комбинации, предназначенному для соединения вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибкий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и содержит аминокислотную последовательность (Gly-GlyGly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число равное или больше 1. Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибкие полипептидные линкеры включают, но не ограничиваются ими, (Gly4Ser)4 или (Gly4Ser)3. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкеры содержат множественные повторы (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser). Линкеры, описанные в WO2012/138475 (включен в настоящий документ посредством ссылки), также включены в объем настоящего изобретения. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3.
- 20 035618
В настоящем изобретении 5'-кэп (также называемый РНК-кэп, РНК-7-метилгуанозиновый кэп или PHK-m7G-K3n) представляет собой модифицированный гуаниновый нуклеотид, который был добавлен к началу или на 5'-конце эукариотической матричной РНК вскоре после старта транскрипции. 5'-кэп состоит из терминальной группы, которая соединена с первым транскрибируемым нуклеотидом. Его присутствие является очень важным для распознавания рибосомой и защиты от РНКазы. Добавление кэпа связано с транскрипцией и происходит котранскрипционно так, что каждый процесс влияет на другой. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой иРНК связывается с кэп-синтезирующим комплексом, связанным с РНК-полимеразой. Этот ферментный комплекс катализирует химические реакции, которые необходимы для кэппирования иРНК. Синтез протекает как многостадийная биохимическая реакция. Кэппирующий фрагмент может быть модифицирован, чтобы модулировать функциональность иРНК, например, стабильность или эффективность трансляции.
В настоящем изобретении транскрибируемая в условиях in vitro РНК относится к РНК, предпочтительно иРНК, которая была синтезирована в условиях in vitro. Как правило, транскрибируемая в условиях in vitro РНК получена из транскрибируемого в условиях in vitro вектора. Транскрибируемый в условиях in vitro вектор содержит матрицу, используемую для получения транскрибируемой в условиях in vitro РНК. В настоящем изобретении поли(А) представляет собой несколько остатков аденозина, прикрепленных с помощью полиаденилирования к иРНК. В предпочтительном варианте реализации конструкции для кратковременной экспрессии последовательность поли(А) содержит от 50 до 5000, предпочтительно более 64, более предпочтительно более 100, наиболее предпочтительно более 300 или 400 оснований. Последовательности поли(А) могут быть модифицированы химическим или ферментативным путем, чтобы модулировать функциональные возможности иРНК, такие как локализация, стабильность и эффективность трансляции.
В настоящем изобретении полиаденилирование относится к ковалентному связыванию полиаденильного фрагмента или его модифицированного варианта с молекулой иРНК. У эукариотических организмов большинство молекул информационной РНК (иРНК) полиаденилированы на 3'-конце. 3'-поли(А) хвост представляет собой длинную последовательность адениновых нуклеотидов (часто несколько сотен), добавленных к пре-иРНК под действием фермента полиаденилатполимеразы. У высших эукариот поли(А) хвост добавляется на транскрипты, которые содержат специфичную последовательность, сигнал полиаденилирования. Последовательность поли(А) и связанный с ней белок помогают защищать иРНК от разрушения экзонуклеазами. Полиаденилирование также имеет большое значение для терминации транскрипции, экспорта иРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре сразу после транскрипции ДНК в РНК, но дополнительно также может происходить позже в цитоплазме. После прекращения транскрипции цепь иРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, связанного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется наличием последовательности оснований AAUAAA вблизи сайта расщепления. После расщепления иРНК происходит добавление аденозиновых остатков к свободному 3'-концу в сайте расщепления.
В настоящем изобретении термин кратковременный относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение часов, дней или недель, причем период времени, необходимый для экспрессии, меньше, чем период времени для экспрессии гена, интегрированного в геном или содержащегося в стабильном плазмидном репликоне в клетке-хозяине.
Термин путь передачи сигнала относится к биохимической взаимосвязи между различными сигнальными молекулами, которые участвуют в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Выражение рецептор клеточной поверхности включает молекулу и комплексы молекул, способных принимать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.
Термин субъект включает живые организмы, у которых может быть вызвана иммунная реакция (например, млекопитающих, человека).
Термин по существу очищенная клетка относится к клетке, которая по существу не содержит других типов клеток. По существу очищенная клетка также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в природном состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к гомогенной популяции клеток. В других случаях этот термин относится только к клеткам, которые были отделены от клеток, с которыми они связаны в природном состоянии. В некоторых аспектах клетки культивируют в условиях in vitro. В других аспектах клетки не культивируют в условиях in vitro.
В настоящем изобретении термин терапевтический означает лечение.
Терапевтический эффект достигается путем уменьшения, подавления, ремиссии или эрадикации болезненного состояния.
В настоящем изобретении термин профилактика означает профилактику или защитную обработку в отношении заболевания или болезненного состояния.
Применительно к настоящему изобретению термины опухолевый антиген или антиген гиперпролиферативного расстройства или антиген, связанный с гиперпролиферативным расстройством относятся к антигенам, которые являются общими для конкретных гиперпролиферативных расстройств. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения антигены гиперпролиферативного расстройства
- 21 035618 согласно настоящему изобретению имеют раковое происхождение, включая, но не ограничиваясь ими, первичную или метастатическую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легких, рак печени, НХЛ, лейкозы, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почек и аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы и т.п. Термин трансфецированный, или трансформированный, или трансдуцированный относится к процессу, с помощью которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. Трансфецированная, или трансформированная, или трансдуцированная клетка представляет собой клетку, которая была трансфецирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство. Термин специфично связывается означает антитело, фрагмент антитела или специфичный лиганд, который распознает и связывается с когнатным партнером по связыванию (например, CD19), присутствующим в образце, но который по существу и в значительной степени не распознает или не связывает другие молекулы в образце. Диапазоны: в настоящем документе различные аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона приведено исключительно для удобства и краткости и не должно быть истолковано как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать, как конкретно описывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах данного диапазона. Например, описание диапазона, например, от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные цифровые значения в пределах данного диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, диапазон, например, 95-99% идентичность включает любое значение из 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и включает поддиапазоны, такие как 96-99, 96-98, 96-97, 97-99, 97-98 и 98-99% идентичность. Широта диапазона не является ограничивающим фактором.
Описание
В настоящем изобретении предложены композиции соединений и способы применения для лечения заболевания, такого как рак, с использованием гибридных белков Т-клеточных рецепторов (TCR). В настоящем изобретении гибридный белок Т-клеточного рецептора (TCR) или TFP содержит рекомбинантный полипептид, полученный из различных полипептидов, содержащих TCR, которые, как правило, способны i) связываться с поверхностным антигеном на клетках-мишенях, и ii) взаимодействовать с другими полипептидными компонентами интактного комплекса TCR, как правило, при совместном расположении внутри или на поверхности Т-клеток. TFP согласно настоящему изобретению обеспечивают значительные преимущества по сравнению с химерными антигенными рецепторами. Термин химерный антигенный рецептор или, в другом варианте, CAR относится к рекомбинантному полипептиду, содержащему внеклеточный антигенсвязывающий домен в форме scFv, трансмембранный домен и цитоплазматические сигнальные домены (также называемые в настоящем документе внутриклеточные сигнальные домены), содержащие функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы, определенной ниже. Обычно центральный внутриклеточный сигнальный домен CAR получен из дзета-цепи CD3, которая обычно связана с комплексом TCR. Сигнальный домен CD3-дзета может быть гибридизован с одним или более функциональными сигнальными доменами, полученными из по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, такой как 4-1ВВ (т.е. CD137), CD27 и/или CD28.
Гибридные белки Т-клеточных рецепторов (TCR) (TFP).
В область настоящего изобретения включены рекомбинантные конструкции ДНК, кодирующие TFP, причем указанный TFP содержит фрагмент антитела, который специфично связывается с CD19, например, CD19 человека, при этом последовательность фрагмента антитела является смежной и находится в пределах одной и той же рамки считывания, как и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу TCR или ее часть. В область настоящего изобретения включены рекомбинантные конструкции ДНК, кодирующие TFP, причем указанный TFP содержит фрагмент антитела, который специфично связывается с ВСМА, например, ВСМА человека, при этом последовательность фрагмента антитела является смежной и находится в пределах одной и той же рамки считывания, как и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая субъединицу TCR или ее часть. TFP согласно настоящему изобретению могут связываться с одной или более эндогенных (или, в другом варианте, одной или более экзогенных, или комбинацией эндогенных и экзогенных субъединиц) субъединиц TCR для того чтобы сформировать функциональный комплекс TCR.
Согласно одному аспекту TFP согласно настоящему изобретению содержит специфичный в отношении мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающий домен. Выбор фрагмента зависит от типа и количества антигена-мишени, который характеризует поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен может быть выбран так, чтобы распознавать антиген-мишень, который выступает в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с конкретным болезненным состоянием. Следовательно, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве антигенов-мишеней для антигенсвязывающего домена в TFP согласно настоящему изобретению, включают те, которые связаны с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями; аутоиммунными заболеваниями; и раковыми заболеваниями (например, злокачественными
- 22 035618 заболеваниями).
Согласно одному аспекту TFP-опосредованный Т-клеточный ответ может быть направлен на антиген, представляющий интерес, путем модификации антигенсвязывающего домена в TFP, который специфично связывается с желаемым антигеном.
Согласно одному аспекту часть TFP, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацелен к CD19. В одном аспекте антигенсвязывающий домен нацелен к CD19 человека. Согласно одному аспекту часть TFP, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, нацеленный к ВСМА. В одном аспекте антигенсвязывающий домен нацелен к ВСМА человека.
Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, включая, но не ограничиваясь ими, однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) нанотела, полученного из верблюдовых, а также альтернативный каркас, известный в данной области техники, чтобы функционировать в качестве антигенсвязывающего домена, такой как рекомбинантный домен фибронектина, антикалин, белок DARPIN и т.п. Аналогичным образом, природный или синтетический лиганд, специфично распознающий и связывающий антиген-мишень, может быть использован в качестве антигенсвязывающего домена для TFP. В некоторых случаях получение антигенсвязывающего домена из того же вида, в котором в конечном итоге будет использован TFP, может обеспечить преимущества. Например, антигенсвязывающий домен TFP, содержащий остатки антитела человека или остатки гуманизированного антитела, может обеспечить преимущества при применении у человека.
Следовательно, согласно одному аспекту антигенсвязывающий домен содержит гуманизированное антитело или антитело человека или фрагмент антитела, или антитело или фрагмент антитела мыши. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированный или человеческий CD19- или ВСМА-связывающий домен содержит один или более (например, все три) из гипервариабельного участка легкой цепи 1 (LC CDR1), гипервариабельного участка легкой цепи 2 (LC CDR2) и гипервариабельного участка легкой цепи 3 (LC CDR3) гуманизированного или человеческого CD19- или ВСМА-связывающего домена, описанного в настоящем документе, и/или один или более (например, все три) из гипервариабельного участка тяжелой цепи 1 (НС CDR1), гипервариабельного участка тяжелой цепи 2 (НС CDR2) и гипервариабельного участка тяжелой цепи 3 (НС CDR3) гуманизированного или человеческого CD19-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, гуманизированный или человеческий CD19- или ВСМА-связывающий домен, содержащий один или более, например, все три, LC CDR, и один или более, например все три, НС CDR. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированный или человеческий Cd19-связывающий домен содержит один или более (например, все три) из гипервариабельного участка тяжелой цепи 1 (НС CDR1), гипервариабельного участка тяжелой цепи 2 (НС CDR2) и гипервариабельного участка тяжелой цепи 3 (НС CDR3) гуманизированного или человеческого CD19- или ВСМА-связывающего домена, описанного в настоящем документе, например, гуманизированный или человеческий CD19- или ВСМА-связывающий домен содержит две вариабельные области тяжелой цепи, каждая из которых содержит НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3, описанные в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированный или человеческий CD19- или ВСМА-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела или антитела человека, описанную в настоящем документе, и/или вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела или антитела человека, описанную в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированный или человеческий CD19- или ВСМА-связывающий домен содержит гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи, описанную в настоящем документе, например, по меньшей мере две гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи или вариабельные области тяжелой цепи человека, описанные в настоящем документе.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения CD19- или ВСМА-связывающий домен представляет собой scFv, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения CD19- или ВСМА-связывающий домен (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи согласно настоящему изобретению, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению; и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен) в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи согласно настоящему изобретению, или последовательность, которая на 95-99% идентична аминокислотной последовательности согласно настоящему изобре- 23 035618 тению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированный или человеческий CD19- или ВСМА-связывающий домен представляет собой scFv, и вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, присоединена к вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, описанную в настоящем документе, с помощью линкера, например, линкера, описанного в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гуманизированный CD19- или ВСМА-связывающий домен содержит линкер (Gly4-Ser)n, в котором n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4. Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv может быть, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкервариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3.
Согласно некоторым аспектам антитело из вида, не относящегося к человеку, представляет собой гуманизированное антитело, в котором специфичные последовательности или области антитела модифицированы, чтобы увеличить сходство с антителом, которое вырабатывается у человека в природных условиях, или его фрагментом. Согласно одному аспекту антигенсвязывающий домен является гуманизированным.
Гуманизированное антитело может быть получено с использованием различных способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, прививку CDR (см., например, европейский патент ЕР239400; международную публикацию WO 91/09967 и патенты США № 5225539, 5530101 и 5585089, каждый из которых полностью включен в настоящий патент посредством ссылки), рекомбинацию поверхностных остатков или модификацию поверхности (см., например, европейский патент ЕР592106 и ЕР519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; и Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, каждый из которых полностью включен в настоящий патент посредством ссылки), перестановку цепей (см., например, патент США № 5565332, который полностью включен в настоящий патент посредством ссылки), а также методики, описанные, например, в публикации заявки на патент US2005/0042664, публикации заявки на патент US2005/0048617, патенте США № 6407213, патенте США № 5766886, международной публикации WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J.S., Gene, 150(2):409-10 (1994), и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), которые все полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Обычно каркасные остатки в каркасных участках будут заменены соответствующим остатком из CDR донорного антитела для изменения, например, улучшения, связывания антигена. Подходящие замены в каркасных участках определяют с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, например, путем моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для выявления каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для выявления нестандартных каркасных остатков в конкретных положениях (см., например, работу Queen et al., патент США № 5585089; и Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, которая полностью включена в настоящее изобретение посредством ссылки).
Гуманизированное антитело или фрагмент антитела содержит один или более остатков аминокислот, которые остаются в нем из источника, который не относится к человеку. Указанные аминокислотные остатки, не относящиеся к остаткам человека, часто называют импортными остатками, которые обычно берут из импортного вариабельного домена. Согласно настоящему изобретению гуманизированные антитела или фрагменты антител содержат один или более CDR из молекул иммуноглобулина из вида, не относящегося к человеку, и каркасные участки, в которых аминокислотные остатки, составляющие каркас, получены полностью или в основном из зародышевой линии человека. Несколько методик гуманизации антител или фрагментов антител хорошо известны в данной области техники и по существу могут быть выполнены в соответствии со способом, описанным Winter et al (Jones et al., Nature, 321:522525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), путем замены CDR или последовательностей CDR грызунов соответствующими последовательностями антитела человека, т.е. путем прививки CDR (ЕР 239400; публикация РСТ WO 91/09967, и патенты США № 4816567; 6331415; 5225539; 5530101; 5585089; 6548640, содержание которых полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки). В указанных гуманизированных антителах и фрагментах антител последовательность по существу меньшего размера, чем интактный вариабельный домен человека, заменяли соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. Гуманизированные антитела часто являются антителами человека, в которых некоторые остатки CDR и необязательно некоторые остатки каркасных участков (FR) заменены остатками из аналогичных участков антител гры- 24 035618 зунов. Гуманизация антител и фрагментов антител также может быть достигнута путем рекомбинации поверхностных остатков или модификации поверхности (ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan, 1991, Molecular
Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); и Roguska et al.,
PNAS, 91:969-973 (1994)) или путем рекомбинации целых цепей (патент США № 5565332), содержание которых полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки.
Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых, для использования в получении гуманизированных антител проводят для снижения антигенности. В соответствии с так называемым способом наилучшей подгонки последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу с использованием полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая максимально сходна с последовательностью грызуна, затем принимают в качестве каркасного участка человека (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), содержание которых полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки). В другом способе используют конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Аналогичный каркас может быть использован для нескольких различных гуманизированных антител (см., например, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), содержание которых полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каркасный участок, например, все четыре каркасных участка, вариабельной области тяжелой цепи получен из последовательности зародышевой линии VH4-4-59. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения каркасный участок может содержать одну, две, три, четыре или пять модификаций, например, замен, например, аминокислоты в соответствующей мышиной последовательности. Согласно одному варианту реализации каркасный участок, например, все четыре каркасных участка вариабельной области легкой цепи получены из последовательности зародышевой линии VK3-1.25. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения каркасный участок может содержать одну, две, три, четыре или пять модификаций, например, замен, например, аминокислоты в соответствующей мышиной последовательности.
Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения часть композиции TFP согласно настоящему изобретению, которая содержит фрагмент антитела, является гуманизированной и сохраняет высокую аффинность в отношении антигена-мишени, а также другие благоприятные биологические свойства. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения гуманизированные антитела и фрагменты антител получают с помощью анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и известны специалистам в данной области техники. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов. Проверка таких образцов позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, например, анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном-мишенью. Следовательно, остатки FR могут быть выбраны и объединены из последовательности-реципиента и импортируемой последовательности так, что достигается желаемая характеристика антитела или фрагмента антитела, например, повышенная аффинность в отношении антигена-мишени. В целом остатки CDR непосредственно и наиболее существенно влияют на связывание антигена. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела может сохранять аналогичную антигенную специфичность, как и исходное антитело, например, согласно настоящему изобретению, способность связываться с CD19 человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированное антитело или фрагмент антитела может иметь улучшенную аффинность и/или специфичность связывания с CD19 человека или ВСМА человека.
Согласно одному аспекту CD19- или ВСМА-связывающий домен характеризуется определенными функциональными признаками или свойствами антитела или фрагмента антитела. Например, согласно одному аспекту часть композиции TFP согласно настоящему изобретению, которая содержит антигенсвязывающий домен, специфично связывается с CD19 человека или ВСМА человека. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен имеет сходную или аналогичную специфичность связывания с CD19 человека, как и FMC63 scFv, описанный в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен антигенсвязывающий доменом, содержащий антитело или фрагмент антитела, причем указанный антигенсвязывающий домен специфично связывается с белком CD19 или ВСМА или его фрагментом, при этом антитело или фрагмент антитела содержит вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым аспектам scFv является смежным и находится в пределах одной и той же рамки считывания, как и лидерная последовательность. Согласно одному аспекту CD19- или ВСМА-связывающий домен представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). Согласно одному аспекту CD19-связывαющий домен представляет собой Fv, Fab, (Fab')2 или бифункциональное
- 25 035618 (например, биспецифичное) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). Согласно одному аспекту антитело и его фрагменты связываются с белком CD19 с аффинностью, характерной для антитела дикого типа, или с повышенной аффинностью.
В настоящем изобретении также предложены способы получения антигенсвязывающего домена антитела, специфичного в отношении антигена-мишени (например, CD19, ВСМА или любого антигенамишени, описанного в настоящем документе в другом месте, чтобы нацелить связывающие домены гибридного фрагмента), причем указанный способ позволяет получить путем добавления, удаления, замены или вставки одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности домена VH, описанного в настоящем документе, домен VH, который представляет собой вариант аминокислотной последовательности домена VH, с последующим необязательным комбинированием домена VH, полученного указанным способом, с одним или более доменами VL, и исследованием домена VH или комбинации VH/VL или их комбинации, чтобы выявить конкретный связывающий элемент или антигенсвязывающий домен антитела, специфичный в отношении антигена-мишени, представляющего интерес (например, CD19 или ВСМА), и необязательно с одним или более желаемыми свойствами. В некоторых случаях домены VH и scFv могут быть получены в соответствии со способом, известным в данной области техники (см., например, Bird et al. (1988), Science 242:423-426 и Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883). Молекулы scFv могут быть получены путем соединения областей VH и VL с использованием гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированной длиной и/или аминокислотным составом. Длина линкера может сильно влиять на сворачивание и взаимодействие вариабельных областей в scFv. Действительно, при использовании короткого полипептидного линкера (например, примерно 5-10 аминокислот) внутрицепочечное сворачивание предотвращается. Межцепочное сворачивание также необходимо для сближения двух вариабельных областей, чтобы сформировать функциональный сайт связывания эпитопа. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3. Примеры ориентации и размера линкера описаны, например, в Hollinger et al. 1993, Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикации заявки на патент США 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикации РСТ WO 2006/020258 и WO 2007/024715, содержание которых полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки.
scFv может содержать линкер, содержащий приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более 15 остатков, между областями VL и VH. Линкерная последовательность может содержать любую природную аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкерная последовательность содержит аминокислоты глицин и серин. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкерная последовательность содержит наборы из повторов остатков глицина и серина, такие как (Gly4Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное или большее 1. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения линкер может представлять собой (Gly4Ser)4 или (Gly4Ser)3. Изменение длины линкера может сохранить или повысить активность, что приводит к более высокой эффективности в исследованиях активности. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит длинную линкерную последовательность (LL). В некоторых случаях длинная линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=2-4. В некоторых случаях линкерная последовательность содержит короткую линкерную последовательность (SL). В некоторых случаях короткая линкерная последовательность содержит (G4S)n, где n=1-3.
Стабильность и мутации.
Стабильность CD19- или ВСМА-связывающего домена, например, молекулы scFv (например, растворимого scFv), можно оценить, исходя из биофизических свойств (например, термической стабильности) стандартной контрольной молекулы scFv или полноразмерного антитела. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термическая стабильность гуманизированного scFv или scFv человека больше на приблизительно 0,1, приблизительно 0,25, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1, приблизительно 1,25, приблизительно 1,5, приблизительно 1,75, приблизительно 2, приблизительно 2,5, приблизительно 3, приблизительно 3,5, приблизительно 4, приблизительно 4,5, приблизительно 5, приблизительно 5,5, приблизительно 6, приблизительно 6,5, приблизительно 7, приблизительно 7,5, приблизительно 8, приблизительно 8,5, приблизительно 9, приблизительно 9,5, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15°C, чем исходного scFv в описанных количественных исследованиях. Улучшенная термическая стабильность CD19- или ВСМА-связывающего домена, например, scFv, затем придается полной конструкции CD19-TFP, что приводит к улучшению терапевтических свойств CD19- или ВСМА-связывающей конструкции TFP. Термическая стабильность CD19- или ВСМА-связывающего домена, например, scFv, может быть улучшена по меньшей мере приблизительно на 2 или 3°С, по сравнению со стандартным антителом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термическая стабильность CD19- или ВСМА-связывающего домена, например, scFv, улучшена на 1°С по сравнению со стандартным антителом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термическая стабиль- 26 035618 ность CD19-связывαющего домена, например, scFv, улучшена на 2°С по сравнению со стандартным антителом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термическая стабильность scFv улучшена на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15°С, по сравнению со стандартным антителом. Сравнения могут быть сделаны, например, между молекулами scFv, раскрытыми в настоящем документе, и молекулами scFv или фрагментами Fab антитела, из которого были получены scFv, VH и VL. Термическая стабильность может быть измерена с использованием способов, известных в данной области техники. Например, в одном варианте реализации, может быть измерена TM. Способы измерения TM и другие способы определения стабильности белка более подробно описаны ниже.
Мутации в scFv (возникающие при гуманизации или прямом мутагенезе растворимого scFv) изменяют стабильность scFv и улучшают общую стабильность scFv и CD19- или ВСМА-связывающей конструкции TFP. Стабильность гуманизированного scFv сравнивают с scFv мыши с использованием измерений TM, температуры денатурации и температуры агрегации. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения CD19- или ВСМА-связывающий домен, например, scFv, содержит по меньшей мере одну мутацию, возникшую в процессе гуманизации, так, что мутированный scFv придает повышенную стабильность CD19-связывαющей конструкции TFP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CD19-связывaющий домен, например, scFv, содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мутаций, возникающих в процессе гуманизации, так, что мутированный scFv придает повышенную стабильность конструкции CD19-TFP или BCMA-TFP.
Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения антигенсвязывающий домен TFP содержит аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению, и антигенсвязывающий домен сохраняет желаемые функциональные свойства фрагментов антител к CD19 или к ВСМА, описанных в настоящем документе. В одном конкретном аспекте композиция TFP согласно настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. Согласно другому аспекту указанный фрагмент антитела содержит scFv.
Согласно различным аспектам антигенсвязывающий домен TFP сконструирован путем модификации одной или более аминокислот в одной или обеих вариабельных областях (например, VH и/или VL), например, в пределах одного или более CDR и/или в пределах одного или более каркасных участков. Согласно одному конкретному аспекту композиция TFP согласно настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. Согласно другому аспекту указанный фрагмент антитела содержит scFv.
Специалист в данной области техники поймет, что антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы так, что они будут отличаться по аминокислотной последовательности (например, от дикого типа), но не желаемой активностью. Например, в белок могут быть введены дополнительные нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам в несущественных аминокислотных остатках. Например, остаток заменимой аминокислоты в молекуле может быть заменен остатком другой аминокислоты из семейства со сходными боковыми цепями. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения участок аминокислотной последовательности может быть заменен структурно аналогичным участком последовательности, который отличается по порядку и/или композиции членов семейства со сходными боковыми цепями, например, может быть сделана консервативная замена, в которой остаток аминокислоты заменен остатком аминокислоты, имеющим сходную боковую цепь.
Семейства остатков аминокислот, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бетаразветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Процент идентичности, применительно к двум или более нуклеиновым кислотам или полипептидным последовательностям, относится к двум или более последовательностям, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются по существу идентичными, если две последовательности имеют определенный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, 60% идентичность, необязательно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность определенного участка, или, если не указано иное, всей последовательности), при сравнении и сопоставлении для определения максимального соответствия в окне сравнения, или обозначенного участка, оцененного с помощью одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуальной оценки. Необязательно, идентичность может иметь место на участке, который содержит по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот) в длину, или более предпочтительно на участке, который содержит от 100 до 500 или 1000 или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот) в длину. Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей испытываемую и эталонную последовательности вводятся в компьютер, назначают координаты подпос
- 27 035618 ледовательностей, в случае необходимости, а также назначают параметры алгоритма для программы сопоставления последовательностей. Могут быть использованы параметры программы по умолчанию, или могут быть назначены альтернативные параметры. Затем на основании параметров программы алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательности для испытываемых последовательностей по отношению к эталонной последовательности. Методы сопоставления последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное сопоставление последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии, предложенного Smith and Waterman (1970), Adv. Appl. Math. 2:482c, с помощью алгоритма сопоставления областей гомологии, предложенного Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443, с помощью поиска сходства с использованием метода Pearson and Lipman (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, с помощью компьютерных вариантов реализации указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), или с помощью мануального сопоставления и визуальной оценки (см., например, Brent et al. (2003), Current Protocols in Molecular Biology)). Два примера алгоритмов, которые пригодны для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, включают алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1977), Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; и Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа с помощью BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены модификации аминокислотной последовательности исходного антитела или фрагмента (например, scFv), которые приводят к получению функционально эквивалентных молекул. Например, VH или VL из CD19- или ВСМА-связывающего домена, например, scFv, входящие в состав TFP, могут быть модифицированы, чтобы сохранить по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичность каркасного участка исходной области VH или VL CD19связывающего домена, например, scFv. В настоящем изобретении предложены модификации всей конструкции TFP, например, модификации в одной или более аминокислотных последовательностях различных областей конструкции TFP, чтобы получить функционально эквивалентные молекулы. Конструкция TFP может быть модифицирована, чтобы сохранить по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичность с исходной конструкцией TFP.
Внеклеточный домен.
Внеклеточный домен может быть получен из природного или из рекомбинантного источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого белка, в частности из связанного с мембраной или трансмембранного белка. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения внеклеточный домен способен связываться с трансмембранным доменом. Внеклеточный домен конкретного варианта применения в настоящем изобретении может содержать по меньшей мере внеклеточную область(области), например, из альфа, бета или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, или CD3эпсилон, CD3-гамма или cDз-дельта, или, в другом варианте, CD28, CD45, CD4, CD5, Cd8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154.
Трансмембранный домен.
В целом последовательность TFP содержит внеклеточный домен и трансмембранный домен, кодируемый одной геномной последовательностью. В других вариантах реализации TFP может быть сконструирован так, чтобы содержать трансмембранный домен, который является гетерологичным по отношению к внеклеточному домену TFP. Трансмембранный домен может содержать одну или более дополнительных аминокислот, смежных с трансмембранной областью, например, одну или более аминокислот, связанных с внеклеточной областью белка, из которой был получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или вплоть до 15 аминокислот внеклеточной области), и/или одну или более дополнительных аминокислот, связанных с внутриклеточной областью белка, из которой был получен трансмембранный белок (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или вплоть до 15 аминокислот внутриклеточной области). Согласно одному аспекту трансмембранный домен представляет собой домен, который связан с одним из других используемых доменов TFP. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем замены аминокислот, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одного и того же или различных поверхностных мембранных белков, например, чтобы свести к минимуму взаимодействие с другими членами рецепторного комплекса. Согласно одному аспекту трансмембранный домен способен к гомодимеризации с другим TFP на поверхности TFP-T-клеток. В другом аспекте аминокислотная последовательность трансмембранного домена может быть модифицирована или заменена так, чтобы свести к минимуму взаимодействия со связывающими доменами нативного партнера по связыванию, присутствующего в том же TFP.
Трансмембранный домен может быть получен из природного или из рекомбинантного источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения трансмембранный домен способен передавать сигналы к внутриклеточному домену(ам) всякий раз, когда TFP свя- 28 035618 зывался с мишенью. Трансмембранный домен конкретного варианта применения в настоящем изобретении может содержать по меньшей мере трансмембранную область (области) из, например, альфа, бета или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22,
CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154.
В некоторых случаях трансмембранный домен может быть присоединен к внеклеточной области TFP, например, антигенсвязывающего домена TFP, с помощью шарнирной области, например, шарнирной области белка человека. Например, в одном варианте реализации, шарнирная область может представлять собой шарнирную область иммуноглобулина (Ig) человека, например, шарнирную область IgG4 или шарнирную область CD8a.
Линкеры.
Необязательно, короткий олиго- или полипептидный линкер, содержащий от 2 до 10 аминокислот в длину, может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматической областью TFP. Дублет глицин-серин обеспечивает особенно подходящий линкер. Например, согласно одному аспекту линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер кодируется нуклеотидной последовательностью GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 4).
Цитоплазматический домен.
Цитоплазматический домен TFP может содержать внутриклеточный сигнальный домен, если TFP содержит полипептиды CD3-гамма, дельта или эпсилон; субъединицы TCR-альфа и TCR-бета, как правило, отсутствуют в сигнальном домене. Внутриклеточный сигнальный домен обычно отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был введен TFP. Термин эффекторные функции относится к специализированной функции клетки. Эффекторная функция Т-клеток, например, может представлять собой цитолитическую активность или вспомогательную активность, включая секрецию цитокинов. Следовательно, термин внутриклеточный сигнальный домен относится к части белка, которая передает эффекторный функциональный сигнал и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Несмотря на то что обычно может быть использован полноразмерный внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости использовать всю цепь. В той степени, в которой используется усеченная часть внутриклеточного сигнального домена, такая усеченная часть может быть использована вместо интактной цепи до тех пор, пока она передает эффекторный функциональный сигнал. Термин внутриклеточный сигнальный домен, следовательно, включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи эффекторного функционального сигнала.
Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для использования в TFP согласно настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторы, которые действуют совместно, чтобы инициировать передачу сигнала после связывания антигенного рецептора, а также любое производное или вариант указанных последовательностей и любой рекомбинантной последовательности, которая имеет аналогичную функциональную способность. Как известно, сигналы, которые возникают при участии только TCR, не могут вызвать полную активацию наивных Т-клеток, и необходим вторичный и/или костимулирующий сигнал. Следовательно, можно сказать, что активация наивных Т-клеток опосредована двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антигензависимую первичную активацию посредством TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), а также теми, которые действуют антигеннезависимым способом, чтобы обеспечить вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический домен, например, костимулирующий домен).
Первичный сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR посредством стимулирующего пути или ингибирующего пути. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют стимулирующим путем, могут содержать мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы (ITAM).
Примеры ITAM, содержащих первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые являются особенно пригодными согласно настоящему изобретению, включают домены из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, СОЗ-эпсилон. Cd5, CD22, CD79a, CD79B и CD66d. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения TFP согласно настоящему изобретению содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен из СОЗ-эпсилон. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первичный сигнальный домен содержит модифицированный домен ITAM, например, мутированный домен ITAM, который имеет измененную (например, повышенную или пониженную) активность по сравнению с нативным доменом ITAM. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первичный сигнальный домен содержит модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, оптимизированный и/или усеченный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения первичный сигнальный домен содержит один, два, три, четыре или более мотивов ITAM.
