JP5096332B2 - 生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法 - Google Patents

生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP5096332B2
JP5096332B2 JP2008522604A JP2008522604A JP5096332B2 JP 5096332 B2 JP5096332 B2 JP 5096332B2 JP 2008522604 A JP2008522604 A JP 2008522604A JP 2008522604 A JP2008522604 A JP 2008522604A JP 5096332 B2 JP5096332 B2 JP 5096332B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substrate
recognition molecule
polypeptide
biological liquid
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2008522604A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2008001802A1 (ja
Inventor
孝之 草加
昌行 野村
拓郎 前田
雄也 杉山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Corp
Original Assignee
Asahi Kasei Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Corp filed Critical Asahi Kasei Corp
Priority to JP2008522604A priority Critical patent/JP5096332B2/ja
Publication of JPWO2008001802A1 publication Critical patent/JPWO2008001802A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5096332B2 publication Critical patent/JP5096332B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/14—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis
    • A61M1/15—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis with a cassette forming partially or totally the flow circuit for the treating fluid, e.g. the dialysate fluid circuit or the treating gas circuit
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、血液等に代表されるの生物学的液体より分離対象物を特異的に吸着または除去するための生物学的液体処理用基材およびその利用に関する。
血液浄化療法とは、特定疾患の治療のため、その発症や誘発、増悪に関連していると考えられる物質成分を血液中から除去することで生体内の恒常性維持をはかることを目的とした治療であり、アフェレシス治療とも呼ばれる。現在行われている血液浄化療法は、除去対象成分及び除去メカニズムにより大きく４つに分類できる。
（１）血液透析・血液濾過・血液濾過透析療法：急性腎不全、慢性腎不全などが適応。尿として体外に排出されるべき成分(尿素・窒素などの低分子量成分)を血液中から直接浄化する療法で、主に血液中の低分子成分が対象である。
（２）血漿交換療法：劇症肝炎、急性肝不全、閉塞性動脈硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性硬化症、骨髄腫、薬物中毒、天疱瘡などが適応。体内に蓄積又は産生された成分を血液中から分離除去する療法で、主にコレステロール、免疫グロブリンなどの血液中のやや大きめの成分が対象である。
血液透析・血液濾過・血液濾過透析と血漿交換との違いは、血液中から除去される物質の大きさであると理解できる。すなわち、血液透析では分子量が数千Ｄａまでの小分子量物質が除去され、また、血液濾過では分子量２〜３万Ｄａ以下の中分子量が除去されるが、血漿交換ではそれよりも分子量の大きい蛋白質や蛋白と結合して血中に存在する有害物質（抗体、炎症性サイトカイン、免疫複合体や中毒物質などの液性因子）が除去される。
（３）吸着式血液浄化療法：エンドトキシンまたはグラム陰性菌感染症による敗血症性ショック、家族性高脂血症、閉塞性動脈硬化症、巣状糸球体硬化症、透析アミロイド症などが適応。吸着剤に血液や血漿を接触させ、物理化学的現象を利用して病因(関連)物質を除去する療法である。除去対象は、エンドトキシン、ＬＤＬ、β２ミクログロブリンなどの血漿成分である。ここで用いられている吸着剤の代表的な例は活性炭である。また、エンドトキシンの活性中心であるリピドＡと結合し、その活性を中和する作用のあるポリミキシンＢを固定化してエンドトキシンを吸着するものが知られている。
（４）血球成分（白血球）除去療法：吸着式血液浄化療法の一種ではあるが、除去対象物質が血球成分であることから別に分類する。潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、皮膚疾患、免疫疾患などが適応である。血液を接触させ、物理化学的現象あるいは免疫反応を利用して病因(関連)物質である細胞、特に白血球を除去する療法である。現在用いられているものは、酢酸セルロースビーズなどによる顆粒球や単球の選択的吸着、あるいは活性化白血球や血小板を選択的に吸着する表面状態の基材など、基材の物理化学的性質を利用して選択性を実現している。
近年、上記の血球成分除去療法において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である細胞を特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めるための研究が行われている。さらに、こうした血液細胞処理の技術は再生医療における幹細胞採集・輸注領域にも応用できることから、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術にまで及ぶと考えられる。
標的物質である細胞をより選択的特異的に捕捉する目的で、特許文献１にＴリンパ球に親和性を有するペプチドまたは脂質を固定化した分離材が報告されているが、少なくとも例示されている胸腺ホルモンを固定化した際のＴリンパ球に対する結合親和性が不十分のため実用上問題がある。また、特許文献２〜特許文献５にはＣＤ４陽性細胞に親和性を有するペプチドを不織布に固定化したＣＤ４陽性細胞捕集材がそれぞれ開示されているが、例示されているような抗体の重鎖または軽鎖可変領域の相補的決定領域部分ペプチドの固定化ではＣＤ４陽性細胞に対する結合親和性が実用上不十分で利用できない。さらに特許文献６では、ＣＤ４分子に結合するキメラ抗体、１本鎖抗体、またはそれらを組み合わせた抗体を用いたＣＤ４陽性細胞分離装置が開示されているが、単核球浮遊液ではなく全血中からＣＤ４陽性細胞を再現良く除去するための方法が記載されておらず、実用上治療に用いるのは極めて困難である。特許文献７には、腫瘍細胞の表面に発現している物質と親和性のあるリガンドを高分子化合物に化学結合で固定化した吸着材が開示されているが、例示されているリガンドの腫瘍細胞に対する特異性が不十分であり、全血中より選択的特異的に目的細胞を捕捉するための要件が開示されてもいないし実施もされていない。特許文献８には、Ｔヘルパータイプ２細胞の表面抗原と親和性を有する物質が水不溶性担体に固定化されてなる免疫系細胞吸着材料が開示されているが、吸着率が不十分であり、また全血中より選択的特異的に目的細胞を捕捉するための要件が開示されてもいないし実施もない。
ところで、血液以外の生物学的液体からの標的物質の分離の例が、非特許文献１に開示されている。まず認識分子として菌の胞子に対する1本鎖抗体の末端に、ストレプトアビジンを有する融合タンパク質を作製しておく。その後、予め、タンパク質として、抗マウス抗体が結合している磁気ビーズを用意し、この抗体のアミノ基に対してビオチンを化学結合した基材を調達する。認識分子である該1本鎖抗体―ストレプトアビジン融合タンパク質を、先の方法によって作製したビオチンを表面に有する基材と接触させることによって、基材表面に該1本鎖抗体が固定化された磁気ビーズの作製を行なっている。このようにして作製した磁気ビーズを用いて、生物学的液体からの菌の胞子の分離例が示されている。ストレプトアビジンはビオチンという低分子と結合する性質を持ち、且つ一般的に４量体を形成しやすい傾向があることが知られている。しかしながら、ビオチンとストレプトアビジンの結合様式は、あくまで非共有結合であり、実際の分離材として使うには、認識分子の溶出が懸念される。さらには、予め適当な自由度をもったスペーサーを介してビオチンを基材表面に固定化しておかないと、４量体以上の多量体を形成している該1本鎖抗体―ストレプトアビジン融合タンパク質中の、ビオチン結合部位と基材表面に導入されたビオチンとの結合が成立せず、煩雑な工程を必要とする上、標的物質の基材表面への安定な固定化という観点では、実用上十分ではない。
非特許文献１では、ビオチンを介して認識分子を固定化させる基材として、抗マウスヒツジ抗体が結合された磁気ビーズの市販品を用いて、この磁気ビーズ表面の抗マウスヒツジ抗体のアミノ基に対して、カルボキシ基がＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたビオチンを化学結合して用いている。該文献中では、ビオチンを化学結合せずに、該認識分子を物理的な吸着のみによって固定化した場合の実験データも示されており、菌の胞子の分離能はビオチンを介した固定よりも格段に劣ることが記載されている。更にこの場合、洗浄により容易に脱離することが示されている。上記で用いられている磁気ビーズは、既に抗マウスヒツジ抗体が表面に固定化されている。このため本明細書と同様に認識分子を共有結合で固定化するためには、固定化のための活性基を該ビーズ表面に再導入しなければならない。例えば表面に既に存在している抗マウスヒツジ抗体由来の、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化することや、該抗体由来の水酸基をエピクロルヒドリン(クロロメチルオキシラン)で活性化することであるが、これは極めて困難かつ非効率であり、仮に活性基を少量導入できたとしても、その後の該認識分子の固定化は物理的な吸着が大きな割合を占めると考えられる。その結果として上記と同様に、菌の胞子の分離能はビオチンを介した固定よりも格段に劣ることが予想される。更に、固定化される該認識分子側のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化することや、カルボジイミドなどを用いて該認識分子と、既に抗マウスヒツジ抗体が表面に固定化されている磁気ビーズ上の抗マウスヒツジ抗体由来のアミノ基とを、共有結合せしめることも可能であるが、この場合認識分子同士の、分子内、あるいは分子間の架橋を起こすため、効率的ではない。
また、当業者であれば、認識分子中のリガンド部位を、固定化状態で有効に使うことを発想するため、４分子以上の認識分子が該会合ドメイン同士が会合することにより会合体構造を形成している分子を、部位非特異的に共有結合で固定化することは、リガンド部位の共有結合による活性失活を懸念し、非効率的であると予想すると考えられる。つまり、本明細書中に例示した認識分子の分子形態を、共有結合で基材表面に固定化して細胞や物質の分離性能を上げるという発想を、当業者がすることは、極めて困難である。
また、上述のような1本鎖抗体の末端にストレプトアビジンを有する融合タンパク質は放射線ガン治療のターゲッティング分子として公知（特許文献９、１０並びに非特許文献２、３）である。これらの使用方法は基本的に該融合タンパク質を体内に投与し、ガンの部位に集積させた後、放射性物質で標識したビオチン誘導体を投与することによって、ガンの効果的治療を目指すものであり、該融合タンパク質を基材表面に固定化して、標的物質を分離することを示した例や、示唆する記載も見当たらず、本発明とは技術思想を異にする。さらに、上述のような1本鎖抗体の末端にストレプトアビジンを有する融合タンパク質が、４価または多価の多量体を形成するため、ターゲット分子に対する結合親和性(アフィニティー)が、単量体の1本鎖抗体と比べて高くなることが報告（非特許文献４、５）されている。しかしながら、何れの報告においても、該1本鎖抗体の末端にストレプトアビジンを有する融合タンパク質が、固定化されていない状態での親和性を議論しているのみであり、該融合タンパク質を基材表面に固定化して、標的物質を分離することを示した例や、示唆する記載も見当たらず、本発明とは技術思想を異にする。
また、特許文献１１には、本明細書中に開示されている４分子以上の認識分子が会合体構造を形成した場合と類似した構造の分子が記載されているが、人体に投与した場合の、疾患の治療や診断に使用されるものであり、本発明のように認識分子を固定化した状態での標的物質の分離を目的としたものではなく、こちらも技術思想が異なる。
非特許文献６には、リステリア菌に対する１本鎖抗体の末端にビオチンを導入したものを、ストレプトアビジンが結合した磁気ビーズに固定化し、該磁気ビーズを利用して、リステリア菌を分離する方法が開示されている。こちらは、当業者が容易に発想しうるリガンド部位の基材表面への配向固定化の方法の一つであるが、夾雑物を含まない実験系であるにもかかわらず、リステリア菌、すなわち標的物質の分離効率が不十分で、実用は難しいという問題点が存在する。
標的物質に対して特異的結合親和性を有する認識分子としては、抗体、キメラ抗体、1本鎖抗体、F(ab')2、Fab、Fab'、ペプチド、核酸、糖鎖、低分子化合物などが知られている。一般に抗体は結合親和性が高く基材に固定化しても結合活性を保持しやすい一方で、製造コストが高く実用上課題がある。一方、抗体を遺伝子工学的に低分子化した、1本鎖抗体などに代表される、抗体の誘導体は、製造コストが抗体に比べ安価であるというメリットはある。これらは基材表面に固定化した状態で実用上十分な結合活性を保持させるのが難しい。
このように血液に代表される生化学的液体中の標的物質、特に全血中より直接細胞を特異的に捕捉することが期待されているが、実用上利用可能な技術として確立されていない。
