JP2003501096A - ストレプトアビジン発現性遺伝子融合およびその使用方法 - Google Patents

ストレプトアビジン発現性遺伝子融合およびその使用方法

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ステファン チャールズ ゴショーン，
スコット ストール グレイブス，
ジョアンネ イレイン シュルツ，
ユカン リン，
ジェイムス アレン サンダーソン，
ジョン エム． レノ，
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ネオルクス コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ゲノムストレプトアビジン融合カセットの発現のためのベクターを提供する。種々の実施形態において、これらのベクターから産生される融合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、単鎖抗体およびゲノムストレプトアビジンを含む融合タンパク質は、単鎖抗体およびゲノムストレプトアビジンをコードするベクターであるように提供される。また提供されるのは、本発明の融合タンパク質の使用方法であり、特に、診断マーカーまたは細胞特異的標的化因子としてのｓｃＦｖＳＡ融合タンパク質の使用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的には、ストレプトアビジンを発現する遺伝子融合構築物に関
し、そしてより詳細には、ゲノムのストレプトアビジンを発現する遺伝子融合体
、ならびに、診断適用および治療適用においてこれらの構築物を使用する方法に
関する。
【０００２】 （発明の背景） ストレプトアビジン（「ＳＡ」）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉ
ｎｎｉによって産生される１５９アミノ酸のタンパク質である。そしてこれは、
水可溶性のビオチンに対して特異的に結合する（Ｃｈａｉｅｔら、Ａｒｃｈ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０６：１−５、１９６４）。ストレプトアビ
ジンは天然においてはほぼ６４，０００ダルトンの四量体タンパク質である。従
って、これは、それぞれがほぼ１６，０００ダルトンの分子量を有している４個
の同一のサブユニットから構成される（ＳａｎｏおよびＣａｎｔｏｒ、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１４２−４６、１９９０）。ス
トレプトアビジンは、アビジンといくつかの共通の特性（例えば、分子量、サブ
ユニットの組成、および高い親和性（ＫD＝１０-15）でビオチンに結合する能力
）を共有する（Ｇｒｅｅｎ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２９：８５−１３３
，１９７５）。さらに、ストレプトアビジンとアビジンは、それらのアミノ酸組
成において異なるが、両方ともが通常ではない高いスレオニンおよびトリプトフ
ァン含有量を有する。さらに、ストレプトアビジンは、おそらく、ストレプトア
ビジン上に炭水化物が存在しないことに起因して、生理学的なｐＨでビオチンに
対してはるかにより特異的である点で、アビジンとは異なる。アビジンおよびス
トレプトアビジンの種々の比較特性および単離が、Ｇｒｅｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８４：５１−６７、１９９０、およびＢａ
ｙｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８４：８０−８９
、１９９０に記載されている。
【０００３】 ストレプトアビジン遺伝子は、クローン化されており、そしてＥ．ｃｏｌｉ中
で発現されている（ＳａｎｏおよびＣａｎｔｏｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（１）：１４２−１４６、１９９０；Ａｇａｒａｎａ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（４）：１８７１−１８８２、
１９８６）。種々のタンパク質（単鎖抗体を含む）とのストレプトアビジンの融
合構築物、およびその短縮形態もまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で（ＳａｎｏおよびＣａ
ｎｔｏｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１２）：１３７８−１３８
１、１９９１；ＳａｎｏおよびＣａｎｔｏｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７６（２）：５７１−５７７、１９９１；Ｓａｎｏ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（５）：１５３４−
１５３８、１９９２；ＷａｌｓｈおよびＳｗａｉｓｇｏｏｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｂｉｏｅｎｇ．４４：１３４８−１３５４、１９９４；Ｌｅら、Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６（６）：４９６−５００、１９９４；Ｄｕ
ｂｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７８（２）：２０１−２０
９、１９９５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａｓ ６（３）：９３−１０１、１９９５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ
ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（２）：２０３−２１１、１９９６；Ｏｈｎｏ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５８（２）：２２７−２３３、１９９６
；ＯｈｎｏおよびＭｅｒｕｅｌｏ、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５（５）：
４０１−４０６、１９９６；Ｐｅａｒｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｉｎｔ．４２（６）：１１７９−１１８８、１９９７；Ｋｏｏら、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（７）：２４９７−２５０
２、１９９８）、および他の生物体中で（Ｋａｒｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２０（３）：４５２−４５９、１９９６）発現されている。Ｓａｎｏおよ
びＣａｎｔｏｒ（ＰＮＡＳ、前出）は、ストレプトアビジンの全長の形態の発現
が、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に対して致死的であり、そして短縮形態で発現され得
る（Ｔ７プロモーターシステムの下で）場合には、わずかな発現または変更され
た発現が観察され、そしてタンパク質は封入体の中のままであることを見出した
。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ中での可溶性のストレプトアビジンの発現の公開された
報告が存在する（Ｇａｌｌｉｚｉａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ
．１４（２）：１９２−１９６、１９９８；Ｖｅｉｋｏら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈ
ｉｍ．２５（３）：１８４−１８８、１９９９）。当業者は、しばしば、「コア
ストレプトアビジン（ｃｏｒｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）」（残基１４〜１
３６）または同様の短縮形態を、融合構築物の調製において使用する。コア残基
１４〜１３６の使用の根拠は、Ｓ．ａｖｉｄｉｎｉｉの培養培地から精製された
ストレプトアビジン調製物が、通常は、このコア構造またはその機能的な形態を
産生するために、Ｎ末端およびＣ末端の両方でタンパク質溶解を受けるという観
察である（Ａｒｇａｒａｎａら、前出）。
【０００４】 現在は、ストレプトアビジンを発現する遺伝子融合体の調製は、通常は、細菌
中でコアストレプトアビジンを含有している構築物を発現させることによって行
われている。ここでは、封入体が形成される。このような産生は、封入体からの
精製の厳しさおよび費用、きつい変性剤（例えば、塩酸グアニジン）を使用する
必要性、ならびに経済的な様式でのスケールアップの難しさを含む、いくつかの
欠点を有する。よりすくない程度に、可溶性の形態でのコアストレプトアビジン
を含有している構築物のペリプラズム発現が報告されている（Ｄｕｂｅｌら、前
出）。
【０００５】 従って、容易に、コスト的に効率良く、そしてスケールアップが可能な方法で
のストレプトアビジン融合タンパク質の産生が、当該分野で必要とされている。
従って、本発明は、いくつかの重要な利点を提供する。例えば、１つの実施形態
においては、ゲノムのストレプトアビジンを発現する遺伝子融合体が、細菌のペ
リプラズム空間に可溶性のタンパク質として発現され、そして自発的なフォール
ディングを受ける。従って、このような発現は、ペリプラズムが低ビオチンの環
境にあり、そしてきつい変性条件下でのタンパク質の精製およびフォールディン
グを必要としないという利点を付与する。きつい変性条件は、ゲノムのストレプ
トアビジン核酸分子に対して融合された異種核酸分子によってコードされるポリ
ペプチドに対して致死的であることが証明され得る。本発明は、この要件を満た
し、一方で他の関連する利点をさらに提供する。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、一般的には、ゲノムのストレプトアビジンを含有している発現カセ
ット、およびそれによってコードされる融合構築物を提供する。本発明の１つの
局面においては、本発明は、ストレプトアビジン融合タンパク質の発現のための
ベクター構築物を提供する。これは、少なくとも１２９アミノ酸のストレプトア
ビジンをコードする第１の核酸配列（図４）、またはその機能的な変異体、第１
の核酸配列に対して作動可能に連結されるプロモーター、およびプロモーターと
第１の核酸配列との間に挿入されるストレプトアビジンと融合されるポリペプチ
ドをコードする第２の核酸配列のためのクローニング部位またはその挿入のため
のクローニング部位を含む。あるいは、第２の核酸は、構築物のストレプトアビ
ジン部分をコードし得、そして第１の核酸がストレプトアビジンと融合されるポ
リペプチドをコードする。
【０００７】 特定の実施形態においては、プロモーターは、誘導性であるかまたは構成性で
ある。他の実施形態においては、第１の核酸配列が、図４のストレプトアビジン
の、少なくともアミノ酸１４から１５０、１４から１５１、１４から１５２、１
４から１５３、１４から１５４、１４から１５５、１４から１５６、１４から１
５７、または１４から１５８をコードする。なお他の実施形態においては、第１
の核酸配列は、図４の少なくともアミノ酸５から１５０〜１５８、または図４の
１から１５０〜１５８をコードする。
【０００８】 ゲノムのストレプトアビジン発現カセットを含有している宿主細胞もまた、そ
れによって発現される融合タンパク質がそうであるように提供される。特定の実
施形態においては、単鎖抗体を含有している融合タンパク質が提供される。なお
他の実施形態においては、単鎖抗体は、細胞表面抗原に対して指向される。なお
他の実施形態においては、単鎖抗体は、細胞表面抗原または、以下を含むがそれ
らに限定されない細胞に関連する間質もしくはマトリックス抗原に対して指向さ
れる：ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＥＧＰ
４０（またはＥＰＣＡＭもしくはＫＳＡ）、ＮＣＡＭ、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、
ムチン（ＭＵＣ−１からＭＵＣ−７）、β−ＨＣＧ、ＥＧＦレセプター、ＩＬ−
２レセプター、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＧＤ２、ＧＭ２、ネテイシ
ン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、シアル化されたネテイシン、ソマトスタチン、活性化
された腫瘍間質抗原、または新抗原形成性（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）抗原
。
【０００９】 本発明の他の局面においては、腫瘍細胞を標的化するための方法が提供される
。この方法は、融合タンパク質の投与を包含し、上記の融合タンパク質は、末端
対末端で連結された少なくとも第１および第２のポリペプチドを含有している。
ここで、上記の第１のポリペプチドは、ストレプトアビジン（図４）の少なくと
も１２９アミノ酸、またはその保存的に置換された変異体を含む。ここでは、上
記の第２のポリペプチドは、腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質に結合するポリペ
プチドであり、ここでは、融合タンパク質は、腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質
に結合する。そしてここでは、融合タンパク質のストレプトアビジン部分は、ビ
オチンに結合し得る。特定の実施形態においては、第２のポリペプチドは、抗体
またはその抗原結合フラグメントである。
【００１０】 本発明の他の局面においては、ゲノムのストレプトアビジン融合構築物を含有
している薬学的組成物が、提供される。
【００１１】 本発明のこれらおよび他の局面が、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
して明らかとなる。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明を示す前に、本明細書中以後に使用される特定の用語の定義を示すこと
は本発明の理解を助け得る。
【００１３】 「コアストレプトアビジン」は、本明細書中で使用される場合は、図４のスト
レプトアビジンの中心のアミノ酸残基１４〜１３６からなるストレプトアビジン
分子、ならびにまた米国特許第４，８３９，２９３号の図３のストレプトアビジ
ン分子、およびＡＴＣＣ番号第Ｘ０３５９１号に寄託されるストレプトアビジン
分子をいう。
【００１４】 「ゲノムのストレプトアビジン」は、本明細書中で使用される場合は、図４に
示される配列の少なくとも１２９残基を含有している配列をいう。従って、ゲノ
ムのストレプトアビジンは、コアストレプトアビジンのＮ末端、Ｃ末端、または
Ｎ末端およびＣ末端の両方の延長を有するストレプトアビジン分子をいう。Ｎ末
端およびＣ末端の伸張は、図４の１〜１３、１３７〜１５９、およびいくつかの
場合には−１〜−２４から選択される任意の数のアミノ酸を含み得る。
【００１５】 本発明のゲノムのストレプトアビジン分子はまた、天然のタンパク質配列の改
変体（対立遺伝子を含む）を含む。簡潔には、このような改変体は、天然の多型
によって生じ得るか、または組換えＤＮＡ方法論によって合成され得、そして１
つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失などによって野生型のタンパク質とは異なる
。改変体は、一般的には、少なくとも７５％のヌクレオチド同一性を天然の配列
に対して有し、好ましくは、少なくとも８０％〜８５％、そして最も好ましくは
、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性を有する。代表的には、操作される場
合は、アミノ酸置換は保存的（すなわち、極性、非極性、芳香族、荷電など）ア
ミノ酸のグループ内でのアミノ酸の置換である。天然の配列に対する相同性に関
して、改変体は、好ましくは、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、
そして特定の実施形態においては、９２％、９５％、または９７％より大きい同
一性を有するようである。このようなアミノ酸配列同一性は、デフォルトパラメ
ーターを使用して、標準的な方法論（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖで入手可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴ検索方法論の使用を含む）によ
って決定され得る。最も好ましい同一性の方法論は、米国特許第５，６９１，１
７９号およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５
：３３８９−３４０２、１９９７に記載されている方法論である。
【００１６】 当業者に明らかであるように、ヌクレオチド配列およびコードされるゲノムの
ストレプトアビジンまたはその改変体は、コドンの縮重、ヌクレオチドの多型、
またはアミノ酸の差異に起因して、既知の天然の配列とは異なり得る。特定の実
施形態においては、改変体は、通常のストリンジェンシーの条件で、天然のヌク
レオチド配列に対して優先的にハイブリダイズする。通常のストリンジェンシー
の条件は、天然の二本鎖のＴｍより約２５〜３０℃下である（例えば、５×ＳＳ
ＰＥ、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト溶液、５０％のホルムアミドで４２℃
、または同等の条件；一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５を参照のこと）。比較によ
って、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションが、Ｔｍより約４０℃下
の条件を利用し、そして高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションが、Ｔ
ｍより約１０℃下の条件を利用する。
【００１７】 「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合は、５個以上の一連のアミ
ノ酸をいう。
【００１８】 「単離された核酸分子」は、分離したフラグメントの形態での、または大きな
核酸構築物の成分としての、ポリヌクレオチド分子をいう。これは、その供給源
の細胞（それが通常は入っている染色体を含む）から少なくとも１回分離されて
おり、そして好ましくは、実質的に純粋な形態である。核酸分子は、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、ヌクレオチドアナログ、またはそれらの組合せを含む、広範な種々のヌク
レオチドから構成され得る。
【００１９】 用語「異種核酸配列」は、本明細書中で使用される場合は、プロモーターのよ
うな調節配列と作動可能に結合した少なくとも１つの構造遺伝子をいう。核酸配
列は、外来種に起源するか、または本来の形態から実質的に改変される場合には
、同じ種に起源する。例えば、用語「異種核酸配列」は、このような配列が、天
然のプロモーターまたは野生型のプロモーターとは異なるプロモーターと作動可
能に結合される場合には、同じ種に起源する核酸を含む。
【００２０】 「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、ポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体の両方；霊長類化（例えば、ヒト化）；マウス；マウス−ヒト；
マウス−霊長類；およびキメラを含み；そして、完全な分子、そのフラグメント
（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ）’2の
フラグメント）、あるいは完全な分子および／またはフラグメントの多量体また
は凝集体であり得；そして天然に存在し得るか、または例えば、免疫、合成、も
しくは遺伝子操作によって産生され得る；「抗体フラグメント」は、本明細書中
で使用される場合には、抗体に由来するかまたは関連するフラグメントをいい、
これは、抗原に結合し、そしていくつかの実施形態においては、例えば、ガラク
トース残基の取り込みによる、クリアランスおよび取り込みを促進する構造的な
特徴を示すように誘導体化され得る。これには、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ
）’2、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶL）、重鎖可変領域（ＶH）、およびそれら
の組合せが含まれる。
【００２１】 用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合は、タンパク質、ポリペ
プチド、およびペプチドを含み；そして完全な分子、そのフラグメント、または