Внутриклеточный сигнальный домен TFP может содержать сигнальный домен СОЗ-дзета по от- 29 035618 дельности или он может быть объединен с любым другим желаемым внутриклеточным сигнальным доменом (доменами), который можно применять в TFP согласно настоящему изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен TFP может содержать часть цепи СЭЗ-эпсилон и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части TFP, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, за исключением антигенного рецептора или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD1, ICOS, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, который специфично связывается с CD83, и т.п. Например, было показано, что костимуляция CD27 усиливает пролиферацию, эффекторную функцию и выживание TFP-T-клеток человека в условиях in vitro и увеличивает устойчивость и противоопухолевую активность Т-клеток человека в условиях in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706).
Внутриклеточные сигнальные последовательности в цитоплазматической части TFP согласно настоящему изобретению могут быть связаны друг с другом в случайном или указанном порядке. Необязательно, короткий олиго- или полипептидный линкер, например, содержащий от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) в длину, может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в качестве подходящего линкера может быть использован дублет глицин-серин. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в качестве подходящего линкера может быть использована отдельная аминокислота, например, аланин или глицин. Согласно одному аспекту TFP-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем документе, может дополнительно содержать второй TFP, например, второй TFP, который содержит другой антигенсвязывающий домен, например, нацеленный к одной и той же мишени (CD19 или ВСМА) или другой мишени (например, CD123). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, если TFP-экспрессирующая клетка содержит два или более различных TFP, то антигенсвязывающие домены различных TFP не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй TFP, может содержать антигенсвязывающий домен первого TFP, например, в виде фрагмента, например, scFv, который не связывается с антигенсвязывающим доменом второго TFP, например антигенсвязывающий домен второго TFP представляет собой VHH.
Согласно другому аспекту TFP-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем документе, может дополнительно экспрессировать другой агент, например, агент, который повышает активность TFPэкспрессирующей клетки. Например, в одном варианте реализации, агент может являться агентом, который ингибирует ингибирующую молекулу. Ингибирующая молекула, например, PD1, может, в некоторых вариантах реализации, уменьшать способность TFP-экспрессирующей клетки вызывать иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2В4 и TGFRe. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент, который ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, связанную со вторым полипептидом, который передает положительный сигнал в клетку, например, с внутриклеточным сигнальным доменом, описанным в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент содержит первый полипептид, например, из ингибирующей молекулы, такой как PD1, LAG3, CTLA4, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4 и TIGIT, или фрагмент любой из указанных молекул (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любой из указанных молекул), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 4-1ВВ, CD27 или CD28, например, описанный в настоящем документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в настоящем документе). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент содержит первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1), и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанного в настоящем документе (например, сигнального домена CD28, описанного в настоящем документе, и/или сигнального домена CD3-дзета, описанного в настоящем документе). PD1 является ингибирующим членом семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных Вклетках, Т-клетках и миелоидных клеток (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Было показано, что два лиганда PD1, PD-L1 и PD-L2, подавляют активацию Т-клеток после связывания с PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 широко экспрессируется в злокачественных опухолях человека (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Подавление иммунитета может быть обращено путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент содержит внеклеточный домен (ВКД) ингибирующей молекулы, например, молекула запрограммированной гибели 1 (PD1) может быть гибридизована с трансмембранным доменом и необязательно внутриклеточным сигнальным доме
- 30 035618 ном, таким как 4-1ВВ и CD3-g3ema (также называемым в настоящем документе как PD1 TFP). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD1 TFP, при использовании в комбинациях с CD19-связывαющим TFP, описанным в настоящем документе, улучшает устойчивость Т-клетки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения TFP представляет собой PD1 TFP, содержащий внеклеточный домен PD1. В другом варианте в настоящем изобретении предложены TFP, содержащие антитело или фрагмент антитела, такой как scFv, который специфично связывается с лигандом молекулы запрограммированной гибели 1 (PD-L1) или лигандом молекулы запрограммированной гибели 2 (PDL2).
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложена популяция TFP-экспрессирующих Т-клеток, например, TFP-T-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция TFP-экспрессирующих Т-клеток содержит смесь клеток, экспрессирующих различные TFP. Например, в одном варианте, популяция TFP-T-клеток может содержать первую клетку, экспрессирующую TFP, содержащий CD19- или ВСМА-связывающий домен, описанный в настоящем документе, и вторую клетку, экспрессирующую TFP, содержащий другой CD19- или ВСМА-связывающий домен, например, CD19- или ВСМА-связывающий домен, описанный в настоящем документе, который отличается от CD19-связывaющего домена в TFP, экспрессированном в первой клетке. В качестве другого примера, популяция TFP-экспрессирующих клеток может содержать первую клетку, экспрессирующую TFP, который содержит CD19- или ВСМА-связывающий домен, например, описанный в настоящем документе, и вторую клетку, экспрессирующую TFP, который содержит антигенсвязывающий домен к мишени, отличной от CD19 или ВСМА (например, к другому, ассоциированному с опухолью антигену).
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложена популяция клеток, в которой по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует TFP, содержащий CD19- или ВСМАсвязывающий домен, описанный в настоящем документе, и вторая клетка, экспрессирующая другой агент, например, агент, который повышает активность TFP-экспрессирующей клетки. Например, в одном варианте реализации, агент может являться агентом, который ингибирует ингибирующую молекулу. Ингибирующая молекула, например, может, в некоторых вариантах реализации, уменьшать способность TFP-экспрессирующей клетки вызывать иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2В4 и TGFRe. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент, который ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, связанную со вторым полипептидом, который передает положительный сигнал в клетку, например, с внутриклеточным сигнальным доменом, описанным в настоящем документе. В настоящем изобретении предложены способы получения транскрибируемой в условиях in vitro РНК, кодирующей TFP. В настоящем изобретении также предложена РНК, кодирующая конструкцию TFP, которая может быть непосредственно трансфецирована в клетку. Способ получения иРНК для использования в трансфекции может включать транскрипцию в условиях in vitro (IVT) матрицы с использованием специально сконструированных праймеров, с последующим добавлением последовательности поли(А), чтобы получить конструкцию, содержащую 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность (НТО), 5'-кэп и/или сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту, которую экспрессируют, и последовательность поли(А), обычно содержащую 50-2000 оснований. РНК, полученная с помощью указанного способа, может эффективно трансфецировать различные виды клеток. Согласно одному аспекту матрица содержит последовательности для TFP. Согласно одному аспекту CD19-связывaющий или ВСМА-связывающий TFP кодируется информационной РНК (иРНК). Согласно одному аспекту настоящего изобретения иРНК, кодирующую CD19-связывающий или ВСМА-связывающий TFP, вводят в Т-клетку для получения TFP-Tклеток. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения транскрибируемая в условиях in vitro РНК TFP может быть введена в клетку в качестве одной из форм кратковременной трансфекции. РНК получают с помощью транскрипции в условиях in vitro с использованием матрицы, полученной с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Представляющая интерес ДНК из любого источника может быть непосредственно преобразована с помощью ПЦР в матрицу для синтеза иРНК в условиях in vitro с использованием соответствующих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может быть, например, геномная ДНК, плазмидная ДНК ДНК фага, кДНК, синтетическая последовательность ДНК или ДНК из любого другого соответствующего источника ДНК. Желаемая матрица для транскрипции в условиях in vitro представляет собой TFP согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ДНК, которая будет использована для ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть получена из природной последовательности ДНК из генома организма. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота может содержать некоторые или все из 5'- и/или 3'-нетранслируемых областей (НТО). Нуклеиновая кислота может содержать экзоны и интроны. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ДНК, которая будет использована для ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека. В другом варианте ДНК, которая будет использована для ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека, включая 5'- и 3'-НТО. В другом варианте ДНК может представлять собой искусственную последовательность ДНК, которая обычно не экспрессируется в организме в при- 31 035618 родных условиях. Типичная искусственная последовательность ДНК представляет собой последовательность, которая содержит участки генов, которые лигированы вместе, чтобы образовать открытую рамку считывания, кодирующую гибридный белок. Участки ДНК, которые лигированы вместе, могут быть получены из одного организма или более чем из одного организма.
ПЦР применяют для получения матрицы для транскрипции в условиях in vitro иРНК, которая используется для трансфекции. Способы проведения ПЦР хорошо известны в данной области техники. Праймеры для использования в ПЦР сконструированы так, чтобы содержать участки, которые являются по существу комплементарными участкам ДНК, которая будет использована в качестве матрицы для ПЦР. В настоящем изобретении термин по существу комплементарны относится к последовательностям нуклеотидов, в которых большинство или все из оснований в последовательности праймера являются комплементарными, или одно или более оснований являются некомплементарными или несовпадающими. По существу комплементарные последовательности могут сплавляться или гибридизоваться с предполагаемой мишенью ДНК в условиях сплавления, используемых для ПЦР. Праймеры могут быть сконструированы так, чтобы быть по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры могут быть сконструированы для амплификации части нуклеиновой кислоты, которая обычно транскрибируется в клетках (открытая рамка считывания), включая 5'- и 3'-НТО. Праймеры также могут быть предназначены для амплификации фрагмента нуклеиновой кислоты, который кодирует определенную область, представляющую интерес. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения праймеры предназначены для амплификации кодирующей области кДНК человека, включая все или части 5'- и 3'-НТО. Праймеры, которые можно применять для ПЦР, могут быть получены с помощью методов синтеза, которые хорошо известны в данной области техники. Прямые праймеры представляют собой праймеры, содержащие область нуклеотидов, которые являются по существу комплементарными нуклеотидам на ДНК-матрице, расположенным выше 5'-конца относительно последовательности ДНК, которая должна быть амплифицирована. В настоящем изобретении термин расположеный выше 5'-конца используется для обозначения положения выше 5'-конца по отношению к последовательности ДНК, подлежащей амплификации, по отношению к кодирующей цепи. Обратные праймеры представляют собой праймеры, содержащие область нуклеотидов, которые по существу комплементарны матрице двухцепочечной ДНК, расположенной ниже 3'-конца относительно последовательности ДНК, которая должна быть амплифицирована. В настоящем изобретении термин расположенный ниже 3'-конца используется для обозначения положения ниже 3'-конца по отношению к последовательности ДНК, подлежащей амплификации, по отношению к кодирующей цепи.
Любая ДНК-полимераза, которую можно применять для ПЦР, может быть использована в способах, описанных в настоящем документе. Реагенты и полимеразы коммерчески доступны из различных источников.
Также могут быть использованы химические структуры, способные усиливать стабильность и/или эффективность трансляции. РНК предпочтительно содержит 5'- и 3'-НТО. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения 5'-НТО содержит от одного до 3000 нуклеотидов в длину. Длина последовательностей 5'- и 3'-НТО, которые будут добавлены к кодирующей области, может быть изменена различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, конструирование праймеров для ПЦР, которые сплавляются с различными участками НТО. Используя этот подход, специалист в данной области техники может модифицировать длины 5'- и 3'-НТО, необходимых для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибированной РНК.
5'- и 3'-НТО могут быть природными, эндогенными 5'- и 3'-НТО для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В другом варианте последовательности НТО, которые не являются эндогенными по отношению к представляющей интерес нуклеиновой кислоте, могут быть добавлены путем включения последовательности НТО в прямой и обратный праймеры или с помощью любых других модификаций матрицы. Использование последовательностей НТО, которые не являются эндогенными по отношению к представляющей интерес нуклеиновой кислоте, может быть пригодным для модификации стабильности и/или эффективности трансляции РНК. Например, как известно, AU-обогащенные элементы в последовательностях 3'-НТО могут уменьшать стабильность иРНК. Следовательно, 3'-НТО могут быть выбраны или сконструированы для повышения стабильности транскрипции РНК на основании свойств НТО, которые хорошо известны в данной области техники.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения 5'-НТО может содержать последовательность Козак из эндогенной нуклеиновой кислоты. В другом варианте если 5'-НТО, которая не является эндогенной по отношению к представляющей интерес нуклеиновой кислоте, добавляют с помощью ПНР, как описано выше, то консенсусная последовательность Козак может быть изменена путем добавления последовательности 5'-НТО. Последовательности Козак могут повысить эффективность трансляции некоторых транскриптов РНК, однако, по видимости, не требуются для всех РНК для обеспечения эффективной трансляции. Необходимость присутствия последовательностей Козак для многих иРНК известна в данной области техники. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения 5'-НТО может представлять собой 5'-НТО из РНК-вируса, РНК-геном которого стабилен в клетках. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения различные нуклеотидные аналоги мо- 32 035618 гут быть использованы в 3' или 5'-НТО, чтобы препятствовать разрушению иРНК экзонуклеазами.
Чтобы обеспечить синтез РНК из ДНК-матрицы без клонирования генов, промотор транскрипции должен быть присоединен к ДНК-матрице выше 5'-конца относительно транскрибируемой последовательности. Если последовательность, которая функционирует в качестве промотора для РНКполимеразы, добавляют к 5'-концу прямого праймера, то промотор РНК-полимеразы включается в продукт ПЦР в выше 5'-конца относительно открытой рамки считывания, которая должна быть транскрибирована. Согласно одному предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения промотор представляет собой промотор полимеразы Т7, описанный в настоящем документе в другом месте. Другие подходящие промоторы включают, но не ограничиваются ими, промоторы РНК-полимеразы Т3 и SP6. Консенсусные нуклеотидные последовательности для промоторов Т7, Т3 и SP6 известны в данной области техники. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения иРНК содержит кэп на 5'-конце и 3'-поли(А) последовательность, которые определяют связывание рибосомы, инициацию трансляции и стабильность иРНК в клетке. На матрице круговой ДНК, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза синтезирует длинный конкатамерный продукт, который не пригоден для экспрессии в эукариотических клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной на конце 3'-НТО, приводит к синтезу иРНК нормального размера, которая не является эффективной при трансфекции в эукариотические клетки, даже если она была полиаденилирована после транскрипции. На матрице линейной ДНК РНК-полимераза фага Т7 может продлить 3'-конец транскрипта после последнего основания матрицы (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)).
Молекулярное клонирование является стандартным способом интеграции участков полиА/Т в матрицу ДНК. Однако последовательность полиА/Т, интегрированная в плазмидную ДНК, может привести к нестабильности плазмиды, поэтому плазмидные ДНК-матрицы, полученные из бактериальных клеток, часто сильно загрязнены делециями и другими аберрациями. Это делает процедуры клонирования не только трудоемкими и длительными, но зачастую и ненадежными. Именно поэтому очень необходим способ, который позволяет конструировать ДНК-матрицы с 3'-концевым участком полиА/Т без использования молекулярного клонирования.
Сегмент полиА/Т транскрипционной матрицы ДНК может быть получен в ходе ПЦР с использованием обратного праймера, содержащего полиТ-хвост, такой как полиТ-хвост, содержащий 100 оснований (размер может составлять 50-5000 Т), или после ПЦР, проведенной любым другим способом, включая, но не ограничиваясь ими, лигирование ДНК или рекомбинацию в условиях in vitro. Поли(А)-хвосты также обеспечивают стабильность РНК и уменьшают их разрушение. Как правило, длина поли(А)-хвоста положительно коррелирует с устойчивостью транскрибированной РНК. В одном из вариантов реализации поли(А)-хвост содержит от 100 до 5000 аденозиновых оснований.
Поли(А)-хвосты РНК могут быть дополнительно продлены после транскрипции в условиях in vitro с использованием поли(А)-полимеразы, такой как поли(А)-полимераза из штамма Е. coli (E-PAP). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения увеличение длины поли(А)-хвоста от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов приводит приблизительно к двукратному увеличению эффективности трансляции РНК. Помимо этого присоединение различных химических групп к 3'-концу может увеличить стабильность иРНК. Подходящие концевые удлинения могут содержать модифицированные/искусственные нуклеотиды, аптамеры и другие соединения. Например, аналоги АТФ могут быть включены в поли(А)-хвост с использованием поли(А)-полимеразы. Аналоги АТФ могут дополнительно повысить стабильность РНК. 5'-Кэпы также обеспечивают стабильность молекул РНК. В предпочтительном варианте реализации РНК, полученные способами, описанными в настоящем документе, содержат 5'-кэп.5'-Кэп обеспечивается с использованием методик, известных в данной области техники и описанных в настоящем документе (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun, 330:958-966 (2005)).
РНК, полученные способами, описанными в настоящем документе, также могут содержать последовательность сайта внутренней посадки рибосомы (IRES). Последовательность IRES может представлять собой любую вирусную, хромосомную или синтетическую последовательность, которая инициирует кэп-независимое связывание рибосомы с иРНК и способствует инициации трансляции. Любые растворенные вещества, пригодные для клеточной электропорации, которые могут содержать факторы, увеличивающие проницаемость и жизнеспособность клетки, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества, могут быть включены. РНК может быть введена в клетки-мишени с использованием любого из ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают, но не ограничиваются ими, электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Кельн, Германия)), (ЕСМ 830 (ВТХ) (Harvard Instruments, Бостон, Массачусетс, США) или Gene Pulser II (BioRad, Денвер, Колорадо, США), Multiporator (Eppendort, Гамбург, Германия), трансфекцию опосредованную катионными липосомами, с использованием липофекции, инкапсуляцию полимерами, опосредованную пептидами трансфекцию или системы для биолистической доставки частиц, такие как генные ружья (см., например, Nishikawa, et al. Hum Gene Then., 12(8):861-70 (2001)).
Конструкции нуклеиновых кислот, кодирующих TFP.
- 33 035618
В настоящем изобретении также предложены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие одну или более конструкций TFP, описанных в настоящем документе. Согласно одному аспекту молекула нуклеиновой кислоты обеспечена в виде транскрипта информационной РНК. Согласно одному аспекту молекула нуклеиновой кислоты обеспечена в виде конструкции ДНК.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие желаемые молекулы, могут быть получены с использованием рекомбинантных способов, известных в данной области техники, таких как, например, скрининг библиотек из клеток, экспрессирующих ген, путем получения гена из вектора, который, как известно, содержит указанный ген, или путем выделения непосредственно из клеток и тканей, содержащих указанный ген, с использованием стандартных методик. В другом варианте представляющий интерес ген может быть получен с помощью способов синтеза, а не клонирования.
В настоящем изобретении также предложены векторы, в которые вставлены ДНК согласно настоящему изобретению. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирусы, являются подходящими инструментами для достижения долгосрочного переноса генов, поскольку они обеспечивают длительную, устойчивую интеграцию трансгена и его распространение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеют дополнительное преимущество по сравнению с векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, поскольку они могут обеспечивать трансдукцию непролиферирующих клеток, таких как гепатоциты. Также их дополнительное преимущество заключается в низкой иммуногенности. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый TFP согласно настоящему изобретению, представляет собой аденовирусный вектор (А5/35). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения экспрессия нуклеиновых кислот, кодирующих TFP, может быть осуществлена с использованием транспозонов, таких как транспозон Спящая красавица, crisper, CAS9 и нуклеазы с доменом цинковые пальцы. См. работу June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки.
Конструкции для экспрессии согласно настоящему изобретению также можно применять для иммунизации нуклеиновой кислотой и для генной терапии с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны в данной области техники (см., например, патенты США № 5399346, 5580859, 5589466, которые полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки). Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен вектор для генной терапии.
Нуклеиновая кислота может быть клонирована в ряд векторов. Например, нуклеиновая кислота может быть клонирована в вектор, включая, но не ограничиваясь ими, плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают векторы экспрессии, векторы репликации, векторы для получения зонда и векторы для секвенирования.
В свою очередь вектор экспрессии может быть введен в клетку в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области техники и описана, например, в Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые можно применять в качестве векторов, включают, но не ограничиваются ими, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В целом подходящий вектор содержит сайт инициации репликации, который является функциональным по меньшей мере в одном организме, последовательность промотора, удобные сайты рестрикции эндонуклеазами и один или более селективных маркеров (например, WO 01/96584, WO 01/29058 и патент США № 6326193).
Целый ряд систем на основе вирусов был разработан для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген может быть введен в вектор и упакован в ретровирусные частицы с использованием способов, известных в данной области техники. Рекомбинантный вирус затем может быть выделен и доставлен к клеткам субъекта в условиях in vivo или ex vivo. Ряд ретровирусных систем известен в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения используются аденовирусные векторы. Ряд аденовирусных векторов известен в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения используются лентивирусные векторы.
Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области, которая локализована на 30-110 пар оснований выше 5'-конца сайта инициации, хотя было показано, что ряд промоторов содержит функциональные элементы, расположенные ниже сайта инициации. Расстояние между промоторными элементами часто является различным, так, что функция промотора сохраняется, если элементы инвертированы или перемещены относительно друг друга. В промоторе тимидинкиназы (ТК) расстояние между элементами промотора может быть увеличено до 50 пар оснований, прежде чем активность начинает снижаться. Как представляется, в зависимости от промотора отдельные элементы могут функционировать совместно или независимо друг от друга, чтобы активировать транскрипцию.
Примером промотора, который способен экспрессировать трансген TFP в Т-клетках млекопитающих, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a стимулирует экспрессию альфа-субъединицы
- 34 035618 комплекса фактора элонгации-1, который отвечает за ферментативную доставку аминоацил-тРНК к рибосоме. Промотор EF1a широко используется в плазмидах экспрессии у млекопитающих, и было показано, что он является эффективными в стимулировании экспрессии TFP из трансгенов, клонированных в лентивирусный вектор (см., например, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)). Другим примером промотора является последовательность промотора немедленных ранних генов цитомегаловируса (ЦМВ). Указанная последовательность промотора представляет собой последовательность сильного конститутивного промотора, способного вызывать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней. Однако также могут быть использованы другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь ими, промотор генов раннего ответа вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор MoMuLV, промотор вируса птичьего лейкоза, промотор генов немедленного раннего ответа вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, но не ограничиваясь ими, промотор актина, промотор миозина, промотор фактора элонгации-1а, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. В дальнейшем настоящее изобретение не должно быть ограничено использованием конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть настоящего изобретения. Применение индуцируемого промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный индуцировать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, если ее экспрессия необходима, или подавить экспрессию, если экспрессия не требуется. Примеры индуцируемых промоторов включают, но не ограничиваясь ими, промотор металлотионеина, промотор глюкокортикоидов, промотор прогестерона и регулируемый тетрациклином промотор.
Для того чтобы оценить экспрессию полипептида TFP или его части, вектор экспрессии, который будет введен в клетку, также может содержать селективный маркерный ген или ген-репортер или оба, чтобы облегчить идентификацию и отбор экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые стремились трансфецировать или инфицировать вирусными векторами. Согласно другим аспектам отдельная часть ДНК может нести селективный маркер, и он может быть использован в процедуре совместной трансфекции. Селективные маркеры и гены-репортеры могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями, чтобы обеспечить экспрессию в клетках-хозяевах. Подходящие селективные маркеры содержат, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т.п.
Г ены-репортеры используют для выявления потенциально трансфецированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. В целом ген-репортер представляет собой ген, который не присутствует или не экспрессируется в организме или ткани реципиента, и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется посредством какого-либо легко детектируемого свойства, например, ферментативной активности. Экспрессию гена-репортера количественно исследуют в подходящее время после введения ДНК в клетки-реципиенты. Подходящие гены-репортеры могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены с использованием известных способов или получены на коммерческой основе. В целом конструкция с минимальной 5'фланкирующей областью, вызывающая высокий уровень экспрессии гена-репортера, определена в качестве промотора. Подходящие промоторные области могут быть связаны с геном-репортером и используются для оценки способности агентов модулировать транскрипцию, инициированную промотором.
Способы введения и экспрессии генов в клетку известны в данной области техники. Применительно к вектору экспрессии, подходящий вектор может быть легко введен в клетку-хозяина, например, клетку млекопитающих, бактерий, дрожжей или насекомых, любым способом, известным в данной области техники. Например, вектор экспрессии может быть перенесен в клетку-хозяина с помощью физических, химических или биологических способов.
Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение с фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т.п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области техники. См., например, Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Предпочтительный способ введения полинуклеотида в клеткухозяина включает трансфекцию фосфатом кальция.
Биологические способы введения полинуклеотида, представляющего интерес, в клетку-хозяина включают использование векторов ДНК и РНК. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым способом для вставки генов в клетки млекопитающих, например, клетки человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивирусов, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т.п. (см., например, патенты США № 5350674 и 5585362).
Химические средства для введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы, и сис
- 35 035618 темы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Типичная коллоидная система для использования в качестве носителя для доставки в условиях in vitro и в условиях in vivo представляет собой липосому (например, везикулу с искусственной мембраной). Доступны другие современные способы нацеленной доставки нуклеиновых кислот, например, доставка полинуклеотидов с использованием нацеленных наночастиц или другой подходящей системы доставки субмикронного размера.
В том случае, если используется невирусная система доставки, типичный носитель для доставки представляет собой липосому. Использование липидных составов предусмотрено в настоящем изобретении для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (в условиях in vitro, в условиях ex vivo или в условиях in vivo). Согласно другому аспекту нуклеиновая кислота может быть связана с липидом. Нуклеиновая кислота, связанная с липидом, может быть инкапсулирована в водном внутреннем содержимом липосомы, диспергирована в липидном бислое липосомы, присоединена к липосоме посредством связывающей молекулы, которая связана как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, включенном в липосому, может находиться в комплексе с липосомой, может быть диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, может быть комбинирована с липидом, может содержаться в виде суспензии в липиде, может содержаться или может быть в комплексе с мицеллой, или может быть связана иным образом с липидом. Композиции, связанные с липидом, липидом/ДНК или липидом/вектором экспрессии, не ограничены какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, указанные композиции могут присутствовать в двухслойной структуре, в виде мицелл или в виде свернутой структуры. Указанные композиции также могут быть просто диспергированы в растворе, возможно, с образованием агрегатов, которые не являются однородными по размеру и форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут быть природными или синтетическими липидами. Например, липиды включают жирные капли, которые естественным образом возникают в цитоплазме, а также класс соединений, которые содержат длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.
Липиды, пригодные для применения, могут быть получены из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин (DMPC) может быть получен из Sigma, Сент-Луис, Миссури, США; дицетилфосфат (DCP) может быть получен из K&K Laboratories (Плейнвью, Нью-Йорк, США); холестерин (Choi) может быть получен из Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин (DMPG) и другие липиды могут быть получены из Avanti Polar Lipids, Inc. (Бирмингем, Алабама, США). Исходные растворы липидов в хлороформе или смеси хлороформ/метанол можно хранить при температуре приблизительно -20°С. Хлороформ используют в качестве единственного растворителя, поскольку он испаряется легче, чем метанол. Липосома это общий термин, охватывающий различные одно- и многослойные липидные носители, образованные путем создания замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы могут быть охарактеризованы как везикулярные структуры с фосфолипидной двухслойной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы имеют множество липидных слоев, разделенных водной средой. Многослойные липосомы образуются спонтанно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Липидные компоненты претерпевают самостоятельную перегруппировку перед образованием замкнутых структур и заключают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Однако в область настоящего изобретения также включены композиции, которые имеют различные структуры в растворе, по сравнению с нормальной везикулярной структурой. Например, липиды могут образовывать мицеллярную структуру или просто существуют в виде негомогенных агрегатов молекул липидов. В область настоящего изобретения также включены комплексы липофектамин-нуклеиновые кислоты.
Независимо от способа, используемого для введения экзогенной нуклеиновой кислоты в клеткухозяина, или иного способа воздействия на клетку ингибитора согласно настоящему изобретению, для того чтобы подтвердить наличие последовательности рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине, можно осуществлять различные количественные исследования. Подходящие количественные исследования включают, например, молекулярно-биологические количественные исследования, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как саузерн-блоттинг и нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; биохимические количественные исследования, такие как детектирование присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, с помощью иммунологических способов (ИФА и вестерн-блоттинга), или с помощью количественных исследований, описанных в настоящем документе для выявления агентов в пределах объема настоящего изобретения.
В настоящем изобретении также предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую TFP. Согласно одному аспекту вектор TFP может быть непосредственно трансдуцирован в клетку, например, в Т-клетку. Согласно одному аспекту вектор представляет собой вектор для клонирования или вектор для экспрессии, например, вектор, включающий, но не ограничивающийся ими, одну или более плазмид (например, плазмид для экспрессии, векторов для клонирования, миниколец, минивекторов, двойных микрохромосом), ретровирусные и лентивирусные векторные конструкции. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения вектор способен экспрессировать конструкцию TFP в Т-клетках млекопитающих. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения Т-клетки
- 36 035618 млекопитающих представляют собой Т-клетки человека.
Источники Т-клеток.
Перед пролиферацией и генетической модификацией источник Т-клеток получают из субъекта. Термин субъект предназначен для включения живых организмов, у которых может быть вызвана иммунная реакция (например, млекопитающих). Примеры субъектов включают человека, собак, кошек, мышей, крыс и их трансгенные виды. Т-клетки могут быть получены из различных источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткань селезенки и опухоли. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения может быть использовано любое число Тклеточных линий, доступных в данной области техники. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения Т-клетки могут быть получены из единицы крови, собранной у субъекта, используя любое число методик, известных специалисту в данной области техники, таких как разделение в градиенте фиколла™. Согласно одному предпочтительному аспекту клетки из циркулирующей крови индивидуума получают путем афереза. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. Согласно одному аспекту клетки, собранные путем афереза, могут быть промыты, чтобы удалить фракцию плазмы и поместить клетки в подходящий буфер или среду для последующих этапов обработки. Согласно одному аспекту настоящего изобретения клетки промывают в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). В другом аспекте промывочный раствор не содержит кальция и может не содержать магния, также могут отсутствовать многие, если не все, двухвалентные катионы. Начальные шаги активации в отсутствие кальция могут привести к повышенной активации. Специалисты в данной области техники легко поймут, что этап промывки можно осуществлять с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, например, с использованием полуавтоматической проточной центрифуги (например, устройства для обработки клеток Cobe 2991, Baxter CytoMate или Haemonetics Cell Saver 5) в соответствии с инструкциями производителя. После промывки клетки могут быть повторно суспендированы в различных биологически совместимых буферах, таких как, например, не содержащий Са и Mg ФСБ, PlasmaLyte А или другой физиологический раствор с добавлением или без буфера. В другом варианте нежелательные компоненты образца после афереза могут быть удалены, и клетки непосредственно ресуспендируют в культуральной среде.
Согласно одному аспекту Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса эритроцитов и истощения моноцитов, например, путем центрифугирования в градиенте Percoll™ или с помощью проточного элютриационного центрифугирования. Конкретная субпопуляция Т-клеток, таких как CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетки, может быть дополнительно выделена с использованием методик положительного или отрицательного отбора. Например, согласно одному аспекту Т-клетки выделяют путем инкубации с гранулами, конъюгированными с антителами к CD3/CD28 (например, 3x28), такими как Dynabeads™ М-450 CD3/CD28 Т, в течение периода времени, достаточного для положительного отбора желаемых Т-клеток. Согласно одному аспекту период времени составляет приблизительно 30 мин. Согласно другому аспекту период времени находится в диапазоне от 30 мин до 36 ч или дольше, и может быть равен любому целому значению в указанном диапазоне. Согласно другому аспекту период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 ч. Согласно другому предпочтительному аспекту период времени составляет от 10 до 24 ч. Согласно одному аспекту период времени инкубации составляет 24 ч. Более длительные периоды инкубации могут быть использованы для выделения Т-клеток в любой ситуации, если присутствует несколько Т-клеток по сравнению с другими типами клеток, например, выделение проникающих в опухоль лимфоцитов (TIL) из опухолевой ткани или у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. В свою очередь, использование более длительных периодов инкубации может повысить эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Следовательно, путем простого уменьшения или удлинения времени инкубации обеспечивают связывание Т-клеток с CD3/CD28гранулами, и/или путем увеличения или уменьшения соотношения количества гранул и Т-клеток (как описано далее в настоящем документе) субпопуляции Т-клеток могут быть подвергнуты предпочтительно положительному или отрицательному отбору при инициации культуры или в других временных точках в ходе процесса отбора. Кроме того, путем увеличения или уменьшения соотношения антител к CD3 и/или антител к CD28 на гранулах или другой поверхности, субпопуляции Т-клеток могут быть подвергнуты предпочтительно положительному или отрицательному отбору при инициации культуры или в других желаемых временных точках. Специалист в данной области техники поймет, что многократные этапы отбора также могут быть использованы применительно к настоящему изобретению. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения желательным может быть проведение отбора и использование неотобранных клеток в процессе активации и размножения. Неотобранная клетка также может быть подвергнута дальнейшим этапам отбора.
Обогащение Т-клеточной популяции путем отрицательной селекции может быть достигнуто с помощью комбинации антител, направленных к поверхностным маркерам, уникальным для отрицательно отобранных клеток. Один из способов заключается в сортировке клеток и/или отборе с помощью отрица
- 37 035618 тельной магнитной иммунной адгезии или проточной цитометрии, при которой используют коктейль из моноклональных антител, направленных к поверхностным маркерам клеток, присутствующим на клетках, отобранных с помощью отрицательной селекции. Например, для обогащения CD4+ клетками путем отрицательной селекции коктейль моноклональных антител, как правило, содержит антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения желательным может оказаться обогащение или положительный отбор регуляторных Т-клеток, которые, как правило, экспрессируют CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ и FoxP3+. В другом варианте согласно некоторым аспектам настоящего изобретения регуляторные Т-клетки истощают с помощью гранул, конъюгированных с антителом к С25, или с помощью другого аналогичного способа отбора.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения может быть отобрана популяция Тклеток, которые экспрессируют один или более из ИФН-γ ФНО-альфа, ИЛ-17А, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ГМКСФ, ИЛ-10, ИЛ-13, гранзима В и перфорина, или другие соответствующие молекулы, например, другие цитокины. Методы скрининга для оценки экспрессии в клетках могут быть определены, например, с помощью способов, описанных в публикации РСТ WO 2013/126712.