特開平3-32680号公報 特開平6-154316号公報 特開平6-154317号公報 特開平6-218051号公報 特開平6-269663号公報 特開平11-332594号公報 特開2000-217909号公報 特開2003-52817号公報 特表2003-501096号公報 国際特許公開番号WO00075333号公報 国際特許公開番号WO2006107617号公報 Applied and Environmental Microbiology July 1998, P2497-2502 Blood 2004 104 P227-236 Clinical Cancer Research 2000 vol.6 P406-414 Protein Engineering 1996 vol.9(2) P203-211 Human Antibodies Hybridomas 1995 6(3) P93-101 Foodborne Pathogens and Disease 2007 4(1) P74-83
血球成分除去療法のみならず、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である細胞をより選択的特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めることが期待されているにもかかわらず、血液中の標的物質である細胞を、特に全血中より直接、特異的に捕捉する技術が、実用上利用可能な技術として確立されていない問題がある。また、血液以外の生物学的液体からの標的物質の分離においても、基材表面に予めビオチンを固定しておいてから、標的分子をビオチン-ストレプトアビジンの親和性を使用して非共有結合により固定化するといった、煩雑でコストがかかる操作を必要とするという問題や、標的物質を認識できるように有効な形で、リガンド部分を固定化させることが困難であるという問題点が存在する。
本発明が解決しようとする課題は、標的物質である細胞等を全血中より直接、特異的に捕捉するための、実用上利用可能な血液処理用基材、ならびに、生物学的液体から標的物質を直接分離が可能な、コスト的に安価で産業上利用できる生物学的液体処理用基材を提供することである。本発明が解決しようとする別の課題は、これらの基材を用いたデバイス及び分離方法を提供することである。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。まず、抗体を遺伝子工学的に低分子化した誘導体を認識分子として、基材表面に対して多量に仕込んで固定化すると、固定化状態でも結合活性を発揮しえるという当該領域研究者が容易に発想し得る結果を深く考察した。前記の結果は、基材表面に固定化されている認識分子の大部分が固定化状態で結合活性を保持していない形で固定化されていることが示唆される。
このため本発明者らは、該認識分子中の標的物質と選択的に結合するリガンド部分に基材表面に固定化するためのドメインを付加して、この会合ドメインを介して標的分子を基材表面に固定化するという配向固定化を試みた。その結果、実際には会合ドメインを基材側に配向化させて固定化するよりも、該ドメインが自己会合する性質をもち、認識分子が会合体をつくった状態のものを、ビオチン-ストレプトアビジンなどの非共有結合を極力含まない形で、共有結合により基材表面に固定化した場合に、顕著に標的分子に対する結合活性が維持されるという当初の配向固定化の仮説からは全く予測し得ない、驚くべき結果を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子が共有結合により基材表面に固定化された生物学的液体処理用基材であって、該認識分子が、標的物質と選択的に結合するリガンド部分および会合ドメインを含む直鎖状の分子であり、少なくとも４分子以上の認識分子が、該会合ドメイン同士が会合することにより会合体構造を形成していることを特徴とする、上記の生物学的液体処理用基材。
（２） 該認識分子が１本鎖のポリペプチドであって、該認識分子を構成するリガンド部分をコードする核酸と会合ドメインをコードする核酸とが連結している核酸を発現させることによって得られるポリペプチドであることを特徴とする、（１）に記載の生物学的液体処理用基材。
（３） 該認識分子を構成するリガンド部分をコードする核酸と会合ドメインをコードする核酸とが、スペーサーをコードする核酸を介して連結している核酸を発現させることによって得られるポリペプチドであり、該スペーサーが、０から１００アミノ酸から構成されるペプチド性スペーサーであることを特徴とする、（２）に記載の基材。
（４） 該リガンド部分をコードする核酸から翻訳されるポリペプチドが分子量100kD以下であることを特徴とする、（２）または（３）に記載の生物学的液体処理用基材。
（５） 該会合ドメインをコードする核酸から翻訳されるポリペプチドが分子量50kD以下であることを特徴とする、（２）から（４）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
（６） 該リガンド部分をコードする核酸から翻訳されるポリペプチドが、１本鎖抗体であることを特徴とする、（２）から（５）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
（７） 該会合ドメインが、ストレプトアビジンまたはアビジンの各々の全長または１部分をコードする核酸から翻訳されたポリペプチド領域であり、４個の該ポリペプチド領域が自発的に会合し、４個のリガンド部分が１会合体中に含まれていることを特徴とする、（２）から（６）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
（８） 該リガンド部分を構成するポリペプチドの分子量と、該会合ドメインを構成するポリペプチドの分子量の比が、１：１０〜２０：１の範囲であることを特徴とする（２）から（７）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
（９） 標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子をコードする核酸をポリペプチドに翻訳し、上記の翻訳過程中に不溶化した該認識分子ポリペプチドを塩酸グアニジンまたは尿素を含有する水溶液で変性可溶化し、次いで、塩酸グアニジンまたは尿素を除去することによって該認識分子ポリペプチドの立体構造を再生することによって製造される、（２）から（８）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
（１０） 水不溶性基材の表面に、標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子との共有結合を形成せしめるための活性基を導入し、次いで、水不溶性基材と認識分子を含む水溶液とを温度０〜５０℃において１０秒以上接触させることによって該認識分子を共有結合により基材表面に固定化することによって製造される、（２）から（９）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
（１１） （ｉ）生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子をコードする核酸をポリペプチドに翻訳する工程、（ｉｉ）上記の翻訳の過程中に不溶化した該認識分子ポリペプチドを、塩酸グアニジンまたは尿素を含有する水溶液で変性可溶化する工程、及び（ｉｉｉ）上記の工程（ｉｉ）の後に、塩酸グアニジンまたは尿素を除去することによって該認識分子ポリペプチドの立体構造を再生する工程を含む、（２）から（１０）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材の製造方法。
（１２） （ｉ）水不溶性の基材表面に、生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子との共有結合を形成せしめるための活性基を導入する工程、及び（ｉｉ）水不溶性基材と認識分子を含む水溶液とを温度０〜５０℃において１０秒以上接触させることによって該認識分子を共有結合により基材表面に固定化する工程を含む、（２）から（１０）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材の製造方法。
（１３） （１）から（１０）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した生物学的液体処理用デバイス。
（１４） 疾患の治療のために使用される、（１３）に記載の生物学的液体処理用デバイス。
（１５） （１）から（１０）の何れかに記載の生物学的液体処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填する工程を含む、（１３）又は（１４）に記載の生物学的液体処理用デバイスの製造方法。
（１６） （１３）又は（１４）に記載の生物学的液体処理用デバイスに、標的物質を含有する水溶液を通液する工程を含む、生物学的液体の処理方法。
（１７） （１３）又は（１４）に記載の生物学的液体処理用デバイスに、標的物質を含有する血液を通液する工程を含む、血液の処理方法。
本発明で用いられる「標的物質」とは、血液に代表される生物学的液体に含まれる生物由来の物質、細胞、組織などのうち、除去対象となる特定の生物由来物のことを意味しており、生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの物質である。標的物質は血液そのものに含まれる場合の他、血液由来の夾雑物が多く含まれる液体中に含まれる場合もある。
標的物質のうち生体関連物質とは、生体が産生するタンパク質、核酸、脂質、糖質や低分子化学物質などをいう。さらには人工物であっても生体に著しい影響を及ぼす内分泌撹乱物質なども本発明でいう生体関連物質に含まれる。生体関連物質の中には、有害物質も含まれる。有害物質とは、例えば、ＬＤＬ、β２ミクログロブリン、薬物、ビリルビン、胆汁酸、アミノ酸、クレアチニン、エンドトキシン、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体、ＩｇＧ、抗カルジオリピン抗体、抗ＤＮＡ抗体、免疫複合体、昏睡物質、リウマチ因子などの血漿成分である。異常プリオンなども含まれる。また、炎症性サイトカインをはじめとする各種メディエータも病態によっては有害物質となる。炎症性サイトカインとして、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ／ＳＩＳサイトカインファミリーなどが知られている。また炎症に関わるメディエータとしては、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなど生体内でアラキドン酸から生成される物質や、血小板活性化因子、ヒスタミン、ブラジキニンや補体因子であるC5aなどがある。
細菌としては、その種類は特に限定されず任意の細菌を挙げることができる。例えば、多くの細菌はその大きさは0.5-4μm程度で，形状としては球菌，桿菌，らせん状のもがある。細胞の細胞の最外層には固い細胞壁があり、その内側に薄い細胞膜がある。また、莢膜，鞭毛，線毛などをもつ細菌や環境の変化によって芽胞を形成するものがある。細菌はその染色性の違いでグラム陽性菌とグラム陽性菌に分類することができるが、どちらにも限定されない。また細菌は独立栄養細菌と従属栄養細菌との分類、好気性菌と嫌気性菌との分類などもあるがこれらに限定されない。
古細菌は生物学上、細菌とは全く別種の微生物であるが、本明細書上は、細菌として例示する。古細菌には好熱菌、高度好塩菌、メタン生成菌などがある。
細胞としては、その種類は特に限定されず任意の細胞を挙げることができ、例えば、病因細胞を挙げることができる。病因細胞とは、腫瘍細胞やバクテリア、あるいは、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、又は単球）、血小板などの血球のうち、特定疾患の病因と推定されるものである。例えば、自己免疫疾患において細胞性免疫の亢進が懸念される場合、白血球細胞表面上に発現されている免疫グロブリンスーパーファミリー分子を指標に病因細胞を区別することが望ましい。具体的には、ＣＤ２陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ２８陽性細胞、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）陽性細胞、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）陽性細胞、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）陽性細胞、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）陽性細胞などがある。また、インテグリンファミリー分子で区別するのも有効である。例えば、ＶＬＡ−１（ＣＤ４９ａ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−２（ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−３（ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−５（ＣＤ４９ｅ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−６（ＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）陽性細胞、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）陽性細胞、ｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）陽性細胞、ｇｐIIｂ／IIIａ（ＣＤ４１／ＣＤ６１）陽性細胞、ＬＰＡＭ−１陽性細胞などであるが、これに限定されない。
細胞塊とは複数の細胞が集合した状態のもので、膵ランゲルハンス島などが例示されるがこれに限定されない。
ウイルスとしては、その種類は特に限定されず任意のウイルスを挙げることができる。例えば、多くのウイルスの大きさは20〜250nm（ナノメートル：1mmの100万分の1）である。細菌と異なる点は、ウイルスは生きた細胞に寄生（感染）しないと増えることができない点である。説明のために動物に感染する主なウイルスを例示するがこれに限定されない。パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ー帯状庖疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス、ポックスウイルス、天然痘ウイルス、種痘ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、ノロウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、A型肝炎ウイルス、アストロウイルス、トガウイルス、風疹ウイルス、フラビウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デングウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、ラブドウイルス、狂犬病ウイルス、ブニヤウイルス、ハンタウイルス、オルトミクソウイルス、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、アレナウイルス、ラッサウイルスなど。また、植物や細菌に感染するウイルスも含まれる。