完全な分子および／もしくはフラグメントの多量体もしくは凝集体であり得；そ
して天然に存在し得るか、または例えば、合成（キメラおよび／もしくは酵素的
を含む）または遺伝子操作によって産生され得る。
【００２２】 （Ａ．ストレプトアビジン遺伝子および遺伝子産物） （１．ストレプトアビジン核酸分子およびその改変体） 本発明は、種々の長さのストレプトアビジン核酸分子を含むストレプトアビジ
ン融合構築物を提供する。特定の実施形態においては、これは、当該分野で利用
可能であり、そして米国特許第４，８３９，２９３号；同第５，２７２，２５４
号、およびＡＴＣＣ登録番号第Ｘ０３５９１号に詳細に記載されている、全長の
ゲノムのストレプトアビジン核酸分子から構築される。
【００２３】 本明細書中で提供される種々のストレプトアビジン核酸分子は、天然の改変体
（例えば、多型、スプライシング改変体、変異体）から操作され得るか、合成さ
れ得るか、または構築され得る。改変体を作成するための多くの方法が、開発さ
れている（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅ
ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５を参照のこと）。簡潔に
は、ヌクレオチド置換を作成するための好ましい方法は、変異される塩基（単数
または複数）にまたがり、そして変異した塩基（単数または複数）を含むオリゴ
ヌクレオチドを利用する。このオリゴヌクレオチドは、相補的な一本鎖の核酸に
対してハイブリダイズさせられ、そして第２鎖の合成がこのオリゴヌクレオチド
からプライムされる。宿主細胞（代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉであるが、あるいは
、他の原核生物、酵母、または他の真核生物）への形質転換のための二本鎖の核
酸が調製される。ＤＮＡのスクリーニングおよび単離および配列決定のための標
準的な方法が、変異配列を同定するために使用された。
【００２４】 同様に、ストレプトアビジン核酸分子の欠失および／または挿入が、前記に議
論されるような、任意の種々の公知の方法によって構築され得る。例えば、核酸
分子は、制限酵素で消化され得、そして再度連結され得、それによって欠失させ
られ得るかまたはさらなる配列（例えば、リンカー）を有する配列を再度連結し
得る。その結果、挿入または大きな置換が作成される。当該分野で公知の方法（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出に記載されている
方法）を使用する改変体配列を作成する他の手段が、使用され得る。改変体配列
のバリエーションは、代表的には、制限酵素マッピング、配列分析、またはプロ
ーブハイブリダイゼーションによって達成される。特定の局面においては、その
コードされる生成物がビオチンに結合し得るストレプトアビジン核酸分子の改変
体が、本発明の状況において有用である。他の局面においては、改変体ストレプ
トアビジンのビオチンに結合する能力は、増大させられ得るか、減少させられ得
るか、または、天然のストレプトアビジンの能力と実質的に類似であり得る。な
お他の実施形態においては、改変体形態が天然のストレプトアビジンのものと同
様の典型的な四量体構造に自己を組立てする能力を残している限りは、ビオチン
に結合する能力は必要ではない。このような四量体構造は、抗体またはそのフラ
グメントをコードする配列に対して融合される場合は、四量体抗体の形成のよう
な種々の用途を有する。
【００２５】 （２．ゲノムのストレプトアビジンおよびそれを含有している発現カセット） 本発明のゲノムのストレプトアビジン融合構築発現カセットは、ストレプトア
ビジン遺伝子またはその改変体の全ての遺伝子配列を利用することによって作成
され得る。特定の実施形態においては、発現カセットは、図４の少なくとも１２
９個の連続しているアミノ酸またはその機能的な改変体をコードする核酸配列を
含む。種々の他の実施形態においては、核酸配列は、図４の少なくともアミノ酸
残基１４から１４０をコードする。さらなる実施形態においては、核酸配列は、
図４のストレプトアビジンの、少なくともアミノ酸１４〜１５０、１４〜１５１
、１４〜１５２、１４〜１５３、１４〜１５４、１４〜１５５、１４〜１５６、
１４〜１５７、１４〜１５８、または１４〜１５９をコードする。なお他の実施
形態においては、核酸配列は、図４の少なくともアミノ酸１０から１５０〜１５
８、または図４の少なくともアミノ酸５から１５０〜１５８、または図４の少な
くともアミノ酸１から１５０〜１５８をコードする。なお他の実施形態において
は、核酸配列は、図４の少なくともアミノ酸残基１〜１５９をコードする。さら
になお他の実施形態においては、発現カセットは、図４の−１から−２４の少な
くとも１０アミノ酸残基をコードする核酸配列を含む。
【００２６】 上記のように、本発明の核酸分子をコードするゲノムのストレプトアビジンは
、当該分野で公知の種々の方法によって利用可能なストレプトアビジン配列から
構築され得る。好ましい方法は、個々の領域を選択的に増幅するための増幅（例
えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））であり、そしてこれはｐＣＲ２．１（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなクローニングベクター中に配置される。さらに
、このようなＰＣＲ反応は、増幅のために使用されるプライマーがベクター中へ
の挿入を容易にするための特異的な制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように、
種々の方法で行われ得る。
【００２７】 さらに、ＰＣＲ以外の種々の他の方法論が、所望される構築物を得るために使
用され得る。例えば、当業者は、目的のヌクレオチド配列を増幅するために、配
列を切り出しそして挿入するためのヌクレオチド配列中に存在している既存の制
限エンドヌクレアーゼ部位を使用するか、または部位指向型変異誘発、続く切り
出しおよび挿入による、異なる制限エンドヌクレアーゼ部位の導入による、等温
方法を使用し得る。これらおよび他の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕ
ｓｕｂｅｌら、前出に記載されている。簡潔には、１つの方法論は、一本鎖のス
トレプトアビジンをコードするＤＮＡを作成し、続いて、所望される変更（例え
ば、小さい挿入、欠失、または変異であり、その結果、特有の制限部位がドメイ
ンの間に作成される）を除いて相補的であるプライマーとアニーリングさせるこ
とである。細菌細胞が形質転換され、そして所望される構築物を含むこれらの細
胞についてスクリーニングされる。この構築物は、次いで、所望の配列を開放す
るために消化され、これは次いで、精製され得、そして適切な方向で再度連結さ
れ得る。
【００２８】 当業者は、発現カセットを設計する場合には、ビオチンに結合し得、そして細
菌宿主のペリプラズム空間ヘと発現され得る形態を利用することと比較した際に
、ゲノムのストレプトアビジンの絶対的な長さのみが第２の考慮であることを認
識する。このような構築物は、当該分野で公知のアッセイおよび本明細書中に記
載されているアッセイによって、ペリプラズム空間においてビオチンに結合しそ
して可溶性を維持するそれらの能力について容易に試験され得る。従って、ビオ
チン結合能力およびビオチン解離速度の測定のような実験は、当該分野で周知で
あり、そしてこれに関して適用可能である。簡潔には、このような構築物は、種
々の手段によってビオチンに結合するそれらの能力について試験され得る。これ
らには、放射性標識したビオチンの半飽和（ｓｕｂｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）レベ
ルで融合タンパク質を標識すること、次いで、解離を開始するために飽和レベル
の１００倍のビオシチンを添加することを含む。遊離の放射性標識されたビオチ
ンが、一定の時間の間隔で測定される。
【００２９】 （Ｂ．ベクター、宿主細胞、およびタンパク質を発現しかつ産生する方法） 本発明の発現カセットは、プロモーターを必ず含む必要はない。しかし、ベク
ター系への挿入の際には、カセットに含まれる配列は、プロモーターまたは他の
調節配列に一旦連結されて発現され得なければならない。１つの実施形態におい
ては、発現カセット自体がプロモーターを含む。さらに、カセットは好ましくは
、ゲノムのストレプトアビジンをコードする配列に対して融合／連結される異種
核酸配列の挿入のためのクローニング部位を含む。１つの例示的なカセットが図
１に示される。しかし、クローニング部位は、ゲノムのストレプトアビジン配列
の５’である必要はないが、ストレプトアビジン配列の３’に配置され得ること
に、注目すべきである。従って、コードされる融合タンパク質は、ゲノムのスト
レプトアビジンポリペプチドを、それに対して融合されるコードされるポリペプ
チドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに、含み得る。さらに、種々の他の核酸配
列がゲノムのストレプトアビジンをコードする配列に連結され得るが、１つの実
施形態においては、この配列が抗体フラグメントをコードし、そして特定の実施
形態においては単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードすることに注目すべきである。
【００３０】 クローニング部位に加えて、カセットは、リンカー分子を含み得る。リンカー
分子は、代表的には、融合タンパク質の状況で利用され、そして当該分野で周知
である。図２に説明されるように、リンカーは代表的には、ゲノムのストレプト
アビジン配列をそれに対して連結される他の配列からゲノムのストレプトアビジ
ン配列を分離するため、およびｓｃＦｖのＶHおよびＶLを分離するために利用さ
れる。連結配列は、短いペプチドをコードし得るか、またはより長いポリペプチ
ドをコードし得る。好ましいリンカー配列は、少なくとも２個のアミノ酸をコー
ドするが、機能的な活性が保持される限りは、所望され得る限り多くのアミノ酸
をコードし得る。種々の実施形態においては、リンカー配列は、５、６、７、８
、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、２５、および３５個のアミノ酸をコードする。特定の
実施形態においては、コードされるリンカーは、標準的なリンカー（例えば、（
Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）xであり、ここでｘは、任意の整数であり得るが、好ましくは１
から１０である）であり得る。長さおよび組成は、最適な発現および生化学的な
特徴を与えるように、経験的に決定され得る。例えば、リンカーの組成は、分子
の等電点を上昇させるかまたは下げるように変更され得る。さらに、当業者は、
可変軽鎖および可変重鎖の間のリンカーの長さが、少なくとも２つのドメイン間
での結合を容易にするために十分な長さを必要とするが、ストレプトアビジンと
抗体フラグメントとの間のリンカーは、機能性が維持される限りは、０から１０
０以上のアミノ酸のまでで変化し得ることことを理解する。従って、軽鎖と重鎖
との間のリンカーは代表的には、５より多くのアミノ酸であり、そして好ましく
は、１０より多く、そしてより好ましくは、１５アミノ酸より多い長さである。
【００３１】 発現カセットは、種々の宿主生物体中で発現を指向するように、ベクター中で
使用され得る。特定の実施形態においては、ゲノムのストレプトアビジンを発現
する遺伝子融合体が細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または哺乳動物細胞（例えば
、ＣＨＯおよびＣＯＳ−７）中で産生される。それらについて多くの発現ベクタ
ーが開発されており、そして利用可能である。他の適切な宿主生物体として、他
の細菌種および真核生物（例えば、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、植物、および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９））が挙げ
られる。
【００３２】 １つの実施形態においては、ゲノムのストレプトアビジン融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列が、宿主細胞に対して適切な発現ベクター中に導入される。
上記に議論するように、配列は、複数のコドンを伴って、それぞれのアミノ酸に
ついて選択的なコドン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｃｏｄｏｎ）を含み得る。選
択的なコドンは、宿主種について「最適」であるように選択され得る。制限部位
は、代表的には、プライマー配列中に組込まれ、そしてベクターのクローニング
部位に関して選択される。必要である場合は、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コ
ドンが、プライマー配列中に操作され得る。
【００３３】 ベクターは、最少で、プロモーター配列を含む。本明細書中で使用される場合
は、「プロモーター」は、連結された遺伝子の転写を指向するエレメントを含む
ヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、最少で、ＲＮＡポリメラーゼ結合部
位を含む。より代表的には、真核生物において、プロモーター配列は、遺伝子発
現の速度およびタイミングを制御する他の転写因子の結合部位を含む。このよう
な部位として、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、ＰＯＵボックス、ＡＰ１
結合部位などが挙げられる、プロモーター領域はまた、エンハンサーエレメント
を含み得る。プロモーターが、遺伝子の転写を可能にするように遺伝子に対して
連結される場合は、それは「作動可能に連結される」。
【００３４】 本明細書中で使用される発現ベクターとして、宿主細胞（例えば、細菌）中の
タンパク質の発現のために設計されたプロモーターが挙げられる。適切なプロモ
ーターが広範に利用可能であり、そして当該分野で周知である。誘導性または構
成性のプロモーターが好ましい。細菌中での発現のためのこのようなプロモータ
ーとして、Ｔ７ファージおよび他のファージに由来するプロモーター（例えば、
Ｔ３、Ｔ５、およびＳＰ６）、ならびにｔｒｐ、ｌｐｐ、およびｌａｃオペロン
が挙げられる。ｔａｃおよびｔｒｃのようなハイブリッドプロモーター（米国特
許第４，５５１，４３３号を参照のこと）もまた、使用され得る。真核生物細胞
中での発現のためのプロモーターとして、バキュロウイルス／昆虫細胞の発現系
のＰ１０またはポリヘドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｏｎ）遺伝子プロモーター（
例えば、米国特許第５，２４３，０４１号、同第５，２４２，６８７号、同第５
，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号、および同第５，１６９，７８
４号を参照のこと）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＲＳＶ
ＬＴＲ、ＳＶ４０、メタロチオネインプロモーター（例えば、米国特許第４，８
７０，００９号を参照のこと）、エクジソン応答エレメント系、テトラサイクリ
ン可逆サイレンシング系（ｔｅｔ−オン、ｔｅｔ−オフ）などが挙げられる。
【００３５】 ゲノムのストレプトアビジン融合構築物の転写を制御するプロモーターは、そ
れ自体が、リプレッサーによって制御され得る。いくつかの系においては、プロ
モーターは、細胞の生理学的条件を変更することによって（例えば、リプレッサ
ーに競合的に結合する分子の添加によってか、または増殖培地の温度を変更する
ことによって）脱抑制され得る。好ましいリプレッサータンパク質として、ＩＰ
ＴＧ誘導に応答性であるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩリプレッサー、温度感受性のλ
ｃＩ８５７リプレッサーなどが挙げられる。
【００３６】 他の調節配列が含まれ得る。このような配列として、転写終結配列、分泌シグ
ナル配列（例えば、米国特許第５，２７２，２５４号の図２Ｂのヌクレオチド４
８０〜５５１）、リボソーム結合部位、複製起点、選択マーカーなどが挙げられ
る。調節配列は、転写、翻訳を可能にするように、または分泌を促進するように
、互いに作動可能に結合される。本発明の調節配列としてまた、米国特許第５，
２７２，２５４号に記載されているようなストレプトアビジン遺伝子の上流の領
域（例えば、米国特許第５，２７２，２５４号の図２Ａ〜２Ｂに示される核酸残
基１７４〜５５１）が挙げられる。従って、１００〜３００塩基対の上流の配列
が、分泌および／または発現を促進するために発現構築物中で利用され得る。こ
のような上流の非翻訳領域が、ヌクレオチド１７４〜４７９として米国特許第５
，２７２，２５４号の図２Ａおよび２Ｂに示されている。好ましい実施形態にお
いては、上記の配列の核酸残基４０８〜４７９が、発現構築物中で利用される。
【００３７】 他の任意の実施形態においては、ベクターはまた、転写終結配列を含む。「転
写終結領域」は、選択されたプロモーターを認識するポリメラーゼによって転写
を終結するシグナルおよび／またはポリアデニル化のためのシグナル配列のいず
れかを提供する配列を有する。
【００３８】 １つの局面においては、ベクターが、宿主細胞中で複製され得る。従って、宿
主細胞が細菌である場合は、ベクターは好ましくは、細菌の複製起点を含む。細
菌の複製起点として、ｆ１−ｏｒｉおよびｃｏｌ Ｅ１複製起点、特に、ｐＵＣ
プラスミドに由来するｏｒｉが挙げられる。酵母中では、ＡＲＳまたはＣＥＮ配
列が、複製を確実にするために使用され得る。哺乳動物細胞中で良好に使用され
る系は、ＳＶ４０ ｏｒｉである。
【００３９】 好ましくは、プラスミドはまた、宿主中で機能的である少なくとも１つの選択
マーカーを含む。選択マーカー遺伝子として、形質転換された細胞が同定されそ
して選択的に増殖することを可能にする、宿主に表現形を付与する任意の遺伝子
が挙げられる。細菌宿主に適切な選択マーカー遺伝子として、アンピシリン耐性
遺伝子（Ａｍｐr）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr）、およびカナマイシ
ン耐性遺伝子（Ｋａｎr）が挙げられる。アンピシリン耐性およびカナマイシン
耐性遺伝子は、本発明に好ましい。真核生物に適切なマーカーは通常は、宿主中
での相補性欠損を必要とする（例えば、ｔｋ−宿主中でのチミジンキナーゼ（ｔ
ｋ））。しかし、薬物マーカーもまた利用可能である（例えば、Ｇ４１８耐性お
よびハイグロマイシン耐性）。
【００４０】 ゲノムのストレプトアビジン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と
してまた、分泌シグナル（例えば、リーダー配列の一部、このリーダー配列は、
分泌シグナルの一部を含有している遺伝子の上流の領域である）が挙げられ得る
。それによって、得られるペプチドは、プロセシングされそして分泌された前駆
体タンパク質である。得られるプロセシングされたタンパク質は、ペリプラズム
空間または醗酵培地から回収され得る。使用に適切な分泌シグナルが広範に利用
可能であり、そして当該分野で周知である（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５、１９８５；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１，１９８３）。Ｅ．ｃｏｌｉ（また
は他の宿主）中で機能的である原核生物および真核生物の分泌シグナルが使用さ
れ得る。本発明に好ましい分泌シグナルとして、以下の細菌遺伝子によってコー
ドされる分泌シグナルが挙げられるが、これらに限定されない：ストレプトアビ
ジン、ｐｅｌＢ（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９、１９
８７）、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ、β−ラクタマー
ゼ、およびアルカリホスファターゼ。
【００４１】 発現を増大させる他の成分もまた、ストレプトアビジン融合体の発現を指向す
るベクター中、または別のベクター中のいずれかに含まれ得る。このような成分
として、例えば、細菌のシャペロンタンパク質（例えば、ＳｉｃＡ、ＧｒｏＥＬ
、ＧｒｏＥ、ＤｎａＫ、ＣｅｓＴ、ＳｅｃＢ、ＦｋｐＡ、ＳｋｐＡなど）が挙げ
られる。
【００４２】 当業者は、細菌細胞中での発現に適切でありそして用意に入手可能である広範
な種々のベクターが存在することを認識する。ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ
、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ｔａｃ、およびｔｒｃシリーズ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＴＴＱ１８（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、ｐＡＣＹ