Для выделения желаемой популяции клеток с помощью положительного или отрицательного отбора можно варьировать концентрацию клеток и поверхностей (например, частиц, таких как гранул). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения желательным может быть значительное уменьшение объема, в котором смешивают гранулы и клетки (например, увеличение концентрации клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и гранул. Например, согласно одному аспекту используемая концентрация составляет 2 млрд клеток/мл. Согласно одному аспекту используемая концентрация составляет 1 млрд клеток/мл. Согласно другому аспекту используемая концентрация составляет более 100 млн клеток/мл. Согласно другому аспекту используемая концентрация составляет 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 млн клеток/мл. Согласно другому аспекту используемая концентрация составляет 75, 80, 85, 90, 95 или 100 млн клеток/мл. Согласно другому аспекту используемая концентрация составляет 125 или 150 млн клеток/мл. Использование высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации клеток, а также пролиферации клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые слабо экспрессируют антигенымишени, представляющие интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки, или выделять клетки из образцов, в которых присутствуют многие опухолевые клетки (например, клетки крови при лейкозе, опухолевая ткань и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическое значение, и их получение является желательным. Например, использование высокой концентрации клеток обеспечивает более эффективный отбор CD8+ Т-клеток, которые обычно более слабо экспрессируют CD28.
Согласно родственному аспекту желательным может быть использование более низких концентраций клеток. При значительном разбавлении смеси Т-клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы) взаимодействие между частицами и клетками сведено к минимуму. Указанный способ позволяет отбирать клетки, которые экспрессируют большое количество желаемых антигенов, которые будут связаны с частицами. Например, CD4+ Т-клетки экспрессируют более высокие уровни CD28 и захватываются более эффективно, чем CD8+ Т-клетки в разбавленных концентрациях. Согласно одному аспекту используемая концентрация клеток составляет 5х106/мл. Согласно другим аспектам используемая концентрация может составлять приблизительно от 1х105/мл до 1х106/мл, и любое целое значение в указанном диапазоне. Согласно другим аспектам клетки можно инкубировать на ротационном шейкере с различной скоростью в течение различных периодов времени и при 2-10°С или при комнатной температуре. Т-клетки для стимуляции также могут быть заморожены после этапа промывки. Не желая быть связанными соответствием какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения полагают, что замораживание и последующий этап оттаивания обеспечивает более равномерный продукт за счет удаления гранулоцитов и в некоторой степени моноцитов в клеточной популяции. После этапа промывки, на котором происходит удаление плазмы и тромбоцитов, клетки могут быть суспендированы в растворе для замораживания. В то время как многие растворы и параметры замораживания известны в данной области техники и будут пригодны применительно к настоящему изобретению, один способ включает использование ФСБ, содержащего 20% ДМСО и 8% сывороточного альбумина человека, или культуральной среды, содержащей 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% сывороточного альбумина человека и 7,5% ДМСО, или 31,25% Plasmalyte-A, 31,25% декстрозы 5%, 0,45% NaCl, 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% сывороточного альбумина человека и 7,5% ДМСО, или другие подходящие среды для замораживания клеток, содержащие, например, Hespan и PlasmaLyte А, клетки затем замораживают при -80°С со скоростью 1°С/мин и хранят в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота. Могут быть использованы другие способы контролируемого замораживания, а также неконтролируемое немедленное замораживание при -20°С или в жидком азоте. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения криоконсервированные клетки оттаивают и промывают, как описано в настоящем документе, и оставляют на один час при комнатной температуре перед активацией с использованием способов согласно настоящему изобретению. Применительно к настоящему изобретению также предусмотрен сбор образцов крови или продуктов афереза у субъекта в течение некоторого периода времени, до того момента, когда могут по
- 38 035618 требоваться размноженные клетки, описанные в настоящем документе. Следовательно, источник клеток, которые размножают, может быть собран в любой необходимый момент времени, и желаемые клетки, такие как Т-клетки, могут быть выделены и заморожены для дальнейшего использования в Т-клеточной терапии для любого числа заболеваний или состояний, в отношении которых Т-клеточная терапия обеспечит положительный результат, таких как те, которые описаны в настоящем документе. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения образец крови или продукт афереза получают в целом от здорового субъекта. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения образец крови или продукт афереза получают в целом от здорового субъекта, который подвергается риску развития заболевания, но у которого заболевание еще не развилось, и клетки, представляющие интерес, выделяют и замораживают для последующего использования. Согласно некоторым аспектам Т-клетки могут быть размножены, заморожены и использованы в более позднее время. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения образцы собирают у пациента вскоре после диагностики определенного заболевания, описанного в настоящем документе, но до применения каких-либо способов лечения. Согласно другому аспекту клетки выделяют из образца крови или афереза от субъекта до применения любого числа соответствующих способов лечения, включая, но не ограничиваясь ими, обработку агентами, такими как натализумаб, эфализумаб, противовирусными агентами, химиотерапию, облучение, применение иммуносупрессивных агентов, таких как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, мофетил, и FK506, антител или других иммунодеструктивных агентов, таких как САМРАТН, антитела к CD3, цитоксан, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенольная кислота, стероиды, FR901228 и облучение.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения Т-клетки получены от пациента непосредственно после лечения, которое не затрагивает функциональность Т-клеток у субъекта. В связи с этим было отмечено, что после определенных способов лечения рака, в частности, лечения с использованием препаратов, которые повреждают иммунную систему, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты, как правило, восстанавливаются после лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или их способность к пролиферации в условиях ex vivo может быть улучшена. Аналогичным образом, после манипуляции в условиях ex vivo с использованием способов, описанных в настоящем документе, указанные клетки могут быть в предпочтительном состоянии для усиления приживления и пролиферации в условиях in vivo. Следовательно, применительно к настоящему изобретению предусмотрен сбор клеток крови, включая Т-клетки, дендритные клетки или другие клетки ростка кроветворения во время данной фазы восстановления. Кроме того, согласно некоторым аспектам настоящего изобретения мобилизацию (например, мобилизацию с использованием ГМ-КСФ) и схемы кондиционирования можно применять для создания состояния у субъекта, которое является благоприятным для репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или пролиферации конкретных типов клеток, особенно во время определенного промежутка времени после терапии. Иллюстративные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.
Активация и пролиферация Т-клеток.
Т-клетки могут быть активированы и размножены с использованием способов, описанных, например, в патентах США № 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и в публикации заявки на патент США 20060121005. Как правило, Т-клетки согласно настоящему изобретению могут быть размножены за счет контакта с поверхностью, содержащей присоединенный к ней агент, который стимулирует передачу сигнала, связанного с комплексом CD3/TCR, и лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, Т-клеточные популяции могут быть стимулированы, как описано в настоящем документе, например, путем контакта с антителом к CD3, или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем контакта с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в комбинации с кальциевым ионофором. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клетки используют лиганд, который связывается со вспомогательной молекулой. Например, популяция Т-клеток может быть приведена в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Для того чтобы стимулировать пролиферацию CD4+ Т-клеток или CD8+ Т-клеток используют антитело к CD3 и антитело к CD28. Примеры антитела к CD28 включают 9.3, В-Т3, XR-CD28 (Diaclone, Безансон, Франция), также могут быть использованы другие способы, широко известные в данной области техники (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
Т-клетки, которые подверглись воздействию в течение различных периодов времени, могут иметь различные характеристики. Например, типичные клетки крови или продуктов афереза мононуклеарных клеток периферической крови содержат популяцию хелперных Т-клеток (ТН, CD4+), которая превышает популяцию цитотоксических или супрессорных Т-клеток (ТС, CD8+). Пролиферация Т-клеток в условиях ex vivo путем стимуляции рецепторов CD3 и CD28 позволяет получить популяцию Т-клеток, которая приблизительно за 8-9 дней до этого состояла преимущественно из ТН клеток, в то время как приблизительно через 8-9 дней популяция Т-клеток содержит увеличивающуюся популяцию ТС клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения, инфузия субъекту популяции Т-клеток, содержащей преимуще- 39 035618 ственно ТН-клетки, может обеспечить преимущества. Аналогичным образом, если была выделена антигенспецифичная подгруппа ТС-клеток, то более интенсивная пролиферация указанной подгруппы может обеспечить преимущества.
Помимо этого, в дополнение к маркерам CD4 и CD8, экспрессия других фенотипических маркеров значительно различается во время пролиферации клеток, однако в значительной степени является воспроизводимой. Следовательно, подобная воспроизводимость дает возможность адаптировать продукт активированных Т-клеток для конкретных целей.
После конструирования CD19-связывαющего или ВСМА-связывающего TFP различные количественные исследования могут быть использованы для оценки активности молекулы, такой как, но не ограничиваясь этим, способность к пролиферации Т-клеток после антигенной стимуляции, поддержание пролиферации Т-клеток при отсутствии повторной стимуляции, а также различных видов противораковой активности в соответствующих моделях in vitro и животных моделях. Количественные исследования для оценки действия CD19-связывaющих или ВСМА-связывающих TFP более подробно описаны ниже.
Исследование экспрессии TFP в первичных Т-клетках с помощью вестерн-блоттинга можно использовать для детектирования присутствия мономеров и димеров (см., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). В общих чертах, Т-клетки (смесь CD4+ и CD8+ Т-клеток в соотношении 1:1), экспрессирующих TFP, размножали в условиях in vitro в течение более чем 10 дней с последующим лизисом, и проводили электрофорез в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. TFP детектировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела к цепи TCR. Аналогичные подгруппы Т-клеток используют для электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях, чтобы оценить образование ковалентного димера. Пролиферацию TFP+ Т-клеток после стимуляции антигеном в условиях in vitro можно измерить с помощью проточной цитометрии. Например, смесь CD4+ и CD8+ Тклеток стимулируют a-CD3/a-CD28 и АПК с последующей трансдукцией лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP под контролем промоторов, которые будут исследованы. Типичные промоторы включают промоторы генов немедленного раннего ответа ЦМВ, EF-1a, убиквитина С или фосфоглицерокиназы (PGK). Флуоресценцию GFP оценивали на 6-й день культивирования в подгруппах CD4+ и/или CD8+ Т-клеток с помощью проточной цитометрии (см., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). В другом варианте смесь CD4+ и CD8+ Т-клеток стимулируют на 0-й день с использованием магнитных гранул, покрытых a-CD3/a-CD28, и трансдуцируют TFP на 1-й день с использованием бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего TFP наряду с EGFP, используя последовательность проскока рибосомы 2А. Культуры повторно стимулируют клетками CD19+ К562 (К562CD19), клетками К562 дикого типа (К562 дикого типа) или клетками К562, экспрессирующими hCD32 и 4-1BBL, в присутствии антитела к CD3 и антитела к CD28 (K562-BBL-3/28) после промывки. Экзогенный ИЛ-2 добавляют к культурам каждый день в концентрации 100 МЕ/мл. GFP+ Т-клетки подсчитывают с помощью проточной цитометрии с использованием подсчета на основе гранул (см., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)).
Устойчивая пролиферация TFP+ Т-клеток в отсутствие повторной стимуляции также может быть измерена (см., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). В общих чертах, средний объем Т-клетки (фемтолитры (fl)) измеряют на 8-й день культивирования с использованием счетчика частиц Coulter Multisizer III после стимуляции магнитными гранулами, покрытыми a-CD3/a-CD28, на 0й день и трансдукции указанным TFP на 1-й день.
Животные модели также могут быть использованы для измерения активности TFP-T-клеток. Например, ксенотрансплантатная модель с использованием TFP+ Т-клеток, специфичных в отношении CD19 человека, может быть использована для лечения первичного пре-B-ALL человека у мышей с ослабленным иммунитетом (см., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). В общих чертах, после формирования ALL мышей случайным образом распределяют по группам лечения. Различное количество модифицированных Т-клеток совместно инъецируют в соотношении 1:1 мышам линии NOD/SCID/γ-/-, несущим B-ALL. Количество копий каждого вектора в ДНК из селезенки мышей оценивают в различные моменты времени после инъекции Т-клеток. У животных еженедельно оценивают степень тяжести лейкоза. Количество CD19+ B-ALL бластных клеток в периферической крови измеряют у мышей, получавших инъекции α-CD19-дзета TFP+ Т-клеток, или Т-клеток, трансдуцированных контрольной конструкцией. Кривые выживаемости для групп сравнивают с помощью логарифмического рангового критерия. Также может быть проанализировано абсолютное количество CD4+ и CD8+ Тклеток периферической крови через 4 недели после инъекции Т-клеток мышам NOD/SCID/γ-/-. Мышам инъецируют лейкозные клетки и через 3 недели инъецируют Т-клетки, модифицированные для экспрессии TFP с помощью бицистронного лентивирусного вектора, который кодирует TFP, связанный с eGFP. Т-клетки нормируют до 45-50% внесенных GFP+ Т-клеток путем смешивания с Т-клетками, трансдуцированными контрольной конструкцией, перед инъекцией, и подтверждают методом проточной цитометрии. Животных еженедельно обследуют для оценки признаков лейкоза. Кривые выживаемости для групп TFP+ Т-клеток сравнивают с помощью логарифмического рангового критерия.
Может быть проведена оценка дозозависимого ответа на лечение с использованием TFP (см., на
- 40 035618 пример, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Например, периферическую кровь получают через 35-70 дней после развития лейкоза у мышей, которым на 21-й день вводили TFP-T-клетки, эквивалентное количество Т-клеток, трансдуцированных контрольной конструкцией, или не вводили Тклетки. У мышей из каждой группы случайным образом брали кровь для определения количества CD19+ В-ALL бластных клеток периферической крови и затем умерщвляли на 35 и 49 день. Остальных животных оценивали на 57 и 70 день.
Оценка клеточной пролиферации и продукции цитокинов была описана ранее, например, в Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). В общих чертах, оценку TFP-опосредованной пролиферации проводят в планшетах для микротитрования путем смешивания промытых Т-клеток с клетками К562, экспрессирующими CD19 (К19) или CD32 и CD137 (KT32-BBL), чтобы получить окончательное соотношение Т-клетки:К562 равное 2:1. Клетки К562 облучают гамма-излучением перед использованием. Моноклональные антитела к CD3 (клон ОКТЗ) и к CD28 (клон 9.3) добавляют к культурам с клетками KT32-BBL для использования в качестве положительного контроля для стимуляции пролиферации Тклеток, поскольку эти сигналы поддерживают длительную пролиферацию CD8+ Т-клеток в условиях ex vivo. Т-клетки подсчитывают в культурах с использованием флуоресцентных гранул CountBright™ (Invitrogen) и проточной цитометрии, как описано производителем. TFP+ Т-клетки идентифицируют по экспрессии GFP, используя Т-клетки, которые модифицированы с использованием EGFP-2А-соединенных TFP-экспрессирующих лентивирусных векторов. Для TFP+ Т-клеток, не экспрессирующих GFP, TFP+ Тклетки детектируют с использованием биотинилированного рекомбинантного белка CD19 и вторичного конъюгата авидин-фикоэритрин. Экспрессию CD4+ и CD8+ на Т-клетках также одновременно детектируют с использованием специфичных моноклональных антител (BD Biosciences). Измерения цитокинов выполняют в супернатантах, собранных через 24 ч после повторной стимуляции с использованием набора для цитометрического определения цитокинов на основе гранул, специфичных в отношении ТН1/ТН2 человека (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями изготовителя. Флуоресценцию оценивают с помощью проточного цитометра FACSCalibur, и данные анализируют в соответствии с инструкциями изготовителя.
Цитотоксичность можно оценить с помощью стандартного количественного исследования высвобождения изотопа 51Cr (см., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). В общих чертах, клетки-мишени (линии К562 и первичные про-B-ALL клетки) загружают 51Cr (в виде NaCrO4, New England Nuclear) при 37°C в течение 2 ч при частом перемешивании, дважды промывают в полной среде RPMI и высевают на планшеты для микротитрования. Эффекторные Т-клетки смешивают с клетками-мишенями в лунках в полной среде RPMI при различных соотношениях эффекторные клетки:клетки-мишени (Е:Т). Также готовят дополнительные лунки, содержащие только среду (спонтанное высвобождение, SR) или 1% раствор детергента тритон X100 (общее высвобождение, TR). После 4 ч инкубации при 37°С супернатант из каждой лунки собирают. Высвобожденный 51Cr затем измеряют с помощью счетчика гамма-частиц (Packard Instrument Co., Волтем, Массачусетс, США). Эксперименты при каждом условии выполняют по меньшей мере три раза, и процент лизиса вычисляют по следующей формуле: % лизиса=(ER-SR)/(TR-SR), где ER представляет собой среднее количество высвобожденного 51Cr для каждого экспериментального условия.
Визуализирующие технологии могут быть использованы для оценки специфичного перемещения и распространения TFP в животных моделях, несущих опухоли. Такие количественные исследования были описаны, например, в Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). В общих чертах, мышам NOD/SCID/yc-/- (NSG) вводят внутривенно клетки Nalm-6 и через 7 дней вводят Т-клетки, которые за 4 ч перед введением подвергают электропорации конструкциями TFP. Т-клетки, стабильно трансфецированные лентивирусной конструкцией для экспрессии люциферазы светлячка, и мышей подвергают визуализирующим методам исследований для оценки биолюминесценции. В другом варианте терапевтическую эффективность и специфичность однократной инъекции TFP+ Т-клеток в ксенотрансплантатной модели NALM-6 можно измерить следующим образом: мышам линии NSG вводят NALM-6, трансдуцированные для стабильной экспрессии люциферазы светлячка, и затем через 7 дней в хвостовую вену вводят однократную инъекцию Т-клеток после электропорации CD19 TFP. Животных подвергают визуализирующим методам исследований в различные моменты времени после инъекции. Например, у типичных мышей могут быть получены тепловые карты плотности фотонов лейкоза, положительного на наличие люциферазы светлячка, на 5-й день (за 2 дня до лечения) и 8-й день (24 ч после введения TFP + PBL).
Другие количественные исследования, включая те, которые описаны в разделе примеров в настоящем документе, а также те, которые известны в данной области техники, также могут быть использованы для оценки CD19-связывαющей или ВСМА-связывающей конструкции TFP согласно настоящему изобретению.
- 41 035618
Способы терапевтического применения.
Заболевания и/или расстройства, связанные с CD19 или ВСМА.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы лечения заболевания, связанного с экспрессией CD19 или ВСМА. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы лечения заболевания, в котором часть опухоли не экспрессирует CD19 или ВСМА, и часть опухоли экспрессирует CD19 или ВСМА. Например, TFP согласно настоящему изобретению можно применять для лечения субъектов, которые получали лечение заболевания, связанного с повышенным уровнем экспрессии CD19 или ВСМА, причем субъект, который получал лечение повышенных уровней CD19 или ВСМА, имеет заболевание, связанное с повышенным уровнем CD19 или ВСМА.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен вектор, содержащий CD19свзывающий или ВСМА-связывающий TFP, функционально связанный с промотором для экспрессии в Т-клетках млекопитающих. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложена рекомбинантная Т-клетка, экспрессирующая CD19 или ВСМА TFP, для использования в лечении CD19- или ВСМА-экспрессирующих опухолей, причем указанная рекомбинантная Т-клетка, экспрессирующая CD19 или ВСМА TFP, называется CD19 или ВСМА TFP-T. Согласно одному аспекту CD19 или ВСМА TFP-T согласно настоящему изобретению способна вступать в контакт с клеткой опухоли посредством по меньшей мере одного из CD19-связывающего или ВСМА-связывающего TFP согласно настоящему изобретению, экспрессирующегося на ее поверхности так, что TFP-T нацелена на клетку опухоли и рост опухоли ингибируется.
Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста CD19или ВСМА-экспрессирующей опухолевой клетки, включающий приведение клетки опухоли в контакт с CD19 или ВСМА TFP Т-клеткой согласно настоящему изобретению так, что TFP-T активируется в ответ на антиген и нацелено воздействует на раковую клетку, при этом рост опухоли ингибируется. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения рака у субъекта. Способ включает введение субъекту CD19 или ВСМА TFP T-клетки согласно настоящему изобретению так, что у субъекта излечивается рак. Пример рака, который поддается лечению с помощью CD19 или ВСМА TFP Т-клетки согласно настоящему изобретению, включает рак, связанный с экспрессией CD19 или ВСМА. Согласно одному аспекту настоящего изобретения рак, связанный с экспрессией CD19 или ВСМА, представляет собой гематологический рак. Согласно одному аспекту гематологический рак представляет собой лейкоз или лимфу. Согласно одному аспекту рак, связанный с экспрессией CD19, включает разные виды рака и злокачественные опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, например, один или более видов острых лейкемий, включая, но не ограничиваясь ими, например, острую В-клеточную лимфоидную лейкемию (B-ALL), острую Т-клеточную лимфоидную лейкемию (Т-ALL), острую лимфобластную лейкемию (ALL); один или более видов хронической лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, хроническую миелогенную лейкемию (CML), хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL). Дополнительные виды гематологических раковых заболеваний или гематологических состояний, связанных с экспрессией CD19 или ВСМА, включают, но не ограничиваются ими, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, новообразование бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лейкоз ворсистых клеток, мелкоклеточную и крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT-типа, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию, миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, новообразование плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и предлейкоз, которые представляют собой разнородную совокупность гематологических состояний, общим признаком которых является неэффективная выработка (или дисплазия) миелоидных клеток крови, и т.п. Помимо этого заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, включает, но не ограничивается ими, например, атипичные и/или неклассические виды рака, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак, который можно лечить с использованием CD19 или ВСМА TFP, например, описанный в настоящем документе, представляет собой множественную миелому. Множественная миелома представляет собой рак крови, характеризующийся накоплением клона плазматических клеток в костном мозге. Современные способы лечения множественной миеломы включают, но не ограничиваются ими, лечение с использованием леналидомида, который является аналогом талидомида. Леналидомид имеет несколько видов активности, которые включают противоопухолевую активность, ингибирование ангиогенеза и иммуномодуляцию. Как правило, клетки миеломы, как полагают, являются отрицательными в отношении экспрессии CD19 или ВСМА, согласно результатам проточной цитометрии. Настоящее изобретение основывается на том факте, что небольшой процент опухолевых клеток миеломы экспрессирует CD19 или ВСМА. Следовательно, в некоторых вариантах реализации, CD19 или ВСМА TFP, например, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для нацеливания на клетки-мишени миеломы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапия с применением CD19 или ВСМА TFP может быть исполь- 42 035618 зована в комбинации с одним или более дополнительными способами терапии, например, лечением с использованием леналидомида.
В настоящем изобретении предложен тип клеточной терапии, при которой Т-клетки генетически модифицированы для экспрессии TFP, и указанные TFP-экспрессирующие Т-клетки вводят реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная клетка способна вызывать гибель опухолевых клеток реципиента. В отличие от терапии антителами TFP-экспрессирующие Т-клетки способны к репликации в условиях in vivo, это приводит к их долговременному сохранению, что может обеспечить устойчивый контроль опухоли. В различных аспектах Т-клетки, введенные пациенту, или их потомство, сохраняются в организме пациента в течение по меньшей мере четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, двенадцати месяцев, тринадцати месяцев, четырнадцати месяцев, пятнадцати месяцев, шестнадцати месяцев, семнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, девятнадцати месяцев, двадцати месяцев, двадцати одного месяца, двадцати двух месяцев, двадцати трех месяцев, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет после введения Т-клетки пациенту.
В настоящем изобретении также предложен тип клеточной терапии, при которой Т-клетки модифицированы, например, с помощью транскрибируемой в условиях in vitro РНК для кратковременной экспрессии TFP, и TFP-экспрессирующие Т-клетки вводят путем инфузии реципиенту, нуждающемуся в этом. Введенная путем инфузии клетка способна вызвать гибель опухолевых клеток реципиента. Следовательно, в различных аспектах Т-клетки, введенные пациенту, присутствуют в течение менее чем одного месяца, например, в течение трех недель, двух недель или одной недели, после введения Т-клетки пациенту.
Не желая быть связанными соответствием какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения полагают, что противоопухолевый иммунный ответ, вызванный TFP-экспрессирующими Тклетками, может представлять собой активный или пассивный иммунный ответ, или, в другом варианте, может быть связан с соотношением непосредственного иммунного ответа и косвенного иммунного ответа. Согласно одному аспекту TFP-трансдуцированные Т-клетки проявляют специфичную секрецию провоспалительных цитокинов и сильную цитолитическую активность в ответ на раковые клетки человека, экспрессирующие антиген CD19 или ВСМА, являются резистентными к ингибированию растворимым CD19 или ВСМА, опосредуют неспецифичный цитолиз и опосредуют регрессию установленной опухоли человека. Например, не содержащие антиген опухолевые клетки в гетерогенной области CD19экспрессирующей или ВСМА-экспрессирующей опухоли могут быть восприимчивы к косвенному разрушению под действием CD19-перенапрαβленных или ВСМА-перенаправленных Т-клеток, которые ранее взаимодействовали с соседними антигенположительными раковыми клетками. Согласно одному аспекту настоящего изобретения TFP-модифицированные Т-клетки человека согласно настоящему изобретению могут представлять собой тип вакцины для иммунизации в условиях ex vivo и/или терапии в условиях in vivo у млекопитающих. Согласно одному аспекту млекопитающее представляет собой человека. При иммунизации в условиях ex vivo перед введением клетки млекопитающему по меньшей мере один из указанных этапов осуществляют в условиях in vitro: i) пролиферацию клеток, ii) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей TFP, в клетки, или iii) криоконсервацию клеток.
Процедуры в условиях ex vivo хорошо известны в данной области техники и более подробно обсуждаются ниже. В общих чертах, клетки выделяют у млекопитающего (например, человека) и генетически модифицируют (т.е. трансдуцируют или трансфецируют в условиях in vitro) с помощью вектора экспрессии TFP, описанного в настоящем документе. TFP-модифицированные клетки могут быть введены млекопитающему-реципиенту, чтобы обеспечить терапевтическое действие. Млекопитающее-реципиент может представлять собой человека, и TFP-модифицированные клетки могут быть аутологичными по отношению к реципиенту. В другом варианте клетки могут быть аллогенными, сингенными или ксеногенными по отношению к реципиенту.
Процедуру пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников в условиях ex vivo, описанную в патенте США № 5199942, включенном в настоящее изобретение посредством ссылки, можно применять в отношении клеток согласно настоящему изобретению. Другие подходящие способы известны в данной области техники, в этой связи настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным способом пролиферации клеток в условиях ex vivo. В общих чертах, способы культивирования в условиях ex vivo и пролиферации Т-клеток включают: (1) сбор CD34+ гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников из образцов периферической крови или эксплантов костного мозга млекопитающего; и (2) пролиферацию указанных клеток в условиях ex vivo. В дополнение к клеточным факторам роста, описанным в патенте США № 5199942, для культивирования и пролиферации клеток могут быть использованы другие факторы, такие как flt3-L, ИЛ-1, ИЛ-3 и лиганд с-kit.
Помимо использования вакцины на основе клеток, применительно к иммунизации в условиях ex vivo, в настоящем изобретении также предложены композиции и способы иммунизации в условиях in vivo, чтобы вызывать у пациента иммунный ответ на антиген.
Как правило, клетки, активированные и размноженные, как описано в настоящем документе, могут быть использованы в лечении и предотвращении заболеваний, которые возникают у индивидуумов с ос- 43 035618 лабленным иммунитетом. В частности, TFP-модифицированные Т-клетки согласно настоящему изобретению применяют в лечении заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CD19 или ВСМА. В некоторых аспектах клетки согласно настоящему изобретению применяют в лечении пациентов с риском развития заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CD19 или ВСМА. Следовательно, в настоящем изобретении предложены способы лечения или предотвращения заболеваний, расстройств и состояний, связанных с экспрессией CD19 или ВСМА, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества TFP-модифицированных Т-клеток согласно настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак или злокачественная опухоль, или предракового состояния, такого как миелодисплазия, MDS или предлейкоз. Согласно одному аспекту рак представляет собой гематологический рак. Согласно одному аспекту гематологический рак представляет собой лейкоз или лимфому. Согласно одному аспекту TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака и злокачественных опухолей, таких как, но не ограничиваясь ими, например, острые лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, например, острую В-клеточную лимфоидную лейкемию (B-ALL), острую Т-клеточную лимфоидную лейкемию (T-ALL), острую лимфобластную лейкемию (ALL); один или более видов хронической лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, хроническую миелогенную лейкемию (CML), хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL); дополнительных видов гематологических раковых заболеваний или гематологических состояний, включая, но не ограничиваясь ими, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, новообразование бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лейкоз ворсистых клеток, мелкоклеточную и крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT-типа, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию, миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластическую лимфому, новообразование плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и предлейкоз, которые представляют собой разнородную совокупность гематологических состояний, общим признаком которых является неэффективная выработка (или дисплазия) миелоидных клеток крови, и т.п. Помимо этого заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, включает, но не ограничивается ими, например, атипичные и/или неклассические виды рака, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА. Показания, не относящиеся к раку, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА, включают, но не ограничиваются ими, например, аутоиммунное заболевание (например, волчанку), воспалительные заболевания (аллергию и астму) и трансплантацию.
TFP-модифицированные Т-клетки согласно настоящему изобретению могут быть введены по отдельности или в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как ИЛ-2 или другие цитокины, или популяции клеток.
Г ематологический рак.
Гематологические раковые состояния включают такие виды рака как лейкоз и злокачественные лимфопролиферативные состояния, которые влияют на кровь, костный мозг и лимфатическую систему.
Лейкемия может быть классифицирована как острая лейкемия и хроническая лейкемия. Острая лейкемия может быть дополнительно классифицирована как острая миелогенная лейкемия (AML) и острая лимфоидная лейкемия (ALL). Хроническая лейкемия включает хроническую миелогенную лейкемию (CML) и хроническую лимфоидную лейкемию (CLL). Другие связанные состояния включают миелодиспластический синдром (MDS, ранее известный как предлейкоз), которые представляют собой разнородную совокупность гематологических состояний, общим признаком которых является неэффективная выработка (или дисплазия) миелоидных клеток крови и риск трансформации в AML.
В настоящем изобретении предложены композиции и способы лечения рака. Согласно одному аспекту рак представляет собой гематологический рак, включая, но не ограничиваясь ими, лейкоз или лимфому. Согласно одному аспекту TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению можно применять для лечения различных видов рака и злокачественных опухолей, таких как, но не ограничиваясь ими, например, острые лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, например, острую В-клеточную лимфоидную лейкемию (B-ALL), острую Т-клеточную лимфоидную лейкемию (Т-ALL), острую лимфобластную лейкемию (ALL); один или более видов хронической лейкемии, включая, но не ограничиваясь ими, хроническую миелогенную лейкемию (CML), хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL); дополнительных видов гематологических раковых заболеваний или гематологических состояний, включая, но не ограничиваясь ими, В-клеточную пролимфоцитарную лейкемию, новообразование бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лейкоз ворсистых клеток, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, лимфому MALT-типа, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию, миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластическую лимфому, но
- 44 035618 вообразование плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и предлейкоз, которые представляют собой разнородную совокупность гематологических состояний, общим признаком которых является неэффективная выработка (или дисплазия) миелоидных клеток крови и т.п. Помимо этого заболевание, связанное с экспрессией CD19 или ВСМА, включает, но не ограничивается ими, например, атипичные и/или неклассические виды рака, злокачественные опухоли, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, связанные с экспрессией CD19 или ВСМА.
В настоящем изобретении также предложены способы ингибирования пролиферации или уменьшения популяции CD19- или ВСМА-экспрессирующих клеток, включающие приведение популяции клеток, содержащих CD19- или ВСМА-экспрессирующую клетку, в контакт с CD19-связывающей или ВСМАсвязывающей TFP-Т-клеткой согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой. Согласно конкретному аспекту в настоящем изобретении предложены способы ингибирования пролиферации или уменьшения популяции раковых клеток, экспрессирующих CD19 или ВСМА, включающие приведение популяции С.'О19-или ВСМА-экспрессирующих раковых клеток в контакт с CD19-связывающей или ВСМА-связывающей TFP-T-клеткой согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы ингибирования пролиферации или уменьшения популяции раковых клеток, экспрессирующих CD19 или ВСМА, включающие приведение популяции CD19- или ВСМА-экспрессирующих раковых клеток в контакт с CD19-связывающей или ВСМАсвязывающей TFP-T-клеткой согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения CD19связывающая или ВСМА-связывающая TFP-T-клетка согласно настоящему изобретению уменьшает долю, число, количество или процент клеток и/или раковых клеток по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% у субъекта, который страдает миелоидным лейкозом или другим видом рака, связанного с CD19- или ВСМАэкспрессирующими клетками, или в животной модели указанных заболеваний, по сравнению с отрицательным контролем. Согласно одному аспекту настоящего изобретения субъект представляет собой человека. В настоящем изобретении также предложены способы предотвращения, лечения и/или контроля заболевания, связанного с CD19- или ВСМА-экспрессирующими клетками (например, гематологического рака или атипичного рака, экспрессирующего CD19 или ВСМА), включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, CD19-связывающей или ВСМА-связывающей TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой. Согласно одному аспекту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека. Неограничивающие примеры расстройств, связанных с CD19- или ВСМА-экспрессирующими клетками, включают аутоиммунные заболевания (такие как волчанка), воспалительные заболевания (такие как аллергии и астма) и различные виды рака (такие как различные виды гематологического рака или атипичные виды рака, экспрессирующие CD19 или ВСМА).