ウイルス感染細胞としては、前述または任意のウイルスが感染した、細胞や細菌などを指す。感染前で、任意のウイルスが細胞表面の受容体に結合した状態のものも含まれる。ウイルス感染細胞の内部では該ウイルスの遺伝子の複製及びタンパク質の合成などをへて、新しいウイルスが産生される。また、任意のウイルス由来の核酸が宿主となる細胞のゲノムに組み込まれていて、ウイルス粒子自体を産生しない場合も、その宿主細胞はウイルス感染細胞と見なすことができる。
本発明で言う生物学的液体とは、汗、血液、リンパ液、髄液、尿、組織液、唾液、粘液、精液、分泌液、消化液などの生体が産生する液体はもとより、細胞、細菌、ウイルスの培養液やその破砕液、抽出液。臓器を機械的に破砕したものや酵素処理した臓器の消化液などをいう。これらの原液のみならず、緩衝液や有機溶剤等で希釈した場合も含まれる。
本発明で用いられる「基材」とは、常温の水溶液中で固体状態にあるものをいい、形状としては特に限定されないが、液相中の目的細胞との接触頻度を高めるために表面積が大きいものであることが好ましい。形状を例示すると、球状、立方状、平面状、平膜状、チップ状、繊維状、綿状、布状、糸状、束状、織布状または不織布状などの繊維構造体、スポンジなどの高分子多孔質体、ビーズ状、ゲル状あるいは中空糸等が挙げられる。これらのうち、細密充填のしやすさ、認識分子を均質に表面に保持しやすい点、実有効面積を比較的多く確保できる点、及び血液に代表される生物学的液体の流通面から、球状、粒状及び繊維状のものが望ましい。特に、血液中の細胞を分離または吸着する場合、吸着効率の点から織布状または不織布状が好ましく、さらには、担体の構造制御が容易であるという点から不織布状が最も好ましい。
認識分子と基材表面との間には様々な分子間力が働いており、物理的な吸着力や引力により基材表面に固定化される力を含む事が考えられる。本発明で用いられる「共有結合により」とは、認識分子と基材表面の結合において、認識分子を構成する分子の大部分は、基材表面と直接または官能基などを介して共有結合を形成している状態をいう。これにより、界面活性剤等で激しく洗浄しても容易には剥離しない固定化となる。
「認識分子を構成する分子の大部分が、共有結合により基材表面に結合している」ことを確認する方法としては、強力なタンパク質変性作用を持ち、且つタンパク質を可溶化可能な、6M Guanidine-HCl水溶液や 8M Urea水溶液を利用することができる。すなわち、固定化・洗浄後の基材表面の認識分子を、上述の強力な該変性剤によって変性・可溶化せしめることによって、基材表面に物理的な吸着など、共有結合以外の分子間力で結合している認識分子の多くを脱離することができる。ストレプトアビジンとビオチンの結合は、非共有結合性の生化学結合で最強Kd=10e-15 Mとされているが、上述の方法であればストレプトアビジンタンパクが変性して結合能を失うので効果的である。しかる後に、脱離してきた認識分子を検出・定量する（例えはSDS-PAGE解析）ことや、あるいは、上述の変性剤処理後の基材を、水でよく洗浄した後、基材自体に残存している該認識分子を、検出・定量する(例えば総タンパク量定量や元素分析)ことにより、共有結合により該認識分子が基材表面に導入されていることを確認し得る。この際、該変性剤溶液のpHは中性付近pH=4-9程度が望ましく、極端に酸性やアルカリ性にすべきではない。これは、該認識分子の加水分解反応を引き起こす危険があり、例え該認識分子が共有結合で固定化されていても、分解して脱離するためである。また該変性剤処理時に熱を加えることも可能であるが、この場合も該認識分子の分解の懸念があるため、結果の解釈には注意が必要である。さらに、フェノールなどの有機溶媒で該認識分子を変性させることは可能であるが、該認識分子が水に不溶化して擬陽性を示す可能性があるので、この場合も結果の解釈には注意が必要である。
基材の材質は、少なくとも所定量の認識分子を安定して固定できるものであれば、無機化合物、有機化合物を問わないが、様々な形状に加工でき、認識分子を直接または間接的に化学結合でき、かつ血液に代表される生物学的液体との接触時に溶出物が少ないなど、医療材料として安全に用いることができるものが好ましい。例えば、ガラス、カオリナイトまたはベントナイトなどの無機材料、セルロース等の植物由来の多糖類系化合物、デキストラン、キチン、キトサン、デンプン、アガロース、タンパク質（コラーゲンなど）または天然ゴムなどの天然ポリマー、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール等のビニル系化合物あるいはその誘導体の重合体及び共重合体、ナイロン６あるいは６６等のポリアミド系化合物、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物、またはポリアミノ酸などの合成ポリマーあるいは活性炭等が挙げられる。
不織布状基材を選択する場合、強度、加工性または安全性の点から、不織布状基材を構成する繊維は、セルロース、ポリエステルまたはポリプロピレンであることが好ましい。また、構成繊維の平均繊維直径を適宜選択することで、不織布基材の構造を制御することができる。この基材構成繊維の平均繊維直径は２．５μｍ以上５０μｍ未満であることが好ましい。なぜなら、平均繊維直径が２．５μｍ未満であると、不織布状とした際に目が細かくなる傾向があり、目的細胞以外の細胞を物理的に捕捉する非特異的細胞吸着が起こるため好ましくない。一方、５０μｍ以上の場合、不織布状とした際に目が粗くなる傾向があり、目的細胞との接触頻度が著しく低下し、従って除去効率が下がるので好ましくない。
本発明で用いられる「認識分子」とは、蛋白工学および/または分子生物学および遺伝子工学的手法を用いて作成した人工的な分子である。さらに詳細には標的物質と選択的に結合するリガンド部分と、該リガンド部分と会合ドメインとから構成される直鎖状の分子である。また、該リガンド部分と会合ドメインとの間にスペーサーを介しても良い。
本発明で用いられる「リガンド部分」とは、標的物質と選択的に結合する性質を持った部分である。抗体のF(ab')2部分、Fab部分、Fab'部分、ペプチド、遺伝子組換え蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物などから選択されるが、望ましくは、遺伝子組換え蛋白質または核酸である。人工的な分子であることから、熱安定性の優れたものを大量生産により低価格で供給できるメリットがある。こうしたリガンドは対象に対して特異的に結合することから人工抗体と呼ばれることもある。人工抗体は、通常、抗体Ｖ領域の３次構造と類似の構造分子を利用してそのループ形成部分をランダム化もしくは抗体Ｖ遺伝子のＣＤＲ３を組み込むことにより作製する。Protein Aを抗体化したAffibody（K.Nord, O.Nord, M.Uhlen, et al., Eur.J.Biochem, 268, 4269 (2001)）、GFPを抗体化した光る抗体Fluorobody（I.S.Kim, J.H.Shim, Y.T.Suh, et al., Biosci.Biotechnol.Biochem., 66, 1148 (2002)）、fibronectinのdomain 10を抗体化したMinibody（V.Batori, A.Koide, S.Koide, Protein Eng., 15, 1015 (2002)）、ペプチドミミック分子と抗体の融合分子Pepbody（E.Lunde, V.Lauvrak, I.B.Rasmussen, et al., Biochem.Soc.Trans., 30, 500 (2002)）、ラクダ抗体の構造を利用した一本鎖抗体Nanobody（A.Muruganandam, J.Tanha, S.Narang, D.Stanimirovic, The FASEB J. 16, 240 (2002)）などがある。また、核酸構造を持ったAptamerやRNAの光学異性体enatio-RNAを利用したSpiegelmer（B.Wlotzka, S.Leva, B.Eschgfaller, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 99, 8898 (2002)）などがある。
本発明でいう1本鎖抗体とは、抗体分子の抗原結合に重要な(重鎖V領域)VH部位(重鎖V領域)及びVL部位(軽鎖V領域)をlinkerと呼ばれるペプチドで繋いで1本鎖のポリペプチドとした抗体である。本明細書中ではSingle-chain Fvおよび scFvと表記したものに関しても1本鎖抗体と同様の意味で用いる。
リガンド部分の大きさは、後述する「会合ドメイン」の自己会合を阻害しないために、100kD以下の分子量のポリペプチドが望ましい。
本発明で用いられる「会合ドメイン」とは、該認識分子中でまとまった立体構造を形成している部分のなかで、「リガンド部分」以外を指し、会合ドメイン同士は２つ以上で会合体を形成する性質を持っているものである。説明のために例示すれば、アビジンやストレプトアビジンに加え、へリックス-ターン-へリックス構造で２量体を形成する人工的なペプチド配列(J Willuda et al, The Journal of Biological Chemistry, 276,14385,(2001))やp53タンパク由来の４量体を形成するドメイン配列(M Rheinnecker et al, The Journal of Immunology 157,2989,(1996))などは、本発明に好的に使用しうるがこれらに限定されない。
より好ましくは、４量体以上の会合体の形成力の観点より、アビジン、ストレプトアビジンである。この「会合ドメイン」の大きさは、該会合ドメイン同士での会合体の形成力を発揮するために1kD以上が望ましく、認識分子全体の会合体の安定性の観点から50kD以下のポリペプチドが望ましい。
本発明で用いられるスペーサーとは該認識分子中の「会合ドメイン」と「リガンド部分」とを共有結合でつなぐ直鎖状の分子であり、好ましくはペプチド性のものである。フレキシブルで、結晶のX線構造解析や、NMRによる構造解析を行なっても、明確な立体構造を決定できない部分である。このスペーサーは「会合ドメイン」と「リガンド部分」それぞれの立体構造の形成を阻害しないために１アミノ酸以上の長さが好ましい。一方スペーサーとして長すぎる場合には、タンパク質としての安定性の低下を招くため１００アミノ酸以下が望ましい。より好ましくは、３から50アミノ酸程度が好的に用いられる。また、この部分にタンパク質としての精製用のtag配列を挿入してもスペーサーとして機能しえる。例えはFLAG tag配列(DYKDDDDK),His tag配列(HHHHHH)などが挙げられるがこれに限定されない。
本発明における認識分子が「会合ドメイン」で自己会合した会合体構造を形成するためには、前述したそれぞれの部分を構成するポリペプチドの分子量や、スペーサーの長さが重要である。それに加え、効率的に会合体を形成させるには「リガンド部分」を構成するポリペプチドの分子量と、「会合ドメイン」を形成するポリペプチドの分子量の比が、１：１０〜２０：１である場合が望ましく、より好ましくは１：５〜１０：１である。
本発明で言う「標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子」における「選択的結合性」とは、抗体抗原結合に代表されるような生物学的相互作用によって、標的物質に対してのみ、高い結合親和性で結合することを言い、固定化された認識分子と標的物質との解離定数は好ましくは１μＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、さらに好ましくは１ｎＭ以下である。
本発明で言う「解離定数」とは、一般にＫDで表され、解離の度合いを表している。数字が小さいほど結合の強さが強く、結合親和性（アフィニティー）が強いという意味で当業者に一般的に用いられている指標である。認識分子に対し、様々な濃度の標的蛋白分子を十分に結合させた後、遊離している標的蛋白分子の量を定量測定することで計算することができる。定量方法はＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）による方法、分光学的方法、水晶発振子を用いる方法、Frontal Affinity Chromatography（M.Nishikata, K.Kasai, S.Ishii, J.Biochem. 82, 1475 (1977)）による方法、ＲＩ標識した標的蛋白分子を用いる方法、表面プラズモン共鳴現象を利用した方法などがある。このうち、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサでは、金薄膜を蒸着したガラス表面を処理してセンサチップとし、そこに認識分子を固定化した後、標的蛋白分子溶液を流して認識分子と標的蛋白分子を接触させる。接触の前後で一定の波長の光を金薄膜にあておき反射光の時間変化を観測する。反射光は表面プラズモン共鳴現象によって金薄膜近傍の物質の密度の影響をうけるため、表面密度の変化からリアルタイムの結合量変化がわかり、結合速度定数、解離速度定数が求まることから解離定数を容易に知ることができる。
本発明での認識分子の変性可溶化状態からの巻き戻し方法は、特に限定されるものではないが、認識分子を可溶性化する変性剤として、グアニジン塩酸塩や、尿素などを用いることができる。タンパク質や核酸分子の立体構造を再生することを一般に巻き戻し（refolding）といい、この巻き戻しのために、変性可溶化した認識分子を、変性剤を含まない緩衝液で急激に希釈する方法や、透析によって段階的に変性剤濃度を下げていく方法などは好的に使用される。また、ある一定のグアニジン塩酸塩濃度において、タンパク質中のジスルフィド結合の形成を促進するために、酸化剤を投入することや、立体構造再生中のタンパク質中の凝集を抑制するためのL-アルギニンに代表される凝集抑制剤を添加する方法が、特開2000-93172号に開示されているが、これらの方法も非常に好適に本発明に使用できる。
基材表面への認識分子の固定においては、基材表面に認識分子を直接結合していてもよいし、または活性基を介して結合していてもよい。公知のいずれの反応も用いることができ、例えば、置換反応、付加反応、縮合反応、重合反応または開環反応等が挙げられる。
