CN116144780A - 一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法，属于白血病检测技术领域。为了提供一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法。本发明公开一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤1：选取确诊为慢性淋巴细胞白血病患者的血液样本/骨髓，提取外周血/骨髓液作为待测试的样本；步骤2：对步骤1获得的外周血样本进行染色体核型分析；步骤3：对步骤1获得的外周血样本进行原位杂交技术分析；步骤4：将步骤2和步骤3获得的数据进行统计学分析会的率间数据。对于CLL患者的分子遗传学异常，FISH与染色体核型分析各有自己的优缺点，它们相辅相成、不可或缺。
Description
技术领域
本发明属于比白血病检测技术领域，具体涉及一种链霉菌和链霉菌次级代谢产物Nanchangmycin及其制备方法应用。
背景技术
慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是一种具有很强异质性的血液疾病，大多具有遗传学异常而且出现的基因异常几乎涵盖了所有染色体。近年来，CLL的分子细胞遗传学异常被广泛研究，虽然由于病例选择、研究方法技术的不同，各家研究结果不尽一致，但这些研究无疑为我们进一步对CLL的治疗、认识CLL的生物学本质提供了基本素材。随着对CLL细胞遗传学研究的不断深入，越来越多的结果表明CLL的细胞遗传学的改变与患者的临床诊断、临床用药及预后判断密切相关。目前，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)是对某一特定异常染色体区域亚组的细化研究，它作为CLL临床检测细胞遗传学手段之一极大的提高了CLL遗传学检测的准确度和敏感性。而传统的染色体核型分析做为CLL细胞遗传学异常检测方法之一做到了全面全基因组分析，有其不可替代的作用。比较上述两种检测CLL细胞遗传学异常的方法，进一步分析它们各自在检测CLL细胞遗传学指标中的地位意义，为进一步CLL的临床治疗和科研研究做出贡献。
慢性淋巴细胞白血病是一种发生在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结的成熟B淋巴细胞恶性增生性的血液系统疾病。发病年龄多在50岁以上，30岁以下者很少见，临床表现具有明显的异质性且预后的个体差异很大。CLL属于惰性疾病，病程长短悬殊，短至1-2年，长至5-10年，甚至二十年，CLL的临床检查涉及血象、骨髓象、淋巴结活结，染色体检查、免疫学检查等，随着对CLL的发生，发展以及预后因素的不断深入研究，细胞遗传学的检测作为CLL的检测指标之一越来越在CLL的临床诊断和预后监测中扮演重要角色，如：对于预后较好的患者，积极的化疗并不能延长其生存时间，反而因过度的治疗给患者的身体造成一定的损害。而预后差的患者如未及时进行治疗干预，疾病会较快进展、恶化，甚至死亡(梁光林，吴炜，夏瑞祥.慢性淋巴细胞白血病的遗传学异常及其临床意义[J].安徽医学,2010,31(9):1130-1132)。所以对于CLL患者运用遗传学检测进行预后评估相当重要。CLL的遗传学异常种类多样复杂，以缺失13q、11q、17q，+12染色体三体遗传异常常见，也存在其它如-12、6q21缺失(Kiefer Y,Schulte C,Tiemann M,et al.Chronic lymphocytic leukemia-associated chromosomal abnormalities and miRNA deregulation.[J].Applicationof Clinical Genetics,2012,5(default):21-28)，而目前检测其分子细胞遗传学异常的方法有传统的染色体核型分析和荧光原位杂交技术，这两种方法它们各有自己的优缺点。由于CLL细胞有丝分裂活性低下，常规染色体核型分析技术仅有20％的CLL患者可检测到克隆性染色体异常，加入有丝分裂原刺激剂后，大大的提高了CLL患者细胞遗传学异常的检出率。