В настоящем изобретении также предложены способы предотвращения, лечения и/или контроля заболевания, связанного с CD19- или ВСМА-экспрессирующими клетками, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, CD19-связывающей или ВСМА-связывающей TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой. Согласно одному аспекту настоящего изобретения субъект представляет собой человека.
В настоящем изобретении предложены способы предотвращения рецидива рака, связанного с CD19- или ВСМА-экспрессирующими клетками, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, CD19-связывающей или ВСМА-связывающей TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой. Согласно одному аспекту настоящего изобретения способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества CD19-связывающей или ВСМА-связывающей TFP-T-клетки согласно настоящему изобретению, которая связывается с CD19- или ВСМА-экспрессирующей клеткой, в комбинации с эффективным количеством другой терапии.
Комбинированные способы лечения.
TFP-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем документе, может быть использована в комбинации с другими известными агентами и способами лечения. В настоящем изобретении введение в комбинации означает, что два (или более) различных способа лечения доставляют субъекту в то время, когда указанный субъект страдает от расстройства, например, два или более способов лечения доставляют после того, как у субъекта был поставлен диагноз расстройства, и до того, как расстройство было излечено или устранено, или лечение было прекращено по другим причинам. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один способ лечения продолжают доставлять в тот момент, когда начинается доставка второго способа лечения, так, что курсы введения перекрываются. Такую ситуацию иногда называют в данном документе как одновременная доставка или совпадающая по времени доставка. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения доставка одного способа лечения заканчивается до начала доставки другого способа лечения. Согласно некоторым вариантам реа
- 45 035618 лизации любого из указанных случаев лечение является более эффективным благодаря комбинированному введению. Например, второй способ лечения является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдают при меньшей интенсивности второго способа лечения, или второй способ лечения снижает симптомы в большей степени, чем можно было бы наблюдать при введении второго способа лечения в отсутствие первого способа лечения, или аналогичную ситуацию наблюдают при применении первого способа лечения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения доставку осуществляют так, что уменьшение симптома или другой параметр, связанный с расстройством, больше, чем можно было бы наблюдать при использовании одного способа лечения, доставленного в отсутствие другого. Действие двух способов лечения может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или более чем аддитивным. Доставка может быть осуществлена так, что действие первого доставленного способа лечения по-прежнему детектируется во время доставки второго способа лечения.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент включает TFP-экспрессирующую клетку. В настоящем изобретении также предложены Т-клетки, которые экспрессируют несколько TFP, которые связываются с одинаковыми или различными антигенами-мишенями, или одинаковыми или различными эпитопами на одном и том же антигене-мишени. В настоящем изобретении также предложены популяции Т-клеток, в которых первая подгруппа Т-клеток экспрессирует первый TFP, и вторая подгруппа Т-клеток экспрессирует второй TFP.
TFP-экспрессирующие клетки, описанные в настоящем документе, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент можно вводить одновременно, в составе одной и той же композиции или в виде отдельных композиций, или последовательно. В случае последовательного введения TFPэкспрессирующую клетку, описанную в настоящем документе, можно вводить первой, и дополнительный агент может быть введен вторым, или порядок введения может быть обратным. В других аспектах, TFP-экспрессирующая клетка, описанная в настоящем документе, может быть использована в схеме лечения в комбинации с хирургическим вмешательством, химиотерапией, облучением, иммуносупрессивными агентами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, мофетил и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными агентами, такими как САМРАТН, антителами к CD3 или другими видами терапии на основе антител, цитоксином, флударабином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофенольной кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением, пептидной вакциной, например, описанной в Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекту может быть введен агент, который уменьшает или улучшает побочный эффект, связанный с введением TFP-экспрессирующей клетки. Побочные эффекты, связанные с введением TFP-экспрессирующей клетки, включают, но не ограничиваются ими, синдром высвобождения цитокинов (CRS) и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (HLH), также называемый синдром активации макрофагов (MAS). Симптомы CRS включают высокую температуру, тошноту, преходящую гипотензию, гипоксию и т.п. Соответственно, способы, описанные в настоящем документе, могут включать введение субъекту TFP-экспрессирующей клетки согласно настоящему изобретению и последующее введение агента для контроля повышенных уровней растворимого фактора, который высвобождается в результате лечения с использованием TFP-экспрессирующей клетки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения растворимый фактор, уровень которого повышен у субъекта, представляет собой один или более из ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-2 и ИЛ-6. Следовательно, агент, введенный для лечения указанного побочного эффекта, может быть агентом, который нейтрализует один или более из указанных растворимых факторов. Такие агенты включают, но не ограничиваются ими, стероид, ингибитор ФНО-α и ингибитор ИЛ-6. Пример ингибитора ФНО включает энтанерцепт. Пример ингибитора ИЛ-6 включает тоцилизумаб (toc).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекту может быть введен агент, который усиливает активность TFP-экспрессирующей клетки. Например, в одном варианте реализации, агент может являться агентом, который ингибирует ингибирующую молекулу. Ингибирующая молекула, например, белок запрограммированной гибели 1 (PD1), может, в некоторых вариантах реализации, уменьшать способность TFP-экспрессирующей клетки индуцировать иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2В4 и TGFR-бета. Ингибирование ингибирующей молекулы, например, путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать функциональную активность TFPэкспрессирующей клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ингибиторная нуклеиновая кислота, например, дцРНК, например, миРНК или кшРНК, может быть использована для ингибирования экспрессии ингибиторной молекулы в TFP-экспрессирующей клетке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор представляет собой кшРНК. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ингибирующая молекула оказывает ингибиторное действие в TFP-экспрессирующей клетке. В указанных вариантах реализации молекула дцРНК, которая ингибирует экспрессию ингибирующей молекулы, связана с нуклеиновой кислотой, которая кодирует компонент, например, все из компонентов, TFP. Согласно одному варианту реализации настоящего изо
- 46 035618 бретения ингибитор ингибиторного сигнала может представлять собой, например, антитело или фрагмент антитела, который связывается с ингибирующей молекулой. Например, агент может представлять собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с PD1, PD-L1, PD-L2 или CTLA4 (например, ипилимумаб (также упоминаемый как MDX-010 и MDX-101, который доступен коммерчески как ервой (Yervoy™); Bristol-Myers Squibb; тремелимумаб (моноклональное антитело IgG2, доступное от Pfizer, ранее известное как тицилимумаб, СР-675206)). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент представляет собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с TIM3. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент представляет собой антитело или фрагмент антитела, который связывается с LAG3.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения агент, который усиливает активность TFP-экспрессирующей клетки, может представлять собой, например, гибридный белок, содержащий первый домен и второй домен, причем указанный первый домен представляет собой ингибирующую молекулу или ее фрагмент, и указанный второй домен представляет собой полипептид, который связан с положительным сигналом, например, полипептид, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, описанный в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который связан с положительным сигналом, может содержать костимулирующий домен CD28, CD27, ICOS, например, внутриклеточный сигнальный домен CD28, CD27 и/или ICOS, и/или первичный сигнальный домен, например, CD3-дзета, например, описанный в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок экспрессируется той же клеткой, которая экспрессирует TFP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок экспрессируется клеткой, например, Т-клеткой, которая не экспрессирует CD19связывающий TFP.
Фармацевтические композиции.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать TFPэкспрессирующую клетку, например, множество TFP-экспрессирующих клеток, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Подходящие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный буферный солевой раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия); и консерванты. Согласно одному аспекту композиции согласно настоящему изобретению изготовлены для внутривенного введения.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены способом, который является подходящим для заболевания, которое лечат (или предотвращают). Количество и частота введения будет определяться такими факторами, как состояние пациента, а также тип и степень тяжести заболевания пациента, тем не менее, соответствующие дозировки могут быть определены с помощью клинических исследований.
Согласно одному варианту реализации фармацевтическая композиция по существу не содержит примеси, например, отсутствуют детектируемые уровни примеси, например, выбранной из группы, состоящей из эндотоксина, микоплазмы, компетентного по репликации лентивируса (RCL), р24, нуклеиновой кислоты VSV-G, gag ВИЧ, остаточных гранул, покрытых антителом к CD3/CD28, мышиных антител, объединенной сыворотки крови человека, бычьего сывороточного альбумина, бычьей сыворотки, компонентов культуральных сред, клеток-упаковщиков вектора или компонентов плазмид, бактерии и грибка. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения бактерия представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia и Streptococcus pyogenes группы А.
Если указано иммунологически эффективное количество, противоопухолевое эффективное количество, ингибирующее опухоль эффективное количество или терапевтическое количество, точное количество композиций согласно настоящему изобретению, подлежащее введению, может быть определено врачом с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе, размере опухоли, степени инфицирования или метастазов, и состояния пациента (субъекта). Как правило, можно утверждать, что фармацевтическая композиция, содержащая Т-клетки, описанные в настоящем документе, может быть введена в дозировке от 104 до 109 клеток/кг массы тела, в некоторых случаях от 105 до 106 клеток/кг массы тела, включая все целые значения в пределах указанных диапазонов. Композиции Т-клеток также можно вводить несколько раз в указанных дозировках. Клетки могут быть введены с помощью методик инфузии, которые обычно известны в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).
Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения желательным может быть введение активированных Т-клеток субъекту с последующим повторным отбором крови (или проведением афереза), активация Т-клеток в образце в соответствии с настоящим изобретением, и повторная инфузия активированных и размноженных Т-клеток пациенту. Указанный способ можно осуществлять несколько раз каж- 47 035618 дые несколько недель. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения Т-клетки могут быть активированы из образцов крови объемом от 10 до 400 см3. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения Т-клетки активируют из образцов крови объемом 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 см3.
Введение субъектам композиций можно осуществлять любым удобным способом, включая аэрозольную ингаляцию, инъекцию, прием внутрь, переливание, имплантацию или трансплантацию. Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены пациенту трансартериально, подкожно, внутрикожно, внутриопухолево, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной (в/в) инъекции или внутрибрюшинно. Согласно одному аспекту композиции Т-клеток согласно настоящему изобретению вводят пациенту с помощью внутрикожной или подкожной инъекции. Согласно одному аспекту композиции Т-клеток согласно настоящему изобретению вводят путем внутривенной инъекции. Композиции Т-клеток могут быть введены непосредственно в опухоль, лимфатический узел или очаг инфекции.
В конкретном иллюстративном аспекте субъекты могут подвергаться лейкаферезу, при котором лейкоциты собирают, обогащают или обедняют в условиях ex vivo для отбора и/или выделения клеток, представляющих интерес, например, Т-клеток. Подходящие выделенные Т-клетки могут быть размножены с помощью способов, известных в данной области техники, и обработаны так, что может быть введена одна или более конструкций TFP согласно настоящему изобретению, создавая тем самым TFPэкспрессирующую Т-клетку согласно настоящему изобретению. Субъекты, нуждающиеся в этом, впоследствии могут пройти стандартное лечение с использованием высоких доз химиотерапии с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения, после или одновременно с введением трансплантата, субъектам путем инфузии вводят размноженные TFP Т-клетки согласно настоящему изобретению. В дополнительном аспекте размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.
Дозировка вышеуказанных способов лечения, которую будут вводить пациенту, будет варьироваться в зависимости от точного характера состояния, подлежащего лечению, и реципиента указанного способа лечения. Масштабирование доз для введения человеку может быть выполнено в соответствии с практикой, принятой в данной области техники. Доза для САМРАТН, например, как правило, будет находиться в диапазоне от 1 до приблизительно 100 мг для взрослого пациента, как правило, при ежедневном введении в течение периода от 1 до 30 дней. Предпочтительная суточная доза составляет от 1 до 10 мг/сутки, хотя в некоторых случаях могут быть использованы более высокие дозы до 40 мг/сутки (описанные в патенте США № 6120766).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения TFP вводят в Т-клетки, например, с использованием транскрипции в условиях in vitro, и субъект (например, человек) получает начальное введение TFP Т-клеток согласно настоящему изобретению, и одно или более последующих введений TFP Т-клеток согласно настоящему изобретению, причем одно или более последующих введений осуществляют менее чем через 15 дней, например 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или через 2 дня, после предыдущего введения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекту (например, человеку) вводят TFP Т-клетки согласно настоящему изобретению чаще, чем один раз в неделю, например, TFP Т-клетки согласно настоящему изобретению вводят 2, 3 или 4 раза в неделю. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъекту (например, человеку) вводят TFP Т-клетки чаще одного раза в неделю (например, 2, 3 или 4 введения в неделю) (также упоминается в настоящем документе как цикл), в течение последующей недели TFP Т-клетки не вводят, и затем осуществляют одно или более дополнительных введений TFP Т-клеток (например, более одного введения TFP Т-клеток в неделю) субъекту. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект (например, человек) получает более одного цикла TFP Т-клеток, и промежуток времени между каждым циклом составляет менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 дней. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения TFP Т-клетки вводят через день, чтобы достичь 3-х введений в неделю. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения TFP Т-клетки согласно настоящему изобретению вводят в течение по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или более недель.
Согласно одному аспекту CD19 TFP Т-клетки получают с использованием лентивирусных векторов, таких как лентивирус TFP-T-клетки, полученные с помощью указанного способа, будут иметь стабильную экспрессию TFP.
Согласно одному аспекту TFP Т-клетки кратковременно экспрессируют векторы TFP в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней после трансдукции. Кратковременная экспрессия TFP может быть осуществлена путем доставки вектора РНК TFP. Согласно одному аспекту настоящего изобретения РНК TFP трансдуцируют в Т-клетку путем электропорации.
Потенциальная проблема, которая может возникнуть у пациентов, которых лечат с использованием кратковременно экспрессирующих TFP Т-клеток (в частности, TFP Т-клеток, несущих scFv мыши), заключается в анафилактической реакции после многократных обработок.
Не желая быть связанными соответствием какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения полагают, что такая анафилактическая реакция может быть вызвана развитием у пациента гуморального ответа на TFP, т.е. антител к TFP, имеющих изотип IgE. Считается, что вырабатывающие
- 48 035618 антитело клетки пациента претерпевают переключение класса от изотипа IgG (который не вызывает анафилактической реакции) к изотипу IgE, если перерыв в воздействии антигена составляет десятьчетырнадцать дней.
Если пациент имеет высокий риск выработки антител к TFP в течение кратковременной терапии с использованием TFP (например, тех, которые получают с помощью РНК-трансдукции), то перерывы между инфузиями TFP Т-клеток не должны длиться более чем от десяти до четырнадцати дней.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие экспериментальные примеры. Данные примеры приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное. Следовательно, настоящее изобретение никоим образом не должно быть истолковано как ограниченное нижеследующими примерами, и подразумевает включение любых и всех вариантов, которые стали очевидными в результате изложения идей, предусмотренных в настоящем документе. Полагают, что обычный специалист в данной области техники может, используя предшествующее описание и следующие иллюстративные примеры, получить и использовать соединения согласно настоящему изобретению и осуществить заявленные способы без подробного описания. Следующие рабочие примеры конкретно указывают на различные аспекты настоящего изобретения и не должны быть истолкованы, как ограничивающие каким-либо образом осталь ную часть описания.
Пример 1. Конструкции TFP.
CD19-связывающие конструкции TFP конструировали путем клонирования фрагмента ДНК CD19связывающего scFv, соединенного с фрагментом ДНК CD3 или TCR с помощью последовательности ДНК, кодирующей короткий линкер (SL): AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 5) или длинный линкер (LL): AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 6), в вектор Р510 (System Biosciences (SBI)) в сайтах XbaI и EcoR1.
Полученные конструкции CD19-связывающих TRuC включали p510_antiCD19_LL_TCRa (антиCD19-scFv-длинный линкер-полноразмерная α-цепь Т-клеточного рецептора человека;), p510_antiCD19_LL_TCR aC (анти-CD19-scFv-длинный линкер-константная область α-цепи Тклеточного рецептора человека), p510_antiCD19_LL_TCRe (анти-CD19-scFv-длинный линкерполноразмерная бета-цепь Т-клеточного рецептора человека), p510_antiCD19_LL_TCReC (анmи-CD19scFv-длинный линкер-константная область бета-цепи Т-клеточного рецептора человека), p510_antiCD19_LL_CD3Y (анти-CD19-scFv-длинный линкер-цепь CD3y человека), p510_antiCD19_LL_CD3δ (анти-CD19-scFv-длинный линкер-цепь CD3δ человека), p510_antiCD19_LL_CD3ε (анти-CD19-scFv-длинный линкер-цепь CD3ε человека), p510_antiCD19_SL_TCRe (анти-CD19-scFv-короткuй линкер-полноразмерная β-цепь Т-клеточного рецептора человека), p510_antiCD19_SL_CD3Y (анти-CD19-scFv-короткuй линкер-цепь CD3y человека), p510_antiCD19_SL_CD3δ (анти-CD19-scFv-короткuй линкер-цепь CD3δ человека), p510_antiCD19_SL_CD3ε (анти-CD19-scFv-короткuй линкер-цепь CD3ε человека).
Конструкцию CD19-связывающего CAR, p510_antiCD19_28Z, получали путем клонирования синтезированной ДНК кодирующей CD19-связывающий фрагмент, частичный внеклеточный домен CD28, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета, в вектор р510 в сайтах XbaI и EcoR1.
Конструкции ВСМА-связывающих TFP получали путем клонирования фрагмента ДНК ВСМАсвязывающего scFv, соединенного с фрагментом ДНК CD3 с помощью последовательности ДНК, кодирующей линкер: GGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 7), в вектор р510 (SBI) в сайтах XbaI и EcoR1. Полученные конструкции ВСМА-связывающих TFP включали p510_antiBCMA_CD3Y (анти-BCMA-scFvлинкер-цепь CD3y человека) и p510_antiBCMA_CD3ε (анти-BCMA-scFv-линкер-цепь CD3ε человека).
Полноразмерный ВСМА синтезировали и клонировали в р514 (SBI) в сайтах BamHI и NheI, чтобы получить конструкцию р514_ВСМА, использованную для получения стабильных линий клетокмишеней.
Конструкции TFP, нацеленные к белку активации фибробластов (FAP) и карбоангидразе-9 (CAIX), получали путем клонирования фрагмента ДНК scFv, нацеленного к FAP или CAIX, соединенного с фрагментом ДНК CD3 с помощью последовательности ДНК, кодирующей линкер: GGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 7), в вектор р510 (SBI) в сайтах XbaI и EcoR1. Конструкции TFP, нацеленных к FAP или CAIX, которые могут быть получены, включают p510_anti FAP_CD3y (антиFAP scFv-линкер-цепь CD3y человека) и p510_antiFAP_CD3ε (анти-FAP scFv-линкер-цепь CD3ε человека) и p510_antiCAIX_CD3Y (анти-CAIX scFv-линкер-цепь CD3y человека) и p510_antiCAIX_CD3ε (анти CAIX scFv-линкер-цепь CD3ε человека).
Полноразмерные FAP и CAIX могут быть синтезированы и клонированы в р514 (SBI) в сайтах BamHI и NheI, чтобы получить конструкции p514_FAP и p514_CAIX, которые могут быть использованы для создания стабильных линий клеток-мишеней. Примеры последовательностей конструкций представ
- 49 035618 лены ниже.
Последовательности конструкций
Целевая конструкция
Р514_ВСМА (SEQ ID NO: 8) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 241 ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 301 gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 361 tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 421 ccgaacaggg acctgaaagc gaaagggaaa ccagagctct ctcgacgcag gactcggctt 481 gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 541 actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 601 attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 661 aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 721 gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 781 tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 841 atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 901 aagaccaccg cacagcaagc ggccactgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 961 caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1021 acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc
1081 tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct
1141 gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag
1201 ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca
1261 ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg
1321 ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa
1381 atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa
1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga
1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa
1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat
- 50 035618
1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagctagcg ccgccaccat gctccagatg gctggccagt gcagccagaa cgagtacttc 2341 gacagcctgc tgcacgcctg catcccttgc cagctgcggt gcagcagcaa caccccaccc 2401 ctgacctgcc agcggtactg caacgccagc gtgaccaaca gcgtgaaggg caccaacgcc 2461 atcctgtgga cctgcctggg cctgagcctg atcatcagcc tggccgtgtt cgtgctgatg 2521 ttcctgctgc ggaagatcaa cagcgagccc ctgaaggacg agttcaagaa caccggcagc 2581 ggcctgctgg gcatggccaa catcgacctg gaaaagagcc ggaccggcga cgagatcatc 2641 ctgcccagag gcctggagta caccgtggaa gagtgtacct gcgaggactg catcaagagc 2701 aagcccaagg tggacagcga ccactgcttc cctctgcccg ccatggaaga gggcgccacc 2761 atcctggtga caacaaagac caacgactac tgcaagagcc tgcctgccgc cctgagcgcc 2821 accgagatcg agaagtccat cagcgccaga tgaggatccg cggccgcaag gatctgcgat 2881 cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 2941 ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 3001 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 3061 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt 3121 cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc 3181 cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc 3241 taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta 3301 cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt 3361 gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt gaccggcgcc tacgtcgaga 3421 tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg 3481 gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 3541 cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc 3601 aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccgcgacggg cgttccttgc gcagctgtgc
- 51 035618
3661 tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 3721 atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 3781 ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 3841 tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 3901 agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg 3961 gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 4021 gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 4081 tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 4141 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 4201 acgagttctt ctgactcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 4261 gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 4321 atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 4381 tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 4441 ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 4501 ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 4561 gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 4621 cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 4681 gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 4741 tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 4801 cctccccgcc tggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 4861 tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag ataagatctg 4921 ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 4981 taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 5041 tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 5101 tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca 5161 aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 5221 taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 5281 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa 5341 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 5401 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 5461 agtgaggagg cttttttgga ggcctagact tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat 5521 ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 5581 ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 5641 cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa
- 52 035618
5701 tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 5761 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 5821 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 5881 agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 5941 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 6001 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 6061 tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 6121 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 6181 acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 6241 acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 6301 cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 6361 gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 6421 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 6481 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 6541 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 6601 ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 6661 atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 6721 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 6781 gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 6841 ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 6901 caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 6961 cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 7021 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 7081 cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 7141 agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 7201 tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 7261 agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 7321 atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 7381 ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 7441 cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 7501 caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 7561 attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 7621 agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct 7681 aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 7741 gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg 7801 tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg 7861 gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 7921 tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 7981 gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 8041 tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 8101 ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctg.
- 53 035618
Конструкции CAR p510_antiCD19_28z (SEQ ID NO: 9) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga
- 54 035618
1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa
1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat
1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt
1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg
1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt
1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat
1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt
1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca
1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc
2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga
2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat
2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag
2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct
2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca
2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct
2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat
2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta
2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc
2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt
2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc
2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct
2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta
2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga
2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc
2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac
3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac
3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct
3121 cctccttacc tagacaatga gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac
3181 ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt
3241 gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg
3301 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc
3361 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc
3421 tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag
3481 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt
- 55 035618
3541 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 3601 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 3661 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 3721 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aagaattcgg atccgcggcc 3781 gcgaaggatc tgcgatcgct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 3841 ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaacgggt gcctagagaa ggtggcgcgg 3901 ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 3961 accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 4021 aacacagctg aagcttcgag gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg 4081 aggccgccat ccacgccggt tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg 4141 aactgcgtcc gccgtctagg taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc 4201 gctcccttgg agcctaccta gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc 4261 tcaactctac gtctttgttt cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agctgtgacc 4321 ggcgcctacg ctagatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg 4381 tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca 4441 ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc 4501 gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct 4561 ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg 4621 ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc 4681 accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg 4741 gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg 4801 tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaaGGtccc cttctacgag cggctcggct 4861 tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca 4921 agcccggtgc ctgagtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 4981 gtattcttaa ctatgttgct GcttttacgG tatgtggata Ggctgcttta atgcctttgt 5041 atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 5101 tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 5161 ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 5221 ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 5281 gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 5341 cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 5401 gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 5461 tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 5521 cctccccgcc tggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac
- 56 035618
5581 tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaaa ataagatctg 5641 ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 5701 taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 5761 tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 5821 tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca 5881 aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 5941 taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 6001 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa 6061 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 6121 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 6181 gcctagactt ttgcagagac ggcccaaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 6241 gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 6301 cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 6361 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 6421 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6481 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat
6541 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6601 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6661 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6721 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6781 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 6841 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6901 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6961 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 7021 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 7081 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 7141 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 7201 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 7261 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 7321 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 7381 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7441 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7501 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 7561 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc
- 57 035618
7621 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7681 acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7741 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7801 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7861 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7921 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 7981 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 8041 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8101 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8161 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 8221 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 8281 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8341 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 8401 cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg 8461 acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 8521 atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct 8581 ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 8641 taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc 8701 gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag 8761 ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt 8821 gtaaaacgac ggccagtgcc aagctg.
p526A_19BBZ (SEQ ID NO: 10) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 Ggatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
- 58 035618
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1441 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1501 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1561 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1621 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1681 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1741 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1801 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1861 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1921 tatcgatact agtggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg 1981 cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc ctagagaagg 2041 tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt 2101 gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt 2161 gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg cgcccgccgc 2221 cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc cgcctgtggt 2281 gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag accgggcctt 2341 tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct ttgcctgacc 2401 ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta cagatccaag 2461 ctgtgaccgg cgcctactct agagccgcca ccatggccct gcctgtgaca gctctgctgc 2521 tgcctctggc cctgctgctc catgccgcca gacccgatat ccagatgacc cagaccacca 2581 gcagcctgag cgccagcctg ggcgatagag tgaccatcag ctgccgggcc agccaggaca 2641 tcagcaagta cctgaactgg tatcagcaga aacccgacgg caccgtgaag ctgctgatct 2701 accacaccag cagactgcac agcggcgtgc ccagcagatt ttctggcagc ggctccggca
- 59 035618
2761 ccgactacag cctgaccatc tccaacctgg aacaggaaga tatcgctacc tacttctgtc 2821 agcaaggcaa caccctgccc tacaccttcg gcggaggcac caagctggaa atcacaggcg 2881 gcggaggatc tggcggaggt ggaagtggcg gaggcggcag cgaagtgaaa ctgcaggaaa 2941 gcggccctgg cctggtggcc ccttctcagt ctctgtccgt gacctgtacc gtgtccggcg 3001 tgtccctgcc cgattatggc gtgtcctgga tccggcagcc tcccagaaag ggcctggaat 3061 ggctgggcgt gatctggggc agcgagacaa cctactacaa cagcgccctg aagtcccggc 3121 tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga 3181 ccgacgacac cgccatctac tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca 3241 tggactactg gggccagggc accagcgtga ccgtgtctag cacaaccacc cctgccccta 3301 gacctcccac cccagcccca acaattgcca gccagcctct gtctctgcgg cccgaagctt 3361 gtagacctgc tgccggcgga gccgtgcaca ccagaggact ggatttcgcc tgcgacatct 3421 acatctgggc ccctctggcc ggcacatgtg gcgtgctgct cctcagcctg gtcatcaccc 3481 tgtactgcaa gcggggcaga aagaaactgc tctacatctt caagcagccc ttcatgcggc 3541 ccgtgcagac cacacaggaa gaggacggct gctcctgcag attccccgag gaagaagaag 3601 gcggctgcga gctgagagtg aagttcagca gatccgccga cgcccctgcc taccagcagg 3661 gacagaacca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagacg ggaagagtac gacgtgctgg 3721 acaagcggag aggcagagat cccgagatgg gcggcaagcc cagacggaag aatccccagg 3781 aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggaa 3841 tgaagggcga gcggagaaga ggcaagggcc acgatggcct gtaccagggc ctgagcaccg 3901 ccaccaagga cacctacgat gccctgcaca tgcaggccct gccacccaga gaattcgaag 3961 gatccgcggc cgctgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 4021 ccggcccttc cggaatggag agcgacgaga gcggcctgcc cgccatggag atcgagtgcc 4081 gcatcaccgg caccctgaac ggcgtggagt tcgagctggt gggcggcgga gagggcaccc 4141 ccaagcaggg ccgcatgacc aacaagatga agagcaccaa aggcgccctg accttcagcc 4201 cctacctgct gagccacgtg atgggctacg gcttctacca cttcggcacc taccccagcg 4261 gctacgagaa ccccttcctg cacgccatca acaacggcgg ctacaccaac acccgcatcg 4321 agaagtacga ggacggcggc gtgctgcacg tgagcttcag ctaccgctac gaggccggcc 4381 gcgtgatcgg cgacttcaag gtggtgggca ccggcttccc cgaggacagc gtgatcttca 4441 ccgacaagat catccgcagc aacgccaccg tggagcacct gcaccccatg ggcgataacg 4501 tgctggtggg cagcttcgcc cgcaccttca gcctgcgcga cggcggctac tacagcttcg 4561 tggtggacag ccacatgcac ttcaagagcg ccatccaccc cagcatcctg cagaacgggg 4621 gccccatgtt cgccttccgc cgcgtggagg agctgcacag caacaccgag ctgggcatcg 4681 tggagtacca gcacgccttc aagaccccca tcgccttcgc cagatcccgc gctcagtcgt 4741 ccaattctgc cgtggacggc accgccggac ccggctccac cggatctcgc tagagctgaa
- 60 035618
4801 tctaagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 4861 actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta 4921 ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 4981 atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg 5041 caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt 5101 tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 5161 gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc 5221 cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc 5281 cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc 5341 ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 5401 ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa 5461 gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa aataagatct gctttttgct 5521 tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 5581 aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt 5641 ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc 5701 tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga 5761 atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 5821 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 5881 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca 5941 gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg 6001 ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctagact 6061 tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 6121 atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 6181 cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 6241 gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 6301 gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 6361 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 6421 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 6481 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6541 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 6601 gctccctcgt gcgctctcct gttGcgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 6661 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6721 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttoagccc gaccgctgcg 6781 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg
- 61 035618
6841 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 6901 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 6961 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 7021 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 7081 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 7141 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 7201 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 7261 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 7321 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 7381 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 7441 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 7501 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 7561 ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 7621 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 7681 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 7741 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 7801 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 7861 cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 7921 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 7981 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 8041 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 8101 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 8161 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 8221 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 8281 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa 8341 acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga 8401 gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact 8461 atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca 8521 gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 8581 gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg 8641 ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 8701 cggccagtgc caagctg.
