ES2634098T3

ES2634098T3 - Anticuerpos terapéuticos contra la proteína ROR-1 y procedimientos para el uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2634098T3
Application number: ES12734733.4T
Authority: ES
Inventors: Thomas J. Kipps; George F. WIDHOPF II; Bing CUI
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2032-01-13
Also published as: EP2663579A2; US10900973B2; PT2663579T; PL2663579T3; US20180348232A1; EP3885366A3; US20160097776A1; US20210208158A1; US10627409B2; DK3252076T3; CA2981662C; US9523695B2; HUE053720T2; EP2663579A4; US9217040B2; US20170248585A1; ES2865068T3; WO2012097313A2; CA2981662A1; CA3027071A1

Abstract

Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína ROR-1 humana en células cancerosas y comprende una región variable de cadena pesada codificada por un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 13, y una correspondiente región variable de cadena ligera codificada por un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 15, donde el anticuerpo se une a la región similar a Ig del dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana desde la posición 1-147, o a los residuos 130-160 en la región similar a Ig y región ligadora adyacente entre el dominio similar a Ig y el dominio CDR del dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana en posición 1-165.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos terapeuticos contra la protefna ror-1 y procedimientos para el uso de los mismos 5 ANTECEDENTES

Las tirosina cinasas son mediadores importantes de la cascada de senalizacion, determinando papeles clave en diversos procesos biologicos como crecimiento, diferenciacion, metabolismo y apoptosis en respuesta a estfmulos externos e internos. Estudios han implicado el papel de las tirosina cinasas en la fisiopatologfa del 10 cancer. Schlessinger J. (2000) Cell, 103:211-225; y Robinson et al. (2000) Oncogene,19: 5548-5557. MacKeigan y colaboradores usaron un enfoque de iARN a gran escala para identificar cinasas que podrfan regular la supervivencia y apoptosis de una lfnea celular tumoral humana (HeLa), la iARN de ROR1 se encontro como una de las mas potentes en la induccion de apoptosis entre el conjunto de iARN orientadas a cada uno de 73 genes codificantes de cinasa diferentes. MacKeigan et al. (2005) Nat Cell Biol., 7: 591-600. Sin embargo, estos 15 investigadores no examinaron la expresion o funcion de la protefna ROR1 en estas celulas.

La ROR1, receptor huerfano similar a receptor de tirosina cinasa, es una molecula expresada a altos niveles durante la embriogenesis que desempena un papel principal en el desarrollo de esqueleto, pulmones y sistema nervioso. La expresion de ROR1 disminuye en gran medida en celulas de mamffero postparto a niveles que son apenas 20 detectables. La ROR1 es un receptor de membrana con un dominio similar a cinasa intracelular y un dominio rico en cistefna similar a Frizzled extracelular que es comun en receptores de miembros de la familia Wnt. La ROR1 es un miembro de la familia ROR que esta evolutivamente conservado entre Caenorhavditis elegans, Drosophila, ratones y seres humanos. Wilson C, Goberdhan DC, Steller H. Dror, a potential neurotrophic receptor gene, encodes a Drosophila homolog of the vertebrate Ror family of Trk-related receptor tyrosine kinases. Proc Natl Acad Sci USA. 25 1993;90:7109-7113; Oishi et al. (1997) J Biol Chem., 272:11916-11923; Masiakowski et al. (1992) J Biol Chem., 267:26181-26190; Forrester et al. (2002) Cell Mol Life Sci., 59:83-96; and Oishi et al. (1999) Genes Cells, 4:41-56. El papel funcional real de la protefna ROR1 durante la embriogenesis es desconocido, aunque se cree que es un receptor para protefnas Wnt que regulan la polaridad celular y las interacciones de celula con celula.

30 Aunque es principalmente una protefna embrionaria, la ROR1 se expresa excepcionalmente en ciertas celulas cancerosas, incluyendo en LLC, linfoma linfocftico pequeno, linfoma de linfocitos B de celulas marginales, linfoma de Burkett y otros canceres (p.ej., canceres de mama), pero no en tejidos y celulas adultos normales. En un estudio reciente, se encontro que la ROR1, tanto a nivel de ARNm como de protefna, se expresaba en gran medida en linfocitos B de LLC pero no en linfocitos B normales. Ademas, se encontro que la ROR1 es un receptor de Wnt5a, 35 que podrfa inducir la activacion de NF-kB cuando se coexpresa con ROR1 en celulas HEK293 y mejora la supervivencia de celulas de LLC in vitro. Esto indica que la ROR1 es un receptor de senalizacion de la supervivencia a LLC para Wnt5a. Otro estudio encontro que la ROR1 se expresaba tambien en leucemia linfocftica aguda (LLA). Shabani et al. (2007) Tumour Biol., 28:318-326; and Baskar et al. (2008) Clin Cancer Res., 14:396-404. La expresion de protefna ROR1 se ha demostrado ahora en una variedad de canceres hematologicos y de tumores 40 solidos.

El control terapeutico de la expresion de ROR1 es necesario. Sin embargo, aunque estan comercialmente disponibles anticuerpos policlonales anti-ROR1 creados contra el peptido ROR1. Los inventores desarrollaron un anticuerpo monoclonal anti-ROR1, denominado 4A5, que reacciona con la protefna ROR1 nativa y es capaz de 45 detectar la expresion en superficie celular de ROR1 para analisis citometrico de flujo.

Este anticuerpo es divulgado por Fukuda, T. et al., PNAS et al. (2008) 105(8):3047-3052.

Sin embargo, no han estado disponibles anticuerpos terapeuticos robustos con capacidad demostrable para inhibir la 50 proliferacion de celulas cancerosas mediada por ROR1 a un grado que sea terapeuticamente significativo para retardar o prevenir el crecimiento y metastasis.

RESUMEN DE LA INVENCION:

55 La invencion proporciona anticuerpos y combinacion de anticuerpos para la inhibicion in vivo e in vitro de la proliferacion mediada por celulas ROR1 de celulas de sujetos con cancer, incluyendo linfomas, LLC, linfoma linfocftico pequeno, linfoma de linfocitos B de celulas marginales, linfoma de Burkett, carcinoma de celulas renales, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de mama, carcinoma espinocelular epitelial, melanoma, mieloma, cancer de estomago, cancer de cerebro, cancer de pulmon, cancer pancreatico, cancer cervicouterino, cancer de ovario, 60 cancer de hfgado, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer testicular, cancer de tiroides y cancer de cabeza y

cuello, pero no en linfocitos sangufneos o esplenicos de pacientes no leucemicos o adultos normales.

Los anticuerpos de la invencion son tambien utiles para la diferenciacion entre celulas cancerosas que expresan ROR1 ("cancer de ROR1") y celulas normales. Por ejemplo, se proporciona un inmunoensayo que detecta ROR1 en 5 una muestra de un sujeto mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo especffico de ROR1 de la invencion y la deteccion de la inmunorreactividad entre el anticuerpo y ROR1 en la muestra.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invencion, se diagnostica un cancer de ROR1 en un sujeto detectando la presencia o cantidad de protefna ROR1 en una muestra.

