CN112575066A - 一种用于骨髓涂片fish检测的处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于骨髓涂片FISH检测的处理方法以及制备骨髓涂片的试剂盒。其中试剂盒中主要包括：20×SSC洗液、NP40、DAPI染色液；蛋白酶；FISH检测探针。骨髓涂片的处理方法，包括骨髓涂片、烤片、蛋白酶消化、杂交、洗脱，室温风干，染色等操作。采用本发明制备的骨髓涂片进行FISH检测，取消了常规方法中细胞培养，细胞收获和细胞滴片等操作，排除标本的交叉污染可能，提高检测报告时效，且检测准确、具有较高的灵敏度以及精密度，样本用量少，更有利于患者的及时诊治，满足了临床的需求。

Description

一种用于骨髓涂片FISH检测的处理方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于骨髓涂片FISH检测的处理方法。
背景技术
荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization)，简称FISH，是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。目前，常用FISH技术来检测血液肿瘤(AML、ALL、NHL、MDS、MM、NB)。常规血液肿瘤FISH检测方法，
1)标本量要求高：常规方法标本量需要1～2ml/探针。如用骨髓涂片方法进行FISH检测，标本量只需要20μl/探针，对于一些疾病原因导致抽取骨髓量少有利；对需要做很多检测项目，骨髓涂片进行FISH检测优势明显。
2)标本运输条件及时效要求高：常规方法运输条件温度为2～8℃，标本时效要求72小时内完成检测。如用骨髓涂片方法进行FISH检测，标本运输条件温度为常温，标本时效可以在一周内完成(168小时)且结果不受影响。若需要长时间延长保持，可以进行瑞氏染色进行保存2年以内有效。
3)标本制备环节多：常规方法标本处理流程多，如细胞收获，细胞滴片操作过程，大批量标本处理可能存在标本污染的风险。如用直接对骨髓涂片进行FISH检测，避免了标本处理过程中的交叉污染。
由于常规FISH方法，处理标本流程多(白细胞计数、接种、收获、滴片)，每个标本流程多，在标本制片的前期过程中可能存在样本交叉风险，如用直接对骨髓涂片进行FISH检测避免标本污染的可能性，省去常规FISH检测的标本处理流程，大大提高检测报告时效。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于骨髓涂片FISH检测的方法。
本申请采用直接对骨髓涂片进行FISH检测的方法，克服对标本量、标本运输、标本时效高的要求，同时取消常规方法中细胞培养，细胞收获和细胞滴片，避免标本的交叉污染，提高检测报告时效性，更有利于患者的及时诊治。对于某些疾病导致骨髓液取量少、干抽或需要做很多检测项目的患者来说，节省标本量，扩大检测项目。对于骨穿时未送检或未做相关疾病FISH检测，且骨髓液标本时效超过72小时，不能正常送检，影响诊断和治疗，这时可以采用穿刺骨髓涂片进行补送，避免重复采集骨髓液，减少对患者穿刺带来痛苦。
对部分治疗后的患者，治疗一段时间后，存在某些遗传学改变，出现复杂异常，需要确定是否为初发时存在的复杂异常，还是疾病进展中出现的附加异常，这对了解疾病的进展非常关键。骨髓涂片FISH检测对于初发未做遗传学检测的患者非常有利，可以用初发时染色形态学涂片进行检测，确定附加异常是否为初发还是治疗相关导致。由于常规FISH检测对标本时效高，不能对这类标本进行检测确定，骨髓涂片FISH检测对标本时效要求非常低，能再去确定这类异常是否为初发异常。
现在医学检验实验室不断发展，技术不断创新，智能化设备不断升级，目前FISH检测设备从以前手工，逐渐变为智能化，更加有利于临床应用，骨髓涂片FISH检测结合形态学，在通过特异性的探针，确定某些细胞是否为肿瘤细胞。
1)骨髓涂片进行形态学染色，染色完成后，用FISH全自动扫描仪进行骨髓涂片全片扫描。
2)骨髓涂片脱色，然后进行涂片FISH，然后对骨髓涂片FISH进行全自动扫描。
通过特殊分析软件，一一对应，可以对异常的形态细胞再结合FISH结果，可以确定是否为肿瘤细胞。
本发明提供了一种用于骨髓涂片FISH检测的处理方法，包括如下步骤：
1)取骨髓样本，于载玻片上进行骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机进行烤片；
3)将烤好的涂片在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化；
4)加入检测基因探针，在杂交仪中杂交；
5)洗脱：在72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗；
6)在室温下放置风干，加荧光染色液，即制备得到骨髓涂片。
优选的，所述步骤2)中烤片机的温度为55-68℃，优选为55℃，58℃，60℃，62℃，65℃，68℃。
优选的，所述步骤2)中烤片时间为3-5分钟。
优选的，所述步骤3)中胃蛋白酶浓度为0.4-0.8％，消化20-40分钟。
优选的，所述步骤4)中的检测基因为慢性髓细胞白血病(CML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、神经母细胞瘤(NB)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)基因。
优选的，所述步骤1)中的载玻片先泡酸后再酒精浸泡处理后晾干。
优选的，所述步骤6)中的荧光染色液为DAPI染液。
优选的，采用权利要求1-7任一所述的处理方法制备得到。
本发明进一步提供了一种制备骨髓涂片的试剂盒，所述试剂盒中主要包括：20×SSC洗液、NP40、荧光染色液；蛋白酶；FISH检测探针。
本发明进一步请求保护所述试剂盒在制备骨髓涂片中的应用。
采用本发明制备的骨髓涂片进行FISH检测，取消了常规方法中细胞培养，细胞收获和细胞滴片等操作，排除标本的交叉污染可能，提高检测报告时效，且检测准确、具有较高的灵敏度以及精密度，样本用量少，更有利于患者的及时诊治，满足了临床的需求。
