CN112048560B - 一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于数字PCR方法，并利用多内参结合序贯概率比检验(SPRT)分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及方法。该试剂盒包含数字PCR酶预混液、用于检测靶基因HER2及内参CEP17及EIF2C1的引物探针混合液、荧光素钠盐溶液和ddH2O。本发明通过比较两内参基因的表达水平，准确有效的判断HER2基因所在17号染色体是否存在多体、单体、着丝粒扩增等情况。此外，还可以通过SPRT分析完成HER2基因拷贝数变异状态的准确判读，显著提高了检测结果判定的准确性，可以作为HER2基因拷贝数变异初次检测的试剂盒及方法使用，具有其他方法所不可替代的优势。

Description

一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的 试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法，属于生物医学核酸检测技术领域。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2)是一种编码具有酪氨酸激酶活性的原癌基因，位于17号染色体上。针对HER2基因拷贝数变异的检测是判断乳腺癌预后和制定有效治疗方案的依据(包括激素治疗和化疗的参考指标)，也是是否可以采取靶向药物治疗的先决条件。目前医院广泛开展的HER2基因拷贝数变异的检测方法主要是免疫组化(IHC)方法和荧光原位杂交(FISH)方法。临床数据表明，IHC方法不能准确地判定HER2基因拷贝数变异的状态，结果常常显示将近50％的样本存在IHC判定为2+的情况，之后必须要使用FISH方法进行复检才能确定HER2基因拷贝数变异的状态。另外，还存在10％左右IHC判定为3+的样本再经过FISH检测后，却显示为HER2基因拷贝数变异为阴性的结果，这样的结果不仅会造成多次重复检测的经济损失，而且耽误了患者使用其他治疗方案进行治疗。同时，当IHC检测结果为0、1+时，也会有将近10％的结果在进行FISH检测时却显示HER2基因拷贝数变异为假阴性的情况。因此，IHC方法在前期HER2基因拷贝数变异状态的初步筛查中并不适宜。FISH检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间的一致性较高，是目前检测HER2基因拷贝数变异状态的“金标准”。但是FISH存在检测周期长、收费高、受检测者专业知识和实验室条件的限制，只能在具有资质的大医院进行，也造成大量样本不能得到及时的判定而失去个体化用药的机会，作为全方面的初次诊断也不适宜。因此，针对IHC/FISH检测中的各种问题，寻找一种初次使用就能更准确检测HER2基因拷贝数变异状态的方法是非常重要的。数字PCR技术是将一个样本分成几万份，分配到不同的反应单元(微滴)中并在每个微滴中经过PCR扩增得到荧光信号，再通过泊松分布计算出核酸分子的浓度，因此具有更高的灵敏度和准确性，可以直接精准计数得出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。特别适用于拷贝数变异、突变检测、基因相对表达等研究领域。其中南京科维思生物科技股份有限公司的HER2基因扩增检测试剂盒(数字PCR法)是目前市场上唯一使用的数字PCR方法对HER2基因扩增状态进行检测的试剂盒。但是，该试剂盒仅采用了一个内参基因，无法判断17号染色体是否存在多体、单体、着丝粒扩增等情况，从而造成假阳性或假阴性的结果。除此之外，因为数字PCR方法是通过对反应后的微滴进行泊松分布计算才得到的数据结果，所以对于得到微滴数据后的群体统计分析也非常重要，目前使用数字PCR方法检测多内参并结合所得到的HER2基因拷贝数变异的数据进行群体统计分析的试剂盒以及方法还未见有报道。
综上所述，本发明采用法国Naica数字PCR平台，设计并完成了一种多内参结合序贯概率比检验(SPRT)分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法。首先，本发明建立在数字PCR技术上可以简单快速地实现靶分子拷贝数的绝对定量，大大消除IHC/FISH方法检测成本高、检测耗时长、操作步骤繁琐、实验结果判读过分依赖于实验人员的现象；其次，通过对使用本发明所述试剂盒检测得到的数字PCR微滴数据进行群体样本的统计分析，并得到两个内参CEP17/EIF2C1的比值来准确评估HER2基因所在的17号染色体的稳定性状态，对于CEP17/EIF2C1的比值异常的结果参照SPRT的结果进行回顾性分析；最后，通过对使用本发明所述试剂盒检测得到的数字PCR微滴数据再次进行分析，得到HER2基因、CEP17基因有效微滴(即去除双阳性的微滴)的比例，再应用SPRT通过检验Pr来评价HER2基因拷贝数变异的真实状态。SPRT结果可输出为三种结果，分别为HER2基因拷贝数变异阳性、阴性以及不可分类。对于HER2基因拷贝数变异不可分类的结果，通过增加HER2基因有效微滴数量再次进行分析，直到数据可通过SPRT的分类界定，对于染色体状态疑似异常且SPRT分析为HER2基因拷贝数变异阴性的结果再推荐使用FISH方法进行检测。
发明内容
