JP2013511966A - 単一特異性ポリペプチド試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体は、血漿糖タンパク質であり、これは、ジスルフィド架橋によって接続した複数のポリペプチド鎖からなる。標準的な抗体は、2本の同一免疫グロブリン(Ig)重鎖および2本の同一軽鎖からなる。両方の抗体鎖は、約110個のアミノ酸残基の長さを有する異なるタンパク質ドメインからなり、このドメインは、特徴的な免疫グロブリンフォールドの形態のβシートからなる。重鎖は、1つの可変(VH)ドメインと、3つまたは4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3、CH4)とからなる。軽鎖は、1つの可変(VL)ドメインと、1つの定常(CL)ドメインとからなる。上記重鎖および軽鎖の可変部分、特に、超可変相補性決定領域(CDR)は、抗原特異性に寄与する。免疫系により、非常に異なる抗原に対する抗体の高度な多様性が実現する。抗体は、異なるクラス、例えば、IgM、IgA、IgG、IgE、IgDに属し得る。
抗体フラグメントは、酵素的切断または組換えプロセスによって得ることができる。抗原認識機能を備えたFabフラグメントは、ジスルフィド架橋を介して共に接続した、上記重鎖のVH-CH1ドメインと、上記軽鎖のVL-CLドメインとを含有するが、Fvフラグメントは、重鎖および軽鎖可変領域のみを含む。しかし、複数のタンパク質サブユニットからなるこれらのフラグメントは、複雑なプロセスによってしか、許容可能な収率で生理活性な形態に調製することができない(Readら(2007)、Appl. Environ. Microbiol. 73: 5088〜5096)。
例えば病原体、自己抗原またはアレルゲンに対する特異的抗体の、生体試料中での存在または濃度を決定するための、多数のイムノアッセイの形式が存在する。一般に、このようなアッセイは、特定の抗体クラス、または、特定の抗体クラスの組合せの検出を対象としており、特定の内部対照またはキャリブレータを使用する。例えば、ヒト自己抗体の決定に適したイムノアッセイは、一般に、較正曲線の作成のために、陽性対照、陰性対照および指標キャリブレータ、または、段階的な様々なキャリブレータ濃度(標準系列)を含み、これにより、試料中の抗体濃度を内挿できる。このような対照および較正試薬は、従来、適切な希釈媒体中に、血清陽性の血漿または血清を希釈することによって調製される。
(i)抗体の重鎖可変領域を含む第1のドメイン(VH)または抗原結合を仲介する少なくとも1つのその区画、
(ii)抗体の軽鎖可変領域を含む第2のドメイン(VL)または抗原結合を仲介する少なくとも1つのその区画、および
(iii)抗体の重鎖定常領域の区画を含む第3のドメイン(CHX)
を含み、
ドメイン(i)、(ii)および(iii)が、ペプチドリンカー(L)を介して共に連結している、
1価の融合ポリペプチドを提供する。
VH-L-VL-L-CHX、または
VL-L-VH-L-CHX
を有し、
式中、VHは、抗体の重鎖可変領域または抗原結合を仲介する少なくとも1つのその区画を意味し、VLは、抗体の軽鎖可変領域または抗原結合を仲介する少なくとも1つのその区画を意味し、Lは、ペプチドリンカーを意味し、CHXは、抗体の重鎖定常領域の部分区画を含むドメインを意味する。CHXは、例えば、抗体の、好ましくは、クラスIgG、IgM、IgEおよびIgAの抗体の、特に好ましくは、クラスIgG、IgM、IgEおよびIgAのヒト抗体の重鎖定常領域の区画CH1、CH2、CH3およびCH4から選定できる。ドメインCHXの好例は、IgG-CH1、IgG-CH2、IgG-CH3、IgA-CH2、IgA-CH3、IgM-CH2、IgM-CH3およびIgM-CH4またはこれらの組合せであり、特に、各々のヒト抗体のものである。
VL-L-VL-L-CHX1-L-CHX2(-L-CHX3)、または
VL-L-VH-L-CHX1-L-CHX2(-L-CHX3)
であり、
式中、VH、LおよびVLは、上記のように定義され、CHX1、CHX2およびCHX3の各々は、上記のように定義された第3のドメインCHXを意味する。
a)配列および構造データバンク情報を考慮して、既知またはモデル化した空間構造の免疫グロブリンの空間的に区分されたドメインを選択するステップ、
b)選択したドメインのジスルフィド架橋を最適化するステップであって、インタクトな免疫グロブリンとの関連で、選定したドメインの外側にジスルフィド架橋を形成するシステイン位置が、構造的に中性のアミノ酸、好ましくはセリン、アラニンまたはグリシンに編集されるステップ、
c)任意選択により、アスパラギン結合グリコシル化位置を、好ましくは、セリン、アラニンまたはグリシンに編集するステップ、
d)ステップa)〜c)から得られた機能モジュールの選択箇所を、好ましくは、アミノ酸のグリシンおよび/またはセリンから主になり、特に好ましくは、リンカー配列(配列番号3)に対応するフレキシブルリンカー配列と連結するステップであって、該モジュボディ内の機能モジュールの位置と、クローニングストラテジーとに応じて、ステップa)〜c)から得られたモジュール配列を、フレキシブルリンカー配列と連結でき、該リンカー配列により、該機能モジュールのN末端またはC末端を形成でき、完全なモジュボディを形成する複数の機能モジュールまたはアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を、任意選択により、生じさせることができるステップ、
e)好ましくは、所期の発現系に対して最適化したコドン頻度表を考慮して、ステップa)〜d)から得られたアミノ酸配列を、対応するDNA配列に翻訳するステップであって、得られたDNA配列に、任意選択により、望ましくない制限酵素切断部位を避けるために、フランキング制限酵素切断部位および保存的塩基置換を提供することができるステップ、