- 62 035618
Конструкции TFP (TRuC) p510_antiCD19_LL_TCRalpha (SEQ ID NO: 11) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc
- 63 035618
2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gaggtgaatg gagagaatgt ggagcagcat ccttcaaccc tgagtgtcca ggagggagac 3241 agcgctgtta tcaagtgtac ttattcagac agtgcctcaa actacttccc ttggtataag 3301 caagaacttg gaaaaagacc tcagcttatt atagacattc gttcaaatgt gggcgaaaag 3361 aaagaccaac gaattgctgt tacattgaac aagacagcca aacatttctc cctgcacatc 3421 acagagaccc aacctgaaga ctcggctgtc tacttctgtg cagcaagtag gaaggactct 3481 gggggttacc agaaagttac ctttggaact ggaacaaagc tccaagtcat cccaaatatc 3541 cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc 3601 tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg 3661 tatatcacag acaaaactgt gctagacatg aggtctatgg acttcaagag caacagtgct 3721 gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt 3781 ccagaagaca ccttcttccc cagcccagaa agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa 3841 agctttgaaa cagatacgaa cctaaacttt caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc 3901 ctcctcctga aagtggccgg gtttaatctg ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagctga 3961 taagaattcg atccgcggcc gcgaaggatc tgcgatcgct ccggtgcccg tcagtgggca 4021 gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaacgggt
- 64 035618
4081 gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt 4141 tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt 4201 cgcaacgggt ttgccgccag aacacagctg aagcttcgag gggctcgcat ctctccttca 4261 cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt tgagtcgcgt tctgccgcct 4321 cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg taagtttaaa gctcaggtcg 4381 agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta gactcagccg gctctccacg 4441 ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt cgttttctgt tctgcgccgt 4501 tacagatcca agctgtgacc ggcgcctacg ctagatgacc gagtacaagc ccacggtgcg 4561 cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga 4621 ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct 4681 gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga 4741 cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc 4801 cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat 4861 ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg 4921 cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga 4981 ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc 5041 cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg 5101 cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgagtcgac aatcaacctc tggattacaa 5161 aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 5221 cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 5281 cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 5341 tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 5401 ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 5461 cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 5521 ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 5581 tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 5641 ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 5701 tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 5761 cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact 5821 cccaacgaaa ataagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 5881 gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 5941 cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 6001 tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta 6061 ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg
- 65 035618
6121 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 6181 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc 6241 tctagctatc ccgGccctaa ctcGgcccag ttccgcccat tctccgcccG atggctgact 6301 aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 6361 gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt ttgcagagac ggcccaaatt cgtaatcatg 6421 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 6481 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 6541 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 6601 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 6661 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 6721 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 6781 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 6841 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 6901 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 6961 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 7021 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 7081 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 7141 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 7201 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 7261 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 7321 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 7381 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 7441 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtia agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 7501 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 7561 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 7621 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 7681 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 7741 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 7801 aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 7861 gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 7921 gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 7981 ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 8041 gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 8101 gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata
- 66 035618
8161 gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 8221 tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 8281 gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 8341 agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 8401 aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 8461 ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 8521 gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 8581 agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 8641 tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 8701 cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 8761 tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 8821 gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 8881 ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 8941 attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 9001 gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagctg.
p510_antiCD19_LL_TCRalphaC (SEQ ID NO: 12) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
- 67 035618
1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct
- 68 035618
3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gagccaaata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt 3241 gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag 3301 gattctgatg tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag 3361 agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac 3421 aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag 3481 ctggtcgaga aaagctttga aacagatacg aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt 3541 gggttccgaa tcctcctcct gaaagtggcc gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg 3601 tggtccagct gataagaatt cgatccgcgg ccgcgaagga tctgcgatcg ctccggtgcc 3661 cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc 3721 aattgaacgg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac 3781 tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg 3841 aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagc tgaagcttcg aggggctcgc 3901 atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc atccacgccg gttgagtcgc 3961 gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt ccgccgtcta ggtaagttta 4021 aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc tagactcagc 4081 cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt ttcgttttct 4141 gttctgcgcc gttacagatc caagctgtga ccggcgccta cgctagatga ccgagtacaa 4201 gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 4261 cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 4321 ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 4381 ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 4441 ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 4501 gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 4561 ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 4621 ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 4681 ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 4741 cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgagtcg acaatcaacc 4801 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4861 gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 4921 cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 4981 tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 5041 cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 5101 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac
- 69 035618
5161 tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 5221 tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 5281 ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 5341 ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctggtacct ttaagaccaa 5401 tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag 5461 ggctaattca ctcccaacga aaataagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt 5521 tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 5581 aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 5641 actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat 5701 gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga 5761 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 5821 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 5881 atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 5941 ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct 6001 attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag acggcccaaa 6061 ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 6121 caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 6181 cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 6241 gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 6301 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 6361 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 6421 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 6481 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 6541 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 6601 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 6661 gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 6721 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 6781 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 6841 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 6901 cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 6961 aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 7021 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 7081 ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 7141 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat
- 70 035618
7201 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc
7261 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat
7321 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc
7331 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag
7441 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag
7501 agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt
7561 ggtgtcacgG tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg
7621 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt
7681 tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc
7741 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc
7801 attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa
7861 taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg
7921 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc
7981 caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag
8041 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt
8101 cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt
8161 tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc
8221 acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac
8231 gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct
8341 cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg
8401 cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat
8461 tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata
8521 ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg
8581 ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg
8641 ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg.
p510_antiCD19_LL_TCRbeta (SEQ ID NO: 13) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 Ggatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
- 71 035618
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta
- 72 035618
2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gagctgggag caggcccagt ggattctgga gtcacacaaa ccccaaagca cctgatcaca 3241 gcaactggac agcgagtgac gctgagatgc tcccctaggt ctggagacct ctctgtgtca 3301 tggtaccaac agagcctgga ccagggcctc cagttcctca ttcagtatta taatggagaa 3361 gagagagcaa aaggaaacat tcttgaacga ttctccgcac aacagttccc tgacttgcac 3421 tctgaactaa acctgagctc tctggagctg ggggactcag ctttgtattt ctgtgccagc 3481 agcccccgga caggcctgaa cactgaagct ttctttggac aaggcaccag actcacagtt 3541 gtagaggacc tgaacaaggt gttcccaccc gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca 3601 gagatctccc acacccaaaa ggccacactg gtgtgcctgg ccacaggctt cttcccGgac 3661 cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg aaggaggtgc acagtggggt cagcacggac 3721 ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc aatgactcca gatactgcct gagcagccgc 3781 ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag 3841 ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg acccaggata gggccaaacc cgtcacccag 3901 atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca gactgtggct ttacctcggt gtcctaccag 3961 caaggggtcc tgtctgccac catcctctat gagatcctgc tagggaaggc caccctgtat 4021 gctgtgctgg tcagcgccct tgtgttgatg gccatggtca agagaaagga tttctgataa 4081 gaattcgatc cgcggccgcg aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag 4141 cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc 4201 tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt 4261 cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc 4321 aacgggtttg ccgccagaac acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc 4381 gcccgccgcc ctacctgagg ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc 4441 gcctgtggtg cctcctgaac tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga 4501 ccgggccttt gtccggcgct cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt
- 73 035618
4561 tgcctgaccc tgcttgctca actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac 4621 agatccaagc tgtgaccggc gcctacgcta gatgaccgag tacaagccca cggtgcgcct 4681 cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta 4741 ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca 4801 agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg 4861 cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga 4921 gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga 4981 aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt 5041 ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc 5101 ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt 5161 ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac 5221 ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg agtcgacaat caacctctgg attacaaaat 5281 ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 5341 tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 5401 gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 5461 cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 5521 tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 5581 cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 5641 gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 5701 gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 5761 cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg 5821 gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 5881 ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 5941 aacgaaaata agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 6001 cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 6061 gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 6121 gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 6181 agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag 6241 cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 6301 cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct 6361 agctatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 6421 tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 6481 aggaggcttt tttggaggcc tagacttttg cagagacggc ccaaattcgt aatcatggtc 6541 atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg
- 74 035618
6601 aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6661 gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 6721 ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 6781 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 6841 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 6901 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 6961 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 7021 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc Ggaccctgcc 7081 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 7141 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 7201 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 7261 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 7321 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 7381 gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 7441 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 7501 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 7561 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 7621 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 7681 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 7741 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 7801 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 7861 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 7921 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 7981 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 8041 gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 8101 catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 8161 ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcG 8221 atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 8281 tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 8341 cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 8401 cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 8461 atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 8521 aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 8581 ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa
- 75 035618
8641 aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 8701 aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 8761 cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 8821 agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 8881 tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca 8941 ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca 9001 ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 9061 acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 9121 ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg p510_antiCD19_LL_TCRbetaC (SEQ ID NO: 14) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa
- 76 035618
1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga
1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa
1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat
1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt
1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg
1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt
1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat
1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt
1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca
1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc
2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga
2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat
2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag
2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct
2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca
2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct
2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat
2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta
2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc
2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt
2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc
2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct
2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta
2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga
2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc
2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac
3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac
3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct
3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc
3181 gaggaggacc tgaacaaggt gttcccaccc gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca
3241 gagatctccc acacccaaaa ggccacactg gtgtgcctgg ccacaggctt cttccccgac
3301 cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg aaggaggtgc acagtggggt cagcacagac
3361 ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc aatgactcca gatactgcct gagcagccgc
3421 ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag
- 77 035618
3481 ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg acccaggata gggccaaacc cgtcacccag 3541 atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca gactgtggct ttacctcggt gtcctaccag 3601 caaggggtcc tgtctgccac catcctctat gagatcctgc tagggaaggc caccctgtat 3661 gctgtgctgg tcagcgccct tgtgttgatg gccatggtca agagaaagga tttctgataa 3721 gaattcgatc cgcggccgcg aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag 3781 cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc 3841 tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt 3901 cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc 3961 aacgggtttg ccgccagaac acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc 4021 gcccgccgcc ctacctgagg ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc 4081 gcctgtggtg cctcctgaac tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga 4141 ccgggccttt gtccggcgct cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt 4201 tgcctgaccc tgcttgctca actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac 4261 agatccaagc tgtgaccggc gcctacgcta gatgaccgag tacaagccca cggtgcgcct 4321 cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta 4381 ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca 4441 agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg 4501 cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga 4561 gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga 4621 aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt 4681 ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc 4741 ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt 4801 ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac 4861 ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg agtcgacaat caacctctgg attacaaaat 4921 ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 4981 tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 5041 gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 5101 cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 5161 tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 5221 cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 5281 gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 5341 gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 5401 cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg 5461 gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag
- 78 035618
5521 ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 5531 aacgaaaata agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 5641 cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 5701 gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 5761 gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 5821 agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag 5881 cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 5941 cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct 6001 agctatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 6061 tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 6121 aggaggcttt tttggaggcc tagacttttg cagagacggc ccaaattcgt aatcatggtc 6181 atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 6241 aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6301 gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 6361 ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 6421 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 6431 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 6541 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 6601 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 6661 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 6721 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 6781 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 6841 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 6901 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 6961 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 7021 gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 7081 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 7141 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 7201 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 7261 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 7321 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 7381 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 7441 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 7501 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac
- 79 035618
7561 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc
7621 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc
7681 gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc
7741 catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt
7801 ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc
7861 atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg
7921 tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag
7981 cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat
8041 cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc
8101 atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa
8161 aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta
8221 ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa
8281 aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga
8341 aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct
8401 cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac
8461 agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt
8521 tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca
8581 ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca
8641 ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt
8701 acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt
8761 ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg.
p510_antiCD19_LL_CD3gamma (SEQ ID NO: 15) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
- 80 035618
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc
1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga
1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc
1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata
1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa
1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga
1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa
1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat
1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt
1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg
1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt
1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat
1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt
1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca
1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc
2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga
2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat
2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag
2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct
2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca
2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct
2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat
2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta
2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc
2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt
2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc
2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct
- 81 035618
2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gagcagtcaa tcaaaggaaa ccacttggtt aaggtgtatg actatcaaga agatggttcg 3241 gtacttctga cttgtgatgc agaagccaaa aatatcacat ggtttaaaga tgggaagatg 3301 atcggcttcc taactgaaga taaaaaaaaa tggaatctgg gaagtaatgc caaggaccca 3361 cgagggatgt atcagtgtaa aggatcacag aacaagtcaa aaccactcca agtgtattac 3421 agaatgtgtc agaactgcat tgaactaaat gcagccacca tatctggctt tctctttgct 3481 gaaatcgtca gcattttcgt ccttgctgtt ggggtctact tcattgctgg acaggatgga 3541 gttcgccagt cgagagcttc agacaagcag actctgttgc ccaatgacca gctctaccag 3601 cccctcaagg atcgagaaga tgaccagtac agccaccttc aaggaaacca gttgaggagg 3661 aattgataag aattcgatcc gcggccgcga aggatctgcg atcgctccgg tgcccgtcag 3721 tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga 3781 acgggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc 3841 cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt 3901 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca cagctgaagc ttcgaggggc tcgcatctct 3961 ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg 4021 ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc 4081 aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc ccttggagcc tacctagact cagccggctc 4141 tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg 4201 cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg cctacgctag atgaccgagt acaagcccac 4261 ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt 4321 cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac 4381 cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc 4441 ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt 4501 gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca 4561 acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac 4621 cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg 4681 agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa 4741 cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg
- 82 035618
4801 accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga gtcgacaatc aacctctgga 4861 ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 4921 tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 4981 ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag 5041 gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc 5101 caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga 5161 actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa 5221 ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac 5281 ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct 5341 tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca 5401 gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt 5461 acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 5521 ttcactccca acgaaaataa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 5581 agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 5641 gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 5701 gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 5761 ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 5821 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5881 catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 5941 tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 6001 ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 6061 gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agacttttgc agagacggcc caaattcgta 6121 atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 6181 acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 6241 aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 6301 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 6361 gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 6421 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 6481 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 6541 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 6601 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 6661 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 6721 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 6781 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga
- 83 035618
6841 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag
6901 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta
6961 cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag
7021 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg
7081 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac
7141 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc
7201 aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag
7261 tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc
7321 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac
7381 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc
7441 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg
7501 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag
7561 tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc
7621 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac
7681 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag
7741 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac
7801 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg
7861 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc
7921 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact
7981 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg
8041 atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa
8101 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt
8161 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg
8221 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga
8281 cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc
8341 ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga
8401 gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc
8461 agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact
8521 gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat
8581 caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc
8641 ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac
8701 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc tg p510_antiCD19_LL_CD3delta (SEQ ID NO: 16) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca
- 84 035618 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga
- 85 035618
2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggGgg cggttctctc 3181 gagttcaaga tacctataga ggaacttgag gacagagtgt ttgtgaattg caataccagc 3241 atcacatggg tagagggaac ggtgggaaca ctgctctcag acattacaag actggacctg 3301 ggaaaacgca tcctggaccc acgaggaata tataggtgta atgggacaga tatatacaag 3361 gacaaagaat ctaccgtgca agttcattat cgaatgtgcc agagctgtgt ggagctggat 3421 ccagccaccg tggctggcat cattgtcact gatgtcattg ccactctgct ccttgctttg 3481 ggagtcttct gctttgctgg acatgagact ggaaggctgt ctggggctgc cgacacacaa 3541 gctctgttga ggaatgacca ggtctatcag cccctccgag atcgagatga tgctcagtac 3601 agccaccttg gaggaaactg ggctcggaac aagtgataag aattcgatcc gcggccgcga 3661 aggatctgcg atcgctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 3721 gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga acgggtgcct agagaaggtg gcgcggggta 3781 aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg 3841 tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca 3901 cagctgaagc ttcgaggggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc 3961 cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact 4021 gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc 4081 ccttggagcc tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa
- 86 035618
4141 ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg 4201 cctacgctag atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc 4261 cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt 4321 cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt 4381 cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac 4441 cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 4501 gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg 4561 gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa 4621 gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc 4681 cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac 4741 cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 4801 cggtgcctga gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 4861 tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 4921 tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 4981 tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 5041 tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 5101 cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 5161 gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc 5221 ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 5281 cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 5341 gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 5401 cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 5461 taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaaaataa gatctgcttt 5521 ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 5581 tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 5641 cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 5701 aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 5761 aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 5821 gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 5881 tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 5941 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 6001 cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 6061 agacttttgc agagacggcc caaattcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 6121 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg
- 87 035618
6181 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 6241 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 6301 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 6361 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 6421 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 6481 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 6541 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 6601 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 6661 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 6721 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 6781 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6841 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6901 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 6961 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 7021 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 7081 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 7141 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 7201 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 7261 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7321 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7381 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7441 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 7501 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 7561 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 7621 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 7681 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 7741 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 7801 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 7861 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 7921 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 7981 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8041 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8101 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8161 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8221 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 8281 aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 8341 tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 8401 cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 8461 taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 8521 gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa 8581 ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg 8641 atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 8701 aacgacggcc agtgccaagc tg.
- 88 035618 p510_antiCD19_LL_CD3epsilon (SEQ ID NO: 17) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta
121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa
- 89 035618
1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gaggatggta atgaagaaat gggtggtatt acacagacac catataaagt ctccatctct 3241 ggaaccacag taatattgac atgccctcag tatcctggat ctgaaatact atggcaacac 3301 aatgataaaa acataggcgg tgatgaggat gataaaaaca taggcagtga tgaggatcac 3361 ctgtcactga aggaattttc agaattggag caaagtggtt attatgtctg ctaccccaga 3421 ggaagcaaac cagaagatgc gaacttttat ctctacctga gggcaagagt gtgtgagaac
- 90 035618
3481 tgcatggaga tggatgtgat gtcggtggcc acaattgtca tagtggacat ctgcatcact
3541 gggggcttgc tgctgctggt ttactactgg agcaagaata gaaaggccaa ggccaagcct
3601 gtgacacgag gagcgggtgc tggcggcagg caaaggggac aaaacaagga gaggccacca
3661 cctgttccca acccagacta tgagcccatc cggaaaggcc agcgggacct gtattctggc
3721 ctgaatcaga gacgcatctg ataagaattc gatccgcggc cgcgaaggat ctgcgatcgc
3781 tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga
3841 ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat
3901 gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta
3961 gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga
4021 ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg
4081 ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag
4141 gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct
4201 agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt
4261 tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gctagatgac
4321 cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac
4381 cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca
4441 catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg
4501 caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt
4561 cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg
4621 gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc
4681 gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc
4741 cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac
4801 ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt
4861 cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagtcga
4921 caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc
4981 tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg
5041 tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt
5101 gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac
5161 tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc
5221 tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct
5281 gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct
5341 cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct
5401 caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct
5461 tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt
- 91 035618
5521 taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg
5581 gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa aataagatct gctttttgct tgtactgggt
5641 ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc
5701 ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg
5761 actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta
5821 gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga
5881 gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa
5941 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca
6001 atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca gttccgccca
6061 ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc
6121 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctagact tttgcagaga
6181 cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac
6241 aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt
6301 gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc
6361 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg
6421 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt
6481 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa
6541 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc
6601 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag
6661 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt
6721 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg
6781 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg
6841 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg
6901 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac
6961 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg
7021 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt
7081 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg
7141 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc
7201 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt
7261 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt
7321 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag
7381 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt
7441 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc
7501 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc
- 92 035618
7561 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg
7621 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac
7681 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg
7741 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc
7801 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact
7861 gcataattct Gttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc
7921 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat
7981 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc
8041 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac
8101 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa
8161 aacaggaagg caaaatgocg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact
8221 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg
8281 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg
8341 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag
8401 gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca
8461 catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc
8521 ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc
8581 agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag
8641 gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg
8701 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg
8761 attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc
8821 caagctg p510_antiCD19_SL_CD3epsilon (SEQ ID NO: 18) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta
121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
- 93 035618
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
731 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag
1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc taaaggatca acagctcctg gggatttggg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata ctggatggag tgggacagag aaattaacaa agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga aagtttgtgg aattggttta acataacaaa gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agttaggcag ggatattcac cattatcgtt cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat gggaggttta tataagcaga gctcgtttag cacgctgttt tgacctccat agaagattct agccttctgc tctgtgagtt accacaccca acacagacta catcctccct gtctgcctct gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat aaactcctga tctaccatac atcaagatta agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc acttactttt gccaacaggg taatacgctt gaaataacag gctccacctc tggatccggc
- 94 035618
2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct
2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta
2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga
2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc
2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac
3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac
3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt
3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gaggatggta atgaagaaat gggtggtatt
3181 acacagacac catataaagt ctccatctct ggaaccacag taatattgac atgccctcag
3241 tatcctggat ctgaaatact atggcaacac aatgataaaa acataggcgg tgatgaggat
3301 gataaaaaca taggcagtga tgaggatcac ctgtcactga aggaattttc agaattggag
3361 caaagtggtt attatgtctg ctaccccaga ggaagcaaac cagaagatgc gaacttttat
3421 ctctacctga gggcaagagt gtgtgagaac tgcatggaga tggatgtgat gtcggtggcc
3481 acaattgtca tagtggacat ctgcatcact gggggcttgc tgctgctggt ttactactgg
3541 agcaagaata gaaaggccaa ggccaagcct gtgacacgag gagcgggtgc tggcggcagg
3601 caaaggggac aaaacaagga gaggccacca cctgttccca acccagacta tgagcccatc
3661 cggaaaggcc agcgggacct gtattctggc ctgaatcaga gacgcatctg ataagaattc
3721 gatccgcggc cgcgaaggat ctgcgatcgc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca
3781 tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga
3841 aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag
3901 ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg
3961 tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc
4021 cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt
4081 ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc
4141 ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct agactcagcc ggctctccac gctttgcctg
4201 accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc
4261 aagctgtgac cggcgcctac gctagatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac
4321 ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc
4381 cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact
4441 cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc
4501 ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg
4561 cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct
4621 cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc
4681 cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga
- 95 035618
4741 gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga 4801 gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg 4861 catgacccgc aagcccggtg cctgagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 4921 aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 4981 aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 5041 atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 5101 gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 5161 cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 5221 ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 5281 ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 5341 gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 5401 gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 5461 cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 5521 atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 5581 aataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 5641 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 5701 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 5761 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt 5821 tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata 5881 atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 5941 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat 6001 cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 6061 tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 6121 cttttttgga ggcctagact tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct 6181 gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 6241 aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 6301 actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 6361 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 6421 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 6481 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 6541 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 6601 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 6661 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 6721 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg
- 96 035618
6781 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc
6841 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag
6901 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt
6961 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt
7021 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg
7081 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac
7141 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca
7201 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac
7261 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac
7321 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt
7381 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt
7441 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt
7501 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc
7561 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa
7621 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg
7681 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt
7741 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc
7801 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt
7861 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg
7921 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac
7981 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc
8041 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt
8101 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg
8161 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag
8221 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa
8281 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat
8341 tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg
8401 tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg
8461 tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg
8521 gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat
8581 gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc
8641 attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca
8701 gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca
8761 gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctg
- 97 035618 p510_antiCD19_SL_CD3gamma (SEQ ID NO: 19) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca
- 98 035618
1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc
2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga
2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat
2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag
2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct
2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca
2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct
2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat
2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta
2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc
2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt
2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc
2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct
2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta
2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga
2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc
2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac
3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac
3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt
3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gagcagtcaa tcaaaggaaa ccacttggtt
3181 aaggtgtatg actatcaaga agatggttcg gtacttctga cttgtgatgc agaagccaaa
3241 aatatcacat ggtttaaaga tgggaagatg atcggcttcc taactgaaga taaaaaaaaa
3301 tggaatctgg gaagtaatgc caaggaccca cgagggatgt atcagtgtaa aggatcacag
3361 aacaagtcaa aaccactcca agtgtattac agaatgtgtc agaactgcat tgaactaaat
3421 gcagccacca tatctggctt tctctttgct gaaatcgtca gcattttcgt ccttgctgtt
3481 ggggtctact tcattgctgg acaggatgga gttcgccagt cgagagcttc agacaagcag
3541 actctgttgc ccaatgacca gctctaccag cccctcaagg atcgagaaga tgaccagtac
3601 agccaccttc aaggaaacca gttgaggagg aattgataag aattcgatcc gcggccgcga
3661 aggatctgcg atcgctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc
3721 gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga acgggtgcct agagaaggtg gcgcggggta
3781 aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg
3841 tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca
3901 cagctgaagc ttcgaggggc tcgcatctct ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc
3961 cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact
- 99 035618
4021 gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc 4081 ccttggagcc tacctagact cagccggctc tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa 4141 ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg 4201 cctacgctag atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc 4261 cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt 4321 cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt 4381 cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac 4441 cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 4501 gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg 4561 gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa 4621 gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc 4681 cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac 4741 cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 4801 cggtgcctga gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 4861 tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 4921 tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 4981 tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 5041 tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 5101 cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 5161 gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc 5221 ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 5281 cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 5341 gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 5401 cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 5461 taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaaaataa gatctgcttt 5521 ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 5581 tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 5641 cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 5701 aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 5761 aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 5821 gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 5881 tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 5941 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 6001 cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct
- 100 035618
6061 agacttttgc agagacggcc caaattcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 6121 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 6181 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 6241 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 6301 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 6361 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 6421 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 6481 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 6541 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 6601 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 6661 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 6721 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 6781 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6841 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6901 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 6961 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 7021 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 7081 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 7141 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 7201 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 7261 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7321 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7381 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7441 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 7501 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 7561 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 7621 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 7681 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 7741 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 7801 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 7861 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 7921 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 7981 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8041 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8101 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8161 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8221 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 8281 aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 8341 tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 8401 cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 8461 taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 8521 gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa 8581 ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg 8641 atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 8701 aacgacggcc agtgccaagc tg
- 101 035618 p510_antiCD19_SL_CD3delta (SEQ ID NO: 20) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta
121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg
- 102 035618
1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt 3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gagttcaaga tacctataga ggaacttgag 3181 gacagagtgt ttgtgaattg caataccagc atcacatggg tagagggaac ggtgggaaca 3241 ctgctctcag acattacaag actggacctg ggaaaacgca tcctggaccc acgaggaata 3301 tataggtgta atgggacaga tatatacaag gacaaagaat ctaccgtgca agttcattat
- 103 035618
3361 cgaatgtgcc agagctgtgt ggagctggat ccagccaccg tggctggcat cattgtcact 3421 gatgtcattg ccactctgct ccttgctttg ggagtcttct gctttgctgg acatgagact 3481 ggaaggctgt ctggggctgc cgacacacaa gctctgttga ggaatgacca ggtctatcag 3541 cccctccgag atcgagatga tgctcagtac agccaccttg gaggaaactg ggctcggaac 3601 aagtgataag aattcgatcc gcggccgcga aggatctgcg atcgctccgg tgcccgtcag 3661 tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga 3721 acgggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc 3781 cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt 3841 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca cagctgaagc ttcgaggggc tcgcatctct 3901 ccttcacgcg cccgccgccc tacctgaggc cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg 3961 ccgcctcccg cctgtggtgc ctcctgaact gcgtccgccg tctaggtaag tttaaagctc 4021 aggtcgagac cgggcctttg tccggcgctc ccttggagcc tacctagact cagccggctc 4081 tccacgcttt gcctgaccct gcttgctcaa ctctacgtct ttgtttcgtt ttctgttctg 4141 cgccgttaca gatccaagct gtgaccggcg cctacgctag atgaccgagt acaagcccac 4201 ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt 4261 cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac 4321 cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc 4381 ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt 4441 gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca 4501 acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac 4561 cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg 4621 agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa 4681 cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg 4741 accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga gtcgacaatc aacctctgga 4801 ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 4861 tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 4921 ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag 4981 gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc 5041 caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga 5101 actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa 5161 ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac 5221 ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct 5281 tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca 5341 gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctggt acctttaaga ccaatgactt
- 104 035618
5401 acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 5461 ttcactccca acgaaaataa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 5521 agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 5581 gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 5641 gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 5701 ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 5761 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5821 catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 5881 tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 5941 ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 6001 gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agacttttgc agagacggcc caaattcgta 6061 atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 6121 acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 6181 aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 6241 atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 6301 gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 6361 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 6421 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 6481 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 6541 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 6601 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 6661 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 6721 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 6781 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 6841 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 6901 cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 6961 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 7021 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 7081 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 7141 aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 7201 tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 7261 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 7321 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 7381 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg
- 105 035618
7441 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag
7501 tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc
7561 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac
7621 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag
7681 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac
7741 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg
7801 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc
7861 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact
7921 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg
7981 atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa
8041 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt
8101 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg
8161 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga
8221 cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc
8281 ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga
8341 gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc
8401 agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact
8461 gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat
8521 caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc
8581 ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac
8641 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc tg. p510_antiCD19_SL_TCRbeta (SEQ ID NO: 21) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta
121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
- 106
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 341 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct
- 107 035618
2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt 3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gagctgggag caggcccagt ggattctgga 3181 gtcacacaaa ccccaaagca cctgatcaca gcaactggac agcgagtgac gctgagatgc 3241 tcccctaggt ctggagacct ctctgtgtca tggtaccaac agagcctgga ccagggcctc 3301 cagttcctca ttcagtatta taatggagaa gagagagcaa aaggaaacat tcttgaacga 3361 ttctccgcac aacagttccc tgacttgcac tctgaactaa acctgagctc tctggagctg 3421 ggggactcag ctttgtattt ctgtgccagc agcccccgga caggcctgaa cactgaagct 3481 ttctttggac aaggcaccag actcacagtt gtagaggacc tgaacaaggt gttcccaccc 3541 gaggtcgctg tgtttgagcc atcagaagca gagatctccc acacccaaaa ggccacactg 3601 gtgtgcctgg ccacaggctt cttccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaatggg 3661 aaggaggtgc acagtggggt cagcacggac ccgcagcccc tcaaggagca gcccgccctc 3721 aatgactcca gatactgcct gagcagccgc ctgagggtct cggccacctt ctggcagaac 3781 ccccgcaacc acttccgctg tcaagtccag ttctacgggc tctcggagaa tgacgagtgg 3841 acccaggata gggccaaacc cgtcacccag atcgtcagcg ccgaggcctg gggtagagca 3901 gactgtggct ttacctcggt gtcctaccag caaggggtcc tgtctgccac catcctctat 3961 gagatcctgc tagggaaggc caccctgtat gctgtgctgg tcagcgccct tgtgttgatg 4021 gccatggtca agagaaagga tttctgataa gaattcgatc cgcggccgcg aaggatctgc 4081 gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg 4141 gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa 4201 agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt 4261 gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acagctgaag 4321 cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg ccgccatcca 4381 cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac tgcgtccgcc 4441 gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct cccttggagc 4501 ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca actctacgtc 4561 tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc gcctacgcta 4621 gatgaccgag tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt 4681 acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga 4741 ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga
- 108 035618
4801 catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga 4861 gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg 4921 ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga 4981 gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg 5041 cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct 5101 ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc 5161 cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg 5221 agtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta 5281 tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc 5341 ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga 5401 ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac 5461 ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc 5521 cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc 5581 tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg 5641 gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc 5701 ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc 5761 gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg 5821 tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa 5881 aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaaaata agatctgctt tttgcttgta 5941 ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc 6001 cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt 6061 tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta 6121 gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata acttgcaaag aaatgaatat 6181 cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 6241 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 6301 tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg cccctaactc cgcccagttc 6361 cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 6421 ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc tagacttttg 6481 cagagacggc ccaaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 6541 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 6601 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 6661 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 6721 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 6781 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc
- 109 035618
6841 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 6901 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 6961 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 7021 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 7081 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 7141 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 7201 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 7261 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 7321 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 7381 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 7441 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 7501 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 7561 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 7621 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 7681 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 7741 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 7801 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 7861 aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 7921 ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 7981 tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 8041 ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 8101 cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 8161 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 8221 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 8281 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 8341 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 8401 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 8461 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 8521 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 8581 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 8641 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 8701 aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 8761 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 8821 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc 8881 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 8941 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 9001 agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 9061 aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 9121 cagtgccaag ctg.