10

La presente invencion incluye composiciones que incluyen anticuerpos monoclonales aislados purificados y combinaciones de los mismos que se unen especfficamente a la protefna receptora ROR1.

Breve descripcion de los dibujos

15

La Figura 1 es una serie de graficas que ilustran los resultados del analisis citometrico de flujo de la expansion de linfocitos B de leucemia CD5+B220low en ratones Tg de ROR1 despues de la transferencia adoptiva de 1x107 esplenocitos de un raton Tg de ROR1xTCL1. El panel superior representa la expansion de 2 a 4 semanas despues de la transferencia adoptiva. Se indica el porcentaje de celulas leucemicas en el grafico de curvas de nivel de mCD5 20 (eje x) frente a mB220 (eje y) por encima de la ventana de adquisicion en linfocitos CD5+B220low El panel inferior representa la expresion relativa de ROR1 (eje x) usando el AcM anti-ROR1 4A5.

La Figura 2 es un diagrama que resume el analisis del AcM anti-ROR1 en la transferencia adoptiva y el injerto de esplenocitos leucemicos ROR1 XTCL1. Se procuraron a ratones Tg de ROR1 (4 ratones/grupo) 250 ug de mIgG 25 4A5, D10 o de control por via i.v. el dfa 0. El dfa siguiente, se transfirieron adoptivamente por via i.v. 1x107 esplenocitos de un raton Tg de ROR1 x TCL1. En todos los ratones se monitorizo posteriormente cada semana la expansion de linfocitos B leucemicos CD5+B220low por citometrfa de flujo empezando 2 semanas despues de la transferencia.

La Figura 3 es una serie de graficas que ilustran los resultados de un analisis citometrico de flujo que demuestra que 30 los anticuerpos anti-ROR1 de la invencion inhibfan el desarrollo de leucemia similar a LLC en ratones Tg de ROR1. 2 semanas despues de la transferencia adoptiva, se efectuaron los analisis FACS de PBMC. Los datos mostraban que el anticuerpo anti-ROR1 D10, pero no el anticuerpo anti-ROR1 4A5, inhibfa notablemente la expansion de linfocitos B leucemicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.

La Figura 4A es una serie de graficas que ilustran los resultados de la prueba in vivo en un modelo de murino de 35 cancer de mama humano. Los anticuerpos anti-ROR1 inhibfan la metastasis de cancer de mama en ratones con deficiencia de rag-/- g-/-. Se transfirieron celulas de cancer de mama 5E5 MDA-MB-231 por inyeccion i.v. a ratones rag-/- g-/- el dfa 1. Se inyectaron tambien en ratones con deficiencia de rag-/- g-/- por via i.v. control isotfpico o anticuerpo anti-ROR1 (4A5, D10 y 4A5 mas D10) los dfas 1, 3, 7 y 14 a 100 mg por raton. La Figura 4A (centro) proporciona tambien imagenes de procedimientos de imagenologfa por IVIS in vivo de los ratones anteriores, que se 40 efectuaron cada semana. 5 semanas despues, se sacrificaron los ratones y se efectuaron analisis de histologfa (Figura 4B). El anticuerpo anti-ROR1 D10 y la combinacion de anticuerpos (4A5 mas D10) inhibfan ambos significativamente la metastasis de cancer de mama, siendo la inhibicion por D10 solo mayor que la inhibicion por 4a5 solo.

45 La Figura 5 proporciona una comparacion de secuencia codificante de nucleotidos de la cadena pesada de Ig 4A5 (VH) con la Vh de inmunoglobulina (Ig) de raton y humana de lfnea germinal mas cercana.

La Figura 6 proporciona una comparacion de secuencia codificante de nucleotidos de la cadena pesada de Ig G6 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de raton y humana de lfnea germinal mas cercana.

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La Figura 7 proporciona una comparacion de secuencia codificante de nucleotidos de la cadena pesada de Ig G3 (VH) con la Vh de inmunoglobulina (Ig) de raton y humana de lfnea germinal mas cercana La Figura 8 proporciona una comparacion de secuencia codificante de nucleotidos de la cadena pesada de Ig H10 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de raton y humana de lfnea germinal mas cercana La Figura 9 proporciona una comparacion de 55 secuencia codificante de nucleotidos de la cadena pesada de Ig D10 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de raton y humana de lfnea germinal mas cercana La Figura 10 es un diagrama y grafico que representa la naturaleza altamente conservada de ROR1 humana y de murino.

La Figura 11 es una comparacion nucleotfdica que representa la estructura de dominio y la homologfa de secuencia de la protefna extracelular ROR1 humana y de murino.

La Figura 12 es un grafico que indica el dominio extracelular con que los AcM anti-ROR1 se unen a la protefna ROR1.

La Figura 13 es un diagrama que representa las protefnas ROR1 quimericas generadas para determinar el dominio 5 de union de cada uno de los AcM anti-ROR1.

La Figura 14 es un diagrama que representa las protefnas ROR1 truncadas generadas para determinar las subregiones con que se une cada uno de los AcM anti-ROR1.

La Figura 15 es un diagrama que representa los aminoacidos que se murinizaron para determinar los residuos crfticos para la union de AcM a ROR1 humana y una transferencia Western que muestra que el residuo de acido 10 glutamico 138 es crftico para la union del anticuerpo D10 a ROR1 humana.

La Figura 16 es una grafica que indica los valores de Kd para el anticuerpo D10 (Figura 16a) y 4A5 (Figura 16b).

La Figura 17 es una serie de graficas que ilustran que el anticuerpo anti-ROR1 D10 es altamente activo en ensayos in vivo.

La Figura 18 es un diagrama que resume el analisis de AcM anti-ROR1 en la transferencia adoptiva y el injerto de 15 esplenocitos leucemicos ROR1XTCL1. Se procuraron a ratones Tg de ROR1 (5 ratones/grupo) 250 ug de mIgG 4A5, D10 o de control por via i.v. el dfa 0. El dfa siguiente, se transfirieron adoptivamente por via i.v. 5x105 esplenocitos de un raton Tg de ROR1 x TCL1. En todos los ratones se monitorizo posteriormente cada semana la expansion de linfocitos B leucemicos CD5dullB220+ por citometrfa de flujo empezando 2 semanas despues de la transferencia.

La Figura 19 es una serie de graficas que ilustran los resultados de un analisis citometrico de flujo de anticuerpos 20 anti-ROR1 que inhiben el desarrollo de leucemia similar a LLC en ratones Tg de ROR1. 2 semanas despues de la transferencia adoptiva, se efectuaron los analisis FACS de PBMC. Los datos mostraban que el anticuerpo anti-ROR1 D10, pero no el anticuerpo anti-ROR1 4A5, inhibfa notablemente la expansion de linfocitos B leucemicos CD5duB220+ y ROR1brightB220+.

