WO2012045716A1

WO2012045716A1 - Verfahren zur diagnose und/oder prognose von krebserkrankungen durch analyse der mechanischen eigenschaften von tumorzellen

Info

Publication number: WO2012045716A1
Application number: PCT/EP2011/067271
Authority: WO
Inventors: Josef KÄS; Jochen Guck
Original assignee: Universität Leipzig
Priority date: 2010-10-04
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2012-04-12
Also published as: DE102010041912B3; JP2013541338A; CA2813653A1; EP2624742A1; US20130316390A1

Abstract

Ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, zur Diagnose des Ursprungsortes von Tumorzellen, zur Therapieoptimierung von Krebspatienten, und zum Screening von Wirkstoffen für die Onkologie. Bei den Verfahren werden die mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen und Referenzzellen unter einer mechanischen Belastung analysiert, die zur linearen oder nicht - linearen Deformation der jeweiligen belasteten Zelle führt. Anhand der Dehnung der Zellen, die aus dem Eintrag einer gerichteten mechanischen Spannung resultiert, wird das Risiko für Tumormetastasen und ggf. das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden und/oder invasiven Zellen, oder das Ursprungsgewebe des Tumors ermittelt. Das Risiko für Tumormetastasen wird dabei anhand des Anteils von Zellen in der Probe, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen, bestimmt. Das Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen wird bei nicht - linearer Verformung der Zelle anhand des Mittelwerts der Dehnung in Spannungsrichtung von Zellen in der Probe ermittelt.

Description

Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen durch Analyse der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, zur Diagnose des Ursprungsortes von Tumorzellen, zur Therapieoptimierung von Krebspatienten, und zum Screening von Wirkstoffen für die Onkologie bei dem die mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen und Referenzzellen aus Normalgewebe analysiert werden und aus der Dehnung der Zellen, die aus dem Eintrag einer gerichteten mechanischen Spannung resultiert, die Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen getroffen wird. Die Erfindung findet Anwendung in der Forschung, der Medizin und der Pharmazie.

Unter der Bezeichnung Krebs und Krebserkrankungen wird eine ganze Krankheitsklasse zusammengefasst, die gemeinsam haben, dass sie maligne Tumore bilden. Bis heute wurden mehr als 200 verschiedene Tumore identifiziert. Charakteristisch für alle malignen Tumore ist die unkontrollierte Proliferation der Zellen, die Fähigkeit gesundes Gewebe verdrängen zu können (Invasion des benachbarten Gewebes) und Metastasen in Gewebe des ganzen Körpers ausbilden zu können (Fernmetastasen). Diese drei Prozesse sind für das Fortschreiten von Krebs charakteristisch und sie werden als Kriterien zur Klassifizierung von Krebs in die Krebsstadien I, II, III und IV (bzw. A - D) bzw. zur Stadieneinteilung mittels TNM-Klassifikation, und damit zur Aussage über die Aggressivität der Erkrankung, herangezogen. Ab Stadium III (C) ist feststellbar, dass der Tumor über sein Entstehungsgebiet hinauswächst und das umliegende Gewebe verdrängt. Ab Stadium IV (D) sind Fernmetastasten feststellbar. Je nach Krebsstadium ist eine unterschiedliche Behandlung empfehlenswert, um einen Heilungserfolg zu erzielen. Insofern ist die Einschätzung der Aggressivität der Tumorzellen von hoher Bedeutung, um das geeignete Therapieverfahren für einen Patienten auszuwählen. Ferner ist es von Bedeutung, dass eine Klassifikation so früh wie möglich vorgenommen werden kann, um eine geeignete Therapie auszuwählen. Bisher ist es nicht möglich, anhand von Primärtumorproben festzustellen, ob bereits ein fortgeschrittenes Stadium mit Metastasenbildung vorliegt.

Die Diagnose von Krebserkrankungen wird nach Beschwerden des Patienten durch bildgebende Verfahren, wie MRT, CT und dergleichen, sowie durch den Nachweis von spezifischen Tumormarkern bestätigt. Tumormarker sind vorwiegend Proteine oder Peptide, die im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten des Patienten oder auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden und deren erhöhte Konzentration auf einen Tumor hinweist. Da sich maligne Tumorzellen aus mutierten Zellen des Normalgewebes entwickeln, sind die Tumormarker auch auf Zellen des Normalgewebes nachweisbar und zeichnen sich in Tumoren lediglich durch ihre unterschiedliche Häufigkeit aus. Eine Vielzahl an unterschiedlichen Tumormarkern wurde mit diversen Krebserkrankungen in Verbindung gebracht. Aufgrund deren geringer Spezifität für Tumorzellen sind diese für diagnostische Zwecke überwiegend ungeeignet. Eine Klassifizierung in Krebsstadien anhand von Tumormarkern ist derzeit nicht möglich. Zur endgültigen Diagnose wird derzeit eine pathologische Untersuchung von Tumorschnitten vorgenommen. Zu Analyse, wie weit ein Tumor bereits fortgeschritten ist, ist es mit derzeitigen Untersuchungsmethoden erforderlich, direkt nach der Tumormetastase zu suchen, und dazu beispielsweise verdächtiges Gewebe (z. B. Lymphknoten) zu entfernen.

Dadurch und mithilfe bildgebender Verfahren ist es möglich, eine Klassifizierung der Krebserkrankung vorzunehmen. Metastasen können erst zu dem Zeitpunkt festgestellt werden, wenn sie ausreichend große Zellverbände ausgebildet haben, so dass sie im jeweiligen Verfahren sichtbar sind. Eine beginnende Metastasierung ist hingegen schwer nachweisbar.

Abweichend von der verbreiteten Analyse von Proteinen, insbesondere Oberflächenproteinen, als Tumormarker, und damit von der Analyse biochemischer Eigenschaften der Zelle zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen wurde festgestellt, dass in Tumorzellen im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe Veränderungen im Zytoskelett stattgefunden haben, die in einer Änderung der mechanischen (hierin auch„biomechanischen") Eigenschaften der Zelle resultieren.

So ist bekannt, dass sich aufgrund mechanischer Eigenschaften des Zytoskeletts von Zellen eine Aussage über die Proliferation der Zellen treffen lässt [Lekka at al. 1999, Guck et al. 2005, Cross et al. 2007, Remmerbach et al . 2009] . Es wurde festgestellt, dass Tumorzellen, also Zellen, die unkontrolliert proliferieren, eine höhere Deformierbarkeit im Vergleich zu Normalgewebe aufweisen. Eine nochmals gesteigerte Deformation wurde für Brustkrebs auch in Assoziation mit einem Risiko für die Migration der Zellen und damit der Metastasenbildung gebracht [Guck et al. 2005, Ward et al. 1991]. Diese höhere Deformierbarkeit der Tumorzellen wird damit begründet, dass Aktinfilamente der Zellen, die in der Interphase vorliegen, mit Eintritt der Zelle in die Mitose zurückgebildet werden und Aktin danach in diffuser Verteilung im Zytoplasma der Zellen vorliegt [Sanger et al. 1975] . Weiter wird davon ausgegangen, dass Aktin in Tumorzellen herunterreguliert wird [Rao & Cohen 1991] . Gerade Aktin in der Form von Filamenten trägt zur Stabilisierung der Zellen bei, so dass die höhere Deformierbarkeit von Zellen als geeigneter Marker für eine unkontrollierte Proliferation von Zellen herangezogen werden kann. Diese erhöhte Deformierbarkeit der Tumorzellen wird bei mechanischen Belastungen beobachtet, die eine lineare Verformung der Zelle zur Folge haben. Neben Aktin können auch andere Zytoskelettelemente wie Mikrotubuli, intermediäre Filamente und deren assoziierte Vernetzungs- und Motorproteine einen Einfluss auf die Zellmechanik haben.

Die US 6,067,859 offenbart mit dem sogenannten optischen Strecker (engl, optical stretcher) ein Verfahren, mit dem die Deformation von Zellen unter Belastung bewirkt werden kann. Dabei wird durch zwei gegenläufige Laserstrahlen eine deformierende mechanische Spannung auf die zu analysierenden Zellen ausgeübt, die in einer viskoelastischen Deformation der Zelle resultieren. Die Zugspannung, die durch die Laserstrahlen erzeugt wird, resultiert zum Zeitpunkt der Belastung (anlegen der mechanischen Spannung) in einer Verlängerung der Zelle entlang der Hauptachse der Zelle, die entlang der Laserstrahlen orientiert ist. Die dabei ermittelte Dehnung, also die relative Längenänderung der Zelle entlang der Spannungsrichtung, ist für Tumorzellen größer als für Normalgewebe. Die Längenveränderung der Zelle wird optisch durch ein Mikroskop verfolgt, so dass die Dehnung ermittelt werden kann.

Allein die Aussage, dass Zellen eine höhere Deformierbarkeit aufweisen, genügt jedoch nicht, um eine Krebsdiagnose bzw. Prognose zu treffen. Auch andere Zellen, die sich gerade in der Teilung befinden, weisen derartige Veränderungen des Zytoskeletts auf. Um eine belastbare Prognose der Krebserkrankung zu treffen, muss ebenfalls eine Aussage über die Metastasenwahrscheinlichkeit bzw. die Invasion der Zellen in umliegende Gewebe vorgenommen werden. Wie bereits ausgeführt, lässt sich die Metastasierung derzeit erst in einem verhältnismäßig späten Stadium, nämlich nach Ausbildung der Metastase, mit bildgebenden Verfahren ermitteln.

Es besteht somit ein Bedarf, metastasierende oder invasive Zellen durch besondere Eigenschaften des Zytoskeletts zu charakterisieren und diese Eigenschaften zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen heranzuziehen. Durch besondere biomechanische Eigenschaften, die mit der Metastasenwahrscheinlichkeit oder der Invasivität von Zellen assoziiert sind, besteht ein neuartiger Therapieansatz für die Krebstherapie, indem mechanische Eigenschaften der Zelle verändert werden. Es besteht auch Bedarf daran, auf diese Weise Wirkstoffe für die Therapie eines Patienten durch patientenspezifisches Wirkstoffscreening auszuwählen, um so die Heilungschancen zu verbessern.

Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen, mit dem durch die Analyse von bisher unbekannten mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen eine Aussage über das Risiko von Tumormetastasen und ggf. das Vorhandensein invasiver Zellen in einem Patienten getroffen werden kann. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Screeningverfahren bereitzustellen, mit dem potentielle Wirkstoffe für die Krebstherapie identifiziert werden, die die biomechanischen Eigenschaften der Tumorzellen beeinflussen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist e s, durch gezielte s Wirkstoffscreening eine an die Bedürfnisse des Patienten individuell angepasste Therapie zu ermöglichen. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, durch Analyse der biomechanischen Eigenschaften von Tumorzellen eines Patienten Rückschlüsse auf den Ursprungsort eines Tumors zu treffen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, welches die Analyse der Dehnung von Zellen unter mechanischer Belastung umfasst, wobei die Zellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten (nachfolgend Patientenprobe) erhältlich sind. Bei dem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahren wird a) auf jeweils eine Zelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt, dass eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist. Zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung wird die Dehnung der Zelle entlang der Spannungsrichtung bestimmt. b) Der Anteil der Zellen in der Patientenprobe, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, wird mit Referenzdaten verglichen. Dabei zeigt ein höherer Anteil von Zellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, in der Patientenprobe als bei den Referenzdaten ein höheres Risiko von Tumormetastasen an.

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass bei der Analyse von Tumorzellen in einem optischen Strecker unter Eintrag einer geringen mechanischen Spannung von 1-2 Pa ein geringer Anteil der Zellen keine positive Dehnung in Spannungsrichtung, also eine positive relative Längenänderung, zeigte, sondern im Gegenteil ein kontraktiles Verhalten zeigte (Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung). Damit ist gemeint, dass unter der mechanischen Belastung eine Verringerung des Zelldurchmessers („Zusammenziehen der Zelle") festgestellt wurde, obwohl die eingetragene mechanische Spannung eigentlich eine Vergrößerung des Zelldurchmessers verursachen müsste. Dieses Verhalten bezeichnet hierin eine Dehnung, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung gerichtet ist.

Es wurde durch die Erfinder festgestellt, dass in Normalgewebeproben keine bzw. nur sehr wenige Zellen dieser Eigenschaft auftreten, wohingegen in Gewebeproben aus Tumoren ein deutlich höherer Anteil dieser Zellen auftritt. Die Häufigkeit der Zellen, die unter gerichteter mechanischer Belastung eine Dehnung entgegensetzt zur Spannungsrichtung aufweisen, wurde in exemplarischen Gewebeproben aus Tumoren auf etwa eine Zelle je 100 Zellen beziffert.

