JP2000516452A - 可溶性が増大した免疫グロブリンスーパーファミリードメインおよびフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメイン、ＩｇＳＦフラグメント、およびその融合タンパク質の修飾、特に、それらの可溶性と収量を改善し、取り扱いを容易にするための抗体誘導体の修飾に関する。本発明者らは、より大きなフラグメントまたは完全ＩｇＳＦタンパク質中の該ＩｇＳＦドメインと隣接するドメインとのインターフェースを含み、修飾により露出し、親水性が増大するようになるＩｇＳＦドメイン中の領域を作製することによりこれを達成することができることをみいだした。本発明は、ＩｇＳＦドメイン、ＩｇＳＦフラグメント、およびその融合タンパク質の可溶性ならびに発現性を改善し、取り扱いを容易にするための、修飾されたＩｇＳＦドメイン、またはフラグメントおよびその融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、これらＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主、該ＤＮＡ配列を適切な発現系で発現させることによって得られるＩｇＳＦドメインまたはフラグメントおよび融合タンパク質、およびＩｇＳＦドメインを修飾する方法について記載している。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性が増大した免疫グロブリンスーパーファミリードメインおよびフラグメン ト 発明の技術分野 本発明は、可溶性を増大させることにより収量を増加させ、取り扱いを容易に するための免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインとその誘導 体の修飾に関する。 発明の背景 治療剤、診断試薬としての使用、および生化学的研究における小さな抗体フラ グメントの有望性は刺激的である。すなわち、該フラグメントは大量に必要であ り、E.coliのペリプラズムにおける抗体フラグメント、例えばＦｖ、一本鎖Ｆｖ (ｓｃＦｖ)、またはＦａｂの発現（SkerraおよびPlueckthum 1988；Betterら、1 988）は今や多くの研究室でルチーン的に用いられている。しかし、特にｓｃＦ ｖの場合、発現収量が大きく異なる。フラグメントのあるものは震盪フラスコ培 養中の培養ブロスのＯＤおよびＩＬあたり機能的可溶性タンパク質を数ｍｇまで 生産するが(Carterら、1992、Plueckthunら、1996)、他のフラグメントはほとん ど所謂封入体中にのみみいだされることが多い不溶性物質を生じるであろう。機 能的タンパク質は、面倒で時間のかかる再ホールディング（折り畳み）工程によ って後者から限られた収量が得られよう。抗体の発現レベルに影響を及ぼす因子 はまだほとんど解っていない。抗体フラグメントのホールディング効率と安定性 、発現タンパク質の宿主細胞に対する毒性、およびプロテアーゼ分解性はしばし ば実際の生産レベルを大きく制限し、発現収量を増大させる多くの試みがなされ てきた。例えば、KnappikおよびPlueckthun(1995)は発現収量に顕著に影響する 抗体フレームワーク中の鍵となる残基を同定している。同様に、Ullrichら(1995 )は、ＣＤＲ中の点突然変異がペリプラズムでの抗体フラグメントの発現収量を 増加させ得ることをみいだした。 KnappikおよびPlueckthum(1995)による研究は、抗原認識に直接関与しない 抗体フラグメントの部分を最適化することにより組換えＦｖおよびｓｃＦｖ構築 物のホールディング特性と生産物収量を有意に改善し得ることを示している。発 現挙動の改善の理由はこれら分子の凝集挙動の減少にある。他の分子ではフラグ メントの安定性とプロテアーゼ耐性も影響を受けるかもしれない。特定の配列の 修飾がこれらの特性をいかに変化させるかに関する理解はまだ非常に限られてお り、現在活発に研究されている。 タンパク質ドメインを発現させ、操作するにあたっては、全分子の部分のみが 発現している時には通常タンパク質構造内に埋没しているアミノ酸が露出するよ うになるため困難が生じるかもしれない。凝集は、最初近傍ドメイン間の接触領 域を形成している新たに溶媒に露出した疎水性残基の相互作用により生じるかも しれない。LeistlerおよびPerham（1994）は、グルタチオン還元酵素のあるドメ インがその隣接ドメインと別個に発現するかも知れないことを示すことができた が、該タンパク質は、多量体のタンパク質種をin vitroで形成する非特異結合を 示した。露出した疎水性アミノ酸に代わって親水性残基を導入するとこの凝集傾 向が減少し、この単離されたドメインを安定化させることができた。野生型およ び修飾ドメインはいずれも全く封入体のみにみいだされ、再ホールディングされ なければならなかった。in vitro試験はホールディング工程を操作する種々の分 子間相互作用を明らかにするのに多いに寄与するが、in vivoにおける異なるポ リペプチド鎖のホールディング挙動を予測するには限られた価値しかない(Gethi ngおよびSambrook,1992)。したがって、LeistlerおよびPerhamは可溶性タンパク 質ドメインの発現収量をいかに増加させるかについて開示も示唆もしていない。 抗体の場合は、２つのβ−シートがジスルフィド結合により一緒にホールドさ れ、所謂免疫グロブリンホールドを形成しているβ−バレルからなるドメイン数 個を含む２本の鎖が二量体（ダイマー）化している。２個のドメイン（１つは可 変ドメイン（ＶＬ）で、１つは定常ドメイン(ＣＬ)）は軽鎖の長軸沿いの近傍に あり(ＶＬ−ＣＬ)、４個のドメイン（１つは可変ドメイン（ＶＨ）で３つは定常 ドメイン(ＣＨ１〜ＣＨ３)）は重鎖の長軸沿いの近傍にある(ＶＨ−ＣＨ １−ＣＨ２−ＣＨ３)。鎖ａおよびｂによって形成される二量体において、２個 のそのようなドメインは、ＶＬ_aはＶＨ_aと、ＣＬ_aはＣＨ１_aと、ＶＬ_bはＶＨ_bと 、ＣＬ_bはＣＨ１_bと、ＣＨ２_aはＣＨ２_bと、またＣＨ３_aはＣＨ３_bと側面で結合 する。ＷＯ９２／０１７８７（Johnsonら、1992）は、単離された１個のドメイ ン、例えばＶＨの疎水性残基が、親ドメインの特異性を変化させることなく親水 性残基と置換することにより前者のＶＬ／ＶＨインターフェース領域中で修飾さ れ得ることを開示している。ＷＯ９２／０１７８７の理論的根拠は、露出した疎 水性残基が非特異的結合、表面との相互作用、および安定性の低下をもたらすか もしれないという仮定にあった。結合特異性の増大に関するデータは得られたが 、発現レベルの増大は示されなかった。さらに、完全な抗原結合部位を含む抗体 フラグメントはＶＬとＶＨを含まなければならないため、ＷＯ９２／０１７８７ はいかなる該抗体フラグメントにも応用できないであろう。Ｔ細胞レセプターの 場合は、各々免疫グロブリンホールドを有する可変（Ｖ）および定常（Ｃ）ドメ インと１個の貫膜ドメインからなる２本の鎖（αおよびβ）が二量体化する。各 鎖において、可変および定常ドメインは該鎖の長軸沿いの近傍にあり(Ｖα−Ｃ α；Ｖβ−Ｃβ)、第二鎖の対応するドメインと側面で結合する(Ｖα−Ｖβ；Ｃ α−Ｃβ)。 ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＣＤ２２のような免疫グロブリンスーパーファミ リーの種々の他の分子は、免疫グロブリンホールドを有する２またはそれ以上の ドメイン（可変および／または定常）が鎖の長軸沿いの近傍にある鎖１本のみを 含む。 本発明では、発現に関する問題が、従来発現研究と関連があるとは考えられて いなかった、免疫グロブリン鎖内の隣り合ったドメイン間のインターフェースを 含む分子の一部と主として関係があることがわかった。この驚くべき知見は本発 明の基礎をなし、可溶性が低いかまたは発現レベルが低下している免疫グロブリ ンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のドメインまたはフラグメント、特に抗体フ ラグメントの生産に関する問題への全般的解決をもたらす。 発明の詳細な説明 上記の異なる鎖のドメイン間の側面での相互作用に加え、長軸に沿った個々の 鎖内の隣接ドメイン間の接触に関する十分な証拠文献がある。例えば、抗体の場 合は(LestおよびChothia，1988)、ＶＬの「底部」はＣＬの「先端部」と接触し 、同じ様な接触がＶＨとＣＨ１の間にみられる。これらドメイン間のインターフ ェースにおける接触はおそらくＦａｂフラグメントのコンパクトな配置に必須で あり、そのような接触に典型的であるように、その性質は少なくとも一部が疎水 性である。 本発明は、少なくとも１個のドメインを含む抗体フラグメントの可溶性（およ び収量）が、通常、より大きな抗体フラグメントまたは完全抗体中の鎖内の第二 ドメインと隣接している該ドメインの「末端」において前者のインタフェースの 疎水性を低下させることにより劇的に増加し得るという驚くべき知見に基く。例 えば、ｓｃＦｖフラグメント中のインターフェースの長軸のサイズはＶＨとＶＬ の間のそれよりかなり小さく、Ｆａｂフラグメント中のＶＨとＣＨ１間またはＶ ＬとＣＬ間のインターフェースを形成するアミノ酸のｓｃＦｖ分子の総表面積に 占める割合はかなり小さいことから、該分子の物理特性の決定にはあまり役割を 果たさないと予測されるため、このことは驚くべきことであり、先行技術文献（ ＷＯ９２／０１７８７）から予測することができなかった。 本発明には、前者のインターフェースの疎水性の低下をもたらす該分子に生じ る変化はＣＤＲ由来のドメインの最も遠い部分に位置するため、本発明を応用し ても該分子の結合特性に有害な影響をもたらさないであろうというさらなる利点 がある。このことは、少なくとも１つの修飾がＣＤＲに近いため、抗原結合に対 する影響があると予測されるかもしれないＷＯ９２／０１７８７には当てはまら ない。さらに、ＷＯ９２／０１７８７は上記のＶＬ／ＶＨヘテロダイマーには応 用することができない。 本発明は、より大きな免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）フラグ メントもしくは完全ＩｇＳＦタンパク質のタンパク質鎖内に親ＩｇＳＦドメイン またはフラグメントと隣接した第二ドメインを有するインターフェースを含むか または含むであろう、該第二ドメインの非存在下で該親ＩｇＳＦドメインまたは フラグメント中で露出している領域が修飾により親水性になっている、親ＩｇＳ Ｆドメインまたはフラグメントと異なる修飾されたＩｇＳＦドメインまたはフラ グメントに関する。 本発明のにおいて、用語免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメ インは、免疫グロブリンまたは抗体、およびＴ細胞レセプターもしくはインテグ リンのような種々の他のタンパク質を含む免疫グロブリンホールドによって特徴 付けられる免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの部分を表す。用語Ｉ ｇＳＦフラグメントは、少なくとも１個のＩｇＳＦドメインを含む免疫グロブリ ンスーパーファミリーのメンバーのあらゆる部分をいう。用語隣接ドメインは第 一ドメインと隣接しているドメインをいう。用語インターフェースは、隣接ドメ インとの相互作用を生じる該第一ドメインの領域をいう。用語疎水性および親水 性は、定量的に評価できるアミノ酸の物理特性をいい、天然のアミノ酸２０個の 疎水性に関する値の一覧表が利用できる(NozakiおよびTanford,1971;Casariおよ びSippl,1992;RoseおよびWolfenden,1993)。 修飾される残基は多くの方法で同定することができる。例えば、ある方法では 、該より大きなＩｇＳＦフラグメントまたは完全ＩｇＳＦタンパク質と比較した 該親ＩｇＳＦフラグメント中の疎水性インターフェース残基の溶媒に対する接近 可能性（アクセシビリティ）が計算され(LeeおよびRichards，1971)、高い接近 可能性は露出した残基が多いことを示唆した。第二の方法では、該より大きいＩ ｇＳＦフラグメントまたは完全ＩｇＳＦタンパク質中の疎水性インターフェース 残基のファンデルワールス（van der Waals）接触の数が計算される。該親ドメ インの残基が大量であることは、該残基が隣接ドメインの非存在下で高度に溶媒 に露出しているであろうことを示す。本発明にしたがって修飾される残基を計算 または決定する他の方法があり、当業者はこれらの方法を確認し、実施すること ができよう。 該親ＩｇＳＦフラグメントのコンピューターモデルを分析することにより、該 フラグメント内の該高度に露出した残基の相互作用を確認することができる。そ のような相互作用は親ＩｇＳＦフラグメントを安定化させるかもしれない。他の 疎水性残基と密接に相互作用し、当業者のいずれもが確認できる残基は優先的に 突然変異されてはならない。 上記修飾は当業者によく知られた多くの方法で行なうことができよう。好まし い態様において、該修飾は、上記のごとく確認された該露出したインターフェー スの１またはそれ以上のアミノ酸を、より親水性のアミノ酸で置換することであ る。あるいはまた、１またはそれ以上のアミノ酸を該インターフェースに挿入す るか、または１またはそれ以上のアミノ酸を該インターフェースから欠失させる ことにより、その全体の親水性を増大させることができる。さらに、置換、挿入 、および欠失のあらゆる組み合わせにより、該インターフェースの疎水性を低下 させることができる。本発明には、該インターフェース領域において全体の親水 性値が増加する限りにおいて、置換または挿入が比較的高い疎水性値のアミノ酸 を含むか、または欠失が比較的低い疎水性値のアミノ酸を含む可能性も含まれる 。置換、挿入、および欠失のような修飾は、当業者によく知られた標準的方法を 用いて行なうことができる。実施例により、当業者は部位指向性突然変異もしく はＰＣＲに基く突然変異(Hoら、1989;Kunkelら、1991；Trower，1994;Viville， 1994)、または全遺伝子合成（ProdromouおよびPearl、1992）のいずれかを用い て必要な修飾を行なうことができる。さらなる態様において、突然変異は適切な 発現およびスクリーニング系を用いるランダム突然変異誘発およびランダム突然 変異体のスクリーニングにより得られよう(例えば、Stemmer，1994;Crameriら、 1996参照)。 好ましい態様において、より疎水性のアミノ酸を置換するアミノ酸には、Ａｓ ｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、およ びＴｈｒが含まれる。