Ｃ １７７、ｐＧＥＸシリーズなどのようなベクターが、ゲノムのストレプトア
ビジン融合タンパク質の発現に適切である。ゲノムのストレプトアビジン融合タ
ンパク質の発現のための宿主の選択は、一部ベクターによって示される。商業的
に入手可能なベクターは、適切な宿主と対である。
【００４３】 真核生物細胞中での発現に適切な広範な種々のベクターもまた利用可能である
。このようなベクターとして、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）；ｐＣＤＮＡシリーズ、ｐＲＥＰシリーズ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＤｉｓｐ
ｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が
挙げられる。特定の実施形態においては、ゲノムのストレプトアビジン融合タン
パク質をコードする核酸分子は、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＯＧシリーズのベクター（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のような遺伝子標的
化ベクター中にクローン化される。
【００４４】 上記のように、好ましい宿主細胞として、例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉのような細菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ
細胞、骨髄腫細胞のような哺乳動物細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａのような昆虫細胞；トウモロコシのような植物細胞、他の宿主細胞などが挙げ
られる。
【００４５】 昆虫細胞は、組換えタンパク質の高い発現が可能である。これに関して、バキ
ュロウイルスベクター（例えば、ｐＢｌｕｅＢａｃ（例えば、米国特許第５，２
７８，０５０号、同第５，２４４，８０５号、同第５，２４３，０４１号、同第
５，２４２，６８７号、同第５，２６６，３１７号、同第４，７４５，０５１号
、および同第５，１６９，７８４号を参照のこと；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能））が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞中での発現に使用さ
れ得る（米国特許第４，７４５，０５１号を参照のこと）。昆虫細胞または昆虫
中での発現は、好ましくは、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの転写
制御下で異種タンパク質を発現し得る組換えバキュロウイルスベクターを使用し
て達成される（例えば、米国特許第４，７４５，０５１号は、バキュロウイルス
／昆虫細胞発現系に関連している）。ポリヘドリンは、高度に発現されるタンパ
ク質であり、従ってそのプロモーターは、十分な異種タンパク質の産生を提供す
る。好ましいバキュロウイルスは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ（ＡＣＭＮＰＶ）である。適切なバキュロウイルスベクターは、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎから市販される。
【００４６】 また、本発明の融合構築物は、トランスジェニック動物中で発現され得る。例
えば、ゲノムのストレプトアビジンを含有している発現カセットは、乳汁特異的
プロモーターのような乳房組織中で特異的に活性化されるプロモーターに作動可
能に連結され得る。このような方法は、米国特許第４，８７３，３１６号および
米国特許第５，３０４，４９８号に記載されている。
【００４７】 ゲノムのストレプトアビジン遺伝子融合体はまた、植物（例えば、トランスジ
ェニックな植物体、植物組織、植物の種子、および植物細胞）中で発現され得る
。このような方法は、米国特許第５，２０２，４２２号に記載されている。
【００４８】 選択される特定のシステムにかかわらず、組換えタンパク質の発現に適切なシ
ステムの設計は周知であり、そして組換え融合タンパク質の発現に関する上記に
同定された参考文献によって立証されているように、当業者の範囲内である。
【００４９】 従って、本明細書中の本文および実施例によって証明されるように、ゲノムの
ストレプトアビジン発現遺伝子融合構築物の状況での融合タンパク質の発現は、
いくつかの重要な利点を提供する。例えば、１つの実施形態においては、ゲノム
のストレプトアビジン融合タンパク質は、細菌のペリプラズム空間中に可溶性の
タンパク質として発現され、そして自発的なフォールディングを受ける。従って
、このような発現は、ペリプラズムが低ビオチンであり、酸化の環境であり、そ
して可溶性の機能的な分子を生じるという利点を付与する。このことは、過酷な
変性条件下でタンパク質を下で精製しそしてフォールディングされなければなら
ないことを回避する。過酷な変性条件は、異種核酸分子によってコードされるポ
リペプチドに対して致命的であることが証明され得る。
【００５０】 ゲノムのストレプトアビジンを発現する遺伝子融合体は、当業者に公知の種々
の方法によって単離され得る。しかし、好ましくは、精製方法は、機能的なスト
レプトアビジン分子の存在を、精製を補助する際にその高い親和性結合を利用す
ることによって利用する。従って、好ましい精製方法は、固体の表面上に固定さ
れたイムノビオチンの使用による。
【００５１】 （Ｃ．融合成分としての抗体） 広範な種々のゲノムのストレプトアビジン発現遺伝子融合分子が、本明細書中
に記載されている方法によって設計され得るが、特に有用な融合タンパク質は、
抗体とゲノムのストレプトアビジンとの融合タンパク質、特に、抗体−ゲノムス
トレプトアビジン発現遺伝子融合体（Ａｂ−ＳＡ）である。好ましい実施形態に
おいては、発現構築物は、抗体のＦｖまたはｓｃＦｖ部分をコードする。さらに
好ましい実施形態においては、構築物は、分子の重鎖部分または軽鎖部分のいず
れかの末端を通じてストレプトアビジンが連結され得る、Ｆａｂフラグメントま
たはその機能的な誘導体をコードする。従って、目的のＦｖ領域をコードするＤ
ＮＡは、例えば、ハイブリドーマのｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応のよう
な、縮重オリゴヌクレオチドを使用する増幅技術、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）
（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０、１９８９、Ｌａ
ｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７、１９８８、ならびにＢ
ａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ、８９：１１７、１９９０を参照のこと）、転写
に基づく増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１１７３、１９８９を参照のこと）、ならびに自己維持配列複製（Ｇｕａ
ｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１８７
４、１９９０を参照のこと）、適切な配列のクローニングおよび制限、あるいは
Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９、１９７９のホ
スホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９
−１５１、１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．
Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２、１９８１のジエチルホスホルアミダイ
ト法のような方法による、直接的な化学合成；ならびに米国特許第４，４５８，
０６６号および米国特許第５，６０８，０３９号および同第５，８４０，３００
号、ならびにＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／４１６４１号の固体支持方法を含む、
任意の適切な方法によって調製され得る。目的の領域（例えば、Ｆａｂまたはｓ
ｃＦＶ）をコードするＤＮＡはまた、ファージディスプレイライブラリーによっ
て単離され得る。
【００５２】 当業者は、本明細書中に提供される開示を考慮すれば、任意の数の結合対のメ
ンバーが利用され得、そして従ってストレプトアビジン／ビオチンの結合に限定
されないことを容易に認識する。これに関して、抗体／エピトープ対または任意
のリガンド／抗リガンド対が利用され得る。当業者はまた、本開示が、４価の抗
体の調製のための一般的な方法を提供することを認識する。その同族の抗原につ
いての抗体のアビディティは一般的にはその結合価の関数であるので、４価の抗
体が２価の抗体より好ましい多くの適用が存在する。このような適用として、イ
ムノアッセイ、免疫治療、免疫親和性クロマトグラフィーなどが挙げられるが、
これらに限定されない。
【００５３】 化学合成もまた、一本鎖のオリゴヌクレオチドを産生するために利用され得る
。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって二本鎖のＤＮＡに転換
され得るか、または鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いる重
合によって二本鎖のＤＮＡに転換され得る。単鎖のＦｖ領域全体の化学合成が可
能であるが、後で互いに連結される多数のより短い配列（約１００〜１５０塩基
）を合成することが好ましい。
【００５４】 あるいは、部分配列がクローン化され得、そして適切な部分配列が適切な制限
酵素を使用して切断され得る。フラグメントは、次いで、所望のＤＮＡ配列を産
生するために連結され得る。
【００５５】 一旦、可変の軽鎖（ＶL）および重鎖（ＶH）のＤＮＡが得られると、直接また
はペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を通じてのいずれかで、当業者に周
知の技術を使用して配列が互いに連結され得る。好ましい実施形態においては、
重鎖および軽鎖の領域が、可撓性のポリペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ4
Ｓｅｒ）x、またはｐＫＯＤ配列、または以下に提供される他のもの）によって
連結される。これらは、軽鎖のＦｖドメインのカルボキシル末端で始まり、そし
て重鎖のＦｖドメインのアミノ末端で終わるか、またはその逆であり、Ｆｖドメ
インの順序は、軽鎖−重鎖または重鎖−軽鎖のいずれであってもよい。配列全体
は、単鎖抗原結合タンパク質の形態でＦｖドメインをコードする。
【００５６】 イムノグロブリンの組換え発現のための種々の方法が存在する。以下の参考文
献は、一般的に組換えイムノグロブリンおよび融合タンパク質の発現について適
切な方法および宿主系の代表である：Ｗｅｉｄｌｅら、Ｇｅｎｅ ５１：２１−
２９、１９８７；Ｄｏｒａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１２）：４２３２
−４２４１、１９８７；Ｄｅ Ｗａｅｌｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
７６：２８７−２９５、１９８８；Ｃｏｌｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
４９：１７３８−１７４５、１９８９；Ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
５（ａ）：３０１１−３０１６、１９９０；Ｂｕｌｅｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１９５：２３５−２４２ １９９１；Ｂｅｇｇｉｎｇｔｏｎら、Ｂ
ｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９、１９９２；Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．２８１：３１７−３２３、１９９２；Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｌ．Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４、１９９１；Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
２９０：７２３−７２９、１９９３；Ｃｈａｕｄａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３
９：３９４−３９７、１９８９；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２
−５２５、１９８６；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
４４：６５−９２、１９８８；Ｂｅｎｈａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２０５１−１２０５５、１９９４；Ｓｉｎｇｅｒら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２８４４−２８５７、１９９３；Ｃｏｏｔｏら
、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３（３）：２１５−２１９、１９９４；Ｑｕｅｅｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００
３３、１９８９；Ｃａｒｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２：６７６１−６７
６７、１９９２；Ｄｕｂｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７８
：２０１−２０９、１９９５；Ｂａｔｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５
：１５１９８−１５２０２、１９９０；Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８５４５−８５４９、１９８９；Ｃｈａｕｄｈ
ａｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１０６６−
１０７０、１９９０（これらのいくつかは、種々の単鎖抗体発現遺伝子融合体の
調製を記載している）。
【００５７】 従って、一旦、発現された場合に特異的結合活性を示すＦｖ領域をコードする
ＤＮＡ配列が同定されると、そのＦｖ領域を含有している融合タンパク質は、当
業者に公知の方法によって調製され得る。Ｆｖ領域は、本発明の発現カセット中
でゲノムのストレプトアビジンに対して直接融合され得るか、あるいは、ペプチ
ドもしくはポリペプチドリンカーを通じてゲノムのストレプトアビジンに対して
直接連結され得、それによって連結された生成物を形成する。リンカーは、Ｆｖ
と融合されたゲノムのストレプトアビジンとの間に空間を提供するように単純に
存在し得るか、または互いにそれらの最適な立体構造を達成することを可能にす
るようにこれらの領域の間の移動を容易にするように存在し得る。ゲノムのスト
レプトアビジン−抗体発現カセットは、代表的には、適切なリンカーによって融
合される重鎖および軽鎖の可変配列の両方、ならびにゲノムのストレプトアビジ
ンと軽鎖および重鎖とを融合するリンカーの発現を提供し、それによって単鎖抗
体：ゲノムのストレプトアビジン（ｓｃＦｖＳＡ）結合体をコードする、単一の
ベクターを含む。１つの実施形態においては、可変軽鎖および可変重鎖を連結す
るリンカーは、可撓性を可能にするために十分な長さであるかまたはそのように
側鎖が選択される。１つの実施形態においては、リンカーは、上記に記載されて
いる（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）xのような標準的なリンカーであり、一方、別の実施形態
においては、リンカーは、ｐＫＯＤリンカー（ＧｌｙＬｅｕＧｌｕＧｌｙＳｅｒ
ＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｙＬｅｕＳｅｒＰｒｏＡｓｐＡｌａＧｌｙＳｅｒＧｌｙ
Ｓｅｒ）（配列番号９）である。種々のリンカーが使用され得るが、いくつかの
実施形態においては、抗体軽鎖と抗体重鎖とを分離するリンカーが、可撓性を可
能にし、そしてゲノムのストレプトアビジン配列に対してｓｃＦｖを付着するリ
ンカーが極めて剛直であり得るかまたは極めて可撓性であり得ることがが好適で
あり得ることが、理解されるはずである。さらに、リンカーに加えて、さらなる
アミノ酸は、リンカーであることは必ずしも意図されず、このようなこれらのア
ミノ酸が、利用される構築方法に依存して、本明細書中の構築物中に含まれ手も
含まれなくともよいので、リンカーの挿入および関連する組換えＤＮＡ操作を容
易にする制限部位の付加によってコードされ得る。
【００５８】 例示的なリンカーが、当業者に公知である。例えば、ポリペプチドリンカーに
よって互いに結び付けられた抗体の重鎖および軽鎖のＦｖ部分が、それらの全長
の２つの鎖の対応部分と同じ結合特性を有し得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２４２：４２３−２６、１９８８およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−８３、１９８８）。いくつかの
例においては、毒素に対して連結された単鎖抗体から構成される融合タンパク質
は、単鎖抗体の結合能力、ならびに毒素の活性を保持し得ることもまた示されて
いる（Ｃｈａｕｄａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：３９４−９７、１９８９；
Ｂａｔｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５；１５１９８−１５２０２、
１９９０；Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：８５４５−８５４９、１９８９；Ｃｈａｕｄａｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６−１０７０、１９９０）。ストレ
プトアビジンを含有している例示的な融合構築物が、Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ａｐｐ
ｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．４３（１１）：１３９９−１４０２、１９９２；
ＳａｎｏおよびＣａｎｔｏｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７８−
１３８１、１９９１；Ｓｐｏｏｎｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２
５（６）：６０６−６１４、１９９４；Ｄｕｂｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ １７８：２０１−２０９、１９９５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（２）：２０３―２１１、１９９６に
よって記載されている。リンカーを含むＤＮＡ配列はまた、クローニングを容易
にするプライマー部位もしくは制限部位のような配列を提供し得るか、またはｓ
ｃＦｖをコードする配列とゲノムのストレプトアビジンをコードする配列との間
にリーディングフレームを保存し得る。このようなリンカーの設計は、当業者に
周知である。
【００５９】 さらに、当業者は、ゲノムのストレプトアビジン−抗体発現遺伝子融合体の、
適切なリガンドに結合する能力を試験することが慣用的であることを見出す。意
図される実施形態においては、このリガンド抗原は、細胞表面抗原、細胞に会合
した間質もしくはマトリックス抗原、または細胞によって分泌される抗原（ＣＤ
１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５
６、ＣＤ５７、ＥＧＰ４０（またはＥＰＣＡＭもしくはＫＳＡ）、ＮＣＡＭ、Ｃ
ＥＡ、ＴＡＧ−７２、ムチン（ＭＵＣ−１からＭＵＣ−７）、β−ＨＣＧ、ＥＧ
Ｆレセプターおよびそれらの変異体、ＩＬ−２レセプター、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、
Ｌｅｗｉｓ ｙ、ＧＤ２、ＧＭ２、Ｌｅｗｉｓ ｘ、葉酸レセプター、線維芽細
胞活性化タンパク質、テネイシン、シアル化されたテネイシン、ソマトスタチン
、活性化された腫瘍間質抗原、また新脈管形成性（ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ
）抗原を含むがこれらに限定されない）であり得る。さらに、抗体の、このよう