基材表面に活性基を介して認識分子を共有結合する場合、認識分子と基材とを共有結合できる構造であれば、該活性基は公知のいずれの官能基であってもよい。活性基としては、例えば、Ｎ-ヒドロキシメチルハロアセトアミドもしくはＮ-ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα-アセトアミノハロゲン基、Ｎ-ヒドロキシメチルジハロプロピオンアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα，β-プロピオンアミノハロゲン基、Ｎ-ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα，α-アセトアミノジハロゲン基、またはＮ-ヒドロキシメチルトリハロアセトアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα，α，α-アセトアミノトリハロゲン基等のハロアセトアミノアルカン化剤を用いて基材表面を活性化することによって得られる活性基、あるいはエピクロロヒドリン等を用いて基材表面の水酸基やアミノ基などの官能基を活性化することによって得られるエポキシ基等が挙げられる。またその他の好適な活性基としては、例えば、カルボキシ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ビニル基、マレイミド基、トシル基、トレシル基またはブロモシアンによる活性基等も挙げられるがこれらに限定されない。認識分子の機能を維持したまま穏和な条件で反応できる点から、ハロアセトアミノアルカン化剤を用いて基材表面を活性化することによって得られる活性基や、エポキシ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基が好ましい。
更に基材表面に活性基を導入する方法として、グラフト重合法や、プラズマ処理、コロナ処理、化学処理やガスへの暴露によって基材表面に官能基や活性基を導入することも好適である。敢えて例示するならば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどにγ線を照射し、酸素を遮断した状態でグリシジルメタクリレートなどのビニル系のモノマー溶液に浸漬することによって容易に固定化に使用できる活性基や官能基が導入された基材を作製可能である。これらのグラフト鎖は、単独のモノマーを用いても良いし、複数のモノマーの混合による共重合体であってもかまわない。もちろんグラフト重合によって水酸基やカルボキシル基、アミノ基などを導入し、更に上述のような方法によって活性化して活性基としても良い。プラズマやコロナ処理では様々なタイプの官能基を基材表面に導入できることが知られているが、敢えて例示するならば、酸素存在下でポリエチレンテレフタレート基材表面に水酸基やカルボキシル基を導入可能であり、これらの表面改質も本発明に応用できる。また、光反応性のアゾ基やジアゾ基を基材表面に導入し、認識分子存在下、光や放射線を照射することによって認識分子を固定化することも可能である。
また、上記のような活性基を含有する重合体を予め重合し、基材表面に適当な溶媒を用いて塗布し、乾燥することによって、基材表面に活性基を導入することも可能である。
上記の通り、本発明の生物学的液体処理用基材は、（ｉ）生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子をコードする核酸をポリペプチドに翻訳する工程、（ｉｉ）上記の翻訳の過程中に不溶化した該認識分子ポリペプチドを、塩酸グアニジンまたは尿素を含有する水溶液で変性可溶化する工程、及び（ｉｉｉ）上記の工程（ｉｉ）の後に、塩酸グアニジンまたは尿素を除去することによって該認識分子ポリペプチドの立体構造を再生する工程によって認識分子を調製し、これを基材の表面に結合することによって製造することができる。また、本発明の生物学的液体処理用基材は、（ｉ）水不溶性の基材表面に、生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子との共有結合を形成せしめるための活性基を導入する工程、及び（ｉｉ）水不溶性基材と認識分子を含む水溶液とを温度０〜５０℃において１０秒以上接触させることによって該認識分子を共有結合により基材表面に固定化する工程によって製造することができる。このような本発明の生物学的液体処理用基材の製造方法も本発明の範囲内に含まれる。
上記にようにして作製することができる本発明による生物学的液体処理用基材は、入口と出口を有する容器に充填されることによって、生物学的液体処理用デバイスを構築することができる。ここで用いる入口と出口を有する容器は、生物学的液体処理用基材を収納できるものであれば特に限定されず、例えば、カラムやチューブなどを用いることができる。上記した生物学的液体処理用デバイスも本発明の範囲内に含まれる。
上記した生物学的液体処理用デバイスは、生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質が関与する疾患の治療のために使用することができる。標的物質が関与する疾患としては、（１）急性腎不全、慢性腎不全など、（２）劇症肝炎、急性肝不全、閉塞性動脈硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性硬化症、骨髄腫、薬物中毒、天疱瘡など、（３）血症性ショック、家族性高脂血症、閉塞性動脈硬化症、巣状糸球体硬化症、透析アミロイド症など、並びに（４）潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、皮膚疾患、免疫疾患などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
上記した生物学的液体処理用デバイスに、標的物質を含有する水溶液又は標的物質を含有する血液を通液することによって、上記水溶液又は血液を処理することにより、上記水溶液又は血液中の標的物質を吸着または除去することができる。このような生物学的液体の処理方法及び血液の処理方法も本発明の範囲内に含まれる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
一例として、標的物質をヒト末梢血中のCD4陽性細胞とし、認識分子中のリガンド部位を既知のモノクローナル抗体Leu3aの配列より作製した1本鎖抗体とし、会合ドメインとしてストレプトアビジンを用いた場合で例示する。
実施例１：Leu3a scFv-SA体の作製
(Leu3a 1本鎖抗体の遺伝子の作製)
抗ヒトCD4マウスモノクローナル抗体であるLeu3aの核酸配列は、VH部位Genbank Accesion No. M97867.1および VL部位Genbank Accesion No. M61046.1が公開されている。これらの配列を1本鎖抗体化するためにlinkerとなる１５アミノ酸の配列（配列表の配列番号１）をコードする核酸で繋いだものを設計しVL-linker-VHの順番になるように完全合成により作製した。この際VL部位の直前に開始コドンを含むようにNco I サイトを付加し、VH部位の末端にはNot I サイトを付加した。これらの核酸はpUC57ベクターにサブクローニングした。
上記の核酸配列の完全合成およびサブクローニングは米国GenScript社が提供する合成受託サービスを利用した、この核酸の配列を配列表の配列番号２にアミノ酸3文字表記と共に示し、配列表の配列番号３にアミノ酸配列のみ示す。
(ストレプトアビジンコア遺伝子の作製)
ストレプトアビジンの核酸配列は、Genbank Accesion No. X03591として公開されている。この配列のうち、成熟型ストレプトアビジンタンパク質のN末端より１３アミノ酸残基から１３９アミノ酸残基に相当するストレプトアビジンコア遺伝子の配列を抽出し、アミノ酸配列を変更せずに、大腸菌で多く発現するようにコドンの最適化を行なった。しかる後に、Xho Iサイトを5'末端側に付加し、3'末端側にsal IサイトとHis tag（配列表の配列番号４）ストップコドンとHind IIIサイトの付加を行なった形のものをデザインし、完全合成により作製した。これらの核酸はpUC57ベクターにサブクローニングした。上記の核酸配列の完全合成および、大腸菌発現でのコドンの最適化、サブクローニングは米国GenScript社が提供する合成受託サービスを利用した、この核酸の配列を配列表の配列番号５にアミノ酸3文字表記と共に示し、配列表の配列番号６にアミノ酸配列のみ示す。なお、本明細書中において、この配列由来のストレプトアビジンタンパク質のことをSAと略記する。
(スペーサー部位の作製)
Not Iサイト由来の３アミノ酸(AAA：アミノ酸一文字表記)および、FLAG tag(配列表の配列番号７)由来の8アミノ酸、Xho Iサイト由来の２アミノ酸(SS：アミノ酸一文字表記)により、スペーサーは１３アミノ酸で構成されている。これも同様にして合成しサブクローニングした。この核酸の配列を配列表の配列番号8にアミノ酸3文字表記と共に示し、配列表の配列番号9にアミノ酸配列のみ示す。
(大腸菌発現ベクターの改変)
pET24d(+)プラスミド(NOVAGEN社)は、予めマルチクローニングサイト中の制限酵素Not Iサイトから制限酵素Bpu1102Iサイト間の除去を行なった。制限酵素Not Iおよび制限酵素Bpu1102I(TAKARA社)を用いてpET24d(+)プラスミドを消化し、Klenow Fragment (New England Biolabs社)とdNTP mixture(TAKARA社)を用いて添付のプロトコールに従い平滑末端化した。これを１％のアガロースゲル電気泳動しEtBr染色後、このDNA断片を切り出し抽出後、自己環化したのち、大腸菌DH5株(TOYOBO)に形質転換することにより取得した。アガロースゲルからのDNA断片の抽出にはQIAGEN社のキットをもちい、ライゲーションはTAKARA社のライゲーションキットVer.2を用いた。
（発現ベクターの構築）
上記の改変したpET24d(+)プラスミドを、制限酵素Nco Iおよび制限酵素Hind III(TAKARA社)を用いて消化し、ベクター側のDNA断片を同様にして精製した。Leu3a 1本鎖抗体をコードする核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Nco Iおよび制限酵素Not I(TAKARA社)を用いて消化し、Leu3a 1本鎖抗体をコードする核酸断片を同様にして精製した。スペーサー部位をコードする核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Not Iおよび制限酵素Xho I(TAKARA社)を用いて消化し、スペーサー部位をコードする核酸断片を同様にして精製した。ストレプトアビジンコア遺伝子をコードする核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Xho Iおよび制限酵素Hind III(TAKARA社)を用いて消化し、ストレプトアビジンコア遺伝子をコードする核酸断片を同様にして精製した。
以上のように精製したそれぞれのDNA断片をTAKARA社のライゲーションキットVer.2を用いて環状にライゲーションし、大腸菌DH5株(TOYOBO)に形質転換することにより、Leu3a scFv-SAタンパク質を発現する、発現ベクターを取得した。
上記の発現ベクターを用いて産生されるLeu3a scFv-SAタンパク質は「リガンド部位」としてLeu3a scFv(約30kD)を含み、スペーサー部位として１３アミノ酸(約2kD)、自己会合する性質を持つ「会合ドメイン」としてSA(約16kD)で構成されている。「リガンド部分」を構成するポリペプチドの分子量と、「会合ドメイン」を形成するポリペプチドの分子量の比はこの場合1.9:1である。
実施例２：発現、グアニジン塩酸塩変性条件での回収
実施例１において構築した発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)株(NOVAGEN社)に説明書にしたがって形質転換した。これを34μg/mlのカナマイシンと1%のグリセリンが入った2×YT培地(1.6%バクトトリプトン、1%バクトイーストラクト、0.5%NaCl)にて37℃で培養し、600nmにおける吸光度ODが0.7-0.8に達したところで培養を止め、final 15%のグリセリンでグリセロールストックとし-80℃保存した。この保存したグリセロールストック1mlと34μg/mlのカナマイシンと1%のグリセリンが入った2×YT培地 300mlを混合し、37℃で培養した。600nmにおける吸光度ODが0.7-0.8に達したところで、終濃度1mMのIPTG(TAKARA社)を添加し、更に37℃で4時間培養した。この大腸菌培養懸濁液を500mlの遠沈管に写し、4,000rpm 15分間遠心分離し、菌体ペレットを回収した。この菌体をSonication Buffer(20mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl)30mlに懸濁し、超音波破砕機Ultra sonic processor VP-60(TAITEC社)で氷冷下、出力5, 50% duty Cycle, 5分間超音波をかけ、菌体を破砕した。これを、30mlの遠沈管に写し、10,000rpm 15分間遠心分離し、上清を捨てて、封入体を形成した不溶性のタンパク質画分を取得した。
これを、溶解buffer(A)(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 6M Guanidine-HCl)30ml で突き崩しながら懸濁し、そのまま室温で一晩放置した。翌日10,000rpm 15分間遠心分離し、上清を回収し、グアニジン塩酸塩変性下で可溶化したLeu3a scFv-SAタンパク質の粗精製物を得た。これを先の溶解buffer70mlで希釈し、予め溶解buffer(A)で平衡化したTALONゲル（ベックトンディッキンソン社：以下BD社と表記）体積5ml分と室温で2hr接触させLeu3a scFv-SAタンパク質を吸着させた。ディスポカラム(BD社)に移してTALONゲルのカラムとし、25mlの溶解Buffer(A)で洗浄した。このカラムを25mlの溶出Buffer(B)(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 6M Guanidine-HCl, 150mM imidazole) 25mlで溶出した。ここにfinal 15mMの2メルカプトエタノールを添加し室温で1hr放置後、0.22μmのフィルターを通して、グアニジン塩酸塩変性下で可溶化したLeu3a scFv-SAタンパク質の精製物を得た。
(グアニジン塩酸塩段階希釈透析での巻き戻し精製)