- 110 035618 p510_antiBCMA_CD3epsilon (SEQ ID NO: 22) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag
1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt
- 111 035618
1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgcggaagt gaaaaaaccg 2401 ggcgcgagcg tgaaagtgag ctgcaaagcg agcggctata gctttccgga ttattatatt 2461 aactgggtgc gccaggcgcc gggccagggc ctggaatgga tgggctggat ttattttgcg 2521 agcggcaaca gcgaatataa ccagaaattt accggccgcg tgaccatgac ccgcgatacc 2581 agcagcagca ccgcgtatat ggaactgagc agcctgcgca gcgaagatac cgcggtgtat 2641 ttttgcgcga gcctgtatga ttatgattgg tattttgatg tgtggggcca gggcaccatg 2701 gtgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 2761 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga ccccgggcga accggcgagc 2821 attagctgca aaagcagcca gagcctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 2881 tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 2941 agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggcg cggattttac cctgaaaatt 3001 agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgcg cggaaaccag ccatgtgccg 3061 tggacctttg gccagggcac caaactggaa attaaaagcg gtggcggcgg ttctggtggc 3121 ggcggttctg gtggcggcgg ttctctcgag gatggtaatg aagaaatggg tggtattaca 3181 cagacaccat ataaagtctc catctctgga accacagtaa tattgacatg ccctcagtat 3241 cctggatctg aaatactatg gcaacacaat gataaaaaca taggcggtga tgaggatgat 3301 aaaaacatag gcagtgatga ggatcacctg tcactgaagg aattttcaga attggagcaa 3361 agtggttatt atgtctgcta ccccagagga agcaaaccag aagatgcgaa cttttatctc 3421 tacctgaggg caagagtgtg tgagaactgc atggagatgg atgtgatgtc ggtggccaca 3481 attgtcatag tggacatctg catcactggg ggcttgctgc tgctggttta ctactggagc 3541 aagaatagaa aggccaaggc caagcctgtg acacgaggag cgggtgctgg cggcaggcaa 3601 aggggacaaa acaaggagag gccaccacct gttcccaacc cagactatga gcccatccgg 3661 aaaggccagc gggacctgta ttctggcctg aatcagagac gcatctgata agaattcgga
- 112 035618
3721 tccgcggccg cgaaggatct gcgatcgctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 3781 gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag 3841 gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 3901 tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 3961 tgccgccaga acacagctga agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg 4021 ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg 4081 tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct 4141 ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac 4201 cctgcttgct caactctacg tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa 4261 gctgtgaccg gcgcctacgc tagatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc 4321 gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca 4381 cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct 4441 tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg 4501 tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc 4561 cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc 4621 tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg 4681 accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc 4741 gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc 4801 ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca 4861 tgacccgcaa gcccggtgcc tgagtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 4921 gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 4981 tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 5041 cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 5101 gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 5161 tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 5221 ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 5281 ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 5341 cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 5401 tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 5461 tttgggccgc ctccccgcct ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat 5521 cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaaa 5581 taagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag 5641 ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt 5701 caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt
- 113 035618
5761 tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta 5821 taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat 5881 ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 5941 tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc 6001 cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 6061 tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 6121 tttttggagg cctagacttt tgcagagacg gcccaaattc gtaatcatgg tcatagctgt 6181 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 6241 agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 6301 tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 6361 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 6421 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 6481 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 6541 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 6601 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 6661 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 6721 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 6781 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 6841 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 6901 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 6961 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 7021 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 7081 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 7141 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 7201 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 7261 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 7321 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 7381 gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 7441 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 7501 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 7561 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 7621 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 7681 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 7741 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag
- 114 035618
7801 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa
7861 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc
7921 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt
7981 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc
8041 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta
8101 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa
8161 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca
8221 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac
8281 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta
8341 ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt
8401 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc
8461 tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt
8521 gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc
8581 ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat
8641 tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc
8701 tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt
8761 cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcca agctg p510_antiBCMA_CD3gamma (SEQ ID NO: 23) acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta
121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga
181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc
241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta
301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact
361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg
421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct
481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt
541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag
601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt
661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt
721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg
781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag
841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag
901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg
- 115
961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgcggaagt gaaaaaaccg 2401 ggcgcgagcg tgaaagtgag ctgcaaagcg agcggctata gctttccgga ttattatatt 2461 aactgggtgc gccaggcgcc gggccagggc ctggaatgga tgggctggat ttattttgcg 2521 agcggcaaca gcgaatataa ccagaaattt accggccgcg tgaccatgac ccgcgatacc 2581 agcagcagca ccgcgtatat ggaactgagc agcctgcgca gcgaagatac cgcggtgtat 2641 ttttgcgcga gcctgtatga ttatgattgg tattttgatg tgtggggcca gggcaccatg 2701 gtgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 2761 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga ccccgggcga accggcgagc 2821 attagctgca aaagcagcca gagcctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 2881 tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 2941 agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggcg cggattttac cctgaaaatt
- 116 035618
3001 agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgcg cggaaaccag ccatgtgccg 3061 tggacctttg gccagggcac caaactggaa attaaaagcg gtggcggcgg ttctggtggc 3121 ggcggttctg gtggcggcgg ttctctcgag cagtcaatca aaggaaacca cttggttaag 3181 gtgtatgact atcaagaaga tggttcggta cttctgactt gtgatgcaga agccaaaaat 3241 atcacatggt ttaaagatgg gaagatgatc ggcttcctaa ctgaagataa aaaaaaatgg 3301 aatctgggaa gtaatgccaa ggacccacga gggatgtatc agtgtaaagg atcacagaac 3361 aagtcaaaac cactccaagt gtattacaga atgtgtcaga actgcattga actaaatgca 3421 gccaccatat ctggctttct ctttgctgaa atcgtcagca ttttcgtcct tgctgttggg 3481 gtctacttca ttgctggaca ggatggagtt cgccagtcga gagcttcaga caagcagact 3541 ctgttgccca atgaccagct ctaccagccc ctcaaggatc gagaagatga ccagtacagc 3601 caccttcaag gaaaccagtt gaggaggaat tgataagaat tcggatccgc ggccgcgaag 3661 gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 3721 gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 3781 ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 3841 tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 3901 gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg 3961 ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc 4021 gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc cggcgctccc 4081 ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc ttgctcaact 4141 ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt gaccggcgcc 4201 tacgctagat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca 4261 gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 4321 atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 4381 ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 4441 cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 4501 tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 4561 ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg 4621 gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 4681 ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 4741 tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 4801 gtgcctgagt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 4861 ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 4921 ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 4981 tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg
- 117 035618
5041 acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg
5101 ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga
5161 caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct
5221 ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg
5281 tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc
5341 ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc
5401 cgcctggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta
5461 aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaaaataaga tctgcttttt
5521 gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta
5581 gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc
5641 cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa
5701 atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa
5761 tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc
5821 aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg
5881 tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc tatcccgccc ctaactccgc
5941 ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg
6001 aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag
6061 acttttgcag agacggccca aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt
6121 gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg
6181 gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt
6241 cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt
6301 tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc
6361 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg
6421 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg
6481 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac
6541 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg
6601 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct
6661 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg
6721 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct
6781 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac
6841 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt
6901 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc
6961 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca
7021 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat
- 118 035618
7081 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac
7141 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt
7201 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc
7261 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg
7321 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg
7381 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc
7441 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta
7501 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg
7561 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct
7621 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta
7681 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg
7741 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga
7801 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt
7861 gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca
7921 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt
7981 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt
8041 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga
8101 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt
8161 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc
8221 gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa
8281 cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg
8341 aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg
8401 ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta
8461 actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc
8521 acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact
8581 gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat
8641 gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa
8701 cgacggccag tgccaagctg.
Пример 2. Последовательности антител.
Создание последовательностей антител.
Каноническая последовательность полипептида CD19 человека представляет собой последовательность под номером доступа UniProt P15391 (или Р15391-1). Каноническая последовательность полипептида ВСМА человека представляет собой последовательность под номером доступа UniProt Q02223 (или Q02223-1). В настоящем изобретении предложены полипептиды антител, которые способны специфично связываться с полипептидом CD19 человека или полипептидом ВСМА человека, или полипептидом FAP человека, или полипептидом ВСМА человека, и их фрагменты или домены. Антитела к CD19, FAP, CAIX и ВСМА могут быть получены с использованием различных технологий (см., например, Nicholson et al., 1997). В указанной работе мышиные антитела к CD19, FAP, CAIX или ВСМА используют в качестве исходного материала, гуманизация мышиных антител к CD19, FAP, CAIX или ВСМА является желательной для клинических условий, при которых специфичные для мыши остатки могут индуцировать антигенный ответ у человека, направленный против антител мыши (НАМА), у субъектов, получающих лечение с использованием гибридного белка (TFP) Т-клеточных рецепторов (TCR), т.е. лечение с использованием Т-клеток, трансдуцированных конструкцией TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA. Гуманизацию осуществляют путем прививки областей CDR из мышиного антитела к CD19, FAP, CAIX или ВСМА на соответствующие акцепторные каркасные участки зародышевой линии человека, необязательно содержащие другие модификации CDR и/или каркасных участков. В настоящем изобретении нумерация остатков антител и фрагментов антитела указана в соответствии с системой Кабат (Kabat) (Kabat E. A. et al., 1991; Chothia et al., 1987).
Создание scFv.
Гуманизированные IgG или IgG человека к CD19, FAP, CAIX или ВМСА используют для создания последовательностей scFv для конструкций TFP. Получают последовательности ДНК, кодирующие до
- 119 035618 мены VL и VH человека или гуманизированные домены VL и VH, и кодоны для конструкций необязательно оптимизируют для экспрессии в клетках из Homo sapiens. Порядок, в котором домены VL и VH появляются в scFv, варьируется (т.е. возможна ориентация VL-VH или VH-VL), и три копии субъединицы G4S или G4S (G4S)3 соединяют вариабельные домены с получением домена scFv. Плазмидные конструкции, содержащие scFv к CD19, FAP, CAIX и ВСМА, необязательно могут содержать метки Flag, His или другие аффинные метки, и могут быть введены путем электропорации в клетки линии НЕК293 или другие пригодные линии клеток человека или млекопитающих, и очищены. Подтверждающие количественные исследования включают исследование связывания методом проточной цитометрии, кинетический анализ с использованием Proteon и окрашивание CD19-экспрессирующих клеток.
Примеры CD19-связывαющих или ВМСА-связывающих CDR из доменов VL и VH и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, соответственно, представлены ниже.
CD19-связывающий домен.
CDR1 легкой цепи, нацеленный к CD19.
Кодирующая последовательность: AGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAA (SEQ ID NO: 24). Аминокислотная последовательность: RASQDISK (SEQ ID NO: 25).
CDR2 легкой цепи, нацеленный к CD19.
Кодирующая последовательность: ATCTACCATACATCAAGATTA (SEQ ID NO: 26).
Аминокислотная последовательность: IYHTSRL (SEQ ID NO: 27).
CDR3 легкой цепи, нацеленный к CD19.
Кодирующая последовательность: CAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACG (SEQ ID NO: 28). Аминокислотная последовательность: QQGNTLPYT (SEQ ID NO: 29).
CDR1 тяжелой цепи, нацеленный к CD19.
Кодирующая последовательность: GGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC (SEQ ID NO: 30). Аминокислотная последовательность: GVSLPDYGVS (SEQ ID NO: 31).
CDR2 тяжелой цепи, нацеленный к CD19.
Кодирующая последовательность: GTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTC (SEQ ID NO: 32).
Аминокислотная последовательность: VIWGSETTYYNSAL (SEQ ID NO: 33).
CDR3 тяжелой цепи, нацеленный к CD19.
Кодирующая последовательность: CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTAC (SEQ ID NO: 34).
Аминокислотная последовательность: HYYYGGSYAMDY (SEQ ID NO: 35). ВСМА-связывающий домен.
CDR1 легкой цепи, нацеленный к ВСМА.
Кодирующая последовательность: AAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCAT (SEQ ID NO: 36).
Аминокислотная последовательность: KSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 37).
CDR2 легкой цепи, нацеленный к ВСМА.
Кодирующая последовательность: AAAGTGAGCAACCGCTTTAGC (SEQ ID NO: 38).
Аминокислотная последовательность: KVSNRFS (SEQ ID NO: 39).
CDR3 легкой цепи, нацеленный к ВСМА.
Кодирующая последовательность: GCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACC (SEQ ID NO: 40). Аминокислотная последовательность: AETSHVPWT (SEQ ID NO: 41).
CDR1 тяжелой цепи, нацеленный к ВСМА.
Кодирующая последовательность: AAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAAC (SEQ ID NO: 42).
Аминокислотная последовательность: KASGYSFPDYYIN (SEQ ID NO: 43).
CDR2 тяжелой цепи, нацеленный к ВСМА.
Кодирующая последовательность: TGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGC (SEQ ID NO: 44)
Аминокислотная последовательность: WIYFASGNSEYNQKFTG (SEQ ID NO: 45).
CDR3 тяжелой цепи, нацеленный к ВСМА.
Кодирующая последовательность: CTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTG (SEQ ID NO: 46). Аминокислотная последовательность: LYDYDWYFDV (SEQ ID NO: 47).
Вариабельная область легкой цепи антитела к CD19.
Кодирующая последовательность:
- 120 035618
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTC ACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCA GAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAG GAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTA GCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTT CCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA (SEQ Ш NO: 48).
Аминокислотная последовательность:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO: 49). Вариабельная область тяжелой цепи антитела к CD19.
Кодирующая последовательность:
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTC CGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCG CCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCA CATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAG AGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTAC TGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGG AACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ Ш NO: 50).
Аминокислотная последовательность:
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYY NSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 51).
Вариабельная область легкой цепи антитела к ВСМА.
Кодирующая последовательность:
GATATTGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCCTGAGCGTGACCCCGGGCGAACCGGC GAGCATTAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATC TGCATTGGTATCTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATAAAGTG AGCAACCGCTTTAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGGA TTTTACCCTGAAAATTAGCCGCGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCGTGTATTATTGCG CGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAA AGC (SEQ Ш NO: 52).
Аминокислотная последовательность:
DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKS(SEQ Ш NO: 53).
Вариабельная область тяжелой цепи антитела к ВСМА.
Кодирующая последовательность:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAACTGGGTG CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATTTATTTTGCGAGCGG CAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCA GCAGCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTG TATTTTTGCGCGAGCCTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGC ACCATGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ Ш NO: 54).
Аминокислотная последовательность:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSE YNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVS S(SEQIDNO: 55).
Источник субъединиц TCR.
Все субъединицы комплекса Т-клеточного рецептора (TCR) человека содержат внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. Комплекс TCR человека содержит полипептид CD3-эпсилон, полипептид CD3-гамма, полипептид CD3-дельта, полипептид CD3-дзета, полипептид аль
- 121 035618 фа-цепи TCR и полипептид бета-цепи TCR. Каноническая последовательность полипептида CD3эпсилон человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Р07766. Каноническая последовательность полипептида СОЗ-гамма человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Р09693. Каноническая последовательность полипептида CD3-дельта человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Р043234. Каноническая последовательность полипептида CD3-дзета человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Р20963. Каноническая последовательность альфа-цепи TCR человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Q6ISU1. Каноническая последовательность С-области бета-цепи TCR человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Р01850, последовательность V области бета-цепи TCR человека может быть найдена в базе данных UniProt под номером доступа Р04435. Каноническая последовательность полипептида СОЗ-эпсилон человека:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEIL
WQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRA RVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQR GQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ Ш NO: 56).
Каноническая последовательность полипептида СОЗ-гамма человека:
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKD GKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATI SGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHL QGNQLRRN (SEQ Ш NO: 57).
Каноническая последовательность полипептида СОЗ-дельта человека:
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLG KRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALG VFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK (SEQ Ш NO: 58).
Каноническая последовательность полипептида СОЗ-дзета человека:
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ Ш NO: 59).
Каноническая последовательность альфа-цепи TCR человека:
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLD SPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHS RSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPA GPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWG EGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA (SEQ Ш NO: 60).
Каноническая последовательность С-области альфа-цепи TCR человека:
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFK SNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIG FRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (SEQ Ш NO: 61).
Каноническая последовательность V области CTL-L17 альфа-цепи TCR человека:
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFD YFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCA AKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL (SEQ Ш NO: 62).
Каноническая последовательность С-области бета-цепи TCR человека:
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTD PQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPV TQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRK DF (SEQ Ш NO: 63).
Каноническая последовательность V-области CTL-L17 бета-цепи TCR человека:
- 122 035618
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQT
LGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAG
LNQPQHFGDGTRLSIL (SEQ Ш NO: 64).
Каноническая последовательность V-области YT35 бета-цепи TCR человека:
MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTM MRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCS ANYGYTFGSGTRLTVV (SEQ ID NO: 65).
Пример последовательности тяжелой цепи анти-ВСМА.
Создание TFP из доменов TCR и scFv.
CD19 или ВСМА scFv рекомбинантно соединены с CD3-эпсилон или другими субъединицами TCR (см. 1С) с использованием линкерной последовательности, такой как G4S, (G4S)2, (G4S)3 или (G4S)4. В настоящем изобретении используют различные линкеры и конфигурации scFv. Альфа-цепь TCR и бетацепь TCR использовали для создания TFP в виде полноразмерных полипептидов или только их константных доменов. Любая вариабельная последовательность альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR пригодна для изготовления TFP.
Векторы экспрессии TFP.
В настоящем изобретении предложены векторы экспрессии, содержащие промотор (энхансерпромотор цитомегаловируса (ЦМВ)), сигнальную последовательность, чтобы обеспечить секрецию, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (ген бычьего гормона роста (BGH)), элемент, обеспечивающий эписомную репликацию и репликацию у прокариот (например, точка начала репликации SV40 и ColE1 или другие, известные в данной области техники), и элементы, обеспечивающие отбор (ген устойчивости к ампициллину и селективный маркер зеоцин). Предпочтительно конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующей TFP, клонируют в лентивирусный вектор экспрессии, и экспрессию подтверждают на основании количества и качества ответа эффекторных Т-клеток, трансдуцированных TFP.CD19 (CD19.TFP, или CD19.TFP Т-клетки, или TFP.CD19, или TFP.CD19 Т-клетки) в ответ на CD19+ клетки-мишени, TFP.FAP-трансдуцированных Т-клеток (FAP.TFP, или FAP.TFP Т-клетки, или TFP.FAP, или TFP.FAP Т-клетки) в ответ на FAP+ клетки-мишени, TFP.CAIX-трансдуцированных Тклеток (CAIX.TFP или CAIX.TFP Т-клетки, или TFP.CAIX, или TFP.CAIX Т-клетки) в ответ на CAIX+ клетки-мишени, или TFP.BCMA-трансдуцированных Т-клеток (BCMA.TFP, или BCMA.TFP Тклетки, или TFP.BCMA, или TFP.BCMA Т-клетки) в ответ на ВСМА+ клетки-мишени. Ответы эффекторных Т-клеток включают, но не ограничиваются ими, размножение, пролиферацию и удвоение клеток, выработку цитокинов и лизис клеток-мишеней или цитолитическую активность (т.е. дегрануляцию). Лентивирусные векторы-переносчики TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA используют для получения геномного материала, упакованного в VSVg-псевдотипированные лентивирусные частицы. ДНК лентивирусного вектора-переносчика смешивают с тремя компонентами для упаковки вируса VSVg, gag/pol и rev в комбинации с реагентом для трансфекции Lipofectamine™ для их переноса в клетки 293. Через 24 и 48 ч среды собирают, фильтруют и концентрируют с помощью ультрацентрифугирования. Полученный вирусный препарат хранят при -80°С. Количество трансдуцирующих единиц определяют титрованием на клетках SupT1. Перенаправленные Т-клетки TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA получают путем активации свежих наивных Т-клеток с использованием гранул, покрытых антителом к CD3x и CD28, в течение 24 ч и затем добавляют соответствующее количество трансдуцирующих единиц, чтобы получить желаемую долю трансдуцированных Т-клеток. Полученные модифицированные Т-клетки размножают, до достижения состояния покоя и уменьшения в размере, после чего их замораживают для последующего анализа. Количество и размеры клеток измеряют с использованием Multisizer III (Beckman Coulter). Перед криоконсервацией процент трансдуцированных клеток (экспрессирующих TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA на клеточной поверхности) и относительную интенсивность флуоресценции в результате экспрессии определяют методом проточной цитометрии. На основании данных гистограммы оценивают относительные уровни экспрессии TFP путем сравнения процента трансдуцированных клеток с относительной интенсивностью флуоресценции для указанных клеток.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения несколько TFP вводят с помощью трансдукции Т-клеток несколькими вирусными векторами.
Оценка цитолитической активности, способности к пролиферации и секреции цитокинов перенаправленных Т-клеток, несущих гуманизированный TFP Функциональные способности TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA Т-клеток вырабатывать TFP, которые экспрессируются на клеточной поверхности, и вызывать гибель опухолевых клеток-мишеней, пролиферировать и секретировать цитокины определяли с помощью количественных исследований, известных в данной области техники.
МКПК человека (например, кровь после афереза у нормального донора, наивные Т-клетки которого получают путем отрицательной селекции в отношении Т-клеток, CD4+ и CD8+ лимфоцитов) обрабатывают интерлейкином-2 (ИЛ-2) человека, и затем активируют гранулами, покрытыми антителами к CD3x
- 123 035618 и CD28, например, в 10% RPMI при 37°С, 5% СО2 перед проведением трансдукции с использованием
TFP-кодирующих лентивирусных векторов. Количественные исследования методом проточной цитометрии используют, чтобы подтвердить присутствие TFP на поверхности клеток, например, с помощью антитела к FLAG или антитела к вариабельной области мыши. Выработку цитокинов (например, ИФН-γ) измеряют с помощью ИФА или других количественных способов исследований.
Пример 3. Эффективность TFP Т-клеток человека в мышиной модели ALL человека.
Первичные клетки ALL человека могут быть выращены у мышей с ослабленным иммунитетом (например, NSG или NOD) без их культивирования в условиях in vitro. Аналогичным образом, культивируемые линии клеток ALL человека могут индуцировать лейкоз у таких мышей. Мышей, несущих ALL, можно использовать для проверки эффективности Т-клеток человека TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA, например, в модели HALLX5447. Исследуемым показателем в указанной модели является выживание мышей после внутривенной (в/в) инфузии клеток ALL в отсутствие и в присутствии внутривенно введенных Т-клеток человека TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA.
Пример 4. Лечение с использованием TFP Т-клеток человека в ксенотрансплантатной мышиной модели солидных опухолей в условиях in vivo.
Эффективность Т-клеток человека TFP.CD19 или TFP.BCMA также может быть проверена в мышиных моделях с ослабленным иммунитетом, несущих подкожные солидные опухоли, полученные из CD19- или ВСМА-экспрессирующих клеток ALL человека, линий клеток CLL или НХЛ человека. Сжатие опухоли в ответ на лечение с использованием Т-клеток человека TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA можно оценить путем измерения размера опухоли штангенциркулем или путем регистрации интенсивности сигнала флуоресценции GFP, испускаемого GFP-экспрессирующими опухолевыми клетками.
Первичные клетки солидной опухоли человека могут быть выращены у мышей с ослабленным иммунитетом без культивирования в условиях in vitro. Примеры клеток солидных опухолей включают линии клеток солидных опухолей, такие как линии, доступные в Атласе генома рака (TCGA) и/или Общей энциклопедии линий раковых клеток (CCLE см. Barretina et al., Nature 483:603 (2012)). Примеры клеток солидных опухолей включают первичные опухолевые клетки, выделенные из карциномы почек, рака молочной железы, рака легких, рака яичников, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака мозга, рака печени, рака поджелудочной железы, рака почек или рака желудка. Такие мыши могут быть использованы для проверки эффективности Т-клеток TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA в ксенотрансплантатных моделях опухолей человека (см., например, Morton et al., Nat. Procol. 2:247 (2007)). После имплантации или подкожной инъекции 1х106-1х107 первичных клеток (обработанные коллагеназой общие суспензии опухолей в материале внеклеточного матрикса) или фрагментов опухоли (фрагменты первичной опухоли в материале внеклеточного матрикса), опухолям обеспечивали время для роста до 200-500 мм3 перед началом лечения.
Пример 5. Демонстрация мультиплексных полипептидов TFP и применение мультиплексных перенаправленных Т-клеток, несущих гуманизированный TFP.
Полипептиды TFP, представленные в настоящем документе, способны функционально связываться с эндогенными полипептидами субъединиц TCR с образованием функциональных комплексов TCR. В настоящем документе множество TFP в лентивирусных векторах используют для трансдукции Т-клеток, чтобы создать функциональный, мультиплексный рекомбинантный комплекс TCR. Например, в настоящем изобретении предложена Т-клетка, содержащая i) первый TFP, содержащий внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен из полипептида CD3-дзета, и фрагмент антитела scFv, специфичный в отношении CD19, FAP, CAIX или ВСМА, и ii) второй TFP, содержащий внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен из полипептида CD3-гамма, и фрагмент антитела, специфичный в отношении CD19, FAP, CAIX или ВСМА. Первый TFP и второй TFP способны взаимодействовать друг с другом и с полипептидами эндогенных субъединиц TCR, образуя тем самым функциональный комплекс TCR.
Применение указанных Т-клеток, несущих мультиплексный гуманизированный TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX или TFP.BCMA, продемонстрировано в гемобластозах и солидных опухолях, как это описано в примерах 2 и 3 выше.
Пример 6. Получение Т-клеток, трансдуцированных TFP.
Получение лентивирусов.
Лентивирус, кодирующий соответствующие конструкции, получали следующим образом. 5х106 HEK293FT-клеток высевали в чашку диаметром 100 мм и размножали до достижения 70-90% конфлюентности в течение ночи. По 2,5 мкг ДНК указанных плазмид и 20 мкл смеси для упаковки лентивируса (ALSTEM, каталожный номер VP100, см. Приложение В3) разводили в 0,5 мл DMEM или среды OPTIMEM I без сыворотки и осторожно перемешивали. В отдельной пробирке 30 мкл реагента для трансфекции NanoFect (ALSTEM, каталожный номер NF100) разводили в 0,5 мл DMEM или среды OPTI-MEM I без сыворотки и осторожно перемешивали. Растворы NanoFect/DMEM и ДНК/DMEM смешивали и встряхивали в течение 10-15 секунд перед инкубацией смеси DMEM-плазмида-NanoFect при комнатной
- 124 035618 температуре в течение 15 мин. Полный комплекс для трансфекции, полученный на предыдущем этапе, добавляли по каплям к планшету с клетками и покачивали, чтобы равномерно диспергировать комплекс для трансфекции в планшете. Затем планшет инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе в увлажненной атмосфере с 5% CO2. На следующий день супернатант заменяли 10 мл свежей среды, и вносили 20 мкл ViralBoost (500x, ALSTEM, каталожный номер VB100). Затем планшеты инкубировали при 37°С еще в течение 24 ч. Супернатант, содержащий лентивирусы, затем собирали в 50 мл стерильную коническую центрифужную пробирку с крышкой и помещали на лед. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4°С очищенный супернатант фильтровали с использованием стерильного фильтра с размером пор 0,45 мкм с низким связыванием белка, и вирус затем выделяли путем ультрацентрифугирования при 25000 об/мин (Beckmann, L8-70M) в течение 1,5 ч при 4°С. Осадок удаляли и повторно суспендировали в средах DMEM, и концентрации/титры лентивирусов определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР с использованием набора Lenti-X qRT-PCR Titration (Clontech; каталожный номер 631235). Любую остаточную плазмидную ДНК удаляли путем обработки ДНКазой I. Исходный препарат вируса немедленно использовали для инфицирования или распределяли на аликвоты и хранили при - 80°С для последующего использования.
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Выделение МКПК.
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) получали из цельной крови или лейкоцитарной пленки. Цельную кровь собирали в 10 мл вакуумный контейнер с гепарином и обрабатывали немедленно или хранили в течение ночи при 4°С. Приблизительно 10 мл цельной антикоагулированной крови смешивали со стерильным забуференным фосфатом физиологическим раствором (ФСБ), чтобы получить общий объем 20 мл в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл (ФСБ, рН 7,4, без Ca2+/Mg2+). 20 мл смеси кровь/ФСБ затем осторожно наслаивали на поверхность 15 мл Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, 17-1440-03) перед центрифугированием при 400g в течение 30-40 мин при комнатной температуре без применения тормоза. Лейкоцитарную пленку получали от Research Blood Components (Бостон, Массачусетс, США). Пробирки Leucosep (Greiner bio-one) подготавливали путем добавления 15 мл Ficoll-Paque (GE Health Care) и центрифугировали при 1000 g в течение 1 мин. Лейкоцитарную пленку разводили в ФСБ в соотношении 1:3 (рН 7,4, без Са2+ или Mg2+). Разведенную лейкоцитарную пленку переносили в пробирку Leucosep™ и центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин без применения тормоза. Слой клеток, содержащих мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), которые можно наблюдать на границе раздела разбавленная плазма/Ficoll, осторожно удаляли, чтобы свести к минимуму загрязнения Ficoll. Остаточный Ficoll, тромбоциты и белки плазмы затем удаляли путем промывки МНПК три раза в 40 мл ФСБ и центрифугирования при 200 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра. Промытые МКПК промывали еще один раз средами CAR-T (AIM V-AlbuMAX (БСА) (Life Technologies) с добавлением 5% сыворотки АВ и 1,25 мкг/мл амфотерицина В (Gemini Bioproducts, Вудланд, Калифорния, США), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). В другом варианте промытые МКПК переносили в изотермические флаконы и замораживали при -80°С в течение 24 ч перед хранением в жидком азоте для последующего использования.
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Активация Т-клеток.
Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), полученные из цельной крови или лейкоцитарной пленки, стимулировали с использованием магнитных гранул, конъюгированных с антителами к CD28 и CD3 человека, в течение 24 ч перед вирусной трансдукцией. Свежевыделенные МКПК промывали один раз в средах CAR-T (AIM V-AlbuMAX (БСА) (Life Technologies) с добавлением 5% сыворотки АВ и 1,25 мкг/мл амфотерицина В (Gemini Bioproducts), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) без hu-Kn-2, перед повторным суспендированием до конечной концентрации 1х 106 клеток/мл в средах CAR-T с добавлением 300 МЕ/мл ИЛ-2 человека (из 1000х исходного раствора; Invitrogen). Если МНПК ранее были заморожены, то их оттаивали и повторно суспендировали в концентрации 1 х 107 клеток/мл в 9 мл подогретой (37°С) среды DMEM (Life Technologies) в присутствии 10% ФБС, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при концентрации 1х106 клеток/мл перед еще одной промывкой в среде CART с повторным суспендированием, чтобы получить концентрацию 1х106 клеток/мл в среде CAR-T, после этого добавляли ИЛ-2, как описано выше. Перед активацией магнитные гранулы, конъюгированные с антителами к CD28 и CD3 человека, (Invitrogen), промывали три раза в 1 мл стерильного ФСБ (1х), рН 7,4, с использованием магнитной стойки, чтобы выделить гранулы из раствора, перед повторным суспендированием в среде CAR-T с добавлением 300 МЕ/мл ИЛ-2 человека до конечной концентрации 4х107 гранул/мл. МКПК и гранулы затем смешивали в соотношении 1:1 гранулы/клетки путем перенесения 25 мкл (1х 106 гранул) гранул в 1 мл МКПК. Желаемое число аликвот затем распределяли в одиночные лунки 12-луночного планшета для культивирования клеток с низкой адгезией или необработанного планшета для культивирования клеток, и инкубировал при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение 24 ч перед вирусной трансдукцией.
- 125 035618
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Трансдукция/трансфекция и пролиферация Т-клеток.
После активации МКПК инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% CO2. Лентивирус оттаивали на льду, и 5х 106 лентивирусных частиц вместе с 2 мкл Transplus (Alstem) на 1 мл сред (конечное разведение 1:500) добавляли в каждую лунку к 1х 106 клеток. Клетки инкубировали в течение еще 24 ч перед повторным добавлением вируса. В другом варианте лентивирус оттаивали на льду, и соответствующий вирус добавляли при 5 или 50 MOI в присутствии 5 мкг/мл полибрена (Sigma). Клетки инокулировали путем осаждения при 100 g в течение 100 мин при комнатной температуре. Затем клетки размножали в присутствии 300 МЕ/мл ИЛ-2 человека в течение 6-14 дней (общее время инкубации зависит от конечного числа необходимых CAR-T-клеток). Концентрации клеток исследовали каждые 2-3 дня, в это же время добавляли среды для поддержания клеточной суспензии в плотности 1х 106 клеток/мл.
В некоторых случаях активированные МКПК подвергали электропорации транскрибируемой в условиях in vitro (IVT) иРНК (фиг. 14). МКПК человека стимулировали с помощью гранул Dynabeads (ThermoFisher) в соотношении 1:1 в течение 3 дней в присутствии 300 МЕ/мл рекомбинантного ИЛ-2 человека (R&D System). Гранулы удаляли перед электропорацией. Клетки промывали и повторно суспендировали в среде OPTI-MEM (ThermoFisher) в концентрации 2,5х107 клеток/мл. По 200 мкм суспензии клеток (5х 106 клеток) переносили в кюветы с 2 мм зазором Electroporation Cuvettes Plus™ (Harvard Apparatus BTX) и предварительно охлаждали на льду. 10 мкг IVT иРНК TFP добавляли к суспензии клеток. Смесь иРНК/клетка затем подвергали электропорации при 200 В в течение 20 мс с использованием системы для электропорации ЕСМ830 Square Wave (Harvard Apparatus BTX). Сразу после электропорации клетки переносили в свежую среду для культивирования клеток (не содержащая сыворотки среда AIM V AlbuMAX (БСА) + 5% сыворотки АВ человека + 300 МЕ/мл ИЛ-2) и инкубировали при 37°С. Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Подтверждение экспрессии TFP с помощью окрашивания клеток.
После лентивирусной трансдукции или электропорации иРНК экспрессию анти-CD19, анти-FAP, анти-CAIX и анти-ВСМА CAR и TFP подтверждали с помощью проточной цитометрии с использованием антитела к Fab мыши для детектирования мышиного анти-CD19, анти-FAP, анти-CAIX или антиВСМА scFv. Т-клетки промывали три раза в 3 мл буфера для окрашивания (ФСБ, 4% БСА) и повторно суспендировали в ФСБ до достижения концентрации 1х 106 клеток на лунку. Для исключения мертвых клеток клетки инкубировали с rive dead aqua (Invitrogen) в течение 30 мин на льду. Клетки дважды промывали в ФСБ и повторно суспендировали в 50 мкл буфера для окрашивания.
Чтобы блокировать рецепторы Fc 1 мкл нормального козьего IgG, разбавленного в соотношении 1:100 (Life Technologies), добавляли в каждую пробирку и инкубировали на льду в течение 10 мин. По 1 мл буфера для проточной цитометрии добавляли в каждую пробирку, хорошо перемешивали, и клетки осаждали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин. Поверхностную экспрессию scFv TFP детектировали с использованием меченых биотином нормальных поликлональных антител козы к F(ab)2 антитела мыши (Life Technologies), при этом меченые биотином нормальные поликлональные антитела IgG козы (Life Technologies) использовали в качестве контроля изотипа. Оба антитела добавляли в концентрации 10 мкг/мл в реакционном объеме 100 мкл. Клетки затем инкубировали при 4°С в течение 45 мин, промывали один раз, повторно суспендировали в буфере для проточной цитометрии, и блокировали с использованием нормального IgG мыши (Invitrogen) путем добавления 100 мкл нормального IgG мыши, разбавленного в соотношении 1:1000, в каждую пробирку. Затем клетки инкубировали на льду в течение 10 мин, промывали буфером для окрашивания и повторно суспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания. Затем клетки окрашивали путем добавления 1,0 мкл меченого фикоэритрином (РЕ) стрептавидина (BD Biosciences), и АРС-конъюгированное антитело к CD3 человека (клон-UCHTI, BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-конъюгированное антитело к CD8 человека (клон-SKI, BD Biosciences) и Pacific Blueконъюгированное антитело к CD4 человека (клон-РРА-Т4 BD Biosciences) добавляли в каждую пробирку. Проточную цитометрию проводили с использованием LSRFortessa™ X20 (BD Biosciences), и данные получали с использованием программного обеспечения FACS diva и анализировали с помощью FlowJo (Treestar, Inc., Ашланд, Орегон, США). От 20% до 40% трансдуцированных Т-клеток экспрессировали CD19-связывающий CAR, CD19-связывающий LL TFP, CD19-связывающий SL TFP или ВСМАсвязывающий TFP, что указывает на сопоставимые уровни трансдукции и поверхностной экспрессии конструкций CAR и TFP (фиг. 5-7).
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Пример 7. Количественное исследование цитотоксичности методом проточной цитометрии.