な抗原のエピトープに結合する能力を評価するための方法が公知である。
【００６０】 （Ｄ．ゲノムのストレプトアビジンを発現する融合構築物の適用可能な用途） 任意の異種核酸配列がゲノムのストレプトアビジンをコードするように連結さ
れ得、そして本明細書中に記載されるように発現され得るが、特に、有用な発現
される融合構築物は、ゲノムのストレプトアビジンに連結されたｓｃＦｖを含有
しているものであり、ｓｃＦｖＳＡと先に呼ばれた。従って、本発明の１つの局
面においては、抗体のｓｃＦｖフラグメントは、医学的な診断および治療目的の
ための方法においてツールとして有用である。哺乳動物宿主中の標的部位の存在
もしくは非存在を検出するため、またはそれを処置するための、診断または治療
方法が、記載されている。治療目的のためのインビボでの投与のために抗体また
は抗体結合体を使用するための基準を決定する場合には、一般的には、到達可能
な標的比が高いこと、および腫瘍に送達される治療薬の絶対的な用量が有意な腫
瘍応答を誘発するために十分であることが所望される。本発明に記載されている
このような抗体を利用するための方法は、例えば、米国特許第４，８７７，８６
８号、同第５，１７５，３４３号、同第５，２１３，７８７号、５，１２０，５
２６号、および同第５，２００，１６９号に見出され得る。治療または診断目的
のためのインビボでの投与の際には、治療薬に対する非標的組織の暴露を制限す
ることもまた所望される。
【００６１】 診断または治療薬に対する非標的組織の暴露を減少させるための１つの方法は
、標的部位に対して標的化部分（例えば、ｓｃＦｖＳＡ）を「プレターゲティン
グさせること」、次いで続いて、標的部位で「プレターゲティングされた」標的
部分に結合し得る、迅速にクリアする診断薬もしくは治療薬結合体を投与するこ
とを含む。この方法においては、一般的に記載されるように、最適な中間工程は
、結合していない標的化部分結合体の、活性な試薬結合体の投与の前の循環から
の効率的な除去を補助するクリア試薬の投与を含み得る。種々のクリア試薬（ｃ
ｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）およびキレート（例えば、ＤＯＴＡ）の記載を含
む、プレターゲティング技術の実施形態の記載は、米国特許第４，８６３，７１
３号、同第５，５７８，２８７号、同第５，６０８，０６０号、同第５，６１６
，６９０号、同第５，６３０，９９６号、同第５，６２４，８９６号；ならびに
ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ９３／２５２４０号、同第ＷＯ９５／１５９７８号、
同第ＷＯ９７／４６０９８号、同第ＷＯ９７／４６０９９号（これらは本明細書
中でそれらの全体において援用されている）に見出され得る。
【００６２】 プレターゲティングアプローチにおいては、活性な試薬の薬物動態学は、標的
化部分のものとは分離される。リガンド／抗−リガンド対のメンバーに結合させ
られた標的化部分は、標的部位への癒着（ａｃｃｒｅｔｅ）を可能にされる。従
って、本発明の１つの実施形態においては、ｓｃＦｖＳＡは、標的化部分（ｓｃ
Ｆｖ）とリガンド（ストレプトアビジン）との結合体（融合体）である。癒着が
生じ、そして標的に関連しない結合体の実質的な画分が、内在性のクリアランス
によって、またはリガンドもしくは抗リガンドを含有しているクリア試薬の投与
によるかのいずれかによって、レシピエントの循環からクリアされた後、活性な
試薬が、標的化結合体のものと相補的であるリガンド／抗リガンド対のメンバー
に対する結合体として、投与される（例えば、ビオチンは、例示的な実施形態に
おける相補的なメンバーである）。好ましくは、試薬−リガンドまたは試薬−抗
リガンドは、短い血清半減期を有し、そして腎臓の経路を通じて排泄される。こ
の様式においては、治療薬は、その治療または診断能力の発揮が所望される標的
部位に対して癒着するか、またはそれがレシピエントから迅速に除去されるかの
いずれかである。活性な試薬のこの分布は、所望されない毒性からのレシピエン
トの正常な組織の保護を容易にする。腎臓の排泄を増強するために、腎臓の排泄
を促進する生体分布を指向する分子に対する結合体が使用され得る。本質的には
、このようなプレターゲティング方法は、従来のガンの診断または治療と比較し
て、標的細胞の部位に対する標的化の比を改善するか、または標的細胞部位に対
する絶対的なな用量を増大させることによって、特徴付けられる。
【００６３】 プレターゲティング方法論の１つの実施形態においては、標的化部分は、目的
の標的細胞に関連する特定の抗原について特異的な本発明の抗体融合体を含む。
関連する局面においては、抗原マーカーは、以下を含むがそれらに限定されない
、ガンに関連し得る：リンパ腫（例えば、ＣＤ２０）；白血病（例えば、ＣＤ４
５）；前立腺（例えば、ＴＡＧ−７２）；卵巣（例えば、ＴＡＧ−７２）；乳房
（例えば、ＭＵＣ−１）；結腸（例えば、ＣＥＡ）；および膵臓（例えば、ＴＡ
Ｇ−７２）。例えば、ＣＤ２０抗原は、リンパ腫の処置のために標的化され得る
。ここでは、リガンド／抗リガンド結合対は、ビオチン／アビジン（例えば、ス
トレプトアビジン遺伝子融合体（ｓｃＦｖＳＡ））であり得、そして活性な試薬
は、プレターゲティング方法における放射性核種である。さらに、例えば以下の
ような、種々の抗原が標的化され得る：例えば、ＣＤ４５抗原に対する抗体によ
って媒介される標的化を使用することによる、広範な血液学の悪性腫瘍の任意の
１つを有している患者を処置するための、プレターゲティングされた放射性免疫
治療（ＰＲＩＴ）のためＣＤ４５抗原標的化。ＣＤ４５は、最も広範に発現され
る公知の血液学的な抗原であり、本質的に全ての白血球細胞およびそれらの前駆
体（好中球、単球、およびマクロファージ、全てのリンパ球、骨髄前駆体および
リンパ前駆体、ならびに約９０％の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を含む）に
おいて見出される。従って、診断または治療目的のための標的化に利用可能な抗
原が多数である場合には、本発明は、これらの抗原の任意のものを標的化するこ
とを促進するように使用され得る。
【００６４】 プレターゲティング方法におけるさらなる工程（上記で同定した工程を含む）
は、結合していない標的化部分（すなわち、リガンドまたは抗リガンドには結合
していない）の最初の投与、あるいは、この最初の工程における結合させられた
形態と同時にこの結合していない標的化部分を投与すること、従って、最初に接
触されるこれらの標的をブロックすることを含む。このようなブロックは、例え
ば、非ホジソンリンパ腫の処置において特に有用であり得る。ここでは、標的化
された組織の第１のセットは脾臓であるが、ほとんどの腫瘍は、深いリンパ節に
見出される。このような予めブロックすることは、活性な試薬での後の処置から
の脾臓細胞の実質的な保護を可能にする。結合していない標的化試薬は、必ずし
も同じエピトープに結合する必要はないが、有効であるためには、標的化部分の
結合体による結合が除外されるはずである。
【００６５】 当業者は、治療効果または診断の有用性を増強するために、同じ細胞型に結合
する異なる抗体を含有している、複数の標的化部分の結合体を使用し得る。Ａｂ
ｒａｍｓに対して発行された米国特許第４，８６７，９６２号は、標的部位に対
して活性な試薬を送達するためのこのような改善された方法を記載している。こ
の方法は、活性な試薬−標的化部分結合体を使用する。簡潔には、Ａｂｒａｍｓ
の方法は、２つ以上の活性な試薬−標的化部分結合体のレシピエントに対する投
与を意図する。ここでは、それぞれの結合体は、標的化部分として異なる抗体種
を含む。利用される抗体種のそれぞれは、異なる標的部位のエピトープ（同じで
あるかまたは異なる標的部位抗原に関連する）と反応し、一方、非標的組織との
抗体種の交差反応性のパターンは重複していない。この様式においては、異なる
抗体が、所望される標的部位で付加的に蓄積するが、任意の型の非標的組織での
全ての種の蓄積は、より少ない。従って、投与される試薬のより高い割合が、非
標的組織よりも標的部位で、インビボで局在化する。本発明は、これと同様のア
プローチを、ならびにプレターゲティング形式で、含み得る。１つの実施形態に
おいては、例えば、それぞれが本発明に従って調製された、異なるエピトープに
対して指向され、そして重複していない交差反応性を有する、抗体との２つ以上
の種の標的化結合体（融合体）が、診断またはと治療の有用性を改善するように
、プレターゲティング方法に従って投与される。さらなる実施形態は、ストレプ
トアビジンの単量体が天然においては四量体を形成するように会合する特性を利
用する。従って、ストレプトアビジンの単量体の形態に対してそれぞれが結合さ
せられた（融合体の）２つ以上の抗体が、選択的に混合され、そして四量体のス
トレプトアビジンの形成の際に、標的部位の複数のエピトープについての特異性
を伴って単一の種を生じる。
【００６６】 記載されている方法が、改変され得、そして所望される効果をなお達成し得る
ことが、理解されるはずである。例えば、それらのそれぞれの交差反応性に関し
て、同じ抗原または細胞型について特異的な２つの抗体が、使用され得る。これ
らの方法に不可欠である全ては、標的化部分−リガンド／抗リガンド結合体が優
先的に標的細胞に結合すること、および活性な試薬−結合体が実質的に予め標的
された細胞に局在化し、そしてそうでなければ循環から実質的にクリアされるこ
とである。
【００６７】 あるいは、抗体に基づくまたは抗体以外に基づく標的化部分は、調節されてい
ない抗原を保有している標的部位に対してリガンド／抗リガンドを送達するため
に使用され得る。好ましくは、調節されていない抗原のような天然の結合剤が、
この目的のために使用される。
【００６８】 本明細書中に記載されているプレターゲティング方法は、必要に応じて、クリ
ア試薬の投与を含む。クリア試薬の投与量は、循環からの予め投与された標的化
部分−リガンド／抗リガンド結合体の実質的なクリアに十分である量である。一
般的には、クリア試薬を投与するタイミングの決定は、標的の取り込みおよび標
的化部分結合体の内因性のクリアランスに依存する。特に好ましいクリア試薬は
、ガラクトシル化されたタンパク質（例えば、ガラクトシル化されたビオチン化
ヒト血清アルブミン、およびＮ−アセチルガラクトサミンおよびビオチンを含有
している低分子クリア試薬）のような、Ａｓｈｗｅｌｌレセプターによって媒介
されるクリアランスを提供するものである。
【００６９】 本明細書中で有用な活性な試薬（診断または治療）の型として、放射性核種、
毒素、抗腫瘍薬、薬物、遺伝子、およびサイトカインが挙げられる。例えば、上
記のように、ビオチンに対するこのような試薬の結合体は、プレターゲティング
アプローチにおいて有用であり得る。これに関して、治療用抗体（例えば、アポ
トーシスを誘導するかまたは血管形成を阻害する抗体）が、プレターゲティング
するような治療様式において使用され得る。診断薬の融合に関して、治療薬の融
合とは対照的に、増強された標的細胞のインターナリゼーションは、当業者が診
断薬−標的化部分結合体を投与する場合には、不利である。診断結合体のインタ
ーナリゼーションは、細胞の代謝および結合体の崩壊を生じる。崩壊の際には、
診断薬の小さい付加物または診断薬自体が、細胞から放出され得、従って、標的
特異的様式で結合体を検出する能力を排除し得る。
【００７０】 本明細書中で有用な診断薬または治療薬として、放射性核種、薬物、抗腫瘍薬
、毒素、遺伝子、およびサイトカインが挙げられる。本発明において有用な放射
性核種として、γ放射体、陽電子放射体、Ａｕｇｅｒ電子放射体、Ｘ線放射体、
および蛍光放射体が挙げられ、治療的な使用にはβ−またはα−放射体が好まし
い。放射性核種は当該分野で周知であり、そして123Ｉ、125Ｉ、130Ｉ、131Ｉ、 133 Ｉ、135Ｉ、47Ｓｃ、72Ａｓ、72Ｓｅ、90Ｙ、88Ｙ、97Ｒｕ、100Ｐｄ、101m
Ｒｈ、119Ｓｂ、128Ｂａ、197Ｈｇ、211Ａｔ、212Ｂｉ、153Ｓｍ、169Ｅｕ、212 Ｐｂ、109Ｐｄ、111Ｉｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、 77 Ｂｒ、99mＴｃ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、166Ｈｏ、および18Ｆが挙げられる。好ま
しい治療用の放射性核種として、188Ｒｅ、186Ｒｅ、203Ｐｂ、212Ｂｉ、213Ｂ
ｉ、109Ｐｂ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、77Ｂｒ、211Ａｔ、97Ｒｕ
、105Ｒｈ、198Ａｕ、および199Ａｇ、166Ｈｏ、または177Ｌｕが挙げられる。
【００７１】 当業者が、容易に適用可能であり得る場合には、上記のストレプトアビジン遺
伝子融合体が、「プレターゲティングすること」が放射線感作試薬の使用と組み
合わせられる場合のような、組合せ治療において利用され得る。このような放射
線感作試薬として、ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、５−フルオロウ
ラシル、パクリタキセルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】 本発明において有用な強力な毒素のいつくかは、Ａ鎖およびＢ鎖から構成され
る。Ａ鎖は細胞毒性部分であり、そしてＢ鎖はインタクトな毒素分子のレセプタ
ー結合部分（ホロ毒素）である。毒素Ｂ鎖が非標的細胞の結合を媒介し得るので
、これは、しばしば、標的部分（例えば、分子）に対して毒素Ａ鎖だけが結合す
るために有利である。しかし、毒素Ｂ鎖の排除は、非特異的細胞毒性を減少させ
るが、これはまた、一般的には、対応するホロ毒素の結合体と比較した場合には
、結合した毒素Ａ鎖の能力の低下を導く。
【００７３】 これに関して好ましい毒素として、ホロ毒素（例えば、アブリン、リシン、モ
デシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、百日咳毒素、シガ
毒素、およびｂｒｙｏｔｏｔｏｘｉｎ；ならびにＡ鎖または「Ａ鎖様」分子（例
えば、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒
素Ａの酵素部分、ジフテリア毒素Ａ鎖、百日咳毒素の酵素部分、シガ毒素の酵素
部分、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質
、サポリン、トリチン、オオムギ毒素、およびヘビ毒液ペプチド）が挙げられる
。トランス配置能力および細胞結合能力を欠失している天然に存在しているタン
パク質合成のインヒビターである、リボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）もま
た、本明細書中での使用に適切である。高度に毒性である毒素（例えば、パリト
キシン（ｐａｌｙｔｏｘｉｎ）など）もまた、本発明の実施における使用のため
に意図される。しかし、治療用薬物は、それ自体が、複合体のインターナリゼー
ションを促進し得る。
【００７４】 標的化させられた結合体として投与される治療薬もまた、本明細書中に含まれ
る。再び、目的は、最も高い可能な濃度の薬物（標的組織の暴露を最大にするた
め）の投与であるが、これはなお、受容可能ではない正常な器官の毒性（非標的
組織の暴露に起因する）の限界未満である。しかし、放射性同位元素とは異なり
、治療薬は、細胞毒性効果を発揮するために標的細胞中に取り込まれる必要があ
る。標的化部分−治療薬結合体の場合においては、標的化部分−薬物結合体の増
強された標的細胞でのインターナリゼーションのために手段と、標的化部分の相
対的な標的特異性を組合せることが有利である。
【００７５】 本明細書中での使用に適切な治療薬として、従来の化学療法薬（例えば、ビン
ブラスチンブ、ドキソルビシン、レオマイシン、メトトレキセート、５−フルオ
ロウラシル、６−チオグアニン、シタラビン、シクロホスファミド、およびシス
−プラチン、ならびに以下に記載されているものを含む他の従来の化学療法薬：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、
第２版、Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ
ａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８５、第１４章、ならびにアナログが親分
子のものよりも大きな能力を有する場合には、そのような薬物のアナログが挙げ
られる。本発明の範囲内の別の薬物は、トリコテセンである。本発明の実施にお
いて診断薬または治療薬として本明細書中での使用に適切な他の好ましい薬物と
して、１９８７年１１月に改正された、ＮＣＩ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａ
ｌ Ｄｒｕｇｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄａｔａ １９８７、ＮＩＨ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ 第８８−２１４１号に記載されているものを含む、
実験用の薬物が挙げられる。
【００７６】 他の抗腫瘍薬（例えば、増殖しつつある細胞に対して活性である試薬）が、本
発明に従って投与される。例示的な抗腫瘍薬として、プロアポトーシス性抗体、
抗血管形成性抗体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、腫瘍開始因子など）、レ
クチン炎症応答プロモーター（セレクチン（例えば、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレ
クチン、Ｐ−セレクチンなど））、ならびに同様の分子が挙げられる。
【００７７】 当業者は、本出願および本明細書中で参照される出願における教示に基づいて
、有用な診断または治療投与量および処置プロトコールを容易に決定し得る。こ
れは、例えば、特定の選択される治療薬もしくは診断薬、送達経路、標的部位（
単数または複数）の型、目的の標的部位についての標的化部分の親和性、正常な
組織との標的化部分の任意の交差反応性、患者の状態、のようなの因子に依存し
、とりわけ、処置が単独で行われるかまたは他の処置（中でも、他の因子）と組
み合わせられるかどうかに依存する。治療有効投与量は、患者の生存時間を延長
することによって患者を処置するものである。好ましくは、治療はさらに、腫瘍
の増殖を停止させることによって患者を処置し、そして最も好ましくは、治療は
さらに、腫瘍を根絶させる。
【００７８】 一貫して議論される特許および特許出願を含む全ての参考文献が、それらの全
体において本明細書中で参考として援用される。
【００７９】 本発明はさらに、以下の実施例の説明を通じて記載される。これらの実施例は
、例示のために提供され、そして限定のためではない。
【００８０】 （実施例） （実施例Ｉ） （ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０単鎖抗体−ゲノムストレプトアビジン融合物の構築） 一般的に、単鎖Ｆｖ／ストレプトアビジン（ｓｃＦｖＳＡ）融合タンパク質は
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉのゲノムのストレプトアビジンに
対する可変領域（ｓｃＦｖ）の単鎖抗体の遺伝的融合から発現される。ｓｃＦｖ
遺伝子は、ＤＮＡリンカー配列（例えば、図２）によって分離されている軽鎖（
ＶL）および重鎖（ＶH）の可変領域から成る。ストレプトアビジンをコードして
いる配列は、ｓｃＦＶ遺伝子の３’末端に連結されており、そして２つの遺伝子
が、２番目のＤＮＡリンカー配列により、インフレームで分離されている。スト
レプトアビジン遺伝子由来のシグナル配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム腔へ
と直接発現させるためにｓｃＦＶ ＳＡ遺伝子の５’末端に融合されている。ｓ
ｃＦＶＳＡ遺伝子は、ｌａｃプロモーターの支配下にあり、発現した融合タンパ
ク質は、Ｅ．ｃｏｌｉから抽出および精製され、そして約１７２，０００の分子
量の可溶性テトラマーを形成する。
【００８１】 ｔｒｃプロモーターを取り除くために、プラスミドｐＫＫ２３３−２（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、
ＮＪ）をＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化した。ｌａｃプロモーターを、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｐＢＲ３２２から増幅し、ｐＫＫ２３３−２
のＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ部位にクローニングした。この過程において、ＥｃｏＲ
Ｉ部位を、ＮｃｏＩ部位のすぐ５’側に導入した。プラスミドはＮｃｏＩおよび
ＰｓｔＩにより消化され、そしてｐｅｌＢリーダー配列をコードするオリゴヌク
レオチドと連結された。プラスミド上の、用いられたＮｃｏＩ部位は、再生され
なかった。そして、新たなＮｃｏＩ部位が、ｐｅｌＢをコードしている配列の３
