CN102747156B - Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用 - Google Patents
Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用。本发明所提供的应用具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品中的应用；所述B细胞淋巴瘤为弥漫大B细胞淋巴瘤。实验证明，与传统的单一骨髓涂片形态学染色法相比，形态学结合FISH法比单一形态学染色法提高了阳性率（DLBCL:33.0%vs10.3%）；本发明骨髓涂片FISH检测Bcl-2/IgH发生基因重排且骨髓涂片细胞形态学存在1-5%幼稚淋巴细胞的病例83.3%（10/12）比单一形态学染色不同程度提早诊断骨髓浸润，比临床复发提早预警至少3个月以上。这为淋巴瘤骨髓浸润的临床分期、治疗及预后复查提供了有力的补充。
Description
技术领域
本发明涉及Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用，特别涉及用于检测Bcl-2/IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者产品中的应用。
背景技术
B细胞淋巴瘤（B-NHL）在肿瘤病理组织学诊断中属于疑难病种之一，种类繁多，分类复杂，弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最频发的类型，占新诊断NHL的30-40%。
由于骨髓内造血细胞的组织学特点，常规的病理组织形态学和免疫组织化学染色技术可以检测出骨髓受侵，合并白血病阶段，对骨髓微小浸润尚不能满足诊断需要，微小浸润病灶是淋巴瘤复发的主要根源，骨髓是否浸润直接影响DLBCL的分期，进而影响治疗及预后。
目前，评价淋巴瘤骨髓浸润与否的常用方法是骨髓涂片细胞形态学染色，该方法存在一定的局限性：一是淋巴瘤细胞形态变化多样不好辨认，尤其化疗后更是难判别，易导致假阳性和假阴性；二是常规判定幼稚淋巴细胞≥5%为骨髓受侵，而正常人骨髓幼稚淋巴细胞≤1%。这就给我们提出了如下迫切需要解决的问题：对于骨髓形态学检查幼稚淋巴细胞在1-5%之间，如何判定哪些是正常状态，哪些是骨髓形态学阴性的潜在的微小浸润？骨髓形态学检查固然重要，如何增加其他辅助手段减少人为因素尽量达到标准化？个体化治疗需要实验室提出个体化的诊断，骨髓检查如何为下一步的临床靶向治疗提供有价值的靶点？这些问题现阶段均无满意的答案。
人类B淋巴细胞在发育至前B细胞阶段时重组酶有选择地将分隔在胚系基因染色体上的可变区（V）、多样区（D）、连接区（J）及恒定区（C）基因连接，即所谓重链（IgH）重排。由于V、D、J基因是多拷贝的，其间又有随机碱基插入（N区插入）V-D.D-J之间，因此所形成的V-N-D-N-J序列数以百万计，但对于每个B淋巴细胞来说该序列却是独特的。B-NHL是由巳完成IgH重排的B细胞恶变来的。
bcl-2/IgH重排中bcl-2断点发生于距bcl-2第3个外显子3'端280bp的非翻译区,称为主要断裂区（major breakpoint region，MBR），发生于距主要断裂区30kb的下游,称为次要断裂区（minor cluster region，MCR），其余的断裂点分布在MBR和MCR之间或bcl-2基因5'端序列。IgH的断点在J片段的5'侧，大多位于J5和J6，少数断裂点位于IgH的JH区3′端，极少数位于IgH的转换区。D-J之间可有碱基缺失，bcl-2同额外的碱基一起插入该区，形成bcl-2/IgH融合基因。发生在MBR的重排，产生bcl-2/IgH融合mRNA转录；发生在MCR的重排，导致bcl-2mRNA水平上调。随后可能是在MBR和MCR之间插入了一小段包含Eμ增强子的IgH基因超越了正常的bcl一2基因调控过程，导致bcl-2基因在B细胞的高表达，从而抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖，引发肿瘤。
间期核FISH技术的研究材料广泛，无论是细胞病理学的涂片、印片、穿刺，还是组织病理学的新鲜标本和石蜡切片都适用。这种方法比传统的染色体显带技术更加精确、灵敏度更高，比PCR方法的操作更为简便，敏感性和特异性均较高，结果更加客观可靠。再者，目前已知某些基因异常与蛋白表达异常并非同步显现。遗传学改变在淋巴组织病变的良、恶性鉴别、类型鉴别、复合型淋巴瘤的诊断及骨髓受侵情况的诊断均有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测Bcl-2/IgH基因重排的物质或/和仪器的新用途。
本发明所提供的检测Bcl-2/IgH基因重排的物质或/和仪器的新用途具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品中的应用。所述骨髓浸润为骨髓涂片细胞形态学检测阳性，即骨髓中出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占有核细胞总数百分比≥5%。
在本发明中，所述Bcl-2基因为人Bcl-2基因，所述IgH基因为人IgH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具体为由t（14；18）染色体易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更为具体的，为由t（14；18）（q32；q21）染色体易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因启动子下游。
