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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten.
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Die inkorporale Behandlung von vielen Erkrankungen ist häufig mit starken Nebenwirkungen verbunden oder sogar bislang unmöglich. Alternativ sind Vorrichtungen bekannt, die sich außerhalb des Körpers (extrakorporal) des Patienten befinden und mit deren Hilfe Zellproben des Patienten behandelt und anschließend wieder zurückgeführt werden können. Hierdurch ist in manchen Fällen eine schonendere Behandlung der betreffenden Erkrankung möglich, da beispielsweise das Immunsystem des Patienten durch die Behandlung in geringerem Maße in Mitleidenschaft gezogen wird, als dies durch eine inkorporale Behandlung möglich wäre.
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Als nachteilig ist anzusehen, dass die bekannten extrakorporalen Behandlungsverfahren und die zu deren Durchführung verwendeten Vorrichtungen vergleichsweise unspezifisch sind und sich daher nur zur entsprechend unspezifischen Behandlung relativ weniger Erkrankungen eigenen.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten anzugeben, die eine spezifischere und flexiblere Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen ermöglichen.
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Die Aufgaben werden erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 16 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen mit zweckmäßigen Weiterbildungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben, wobei vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens als vorteilhafte Ausgestaltungen der Vorrichtung und umgekehrt anzusehen sind.
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Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten, der unter einer Erkrankung leidet, bei welchem zumindest die Schritte a) Ermitteln wenigstens eines Proteinclusters (CMP), das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist, b) Bereitstellen der Zellprobe des Patienten und c) extrakorporales Entfernen von Bestandteilen, die das wenigstens eine ermittelte CMP aufweisen, aus der Zellprobe durchgeführt werden. Hierdurch kann eine Vielzahl von Erkrankungen hochspezifisch und nebenwirkungsarm behandelt werden, da lediglich die betroffenen Bestandteile der Zellprobe außerhalb des Körpers des Patienten entfernt werden, während nicht von der Erkrankung betroffene Zellen der Zellprobe nicht entfernt werden bzw. zumindest weitgehend unverändert bleiben. Der Begriff „Entfernen“ umfasst im Kontext der vorliegenden Erfindung nicht nur ein teilweises oder vollständiges „Entfernen“ der betreffenden Bestandteile, sondern alternativ oder zusätzlich auch ein teilweises oder vollständiges Inaktivieren bzw. Zerstören dieser Bestandteile, wodurch diese zumindest nicht mehr in ihrer pathogenen Form in der Zellprobe vorliegen bzw. möglichst stark abgereichert werden.
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Unter einem Proteincluster wird innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung ein kombinatorischer molekularer Phänotyp (Combinatorial Molecular Phenotype, CMP) verstanden, der kolokalisierte und/oder antikolokalisierte CDs (Cluster of Differentiation, Unterscheidungsgruppen), Proteine und/oder Moleküle in einem bestimmten Ort einer Zelle beschreibt. Dementsprechend repräsentieren Gruppen von CMPs Regionen von kolokalisierten und/oder antikolokalisierten CDs, Proteinen und/oder sonstigen Molekülen in einer Zelle oder einem Zellkomplex der Zellprobe. Ein CMP in diesem Zusammenhang kann beispielsweise in Form eines binären Codes angegeben werden, wobei es möglich ist, über jede Ziffer der Binärzahl (d.h. über jedes "Bit") zu kodieren, ob ein vorbestimmtes CD/Protein/Molekül in einem bestimmten vorgegebenen Ort und/oder in einer einen bestimmten Grenzwert übersteigenden Konzentration (z. B. L, 1 oder True) in der Zelle vorkommt. Im anderen Fall, das heißt wenn das vorbestimmte CD/Protein/Molekül nicht an dieser Stelle der Zelle vorvorkommt oder nur in einer unterhalb eines Grenzwert liegenden Konzentration, wird eine abweichende Kodierung (z. B. A, 0 oder False) verwendet. Ebenso kann es vorgesehen sein, dass bestimmte CDs/Proteine/Moleküle nur manchmal mit einem oder mehreren anderen CDs/Proteinen/Molekülen kolokalisiert und manchmal nicht kolokalisiert sind. Diese CDs/Proteine/Moleküle können mit „Wildcards“ (z. B. W, *) kodiert werden.
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Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass bestimmte CDs/Proteine/Moleküle erkrankungsspezifisch und/oder patientenspezifisch als sogenannte Leitproteine fungieren. Auf einem hohen Level der molekularen Zellorganisation werden Proteine häufig als Cluster oder Netzwerke miteinander gekoppelt (entsprechend den besagten CMP-Motiven), wobei diese Kopplung von Leitproteinen gesteuert wird: Wenn die Leitproteinen gehemmt oder entfernt werden, zerfallen diese Cluster, was zu einem Verlust ihrer biologischen Funktion führt. Deshalb können zahlreiche Erkrankung effektiv und zumindest im Wesentlichen nebenwirkungsfrei behandelt werden, indem das CMP oder die Gruppe von CMPs ermittelt wird, das oder die für eine bestimmte Erkrankung charakteristisch ist, wonach die betreffenden Bestandteile der Zellprobe, die diese pathologischen „Marker“ tragen, extrakorporal aus der Zellprobe entfernt bzw. inaktiviert werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Abhängigkeit der Erkrankung und des Behandlungserfolgs grundsätzlich einmal oder mehrmals durchgeführt werden. Beispielsweise können mehrere Zyklen in bestimmten gleich bleibenden oder variierenden Abständen durchgeführt werden. Die Anzahl und Frequenz der Verfahrensdurchläufe sollte von einem Arzt bestimmt und kontrolliert werden.
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Dabei hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn als Zellprobe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Blut und/oder Blutplasma, und/oder eine Gewebeprobe des Patienten bereitgestellt wird. Hierdurch kann die Zellprobe optimal in Abhängigkeit der zu behandelnden Erkrankung ausgewählt werden.
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Weitere Vorteile ergeben sich, indem das wenigstens eine CMP anhand einer Datenbank und/oder mittels eines Multi-Epitop-Ligand-Kartographie (MELK) bzw. ICM-Verfahrens (Multi-Epitop-Ligand Kartographie/Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder mittels eines MELK-Robotersystems ermittelt wird. Für Erkrankungen, bei denen das charakteristische CMP bzw. die charakteristische Gruppe von CMPs bereits bekannt und nicht in der Regel nicht patientenspezifisch ist, kann es ausreichend sein, das oder die CMPs aus einer entsprechenden medizinischen Datenbank zu ermitteln. Alternativ oder zusätzlich kann es vorgesehen sein, dass das oder die für die Erkrankung charakteristische(n) CMP(s) mit Hilfe eines Multi-Epitop-Ligand-Kartographie (MELK) bzw. ICM-Verfahrens (Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder mittels eines MELK-Robotersystems ermittelt wird bzw. werden. Das MELK/ICM-Verfahren bzw. das MELK-Robotersystem sind als solche beispielsweise aus den Dokumenten
US 6,150,173 ,
DE 197 09 348 A1 ,
EP 0 810 428 A1 ,
DE 100 43 470 A1 und
WO 02/21137 A2 bekannt.
