CN111004838A - 骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤分子诊断领域，具体涉及一种骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用，具体包括：将骨髓液制备成骨髓涂片进行瑞氏染色，选择骨髓瘤细胞多且分散良好区域作为FISH杂交区域；采用新鲜固定液覆盖FISH杂交区域使之褪色并固定细胞，将骨髓涂片置于56℃的2×SSC溶液中洗涤10min，快速放入去离子水中浸洗一遍，随后放入到梯度乙醇脱水、风干；在FISH杂交区域上加入FISH探针进行杂交，用DAPI复染剂染色、镜检荧光杂交信号。本发明所述骨髓涂片FISH检测方法特别适用于在流式免疫分型中单克隆异常浆细胞比例低于20％、在骨髓涂片瑞氏染色形态学中骨髓瘤细胞占比高于20％的情况。

Description

骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子诊断领域，具体涉及一种骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(MM,multiple myeloma)是一种浆细胞恶性增殖性疾病，生物学异质性强，临床疗效个体差异大，生存期从数月至数十年不等。细胞及分子遗传学特性是MM重要的预后指标，以遗传学特性为基础的预后分层体系及个体化治疗已成为MM临床研究的发展趋势。

荧光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridization)技术是利用DNA变性后双链解开变成单链,在适宜的温度和离子强度下退火后可和互补DNA链形成稳定的异源双链的原理。采用荧光素标记的已知核酸序列作为探针，与靶DNA进行杂交，在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进行定性，定位和定量分析。

FISH在恶性血液病的诊治中的应用主要包括诊断和鉴别诊断，治疗和预后分层，异基因造血干细胞移植后判断骨髓细胞来源及监测疗效。FISH相比传统的染色体核型分析方法可直接利用间期细胞，不需要培养获得，分裂中期进行分析，标本易于获得，甚至在骨髓干抽的情况下能直接利用骨髓涂片检测，仅需一个工作日、甚至最快四个小时就可以报告结果，而染色体核型分析报告结果至少需要两周的时间；染色体显带技术分辨率低，FISH是在特定基因位点结合上荧光，成为在荧光显微镜下肉眼可观察到的颜色信号，极大地提高了灵敏度，如人体内重要的抑癌基因p53位点的缺失用FISH检测在各个恶性肿瘤中非常普遍。

最新版NCCN指南将FISH检测del(13q14)/RB1、del(17p13)/p53、t(4；14)/IGH-FGFR3、t(11；14)/IGH-CCND1、t(14；16)/IGH-MAF、t(14；20)/IGH-MAFB、amp(1q21)扩增和1p缺失作为初诊MM的检测指标。2019年多发性骨髓瘤遗传学检测中国专家共识建议：(1)检测靶点至少包括del(17p13)、amp(1q21)、t(4；14)、t(14；16)4个与MM风险分层密切相关的靶点，有条件的单位可增加del(13q14)和t(11；14)；(2)探针选择建议采用特异性识别检测lq21扩增、IGH-CCNDl检测t(11；14)、IGH-FGFR3检测t(4；14)、IGH-MAF检测t(14；16)、p53检测del(17p13)和D13S319或RBl基因缺失检测探针检测del(13q14)。

通常我们会采用肝素抗凝骨髓标本收获有核细胞进行FISH探针的检测，由于多发性骨髓瘤细胞在骨髓中呈灶性分布，抽吸骨髓超过0.2毫升时易被外周血稀释，目前骨髓瘤细胞富集检测方法多数是CDl38免疫磁珠分选结合FISH和胞质κ/λ轻链免疫荧光结合FISH(cIg-FISH)识别浆细胞，然后进行FISH检测，假阴性率低，适用于浆细胞比例低，MRD监测，但这两种方法手工操作步骤繁杂耗时、成本增加。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用，具体包括如下步骤：

(1)将骨髓液滴加到载玻片上制备成骨髓涂片，滴加瑞氏染色液进行瑞氏染色，利用明场显微镜镜检骨髓涂片，在高倍镜下选择恶性细胞多且分散良好区域做上标记，作为FISH杂交区域；

(2)采用新鲜配制的固定液覆盖FISH杂交区域使之褪色并固定细胞；将骨髓涂片置于56℃的2×SSC溶液中洗涤10分钟，快速放入去离子水中浸洗一遍，随后放入到梯度乙醇脱水、风干；