f)遺伝子合成、および個々の機能モジュール、または一連の複数の同一であるもしくは異なる機能モジュールをコードする遺伝子ユニットの適切なベクター中へのクローニング、所期の機能モジュール配列および番号における、個々の機能モジュールまたは一連の機能モジュールのアセンブリによる、完全なモジュボディのクローニングにより、ステップe)で定義した配列を合成DNAとして調製するステップであって、完全なモジュボディをコードする遺伝子ユニットは、任意選択により、直接クローニングもできるステップ
を含む。
(実施例1)
β2糖タンパク質結合モジュール(scFv-CAD)の構築、クローニングおよび特性決定
1.1 scFv-CADの構築
下記の例では、合成構築体の形態でのβ2糖タンパク質特異的結合モジュール(scFv-CAD)の構築を説明する。
上記構築のために、実施例1.1で説明した、β2糖タンパク質検出ドメインをコードする人工DNA配列scFv-RP-CAD-N(配列番号5)を、プライマーRP-CAD01(配列番号6)、RP-CAD02(配列番号7)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。856塩基対(bp)の増幅物を、アガロースゲル電気泳動後に、QiaExIIキット(Qiagen、Hilden)を用いて単離した。単離したフラグメントを、最初に、制限酵素HindIIIで消化し、その後、BgIIIによる部分消化を行った。制限フラグメントを、適合性の酵素BamHIおよびHindIIIで消化したプラスミドpQE-80L(Qiagen、Hilden)とライゲーションし、大腸菌株NovaBlue(Merck、Nottingham)に形質転換した。この形質転換バッチを、50μg/mlのカルベニシリンを追加したLB寒天プレート上に蒔き、36℃で一晩(o.n.)(16〜20h)、インキュベートした。得られた大腸菌株CAD-pQE80-NovaBlueの単一コロニーを、50μg/mlのカルベニシリン(LB-Carb)を追加したLB培地中で、180回転/分(rpm)の振とう器上で増殖した(36℃、o.n.)。凍結用の保存培養物を、単一クローン培養物から調製した。いずれの場合でも、1mlの単一クローン培養物を、プラスミド調製に使用した。単離したプラスミドを、EcoRI/HindIIIでの消化によって分析した。予想される901bpのフラグメントを有するクローンを、誘導分析によってさらに調査した。そのために、選定した単一クローンを、LB-Carb中で、0.5から1.0までのO.D. 500になるまで成長させ、1培養体積のLB-Carb、1mMイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の添加により、クローニングしたDNAフラグメントによってコードされるタンパク質の発現へ誘導し、36℃、180rpmで16時間(h)培養した。この誘導細胞を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)含有緩衝液中に溶解し、タンパク質を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって分離した。ウエスタンブロットにおいて、予想される30kDaのscFv-CADタンパク質の発現が、抗RGS-6xHisペルオキシダーゼ結合型抗体(Qiagen、Hilden)を用いた検出により検出された。正しくクローニングされていることを、シークエンシングによって確認した。
発現構築体を有する、1.2で形質転換した大腸菌株CAD-pQE80-NovaBlueを、LB-Carb培地中において36℃で、0.5から1.0までのO.D. 500になるまで成長させ、IPTGの添加により、scFv-CADの合成へ誘導した。誘導した培養物を、4時間から一晩までの間で、36℃で培養した。この誘導細胞を回収し、リゾチーム処理後に、8M尿素含有トリスHCl塩化ナトリウム緩衝液(TBS)中に溶解した。発現したscFv-CADを、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとの組合せにより、均一になるまで精製した。scFv-CADタンパク質は、クーマシーブルー染色SDS-ポリアクリルアミドゲル中の30kDaバンドの形態において、視認可能である。β2糖タンパク質結合活性の向上は、30kDaバンドの精製に関連している。
scFv-CADの結合特異性を、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)において、β2糖タンパク質によってまたはウシ血清アルブミン(BSA)によって被覆したマイクロタイタープレートを使用して、試験した。scFv-CADの熱ストレスに対する安定性を、scFv-CADの適切な希釈物に対して調査した。
scFv-CADが、特異的β2糖タンパク質結合活性を有するかを決定するために、精製タンパク質モジュールを、イムノアッセイによって試験した。そのために、scFv-CADの連続希釈物を、β2糖タンパク質(ORG 521、ORGENTEC Diagnostika GmbH、Mainz)で被覆した抗β2糖タンパク質アッセイのマイクロタイタープレートと、結合特異性の対照とするためのBSA被覆プレートとに適用し、20〜25℃で30分間インキュベートした。マイクロタイタープレートを洗浄し、scFv-CADの結合を、ペルオキシダーゼ標識RGS-6X-His抗体(Qiagen、Hilden)と、O.D. 450の計測によるテトラメチルベンジジン(TMB)呈色反応を使用して決定した。図2に示されているように、β2糖タンパク質への特異的結合は、わずか19ng/mlのscFv-CAD濃度で検出された。β2糖タンパク質被覆マイクロタイタープレートへの結合と、BSA被覆マイクロタイタープレートへの結合とにおけるscFv-CAD連続希釈物の反応レベルの比較により、非特異的結合が、濃度範囲0.019〜10μg/mlのscFv-CAD中では起きないことを示している。
scFv-CADの特異的β2糖タンパク質結合活性に対する温度ストレスの影響を調査するために、濃度5μg/mlの精製タンパク質モジュールを、0〜180分間にわたって、50℃の温度にさらした。β2糖タンパク質へのscFv-CADの結合を、1.4.1で説明したイムノアッセイにおいて決定した。図3Aに示しているように、キャリブレータ希釈媒体中に希釈したscFv-CADモジュールは、50℃の温度に3時間耐えることが見出された。