荧光原位杂交(FISH)技术由于不受细胞分裂的影响，应用时既可检测分裂相，也可检测间期细胞，大大促进了CLL遗传学研究的开展(Glassman AB,Hayes K J.The value offluorescence in situ hybridization in the diagnosis and prognosis of chroniclymphocytic leukemia[J].Cancer Genetics&Cytogenetics,2005,158(1):88)，但是FISH不适合运用全基因组检测CLL细胞遗传学异常。本文应用FISH技术和染色体核型分析对CLL患者的细胞遗传学异常进行综合分析探讨，进一步了解CLL的遗传学特征，对比分析两种方法各自的优缺点，找出在临床应用中对CLL患者最佳的细胞遗传学检测方法，能更快速更准确的检测CLL细胞遗传学异常。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法。
本发明提供一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：选取确诊为慢性淋巴细胞白血病患者的血液样本/骨髓，提取外周血/骨髓液作为待测试的样本；
步骤2：对步骤1获得的外周血样本进行染色体核型分析；
步骤3：对步骤1获得的外周血样本进行原位杂交技术分析；
步骤4：将步骤2和步骤3获得的数据进行统计学分析会的率间数据。
进一步地限定，步骤1中所述的外周血的总数是大于10×109个/L。
进一步地限定，步骤2中染色体核型分析的具体步骤如下：
(1)取外周血或骨髓液接种于含有20％胎牛血清RPM1640培养基内，37℃培养72小时，收获前加秋水酰胺阻断剂，低渗法收集细胞；
(2)制备气干法滴片，G显带技术、Giemsa染色，全自动染色体扫描采集优质图像，处理分析并记录结果。
进一步地限定，步骤3中原位杂交技术分析的具体步骤如下：
(1)提取单个核细胞，低渗法收集细胞，制备气干法滴片；
(2)选择标记探针78℃变性5分钟，37℃杂交过夜；
(3)荧光显微镜观察；
(4)建立阈值。
进一步地限定，步骤(3)的具体方法是：Isis Version5.4 FISH分析计数500个细胞并记录杂交信号。
进一步地限定，采用VYSIS单色标记RB-1探针，RB-1基因标记为红色，正常信号特征为2R,阳性信号特征为1R；单色标记CEP12探针，CEP12基因标记为红色，正常信号特征为2R，阳性信号特征为3R；双色分离标记IGH探针，5’IGH基因标记为绿色，3’IGH基因标记为红色，IGH基因显示为黄色或红绿叠加信号，正常信号特征为2F，阳性信号特征为1F1R1G。
进一步地限定，，采用双色标记TP53探针，TP53基因标记为红色，CEP17基因标记为绿色，正常信号特征为2R2G，阳性信号特征为2G1R，-17为1R1G；双色标记ATM探针，ATM基因标记为红色，CEP11基因标记为绿色，正常信号特征为2R2G，阳性信号特征为2G1R，-11为1R1G。
进一步地限定，步骤(4)的具体方法如下：每种探针均选取10例正常骨髓捐献者标本检查，计数至少500个间期细胞，正常参考区间为小于95％累计beta分布区间点，每种探针的切割值：RB-1的切割值<6.17％，TP53的切割值为<3.98％,ATM的切割值为<2.08％，TP12的切割值为<1.94％，IGH的切割值为<4.18％。
进一步地限定，步骤3所述的统计学分析是采用四格表卡方检验。
进一步地限定，P<0.05为差异。
有益效果：选取69例初诊慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者探讨能够检测其分子遗传学异常的两种方法的特点。方法回顾性分析采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)(CEP12、RB1、TP53、ATM、IGH探针)及染色体核型分析检测过的69例初诊患者的病例资料。分析CLL患者中分子遗传学的改变。结果69例CLL初诊患者中，FISH检测发现遗传学异常的有34例(49.28％)，染色体核型分析得出有明确遗传学异常的有18例(26.09％)(其中包括FISH没有检测出的其他复杂核型)，两者间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论对于CLL患者的分子遗传学异常，FISH与染色体核型分析各有自己的优缺点，它们相辅相成、不可或缺。
具体实施方式
实施例1.