(3)依据骨髓涂片上FISH杂交区域的面积大小，在FISH杂交区域上加入相应探针量的FISH探针进行FISH杂交，随后将骨髓涂片浸入2×SSC溶液中洗涤出去未杂交的探针，再置于72℃0.4×SSC溶液中洗涤，接着在含有2×SSC+0.5％的吐温20溶液中漂洗后，在避光处竖立涂片晾干，然后用DAPI复染剂对杂交区域进行染色，采用荧光显微镜油镜观察骨髓涂片中间期细胞的荧光杂交信号。

上述方案中，所述骨髓涂片的制备过程为：采用首次抽吸的0.2ml骨髓液，滴加到载玻片上，迅速用推片蘸取骨髓制作厚薄均匀、头体尾分明的骨髓涂片。

上述方案中，所述瑞氏染色的过程为：滴加瑞氏染色液覆盖骨髓，10s～20s后滴加同体积缓冲液，吸耳球混匀染液，静置15min～20min，流水冲洗干净，自然晾干。

上述方案中，若所述骨髓涂片中骨髓有核细胞增生低下或瘤细胞比例低于20％，则采用荧光显微镜油镜及载物台坐标定位瘤细胞并标记FISH杂交区域。

上述方案中，所述FISH杂交的过程为：将载玻片放入杂交仪或加热板上，在75℃下变性2分钟，然后在FISH杂交仪或37℃下杂交2～16h。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过临床上抽取骨髓瘤患者骨髓标本，分别进行骨髓涂片瑞氏染色形态学观察以及骨髓涂片FISH检测，在流式细胞学检测出异常单克隆浆细胞比例较低的情况下，骨髓涂片FISH技术能检测出较高比例异常信号细胞，与骨髓涂片瑞氏染色形态学检测比例接近，为病人诊断提供了可靠的遗传学依据。

(2)本发明所述多发性骨髓瘤骨髓涂片FISH较传统FISH操作更简单，标本更易获取，不增加FISH检测的额外操作及成本，且在流式免疫分型中单克隆异常浆细胞比例低于20％、在骨髓涂片瑞氏染色形态学中骨髓瘤细胞占比高于20％的患者中占明显优势。

附图说明

图1为实施例1中多发性骨髓瘤患者髂骨骨髓涂片瑞氏染色后的骨髓瘤细胞。

图2为实施例1中坐标定位标记骨髓涂片的骨髓瘤细胞。

图3为实施例1中骨髓涂片CKS1B(1q21)/CDKN2C(1p32)双色探针FISH检测结果。

图4为实施例2中多发性骨髓瘤患者髂骨骨髓涂片瑞氏染色后的骨髓瘤细胞。

图5为实施例2中坐标定位标记骨髓涂片的骨髓瘤细胞。

图6为实施例2中骨髓涂片p53双色探针FISH检测结果。

图7为实施例2中染色体核型分析结果。

图8为实施例3中多发性骨髓瘤患者髂骨骨髓涂片瑞氏染色后的骨髓瘤细胞。

图9为实施例3中坐标定位标记骨髓涂片的骨髓瘤细胞。

图10为实施例3中骨髓涂片RB1(13q14)/DLEU(13q14.2)/LAMP(13q34)三色探针FISH检测结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一例多发性骨髓瘤患者中其髂骨骨髓涂片细胞形态骨髓瘤细胞易见占57％，胞体大小不一，胞浆增多，核增大，胞浆淡蓝色，胞核圆形、椭圆形、可见巨大、双/多核瘤细胞(如图1所示)。同时抽吸的第一管肝素抗凝骨髓检测流式免疫分型仅见一群占骨髓有核细胞3.7％的单克隆异常浆细胞，随后抽吸的肝素抗凝骨髓中骨髓瘤细胞比例更低，做CD138磁珠分选需要20mL以上骨髓来获得足够量的骨髓瘤细胞做FISH检测。本实施例选用仅0.2mL不到的骨髓涂片进行荧光原位杂交技术检测，具体操作如下：