La Figura 20 es una grafica que ilustra que el anticuerpo anti-ROR1 D10 inhibe el desarrollo y expansion de 25 linfocitos B leucemicos ROR1 x TCL1 en la sangre de animales receptores hasta 2 semanas despues de recibir la ultima infusion del AcM.

La Figura 21 es una representacion de la rapida internalizacion del anticuerpo anti-ROR1 D10 en celulas de LLC.

La Figura 22 es una serie de graficos que ilustran los resultados del analisis citometrico de flujo que muestran que los anticuerpos anti-ROR1 D10 y 4A5 se internalizan ambos en celulas de LLC. Se incubaron las celulas de LLC con 30 Ac-Alex647 anti-hROR1 durante 30 min a 4 °C. Posteriormente, se lavaron las celulas y se dejaron a 4 °C o se incubaron durante 4 horas a 37 °C, seguido de citometrfa de flujo. Se muestra tambien la senal de fondo sin tincion. La Figura 23 es una grafica que ilustra la cinetica de la internalizacion de los anticuerpos anti-ROR1 D10 y 4A5.

La Figura 24 es un diagrama que representa los aminoacidos que se murinizaron para determinar los residuos crfticos para la union de AcM a ROR1 humana y una transferencia Western que muestra que el residuo de isoleucina 35 111 es crftico para la union del anticuerpo 4A5 a ROR1 humana.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

La materia en cuestion divulgada actualmente se describe mas completamente a continuacion. Sin embargo, la 40 materia en cuestion divulgada actualmente puede representarse en muchas formas diferentes y no deberfa considerarse limitada a las realizaciones expuestas en la presente memoria; en lugar de ello, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgacion satisfaga los requisitos legales aplicables. Es mas, se le ocurriran muchas modificaciones y otras realizaciones de la materia en cuestion divulgada actualmente expuesta en la presente memoria a un especialista en la tecnica a la que pertenece la materia en cuestion divulgada actualmente, teniendo el 45 beneficio de las ensenanzas presentadas en las descripciones anteriores y las figuras asociadas. Por lo tanto, ha de entenderse que la materia en cuestion divulgada actualmente no ha de limitarse a las realizaciones especfficas divulgadas y que se pretende que esten incluidas modificaciones y otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

50 Se produjeron de forma monoclonal anticuerpos de la invencion usando tecnicas como se describen anteriormente. Brevemente, los anticuerpos de origen natural son generalmente tetrameros que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Experimentalmente, los anticuerpos pueden escindirse con la enzima proteolftica papafna, que causa la rotura de cada una de las cadenas pesadas, produciendo tres subunidades separadas. Las dos unidades que consisten en una cadena ligera y un fragmento de la cadena pesada aproximadamente igual a la masa 55 de la cadena ligera se denominan fragmentos Fab (es decir, los fragmentos de union a antfgeno). La tercera unidad, consistente en dos segmentos iguales de la cadena pesada, se denomina el fragmento Fc. El fragmento Fc tfpicamente no esta implicado en la union antfgeno-anticuerpo, pero es importante en procesos posteriores implicados en retirar del cuerpo el antfgeno.

60 Debido a que los fragmentos Fab y F(ab')2 son menores que las moleculas de anticuerpo intactas, estan disponibles

mas dominios de union a antfgeno que cuando se usan moleculas de anticuerpo enteras. La escision proteolftica de una molecula de IgG tfpica con papafna es conocida por producir dos fragmentos de union a antfgeno separados denominados fragmentos Fab que contienen una cadena ligera intacta ligada con una porcion aminoterminal de la cadena pesada contigua a traves de un ligamiento disulfuro. La porcion restante de la molecula de inmunoglobulina 5 digerida con papafna es conocida como el fragmento Fc, y consiste en las porciones carboxiterminales del anticuerpo dejadas intactas y ligadas conjuntamente a traves de enlaces disulfuro. Si se digiere un anticuerpo con pepsina, se produce un fragmento conocido como F(ab')2, que carece de la region Fc pero contiene ambos dominios de union a antfgeno mantenidos juntos por enlaces disulfuro entre las cadenas ligera y pesada contiguas (como los fragmentos Fab) y tambien ligamientos disulfuro entre las porciones restantes de las cadenas pesadas contiguas 10 (Handbook of Experimental Immunology. Vol 1: Immunochemistry, Weir, D. M., Editor, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986)).

Como se reconoce facilmente por los especialistas en la tecnica, pueden producirse tambien mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica anticuerpos alterados (p.ej., quimericos, humanizados, injertados con 15 CDR, bifuncionales, dfmeros polipeptfdicos de anticuerpo (es decir, una asociacion de dos componentes de cadena polipeptfdica de un anticuerpo, p.ej., un brazo de un anticuerpo que incluye una cadena pesada y una cadena ligera, o un fragmento Fab que incluye los dominios de anticuerpo VL, CH, CL y CH, o un fragmento Fv que comprende un dominio VL y un dominio VH), anticuerpos monocatenarios (p.ej., un fragmento scFv (es decir, Fv monocatenario) que incluye un dominio VL ligado a un dominio VH por un ligador, y similares).

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La tecnologfa de anticuerpos monoclonales (AcM) puede usarse para obtener AcM de ROR1. Brevemente, se producen hibridomas usando celulas de bazo de ratones inmunizados con antfgenos de ROR1. Se fusionan las celulas de bazo de cada raton inmunizado con celulas Sp 2/0 de mieloma de raton, por ejemplo usando el procedimiento de fusion con polietilenglicol de Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981). Se llevan 25 a cabo el crecimiento de hibridomas, la seleccion en medio HAT, la clonacion y cribado de clones contra antfgenos usando metodologfa estandar (Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981)):

Se inyectan clones seleccionados por HAT en ratones para producir grandes cantidades de AcM en asicitis como se describe por Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981), que puede purificarse usando 30 cromatograffa en columna de protefna A (BioRad, Hercules, Calif.). Los AcM se seleccionan basandose en (a) su especificidad por ROR1, (b) una alta afinidad de union, (c) el isotipo y (d) la estabilidad.

Los AcM pueden cribarse o ensayarse la especificidad por ROR1 usando cualquiera de una variedad de tecnicas estandares, incluyendo transferencia Western (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)) y ensayo 35 de inmunosorcion ligado a enzima (ELISA) (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)).

Pueden generarse formas humanizadas de anticuerpos de raton ligando las regiones de CDR de anticuerpos no humanos con regiones constantes humanas mediante tecnicas de ADN recombinante (veanse, p.ej., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989 y WO 90/0786). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse 40 usando procedimientos de presentacion en fago (veanse, p.ej., Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047). En estos procedimientos, se producen colecciones de fagos en que los miembros presentan diferentes anticuerpos sobre sus superficies externas. Los anticuerpos se presentan habitualmente como fragmentos Fv o Fab. Puede seleccionarse el fago que presenta anticuerpos con una especificidad deseada mediante enriquecimiento por afinidad.