在本发明的一个实施例中，所述用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排物质具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针，更为具体的，为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的荧光原位杂交探针，如美国Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH双色双融合探针（产品目录号32-191018）。Bcl-2/IgH双色双融合探针，IgH基因被绿色荧光素标记，范围大约1.5Mb，覆盖了14q32上IgH的整个同源序列，并从3′端向IgH基因外扩展了300kb的长度。Bcl-2基因被橙红色荧光素标记，范围大约750kb，覆盖了整个Bcl-2基因并向远近两端延伸了250kb的长度。
当然，根据实际需要也可以为其它类型的探针，或是其他可用于检测所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物质。
在本发明的一个实施例中，所述B细胞淋巴瘤具体为弥漫大B细胞淋巴瘤。
本发明的再一个目的是提供一种筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品。
本发明所提供的筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器。所述骨髓浸润为骨髓涂片细胞形态学检测阳性，即骨髓中出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占细胞总数百分比≥5%。
在本发明中，所述Bcl-2基因为人Bcl-2基因，所述IgH基因为人IgH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具体为由t（14；18）染色体易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更为具体的，为由t（14；18）（q32；q21）染色体易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因启动子下游。
在本发明中，所述筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品可为用于筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润患者或潜在骨髓浸润患者的试剂或试剂盒。
在本发明的一个实施例中，所述用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排物质具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针，更为具体的，为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的荧光原位杂交探针，如美国Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH双色双融合探针（产品目录号32-191018）。Bcl-2/IgH双色双融合探针，IgH基因被绿色荧光素标记，范围大约1.5Mb，覆盖了14q32上IgH的整个同源序列，并从3′端向IgH基因外扩展了300kb的长度。Bcl-2基因被橙红色荧光素标记，范围大约750kb，覆盖了整个Bcl-2基因并向远近两端延伸了250kb的长度。
当然，根据实际需要也可以为其它类型的探针，或是其他可用于检测所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物质。
在本发明的一个实施例中，所述B细胞淋巴瘤具体为弥漫大B细胞淋巴瘤。
在实际应用中，为了提高检测结果的准确率，也可以将本发明的方法配合其他检测手段一同使用，如常规的骨髓涂片细胞形态学染色检测法。
在本发明中，所述产品的筛查对象是临床上确诊患有弥漫大B细胞淋巴瘤患者，或是健康人。更为具体的，所述弥漫大B细胞淋巴瘤患者为原发部位（如淋巴结）发生所述Bcl-2基因和IgH基因重排的患者；所述健康人满足外周血中淋巴细胞占白细胞比例在0.20-0.40之间，且无异型淋巴细胞及幼稚淋巴细胞的条件。所述产品的筛查样本具体为采自所述对象的骨髓。
本发明利用荧光原位杂交（FISH）等技术对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的原发部位（如淋巴结）石蜡组织切片和骨髓涂片进行检测，最终发现Bcl-2基因和IgH基因的重排可作为DLBCL骨髓浸润与否的分子标志以及治疗效果评价的标志，具体体现为：与传统的单一骨髓涂片形态学染色法相比，形态学结合FISH法比单一形态学染色法提高了阳性率（33.0%vs10.3%）；本发明骨髓涂片FISH检测Bcl-2/IgH基因重排且骨髓涂片细胞形态学存在1-5%幼稚淋巴细胞的病例83.3%（10/12）比单一形态学染色不同程度提早诊断骨髓浸润，比临床复发提早预警至少3个月以上。这为淋巴瘤骨髓浸润的临床分期、治疗及预后复查提供了有力的补充。