’側に導入された。この結果、得られたプラスミドは、ｐＫＫ−ｌａｃ／ｐｅｌ
Ｂといわれた（図５）。ｐＫＫ−ｌａｃ／ｐｅｌＢおよびｐＵＣ１８を、Ｐｒｖ
ｕおよびＰｖｕＩＩを用いて消化した。ｌａｃプロモーターおよびマルチクロー
ニング部位を含むｐＫＫ−ｌａｃ／ｐｅｌＢの２．９ｋｂのフラグメントが、プ
ラスミドｐＥＸ−１を作るための複製起点を含むｐＵＶ１８の１．４ｋｂのフラ
グメントへとライゲーションされた（図６）。
【００８２】 ストレプトアビジンおよびｈｕＮＲ−ＬＵ１０ ｓｃＦＶ遺伝子（４０ｋＤの
上皮糖タンパク質である抗原ＥＧＰ４０あるいはＥＰＣＡＭに結合するモノクロ
ーナル抗体）を、ｈｕＮＰ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ遺伝子の構築に先立って
、別々のプラスミドにクローニングした。ストレプトアビジン遺伝子、シグナル
配列、および、およそ３００ｂｐの上流配列を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｖｉｄｉｎｉｉ（ＡＴＣＣ ２７４１９）のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅
し、ｐＥＸ３１８を形成するために、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
としてｐＥＸ−１へとクローニングした（図７）。ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃ
ＦＶは、ヒト化抗体プラスミドｐＮＲＸ４５１に由来する（Ｇｒａｖｅｓら、Ｃ
ｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５：８９９−９０８、１９９９）。重鎖およ
び軽鎖の可変領域は、別々にｐＮＲＸ４５１からＰＣＲ増幅し、次いで、配列決
定ＰＣＲに組み合わされた。この過程で用いられたオリゴヌクレオチドは、リー
ディングＶLおよびトレイリングＶHの間に、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーを導入
するように設計された。生じるＰＣＲ産物を、プラスミドｐＥＸ−ｓｃＦｖ３．
２．１を作るために、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＥＸ−１
へとクローニングした（図７）。ｓｃＦＶおよびストレプトアビジン遺伝子を、
ｐＥＸ−ｓｃＦＶ３．２．１およびｐＥＸ３１８からそれぞれ増幅し、そして図
８に示されているように融合物に組合わせた。これらの反応で用いられたオリゴ
ヌクレオチドは、リーディングｓｃＦｖの３’末端とトレイリングストレプトア
ビジンの５’末端との間に重複を形成し、５つのアミノ酸リンカー（ＧＳＧＳＡ
）をコードしていた。そのフラグメントを、外側のプライマー用いて、ＰＣＲに
より結合した。生じた１．２５ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＥＴ３ａ（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位へとクローニングし、ｐＥＴ３
ａ−４１Ｂを産生した。このプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、そしてＶH−ＳＡコーディング領域を含む１．３ｋｂのフラグメントおよ
び転写ターミネーターを、ＶLコード領域、ｌａｃプロモーター、およびアンピ
シリン耐性遺伝子（ｐＹＬ２５６）を含むｐＥＸ−３．２．１の４．６ｋｂのＸ
ｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結した。ストレプトアビジン調節領域
およびシグナル配列を、ｐＥＸ３１８からＰＣＲ増幅し、そしてｐＥＸ９４Ｂを
形成するためにｐＹＬ２５６のＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ部位にクローニングした（
図８）。
【００８３】 Ｔｎ５カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を、以下のようにｈｕＮＲ−ＬＵ−
１０ ｓｃＦｖＳＡ発現プラスミドｐＥＸ９４Ｂに挿入した（図９）：プラスミ
ドｐＮＥＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ＢａｍＨＩで消化し
、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使
用してヌクレオチドよる末端の平滑化を行った後、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化
した。カナマイシン耐性遺伝子を含む１４９４ｂｐのフラグメントを、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ／ＳｃａＩで消化したｐＥＸ９４Ｂプラスミドへ連結し、プラスミドｐＥ
Ｘ９４Ｂｎｅｏを生じた。プラスミドｐＥＸ９４ＢおよびｐＥＸ９４Ｂｎｅｏの
、１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列を、図１０
に示す。
【００８４】 （実施例ＩＩ） （Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ融合物の構築） さらに、ゲノムストレプトアビジンを含む単鎖抗体を、上記の方法と似た方法
で構築した。ｓｃＦｖＳＡバージョンの抗ＣＤ ｍＡｂ、Ｂ９Ｅ９を、（Ｇｌｙ 4 Ｓｅｒ）3（配列番号１０）リンカーあるいはｐＫＯＤと記されるリンカー（ア
ミノ酸ＧＬＥＧＳＰＥＡＧＬＳＰＤＡＧＳＧＳ）（配列番号９）のいずれかで、
ＶLＶH配向で構築した。簡単に書くと、Ｂ９Ｅ９−１Ｄ３ハイブリドーマ細胞（
１×１０7）（ＢｉｏｐｒｏｂｅＢＶ、Ａｍｓｔｅｌｖｅｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔ
ｈｅｒｌａｎｄｓによる）を回収し、そして、全ＲＮＡを調製した。Ｂ９Ｅ９の
カッパー鎖および重鎖のｃＤＮＡを、それぞれ、ＲＸ２０７およびＲＸ２１５の
プライマーを用いた逆転写反応により得た。カッパー鎖および重鎖の可変領域の
ＰＣＲフラグメントを、上述のｃＤＮＡおよびオリゴの組を用いて取得した（Ｒ
Ｘ２０７およびＮＸ５４はカッパー鎖用；ＲＸ２１５およびＮＸ５０は重鎖用）
。ＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてあらかじ
めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで制限されたｐＰＩＣαＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ）へとクローニングした。得
られたＣ５８−１およびＣ５８−１６プラスミドは、Ｂ９Ｅ９カッパー鎖および
重鎖をそれぞれ保持した。二つの鎖をさらに、オリゴの組を用いたＰＣＲにより
Ｃ５８−１およびＣ５８−１６からクローニングした（ＲＸ４６８およびＲＸ４
６９はカッパー鎖用；ＲＸ４７０およびＲＸ４７１は重鎖用）。カッパー鎖フラ
グメントを、ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで、そして、重鎖をＸｈｏＩ−ＳａｃＩ
でそれぞれ消化した。カッパー鎖をベクターとしてｐＥＸ９４Ｂ（ＮｃｏＩ−Ｂ
ｇｌＩＩ）へとクローニングし、そして、重鎖をｐＥＸ９４ＢにＸｈｏＩ−Ｓａ
ｃＩ部位でクローニングした。得られたプラスミド（Ｃ７４−２はカッパー鎖用
、Ｃ７６−１０は重鎖用）を、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｃ７
６−１０由来の小さなフラグメントを、同じ酵素で消化したＣ７４−２ベクター
に連結した。得られたプラスミド（Ｃ８７−１４）を、カッパー鎖と重鎖の間に
（Ｇ4Ｓ）3（配列番号１０）リンカーを有するＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ融合タン
パク質を保有した。Ｃ８７−１４をさらにＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、
２つのオリゴ（ｐＩｎｅｗ５’およびｐＩｎｅｗ３’）で調製されたｐＫＯＤリ
ンカーと連結し、Ｃ１３６−１を産生した。図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂ９Ｅ９
ｐＫＯＤ ｓｃＦｖＳＡの決定された各酸配列および推定アミノ酸配列を示して
いる。
【００８５】 他のバージョンのＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡを、延長された２５ｍｅｒの（Ｇｌ
ｙ4Ｓｅｒ）5（配列番号１１）リンカーを有してＶHＶL配向で構築した。ｓｃＦ
Ｖを含むＣ８７−１４のＮｃｏＩ−ＳａｃＩフラグメントを、ＶL領域にセリン
残基を加えるための１組のプライマー（ＲＸ６３３およびＲＸ４７１）を用いた
ＰＣＲによりさらにサブクローニングした。ＰＣＲフラグメントを、ＮｃｏＩお
よびＳａｃＩで消化し、そしてＮｃｏＩおよびＳａｃＩで制限したｐＥＸ９４Ｂ
ベクターへとクローニングした。得られたプラスミドＤ５９−３を、ＶHあるい
はＶLフラグメントを作るために、それぞれＲＸ７８およびＲＸ７８２、あるい
は、ＲＸ７２９およびＲＸ７８０を用いたＰＣＲによりサブローニングに供した
。ＶHＰＣＲフラグメントをＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、同じ部位でｐ
ＥＸ９４Ｂベクターへとクローニングし、Ｄ１４２−６が形成した。ＶLＰＣＲ
フラグメントを、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化し、同じ部位でｐＥＸ９４Ｂベ
クターへとクローニングし、Ｄ１４２−１を形成した。Ｄ１４２−１由来のＸｈ
ｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離し、そしてＤ１４２−６のＸｈｏＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと置換し、Ｄ１４８−１を産生した（ＶH−ＶL ｓ
ｃＦｖＳＡ）。前述のようなｎｅｏ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフ
ラグメント（ＢａｍＨＩ側で平滑にされている）を、Ｄ１４８−１のＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを置換するために使用し、Ｄ１６４−１３を形成
した。Ｄ１４８−１はまた、リンカーフラグメントを取り除くために、ＢｇｌＩ
ＩおよびＸｈｏＩで消化された後、２５ｍｅｒのリンカー（ＲＸ８３８およびＲ
Ｘ８３９を用いてアニールされた）と連結し、Ｅ５−２−６を形成した。ＶH−
ＶL ｓｃＦｖＳＡを含むＥ５−２−６のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントを、切り出した後、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限した
Ｄ１６４−１３ベクターに連結し、Ｅ３１−２−２０を形成した。Ｅ５−２−６
（カルベニシリン耐性）およびＥ３１−２−２０（カナマイシン耐性）両プラス
ミドは、Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ融合タンパク質を発現する。図１１Ｃは、Ｂ９
Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ（ＶH−ＬH ２５ｍｅｒ）の核酸配列および予想されるアミ
ノ酸配列を示している。
【００８６】 下に載せられた全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）により合成された。
【００８７】 ＮＸ５０（配列番号１２） ＴＧＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＲＴＣＷＧＧ ＮＸ５４（配列番号１３） ＴＧＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＳＷＧＣＴＧＡＣＣＡＲＴＣＴＣ ＲＸ２０７（配列番号１４） ＴＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡ ＲＸ２１５（配列番号１５） ＴＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣ ＲＸ４６８（配列番号１６） ＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡ
ＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴ ＲＸ４６９（配列番号１７） ＣＡＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧ ＲＸ４７０（配列番号１８） ＣＧＧＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧ
ＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡ ＲＸ４７１（配列番号１９） ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣ
ＣＣＡＴＴＣＣＧＧＣ ｐＩｎｅｗ５’（配列番号２０） ＧＡＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＣ
ＴＧＴＣＴＣＣＧＧＡＣＧＣＡＧＧ ｐＩｎｅｗ３’（配列番号２１） ＴＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴ
ＴＣＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡ ＲＸ６３３（配列番号２２） ＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＴＣＴ
ＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴ ＲＸ７７９（配列番号２３） ＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＴＣＴＣ
ＣＡ ＲＸ７８０（配列番号２４） ＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ ＲＸ７８１（配列番号２５） ＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡ ＲＸ７８２（配列番号２６） ＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣ ＲＸ８３８（配列番号２７） ＧＡＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴ
ＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＣＧ
ＧＣＧＧＣＧＧＣ ＲＸ８３９（配列番号２８） ＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧ
ＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧ
ＣＣＡＣＣＡＧＡ （実施例ＩＩＩ） （ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡおよびＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡタンパ
ク質の発現） プラスミドｐＥＸ９４Ｂ（ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ）あるいはＥ
５−２−６（Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ）を含むＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の形質転換体を、カルベ
ニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（２０ｍｌ；
Ｓｉｇｍａ）中で３０℃で一晩培養した。培養液を新鮮な培地で１００倍に希釈
した後、振とう培養器で３０℃で培養した。培養液が、０．３〜０．５Ａの６０
０になったときに、ＩＰＴＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を０．２ｍＭの終濃度になるように添
加し、そして一晩インキュベートした。ｓｃＦｖＳＡ発現レベルを定量的に解析
するために、ペリプラズム抽出液を調製した。細胞を、２０％スクロース、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、およびリゾチーム（２．９
ｍｇ／ｍｌ）の氷冷した溶液に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベート
した。上清を、非還元、非煮沸条件下で、４〜２０％のＴｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎ
ｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分析し、そしてゲルをＧｏｏｍａｓ
ｓｉｅ Ｂｌｕｅで染色した。振とうフラスコにおける発現を、ＩＰＴＧ濃度お
よびタイミング、温度、培地、炭素源などのような異なる環境パラメーター、あ
るいは、異なるプロモーターあるいはシグナル配列といった遺伝学的要因を試す
ことにより、最適化した。
【００８８】 クローンをさらに、８Ｌファーメンターを用いて培養し、発現レベルを解析し
た。はじめの接種物（５０ｍＬ）を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（プラスミ
ドｐＥＸ９４ＢｎｅｏあるいはＥ３１−２−２０）あるいはカルベニシリン（プ
ラスミドｐＥＸ９４ＢあるいはＥ５−２−６）を添加したＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂ
ｒｏｔｈを含む振とうフラスコを用いて、３０℃で一晩培養した。これはプラス
ミドの選択マーカーに依存している。その後、培養液を、同じ培地中に１００倍
に希釈し、そして、さらに４〜５時間、３０℃で培養した。２回目の接種物（０
．５Ｌ）を、８ＬのＥ．ｃｏｌｉ用完全培地［１Ｌあたり：６ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 、３ｇ ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇ ＮａＣｌ、３ｇ （ＮＨ4）2ＳＯ4、４８ｇ
ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．２５ｍｌ Ｍａｚｕ ＤＦ２
０４ 消泡剤（ＰＰＧ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ、ＰＡ）、０．７９ｇ ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、０．０４４ｇ ＣａＣｌ2−２
Ｈ2Ｏ、および３ｍｌのトレースエレメント（１Ｌあたり：０．２３ｇ ＣｏＣ
ｌ2、０．５７ｇ Ｈ3ＢＯ3、０．２ｇ ＣｕＣｌ2−２Ｈ2Ｏ、３．５ｇ Ｆｅ
Ｃｌ3−６Ｈ2Ｏ、４．０ｇ ＭｎＣｌ2−４Ｈ2Ｏ、０．５ｇ ＺｎＣｌ、１．３
５ｇ チアミン、および０．５ｇ Ｎａ2ＭｏＯ4−２Ｈ2Ｏ）］を含む１４Ｌの
ＢｉｏＦｌｏ３０００ファーメンター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ）に移した。その培地は、はじめの５ｇ／Ｌのガラクトースを炭素
源として含み、そして、プラスミド保持についての５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンあるいはカルベニシリンを含んだ。培養液を３０℃で培養し、そして接種の６
時間後に、ＩＰＴＧ（０．２ｍＭ）で誘導した。ｐＨを、リン酸あるいはＮａＯ
Ｈのいずれかを自動添加する事により、７．０に保持した。溶存酸素濃度を、４
００〜８００ｒｐｍの攪拌速度および必要量の酸素の供給により、期間中、３０
％以上に維持した。ガラクトース溶液（５０％）を、培養液中に存在したはじめ
のガラクトースを使い切ってから９時間後に、全部で１Ｌあたり２０〜２５ｇに
なるように添加した。細胞を、接種（Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ）の２４〜２６時
間後、あるいは接種（ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ）の４８〜５６時間
後に、連続流加遠心機（ｃｏｎｔｉｎｏｕｓ ｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