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Pueden seleccionarse anticuerpos humanos por experimentos de union competitiva, o de otro modo, para tener la misma especificidad de epftopo que un anticuerpo de raton particular. Usando estas tecnicas, un anticuerpo de ROR1 humanizado que tiene el dominio de region constante de IgG1 humana y el dominio de region constante de cadena ligera kappa humana con las regiones variables de cadena pesada y ligera de raton. El anticuerpo 50 humanizado tiene la especificidad de union de un AcM de ROR1 de raton, especfficamente el AcM 4A5 descrito en los Ejemplos 4 y 5.

Puede ser deseable producir y usar fragmentos funcionales de un AcM para una aplicacion particular. La estructura basica bien conocida de una molecula de IgG tfpica es una molecula en forma de Y tetramerica simetrica de 55 aproximadamente 150.000 a 200.000 daltones consistente en dos cadenas polipeptfdicas ligeras identicas (que contienen aproximadamente 220 aminoacidos) y dos cadenas polipeptfdicas pesadas identicas (que contienen aproximadamente 440 aminoacidos). Las cadenas pesadas estan ligadas entre sf a traves de al menos un enlace disulfuro. Cada cadena ligera esta ligada con una cadena pesada contigua por un ligamiento disulfuro. Esta localizado un sitio o dominio de union a antfgeno en cada brazo de la molecula de anticuerpo en forma de Y, y esta 60 formado entre las regiones aminoterminales de cada par de cadenas ligera y pesada ligadas por disulfuro. Estas

regiones aminoterminales de las cadenas ligera y pesada consisten en aproximadamente sus primeros 110 aminoacidos aminoterminales y son conocidas como las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. Ademas, dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, hay regiones hipervariables que contienen tramos de secuencias aminoacfdicas conocidos como regiones determinates de la complementariedad (CDR). Las CDR 5 son responsables de la especificidad del anticuerpo por un sitio particular en una molecula de antfgeno denominado epftopo. Por tanto, la molecula de IgG tfpica es divalente al poder unirse a dos moleculas de antfgeno, debido a que cada sitio de union a antfgeno es capaz de unirse al epftopo especffico de cada molecula de antfgeno. Las regiones carboxiterminales de las cadenas ligera y pesada son similares o identicas a aquellas de otras moleculas de anticuerpo y se denominan regiones constantes. La secuencia aminoacfdica de la region constante de las cadenas 10 pesadas de un anticuerpo particular define cual clase de anticuerpo es, por ejemplo IgG, IgD, IgE, IgA o IgM. Algunas clases de anticuerpos contienen dos o mas anticuerpos identicos asociados entre sf en disposiciones de union a antfgeno multivalentes.

Pueden usarse fragmentos Fab y F(ab')2 de AcM que se unen a ROR1 en lugar de AcM enteros. Debido a que los 15 fragmentos Fab y F(ab')2 son menores que las moleculas de anticuerpo intactas, estan disponibles mas dominios de union a antfgeno que cuando se usan moleculas de anticuerpo enteras. La escision proteolftica de una molecula de IgG tfpica con papafna es conocida por producir dos fragmentos de union a antfgeno separados denominados fragmentos Fab que contienen una cadena ligera intacta ligada con una porcion aminoterminal de la cadena pesada contigua a traves de un ligamiento disulfuro. La porcion restante de la molecula de inmunoglobulina digerida con 20 papafna es conocida como el fragmento Fc, y consiste en las porciones carboxiterminales del anticuerpo dejadas intactas y ligadas conjuntamente a traves de enlaces disulfuro. Si se digiere un anticuerpo con pepsina, se produce un fragmento conocido como F(ab')2, que carece de la region Fc pero contiene ambos dominios de union a antfgeno mantenidos juntos por enlaces disulfuro entre las cadenas ligera y pesada contiguas (como los fragmentos Fab) y tambien ligamientos disulfuro entre las porciones restantes de las cadenas pesadas contiguas (Handbook of 25 Experimental Immunology.Con respecto a anticuerpos particulares, "union especffica" hace referencia a la union de anticuerpo a un antfgeno predeterminado. Tfpicamente, el anticuerpo se une con una afinidad correspondiente a una Kd de aproximadamente 10-8 M o menor, y se une al antfgeno predeterminado con una afinidad (expresada por Kd) que es al menos 10 veces menor, y preferiblemente al menos 100 veces menor, que su afinidad de union por un antfgeno no especffico (p.ej., BSA, casefna) distinto del antfgeno predeterminado o un antfgeno estrechamente 30 relacionado. Como alternativa, el anticuerpo puede unirse con una afinidad correspondiente a una Ka de

61 1 1 7 1 8 1 1 Q1

aproximadamente 10 M' o de aproximadamente 10 M', o de aproximadamente 10 M', o de 10 M' o mayor, y se une al antfgeno predeterminado con una afinidad (expresada por Ka) que es al menos 10 veces mayor, y preferiblemente al menos 100 veces mayor, que su afinidad de union por un antfgeno no especffico (p.ej., BSA, casefna) distinto del antfgeno predeterminado o un antfgeno estrechamente relacionado.

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Tambien, la referencia a "un anticuerpo que tiene especificidad de union por la protefna ROR1" incluye fragmentos de anticuerpo que tienen al menos un 90 o 95 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias polipeptfdicas divulgadas en las SEC ID N°: 2. 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18 y 20, incluyendo variantes modificadas por mutacion para mejorar la utilidad de las mismas (p.ej., capacidad mejorada de orientarse a tipos celulares 40 especfficos y similares). Tales variantes incluyen aquellas donde se introducen una o mas sustituciones conservativas en la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo.

Tales variantes incluyen aquellas donde se introducen una o mas sustituciones en la secuencia nucleotfdica de cadena pesada y/o la secuencia nucleotfdica de cadena ligera del anticuerpo. En algunas realizaciones, la variante 45 tiene una cadena ligera y/o una cadena pesada que tiene una secuencia nucleotfdica al menos un 80 % o al menos un 90 % o al menos un 95 % identica a las secuencias nucleotfdicas expuestas en las SEC ID N°: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 y 19.

Las secuencias polinucleotfdicas que codifican rasgos estructurales de los anticuerpos de la invencion incluyen 50 aquellas cuyas secuencias se exponen a continuacion. Cada secuencia polinucleotfdica es seguida por la secuencia aminoacfdica del polipeptido codificado. Las secuencias de cadena ligera que se considera que son "correspondientes" a secuencias de cadena pesada son aquellas enumeradas por ser del mismo anticuerpo; es decir, las secuencias de cadena pesada de F2 corresponden a las secuencias de cadena ligera de F2, las secuencias de cadena pesada de d10 corresponden a las secuencias de cadena ligera de D10 y asf.

la SEC ID N°: 1: Secuencia de codificacion de la region variable de cadena pesada del AcM anti-ROR1 4A5 de raton GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGC-GGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATT

CACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGATTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGCG

TCGCATCCATTAGTCGTG

GTGGTACCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTC AGGAACATC CTGTACCTG

CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGGAAGATATGATTACGA

CGGGTACTATGCAATGGA

CTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA la SEC ID N°: 2: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena pesada del AcM anti-ROR1 4A5 de raton: EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQIPEKRLEWVASISRGGTTYYPDS VKGRFTISRDNVRNILYL

5 QMSSLRSEDTAMYYCGRYDYDGYYAMDYWGQGTSVTVSS

la SEC ID N°: 3: Secuencia de codificacion de la region variable de cadena ligera del AcM anti-ROR1 4A5 de raton: GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTAT CACTTGCAAGGCGAGTCC

GGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGA

TCTATCGTGCAAACAGAT

TGGTTGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACC

ATCAACAGCCTGGAGTAT

GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAATTTCCGTACACGTTCGGAGGGGG

GACCAAGCTGGAAATGAA

AC

10

la SEC ID N°: 4: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena ligera del AcM anti-ROR1 4A5 de raton: DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASPDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF SGGGSGQDYSLTINSLEY

EDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEMK

15 la SEC ID N°: 5: Secuencia de codificacion de la region variable de cadena pesada de los AcM anti-ROR1 F2, F12 y G6 de raton:

GAGGTCCAGCTACAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATC

CTGCAAGGCTTCTGGTTT

CGCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAAACAGACCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGA

TTGGAAGTATTGATCCTT

ACTATGGTGGTTCTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAA

TCCTCCAGCACAGCCTAC

ATGCAACTCAAGAGCCTCACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCCCCGGG

GGGGGACTATGCTATGGA

CTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

la SEC ID N°: 6: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena pesada de los AcM anti-ROR1 F2, F12 y G6 de raton:

5

EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGFAFTGYNMNWVKQTNGKSLEWIGSIDPYYGGSTYTSTQ

KFKDKATLTVDKSSSTAY

MQLKSLTSDDSAVYYCARS PGGDYAMDYWGQGTSVTVSS

la SEC ID N°: 7: Secuencia de codificacion de la region variable de cadena ligera de los AcM anti-ROR1 F2, F12 y G6 de raton:

10

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTGTAGGAGAGAGAGTCACTAT

CACTTGTAAGGCGAGI'CA

GGGCATTAATAGCTATTCAGGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGA TTTATCGTGGAAATAGAT

TGGTGGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACC

ATCAGCAGCCTGGAGTAT

GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGG

GACCAAGCTGGAAATAAA

AC

la SEC ID N°: 8: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena ligera de los AcM anti-ROR1 F2, F12 y G6 de raton:

5

10

15

DIKMTQSPSSMYASVGERVTITCKASQGINSYSGWFQQKPGKSPKTLIYRGNRLVDGVPSRF

SGSGSGQDYSLTISSLEY

EDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK

la SEC ID N°: 9 Secuencia de codificacion de la region variable de cadena pesada del AcM anti-ROR1 G3 de raton: CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTC CTGCAAGGCTTCTGGCTA

CAACTTCACCAACTACTGGATAAACTGGGTGAAGCTGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGA

TTGGAGAAATTTATCCTG

GTAGTGGTAGTACTAATTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACA

TCCTCCAGCACAGCCTAC

ATGCAACTCAGCAGCCTGGCATCTGAAGACTCTGCTCTCTATTACTGTGCAAGAGATGGTAA CTACTATGCTATGGACTA .

CTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

la SEC ID N°: 10 Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena pesada del AcM anti-ROR1 G3 de raton: QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYNFTNYWINWVKLRPGQGLEWIGEXYPGSGSTNYNE KFKSKATLTADTS SSTAY

MQLSSLASEDSALYYCARDGNYYAMDYWGQGTSVTVSS

la SEC ID N°: 11 Secuencia de codificacion de la region variable de cadena ligera del AcM anti-ROR1 G3 de ratonCadena ligera:

GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCAT

CACTTGCAGGGCAAGTCA

GGACATTAACAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGA

TCTACTACACATCAGCAT

TACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACC ATTAGCAAC CTGGAACAA

GAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCCGTACACGTTCGGAGG

GGGGACCAAGCTGGAAAT

AAAAC

la SEC ID N°: 12 Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena ligera del AcM anti-ROR1 G3 de ratonCadena ligera:

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSALHSGVPSRF

SGSGSGTDYSLTISNLEQ

EDIATYFCQQGNTLPPYTFGGGTKLEIK 5

la SEC ID N°: 13 Secuencia de codificacion de la region variable de cadena pesada del AcM anti-ROR1 D10 de raton:

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGACTCTGTCCATCAC

TTGCACTGTCTCTGGGTT

TTCATTAACCAGTTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGC

TGGGAGTAATATGGGCTG

GTGGATTCACAAATTATAATTCGGCTCTCAAGTCCAGACTGAGCATCAGCAAAGACAACTCC

AAGAGCCAAGTTCTCTTA

AAAATGACCAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGGAGAGGTAGTTC

CTATTCTATGGACTATTG

GGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

10

la SEC ID N°: 14: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena pesada del AcM anti-ROR1 D10 de raton:

QVQLKESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSDTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGFTNYNSA LKSRLSISKDNSKSQVLL

KMTSLQTDDTAMYY CARRGS SYSMDYWGQGTSVTVS S

15 la SEC ID N°: 15 Secuencia de codificacion de la region variable de cadena ligera del AcM anti-ROR1 D10 de ratonCadena ligera:

GAAATTGTGCTCTCTCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGCCAAAAGGTCACCAT

CACCTGCAGTGCCAGTTC

AAATGTAAGTTACATCCACTGGTACCAGCAGAGGTCAGGCACCTCCCCCAGACCATGGATTT

ATGAAATATCCAAACTGG

CTTCTGGAGTCCCAGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATC

AGCAGCATGGAGGCTGAA

GATGCTGCCATTTATTATTGTCAGCAGTGGAATTATCCTCTTATCACGTTCGGCTCGGGGAC

AAAGTTGGAAATACAA

la SEC ID N°: 16 Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena ligera del AcM anti-ROR1 D10 de ratonCadena ligera:

5

EIVLSQSPAITAASLGQKVTITCSASSNVSYIHWYQQRSGTSPRPWIYEISKLASGVPVRFS

GSGSGTSYSLTISSMEAE

DAAIYYCQQWNYPLITFGSGTKLEIQ

la SEC ID N°: 17: Secuencia de codificacion de la region variable de cadena pesada de los AcM anti-ROR1 H10 y G11 de raton:

10

GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTC

CTGTGCAGCCTCTGGATT

CACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGG

TCGCTTCCATTAGTACTG

GTGCTAGCGCCTACTTTCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AGGAACATC CTGTACCTG

CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTGCAAGGATTACTACGTC

TACCTGGTACTTCGATGT

CTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

la SEC ID N°: 18: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena pesada de los AcM anti-ROR1 H10 y G11 de raton:

15

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISTGASAYFPDS

VKGRFTISRDNARNILYL

QMSSL.RSEDTAMYYCARITTSTWYFDVWGAGTTVTVSS

la SEC ID N°: 19: Secuencia de codificacion de la region variable de cadena ligera de los AcM H10 y G11 anti-ROR1 de raton:

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTAT

CACTTGCAAGGCGAGTCA

GGACATTAATAGTTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGA

TCTATCGTGCAAACAGAT

TGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACC

ATCAGCAGCCTGGAGTAT

GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGG

GACCAAGCTGGAAATAAA

AC

la SEC ID N°: 20: Secuencia polipeptfdica de la region variable de cadena ligera de los AcM anti-ROR1 H10 y G11 de raton:

5

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF

SGSGSGQDYSLTISSLEY

EDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos en que una cadena pesada esta codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 13 y una cadena ligera esta codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SEC 10 ID N°: 15.

Se divulga tambien un anticuerpo que contiene una cadena pesada codificada por la secuencia polinucleotfdica de LA SEC ID N°: 1 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 3.

15 Se divulgan tambien anticuerpos que tienen una cadena pesada codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 5 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 7 o por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 9 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 11; o por la secuencia polinucleotfdica de la SEC ID N°: 15 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotfdica de la SeC ID N°: 17.

20

En otro aspecto, se proporcionan anticuerpos que contienen una cadena pesada con la secuencia polipeptfdica de LA SEC ID N°: 14 y una cadena ligera con la secuencia polipeptfdica de la SEC ID N°: 16.

Se divulgan tambien anticuerpos que contienen una cadena pesada con la secuencia polipeptfdica de la SEC ID N°: 25 2 y una cadena ligera con la secuencia polipeptfdica de la SEC ID N°: 4.

En un aspecto de la divulgacion, se proporcionan polinucleotidos aislados que codifican un anticuerpo que se une especfficamente a protefna ROR1 que (a) comprenden una region de cadena pesada codificada por polinucleotidos que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo 30 consistente en las la SEC ID N°: 1, 5, 9, 13 o 17, (b) comprenden una correspondiente region de cadena ligera codificada por polinucleotidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo consistente en las la SEC ID N°: 3, 7, 11, 15 o 19 y (c) se unen especfficamente a cualquiera del extremo 3' o la porcion media de la region similar a Ig del dominio extracelular de la protefna ROR1 humana o de murino.

35

Se divulgan tambien anticuerpos que se unen a residuos en el medio de la region similar a Ig del dominio extracelular de la protefna ROR1 humana o de murino (aminoacidos 1-147 en la molecula humana). En un aspecto, los anticuerpos de la presente invencion se unen a los aminoacidos 70-130 de ROR1 humana. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen 4a5, G11, H10 y G3.

40

Como alternativa o adicionalmente, un residuo correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la protefna ROR1 humana en posicion 111 es crftico para la actividad de union de los anticuerpos.

Se divulgan adicionalmente anticuerpos que se unen a residuos en la region 3'-similar a Ig y la region ligadora entre

el dominio similar a Ig y el dominio CRD de la protefna ROR1 humana o de murino (aminoacidos 1-165 en la molecula humana). En un aspecto, los anticuerpos de la presente divulgacion se unen a los aminoacidos 130-165 de ROR1 humana. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen D10, F2, F12 y G6.

5 Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos se unen a un residuo de acido glutamico correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la protefna ROR1 humana en posicion 138.

Como alternativa o adicionalmente, un residuo correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la protefna ROR1 humana en posicion 138 es crftico para la actividad de union de los anticuerpos.

10

Como alternativa o adicionalmente, el anticuerpo codificado tiene actividad in vivo en la reduccion de la carga de celulas leucemicas o linfomicas en un modelo animal aceptado en la tecnica a una tasa de 2-8 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 veces la del anticuerpo anti-ROR1 humano de tipo silvestre o anticuerpo monoclonal 4A5 (divulgado en la presente memoria).

15

Como alternativa, o adicionalmente, el anticuerpo codificado tiene actividad in vivo en la inhibicion de la expansion de linfocitos B leucemicos CD5dullB220+ y ROR1WightB220+.

Como alternativa o adicionalmente, el anticuerpo codificado se internaliza en celulas leucemicas o linfomicas a una 20 tasa de al menos 2 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces la del anticuerpo monoclonal 4A5. Tales anticuerpos son particularmente utiles como vehfculos para el suministro de farmaco a una celula diana.

Es un ejemplo de un anticuerpo que posee todas las caracterfsticas funcionales anteriormente mencionadas D10, que tiene una region de cadena pesada codificada por la la SEC ID N°: 13 y una region de cadena ligera codificada 25 por la la SEC ID N°: 15.

En otro aspecto, se divulgan polipeptidos que consisten en o comprenden anticuerpos que se unen especfficamente a la protefna ROR1 y (a) comprenden una region de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14 o 18, (b) comprenden una correspondiente 30 region de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de la SEC ID N°: 4, 8, 12, 16 o 20 y (c) se unen especfficamente a cualquiera del extremo 3' o la porcion media de la region similar a Ig del dominio extracelular de la protefna ROR1 humana o de murino. En un aspecto, el polipeptido aislado es un anticuerpo. En un aspecto adicional, el polipeptido es un Fab o F(ab)'2.

35 En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente invencion puede contener adicionalmente un marcaje detectable. Tales marcajes son conocidos en la tecnica e incluyen radioisotopos y marcajes fluorescentes. Como tal, la internalizacion de un compuesto que evidencie el paso mediante transportadores puede detectarse detectando la senal de una celula de cualquiera de una variedad de indicadores. El indicador puede ser un marcaje tal como un fluoroforo, un cromoforo o un radioisotopo. Puede usarse tambien la imagenologfa confocal para detectar la 40 internalizacion de un marcaje, ya que proporciona suficiente resolucion espacial para distinguir entre fluorescencia sobre una superficie celular y fluorescencia en una celula; como alternativa, puede usarse la imagenologfa confocal para rastrear el movimiento de los compuestos con el tiempo. En otro enfoque, se detecta la internalizacion de un compuesto usando un indicador que es un sustrato de una enzima expresada en una celula. Una vez se internaliza el complejo, se metaboliza el sustrato por la enzima y genera una senal optica o descomposicion radiactiva que es 45 indicativa de la captacion. La emision de luz puede monitorizarse por instrumentos comerciales basados en PMT o por sistemas de imagenologfa basados en CCD. Ademas, se emplean tambien procedimientos de ensayo que utilizan deteccion por LCMS de los compuestos transportados o de senales electrofisiologicas indicativas de la actividad de transporte.

50 En ciertas realizaciones terapeuticas, el anticuerpo seleccionado puede administrarse solo, en combinacion con otro anticuerpo de la invencion o con uno o mas agentes terapeuticos combinatorios para tratar un cancer de ROR1. Cuando se administran uno o mas de los anticuerpos descritos en la presente memoria como agentes terapeuticos, pueden ejercer un efecto beneficioso en el sujeto mediante una variedad de mecanismos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se purifican anticuerpos que se unen especfficamente a ROR1 y se administran a un paciente para 55 neutralizar una o mas formas de ROR1, para bloquear una o mas actividades de ROR1 o para bloquear o inhibir una interaccion de una o mas formas de ROR1 con otra biomolecula; p.ej., para tratar LLCL u otros canceres de ROR1. Todos tales procedimientos terapeuticos se practican para el suministro de una dosificacion terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que contiene los anticuerpos y agentes terapeuticos, que puede determinarse por un farmacologo o facultativo especialista en inmunoterapia de cancer humano.

En una realizacion, puede usarse la presente invencion en un procedimiento para el tratamiento de cancer mediante la administracion a un sujeto humano necesitado de ello de una dosis terapeuticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invencion.

5 En otra realizacion, puede usarse la presente invencion en un procedimiento para el tratamiento de cancer que comprende la administracion a un sujeto humano necesitado de ello de una dosis terapeuticamente efectiva de un anticuerpo de acuerdo con la invencion.

Ventajosamente, tales procedimientos proporcionan una reduccion de la carga de celulas leucemicas o linfomicas 10 (como se demuestra en y equivalente a un modelo animal aceptado en la tecnica) de 2-8 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 veces la del anticuerpo anti-ROR1 humano de tipo silvestre o anticuerpo monoclonal 4A5 (divulgado en la presente memoria).

Tales procedimientos proporcionan adicionalmente un enfoque terapeutico para inhibir la expansion de linfocitos B 15 leucemicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.

Como se discute en la presente memoria, los anticuerpos de la invencion pueden incluir anticuerpos humanizados y pueden combinarse para uso terapeutico con ingredientes activos o inertes adicionales, p.ej., en vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables convencionales, p.ej., adyuvantes inmunogenicos, y opcionalmente con 20 moleculas complementarias o activas combinatoriamente tales como farmacos antiinflamatorios y antifibrinolfticos. Los anticuerpos que se internalizan facilmente en celulas, como se demuestra en la presente memoria con respecto al anticuerpo D10, son tambien de uso particular como vehfculos para el suministro de farmaco a celulas diana (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 21-23). Los especialistas en la tecnica estaran familiarizados con los procedimientos para la produccion de conjugados de anticuerpo-farmaco utiles en tales protocolos de suministro de 25 farmaco.

Al llevar a cabo diversos procedimientos de ensayo, diagnostico y terapeuticos, es deseable preparar por adelantado kits que comprenden una combinacion de anticuerpos como se describen en la presente memoria con otros materiales. Por ejemplo, en el caso de inmunoensayos enzimaticos de sandwich, los kits pueden contener un 30 anticuerpo que se une especfficamente a ROR1 ligado opcionalmente con un vehfculo apropiado, una preparacion liofilizada o una solucion de un anticuerpo monoclonal marcado con enzima que puede unirse al mismo antfgeno junto con el anticuerpo monoclonal o de un anticuerpo policlonal marcado con la enzima de la misma manera, una solucion patron de ROR1 purificada, una solucion tampon, una solucion de lavado, pipetas, un envase de reaccion y similares. Ademas, los kits incluyen opcionalmente materiales de etiquetado y/o explicativos que proporcionan 35 instrucciones (es decir, protocolos) para la practica de los procedimientos descritos en la presente memoria en un entorno de ensayo. Aunque los materiales explicativos comprenden tfpicamente materiales escritos o impresos, no estan limitados a ellos. Se contempla cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Tales medios incluyen, pero sin limitacion, medios de almacenamiento electronico (p.ej., discos magneticos, cintas, cartuchos, chips), medios opticos (p.ej., CD ROM) y similares. Tales medios pueden incluir 40 direcciones de sitios de internet que proporcionan tales materiales explicativos.

En general, un procedimiento in vitro de diagnostico de un cancer de ROR1 comprendera poner en contacto las presuntas celulas cancerosas de un sujeto humano con un anticuerpo de acuerdo con la invencion, y detectar la union con ROR1 expresada en dichas celulas en comparacion con la expresion en celulas no cancerosas humanas 45 postembrionarias. Todos tales procedimientos de diagnostico se practican mediante el suministro de una cantidad con efecto de diagnostico de anticuerpos de acuerdo con la invencion, que puede determinarse por un especialista en diagnostico o ingeniero de diagnostico in vivo especializado en el diagnostico de cancer humano.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invencion.

50

EJEMPLO 1: GENERACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ROR1

Para la produccion de AcM generados por hibridoma, se inocularon ratones con ADN, protefna y constructos adenovfricos que expresan la porcion extracelular (AA 1-406) de la protefna ROR1 que incluye los dominios similar a 55 Ig, CRD y Kringle y regiones ligadoras adyacentes (Figuras 10-11). Debido al alto grado de homologfa entre las moleculas de murino y humana, se coinyectaron una variedad de citocinas y agentes inmunoestimulantes, tales como adyuvante completo de Freund, para maximizar la generacion de anticuerpos anti-ROR1 humana. Se generaron AcM generados por hibridoma y se cribo la union a ROR1 humana y de murino. Es un ejemplo de AcM derivado de hibridoma D10.

EJEMPLO 2 GENERACION DE ANTICUERPOS ANTI-ROR1 USANDO PRESENTACION EN FAGO

Se genera un segundo conjunto de anticuerpos mediante el uso de una coleccion en fago mejorada patentada (Alere, Inc. San Diego). Estos anticuerpos anti-ROR1 humana se unen a epftopos que cubren toda la longitud del 5 dominio extracelular de la protefna ROR1 (Figura 12). Es un ejemplo de anticuerpo anti-ROR1 derivado de presentacion en fago 4A5.

EJEMPLO 3 ANALISIS IN VITRO DE ANTICUERPOS ANTI-ROR1

10 Se cribo en los anticuerpos generados por hibridomas o presentacion en fago la union a ROR1 humana y de murino. Se determino que los anticuerpos anti-ROR1 D10 y 4A5 se unfan solo a ROR1 humana y no reaccionaban de forma cruzada con ROR1 de murino.

EJEMPLO 4 DETERMINACION DE LOS SITIOS DE UNION PARA ANTICUERPOS ANTI-ROR1

15

Debido a que los AcM anti-ROR1 son especfficos de especie, se generaron una serie de protefnas quimericas que se usaron para determinar el sitio de union de cada uno de los AcM anti-ROR1 (Figura 13). Como cribado de segundo nivel, se generaron una serie de constructos de delecion para determinar el dominio extracelular de ROR1 real al que se unen los AcM. Una vez se identifico el dominio de union, se generaron moleculas de ROR1 quimericas 20 truncadas para identificar subregiones especfficas que se reconocen por los AcM anti-ROR1 humana (Figura 14). Como etapa final, se determinaron los aminoacidos reales diana de estos anticuerpos. Para este cribado final, se generaron aminoacidos humanos murinizados en los fragmentos de subdominio para determinar los residuos crfticos requeridos para la union de AcM (Figura 15). A partir de este paradigma de cribado, se determinaron los subdominios de union para los AcM (Figura 15). Se determino que el AcM anti-ROR1 humana D10 requerfa que el 25 residuo de acido glutamico en posicion 138 se uniera al dominio similar a Ig de la molecula de ROR1 humana. Cuando se reemplaza este aminoacido por el residuo de lisina de la molecula de murino, la molecula D10 no se une mas a la protefna ROR1.