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Alternativ oder zusätzlich ist es vorgesehen, dass das extrakorporale Entfernen der Bestandteile mittels eines MELK bzw. ICM-Verfahrens und/oder mittels eines MELK-Robotersystems überwacht und/oder kontrolliert wird. Hierdurch kann die gewünschte Abreicherung der krankheitsspezifischen Bestandteile der Zellprobe kontrolliert und gegebenenfalls gesteuert bzw. geregelt werden.
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Eine besonders spezifische und damit effektive und nebenwirkungsarme Entfernung der pathogenen und/oder überzähligen Bestandteile aus der Zellprobe ist in weiterer Ausgestaltung der Erfindung möglich, wenn die Erkrankung eine Tumorerkrankung und/oder eine Entzündungserkrankung ist. Solche Erkrankungen weisen ein besonders hohes Maß an zellulärer Organisation auf und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung dementsprechend spezifisch adressiert werden.
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Weitere Vorteile ergeben sich, indem das extrakorporale Entfernen mittels eines Aphereseverfahrens und/oder mittels einer Apheresevorrichtung durchgeführt wird. Hierdurch können insbesondere pathogene und/oder überzählige Bestandteile, die sich zumindest überwiegend im Blut und/oder Blutplasma des erkrankten Patienten finden, besonders wirkungsvoll und nebenwirkungsarm aus dem Blut und/oder Blutplasma entfernen.
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Dabei hat es sich weiterhin als vorteilhaft gezeigt, wenn als Aphereseverfahren eine unselektive Apherese und/oder eine selektive Apherese und/oder eine Vollblutapherese und/oder eine Photopherese durchgeführt wird und/oder dass die Apheresevorrichtung zur Durchführung wenigstens eines Aphereseverfahrens aus der Gruppe unselektive Apherese, selektive Apherese, Vollblutapherese und Photopherese ausgebildet ist. Dies erlaubt eine optimale Anpassung an die jeweilige Erkrankung bzw. an die für die betreffende Erkrankung charakteristischen Bestandteile. Bei der extrakorporalen Apherese kann in manchen Ausführungen zunächst das Blut des Patienten mittels einer Zentrifuge aufgetrennt werden, um die pathogenen Bestandteile gegenüber nicht-pathogenen Bestandteilen anzureichern. Ebenso ist es möglich, bestimmte Bestandteile vollständig anzutrennen und/oder zu substituieren. Im Rahmen einer Photopherese werden die pathogenen Bestandteile einer kontrollierten Bestrahlung mit Licht bestimmter Wellenlänge(n) ausgesetzt, um eine Zerstörung bzw. Abreicherung zu erzielen. Die Wellenlänge(n), Bestrahlungszeit und Bestrahlungsdauer können in Abhängigkeit der Eigenschaften der pathogenen Bestandteile gewählt werden. Beispielsweise kann die gegebenenfalls aufgetrennte bzw. fraktionierte Zellprobe einer kontrollierten UV-A- und/oder UV-B-Bestrahlung ausgesetzt werden. Im Anschluss an die Apherese kann das Blut bzw. Blutplasma, in welchem die pathogenen Bestandteile abgereichert oder vollständig entfernt wurden, wieder zum Patienten zurückgeführt werden. Die behandelte Zellprobe wird hierdurch dem nichtbehandelten Immunsystem präsentiert und kann in manchen Fällen eine zusätzliche Modulation des Immunsystems bewirken.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist es vorgesehen, dass zum extrakorporalen Entfernen wenigstens ein Streptamer und/oder wenigstens ein Antikörper und/oder wenigstens ein Ligand, insbesondere ein variables Einzelkettenfragment (scFv) und/oder ein multivalentes Antikörperfragment (scFv Multimer), verwendet wird. Hierdurch kann eine optimal auf den zu entfernenden Bestandteil angepasste Selektionierung durchgeführt werden. Das wenigstens eine Streptamer und/oder der wenigstens eine Antikörper und/oder der wenigstens eine Ligand können grundsätzlich der Zellprobe zugegeben und/oder immobilisiert an einem Trägermaterial verwendet werden. Antikörperfragmente bieten den Vorteil einer hohen Bindungsaffinität bzw. -avidität und Spezifität für ein breites Spektrum an Zielstrukturen und Haptenen. Einzelkettenfragmente können zudem als Diabodies (60 kDa), Triabodies (90 kDa), Tetrabodies (120 kDa) etc. vernetzt bzw. exprimiert werden, wobei unterschiedliche Linkerlängen zwischen V-Domänen möglich sind. Ein besonderer Vorteil ist zudem, dass Moleküle von 60–120 kDa die Penetration von Zellen erhöhen und schnellere Clearance-Raten als korrespondierende Igs (150 kDa) besitzen. Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass der Antikörper und/oder Ligand ein Diabody, Triabody, Tetrabody, Pentabody, Hexabody, Heptabody oder Octabody ist. Mit anderen Worten ist es vorgesehen, dass der Antikörper und/oder Ligand mono-, bi-, tri-, quad-, pent-, hex-, hept-, oct-, enn- oder multispezifisch ausgebildet ist. Dies erlaubt die Quervernetzung von zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht Zielstrukturen bzw. Zielproteinen, wobei scFv Multimere besonders präzise und individuell an die gegebenenfalls patientenspezifische räumliche Anordnung der Zielepitope bestimmter kombinatorischer Proteincluster (CMPs) angepasst werden können. Die erhöhte Bindungswertigkeit von scFv-Multimeren führt zu einer besonders hohen Avidität.