Diese Zellen wurden isoliert und zeigten unterschiedliche biologische Eigenschaften, als die übrigen Zellen aus Tumorgewebe (die im optischen Strecker eine positive Dehnung unter mechanischer Belastung aufweisen). Diese Eigenschaften deuten daraufhin, dass diese Zellen an der Metastasierung beteiligt sind . Eine Co-Kultur aus Zellen aus Normalgewebe mit unsortierten Zellen aus Tumorgewebe (Klassifikation Tlb) zeigte, dass sich die Tumorzellen während der Kultur vom Normalgewebe isolieren und Cluster bilden. Die Tumorzellen zeigen beim Wachstum also eine Affinität zu gleichartigen Zellen und lagern sich so während der Kultur zusammen. Eine Vermischung mit Normalgewebe erfolgt kaum. Gerade bei der Metastasierung findet jedoch ein Übergang der Tumorzelle in Gewebe anderen Ursprungs statt. Eine Co-Kultur aus Zellen aus Normalgewebe mit sortierten kontraktilen Zellen aus Tumorgewebe (Klassifikation T3b und T4) zeigte, dass die sortierten kontraktilen Tumorzellen keine Cluster bilden und die Vermischung mit den Zellen des Normalgewebes auch während der Kultur erhalten bleibt. Die sortierten, kontraktilen Zellen haben also die Affinität zu gleichartigen Zellen verloren (Fig. 2). Ein höherer Anteil von Zellen in der Probe, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung unter mechanischer Belastung aufweisen, im Vergleich zu Referenzdaten aus Normalgewebe bedeutet somit, dass die analysierte Probe mehr Zellen enthält, die metastasieren können.

Es kann somit durch die Analyse dieser mechanischen Eigenschaften (kontraktiles Verhalten bei mechanischen Belastungen im linearen Verformungsbereich) von Tumorzellen eine Aussage darüber getroffen werden, ob ein erhöhtes Risiko von Tumormetastasen vorliegt.

Es ist ferner bekannt, dass Zellen aus Tumorgewebe unter mechanischen Belastungen in einem Bereich, in dem eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, einerseits einen höheren Anteil an Zellen enthalten, die eine erhöhte positive Dehnung unter Zugbelastung (also eine Dehnung in Richtung der Spannung) im Vergleich zu Zellen des Normalgewebes aufweisen und dass andererseits die Bandbreite der Dehnung größer ist, als bei Zellen des Normalgewebes. Dies wurde in der Auflösung der Aktinfilamente des Zytoskeletts der Zellen nach Eintritt in die Mitose begründet. Diese höhere Dehnbarkeit von Tumorzellen unter mechanischen Belastungen, die eine lineare Verformung der Zelle verursachen, kann zusätzlich als Maß für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen herangezogen werden. Metastatische Zellen weisen im Vergleich zu nicht- metastatischen Tumorzellen eine nochmals höhere Deformierbarkeit auf. Auch die Bandbreite der Dehnung ist nochmals höher (Fig. 3). Insofern kann eine höhere Deformierbarkeit der Zellen der Patientenprobe im Vergleich zu Zellen des Normalgewebes sowohl zur Ermittlung eines erhöhten Risikos für das Vorhandensein unkontrolliert proliferierender Zellen als auch zur Ermittlung des Risikos für Metastasenbildung herangezogen werden. Da bei der Analyse der Dehnung von Zellen einer Patientenprobe unter mechanischer Belastung üblicherweise der Abgleich mit nur einer Referenzprobe erfolgt, ist zu einer belastbaren Aussage über das Metastasenrisiko zusätzlich der Anteil der Zellen, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung unter mechanischer Belastung aufweisen, heranzuziehen. Allein die Feststellung, dass ein höherer Anteil an Zellen in der Patientenprobe vorliegt, die eine höhere Dehnung unter mechanischer Belastung aufweisen, als Zellen des Normalgewebes, ist nicht ausreichend, um eine sichere Aussage über das Metastasenrisiko zu treffen, weil dazu eine Referenz erforderlich ist und keine absoluten Grenzwerte zur Bestimmung ausreichen. Dafür wäre ein weiterer Vergleich mit nicht-metastatischen Tumorzellen notwendig, die jedoch üblicherweise nicht von demselben Patienten vorliegen. Insofern ist die Feststellung, dass ein höherer Anteil an Zellen in der Patientenprobe vorliegt, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung unter mechanischer Belastung aufweisen, in Kombination mit der Feststellung, dass die Bandbreite der Dehnung der Zellen in Spannungsrichtung und der Mittelwert dieser Dehnung in der Patientenprobe signifikant höher ist als in der Referenzprobe (z. B. Normalgewebe) sehr vorteilhaft zur Feststellung eines erhöhten Metastasenrisikos geeignet. Es ist jedoch auch bereits allein aus dem höheren Anteil von Zellen mit einer Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung in der Probe, im Vergleich zur Referenzprobe möglich, das Risiko von Tumormetastasen zu ermitteln. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst vorzugsweise zusätzlich die Bestimmung, ob ein Risiko von unkontrolliert proliferierenden Zellen in der Probe vorliegt, wobei

c) der Mittelwert der Dehnung der analysierten Zellen der Patientenprobe, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung in Spannungsrichtung aufweisen mit den Referenzdaten verglichen wird. Dabei zeigt ein höherer Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung in der Patientenprobe als in den Referenzdaten ein höheres Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen an.

Liegen bei mechanischen Belastungen in einem Bereich, bei dem eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, sowohl ein höherer Anteil von Zellen vor, die unter der Belastung eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen als auch ein höherer Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung, jeweils im Vergleich zu den Referenzdaten, so besteht für den Patienten ein hohes Risiko für einen aggressiven Tumor, wie er durch unkontrollierte Proliferation und durch die Anwesenheit von Tumorzellen, die Metastasen bilden können, verursacht wird.

Zusätzlich zum Mittelwert der Dehnung der Zellen (die eine Dehnung in Spannungsrichtung aufweisen) wird vorzugsweise zusätzlich die Verteilung (Häufigkeitsverteilung) der Dehnung von Zellen, die eine Dehnung in Richtung der deformierenden Spannung aufweisen, berücksichtigt. Nicht nur ein höherer Mittelwert, sondern auch Unterschiede in der Verteilung der Dehnung können zur Aussage über das Risiko für das Vorhandensein unkontrolliert proliferierender Zellen herangezogen werden.

Zum Vergleich der Verteilung werden vorzugsweise der Mittelwert und die Standardabweichung (bei einer Normalverteilung der Probe) bzw. der Median und der Abstand zwischen 25 % und 75 % Quantile (bei nicht-normaler Verteilung) sowie ggf. die minimale und maximale Dehnung in Spannungsrichtung der untersuchten Zellen der Probe verglichen. Wird ein erfindungsgemäßes Verfahren nach dem Prinzip des optischen Streckers durchgeführt, so sind sowohl ein höherer Mittelwert und eine größere Standardabweichung (bei einer Normalverteilung der Probe) bzw. ein höherer Median und größerer Abstand zwischen 25 % und 75 % Quantile (bei nicht-normaler Verteilung) und eine geringere minimale und/oder eine höhere maximale Dehnung (in Richtung der Spannung) ein Anzeichen für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen.

Von einer schmaleren Verteilung wird dann gesprochen, wenn die Standardabweichung (bei Normalverteilung) bzw. der Abstand zwischen 25 % und 75 % Quantile (bei nicht-normaler Verteilung) im Vergleich zu Referenzdaten geringer ist.

In einer Ausgestaltung der Erfindung wird alternativ oder zusätzlich zur Dehnung der Zelle unter mechanischer Belastung auch das Relaxationsverhalten der Zelle analysiert. Als Parameter für das Relaxationsverhalten wird die relative Relaxation ermittelt, die angibt, wie weit die Zelle in ihren Ausgangszustand (vor Ausübung einer mechanischen Belastung) zurückkehrt. Für die Ermittlung der relativen Relaxation werden folgende Parameter bestimmt:

die ursprüngliche Ausdehnung der Zelle vor der Messung, ohne Ausübung einer mechanischen Spannung (L₀);

anschließend die Ausdehnung der Zelle unter Ausübung einer mechanischen Spannung, bei der eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist (L_s), wobei die Ausdehnung L_s zu einem Zeitpunkt t_s bestimmt wird, zu dem die mechanische Spannung noch auf die Zelle ausgeübt wird;

anschließend daran die Ausdehnung der Zelle in Abwesenheit der mechanischen Spannung (L_R), wobei die Ausdehnung L_R zu einem Zeitpunkt t_R bestimmt wird, zu dem die mechanische Spannung nicht mehr auf die Zelle ausgeübt wird (vorzugsweise ist t_R zwischen 1 und 5 Sekunden nachdem keine mechanische Spannung mehr auf die Zelle ausgeübt wird).

Nachdem keine mechanische Spannung mehr auf die Zelle ausgeübt wird, relaxiert diese in Richtung ihres Ursprungszustandes. Aus der Differenz der Dehnung (relative Deformation der Zelle) nach der Relaxation der Zelle zum Zeitpunkt t_R und der Dehnung unter Spannungseintrag zum Zeitpunkt t_s wird die relative Relaxation der Zelle ermittelt. Entsprechend kann die relative Relaxation R der Zelle mit folgendem Zusammenhang beschrieben werden:

R= (L_R-L_S)/L₀ (1)

Durch die Bestimmung des Relaxationsverhaltens kann vorteilhaft eine Aussage über das Risiko für das Vorliegen unkontrolliert proliferierender Zellen und über das Vorhandensein von invasiven Zellen getroffen werden. Weiterhin gilt: je kleiner der Mittelwert der relativen Relaxation R der Zellen der Patientenprobe ist, desto höher ist das Risiko für Tumormetastasen.

Hinter der Bestimmung des Relaxationsverhaltens liegt folgende Beobachtung:

Es wird davon ausgegangen, dass Zellen viskoelastische Objekte sind, die ihre Zellform aktiv verändern können. Bei rein elastischen Objekten sind Deformation und Relaxation spiegelbildliche Prozesse, bei rein viskosen Objekten findet hingegen überhaupt keine Relaxation statt. Bei der Betrachtung eines viskoelastischen Objekts, wie einer Zelle, wird erwartet, dass sich Zellen, die steifer sind (also unter Eintrag einer mechanischen Spannung eine geringere Dehnung aufweisen) auch stärker relaxieren. Umgekehrt würde für Tumorzellen, die eine höhere Dehnung als Zellen des Normalgewebes (unter Eintrag einer mechanischen Spannung, bei der eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist) aufweisen, eine schwächere Relaxation als bei Zellen des Normalgewebes erwartet. Überraschenderweise konnte anhand der Analyse von Gewebe aus Brusttumoren gezeigt werden, dass Tumorzellen ein genau umgekehrtes Verhalten aufweisen, und noch stärker relaxieren, als Zellen des Normalgewebes, hier Brustgewebe (Fig . 6) . Es konnte gezeigt werden, dass Tumorzellen schneller relaxieren als Zellen des Normalgewebes, d. h. ihre Verteilungsfunktion zeigt mehr negative Werte, und dieser Effekt nimmt mit zunehmendem Fortschreiten des Krebses (Tumorstaging) zu.

Die Beobachtung, dass metastasierende Zellen ein der Spannungsrichtung entgegen gerichtetes Dehnungsverhalten aufweisen (und es sich somit um ein aktives Verformungsverhalten der metastasierenden Zellen unter Spannungseintrag handelt), werden durch die Beobachtungen beim Relaxationsverhalten der Tumorzellen bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass beim Fortschreiten einer Kreb serkrankung zunehmend mehr Zellen auftreten, die ein derartige s aktives Verformungsverhalten zeigen. Während diese Eigenschaft der Zellen durch die Bestimmung der Dehnung unter Spannungseintrag erst nachweisbar wird, wenn die Zellen bereits so geartet sind, dass diese den Zellverbund verlassen können und Metastasen bilden (Tumoren ab Stadium 3), so ist das aktive Verformungsverhalten der Zellen anhand der Relaxation bereits bei nicht metastierenden Zellen (Stadium 1 und 2) zu beobachten. Dies lässt sich durch den unterschiedlichen Kraftaufwand der Zelle für die jeweilige Verformung erklären. Bei der Relaxation muss die Zelle keiner zusätzlich eingetragenen Spannung entgegenwirken, wie dies bei der Ermittlung der Dehnung unter Spanungseintrag der Fall ist. Daher wird von der Zelle für den Verformungsvorgang der Relaxation weniger Kraft benötigt, als für die Verformung unter Spannung . Bei fortschreitender Krankheitsentwicklung nimmt die Zahl der Zellen, die ein aktives Verformungsverhalten zeigen, zu, so dass sich der Mittelwert der relativen Relaxation immer weiter zu negativen Werten verschiebt.

Daher umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zu Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen unter Ermittlung des Relaxationsverhaltens umfasst die Analyse der Dehnung von Zellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten unter mechanischer Belastung und im Anschluss daran die Dehnung der Zelle in Abwesenheit einer mechanischen Belastung. Das Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose wird gemäß der Erfindung dabei wie folgt vorgenommen:

es wird die Ausdehnung L₀ der Zelle der Patientenprobe ohne Ausübung einer mechanischen Spannung ermittelt,

anschließend wird eine mechanischen Spannung, bei der eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, zu einem Zeitpunkt ts auf die Zelle ausgeübt und die Ausdehnung L_s der Zelle unter Spannungseintrag wird ermittelt,

anschließend wird ohne Ausübung der mechanischen Spannung zu einem Zeitpunkt t_R die Ausdehnung L_R der Zelle nach deren Relaxation ermittelt.