附图说明
图1为Bcl-2/IgH双色双融合探针结构和原理。
图2为DLBCL患者淋巴结和骨髓的Bcl-2/IgH基因分析和Bcl-2蛋白表达。a，冰冻淋巴结石蜡切片证实是DLBCL（HE×100）。b，细胞形态学检查骨髓涂片计数幼稚淋巴细胞是6.0%，按常规诊断标准，判为骨髓浸润（×1000）。c，免疫组化染色评价DLBCL的Bcl-2蛋白阳性表达（×400）。d，免疫细胞化学染色Bcl-2蛋白细胞浆呈棕黄色阳性表达（×400）。e，淋巴结石蜡切片（2μm）的Bcl-2/IgH荧光原位杂交结果，基因融合信号黄色箭头标记（×630）。f，骨髓受侵间期核片的Bcl-2/IgH荧光原位杂交结果，可见14号及18号染色体呈多体改变黄色箭头标记（×630）。
图3为DLBCL骨髓微小浸润的瑞氏-吉姆萨染色和双色荧光原位杂交在同一张骨髓涂片的结果对比（Bcl-2/IgH）。A，阳性对照（×630）。B，阴性对照（×630）。C，DLBCL骨髓形态学瑞氏-吉姆萨染色涂片，可疑细胞用黄色箭头标记（×630）。D，DLBCL骨髓细胞的荧光原位杂交结果，形态可疑细胞发生基因融合用黄色箭头标记（×630）。
图4为DLBCL淋巴结石蜡切片和骨髓经双色荧光原位杂交检测发生信号扩增（黄色箭头标记）。A，淋巴结石蜡切片（×630）。B，骨髓间期核片（×630）。
图5为不同厚度石蜡组织切片的荧光原位杂交结果（2μm和4μm）（×630）。A，2μm。B，4μm。
图6为DLBCL骨髓浸润病例的病程进展中的骨髓形态学与双色荧光原位杂交结果（Bcl-2/IgH）的比较。A，淋巴结石蜡切片证实为DLBCL（HE×100）。B，淋巴结组织切片（2μm厚）FISH检测Bcl-2/IgH显示阳性（×630，箭头所示）。C，3个月后复诊行骨髓穿刺，骨髓形态学检查幼稚淋巴细胞1.5%，依据形态学诊断标准判为骨髓未受侵（×1000）。D，3个月后复诊的骨髓间期核片经FISH检测Bcl-2/IgH显示阴性。E，6个月后复诊，骨髓形态学检查幼淋细胞3.5%，依据形态学诊断标准判为骨髓未受侵（×1000）。F，6个月后复诊的骨髓间期核片经FISH检测Bcl-2/IgH显示阳性（×630，箭头所示）。G，14个月后复诊，骨髓形态学诊断为NHL合并急性淋巴细胞白血病（×1000）。H，14个月后复诊的骨髓间期核片经FISH检测Bcl-2/IgH显示阳性（×630，箭头所示）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、主要试剂和仪器：
Bcl-2/IgH探针：美国Vysis公司，产品目录号为32-191018。Bcl-2/IgH探针是双色双融合探针，IgH基因被绿色荧光素标记，范围大约1.5Mb，覆盖了14q32上IgH的整个同源序列，并从3′端向IgH基因外扩展了300kb的长度。Bcl-2基因被橙红色荧光素标记，范围大约750kb，覆盖了整个Bcl-2基因并向远近两端延伸了250kb的长度。正常的一个间期核中可见各自独立的两个橙红色信号和两个绿色信号（2O2G），发生染色体易位（Bcl-2/IgH基因重排）的细胞核内有两个黄色信号（1O1G2F），见图1，有时可以观察到更多的融合信号或其他异常现象。
Bcl-2抗体：丹麦Dako公司，产品目录号为IR614。
PV-9000试剂盒（二步法免疫组化检测试剂）：北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录号为PV-9000，内含3%H2O2去离子水、Polymer Helper（试剂1）、polyperxidase-anti-mouse/rabbit IgG（试剂2）。
一抗稀释液、浓缩型DAB Kit、EDTA缓冲液、PBS缓冲液：北京中杉金桥生物技术有限公司。
2、溶液配方
（1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，用10ml/L NaOH调制pH7.0，加蒸馏水定容至1L。
（2）1×pepsin（胃蛋白酶）：10％(w/v)pepsin0.5μl，0.01N HCL1ml。
（3）10×PBS：40g NaCl，1gKCl，14.35g Na2HPO4，用HCl调制pH7.4，加蒸馏水定容至500ml。
（4）40%硫酸葡聚糖：40g硫酸葡聚糖，100ml8×SSC溶液。
（5）1%多聚甲醛：1g多聚甲醛，100ml1×PBS。
（6）70%甲酰胺/2×SSC（pH＝7.0，100ml）：70ml100%(v/v)甲酰胺，10ml20×SSC溶液，20ml去离子水。
（7）50%甲酰胺/2×SSC（pH＝7.0，100ml）：50ml100%(v/v)甲酰胺，10ml20×SSC溶液，40ml去离子水。
（8）0.075M KCl：1.12g KCl，200ml去离子水。
（9）20μl杂交液：3μl7%(v/v)吐温-20水，12μl甲醛，5μl硫酸葡聚糖（现用现配）。
（10）2×SSC/0.3％NP-40：100ml20×SSC（pH5.3）溶于850ml纯化水，加3mlNP-40，至NP-40完全溶解。NaOH调至pH7.0，加纯化水至1L。
3、主要仪器
| 设备名称 | 生产商 | 产地 |
| 荧光显微镜 | Opton | |
| 光学显微镜 | Olympus BX40 | 日本 |
| CCD相机 | princeton Inc | |
| 高速离心机20PR-52D | Hitachi | 日本 |
| 台式高速低温离心机，TGL-16G | 安亭 | 上海 |