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Weitere Vorteile ergeben sich, indem das wenigstens eine Streptamer und/oder der wenigstens eine Antikörper und/oder der wenigstens eine Ligand ein für die Erkrankung charakteristisches Leitprotein spezifisch bindet und/oder inaktiviert. Hierdurch können eine besonders effiziente und umfassende Entfernung der pathogenen und/oder überzähligen Bestandteile erzielt und eine entsprechend zuverlässige Behandlung der betreffenden Erkrankung ermöglicht werden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist es vorgesehen, dass die Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist und/oder dass die Zellprobe eine Blutprobe des Patienten ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD11b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD11b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet, und/oder mittels eines CD16-Ectodomain-Shedding-Moleküls extrakorporal entfernt werden. Die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) beruht auf einer unaufhaltsam und rasch fortschreitenden irreversiblen Lähmung der Muskulatur, da bestimmte Nervenzellen, die die Muskulatur steuern, degenerieren. Es wurden bisher über 50 klinische Behandlungsstudien durchgeführt, deren Therapiekonzepte sich allerdings überwiegend als unwirksam erwiesen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erstmals möglich, die pathogenen ALS-spezifischen Zellen extrakorporal zu entfernen bzw. zu inhibieren, wodurch der Krankheitsfortschritt gestoppt oder zumindest erheblich verlangsamt werden kann. Bei den für die ALS verantwortlichen pathogenen Bestandteilen handelt es sich um aberrante T-Lymphozyten, die neben dem CD8-Rezeptor auch den CD16-Rezeptorkomplex exprimieren. Daher zeichnen sie sich durch CMPs aus, die CD8 und/oder CD16 als Leitproteine enthalten. Die Leitproteine können mit den weiteren angegebenen CDs und Proteinen kolokalisiert bzw. antikolokalisiert sein. Dementsprechend hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn der zum Entfernen der pathogenen Bestandteile verwendete Antikörper und/oder Ligand einen, zwei, drei, vier, fünf oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, STTP1, NeuN, Bax, Bcl2, CD11b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet. Mit anderen Worten ist es vorgesehen, dass der Antikörper und/oder Ligand mono-, bi-, tri-, quad-, pent-, hex-, hept-, oct-, enn- oder multispezifisch ausgebildet ist. Die genannten Proteine bilden in unterschiedlichen Kombinationen überindividuelle und individuelle Cluster in ALS-spezifischen Zellen und können daher extrakorporal therapeutisch quervernetzt und damit blockiert werden, wodurch die ALS-spezifischen Zellen ihre Funktionalität einbüßen. Hierdurch wird eine besonders spezifische und damit nebenwirkungsarme oder sogar nebenwirkungsfreie Behandlung von ALS ermöglicht. Weitere Vorteile ergeben sich, wenn der Antikörper und/oder Ligand zumindest CD16, CD8 und STTP1 bindet. STTP1 bezeichnet hierbei das gegebenenfalls Patienten-spezifische Signalprotein (signal transduction protein 1, z. B. Kinase), welches die Signalkaskade, die sich von der Zelloberfläche zum Zellkern erstreckt, vermittelt und zusammen mit dem Modul „CD16a und CD8“ an der Oberfläche der Zelle koppelt, wo es mit CD16a und CD8 kolokalisiert ist. STTP1 kann mit Hilfe der an sich bekannten MELK- und/oder ICM-Technik (Multi-Epitope-Ligand-Kartographie bzw. Imaging Cycler Mikroskopie) für den betreffenden Patienten individuell ermittelt bzw. überwacht werden. Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass STTP1 wenigstens ein Protein aus der Gruppe RAC1, STAP2 und SMAD2 ist. Weitere Vorteile ergeben sich, wenn der Antikörper und/oder Ligand rekombinant, human oder de novo hergestellt ist.
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Weitere Vorteile ergeben sich, indem zum extrakorporalen Entfernen ein Antikörper und/oder Ligand verwendet wird, welcher zwei oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, RAC1, STAP2 und SMAD2 bindet. Hierdurch können ALS-spezifische Protein-Cluster blockiert werden, die neben einem oder mehreren Zelloberflächenproteinen (z. B. CD8, CD16, CD45RA) zusätzlich mit einem oder mehreren Signalketten-Molekülen aus der Gruppe RAC1, STAP2 und/oder SMAD2 direkt assoziiert sind. RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) als Mitglied der RAC Subfamilie regelt eine Vielfalt von zellulären Ereignissen, einschließlich der Kontrolle des Zellwachstums, der Zytoskelett-Reorganisation und der Aktivierung von Proteinkinasen. STAP2 (Signal-transducing adaptor protein 2) und SMAD 2 (Mothers against decapentaplegic homolog 2) sind ebenfalls Teil der Signaltransduktionskette und regulieren die Signaltransduktion und Transkription zentraler Signalwege in ALS-spezifischen Zellen.
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Alternativ ist es vorgesehen, dass die Erkrankung Prostatakrebs ist und/oder dass die Zellprobe Prostatagewebe ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe CD26 und CD29 umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD26 und CD29 bindet, extrakorporal entfernt werden. Hierdurch ist es erstmals möglich, Prostatakrebs extrakorporal zu behandeln und die Therapie zu überwachen. Die Erfindung basiert dabei auf der Erkenntnis, dass sich Prostatakrebs durch CMPs auszeichnet, die CD26 und/oder CD26 als Leitproteine enthalten, die gegebenenfalls mit weiteren CDs bzw. Proteinen kolokalisiert bzw. antikolokalisiert sind.
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Weitere Vorteile ergeben sich, wenn das wenigstens eine CMP auch CD44 und/oder CD54 und/oder CD138 umfasst und/oder wenn dem wenigstens einen CMP mindestens eines von CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 und CD80 fehlt. Dies ermöglicht eine besonders zuverlässige Identifizierung und Überwachung der Entfernung der für Prostatakrebs verantwortlichen pathogenen Bestandteile der Zellprobe. Prostatakrebs liegt insbesondere dann vor, wenn die Zellprobe vom Stroma und/oder neoplastischen Epithel von Azini von Prostatagewebe stammt, und/oder wenn mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 75 % der CMPs auf der Zellenoberfläche mindestens einer Zelle CD26 und/oder CD29 enthalten, und/oder wenn mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 35 % der CMPs auf der Zellenoberfläche mindestens einer Zelle CD26 und/oder CD29 umfassen und ihnen mindestens CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 und CD80 fehlt.
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Dementsprechend können die pathogenen Bestandteile der Zellprobe in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besonders zuverlässig dadurch extrakorporalen entfernt werden, dass zum Entfernen ein Antikörper und/oder Ligand verwendet wird, welcher mindestens eines oder mehrere aus der Gruppe CD26, CD29, CD44, CD54 und CD138 bindet.