モジュボディ用の一連の反応モジュールの構築
下記の実施例では、ヒト抗体の重鎖定常領域のドメインに由来する一連の反応モジュールの構築を説明する。そのために、構造的または機能的に区切られたドメインは、公知の空間構造の、クラスIgG、IgA、IgMのヒト抗体の重鎖のタンパク質配列に由来した。選定したタンパク質配列を、潜在的なドメイン間ジスルフィド架橋について検査した。インタクトな免疫グロブリンの領域とのジスルフィド架橋を、選定したドメインの外部に形成するシステイン位置を、システインからセリンに編集した。同様に、個々のグリコシル化位置で、アスパラギンを同様に、セリンに編集した。選定した免疫グロブリンドメイン配列は、反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)およびフランキング配列と接合させて、人工タンパク質配列を形成した。コドン頻度表に基づいて、これらの反応モジュール配列を、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列を提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列として調製した。
Worldwide Protein Data Bank(pdb)から(Bermanら(2003)、Nature Structural Biology 10: 980)、配列位置125〜219を、タンパク質構造データバンクエントリーpdb 3D69Hに基づいて、代表的なIgG-CH1ドメインとして、抗第Ix因子抗体10c12のFabフラグメントの結晶構造から選定した。選定したIgG-CH1免疫グロブリンドメイン配列は、IgG-CH1反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合させて、人工タンパク質配列Sc-RP-CH1-G-P(配列番号8)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI、HindIII)がさらに備えられ、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH1-G-N(配列番号9)として調製した。IgG-CH1ドメインは、配列番号8中のアミノ酸37〜131から延びる。
変異Adcc強化Fcフラグメントの結晶構造から、配列位置15〜116を、タンパク質構造データバンクエントリーpdb 2QL1Aに基づいて、代表的なIgG-CH2ドメインとして選定した。選定したIgG-CH2免疫グロブリンドメイン配列は、IgG-CH2反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合させて、人工タンパク質配列Sc-RP-CH2-G-P(配列番号10)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)がさらに備えられ、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH2-G-N(配列番号11)として調製した。IgG-CH2ドメインは、配列番号10中のアミノ酸37〜138から延びる。
ヒンジが欠失したヒト免疫グロブリンの重鎖の結晶構造から、配列位置330〜428を、タンパク質構造データバンクエントリーpdb 1MCO_H(GI: 494350)に基づいて、代表的なIgG-CH3ドメインとして選定した。選定したIgG-CH3免疫グロブリンドメイン配列を、IgG-CH3反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合して、人工タンパク質配列Sc-RP-CH3-G-P(配列番号12)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH3-G-N(配列番号13)として調製した。IgG-CH3ドメインは、配列番号12中のアミノ酸37〜135から延びる。
溶液中の中性子散乱および相同性モデリング(Boehmら(1999) J. Mol. Biol. 286: 1421〜1447)に基づいて得られたヒトIgAの構造モデルから、配列位置126〜222(UNIPROT P01876に対応する)を、ヒトIgA1の重鎖の空間構造に基づいて、代表的なIgA-CH2ドメインとして、タンパク質構造データバンクエントリーpdb 1IGAから選定した。位置182、192では、システインをセリンに編集した。選定および編集したIgA-CH2免疫グロブリンドメイン配列は、IgA-CH2反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合させて、人工タンパク質配列Sc-RP-CH2-A-P(配列番号14)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH2-A-N(配列番号15)として調製した。IgA-CH2ドメインは、配列番号14中のアミノ酸37〜133から延びる。
タンパク質構造データバンクエントリーPDB 1IGAから、配列位置227〜331(UNIPROT P01876に対応する)を、ヒトIgA1の重鎖の空間構造に基づいて、代表的なIgA-CH3ドメインとして選定した。選定したIgA-CH3免疫グロブリンドメイン配列は、IgA-CH3反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合させて、人工タンパク質配列sc-RP-CH3-A-P(配列番号16)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列sc-RP-CH3-A-N(配列番号17)として調製した。IgA-CH3ドメインは、配列番号16中のアミノ酸37〜141から延びる。