附图说明
图1.慢性髓细胞白血病(CML)涂片法和常规方法的镜检结果。其中，图1A为涂片法的镜检结果，而图1B为常规方法的镜检结果。
图2.急性早幼粒细胞白血病(APL)涂片法和常规方法的镜检结果。其中，图2A为涂片法的镜检结果，而图2B为常规方法的镜检结果。
图3.神经母细胞瘤(NB)涂片法和常规方法的镜检结果。其中，图3A为涂片法的镜检结果，而图3B为常规方法的镜检结果。
图4.急性淋巴细胞白血病(ALL)涂片法和常规方法的镜检结果。其中，图4A为涂片法的镜检结果，而图4B为常规方法的镜检结果。
图5.慢性淋巴细胞白血病(CLL)涂片法和常规方法的镜检结果。其中，图5A为涂片法的镜检结果，而图5B为常规方法的镜检结果。
具体实施方式
本发明的骨髓涂片的处理方法，实施方式如下。
1)取骨髓样本，涂2张骨髓涂片；
2)将步骤1)制备的骨髓涂片放烤片机进行烤片；
3)将步骤2)烤好的烤片在2XSS泡洗C洗液中，用胃蛋白酶消化；
4)进一步加入检测基因探针，在杂交仪中杂交；
5)将步骤4)杂交后的烤片洗脱：在“72℃水浴箱、0.3NP40％洗脱液，轻轻泡洗1min30s”
6)洗脱完毕后，在室温下放置3～7min，加DAPI染色液，进行镜检；计数阳性细胞比例。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 慢性髓细胞白血病骨髓涂片的制备
1)取20微升骨髓样本，涂2张骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机65℃、3min进行烤片；
3)在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化，胃蛋白酶浓度0.5％，消化30分钟；
4)加入检测基因探针BCR/ABL，在杂交仪中杂交，所述探针的浓度为5μM；
5)洗脱：在“72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗1min30s”
6)在室温下放置4min，加DAPI染色液，进行镜检；计数阳性细胞比例。
实施例2 急性早幼粒细胞白血病骨髓涂片的制备
1)取18微升骨髓样本，涂2张骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机65℃、4min进行烤片；
3)在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化，胃蛋白酶浓度0.5％，消化30分钟；
4)加入检测基因探针PML/RARA，在杂交仪中杂交，所述探针的浓度为5μM；
5)洗脱：在“72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗1min40s”；
6)在室温下放置5min，加DAPI染色液，进行镜检；计数阳性细胞比例。
实施例3 神经母细胞瘤骨髓涂片的制备
1)取20微升骨髓样本，涂2张骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机65℃、3min进行烤片；
3)在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化，胃蛋白酶浓度0.6％，消化25分钟；
4)加入检测基因探针N-MYC，在杂交仪中杂交，所述探针的浓度为5μM；
5)洗脱：在“72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗1min30s”；
6)在室温下放置4min，加DAPI染色液，进行镜检；计数阳性细胞比例。
实施例4 急性淋巴细胞白血病骨髓涂片的制备
1)取18微升骨髓样本，涂2张骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机65℃、3min进行烤片；
3)在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化，胃蛋白酶浓度0.5％，消化30分钟；
4)加入检测基因探针C-MYC，在杂交仪中杂交，所述探针的浓度为5μM；
5)洗脱：在“72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗1min30s”；
6)在室温下放置6min，加DAPI染色液，进行镜检；计数阳性细胞比例。
实施例5 慢性淋巴细胞白血病骨髓涂片的制备
1)取20微升骨髓样本，涂2张骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机65℃、3min进行烤片；
3)在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化，胃蛋白酶浓度0.5％，消化30分钟；
4)加入检测基因探针ATM，在杂交仪中杂交，所述探针的浓度为5μM；
5)洗脱：在“72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗1min30s”；
6)在室温下放置5min，加DAPI染色液，进行镜检；计数阳性细胞比例。
实施例6 本发明的骨髓涂片方法与常规FISH方法检测准确性比较
比较两种方法学对于同一标本检测结果的一致性。两种方法采用同样的项目探针。
取10例临床样本标本，其分别包含神经母细胞瘤、慢性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病阳性。
其中本发明的骨髓涂片的制备方法参照实施例1-实施例5的操作方法，而常规FISH的检测方法参照况小红等方法(Fish与ISS分期对多发性骨髓瘤检测和评价的临床意义，《湖南师范大学学报(医学版)》第15卷第4期)。检测结果如下：
表1：FISH检测准确度验证结果
Figure BSA0000228483910000071
Figure BSA0000228483910000072