| 振荡器 | IKA-VIBRAX-VXR | 德国 |
| 涡旋震荡器 | IKA | 广州 |
| 电热鼓风干燥箱 | 101-OAB | 天津 |
| 医用微波炉 | NN-K566WS | 浙江 |
| 恒温水浴箱 | New Brunswick Scientific CO，Inc | |
| 电子天平 | Ohaus Corporation； | |
| 二氧化碳恒温培育箱 | NAPCO | |
| 免疫组化笔ZLI-9070 | 中杉金桥 | 北京 |
| 移液器1000μl R5376 | Gilson | 法国 |
| 移液器200μl | 金花 | 北京 |
| 移液器0.5-10μl Y21344 | thermolabsystem | 上海 |
| 电子天平 | Ohaus Corporation | |
| 冰箱 | SANYO | 日本 |
| Metamorph Imaging System | Universal Imaging Corparation |
4、病例资料
收集2005-2010年中国医学科学院肿瘤医院病理证实的106例按修订的欧美淋巴瘤分类标准(REAL)和WHO2001淋巴瘤分类标准确认为DLBCL的原发部位（如淋巴结）石蜡组织切片和新鲜骨髓，所有病例经免疫组化染色证实是B细胞来源（CD20+）。所选病例资料完整且抽取骨髓前均未接受过放疗和化学治疗。2011，第二版"NCCN（National Comprehensive Cancer Network）NHL临床实践指南"指出NHL患者治疗前为明确是否存在骨髓浸润必须做骨髓穿刺或活检。如果疗程结束时PET-CT结果阴性，建议观察。治疗后必须检查PET-CT[computed tomography(CT)scan,gallium/positronemission tomography(PET)]，如果PET-CT扫描阳性，预期治疗或改变治疗方案前重做骨髓穿刺。临床随访每3-6个月一次持续5年。所研究病例患者均签署知情同意书，且有完整临床资料、骨髓穿刺符合要求、原发部位的冰冻石蜡切块充分。
DLBCL患者中位年龄42岁（5-76岁）。基本阶段划分依CT、PET、骨髓受侵与否来界定。Ann Arbor分期I+II29例，III期36例，IV期41例。国际预后指数（Internationalprognostic index，IPI）评分0-2分73例，3-5分25例，8例不详。体力状况（PerformanceStatus，PS）分析标准1分96例，2分6例，4例不详。中位随访期32个月（5-54个月）。
22例临床上确认为淋巴结良性病变组织的石蜡切块作参照组。Bcl-2／IgH基因重排阳性的淋巴瘤DoHH2细胞株（南京金斯瑞生物科技有限公司，产品目录号No.133。Leukemia.1991;5(3):221-4.A new non-Hodgkin's B-cell line(DoHH2)with a chromosomaltranslocation t(14;18)(q32;q21).Kluin-Nelemans HC,Limpens J,Meerabux J,BeverstockGC,Jansen JH,de Jong D,Kluin PM.）作为阳性对照，健康人外周血淋巴细胞（满足淋巴细胞占白细胞比例在0.20-0.40之间，且无异型淋巴细胞及幼稚淋巴细胞）作阴性对照。年龄、性别、原发部位、乳酸脱氢酶（serum lactate dehydrogenase，LDH）、分期见表1。
表1弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)患者临床特征
实施例1、DLBCL骨髓微小浸润和疗效评价的分子标志的发现
一、原发部位Bcl-2/IgH基因重排及Bcl-2蛋白表达检测
（一）实验方法
1、FISH检测石蜡组织切片Bcl-2/IgH基因重排
（1）将106例按修订的欧美淋巴瘤分类标准(REAL)和WHO2001淋巴瘤分类标准确认为DLBCL的石蜡组织切片65℃烤片4小时。
（2）取0.1μl健康人外周血淋巴细胞中期染色体标本，点在每张切片空白区上作为正常对照，另取0.1μl DoHH2细胞悬液滴在每张切片空白区上作为阳性对照。
（3）室温放置24小时或65℃烤片2小时，4℃冰箱保存备用
（4）RNA酶预处理：每张玻片加100μl稀释的RNA酶（1μl10mg/ml RNA酶贮存液加入99μl2×SSC），盖膜后置于湿盒内，37℃孵育40分钟。
（5）室温下2×SSC洗涤2次，3分钟/次.
（6）梯度酒精脱水（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），2分钟×3次后晾干。
（7）胃蛋白酶处理：每张玻片加稀释的胃蛋白酶（Pepsin）100μl（3.5μl的1%(w/v)Pepsin贮存液加200μl0.01N HCl），盖膜后置于湿盒内，37℃孵育15分钟。
（8）1×PBS洗涤5分钟。
（9）1%多聚甲醛中浸泡10分钟。
（10）1×PBS中洗涤5分钟。
（11）梯度酒精脱水（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），2分钟×3次。
（12）空气中自然干燥。
（13）玻片变性：将玻片置于70%甲酰胺溶液，73℃变性5min。
（14）在预先冷却的2×SSC（4℃）中洗涤2次，每次3min。