1.1入选病例
选取2015年12月份至2017年3月份在医院住院和门诊收治的69例初诊CLL患者病例，其中男性39例，女性30例，年龄范围在38-78岁之间，中位数年龄是59岁，所选病例均为按照多学科的综合诊断已确诊的CLL患者。
1.2方法
1.2.1主要试剂及仪器
RPM1640(Gibco公司)培养液、秋水酰胺溶液(上海生工)、RB1(13q14)、TP53(17q13)、ATM(11q22)、CEP12(12p11-q11)、IGH(14q32)探针(美国VYSIS)、Metafer4.0全自动染色体扫描工作站(德国MetaSystems公司)、Ikaros Version5.4(德国MetaSystems公司)、杂交仪(美国Abbott公司)、Isis Version5.4 FISH分析软件(德国MetaSystems公司)
1.2.2标本的制备
CLL的核型分析和FISH检查以骨髓、外周血(总数>10*10^9/L)为主，选取2015年12月份至2017年3月份在天津血液病医院血液病研究所住院和门诊收治的69例初诊确诊CLL患者标本。
1.2.3染色体核型分析主要步骤
(1)取外周血或骨髓液接种于含有20％胎牛血清RPM1640培养基内，37℃培养72小时，收获前加秋水酰胺阻断剂，低渗法收集细胞。
(2)气干法滴片，G显带技术、Giemsa染色，全自动染色体扫描采集优质图像，处理分析并记录结果(结果应用ISCN2016命名规范描述)
1.2.4FISH主要步骤
(1)提取单个核细胞，低渗法收集细胞，气干法滴片
(2)选择标记探针(按相关探针说明书)78℃变性5分钟，37℃杂交过夜
(3)荧光显微镜观察，Isis Version5.4 FISH分析计数500个细胞并记录杂交
信号(应用ISCN2016命名规范描述)。采用VYSIS单色标记RB-1探针，RB-1基因标记为红色，正常信号特征为2R,阳性信号特征为1R；双色标记TP53探针，TP53基因标记为红色，CEP17基因标记为绿色，正常信号特征为2R2G，阳性信号特征为2G1R，-17为1R1G；双色标记ATM探针，ATM基因标记为红色，CEP11基因标记为绿色，正常信号特征为2R2G，阳性信号特征为2G1R，-11为1R1G；单色标记CEP12探针，CEP12基因标记为红色，正常信号特征为2R，阳性信号特征为3R；双色分离标记IGH探针，5’IGH基因标记为绿色，3’IGH基因标记为红色，IGH基因显示为黄色或红绿叠加信号，正常信号特征为2F，阳性信号特征为1F1R1G(R为红色信号，G为绿色信号，F为融合信号)。
(4)阈值的建立：每种探针均选取10例正常骨髓捐献者标本检查，计数至少500个间期细胞，正常参考区间为小于95％累计beta分布区间点。每种探针的切割值：RB-1的切割值<6.17％，TP53的切割值为<3.98％,ATM的切割值为<2.08％，TP12的切割值为<1.94％，IGH的切割值为<4.18％。
1.2.5统计学分析率间比较采用四格表卡方检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
表1：核型分析与FISH就5种遗传学异常的结果
| 项目 | 核型百分率 | FISH百分率 |
| CEP12(12+) | 7.25％(5/69) | 21.74％(15/69) |
| IGH(14q32) | 5.80％(4/69) | 15.94％(11/69) |
| RB1(13q14) | 7.25％(5/69) | 15.94％(11/69) |
| TP53(17q13) | 5.80％(4/69) | 10.14％(7/69) |
| ATM(11q22) | 2.90％(2/69) | 7.25％(5/69) |
表2：合并2种及以上遗传学异常的病例数
| 合并遗传学异常 | 核型/例 | FISH/例 |
| CEP12+RB1 | 1 | 1 |
| CEP12+IGH | 0 | 1 |
| RB1+TP53 | 1 | 2 |
| RB1+ATM | 0 | 2 |
| TP53+IGH | 0 | 1 |
| CEP12+RB1+ATM | 0 | 1 |
| CEP12+IGH+TP53 | 1 | 2 |