上記のグアニジン塩酸塩変性下で可溶化したLeu3a scFv-SAタンパク質の精製物液約30mlをSlide-A-Lyzer(分画分子量10kD:PIERCE社)を用いて、1段目のグアニジン塩酸塩段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 2M Guanidine-HCl) 1L、4℃で一晩透析した。次に2段目のグアニジン塩酸塩段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 1M Guanidine-HCl, 400mM L-Arginine, 375μM酸化型グルタチオン ) 1L、4℃で24時間透析した。しかる後に、Leu3a scFv-SAタンパク質の立体構造再生後の沈殿形成を防ぐため、上記の段階希釈透析中のLeu3a scFv-SAタンパク質の精製物5mlを抜き出し、3段目のグアニジン塩酸塩段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 0.5M Guanidine-HCl, 400mM L-Arginine) 25mlを用いて希釈した。この合計30mlとなったLeu3a scFv-SAタンパク質溶液を、再度Slide-A-Lyzer(分画分子量10kD:PIECE社)の透析カセット内に入れ、3段目のグアニジン塩酸塩段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 0.5M Guanidine-HCl, 400mM L-Arginine) 1L、4℃で一晩透析した。その後、リン酸緩衝生理的食塩水（ダルベッコPBS(-)溶液：ニッスイ社：以下単にPBS(-)と表記）1L、4℃で8-12hr透析することを繰り返した。途中でわずかに形成された再沈殿物は、遠心分離及び、フィルターろ過で除去し、Leu3a scFv-SAタンパク質の巻き戻し精製品を得た（これを以下Leu3a scFv-SA-guanidineと表記する）。上記の方法で精製したLeu3a scFv-SA-guanidineの生産量は大腸菌培養液1Lあたり99mgであった。
実施例３：Urea段階希釈透析での巻き戻し精製
実施例２の前半と同様にして精製した、グアニジン塩酸塩変性下で可溶化したLeu3a scFv-SAタンパク質の精製物液約30mlをSlide-A-Lyzer(分画分子量10kD:PIERCE社)を用いて、Urea段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 4M Urea) 1L、室温で一晩透析した。次に2段目のUrea段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 2M Urea, 400mM L-Arginine, 375μM酸化型グルタチオン ) 1L、室温で24時間透析した。しかる後に、Leu3a scFv-SAタンパク質の立体構造再生後の沈殿形成を防ぐため、上記の段階希釈透析中のLeu3a scFv-SAタンパク質の精製物5mlを抜き出し、3段目のUrea段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 1M Urea, 400mM L-Arginine) 25mlを用いて希釈した。この合計30mlとなったLeu3a scFv-SAタンパク質溶液を、再度Slide-A-Lyzer(分画分子量10kD:PIERCE社)の透析カセット内に入れ、3段目のUrea段階希釈透析外液(50mM Tris-HCl pH=8.0, 300mM NaCl, 1M Urea, 400mM L-Arginine) 1L、室温で一晩透析した。その後、リン酸緩衝生理的食塩水（ダルベッコPBS(-)溶液：ニッスイ社：以下単にPBS(-)と表記）1L、4℃で8-12hr透析することを繰り返した。途中でわずかに形成された再沈殿物は、遠心分離及び、フィルターろ過で除去し、Leu3a scFv-SAタンパク質の巻き戻し精製品を得た（これを以下Leu3a scFv-SA-Ureaと表記する）。上記の方法で精製したLeu3a scFv-SA-Ureaの生産量は大腸菌培養液1Lあたり102mgであった。
比較例１：
比較対照のため、実施例１および２のLeu3a scFv-SAのSA部分を削除して自発的に会合体を形成しない1本鎖抗体遺伝子を以下のようにして構築した。以下Leu3a scFv-Normal遺伝子と表記し、これから発現されるタンパク質をLeu3a scFv-Normalと表記する。
(スペーサー部位を含むC末端部位の改変)
Not Iサイトおよび、FLAG tag(配列表の配列番号７)由来の8アミノ酸、c-myc epitope tag（配列表の配列番号１０）由来の１０アミノ酸を含み、His tag（配列表の配列番号４）、Xho I, Sal I ストップコドンとHind IIIサイトなどを導入した人工的な遺伝子をデザインし、実施例１と同様にして合成しサブクローニングした。
この核酸の配列を配列表の配列番号１１にアミノ酸3文字表記と共に示し、配列表の配列番号１２にアミノ酸配列のみ示す。
（発現ベクターの構築）
実施例１の改変したpET24d(+)プラスミドを、制限酵素Nco Iおよび制限酵素Hind III(TAKARA社)を用いて消化し、ベクター側のDNA断片を同様にして精製した。実施例１と同様にLeu3a 1本鎖抗体をコードする核酸(Leu3a scFv-Normal)がサブクローニングされたベクターは制限酵素Nco Iおよび制限酵素Not I(TAKARA社)を用いて消化し、Leu3a 1本鎖抗体をコードする核酸断片を同様にして精製した。上記で示したスペーサー部位を含むC末端部位を改変を行なう核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Not Iおよび制限酵素Hind III(TAKARA社)を用いて消化し、スペーサー部位を含むC末端部位を改変を行なう核酸断片を同様にして精製した。以上のように精製したそれぞれのDNA断片をTAKARA社のライゲーションキットVer.2を用いて環状にライゲーションし、大腸菌DH5株(TOYOBO)に形質転換することにより、Leu3a scFv-Normalタンパク質を発現する、発現ベクターを取得した。
上記の発現ベクターを用いて産生されるLeu3a scFv-Normalタンパク質は「リガンド部位」としてLeu3a scFv(約30kD)を含み、スペーサー部位を含むC末端改変部位は３９アミノ酸(約5kD)で構成されており、会合ドメインを含まない。
上記により作製した発現ベクターを実施例２と同様にして、(発現、グアニジン塩酸塩変性条件での回収)及び(グアニジン塩酸塩段階希釈透析での巻き戻し精製)した。このようにして取得したLeu3a scFv-Normalの生産量は大腸菌培養液1Lあたり83mgであった。
実施例４：
(GPC解析)
実施例２、３及び比較例１において作製した、Leu3a scFv-SA-guanidine、Leu3a scFv-SA-Urea、及びLeu3a scFv-Normalの会合体形成状況を把握するため、ゲルろ過解析(GPC解析)を行なった。すなわち、各サンプルを100μg/mlのPBS(-)溶液とし、これをゲルろ過カラム(TOSOH社 G4000PWXL) に30μlアプライした。Running緩衝液はPBS(-)で、流速0.8ml/min, 225nmの吸収により同定した。スタンダードはGel Filtration standard(BIORAD社製)を用いた。ピークトップの溶出時間を元に、会合体の分子量を計算した。結果を表１に示す。
Figure 0005096332
比較例１のLeu3a scFv-Normalと比較して、Leu3a scFv-SA-guanidine（実施例２）及びLeu3a scFv-SA-Urea（実施例３）は,分子サイズが大きく、少なくとも４分子以上(4-8分子)が会合していると考えられる。
(SDS-PAGE解析)
Leu3a scFv-SA-guanidine（実施例２）のSDS-PAGE解析を行なった。すなわち、所定量2-3μg(0.04-0.07nmol)分のLeu3a scFv-SA-guanidineに対して、大過剰量（5nmol）のD-biotin(+) (SIGMA社)を添加し、SDS-PAGE(２メルカプトエタノールを含む)用のサンプルBufferと混合した後、99℃で５分間熱処理した。上記と同様にして、biotinを添加していないものや、熱処理を加えず、室温で放置したものも用意した。これらを、4-20%のポリアクリルアミドゲル(第一化学社)でSDS-PAGEし、固定化後、CBB R-250色素で染色した。この結果を図１に示した。
ストレプトアビジン（SA）は4量体を形成し易く、Biotin存在下ではその会合は更に強固となり、熱処理しても４量体の会合体を維持する(Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.92, p3180-3184, 1995)ことが知られており、上記のような条件でSDS-PAGE解析すると、SAの部分で4量体を形成しているか否かを解析することができる。
図１の結果のように、Leu3a scFv-SA-guanidine中の一部の会合体は、biotin存在下で熱処理しても、強固な４量体を形成している。このため４本以上の認識分子が、該会合ドメイン（本実施例の場合にはSA）で自己会合した会合体構造の内でも、４量体構造が特に安定なことが判る。また、biotin非存在下でも、熱処理しない場合には、SDSという強力な界面活性剤存在下にも関わらず、一部は4量体構造を形成しておりbiotin非存在下でも、４量体構造が安定なことが判る。
Leu3a scFv-SA-Urea（実施例３）及び、Leu3a scFv-Normal (比較例１)を上記と同様にして解析したところ、SDSという強力な界面活性剤存在下においては、単量体のバンドのみ観察された。
以上のようにGPC解析とSDS-PAGE解析の結果より示される、各認識分子の会合形成状況を表２に示す。
Figure 0005096332
実施例５：
（GMAのグラフト不織布の作製）
ポリプロピレン（以下PPと表記）からなる不織布P080HW-00F（東燃TAPYRUS社製、平均繊維直径３．５μｍ）を19cm×12cmに切断し、脱気後、窒素置換してシールした。これに200kGyのガンマ線を照射することによって、基材表面にラジカルを発生させたPP不織布を得た。これを４枚重ねて、十分に窒素置換して酸素を除去した容器内に移し、Glycidyl Methacrylate (以下GMAとGMA表記)の10v/v%メタノール溶液400mlに40℃で浸漬した。25分グラフト反応後、不織布を取り出し、多量のメタノールで洗浄することによって未反応のGMAを除去した後、減圧乾燥することによりGMAグラフトPP不織布を得た。グラフト率の算出は次式により定義される。
（グラフト後不織布重量 − グラフト前不織布重量）/ グラフト前不織布重量
この時のグラフト率は89.1％であった。GMAグラフト不織布は活性基としてグリシジル基（エポキシ基）を多量に持っており、タンパク質中のアミノ基と反応して共有結合により、認識物質を固定化することができる。
このGMAグラフト不織布を直径7mmの円に切断したもの４枚を、エタノールに浸漬後、機械的に絞ってエタノールを極力除いたのち、0.2% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(以下：Tween20と表記)を含むPBS(-) (以下PBS-Tと表記する)に溶解した各認識分子溶液400μl（16μg認識分子/400μl）に室温(約23℃)で19hr軽く撹拌しながら浸した。
その後該不織布を、160μMのD-Biotin（＋）を含有したPBS(-)溶液400μｌに移しかえ、SA部のbiotin結合部位をブロッキングした。
このとき使用した各認識分子は、実施例２、３及び比較例１において作製した、Leu3a scFv-SA-guanidine、Leu3a scFv-SA-Urea、及びLeu3a scFv-Normalである。更なる比較例として市販されている、抗ヒトCD4モノクローナル抗体(clone 4H5、医学生物学研究所)を同様に固定化したものを用意した、これを比較例２とする。また、いかなる認識分子も固定化しないで、同様の操作を行なったGMAグラフト不織布を、比較例３とする。各種認識分子固定後、PBS-T溶液20mlで激しく撹拌しながら洗浄する操作を３回繰り返し、さらにPBS(-)溶液20mlで同様に2回洗浄し、吸着により表面に結合した認識分子を洗い流し、目的である、各認識分子が共有結合により、基材表面に固定化された生物学的液体処理用基材を得た。上記の操作により、実施例１、比較例１および比較例２の各認識分子は上記活性化不織布表面に、各認識分子中のアミノ基を介して共有結合されている。
入口と出口を有する容量1mlの容器(モビコールカラム：フナコシ製)に上記各細胞吸着材４枚とPBS(-)溶液を充填して、生物学的液体処理用デバイスを作製した。
（細胞吸着性の評価）
実験開始直前に、上記カラムのエアを通過させることによって、PBS(-)液を切り、ACD-A(川澄化学株式会社)添加ヒト健常人新鮮血液5.0ml（血液：ACD-A＝6.7：1）をシリンジポンプにて細胞吸着器の入口より流速1.0ml/minで送液し最初の5滴を捨てた後に、カラム出口より処理後の血液を回収した。
このときのCD4陽性細胞の除去率を、コールターカウンターを用いた、白血球数の変化および、フローサイトメーター（FACS Calibur：ベックトンディッキンソン社）を用いてフローサイトメトリー法で測定した、回収細胞中のCD4陽性細胞の割合の変化から算出した。細胞の染色は、回収した血液100μlに対して、anti-CD4-PE液(clone SK3、ベックトンディッキンソン社製)10μl、anti-CD8-FITC液(clone RPA-T8、ベックトンディッキンソン社製)10μlおよびanti-CD45-PerCP液(ベックトンディッキンソン社製)10μlを添加し、室温で30min染色後、FACS Lysing solution(ベックトンディッキンソン社製)1mlを添加し溶血したものを使用した。CD45が陽性の細胞を白血球としてゲートをかけ、その中のＣＤ４陽性細胞の割合を解析した。また、標的物質への特異性を評価するため、CD4陽性細胞とよく似た性質であるが表面にCD4分子を有さないCD8陽性細胞の回収率も同時に示した。これらの結果を表３に、実施例２，３及び比較例１は３回の実験の平均値±SDで示し、比較例２および３は１回の実験の数値で示した。
Figure 0005096332
この結果は、実施例５のような固定化条件で、認識分子を基材表面に共有結合により固定化した場合には、本発明の「少なくとも４本以上の認識分子が、該会合ドメインで自己会合した構造を有している」場合に、顕著に標的物質であるCD4陽性細胞の吸着除去に効果を発揮し、CD8陽性細胞の非特異的吸着除去も示さないことを示している。これは、同条件で固定化した市販の抗ヒトCD4抗体を凌ぐ効果である。また、会合体の分子数の内、主要なものが４量体(実施例４より)であるLeu3a scFv-SA-guanidine (実施例２)を認識分子とした場合に、特に効果が高いことが判る。