（15）梯度酒精脱水（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（16）空气中自然干燥。
（17）做第（13）步同时，将
ddH2O 2μl
杂交缓冲液 7μl
Bcl-2/IgH探针 1μl
混匀后73℃水浴5min，45℃水浴20min。
（18）杂交：将变性好的探针加到已变性好的玻片上（tip头不要触及玻片），盖上大小适中的盖玻片。
（19）用橡胶封住盖玻片边缘，用吹风机吹干，放于湿盒内置37℃温箱杂交16h。
（20）用镊子除去盖玻片上的封胶，置于73℃预热的40ml2×SSC/0.3％NP-40染色缸中洗涤2分钟。
（21）室温2×SSC/0.1％NP-40染色缸中洗涤1分钟，摇洗3秒钟。
（22）室温避光晾干，加DAPI液15～20μl复染核，盖上干净盖玻片，避光放置于4℃冰箱，以备在荧光显微镜下观察结果。
（23）信号检测及图像获取：通过荧光显微镜获取图像。选取适合的滤光片观察，使用63倍物镜（油镜）观察杂交后涂片的信号。荧光信号通过CCD相机摄取，应用Metamorph Imaging System（Universal Imaging Corporation）软件将摄取的图像转化为数字格式以1317×1035pixel的尺寸，TIF格式储存。将拍摄的DAPI、Spectrum Green、SpectrumOrange图像分别赋予蓝、绿、红三种颜色，随后将其合成为彩图。在观察信号时，应根据情况随时调节显微镜的焦距，尽量多拍照片，以准确计数位于细胞核不同平面上的信号。
（24）FISH结果判读：
A.标记满意度判断标准
1）首先观察作为阴性对照的健康人外周血间期核，如果荧光信号都能够清晰显示，并且每个细胞核上分别显示两个信号，说明探针标记满意，再观察标记的细胞。反之，则需重新实验。
2）在观察的探针杂交细胞中，至少出现一个清晰的信号视为该探针杂交满意，否则为不满意。不满意则需重新实验。
B.计数标准
1）计数DAPI染色下核轮廓清晰的细胞，核重叠、被杂质覆盖和核破碎的细胞不纳入分析。
2）小而弱的信号不计数。杂交信号明显靠近者（互相有交叉或两者间距小于单个荧光点大小的一半）计为一个信号；如果发现在一个细胞核中这两种探针同时出现5个信号不记为阳性结果，因为正常细胞的G2-M期可能出现这样的改变。
C.阳性判断标准
若Bcl-2/IgH探针（Bcl-2红色标记，IgH绿色标记）在同一类细胞（淋巴细胞系）中出现黄色融合点，则认为这个染色体发生了畸变，即这个细胞FISH结果阳性。对于原发部位石蜡组织切块的FISH结果阳性（即Bcl-2/IgH基因重排）判断标准：阳性细胞占细胞总数的百分比≥10%（Dunphy CH,O'Malley DP，Cheng L,Fodrie TY，PerkinsSL,Kaiser-Rogers K.Primary mediastinal B-cell lymphoma:detection of BCL2 generearrangements by PCR analysis and FISH.J Hematop.2008;1:77-84.），淋巴瘤转移到骨髓和外周血的FISH结果阳性（即Bcl-2/IgH基因重排）诊断标准：每份病例计数50-100个间期核细胞，阳性细胞占淋巴系统细胞数的百分比≥5%（Treon SP，Hunter ZR,Aggarwal A,Ewen EP，Masota S,Lee C,Santos DD,Hatjiharissi E,Xu L,Leleu X,Tournilhac O,Patterson CJ,Manning R,Branagan AR,Morton CC.Characterization offamilial Waldenstrom's macroglobulinemia.Ann Oncol.2006;17:488-494.或Rizzo KA,Streubel B,Pittaluga S,Chott A,Xi L,Raffeld M,Jaffe ES.Marginal zone lymphomas inchildren and the young adult population;characterization of genetic aberrations by FISHand RT-PCR.Mod Pathol.2010;23:866-873.）。
2、IHC检测石蜡组织切片Bcl-2蛋白的表达
（1）将106例按修订的欧美淋巴瘤分类标准(REAL)和WHO2001淋巴瘤分类标准确认为DLBCL的石蜡组织切（厚度为2μm）于65℃温箱中烘烤30min。
（2）二甲苯脱蜡：10min×3次。
（3）梯度乙醇水化：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（4）1×PBS洗片：5min×2次。
（5）提前1分钟配置3%(v/v)H2O2（36ml H2O+4ml30%(v/v)H2O2）
（6）抗原修复：枸橼酸钠微波修复20min（先用微波高火加热枸橼酸钠3.5min，时间结束把组织切片放入枸橼酸钠，用低火—中低火档加热20min），室温自然冷却。
（7）1×PBS洗片：3min×3次。
（8）抗体孵育：用一抗稀释液将Bcl-2抗体按照1:100的比例进行稀释，4℃过夜。
（9）1×PBS洗片，3min×3次。
（10）加入Polymer Helper（试剂1），37℃孵育20min。
（11）弃液体，1×PBS洗片，3min×3次。
（12）加入polyperoxidase-anti-mouse/rabbiy IgG（试剂2），37℃孵育30min。