溶液中のX線散乱およびモデリング(Perkinsら(1991) J. Mal. Biol. 221:1345〜1366)に基づいて得られたヒトIgMの構造モデルから、配列位置106〜217(UNIPROT P01871に対応する)を、ヒトIgMの重鎖の空間構造に基づいて、代表的なIgM-CH2ドメインとして、タンパク質構造データバンクエントリーpdb 2rcjから選定し、編集した。位置214では、システインをセリンに編集し、位置109では、アスパラギンをセリンに編集する。選定および編集したIgM-CH2免疫グロブリンドメイン配列を、IgM-CH2反応モジュール用の構成単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)を接合して、人工タンパク質配列Sc-RP-CH2-M-P(配列番号18)を形成し、コドン頻度表を考慮した、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH2-M-N(配列番号19)として調製した。IgM-CH2ドメインは、配列番号18中のアミノ酸37〜148から延びる。
タンパク質構造データバンクエントリーpdb 2rcjから、配列位置218〜323(UNIPROT P01871に対応する)を、ヒトIgMの重鎖の空間構造に基づいて、代表的なIgM-CH3ドメインとして選定し、編集した。位置291では、システインをセリンに編集し、位置272および279では、アスパラギンをセリンに編集した。選定および編集したIgM-CH3免疫グロブリンドメイン配列を、IgM-CH3反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合して、人工タンパク質配列Sc-RP-CH3-M-P(配列番号20)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH3-M-N(配列番号21)として調製した。IgM-CH3ドメインは、配列番号20中のアミノ酸37〜142から延びる。
タンパク質構造データバンクエントリーpdb 2rcjから、配列位置324〜452(UNIPROT P01871に対応する)を、ヒトIgMの重鎖の空間構造に基づいて、代表的なIgM-CH3ドメインとして選定し、編集した。位置451では、システインをセリンに編集し、位置439では、アスパラギンをセリンに編集した。選定および編集したIgM-CH3免疫グロブリンドメイン配列を、IgM-CH3反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合して、人工タンパク質配列Sc-RP-CH4-M-P(配列番号22)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH4-M-N(配列番号23)として調製した。IgM-CH4ドメインは、配列番号22中のアミノ酸37〜165から延びる。
ヒンジが欠失したヒト免疫グロブリンの重鎖の結晶構造から、配列位置330〜428を、タンパク質構造データバンクエントリーpdb 1MCO_H(GI:494350)に基づいて、代表的なIgG-CH3ドメインとして選定し、編集した。その側鎖がIgG1-CH3二量体の界面(Ridgway J.B.Bら(1996)、Protein Engineering、9: 617〜621)で接触を形成するアミノ酸残基の位置を、IgG-CH3ドメインの二量体化が起きないように修飾した。位置351および379では、トレオニンをチロシンに編集し、位置390では、フェニルアラニンをチロシンに編集した。選定および編集したIgG-CH3免疫グロブリンドメイン配列を、IgG-CH3-Knob02反応モジュール用の構造単位として、フレキシブルリンカー(配列番号3)と接合して、人工タンパク質配列Sc-RP-CH3-G-Knob02-P(配列番号32)を形成し、コドン頻度表を考慮して、大腸菌中での発現に対して最適化した核酸配列に翻訳し、フランキングクローニング配列(BamHI/HindIII)をさらに提供し、遺伝子合成により、人工DNA配列Sc-RP-CH3-G-Knob02-N(配列番号33)として調製した。IgG-CH3-Knob02ドメインは、配列番号32中のアミノ酸37〜135から延びる。
単鎖CAD-IgG-CH3モジュボディ
3.1 単鎖CAD-IgG-CH3モジュボディの構築およびクローニング
下記の実施例では、ヒトIgG-CH3検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH3の構築およびクローニングについて説明する。
下記の実施例では、ヒトIgG-CH3検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH3の発現および精製について説明する。
下記の実施例では、特異的抗原認識に関連するヒトIgG-CH3検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH3の特性決定と、抗ヒトIgG二次抗体を介した特異的検出性と、高温、乾燥および凍結融解サイクルに対する安定性とを説明する。
CAD-IgG-CH3モジュボディが、scFv-CADのβ2糖タンパク質結合活性を保持していて、抗原への結合が、抗ヒトIgG二次抗体を介して、特異的に検出できるかを決定するために、精製CAD-IgG-CH3調製物を、抗β2糖タンパク質イムノアッセイにより調査した。精製CAD-IgG-CH3モジュボディを、キャリブレータ希釈媒体中での濃度が0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlである連続希釈で、β2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗β2糖タンパク質アッセイ(ORG 521、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して決定した。図4は、濃度に応じた、選定した反応条件下で決定したOD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、CAD-IgG-CH3モジュボディは、5μg/mlの濃度で2.2のO.D. 450において検出された。