実施例６：
（GMAグラフト不織布表面へのBiotin PEO-Amineの導入）
実施例５と同様にしてGMAのグラフト不織布を作製した。このときのGMAグラフト率は81.4%であった。このGMAグラフト不織布を直径7mmの円に切断したもの４枚を、10mM（10E-5mol/ml）Biotin PEO-Amine(PIECE社)のメタノール溶液400μlに浸漬し、37℃,48hr反応させた。これをメタノールで２回、PBS-Tで2回、さらに蒸留水で２回洗浄後、真空乾燥することによって、表面にビオチンがPEO鎖とアミノ基を介して結合した基材を作製した。(以下これをアミノビオチン化GMA-g-不織布と表記する)
（GMAグラフト不織布表面へのBiotin hdrazineの導入）
実施例５と同様にしてGMAのグラフト不織布を作製した。このときのGMAグラフト率は81.4%であった。このGMAグラフト不織布を直径7mmの円に切断したもの４枚を、1mM（10E-6mol/ml）Biotin hydrazine(SIGMA社)のメタノール溶液400μlに浸漬し、37℃,48hr反応させた。これをメタノールで２回、PBS-Tで2回、さらに蒸留水で２回洗浄後、真空乾燥することによって、表面にビオチンがヒドラジド基を介して結合した基材を作製した。(以下これをヒドラジドビオチン化GMA-g-不織布と表記する)
上記で作製した、GMAグラフト不織布、アミノビオチン化GMA-g-不織布及びヒドラジドビオチン化GMA-g-不織布をエタノールに浸漬後、機械的に絞ってエタノールを極力除いたのち、認識分子としてLeu3a scFv-SA-guanidineを16μg含むPBS-Tに溶液400μl（16μg/400μl）に浸漬して、室温(約23℃)で19hr軽く撹拌しながら浸した。その後該不織布を、160μMのD-Biotin（＋）を含有したPBS(-)溶液400μｌに移しかえ、SA部のbiotin結合部位をブロッキングした。
上記により、認識分子としてLeu3a scFv-SA-guanidineが、共有結合により基材表面に導入された基材(GMAグラフト不織布)および、Leu3a scFv-SA-guanidineが主に表面のbiotinを介してビオチン-ストレプトアビジン（biotin-SA）の非共有結合により導入された基材(アミノビオチン化GMA-g-不織布、並びにヒドラジドビオチン化GMA-g-不織布)を得た。
入口と出口を有する容量1mlの容器(モビコールカラム：フナコシ製)に上記各細胞吸着材４枚とPBS(-)溶液を充填して、生物学的液体処理用デバイスを作製した。
（細胞吸着性の評価）
細胞吸着性の評価は実施例５と同様に行った。結果を表４にCD4陽性細胞（標的物質）除去能で示した。
Figure 0005096332
この結果は、実施例２で作製した認識分子であるLeu3a scFv-SA-guanidineを基材表面に固定化して使用する場合、非特許文献１で例示したような、基材表面にbiotinを導入し、主に認識分子中の会合ドメインであるSAとの、biotin-SA結合で固定化して、リガンド部位を有効に配向固定化をするよりも、簡便に作製しうる、共有結合により認識分子を基材表面に固定化した方が、標的物質の選択除去においては効果が高いという、驚くべきものである。Leu3a scFv-SA-guanidineがビオチンと強固に結合して安定な４量体を形成すること、および４分子以上が会合した会合状態であることは実施例４に例示している。このため、該認識分子が、標的物質と選択的に結合するリガンド部分および会合ドメインを含む直鎖状の分子であり、少なくとも４分子以上の認識分子が、該会合ドメイン同士が会合することにより会合体構造を形成している場合には、基材表面に共有結合により固定化してなる生物学的液体処理用基材が優れていることが判る。
また、ヒドラジドビオチン化GMA-g-不織布では、標的物質であるCD4陽性細胞の選択除去性能が劣る結果となっている。Biotin hdrazineを用いて作製した、ヒドラジドビオチン化GMA-g-不織布表面では、不織布表面の荷電状態や親疎水性の度合いなどが、アミノビオチン化GMA-g-不織布と比べて異なっていると考えられる。この結果、認識分子の該基材表面への固定化時には、biotin-SA結合に加えて、物理的な吸着により、認識分子の配向性がさらに変化しているためと考えられる。このように、主にbiotin-SAによる非共有結合においては、基材表面へのbiotinの導入方法などによって、認識分子の結合活性が保てない場合が存在する。
実施例７：
実施例５と同様にしてGMAのグラフト不織布を作製した。このときのGMAグラフト率は81.4%であった。このGMAグラフト不織布を直径7mmの円に切断したもの４枚をエタノールに浸漬後、機械的に絞ってエタノールを極力除いたのち、認識分子としてLeu3a scFv-SA-guanidineを16μg含むPBS-Tに溶液400μl（16μg/400μl）に浸漬して、室温(約23℃)で19hr軽く撹拌しながら浸した。その後該不織布を、160μMのD-Biotin（＋）を含有したPBS(-)溶液400μｌに移しかえ、SA部のbiotin結合部位をブロッキングした場合(以下：ビオチンブロック有 と表記)と、D-Biotin（＋）を含まない普通のPBS(-)溶液400μｌに移しかえて同様の操作を行なった場合(以下：ビオチンブロック無 と表記)の２種類の生物学的液体処理用基材を作製した。
入口と出口を有する容量1mlの容器(モビコールカラム：フナコシ製)に上記各細胞吸着材４枚とPBS(-)溶液を充填して、生物学的液体処理用デバイスを作製した。
（細胞吸着性の評価）
細胞吸着性の評価は実施例５と同様に行った。これらの結果を表５に３回の実験の平均値±SDで示した。
Figure 0005096332
この結果は、認識分子を基材表面に共有結合により固定化した後に、該会合ドメインであるSAのビオチン結合部位へビオチンが結合しても、しなくても、全く同等な標的物質除去性能が発揮されることを示している。これは、本発明の生物学的液体処理用基材では、該ドメイン部にSAを使用していても、標的物質除去性能発揮にビオチンは全く必要ない事を示している。
実施例８：
実施例５と同様にしてGMAのグラフト不織布を作製した。ただしこの際、反応させるGMAのメタノール溶液濃度を10-20%v/v%の範囲で変化させ、グラフト率の異なる不織布を用意した。このときのGMAグラフト率は低いものから順に、53.8%, 81.4%, 121.6%および186.4%であった。このGMAグラフト不織布を直径7mmの円に切断したもの４枚を、エタノールに浸漬後、機械的に絞ってエタノールを極力除いたのち、認識分子としてLeu3a scFv-SA-guanidineを16μg含むPBS-Tに溶液400μl（16μg/400μl）に浸漬して、室温(約23℃)で19hr軽く撹拌しながら浸した。その後該不織布を、160μMのD-Biotin（＋）を含有したPBS(-)溶液400μｌに移しかえ、SA部のbiotin結合部位をブロッキングし、グラフト率の異なる４種類の生物学的液体処理用基材を作製した。
入口と出口を有する容量1mlの容器(モビコールカラム：フナコシ製)に上記各細胞吸着材４枚とPBS(-)溶液を充填して、生物学的液体処理用デバイスを作製した。
（細胞吸着性の評価）
細胞吸着性の評価は実施例５と同様に行った。これらの結果を表６に３回の実験の平均値±SDで示した。
Figure 0005096332
この結果は、認識分子を基材表面に共有結合により固定化する場合の活性基（GMAのエポキシ基）はある程度以上基材表面に存在していれば、標的物質除去性能発揮に全く影響せず、本発明の生物学的液体処理用基材に好的に使用できることを示している。
以下本発明の他の一例として、標的物質をヒト末梢血中のCD19陽性細胞とし、認識分子中のリガンド部位を既知のモノクローナル抗体4G7の配列より作製した1本鎖抗体とし、会合ドメインとしてストレプトアビジンを用いた場合で例示する
実施例９：4G7 ScFv-SA体の作製
(4G71本鎖抗体の遺伝子の作製)
抗ヒトCD19マウスモノクローナル抗体である4G7の核酸配列は、VH部位Genbank Accesion No. AJ555622および VL部位Genbank Accesion No. AJ555479が公開されている。これらの配列を1本鎖抗体化するためにlinkerとなる１５アミノ酸の配列（配列表の配列番号１）をコードする核酸で繋いだものを設計しVL-linker-VHの順番になるように完全合成により作製した。この際VL部位の直前に開始コドンを含むようにNco I サイトを付加し、VH部位の末端にはNot I サイトを付加した。これらの核酸はpUC57ベクターにサブクローニングした。
上記の核酸配列の完全合成およびサブクローニングは米国GenScript社が提供する合成受託サービスを利用した、この核酸の配列を配列表の配列番号１３にアミノ酸３文字表記と共に示し、配列表の配列番号１４にアミノ酸配列のみ示す。
実施例１と同様にストレプトアビジンコア遺伝子の作製、スペーサー部位の作製及び大腸菌発現ベクターの改変を行い、以下のように発現ベクターの構築を行なった。
実施例１で改変したpET24d(+)プラスミドを、制限酵素Nco Iおよび制限酵素Hind III(TAKARA社)を用いて消化し、ベクター側のDNA断片を同様にして精製した。4G7 1本鎖抗体をコードする核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Nco Iおよび制限酵素Not I(TAKARA社)を用いて消化し、4G7 1本鎖抗体をコードする核酸断片を同様にして精製した。スペーサー部位をコードする核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Not Iおよび制限酵素Xho I(TAKARA社)を用いて消化し、スペーサー部位をコードする核酸断片を同様にして精製した。ストレプトアビジンコア遺伝子をコードする核酸がサブクローニングされたベクターは制限酵素Xho Iおよび制限酵素Hind III(TAKARA社)を用いて消化し、ストレプトアビジンコア遺伝子をコードする核酸断片を同様にして精製した。
以上のように精製したそれぞれのDNA断片をTAKARA社のライゲーションキットVer.2を用いて環状にライゲーションし、大腸菌DH5株(TOYOBO)に形質転換することにより、4G7 scFv-SAタンパク質を発現する、発現ベクターを取得した。
上記の発現ベクターを用いて産生される4G7 scFv-SAタンパク質は「リガンド部位」として4G7 scFv(約29kD)を含み、スペーサー部位として１３アミノ酸(約2kD)、自己会合する性質を持つ「会合ドメイン」としてSA(約16kD)で構成されている。「リガンド部分」を構成するポリペプチドの分子量と、「会合ドメイン」を形成するポリペプチドの分子量の比はこの場合1.8:1である。
(発現、グアニジン塩酸塩変性条件での回収)
上記のようにして作製した、発現ベクターを用いて実施例２と同様に、発現・変性可溶化、グアニジン塩酸塩段階希釈透析での巻き戻し精製を行なった。このようにして4G7 scFv-SAタンパク質の巻き戻し精製品を得た（これを以下単に4G7 scFv-SAと表記する）。上記の方法で精製した4G7 scFv-SAの生産量は大腸菌培養液1Lあたり148mgであった。
実施例５と同様にしてGMAのグラフト不織布を作製した。このときのGMAグラフト率は89.1%であった。このGMAグラフト不織布を直径7mmの円に切断したもの４枚を、エタノールに浸漬後、機械的に絞ってエタノールを極力除いたのち、認識分子として4G7 scFv-SAを80μg含むPBS-Tに溶液400μl（80μg/400μl）に浸漬して、室温(約23℃)で19hr軽く撹拌しながら浸した。その後該不織布を、160μMのD-Biotin（＋）を含有したPBS(-)溶液400μｌに移しかえ、SA部のbiotin結合部位をブロッキングした場合(以下：ビオチンブロック有 と表記)と、D-Biotin（＋）を含まない普通のPBS(-)溶液400μｌに移しかえて同様の操作を行なった場合(以下：ビオチンブロック無 と表記)の２種類の生物学的液体処理用基材を作製した。また、いかなる認識分子も固定化しないで同様の操作を行なったGMAグラフト不織布を比較例４とする。
入口と出口を有する容量1mlの容器(モビコールカラム：フナコシ製)に上記各細胞吸着材４枚とPBS(-)溶液を充填して、生物学的液体処理用デバイスを作製した。
（細胞吸着性の評価）
実験開始直前に、上記カラムのエアを通過させることによって、PBS(-)液を切り、ACD-A(川澄化学株式会社)添加ヒト健常人新鮮血液5.0ml（血液：ACD-A＝6.7：1）をシリンジポンプにて細胞吸着器の入口より流速1.0ml/minで送液し最初の5滴を捨てた後に、カラム出口より処理後の血液を回収した。
このときのCD19陽性細胞の除去率を、コールターカウンターを用いた、白血球数の変化および、フローサイトメーター（FACS Calibur：ベックトンディッキンソン社）を用いてフローサイトメトリー法で測定した、回収細胞中のCD19陽性細胞の割合の変化から算出した。細胞の染色は、回収した血液100μlに対して、Cyto-Stat/Coulter Clone液(ベックマンコールター社製；anti-CD19-FITCとanti-CD2-RD1の混合液)10μlおよびanti-CD45-PerCP液(ベックトンディッキンソン社製)10μlを添加し、室温で30min染色後、FACS Lysing solution(ベックトンディッキンソン社製)1mlを添加し溶血したものを使用した。CD45が陽性の細胞を白血球としてゲートをかけ、その中のCD19陽性細胞の割合を解析した。また、標的物質への特異性を評価するため、CD19陽性細胞とよく似た性質であるが表面にCD19分子を有さないCD2陽性細胞の回収率も同時に示した。これらの結果を表７に３回の実験の平均値±SDで示した、ただし、比較例４の認識分子無しの結果のみ、１回の実験の結果である。
Figure 0005096332
この結果は、本発明の生物学的液体処理用基材は、認識分子中の標的物質と選択的に結合するリガンド部位が異なれば、異なる標的物質を選択除去可能なことを示している。また、実施例７同様、該ドメイン部にSAを使用していても、標的物質除去性能発揮にビオチンは全く必要ない事を示している。
実施例１０：
実施例５と同様にしてGMAのグラフト不織布を作製した。このときのGMAグラフト率は81.4%であった。このGMAグラフト不織布を10cm×10cmに切断したもの10枚を、エタノールに浸漬後、機械的に絞ってエタノールを極力除いたのち、PBS-Tに溶解したLeu3a scFv-SA-guanidine溶液240ml（9.6mg認識分子/240ml）に室温(約23℃)で19hr軽く撹拌しながら浸した。
認識分子固定後、PBS-T溶液4Lで激しく撹拌しながら洗浄する操作を３回繰り返し、さらにPBS(-)溶液4Lで同様に2回洗浄し、吸着により表面に結合した認識分子を洗い流し、目的である、各認識分子が共有結合により、基材表面に固定化された生物学的液体処理用基材を得た。