Die relative Relaxation R wird ermittelt, indem die Dehnung y(t_s) der Zelle unter Spannungseintrag zum Zeitpunkt ts ermittelt wird und die Dehnung y(t_R) der Zelle nach der Relaxation der Zelle zum Zeitpunkt t_R ermittelt wird und die Differenz von y(t_R) und y(ts) gebildet wird. Die Dehnung ist dabei wie obenstehend definiert und gibt die relative Deformation der Zelle an. Dabei ergibt sich aus der Länge der Zelle (L) entlang der Spannungsrichtung als Funktion der Zeit L(t) = 2 [r₀ + Ar(t)] (wobei r₀ der Radius der Zelle entlang der Spannungsrichtung im unverformten Zustand ist und Ar(t) die von der Zeit t_x abhängige zusätzliche Ausdehnung der Zelle ist) die Dehnung γ(ΐ) aus dem Zusammenhang γ(ΐ) = Ar(t)/ r₀. Vorzugsweise wird die relative Relaxation dabei mit Formel (1) berechnet.

Die relative Relaxation der Zellen in der Patientenprobe wird mit Referenzdaten verglichen. Eine im Mittel niedrigere relative Relaxation in der Patientenprobe im Vergleich zu den Referenzdaten zeigt ein höheres Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen an. Alternativ oder in Kombination dazu zeigt eine geringere Anzahl an Zellen in der Patientenprobe mit einer relativen Relaxation von mehr als 0 im Vergleich zu den Referenzdaten ein höheres Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen an. Alternativ oder in Kombination dazu zeigt ein Anteil von maximal 1 % der Zellen der Patientenprobe mit einer relativen Relaxation von mehr als 0 ein höheres Risiko für das Vorhandensein invasiver Zellen an.

Vorzugsweise wird der Mittelwert der relativen Relaxation aller analysierten Zellen mit den Referenzdaten verglichen und ein verringerter Mittelwert in der Patientenprobe zeigt ein erhöhtes Risiko für das Vorliegen unkontrolliert proliferierender Zellen an. Vorzugsweise wird durch einem Mittelwert der relativen Relaxation aller analysierten Zellen der Patientenprobe von < -0,01, vorzugsweise -0,05 bis -0,01, ein höheres Risiko für das Vorliegen unkontrolliert proliferierender Zellen angezeigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen unter Analyse des Relaxationsverhaltens von Krebszellen nach mechanischer Belastung ist allein ausreichend, um eine Aussage über das Risiko für das Vorliegen einer Krebserkrankung zu treffen. Vorzugsweise wird dieses Verfahren in Kombination mit dem mit der Bestimmung des Anteils der Zellen, die unter mechanischen Belastungen eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist (Anteil kontraktiler Zellen), ermittelt. Dabei zeigen ein höherer Anteil von Zellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, in der Patientenprobe als bei den Referenzdaten und eine im Mittel eine niedrigere relative Relaxation in der Patientenprobe im Vergleich zu den Referenzdaten ein höheres Risiko von Tumormetastasen an. Durch die Kombination der beiden Verfahren wird vorteilhaft eine belastbarere Aussage über das Risiko von Tumormetastasen möglich.

Es kann somit vorteilhaft allein aus der Analyse von Tumorzellen unter mechanischer Belastung, die durch eine mechanische Spannung eingetragen wird, im Bereich der linearen Verformung eine Aussage über die Metastasenwahrscheinlichkeit und Proliferation der Zellen sowie über das Vorhandensein invasiver Zellen getroffen werden. Weiter haben die Erfinder festgestellt, dass Tumorzellen auch unter mechanischen Belastungen, die eine nicht-lineare Verformung der Zellen zur Folge hat, ein charakteristisches Verhalten zeigen. Im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe zeigen Tumorzellen im Belastungsbereich der nicht-linearen Verformung bei steigender mechanischer Belastung eine höhere Versteifung als die Zellen des Normalgewebes. In diesem Belastungsbereich (für nicht-lineare Verformung) zeigt die Dehnung der Tumorzellen unter Belastung somit genau die gegenteilige Tendenz, wie bei Belastungen, die eine lineare Verformung verursachen. Die Dehnung der Zelle in Spannungsrichtung unter mechanischer Belastung in einem Bereich der nicht-linearen Verformung ist geringer, als die Dehnung der Zellen aus Normalgewebe und der Anteil der Zellen, die eine geringe Dehnung unter mechanischer Belastung zeigen, ist höher, als im Normalgewebe. Es konnte gezeigt werden, dass diese höhere Steifigkeit der Tumorzellen unter mechanischen Belastungen, die eine nicht-lineare Verformung der Zelle zur Folge haben, charakteristisch für Zellen sind, die invasiv sind. Es wird angenommen, dass die Versteifung der Zellen unter mechanischen Belastungen, bei denen eine nicht-lineare Verformung zu erwarten ist, durch Mikrotubuli und intermediäre Filamente verursacht wird.

Tumorzellen, die sich invasiv in umliegende Gewebe ausbreiten, sind im Unterschied zu metastasierenden Zellen meist keine Einzelzellen, die den Zellverband verlassen. Es breitet sich vielmehr der gesamte Zellverband in das umliegende Gewebe aus und verdrängt dadurch das umliegende Gewebe. Dies kann nur erfolgen, so lang der Widerstand, den die Zellen des umliegenden Gewebes bewirken, niedriger ist, als die Kraft, die durch das Wachstum des Tumors aufgebracht wird. Da die Tumorzellen bei hohen Belastungen eine höhere Steifigkeit als Nicht-Tumorzellen aufweisen, können diese die Zellen des Normalgewebes, die bei diesen Belastungen dehnbarer sind, verdrängen oder auflösen. Durch ein Anschauungsexperiment, bei dem Tumorzellen einem Hydrogel mit Agarose kultiviert wurden, wurde festgestellt, dass Tumorzellen im Zellverband Spannungen von bis zu 10 kPa widerstehen können (Fig. 5).

Es kann also aus der Dehnung bei mechanischen Belastungen, die eine nicht-lineare Verformung der Zelle zur Folge hat, abgeleitet werden, ob ein erhöhtes Risiko für das Vorhandensein von invasiven Zellen besteht. Dabei sind die mechanischen Spannungen, die ausgeübt werden deutlich höher als die, die eine lineare Verformung der Zelle zur Folge haben.

Es wird dafür in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise zusätzlich

d) auf mindestens eine Zelle derselben Patientenprobe eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt, dass eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist. Die Dehnung der Zelle wird zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung bestimmt.

e) Der Mittelwert der Dehnung der analysierten Zellen der Patientenprobe wird mit Referenzdaten verglichen. Dabei zeigt ein geringerer Mittelwert der Dehnung in der Patientenprobe als in der Referenzprobe ein höheres Risiko für das Vorhandensein von invasiven Zellen an. Diese invasiven Zellen erlauben es dem Tumor, gegen den Druck des umgebenden Gewebes anzuwachsen.

Durch die Analyse der Dehnung von Zellen aus Gewebeproben unter linearer und nicht-linearer Verformung kann somit sowohl eine Aussage über die unkontrollierte Proliferation, die Invasivität als auch der Metastasenwahrscheinlichkeit getroffen werden. Dabei ist es durch das erfindungsgemäße Diagnose- und/oder Prognoseverfahren vorteilhaft möglich, Tumorzellen durch die Analyse deren mechanischer Eigenschaften und nicht durch die Analyse von Oberflächenmarkern zu charakterisieren. Dies hat den Vorteil, dass keine Veränderung der Zelle, beispielsweise durch Färbung mit Antikörpern o.ä. vorgenommen wird, die deren Vitalität und deren funktionellen Zustand beeinträchtigen kann. Dabei ist durch die Analyse der mechanischen Eigenschaften der Zellen in einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahren vorteilhaft eine Klassifikation der Krebserkrankung in die Krebsstadien I, II, III und IV bzw. in die Stadieneinteilung der TNM- Klassifikation möglich. Es ist dabei sogar vorstellbar, eine genauere Einteilung zu treffen als das derzeit bestehende Klassifikationsraster es zulässt, da das Risiko für Metastasenbildung bereits vor der eigentlichen Ausbildung der Metastase aus Zellen des primären Tumors (Ursprungstumors) ermittelt werden kann.

Die Zellen, die in einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognose-Verfahren analysiert werden, entstammen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten. Bevorzugt sind dabei Gewebeproben aus Tumoren des Patienten, die invasiv oder minimalinvasiv entnommen wurden. Zur minimalinvasiven Entnahme sind Stanzbiopsie, Feinnadelbiopsie oder Punktionen bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Gewebeproben aus Primärtumoren des Patienten, da es bei der Analyse von Zellen aus solchen Proben vorteilhaft möglich ist, aus Zellen des Primärtumor festzustellen, ob das Risiko für eine Metastasenbildung besteht. Dafür werden in einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahren vorzugsweise Zellen aus einem Dünnschnitt aus einem chirurgisch entfernten Tumor des Patienten analysiert. Es sind jedoch auch Zellen in einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahren bevorzugt, die einem Patienten nichtinvasiv, beispielsweise durch eine Abstrichprobe, entnommen wurden. Zellen aus Abstrichproben haben den Vorteil, dass diese bereits in vereinzelter Form vorliegen und deshalb nicht mit in einem aufwändigen zusätzlichen Verfahrensschritt vereinzelt werden müssen. Weiter bevorzugte Zellen, die in einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahren analysiert werden, entstammen einer Probe einer Körperflüssigkeit des Patienten, insbesondere einer Blutprobe, einer Probe aus einer Lumbalpunktion oder Probe einer Thoraxdrainage. Ganz besonders bevorzugt davon sind Zellen aus einer Blutprobe.

Durch die Analyse der Dehnung von Zellen unter Belastung kann eine Diagnose und/oder eine Prognose von Krebserkrankungen getroffen werden. Die analysierten mechanischen Eigenschaften treffen auf eine Vielzahl von Krebserkrankungen zu. Insofern ist die Veränderung dieser mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen nicht charakteristisch für eine bestimmte Krebserkrankung, sondern kann auf die Diagnose und/oder Prognose einer Vielzahl von Krebserkrankungen, vorzugsweise Krebserkrankungen bei denen solide Tumore auftreten, übertragen werden. Bevorzugt wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Brustkrebs, Krebs des Mund- und Rachenraums, Lungenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Hautkrebs, Magenkrebs, Darmkrebs oder Prostatakrebs eingesetzt. Auch Leukämiezellen zeigen im Vergleich zu normalen weißen Blutzellen einen höheren Anteil an Zellen, die unter mechanischer Belastung (lineare Verformung) eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen eingesetzt, indem Zellen aus einer Tumorgewebeprobe, insbesondere einer Primärtumorprobe, eines Patienten analysiert werden und anschließend eine Aussage über die Metastasenwahrscheinlichkeit und ggf. Invasivität und/oder unkontrolliertes Wachstum getroffen wird.

Auch eine Klassifikation im Rahmen einer Diagnose wird vorteilhaft mit erfindungsgemäßen Verfahren aus Proben von Tumorgewebe vorgenommen. Besonders vorteilhaft im Vergleich zu Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, kann aus Primärtumorproben auch eine Aussage zur Metastasenbildung getroffen werden. Die Diagnose von Krebserkrankungen mit anschließender Klassifizierung mithilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine bevorzugte Anwendung.

Ferner werden zur Diagnose auch bevorzugt Zellen aus einer nichtinvasiv oder minimalinvasiv gewonnen Probe aus einem Individuum analysiert. Dies kann beispielsweise eine Abstrichprobe, Stanzbiopsie oder Feinnadelbiopsie sein oder eine Gewebeprobe verdächtigen Gewebes z. B. der Dünnschnitt aus einem chirurgisch entfernten Tumor. Die Analyse wird vorzugsweise an vitalen Zellen durchgeführt. Liegen in der Probe Zellen vor, die unkontrolliert proliferieren, so ist ein erstes Anzeichen für eine Krebserkrankung gegeben. Dies ist der Fall, wenn unter mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung zu erwarten ist, ein höherer Mittelwert der Dehnung in Richtung der deformierenden Spannung von Zellen des Individuums, als in den Referenzdaten vorliegt und ggf. Unterschiede in der Verteilung der Dehnung in der Patientenprobe im Vergleich zu den Referenzdaten vorliegen. Für den Fall, dass alternativ oder in Kombination dazu das Relaxationsverhalten der Zelle nach Belastung bestimmt wird, liegt ein weiteres Anzeichen für unkontrolliert proliferierende Zellen dann vor, wenn ein geringerer Mittelwert der relativen Relaxation der Zellen in der Patientenprobe im Vergleich zu den Referenzdaten vorliegt. Liegt in der Probe außerdem ein höherer Anteil an Zellen vor, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen (im Vergleich zu Referenzdaten), so ist ein Anzeichen für eine Metastasierung bei einer Krebserkrankung gegeben. Liegt in der Probe bei mechanischen Belastungen, bei denen eine nicht-lineare Verformung der Zellen zu erwarten ist, ein geringerer Mittelwert der Dehnung (in Spannungsrichtung) in der Probe des Individuums als in der Referenzprobe vor, so ist ein Anzeichen für das Vorhandensein von invasiven Zellen bei einer Krebserkrankung gegeben. Diese invasiven Zellen erlauben es dem Tumor, gegen den Druck des umgebenden Gewebes anzuwachsen.

Durch die Kombination dieser Daten kann aus einer ersten Probe eines Individuums eine Aussage getroffen werden, ob Anzeichen für eine Krebserkrankung vorliegt und wenn eine Krebserkrankung vorliegt, wie weit diese bereits fortgeschritten ist. Es ist dafür nicht zwingend notwendig, dass Zellen aus einer Tumorgewebeprobe analysiert werden, es können dafür auch Zellen aus nichtinvasiv oder minimalinvasiv entnommenen Proben analysiert werden, wie beispielsweise Blutproben, Proben einer Punktion oder Abstrichproben von Patienten.

Das erfindungsgemäße Diagnose und/oder Prognose-Verfahren erfordert immer einen Vergleich der Dehnung der analysierten Tumorzellen bzw. der potentiellen Tumorzellen mit Referenzdaten. Darunter sind die Daten der Analyse der Dehnung unter Belastung von Zellen einer geeigneten Referenzprobe zu verstehen, die auf dieselbe Weise analysiert wurden, wie die Zellen der Patientenprobe. Als Referenzprobe werden dabei für die Diagnose und/oder Prognose bevorzugt Zellen des gleichen Gewebes eines oder mehrerer gesunder Individuen herangezogen. Alternativ dazu sind gleichermaßen bevorzugt auch Zellen gesunden Gewebes desselben Patienten geeignet, welches nicht mit dem Tumor befallen ist. Dafür werden insbesondere nach der Resektion eines Tumors aus einem Patienten Tumorzellen und Nicht-Tumorzellen aufgetrennt und separat analysiert.

Nach dem Prinzip eines erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognose-Verfahrens ist es ebenfalls möglich, durch die Analyse von Tumorzellen im Blut Rückschlüsse auf den Ort des Ursprungstumors zu ziehen. Tumorzellen weisen zwar im Vergleich zum ursprünglichen Gewebe aus dem sie entstanden sind, Unterschiede in den biomechanischen Eigenschaften auf. Dennoch ist es so, dass die Tumorzellen in der Größenordnung ihrer Dehnbarkeit dem Ursprungsgewebe stark ähneln. Aufgrund dessen, dass sich auch Zellen des ursprünglichen Gewebes in ihrer Dehnbarkeit unterscheiden (beispielsweise sind Zellen des Lungengewebes dehnbarer als Zellen des Brustgewebes), kann durch die Größenordung der Dehnung (Absolutwert), die unter mechanischer Belastung ermittelt wird, ein Rückschluss auf den Ursprungsort des Tumors getroffen werden. Dafür werden Tumorzellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten unter mechanischer Belastung analysiert und der Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung ermittelt. Dieser Mittelwert wird mit dem Mittelwert der Dehnung (in Spannungsrichtung) von Referenzdaten, bei denen jeweils die Dehnung von Zellen unterschiedlichen humanen Gewebes bestimmt wurde, verglichen. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Tumorzellen von einem bestimmten Ursprungsgewebe abstammen, ist bei dem Datensatz (Gewebe) der Referenzdaten am höchsten, bei dem der absolute Unterschied zwischen den beiden Mittelwerten der Dehnung am geringsten ist. Dafür umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose des Ursprungsgewebes von Tumorzellen eines Patienten, welches die Analyse der Dehnung von Tumorzellen unter mechanischer Belastung umfasst, wobei die Tumorzellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten erhältlich sind. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose des Ursprungsgewebes von Tumorzellen wird

a) auf jeweils eine Tumorzelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung ausgeübt, so dass eine lineare oder nicht-lineare Verformung der Tumorzelle zu erwarten ist. Die Dehnung der Tumorzelle wird zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung bestimmt.

b) Der Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung der Tumorzellen wird ermittelt und mit unterschiedlichen Referenzdatensätzen verglichen, wobei jeweils ein Referenzdatensatz den Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung von Zellen eines bestimmten humanen Gewebes enthält. Als Ursprungsgewebe des Tumors wird dabei das bestimmte Gewebe des Referenzdatensatzes zugeordnet, bei dem der Betrag der Differenz der Mittelwerte der Dehnung zwischen Patientenprobe und Referenzdatensatz am geringsten ist.

Die Zellen, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose des Ursprungsgewebes analysiert werden, werden aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten gewonnen und durch bekannte Verfahren isoliert und vereinzelt. Vorzugsweise ist die Probe dabei eine nicht- oder minimalinvasiv entnommene Probe des Patienten und keine Gewebeprobe des primären Tumors. Bevorzugt werden die Tumorzellen aus einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten, besonders bevorzugt aus einer Blutprobe, Probe aus einer Lumbalpunktion oder Probe einer Thoraxdrainage, gewonnen. Ganz besonders bevorzugt wird mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren das Ursprungsgewebe von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Blutprobe eines Patienten bestimmt.

Die Referenzdatensätze, mit denen die Dehnung der zirkulierenden Tumorzellen abgeglichen wird, sind vorzugsweise identisch zu den Referenzdaten eines erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahrens. Da der Ursprungsort der Tumorzellen aus der Patientenprobe erst bestimmt werden muss, werden verschiedene Referenzdatensätze mit der im Verfahren ermittelten Dehnung der Tumorzellen aus der Patientenprobe verglichen. Ein Referenzdatensatz enthält dabei Ergebnisse der Dehnungsanalyse von einem definierten humanen Gewebe, besonders bevorzugt aus humanem Normalgewebe. Durch den Abgleich der Dehnung der Tumorzellen mit einer Vielzahl von Referenzdatensätzen unterschiedlichen Gewebes ist es möglich, den Ursprungsort des Tumors zu prognostizieren. Alternativ zum Vergleich der Dehnung der Tumorzellen der Patientenprobe mit Referenzdatensätzen von verschiedenem humanen Normalgewebe, werden als Referenzdaten Datensätze eingesetzt, die jeweils Ergebnisse der Dehnungsanalyse von definiertem humanen Tumorgewebe enthalten. Idealerweise sind dabei in einem Referenzdatensatz Daten von mindestens zwei Referenzpatienten enthalten und die Werte der Dehnung sind über die verschiedenen Referenzpatientenproben gemittelt.

Die mechanischen Eigenschaften der Tumorzellen, die das Risiko von Tumormetastasen und das Vorhandensein invasiver Zellen anzeigen, waren zuvor unbekannt. Daher stellen Substanzen, die die biomechanischen Eigenschaften von Zellen verändern, potentielle Wirkstoffe für die Onkologie dar. Substanzen, die eine Verringerung der Deformierbarkeit von Zellen bei mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, bewirken und Substanzen, die eine Erhöhung der Deformierbarkeit von Zellen bei mechanischen Belastungen, bei denen eine nichtlineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, bewirken, sind potentielle Wirkstoffe für die Onkologie. Ferner können auch Substanzen, die den Anteil der Tumorzellen verringern, die unter einer Belastung, bei der eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen, potentielle Wirkstoffe für die Onkologie sein. Ein besonders hohes Potential als Wirkstoff für die Onkologie besitzen Substanzen, die mehrere dieser Veränderungen der biochemischen Eigenschaften der Zelle bewirken. Grundsätzlich kann geschlussfolgert werden, dass Substanzen, die die mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen so beeinflussen, dass die Proliferation oder Migration von Tumorzellen verhindert wird, als potentielle Wirkstoffe für die Onkologie eingestuft werden können.

Daher umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zum Screening von Substanzen als potentielle Wirkstoffe für die Onkologie (Screeningverfahren), bei dem der Einfluss der Substanzen auf biomechanische Eigenschaften von Tumorzellen untersucht wird, indem die Dehnung einer Vielzahl von Tumorzellen unter mechanischer Belastung analysiert wird. Dabei wird

i) mindestens eine Tumorzelle:

mit einer Substanz kontaktiert und

anschließend wird auf die Tumorzelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt, dass die Tumorzelle linear oder nicht-linear verformt wird. Die Dehnung der Tumorzelle wird zum Zeitpunkt der Belastung bestimmt.

ii) Die Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen wird mit Referenzdaten der Analyse der Dehnung von gleichartigen unbehandelten Tumorzellen verglichen. Die Substanz wird dann als potentieller Wirkstoff für die Onkologie eingestuft, wenn bei mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Zellen zu erwarten ist, der Anteil der Tumorzellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, an den mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen geringer ist.

Vorzugsweise wird die Substanz als potentieller Wirkstoff für die Onkologie eingestuft, wenn unter mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, der Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen geringer ist und/oder

wenn unter mechanischen Belastungen, bei denen eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, der Mittelwert der Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen höher ist.

Substanzen, die in einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren analysiert werden, umfassen Moleküle, die natürlichen oder synthetischen Ursprung sind. Bevorzugte Substanzen, die in einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren analysiert werden, sind ausgewählt aus natürlichen Molekülen, insbesondere Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, davon insbesondere siRNA, synthetischen organischen Molekülen, insbesondere Monomeren, Polymeren, synthetischen anorganischen Molekülen und small molecules.

In einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren werden Tumorzellen untersucht, die entweder aus einer Gewebeprobe eines Patienten stammen oder aber aus einer Zelllinie entstammen. Vorzugsweise werden in einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren aufgrund deren leichteren Kultivierbarkeit und Erhältlichkeit Tumorzellen aus Zelllinien eingesetzt.

Als Referenzdaten dient dabei die Analyse der Dehnung gleichartiger Zellen, die nicht mit der Substanz kontaktiert, ansonsten aber identisch gehandhabt wurden (hierin auch„unbehandelte" Zellen). Beim Einsatz von Zelllinien dient daher die Analyse der Dehnung von unbehandelten Tumorzellen der jeweiligen Zelllinie als Referenz. Diese Daten werden mit der Dehnung von Zellen derselben Zelllinie verglichen, die mit der Substanz kontaktiert wurden. Beim Einsatz von Zellen aus Gewebeproben, vorzugsweise Tumorgewebeproben, werden unbehandelte Zellen aus derselben Gewebeprobe als Referenz analysiert.

Besonders bevorzugt werden die Daten auch noch mit Normalreferenzdaten verglichen. Zur Erhebung der Daten der Normalreferenz dienen dabei Nicht-Tumorzellen der gleichen Art, für die die Dehnung nach dem gleichen Prinzip wie für die Tumorzellen bestimmt wird. Wird das erfindungsgemäße Screeningverfahren mit Tumorzelllinien durchgeführt, werden als Normalreferenz Zelllinien eingesetzt, die keine Tumorzellen enthalten. Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Tumorzellen aus Gewebeproben durchgeführt, so werden als Normalreferenz vorzugsweise Zellen des gleichen Gewebes eingesetzt, die jedoch nicht zu Tumorzellen degeneriert sind, oder alternativ Zellen eines gesunden Individuums aus dem gleichen Gewebe (beispielsweise wird das Screeningverfahren an Brustkrebszellen durchgeführt, so werden als Normalreferenz entweder Nicht-Tumorzellen des Brustgewebes desselben Patienten oder Zellen aus Brustgewebe eines gesunden Individuums eingesetzt). Werden die mechanischen Eigenschaften der Tumorzellen durch das Kontaktieren mit der Substanz in Richtung der Eigenschaften der Normalreferenz verändert, so ist auch dies ein Indiz dafür, dass die Substanz ein potentieller Wirkstoff für die Onkologie ist.

Das erfindungsgemäße Screeningverfahren beruht ebenso wie das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen auf dem Effekt, dass die Dehnung von Zellen bei linearer bzw. nicht-linearer Verformung als Kriterium für die Aggressivität von Tumorzellen herangezogen werden kann. In beiden Verfahren wird die Dehnung der Zelle unter mechanischer Belastung ermittelt, wobei die Belastung durch eine deformierenden mechanischen Spannung auf die Zelle ausgeübt wird und dadurch die Zelle deformiert wird.

In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Screeningverfahren wird auf die Tumorzellen eine mechanische Spannung so ausgeübt, dass eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist. In einem weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Screeningverfahren wird eine mechanische Spannung so ausgeübt, dass eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist. Weiter bevorzugt wird von den Tumorzellen sowohl die Dehnung unter mechanischer Belastung, bei der eine lineare Verformung zu erwarten ist und die Dehnung unter einer mechanischen Belastung, bei der eine nicht-lineare Verformung zu erwarten ist, ermittelt.

In einer besonderen Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Screeningverfahrens wird von derselben Tumorzelle die Dehnung unter mechanischer Belastung bestimmt. Dabei wird zunächst die Dehnung der unbehandelten Tumorzelle unter Belastung ermittelt. Dafür muss ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Tumorzelle auch nach der Ermittlung der Dehnung vital ist. Dazu ist vorzugsweise ein optischer Strecker geeignet. Anschließend wird die Tumorzelle mit der Substanz kontaktiert und anschließend die Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzelle ermittelt. In dieser Ausgestaltung kann der Einfluss der Substanz auf die mechanischen Eigenschaften der Tumorzellen besonders gut ermittelt werden, da identische Zellen vor und nach der Kontaktierung mit der Substanz analysiert werden.