）（Ｐｉｌｏｔ Ｐｏｗｅｒｆｕｇｅ、Ｃａｒｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｆ
ｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）中に回収し、ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、遠心によりペレット化した。典型
的な発酵により、培地１Ｌあたり８０〜９０ｇの細胞（湿重量）を産生した。
【００８９】 発現レベルを決定するために、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、元の量まで再懸濁
し、氷上で超音波破砕（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、Ｄａｎｂｕ
ｒｙ、ＣＴ）あるいは２サイクルの微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎｅｗ
ｔｏｎ、ＭＡ）のいずれかにより破砕された。粗溶解産物の遠心サンプルの上清
中における融合タンパク質を定量するために、２つのアッセイ法を用いた。はじ
めに、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。このアッセイでは、ビオチン化アルブミン
（１００ｎｇ／ウエル（ＰＢＳ中））を、４℃で９６ウェルプレートに一晩コー
ティングし、そしてＨＰＬＣ精製融合タンパク質（２００ｎｇ／ｍｌ）あるいは
テストサンプルのいずれかを連続２倍希釈物と共にインキュベートした。検出に
はペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ストレプトアビジンポリクローナル抗体（Ｚ
ｙｍｅｄ、Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）およびＡＢＴＳ（Ｓｉｇ
ｍａ）基質緩衝液を用いた。プレートを、２波長自動プレートリーダーを用いて
４１５／４９０ｎｍの波長を読みとった。融合タンパク質の定量のために、一次
ｌｏｇ ｘ／ｌｏｇ ｙ回帰解析を行った。
【００９０】 あるいは、より速く結果を得るために、ローダミン−ビオチンＨＰＬＣアッセ
イを工夫した。遠心分離された溶解物中の融合タンパク質は、過剰のローダミン
誘導ビオチンと複合体を作った。これは、次のように調製された：５−（および
−６−）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシニンイミジルエステル（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）は、安定なアミド結
合の形成を通して、ビオシチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）と結
合した。反応混合物を、Ｄｙｎａｍａｘ ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ
Ｃ−１８カラム（Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｗｏｂｕｒｎ
、ＭＡ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。流出物を５４７ｎｍでモニターし、
そしてピーク画分を集め、質量分析により解析した。分子量がビオチン−ローダ
ミン結合体と一致する画分をプールし、ｒｏｔｏ−エバポレーションにより濃縮
した（Ｂｕｃｈｉｉ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。粗溶解物を清祥にするために
、過剰量の精製ビオチン−ローダミン結合体を添加し、そして１５％ ＤＭＳＯ
を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム中で平衡化されたＺｏｒｂａｘ ＧＦ−２５
０カラム（ＭＡＣ−ＭＯＤ、Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒｄ ＰＡ）を用いたサイズ排
除クロマトグラフィーにより、１．０ｍｌ／１分の流速で解析した。流出液を、
Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＰＤＡ−２検出器を用いて５４７ｎｍでモニタ
ーし、そして融合タンパク質の溶出に対応するピークの面積を、Ｖａｒｉａｎ
Ｄｙｎａｍａｘ ＨＰＬＣ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｌｔｎｕｔ Ｃｒｅ
ｅｋ、ＣＡ）を用いて決定した。粗溶解物中の融合タンパク質濃度を、同じ条件
下で解析されたスタンダードとの比較により算出した。融合タンパク質スタンダ
ードに対するモル吸光係数は、以前に記載された２８０ｎｍにおけるアミノ酸吸
収の相対的寄与率を合計する方法により計算した（Ｇｉｌｌ ａｎｄ ｖｏｎ
Ｈｉｐｐｅｌ、Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．１８２：３１９−３２６、１９８９）
。
【００９１】 ファーメンターで培養した細胞での発現レベルは、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓ
ｃＦｖＳＡでは１００〜１３０ｍｇ／Ｌ、Ｂ９Ｅ９ＫＯＤ ｓｃＦｖＳＡでは４
０ｍｇ／Ｌ、およびＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ（ＶH−ＶL２５ｍｅｒ）では２７０
〜３００ｍｇであった。
【００９２】 （実施例ＩＶ） （種々のリンカーおよびシグナル配列を用いたＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡの発現
） 異なる長さおよび組成のリンカー、ならびに異なる順序の可変領域を含む多く
の遺伝的変異体を構築した（表１）。始めに、これらの構築物を、振とうフラス
コによる培養で発現および誘導し、そしてペリプラズムのタンパク質をクマシー
染色された、非還元のＳＤＳゲルで可視化することにより、発現を定量的に評価
した。高発現構築物を、ガラクトース流加培養プロトコルを用いて８Ｌファーメ
ンターでさらに調べ、そしてそれらの発現レベルをローダミン誘導ビオチンを用
いたサイズ排除ＨＰＬＣにより定量的に決定した。これらの基準を最もよく満た
した構築物は、ＶH−ＶL配向で、ｓｃＦｖを有する２５ｍｅｒのＧｌｙ4Ｓｅｒ
リンカーを含んだ。
【００９３】 （表１．Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ遺伝的変異体の発現レベルの要約）
【００９４】
【表１】 （実施例Ｖ） （Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおけるｓｃＦｖ融合タンパク質の発現の上昇
） Ｅ．ｃｏｌｉ ｆｋｐＡ遺伝子は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰｓ）
のファミリーのメンバーであり、そしてタンパク質のフォールディングに関与す
るペリプラズ成分の一つである。それは、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムに発現さ
れ、そしてペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性を有する。
ＦｋｐＡ遺伝子産物のＰＰＩａｓｅ非依存生シャペロン活性はまた、ｉｎ ｖｉ
ｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で実証されている。ＦｋｐＡシャペロンタン
パク質は、ペリプラズムにおいてフォールディング中間体を安定化することによ
り、タンパク質フォールディングプロセスに関与する。単一シャペロンタンパク
質遺伝子（ｆｋｐＡ）の共発現が、ｓｃＦｖ融合タンパク質の発現を刺激しうる
かどうかが試験した。特に、以前には、Ｅ．ｃｏｌｉ内で十分に発現しなかった
タンパク間について試験した。
【００９５】 ｆｋｐＡ遺伝子のＤＮＡフラグメントをクローニングするために、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から染色体ＤＮＡを抽出し
、そしてＸｈｏＩで消化した。３５サイクルのＰＣＲを、１組のオリゴヌクレオ
チド（ＲＸ１２２９：ＡＣＧＡＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＣ（配列番号
３２）；ＲＸ１２３１：ＡＧＧＣＴＣＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＧＴ（配列番
号３３）；共にＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．から入手）
および、３００ｎｇの消化されたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行った。ＰＣ
Ｒ混合物を、２回目のＰＣＲ（３０サイクル）に供した。これには、一組のネス
ト化されたオリゴヌクレオチド（ＲＸ１２３０：ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣ
ＧＡＴＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＧ（配列番号３４）；ＲＸ１２３２：Ｃ
ＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＧＣＧＧＡ（配列番
号３５））が用いた。ＰＣＲフラグメントを、１％アガロースゲルで分離し、そ
して１．６ｋｂのフラグメントを単離した。抽出されたＤＮＡを、ＴＡベクター
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そしてＤＮＡ配列決定により配列
を確かめた。クローンを、オリゴヌクレオチドＲＸ１２３０およびＲＸ１２３２
に組み込まれている部位を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして抗−ＣＥＡ
Ｔ８４．６６ ｓｃＦｖＳＡ融合遺伝子（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ、Ｄｕａ
ｒｔｅ、ＣＡからのＴ８４．６６ ｃＤＮＡ）を保持するＨｉｎｄＩＩＩ消化ベ
クターＥ８４−２−８（ＮｅｏＲｘ Ｃｏｒｐ．）と連結した。得られたプラス
ミド（Ｆ１１５−１−１）を、振とうフラスコ発現のためにＸＬ１−Ｂｌｕｅ
Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換に使用した。ペリプラズム成分を抽出し、そして４〜２
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。電気泳動解析のために、２０μｌのｓｃＦｖ
ＳＡペリプラズム融合タンパク質の溶液を、ゲルの各レーンにロードした。電気
泳動に続き、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０で染色した。約３
０，０００の分子量を持つＦｋｐＡタンパク質は、ｆｋｐＡ遺伝子を持つ全ての
サンプル（＋）において優性に存在した。その一方で、例えば、図１９に示され
ているこの遺伝子を欠いているサンプル（−）存在しなかった。Ｎｏｖｅｘから
入手したＳｅｅＢｌｕｅ分子標準マーカー（Ｍ）中の７つの成分の分子量は、ゲ
ルの下端から、サイズが増えていく順に列挙され、１６，０００；３０，０００
；３６，０００；５０，０００；６４，０００；９８，０００；および２５０，
０００である。図１９に示されているように、Ｔ８４．６６ ｓｖＦｖＳＡ融合
タンパク質の発現は、ｆｋｐＡ遺伝子を欠く親の構築物（Ｅ８４−２−８）に比
べ、ＦｋｐＡシャペロンタンパク質と共発現したとき、劇的に増加した。さらな
るｓｃＦｖＳＡ融合タンパク質を、すでにＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断されて
いたＦ１１５−１−１ベクターへ、ＮｃｏＩ−ＳａｃＩフラグメントを移すこと
により構築した。得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅの発
現が振とうフラスコ培養で調べらた。電気泳動解析において、図１９および表 ２に示されているように、幾つかは、融合タンパク質の発現増加を示した。本明
細書中に要約された結果は、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）5（配列番号１１）リンカーを取
り込んでいるＶH−ＶL−ＳＡ構造にのみ関与する。表２に要約されるように、振
とうフラスコ実験における融合タンパク質の発現レベルは、＋＋＋＋＋の割り当
てられた、もっと高いレベルに定量的に見積もられた。
【００９６】 （表２ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｓｃＦｖＳＡ融合タンパク質の定量的な発現）
【００９７】
【表２】 （実施例ＶＩ） （ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡおよびＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡタンパ
ク質の精製） イムノビオチンアフィニティーマトリックスを、エポキシド活性化Ｍａｃｒｏ
−ｐｒｅｐマトリックス（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）を０．２Ｍ
炭酸緩衝液中のマトリックス１ｇあたり１１２μｍのＮ−（３−アミノプロピル
）−１，３プロパンジアミン（Ｓｉｇｍａ）と反応させることにより調製した。
反応を、８時間後にスラリーをシンダード（ｓｃｉｎｔｅｒｅｄ）ガラスロート
を通してろ過し、そして蒸留水でマトリックスを洗浄することにより停止した。
残ったエポキシドを、マトリックスと０．１Ｍの硫酸を８０℃で４時間反応させ
ることにより不活性化し、そして、マトリックスを再びリンスした。アミンで誘
導体化されたマトリックスをＰＢＳに懸濁し、１０％の容量の０．５Ｍホウ酸ナ
トリウム（ｐＨ８．５）を加えることにより、ｐＨを８．５まで上げた。ＮＨＳ
−イムノビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）をＤＭＳＯに溶解し、そして２．６ｍｇ／ｇ
のマトリックスの割合になるように懸濁されたマトリックスに添加した。４時間
反応後、マトリックスを蒸留水でリンスし、続いてｐＨ１１の炭酸ナトリウム緩
衝液およびｐＨ４の酢酸ナトリウム緩衝液を数回交換して洗浄した後、最終的に
蒸留水で洗浄した。マトリックスを、スラリーとして、２０％エタノール中に保
存された。
【００９８】 細胞（６５０−７５０ｇ、湿重量）を、ＰＢＳで二回洗浄し、氷冷した３０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で１０〜２０重量％まで再懸濁し
、そして２サイクルの微小流動化により破砕された。溶解物を、１ｃｍあたり４
６−４８ｍＳｅの範囲の濁度で、５０ｍＭ グリシン、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ９．６に調製し、その後、１２０００ｒｐｍで９０分間遠心分離した。上清
をろ過し（０．２μｍ）、次いで固定化イムノビオチンによってアフィニティー
精製した。イムノビオチンマトリックスはカラムを詰め、そして１ｃｍあたり４
６−４８ｍＳｅの濁度で、５０ｍＭ グリシン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９
．６に平衡化した。組換えストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたときの許容量は、２ｍｌ／
ｃｍ2／分の流速条件下では、１ｍｌのベットボリュームあたり２ｍｇであった
。０．２μｍろ過された細胞ホモジナイズ上清を、室温で、１００ｇの細胞あた
り８０ｍｌの総容積を用いて、１分あたり２ｍｌ／ｃｍ2で汲み出した。２０総
容積のカラム平衡化緩衝液による洗浄後、ｓｃＦｖＳＡ融合タンパク質を、０．
２Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０で溶出し、Ｔｒｉｓ緩衝
液で中和し、次いで冷やしたＰＢＳ中で徹底的に透析した。
【００９９】 タンパク質の凝集を減らすために、精製されたｓｃＦｖＳＡを、１０％ＤＭＳ
Ｏで室温で５〜７時間処理し、そしてＰＢＳ中で透析した。精製されたタンパク
質を、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ３０膜装置を用いて濃縮し、４℃で無菌的に保存する
ためにフィルター滅菌した。２〜３ｍｇ／ｍｌの濃度において、精製された調製
物は、典型的に、約５〜８％の凝集物を含んだ。
【０１００】 イムノビオチンクロマトグラフィーからの典型的な回収率は５０〜６０％であ
り、通過および洗浄への混入は５％未満であった。残りのものは、凝集／トラッ
プされた物質としてカラム中に残った。溶出緩衝液へのＤＭＳＯの添加により、
さらに５％以下の精製されたタンパク質が得られた。様々なイオン性および非イ
オン性界面活性剤を用いても、回収量は改善されなかった。溶出された融合タン
パク質の、ＨＰＬＣサイズ排除解析により、４０％までのタンパク質が凝集した
形で存在することが示された。光散乱ＨＰＬＣにより、４００，０００〜４００
万の間の凝集物のサイズが示された。１０％ＤＭＳＯで数時間処理する事により
、融合タンパク質のゆっくりとした脱凝集が起こり、その結果、３ｍｇ／ｍｌ未
満の濃度でＰＢＳ中で冷蔵保存された時にも９２％よりも多く残るような四量体
種を生じることが示された。
【０１０１】 （実施例ＶＩＩ：ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ およびＢ９Ｅ９ ｓ
ｃＦｖＳＡタンパク質の生化学的特徴） （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析．）４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシン ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、非還元条件下で
精製融合タンパク質を分析した。電気泳動前に、試料をＳＤＳ−ローディング緩
衝液と混合し、室温または９５oＣのどちらかで５分間インキュベーションを行
った。ゲルをクーマシーブルーで染色した。
【０１０２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、イムノビオチンクロマトグラフィー後、融合タン
パク質が９５％を超える均一性で精製されたことが示された（図１２、レーン２
および３；ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０データのみ）。主要なバンドは、およそ１７３
ｋＤａの予測分子量に移動しており、微量なアイソフォームがはっきりと分かっ
た。また、これらのアイソフォームを、ポリクローナル抗ストレプトアビジン抗
体を用いて、ウエスタンゲル分析により検出した（データは示していない）。し
かしながら、電気泳動前にタンパク質を煮沸したとき、約４３ｋＤａの単一種に
分割されたバンド全てが、完全にその均一なサブユニットに解離され得る単一の
タンパク質実体と一致する（図１２、レーン４および５）。Ｎｏｖｅｘより入手
可能なＳｅｅＢｌｕｅ分子標準マーカーの７成分の分子量（図１２、レーン１）
については、実施例Ｖにおいて記載している。
【０１０３】 （サイズ排除ＨＰＬＣおよびレーザー光散乱分析．） Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−
２５０カラム上で、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ 移動相
を用いて、サイズ排除ＨＰＬＣによって精製タンパク質調製物を分析した。Ｖａ
ｒｉａｎ Ｓｔａｒ ９０４０屈折率検出器およびＭｉｎｉＤａｗｎ光散乱装置
（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ
）を直列に連結したＺｏｒｂａｘシステムを用いて、融合構造物の分子量を測定
した。緩衝水溶液における、タンパク質に対するｄｎ／ｄｃ値０．１８５を用い
て、分子量算出を行った。
【０１０４】 ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより、微量（８％未満）な凝集体ピ
ークとともに、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０四量体については適切な保持時間で主要な
ピークが示された（図１３）。Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡは、非常に似たプロファ
イルを示した（グラフを示していない）。これらの分析によって、全ての精製タ
ンパク質が四量体またはその凝集体であることが示された。ｈｕＮＲ−ＬＵ−１
０ ｓｃＦｖＳＡに対する光散乱分析により、四量体について予測されたように