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Alternativ ist es vorgesehen, dass die Erkrankung ein kutanes Lymphom, insbesondere Mycosis fungoides ist und/oder dass die Zellprobe eine Hautprobe ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71, CD80 und HLA-DR umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71, CD80 und HLA-DR bindet, extrakorporal entfernt werden. Damit ist erstmals eine extrakorporale Behandlung und Therapiekontrolle von kutanen Lymphomen ermöglicht. Die Erfindung basiert dabei auf der Erkenntnis, dass sich kutane Lymphome durch CMPs auszeichnet, die insbesondere HLA-DQ als Leitprotein enthalten, das mit einem oder mehreren der genannten CDs bzw. Proteine kolokalisiert bzw. antikolokalisiert ist.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Zellprobe nach dem extrakorporalen Entfernen der Bestandteile dem Patienten wieder zurückgeführt.
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Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung, welche zur Durchführung eines Verfahrens gemäß dem ersten Erfindungsaspekt ausgebildet ist. Unter dem Ausdruck „ausgebildet zu“ ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zu verstehen, die nicht nur eine grundsätzliche Eignung zur Durchführung eines solchen Verfahrens aufweist, sondern konkret dazu eingerichtet und ausgestattet ist, ein solches Verfahren durchzuführen. Die sich hieraus ergebenden Merkmale und deren Vorteile sind den Beschreibungen des ersten Erfindungsaspekts zu entnehmen, wobei vorteilhafte Ausgestaltungen des ersten Erfindungsaspekts als vorteilhafte Ausgestaltungen des zweiten Erfindungsaspekts und umgekehrt anzusehen sind.
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Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft ein Streptamer und/oder einen Antikörper und/oder einen Ligand zur Verwendung in einem Verfahren gemäß dem ersten Erfindungsaspekt. Die sich hieraus ergebenden Merkmale und deren Vorteile sind den Beschreibungen des ersten Erfindungsaspekts zu entnehmen, wobei vorteilhafte Ausgestaltungen des ersten Erfindungsaspekts als vorteilhafte Ausgestaltungen des dritten Erfindungsaspekts und umgekehrt anzusehen sind. Das Streptamer, der Antikörper und/oder der Ligand kann bzw. können in weiterer Ausgestaltung mit einem Adsorber und/oder einem Chromophor gekoppelt sein. Hierdurch eignen sie sich insbesondere für die Verwendung im Rahmen einer Photopherese mit auf den Absorber bzw. das Chromophor abgestimmten Wellenlängen. Alternativ oder zusätzlich kann das Streptamer, der Antikörper und/oder der Ligand mit einem Marker, insbesondere einem magnetischen Marker (Magnetic Cell Separation) gekoppelt sein. Dies erlaubt eine einfache extrakorporale Abtrennung von mit dem Streptamer/Antikörper/Ligand gebundenen pathogenen Bestandteilen per Affinitätschromatographie, beispielsweise mit Hilfe von sogenannten MicroBeads. Dabei handelt es sich um etwa 50 Nanometer große Magnetpartikel, die an das Streptamer, den Antikörper bzw. den Ligand gebunden sind. Streptamer/Antikörper/Ligand erkennen krankheitsspezifische CMP(s) auf der Oberfläche von pathogenen Bestandteilen (Zellen) und sorgen damit für die Bindung der MicroBeads an diese Zellpopulation. Beim Durchfluss der Zellprobe durch eine Säule, die von einem starken Magnetfeld umgeben ist, werden die mit den MicroBeads markierten Zellen zurückgehalten. Auf diese Weise erhält man beim Spülen der Säule nur unmarkierte und damit nichtpathogene Zellen, so dass aus dem ursprünglichen Zellgemisch die markierte Zellpopulation und damit die für die Erkrankung charakteristischen Bestandteile entfernt wurden. Nach dem Entfernen des Magnetfeldes kann zudem auch die markierte Zellpopulation durch Spülen der Säule gewonnen werden und steht damit für weitere Versuche zur Verfügung. Durch wiederholte Behandlung eines Zellgemisches mit verschiedenen MicroBeads ist auch eine sogenannte fraktionierte Trennung, also die Auftrennung in mehrere Zellpopulationen, möglich. Das Streptamer, der Antikörper und/oder der Ligand kann bzw. können in weiterer Ausgestaltung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Quantenpunkt, einem radioaktiven Marker, einem Spin-Marker und/oder einem Tag für einen weiteren Antikörper/Liganden und/oder ein Einzym gekoppelt sein.
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Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen, den Figuren und der Figurenbeschreibung. Die vorstehend in der Beschreibung genannten Merkmale und Merkmalskombinationen, sowie die nachfolgend in der Figurenbeschreibung genannten und/oder in den Figuren alleine gezeigten Merkmale und Merkmalskombinationen sind nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen verwendbar, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Es sind somit auch Ausführungen von der Erfindung als umfasst und offenbart anzusehen, die in den Figuren nicht explizit gezeigt und erläutert sind, jedoch durch separierte Merkmalskombinationen aus den erläuterten Ausführungen hervorgehen und erzeugbar sind. Es sind auch Ausführungen und Merkmalskombinationen als offenbart anzusehen, die somit nicht alle Merkmale eines ursprünglich formulierten unabhängigen Anspruchs aufweisen. Dabei zeigt:
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1a bis 1f verschiedene Toponomabbildungen ALS spezifischer, abnormer Zellen;
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2a bis 2f den Stufenprozess dieser abnormen Zellen, der zum ALS spezifischen Krankheitsbild führt;
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3 eine schematische Darstellung der topologischen Hierarchie von Proteinen innerhalb eines Toponoms;
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4 eine Toponomkarte, die die Lage der 30 häufigsten aus mehr als 2.000 verschiedenen CMPs bei Prostatakrebs zeigt;
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5 eine Darstellung der selektiven Expression des Prostatakrebsspezifischen CMPs in subzellulären Stellen von neoplastischen Prostata Acini;
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6 eine Illustration der zyklischen Lokalisierung von 25 Biomolekülen und die nachfolgende Ermittlung der CMPs mit Hilfe des MELK/ICM Verfahrens; und
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7 Toponomabbildungen zur Gewebeorganisation eines kutanen Lymphoms.