（13）弃液体，1×PBS洗片，3min×3次。
（14）DAB染色：1ml substrate buffered中加1滴DAB chromogen（中杉金桥），蒸馏水洗片。
（15）苏木素（中杉金桥）复染，自来水冲洗，氨水返蓝
（16）梯度乙醇脱水：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（17）二甲苯透明（5min×2）、封片、镜检。
（18）IHC结果判断：淋巴瘤细胞浆显示弥漫的棕黄色即为Bcl-2在细胞中阳性表达。每次试验均并行做阳性反应片，阴性对照用抗体稀释液代替Bcl-2抗体。阳性染色为棕黄色颗粒，综合染色强度和阳性细胞占细胞总数比例进行半定量处理。染色强度按后列标准评分：阴性为0分；染色弱，但明显强于阴性对照者为1分；染色清晰者为2分；染色强者为3分。阳性细胞占细胞总数比例评定标准：阳性细胞数＜10％者为0分；10％～30％者为1分；31％～50％者为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。两种评分相加，0～1分为（-），2分为（+）；3～4分为（++）；5～6分为（+++）。以Bcl-2综合评分2分做为异常增殖的界值，即综合评分≥2分为IHC检测Bcl-2蛋白阳性表达。
（二）实验结果
106例DLBCL原发部位石蜡组织切片（2μm为宜，图5）中有41例经FISH检测发生Bcl-2/IgH基因重排（38.7%，41/106）（图2中e）。出现基因重排的41例中的32例经IHC分析Bcl-2蛋白呈阳性表达（78%，32/41）（图2中c）。基于FISH方法研究的Bcl-2/IgH基因重排和Bcl-2蛋白的表达明显相关。健康人的淋巴结石蜡组织切片未检测到Bcl-2/IgH基因重排（0/35），淋巴结良性病变的石蜡组织切片也未见Bcl-2/IgH基因重排（0/22）。
二、骨髓Bcl-2/IgH基因重排及Bcl-2蛋白表达检测
（一）实验方法
1、FISH检测新鲜骨髓Bcl-2/IgH基因重排
（1）将106例按修订的欧美淋巴瘤分类标准(REAL)和WHO2001淋巴瘤分类标准确认为DLBCL的新鲜骨髓液弃去上清，加入低渗液0.075M KCl水溶液10ml，轻轻吹打均匀，37℃水浴40分钟。
（2）加入1ml固定液（甲醇:冰醋酸=体积比3:1），混匀。
（3）1000转/分离心10分钟。
（4）去上清，向离心管中加固定液（甲醇:冰醋酸=体积比3:1）10ml，轻轻吹打均匀。室温静置10min
（5）重复步骤（3）、（4）两次。
（6）1000转/分离心10分钟，移去上清，取其中一管加入适量固定液（甲醇:冰醋酸=体积比1:1）。
（7）将细胞沉淀吹打均匀，将10μl悬浮液滴到4℃预冷的载玻片上。取0.1μl健康人外周血淋巴细胞中期染色体标本，点在每张涂片空白区上作为正常对照，另取0.1μl DoHH2细胞悬液滴在每张涂片空白区上作为阳性对照。
（8）RNA酶预处理：每片加RNase 100μl（0.1mg/ml，2×SSC稀释）并覆盖PE膜（防止液体蒸发），将玻片置于湿盒内，37℃孵育40min。
（9）从湿盒里取出玻片，揭去盖膜，在2×SSC室温下洗涤2次，每次3min。
（10）梯度酒精脱水：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（11）空气中干燥。
（12）胃蛋白酶预处理：每片滴加1×胃蛋白酶（Pepsin）80μl，将载玻片置于湿盒内，37℃孵育20min。
（13）在PBS中室温洗涤5min。
（14）固定：将滴片在1%多聚甲醛中室温浸泡10min。
（15）在PBS中室温洗涤5min。
（16）梯度酒精脱水：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（17）空气中自然干燥。
（18）玻片变性：将玻片置于70%甲酰胺溶液，73℃变性5min。
（19）在预先冷却的2×SSC（4℃）中洗涤2次，每次3min。
（20）梯度酒精脱水：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（21）空气中自然干燥。
（22）做第（18）步同时，将
ddH2O 2μl
杂交缓冲液 7μl
Bcl-2/IgH探针 1μl
混匀后73℃水浴5min，45℃水浴20min。
（23）杂交：将变性好的探针加到已变性好的玻片上（tip头不要触及玻片），盖上大小适中的盖玻片。
（24）用橡胶封住盖玻片边缘，用吹风机吹干，放于湿盒内置37℃温箱杂交16h。
（25）用镊子除去盖玻片上的封胶，置于73℃预热的40ml2×SSC/0.3％NP-40染色缸中洗涤2分钟。
（26）室温2×SSC/0.1％NP-40染色缸中洗涤1分钟，摇洗3秒钟。
（27）-（29）：同步骤一1中的步骤（22）-（24）。
2、FISH检测骨髓涂片Bcl-2/IgH基因重排
（1）将106例按修订的欧美淋巴瘤分类标准(REAL)和WHO2001淋巴瘤分类标准确认为DLBCL的骨髓穿刺后涂于FISH防脱片，经瑞氏-吉姆萨染色后，计数500个有核细胞，对出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞≥5%判为淋巴瘤骨髓浸润标准（KlasaRJ,Gillum AM,Klem RE,Frankel SR.Oblimersen Bcl-2 antisense:facilitating apoptosis inanticancer treatment.Antisense Nucleic Acid Drug Dev2002;12:193–213.）。