、１７２，６００の分子量が示された。
【０１０５】 （アミノ末端配列決定．） Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４シークエンサー（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
を用いて、自動アミノ酸配列決定を行った。この配列決定により、可変領域の最
初のアミノ酸に隣接する、予想されたシグナルペプチダーゼ部位でｈｕＮＲ−Ｌ
Ｕ−１０ ｓｃＦｖＳＡおよびＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ両方のリーダー配列が切
断されていることが明らかとなった。
【０１０６】 （Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡの分子量測定．） Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラム
（３００△，３．２×５０ｍｍ，５μ）およびＣ１８「ＳａｆｅＧｕａｒｄ」カ
ラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を装備したＨｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄシリーズ１１００システムを用いて、流速５００μｌ／分
で、液相クロマトグラフィーによる分離を行った。移動相は、水／１％ギ酸（緩
衝液Ａ）およびアセトニトリル／１％ギ酸（緩衝液Ｂ）により構成された。適用
した勾配は、２％Ｂを３分間流し、７分間で９９％まで上昇させるというもので
あった。保持時間８．７分で、Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ（１０μｌ）を溶出した
。分析カラムを、Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ／Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＥＳＩ ＬＣＱ
イオントラップマススペクトロメーター（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）と連結した
。ミオグロビンを用いて機器を較正し、陽イオンモードで、２００oＣに設定し
た加熱キャピラリーおよび５．１ｋＶにしたエレクトロスプレー針を用いて操作
した。フルスキャンＭＳモード（ｍ／ｚ［５００〜２０００ Ｄａ／ｚ］）で、
３つのマイクロスキャンおよび最大イオン時間を５００ｍｓとした自動的ゲイン
コントロールを用いて、データを得た。
【０１０７】 Ｂ９Ｅ９単量体のマススペクトルによって、デコンボルーションした分子量と
して４３，４０１が示された。この値は、最も量的に多い質量計算値４３，４０
０と一致した。
【０１０８】 （ＨｕＮＲ−ＬＵ−１０競合的免疫反応性ＥＬＩＳＡ．） ヒト化ＮＲ−ＬＵ
−１０完全抗体およびｈｕＮＲ−ＬＵ−１０融合タンパク質の連続希釈を、ペル
オキシダーゼ標識マウスＮＲ−ＬＵ−１０完全抗体と、ヒト腫瘍細胞株ＬＳ−１
７４（ＡＴＣＣ＃ＣＬ１８８）由来の０．１％ＮＰ４０膜抽出物結合に対して競
合させた。データのｌｏｇ−ｌｏｇｉｔ変換後（このデータにおいて、曲線は同
一の傾きに合っていた）、５０％阻害（ｋ）を示す競合抗体の濃度を計算した。
式：ｋ（融合タンパク質標準試料）／ｋ（完全抗体標準試料）×１００、に従っ
て、パーセント免疫反応性を決定した。ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０融合タンパク質が
、インタクトな２価のヒト化抗体よりも優れた（約２２５％）免疫反応性を保持
することが分かった（図１４）。
【０１０９】 （Ｂ９Ｅ９競合免疫反応性ＦＡＣＳアッセイ．） 様々な濃度の非標識抗体存
在下で、ＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞株（バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ−１５９６）に対するフルオレセイン標識Ｂ９Ｅ９の結合を測定する、フロー
サイトメトリーを用いた競合的結合アッセイにおいて免疫反応性を評価した。フ
ルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミデートを用いてＢ９Ｅ９ ｍＡｂを標
識し、最適化されたこの標識量を、連続希釈（３〜２００ｎｇ／ｍｌ）のＢ９Ｅ
９ ｍＡｂ標準試薬または、等モルのＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡと混合し、１×１
０6細胞とともに、４℃にて３０分間インキュベーションを行った。試料を洗浄
し、単レーザーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
で分析した。一つ一つの細胞を流入させた後、蛍光のヒストグラムプロットから
幾何平均蛍光強度を決定した。非線形回帰分析を用いて、単一部位の結合に対し
て、フルオレセインＢ９Ｅ９結合を５０％阻害するために必要な競合抗体の濃度
（ＩＣ50）を計算した。パーセント免疫反応性＝［ＩＣ50ｓｃＦｖＳＡ／ＩＣ50 ｍＡｂ］×１００である。
【０１１０】 ｓｃＦｖＳＡは、１モルあたり、２価Ｂ９Ｅ９抗体のおよそ２倍の免疫反応性
（約１８５％）であり、四価であることを考慮して調整した場合、Ｂ９Ｅ９ ｍ
Ａｂとほぼ等しい（９３％）の免疫反応性があった（グラフを示していない）。
【０１１１】 （Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡアビディティー．） 飽和結合実験を用いてアビデ
ィティーを決定した。この実験では、過剰量の抗原（１０7細胞）存在下で、平
衡状態で、放射性標識したｍＡｂまたは融合タンパク質（０．０２５〜５０ｎｇ
／ｍｌ）の特異的な結合を測定する。過剰量の放射性標識していないｍＡｂまた
は融合タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）存在下で、非特異的結合を測定した。上記
のように、混合物をインキュベーションし、遠心分離した。免疫反応性に応じて
調整された抗体濃度を用いて、ｎＭ結合 対 ｎＭ放射性リガンドの非線形回帰
分析から、平衡解離定数（Ｋｄ）を計算した。Ｒａｍｏｓ 細胞に対する放射性
標識結合により測定されたように（表３）、Ｂ９Ｅ９融合タンパク質は、Ｂ９Ｅ
９ ｍＡｂと同じ相対的ナノモル濃度アビディティーを保持していた。
【０１１２】
【表３】 （ビオチン結合および解離．） ９倍モル過剰の［3Ｈ］ビオチン（ＮＥＮ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）とともに、既知量
の融合タンパク質のインキュベーションを行い、ビオチン結合能を測定した。ス
トレプトアビジン固定化ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、複合体を形成していないビオチンを除去した後、融合
タンパク質と結合している［3Ｈ］ビオチン量を測定した。
【０１１３】 組換えストレプトアビジンが４つのビオチン結合部位を持つことと比較して、
ＨｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡおよびＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡは、平均３
．０および３．６ビオチンとそれぞれ結合可能だった。
【０１１４】 ＨｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡに対して、３７oＣにて、１０μＭ 融
合タンパク質または組換えストレプトアビジンのいずれか、および飽和状態未満
のレベルの［90Ｙ］ＤＯＴＡ−ビオチンを含む０．２５Ｍ リン酸、０．１５塩
化ナトリウム、ｐＨ７．０中で、ＤＯＴＡ−ビオチン解離の速度を評価した。解
離測定を開始するために、１００倍飽和レベルのビオシチン（Ｓｉｇｍａ）を添
加した。決められた時間間隔で、０．５％仔牛血清アルブミン含有ＰＢＳでイン
キュベート溶液のアリコートを希釈した。タンパク質を沈殿させるために、それ
ぞれの希釈アリコートに硫酸亜鉛を添加し、最終濃度が０．０６Ｍになるように
、それぞれに対して水酸化ナトリウムを添加した。微量遠心分離後、Ｈｅｗｌｅ
ｔｔ Ｐａｃｋａｒｄベータカウンターを用いて上清中の遊離［90Ｙ］ＤＯＴＡ
−ビオチンを評価した。ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡのＤＯＴＡ−ビオ
チン解離速度は、組換えストレプトアビジンの解離速度と匹敵した（ｈｕＮＲ−
ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡに関してｔ1/2が５８分間であるのに対して、組換え
ストレプトアビジンに関してｔ1/2は４７分間；図１５）。
【０１１５】 Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡに対して、［90Ｙ］ＤＯＴＡ−ビオチンの代わりに［ 3 Ｈ］ビオチンを用いたことを除いて、上記と同じようにビオチン解離を測定し
た。ビオチン解離に関する計算ｔ1/2値は、Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡの場合は３
７９分、対して組換えストレプトアビジンの場合は３６４分（グラフは示さない
）であった。
【０１１６】 （実施例ＶＩＩＩ：ＨＵＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡでのプレターゲティ
ング後の、111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンの生体内分布の分析） 完全プレターゲットプロトコールで、右脇腹皮下にＳＷ−２２ヒト結腸癌異種
移植片（１００〜２００ｍｇ）を移植した雌ヌードマウスを用いて、発現された
ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ遺伝子融合について試験した。これらの実
験において、５７５μｇの125Ｉ−標識融合タンパク質を静脈内（ｉｖ）注射し
、１００μｇの合成洗浄剤（ｓＣＡ）をＩＶ注射する前に、１８時間循環させた
（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４６０９８およびＷＯ９５／１５９７８を
参照のこと）。ｓＣＡ注射の３時間後、本質的にはビオチン標識した放射性核種
を含むキレート剤である１．０μｇの111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンを注射した
（米国特許第５，５７８，２８７号および第５，６０８，０６０号を参照）。11 1 Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンを注射してから２、２４、４８および１２０時間後
にマウスから血液を採取し、屠殺して解剖を行った。
【０１１７】 ｓＣＡの錯体形成および引き続く肝臓によるクリアランスによって誘導された
低血液プール濃度に起因して、血中および最もよく灌流された軟組織における12 5 Ｉ−ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ放射能の濃度は非常に低かった。例
外は、肝臓と腫瘍であった。融合タンパク質の肝臓取り込みおよび保持は、洗浄
剤の作用機構によるものであり、また多少は、ストレプトアビジン含有融合タン
パク質の分解が阻害されたことによるもので、ストレプトアビジンおよびｈｕＮ
Ｒ−ＬＵ−１０とストレプトアビジンの化学結合体（ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０／Ｓ
Ａ）の両実験において観察される同じような結果と矛盾しなかった（データは示
さない）。125Ｉ−ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡにより、全ての時点で
、腫瘍において比較的高い放射性標識濃度が保持されることからインビボでの免
疫反応性が明らかになった（化学量論的に、かつ血液プール濃度に対して相対的
に）。腫瘍濃度 対 血液濃度の比は２３時間から１４３時間で連続的に上昇し
た。洗浄剤により誘導された低血液プール値は、その比が劇的に上昇し、平均値
は洗浄剤がない場合に観察された値の２倍を超えた（データは示さない）。
【０１１８】 プレターゲットされた111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチン生体内分布を、図１６で
示す。化学結合体ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０／ＳＡを用いたプレターゲティングの結
果と一致して、血中および全ての異種移植でない片軟組織において、111Ｉｎ−
ＤＯＴＡ−ビオチン放射能濃度は非常に低かった。上記のように肝臓において高
濃度にも関わらず、肝臓での111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチン取り込みおよび保持
は明らかではなく、融合タンパク質が効果的にインターナリゼーションされてお
り、続いて投与されたラジオビオチンの結合には利用できないことが示された。 111 Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンの最高濃度は、全ての時点において、腫瘍におい
て観察された。（図１６での組織の順番は、血液、尾、肺、脾臓、胃、腎臓、腸
および腫瘍である。）採取した最初の時点でピーク濃度に達するような急速な取
り込みは、プレターゲティングの証明である。腫瘍における、111Ｉｎ−ＤＯＴ
Ａ−ビオチンの、効果的、終始変化しない輸送および保持もまた観察された。腫
瘍における111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンのピーク濃度は、化学的ＮＲ−ＬＵ−
１０／ＳＡ結合体（２０〜２５％注射用量／ｇ）を用いて矛盾せずに起こり得る
範囲内であった（データは示していない）。
【０１１９】 （実施例ＩＸ： ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ 対 ｈｕＮＲ−ＬＵ
−１０／ストレプトアビジン化学結合体の血液クリアランスおよび腫瘍での取り
込みの分析） ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡの場合の、腫瘍 対 血液比は、ＤＯＴ
Ａ−ビオチン注射後２時間での値である１００付近から、２４時間で数千まで上
昇した。腫瘍へのラジオビオチン輸送の効力を示し、血液および腫瘍についての
曲線下面積（ＡＵＣ）値に対応する、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０／ＳＡ化学結合体お
よび融合タンパク質に対する相対的な結果を図１７に示す。
【０１２０】 融合タンパク質を用いた全体の腫瘍ＡＵＣは、化学結合体のＡＵＣよりもいく
らか低かった（０〜１２０時間の時間間隔に関して１７２６ 対 典型的化学結
合体実験に関して２０４７）。しかしながら、血液プール中の111Ｉｎ−ＤＯＴ
Ａ−ビオチン濃度において劇的な相違があった（融合タンパク質グループの濃度
は、一貫して全ての時点においてより低かった）。血中における放射能のこの減
少保持による最大の効果は、融合タンパク質で処理された動物が、化学結合体に
より処理された動物よりも高い治療指標（腫瘍／血液）を示すことである。
【０１２１】 （実施例Ｘ：Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡのプレターゲット生体内分布） 十分に樹立されたＲａｍｏｓヒト癌異種移植片（１００〜４００ｍｇ）を有す
る雌ヌードマウスにおいて、プレターゲット放射性免疫治療研究を行った。実験
開始する１０〜２５日前に、Ｂｋｌ：ＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕヌードマウスの
側面の正中線（ｓｉｄｅ ｍｉｄｌｉｎｅ）の皮下に５〜２５×１０6個の培養
細胞を移植することにより、腫瘍を形成させた。マウスに125Ｉ−標識Ｂ９Ｅ９
ｓｃＦｖＳＡ（６００μｇ）を静脈内注射し、２０時間後に１００μｇの合成
洗浄剤を静脈内注射した。洗浄剤投与から４時間後に、それぞれのマウスに対し
て、111Ｉｎ−標識ＤＯＴＡ−ビオチン（１．０μｇ）を静脈内注射した。各時
点につき３匹のマウスで１つのグループとし、111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチン注
射から２、２４、４８時間後に採血し、屠殺した。全ての器官および組織を摘出
、重量を測定し、ガンマカウンターを用いて放射能測定を行った。
【０１２２】 図１８で示すように、血中および全ての異種移植片以外の軟組織において111
Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチン放射能は、注射用量／ｇの２％未満であった。さらに
、肝臓における111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチン取り込みおよび保持は検出されな
かったことから、添加した洗浄剤によって融合タンパク質が肝臓に効果的にイン
ターナリゼーションされており、その後投与されたラジオビオチンの結合に利用
できないことが示される。腫瘍における111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンの安定し
た輸送および保持を観察した。全ての時点において、ラジオビオチンの最高濃度
は、腫瘍（化学量論的に、かつ血液プール濃度に対して相対的に）で見られた。
腫瘍における111Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ビオチンのピーク濃度は、注射用量／ｇの１
７〜２４％（平均２１．６６、ｓ．ｄ．３．１７）であった。腫瘍 対 血液比
は、ＤＯＴＡ−ビオチン注射から２時間後の値であるおよそ９０から、２４時間
で７００をこえるまでに上昇した。これらの実験において、融合タンパク質、洗
浄試薬またはＤＯＴＡ−ビオチンの用量を最適化する努力も、これらの成分を投
与するスケジュールを最適化する努力も払っていない（図１８において、組織は
順に、血液、尾、肺、肝臓、脾臓、胃、腎臓、腸および腫瘍である）。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、異種タンパク質−ゲノムのストレプトアビジンを発現する遺伝子構築
物の模式図である。
【図２】 図２は、単鎖抗体−ゲノムストレプトアビジン融合構築物の模式図である。
【図３】 図３は、単鎖抗体（ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０）−ゲノムのストレプトアビジン融
合構築物を含有しているｐＥＸ９４Ｂ発現ベクターの模式図である。
【図４】 図４は、シグナル配列および推定のアミノ酸配列（配列番号２）を含有してい
る、ゲノムのストレプトアビジン（配列番号１）の配列である。
【図５】 図５は、ｐＫＫｌａｃ／ｐｅｌＢベクターの構築の模式図である。
【図６】 図６は、ｐＥＸ−１ベクターの構築の模式図である。
【図７】 図７は、ｐＥＸ−ＳＡ３１８およびｐＥＸ−ｓｃＦｖ３．２．１ベクターの構
築の模式図である。
【図８】 図８は、ｐＥＸ９４Ｂベクターの構築の模式図である。
【図９】 図９は、ｐＥＸ９４Ｂ ｎｅｏベクターの構築の模式図である。
【図１０】 図１０は、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０単鎖抗体−ゲノムのストレプトアビジン融合
体についての、決定された核酸配列（配列番号３）および推定のアミノ酸配列（
配列番号４）を示す。ストレプトアビジン調節領域、シグナル配列、およびコー
ド配列は、単鎖抗体の種々のリンカー、ならびに軽鎖および重鎖がそうであるよ
うに示される。
【図１１Ａ】 図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ融合構築物の決定された核
酸（配列番号５）および推定のアミノ酸配列（配列番号６）であり、ＶLとＶHと
の間にｐＫＯＤリンカーを有する。リンカーは、箱で囲まれ、そして方向は、Ｖ L −リンカー−ＶH−リンカー−ストレプトアビジンである。
【図１１Ｂ】 図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ融合構築物の決定された核
酸（配列番号５）および推定のアミノ酸配列（配列番号６）であり、ＶLとＶHと
の間にｐＫＯＤリンカーを有する。リンカーは、箱で囲まれ、そして方向は、Ｖ L −リンカー−ＶH−リンカー−ストレプトアビジンである。
【図１１Ｃ】 図１１Ｃは、ＶH−リンカー−ＶL−リンカー−ストレプトアビジンをコードす
るＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡ融合構築物の、核酸配列（配列番号７）および推定の
アミノ酸配列（配列番号８）を含有している発現カセットである。