1.骨髓涂片的准备

1.1玻片制备：将首次抽吸的0.2mL骨髓液迅速置于洁净免洗载玻片，迅速用推片蘸取骨髓制作厚薄均匀、头体尾分明的骨髓涂片，自然晾干。

1.2瑞氏染色：滴加瑞氏染色液覆盖血膜，约10秒后滴加同体积缓冲液，吸耳球混匀染液，静置15分钟，流水冲洗干净，自然晾干。

1.3杂交区域选择：明场显微镜镜检待测骨髓瘤浆细胞，高倍镜下选择骨髓瘤细胞多且分散良好区域做标记，作为杂交区域；细胞无法辨识时换用油镜确认。

1.4杂交区域定位选择(非必需)：在骨髓有核细胞增生低下或瘤细胞较少的涂片中，如骨髓涂片中骨髓瘤细胞比例低于20％可以采用荧光显微镜油镜及载物台坐标定位瘤细胞，作为杂交区域，并用显微镜明场采集细胞图片保存，待FISH探针杂交后比较，经我们实践，在多发性骨髓瘤患者中，骨髓涂片瘤细胞仅占总有核细胞3％的情况下，8mm×8mm的细胞分散良好的杂交区域可以定位不少于50个的骨髓瘤细胞供检测。

1.5杂交区域处理：有镜油时使用透明剂浸泡去掉油渍，晾干后采用新鲜配制固定液覆盖杂交区域5至10min褪色并固定细胞，流水冲洗晾干备用。

2.骨髓涂片FISH制作

2.1准备一个装有2×SSC的Coplin瓶，放入水浴锅中预热至56℃；准备三个分别装有70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇的Coplin瓶。

2.2在56℃的2x SSC的中洗涤准备好的骨髓涂片10分钟后，快速放入去离子水中浸洗一遍。

2.3将骨髓涂片放入梯度乙醇脱水(70％乙醇、85％乙醇至100％乙醇每次1分钟)，风干。

3.骨髓涂片FISH杂交和洗涤

3.1将标记面积大小的探针量应用于杂交区域，并用相应直径正方形盖玻片覆盖(面积为8×8mm，探针量为2μL，依此类推)。用细尖镊子均匀施加压力，去除盖玻片下面的气泡。

3.2用橡胶水泥密封盖玻片。

3.3当橡胶水泥完全凝固后，将载玻片放入杂交仪或加热板上，并在75℃下变性2分钟，然后在FISH杂交仪或37℃下杂交2～16小时。

3.4在72℃水浴锅中预热装有50ml 0.4×SSC的Coplin瓶。准备一个装有50ml的Coplin瓶和50ml 2×SSC的Coplin瓶置于室温环境中。

3.5使用细尖镊子取下橡胶水泥，将骨髓涂片浸入室温的2×SSC后拿出轻轻推去盖玻片。

3.6在72℃的0.4×SSC中洗涤载玻片4分钟，然后在含有2×SSC+0.5％的吐温20的Coplin罐中在室温下漂洗3分钟，在避光处竖立涂片晾干。

3.7彻底晾干后加入足量DAPI复染剂于杂交区域，并用盖玻片覆盖，黑暗中静置5min。

4.FISH分析和图像采集

4.1在载玻片上的每个杂交区域涂抹一小滴显微镜油。

4.2用荧光显微镜油镜在相应滤色镜的激发下观察骨髓涂片中间期细胞的荧光杂交信号。

4.3每个标本由两人分别计数100个细胞，或由一人随机选取不同杂交区域分别计数共计200个细胞，计算异常信号百分率；并应用ISCN2016命名规范描述信号特征；杂交不均匀的区域不宜进行分析；细胞核轮廓不清或重叠的不宜进行分析；细胞核轮廓不规则或体积巨大的慎重分析。

4.4使用成像软件捕获代表性异常细胞的至少两个图像。

本实施例选用骨髓涂片检测CKS1B(1q21)/CDKN2C(1p32)双色探针(绿色标记1号染色体短臂CDKN2C；红色标记1号染色体长臂CKS1B基因位点)，结果如图2(坐标定位标记骨髓涂片骨髓瘤细胞)和图3(骨髓涂片FISH)所示，可见坐标定位的骨髓瘤细胞CKS1B(1q21)扩增拷贝数为三个的阳性异常信号，最终计数阳性瘤细胞数与骨髓涂片形态学检测比例接近，说明了采用本实施例骨髓涂片荧光原位杂交技术可以简单、快捷、准确的检测骨髓瘤细胞，为病人诊断提供了可靠的遗传学依据。