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Mechanismen der ALS im Toponom
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Synopsis des ALS-Toponoms: Analysen der Zelloberflächen von Immunzellen des Blutes haben gezeigt, dass bei ALS ein spezifisches abnormes Toponom vorkommt. Wesentliches Merkmal ist die Existenz von aberranten T-Lymphozyten, die neben dem CD8-Rezeptor auch den CD16-Rezeptorkomplex exprimieren. Exakt dieselben Zellformen finden sich im morphologisch gut erhaltenen ALS postmortem Gewebe innerhalb von postkapillären Venolen der spinalen Pyramidenbahn (1a, b; Box). Detaillierte 3D Toponomauflösung zeigt, dass diese Zellen den CD16-Komplex (1, Pfeil 1) exprimieren, polarisiert sind und eine „leading edge“ mit CD3 positiver Membran zeigen, die durch die Endothelzellschicht des Blutgefäßes dringt (1c; Pfeil 2), während CD3 positive Vesikel intrazellulär zu der „leading edge“ transportiert werden (1c; Box). Einzelne Vesikel enthalten Komplexe aus CD8/CD16 (1d, e, f). Diese CD8/CD16-Komplexe sind durch „forward transport“ für die Transmigration dieser Zellen durch die Endothelzellschicht via „vesicle budding“ in der Zelloberfläche erforderlich, um als Teil eines abnormen „homing codes“ (Referenzcodes) die Transmigration voranzutreiben. CD16 wird auch als Fc region receptor III-A bzw. FcγIII bezeichnet. Nach der Transmigration wird dieser Komplex degradiert, da CD8 positive T-Zellen im Parenchym der Pyramidenbahn den CD16-Komplex nicht aufweisen. Stattdessen finden sie sich als einzelne Zellen zwischen den myelinisierten Neuronen (2a, CD8 + CD16 – blaue Zelle). Stärkere 3D-Vergrößerung dieser Zelle weist einen Zellfortsatz auf, der tief in die Oberfläche eines morphologisch intakten Axons eingedrungen ist (2b, Box; 2c: Vergrößerung der Box: Stern = morphologisch intakter Axonkörper). Dieser Zellfortsatz exprimiert CD3 und CD8 (2; Pfeile 1, 2). Eine geometrisch exakte 3D-Berechnung ergibt den Zellfortsatz in 2f (Pfeil 3) und das Axon in 2f (mit Stern markiert). Ein ähnlicher Zellfortsatz findet sich ausgehend von derselben Zelle in 2d (untere Bildhälfte): Hier hat der Zellfortsatz (rot) offensichtlich die intakte Myelinscheide (weiß) durchdrungen. Zum Vergleich hierzu zeigt 2e eine intakte Myelinscheide.
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Zusammenfassend: CD16 ist notwendig, um das abnorme „homing“ aberranter CD8 Zellen in die Pyramidenbahn zu steuern. Wenn dieser homing-Prozess abgeschlossen ist, degradieren (verlieren) die Zellen den CD16-Komplex, wandern dann als CD8 + CD16-Zellen zwischen den myelinisierten Neuronen, dringen durch die Myelinscheiden und axotomieren Neurone. Dieser Prozess ist offensichtlich primär autonom, da die Zellen nie im Kontext mit Zell“debris“, also Zeichen primärer neuronaler Degradation beobachtet werden. Die Zellen spielen daher eine primäre pathogenetische Rolle. Diese Interpretation wird gestützt durch die Tatsache, dass die Herunterregulierung von CD16 zu einem Stopp der Krankheitsprogression führt: wenn CD16 nicht mehr wie in 1f zur Verfügung steht, kann der endotheliale homing-Vorgang nicht mehr ausgeführt werden. Ein Teil der (sporadischen) ALS kann daher als Krankheit des Immunzelltoponoms beschrieben werden, das mittels eines hochselektiven „homing codes“ die ALS-spezifischen Pyramidenbahn-Läsionen (Axotomie) generiert. Viele genetische Befunde und Proteinaggregationen, die bei ALS beschrieben wurden, sind auch bei experimenteller Axotomie beschrieben worden, so dass die Immunzelltoponom-vermittelte Axotomie diese Befunde erklärt.
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Koepressionsmuster
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Die invasiven Zellen gemäß 1c koexprimieren weiterhin folgende Moleküle: Bax, Bcl2, CD11b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD8, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, NeuN, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2.
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NeuN (Fox-3, Rbfox3, oder Hexaribonucleotid Bindeprotein-3) ist ein neuronales, nukleäres Antigen, das normalerweise als Biomarker für Neurone verwendet wird.
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Die nukleäre Koexpression von NeuN und CD49d, sowie die cytoplasmatische Expression von Immunglobulin G (IgG) zusammen mit den CD16 tragenden Vesikeln aus 1d–f) und die Zelloberflächenexpression von CD8 und CD3 zeigen, dass diese Zelle einen abnormen Differenzierungsstatus aufweist: Eine Zelle mit Merkmalen einer T Zelle (CD3, CD8), einer neuronalen Zelle (NeuN im Zellkern), eines Monozyten (CD16) und eines B Lymphocyten (IgG).
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Proteine, die teilweise patientenspezifisch, das heißt mit individuell unterschiedlicher Wahrscheinlichkeit bzw. Häufigkeit mit CD8 und/oder CD16 in ALS-indikativen Zellen kolokalisiert sind, sind in Tabelle 1 angegeben. Alle diese Proteine stellen damit einzeln oder in Kombination mit CD8 und/oder CD16 therapeutische Zielstrukturen (Targets) dar, da ein Ausschalten dieser Proteine zu einem Zusammenbruch des intrazellulären Informationsflusses und damit zum Funktionsverlust der aberranten Zellen führt. Tabelle 1
| Protein | Offizielles Symbol | Offizieller Name |
| BMX | [BMX] | BMX non-receptor tyrosine kinase |
| GAK | [GAK] | cyclin G associated kinase |
| JNK2 | [MAPK9] | mitogen-activated protein kinase 9 |
| MAPKK6 | [MAP2K6] | mitogen-activated protein kinase kinase 6 |
| OTUB2 | [OTUB2] | OTU deubiquitinase, ubiquitin aldehyde binding 2 |
| PRKAR2 A | [PRKAR2A] | protein kinase cAMP-dependent type II regulatory subunit alpha |
| RAC1 | [RAC1] | ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Rac1) |
| SMAD2 | [SMAD2] | SMAD family member 2 |
| SMAD4 | [SMAD4] | SMAD family member 4 |
| STAP2 | [STAP2] | signal transducing adaptor family member 2 |
| SIRT1 | [SIRT1] | nicotinamide adenine dinucleotide-dependent protein deacetylase |
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Die Zelle aus 2c, f), die wie oben begründet nach Invasion der Zelle aus 1 einen CD16 negativen Phänotyp exprimiert, bleibt positiv für NeuN.