Nach dem Prinzip eines erfindungsgemäßen Screeningverfahrens ist es weiterhin möglich, für die Krebstherapie eines einzelnen Patienten einen geeigneten Wirkstoff auszuwählen (personalisierte Therapie). Dafür werden Tumorzellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten mit verschiedenen Wirkstoffen kontaktiert und derjenige Wirkstoff für die Therapie ausgewählt, der von allen untersuchten Wirkstoffen den größten Einfluss auf die biomechanischen Eigenschaften der Patientenzellen hat, und diese vorzugsweise so modifiziert, dass dem Fortschreiten der Krankheit entgegengewirkt wird. Dies kann durch Verhindern der Teilungsfähigkeit oder Migrationsfähigkeit, durch Abtöten der Zellen oder durch Rekonstitution der biomechanischen Eigenschaften der Zelle dahingehend, dass diese ähnlich zu Nicht-Tumorzellen sind, geschehen. Dafür sind vorzugsweise Wirkstoffe geeignet, die es bewirken, dass die Dehnung der Zelle (bei Belastung im Bereich der linearen Verformung) so abgesenkt wird, dass keine Zellteilung mehr möglich ist. Ebenfalls sind dafür Wirkstoffe geeignet, die selektiv Tumorzellen mit einer höheren mittleren Dehnung in Spannungsrichtung (im Vergleich zu gleichartigen Nicht-Tumorzellen) abtöten oder die selektiv nur die Tumorzellen abtöten, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung (bei Belastung im linearen Verformungsbereich) zeigen oder die die der Spannung entgegen gerichtete Dehnung verhindern und somit die Metastasierung inhibieren.

Dafür umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Therapieoptimierung eines Patienten mit einer Krebserkrankung, bei dem der Einfluss von verschiedenen Wirkstoffen auf die biomechanischen Eigenschaften von Tumorzellen des Patienten untersucht wird. Dabei wird eine Vielzahl der Tumorzellen des Patienten unter mechanischer Belastung analysiert wird, wobei

i) mindestens zwei Proben mit Tumorzellen des Patienten bereitgestellt werden, die jeweils:

mit einem Wirkstoff kontaktiert werden und

anschließend auf jeweils eine Tumorzelle einer Probe eine mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt wird, dass die Tumorzelle linear oder nicht-linear verformt wird und die Dehnung der Tumorzelle zum Zeitpunkt der Belastung bestimmt wird.

ii) Die Dehnung der mit dem jeweiligen Wirkstoff kontaktierten Tumorzellen wird mit Referenzdaten unbehandelter Tumorzellen des Patienten verglichen.

Es wird von den Wirkstoffen derjenige Wirkstoff für die Therapie ausgewählt, bei dem die Probe mit Tumorzellen nach Kontaktierung mit dem Wirkstoff im Vergleich zu unbehandelten Tumorzellen a) unter mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Tumorzelle zu erwarten ist, den geringsten Anteil an Tumorzellen aufweist, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen, und/oder

b) unter mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Tumorzelle zu erwarten ist, den niedrigsten Mittelwert der Dehnung der Tumorzellen in Spannungsrichtung aufweist und/oder

c) unter mechanischen Belastungen, bei denen eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, den höchsten Mittelwert der Dehnung der Tumorzellen aufweist.

Bevorzugt werden in einem derartigen erfindungsgemäßen Verfahren zur Auswahl eines geeigneten Wirkstoffs für die therapeutische Behandlung eines Krebspatienten verschiedene Wirkstoffe untersucht, die zur Behandlung der jeweiligen Krebserkrankung des Patienten zugelassen sind. Als geeigneter Wirkstoff wird dabei ein Wirkstoff ausgewählt der mindestens eines der Kriterien a) bis c), vorzugsweise mindestens zwei der Kriterien a) bis c), idealerweise alle drei Kriterien erfüllt.

Tumorzellen des Patienten, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Therapieoptimierung eingesetzt werden, können auf gleiche Art und Weise gewonnen werden, wie die Proben mit Patientenzellen, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose eingesetzt werden. Sie entstammen vorzugsweise aus einer Tumorgewebeprobe des Patienten, die invasiv oder minimalinvasiv entnommen wurde. Bevorzugt werden Zellen derselben Probe zunächst mit einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognoseverfahren analysiert und anschließend in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Therapieoptimierung eingesetzt. Auf diese Weise kann zunächst die Erkrankung klassifiziert werden und anhand der Patientenzellen derselben Probe ein gezieltes Wirkstoffscreening für den jeweiligen Patienten vorgenommen werden.

Als Referenzzellen zum Vergleich, ob der untersuchte Wirkstoff einen Effekt auf die Tumorzellen des Patienten hat, werden Tumorzellen aus vorzugsweise derselben Patientenprobe, auf jeden Fall jedoch Tumorzellen desselben Patienten eingesetzt.

Vor der Analyse der Zellen in einem der erfindungsgemäßen Verfahren werden diese vorzugsweise vereinzelt bereitgestellt, so dass jeweils auf eine Zelle eine mechanische Belastung ausgeübt wird und die Dehnung unter Belastung bestimmt wird. Es werden also die mechanischen Eigenschaften von Einzelzellen analysiert. Dabei wird eine Vielzahl von Zellen, vorzugsweise mindestens 10, insbesondere mindestens 100 Zellen, in einem der erfindungsgemäßen Verfahren analysiert und daraus der Mittelwert und ggf. die Verteilung der Dehnung in Spannungsrichtung und der Anteil der Zellen, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung und ggf. der Anteil der Zellen, die eine Dehnung in Spannungsrichtung aufweisen, errechnet.

Bevorzugt wird in einem der erfindungsgemäßen Verfahren von derselben Zelle die Dehnung bei linearer und bei nicht-linearer Verformung bestimmt, indem auf die Zelle zu einem Zeitpunkt eine mechanische Belastung ausgeübt wird, so dass eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist und zu einem anderen Zeitpunkt eine mechanische Belastung ausgeübt wird, so dass eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist. Bei einer Analyse im optischen Strecker, die in einer Ausgestaltung der Erfindung vorgenommen wird, werden dabei nacheinander ansteigend oder absteigend mechanische Spannungen ausgeübt, wobei bei jeder ausgeübten Spannung die Dehnung der untersuchten Zelle bestimmt wird.

An dieser Stelle sollen einige Begriffe näher definiert werden, die hierin im Zusammenhang mit der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften von Zellen verwendet wurden:

Die Dehnung ist in der Mechanik eine Angabe für die relative Längenänderung, also die Verlängerung oder auch die Verkürzung eines Körpers, in diesem Fall der untersuchten Zelle, unter Belastung. Die Dehnung gibt das Verhältnis der Längenänderung unter Belastung zur ursprünglichen Länge an (entlang der Richtung der deformierenden mechanischen Spannung), sie ist also der Quotient aus Längenänderung und ursprünglicher Länge der Zelle. Die Dehnung ist somit eine dimensionslose Größe. Vergrößert sich die Abmessung der Zelle unter mechanischer Belastung ist die Dehnung positiv („positive Dehnung"), verkleinert sich die Abmessung der Zelle unter mechanischer Belastung, besitzt die Dehnung ein negatives Vorzeichen („negative Dehnung"). Bei einer Vergrößerung der Zelle in Spannungsrichtung hat die Dehnung in Spannungsrichtung ein positives Vorzeichen (positive Dehnung in Spannungsrichtung, z. B. bei Ausdehnung der Zelle unter Zugspannung). Bei einer Verkleinerung der Zelle in Spannungsrichtung (z. B. Zusammenziehen der Zelle unter Zugspannung) hat die Dehnung in Spannungsrichtung ein negatives Vorzeichen und ist damit entgegengesetzt zur Spannungsrichtung. Dies kann sowohl als negative Dehnung in Spannungsrichtung oder auch als positive Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung bezeichnet werden.

Die Dehnung der Zelle wird in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung und in Richtung der Belastung ermittelt. Dabei wird vorzugsweise der Zelldurchmesser unter mechanischer Belastung in Richtung der Belastung bestimmt, mit dem Zelldurchmesser vor Belastung verglichen und daraus die Dehnung berechnet. Außer dem Zelldurchmesser eignen sich zur Ermittlung der Dehnung auch sämtliche anderen Parameter der Zelle, die als Maß für eine Größenänderung herangezogen werden können, insbesondere die Querschnittsfläche der Zelle, die Exzentrizität, das Verhältnis von großer zu kleiner Hauptachse, der Taylor Verformungsparameter oder das zweite Moment und höhere Momente der Zellform. Die Dehnung wird für jede einzelne Zelle zum Zeitpunkt einer bestimmten mechanischen Belastung ermittelt. Dabei werden sukzessive mehrere Zellen analysiert. Die Bestimmung der Dehnung„zum Zeitpunkt der Belastung" ist dabei im Sinne der Erfindung so zu verstehen, dass auch noch eine Dehnung nach Ende der mechanischen Belastung ermittelt werden kann, da die Zelle nicht unmittelbar nach Ende der Belastung relaxiert. Besonders vorteilhaft ist es jedoch, die Dehnung zum tatsächlichen Zeitpunkt der Belastung zu ermitteln.

Durch die Analyse einer Vielzahl von Einzelzellen werden dann die notwendigen Parameter (Anteil, Mittelwert, Verteilung der jeweiligen Dehnung) für die untersuchte Probe ermittelt.

Als mechanische Belastung wird in jedem der erfindungsgemäßen Verfahren eine mechanische Spannung ausgeübt, die eine Deformation der Zelle zur Folge hat (deformierende mechanische Spannung). Dieser Begriff wird hierin analog zur deren Definition in der Mechanik angewendet und bezeichnet die Kraft, die pro Flächeneinheit in einer gedachten Schnittfläche auf einen Körper, im vorliegenden Fall auf die Zelle, wirkt. Die auf die Zelle ausgeübte mechanische Spannung hat eine Verformung der Zelle zur Folge, vorzugsweise wird dazu eine Kompressionsspannung, insbesondere eine Zugspannung oder eine Druckspannung angelegt und/oder eine Scherspannung, insbesondere eine Schubspannung. Im Normalfall findet die Verformung der Zelle so statt, dass diese in Richtung der Spannung wirkt. Wird also eine Zugspannung angelegt, so dehnt sich die Zelle in Richtung der Zugspannung aus (positive Dehnung), wird hingegen eine Druckspannung angelegt, so zieht sich die Zelle in Richtung der Druckspannung zusammen (negative Dehnung).

Bevorzugt wird in erfindungsgemäßen Verfahren eine Zugspannung angelegt. Vergrößert sich die Zelle entlang der Spannung (in diesem Fall: positive Dehnung der Zelle), so wirkt die Dehnung in Spannungsrichtung. Bei Verkleinerung der Zelle (Kontraktion der Zelle, in diesem Fall: negative Dehnung der Zelle) wirkt die Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung.

Einige Zellen des Tumorgewebes dehnen sich nicht in Richtung der auf die Zelle ausgeübten mechanischen Spannung, sondern zeigen eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung. In einem derartigen Verhalten ziehen sich die Zellen bei Ausüben einer Zugspannung zusammen oder dehnen sich aus, wenn eine Druckspannung auf die Zellen ausgeübt wird. Diese Eigenschaft ist charakteristisch für Tumorzellen, die gewebegängig sind und Metastasen bilden können.

Die Amplitude der Verformung der Zelle ist abhängig von der ausgeübten Belastung, d. h. die Dehnung der Zelle hängt von der auf die Zelle ausgeübten mechanischen Spannung ab. Dabei kann die Spannung, die zur Deformation notwendig ist, zwischen unterschiedlichen Zelltypen und je nach dem ausgeübten Verfahren, mit dem die Spannung auf die Zellen eingetragen wird, über viele Größenordnungen von wenigen Pa zu 100.000 Pa variieren.

Zellen sind komplexe biologische und mechanische Objekte. Die Verformung von Zellen unter mechanischer Belastung ist nicht rein elastisch, sondern zumindest viskoelastisch. Eine Zelle relaxiert also nach der Beendigung der ausgeübten mechanischen Belastung nur unvollständig bzw. benötigt zumindest eine sehr lange Zeit für eine vollständige Relaxation (Rückkehr in den Ursprungszustand).

Im linearen Verformungsbereich ist die Dehnung zur Spannung proportional. Der Bereich, in dem eine lineare Verformung von Zellen zu erwarten ist, unterscheidet sich zwischen Zellen unterschiedlichen Ursprungs. Die mechanische Spannung, die für Zellen eines bestimmten Gewebetyps geeignet ist, um eine Verformung der Zelle im linearen Bereich zu bewirken, kann auf einfache Weise dadurch bestimmt werden, dass die Dehnung der Zellen des bestimmten Gewebetyps bei einer Reihe verschiedener mechanischer Spannungen ermittelt wird und der lineare Bereich in einem Spannungs- Dehnungs-Diagramm abgelesen wird.

In den Ausgestaltungen der Erfindung, in denen die Zellen in einem der erfindungsgemäßen Verfahren nach dem Prinzip des optischen Streckers analysiert werden, kann bei einer mechanischen Spannung von vorzugsweise maximal 5 Pa bei den Zellen, die mit erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden, eine lineare Verformung erwartet werden. Vorzugsweise wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren, in welchem die Zellen nach dem Prinzip des optischen Steckers analysiert werden, als Belastung eine mechanische Spannung von 1 Pa bis 5 Pa, vorzugsweise 1 Pa bis 4 Pa, insbesondere 2 Pa bis 3 Pa ausgeübt.