| CEP12+IGH+ATM | 0 | 1 |
| 总数 | 3 | 11 |
表3：细胞刺激剂的使用前后核型分析结果
| 核型的检出率 | 培养失败的例数 | |
| 未使用刺激剂 | 21.15％(11/52) | 7 |
| 使用刺激剂 | 41.18％(7/17) | 2 |
注：2016年10月开始正式使用DSP30细胞刺激剂(上海生工)
2.1染色体核型结果所选的69例CLL初诊患者中，运用染色体核型分析发现18例患者至少有1种以上的核型异常，检出率为26.09％。其中有5例患者为+12三体，4例患者为14q32缺失或14号染色体丢失，5例患者13q14的缺失或13号染色体丢失，4例患者为17p13缺失或17号染色体丢失，2例患者为11p22缺失或11号染色体丢失，其中还有4例患者为其他复杂核型异常包括-20、+8、t(1；7)(q32；p22)、del(1)(q32)，其余42例患者核型正常，9例患者未见可分析分裂象。
2.2染色体核型与细胞刺激剂2016年10月开始正式使用DSP30(磷酸胞苷酰寡脱氧核苷酸)和IL-2细胞刺激剂(上海生工)，其中7/9的未见可分析分裂象即细胞培养失败是在2016年10月之前未使用细胞刺激剂的，细胞培养失败中的2/9是在12月及以后使用刺激剂的。使用前核型分析的检出率为21.15％，使用后检出率为41.18％。
2.3FISH的结果所选的69例CLL初诊患者中，FISH检测发现34例患者至少有1种以上的分子遗传学异常，异常率为49.28％，其中单一分子遗传学异常的有23例，合并2种分子遗传学异常的有7例，合并3种分子遗传学异常的有4例。具体为CEP12基因异常发生率最高为21.74％，,其次RB1和IGH阳性都为10例占15.94％，其中单纯的RB1阳性患者有4例，合并2种及以上有6例。然后TP53阳性有7例占10.14％，发生率最低的为ATM阳性共5例占7.25％。
3讨论
CLL是欧美国家成年人群中最常见的白血病，在包括我国在内的亚洲国家相对少见，它病程进展缓慢，发病多见于老年人，男性比女性多见，症状具有明显的异质性。本研究中CLL发病患者中位年龄为59岁，其中≥60岁者32例，男性与女性比例为1.3：1。CLL患者的细胞遗传学异常发生率高且涉及基因范围广，越来越多的结果表明CLL的细胞遗传学的改变与患者的临床诊断、临床用药及预后判断密切相关。染色体核型分析和FISH作为检测CLL细胞遗传学异常的常用方法。在检测CLL细胞遗传学中都有自己的独特优点和缺陷。
常规的染色体核型分析是全基因组分析可以检测出所有染色体的类型数量变化及结构异常，但它只能检测质量较好的分裂中期细胞染色体异常，而且CLL细胞大多处于间期，有丝分裂活性低，增值能力低下，对于间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。据文献报道，常规染色体R显带技术仅20％左右的CLL检测出克隆性染色体异常；在细胞培养中使用多克隆B细胞激活剂，其异常细胞检出率可达39％左右。荧光原位杂交技术是一种利用荧光信号标记的探针检测某一特定染色体上的结构和数目等的改变的技术，其不需要进行细胞培养，可用于观察大量间期细胞，运用荧光显微镜观察简单快速且能分辨较小的染色体易位和缺失区域，克服了常规染色体核型分析的局限性，又简化了操作步骤，具有快速、稳定、敏感等优点，但因其是用已知探针特异性检测靶基因，不能用于全面分析CLL的染色体异常，使其在CLL细胞遗传学检测中受到限制。
13q缺失是CLL最常见的染色体异常，通常涉及长臂的1区4带，但是具体缺失长度仍未被明确定义。一些研究表明，缺失区域可能只为13q14，也可能伴有更大片段的缺失。视网膜母细胞瘤基因位于13q14.1-14.2，研究表明del(13q)异常的患者中位生存期为133个月,无治疗生存期长达92个月。单纯del(13q)的患者预后较好，其总体生存率甚至高于核型正常患者，但同时伴有+12、ATM缺失或P53缺失的患者预后较差，本研究中FISH发现有60％(6/10)RBI阳性中为同时伴有其它异常者；+12是首先被发现的CLL常发的染色体异常，研究显示具有+12遗传学异常更容易出现不典型的形态，容易向幼淋细胞白血病转化，预后更差，临床分期也更晚，病情发展快，对嘌呤类似物的反应较差，因而需要积极的治疗；ATM基因位于11q22-23，编码磷脂酰肌醇3激酶，与信号转导和核定位信号有关，参与细胞周期调控、DNA损伤信号的转导修复等过程。