（2）骨髓涂片经瑞氏-吉姆萨染色后，光镜阅读全片观察形态学可疑的单个细胞，经乙醇脱色，用钻石笔在玻片反面将需要观察的细胞做标记。每例靶细胞的选择都经过两位骨髓形态学医师复核。
（3）将涂片上标记的细胞全部拍照留档，荧光显微镜下定位，记录坐标。
（4）4%(v/v)多聚甲醛固定脱色后的骨髓涂片。
（5）将玻片浸入95%(v/v)乙醇，依次浸入85%(v/v)、70%(v/v)乙醇各3分钟，蒸馏水漂洗5分钟
（6）浸入0.5%(v/v)HCl的乙醇溶液1-2小时脱色后，清水漂洗5分钟，晾干后，浸入固定液（甲醇:冰醋酸=体积比3:1）中固定30分钟后取出晾干。
（7）取0.1μl正常人外周血淋巴细胞中期染色体标本，点在每张涂片空白区上作为正常对照，另取0.1μl DoHH2细胞悬液滴在每张涂片空白区上作为阳性对照。
（8）室温放置24小时或65℃烤片2小时，4℃冰箱保存备用。
（9）用钻石笔标记血点及靶细胞的范围。每张玻片加100μl稀释的RNA酶（1μl10mg/ml RNA酶贮存液加入99μl2×SSC），盖膜后置于湿盒内，37℃孵育40分钟。
（10）后续步骤同步骤一1中的步骤（4）-（24）。
3、ICC检测骨髓涂片Bcl-2蛋白的表达
（1）将106例按修订的欧美淋巴瘤分类标准(REAL)和WHO2001淋巴瘤分类标准确认为DLBCL的骨髓涂片用4%(v/v)多聚甲醛固定后经瑞氏-吉姆萨染色，光镜下选择需要检测的细胞，将所选细胞拍照，普通光学显微镜下定位，记录坐标。
（2）95%(v/v)乙醇30min-60min。
（3）梯度乙醇水化：：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（4）1×PBS洗片：5min×2次。
（5）提前1分钟配置3%(v/v)H2O2（36ml H2O+4ml30%(v/v)H2O2）
（6）抗原修复：枸橼酸钠微波修复20min（先用微波高火加热枸橼酸钠3.5min，时间结束把组织切片放入枸橼酸钠，用低火—中低火档加热20min），室温自然冷却。
（7）1×PBS洗片：3min×3次。
（8）用石蜡笔画好组织范围，按照体积比1：100的比例稀释并加入Bcl2抗体（Dako公司），每张玻片在画好组织范围外画出一区域，不加Bcl2抗体，用抗体稀释液代替作为阴性对照，4℃孵育过夜。
（9）1×PBS洗片，3min×3次。
（10）加入Polymer Helper（试剂1），37℃孵育20min。
（11）弃液体，1×PBS洗片，3min×3次。
（12）加入polyperoxidase-anti-mouse/rabbiy IgG（试剂2），37℃孵育30min。
（13）弃液体，1×PBS洗片，3min×3次。
（14）DAB染色：1ml substrate buffered中加1滴DAB chromogen（中杉金桥），蒸馏水洗片。
（15）苏木素（中杉金桥）复染，自来水冲洗，氨水返蓝
（16）梯度乙醇脱水：（体积百分含量依次为75%、85%、100%乙醇），3分钟×3次。
（17）二甲苯透明（5min×2）、封片、镜检。
（18）ICC结果判断：疑似淋巴瘤或幼稚淋巴细胞的细胞浆显示弥漫的棕黄色即为Bcl-2蛋白在细胞中阳性表达。根据文献报道结合本研究的细胞量，出现阳性肿瘤细胞或阳性幼稚淋巴细胞占有核细胞总数≥5%作为异常增殖的界值（Naushad H,ChoiWW，Page CJ,Sanger WG，Weisenburger DD,Aoun P.Mantle cell lymphoma with flowcytometric evidence of clonal plasmacytic differentiation:a case report.Cytometry B ClinCytom.2009;76:218-224.），即出现Bcl-2蛋白阳性表达的细胞占有核细胞总数≥5%为ICC检测Bcl-2蛋白阳性表达。这些细胞大多具有不规则细胞核、核仁明显、细胞浆嗜碱、空泡易见等特征。
在实验过程中，本发明的发明人还对初诊16例细胞形态学检查（骨髓涂片染色）显示骨髓未受浸润（未见淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占细胞总数<5%），但原发部位组织发生Bcl-2/IgH基因重排的DLBCL患者（表4）进行了追踪观察，每3-6个月一次，持续2-5年，每次对骨髓涂片一方面进行瑞氏-吉姆萨染色（细胞形态学检测），另一方面进行FISH检测Bcl-2/IgH基因重排情况，根据两种方法各自结果判断标准进行骨髓浸润与否的诊断。
（二）实验结果
1、Bcl-2/IgH基因重排与Bcl-2蛋白表达之间的相关性
初诊时，经步骤一石蜡组织切片检测出现Bcl-2/IgH基因重排的41例DLBCL患者中的35例（新鲜骨髓FISH检测结果）骨髓中检出相同的基因改变（85.4%，35/41）（图2中f，表2）。35例骨髓Bcl-2/IgH基因重排的患者中有26例由ICC方法得出Bcl-2蛋白表达阳性（74.3%，26/35）（图2中d）。然而，健康人外周血未检测到Bcl-2/IgH基因重排（0/31）（图3中B）。III/IV期的DLBCL分别与I+II期的重排率有显著差异，与年龄、性别、原发部位无明显差异。患者Bcl-2/IgH基因水平的表达与Bcl-2蛋白呈明显相关（表2；DLBCL：P=0.031）。