Bei höheren mechanischen Spannungen ist die Dehnung der Zelle nicht mehr proportional zur Spannung. In diesem Bereich wird eine nicht-lineare Verformung der Zelle in Abhängigkeit von der ausgeübten Spannung festgestellt. In diesem Belastungsbereich werden Zellen in einem erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognose-Verfahren analysiert, um eine Aussage über das Vorhandensein invasiver Zellen zu treffen bzw. in erfindungsgemäßen Screening- und Therapieoptimierungsverfahren, um eine geeignete Substanz oder einen Wirkstoff zu ermitteln, der dieses Verhalten beeinflusst. Auch hier ist es abhängig vom Zelltyp, welche mechanische Spannung ausgeübt werden muss, um eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu bewirken. Dieser Bereich kann ebenfalls im oben beschriebenen Spannungs-Dehnungs-Diagramm abgelesen werden.

Bevorzugt wird in erfindungsgemäßen Verfahren, in denen die Zellen nach dem Prinzip des Rasterkraftmikroskops (AFM) analysiert werden, eine mechanische Spannung von 10 Pa bis 50 kPa auf eine Zelle ausgeübt. Bevorzugt wird dabei eine mechanische Spannung im Bereich von mehr als 100 Pa bis 50 kPa, insbesondere bevorzugt zwischen 5 kPa und 50 kPa ausgeübt.

In jedem der erfindungsgemäßen Verfahren wird eine mechanische Spannung auf die Zellen ausgeübt, so dass diese eine Deformierung erfahren. Die mechanische Spannung wird dabei in einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren durch Kräfte aus elektromagnetischer Strahlung auf die Zellen ausgeübt, welche vorzugsweise durch das Auftreffen zweier gegenläufiger Laserstrahlen auf eine einzelne Zelle erzeugt wird. Dies geschieht vorzugsweise nach dem Prinzip des optischen Streckers.

Die Ermittlung der Dehnung erfolgt durch vorzugsweise optische Verfahren, mit denen eine Größenänderung der Zelle detektiert werden kann. Bevorzugt erfolgt die Ermittlung der Dehnung mit einem Mikroskop, wobei der Zelldurchmesser vor und während der Belastung (also vor und während des Ausübens der mechanischen Spannung) entlang der Richtung in die die Deformation ausgeübt wird, bestimmt wird und daraus die Dehnung berechnet wird. In einem besonders bevorzugten der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Analyse der mechanischen Eigenschaften der Zelle mit einem optischen Strecker (optical stretcher). Eine Analyse im optischen Strecker bzw. ein Eintrag mechanischer Spannung durch elektromagnetische Strahlung, vorzugsweise Laserstrahlung (die von den Zellen nicht signifikant absorbiert wird) ist besonders vorteilhaft, da keine Schädigung der Zelle verursacht wird und diese nach der Bestimmung der Dehnung weiter kultiviert werden kann. Die Zelle kann nach der Analyse somit wiedergewonnen werden und nahezu unverändert für weitere Analysen oder zur Kultur bereitstehen. Dies ist durch bisherige Verfahren, bei denen die Oberflächeneigenschaften der Zelle beispielsweise durch Färbung mit Antikörpern ermittelt wird, in dieser Form nicht möglich, da nicht sicher ist, inwiefern gebundene Antikörper die Reaktionen der Zellen beeinflussen können.

In weiter bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird das Verfahren mithilfe von Rasterkraftmikroskopie, dielektrophoretischen Kräften, insbesondere mithilfe dielektrophoretischer Käfige, mikrofluidischer Flüsse, optischer Pinzetten, Laserdiodenbars oder Ultraschallmikroskopie ermittelt, wobei aus dieser Gruppe die Rasterkraftmikroskopie besonders bevorzugt ist. Bei den Verfahren wird die mechanische Spannung durch die jeweiligen Vorrichtungen auf die Zellen ausgeübt und die Dehnung wird durch vorzugsweise optische Verfahren ermittelt. Zur Analyse der Dehnung in erfindungsgemäßen Verfahren kommen grundsätzlich alle Verfahren in Frage, die dazu geeignet sind, eine mechanische Spannung auf einzelne Zellen auszuüben und die Dehnung der Zelle unter Belastung zu ermitteln.

Entsprechende Vorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Da die Eigenschaft, dass durch die Analyse mechanischer Eigenschaften von Tumorzellen eine Aussage über deren Aggressivität getroffen werden kann, bisher unbekannt war, umfasst die Erfindung auch die Verwendung von Vorrichtungen, die dazu geeignet sind auf eine vorzugsweise vereinzelte Zelle eine mechanische Spannung als mechanische Belastung auszuüben und die Dehnung der Zelle zum Zeitpunkt der Belastung zu bestimmen,

a) zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen durch Analyse von Zellen, die aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten erhältlich sind, wobei das Risiko für Tumormetastasen anhand des Anteils von Zellen in der Probe, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen und ggf. das Risiko für das Vorhandensein invasiver Zellen anhand des Mittelwerts der Dehnung in Spannungsrichtung von Zellen in der Probe bei nichtlinearer Verformung der Zellen ermittelt wird, und/oder

b) zur Bestimmung des Ursprungsgewebes eines Tumors eines Patienten mit einer Krebserkrankung durch Analyse der Dehnung von Tumorzellen aus einer Probe biologischen Materials des Patienten, und/oder

c) zum Screening von Substanzen als potentielle Wirkstoffe für die Onkologie, wobei der Einfluss einer Substanz auf die biomechanischen Eigenschaften von Tumorzellen untersucht wird, und/oder

d) zur Therapieoptimierung eines Patienten mit einer Krebserkrankung, wobei der Einfluss von verschiedenen Wirkstoffen auf die biomechanischen Eigenschaften von Tumorzellen des Patienten untersucht wird.

Bevorzugt werden die Vorrichtungen in einem der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Eine dafür besonders geeignete und bevorzugte Vorrichtung ist der optische Strecker. Eine weiterhin bevorzugte Vorrichtung ist ein Rasterkraftmikroskop. Außerdem sind die folgenden Vorrichtungen für die erfindungsgemäßen Verwendungen bevorzugt: ein dielektrophoretischer Feldkäfig, eine Vorrichtung zur Analyse der Zellverformung in mikrofluidischen Flüssen, eine optische Pinzette inklusive Diodenlaserbars und/oder ein Ultraschallmikroskop.

Durch die Analyse der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen ist es durch geeignete Analyseverfahren vorteilhaft möglich, die Aggressivität von Tumorzellen zu ermitteln, ohne diese notwendigerweise in ihrer Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. So ist es insbesondere nicht erforderlich, die Zellen mithilfe von Antikörpern oder ähnlichen Molekülen zu markieren, um nachzuweisen, dass es sich um eine Tumorzelle handelt. Allein aus der Analyse der Dehnung der Zelle unter Belastung kann diese Aussage getroffen werden.

Dies birgt einerseits den Vorteil, dass die Zelle völlig unkontaminiert nach der Analyse der mechanischen Eigenschaften für weitere Analysen oder zur Kultivierung bereit stehen kann. Weiterhin hat die Analyse der mechanischen Eigenschaften der Zellen einen erheblichen Kostenvorteil gegenüber der Anwendung molekularer Zellmarker (Oberflächenmarker, insbesondere Tumormarker) oder Markersets. Die Zellmarker sind für jede Krebsform stark unterschiedlich, so dass für alle unterschiedlichen Erkrankungen ein eigenes Markerset zum Einsatz kommt, dass eine bestimmte „Signatur" an molekularen Markern bestimmt. Dennoch ist nicht sichergestellt, dass mit dem ausgewählten Set an molekularen Markern auch jeder Tumor detektiert werden kann, da es aufgrund der Vielfalt, die sich aus den Mutationen in den Tumorzellen ergibt, auch Abweichungen in dieser Signatur geben kann. Die mechanischen Eigenschaften der Zellen, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose oder Diagnose herangezogen werden, sind jedoch für verschiedene Krebsformen reproduzierbar.

Die Änderung der Dehnung der Tumorzelle, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wird, beruht auf der Bestimmung von Änderungen im Zytoskelett der Zelle. Derartige Änderungen lassen sich mit bekannten Vorrichtungen mit hoher Sensitivität nachweisen.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Prognose und/oder Diagnose von Krebserkrankungen ist es, dass das Risiko für das Auftreten von Tumormetastasen bereits zu einem vergleichsweise frühen Zeitpunkt, beispielsweise aus Zellen des Primärtumors, ermittelt werden können. Das Risiko für das Auftreten von Tumormetastasen kann hier bereits vor der Bildung von Metastasen bzw. vor dem Auftreten von neuen Tumoren in fernem Gewebe ermittelt werden. Entsprechend kann die Behandlung des Patienten durch diese Informationen angepasst werden. So kann die Therapie unter Kenntnis des Risikos für Metastasen bereits entsprechend ausgerichtet werden, ohne dass die Metastasen bereits in einem bildgebenden Verfahren nachweisbar sind bzw. nachgewiesen wurden.

Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Diagnose- und/oder Prognose-Verfahrens sowie des Verfahrens zur Bestimmung des Ursprungsorts des Tumors ist es, dass es bereits aus einer Probe einer Körperflüssigkeit, insbesondere einer Blutprobe, eines Patienten möglich ist, eine Aussage darüber zu treffen, ob eine Krebserkrankung vorliegt und in welchem Gewebe sich der Ursprungstumor befindet. Auf diese Weise ist es möglich, durch einen verhältnismäßig einfachen und kostengünstigen Test, z. B. durch Analyse einer Blutprobe, deutlich mehr Informationen über eine Krebserkrankung zu erhalten, als es mit derzeitigen Bluttests möglich ist. Zur Detektion des Ursprungsorts des Tumors sind nach derzeitigem Stand der Technik bildgebende Verfahren notwendig. Mit einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Therapieoptimierung eines Patienten ist vorteilhaft eine individuelle Auswahl eines geeigneten Wirkstoffs für jeden einzelnen Patienten möglich. Für einige Tumorerkrankungen sind beispielsweise bis zu 9 verschiedene Chemotherapien möglich. Durch eine frühzeitige und individuelle Charakterisierung und Klassifizierung der Krebserkrankung und das Screening verschiedener Wirkstoffe direkt an den patienteneigenen Zellen können so Therapien besser ausgewählt und auf den Patienten individuell zugeschnitten werden, wodurch die Heilungschancen erhöht und Kosten gesenkt werden können.

Ferner ist es möglich, neue Wirkstoffklassen zu ermitteln, die die biomechanischen Eigenschaften von Tumorzellen so beeinflussen, dass ein Fortschreiten einer Krebserkrankung gehemmt wird. Dazu eignet sich vorteilhaft ein erfmdungsgemäßes Screeningverfahren.

Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.

Fig. 1 Dehnung von Zellen aus primären Brusttumoren (schwarze Balken) und gesunden Zellen aus Brustreduktionen (weiße Balken). Die Analyse wurde mit dem optischen Strecker bei einer mechanischen Spannung von 2 Pa durchgeführt. Die schwarzen Balken links stammen von einem Tumor mit der Klassifikation T4. Die schwarzen Balken rechts stammen von einem Tumor mit der Klassifikation Tlb. Der Doppelpfeil zeigt die Grenze zwischen Zellen mit negativer und positiver Dehnung. Alle Zellen wurden in HuMEC Ready Medium (Invitrogen) vermessen.

Fig. 2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von sortierten kontraktilen Zellen aus Tumorgewebe von Gebärmutterhalstumoren in Tröpfchenkultur. Kontraktile Zellen bilden nach Co-Kultur mit Z e llen aus No rmalg eweb e keinen eigenen Zellverband. Co-Kultur aus Gebärmutterhalstumorzellen (Klassifizierung T lb) und Gebärmutterhalszellen a) zum Kulturstart und b) nach 24 h Kultur (Vergleichsbeispiel), c) Co-Kultur aus sortierten kontraktilen Gebärmutterhalstumorzellen (Klassifizierung T3b und T4) mit Gebärmutterhalszellen nach 24 h Kultur. Die Färbung wurde mit rot und grün fluoreszierendem Farbstoff der CellTracker™ Serie von Invitrogen durchgeführt.

Fig. 3 Dehnung von Zellen der Zelllinie MCF10 (nicht-krebsartige Brustepithelzellen), MCF7 (nicht- metastatische Tumorzellen) und modMCF7 (metastatische Tumorzellen) bestimmt im optischen Strecker bei einer mechanischen Spannung von 5 Pa (lineare Verformung der Zellen). Tumorzellen weisen eine höhere Dehnung als Zellen aus Normalgewebe auf. Eine weitere Erhöhung der Dehnung wird in metastasierenden Zellen festgestellt.

Fig. 4 Kompression von Tumorzellen ermittelt mittels Rasterkraftmikroskopie (Scanning force microscopy, SFM). MCF 10A (nicht-krebsartige Brustepithelzellen, Vergleichsbeispiel), MCF7 (nicht-metastatische Krebszellen) und MDA-MB-231 (metastatische Krebszellen). Bei linearer Verformung weisen Tumorzellen MCF7 und MDA-MB-231 eine höhere Kompression auf. Die metastatischen MDA-MB-231 zeigen die höchste Komprimierbarkeit.

Fig. 5 Wachstum von Tumorzellen (MCF7) als Sphäroid in einem Hydrogel aus Zellkulturmedium enthaltend 1 % Agarose mit einer Steifigkeit von 1 - 2 kPa in Kultur nach a) 2 Tagen, b) 4 Tagen, c) 14 Tagen und d) 18 Tagen. Die Sphäroide verdrängen das Hydrogel und wachsen bis zu einer Steifigkeit von 6 - 10 kPa an.