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Bedeutung: Die oben beschriebene invasive Zelle ist als ALS-spezifische Zelle mit den oben genannten Merkmalen im Blut oder in Gewebeproben durch räumliche Toponomanalyse detektierbar. Da deren Invasionsverhalten in die Pyramidenbahn wie oben dargelegt bekannt ist und da ferner bekannt ist, dass die Zelle offenbar durch Phänotyp switching (CD16-) zu einer NeuN positiven T Zelle transformiert, die Neurone axotomiert, läßt die Detektion von Zellen des CD16/CD8 Phänotyps aus 1c auf den Prozess der Axotomie schliessen. Daraus folgt, dass die Zellinvasion der Zelle aus 1c durch molekulare Blockierung oder Lyse therapeutisch verhindert werden muss, um die Axotomie zu verhindern und das Fortschreiten der ALS zu stoppen.
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Der beschriebene Zwei-Stufenprozess (Homing aberranter „NeuN“ positiver Blutzellen in die Pyramidenbahn, deren Transformation in „NeuN“ positive T Zellen, die die Oberflächen von Nervenzellen verletzen) stellt eine Verletzung grundlegender Regeln der Kooperation von Zellen verschiedener Keimblätter dar: Diese Regeln beruhen in intakten Systemen darauf, dass Zellen aus verschiedenen Keimblättern die Regel der Nicht-Verletzung der gegenseitigen Zelloberflächen befolgen. Im Fall der ALS verletzen die transformierten T-Zell-artigen Zellen (Keimblatt Mesenchym) die Oberflächen von Neuronen (Keimblatt Ektoderm). Dadurch kommt es zu einer physischen transzellulären Vernetzung der beiden Keimblattfunktionen mit der Folge der Unterbrechung der Nervenbahnen zu der Willkürmuskulatur. Die Tatsache der Expression von „NeuN“ im Zellkern der agierenden Zellen (Immunzellen in der Zirkulation und nach Invasion in das Nervensystem der Pyramidenbahn) bedeutet, dass diese Zellen einem Programm aberranter neuronaler Stammzellen folgen, da NeuN unter physiologischen Bedingungen nur in Neuronen exprimiert wird. Damit kann NeuN als Marker für das Vorliegen ALS-verursachender Zellen, das heißt zur Diagnose der ALS verwendet werden.
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Um das molekulare „Programm“ dieser aberranten Zellen zu blockieren, das heißt als Therapiemaßnahme zum Behandeln eines Patienten, der unter ALS leidet, bieten sich verschiedene extrakorporale Verfahren an, um die pathogenen Zellen, die das Leitprotein CD16 exprimieren, extrakorporal zu entfernen.
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Hierzu kann das Blut des Patienten einer therapeutischen Apherese unterzogen werden, bei welcher die pathogenen Zellen mit Hilfe von vorzugsweise immobilisierten Antikörpern und/oder Liganden, die CD16 binden, aus dem Blut entfernt werden. Alternativ oder zusätzlich können auch vorzugsweise immobilisierte Antikörper und/oder Liganden, die CD8 und/oder RAC1 und/oder STAP2 und/oder SMAD2 binden, verwendet werden. Ebenso ist es möglich, mehrere unterschiedliche Antikörper und/oder Liganden zu verwenden, die gemeinsam und/oder in Strömungsrichtung des Bluts betrachtet nacheinander angeordnet sind, so dass sich eine mehrstufige Abreicherung der pathogenen Bestandteile des Bluts ergibt. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, das Blut vor dem extrakorporalen Entfernen der pathogenen Zellen zu fraktionieren, beispielsweise durch Zentrifugation. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, das Blut durch Photopherese zu behandeln, wobei das gegebenenfalls fraktionierte Blut für eine vorbestimmte Zeit mit Licht bestimmter Wellenlänge(n) bestrahlt wird, um die pathogenen Zellen zu inaktivieren.
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Weitere Möglichkeiten, um die pathogenen Zellen mit Hilfe von Apherese-Verfahren extrakorporal zu entfernen, umfassen:
- 1. Verwendung von Molekülen (Antikörper/Liganden), die IgG (1/3) binden und/oder blockieren/inhibieren bzw. den physiologischen Mechanismus der IgG-vermittelten Aktivierung von CD16 blockieren/inhibieren. Ein Beispiel hierfür sind Antikörper gegen IgG und (gegebenenfalls rekombinantes) Streptokokken Protein G;
- 2. Blockierung (z. B. durch Quervernetzung/cross-linking) des ALS-spezifischen Clusters CD16a + CD8 + STTP1, beispielsweise mittels wenigstens eines bi-, tri- oder multispezifischen Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.), der vorzugsweise immobilisiert an einer Matrix gebunden vorliegt. STTP1 bezeichnet hierbei das gegebenenfalls Patienten-spezifische Signalprotein (signal transduction protein 1, z. B. Kinase), welches die vom Zellkern ausgehende Signalkaskade vermittelt und zusammen mit dem Modul „CD16a und CD8“ an der Oberfläche der Zelle gekoppelt bzw. mit CD16a und CD8 und kolokalisiert ist. STTP1 kann mit Hilfe der an sich bekannten MELK- und/oder ICM-Technik (Multi-Epitope-Ligand-Kartographie bzw. Imaging Cycler Mikroskopie) für den betreffenden Patienten individuell ermittelt bzw. kontrolliert werden. STTP1 kann beispielsweise ein oder mehrere Proteine aus der Gruppe RAC1, STAP2 und/oder SMAD2 und/oder ein anderes Protein aus der Signaltransduktionskette von ALS-Zellen sein. Ein entsprechender Antikörper, beispielsweise ein trispezifischer Anti-CD16a-CD8-STTP1-Antikörper, kann dann ebenfalls über an sich bekannte Herstellungsverfahren hergestellt und zur Therapie des betreffenden Patienten verwendet werden. Da ein solcher trispezifischer Antikörper eine extrem hohe Selektivität für abnorme, ALS-spezifische Zellen aufweist, ist eine solche Behandlung besonders nebenwirkungsarm;
- 3. Verwendung von Molekülen, die die proteolytische Abtrennung der extrazellulären CD16-Domänen (Ektodomänen) bewirken (sog. Shedding, bzw. Ectodomain-Shedding). Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung von vorzugsweise immobilisiertem Adam17 (Metallopeptidase Domäne 17), das auch TACE (tumor necrosis factor-α-converting enzyme) genannt wird. Adam17 ist ein 70-kDa Enzym, das zur ADAM Proteinfamilie von Disintegrinen und Metalloproteasen gehört. Adam17 bzw. das jeweilige CD16-Shedding-fähige Molekül kann optional mit einem mono-, bi-, tri- oder multispezifischen Antikörper (siehe Punkt 2) gekoppelt sein bzw. werden, um seine Spezifität vorteilhaft zu erhöhen;
- 4. Verwendung wenigstens eines mono-, bi-, tri- oder multi-spezifischen Anti-CD16 Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.), der vorzugsweise an einem Matrixmaterial immobilisiert ist;
- 5. Verwendung wenigstens eines mono-, bi-, tri- oder multi-spezifischen Anti-NeuN Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.), der vorzugsweise an einem Matrixmaterial immobilisiert ist;
- 6. Verwendung von Streptameren und/oder magnetic beads zur Entfernung der pathogenen CD16-Zellen.