实施例2

一例多发性骨髓瘤患者中其髂骨骨髓涂片细胞形态骨髓瘤细胞占10％，胞体大，胞浆增多，核增大，胞浆蓝色，胞核圆形、椭圆形(如图4所示)。同时抽吸的第一管肝素抗凝骨髓检测流式免疫分型仅见一群占骨髓有核细胞2.3％的单克隆异常浆细胞，随后抽吸的肝素抗凝骨髓中骨髓瘤细胞比例更低，做CD138磁珠分选抽吸20mL以上的骨髓尚不能获得足够量的骨髓瘤细胞做FISH检测。本实施例选用仅0.2mL不到的骨髓涂片进行荧光原位杂交技术检测，具体操作如下：

1.骨髓涂片的准备

1.1玻片制备：将首次抽吸的0.2mL骨髓液迅速置于洁净免洗载玻片，迅速用推片蘸取骨髓制作厚薄均匀、头体尾分明的骨髓涂片，自然晾干。

1.2瑞氏染色：滴加瑞氏染色液覆盖血膜，约10秒后滴加同体积缓冲液，吸耳球混匀染液，静置15分钟，流水冲洗干净，自然晾干。

1.3杂交区域选择：明场显微镜镜检待测骨髓瘤恶性浆细胞，高倍镜下选择骨髓瘤恶性细胞多且分散良好区域做标记，作为杂交区域；细胞无法辨识时换用油镜确认。

1.4杂交区域细胞定位选择：该例骨髓涂片中骨髓瘤细胞比例低于20％，采用荧光显微镜油镜及载物台坐标定位瘤细胞50个，作为杂交区域，并用显微镜明场采集细胞图片保存，待FISH探针杂交后比较。经我们实践，在多发性骨髓瘤患者中，骨髓涂片瘤细胞仅占总有核细胞3％的情况下，8mm×8mm的细胞分散良好的杂交区域可以定位不少于50个的骨髓瘤细胞供检测。

1.5杂交区域处理：有镜油时使用透明剂浸泡去掉油渍，晾干后采用新鲜配制固定液覆盖杂交区域5至10min褪色并固定细胞，流水冲洗晾干备用。

2.骨髓涂片FISH制作

2.1准备一个装有2×SSC的Coplin瓶，放入水浴锅中预热至56℃；准备三个分别装有70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇的Coplin瓶。

2.2在56℃的2×SSC的中洗涤准备好的骨髓涂片10分钟后，快速放入去离子水中浸洗一遍。

2.3将骨髓涂片放入梯度乙醇脱水(70％乙醇、85％乙醇至100％乙醇每次1分钟)，风干。

3.骨髓涂片FISH杂交和洗涤

3.1将标记面积大小的探针量应用于杂交区域，并用相应直径正方形盖玻片覆盖(面积为8×8mm，探针量为2μL，依此类推)。用细尖镊子均匀施加压力，去除盖玻片下面的气泡。

3.2用橡胶水泥密封盖玻片。

3.3当橡胶水泥完全凝固后，将载玻片放入杂交仪或加热板上，并在75℃下变性2分钟，然后在FISH杂交仪或37℃下杂交2～16小时。

3.4在72℃水浴锅中预热装有50ml 0.4×SSC的Coplin瓶。准备一个装有50ml的Coplin瓶和50ml 2×SSC的Coplin瓶置于室温环境中。

3.5使用细尖镊子取下橡胶水泥，将骨髓涂片浸入室温的2×SSC后拿出轻轻推去盖玻片。

3.6在72℃的0.4×SSC中洗涤载玻片4分钟，然后在含有2×SSC+0.5％的吐温20的Coplin罐中在室温下漂洗3分钟，在黑暗中避光处竖立涂片晾干。

3.7彻底晾干后加入足量DAPI复染剂于杂交区域，并用盖玻片覆盖，黑暗中静置5min。

4.FISH分析和图像采集

4.1在载玻片上的每个杂交区域涂抹一小滴显微镜油。

4.2用荧光显微镜油镜在相应滤色镜的激发下观察骨髓涂片中间期细胞的荧光杂交信号模式。

4.3每个标本由两人分别寻找前述定位选择的50个骨髓瘤细胞进行探针信号判读，计算异常信号百分率；并应用ISCN2016命名规范描述信号特征；杂交不均匀的区域不宜进行分析；细胞核轮廓不清或重叠的不宜进行分析；细胞核轮廓不规则或体积巨大的慎重分析。