Fig. 6 Relative Relaxation von Tumorzellen aus primären Brusttumoren (BT 1 bis 4) und Zellen aus Normalgewebe (Nl, N2). Die analysierten Tumorzellen entstammen den folgenden Krebsstadien: BT1 ... Stadium I, BT2 ... Stadium II, BT3 und BT4 ... Stadium III.

Beispiel 1 : Analyse der Dehnung von Tumorzellen bei niedrigen Belastungen zeigt das Auftreten von Zellen, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen

In einem optischen Strecker wurde die Dehnung von Zellen aus malignen humanen Brusttumoren (Fig. la, schwarze Balken, jeweils links) analysiert, die aus Gewebeproben von Patienten mit einer Klassifizierung T4 (Fernmetastasen) stammen. Die Zellen wurden mit üblichen Methoden aufgearbeitet und vereinzelt. Anschließend wurden die Zellen in einem optischen Strecker bei einer Spannung von 2 Pa analysiert. Bei dieser mechanischen Spannung ist im optischen Strecker eine lineare Verformung der Zellen zu erwarten. Als Referenzprobe wurden Zellen aus humanen Brustgewebeproben aus Brustverkleinerungen ebenfalls vereinzelt bei einer Spannung von 2 Pa im optischen Strecker analysiert (Fig. la, weiße Balken, Vergleichsbeispiel mit Zellen eines gesunden Individuums). Ferner wurden Zellen aus malignen humanen Brusttumoren aus Gewebeproben von Patientinnen mit einer Klassifizierung T lb analysiert. In diesem Stadium liegen noch keine Metastasen vor (Fig. la, schwarze Balken, jeweils rechts).

Fig. 1 zeigt die Verteilung der Dehnung in der analysierten Proben. Nur in humanen Gewebeproben aus Brustkrebspatientinnen mit Klassifizierung T4, bei dem Metastasen vorliegen, wurde ein Anteil von Zellen festgestellt, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufwiesen („kontraktile Zellen"). In Richtung der eingetragenen mechanischen Zugspannung verkleinert sich der Durchmesser dieser Zellen unter Belastung (negative Dehnung). Etwa eine in 100 Zellen der Gewebeproben der Klassifizierung T4 zeigt dieses Verhalten.

In Normalgewebe lag der Anteil kontraktiler Zellen unter der Nachweisgrenze. Dies gilt ebenso für Zellen aus humanen Gewebeproben aus Brustkrebspatientinnen mit Klassifizierung Tlb.

Das unerwartete mechanische Verhalten der Tumorzellen, dass sie unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Richtung der Spannung gerichtet ist, wird nur in Gewebeproben aus Patientinnen mit Metastasen festgestellt. Im Gegensatz zu nicht-metastatischen Tumorzellen sind diese (metastatischen) Zellen in der Lage, den Zellverband des Tumors zu verlassen und in Gewebe anderen Ursprungs überzugehen. Es wird angenommen, dass bestimmte Eigenschaften des Zytoskeletts der metastatischen Zellen in einer Art verändert ist, dass diese in der Lage sind, die Oberflächenspannungseffekte zu überwinden, die es normalerweise verhindern, dass Gewebezellen den ursprünglichen Zellverband (Gewebe) verlassen. Offenbar bewirken diese Veränderungen im Zytoskelett, die in metastatischen im Vergleich zu nicht-metastatischen Tumorzellen vorliegen, eine dahingehende Veränderung der biomechanischen Eigenschaften, so dass diese Zellen bei eingetragenen mechanischen Spannung in einer völlig unerwarteten Weise reagieren und eine Dehnung zeigen, die nicht in Richtung der Spannung geht, sondern entgegengesetzt gerichtet ist.

Zum Nachweis, dass Tumorzellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung zeigen, unterschiedliche biologische Eigenschaften zeigen, als andere Tumorzellen (die im optischen Strecker eine positive Dehnung in Spannungsrichtung zeigen) wurde Ausführungsbeispiel 2 durchgeführt.

Beispiel 2: Co-Kultur von Tumorzellen mit Normalgewebe

Es wurde anhand eines Zellkulturversuchs untersucht, ob sich Tumorzellen, die im optischen Strecker unter mechanischer Belastung von 2 Pa (Bereich der linearen Verformung) ein kontraktiles Verhalten zeigen, im biologischen Verhalten von Tumorzellen unterscheiden, die unter mechanischer Belastung eine positive Dehnung aufweisen.

Dazu wurden die Zellen aus den folgenden unterschiedlichen Gewebeproben untersucht: als Normalgewebe wurden Zellen aus gesundem Gebärmutterhalsgewebe der Patientin bereitgestellt. Diese wurden in Co-Kultur entweder mit Zellen aus Gebärmutterhalstumoren der Klassifizierung Tlb (klinisch erkennbare Läsionen, begrenzt auf die Cervix uteri) oder mit kontraktilen Zellen aus Gebärmutterhalstumoren der Klassifizierung T3b (Befall des unteren Drittels der Vagina und/oder der Beckenwand) und T4 (Fernmetastasen) in Tröpfchenkultur kultiviert. Die kontraktilen Zellen wurden aus einer Sortierung gewonnen, bei dem die Zellen jeweils mithilfe des optischen Streckers deformiert wurden und die Zellen sortiert wurden, die unter mechanischer Spannung von 2 Pa eine negative Dehnung zeigten. Diese Zellen wurden zur Co-Kultur mit Zellen des Normalgewebes eingesetzt.

Die verwendeten Zellen wurden vor der Kultur vereinzelt. Für die Co-Kultur wurde jeweils die gleiche Anzahl von Zellen aus Normalgewebe mit den jeweiligen Zellen aus Tumorgewebe vermischt und in Tröpfchenkultur in HuMEC Ready Medium (Invitrogen) für 24 h kultiviert.

Dazu wurden die Zellen vor Kultivierung mithilfe der rot und grün fluoreszierenden Farbstoffe der CellTracker™ Serie von Invitrogen unterschiedlich angefärbt und im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Fig. 2a zeigt den Zustand der Zellen vor dem Beginn der Kultivierung. Zwischen den Tumorzellen aus Patientinnen mit Klassifizierung Tlb wurde die Ausbildung eines Zellverbandes der Tumorzellen (mittig) und der Zellen des Normalgewebes beobachtet (Fig. 2b). Die Tumorzellen lagern sich mit ähnlichen Zellen, nämlich den anderen Tumorzellen, zu einem Zellcluster zusammen. Eine Vermischung mit Zellen des Normalgewebes findet selbst in den Randbereichen um den Zellverband nur in geringem Maße statt.

Die Zellen aus der Co-Kultur der sortierten kontraktilen Zellen aus Gebärmutterhalstumoren der Klassifizierung T3b und T4 mit Zellen des Normalgewebes zeigen ein anderes Bild. Nach 24- stündiger Kultur unter identischen Kultivierungsbedingungen wurde keine Bildung von Zellverbänden aus Tumorzellen und Zellen des Normalgewebes festgestellt. Die Tumorzellen, die unter mechanischen Belastungen ein den Belastungen entgegengerichtetes Dehnungsverhalten zeigen, verhalten sich auch in Zellkultur unterschiedlich von den Tumorzellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung in Richtung der Belastung zeigen. Die Veränderungen des Zytoskeletts sind also mit einer derartigen biologischen Veränderung der Zellen assoziiert, so dass diese die Affinität zu gleichartigem Gewebe verlieren und in homogener Vermischung mit andersartigen Zellen (hier den Zellen des Normalgewebes) vorliegen.

Metastatische Zellen zeigen genau diese Eigenschaft, den Zellverband des Tumors verlassen zu können und andersartige Gewebe infiltrieren zu können. Gemäß Ausführungsbeispiel 1 werden Zellen, deren Dehnung unter mechanischer Belastung entgegengesetzt zur Belastung gerichtet ist nur in Gewebeproben aus Patienten mit Metastasenbildung festgestellt. Insofern kann durch das Vorhandensein von Zellen mit diesen biomechanischen Eigenschaften in einer Gewebeprobe geschlussfolgert werden, dass ein erhöhtes Risiko für Tumormetastasen vorliegt.

Beispiel 3: Die Deformierbarkeit von Tumorzellen ist mit deren Aggressivität assoziiert.

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass die Deformierbarkeit (und damit die Dehnung unter mechanischer Belastung) bei Tumorzellen im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe ansteigt. Fig. 3 zeigt dies anhand eines Histogramms, welches die Dehnung der analysierten Zellen bei Untersuchung nach dem Prinzip des optischen Streckers zeigt.

Es wurden drei Zellpopulationen aus Zelllinien untersucht: als Normalgewebe wurden Zellen der Zelllinie MCF 10 analysiert, einer Zelllinie humaner nicht-krebsartiger Brustepithelzellen. Die Zelllinie wurde aus dem Brustgewebe einer 36-jährigen Frau mit Mastopathie gewonnen. Als Tumorzelllinie diente die Zelllinie MCF7, eine Adenokarzinom-Zelllinie, die aus Zellen einer 69- jährigen Brustkrebspatientin hergestellt wurde. Diese Zellen sind ein Modell für nicht-metastatische und nicht-invasive Zellen. Werden Zellen der Zelllinie MCF7 mit dem Phorbolester 12-0- Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) versetzt (Zugabe von 100 nmol/1 TPA für 18 h in Kultur), so wird ein signifikanter Anstieg des Invasionspotentials und des Metastasierungspotentials bei diesen Zellen festgestellt (Johnson et al. 1999). Mit TPA versetzte MCF7 Zellen werden hierin als „modMCF7" Zellen bezeichnet und dienten im Versuch als Modellzelllinie für metastatische Zellen.

Die Dehnung wurde nach dem Prinzip des optischen Streckers bei einer Spannung von 5 Pa ermittelt (Fig. 3). MCF10 Zellen zeigen im Mittel die geringste Dehnung in Spannungsrichtung. MCF7 Zellen zeigen im Vergleich zu MCF 10 Zellen im Mittel eine höhere Dehnung in Spannungsrichtung. Weiterhin wurde festgestellt, dass innerhalb der Probe die Dehnung der Einzelzellen mehr schwankt, so dass die Standardabweichung der Dehnung im Vergleich zu den MCF10 Zellen bei MCF7 Zellen höher ist. Die Analyse der metastatischen modMCF7 Zellen zeigt, dass die Dehnung sowohl im Vergleich zu MCFIO als auch zu MCF7 Zellen im Mittel höher ist. Auch die Standardabweichung ist im Vergleich zu unmodifizierten, nicht-metastatischen MCF7 Zellen nochmals höher [Guck et al. 2005].

Die Untersuchung von Brustgewebezelllinien mithilfe von Rasterkraftmikroskopie (SFM) bestätigt diese biomechanischen Eigenschaften (Fig. 4). Die Daten wurden durch stetes Erhöhen des SFM Einstellwertes im „real time scan" Modus bei einer Rate von 1 nN/s und Aufzeichnung der zugehörigen Cantilever Biegungsrate bei einer Rate von 10 Hz ermittelt.

Es wurden MCF 10A Zellen (Normalgewebe, ATCC-LGC-Promochem, Deutschland) und MCF7 Zellen (nicht-metastatisches, nicht-invasives Tumorgewebe, ATCC-LGC-Promochem, Deutschland) eingesetzt. Als metastatische Zellen wurde die Zelllinie MDA-MB-23 1 (ATCC-LGC-Promochem, Deutschland), die aus einem metastasierten Tumor stammt, analysiert. Fig. 4 zeigt, dass die Zellen bei linearer Verformung unterschiedliche Dehnungseigenschaften zeigen. MCF10A Zellen zeigen die niedrigste Kompression während die Tumorzellen im Vergleich dazu signifikant höhere Kompressionswerte zeigen. Die metastatischen MDA-MB-231 Zellen zeigen im Vergleich zu nicht- metastatischen MCF7 Zellen eine nochmals signifikant höhere Kompression.

Aus einem höheren Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung, kann somit eine Aussage getroffen werden, ob unkontrolliert proliferierende Zellen vorliegen.

Liegt ein höherer Mittelwert der in Spannungsrichtung gerichteten Dehnung von Zellen in einer analysierten Patientenprobe im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe vor und zeigen die Zellen aus der analysierten Patientenprobe gleichzeitig einen höheren Anteil an Zellen, die unter Belastung eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen, so besteht ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Tumormetastasen.

Beispiel 4: Simulation des Einwachsens von Tumorzellen in umliegendes Gewebe (Invasion)

Es wird angenommen, dass die Versteifung der Zellen bei hohen Belastungen, die eine nicht-lineare Verformung bewirken (geringe entlang der Spannung gerichtete Dehnung von Tumorzellen bei nicht- linearer Verformung), dafür verantwortlich ist, dass Tumorzellen gegen das umliegende Normalgewebe anwachsen können und so in das umliegende Gewebe invasieren können.