入口と出口を有する容器に,上記生物学的液体処理用基材10枚とPBS(-)溶液,ならびにアスコルビン酸を充填したのち、25kGyの放射線により滅菌した。これにより、CD4陽性細胞を標的物質とした、血液体外循環による自己免疫疾患治療用のデバイスを作製した。
参考例：
従来技術との差異を明確にするために、非特許文献１に記載されている、生物学的液体処理用基材の作製法と実験結果を詳細に解析し、本発明との机上での比較を行なった。ここで、非特許文献１で使用されている磁気ビーズの物理特性は、Dynal社(ノルウェー)のDynabeads M-280 Sheepanti-mouse IgG のデータシート(Prod.No.112.01 and 112.02, Rev.No.004)に記載されており、実験に使われた磁気ビーズの量や表面積を算出可能である。非特許文献１では、ビオチンを介して認識分子を固定化させる基材を調整する際、磁気ビーズ表面の抗マウスヒツジ抗体のアミノ基に対してビオチンを化学結合する条件として、400μlを使用しており、これは2.4x10e8 beadsに相当する。直径2.8μmのビーズのため球の表面積の公式(4πr2)から2.46x10e-7cm2/beads、反応に用いた磁気ビーズの総表面積は、約59.1cm2となる。これにN-hydroxysuccinimidobiotin を反応させ、洗浄したものを、認識分子である一本鎖抗体-ストレプトアビジン融合タンパク質の0.1mg/mlの溶液と接触させ、磁気ビーズ表面のビオチンを介して、認識分子を固定化している。このとき使用されている認識分子の量は以下のように見積もられる。反応に使用されているmicrocentrifuge tubeの容積から、最大でも1mlであり、400ulのビーズに均一に認識分子の溶液を接触させるには最小で100ul程度は必要であることを勘案すると、ビオチンを介して該磁気ビーズ表面に固定するために使用された、該認識分子の物質量は10-100μg程度となる。したがってビオチンを介して認識分子を表面固定化するために用いられた単位面積あたりの使用量は、約0.17-1.7μg/cm2と算出される。
その後、非特許文献１では、上記磁気ビーズを洗浄後、6x10e5 beads/ul(10μg/ul)となるように再懸濁し、このうち50ul（最初にビオチン及びそれを介した認識分子固定化反応に用いた量の８分の１量、すなわち3x10e7 beads、除去対象物質が結合しうる表面積として約7.4cm2）を、標的物質を含む生物学的液体である1mlの5x10e4 CFU/mlの濃度の菌の胞子（胞子の絶対量として5x10e4 CFU）と室温または4℃において１時間接触させることにより、標的物質である菌の胞子を90%以上該磁気ビーズ表面に吸着分離できることが示されている。
この結果は生物学的液体として0.1%の牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸生理食塩水、PBSに、対象となる菌の胞子(Bacillus cereus spore)を混入させたのもを使用した、除去対象物以外の夾雑物を含まない場合である。非特許文献１ではさらに、牛乳に対象となる菌の胞子を混入させ同様の検討を行なっており、この場合の吸着除去性能は37%にとどまり、牛乳のような夾雑物を含む場合は性能が著しく低下することが記載されている。
一方、本明細書中に記載されている、生物学的液体処理用基材では、複数の実施例に記載のように、抗凝固剤を添加したのみの人全血を使用しており、液状のタンパク質や塩、脂質以外にも、赤血球や血小板のような、実施例において標的とした白血球よりも、極めて多く存在する粒子状の血球や、標的物質の白血球と、極めて物理的性状の似通った、他のリンパ球など多種多様な夾雑物を含むものを対象としている。本明細書中の実施例の標準的な条件として、16μgの物質量の認識分子を、直径7mmの円に切断した不織布４枚（標的物質が結合しうる表面積として140-190cm2）に固定化させており、したがって認識分子を共有結合にて表面固定化するために用いられた単位面積あたりの使用量は、約0.084-0.114μg/cm2と算出される。これは非特許文献1と比較して、表面への固定化に使用する認識分子の固定化反応仕込みの物質量、あるいは単位面積あたりの使用量は、大きく変わらないか、１桁少ない程度の量であることを示している。
本明細書中の不織布表面の理論的実効表面積の算出方法は、不織布を構成する繊維を円柱と仮定した場合の表面積であり次式により算出される
実効表面積(m2/g)= 4 / 不織布素材の比重(d)×不織布平均繊維径(μm)
ところで実施例で示した標的物質の一つであるCD4陽性細胞の血液中の数は、仮に末梢血中の白血球数を6,000 cells/ul（6x10e6 cells/ml）とし、末梢血中のリンパ球の割合を40%,その中でCD4陽性細胞の割合を40%とすれば960 cells/ulとなるため、約1x10e6 cells/mlと見積もられる。これを入口と出口を有するカラムに充填し、除去標的物質以外の夾雑物を多量に含む生物学的液体である、抗凝固剤を添加したのみの人全血5mlを1ml/minの流速で通液（基材との接触時間は全体で5分）している。このような短い接触時間にも関わらず、除去標的物質を60-90%以上吸着除去し、更には除去対象物質と非常に物理的性状が類似した他のリンパ球を70%以上回収可能である。これは上述した非特許文献１と比較すると、表面への固定化反応に用いる認識分子の物質量が同等か、１桁低いにも関わらず、100倍量の除去標的物質（非特許文献１：5x10e4 CFU/ml×1mlの胞子に対し、本発明：1x10e6 cells/ml×5mlの細胞を）を、12分の1の処理時間(60分に対し5分)で処理できることを示しており、基材本明細書に記載されている基材が、活性や性能において、従来技術より優れていることを示している。
これは、非特許文献１に記載されているような、４量体以上の多量体を形成している認識分子である該１本鎖抗体―ストレプトアビジン融合タンパク質中の、中心に位置するストレプトアビジンのビオチン結合部位と、基材表面に導入されたビオチンとの結合をさせることは、立体障害を伴うために効率が低いことが1つの原因と示唆される。また、認識分子がストレプトアビジンを会合ドメインとして４量体を形成するには、リガンド部分を頂点に配する正４面体構造が安定であると予測される。図２には、認識分子の会合体構造(４量体)の模式図を示した。すなわち該認識分子が、ビオチンを介して基材表面への固定化される為には、該認識分子会合体の正４面体構造に、歪みを生じる確率が高く、結果としてリガンド部位が標的分子を認識できない形で非効率的に固定化されている割合が大きいためと考えられる。あるいは非特許文献１の固定化方法では、固定化仕込みに使われた認識分子の、一部分のみが、実際にビオチンを介して固定化されるためと考えられる。
一方、本明細書中に記載の方法にて、共有結合により認識分子を固定化する場合には、正四面体構造を維持した状態で、表面に固定化されることが可能と考えられる。この場合、リガンド部位を配する４頂点の内、少なくとも１頂点は、基材表面から外側を向く形で固定化される。また共有結合を形成するための活性基が表面に多量に存在するため、より多くの認識分子を固定化可能である。この結果、非常に多くの認識分子が、少なくとも１頂点のリガンド部位を外側に向けて、配向固定化されるという、当初全く予想し得なかった効果が発揮されたものと考えられる。これは、リガンド部位の４頂点のうち３頂点が、基材表面との共有結合により失活しても、生物学的液体処理用基材としては、抜群の効果を有していることを示しており、当業者がこの効果を予測することは極めて困難である。図３には、本発明の基材表面での認識分子の固定化状態および、リガンド部位の配向状態の模式図を示した。
また、除去標的物質が吸着し得る表面積を仮に同じ100cm2として算出したにおいても、除去標的物質の処理量はほぼ同等で、(非特許文献１：約6.75x10e5 CFU/100cm2, 本発明実施例：5.3-7.1x10e5 cells/100cm2) 12分の1の処理時間(60分に対し5分)で分離ができることが判る。さらには夾雑物が多量に存在することを考え合わせると、本発明が、除去標的物質が吸着し得る表面積を同じとして比較しても、非特許文献１に比べて格段に性能面で優位であることが判る。
さらに、非特許文献1で用いられている、Bacillus種の胞子の直径は、文献報告によれば0.9-1.7μm程度（Journal of Applied Microbiology February 2007, 102, P303-312）であり、本明細書の実施例で標的としている、白血球の直径10-20μmよりも小さい。このため、非特許文献１の基材に対して、標的の胞子は、同じ単位面積あたり、本実施例中の白血球よりも、数多く吸着可能である。すなわちこれらの相違は物理的に基材表面の面積が不足していることに起因するわけではない。
血球成分除去療法のみならず、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である病因細胞をより選択的特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めることが期待されているにもかかわらず、血液中の標的物質である細胞を、特に全血中より直接、特異的に捕捉する技術が、実用上利用可能な技術として確立していなかった。本発明により、標的物質である細胞を全血中より直接、特異的に捕捉するための、実用上利用可能な血液処理用基材、デバイスおよび分離方法を提供できることとなり、目的の標的物質のみを処理できるという意味で、ＥＢＭ（Evidence Based Medicine）時代の医療の質、効率の向上に貢献する。
また、血液以外の生物学的液体からの標的物質の分離においても、本発明により、基材表面に予めビオチンを固定しておいてから、標的分子をビオチン-ストレプトアビジンの親和性を使用して非共有結合により固定化するといった、煩雑でコストがかかる操作を必要としない、コスト的に安価で産業上利用できる生物学的液体処理用基材、デバイスおよび分離方法を提供できるため、食品・検査・環境など幅広い分野の分離や検出方法の普及に貢献できる。
図１は、Leu3a scFv-SA-guanidine（実施例２）のSDS-PAGE解析の結果を示す。 図２は、認識分子の会合体構造(４量体)の模式図を示す。 図３は、本発明の基材表面での認識分子の固定化状態および、リガンド部位の配向状態の模式図を示す。

Claims (10)

  1. 生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子が共有結合により基材表面に固定化された生物学的液体処理用基材であって、該認識分子が標的物質と選択的に結合するリガンド部分および会合ドメインを含む直鎖状の分子であり、かつ該認識分子を構成するリガンド部分をコードする核酸と会合ドメインをコードする核酸とがスペーサーをコードする核酸を介して連結している核酸を発現させることにより得られる一本鎖のポリペプチドであり、該スペーサーが０から１００アミノ酸から構成されるペプチド性スペーサーであり、該リガンド部分をコードする核酸から翻訳されるポリペプチドが分子量１００ｋＤ以下の一本鎖抗体であり、該会合ドメインをコードする核酸から翻訳されるポリペプチドが分子量５０ｋＤ以下であり、少なくとも４分子以上の該認識分子が、該会合ドメイン同士が会合することにより会合体構造を形成し、認識分子が、リガンド部分と基材表面との間の共有結合により基材表面に固定化されていることを特徴とする、上記の生物学的液体処理用基材。
  2. 該会合ドメインが、ストレプトアビジンまたはアビジンの各々の全長または１部分をコードする核酸から翻訳されたポリペプチド領域であり、４個の該ポリペプチド領域が自発的に会合し、４個のリガンド部分が１会合体中に含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の生物学的液体処理用基材。
  3. 該リガンド部分を構成するポリペプチドの分子量と、該会合ドメインを構成するポリペプチドの分子量の比が、１：１０〜２０：１の範囲であることを特徴とする請求項１または２に記載の生物学的液体処理用基材。
  4. 標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子をコードする核酸をポリペプチドに翻訳し、上記の翻訳過程中に不溶化した該認識分子ポリペプチドを塩酸グアニジンまたは尿素を含有する水溶液で変性可溶化し、次いで、塩酸グアニジンまたは尿素を除去することによって該認識分子ポリペプチドの立体構造を再生することによって製造される、請求項１から３の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
  5. 水不溶性基材の表面に、標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子との共有結合を形成せしめるための活性基を導入し、次いで、水不溶性基材と認識分子を含む水溶液とを温度０〜５０℃において１０秒以上接触させることによって該認識分子を共有結合により基材表面に固定化することによって製造される、請求項１から４の何れかに記載の生物学的液体処理用基材。
  6. （ｉ）生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子をコードする核酸をポリペプチドに翻訳する工程、（ｉｉ）上記の翻訳の過程中に不溶化した該認識分子ポリペプチドを、塩酸グアニジンまたは尿素を含有する水溶液で変性可溶化する工程、及び（ｉｉｉ）上記の工程（ｉｉ）の後に、塩酸グアニジンまたは尿素を除去することによって該認識分子ポリペプチドの立体構造を再生する工程を含む、請求項１から５の何れかに記載の生物学的液体処理用基材の製造方法。
  7. （ｉ）水不溶性の基材表面に、生体関連物質、細菌、細胞、細胞塊、ウイルス又はウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質に対する選択的結合性を有する認識分子との共有結合を形成せしめるための活性基を導入する工程、及び（ｉｉ）水不溶性基材と認識分子を含む水溶液とを温度０〜５０℃において１０秒以上接触させることによって該認識分子を共有結合により基材表面に固定化する工程を含む、請求項１から５の何れかに記載の生物学的液体処理用基材の製造方法。
  8. 請求項１から５の何れかに記載の生物学的液体処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した生物学的液体処理用デバイス。
  9. 疾患の治療のために使用される、請求項８に記載の生物学的液体処理用デバイス。
  10. 請求項１から５の何れかに記載の生物学的液体処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填する工程を含む、請求項８又は９に記載の生物学的液体処理用デバイスの製造方法。