CAD-IgG-CH3モジュボディの頑健性を特性決定するために、キャリブレータ希釈媒体中の希釈物を、50℃の熱ストレス、36℃での高い貯蔵温度、乾燥および凍結融解サイクルの反復といったストレス因子にさらした。β2糖タンパク質結合活性と、抗hu IgGペルオキシダーゼ標識二次抗体(Jackson Immunoresearch)を用いた検出性とを、未処理試料と比較して決定した。
熱ストレスに対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体中での濃度が0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlであるCAD-IgG-CH3モジュボディの希釈物を、50℃で60分間および90分間インキュベートし、室温で貯蔵した希釈系列と比較して、抗β2糖タンパク質イムノアッセイにおいて調査した。β2糖タンパク質結合活性を、抗β2糖タンパク質アッセイ(ORG 521、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して決定した。図5は、室温で貯蔵した希釈系列と比較して、50℃で60分間および90分間インキュベートした希釈系列について選定した反応条件下で決定した、OD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、0.31μg/mlから20μg/mlまでの濃度範囲の希釈物中のCAD-IgG-CH3モジュボディの機能は、60分間または90分間での50℃の温度ストレスによって損なわれなかった。
高い貯蔵温度に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体中での濃度が0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlであるCAD-IgG-CH3モジュボディの希釈物を、36℃で1、2、4、7、10日間インキュベートし、4℃で貯蔵した希釈系列と比較して、抗β2糖タンパク質イムノアッセイにおいて調査した。β2糖タンパク質結合活性を、抗β2糖タンパク質アッセイ(ORG 521、ORGENTEC GmbH、Mainz)ために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して決定した。図6は、4℃で貯蔵した希釈系列と比較して、36℃で1、2、4、7、10日間貯蔵した希釈系列について選定した反応条件下で決定した、OD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、0.31μg/mlから20μg/mlまでの濃度範囲の希釈物中のCAD-IgG-CH3モジュボディの機能は、10日間にわたる36℃での貯蔵によっては損なわれなかった。
乾燥に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体50μlずつ中での濃度が0μg/ml、3.1μg/ml、6.21μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlであるCAD-IgG-CH3モジュボディの希釈物を、Speedvak中で、真空下、22℃で乾燥した。乾燥試料を、450μlのキャリブレータ希釈媒体と、50μlの水とで再可溶化して、濃度0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlの希釈系列を生じさせ、未処理の希釈系列と比較して、抗β2糖タンパク質-カルジオリピンイムノアッセイにおいて調査した。β2糖タンパク質結合活性を、抗カルジオリピン-β2糖タンパク質アッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して決定した。図7は、未処理の希釈系列と比較して、乾燥試料について選定した反応条件下で決定した、OD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、3.1μg/mlから200μg/mlまでの濃度範囲の希釈物中のCAD-IgG-CH3モジュボディの機能は、乾燥によっては損なわれなかった。
凍結融解サイクルの反復に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体50μlずつ中での濃度が0μg/ml、3.1μg/ml、6.21μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlであるCAD-IgG-CH3モジュボディの希釈物を、凍結融解サイクルの5回の反復中に、-70℃で凍結させ、37℃で再び融解した。次に、これらの試料を、450μlのキャリブレータ希釈媒体によって希釈して、濃度0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlの希釈系列を生じさせ、未処理のCAD-IgG-CH3希釈系列と比較して、抗β2カルジオリピン-糖タンパク質イムノアッセイにおいて調査した。β2糖タンパク質結合活性を、抗カルジオリピン-β2糖タンパク質アッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して決定した。図8は、未処理の希釈系列と比較して、凍結および融解を反復した試料について選定した反応条件下で決定した、OD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、3.1μg/mlから200μg/mlまでの濃度範囲のCAD-IgG-CH3モジュボディの機能は、凍結融解サイクルの反復によっては損なわれなかった。
単鎖CAD-IgG-CH2モジュボディ
4.1 単鎖CAD-IgG-CH2モジュボディの構築およびクローニング
下記の実施例では、モノマー型ヒトIgG-CH2検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH2の構築およびクローニングについて説明する。
下記の実施例では、モノマー型ヒトIgG-CH2検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH2の発現および精製について説明する。
下記の実施例では、特異的抗原認識に関連するモノマー型ヒトIgG-CH2検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH2の特性決定と、抗ヒトIgG二次抗体を介した特異的検出性と、高温、乾燥および凍結融解サイクルに対する安定性とについて説明する。
CAD-IgG-CH2モジュボディが、scFv-CADのβ2糖タンパク質結合活性を保持していて、抗原への結合が、抗ヒトIgG二次抗体を介して、特異的に検出できるかを決定するために、精製CAD-IgG-CH2調製物を、抗カルジオリピン/β2糖タンパク質イムノアッセイにおいて調査した。精製CAD-IgG-CH2モジュボディを、キャリブレータ希釈媒体中での濃度が0μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/mlである希釈系列中で、カルジオリピンと複合したβ2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗カルジオリピンアッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)ために用意したインキュベーション条件下で、濃度200ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識した二次抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して決定した。図9は、濃度に応じた、選定した反応条件下で決定したOD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、CAD-IgG-CH2モジュボディは、20μg/mlの濃度で1.7のO.D. 450nmにおいて検出された。
乾燥に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体50μlずつ中での濃度が0μg/ml、3.1μg/ml、6.21μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlであるCAD-IgG-CH2モジュボディの希釈物を、Speedvak装置中で、真空下、22℃において乾燥した。この乾燥試料を、450μlのキャリブレータ希釈媒体と、50μlの水とで再可溶化して、濃度0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlの希釈系列を生じさせ、未処理の希釈系列と比較して、カルジオリピンと複合したβ2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗カルジオリピンアッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)ために用意したインキュベーション条件下で、濃度200ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して決定した。図10は、未処理の希釈系列と比較して、乾燥試料について選定した反応条件下で決定したOD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、3.1μg/mlから200μg/mlまでの濃度範囲の希釈物中のCAD-IgG-CH2モジュボディの機能は、乾燥によっては損なわれていなかった。
凍結融解サイクルの反復に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体50μlずつ中での濃度が0μg/ml、3.1μg/ml、6.21μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlであるCAD-IgG-CH2モジュボディの希釈物を、凍結融解サイクルの5回の反復中に、-70℃で凍結させ、37℃で再び融解した。次に、この試料を、450μlのキャリブレータ希釈媒体で希釈して、濃度0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlの希釈系列を生じさせ、未処理のCAD-IgG-CH2希釈系列と比較して、カルジオリピンと複合したβ2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗カルジオリピンアッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)ために用意したインキュベーション条件下で、濃度200ng/mlの抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して決定した。図11は、未処理の希釈系列と比較して、凍結および融解の反復をした試料について選定した反応条件下で決定したOD 450nmの変動を示している。選定した反応条件下では、3.1μg/mlから200μg/mlまでの濃度範囲のCAD-IgG-CH2モジュボディの機能は、凍結融解サイクルの反復によっては損なわれなかった。
単鎖多機能性CAD-IgM-IgA-IgGモジュボディ
単鎖多機能性モジュボディCAD-IgM-IgA-IgGは、直線配列中に、4つの機能モジュールを含有する。β2糖タンパク質認識ドメインと、ヒト免疫グロブリンIgM、IgAおよびIgGの重鎖のCH3ドメインに由来する複数の反応モジュールとは、ペプチドリンカーを介して連結している。したがって、CAD-IgM-IgA-IgGモジュボディの検出は、異なるアイソタイプ特異的二次抗体を介して実施できる。
下記の実施例では、ヒトIgM-、IgG-およびIgA-CH3検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgM-IgA-IgGの構築およびクローニングを説明する。
下記の実施例では、ヒトIgM-CH3、IgA-CH3およびIgG-CH3検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgM-IgA-IgGの発現および精製について説明する。
下記の実施例では、特異的抗原認識に関連するヒトIgM-CH3、IgA-CH3およびIgG-CH3検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgM-IgA-IgGの特性決定と、抗ヒトIgM、IgAおよびIgG二次抗体を介した特異的検出性と、乾燥および凍結融解サイクルに対する安定性とについて説明する。
CAD-IgM-IgA-IgGモジュボディが、scFv-CADのβ2糖タンパク質結合活性を保持していて、抗原への結合が、異なるアイソタイプ特異的抗ヒト二次抗体を介して検出できるかを決定するために、精製CAD-IgM-IgA-IgG調製物を、抗β2糖タンパク質/カルジオリピンイムノアッセイによって調査した。精製CAD-IgM-IgA-IgGモジュボディを、キャリブレータ希釈媒体中での濃度が0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlである希釈系列中で、カルジオリピンと複合したβ2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗カルジオリピンアッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgM、抗ヒトIgAおよび抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して別個の決定において決定した。図12は、CAD-IgM-IgA-IgGモジュボディの濃度に応じた、選定した検出抗体によるOD 450nm決定の変動を示している。選定した反応条件下では、CAD-IgM-IgA-IgGモジュボディは、O.D. 450nm値が2.8、1.8および2.7である抗ヒトIgM、抗ヒトIgAおよび抗ヒトIgG二次抗体による決定時に、濃度5μg/mlにおいて検出された。
乾燥に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体50μlずつ中での濃度が0μg/ml、3.1μg/ml、6.21μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlであるCAD-IgM-IgA-IgGモジュボディの希釈物を、Speedvak装置中で、真空下、22℃において乾燥した。この乾燥試料を、450μlのキャリブレータ希釈媒体および50μlの水で再可溶化して、濃度0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlの希釈系列を生じさせ、未処理の希釈系列と比較して、カルジオリピンと複合したβ2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗カルジオリピンアッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgM、抗ヒトIgAおよび抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して別個の決定において決定した。図13は、乾燥試料の希釈ステップと比較して、未処理試料の希釈ステップでの選定した検出抗体によるOD 450nm決定の変動を示している。選定した反応条件下では、3.1μg/mlから200μg/mlまでの濃度範囲の希釈物中のCAD-IgM-IgA-IgGモジュボディの機能は、乾燥によっては損なわれなかった。
凍結融解サイクルの反復に対する安定性を、以下の通りに調査した。キャリブレータ希釈媒体50μlずつ中での濃度が0μg/ml、3.1μg/ml、6.21μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlであるCAD-IgM-IgA-IgGモジュボディの希釈物を、凍結融解サイクルの5回の反復中に、-70℃で凍結させ、37℃で再び融解した。次に、これらの試料を、450μlのキャリブレータ希釈媒体で希釈して、濃度0μg/ml、0.31μg/ml、0.62μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/mlの希釈系列を生じさせ、未処理のCAD-IgM-IgA-IgG希釈系列と比較して、カルジオリピンと複合したβ2糖タンパク質で被覆したマイクロタイタープレートに適用した。抗原結合活性を、抗カルジオリピンアッセイ(ORG 515、ORGENTEC GmbH、Mainz)のために用意したインキュベーション条件下で、濃度80ng/mlの抗ヒトIgM、抗ヒトIgAおよび抗ヒトIgGペルオキシダーゼ標識二次抗体(Jackson Immunoresearch)を使用して別個の決定において決定した。図14は、凍結および融解の反復をした試料と比較して、未処理試料の希釈ステップの場合での選定した検出抗体による、OD 450nm決定の変動を示している。選定した反応条件下では、3.1μg/mlから200μg/mlまでの濃度範囲の希釈物中のCAD-IgM-IgA-IgGモジュボディの機能は、凍結融解サイクルの反復によっては損なわれなかった。
単鎖CAD-IgG-CH3-Knob02モジュボディ
6.1 単鎖CAD-IgG-CH3-Knob02モジュボディの構築およびクローニング
下記の実施例では、モノマー型修飾ヒトIgG-CH3-Knob02検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH3-Knob02の構築およびクローニングについて説明する。
下記の実施例では、修飾ヒトIgG-CH3-Knob02検出ドメインを備えたβ2糖タンパク質特異的モジュボディCAD-IgG-CH3-Knob02の発現および精製について説明する。