除染色体易位外，实验中还检测出原发部位（如淋巴结）和骨髓均出现Bcl-2/IgH融合信号不同程度的扩增（图4），在恶性肿瘤中的发生率（8.5%，9/106）高于良性病变（4.5%，1/22）。骨髓标本常规瑞氏-吉姆萨染色形态学检查的可疑细胞，标记后可原位做FISH（DLBCL见图3中C和D）。形态学结合FISH法比单一形态学染色法提高了阳性DLBCL：33.0%vs10.3%）（表3）。
2、Bcl-2/IgH基因重排与骨髓浸润之间的相关性
初诊时，106例DLBCL患者中经骨髓涂片FISH检测未发生Bcl-2/IgH基因重排的71例患者，经骨髓涂片细胞形态学检测均没有发生骨髓浸润；经骨髓涂片FISH检测发生Bcl-2/IgH基因重排的35例患者，经骨髓涂片细胞形态学检测确诊其中的11例发生了骨髓浸润，另外的24例暂时没有发生细胞形态学上的骨髓浸润（表2）。
3、可疑骨髓微小浸润的Bcl-2/IgH基因重排检测及其随访样本的细胞学观察
在106例DLBCL中，有28例骨髓细胞学存在1-5%幼稚淋巴细胞。采用对同一张骨髓涂片瑞氏-吉姆萨染色后脱色再行FISH，观察细胞学所见的单个可疑细胞。淋巴结组织FISH结果显示有24例存在Bcl-2/IgH重排，对其中的16例患者进行为期2-5年的随访，定期获取这些患者治疗后的骨髓标本，同时进行细胞形态学检测和FISH检测。其中，有5例骨髓涂片FISH检测阳性比细胞形态学检测阳性提前6个月，2例提前12个月，1例提前9个月，1例提前3个月（表4）。有4例12个月内未检测到重排，36个月后形态学仍没有检测到骨髓浸润。3例12个月内仅检测到重排，其中1例21个月后形态学检测到骨髓浸润。以上结果说明，原发部位组织发生Bcl-2/IgH基因重排，但经骨髓涂片细胞形态学检测确诊为没有骨髓浸润的患者，一旦检测到骨髓中有Bcl-2/IgH基因重排现象，该患者就可能成为潜在的骨髓浸润患者。
随访不同病期的骨髓形态学和FISH结果对比，以第4例患者的检查结果为例说明，详见（图6）。随访结果表明骨髓涂片FISH检测Bcl-2/IgH发生基因重排且骨髓涂片细胞形态学存在1-5%幼稚淋巴细胞的病例83.3%（10/12）比单一形态学染色不同程度提早诊断骨髓浸润。在DLBCL骨髓微小浸润方面Bcl-2/IgH基因重排比临床复发（细胞形态学检测）提早预警至少3个月以上。本专利受国家自然科学基金项目资助（81000977）项目负责人为车轶群。
表2 DLBCL骨髓Bcl-2蛋白与Bcl-2/IgH基因重组的比较
注：n.s，两者之间差别无统计学意义(P>0.05)；*，III/IV期与I+II期之间差别有统计学意义；相关性P值#，免疫细胞化学染色的Bcl-2蛋白表达与荧光原位杂交标记的Bcl-2/IgH基因重排之间的相关性；骨髓浸润，细胞形态学检查出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占有核细胞总数百分比≥5%。
表3CM-FISH（Bcl-2/IgH）与CM两种方法分析骨髓浸润结果比较
注：CM+，骨髓细胞形态学检查出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占有核细胞总数百分比≥5%。CM-FISH+，细胞形态学染色后原位杂交Bc1-2/IgH基因重排。
表4随访初诊骨髓未受侵的DLBCL患者骨髓微小转移的相关特征
注：M，男。F，女。CM，细胞形态学。FISH，荧光原位杂交。*LDH，血清乳酸脱氢酶，血清乳酸脱氢酶正常范围110-210U/L。LN，淋巴结。R-CHOP，利妥昔+环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+强的松。R-ACVBP，利妥昔+多柔比星+环磷酰胺+长春地辛+博来霉素+泼尼松。CR，完全缓解。PD，病程进展。SD，疾病稳定。除第5例用Bcl2抗体克隆C-2（氨基酸靶位1-205）表达阳性外，其余病例均使用Bcl2抗体克隆124（氨基酸靶位41-54）阳性表达。
Claims (1)
1.用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针在制备筛查弥漫大B细胞淋巴瘤患者疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润的荧光原位杂交技术产品中的应用，所述弥漫大B细胞淋巴瘤患者是骨髓形态学检查幼稚淋巴细胞在1-5％之间的患者。
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| 《Detection of bone marrow infiltration of lymphoma cells by fluorescence in situ hybridization》;Kenichi Ishizawa等;《Clinica Chimica Acta》;20041231;第344卷;第79－82页 * |
| Richard R.Einerson等.《FISH Is Superior to PCR in Detecting t(14 18)(q32;q21)–IgH/bcl-2 in Follicular Lymphoma Using Paraffin-Embedded Tissue Samples》.《Am J Clin Pathol》.2005,第124卷第421-429页. * |
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