4.4使用成像软件捕获代表性异常细胞的至少两个图像。

本实施例选用骨髓涂片检测检测p53双色探针(绿色标记17号染色体着丝粒；红色标记17号染色体短臂上p53基因位点)，结果如图5(坐标定位标记骨髓涂片双核骨髓瘤细胞)和图6(骨髓涂片FISH)所示，可见坐标定位的双核骨髓瘤细胞单个核中17号染色体着丝粒和p53(17p13)基因位点信号数均为四个的异常信号，提示骨髓瘤细胞单个核17号染色体为四条，同时计数异常瘤细胞在所有有核细胞中所占比例与骨髓涂片形态学检测的骨髓瘤细胞比例接近，说明了采用本实施例骨髓涂片荧光原位杂交技术可以简单、快捷、准确的检测骨髓瘤细胞，而FISH报告结果后约20天染色体核型分析得到该患者骨髓培养48小时可见17号染色体为四条(见图7)，进一步验证骨髓涂片FISH检测结果的准确性，为病人诊断提供了可靠的遗传学依据。

实施例3

一例多发性骨髓瘤患者中其髂骨骨髓涂片细胞形态骨髓瘤细胞仅占3％，胞体偏小，胞浆量多少不一，胞浆淡蓝色，胞核圆形、椭圆形(如图8所示)。同时抽吸的第一管肝素抗凝骨髓检测流式免疫分型仅见一群占骨髓有核细胞0.2％的单克隆异常浆细胞，随后抽吸的肝素抗凝骨髓中骨髓瘤细胞比例更低，即使做CD138磁珠分选也不能获得足够量的骨髓瘤细胞做FISH检测。本实施例选用骨髓涂片荧光原位杂交技术进行检测，具体操作如下：

1.骨髓涂片的准备

1.1玻片制备：将首次抽吸的0.2mL骨髓液迅速置于洁净免洗载玻片，迅速用推片蘸取骨髓制作厚薄均匀、头体尾分明的骨髓涂片，自然晾干。

1.2瑞氏染色：滴加瑞氏染色液覆盖血膜，约10秒后滴加同体积缓冲液，吸耳球混匀染液，静置15分钟，流水冲洗干净，自然晾干。

1.3杂交区域选择：明场显微镜镜检待测骨髓瘤恶性浆细胞，高倍镜下选择骨髓瘤恶性细胞多且分散良好区域做标记，作为杂交区域；细胞无法辨识时换用油镜确认。

1.4杂交区域细胞定位选择：该例骨髓涂片中骨髓瘤细胞比例远远低于20％，必须采用荧光显微镜油镜及载物台坐标定位瘤细胞50个，作为杂交区域，并用显微镜明场采集细胞图片保存，待FISH探针杂交后比较，经我们实践，在多发性骨髓瘤患者中，骨髓涂片瘤细胞仅占总有核细胞3％的情况下，8mm×8mm的细胞分散良好的杂交区域可以定位不少于50个的骨髓瘤细胞供检测。

1.5杂交区域处理：有镜油时使用透明剂浸泡去掉油渍，晾干后采用新鲜配制固定液覆盖杂交区域5至10min褪色并固定细胞，流水冲洗晾干备用。

2.骨髓涂片FISH制作

2.1准备一个装有2×SSC的Coplin瓶，放入水浴锅中预热至56℃；准备三个分别装有70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇的Coplin瓶。

2.2在56℃的2×SSC的中洗涤准备好的骨髓涂片10分钟后，快速放入去离子水中浸洗一遍。

2.3将骨髓涂片放入梯度乙醇脱水(70％乙醇、85％乙醇至100％乙醇每次1分钟)，风干。

3.骨髓涂片FISH杂交和洗涤

3.1将标记面积大小的探针量应用于杂交区域，并用相应直径正方形盖玻片覆盖(面积为8×8mm，探针量为2μL，依此类推)。用细尖镊子均匀施加压力，去除盖玻片下面的气泡。

3.2用橡胶水泥密封盖玻片。

3.3当橡胶水泥完全凝固后，将载玻片放入杂交仪或加热板上，并在75℃下变性2分钟，然后在FISH杂交仪或37℃下杂交2～16小时。

3.4在72℃水浴锅中预热装有50ml 0.4×SSC的Coplin瓶。准备一个装有50ml的Coplin瓶和50ml 2×SSC的Coplin瓶置于室温环境中。