Клетки-мишени, которые были положительными или отрицательными в отношении соответствующих мишеней CD19, FAP, CAIX или ВСМА, помечали с помощью флуоресцентного красителя, сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE). Указанные клетки-мишени смешивали с эффекторными Т-клетками, которые представляли собой нетрансдуцированные клетки, трансдуцированные контрольными конструкциями CAR-T клетки или клетки, трансдуцированные TFP. После указанного периода инкубации процент мертвых или живых CFSE-меченых клеток-мишеней и клеток-мишеней для отри- 126 035618 цательного контроля определяли для каждой культуры эффектор/клетка-мишень с помощью проточной цитометрии. Процент выживаемости клеток-мишеней в каждой культуре Т-клетка + клетка-мишень рассчитывали по отношению к лункам, содержащим только клетки-мишени.
Цитотоксическую активность эффекторных Т-клеток измеряли методом проточной цитометрии путем сравнения количества выживших клеток-мишеней в отсутствие или в присутствии эффекторных Тклеток после совместной инкубации эффекторных клеток и клеток-мишеней. В экспериментах с использованием CD19 TFP или CAR-T-клеток клетки-мишени представляли собой CD19-положumельные клетки лимфомы Беркитта линии Raji (ATCC, CCL-86), в то время как клетки, используемые в качестве отрицательного контроля, представляли собой CD19-отрицательные клетки линии К562 (ATCC, CCL-243). В экспериментах с использованием ВСМА TFP Т-клеток клетки-мишени представляли собой ВСМАположительные RPMI-8226 плазмацитомные/миеломные клетки (ATCC, CCL-155), в то время как клетки, используемые в качестве отрицательного контроля, представляли собой ВСМА-отрицательные клетки лимфомы Беркитта линии Raji (ATCC, CCL-86). Клетки-мишени промывали один раз и повторно суспендировали в ФСБ до конечной концентрации 1х 106 клеток/мл. Флуоресцентный краситель, сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE) (ThermoFisher), добавляли к суспензии клеток в концентрации 0,03 мкМ, и клетки инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Реакцию мечения останавливали путем добавления к суспензии клеток полноценной культуральной среды (RPMI-1640 + 10% HI-FBS) в объеме, который в 5 раз превышал реакционный объем, и клетки инкубировали в течение еще 2 мин при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием и повторно суспендировали в среде для оценки цитотоксичности (не содержащая фенолового красного среда RPMI1640 (Invitrogen) с добавлением 5% сыворотки АВ (Gemini Bioproducts) до конечной концентрации 2х105 клеток/мл. 50 мкл суспензии клеток-мишеней, меченных CFSE (эквивалентно 10000 клеток), добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном (Corning).
Эффекторные Т-клетки трансдуцированные конструкциями ВСМА TFP, совместно с нетрансдуцированными Т-клетками в качестве отрицательного контроля, промывали и суспендировали до конечной концентрации 2х106 клеток/мл или 1х106 клеток/мл в среде для оценки цитотоксичности. По 50 мкл суспензий эффекторных Т-клеток (эквивалентно 100000 или 50000 клеток) добавляли к высаженным клеткам-мишеням, чтобы получить соотношение эффекторные клетки:клетки-мишени 10:1 или 5:1, соответственно, в общем объеме 100 мкл. Культуры затем смешивали, осаждали и инкубировали в течение 4 ч при 37°С, 5% CO2. Немедленно после указанной инкубации 7AAD (7-аминоактиномицин D) (BioLegend) добавляли к культуре клеток, как рекомендовано изготовителем, и исследование методом проточной цитометрии проводили с помощью BD Fortessa X-20 (BD Biosciences). Анализ данных проточной цитометрии проводили с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Inc). Процент выживания для клеток-мишеней RPMI-8226 рассчитывали путем деления числа живых клеток-мишеней RPMI-8226 (CFSE+ 7-AAD) в образце, содержащем эффекторные Т-клетки и клетки-мишени, на количество живых клеток RPMI-8226 (CFSE+ 7-AAD) в образце, содержащем только клетки-мишени. Цитотоксичность для эффекторных клеток рассчитывали как процент гибели клеток для RPMI-8226=100% - процент выживания для клеток RPMI-8226.
Как было описано ранее, Т-клетки, трансдуцированные анmи-CD19-28ζ конструкцией CAR, проявляли цитотоксичность в отношении CD19-экспрессирующих В-клеток Raji, по сравнению с Т-клетками, которые не были трансдуцированы или были трансдуцированы контрольной конструкцией CAR, не обладающей специфичностью в отношении CD19 (фиг. 8). Однако Т-клетки, трансдуцированные антиCD19-CD3ε, более эффективно индуцировали цитотоксичность в отношении мишеней Raji, чем CD19связывающая контрольная конструкция CAR, при всех проверенных соотношениях эффектор:мишень. Ahtu-CD19-CD3y TFP также вызывали устойчивую цитотоксичность, которая превышала цитотоксичность, наблюдаемую при использовании CD19-связывающих CAR, при соотношениях эффектор:мишень от 5 до 10:1 (фиг. 8). Некоторую степень цитотоксичности наблюдали при использовании CD19связывающего TCRa TFP и CD19-связывающего TCRe TFP. Аналогичные результаты были получены при использовании CD19-связывающего TFP, который был сконструирован с другой шарнирной областью. Аналогичным образом, цитотоксичность в отношении CD19-экспрессирующих клеток-мишеней Raji была больше при использовании Т-клеток, трансдуцированных CD19-связывающим CD3ε TFP или CD19-связывающим CD3y TFP, чем цитотоксичность, наблюдаемая для Т-клеток, трансдуцированных CD19-связывающим CAR.
Т-клетки, которые подвергали электропорации с использованием иРНК, кодирующей TFP, специфичные в отношении CD19, также проявляли устойчивую цитотоксичность в отношении CD19экспрессирущих В-клеток Raji, тогда как при использовании контрольной конструкции или конструкций CD19-связывающих TRuC не было обнаружено существенной гибели CD19-отрицательных клеток К562, CD19-специфичную гибель клеток Raji наблюдали при использовании Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19-CD3ε SL или анти-CD19-CD3γ SL TRuC (фиг. 14). Т-клетки, трансдуцированные TFP, специфичным в отношении В-клеточного антигена созревания (ВСМА), также проявляли устойчивую цитотоксичность в отношении ВСМА-экспрессирующих клеток RPMI8226. Т-клетки, трансдуцированные
- 127 035618 aнти-BСМА-CD3ε или aHTu-BCMA-CD3Y TFP, эффективно индуцировали цитотоксичность в отношении
ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней RPMI8226. При соотношении эффекторные клетки:клеткимишени 10:1 почти 100% клеток-мишеней подвергались цитолизу (фиг. 9).
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Пример 8. Оценка цитотоксичности с помощью количественного исследования цитотоксичности в режиме реального времени.
CD19-связывaющие и ВСМА-связывающие TFP также проявляли превосходную цитотоксичность по сравнению с CD19-связывaющими CAR в формате количественного исследования цитотоксичности в режиме реального времени (RTCA). Количественное исследование RTCA позволяет измерить электрическое сопротивление прикрепленного монослоя клеток-мишеней в каждой лунке специализированного 96луночного планшета в режиме реального времени и позволяет получить окончательный показатель в виде значения, которое называется клеточный индекс. Изменения клеточного индекса указывают на разрушение монослоя клеток-мишеней в результате гибели клеток-мишеней при совместной инкубации с эффекторными Т-клетками. Следовательно, цитотоксичность эффекторных Т-клеток может быть оценена как изменение клеточного индекса лунок, содержащих клетки-мишени и эффекторные Т-клетки, по сравнению с лунками, содержащими только клетки-мишени.
Клетки-мишени для RTCA представляли собой клетки линии HeLa, экспрессирующие CD 19 (CD19HeLa) или ВСМА (BCMA-HeLa), при этом исходные нетрансдуцированные клетки линии HeLa использовали в качестве отрицательного контроля. ДНК, кодирующую полноразмерный CD19 человека или ВСМА человека, синтезировали в GeneArt (ThermoFisher) и встраивали в сайт множественного клонирования лентивирусного вектора с двумя промоторами, pCDH514B (System Bioscience), несущего неомицин в качестве селективного маркера, под контролем промотора EF1a. Лентивирус, несущий вектор, кодирующий CD19, или вектор, кодирующий ВСМА, затем упаковывали. Клетки линии HeLa трансдуцировали с использованием лентивирусов, несущих CD19 или ВСМА, в течение 24 ч и затем отбирали в присутствии G418 (1 мг/мл). Экспрессию CD19 или ВСМА трансдуцированными клетками CD19-HeLa или BCMA-HeLa подтверждали методом проточной цитометрии с использованием антител к CD19 человека или к ВСМА человека (BioLegend, клон 19А2; Miltenyi, клон REA315).
Прикрепленные клетки-мишени культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ФБС, 1% смеси антибиотиков и противогрибковых агентов (Life Technologies). Чтобы получить RTCA 50 мкл среды RPMI добавляли в соответствующие лунки Е-планшета (ACEA Biosciences, Inc., каталожный номер JL10-156010-1А). Затем планшет помещали в прибор RTCA МР (ACEA Biosciences, Inc.), и соответствующий макет планшета и график количественного исследования вводили в программу RTCA 2.0, как описано в руководстве производителя. Измерение в начальных условиях проводили каждые 15 мин, чтобы получить 100 измерений. Затем к каждой исследуемой лунке добавляли 1х 104 клеток-мишеней в объеме 100 мкл, и клетки оставляли в покое для осаждения в течение 15 мин. Планшет возвращали в считывающее устройство и возобновляли регистрацию показаний.
На следующий день эффекторные Т-клетки промывали и повторно суспендировали в среде для исследования цитотоксичности (не содержащая фенолового красного среда RPMI1640 (Invitrogen) с добавлением 5% сыворотки АВ (Gemini Bioproducts; 100-318)). Планшет затем извлекали из прибора, и эффекторные Т-клетки, суспендированные в среде для оценки цитотоксичности (не содержащая фенолового красного среда RPMI1640 (Invitrogen) с добавлением 5% сыворотки АВ), добавляли в каждую лунку в количестве 100000 клеток или 50000 клеток, чтобы достичь соотношения эффекторные клетки:клеткимишени 10:1 или 5:1 соответственно. Планшет затем помещали обратно в прибор. Измерение проводили каждые 2 мин для получения 100 измерений и затем через каждые 15 мин для получения 1000 измерений. В количественном исследовании RTCA гибель CD19-трaнсдуцировaнных клеток линии HeLa наблюдали при использовании Т-клеток, трансдуцированных aнти-CD19-28ζ CAR, о чем свидетельствовало уменьшение клеточного индекса в зависимости от времени после добавления эффекторных клеток, по сравнению с клетками линии HeLa по отдельности или клетками линии HeLa, которые инкубировали совместно с Т-клетками, трансдуцированными контрольной конструкцией CAR (фиг. 11). Однако гибель клеток-мишеней под действием Т-клеток, экспрессирующих aнти-CD19-CD3ε TFP или анти-ВСМАCD3Y TFP, была более выраженной и быстрой, чем та, которую наблюдали при использовании CD19связывающего CAR. Например, в течение 4 ч после добавления Т-клеток, трансдуцированных антиCD19-CD3ε TFP, наблюдали почти полную гибель CD19-экспрессирующих клеток-мишеней. При использовании Т-клеток, трансдуцированных рядом конструкций TFP, содержащих другие CD3 и TCR, наблюдали незначительную гибель клеток-мишеней или гибель клеток отсутствовала. Аналогичные результаты были получены при действии CD19-связывaющих TFP, сконструированных с использованием другой шарнирной области. Цитотоксичность в отношении CD19-трaнсдуцировaнных клеток-мишеней линии HeLa также была выше для Т-клеток, трансдуцированных aнти-CD19-CD3ε TFP или aнти-CD19CD3y TFP, чем при использовании Т-клеток, трансдуцированных CD19-связывaющим CAR. Т-клетки, трансдуцированные ВСМА-связывающими TFP, также проявляли устойчивую цитотоксичность в отношении ВСМА-экспрессирующих клеток RPMI8226. Как показано на фиг. 9 Т-клетки, трансдуцированные
- 128 035618 анти-BCMA-CD3ε TFP или aHTu-BCMA-CD3Y TFP, эффективно индуцировали цитотоксичность в отношении ВСМА-экспрессирующих клеток-мишеней RPMI8226. При соотношении эффекторные клетки:клетки-мишени 10:1 почти 100% клеток-мишеней подвергались цитолизу (фиг. 12).
Цитотоксическая активность TFP-трансдуцированных Т-клеток зависела от дозы по отношению к количеству вируса (MOI), использованному для трансдукции. Увеличение степени гибели клеток CD19HeLa наблюдали при увеличении MOI лентивирусов, несущих анти-CD19-CD3ε TFP, дополнительно усиливая взаимосвязь между трансдукцией TFP и цитотоксической активностью (фиг. 13).
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Пример 9. Исследование секреции ИЛ-2 и ИФН-γ методом ИФА.
Другой мерой активации и пролиферации эффекторных Т-клеток, связанной с распознаванием клеток, несущих родственный антиген, является выработка эффекторных цитокинов, таких как интерлейкин-2 (ИЛ-2) и интерферон-гамма (ИФН-γ). Количественные исследования методом ИФА для определения ИЛ-2 человека (каталожный номер EH2IL2, Thermo Scientific) и ИФН-γ (каталожный номер KHC4012, Invitrogen) осуществляли, как описано в листках-вкладышах. В общих чертах, по 50 мкл разведенных стандартов или образцов в двух повторах добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и затем вносили по 50 мкл биотинилированного антитела. Образцы смешивали, осторожно постукивая планшет несколько раз. По 50 мкл стандартного раствора для разведения затем добавляли во все лунки, которые не содержали стандартов или образцов, и планшет тщательно запечатывали клейкой крышкой планшета перед инкубацией в течение 3 ч при комнатной температуре (20-25°С). Крышку планшета затем удаляли, содержимое планшетов также удаляли, и каждую лунку заполняли промывочным буфером. Процедуру промывки повторяли в общей сложности 3 раза, и планшет переносили на бумажные полотенца или другой абсорбирующий материал. По 100 мкл приготовленного раствора стрептавидин-ПХ добавляли в каждую лунку, и закрывали новой крышкой планшета перед инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре. Крышку планшета затем удаляли, содержимое планшетов также удаляли, и в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора субстрата ТМВ. Реакционную смесь оставляли на 30 мин для проявления окрашивания при комнатной температуре в темноте, после чего в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора для остановки реакции. Проводили измерение оптической плотности в планшете. Оптическую плотность измеряли в течение 30 мин после остановки реакции на планшет-ридере для ИФА при длине волны 450 нм и 550 нм. Значения, полученные при регистрации при 550 нм, вычитали из значений, полученных при регистрации при 450 нм, и количество ИЛ-2 в неизвестных образцах рассчитывали по отношению к значениям, полученным из стандартной кривой ИЛ-2.
В другом варианте количественные исследования в формате 2-Plex проводили с использованием набора Human Cytokine Magnetic Buffer Reagent (Invitrogen, LHB0001M), набора Human IL-2 Magnetic Bead (Invitrogen, LHC0021M) и набора Human IFN-γ Magnetic Bead (Invitrogen, LHC4031M). В общих чертах, по 25 мкл гранул, конъюгированных с антителом к ИЛ-2 человека, и гранул, конъюгированных с антителом к ИФН-γ, добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и промывали, используя следующие рекомендации: две промывки с использованием 200 мкл 1х промывочного раствора, приведение планшета в контакт с магнитным сепаратором для 96-луночного планшета (Invitrogen, A14179), инкубация гранул в течение 1 мин для осаждения и декантирование жидкости. Затем 50 мкл инкубационного буфера добавляли в каждую лунку планшета, содержащую 100 мкл разведенных стандартов в двух повторах, или 50 мкл образцов (супернатантов из количественных исследований цитотоксичности) и 50 мкл раствора для разведения для количественного исследования в трех повторах в общем объеме 150 мкл. Образцы смешивали в темноте при 600 об/мин с использованием орбитального шейкера с орбитальным радиусом 3 мм в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшет промывали в соответствии с вышеупомянутыми принципами промывки, и в каждую лунку добавляли 100 мкл биотинилированного детектирующего антитела к ИЛ-2 и антитела к ИФН-γ. Образцы смешивали в темноте при 600 об/мин с использованием орбитального шейкера с орбитальным радиусом 3 мм в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывали в соответствии с вышеупомянутыми принципами промывки, и в каждую лунку добавляли по 100 мкл стрептавидина-К-фикоэритрина. Образцы смешивали в темноте при 600 об/мин с использованием орбитального шейкера с орбитальным радиусом 3 мм в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшет промывали 3 раза в соответствии с вышеупомянутыми принципами промывки, и после декантирования жидкости образцы повторно суспендировали в 150 мкл 1х промывочного раствора. Образцы смешивали в темноте при 600 об/мин с использованием орбитального шейкера с орбитальным радиусом 3 мм в течение 3 мин и хранили в течение ночи при 4°С. После этого планшет промывали в соответствии с вышеупомянутыми принципами промывки, и образцы повторно суспендировали в 150 мкл 1х промывочного раствора.
Планшет считывали с использованием системы MAGPIX (Luminex) и программного обеспечения xPONENT. Анализ полученных данных проводили с использованием аналитического программного обеспечения MILLIPLEX, которое обеспечивает стандартную кривую и концентрации цитокинов.
На фиг. 15 показано, что, по сравнению с нетрансдуцированными клетками, или Т-клетками, трансдуцированными контрольным CAR, Т-клетки, трансдуцированные CD19-связывαющим TFP, вырабаты- 129 035618 вают более высокие уровни ИЛ-2 и ИФН-γ при совместном культивировании с клетками Raji, которые эндогенно экспрессируют CD19, или с CD19-трансдуцированными клетками линии HeLa. Напортив, совместное культивирование с CD19-отрицательными клетками К562 или нетрансдуцированными клетками HeLa приводит к незначительному высвобождению цитокинов из TFP-трансдуцированных Т-клеток или вообще не сопровождается выработкой цитокинов. В соответствии с предыдущими данными по цитотоксичности CD19-связывαющие TFP, сконструированные с использованием другой шарнирной области, обеспечивают аналогичные результаты при совместном культивировании с клетками-мишенями, несущими CD19 (фиг. 16).
В соответствии с предыдущими данными по цитотоксичности анти-CD19-CD3ε и анти-CD19-CD3γ обеспечивают самые высокие уровни ИЛ-2 и ИФН-γ из всех конструкций TFP (фиг. 15 и 16). Однако выработка цитокинов Т-клетками, трансдуцированными анти-CD19-CD3ε TFP и αнти-CD19-CD3γ TFP, была сопоставима с таковой для Т-клеток, экспрессирующих анти-CD19 28ζ CAR, несмотря на TFP, демонстрирующие намного более высокие уровни лизиса клеток-мишеней (фиг. 8 и 11). Возможность того, что TFP могут более эффективно лизировать клетки-мишени, чем CAR, но при этом высвобождают сопоставимые или более низкие уровни провоспалительных цитокинов, представляет собой потенциальное преимущество TFP по сравнению с CAR, поскольку повышенные уровни указанных цитокинов были связаны с ограничивающей дозу токсичностью для различных способов адоптивной терапии с применением CAR-T.
Т-клетки, трансдуцированные αнти-ВСМА-CD3ε TFP или анти-ВСМА-CD3γ TFP, также вырабатывали ИЛ-2 и ИФН-γ при совместном культивировании с клетками BCMA-HeLa, но не контрольными клетками линии HeLa, которые не экспрессируют ВСМА(фиг. 17).
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Пример 10. Исследование поверхностного экспонирования CD107а методом проточной цитометрии.
Дополнительный количественный способ исследования активации Т-клеток заключается в оценке поверхностного экспонирования CD107а, связанного с лизосомами мембранного белка (LAMP-1), который расположен в мембране цитоплазматических цитолитических гранул покоящихся клеток. Дегрануляция эффекторных Т-клеток, которая является необходимым условием для цитолитической активности, приводит к мобилизации CD107а к поверхности клетки после индуцированного активацией экзоцитоза гранул. Следовательно, поверхностное экспонирование CD107а обеспечивает дополнительную меру активации Т-клеток, помимо выработки цитокинов, которая сильно коррелирует с цитотоксичностью.
Клетки-мишени и эффекторные клетки промывали по отдельности и повторно суспендировали в среде для оценки цитотоксичности (RPMI + 5% сыворотки АВ человека + 1% смеси антибиотиков и противогрибковых агентов). Количественное исследование проводили путем комбинирования 2х105 эффекторных клеток с 2х105 клеток-мишеней в 100 мкл конечного объема в 96-луночных планшетах с Uобразным дном (Corning) в присутствии 0,5 мкл/лунку РЕ/Су7-меченого антитела к CD107а человека (LAMP-1) (клон Н4А3, BD Biosciences). Культуры затем инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2. Немедленно после инкубации 10 мкл ингибитора секреции монензина, разбавленного в соотношении 1:10 (1000х раствор, BD GolgiStop™), осторожно добавляли в каждую лунку, не затрагивая клетки. Затем планшеты инкубировали в течение еще 2,5 ч при 37°С, 5% CO2. После указанной инкубации клетки окрашивали АРС-конъюгированным антителом к CD3 человека (клон UCHT1, BD Biosciences), PerCP/Су5.5-конъюгированным антителом к CD8 человека (клон SKI, BD Biosciences) и меченым Pacific Blue антителом к CD4 человека (клон RPA-T4, BD Biosciences), и затем инкубировали в течение 30 мин при 37°С, 5% CO2. Клетки затем промывали 2 раза буфером для проточной цитометрии и ресуспендировали в 100 мкл буфера для проточной цитометрии и в 100 мкл буфера IC fix перед проведением исследования. Экспонирование CD107а на поверхности Т-клеток определяли методом проточной цитометрии. Проточную цитометрию проводили на приборе LSRFortessa™ Х20 (BD Biosciences), и анализ данных проточной цитометрии выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo (Treestar, Inc., Эшланд, Орегон, США). Процент эффекторных клеток CD8+ в пропущенной популяции CD3, которые были CD107+ve, определяли для каждой культуры эффекторные клетки/клетки-мишени. В соответствии с предыдущими данными по цитотоксичности и высвобождению цитокинов совместное культивирование CD19-экспрессирующих клеток-мишеней, таких как клетки Raji или Nalm-6, с эффекторными Тклетками, трансдуцированными анти-CD19 28ζ CAR, индуцировало увеличение поверхностного экспонирования CD107а в 3-5 раз, по сравнению с действием эффекторных клеток, инкубированных с CD19ve клетками-мишенями (фиг. 18). Для сравнения, в тех же условиях aнти-CD19-CD3ε LL или анти-CD19CD3Y LL TFP-экспрессирующие эффекторные клетки индуцировали поверхностное экспонирование CD107а в 5-7 раз сильнее. CD19-связывαющие TFP, сконструированные с использованием другой шарнирной области, оказывали аналогичное действие после совместного культивирования с клеткамимишенями, несущими CD19.
По сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками, клетки, трансдуцированные анти-ВСМА-CD3ε или анти-ВСМА-CD3γ TFP, также увеличивали поверхностное экспонирование CD107а при совместном
- 130 035618 культивировании с клетками BCMA+ve RPMI8226 (фиг. 19). Полученные результаты указывают на то, что TFP-трансдуцированные эффекторные Т-клетки активируются и подвергаются дегрануляции при воздействии клеток-мишеней, экспрессирующих когнатный антиген. Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Пример 11. Исследования эффективности у мышей в условиях in vivo.
Чтобы оценить способность эффекторных Т-клеток, трансдуцированных CD19-связывαющими TFP, вызывать противоопухолевые ответы в условиях in vivo, эффекторные Т-клетки, трансдуцированные анти-CD19-28ζ CAR, анти-CD19-CD3ε LL TFP или анти-CD19-CD3γ LL TFP, адаптивно переносили мышам линии NOD/SCID/IL-2RU-/- (NSG-JAX), которым ранее прививали клетки лейкоза человека CD19+ Raji или Nalm6.
Самок мышей линии NOD/SCID/IL-2Ry-/- (NSG-JAX), в возрасте не менее 6 недель до начала исследования, получали из The Jackson Laboratory (артикул 005557) и акклиматизировали в течение 3 дней перед использованием в экспериментах. Клетки лейкоза человека Raji и NALM-6 для прививки поддерживали в логарифмической фазе в культуре до сбора и подсчета с использованием трипанового синего, чтобы определить число жизнеспособных клеток. В день прививки опухоли клетки центрифугировали при 300g в течение 5 мин и повторно суспендировали в предварительно нагретом стерильном ФСБ до достижения концентрации 1х 106 клеток/100 мкл (NALM-6) или 5х105 клеток/100 мкл (Raji). Готовили Тклетки для адоптивного переноса, которые не были трансдуцированы или были трансдуцированы конструкциями анmи-CD19-28ζ CAR, анти-CD19-CD3ε LL TFP или анmи-CD3γ LL TFP. В 0-й день исследования 10 животных в каждой экспериментальной группе иммунизировали путем внутривенного введения 5х105 клеток линии Raji или 1х 106 клеток линии NALM-6. Через 3 дня 5х106 указанных популяций эффекторных Т-клеток внутривенно вводили каждому животному в 100 мкл стерильного ФСБ. Результаты подробных клинических наблюдений за животными регистрировали ежедневно до проведения эвтаназии. Измерения массы тела проводили у всех животных еженедельно до смерти или эвтаназии. Всех животных умерщвляли через 35 дней после адоптивного переноса исследуемых и контрольных продуктов. Любых животных с признаками агонии в ходе исследования умерщвляли по усмотрению руководителя исследования после консультации с ветеринаром.
По сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками адоптивный перенос Т-клеток, трансдуцированных анти-CD19-28ζ CAR, анmи-CD19-CD3ε LL TFP или анти-CD19-CD3γ LL TFP, увеличивал выживаемость мышей, несущих опухоль Raji (фиг. 20А) и Nalm6 (фиг. 20В), это свидетельствует о том, что Тклетки, трансдуцированные CD19-связывающим CAR и TFP, были способны вызывать гибель клетокмишеней с соответствующим увеличением выживаемости в указанных мышиных моделях. В совокупности полученные данные указывают на то, что TFP представляют собой альтернативную платформу для модификации химерных рецепторов, которые проявляют превосходную антигенспецифичную цитолитическую активность по сравнению с CAR первого поколения в условиях in vitro и в условиях in vivo.
Аналогичные эксперименты можно осуществлять с конструкциями FAP.TFP и CAIX.TFP.
Несмотря на то что предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения были представлены и описаны в настоящем документе, специалисты в данной области техники поймут, что указанные варианты реализации приведены исключительно в качестве примера. Многочисленные варианты, изменения и замены будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от сущности настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантов реализации настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, могут быть использованы при реализации настоящего изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения и что способы и конструкции в пределах объема указанной формулы изобретения и их эквиваленты тем самым включены в объем настоящего изобретения.

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая:
    (I) Т-клетку из субъекта-человека, причем Т-клетка содержит молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок (TFP) Т-клеточного рецептора (TCR), причем TFP содержит:
    (a) субъединицу TCR, содержащую:
    (i) по меньшей мере часть внеклеточного домена TCR из внеклеточного домена СОЗ-эпсилон. CD3гамма, СО3-дельта, TCR-альфа или TCR-бета и (ii) внутриклеточный домен TCR, содержащий стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена СОЗ-эпсилон, СО3-гамма, СО3-дельта, TCR-альфа или TCR-бета; и (b) человеческий или гуманизированный домен антитела, содержащий антигенсвязывающий домен;
    причем внеклеточный домен TCR субъединицы TCR и человеческий или гуманизированный домен антитела функционально связаны, и при этом указанный TFP встраивается в TCR при экспрессии в Т-клетке; и (II) фармацевтически приемлемый носитель.
    - 131 035618
  2. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен против CD19 или антигенсвязывающий домен против В-клеточного антигена созревания (ВСМА).
  3. 3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, в которой указанный человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий домен и внеклеточный домен TCR субъединицы TCR функционально связаны посредством линкерной последовательности, необязательно указанная линкерная последовательность содержит (G4S)n, в котором n=1-4.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, в которой указанная субъединица TCR содержит (i) указанный внеклеточный домен TCR, (ii) указанный внутриклеточный домен TCR и дополнительно содержит (iii) трансмембранный домен TCR из СЭЗ-эпсилон, CD3-гамма, CD3-дельта, TCR-альфа или TCR-бета, причем по меньшей мере два из (i), (ii) и (iii) получены из одной и той же субъединицы TCR, необязательно (i), (ii) и (iii) получены из одной и той же субъединицы TCR.
  5. 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, в которой указанный человеческий или гуманизированный домен антитела содержит scFv или однодоменное антитело, где однодоменное антитело необязательно представляет собой домен VH.
  6. 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, в которой человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий домен содержит (i) гипервариабельный участок (CDR) 1 легкой цепи (LC), LC CDR2 и LC CDR3 аминокислотной последовательности CD19-антигенсвязывαющего домена легкой цепи, которые на 70-100% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 29 соответственно, и/или (ii) гипервариабельный участок (CDR) 1 тяжелой цепи (НС), НС CDR2 и НС CDR3 аминокислотной последовательности CD19-связывaющего домена тяжелой цепи, которые на 70-100% идентичны последовательностям SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 35 соответственно.
  7. 7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, в которой молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимулирующий домен, необязательно костимулирующий домен представляет собой функциональный сигнальный домен, полученный из белка, выбранного из группы, состоящей из ОХ40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1ВВ (CD137), и их аминокислотных последовательностей, имеющих по меньшей мере одну, но не более 20 модификаций.
  8. 8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, в которой указанная Т-клетка представляет собой первичную Т-клетку.
  9. 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, в которой указанная Т-клетка представляет собой CD8+ или CD4+ Т-клетку.
  10. 10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9, в которой Т-клетка дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере часть ингибирующей молекулы, где по меньшей мере часть ингибирующей молекулы связана со вторым полипептидом, который содержит положительный сигнал из внутриклеточного сигнального домена, необязательно ингибирующая молекула содержит первый полипептид, который содержит по меньшей мере часть PD1, и второй полипептид, содержащий костимулирующий домен и первичный сигнальный домен.
  11. 11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, в которой Т-клетка образует конъюгат с клеткой человека, экспрессирующей антиген, который специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом, выработка IL-2 Т-клеткой увеличивается в присутствии клетки человека, экспрессирующей антиген, который специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом, или Тклетка проявляет увеличенную цитотоксичность в отношении клетки человека, экспрессирующей антиген, который специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом.
  12. 12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-11, в которой внутриклеточный домен TCR содержит стимулирующий домен из внутриклеточного сигнального домена СЭЗ-эпсилон. CD3-гамма или CD3-дельта.
  13. 13. Способ лечения млекопитающего, страдающего раком, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-12.
  14. 14. Способ по п.13, характеризующийся тем, что рак представляет собой гематологический рак.
  15. 15. Способ по п.14, характеризующийся тем, что гематологический рак выбран из группы, состоящей из острой В-клеточной лимфоидной лейкемии (B-ALL), острой Т-клеточной лимфоидной лейкемии (T-ALL), острой лимфобластной лейкемии (ALL); хронической миелогенной лейкемии (CML), хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL); В-клеточной пролимфоцитарной лейкемии, новообразования бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной Вклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лейкоза ворсистых клеток, мелкоклеточной фолликулярной лимфомы, крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, лимфомы MALT-типа, лимфомы из клеток мантийной зоны, лимфомы из клеток маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии, миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластической лимфомы, новообразования плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, предлейкоза и их комбинаций.
EA201792420A 2015-05-18 2016-05-18 Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков EA035618B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562163342P 2015-05-18 2015-05-18
PCT/US2016/033146 WO2016187349A1 (en) 2015-05-18 2016-05-18 Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201792420A1 EA201792420A1 (ru) 2018-04-30
EA035618B1 true EA035618B1 (ru) 2020-07-16

Family

ID=57320750

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792420A EA035618B1 (ru) 2015-05-18 2016-05-18 Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков
EA202090931A EA202090931A3 (ru) 2015-05-18 2016-05-18 Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202090931A EA202090931A3 (ru) 2015-05-18 2016-05-18 Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков

Country Status (20)

Country Link
US (6) US10442849B2 (ru)
EP (3) EP3298033B2 (ru)
JP (4) JP2018515123A (ru)
KR (1) KR20180029201A (ru)
CN (2) CN114634943A (ru)
AU (2) AU2016264323B2 (ru)
BR (1) BR112017024757A2 (ru)
CA (1) CA2986254A1 (ru)
DK (1) DK3298033T4 (ru)
EA (2) EA035618B1 (ru)
ES (1) ES2819976T5 (ru)
FI (1) FI3298033T4 (ru)
HK (1) HK1252643A1 (ru)
HU (1) HUE051661T2 (ru)
IL (2) IL303905A (ru)
MX (1) MX2017014822A (ru)
PL (1) PL3298033T5 (ru)
PT (1) PT3298033T (ru)
SG (1) SG10201914069SA (ru)
WO (1) WO2016187349A1 (ru)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9273283B2 (en) * 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
WO2016187349A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Tcr2, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2017004252A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Redirected cells with mhc chimeric receptors and methods of use in immunotherapy
WO2017027291A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific car t-cells for solid tumor targeting
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
WO2017059796A1 (en) * 2015-10-08 2017-04-13 Shanghai Sidansai Biotechnology Co., Ltd Activation and expansion of t cells
RU2767209C2 (ru) 2015-10-23 2022-03-16 Еурека Терапьютикс, Инк. Химерные конструкции антитело/т-клеточный рецептор и их применения
WO2017162797A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins of pd-1 and 4-1bb
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
US10086055B2 (en) * 2016-06-01 2018-10-02 Promab Biotechnologies, Inc. Adherent cancer cell line expressing a hematological tumor antigen
AU2017306432A1 (en) 2016-08-02 2019-03-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
US11307205B2 (en) 2016-09-19 2022-04-19 University Of Southern California Non-radioactive cytotoxicity assays
MX2019003489A (es) 2016-09-27 2020-01-23 Cero Therapeutics Inc Moleculas del receptor de envolvimiento quimerico.