【図１２】 図１２は、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示
すスキャンした画像である。
【図１３】 図１３は、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡのサイズ排除ＨＰＬＣ分析を
示すグラフである。
【図１４】 図１４は、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｍＡｂと比較した場合の、ｈｕＮＲ−ＬＵ
−１０ ｓｃＦｖＳＡ（９７−２０．０および９８−０１．０）の競合免疫反応
アッセイを示すプロットである。
【図１５】 図１５は、組換えストレプトアビジン（ｒ−ＳＡ）と比較した場合の、ｈｕＮ
Ｒ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡ（９７−１３．０）からのＤＯＴＡ−ビオチンの
解離の速度を示すプロットである。
【図１６】 図１６は、プレターゲティングされたｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦｖＳＡの
生体分布を示すグラフである。
【図１７】 図１７は、化学的に結合させた形態に対する、ｈｕＮＲ−ＬＵ−１０ ｓｃＦ
ｖＳＡの血液のクリアランスおよび腫瘍の取り込みを示すグラフである。
【図１８】 図１８は、プレターゲティングされたＢ９Ｅ９ ｓｃＦｖＳＡの生体分布を示
す棒グラフである。
【図１９】 図１９は、ＦｋｐＡの存在下および非存在下での、ｓｃＦｖＳＡ融合タンパク
質の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のスキャンした画像である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ 5/10 33/574 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ 33/574 Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュルツ， ジョアンネ イレイン アメリカ合衆国 ワシントン 98112， シアトル， イースト アロハ ストリー ト 2610 (72)発明者 リン， ユカン アメリカ合衆国 ワシントン 98028， ケンモア， 61エスティー アベニュー エヌ．イー．−18216 (72)発明者 サンダーソン， ジェイムス アレン アメリカ合衆国 ワシントン 98125， シアトル， エヌ．イー．103アールディ ー ストリート 1539 (72)発明者 レノ， ジョン エム． アメリカ合衆国 ワシントン 98036， ブライアー， エルム ドライブ 2452 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA43 BA80 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 FA10 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ01 QR33 QR60 QR75 QR77 QR78 QR80 QS05 QS15 QS36 QX02 4B065 AA01X AA01Y AA87X AA90Y AB01 BA01 CA24 CA46 4C076 CC27 EE59 4C084 AA01 AA02 AA13 BA01 BA08 BA21 CA04 CA53 DC50 MA05 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA11 CA40 DA00 DA75 EA50 FA72 FA74

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ストレプトアビジン融合タンパク質の発現のためのベクター
    構築物であって、以下： （ａ）ゲノムストレプトアビジンまたはその機能的な変異体をコードする第１の
    核酸配列； （ｂ）該第１の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター；および （ｃ）ストレプトアビジンに融合され、該プロモーターと該第１の核酸配列との
    間に配置されるポリペプチドをコードする第２の核酸配列の挿入のためのクロー
    ニング部位、 を含む、ベクター構築物。
  2. 【請求項２】 前記構築物が、前記クローニング部位に挿入された前記第２
    の核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の構築物。
  3. 【請求項３】 前記プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１に記
    載の構築物。
  4. 【請求項４】 前記プロモーターがＬａｃプロモーターである、請求項３に
    記載の構築物。
  5. 【請求項５】 前記プロモーターが構成プロモーターである、請求項１に記
    載の構築物。
  6. 【請求項６】 前記プロモーターと前記クローニング部位との間に配置され
    たＳ．ａｖｉｄｉｎｉｉ調節配列をさらに含む、請求項１に記載の構築物。
  7. 【請求項７】 前記調節配列がストレプトアビジン調節配列である、請求項
    ６に記載の構築物。
  8. 【請求項８】 前記調節配列と前記クローニング部位との間に配置された細
    菌リーダー配列をさらに含む、請求項１に記載の構築物。
  9. 【請求項９】 前記リーダー配列がシグナル配列を含む、請求項８に記載の
    構築物。
  10. 【請求項１０】 前記リーダー配列がＳ．ａｖｉｄｉｎｉｉストレプトアビ
    ジンシグナル配列を含む、請求項８に記載の構築物。
  11. 【請求項１１】 前記シグナル配列が、図４のヌクレオチド５０〜１２１を
    含む、請求項１０に記載の構築物。
  12. 【請求項１２】 選択マーカーであるタンパク質をコードする核酸配列をさ
    らに含む、請求項１に記載の構築物。
  13. 【請求項１３】 前記タンパク質が抗生物質耐性を与える、請求項１２に記
    載の構築物。
  14. 【請求項１４】 前記第１の核酸配列が、少なくとも図４のストレプトアビ
    ジンのアミノ酸１４〜１５０をコードする、請求項１に記載の構築物。
  15. 【請求項１５】 前記第１の核酸配列が、少なくとも図４のストレプトアビ
    ジンの１〜１５８、５〜１５８、１４〜１５０、１４〜１５１、１４〜１５２、
    １４〜１５３、１４〜１５４、１４〜１５５、１４〜１５６、１４〜１５７、ま
    たは１４〜１５８からなる群より選択されるアミノ酸をコードする、請求項１に
    記載の構築物。
  16. 【請求項１６】 請求項１の構築物でトランスフェクトされた、宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 前記細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳
    動物細胞からなる群より選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 末端同士が連結された第１のポリペプチドおよび第２のポ
    リペプチドを少なくとも含む融合タンパク質であって、ここで該第１のポリペプ
    チドが、図４のストレプトアビジンの少なくとも１２９のアミノ酸またはその機
    能的変異体を含み、そして該第２のポリペプチドが、該第１のポリペプチドとは
    少なくとも１残基異なるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
  19. 【請求項１９】 前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、少
    なくとも２つのアミノ酸のリンカーによって分けられる、請求項１８に記載の融
    合タンパク質。
  20. 【請求項２０】 前記リンカーが少なくとも４のアミノ酸である、請求項１
    ９に記載の融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】 前記リンカーが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
    １２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０のアミノ酸の間
    である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 前記リンカーが５〜１０のアミノ酸の間である、請求項２
    １に記載の融合タンパク質。
  23. 【請求項２３】 前記第２のポリペプチドが抗体またはそのフラグメントで
    ある、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の融合タンパク質であって、ここで該融
    合タンパク質が、第２、第３および第４の融合タンパク質と四量体複合体を形成
    し得、該第２、第３および第４の融合タンパク質は、末端同士が連結された第１
    および第２のポリペプチドを少なくとも含み、ここで該第１のポリペプチドが、
    図４のストレプトアビジンの少なくとも１２９のアミノ酸またはその機能的改変
    体を含み、そして該第２のポリペプチドが、該第１のポリペプチドとは少なくと
    も１残基異なるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
  25. 【請求項２５】 前記抗体がＢ９Ｅ９である、請求項２３に記載の融合タン
    パク質。
  26. 【請求項２６】 前記抗体が１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦＶ）である、
    請求項２３に記載の融合タンパク質。
  27. 【請求項２７】 前記１本鎖Ｆｖフラグメントが抗体Ｂ９Ｅ９由来である、
    請求項２６に記載の融合タンパク質。
  28. 【請求項２８】 リンカーが、前記単鎖抗体の可変軽鎖と可変重鎖とを接続
    する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
  29. 【請求項２９】 前記リンカーが少なくとも１０のアミノ酸残基を含む、請
    求項２８に記載の融合タンパク質。
  30. 【請求項３０】 前記リンカーが少なくとも１５のアミノ酸を含む、請求項
    ２９に記載の融合タンパク質。
  31. 【請求項３１】 前記リンカーが少なくとも２０のアミノ酸を含む、請求項
    ３０に記載の融合タンパク質。
  32. 【請求項３２】 前記リンカーが少なくとも４のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーを
    含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  33. 【請求項３３】 前記抗体が、細胞表面タンパク質または細胞関連間質タン
    パク質もしくは細胞関連性マトリックスタンパク質に特異的である、請求項２３
    に記載の融合タンパク質。
  34. 【請求項３４】 前記抗体が霊長類化抗体である、請求項３３に記載の融合
    タンパク質。
  35. 【請求項３５】 前記抗体がマウス抗体である、請求項３３に記載の融合タ
    ンパク質。
  36. 【請求項３６】 前記細胞表面タンパク質または前記細胞関連性間質タンパ
    ク質もしくは細胞関連性マトリックスタンパク質が、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＥＧ
    Ｐ４０、ＣＥＡ、ＴＡＧ７２、ＮＣＡＭ、β−ＨＣＧ、ムチン、および新脈管形
    成抗原からなる群より選択される、請求項３３に記載の融合タンパク質。
  37. 【請求項３７】 前記細胞表面タンパク質がＣＤ２０である、請求項３６に
    記載の融合タンパク質。
  38. 【請求項３８】 前記第１のポリペプチドが、少なくとも図４のストレプト
    アビジンのアミノ酸１４〜１５０を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  39. 【請求項３９】 前記第１のポリペプチドが、少なくとも図４のストレプト
    アビジンの１〜１５８、５〜１５８、１４〜１５０、１４〜１５１、１４〜１５
    ２、１４〜１５３、１４〜１５４、１４〜１５５、１４〜１５６、１４〜１５７
    、または１４〜１５８からなる群より選択されるアミノ酸を含む、請求項１８に
    記載の融合タンパク質。
  40. 【請求項４０】 融合タンパク質の投与を含む腫瘍細胞の標的化方法であっ
    て、該融合タンパク質は、末端同士で連結された第１のポリペプチドおよび第２
    のポリペプチドを少なくとも含み、ここで該第１のポリペプチドは、図４のスト
    レプトアビジンの少なくとも１２９のアミノ酸またはその保存的に置換された変
    異体を含み、ここで該第２のポリペプチドは、腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質
    または細胞関連性間質タンパク質もしくは細胞関連性マトリックスタンパク質に
    結合するポリペプチドであり、ここで該融合タンパク質は、腫瘍細胞上の細胞表
    面タンパク質または細胞関連性間質タンパク質もしくは細胞関連性マトリックス
    タンパク質に結合し、そして該融合タンパク質の該ストレプトアビジン部分は、
    ビオチンに結合し得る、方法。
  41. 【請求項４１】 前記融合タンパク質が、腫瘍細胞上の細胞表面タンパク質
    レセプターまたは細胞関連性間質タンパク質もしくは細胞関連性マトリックスタ
    ンパク質、ならびにビオチン化放射性核種を含む化合物に結合する、請求項４０
    に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、少
    なくとも２のアミノ酸のリンカーによって分けられる、請求項４０に記載の方法
    。
  43. 【請求項４３】 前記リンカーが少なくとも４のアミノ酸である、請求項４
    ２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記リンカーが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
    １２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０のアミノ酸の間
    である、請求項４３に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記リンカーが５〜１０のアミノ酸の間である、請求項４
    ４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記第２のポリペプチドが抗体である、請求項４０に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 前記抗原がＢ９Ｅ９である、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記抗体が１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦＶ）である、
    請求項４０に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記１本鎖Ｆｖフラグメントが抗体Ｂ９Ｅ９由来である、
    請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 リンカーが、前記単鎖抗体の可変軽鎖と可変重鎖とを接続
    する、請求項４８に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記リンカーが少なくとも１０のアミノ酸残基を含む、請
    求項５０に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記リンカーが少なくとも１５のアミノ酸を含む、請求項
    ５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記リンカーが少なくとも２０のアミノ酸を含む、請求項
    ５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記リンカーが少なくとも４のＧｌｙ4Ｓｅｒリンカーを
    含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記抗体が、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４５、ＣＤ５２、
    ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＥＧＰ４０、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＮＣＡＭ、β−ＨＣ
    Ｇ、ムチン、ＥＧＦレセプター、ＩＬ−２レセプター、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｌｅ
    ｗｉｓ ｙ、ＧＤ２、ＧＭ２、テネイシン、シアリル化テネイシン、ソマトスタ
    チン、活性化腫瘍間質抗原および新脈間形成抗原からなる群より選択される細胞
    表面タンパク質、または細胞関連性間質タンパク質もしくは細胞関連性マトリッ
    クスタンパク質に特異的に結合する、請求項４０に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 前記抗体が霊長類化抗体である、請求項４０に記載の方法
    。
  57. 【請求項５７】 前記抗体がマウス抗体である、請求項４０に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記第１のポリペプチドが、少なくとも図４のストレプト
    アビジンのアミノ酸１４〜１５８を含む、請求項４０に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記第１のポリペプチドが、少なくとも図４のストレプト
    アビジンのアミノ酸５〜１５８を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記第１のポリペプチドが、少なくとも図４のストレプト
    アビジンのアミノ酸１〜１５８を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 腫瘍細胞が、腺癌および血液学的な悪性疾患からなる群よ
    り選択される癌と関連する、請求項４０に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 前記腺癌が、神経膠腫、前立腺、卵巣、胸、結腸、直腸、
    膵臓および肺からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 請求項６１に記載の方法であって、前記血液学的な悪性疾
    患が、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、急性リンパ性
    白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨
    髄腫、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症からなる群より選択さ
    れる、方法。
  64. 【請求項６４】 四価の抗体の構築方法であって、該方法は、請求項２３に
    記載の四量体複合体を形成し得る前記融合タンパク質を、第２、第３および第４
    の融合タンパク質と接触させる工程を包含し、該第２、第３および第４の融合タ
    ンパク質はまた、四量体複合体を形成し得、そして末端同士で連結された第１の
    ポリペプチドおよび第２のポリペプチドを少なくとも含み、ここで該第１のポリ
    ペプチドは、図４のストレプトアビジンの１２９のアミノ酸またはその機能的変
    異体を含み、そして該第２のポリペプチドは、該第１のポリペプチドとは少なく
    とも１残基異なるアミノ酸配列を含む、方法。
  65. 【請求項６５】 請求項１８〜３９のいずれか１項に記載の融合タンパク質
    を含む、薬学的組成物。
  66. 【請求項６６】 ストレプトアビジン融合タンパク質の発現のためのベクタ
    ー構築物であって、以下： （ａ）ストレプトアビジンに融合されたポリペプチドをコードする第１の核酸配
    列； （ｂ）該第１の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター；および （ｃ）少なくとも図４のストレプトアビジンの１２９のアミノ酸をコードする第
    ２の核酸配列またはその機能的変異体の挿入のためのクローニング部位、 を含む、ベクター構築物。
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