3.5使用细尖镊子取下橡胶水泥，将骨髓涂片浸入室温的2×SSC后拿出轻轻推去盖玻片。

3.6在72℃的0.4×SSC中洗涤载玻片4分钟，然后在含有2×SSC+0.5％的吐温20的Coplin罐中在室温下漂洗3分钟，在黑暗中避光处竖立涂片晾干。

3.7彻底晾干后加入足量DAPI复染剂于杂交区域，并用盖玻片覆盖，黑暗中静置5min。

4.FISH分析和图像采集

4.1在载玻片上的每个杂交区域涂抹一小滴显微镜油。

4.2用荧光显微镜油镜在相应滤色镜的激发下观察骨髓涂片中间期细胞的荧光杂交信号模式。

4.3每个标本由两人分别寻找前述定位选择的50个骨髓瘤细胞进行探针信号判读，；并应用ISCN2016命名规范描述信号特征；杂交不均匀的区域不宜进行分析；细胞核轮廓不清或重叠的不宜进行分析；细胞核轮廓不规则或体积巨大的慎重分析。

4.4使用成像软件捕获代表性异常细胞的至少两个图像。

本实施例选用骨髓涂片检测RB1(13q14)/DLEU(13q14.2)/LAMP(13q34)三色探针(绿色标记13号染色体长臂1区4带RB1；红色标记13号染色体长臂1区4带2亚带DLEU；青色标记13号染色体长臂3区4带LAMP基因位点)，结果如图9(坐标定位标记骨髓涂片骨髓瘤细胞)和图10(骨髓涂片FISH)所示，可见坐标定位的骨髓瘤细胞CKS1B(1q21)扩增拷贝数为三个的阳性异常信号，最终计数阳性瘤细胞数与骨髓涂片形态学检测比例接近，说明了采用本实施例骨髓涂片荧光原位杂交技术可以简单、快捷、准确的检测骨髓瘤细胞，为病人诊断提供了可靠的遗传学依据。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.骨髓涂片荧光原位杂交在多发性骨髓瘤中的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）将骨髓液滴加到载玻片上制备成骨髓涂片，滴加瑞氏染色液进行瑞氏染色，利用明场显微镜镜检骨髓涂片，在高倍镜下选择恶性细胞多且分散良好区域做上标记，作为FISH杂交区域；

（2）采用新鲜配制的固定液覆盖FISH杂交区域使之褪色并固定细胞；将骨髓涂片置于56℃的2×SSC溶液中洗涤10min，快速放入去离子水中浸洗一遍，随后放入到梯度乙醇脱水、风干；

（3）依据骨髓涂片上FISH杂交区域的面积大小，在FISH杂交区域上加入相应探针量的FISH探针进行FISH杂交，随后将骨髓涂片浸入2×SSC溶液中洗涤出去未杂交的探针，再置于72℃ 0.4×SSC溶液中洗涤，接着在含有2×SSC+0.5%的吐温20溶液中漂洗后，在避光处中竖立晾干涂片，然后用DAPI复染剂对杂交区域进行染色；采用荧光显微镜油镜观察骨髓涂片中间期细胞的荧光杂交信号。

2.根据权利要求1所述的骨髓涂片荧光原位杂交在多发性骨髓瘤中的应用，其特征在于，所述骨髓涂片的制备过程为：采用首次抽吸的0.2ml骨髓液，滴加到载玻片上，迅速用推片蘸取骨髓制作厚薄均匀、头体尾分明的骨髓涂片。

3. 根据权利要求1所述的骨髓涂片荧光原位杂交在多发性骨髓瘤中的应用，其特征在于，所述瑞氏染色的过程为：滴加瑞氏染色液覆盖骨髓，10s~20s后滴加同体积缓冲液，吸耳球混匀染液，静置15min~20 min，流水冲洗干净，自然晾干。

4.根据权利要求1所述的骨髓涂片荧光原位杂交在多发性骨髓瘤中的应用，其特征在于，若所述骨髓涂片中骨髓有核细胞增生低下或瘤细胞比例低于20%，则采用荧光显微镜油镜及载物台坐标定位瘤细胞并标记FISH杂交区域。

5.根据权利要求1所述的骨髓涂片荧光原位杂交在多发性骨髓瘤中的应用，其特征在于，所述FISH杂交的过程为：将载玻片放入杂交仪或加热板上，在75℃下变性2分钟，然后在FISH杂交仪或37℃下杂交2~16h。

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