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Dabei kann es vorgesehen sein, dass die pathogenen Zellen nicht oder nicht vollständig aus der Blutprobe entfernt werden, sondern extrakorporal inaktiviert werden, so dass sie ihre biologische Funktionalität verlieren.
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Die oben genannten Verbindungen (Arzneimittel) können grundsätzlich einzeln oder in beliebiger Kombination im Rahmen eines Apherese-Verfahrens verwendet werden. Die Wirksamkeit und der Umfang der Entfernung sollte durch regelmäßige Kontrolle überprüft und gegebenenfalls angepasst werden. Die Kontrolle kann beispielsweise mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Diagnose-Verfahrens durchgeführt werden. Bei erfolgreicher Entfernung können üblicherweise signifikant weniger oder vorzugsweise keine abnormen ALS-spezifischen Zellen (siehe oben) mehr in der Zell- bzw. Blutprobe des betreffenden Patienten festgestellt werden.
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Generell ergeben sich damit zahlreiche ALS-spezifische überindividuelle und/oder indivduelle thereutische Optionen. Eine überindividuelle Therapie kann auf die ALS-spezifischen Oberflächenproteine (CDs) bzw. Oberflächenproteincluster gerichtet sein, die quervernetzt, inhibiert oder an eine Matrix gebunden werden. Zusätzlich können gegebenenfalls zentrale Signalketten-Moleküle von ALS-Zellen quervernetzt, inhibiert oder anderweitig blockiert werden. Beispielsweise können die Zelloberflächenproteine CD8/CD16A/CD45RA gegebenenfalls zusammen mit dem Signalketten-Molekül RAC1 extrakorporal blockiert werden, da diese ausschließlich in ALS-Zellen direkt assoziiert vorkommen. Eine solche Therapie kann beispielsweise mit Hilfe von bi-, tri- und/oder tetraspezifischen Antikörpern bzw. durch entsprechende variable Einzelkettenfragmenten (scFv) oder multivalente Antikörperfragmente (scFv Multimere), das heißt durch sogenannte Diabodies, Triabodies oder Tetrabodies erfolgen.
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Als individuelle Targets, die alternativ oder zusätzlich zu dem vorstehend bezeichneten ALS spezifischen Cluster therapeutisch adressiert werden können, umfassen individuelle Cluster von CD16/CD8 mit den Molekülen STAP2 und/oder SMAD2 sowie gegebenenfalls Kombinationen der in Tabelle 1 bezeichneten Moleküle zusammen mit dem CD8/CD16 Cluster oder auch als isolierte Cluster ohne CD8/CD16. Auch diese Cluster können mit Hilfe von gegebenenfalls multispezifischen Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten ausgeschaltet werden.
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3 zeigt eine schematische Darstellung der topologischen Hierarchie von Proteinen innerhalb eines Toponoms. Die Proteine sind mit den Symbolen Stern, Quadrat, Dreieck und Fünfeck symbolisiert. Man erkennt, dass das mit Stern symbolisierte Protein in allen drei CMPs 1–3 vorkommt, so dass es sich bei diesem Protein um ein Leitprotein (L, 1, True) handelt. Demgegenüber kommt das mit Quadrat bezeichnete Protein in keinem der CMPs 1–3 vor, so dass es sich bei diesem Protein um ein antikolokalisiertes Protein (A – absent, 0, False) handelt. Die anderen Proteine (Dreieck, Fünfeck) sind variabel mit dem Leitprotein assoziiert und stellen damit sogenannte Wildcard-Proteine dar (W, *).
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4 zeigt eine Toponomkarte, die die Lage der 30 häufigsten aus mehr als 2.000 verschiedenen CMPs bei Prostatakrebs zeigt. Die Lage dieser CMPs im Gewebe ist als Overlay mit einem CD138 Fluoreszenzsignal gezeigt.
4 veranschaulicht die Position dieser CMPs durch ihre unterschiedlichen Farben (resp. Graustufen), die an dem CD138 Fluoreszenzsignal ausgerichtet sind. Relevante CMPs sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt und haben CD26 und CD29 als Leitproteine (= L), während in all diesen CMPs CD3 / CD4 / CD8 / CD19 / CD20 / CD44 / CD80, abwesend sind (anti-kolokalisiert, A, 0), und CD10 / CD13 / CD38 / CD49d / CD54 / CD58 / CD138 variabel assoziiert sind (W, *). Wie erwähnt ergibt dies den Symbolcode (L, A, W) für die Protein-Cluster (CMP-Motiv). Damit konnten CD26 und CD29 als Leitproteine auf den Zellenoberflächen von Zellen von Prostatagewebe eines Patienten identifiziert werden kann, der von Prostatakrebs betroffen ist. Tabelle 2
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5 zeigt eine Darstellung der selektiven Expression des Prostatakrebs-spezifischen CMPs in subzellulären Stellen von neoplastischen Prostata Acini. 5 veranschaulicht die selektive Expression von CMP1 in subzellulären Stellen von neoplastischen Prostata Acini. CMP1 ist die häufigste CMP innerhalb des CMP-Motiv der Tabelle 2. 5a zeigt eine Übersicht, in der Pfeil 1 und Pfeil 2 apikale Stellen von sekretorischen Zellen kennzeichnen, während Pfeil 3 Projektionen an der basolateralen Stelle eines Acinus kennzeichnet. 5b–c zeigen Details, die durch Pfeile gekennzeichnet sind. Man erkennt die ringförmige Anordnung des CMP1 (braune Farbe) mit dem Zelloberflächenfluoreszenzsignal von CD133 (weiß). "BE" bedeutet basale epitheliale Zellschicht. (Bars: 5a: 100 µm; 5b–d:. 10 µm)
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Dementsprechend kann Prostatakrebs analog zur ALS durch extrakorporales Entfernen von Bestandteilen und Zellen behandelt werden, welche CMPs aufweisen, die zumindest CD26 und/oder CD29 als krankheitsspezifische Leitproteine umfassen. Hierzu kann beispielsweise ein Aphereseverfahren verwendet werden, bei welchem die CD26/CD29 exprimierenden Zellen in der oben beschriebenen Weise abgetrennt und/oder inaktiviert bzw. zerstört werden.