JP2008522604A 2006-06-27 2007-06-27 生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法 Expired - Fee Related JP5096332B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008522604A JP5096332B2 (ja) 2006-06-27 2007-06-27 生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006176487 2006-06-27
JP2006176487 2006-06-27
JP2008522604A JP5096332B2 (ja) 2006-06-27 2007-06-27 生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法
PCT/JP2007/062878 WO2008001802A1 (fr) 2006-06-27 2007-06-27 Substrat pour traitement de fluide biologique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2008001802A1 JPWO2008001802A1 (ja) 2009-11-26
JP5096332B2 true JP5096332B2 (ja) 2012-12-12

Family

ID=38845566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008522604A Expired - Fee Related JP5096332B2 (ja) 2006-06-27 2007-06-27 生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20100069815A1 (ja)
EP (1) EP2036584B1 (ja)
JP (1) JP5096332B2 (ja)
CN (1) CN101478998B (ja)
WO (1) WO2008001802A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8790916B2 (en) * 2009-05-14 2014-07-29 Genestream, Inc. Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid
JP2013535683A (ja) 2010-07-30 2013-09-12 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン クロマトグラフィー媒体及び方法
WO2016036508A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Emd Millipore Corporation High surface area fiber media with nano-fibrillated surface features
EP3230299A1 (en) 2014-12-08 2017-10-18 EMD Millipore Corporation Mixed bed ion exchange adsorber
DE102016106510A1 (de) * 2016-04-08 2017-10-12 ToposNomos Ltd. Verfahren und Vorrichtung zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines Patienten
WO2021221050A1 (ja) * 2020-04-27 2021-11-04 株式会社カネカ 構造物及びその製造方法、それを用いた吸着体、並びに生体粒子の精製方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999025463A1 (en) * 1997-11-14 1999-05-27 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and method for treating whole blood
JP2000501949A (ja) * 1995-10-05 2000-02-22 プリファテス インスティトゥット バイオサルフ ゲーエムベーハー 体外搬出法のための患者特異性免疫吸着剤およびその製出法
JP2003501114A (ja) * 1998-10-07 2003-01-14 セル ジェネシス，インコーポレイティド 治療用ウイルス免疫原性剤投与の有効性を増強する方法
JP2003501096A (ja) * 1999-06-07 2003-01-14 ネオルクス コーポレイション ストレプトアビジン発現性遺伝子融合およびその使用方法
WO2004073864A2 (en) * 2003-02-13 2004-09-02 Becton, Dickinson And Company Devices for component removal during blood collection, and uses thereof
WO2004091500A2 (en) * 2003-04-10 2004-10-28 3M Innovative Properties Company Delivery of immune response modifier compounds
US20050014196A1 (en) * 2003-04-04 2005-01-20 Carbonell Ruben G. Prion protein binding materials and methods of use
JP2006508336A (ja) * 2002-07-15 2006-03-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる処置に応答性である腫瘍を同定するための方法
WO2006107617A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0332680A (ja) 1989-06-30 1991-02-13 Terumo Corp Ｔリンパ球の分離材および分離装置
JPH06154316A (ja) 1992-11-24 1994-06-03 Toyobo Co Ltd Ｃｄ４陽性細胞捕集材
JPH06154317A (ja) 1992-11-25 1994-06-03 Toyobo Co Ltd Ｃｄ４陽性細胞捕集材
JPH06218051A (ja) 1993-01-25 1994-08-09 Toyobo Co Ltd Ｃｄ４陽性細胞捕集材
JPH06269663A (ja) 1993-03-17 1994-09-27 Toyobo Co Ltd Ｃｄ４陽性細胞捕集材
US5635363A (en) * 1995-02-28 1997-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells
JPH11332594A (ja) 1998-05-26 1999-12-07 Asahi Chem Ind Co Ltd Ｃｄ４陽性細胞の分離装置および分離方法
JP2000093172A (ja) 1998-09-25 2000-04-04 Japan Energy Corp 組換え型抗体の製造方法
JP2000217909A (ja) 1998-11-24 2000-08-08 Toray Ind Inc 吸着材
JP4196592B2 (ja) 2001-05-25 2008-12-17 東レ株式会社 免疫系細胞吸着材料およびそれを用いた体外循環用カラムおよび免疫系細胞の除去方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000501949A (ja) * 1995-10-05 2000-02-22 プリファテス インスティトゥット バイオサルフ ゲーエムベーハー 体外搬出法のための患者特異性免疫吸着剤およびその製出法
WO1999025463A1 (en) * 1997-11-14 1999-05-27 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and method for treating whole blood
JP2003501114A (ja) * 1998-10-07 2003-01-14 セル ジェネシス，インコーポレイティド 治療用ウイルス免疫原性剤投与の有効性を増強する方法
JP2003501096A (ja) * 1999-06-07 2003-01-14 ネオルクス コーポレイション ストレプトアビジン発現性遺伝子融合およびその使用方法
JP2006508336A (ja) * 2002-07-15 2006-03-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる処置に応答性である腫瘍を同定するための方法
WO2004073864A2 (en) * 2003-02-13 2004-09-02 Becton, Dickinson And Company Devices for component removal during blood collection, and uses thereof
US20050014196A1 (en) * 2003-04-04 2005-01-20 Carbonell Ruben G. Prion protein binding materials and methods of use
WO2004091500A2 (en) * 2003-04-10 2004-10-28 3M Innovative Properties Company Delivery of immune response modifier compounds
WO2006107617A2 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses

Also Published As

Publication number Publication date
CN101478998A (zh) 2009-07-08
EP2036584A1 (en) 2009-03-18
EP2036584B1 (en) 2015-01-21
US20100069815A1 (en) 2010-03-18
JPWO2008001802A1 (ja) 2009-11-26
EP2036584A4 (en) 2011-09-21
WO2008001802A1 (fr) 2008-01-03
CN101478998B (zh) 2012-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9173943B2 (en) Imprinted polymer nanoparticles
JP5096332B2 (ja) 生物学的液体処理用基材、生物学的液体処理用基材の製造方法、生物学的液体処理用デバイス、及び生物学的液体処理用デバイスの製造方法
JP3161604B2 (ja) 血液中の物質を結合してそれを除去するためのタンパク質を結合させた、無菌かつ発熱物質を含有しないカラム
JP5974343B2 (ja) アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
KR101036995B1 (ko) 중합체 친화성 기질과 이의 제조 방법 및 용도
EP2058335B1 (en) Biocompatible three dimensional matrix for the immobilization of biological substances
Hoshino et al. The evolution of plastic antibodies
JP2009000536A (ja) 細胞外体液からの特異的生体高分子物質の体外捕獲
EP2331568A2 (en) Treating inflammatory conditions
EP3669888A1 (en) Extracorporeal devices for methods for treating diseases associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibodies
JP2009536025A (ja) 生物学的材料の固定のための生体適合性三次元マトリクス
JP2001299904A (ja) フィブリノーゲンおよび／またはフィブリンの濃度を減少させるための吸着剤、吸着装置の製造のための吸着剤の使用、および吸着剤を有する吸着装置
JP2928589B2 (ja) 変性ｌｄｌの吸着体およびそれを用いる変性ｌｄｌの除去装置
JP4942015B2 (ja) リガンド固定化用基材および細胞選択吸着材
US20070225226A1 (en) C-reactive protein apheresis
JP2007089788A (ja) ＣＤ４９ｄ強陽性細胞除去材料
JP2006346096A (ja) 血液処理用基材
WO2012140214A1 (en) IMMUNOAFFINITY SEPARATION MATERIALS COMPRISING ANTI-IgE ANTIBODY DERIVATIVES
JP5250288B2 (ja) 体液浄化システムの作動方法
CN116194164A (zh) 用于治疗败血症的透析系统
JPH06154317A (ja) Ｃｄ４陽性細胞捕集材
JPH06218051A (ja) Ｃｄ４陽性細胞捕集材
JP2004358256A (ja) フィブリノゲン吸着剤ｉｉｉ
JPH06154316A (ja) Ｃｄ４陽性細胞捕集材
JPH06218050A (ja) 抗血小板抗体吸着材

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20111206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120203

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120918

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120920

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150928

Year of fee payment: 3

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees