PL237087B1

PL237087B1 - Sposób diagnozowania nowotworów układu chłonnego

Info

Publication number: PL237087B1
Application number: PL423266A
Authority: PL
Inventors: Kamila Duś-Szachniewicz; Marta WOŹNIAK; Krzysztof ZDUNIAK; Kinga WALASZEK; Sławomir DROBCZYŃSKI
Original assignee: Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2021-03-08
Also published as: PL423266A1; EP3701265A1; EP3701265A4; EP3701265B1; EP3701265C0; WO2019083383A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji komórek prawidłowych i komórek nowotworowych, w szczególności prawidłowych limfocytów B i komórek chłoniaków nieziarniczych u pacjentów z podejrzeniem chłoniaka. Wynalazek należy do dziedziny diagnostyki nowotworów układu chłonnego.

Chłoniaki nie-Hodgkinowskie (NHL) są ósmą przyczyną zachorowań na nowotwory na świecie u mężczyzn i jedenastą u kobiet. Szacuje się, że chłoniaki te diagnozuje się rocznie u ponad 350 000 osób. Liczba zgonów wynosi około 200 000. W Polsce chłoniaki nie-Hodgkinowskie stanowią około 3% zachorowań i zgonów na choroby nowotworowe u mężczyzn i 2,5% u kobiet wg. Krajowego Rejestru Nowotworów, 2014 r. W ciągu wielu lat coraz dokładniejszych badań ustalono, że pod tą samą nazwą kryją się różne podtypy chorób. Mimo iż chłoniaki mogą mieć początkowo podobne objawy kliniczne, to ich profil genetyczny i molekularny jest odmienny, a zatem są zróżnicowane pod względem rokowania, przebiegu i leczenia.

Obecnie stosowane procedury diagnostyczne u pacjentów z podejrzeniem choroby rozrostowej układu chłonnego obejmują ocenę patomorfologiczną tkanek pobranych ze zmienionego chorobowo narządu bądź też cytometrię przepływową materiału biopsyjnego.

Jako standard w diagnostyce chłoniaków stosuje się badanie histopatologiczne na podstawie badania różnych materiałów w zależności od obrazu klinicznego. Wycinki pobierane drogą chirurgiczną najczęściej pochodzą z węzłów chłonnych lub tkanek pozawęzłowych: skóry, przewodu pokarmowego, szpiku kostnego, śledziony, grasicy i migdałków. W większości przypadków w celu doprecyzowania rodzaju chłoniaka konieczne jest wykorzystanie przynajmniej jednego badania dodatkowego: immunohistochemii, badania genetycznego lub molekularnego.

Badanie immunohistochemiczne to diagnostyka różnicowa chłoniaków opierająca się na National Comprehensive Cancer Network. Interpretacja immunofenotypu powinna być skorelowana z obrazem klinicznym i cechami morfologicznymi chłoniaków.

W cytometrii przepływowej materiał z biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej węzła chłonnego, krwi obwodowej lub szpiku zostaje poddany immunofenotypowaniu.

Diagnostyka chłoniaków uwzględnia również badanie cytogenetyczne (hybrydyzacja in situ/FISH) oraz badanie cytologiczne, w którym analizuje się materiał z biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej węzła chłonnego, krwi obwodowej lub szpiku, a także diagnostykę obrazową wykorzystującą techniki tomograficzne.

Ze stanu techniki wiadomo o innych próbach dostarczenia skutecznego testu diagnostycznego, który mógłby być wykorzystany w przypadkach chorób przerostowych układu chłonnego.

EP2697256 dostarcza sposób diagnozowania chłoniaków opierający się na wykrywaniu ekspresji białek LY6G6F, VSIG10, TMEM25 i LSR.

US4038145 ujawnia metodę diagnostyczną, w której stosuje się mieszaną reakcję limfocytarną (MLR) w hodowli tkankowej do wykrywania reakcji autoimmunologicznej wywoływanej przez nowotwór, charakterystycznej dla nowotworów limfoidalnych. Limfocyty pochodzące z krwi, śledziony i węzłów chłonnych są stosowane w kombinacji. Mieszana reakcja limfocytarna w wyniku dowolnej z trzech możliwych kombinacji wskazuje na obecność nowotworu limfoidalnego.

EP3221467 ujawnia metodę diagnostyczną do wykrywania chłoniaków, obejmującą następujące etapy: określenie poziomu ekspresji hGSTAl w próbce nowotworu uzyskanej od pacjenta, ii) porównanie poziomu ekspresji określonego w kroku i) z ustaloną z góry wartością odniesienia, ii) stwierdzenie, że pacjent jest chory, gdy poziom ekspresji hGSTAl jest niższy niż określona z góry wartość odniesienia.

EP3167288 dotyczy sposobów diagnozowania nowotworów krwi. W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu zawierającego etapy i) wykrywanie obecności komórek CD45RARO NK w próbce otrzymanej od pacjenta, ii) oraz stwierdzenie, że pacjent cierpi na nowotwór krwi, gdy obecność komórek CD45RARO NK wykrywa się w próbce, a obecność co najmniej jednego markera fenotypowego wskazuje na typ nowotworu.

EP2612869 dostarcza przeciwciało mające zdolność wiązania się z izoformą ED-A fibronektyny, przy czym wiązanie się przeciwciała z białkiem wskazuje na obecność komórek nowotworu układu chłonnego.

US2011287948 ujawnia sposób diagnozowania nowotworów, w tym chłoniaków, na podstawie algorytmu uwzględniającego pomiar sił adhezyjnych pomiędzy komórkami patologicznymi w mikroskopie sił atomowych (AMF) lub szczypcach optycznych.

PL 237 087 B1

EP2624742 zapewnia metodę diagnostyczną, w której analizuje się mechaniczne właściwości komórek nowotworowych i komórek referencyjnych pod obciążeniem mechanicznym, które prowadzi do liniowego lub nieliniowego odkształcenia obciążonej komórki. Ekspansja komórek, która jest wynikiem zastosowania mechanicznego naprężenia, jest wykorzystana do określania ryzyka przerzutów nowotworowych oraz, w stosownych przypadkach, obecności komórek proliferujących w niekontrolowany sposób, inwazyjnych, lub tkanki pochodzenia nowotworowego. W przypadku nieliniowej deformacji komórki określane jest ryzyko wystąpienia komórek nieprawidłowo proliferujących, na podstawie średniej wartości ekspansji w kierunku naprężania komórek w próbce. Sposób realizowany jest z wykorzystaniem szczypiec optycznych.

Odsetek pacjentów ze zmianami odczynowymi wśród wszystkich diagnozowanych w kierunku choroby rozrostowej pacjentów wynosi około 30%. Proces diagnostyczny wymaga coraz bardziej skomplikowanych metod diagnostycznych, aby odpowiednio zaklasyfikować oraz szybko i skutecznie odróżnić zmiany nowotworowe od niezłośliwych zmian reaktywnych.

Pomimo dostępnych metod diagnostycznych nowotworów układu chłonnego w stanie techniki istnieje potrzeba dostarczenia prostej i wysoce specyficznej metody identyfikacji komórek patologicznych i komórek prawidłowych u pacjentów z podejrzeniem nowotworu.

Celem wynalazku jest dostarczenie skutecznej metody pozwalającej na efektywną identyfikację komórek patologicznych powstających w procesie nowotworzenia i komórek zdrowych u pacjentów z podejrzeniem choroby nowotworowej układu chłonnego.

Cel ten zrealizowano w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania in vitro nowotworu układu chłonnego obejmujący etapy, w których:

a) dostarcza się limfocyty B od pacjenta,

b) przygotowuje się zawiesinę limfocytów B oraz komórki zrębu szpiku kostnego do procedury pomiarowej techniką szczypiec optycznych,

c) techniką szczypiec optycznych komórkę limfocytu B zbliża się do komórki zrębu szpiku kostnego, w ten sposób, że komórka limfocytu B i komórka zrębu szpiku kostnego pozostają w bezpośrednim kontakcie, aż do utworzenia stabilnego połączenia, przy czym połączenie uważa się za stabilne gdy komórka limfocytu B nie pozwala się odciągnąć od komórki zrębu szpiku kostnego za pomocą pułapki optycznej generowanej laserem o mocy 200 mW, d) mierzy się czas utworzenia stabilnego połączenia (t) pomiędzy komórką limfocytu B a komórką zrębu szpiku kostnego, przy czym czas utworzenia stabilnego połączenia t > 60 s wskazuje na obecność komórek nowotworowych.

Korzystnie, przed zbliżeniem limfocytu B do komórki zrębu szpiku kostnego komórkę limfocytu B chwyta się w pułapkę optyczną za pomocą szczypiec optycznych.

Korzystnie, komórka limfocytu B jest chwytana w pułapkę optyczną o sile 100 pN.

Korzystnie, nowotworem układu chłonnego jest chłoniak nieziarniczy z komórek B (NHL).

Korzystnie, nowotworem układu chłonnego jest chłoniak rozlany z dużych komórek B (DLBCL), chłoniak grudkowy (FL), chłoniak z komórek płaszcza (MCL), chłoniak typu MALT, chłoniak Burkitta (BL) oraz chłoniak z komórek B o wysokim stopniu złośliwości (HGBL).

Korzystnie, komórkę limfocytu B zbliża się do centralnej części komórki zrębu szpiku kostnego.

Korzystnie, komórką zrębu szpiku kostnego jest fibroblast.

Korzystnie, komórki zrębu szpiku kostnego stanowi linia HS-5 zdeponowana pod nr ATCC CRL-11882.

Szczypce optyczne to urządzenie generujące siły optyczne zdolne do manipulowania obiektami o rozmiarach w zakresie od 0,4 pm do 20,0 pm w preparacie mikroskopowym. Odpowiedni kształt wiązki laserowej o długości fali z zakresu podczerwieni lub światła widzialnego umożliwia badanie własności mechanicznych komórek, określenie sprężystości błon komórkowych, oddziaływań międzykomórkowych w kokulturach komórek zdrowych i nowotworowych, materiałów biologicznych, nici DNA. Wygenerowana przez system kształtowania wiązki laserowej pułapka optyczna, pochodząca z mocno zogniskowanej wiązki laserowej, chwyta w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu mikroskopowego obiekty znajdujące się w preparacie. Układ pęsety optycznej pozwala na bezpośrednie lub pośrednie (poprzez specjalne dielektryczne nanokulki) pomiary przesunięć, sił oddziałujących na struktury biologiczne, czy też właściwości adhezyjnych schwytanych komórek.

W sposobie według wynalazku możliwe jest zastosowanie innych technik manipulacji komórkowej.

PL 237 087 Β1

Istota wynalazku polega na identyfikacji prawidłowych oraz patologicznych limfocytów B na podstawie czasu niezbędnego do utworzenia przez komórkę chłoniaka stabilnego połączenia z fibroblastami zrębu szpiku kostnego. Sposób według wynalazku umożliwia skuteczną diagnostykę nowotworu poprzez rozróżnianie komórek prawidłowych od komórek patologicznych stabilnej kokultury pomiędzy fibroblastami a limfocytami B w szczypcach optycznych. Sposób według wynalazku oparty na oddziaływaniach między limfocytami B a fibroblastami zrębu szpiku kostnego pozwala zatem na odróżnienie z wysoką skutecznością prawidłowych limfocytów B od komórek patologicznych. Zatem już na pierwszym etapie procedury diagnostycznej znacznie skraca jej czas oraz koszt.

Opis figur

Fig. 1 przedstawia etapy nasuwania komórki limfocytu B na komórkę fibroblasta linii HS-5. a) przesuwanie komórki nad podłożem, brak bezpośredniego kontaktu między komórkami b) powstanie miejsca stycznego błony komórkowej limfocytu B z powierzchnią komórki HS-5; komórka limfocytarna pozostaje dokładnie w centrum pułapki optycznej c) przesuwanie limfocytu B do centralnej części komórki HS-5.

Fig. 2 przedstawia a) patologiczny limfocyt B złapany w pułapkę optyczną b) komórkę chłoniaka zbliżoną do komórki zrębu szpiku kostnego HS-5, utrzymany kontakt komórek w pułapce optycznej.

Fig. 3 przedstawia liczbę pacjentów różniących się płcią i stanem zdrowia oraz wyniki testu niezależności.

Fig. 4 przedstawia czas utworzenia silnego połączenia komórek w grupie badanej i kontrolnej oraz wynik testu istotności U Manna Whitneya.

Fig. 5 przedstawia krzywą ROC dla czasu utworzenia stabilnego połączenia między komórkami oraz pole pod krzywą ROC (AUC = 0,997).

Fig. 6 przedstawia histogram czasu utworzenia stabilnego połączenia między komórkami patologicznymi i prawidłowymi oraz czułość (Sens.) i swoistość (Spec.) testu dla wartości odcinającej (cut-off) t > 60 s.

Fig. 7 przedstawia wymaganą minimalną liczbę wyizolowanych komórek w funkcji mocy testu.

Przykład

Materiał kliniczny

Celem Twórców było uzyskanie komórek w stanie jak najbardziej zbliżonym do ich kondycji w warunkach in vivo. W sposobie według wynalazku wykorzystano ściśle zdefiniowany materiał kliniczny jakim są prawidłowe oraz nowotworowe limfocyty B pozyskane w celach rutynowej diagnostyki onkologicznej. Materiał kliniczny stanowią komórki nowotworowe uzyskane od pacjentów z rozpoznanym chłoniakiem rozlanym z dużych komórek B (DLBCL), chłoniakiem grudkowym (Folicullar Lymphoma, FL), chłoniakiem z komórek płaszcza (Mantle Celi Lymphoma, MCL), chłoniakiem typu MALT, chłoniakiem Burkitta (BL) oraz chłoniakiem typu High Grade B-Cell Lymphoma. Informacje dotyczące pochodzenia oraz rodzaju materiału klinicznego włączonego do badań zostały zebrane w tabelach 1 i 2, przy czym tabela 2 przedstawia dane kliniczno-patologiczne pacjentów kontrolnych włączonych do badania. Badaniami objęto 47 osób w wieku od 21 do 89 lat (średnia M = 59,8; odchylenie standardowe SD = 15,8 lat). Podstawowe statystyki cech charakteryzujących obie grupy zamieszczono w tabeli 3 (wiek oraz płeć pacjentów w grupie badanej i kontrolnej; wyniki testu istotności U Manna Whitneya). Opracowanie statystyczne wyników wykonano w programie Statistica 11, StatSoft Polska. Obie grupy pacjentów nie różniły się istotnie pod względem wieku (59,2 vs. 61,1 lat; p = 0,699) ani struktury płci (udział kobiet: 50,0% vs. 66,7%; p = 0,449).

Tabela 1

NR.	PŁEĆ	WIEK	ROZPOZNANIE	MATERIAŁ	LOKALIZACJA	IMMUNOFENOTYP
1	M	50	Extranodal DLBCL, NOS, non GCB	B	węzeł chłonny szyi po stronie prawej, naciek spojenia łonowego	FC: 42% patologicznych limfocytów B. Double expressor lymphoma: EC12+/-/BC16+/MYC-.
2	M	75	Extranodal DLBCL, NOS, non GCB	B	naciek spojenia łonowego	FC: 56% patologicznych limfocytów B, Double expressor lymphoma: BC12+ higher/BClć/+/MYC-.
3	K	46	Extranodal DLBCL, NOS, GCB.	B	węzeł chłonny okolicy nadobojczykowej lewej	FC: 96% patologicznych limfocytów B, Triple expressor lymphoma: BC12+ higher/BC16+/MYC+-

PL 237 087 Β1

4	Κ	61	Extranodal DLBCL, NOS, GCB	B	guz uda lewego poniżej więzadła pachwinowego	FC: 91% patologicznych limfocytów B, Triple expressor lymphorna: BCL2+higher/ BCL6+high/MYC+.
5.	κ	54	Nodal DLBCL, NOS, GCB	B	węzeł chłonny podżuchwowy po stronie prawej	FC: 41% patologicznych limfocytów B_r Double expressor lymphorna: BCL2/BCL6+high/MYC+.
6.	Μ	62	Nodal DLBCL, NOS, GBC	B	węzeł chłonny szyi po stronie prawej	FC: 63% patologicznych limfocytów B, Double expressor lymphorna: BCL2+higher/ BCL6+/MYC-/+.
7.	Κ	55	Extranodal DLBCL, NOS, GCB	B	naciekający skórę guz jamy brzusznej	FC: 24% patologicznych limfocytów B, Double expressor lymphorna: BCL2+/BCL6+/MYC-.
8.	Μ	44	Nodal DLBCL, NOS, GCB	B	węzeł chłonny szyi po stronie lewej	FC: 34% patologicznych limfocytów B, Double espressor lymphorna BCL2+/BCL6+/MYC-.
9.	κ	54	Nodal DLBCL, NOS, non-GCB	B	węzeł chłonny szyi po stronie lewej, masy węzłowe w jamie brusznej	FC: 50% patologicznych limfocytów B, Triple expressor lymphorna BC12+/BC16+/MYC+.
10,	Μ	32	Nodal DLBCL, NOS, between GCB and non-GCB	B	węzeł chłonny szyi	FC: 23% patologicznych limfocytów B, One expressor lymphorna: BCL2-/ BCL6+/MYC-.
11.	Κ	61	Nodal DLBCL, NOS, GCB	B	węzeł chłonny w okolicy mięśnia motkowo-sutkowoobojczykowego po stronie prawej	FC: 24% patologicznych limfocytów B, . Double expressor lymphorna: BCL2-/ BCL6+/MYC-/+.
12.	κ	74	Primary cutaneous DLBC,GCB withBL	B	zmiany skórne prawego podudzia dolnej części uda z owrzodzeniami	FC: 45% patologicznych limfocytów B, Double expressor lymphorna: BC12-/BC16+/MYC+/.
14.	κ	84	HGBL, NOS between GCB and non-GCB	B	guz jamy nosa po stronie prawej	FC: 44% patologicznych limfocytów B,. Triple expressor lymphorna: BCL2+higher/BCL·6+/MYC+.
1S.	Μ	37	HGBL, GCB	B	węzeł chłonny szyi typu bulky strony prawej	FC: 66% patologicznych limfocytów B, Double expressor lymphorna: BCL2+hlgher/ BCL6+/MYC-.
16.	Μ	60	HGBL, NOS	B	guzy skórne łydki po stronie prawej	FC: 97% patologicznych limfocytów B, Triple expressor lymphorna BC12+/SC16+/MYC+.
17.	Κ	70	FL	B	guz jamy brzusznej	FC: 86% patologicznych limfocytów B, WHO classification G2 Iow grade.
18.	κ	79	FL	B	węzły chłonne jamy brzusznej	FC: 65% patologicznych limfocytów B,
19.	κ	49	FL	B	węzeł chłonny nadobojczykowy	FC: 24% patologicznych limfocytów B, WHO classification G2 Iow grade.
20.	κ	66	FL	w	węzły chłonne biodrowe	FC: 86% patologicznych limfocytów B, WHO classification G1 Iow grade.
21.	Μ	65	FL	w	węzeł chłonny szyi	FC: 53% patologicznych limfocytów B,WHO classification G2 Iow grade.
22.	Μ	56	FL	B	węzeł chłonny pachwiny lewej	FC: 42% patologicznych limfocytów B, WHO classification G2 Iow grade.

PL 237 087 Β1

23.	M	32	FL	B	Guz jamy brzusznej typu bulky	FC: 95% patologicznych limfocytów B, Acc WHO classification Gl.
24.	M	70	FŁ	B	węzeł chłonny szyi po stronie lewej	FC: 19% patologicznych limfocytów B, WHObrak danych
25.	K	67	FŁ	w	węzeł chłonny z tkanki nadobojczykowej	FC: 47% patologicznych limfocytów B
26.	K	86	MCL	B	zmiana węzłowa w jamie brzusznej	FC: 96% patologicznych limfocytów B
27.	K	69	MCL	B	węzły chłonne szyi po stronie prawej	FC: 86,2% patologicznych limfocytów B
28.	M	bd	MCL	W	błona śluzowa żołądka i dwunastnicy	FC: 95% patologicznych limfocytów B
29.	M	64	MCL	W	węzeł chłonny okolicy pachwinowej	FC: 94% patologicznych limfocytów B
30.	M	21	BL	B	guz węzłowy pachy prawej	FC: 90% patologicznych limfocytów B, BCL2/BCL6-/ MYC+.
31.	M	54	BL	B	węzeł szyi po stronie prawej	FC: 65% patologicznych limfocytów B
32.	M	65	MALT	B	guz sutka prawego	FC: 80% patologicznych limfocytów B

F- płeć żeńska, M-płeć męska, B-materiał biopsyjny, W-materiał operacyjny

Tabela 2

NR.	PŁEĆ	WIEK	ROZPOZNANIE	LOKALIZACJA
1.	F	82	Cholecystitis acuta	okolica przewodu żółciowego wspólnego
2.	F	76	Cholecystitis acuta	okolica przewodu żółciowego wspólnego
3.	F	65	Cholecystitis acuta	okolica przewodu żółciowego wspólnego
4.	F	80	Cholecystitis acuta	okolica przewodu żółciowego wspólnego
5.	M	65	Colitis chronica	węzeł chłonny krezki jelita cienkiego
6.	F	45	Pancreatltis acuta	węzeł chłonny krezki jelita cienkiego
7.	M	29	Lymphonodulitis reactiva	węzeł chłonny szyi
8.	F	51	Lymphonodulitis reactiva	węzeł okolicy trójkąta udowego lewego
9.	F	58	Lymphonodulitis reactiva	węzeł chłonny szyi
10-	M	43	Lymphonodulitis reactiwa	węzeł chłonny szyi
11.	M	74	Lymphonodulitis reactiva	węzeł pachwinowy po stronie prawej
12.	K	44	Lymphonodulitis reactiwa	węzeł chłonny tkanki podżuchwowej
13.	K	72	Lymphonodulitis reactiva	węzeł pachowy
14.	M	89	Adenocarcinoma coli,, Gil	krezka jelita grubego
15.	F	44	lnvaslve carcinoma of no special type (NST)	węzeł pachowy

F- płeć żeńska, M- płeć męska

PL 237 087 Β1

Tabela 3

Cecha (zmienna)	Wszyscy pacjenci __ N = 47	Grupa pacjentów	Bvs. K P
Badana(8) N = 32	Kontrolna (K) W =15
Wiek (rok życia) M±SD	59,8 ±15,8	59,2 ± 15,1	61,1 ±17,8
Me [Q_i; Qa] Min - Max	61 [49; 72] 21-89	61 [52; 70] 21-86	65 [44; 76] 29-89	0,699
Pteć:	n %	n %	n %
Kobiety Mężczyźni		16 50,0 16 50,0	10 66,7% 5 33,3%	0,449

Protokół pozyskiwania materiału klinicznego

Biopsje

Zawiesina komórkowa pobierana jest pod kontrolą USG do roztworu PBS pH = 7,4 (Life Technologies, nr kat. 10010-023), a następnie sterylnie przenoszona do probówki z EDTA (Becton Dickinson, EDTA 7,2 mg, nr kat. 368861). Po 40 minutach materiał jest głęboko mrożony w 30% płodowej surowicy bydlęcej (Life Technologies, FBS, nr kat. 10270-098) i 10% DMSO (BioShop, nr kat. DMS555). Komórki przechowywane są w ciekłym azocie.

Materiał operacyjny

Po śródoperacyjnym pobraniu węzła materiał trafia do sterylnego roztworu PBS z 2% antybiotykiem i antymykotykiem (Life Technologies, nr kat. 15240062). Limfocyty B izolowane są z węzła chłonnego do 4 godzin od pobrania. Komórki naciągane są igłą biopsyjną do strzykawki z antykoagulantem i sterylnym roztworem PBS. Po 40 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej materiał jest mrożony w 30% FBS i 10% DMSO. Komórki przechowywane są w ciekłym azocie.

Przygotowanie próbek klinicznych do pomiarów w szczypcach optycznych

Układ holograficzny szczypiec wykorzystany w przedmiotowym sposobie posiada następujące parametry: lasery pułapkujące: 1064 nm 4W, 980 nm 900mW; obiektyw mikroskopowy 100x NA 1.3; holograficzna generacja pułapek optycznych z wykorzystanie modulatora LCoS Hamamatsu o rozdzielczości 800x600; sterowanie wiązką laserową z wykorzystaniem galvano-zwierciadeł; tor optyczny do analizy spektroskopowej; kamera video: CMOS max frame ratę 10 000 fps (frames per second).

Próbkę rozmraża się, dwukrotnie wiruje się w pożywce RPMI (1800 x g przez 7 min). Określa się liczbę i przeżywalność komórek, a następnie inkubuje się 24 h w temp. 37°C, 5% CO2.

W przypadkach, w których odsetek patologicznych limfocytów B w badaniu immunofenotypowym (cytometria przepływowa) był mniejszy niż 90% wykonywano deplecję limfocytów T oraz komórek NK za pomocą kulek magnetycznych powleczonych przeciwciałem anty-CD3 (CD3+ Manuał MACS® Cell Separation, Miltenyi Biotech). Procedurze tej każdorazowo poddaje się próbki kontrolne. Próbki pacjentów nr 7, 11, 24 w związku z dużym odsetkiem prawidłowych limfocytów B poddano dodatkowej izolacji magnetycznej z wykorzystaniem kulek powleczonych przeciwciałami CD5+ oraz CD10+. Efektywność izolacji magnetycznej potwierdzono w cytometrii przepływowej. Bezpośrednio przed pomiarami w szczypcach optycznych komórki odwirowuje się i przyrządza się zawiesinę o gęstości 5x10⁵/mL.

Hodowla komórek zrębu szpiku kostnego

W celu uzyskania optymalnych i powtarzalnych warunków eksperymentalnych opracowano protokół określający sposób zakładania hodowli komórek zrębu szpiku kostnego HS-5. Do hodowli komórek linii HS-5 (ATCC, nr kat. ATCC® CRL-11882™) rekomenduje się pożywkę DMEM (ATCC, Dul

PL 237 087 Β1 becco’s modified Eagle’s medium, nr kat. ATCC® 30-2002™). Pożywkę dodatkowo wzbogacono płodową surowicą bydlęcą (ATCC, FBS, nr kat. ATCC® 30-2020™). Hodowlę komórek prowadzono w wilgotnej atmosferze w obecności 5% CO2.

Komórki HS-5 po osiągnięciu konfluencji 80% w butelce hodowlanej pasażowano, określono ich ilość oraz żywotność z wykorzystaniem błękitu trypanu (lnvitrogen, The Countess™ automated celi counter). Następnie komórki w dobranej eksperymentalnie ilości (25 000 komórek w 200 ul pożywki DMEM) wysiewano na sterylną szalkę Petriego ze szklanym dnem (Greiner bio-one, nr kat. 627960). Po upływie 24 h od założenia hodowli, do komórek dolewano 1 ml pożywki hodowlanej. Po upływie 72 h od założenia hodowli konfluencja dojrzałych morfologicznie komórek na szalkach wynosiła około 60%. Bezpośrednio przed pomiarami w szczypcach optycznych odpłukano nieprzyklejone do podłoża komórki.

Procedura pomiarowa

Szalkę pomiarową z fibroblastami HS-5 umieszczono na stoliku manipulatora optycznego. Bezpośrednio na szalkę nanoszono 100 ul zawiesiny limfocytów B. Czas opadania komórek na dno szalki wynosił około 5 minut. Następnie limfocyt B chwytano w pułapkę optyczną o sile 100 pN i zbliżano do centralnej części komórki zrębu w ten sposób, że komórki pozostawały w bezpośrednim kontakcie aż do utworzenia stabilnej kokultury (Fig. 1).

Wyznaczone eksperymentalnie przedziały czasowe pułapkowania komórki wynosiły odpowiednio: 5, 10, 15, 20, 40, 60 i 90 s dla komórek prawidłowych oraz 30, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 360, 420 i 480 s dla komórek patologicznych.

Jako stabilna kokultura przyjęto stan, w którym limfocyt B nie pozwala się odciągnąć od komórki zrębu HS-5 za pomocą pułapki optycznej generowanej laserem o mocy 200 mW.

Szalkę z podłożem komórkowym wymieniano co 20 minut manipulacji jednocześnie niedopuszczając do spadku temperatury pożywki hodowlanej poniżej 33°C. Eksperyment powtórzono co najmniej dwukrotnie dla każdego z przypadków.

W tabelach 4 i 5 zamieszczono wyniki pomiarów czasu potrzebnego do utworzenia kokultur w szczypcach optycznych, odpowiednio dla komórek patologicznych oraz prawidłowych. Tabela 4 przedstawia czas potrzebny do utworzenia stabilnego połączenia między patologicznymi limfocytami B a komórkami zrębu HS-5 z wykorzystaniem szczypiec optycznych. Tabela 5 przedstawia czas potrzebny do utworzenia stabilnego połączenia między prawidłowymi limfocytami B a komórkami zrębu HS-5 z wykorzystaniem szczypiec optycznych.

Tabela 4

NR.	LB POMIARÓW	ŚREDNIA [s]	os	ZAKRES [sl	NR.	LB POMIARÓW	ŚREDNIA [s]	OS	ZAKRES [sj
1	73	131,5	49,4	60-210	17	62	202,2	64,0	120-360
2	73	162,2	59,2	90-270	18	54	120,5	46,0	60-240
3	80	157,9	57,3	90-300	19	56	304,8	59,4	210-420
4	76	168,9	55,8	90-270	20	65	180,0	50,3	90-270
5	54	160,5	48,4	90-300	21	72	109,2	32,4	60-180
6	60	339,5	65,4	210-480	22	55	317,4	86,1	120-420
7	59	163,2	44,7	90-300	23	53	110,9	28,9	60-150
8	53	162,4	43,0	120-360	24	57	201,6	69,4	120-360
9	52	264,2	52,1	120-360	25	68	157,1	60,9	60-300

PL 237 087 Β1

10	65	167,1	49,7	90-300	26	62	119,0	44,8	60-210
11	52	209,4	54,3	120-300	27	51	120,0	32,3	60-180
12	64	257,8	68,2	120-360	28	50	115,2	41,7	60-210
13	47	324,2	59,2	210-420	29	58	124,1	33,6	60-180
14	58	300,5	61,4	180-420	30	72	268,7	62,9	180-420
15	54	336,7	85,2	180-480	31	58	315,0	73,9	180-420
16	67	265,1	94,8	120-420	32	42	350,7	53,8	270-420

Tabela 5

NR.	LB POMIARÓW	ŚREDNIA [s]	OS	ZAKRES [s]	NR.	LB POMIARÓW	ŚREDNIA (sj	OS	ZAKRES
1	93	17,1	8,9	5-30	9	98	16,7	8,3	5-40
2	74	18,5	8,1	5-40	10	54	37,1	21,4	10-90
3	67	29,6	12,1	10-60	11	78	36,2	20	15-90
4	48	41,2	24,4	10-90	12	68	23,8	11,7	5-60
5	55	33,4	13,9	10-60	13	51	42,3	11,1	30-60
6	57	49,8	17	20-90	14	70	21,8	7,2	10-40
7	98	18,4	9,9	5-60	15	66	20,4	10,3	5-40
8	110	22,4	13,1	5-60

Podstawowe statystyki czasu utworzenia stabilnego połączenia komórek wyizolowanych od osób chorych (B) i zdrowych (K) wraz z testem istotności przedstawiono w tabeli 6.

Tabela 6 . . . ... Wszystkie komórki

Czas utworzenia stabilnego połączenia (s)

N = 2999

Komórki ______________________________________________ B vs. K patologiczne (B) prawidłowe (K)

N = 1912 N=1087 p

M±SD	140,8 + 116,0	205,6 ± 96,7	26,7 + 16,6
Me [Q_x; Os]	120 130; 210]	180 [120; 270]	20 [15; 301 <0,0001
Min - Max	5-480	60 - 480	5-90

A/ - średnia, SD - odchylenie standardowe, Me - mediana, gi - kwartyl dolny (25-ty percentyl), - kwartyl górny (75-ty percentyl), Min - wartość minimalna, Max - wartość maksymalna

Z przeprowadzonych pomiarów wynika, że komórki chłoniaka tworzą stabilne połączenie z fibroblastami zrębu HS-5 od 2,2 do 20,5 razy wolniej niż komórki prawidłowe. Czas niezbędny do utworzenia trwałego połączenia dla komórek patologicznych jest istotnie dłuższy niż dla komórek prawidłowych (180 s vs. 20 s). Wynik porównania średnich wartości czasów jest istotny statystycznie na poziomie p < 0,001. Moc testu jest bliska jedności (Fig. 4).

PL 237 087 Β1

W tabelach 7 i 8 przedstawiono odsetek limfocytów B tworzących stabilne kokultury z komórkami zrębu w określonych przedziałach czasowych. Tabela 7 zawiera rozkład % patologicznych komórek tworzących stabilne połączenie z komórkami zrębu w określonych przedziałach czasowych. Tabela 8 zawiera rozkład % prawidłowych komórek tworzących stabilne połączenie z komórkami zrębu w określonych przedziałach czasowych.

Tabela 7

PACJENCI
[s]	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
[%]
30	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
60	12,3	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
90	24,7	20,3	18,8	11,8	11,1	0	3,4	11,3	0	4,6	0	0	0	0	0	0
120	20,5	25,0	27,5	26,3	24,1	0	30,5	22,6	1,9	32,3	13,5	6,3	0	0	0	4,5
150	12,3	6,3	13,8	13,2	24,1	0	23,7	5,7	0	13,8	9,6	0	0	0	0	11,9
180	15,1	21,9	15,0	13,2	13,0	0	15,3	41,5	5,8	18,5	11,5	15,6	0,0	5,2	1,9	16,4
210	15,1	0	7,5	13,2	18,5	5,1	18,6	11,3	19,2	18,5	26,9	9,4	6,4	1,7	5,6	9,0
240	0	21,9	11,3	15,8	7,4	0	6,8	7,5	15,4	9,2	17,3	15,6	0	17,2	11,1	14,9
270	0	4,7	3,8	6,6	0	15,3	0	0	13,5	0	11,5	15,6	17,0	24,1	16,7	0
300	0	0	2,5	0	1,9	30,5	1,7	0	32,7	3,1	9,6	20,3	34,0	20,7	18,5	6,0
330	0	0	0	0	0	1,7	0	0	5,8	0	0	0	6,4	0	0	0
360	0	0	0	0	0	18,6	0	0	5,8	0	0	17,2	17,0	20,7	9,3	28,4
390	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
420	0	0	0	0	0	28,8	0	0	0	0	0	0	19,1	10,3	27,8	9,0
480	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	9,3	0

PACJENCI
[s]	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30	31	32
[%]
30	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
60	0	20,4	0	0	16,7	0	13,2	0	7,4	18,0	5,9	14,0	5,2	0	0	0

PL 237 087 Β1

90	0	11,1	0	3,1	27,8	0	26,4	0	11,8	27,9	29,4	34,0	25,9	0	0	0
120	19,4	46,3	0	24,6	34,7	5,5	37,7	22,8	23,5	21,3	31,4	26,0	34,5	0	0	0
150	11,3	1,9	0	12,3	16,7	0	22,6	8,8	8,8	8,2	23,5	16,0	19,0	0	0	0
180	19,4	9,3	0	16,9	4,2	7,3	0	22,8	30,9	21,3	9,8	0	15,5	8,3	0	0
210	11,3	11,1	1,8	21,5	0	5,5	0	8,8	5,9	3,3	0	10,0	0	13,9	10,3	0
240	24,2	0	23,2	15,4	0	5,5	0	22,8	2,9	0	0	0	0	29,2	6,9	0
270	3,2	0	21,4	6,2	0	3,6	0	1,8	2,9	0	0	0	0	16,7	5,2	7,1
300	6,5	0	19,6	0	0	16,4	0	3,5	5,9	0	0	0	0	13,9	3,4	35,7
330	0	0	0	0	0	5,5	0	0	0	0	0	0	0	6,9	24,1	0
360	4,8	0	23,2	0	0	29,1	0	8,8	0	0	0	0	0	2,8	8,6	26,2
390	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	24,1	0
420	0	0	10,7	0	0	21,8	0	0	0	0	0	0	0	8,3	0	31,0
480	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	17,2	0

Tabela 8

KONTROLE
[s]	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
[%]
5	8,6	2,7	0	0	0	0	8,2	5,5	9,2	1,9	0	8,8	0	0	10,6
10	25,8	25,7	3,9	12,5	9,1	0	22,4	20,9	34,7	1,9	9,0	13,2	0	7,1	19,7
15	28,0	16,2	10,4	0	0	0	19,4	9,1	5,1	0	15,4	0,	0	18,6	6,1
20	19,4	36,5	23,9	22,9	14,5	10,5	28,6	31,8	34,7	33,3	0	30,9	0	44,3	30,3
30	12,9	14,9	35,8	14,6	38,2	33,3	18,4	19,1	14,3	27,8	33,3	35,3	27,5	25,7	24,2
40	5,4	4,1	19,4	10,4	23,6	50,9	1,0	8,2	2,0	7,4	19,2	8,8	47,1	4,3	9,1
60	0,	0	7,5	29,2	14,5	5,3	2,0	5,5	0	20,4	17,9	2,9	25,5	0	0
90	o,	0	0	10,4	0	0	0	0	0	7,4	5,1	0	0	0	0

Celem oszacowania wartości odcinającej (cut-off) dla testu rozróżniającego komórki patologiczne od prawidłowych przeprowadzono analizę krzywych ROC (Fig. 6).

PL 237 087 B1

Dla wartości odcinającej t > 60 s czułość testu wynosi Sens. = 96,4% a swoistość Spec. = 98,5% (Fig. 7).

Czas utworzenia stabilnego połączenia między komórkami patologicznymi i prawidłowymi jest istotnie różny bez względu na płeć pacjenta i jego wiek. Przy zaobserwowanych w badaniu wartościach średnich (M) i odchyleniach standardowych (SD) czasu stabilnego połączenia komórek, minimalna liczba wyizolowanych komórek powinna wynosić N = 15. Dla tej liczby komórek przy poziomie istotności p = 0,001 moc testu wynosi β = 0,92 (Fig. 7).

Claims

1. Sposób diagnozowania in vitro nowotworu układu chłonnego, znamienny tym, że:

a) dostarcza się limfocyty B od pacjenta,

c) techniką szczypiec optycznych komórkę limfocytu B zbliża się do komórki zrębu szpiku kostnego, w ten sposób, że komórka limfocytu B i komórka zrębu szpiku kostnego pozostają w bezpośrednim kontakcie, aż do utworzenia stabilnego połączenia, przy czym połączenie uważa się za stabilne gdy komórka limfocytu B nie pozwala się odciągnąć od komórki zrębu szpiku kostnego za pomocą pułapki optycznej generowanej laserem o mocy 200 mW,

d) mierzy się czas utworzenia stabilnego połączenia (t) pomiędzy komórką limfocytu B a komórką zrębu szpiku kostnego, przy czym czas utworzenia stabilnego połączenia t > 60 s wskazuje na obecność komórek nowotworowych.

2. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że przed zbliżeniem limfocytu B do komórki zrębu szpiku kostnego komórkę limfocytu B chwyta się w pułapkę optyczną za pomocą szczypiec optycznych.

3. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że komórka limfocytu B jest chwytana w pułapkę optyczną o sile 100 pN.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotworem układu chłonnego jest chłoniak nieziarniczy z komórek B (NHL).

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotworem układu chłonnego jest chłoniak rozlany z dużych komórek B (DLBCL), chłoniak grudkowy (FL), chłoniak z komórek płaszcza (MCL), chłoniak typu MALT, chłoniak Burkitta (BL) oraz chłoniak z komórek B o wysokim stopniu złośliwości (HGBL).

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórkę limfocytu B zbliża się do centralnej części komórki zrębu szpiku kostnego.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórką zrębu szpiku kostnego jest fibroblast.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki zrębu szpiku kostnego stanowi linia HS-5 zdeponowana pod nr ATCC CRL-11882.