CLL患者中，ATM缺失的发生率约12-20％，并且随着疾病进展也可能出现ATM缺失，因此ATM缺失与CLL疾病进展密切相关。ATM缺失阳性患者更易出现全身广泛性淋巴结肿大，从而影响患者预后；TP53基因位于17p13，是一类重要的抑癌基因。TP53蛋白通过阻止损伤DNA的复制介导细胞的促凋亡机制，控制细胞增殖。TP53缺失患者细胞形态多不典型(幼淋>10)，且多处于疾病晚期，因此TP53成为CLL患者预后的重要指标。各种细胞遗传学异常亚型之中，TP53缺失患者的预后最差，TP53是否缺失为临床治疗方案的选择提供重要指导]；IGH基因即免疫球蛋白重链基因位于14q32带，免疫球蛋白基因重排是B淋巴细胞分化过程中的一个生理过程。正常情况下B细胞不呈单克隆生长，为多克隆增殖，呈多条非特异带；在病理情况下，由于B细胞克隆性生长，几乎见于所有B淋巴细胞恶性肿瘤，常导致抑细胞治疗反应差，疾病进展迅速，预后差。综上所述，故本文应用了这五种常用探针来检测CLL的细胞遗传学，对临床进一步的诊断，用药和预后提供必要帮助。
本研究中染色体核型细胞培养失败中有7/9是未使用细胞刺激剂DSP30和IL-2的，2/9是使用刺激剂DSP30后的，故细胞刺激剂的使用提高了CLL患者的细胞培养率。如表3：细胞刺激剂的使用前后核型分析结果所示，使用DSP30和IL-2细胞刺激剂之前的检出率为21.15％(11/52)，使用之后的检出率为41.18％(7/17)。使用之后的检出率明显高于使用前的，但是仍然低于FISH的检出率。使用之后的检出率也略高于上文提到的使用多克隆B细胞激活剂的检出率39％左右。由于本研究中69例病例中只有17例是使用了细胞刺激剂的，样本量少。所以在下文染色体核型分析与FISH的对比分析中不分开分析细胞刺激剂使用前后与FISH的比较。
本研究中FISH检测出的细胞遗传学异常率为49.28％，低于国内报道的63.3～72.7％，原因可能是标本数量少或地域差异，本文不做进一步研究。
如表1:核型与FISH就5种遗传学异常的结果所示，针对RB1(13q14)、TP53(17q13)、ATM(11q22)、CEP12(12p11-q11)、IGH(14q32)这五种遗传学改变，FISH的检出率明显高于染色体核型分析的检出率(P<0.05)。与许多的研究报道一样，两种方法检测同一异常时，FISH的检出率更高，更为敏感、可靠。本文中FISH检测的细胞遗传学异常中CEP12基因异常发生率最高为21.74％，不同与其它研究中所说的13q缺失是CLL最常见的染色体异常。+12通常伴有其它核型异常。本文中15例+12患者中有1/3伴有其它核型异常。根据表2:合并2种及以上遗传学异常的病例数可知，针对FISH所能检测出的合并2种及以上遗传学异常的检出者中，FISH的检出病例数(11例)也比核型分析检出病例数(3例)多的多。有些如CEP12和IGH同时阳性者，FISH检测出而核型分析并没有检测出。采用染色体核型分析技术检测出-20、+8、t(1；7)(q32；p22)、del(1)(q32)等复杂染色体异常，而采用FISH探针并不能检测出所选探针所针对的核型之外的染色体异常。
综上所述:针对CLL的细胞遗传学异常检测，染色体核型分析在检测中很重要，不可忽略，其优点是它能检测出FISH探针没有涉及到的其他复杂核型如本文中检测出的-20、+8、t(1；7)(q32；p22)、del(1)(q32)等，缺点是只能分析质量较好的中期细胞且检出率低，需要进行细胞培养操作步骤复杂。FISH在CLL患者的细胞遗传学异常检测指标中不能缺少，它的优点是能弥补染色体核型分析的不足，不需要进行细胞培养操作步骤，且荧光显微镜的应用能更加快速易观察，针对某些提高特定的染色体异常FISH大大的提高了检出率，比染色体核型分析更敏感，特异性更高。FISH是对某一特定异常染色体区域亚组的细化研究。其缺点是不能检测出除所选用探针之外的其它染色体的数量及结构异常，综上，染色体核型分析与FISH这两种测细胞遗传学的方法各有侧重，两者之间相辅相成不可或缺。故最佳检测CLL细胞遗传学异常的方法不是染色体核型分析也不是FISH，而是两种方法的联合对比使用，既可以快速准确的检测出CLL常见的染色体异常，又可以全面的尽可能检测出所有的染色体异常。两种方法的联合使用可明显提高CLL患者的遗传学检测的效率，是省时、高效、灵敏的检测手段，对于CLL患者指导临床诊断用药及预后判断意义重大。