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6 zeigt eine Illustration der zyklischen Lokalisierung von 25 Biomolekülen und die nachfolgende Ermittlung der CMPs mit Hilfe des MELK/ICM Verfahrens. 6a zeigt eine optische Ebene aus 20 gemeisam gemappten Ebenen in der z-Richtung und dient zur Veranschaulichung der Fluoreszenzsignale der in 7 angegebenen Biomoleküle. 6b veranschaulicht die Binarisierung der parallel gezeigten Primärsignale von 6a. 6c zeigt 2D-Karten der resultierenden kombinatorischen molekularen Phänotypen (CMPs), die für alle Datenpunkte aus dem binären Datensatz (6b) berechnet werden. 6d zeigt zwei beispielhafte CMPs aus den Datenpunkten (6b).
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7 zeigt Toponomabbildungen zur Gewebeorganisation eines kutanen Lymphoms (Bars: in a–d, j: 10 μm, in f, g, k: 1 μm). 7a zeigt eine 3D-Cokartierung von 3213 CMPs (aus 7161 CMPs) innerhalb eines Bereichs einer Kryosektion einer von einem kutanen Lypmhom (Mycosis fungoides) betroffenen Gewebeprobe eines Patienten gemäß 7b (eingekastelter Bereich). Unterschiedliche CMPs sind mit unterschiedlichen Farben kodiert. 7b zeigt ein Phasenkontrastbild der kryogenen Hautsektion, in der Nuclei für Histone blau eingefärbt sind, während die Basallamina für CD49f weiß gefärbt ist. 7c zeigt eine Vergrößerung des eingekastelten Bereichs (7b) und ist identisch wie 7d ausgerichtet, in welcher die Leitproteine der CMPs von 7a gezeigt sind. Man erkennt einen länglichen multizellulären Komplex von fünf Zelltypen (Zellen 1–5 in a, d, c). Eine längliche Zellprojektion (Pfeil 1 in a) der Zellen 3, 4, 5 erstreckt sich von der Dermis über die Basallamina (a, BL) in die Epidermis, wo sie nahe an CD8+/CD3+ T-Zellen liegt (Zelle 2 in a, c, d, braune Farbe in d und benachbarter Keratinozyt (Zelle 1 in a, c, d)). 7e zeigt Details eines suprabasalen Teils dieser Struktur aus unterschiedlichem Blickwinkel (e, f, g, h). Eine Zytokeratin-enthaltende Zellprojektion (CK) erstreckt sich vom Keratinozyt (e, Pfeil) weg und projiziert durch die CD8+/CD3+ T-Zelloberfläche (vergleiche h, welche CK in grün zeigt; vergleiche g, welche das gleiche ohne CK zeigt). 7k zeigt einen transversen virtuellen anatomischen Schnitt durch die CD8+/CD3+ T-Zelle (Zelle 2 in j). Die Projektion des Keratinozyten dringt in die T-Zelle ein (Pfeil). 7i zeigt eine Liste der kokartieren Moleküle. 7l spezifiziert das für das kutane Lymphom charakteristische CMP-Motif:
L: HLA-DQ
A: CD2, CD10, CD18, CD54, CD57, CD58, CD62L, CD80
W: CD3, CD4, CD7, CD8, CD13, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD56, CD71, HLA-DR, Cytok., Histone.
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Dementsprechend kann das kutane Lymphom analog zur ALS durch extrakorporales Entfernen von Bestandteilen und Zellen behandelt werden, welche CMPs aufweisen, die zumindest HLA-DQ als krankheitsspezifisches Leitprotein umfassen. Hierzu kann beispielsweise ein Aphereseverfahren verwendet werden, bei welchem die HLA-DQ exprimierenden Zellen in der oben beschriebenen Weise abgetrennt und/oder inaktiviert bzw. zerstört werden.
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Das Verfahren kann daher grundsätzlich eine Kombination der Toponomtechnologie mit Verfahren der Isolierung von Zellen aus Körperflüssigkeiten und/oder Geweben umfassen. Durch Anwendung der Toponomtechnologie können Zellen durch Kokartierung von tausenden Multiproteinkomplexen extrem genau klassifiziert werden. Auf diese Weise werden die krankheitsspezifische Zellen bzw. CMPs gefunden. Die betreffenden Zellen können dann mit Hilfe an sich bekannter Verfahren gezielt isoliert werden und für diverse Zwecke weiter verwendet werden, z. B. Klonierung, extrakorporale Expansion, Re-Transfer in Gewebe bzw. Blut, therapeutische Anwendungen etc. Ein besonderer Aspekt ist die Isolierung von krankheitsspezifischen Zellen aus der Blutzirkulation, die als autoimmune Zellen oder aberrante Zellen des Immunsystems in Organe einwandern, wo sie gezielt Gewebestrukturen zerstören. In dem letzteren Fall wäre z. B. die Isolierung solcher Zellen aus der Blutzirkulation durch eine therapeutische Apherese/Photopherese eine sehr zielgerichtete Massnahme mit dem Ziel des Stopps der Krankheitsprogression, da die krankheitsspezifischen Zellen durch hochdimensionale Toponomkartierung exakt vordefiniert werden können, sodass sie gezielt über antikörperbasierte Isolierung aus der Zirkulation entfernt werden können. Über konsekutives Monitoring mittels Toponomkartierung des Blutes kann die Effizenz des Verfahrens kontrolliert werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der Verwendung solcher Zellen für die Entwicklung von Medikamenten zur selektiven Blockierung / Eliminierung solcher Zellen oder, im Falle von Stammzellen, zur Reinfusion in den Organismus (z. B. therapeutische Organregenration oder Tumortherapie), oder zur Verwendung für die Entwicklung von Diagnostika, oder für die Therapie der amyotrophen Laterasklerose (ALS) oder anderer Erkrankungen durch Entfernung von pathogenen Zellen aus der Blutzikulation, um deren biologischen Mechanismus, im Fall von ALS die Invasion in das Motoneuronsystem und deren neurotoxische Schädigungsmechanismen, zu verhindern.
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Die in den Unterlagen angegebenen Parameterwerte zur Definition von Prozess- und Messbedingungen für die Charakterisierung von spezifischen Eigenschaften des Erfindungsgegenstands sind auch im Rahmen von Abweichungen – beispielsweise aufgrund von Messfehlern, Systemfehlern, Einwaagefehlern, DIN-Toleranzen und dergleichen – als vom Rahmen der Erfindung mitumfasst anzusehen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 6150173 [0011]
- DE 19709348 A1 [0011]
- EP 0810428 A1 [0011]
- DE 10043470 A1 [0011]
- WO 02/21137 A2 [0011]