これらは天然のアミノ酸２０個の中でより親水性の高いも のであり、本発明の応用において特に有効であることが証明された。単独もしく は連結した、または他のアミノ酸と連結した該アミノ酸を用いて、該インターフ ェース領域をより親水性にする上記挿入を形成することもできる。 上記親ＩｇＳＦドメインまたはフラグメントはいくつかの異なるタイプの一つ であり得る。ある態様において、該親ドメインまたはフラグメントは抗体由来で ある。ある態様において、該親抗体フラグメントはＦｖフラグメントを含む。こ の文脈において、用語Ｆｖフラグメントは抗体分子のＶＬ（可変軽）およびＶＨ （可変重）部分を含むコンプレックスを表す。さらなる態様において、親抗体フ ラグメントは、ＶＬ鎖とＶＨ鎖がペプチドリンカーによりＶＬ−ＶＬまたはＶＨ −ＶＬ方向に連結している一本鎖Ｆｖフラグメントであってよい(ｓｃＦｖ；Bir dら、1988;Hustonら、1988)。さらなる態様において、親抗体フラグメントは、 ドメイン間のジスルフィド結合により安定化されたＦｖフラグメントであってよ い。これは、各鎖内に１個のシステイン残基を組み込むことにより作製すること ができる構造であり、二本の鎖由来のシステイン残基が酸化によって連結してジ スルフィドが形成される(Glockshuberら、1990；Brinkmannら、1993)。 最も好ましい態様において、上記可変ドメインのインターフェース領域には、 Kabatナンバリング法（Kabatら、1991）に従って、ＶＬでは残基９、１０、１２ 、１５、３９、４０、４１、８０、８１、８３、１０３、１０５、１０６、１０ ６Ａ、１０７、１０８が、また、ＶＨでは９、１０、１１、１３、１４、４１、 ４２、４３、８４、８７、８９、１０５、１０８、１１０、１１２、１１３が含 まれる。該ナンバリング法は、全抗体の配列用に確立されたものであるが、ＶＬ とＶＨがペプチドリンカーにより連結し、Ｎ末端からＣ末端までのタンパク質配 列を別々に番号付けしなければならないｓｃＦｖフラグメントの場合でも単離さ れた抗体ドメインまたは抗体フラグメントの配列を説明するのに対応して適合さ せることができる。このことは、本発明においてKabatナンバリング法が、目的 とする抗体フラグメント配列内の実際の位置を絶対的に説明するものとしてでは なく、抗体配列について存在するデータに対応した配列の説明として用いられて いることを意味する。 さらなる態様において、該親抗体フラグメントはＦａｂフラグメントを含む。 この文脈において,用語Ｆａｂは抗体分子のＶＬ−ＣＬ（可変および定常軽）お よびＶＨ−ＣＨ１（可変および第一定常重）部分を含むコンプレックスを表し、 用語インターフェース領域は、より大きな抗体フラグメントまたは完全抗体中の ＣＨ２ドメインと隣接するかまたは隣接していると思われる重鎖の第一定常ドメ イン（ＣＨ１）中の領域を表す。 さらなる態様において、該親ＩｇＳＦフラグメントは、あらゆる該ドメインま たはフラグメントと、抗体またはあらゆる他のタンパク質もしくはペプチド由来 の別のタンパク質ドメインとの融合タンパク質である。抗体フラグメントの細菌 における発現が実現し、抗体フラグメントと別の分子との融合物を含むタンパク 質の構築に道が開かれた。本発明のさらなる態様は、上記の修飾されたＩｇＳＦ ドメインまたはフラグメント、およびさらなる部分を共にコードするＤＮＡ配列 を提供することによるそのような融合タンパク質に関する。有用な治療的機能を 有する部分が特に好ましい。例えば、さらなる部分は細胞を殺すことができる毒 素分子であってよい(Vitettaら、1993)。細菌毒素Pseudomonas菌体外毒素Ａなら びにジフテリア毒素、および植物毒素リシン、アブリン、モデクシン、サポリン 、ならびにゲロニンのような当業者によく知られたその様な毒素の多くの例があ る。そのような毒素と抗体フラグメントを融合することにより、毒素は例えば病 的細胞を標的とすることができ、それにより有益な治療的効果が得られる。ある いはまた、さらなる部分は、あるファミリーの細胞に対する特定の効果（この場 合はＴ細胞増殖効果）を有するＩＬ−２(RosenbergおよびLotze,1986)のような サイトカインであってよい。さらに好ましい態様において、さらなる部分は、有 機体、例えば細胞またはファージの表面に融合タンパク質を導き、ＩｇＳＦパー トナーを表現する表面タンパク質の少なくとも部分である。好ましくは、さらな る部分はフィラメント状バクテリオファージのコートタンパク質の、最も好まし くは遺伝子IIIタンパク質の少なくとも部分である。さらなる態様において、さ らなる部分はそのＩｇＳＦパートナーを検出および／または精製する手段を与え ることができよう。例えば、融合タンパク質はアルカリホスファターゼのような 検出目的で通常使用される酵素、および修飾されたＩｇＳＦドメインまたはフラ グメントを含むかもしれない(Blakeら、1984)。当業者によく知られている検出 または精製用タグとして用いることができる多くの他の部分がある。特に好まし いのは金属イオンと結合することができ、それらが融合するタンパク質 の精製に用いることができる（Lindnerら、1992）少なくとも５個のヒスチジン 残基を含むペプチドである(Hochuliら、1988)。本発明は、通常用いられるｃ− ｍｙｃおよびＦＬＡＧタグのようなさらなる部分も提供する(Hoppら、1988；Kna ppikおよびPlueckthun,1994)。 １またはそれ以上の融合したさらなるドメインを操作することにより、ＩｇＳ Ｆドメインまたはフラグメントをより大きな分子内に組み立てることができ、こ れも本発明の範囲内である。ＩｇＳＦドメインまたはフラグメントの物理特性が 組み立てられたものの特性を決定する程度まで、本発明はそのようなより大きい 分子の可溶性を増大させる手段を与える。例えば、ミニ−抗体(Pack,1994)は、 各々が自己結合二量体化ドメインと融合する２つの抗体フラグメントを含む二量 体である。特に好ましい二量体化ドメインにはロイシンジッパー(PackおよびPlu eckthum,1992)またはヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ（Packら、1993 ）から誘導されるものが含まれる。 本発明の上記態様はすべて、当業者に知られた分子生物学における標準的技術 を用いて実施することができる。 上記組成物は多くの環境のいずれにおいても有用性を持つかもしれない。診断 的および治療的組成物が特に好ましい。 本発明は上記に包含される組成物および化合物を製造する方法も提供する。以 下の工程を含む方法が特に好ましい： i）溶媒アクセシビリティ（接近可能性）法(LeeおよびRichards,1971)、インタ ーフェース領域におけるファンデルワールス相互作用の分析、または当業者によ く知られている同様の方法を用いて溶媒に露出するＩｇＳＦドメインのインター フェース領域の疎水性残基を分析し、 ii）より親水性の高い残基で置換される１またはそれ以上の疎水性残基、または インタフェース領域の全体の親水性を増大させる親水性残基またはアミノ酸スト レッチを該インターフェース領域内に挿入することができる１またはそれ以上の 位置、またはインタフェース領域の全体の疎水性を増大させる疎水性残基または アミノ酸ストレッチを該インターフェース領域から欠失させることができる１ま たはそれ以上の位置、または該親ＩｇＳＦドメインの１またはそれ以上の突然変 異体をもたらす該置換、該挿入、および該欠失のあらゆる組み合わせを同定し、 iii）例えば、通常の突然変異誘発法または遺伝子合成法を用いることにより、i i）において同定された変化によって特徴付けられる、別個にかまたは混合物と して製造される該ＩｇＳＦの突然変異体をコードするＤＮＡを製造し、 iv）該突然変異体を発現させるのに適したベクター系中にＤＮＡまたはＤＮＡ混 合物を導入し、 ｖ）適切な宿主細胞中に該ベクター系を導入し、次いで該突然変異体または突然 変異体混合物を発現させ、 vi）可溶形で高収量で得られる突然変異体を同定し、特徴付け、 vii）必要であれば、工程iii）〜vi）を反復して該同定された突然変異体または 突然変異体（複数）の親水性をさらに増大させる。 上記宿主は、限定されるものではないがE.coli(Geら、1995)、またはBacillus subtilis（Wuら、1993）のような細菌、酵母（Horwitzら、1988；Ridderら、19 95）または糸状菌（Nyyssoenenら、1993）のような真菌、植物細胞(Hiatt，1990 、HiattおよびMa,1993;Whitelamら、1994)、昆虫細胞(Potterら、1993；Wardら 、1995)、または哺乳動物細胞（Trillら、1995）を含む、ヘテロローガスなタン パク質の生産に通常用いられる多くのあらゆる宿主であってよい。 本発明は、本発明の宿主細胞を培養し、ＩｇＳＦドメインまたはフラグメント を単離することを含む本発明の該ドメインまたはフラグメントの製造方法にも関 する。 本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、これらは単に例示であって 、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 ｉ）略号 略号：ＣＤＲ：相補性決定領域；ｄｓＦｖ：ジスルフィド連結Ｆｖフラグメン ト；ＩＭＡＣ：固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；ＩＰ ＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシピラノシド；ｉ／ｓ：不溶性／可 溶性比；Ｈ(Ｘ)：重鎖残基番号Ｘ；Ｌ(X)：軽鎖残基番号Ｘ；ＮＴＡ：ニトリロ −３酢酸；ＯＤ₅₅₀：５５０ｎｍにおける光学濃度；ＰＤＢ：タンパク質データ ベース；ｓｃＦｖ：一本鎖Ｆｖフラグメント；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ｖ／ｃ：可変／定常；ｗｔ：野生 型。 ii）材料と方法 （ａ）溶媒アクセシビリティの計算 ＰＤＢファイルから定常ドメイン相当物を削除することにより３０個の非重複 Ｆａｂフラグメントおよびこれら由来のＦｖフラグメントの溶媒に接近可能な表 面積を、Lee & Richards(1971)によって記載されたアルゴリズムに基くプログラ ムＮＡＣＣＥＳＳの最新バージョン(1996年３月)(http://www.biochem.ucl.ac.u k/〜roman/naccess/naccess)を用いて計算した。 （ｂ）ｓｃＦｖ遺伝子合成 抗体４−４−２０（Bedzykら、1990）のＶ_L−リンカー−Ｖ_H方向の一本鎖Ｆｖ フラグメント（ｓｃＦｖ）を遺伝子合成法（ProdromouおよびPearl,1992）によ り得た。Ｖ_Lドメインは３アミノ酸長のＦＬＡＧタグ(KnappikおよびPlueckthun, 1994)を保持する。長さ１５(Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ)₃および３０アミノ酸(Ｇｌｙ₄Ｓｅ ｒ)₆の２つの異なるリンカーをそれぞれ用いた。得られた遺伝子をベクターｐＩ Ｇ６(Geら、1995)の誘導体中にクローンした。突然変異体抗体フラグメントは一 本鎖ＤＮＡ、および反応あたり３個までのオリゴヌクレオチドを用いる部位指向 性突然変異誘発（Kunkelら、1987）によって構築された。 （ｃ）発現 増殖曲線は以下のごとく得られた：１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２５ μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む２ｘＹＴ培地２０ｍＬに、それぞれの抗体 フラグメントをコードするプラスミドを保持するE.coli JM83の一夜培養２５０ μＬを接種し、ＯＤ₅₅₀が０．５に達するまで２４．５℃でインキュベーション した。ＩＰＴＧ（Biomol Feinchemikalien GmbH）を最終濃度が１ｍＭとなる ように加え、３時間インキュベーションを続けた。細胞の漏れやすさ(leakiness )の程度を定量するために培養上清のβ−ラクタマーゼ活性を測定したように、 ＯＤを毎時間測定した。誘導後３時間の培養の部分標本を取り出し、Knappikお よびPlueckthun（1995）の記載に厳密に従って細胞を溶解させた。不溶性分画お よび可溶性分画の上清のβ−ラクタマーゼ活性を測定した。考えられるプラスミ ドの損失と細胞における漏れやすさを説明するため、ＯＤおよびβ−ラクタマー ゼ活性について正規化した試料を用いる還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画の抗体 フラグメントについてアッセイした。ゲルをブロットし、ＦＬＡＧ抗体Ｍ１（Pr ickettら、1989）を第一抗体に、ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合Ｆｃ −特異的抗マウス抗血清(Pierce)を第二抗体に用い、別に記載（Geら、1995）の 化学ルミネッセント検出アッセイを用いて免疫染色した。 （ｄ）精製 突然変異体ｓｃＦｖフラグメントは２カラム法により精製された。細胞をフレ ンチプレスで溶解させ、次いで生（き）E.coli抽出物をＩＭＡＣ(Ｎｉ−ＮＴＡ スーパーフロー、Qiagen)(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００Ｍｍ ＮａＣｌ(ｐＨ６ ９)；イミダゾール１０、５０、および２００ｍＭの段階勾配)(Lindnerら、1992 )によって最初に精製し、次いで２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）でＩＭＡＣ溶出 物を透析した後、最終的に陽イオン交換クロマトグラフィー(Ｓ−Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ急速流速カラム、Pharmacia)(２０ｍＭ ＭＥＳ(ｐＨ６．０)；塩勾配０− ５００ｍＭ ＮａＣｌ)により精製した。純度はクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ により調節した。ｓｃＦＶの機能性は競合ＥＬＩＳＡにより試験した。 ｗｔ４−４−２０はペリプラズマ系における可溶性が非常に低いため、Ｔ７に 基く系（Studier & Moffatt,1986;Geら、1995）中で原形質封入体として発現さ せた。再ホールディング手順は別の記載（Geら、1995）に従って行なった。精製 において、再ホールディング用溶液（２Ｌ）を、予め透析することなく、１０時 間かけてフルオレセインアフィニティーカラムにかけ、次いで２０ｍＭ ＨＥＰ ＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。１ｍＭフルオレセイン( ナトリウム塩、Sigma Chemicals Co.)(ｐＨ７．５)２カラム容量を用い て、すべての機能的ｓｃＦｖフラグメントを溶出した。すべてのフルオレセイン を除去するには徹底的な透析（７日間、緩衝液交換１２回）が必要であった。す べての精製ｓｃＦｖフラグメントをゲル濾過にて試験した（Superose-12カラム 、Pharmacia SMART-System、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ ７．５)。 （ｅ）フルオレセインタイトレーションによるＫ_D測定 タンパク質の濃度はGillおよびvon Hippel（1989）に従って、計算した吸光度 係数を用いて測光法的に測定した。蛍光タイトレーション実験はフルオレセイン の蛍光が強いという利点を生かして行なった。１０または２０ｎＭフルオレセイ ンを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）２ｍＬをス ターラーを統合したキュベットに入れた。励起波長は４８５ｎｍであり、４９０ から５３０ｎｍまでの放射波長を記録した。精製ｓｃＦｖ（２０ｍＭ ＨＥＰＥ Ｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中）を部分標本５〜１００μＬ加え、 ３分間平衡化した後、スペクトルを記録した。スペクトルはすべて２０℃で記録 した。５１０ｎＭにおける最大放射を用いて、抗体フラグメント濃度の関数とし て減衰として示されるｓｃＦｖのフルオレセインに対するコンプレックス化の程 度を測定した。Ｋ_D値はScatchard分析により測定された。 （ｆ）平衡変性測定値 平衡変性曲線を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）緩衝液（２０ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ７．５)）中で０．２μ Ｍタンパク質を変性させ、総量１．７ｍＬ中の尿素量を増加させる（１．０−７ ．５Ｍ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）；１段階０ ．２５Ｍ）ことによって得た。試料を１０℃で１２時間、さらに測定前に２０℃ で３時間インキュベーションした後、励起波長２８０ｎｍで２０℃にて３２０− ３６０ｎｍの蛍光スペクトルを記録した。変性時における蛍光ピークの放射波長 は３４１から３４７ｎｍに移動し、非ホールド分子の分画を測定するのに用いら れた。曲線はPace（1990）に従って適合させた。 （ｇ）温度変性 温度変性速度を測定するには、精製ｓｃＦｖを最終濃度０．５μＭとなるよう にＨＢＳ緩衝液２ｍＬに溶解させた。４００ｎｍでの光分散により４０℃および ４５℃で２．５時間、凝集を追跡した。 iii）結果 （ａ）既知の抗体配列の比較 タンパク質の他のドメイン／ドメインインターフェースに比べて、免疫グロブ リンの可変ドメインと定常ドメイン間のインターフェースはあまり密にはパッキ ングされていない。ＰＤＢデータベースの３０の非重複Ｆａｂ構造の比較により 、軽鎖の可変ドメインと定常ドメイン間のドメインあたり４１０±９０Ųの領 域が埋没しているが、重鎖の可変ドメインと定常ドメインは７１０±１８０Ų の領域にわたって相互作用することが示された。インターフェース残基のすべて ではなくそのいくつかは疎水性、主に脂肪族である。一般的に、ｖ／ｃドメイン インターフェースに関与する残基の配列保存性は特に高くない。さらに、ｖ／ｃ ドメインインターフェースはＦｖフラグメント表面にはっきりした疎水性パッチ として現れる（図１）。 ３０の非重複Ｆａｂフラグメントおよびその対応Ｆｖフラグメント（ＰＤＢフ ァイルから定常ドメイン相当物を除去することによりＦａｂフラグメントから誘 導）の溶媒に接近可能な（アクセシブル）表面積はプログラムＮＡＣＣＥＳＳ(L ee & Richards，1971)を用いて計算した。ｖ／ｃドメインインターフェースに関 与する残基は、Ｆｖフラグメントにおける各アミノ酸側鎖の溶媒に接近可能な表 面をＦａｂフラグメントにおけるその接近可能な表面と比較することにより同定 された。図２は、定常ドメインを除去したときの側鎖の接近可能性の相対変化の プロットを配列位置の関数として示す。側鎖の接触可能性の有意な低下を示す残 基も配列アラインメント中に印をつけている。図２に示す位置の配列変動性を評 価するため、Kabatデータベースに収集された可変ドメイン配列（1996年現在） を分析した(表１)。抗体4-4-20のＶ_Lドメイン中に同定された１５インターフェ ース残基（図１および表１）のうち、Ｌ９(ｌｅｕ)、Ｌ１２(ｐｒｏ)、Ｌ１５( ｌｅｕ)、Ｌ４０(ｐｒｏ)、Ｌ８３(ｌｅｕ)、およびＬ１０６ （ｉｌｅ）は疎水性であり、したがって、置換の候補である。Ｖ_Hドメインの１ ６インターフェース残基のうち、Ｈ１１(ｌｅｕ)、Ｈ１４(ｐｒｏ)、Ｈ４１(ｐ ｒｏ)、Ｈ８４(ｖａｌ)、Ｈ８７(ｍｅｔ)、およびＨ８９（ｉｌｅ）は抗体4-4-2 0のｓｃＦｖフラグメントにおいて親水性残基で置換する可能性のある候補であ ることが確認された(図１および表１)。 しかしながら、これら疎水性残基のすべてが等しく置換の良い候補であるわけ ではない。ある特定の配列中では疎水性であるが、多くの他の配列中では親水性 である残基が最も魅力的であるかもしれないが、表１に示した保存された疎水性 残基が保持する展開圧力は全抗体内のＦａｂフラグメントには作用したが、単離 されたＦｖ部分には作用しなかったため、該残基についても検討を行なった。ｐ ｒｏＬ４０およびｐｒｏＨ４１はフレームワークII領域の底部でヘアピンターン を形成するが、保存されたＶ_Lシス−プロリンＬ８およびプロリン残基Ｈ９およ びＨ１４は免疫グロブリン可変ドメインのフレームワークＩの形を決定するため 、この試験ではプロリン残基は置換しなかった。 プロリンを除き、これは4-4-20ｓｃＦｖフラグメントにおいて考えられる置換 の候補として、Ｖ_Lドメイン中の残基Ｌ９(4-4-20ではｌｅｕ、ほとんどのκ鎖で はｓｅｒ)、Ｌ８３(ｌｅｕ、通常ｖａｌまたはｐｈｅ)、およびＬ１０６(すべて のκ鎖の８６％ではＩｌｅ)、およびＶ_H中のＨ１１(すべての重鎖の６０％では ｌｅｕ)、Ｈ８４(ｌｅｕ)他のＶ_Hドメインではしばしばａｌａまたはｓｅｒ)、 Ｈ８７(ｍｅｔ、通常ｓｅｒ)、およびＨ８９（ｉｌｅ、最もしばしばｖａｌ）を 残す。 （ｂ）4-4-20ｓｃＦｖ中の突然変異 4-4-20ｓｃＦｖフラグメントでは、上記配列分析において確認された非常に重 要な残基のいくつかはすでに親水性であるにも関わらず、９残基は疎水性の性状 を有する（軽鎖中のｐｒｏ１２を含む）(表１)。突然変異によってより綿密に分 析するため３つの残基を選んだ。 Ｖ_L中のｌｅｕ１５はすべてのκ鎖の９８％において疎水性アミノ酸である(表 １)。ｌｅｕ１１はＶ_H中で保存されており(表１)、ｖ／ｃドメイン間接触 に関与する(Lesk & Chothia,1988)。反対に、バリンがＨ８４位にあることは非 常に稀であり、主にこの位置にみられるのはトレオニンまたはセリンおよびアラ ニンである(表１)。図１にみることができるように、ｖａｌ８４はＶ_Hの新たに 露出した表面における大きな疎水性パッチに関与する。すべての３つの位置は突 然変異により酸性残基となり、Ｌ１１もアスパラギンに変化した(表２)。 ｓｃＦｖフラグメントは、２つの異なるリンカー、１５マー（量体）・リンカ ー（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃(Hustonら、1995)、および３０アミノ酸（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ ）₆に伸長した同じモチーフを用いて試験し、発現させた。すべての突然変異は 両構築物中で試験された。異なる突然変異の可溶性に関するin vivoの結果は同 じであるため、３０マー・リンカーの結果についてのみ詳細に説明する。ペリプ ラズマにおける発現試験は２４．５℃で実施し、すべての構築物の可溶性および 不溶性タンパク質をイムノブロッティングにより試験した。不溶性／可溶性タン パク質（ｉ／ｓ）比をすべての突然変異体について検討した。図３Ａ−Ｄにｗｔ ｓｃＦｖ突然変異体の不溶性（レーン１）および可溶性（レーン２）分画を示 す。可溶性物質はペリプラズマではほとんど発現がみられず、これは、先にｗｔ ｓｃＦｖｃのペリプラズマでの発現が主としてペリプラズマの封入体を生じる と述べたBedzykら（1990）およびDenzinら（1991）の以前の報告と一致する。 Ｖ_L中の単一点突然変異Ｌ１５Ｅ（Ｆｌｕ１）は、ｗｔと比べてｉ／ｓ比に対 する影響はなかった(図３Ａ、レーン３、４)。重鎖の１１位のｌｅｕのアスパラ ギンへの突然変異（Ｆｌｕ２）はｗｔに比べてほとんど影響がなく、アスパラギ ン酸による置換（Ｆｌｕ３）はｉ／ｓ比をより可溶性タンパク質へと変化させた が、この効果はあまり劇的ではなかった。これに対し、８４位の点突然変異（Fl u4、図３Ｂ、レーン３、４、および図３Ｄ、レーン３、４）は抗体4-4-20のｓｃ Ｆｖフラグメントの可溶性に劇的な影響を与えた。ｉ／ｓ比は約１：１に変化し 、ｗｔに比べて可溶性タンパク質が２５倍に増加した。 Ｖ８４ＤのＬ１１ＮまたはＬ１１Ｄとの組み合わせ（Ｆｌｕ５、Ｆｌｕ６）も ｗｔに比べてｉ／ｓ比を変化させるが、この比はＶ８４Ｄ単独に比べてさらに改 善されなかった(図３Ｂ)。興味深いことに、Ｆｌｕ５を、１５位の軽鎖突然変異 （Ｆｌｕ９）と組み合わせると、Ｆｌｕ５自体（図３Ｂ、レーン５、６）より可 溶性物質が少なくなる(図３Ｃ、レーン７、８)。Ｌ１５Ｅ突然変異の負の影響は Ｆｌｕ３（図３Ａ、レーン７、８）に比べてＦｌｕ８（図３ｃ、レーン５、６） でもみることができる。図３Ｄにおいて、ｗｔ（レーン１、２および５、６）と Ｆｌｕ４（レーン３、４および７、８）の比較を１５マーと３０マーの構築物の 両方について示す。Ｌ１５Ｅの負の影響は4-4-20ｓｃＦｖフラグメントのモデル を考察することにより合理的に説明することができる。Ｌ１５は残基Ａ８０、Ｌ ８３およびＬ１０６と一緒に疎水性ポケットを形成している。明らかに、Ｌ１５ はその直近の隣接物との疎水性相互作用によりｓｃＦｖフラグメントを安定化さ せる。この様に、ｓｃＦｖフラグメントをより親水性かつ可溶性にするためのＬ １５Ｅの置換はフラグメントの安定性を犠牲にしてなされる。したがって、フラ グメント内の疎水性相互作用の分析は、あらゆる他の抗体フラグメントにおいて 突然変異される溶媒に露出する残基を選ぶのに用いるべきである。ＶＨにおける 種々のセリン突然変異の組み合わせは、ｉ／ｓ比のさらなる改善をもたらす。突 然変異体ＦＨ１５（Ｖ８４Ｓ、Ｍ８７Ｓ、Ｉ８９Ｓ）およびＦＨ２０（Ｌ１１Ｓ 、Ｖ８４Ｓ、Ｍ８７Ｓ、Ｉ８９Ｓ）はいずれもイムノブロットにおいて７０％以 上が可溶性タンパク質であることを示した(データ示さず)。Ｌ１５Ｅの負の影響 （ｃ）機能的発現および精製 リンカー長の関数としてのｓｃＦｖフラグメントのオリゴマー化は以前に検討 されている。リンカー長の関数としての二量体および多量体の形成量の連続的減 少が報告されてきた(Desplancqら、1994;Whitlowら、1994)。（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ リンカーはＶ_H−Ｖ_L方向で多くの場合においてモノマーｓｃＦｖをもたらすこ とが示されたが、これはＶ_L−Ｖ_H方向の場合には当てはまらないことが多い。こ れはＶ_L／Ｖ_H配列が非対称であることにより、Ｖ_LのＣ末端とＶ_HのＮ末端間より Ｖ_Hの末端とＶ_LのＮ末端間の距離がより長くなることによって生じる(Hustonら 、1995)。結果として、同じ長さのリンカーは得られる分子に異 なる特性をもたらすことができよう。 本発明では構築物のＶ_LのＮ末端に最小摂動(perturbation)ＦＬＡＧ(Knappik & Plueckthun,1994)を用いることを選択したため、より長いリンカーの使用が検 討された。E.coliのペリプラズマにおける発現において、対応突然変異体におけ る１５マーと３０マー・リンカーの差は明らかでなかったが(図３D)、長および 短リンカーを用いて２つのＦｌｕ４ｓｃＦｖの精製を試みると、２つの構築物に 大きな不一致がみられた。１５マー・リンカーを用いるＦｌｕ４突然変異体（Ｖ ８４Ｄ）の精製では非常に少量の部分精製タンパク質しか得られないが(約０． ０１５ｍｇ／ＬおよびＯＤ；ＩＭＡＣ精製後ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推定)、３０ マー・リンカー構築物は、高度に精製された機能的タンパク質約０．３ｍｇ／Ｌ およびＯＤを生じる。３０マー・リンカーを用いるすべての突然変異体はゲル濾 過で試験され、モノマーであることがわかった(データ示さず)。 さらなるin vitro特性に関して、５つの突然変異体を３０マー・リンカーを用 いて精製した(Ｖ８４Ｄ(Ｆｌｕ４)、Ｖ８４Ｄ／Ｌ１１Ｄ(Ｆｌｕ６)、Ｌ１１Ｄ( Ｆｌｕ３)、およびセリン突然変異体ＦＨ１５およびＦＨ２０(iii(ｂ)参照)。最 初にＩＭＡＣを用い、次に陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる二段階クロ マトグラフィーは均質なタンパク質をもたらした。抗体フラグメントのｉ／ｓ比 （図３）は機能的タンパク質の精製収量にも反映された。高度に可溶性の突然変 異体Ｆｌｕ４（Ｖ８４Ｄ）（図３Ｂ、レーン３、４）は精製された機能的タンパ ク質約０．３ｍｇ／ＬおよびＯＤを産生し、Ｆｌｕ３（図３Ａ、レーン７、８の ブロットにおいて可溶性の低い物質）は約０．２５ｍｇ／ＬおよびＯＤを生じた 。セリン突然変異体ＦＨ１５およびＦＨ２０はそれぞれ０．３ｍｇおよび０．４ ｍｇ／ＬおよびＯＤを生じた。抗体4-4-20のｗｔ ｓｃＦｖはいずれのリンカー を用いたペリプラズマにおける発現でも全くいかなる可溶性タンパク質も生じず 、細胞質封入体として発現し、次いでin vitroで再ホールディングされ、蛍光ア フィニティクロマトグラフィーにかけられた。再ホールディングしたｗｔｓｃＦ ｖは、ゲル濾過により３０マー・リンカーを用いてモノマーであることが示され た(データ示さず)。 （ｄ）突然変異体ｓｃＦｖの生物物理学的特性 本発明では保存されているアミノ酸を変化させたため、これらの位置の変化が 構造全体に及び、それらが結合部位から非常に離れていても結合定数に影響する 可能性を排除できない(Chatellierら、1996)。これらの可能性を排除するため、 突然変異体Ｆｌｕ３、Ｆｌｕ４、Ｆｌｕ６、およびｗｔｓｖＦｖの結合定数を測 定した。蛍光タイトレーションを用い、フルオレセインが抗体と結合するときの フルオレセインの内在性蛍光の減衰を用いて溶液中のＫ_Dを測定した。５１０ｎ ｍで減衰する蛍光を、加えたｓｃＦｖの関数として測定した。Ｋ_D値（表３およ び図４）は３つすべての突然変異体ｓｃＦｖにっいて得られ、ｗｔ ｓｃＦｖは モノクローナル抗体4-4-20の最近訂正されたＫ_Dときわめて同様で非常に良く一 致している(Miklaszら、1995)。 突然変異が該タンパク質の熱力学的安定性に影響を及ぼすか否かを検討するた め、尿素変性による平衡無ホールディング曲線を検討した。V84D突然変異体およ びｗｔ ｓｃＦｖをこの分析に用い、図５にオーバーレイプロットを示す。両曲 線の中心点は４．１Ｍ尿素である。両曲線はPace（1990）記載の２段階モデルの アルゴリズムにより適合させたが、V84D突然変異体とｗｔ ｓｃＦｖの明らかに 小さな差は統計的に有意ではない。 ホールディング中間体の凝集は、突然変異体ｓｃＦｖとｗｔ ｓｃＦｖのin v ivo成績が異なることに対する別の説明となるかもしれない(図３)。E.coliのペ リプラズマではタンパク質濃度がかなり高いと考えられるため(van Wielink & D uine,1990)、凝集効果がみられるのであろう。in vitroでの凝集挙動を推定する ため、種々の温度で温度凝縮速度が測定された。図６には、ｗｔ ｓｃＦｖは４ ４℃ですでに有意に凝集し始めるが、突然変異体Ｖ８４Ｄはより徐々に凝集する 傾向があることが明確に示されている。すなわち、ｗｔ ｓｃＦｖは突然変異体 ｓｃＦｖより明らかに凝集傾向が強い。これは、平衡変性曲線と発現挙動との間 に相関が認められなかったが温度凝集速度には良好な相関がみられた、抗体Ｍｃ ＰＣ６０３について種々の突然変異を用いて行なわれた観察結果（Knappikおよ びPlueckthum,1995)と非常に同様である。 図および表 図１：抗体4-4-20のＦｖフラグメントの空間充填模型 図２：Ｖ_L（２ａ）およびＶ_H（２ｂ）の可変／定常ドメインインターフェース 残基。Brookhaven Databankからの３０の非重複(redundant)Ｆａｂフラグメント について、アミノ酸側鎖の溶媒に接近可能な表面をＦｖおよびＦａｂフラグメン トについて計算した。プロットは定常ドメインと接触している接近可能な表面の 相対的減少を示す（３０すべてのＦｖフラグメントについてのオーバーレイプロ ット)。配列アラインメントにおいて、ｖ／ｃインターフェースに関与する残基 に印を付している。シンボルは定常ドメインの除去における溶媒に接近可能な表 面の相対的減少を示す(シンボル：シンボルなし＜１％；●＜２０％；■＜４０ ％；▲＜６０％；▼＜８０％；および◆≧８０％)。円はさらに分析される残基 の位置を示す(表１参照)。 図３：抗体4-4-20のｓｃＦｖフラグメントを発現している材料と方法に従って 調製した細胞抽出物の不溶性（ｉ）および可溶性（ｓ）分画を示すウエスタンブ ロット。種々の突然変異体において置換されたアミノ酸を表２に示す。 図４：５１０ｎｍで測定した抗体（４〜８００ｎＭ）を用いるフルオレセイン （２０ｎＭ）の蛍光タイトレーションのScatchardプロット。ｒ値は(Ｆ−Ｆ_O)／ (Ｆ_OO−Ｆ_O)から得られた(ここで、Ｆは示した抗体濃度で測定されたフルオレセ イン蛍光であり、Ｆ_Oは抗体非存在下の蛍光であり、Ｆ_OOは大過剰の抗体が存在 するときの蛍光である)。ｒは抗体によるフルオレセインの飽和をもたらす。（ ａ）ｗｔ ｓｃＦｖのタイトレーション。（ｂ）Ｆｌｕ４（Ｖ８４Ｄ）のタイト レーション。 図５：尿素変性曲線のオーバーレイプロットを示す。（Ｘ）ｗｔ ｓｃＦｖ、 （ｏ）Ｆｌｕ４。 図６：ｗｔおよびＦｌｕ４ｓｃＦｖフラグメントの４０および４４℃における 温度変性時間経過を示す。（ａ）４０℃におけるｗｔ ｓｃＦｖ、（ｂ）４０℃ におけるＦｌｕ４、（ｃ）４４℃におけるＦｌｕ４、（ｄ）４４℃におけるｗｔ ｓｃＦｖ。 表１：ｖ／ｃインターフェースに関与する残基の配列変動性：残基の統計はKa batデータベース（1996年3月）の可変ドメイン配列に基く。＜９０％完全な配列 は分析から除外した。分析した配列の数：ヒトＶＬκ：８８１中４０４、ネズミ ＶＬκ：２２３９中１０６１、ヒトＶＬλ：４０９中２２３、ネズミＶＬλ：２ ０６中７１、ヒトＶＨ：１７５６中６６３、ネズミＶＨ：３８４９中１２９４。 位置はKabatら（1991）に従った配列位置を示し、また、％exp．(Ｆａｂ)はプロ グラムＮＡＣＣＥＳＳ(NACCESS v2.0、Simon Hubbard(http://www．biochem.ucl .ac.uk/〜roman/naccess/naccess.html))により計算されたＦａｂフラグメント 中の相対的側鎖接近可能性を、％exp.(ind.)は単離されたＶＬ」またはＶＨドメ インの相対的側鎖接近可能性を、埋没％はFvフラグメントとＦａｂフラグメント の側鎖接近可能性の相対的差を示す。コンセンサスは配列コンセンサスを示し、 分布は残基の種類の分布を示す。 表２：抗体4-4-20のｓｃＦｖフラグメントに導入された突然変異。各線は示し た突然変異を有する異なるタンパク質を表す。残基はKabatら（1991）に従って 番号付けしている。 表３：蛍光タイトレーションにおいて測定した異なるｓｃＦｖ突然変異体のＫ_D 値。Ｋ_D値はｎＭで示し、誤差はScatchard分析（図４）から計算し、＃はMikla szら（1995）によって決定した。 参考文献 表１：ｖ／ｃインターフェースに関与する残基の配列変動性表１：ｖ／ｃインターフェースに関与する残基の配列変動性（続き）表１：ｖ／ｃインターフェースに関与する残基の配列変動性（続き）表１：ｖ／ｃインターフェースに関与する残基の配列変動性（続き）表１：ｖ／ｃインターフェースに関与する残基の配列変動性（続き）表２：抗体４−４−２０のｓｃＦｖフラグメントに導入された突然変異表３：蛍光タィトレーションで決定した種々のｓｃＦｖ突然変異体のＫ_D値

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．より大きな免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）フラグメント もしくはタンパク質の鎖内に親ＩｇＳＦドメインまたはフラグメントと隣接した 第二ドメインとのインターフェースを含むかまたは含むであろう領域が修飾によ り親水性になっている、親ＩｇＳＦドメインまたはフラグメントと異なるＩｇＳ ＦドメインまたはフラグメントをコードするＤＮＡ配列。 ２．修飾が、より親水性であるアミノ酸とのインターフェースにおける１また はそれ以上のアミノ酸の置換である請求項１記載のＤＮＡ配列。 ３．修飾が、該インターフェースにおける１またはそれ以上の親水性アミノ酸 の挿入、または該インターフェースにおける全体的親水性を増大させるアミノ酸 の挿入、または該インターフェースにおける１またはそれ以上の疎水性アミノ酸 の欠失、または該インターフェースにおける全体的親水性の増大をもたらすアミ ノ酸の欠失である請求項１記載のＤＮＡ配列。 ４．修飾が、 ａ）より親水性であるアミノ酸を有するインターフェースでの１またはそれ以上 のアミノ酸の置換、 ｂ）該インターフェースにおける１またはそれ以上の親水性アミノ酸の挿入また は該インターフェースにおける全体的親水性を増大させるアミノ酸の挿入、 ｃ）該インターフェースにおける１またはそれ以上の疎水性アミノ酸の欠失また は該インターフェースにおける全体的親水性の増大をもたらすアミノ酸の欠失の ２またはそれ以上からなる請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ５．該置換または挿入アミノ酸がＡｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、 Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選ばれる請求項２〜４のい ずれかに記載のＤＮＡ配列。 ６．親ＩｇＳＦドメインがＩｇＳＦフラグメントの一部である請求項１〜５の いずれかに記載のＤＮＡ配列。 ７．該ドメインまたはフラグメントが抗体由来である請求項１〜６のいずれか に記載のＤＮＡ配列。 ８．該フラグメントがＦａｂフラグメントである請求項７記載のＤＮＡ配列。 ９．該フラグメントがＦｖフラグメントである請求項７記載のＤＮＡ配列。 １０．該フラグメントがｓｃＦｖフラグメントである請求項７記載のＤＮＡ配 列。 １１．該フラグメントがドメイン間のジスルフィド結合により安定化している Ｆｖである請求項７記載のＤＮＡ配列。 １２．該インターフェース領域が、ＶＬでは残基９、１０、１２、１５、３９ 、４０、４１、８０、８１、８３、１０３、１０５、１０６、１０６Ａ、１０７ 、１０８を、ＶＨでは残基９、１０、１１、１３、１４、４１、４２、４３、８ ４、８７、８９、１０５、１０８、１１０、１１２、１１３を含む請求項９〜１ １のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 １３．１またはそれ以上のさらなる部分をコードする隣接配列を有する請求項 １〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 １４．該さらなる部分の少なくとも一つが毒素、サイトカイン、またはレポー ター酵素である請求項１３記載のＤＮＡ配列。 １５．該さらなる部分の少なくとも一つが有機体の表面タンパク質の少なくと も部分である請求項１３記載のＤＮＡ配列。 １６．該有機体がフィラメント状バクテリオファージである請求項１５記載の ＤＮＡ配列。 １７．表面タンパク質が遺伝子IIIタンパク質である請求項１６記載のＤＮＡ 配列。 １８．該さらなる部分の少なくとも一つが金属イオンと結合することができる 請求項１３記載のＤＮＡ配列。 １９．該さらなる部分の少なくとも１つが少なくともヒスチジン５個を含む請 求項１８記載のＤＮＡ配列。 ２０．該部分がペプチドである請求項１３記載のＤＮＡ配列。 ２１．該ペプチドが標識用タグである請求項２０記載のＤＮＡ配列。 ２２．標識用タグがｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧである請求項２１記載のＤＮＡ 配列。 ２３．該ペプチドが２またはそれ以上の抗体フラグメントの自己結合を生じる 結合ドメインを含む請求項２０記載のＤＮＡ配列。 ２４．該結合ドメインがロイシンジッパーまたはヘリックス−ターン−ヘリッ クスモチーフから誘導される請求項２３記載のＤＮＡ配列。 ２５．該ペプチドが第一ヘテロ結合ドメインと結合することができる第二ヘテ ロ結合ドメインを含む、１またはそれ以上の抗体フラグメントと１またはそれ以 上のペプチドまたはタンパク質とのヘテロ結合を生じる第一ドメインを含む請求 項２０記載のＤＮＡ配列。 ２６．請求項１〜２５のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むベクター。 ２７．請求項２６記載のベクターを含む宿主細胞。 ２８．請求項１〜２５のいずれかに記載のＤＮＡ配列、請求項２６記載のベク ターによってコードされるか、または請求項２７記載の宿主細胞によって生産さ れるＩｇＳＦドメインまたはフラグメントを含むＩｇＳＦドメインもしくはフラ グメントまたは融合タンパク質。 ２９．請求項２８記載のＩｇＳＦドメインまたはフラグメントを含むＩｇＳＦ ドメインもしくはフラグメントまたは融合タンパク質を含む診断的組成物。 ３０．請求項２８記載のＩｇＳＦドメインまたはフラグメントを含むＩｇＳＦ ドメインもしくはフラグメントまたは融合タンパク質を含む治療的組成物。 ３１．ｉ）溶媒に暴露する親ＩｇＳＦドメインのインターフェース領域の疎水 性残基を分析し、 ii）より親水性の残基で置換される１またはそれ以上の疎水性残基、または該イ ンターフェース領域の全体的親水性を増大させる親水性残基またはアミノ酸スト レッチを該インターフェース領域中に挿入することができる１またはそれ以上の 位置、、または該インターフェース領域の全体的疎水性を増大させる疎水性残基 またはアミノ酸ストレッチを該インターフェース領域中から欠失させることがで きる１またはそれ以上の位置、または親ＩｇＳＦドメインの１またはそれ以上の 突然変異体をもたらす置換、挿入、および欠失のあらゆる組み合わせを同定する 工程を含む請求項１〜２５のいずれかに記載のＤＮＡ配列を誘導する方法。 ３２．ｉ）請求項３１記載のＤＮＡ配列を誘導し、 ii）別個にかまたは混合物として製造される、該突然変異体または突然変異体（ 複数）をコードするＤＮＡを製造し、 iii）所望によりさらなるＩｇＳＦドメインまたはフラグメントを発現するのに 適した１またはそれ以上のさらなるＤＮＡ配列、または該突然変異体または突然 変異体（複数）を含む融合タンパク質を発現させるのに適した１またはそれ以上 のＤＮＡ配列、または該さらなるＤＮＡ配列のあらゆる組み合わせを含む、該突 然変異体または突然変異体（複数）を発現させるのに適したベクター系中に該Ｄ ＮＡまたはＤＮＡ混合物を導入し、 iv）該ベクター系を適切な宿主細胞中に導入し、次いで該突然変異体または突然 変異体（複数）の混合物を発現するか、または該さらなるＤＮＡ配列の発現産物 と共に該突然変異体または突然変異体の混合物を発現し、 ｖ）可溶性形で高収量で得られる単独または混合物の１またはそれ以上の突然変 異体を同定し、特徴づけ、 vi）必要により、さらに単独または混合物の該同定された突然変異体または突然 変異体（複数）の親水性を増大させるために工程ii)〜vi）を反復する工程を含 む請求項２８記載のＩｇＳＦドメインまたはフラグメントを含むＩｇＳＦドメイ ンもしくはフラグメントまたは融合タンパク質の製造方法。 ３３．該宿主が細菌、真菌、植物、昆虫細胞、または哺乳動物起源の細胞系で ある請求項３２に記載の方法。 ３４．請求項２７記載の宿主細胞を培養し、該ドメインまたはフラグメントを 単離することを含む請求項２８記載のＩｇＳＦドメインまたはフラグメントの製 造方法。