Claims (10)
1.一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：选取确诊为慢性淋巴细胞白血病患者的血液样本/骨髓，提取外周血/骨髓液作为待测试的样本；
步骤2：对步骤1获得的外周血样本进行染色体核型分析；
步骤3：对步骤1获得的外周血样本进行原位杂交技术分析；
步骤4：将步骤2和步骤3获得的数据进行统计学分析会的率间数据。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在在于，步骤1中所述的外周血的总数是大于10×109个/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中染色体核型分析的具体步骤如下：
(1)取外周血或骨髓液接种于含有20％胎牛血清RPM1640培养基内，37℃培养72小时，收获前加秋水酰胺阻断剂，低渗法收集细胞；
(2)制备气干法滴片，G显带技术、Giemsa染色，全自动染色体扫描采集优质图像，处理分析并记录结果。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中原位杂交技术分析的具体步骤如下：
(1)提取单个核细胞，低渗法收集细胞，制备气干法滴片；
(2)选择标记探针78℃变性5分钟，37℃杂交过夜；
(3)荧光显微镜观察；
(4)建立阈值。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：Isis Version5.4FISH分析计数500个细胞并记录杂交信号。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用VYSIS单色标记RB-1探针，RB-1基因标记为红色，正常信号特征为2R,阳性信号特征为1R；单色标记CEP12探针，CEP12基因标记为红色，正常信号特征为2R，阳性信号特征为3R；双色分离标记IGH探针，5’IGH基因标记为绿色，3’IGH基因标记为红色，IGH基因显示为黄色或红绿叠加信号，正常信号特征为2F，阳性信号特征为1F1R1G。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用双色标记TP53探针，TP53基因标记为红色，CEP17基因标记为绿色，正常信号特征为2R2G，阳性信号特征为2G1R，-17为1R1G；双色标记ATM探针，ATM基因标记为红色，CEP11基因标记为绿色，正常信号特征为2R2G，阳性信号特征为2G1R，-11为1R1G。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)的具体方法如下：每种探针均选取10例正常骨髓捐献者标本检查，计数至少500个间期细胞，正常参考区间为小于95％累计beta分布区间点，每种探针的切割值：RB-1的切割值<6.17％，TP53的切割值为<3.98％,ATM的切割值为<2.08％，TP12的切割值为<1.94％，IGH的切割值为<4.18％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述的统计学分析是采用四格表卡方检验。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用P<0.05为差异。
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| 黄晓军等: "慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤诊疗指南", 国家卫生健康委办公厅, 3 April 2022 (2022-04-03), pages 1 - 19 * |
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