阳性符合率＝a/(a+c)×100％＝10/10×100％＝100.00％
阴性符合率＝d/(b+d)×100％＝2/2×100％＝100.00％
总符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100％＝10/10＝100.00％
实施例7 本发明的骨髓涂片方法与常规FISH方法检测时效性比较
比较两种方法学对于同一标本检测结果的一致性。两种方法采用同样的项目探针。
取5例临床样本标本，其分别包含神经母细胞瘤、慢性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病阳性。
其中本发明的骨髓涂片的制备方法参照实施例1-实施例5的操作方法，而常规FISH的检测方法参照况小红等方法(Fish与ISS分期对多发性骨髓瘤检测和评价的临床意义，《湖南师范大学学报(医学版)》第15卷第4期)。检测结果如下：
表2：FISH检测时效性验证结果
Figure BSA0000228483910000081
Figure BSA0000228483910000091
从表2的结果可以看出，在保证检测准确性的基础上，本发明的骨髓涂片方法对于样本的用量远低于常规FISH方法，用时为常规FISH方法的一半。
实施例8 本发明的骨髓涂片方法与常规FISH方法检测检测的涂片可视性
比较两种方法学对于同一标本检测的涂片的可视性。两种方法采用同样的项目探针。
取5例临床样本标本，其分别包含神经母细胞瘤、慢性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病阳性。
其中本发明的骨髓涂片的制备方法参照实施例1-实施例5的操作方法，而常规FISH的检测方法参照况小红等方法(Fish与ISS分期对多发性骨髓瘤检测和评价的临床意义，《湖南师范大学学报(医学版)》第15卷第4期)。检测结果参照图1-图5。
从图1-图5的检测结果可以看出，本发明的骨髓涂片的方法和常规FISH检测方法所拍摄的图片，均具有较好的可视性，很容易得出检测的结果。
实施例9 本发明的骨髓涂片方法的精密度验证
骨髓涂片的制备方法参照实施例1-实施例5的操作方法。
批内精密度：连续3天每天重复检测一个标本3次，结果如下表3所示：
表3：批内精密度测定结果
Figure BSA0000228483910000101
Figure BSA0000228483910000111
批间精密度：3个标本连续3天，每天检测1次，结果如下表4所示：
表4：批间精密度验证结果
Figure BSA0000228483910000112
每个标本的3次检测都是独立进行的，检测结果一致。批内精密度达到要求。3个标本均独立检测3天，检测结果一致，批间精密度达到要求。
检测人员间精密度验证：两个不同人员同时检测3个标本，标本操作或分析都至少有两个不同人员进行。3个标本的结果如表5所示：
表5：人员间精密度验证
Figure BSA0000228483910000121
每个标本的每个步骤都至少有两个不同人员进行，检测结果一致，检测人员间精密度验证达到要求。
实施例10 本发明的骨髓涂片方法的灵敏度验证
骨髓涂片的制备方法参照实施例1-5。三个探针浓度稀释到80％、50％，将稀释探针进行检测，检测结果阴阳性与100％浓度的检测结果没有显著性差异。结果如下表6所示：
表6：灵敏度验证结果
Figure BSA0000228483910000122
Figure BSA0000228483910000131
结果显示，探针浓度稀释到50％、80％时，仍然检测到阳性细胞。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于骨髓涂片FISH检测的处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取骨髓样本，于载玻片上进行骨髓涂片；
2)将骨髓涂片放烤片机进行烤片；
3)将烤好的涂片在2XSSC洗液中，用胃蛋白酶消化；
4)加入检测基因探针，在杂交仪中杂交；
5)洗脱：在72℃水浴箱、0.3％NP40洗脱液，轻轻泡洗；
6)在室温下放置风干，加荧光染色液，即制备得到骨髓涂片。
2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述步骤2)中烤片机的温度为55-68℃，优选为55℃，58℃，60℃，62℃，65℃，68℃。
3.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述步骤2)中烤片时间为3-5分钟。
4.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述步骤3)中胃蛋白酶浓度为0.4-0.8％，消化20-40分钟。
5.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述步骤4)中的检测基因为慢性髓细胞白血病(CML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、神经母细胞瘤(NB)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)基因。
6.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述步骤1)中的载玻片先泡酸后再酒精浸泡处理后晾干。
7.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于：所述步骤6)中的荧光染色液为DAPI染液。
8.一种骨髓涂片，其特征在于，采用权利要求1-7任一所述的处理方法制备得到。
9.一种制备骨髓涂片的试剂盒，其特征在于：试剂盒中主要包括：20×SSC洗液、NP40、荧光染色液；蛋白酶；FISH检测探针。
10.权利要求9所述的试剂盒在制备骨髓涂片中的应用。
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