DK3445787T3 (da) * 2016-10-07 2021-03-01 Tcr2 Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til omprogrammering af t-cellereceptorer under anvendelse af fusionsproteiner
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CA3047999A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 TCR2 Therapeutics Inc. Engineered t cells for the treatment of cancer
EP3609536B1 (en) * 2017-01-05 2022-03-09 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Humanized anti-cd19 antibody and use thereof with chimeric antigen receptor
CN110582509A (zh) * 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
WO2018166589A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen receptors and uses thereof
JP2020517287A (ja) 2017-04-26 2020-06-18 ユーリカ セラピューティックス， インコーポレイテッド キメラ抗体／ｔ細胞受容体構築物及びその使用
CA3059820A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
PT3618842T (pt) * 2017-05-01 2024-01-12 Juno Therapeutics Inc Combinação de uma terapia celular e de um composto imunomodulador
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
AU2018367896B2 (en) 2017-05-12 2023-06-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
AU2018298884A1 (en) 2017-07-14 2020-02-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Improved dual specificity polypeptide molecule
WO2019067328A1 (en) 2017-09-26 2019-04-04 Cero Therapeutics, Inc. CHIMERIC ENGINEERING RECEPTOR MOLECULES AND METHODS OF USE
WO2019089982A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
CN110662771B (zh) * 2018-02-01 2023-07-28 南京驯鹿生物技术股份有限公司 一种结合bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
CA3074526C (en) * 2018-02-01 2021-08-03 Nanjing Iaso Biotherapeutics Co., Ltd. Chimeric antigen receptor (car) binding to bcma and application thereof
EP3749349A4 (en) * 2018-02-10 2021-11-24 Berkeley Lights, Inc. MUTANT IDH1 SPECIFIC T CELL RECEPTOR
BR112020016138A2 (pt) 2018-02-11 2020-12-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Receptores de células t não restritos ao hla e usos dos mesmos
MX2020008542A (es) 2018-02-17 2021-01-08 Flagship Pioneering Innovations V Inc Composiciones y métodos para el suministro de proteínas membranales.
EP3765039A4 (en) * 2018-03-09 2021-12-08 TCR2 Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR REPROGRAMMING TCR USING FUSION PROTEINS
WO2019191334A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
EP3774869A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Expression vectors for chimeric engulfment receptors, genetically modified host cells, and uses thereof
US20210023135A1 (en) 2018-03-28 2021-01-28 Cero Therapeutics, Inc. Cellular immunotherapy compositions and uses thereof
CA3099364A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer comprising engineered t cells comprising modified chimeric antigen receptors
JP7447388B2 (ja) * 2018-07-13 2024-03-12 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッド 感染性疾患の治療のための共受容体システム
WO2020023888A2 (en) * 2018-07-26 2020-01-30 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using target specific fusion proteins
CN109735558B (zh) * 2018-12-12 2022-04-15 中南大学 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用
WO2020147708A1 (en) * 2019-01-14 2020-07-23 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric receptor polypeptides and uses thereof
US20220144916A1 (en) * 2019-02-12 2022-05-12 Board Of Regents, The University Of Texas System High affinity engineered t-cell receptors targeting cmv infected cells
EP3715368A1 (en) 2019-03-28 2020-09-30 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Chimeric antigen receptors, vectors coding for such receptors and their use in the modification of t cells
WO2020201527A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Umc Utrecht Holding B.V. Modified immune receptor constructs
CA3137519A1 (en) * 2019-04-22 2020-10-29 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
MX2021013359A (es) 2019-04-30 2022-01-31 Crispr Therapeutics Ag Terapia de celulas alogénicas de neoplasias malignas de células b usando células t modificadas genéticamente dirigidas a cd19.
WO2020243158A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 The University Of Vermont And State Agricultural College Gamma-delta t cell ligands for cancer immunotherapy
MX2021015433A (es) 2019-07-02 2022-06-08 Hutchinson Fred Cancer Res Vectores ad35 recombinantes y mejoras de la terapia génica relacionadas.
DE102019121007A1 (de) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2021067875A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
CN110964122B (zh) * 2019-12-24 2022-04-15 南京北恒生物科技有限公司 T细胞受体融合蛋白及其用途
EP4126962A1 (en) * 2020-04-01 2023-02-08 Medigene Immunotherapies GmbH Cd3-fusion protein and uses thereof
WO2021226289A2 (en) * 2020-05-05 2021-11-11 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using cd70 specific fusion proteins
WO2022020720A1 (en) * 2020-07-24 2022-01-27 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating cancer
WO2022036287A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Anti-cd72 chimeric receptors and uses thereof
WO2022036285A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancer with chimeric tim receptors in combination with inhibitors of poly (adp-ribose) polymerase
WO2022036265A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim receptors and uses thereof
WO2022104035A2 (en) 2020-11-13 2022-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Enhanced antigen reactivity of immune cells expressing a mutant non-signaling cd3 zeta chain
CN112521513B (zh) * 2020-12-15 2021-08-24 青岛西凯生物技术有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体(car)及其应用
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
WO2022147480A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma, Inc. Oncolytic virus encoding sialidase and multispecific immune cell engager
US20240131157A1 (en) * 2021-02-15 2024-04-25 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Customized chimeric antigen receptor polypeptides
WO2022177966A1 (en) * 2021-02-16 2022-08-25 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for the treatment of hiv
WO2022187591A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
WO2022192286A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and rna interference
JP2024518378A (ja) 2021-05-05 2024-05-01 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質
WO2023010097A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
WO2023010436A1 (zh) * 2021-08-05 2023-02-09 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 Tcr表达构建体以及其制备方法和用途
AU2022324456A1 (en) 2021-08-05 2024-02-15 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
WO2023034569A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
WO2023034571A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
WO2023081767A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Precision Biosciences, Inc. Methods for immunotherapy
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2023108150A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110189141A1 (en) * 2009-05-19 2011-08-04 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Multiple target t cell receptor
US20130323247A1 (en) * 2008-11-07 2013-12-05 Micromet Ag Treatment of acute lymphoblastic leukemia

Family Cites Families (269)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1009390A (en) 1910-04-18 1911-11-21 Miehle Printing Press & Mfg Manufacture of printing-plates.
US1035847A (en) 1910-05-23 1912-08-20 William P Bettendorf Means for cushioning the bodies of railway-cars.
US1020828A (en) 1911-12-11 1912-03-19 William A Rees Electric washing-machine.
US1044284A (en) 1912-04-29 1912-11-12 Gen Electric Heating device.
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5906936A (en) * 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
DE69233204T2 (de) 1991-12-13 2004-07-15 Xoma Corp., Berkeley Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
WO1993019163A1 (en) 1992-03-18 1993-09-30 Yeda Research And Development Co, Ltd. Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DE60039510D1 (de) 1999-05-27 2008-08-28 Us Gov Health & Human Serv Immunokonjugate mit hoher bindungsaffinität
IL147095A0 (en) 1999-06-16 2002-08-14 Myelos Corp Retro-inverso peptides derived from leukemia inhibitory factor
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6905874B2 (en) 2000-02-24 2005-06-14 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
AU2001271589A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Zymogenetics Inc. Mammalian secreted proteins
EP1334188B1 (en) 2000-11-07 2006-08-30 City of Hope Cd19-specific redirected immune cells
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
AU2003208839A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Micromet Ag De-immunized (poly)peptide constructs
DE10244457A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur rationalen Mutagenese von alpha/beta T-Zell Rezeptoren und entsprechend mutierte MDM2-Protein spezifische alpha/beta T-Zell Rezeptoren
NZ563471A (en) 2002-11-08 2009-04-30 Ablynx Nv Camelidae antibodies against imminoglobulin E and use thereof for the treatment of allergic disorders
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US7251470B2 (en) 2003-06-25 2007-07-31 Nokia Corporation Emergency response system with personal emergency device
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
ES2458636T3 (es) 2003-08-18 2014-05-06 Medimmune, Llc Humanización de anticuerpos
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
NZ546173A (en) 2003-10-16 2009-04-30 Micromet Ag Multispecific deimmunized CD3-binders
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
DE602004027291D1 (de) 2003-11-25 2010-07-01 Us Gov Health & Human Serv Mutierte anti-cd22-antikörper und immunkonjugate
US20050238626A1 (en) 2004-04-01 2005-10-27 Lili Yang Antigen specific T cell therapy
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
US20080294058A1 (en) 2004-08-16 2008-11-27 Dror Shklarski Wearable Device, System and Method for Measuring a Pulse While a User is in Motion
US9707302B2 (en) 2013-07-23 2017-07-18 Immunomedics, Inc. Combining anti-HLA-DR or anti-Trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, PARP inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
ES2386367T3 (es) 2005-03-10 2012-08-17 Morphotek, Inc. Anticuerpos anti-mesotelina
EP1885758A2 (en) 2005-05-12 2008-02-13 The Government of the United States of America as Represented by The Department of Health and Human Services Anti-mesothelin antibodies useful for immunological assays
AU2006283532B2 (en) 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
AT503861B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von t-zell-rezeptoren
CA2967847C (en) 2007-03-30 2023-08-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
GB0721686D0 (en) 2007-11-05 2007-12-12 Medinnova As Polypeptides
CA2706529C (en) 2007-11-26 2016-10-25 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Anti-mesothelin antibodies and uses therefor
US9308257B2 (en) 2007-11-28 2016-04-12 Medimmune, Llc Protein formulation
KR20090092900A (ko) 2008-02-28 2009-09-02 신준호 어린이 및 노약자 안전보호시스템
US20090322513A1 (en) 2008-06-27 2009-12-31 Franklin Dun-Jen Hwang Medical emergency alert system and method
CA2735456C (en) 2008-08-26 2021-11-16 City Of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
AU2009290543B2 (en) 2008-09-12 2015-09-03 Oxford University Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
MX338038B (es) 2008-10-01 2016-03-30 Amgen Res Munich Gmbh Anticuerpo de una sola cadena bis-especifico de pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinaxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 o fapalfaxcd3 de especies cruzadas.
CA2753158A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Humanized antibodies that bind to cd19 and their uses
CN102421801B (zh) * 2009-03-10 2016-03-16 比奥根Ma公司 抗-bcma抗体
WO2010124188A1 (en) 2009-04-23 2010-10-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human ror1 antibodies
WO2011050327A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Forsight Labs Llc Corneal denervation for treatment of ocular pain
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
EP2361936B1 (en) 2010-02-25 2016-04-20 Affimed GmbH Antigen-binding molecule and uses thereof
PT2552959T (pt) 2010-03-26 2017-04-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticorpos para muc16 e métodos de utilização dos mesmos
EP2593796A4 (en) 2010-07-16 2016-07-27 Auckland Uniservices Ltd BACTERIAL NITROREDUCTASE ENZYMES AND ASSOCIATED METHODS
WO2012033885A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
SI2632954T2 (sl) 2010-10-27 2021-11-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Sredstva in postopki za zdravljenje dlbcl
NZ609967A (en) 2010-10-27 2015-04-24 Baylor College Medicine Chimeric cd27 receptors for redirecting t cells to cd70-positive malignancies
US9758586B2 (en) 2010-12-01 2017-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric rabbit/human ROR1 antibodies
MX347078B (es) 2010-12-09 2017-04-10 Univ Pennsylvania Uso de celulas t modificadas por receptor de antigeno quimerico para tratar cancer.
GB201020995D0 (en) 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
PH12018500046A1 (en) 2010-12-20 2019-04-08 Genentech Inc Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates
ES2634098T3 (es) 2011-01-14 2017-09-26 The Regents Of The University Of California Anticuerpos terapéuticos contra la proteína ROR-1 y procedimientos para el uso de los mismos.
JP2014509841A (ja) 2011-01-18 2014-04-24 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌を治療するための組成物および方法
WO2012123590A1 (de) 2011-03-17 2012-09-20 Miltenyi Biotec Gmbh Tcralpha/beta-depletierte zellpräparationen
EP3459560B1 (en) 2011-04-08 2021-02-24 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
BR112014006176A8 (pt) 2011-09-16 2017-09-12 Univ Pennsylvania Rna transcrito in vitro ou rna sintético, composição, método para gerar uma população de células t geneticamente modificadas por rna, e, uso de uma célula t geneticamente modificada
US9688740B2 (en) 2011-10-26 2017-06-27 National Cancer Center Mutant CTLA4 gene transfected T cell and composition including same for anticancer immunotherapy
WO2013063419A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
ES2861435T3 (es) 2011-11-03 2021-10-06 Univ Pennsylvania Composiciones específicas de B7-H4 aisladas y métodos de uso de las mismas
WO2013070468A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013083809A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Prevention of adverse effects caused by epcamxcd3 bispecific antibodies
AU2013221672B2 (en) 2012-02-13 2017-11-09 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
EA201491573A1 (ru) * 2012-02-22 2015-03-31 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Применение передающего сигнал домена cd2 в химерных антигенспецифических рецепторах второго поколения
WO2013126712A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
EP2828290B1 (en) 2012-03-23 2018-08-15 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
RU2766608C2 (ru) 2012-04-11 2022-03-15 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания b-клеток
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
US9127081B2 (en) 2012-05-10 2015-09-08 Washington University Tumor targeted TNF-related apoptosis inducing ligand fusion polypeptide and nucleic acids encoding the same
DK2855667T3 (da) * 2012-05-25 2023-10-30 Cellectis Fremgangsmåder til manipulation af allogeniske og immunosuppressiv-resistante T-celler til immunterapi
EP2872617A4 (en) 2012-07-13 2015-12-09 Univ Pennsylvania EXTENSION OF EPITOPES IN RELATION TO T CAR LYMPHOCYTES
MX370495B (es) 2012-07-13 2019-12-13 Univ Pennsylvania Métodos para evaluar la conveniencia de células t transducidas para administración.
EP2872526B1 (en) 2012-07-13 2020-04-01 The Trustees of the University of Pennsylvania Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody
JP6574381B2 (ja) 2012-08-20 2019-09-11 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 細胞免疫療法のための方法および組成物
EP2900695B1 (en) 2012-09-27 2018-01-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin antibodies and methods for eliciting potent antitumor activity
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
CN104853766A (zh) 2012-10-02 2015-08-19 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
JP6571527B2 (ja) 2012-11-21 2019-09-04 ウーハン ワイゼットワイ バイオファルマ カンパニー リミテッドＷｕｈａｎ Ｙｚｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 二重特異性抗体
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
US10077315B2 (en) 2013-02-05 2018-09-18 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3 and BCMA
CA3115383A1 (en) 2013-02-06 2014-08-14 Celgene Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
DK3300745T3 (da) 2013-02-15 2019-11-04 Univ California Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
TW201446794A (zh) * 2013-02-20 2014-12-16 Novartis Ag 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
CN105874061B (zh) 2013-02-26 2021-08-10 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
US9393257B2 (en) 2013-03-01 2016-07-19 Regents Of The University Of Minnesota TALEN-based gene correction
JP6420776B2 (ja) 2013-03-05 2018-11-07 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫療法のためのエンゲージャー細胞
KR102466666B1 (ko) 2013-03-15 2022-11-15 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
US9446105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimeric antigen receptor specific for folate receptor β
US10238690B2 (en) 2013-03-15 2019-03-26 Celgene Corporation Modified T lymphocytes comprising an inducible caspase and methods of apoptosis
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
EP2968541A4 (en) 2013-03-15 2017-02-08 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
ES2831315T3 (es) 2013-04-03 2021-06-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Generación efectiva de células T dirigidas al tumor derivadas de células madre pluripotentes
LT3546572T (lt) 2013-05-13 2024-05-27 Cellectis Cd19 specifinis chimerinis antigeno receptorius ir jo panaudojimas
US11311575B2 (en) 2013-05-13 2022-04-26 Cellectis Methods for engineering highly active T cell for immunotherapy
SG11201509609SA (en) 2013-05-24 2015-12-30 Univ Texas Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
ES2645393T3 (es) 2013-05-29 2017-12-05 Cellectis Métodos de manipulación de linfocitos T para inmunoterapia usando el sistema de nucleasa Cas guiada por ARN
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
EP3019622A4 (en) 2013-07-12 2017-06-14 Zymeworks Inc. Bispecific cd3 and cd19 antigen binding contructs
JP6516740B2 (ja) 2013-08-02 2019-05-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 幹細胞及びキメラ抗原受容体を介した抗腫瘍性ｔ細胞免疫の改変
NZ718283A (en) 2013-09-25 2022-05-27 Cytomx Therapeutics Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
GB201317929D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
AU2014337367B2 (en) 2013-10-15 2020-04-30 The Scripps Research Institute Peptidic chimeric antigen receptor T cell switches and uses thereof
US20150238631A1 (en) 2013-10-15 2015-08-27 The California Institute For Biomedical Research Chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
JP2017504601A (ja) 2013-12-20 2017-02-09 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 免疫療法のためにマルチインプットシグナル感受性ｔ細胞を操作する方法
DK3083671T3 (da) 2013-12-20 2020-12-07 Hutchinson Fred Cancer Res Mærkede kimære effektormolekyler og receptorer deraf
CN106459182B (zh) 2013-12-30 2021-09-03 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
AU2015206040B2 (en) 2014-01-14 2018-11-01 Cellectis Chimeric antigen receptor using antigen recognition domains derived from cartilaginous fish
EP3097117B1 (en) * 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
EP3097123A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-ny-br-1 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
KR20210020165A (ko) 2014-02-04 2021-02-23 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
JP6640726B2 (ja) 2014-02-14 2020-02-05 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム キメラ抗原受容体及びその製造方法
KR102157924B1 (ko) 2014-02-14 2020-10-26 셀렉티스 면역 세포들 및 병리 세포들 둘 다에 존재하는 항원을 타겟팅하기 위하여 조작된 면역치료용 세포들
WO2015124715A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory t cells
CA2935748A1 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Immunomedics, Inc. Humanized rfb4 anti-cd22 antibody
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
WO2015142661A1 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
JP6726656B2 (ja) 2014-04-01 2020-07-22 バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハーＢｉｏｎｔｅｃｈ Ｃｅｌｌ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｇｍｂｈ クローディン６特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ
JP6698546B2 (ja) 2014-04-14 2020-05-27 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 癌免疫療法のためのｂｃｍａ（ｃｄ２６９）特異的キメラ抗原受容体
RU2741899C2 (ru) 2014-04-25 2021-01-29 Блубёрд Био, Инк. Улучшенные способы производства средств адоптивной клеточной терапии
EP3998278A1 (en) 2014-04-25 2022-05-18 2seventy bio, Inc. Mnd promoter chimeric antigen receptors
CA2984484C (en) 2014-05-02 2024-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor t cells
CN106535925A (zh) 2014-05-23 2017-03-22 佛罗里达大学研究基金会有限公司 基于car的免疫治疗
EP3145954A1 (en) 2014-05-23 2017-03-29 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Anti- egfr conformational single domain antibodies and uses thereof
ES2791953T3 (es) 2014-06-06 2020-11-06 Us Health Receptores de antígeno quimérico dirigidos a mesotelina y usos de los mismos
WO2016011210A2 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Juno Therapeutics, Inc. Engineered cells for adoptive cell therapy
MX2017001011A (es) 2014-07-21 2018-05-28 Novartis Ag Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma.
EP3172231B1 (en) 2014-07-24 2021-05-05 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
MX367787B (es) 2014-07-29 2019-09-06 Cellectis Receptores de antígenos quimericos ror1 (ntrkr1) específicos para inmunoterapia del cáncer.
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3177711B1 (en) 2014-08-07 2024-04-24 Northwestern University Use of ligands for the programmed cell death receptor conjugated to solid supports for the expansion of human regulatory t cells
WO2016022994A2 (en) 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity pd-1 agents and methods of use
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
AU2015301921A1 (en) 2014-08-12 2017-03-02 Celgene Corporation Car-T lymphocytes engineered to home to lymph node B cell zone, skin, or gastrointestinal tract
BR112017003835A2 (pt) 2014-08-28 2018-04-10 Bioatla Llc receptor de antígeno quimérico, vetor de expressão, célula citotóxica engenheirada geneticamente, composição farmacêutica, e, métodos para produção de um receptor de antígeno quimérico e para tratamento de uma doença em um indivíduo.
GB201415347D0 (en) 2014-08-29 2014-10-15 Ucl Business Plc Signalling system
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
US20180133252A9 (en) 2014-09-09 2018-05-17 Unum Therapeutics Inc. Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
JP6657195B2 (ja) 2014-09-19 2020-03-04 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｌ１３Ｒα２を標的とする共刺激性キメラ抗原レセプターＴ細胞
WO2016054520A2 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 The California Institute For Biomedical Research Engineered cell surface proteins and uses thereof
AU2015330017A1 (en) 2014-10-07 2017-04-27 Cellectis Method for modulating car-induced immune cells activity
ES2879612T3 (es) 2014-10-20 2021-11-22 Juno Therapeutics Inc Métodos y composiciones para dosificación en terapia celular adoptiva
CA2964958A1 (en) † 2014-10-31 2016-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for modified t cells
EP3215139B1 (en) 2014-11-03 2020-08-19 Cerus Corporation Compositions and methods for improved car-t cell therapies
CA2966538A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Juno Therapeutics, Inc. Methods for transduction and cell processing
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
BR112017010513A2 (pt) 2014-11-20 2018-04-03 F. Hoffmann-La Roche Ag ?cadeias leves comuns e métodos de uso?
ES2692206T3 (es) 2014-11-26 2018-11-30 Miltenyi Biotec Gmbh Inmunoterapia combinada de receptores de reconocimiento de antígenos y células hematopoyéticas para el tratamiento de enfermedades
EP3029067A1 (en) 2014-12-01 2016-06-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Use of blocking-reagents for reducing unspecific T cell-activation
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
AU2015358400B2 (en) 2014-12-03 2020-09-10 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for adoptive cell therapy
CN113429485A (zh) 2014-12-05 2021-09-24 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b-细胞成熟抗原的抗体及其用途
FI3227432T3 (fi) 2014-12-05 2024-01-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center B-solujen kypsymisantigeeniin kohdistuvia kimeerisiä antigeenireseptoreita ja niiden käyttötarkoituksia
MX2017007242A (es) 2014-12-05 2018-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Receptores de antigeno quimerico que se dirigen al receptor acoplado a la proteina g y sus usos.
WO2016097231A2 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Cellectis INHIBITORY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (iCAR OR N-CAR) EXPRESSING NON-T CELL TRANSDUCTION DOMAIN
EP3037170A1 (en) 2014-12-27 2016-06-29 Miltenyi Biotec GmbH Multisort cell separation method
EP3240803B1 (en) 2014-12-29 2021-11-24 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2018503399A (ja) 2015-01-14 2018-02-08 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 多特異性免疫調節抗原結合構築物
EP3760644A1 (en) 2015-01-16 2021-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
GB201501175D0 (en) 2015-01-23 2015-03-11 Univ Oslo Hf A universal T-cell for personalised medicine
EP3250611B1 (en) 2015-01-26 2021-04-21 The University of Chicago Car t-cells recognizing cancer-specific il 13r-alpha2
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
WO2016123675A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 The University Of Queensland Targeting constructs for delivery of payloads
CN107635578A (zh) 2015-02-05 2018-01-26 Stc.Unm 公司 抗前‑bcr拮抗剂和方法
US20160228547A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor targeting of tumor endothelium
WO2016130598A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
KR102607152B1 (ko) 2015-02-12 2023-11-27 유니버시티 헬스 네트워크 키메라 항원 수용체
US20160237407A1 (en) 2015-02-17 2016-08-18 Batu Biologics, Inc. Universal donor chimeric antigen receptor cells
EP3865139B1 (en) 2015-02-18 2023-05-03 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
MX2017010721A (es) 2015-02-24 2018-08-28 Univ California Interruptores transcripcionales activados mediante unión y métodos para su uso.
WO2016138846A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Shanghai Sidansai Biotechnology Co., Ltd Reducing immune tolerance induced by pd‐l1
CN107531805A (zh) 2015-03-05 2018-01-02 弗雷德哈钦森癌症研究中心 免疫调节融合蛋白及其用途
GB201504840D0 (en) 2015-03-23 2015-05-06 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
KR20170134525A (ko) 2015-04-02 2017-12-06 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 Tnfrsf14 / hvem 단백질 및 이의 이용 방법
WO2016187349A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Tcr2, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
DK3909972T3 (da) 2015-06-19 2024-04-29 Sebastian Kobold Pd1-cd28-fusionsproteiner og disses anvendelse i medicin
WO2016210129A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Novel pd-1 immune modulating agents
CA2991040A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 The Johns Hopkins University Immune checkpoint chimeric receptors therapy
US11242375B2 (en) 2015-09-04 2022-02-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use
CN106519037B (zh) 2015-09-11 2019-07-23 科济生物医药（上海）有限公司 可活化的嵌合受体
AU2016333898B2 (en) 2015-10-05 2020-11-12 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human T cell receptor alpha constant region gene
RU2767209C2 (ru) 2015-10-23 2022-03-16 Еурека Терапьютикс, Инк. Химерные конструкции антитело/т-клеточный рецептор и их применения
WO2017079703A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
CN105331585A (zh) 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN109072194B (zh) 2015-12-09 2022-12-27 纪念斯隆-凯特林癌症中心 免疫细胞组合物及其使用方法
EP3393504A1 (en) 2015-12-22 2018-10-31 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
US20170224837A1 (en) 2016-02-10 2017-08-10 Immunomedics, Inc. Combination of abcg2 inhibitors with sacituzumab govitecan (immu-132) overcomes resistance to sn-38 in trop-2 expressing cancers
EP3433280B1 (en) 2016-03-22 2023-04-19 F. Hoffmann-La Roche AG Protease-activated t cell bispecific molecules
WO2017162797A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins of pd-1 and 4-1bb
BR112018070073A2 (pt) 2016-04-01 2019-02-12 Kite Pharma, Inc. receptores de antígeno quimérico e célula t e métodos de uso
DK3468997T3 (da) 2016-06-08 2023-10-02 Xencor Inc Behandling af IgG4-relaterede sygdomme med anti-CD9-antistoffer med tværbinding til CD32B
AU2017306432A1 (en) 2016-08-02 2019-03-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2018044866A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use for treating viral and other infections
DK3445787T3 (da) 2016-10-07 2021-03-01 Tcr2 Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til omprogrammering af t-cellereceptorer under anvendelse af fusionsproteiner
CA3044593A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CA3047999A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 TCR2 Therapeutics Inc. Engineered t cells for the treatment of cancer
WO2018119198A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Windmil Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating the immune system
EP3572427A4 (en) 2017-01-23 2021-04-28 Cafa Therapeutics Limited BCMA TARGETING ANTIBODIES AND ITS USE
EP3592854A1 (en) 2017-04-13 2020-01-15 Cellectis New sequence specific reagents targeting ccr5 in primary hematopoietic cells
JP2020517287A (ja) 2017-04-26 2020-06-18 ユーリカ セラピューティックス， インコーポレイテッド キメラ抗体／ｔ細胞受容体構築物及びその使用
WO2018232020A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EA202090839A1 (ru) 2017-09-27 2021-02-04 Юниверсити Оф Саутерн Калифорния Новые платформы для костимуляции, новые конструкции car и другие улучшения для адаптивной клеточной терапии
GB201800298D0 (en) 2018-01-09 2018-02-21 Autolus Ltd Method
PE20211299A1 (es) 2018-02-01 2021-07-20 Pfizer Receptores de antigeno quimericos dirigidos a cd70
EP3765039A4 (en) 2018-03-09 2021-12-08 TCR2 Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR REPROGRAMMING TCR USING FUSION PROTEINS
WO2019222275A2 (en) 2018-05-14 2019-11-21 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using inducible fusion proteins
WO2020023888A2 (en) 2018-07-26 2020-01-30 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using target specific fusion proteins
EP3844282A4 (en) 2018-08-29 2022-06-01 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ANTI-MESOTHELIN CHIMERAL ANTIGEN RECEPTOR (CAR) CONSTRUCTS AND THEIR USES
US20210253666A1 (en) 2018-08-30 2021-08-19 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US20220347214A1 (en) 2019-03-22 2022-11-03 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
CA3137519A1 (en) 2019-04-22 2020-10-29 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US20210130438A1 (en) 2019-10-28 2021-05-06 The Broad Institute, Inc. Pan-cancer t cell exhaustion genes
AU2021205501A1 (en) 2020-01-10 2022-08-18 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for autoimmunity regulation
WO2021155034A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using muc16 specific fusion proteins
WO2021226289A2 (en) 2020-05-05 2021-11-11 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using cd70 specific fusion proteins
WO2022020720A1 (en) 2020-07-24 2022-01-27 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating cancer
WO2022056321A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using gpc3 specific fusion proteins
WO2022177966A1 (en) 2021-02-16 2022-08-25 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for the treatment of hiv
US20230065936A1 (en) 2021-04-09 2023-03-02 Tcr2 Therapeutics Inc Compositions and methods for treating cancer
WO2023044039A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for treating cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130323247A1 (en) * 2008-11-07 2013-12-05 Micromet Ag Treatment of acute lymphoblastic leukemia
US20110189141A1 (en) * 2009-05-19 2011-08-04 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Multiple target t cell receptor

Also Published As

Publication number Publication date
JP7262535B2 (ja) 2023-04-21
US10442849B2 (en) 2019-10-15
BR112017024757A2 (pt) 2018-11-13
IL255697A (en) 2018-01-31
PL3298033T5 (pl) 2023-10-30
ES2819976T5 (es) 2024-02-23
EA202090931A2 (ru) 2020-07-31
EA201792420A1 (ru) 2018-04-30
CN114634943A (zh) 2022-06-17
US10358474B2 (en) 2019-07-23
JP2021176326A (ja) 2021-11-11
IL255697B1 (en) 2023-07-01
SG10201914069SA (en) 2020-03-30
PL3298033T3 (pl) 2021-02-22
US20180251514A1 (en) 2018-09-06
EA202090931A3 (ru) 2020-10-30
MX2017014822A (es) 2018-04-30
US20200207828A1 (en) 2020-07-02
WO2016187349A1 (en) 2016-11-24
FI3298033T4 (fi) 2023-09-22
HK1252643A1 (zh) 2019-05-31
JP2023085509A (ja) 2023-06-20
JP7047172B2 (ja) 2022-04-04
US11028142B2 (en) 2021-06-08
EP3298033A4 (en) 2018-10-24
EP3770168A1 (en) 2021-01-27
US20230235010A1 (en) 2023-07-27
EP3298033B1 (en) 2020-08-05
AU2016264323B2 (en) 2021-02-18
EP3466967A1 (en) 2019-04-10
AU2016264323A1 (en) 2017-12-14
US20210206827A9 (en) 2021-07-08
JP2018515123A (ja) 2018-06-14
US10358473B2 (en) 2019-07-23
US20180244747A1 (en) 2018-08-30
CN107995913A (zh) 2018-05-04
US20200362011A1 (en) 2020-11-19
PT3298033T (pt) 2020-09-22
US11965012B2 (en) 2024-04-23
AU2016264323A8 (en) 2017-12-21
AU2021203052A1 (en) 2021-06-10
IL303905A (en) 2023-08-01
CN107995913B (zh) 2022-02-11
ES2819976T3 (es) 2021-04-19
KR20180029201A (ko) 2018-03-20
DK3298033T4 (da) 2023-10-02
EP3298033A1 (en) 2018-03-28
IL255697B2 (en) 2023-11-01
HUE051661T2 (hu) 2021-03-29
JP2021184749A (ja) 2021-12-09
US20170166622A1 (en) 2017-06-15
EP3298033B2 (en) 2023-07-12
CA2986254A1 (en) 2016-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11965012B2 (en) Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
AU2019203955B2 (en) Multipartite signaling proteins and uses thereof
KR102319845B1 (ko) 조류 숙주 세포에 대한 crispr-cas 시스템
KR101666228B1 (ko) 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도
KR20210108423A (ko) 아데노 관련 바이러스 (aav) 생산자 세포주 및 관련 방법
KR20230019063A (ko) C9orf72 연관 질환의 치료를 위한 삼중 기능 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터
WO2021050948A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
KR20220016485A (ko) 미엘린 단백질 제로 프로모터를 갖는 aav 벡터, 및 샤르코-마리-투스 질환과 같은 슈반 세포-관련 질환을 치료하기 위한 이의 용도
KR20240037185A (ko) 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도
KR20230117327A (ko) 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물 및 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터
US20240165154A1 (en) Methods and agents for modulating adoptive immunotherapy
CA2522166C (en) Lambda integrase mutein for use in recombination
KR20240022571A (ko) Rna-가이드된 이펙터 동원을 위한 시스템, 방법 및 성분
KR20220042392A (ko) 종양 용해성 백시니아 바이러스