De manera similar, se determino que el AcM anti-ROR1 humana 4A5 requerfa que el residuo de isoleucina en 30 posicion 111 se uniera a la molecula de ROR1 humana (Figura 24). Cuando se reemplaza este aminoacido por el residuo de asparagina de la molecula de murino, la molecula 4A5 no se une mas a la protefna ROR1. Se determino tambien que los anticuerpos anti-ROR1 G11, H10 y G3 se unen a la misma region que 4A5.

Usando tecnicas de bloqueo cruzado estandares, se determinaron los sitios de union para los anticuerpos anti- 35 ROR1 F2, F12 y G6. Estos experimentos determinaron que los anticuerpos F2, F12 y G6 bloquean de forma cruzada el anticuerpo anti-ROR1 D10, indicando que comparten un sitio de union.

EJEMPLO 5 DETERMINACION DE LOS VALORES DE Kd PARA LOS ANTICUERPOS ANTI-ROR1 D10 Y 4A5

40 Se determinaron los valores de Kd para los anticuerpos anti-ROR1 usando tecnicas estandares. Se determino que la Kd para el anticuerpo D10 era de 40 nM y para el anticuerpo 4A5 era de 4 nM (Figuras 16A y B).

EJEMPLO 6 ANALISIS IN VIVO DE ANTICUERPOS ANTI-ROR1

45 Se valoro el AcM D10 en varios modelos in vivo. En un modelo de actividad dependiente de nicho xenografico in vivo de murino, se administraron dos dosis de AcM a 10 mg/kg contra 4 celulas de LLC de paciente primario en 76 ratones. Como se muestra en la Figura 17, el AcM D10 eliminaba sustancialmente las celulas de LLC del paciente de manera dependiente de la dosis. En contraposicion, el AcM 4A5 tenia una actividad minima en estos estudios aunque la kDa de este AcM sea 10 veces mayor (4 frente a 40) que en el AcM D10.

50

Ademas de este modelo de actividad, se ensayo tambien el AcM D10 en un modelo de raton transgenico inmunocompetente que genera espontaneamente celulas leucemicas que expresan la protefna ROR1 humana (Figuras 18-20). Se administraron los AcM especfficos de ROR1 D10 y 4A5 o anticuerpos de IgG de control (10 mg/kg) antes y despues de la transferencia adoptiva de linfocitos B de LLC ROR1xTCL1 en ratones Balb C. El AcM 55 D10, pero no el IgG de control o 4A5, era capaz de inhibir el desarrollo y expansion de linfocitos B leucemicos ROR1xTCL en la sangre de animales receptores hasta dos semanas despues de recibir la ultima infusion de AcM.

Junto con la actividad antileucemica de este AcM, se ha mostrado tambien que el anticuerpo anti-ROR1 D10 se internaliza en celulas de LLC de paciente y lfneas celulares de leucemia y linfoma de linfocitos B a una mayor tasa y 60 grado que otros AcM anti-ROR1 que se unen a otros sitios antigenicos en la porcion extracelular de la protefna

ROR1 (Figuras 21-23). Debido a la ausencia de la protefna ROR1 en tejidos postparto y a su rapida tasa de internalizacion, el AcM D10 puede servir como una excelente protefna vehfculo para farmacos; por ejemplo, para uso en citotoxicidad mediada por el conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC). Basandose en estos hallazgos preclfnicos, el AcM D10 tiene potencial para tener actividad terapeutica contra leucemias, linfomas y canceres 5 tumorales solidos que expresan ROR1 como terapia orientada y/o vehfculo de farmaco conjugado.

Aunque la materia en cuestion anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustracion y ejemplo con fines de claridad de comprension, se entendera por los especialistas en la tecnica que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une especfficamente a la protefna ROR-1 humana en celulas cancerosas y comprende una region variable de cadena pesada codificada por un polinucleotido que tiene la

5 secuencia de la SEC ID N°: 13, y una correspondiente region variable de cadena ligera codificada por un polinucleotido que tiene la secuencia de la SEC ID N°: 15, donde el anticuerpo se une a la region similar a Ig del dominio extracelular de la protefna ROR-1 humana desde la posicion 1-147, o a los residuos 130-160 en la region similar a Ig y region ligadora adyacente entre el dominio similar a Ig y el dominio CDR del dominio extracelular de la protefna ROR-1 humana en posicion 1-165.

10
2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde se une adicionalmente a un residuo de acido glutamico correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la protefna ROR-1 humana en posicion 138.
3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde reduce adicionalmente la carga de celulas 15 leucemicas o linfomicas en un modelo animal aceptado en la tecnica a una tasa de 2-8 veces, o al menos 2, 3, 4, 5,

6, 7 u 8 veces, la de un anticuerpo monoclonal que comprende regiones de cadena pesada y ligera codificadas por la secuencia nucleotfdica de la SEC ID N°: 1 (cadena pesada) y la secuencia nucleotfdica de la SEC ID N°: 3 (cadena ligera).

20 4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde inhibe adicionalmente la expansion de

linfocitos B leucemicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.
5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde se internaliza adicionalmente en celulas leucemicas o linfomicas a una tasa de al menos 2 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces la de un

25 anticuerpo monoclonal que comprende regiones de cadena pesada y ligera codificadas por la secuencia nucleotfdica de la SEC ID N°: 1 (cadena pesada) y la secuencia nucleotfdica de la SEC ID N°: 3 (cadena ligera).
6. Una composicion de anticuerpo anti-ROR1 farmaceuticamente aceptable que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

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7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde un residuo de acido glutamico correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la protefna ROR-1 humana en posicion 138 es crftico para la union del anticuerpo a ROR-1.

35 8. Un polinucleotido aislado que codifica un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1.
9. Un anticuerpo aislado que se une al mismo epftopo que un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera codificadas por la secuencia nucleotfdica de la SEC ID N°: 13 (cadena pesada) y la secuencia nucleotfdica de la SEC ID N°: 15 (cadena ligera).

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10. Un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 12 a 14 o una composicion de anticuerpo anti-ROR1 farmaceuticamente aceptable que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento de cancer.

45 11. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, donde el cancer es leucemia, linfoma o

LLC.
12. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el anticuerpo sirve como protefna vehfculo para un farmaco.

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13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 12, donde el farmaco se conjuga con el anticuerpo, proporcionando asf un conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC).
14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 13, donde el conjugado de anticuerpo-farmaco media la 55 citotoxicidad.