Zum Nachweis wurden Zellen der Tumorzelllinie (MCF7) sowie in einem weiteren Versuch Primärtumorzellen aus Brustkrebspatientinnen als Sphäroid in einem Hydrogel enthaltend 1 % Agarose (Zellkulturmedium mit 1 % Agarose) kultiviert (Fig. 5). Die Analyse dieser Zellen nach dem Prinzip des optischen Streckers zeigte, dass die vereinzelten Zellen eine maximale mechanische Widerstandsfähigkeit von weniger als 1000 Pa bei linearer Verformung zeigten. Nach der Kultur im Hydrogel wurde festgestellt, dass der Zellverband in den Hydrogelen gegen deutlich höhere Widerstände anwachsen kann. Die Tumorzellsphäroide wuchsen in 18-tägiger Kultur in dem Hydrogel, das aufgrund seiner Steifigkeit einen Druck von 6000 bis 10.000 Pa ausübt, an (Fig. 5 d). Die Steifigkeit des Hydrogels wurde im Rheometer bestimmt. Es konnte damit gezeigt werden, dass Tumorzellsphäroide deutlich höheren mechanischen Spannungen widerstehen können, als unter linearer Verformung ermittelt wurde.

Beispiel 5 : Relaxationsverhalten von Tumorzellen aus primären Brusttumoren und Zellen aus Normalgewebe

In einem optischen Strecker wurde das Relaxationsverhalten von Zellen aus malignen humanen Brusttumoren analysiert und mit dem Relaxationsverhalten von Zellen einer Referenzprobe (Zellen aus humanen Brustgewebeproben aus Brustverkleinerungen) verglichen. Dazu wurden die Zellen vereinzelt bei 800 mW im optischen Strecker analysiert, wobei für 2 Sekunden eine Spannung angelegt wurde und die Zelle für weitere 2 Sekunden beobachtet wurde. Bei der eingetragenen mechanischen Spannung ist im optischen Strecker eine lineare Verformung der Zellen zu erwarten.

Folgende Zellen wurden analysiert (Fig. 6):

Nl (Vergleichsbeispiel): primäre Brustepithelzellen aus Brustreduktionen (Invitrogen, HMEC Zellen)

N2 (Vergleichsbeispiel): primäre Brustepithelzellen aus Brustreduktionen (Promozell, HMEpC Zellen)

BT1 : primärer Brusttumor Stadium I

BT2: primärer Brusttumor Stadium II

BT3 : primärer Brusttumor Stadium III

BT4: primärer Brusttumor Stadium III

Folgende Parameter wurden gemessen:

vor Eintrag der mechanischen Spannung die Ausdehnung der Zelle (L₀), zwei Sekunden nach Beginn des Eintrags der mechanischen Spannung (entspricht dem Zeitpunkt t_s) die Ausdehnung der Zelle (L_s),

zwei Sekunden nach Beendigung des Spannungseintrags (entspricht dem Zeitpunkt t_R) die Ausdehnung der Zelle (L_R).

Anhand der ermittelten Parameter wurde die relative Relaxation der analysierten Zellen ermittelt (R= (L_R-L_S)/L₀). Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, wobei die Verteilung der relativen Relaxation in den analysierten Proben abgebildet ist.

Es ist zu erkennen, dass Zellen aus primären Brusttumoren ab Stadium II, im Mittel eine niedrigere relative Relaxation zeigen, also eine stärkere Kontraktion in den Ausgangszustand zeigen. Ferner wird deutlich, dass Zellen primärer Brusttumoren ab Stadium II nur zu einem äußerst geringen Anteil nicht re laxieren (relative Relaxation > 0).

Zitierte Nichtpatentliteratur:

(Cross et al. 2007) Cross SE, Jin YS, Rao J, Gimzewski JK. Nanomechanical analysis of cells from Cancer patients. Nat Nanotechnol. 2007 Dec;2(12):780-3.

(Guck et al. 2005) Guck J, Schinkinger S, Lincoln B, Wottawah F, Ebert S, Romeyke M, Lenz D, Erickson HM, Ananthakrishnan R, Mitchell D, Käs J, Ulvick S, Bilby C. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophys J. 2005 May;88(5):3689-98.

(Lekka at al. 1999) Lekka M, Laidler P, Gil D, Lekki J, Stachura Z, Hrynkiewicz AZ. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy. Eur Biophys J. 1999;28(4):312-6.

(Rao & Cohen 1991) Rao KM, Cohen HJ. Actin cytoskeletal network in aging and Cancer. Mutat Res. 1991 Mar-Nov;256(2-6): 139-48.

(Remmerbach et al. 2009) Remmerbach TW, Wottawah F, Dietrich J, Lincoln B, Wittekind C, Guck J. Oral Cancer diagnosis by mechanical phenotyping. Cancer Res. 2009 Mar 1;69(5): 1728-32. Epub 2009 Feb 17.

(Sanger et al. 1975) Sanger JW. Changing patterns of actin localization during cell division. Proc Natl Acad Sei U S A. 1975 May;72(5): 1913-6.

(Ward et al. 1991) Ward KA, Li WI, Zimmer S, Davis T. Viscoelastic properties of transformed cells: role in tumor cell progression and metastasis formation. Biorheology. 1991;28(3-4):301-13.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, welches die Analyse der Dehnung von Zellen unter mechanischer Belastung umfasst, wobei die Zellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten erhältlich sind, bei dem

a) auf jeweils eine Zelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt wird, dass eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, und die Dehnung der Zelle zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung bestimmt wird, und

b) der Anteil der Zellen in der Patientenprobe, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, mit Referenzdaten verglichen wird, wobei ein höherer Anteil von Zellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, in der Patientenprobe als bei den Referenzdaten ein höheres Risiko von Tumormetastasen anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

c) der Mittelwert der Dehnung der analysierten Zellen der Patientenprobe, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung in Spannungsrichtung aufweisen mit den Referenzdaten verglichen wird, und

wobei ein höherer Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung in der Patientenprobe als in den Referenzdaten ein höheres Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen anzeigt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass

d) auf mindestens eine Zelle derselben Patientenprobe eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt wird, dass eine nicht-lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, und die Dehnung der Zelle zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung bestimmt wird, und

e) der Mittelwert der Dehnung der analysierten Zellen der Patientenprobe mit den Referenzdaten verglichen wird,

wobei ein geringerer Mittelwert der Dehnung in der Patientenprobe als in der Referenzprobe ein höheres Risiko für das Vorhandensein von invasiven Zellen anzeigt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen aus Tumorgewebe eines Patienten, vorzugsweise aus einer Primärtumorprobe, isoliert werden.

Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, welches die Analyse der Dehnung von Zellen unter mechanischer Belastung umfasst, wobei die Zellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten erhältlich sind, vorzugsweise nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei

die Ausdehnung der Zelle der Patientenprobe ohne Ausübung einer mechanischen Spannung ermittelt wird,

anschließend eine mechanischen Spannung, bei der eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, zu einem Zeitpunkt t_s auf die Zelle ausgeübt wird und die Ausdehnung der Zelle unter Spannungseintrag ermittelt wird,

anschließend ohne Ausübung der mechanischen Spannung zu einem Zeitpunkt t_R die Ausdehnung der Zelle nach deren Relaxation ermittelt wird,

wobei die relative Relaxation ermittelt wird, indem die Differenz der Dehnung der Zelle unter Spannungseintrag zum Zeitpunkt t_s und der Dehnung der Zelle nach der Relaxation der Zelle zum Zeitpunkt t_R gebildet wird,

wobei die relative Relaxation der Zellen in der Patientenprobe mit Referenzdaten verglichen wird und

o wobei im Mittel eine niedrigere relative Relaxation in der Patientenprobe im Vergleich zu den Referenzdaten ein höheres Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen anzeigt und/oder

o wobei eine geringere Anzahl an Zellen in der Patientenprobe mit einer relativen Relaxation von mehr als 0 im Vergleich zu den Referenzdaten ein höheres Risiko für das Vorhandensein von unkontrolliert proliferierenden Zellen anzeigt.

Verfahren nach Anspruch 5, wobei zusätzlich mindestens eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 durchgeführt wird, und wobei ein höherer Anteil von Zellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, in der Patientenprobe als bei den Referenzdaten und eine im Mittel eine niedrigere relative Relaxation in der Patientenprobe im Vergleich zu den Referenzdaten ein höheres Risiko von Tumormetastasen anzeigt.

Verfahren zur Diagnose des Ursprungsgewebes von Tumorzellen eines Patienten, welches die Analyse der Dehnung von Tumorzellen unter mechanischer Belastung umfasst, wobei die Tumorzellen aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten erhältlich sind, bei dem a) auf jeweils eine Tumorzelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung ausgeübt wird, so dass eine lineare oder nicht-lineare Verformung der Tumorzelle zu erwarten ist und die Dehnung der Tumorzelle zum Zeitpunkt der mechanischen Belastung bestimmt wird, und

b) der Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung der Tumorzellen ermittelt wird, und mit unterschiedlichen Referenzdatensätzen verglichen wird,

wobei jeweils ein Referenzdatensatz den Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung von Zellen eines bestimmten humanen Gewebes enthält,

wobei als Ursprungsgewebe des Tumors das bestimmte Gewebe des Referenzdatensatzes zugeordnet wird, bei dem der Betrag der Differenz der Mittelwerte der Dehnung zwischen Patientenprobe und Referenzdatensatz am geringsten ist.

8. Verfahren zum Screening von Substanzen als potentielle Wirkstoffe für die Onkologie,

bei dem der Einfluss der Substanzen auf biomechanische Eigenschaften von Tumorzellen untersucht wird, indem die Dehnung einer Vielzahl von Tumorzellen unter mechanischer Belastung analysiert wird und dabei

i) mindestens eine Tumorzelle:

mit einer Substanz kontaktiert wird und

anschließend auf die Tumorzelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt wird, dass die Tumorzelle linear oder nicht-linear verfbrmt wird, und die Dehnung der Tumorzelle zum Zeitpunkt der Belastung bestimmt wird,

ii) die Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen mit Referenzdaten der Analyse der Dehnung von gleichartigen unbehandelten Tumorzellen verglichen wird,

wobei die Substanz ein potentieller Wirkstoff für die Onkologie ist, wenn bei mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Zellen zu erwarten ist, der Anteil der Tumorzellen, die unter mechanischer Belastung eine Dehnung aufweisen, die entgegengesetzt zur Spannungsrichtung ist, an den mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen geringer ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Substanz ein potentieller Wirkstoff für die Onkologie ist, wenn unter mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist, der Mittelwert der Dehnung in Spannungsrichtung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen geringer ist und/oder

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass Tumorzellen einer Zelllinie analysiert werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfluss einer Substanz auf die biomechanischen Eigenschaften derselben Tumorzelle bestimmt wird, wobei zunächst die Dehnung einer unbehandelten Tumorzelle unter Belastung ermittelt wird, anschließend die Tumorzelle mit der Substanz kontaktiert wird, und

anschließend die Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzelle bestimmt wird.

12. Verfahren zur Therapieoptimierung eines Patienten mit einer Krebserkrankung, bei dem der Einfluss von verschiedenen Wirkstoffen auf die biomechanischen Eigenschaften von Tumorzellen des Patienten untersucht wird, indem eine Vielzahl der Tumorzellen unter mechanischer Belastung analysiert wird und dabei

i) mindestens zwei Proben mit Tumorzellen des Patienten jeweils:

mit einem Wirkstoff kontaktiert werden und

anschließend auf jeweils eine Tumorzelle einer Probe eine mechanische Spannung als mechanische Belastung so ausgeübt wird, dass die Tumorzelle linear oder nicht-linear verformt wird und die Dehnung der Tumorzelle zum Zeitpunkt der Belastung bestimmt wird, ii) die Dehnung der mit dem jeweiligen Wirkstoff kontaktierten Tumorzellen mit Referenzdaten unbehandelter Tumorzellen des Patienten verglichen wird,

wobei von den Wirkstoffen der Wirkstoff für die Therapie ausgewählt wird, bei dem die Probe mit Tumorzellen nach Kontaktierung mit dem Wirkstoff im Vergleich zu unbehandelten Tumorzellen a) unter mechanischen Belastungen, bei denen eine lineare Verformung der Tumorzelle zu erwarten ist, den geringsten Anteil an Tumorzellen aufweist, die e ine D ehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen, und/oder

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor der Analyse vereinzelt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanische Spannung nach dem Prinzip des optischen Streckers auf die Zellen ausgeübt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mithilfe von Rasterkraftmikroskopie, dielektrophoretischen Kräften, mikrofluidischer Flüsse, optischer Pinzetten, Laserdiodenbars oder Ultraschallmikroskopie durchgeführt wird.

16. Verwendung einer Vorrichtung, die geeignet ist auf eine Zelle eine mechanische Spannung als mechanische Belastung auszuüben und die Dehnung der Zelle zum Zeitpunkt der Belastung zu bestimmen,

a) zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen durch Analyse von Zellen, die aus einer Probe biologischen Materials eines Patienten erhältlich sind, wobei das Risiko für Tumormetastasen anhand des Anteils von Zellen in der Probe, die eine Dehnung entgegengesetzt zur Spannungsrichtung aufweisen und ggf. das Risiko für das Vorhandensein invasiver Zellen anhand des Mittelwerts der Dehnung in Spannungsrichtung von Zellen in der Probe bei nicht-linearer Verformung der Zellen ermittelt wird, und/oder

b) zur Bestimmung des Ursprungsgewebes eines Tumors eines Patienten mit eine r Krebserkrankung durch Analyse der Dehnung von Tumorzellen aus einer Probe biologischen Materials des Patienten, und/oder