CAD-IgG-CH3-Knob02モジュボディが、scFv-CADのβ2糖タンパク質結合活性を保持しているかを決定するために、精製CAD-IgG-CH3-Knob02調製物を、イムノアッセイによって試験した。そのために、CAD-IgG-CH3-Knob02モジュボディの希釈系列を、β2糖タンパク質(ORG 521、ORGENTEC Diagnostika GmbH、Mainz)で被覆した抗β2糖タンパク質アッセイのマイクロタイタープレートと、結合特異性の対照とするためのBSA被覆プレートとに適用し、20〜25℃で30分間インキュベートした。これらのマイクロタイタープレートを洗浄し、CAD-IgG-CH3-Knob02モジュボディの結合を、ペルオキシダーゼ標識RGS-6X-His抗体(Qiagen、Hilden)と、O.D. 450nmの計測によるテトラメチルベンジジン(TMB)呈色反応とを使用して決定した。図15は、濃度に応じた、選定した反応条件下で決定したOD 450nmの変動を示している。β2糖タンパク質への特異的結合は、CAD-IgG-CH3-Knob02モジュボディの濃度が19ng/mlでも、検出された。β2糖タンパク質またはBSA被覆のマイクロタイタープレートへの結合の場合での、CAD-IgG-CH3-Knob32希釈ステップの反応レベルの比較は、非特異的結合が、0.019〜10μg/mlのCAD-IgG-CH3-Knob02の濃度範囲では起きないことを示している。
[配列表]
Claims (18)
- (i)抗体の重鎖可変領域を含む第1のドメイン(VH)または抗原結合を仲介する少なくとも1つのその区画、
(ii)抗体の軽鎖可変領域を含む第2のドメイン(VL)または抗原結合を仲介する少なくとも1つのその区画、および
(iii)抗体の重鎖定常領域の区画を含む第3のドメイン(CHX)
を含み、
ドメイン(i)、(ii)および(iii)が、ペプチドリンカー(L)を介して共に連結している、
1価の融合ポリペプチド。 - 構造
VH-L-VL-L-CHX、または
VL-L-VH-L-CHX
を含む、請求項1に記載の融合ポリペプチド。 - ドメイン(i)、(ii)および(iii)がそれぞれ、80から130個までのアミノ酸残基の長さを有する、請求項1または請求項2のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
- ドメイン(iii)が、抗体の、好ましくは、クラスIgG、IgM、IgEおよびIgAのヒト抗体の区画CH1、CH2、CH3およびCH4、またはこれらの区画の組合せから選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 前記ペプチドリンカーがそれぞれ独立に、10から50個まで、好ましくは、25から45個まで、特に好ましくは、30から40個までのアミノ酸残基の長さを有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 前記ペプチドリンカーが、少なくとも90%のグリシンおよび/またはセリン残基からなる、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 少なくとも1つのさらなるドメイン、例えば、シグナルペプチドおよび/またはペプチドタグを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 配列番号1(VL)、配列番号2(VH)、配列番号4(VH、VL)、配列番号8(IgG-CH1)、配列番号10(IgG-CH2)、配列番号12(IgG-CH3)、配列番号14(IgA-CH2)、配列番号16(IgA-CH3)、配列番号18(IgM-CH2)、配列番号20(IgM-CH3)または配列番号22(IgM-CH4)に記載の対応するドメインとアミノ酸レベルで、少なくとも90%の同一性、好ましくは、少なくとも95%の同一性を有する1つまたは複数のドメインVH、VLおよび/またはCHXを有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- グリコシル化位置の少なくとも1個のアスパラギン残基が、異なるアミノ酸残基、好ましくは、セリン、アラニンまたはグリシンによって置換されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 少なくとも1個のシステイン残基が、異なるアミノ酸残基、好ましくは、セリン、アラニンまたはグリシンによって置換されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 任意選択により、発現調節配列と作動可能に連結している、請求項1から10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
- 選定された宿主細胞、例えば、大腸菌などの細菌中での発現に関してコドン最適化された、請求項11に記載の核酸。
- 請求項11または請求項12のいずれかに記載の核酸を含有する、宿主細胞。
- 請求項13に記載の宿主細胞を培養するステップ、および、前記細胞または培養上清から融合ポリペプチドを得るステップを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの調製方法。
- 診断試験または生化学的試験における試薬としての、請求項1から10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの使用。
- (i)対照もしくはキャリブレータ試薬としての、または
(ii)分析物を決定するための試験試薬としての
請求項15に記載の使用。 - 医学において、例えば、人間医学または獣医学において使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項11もしくは12に記載の核酸、または請求項13に記載の宿主細胞。
- 薬学的に適切な担体物質と共に、請求項1から10のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項11もしくは12に記載の核酸、または請求項13に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
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