本发明旨在提供一种多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法，以解决IHC/FISH检测HER2基因拷贝数变异状态准确性低的技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒，试剂盒包括以下四个组分：数字PCR酶预混液、引物探针混合液、荧光素钠盐溶液和ddH2O；其中，引物探针混合液由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9所示的引物核苷酸序列以及探针核苷酸序列的溶液组成；所述每种引物核苷酸序列溶液的浓度为10μM，所述每种探针核苷酸序列溶液的浓度为5μM；所述荧光素钠盐溶液的浓度为1μM。
本发明还提供了一种多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异试剂盒的使用方法，该方法是：提取待测样本的DNA作为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物核苷酸序列作为扩增引物，并加入SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示的探针核苷酸序列作为检测探针，并加入数字PCR酶预混液、荧光素钠盐溶液和ddH2O进行数字PCR扩增，对扩增结果进行拷贝数及微滴数统计并将CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI，计算每个样本C/EI比值以及群体样本的C/EI的平均值并统计群体样本的C/EI比值的95％的置信区间，若某个样本的C/EI比值处于置信区间内，则判定为HER2基因所在的17号染色体为正常，若某个样本的C/EI比值处于置信区间之外，则判定为HER2基因所在的17号染色体疑似异常。
本发明进一步提供了一种多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异试剂盒的使用方法，该方法如下：
(1)提取群体样本中的待测样本的DNA作为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物核苷酸序列作为扩增引物，并加入SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示的探针核苷酸序列作为检测探针，并加入数字PCR酶预混液、荧光素钠盐溶液和ddH2O进行数字PCR扩增，对每个样本的扩增结果进行拷贝数及微滴数统计并将总微滴数简写为dTotal、HER2基因的拷贝数简写为H、HER2基因的阳性微滴数简写为dH、仅包含HER2基因的阳性微滴数简写为NHER2(NHER2＝dH-dH×dC/dTotal)、仅包含HER2基因的阳性微滴占比简写为Pr(Pr＝NHER2/(NHER2+NCEP17))、CEP17基因的拷贝数简写为C、CEP17基因的阳性微滴数简写为dC、仅包含CEP17的阳性微滴数简写为NCEP17(NCEP17＝dC-dH×dC/dTotal)；
(2)对所检测的群体样本的HER2基因的拷贝数变异结果进行序贯概率比检验分析：将HER2基因发生拷贝数变异的阈值线简写为T(T是以群体样本中每个样本的dH/dC的比值绘制接受者操作特征曲线(ROC)的线下与坐标轴围成的面积最大时(AUC)对应的值)；群体样本微滴中的CEP17拷贝数的平均值简写为MCEP17，MCEP17＝-Ln(1-dC/dTotal)。根据T及MCEP17计算在HER2基因的拷贝数变异接受备择假设时，仅包含HER2基因阳性微滴的比例q1，q1＝[1-exp(-T-0.05)]×(1–dC/dTotal)/{1-exp(-T-0.05)×MCEP17+dC/dTotal-2[(1-exp(-T-0.05)MCEP17]×(dC/dTotal)}；根据T及MCEP17计算在无HER2基因的拷贝数变异的情况下接受原假设时，仅包含HER2阳性微滴的比例q0，q0＝[1-exp(-T+0.05)]×(1–dC/dTotal)/{[(1-exp(-T+0.05)×MCEP17]+dC/dTotal–2[1-exp(-T+0.05)MCEP17]×(dC/dTotal)}；
(3)由上述两种情况下的仅包含HER2基因阳性微滴的比例可以计算得到HER2基因拷贝数变异判定的阈值线：Upper(高值)＝{(Ln 8)/(NHER2+NCEP17)-Ln[(1-q1)/(1-q0)]}/Ln[q1(1-q0)/q0(1-q1)]；Lower(低值)＝{(Ln 1/8)/(NHER2+NCEP17)-Ln[(1-q1)/(1-q0)]}/Ln[q1(1-q0)/q0(1-q1)]
(4)若HER2基因的Pr值高于阈值线Upper(高值)，则判定HER2基因拷贝数变异状态为阳性；若Pr值低于阈值线Lower(低值)，则判定HER2基因拷贝数变异状态为阴性；若Pr值介于Upper(高值)和Lower(低值)二者之间，则判定HER2基因拷贝数变异状态为不可分类；
(5)若判定HER2基因拷贝数变异状态为不可分类，则通过数字PCR检测增加更多的HER2基因阳性微滴数，直至得到明确的HER2基因拷贝数变异为阳性或阴性的结果。
进一步地，所述的试剂盒及方法对于判定为HER2基因所在的17号染色体疑似异常并且通过SPRT分析后HER2基因拷贝数变异为阴性结果的样本再需要使用荧光原位杂交的方法进行检测以确定HER2基因拷贝数变异的状态。
本发明为检测HER2基因拷贝数变异的数字化分析方法与试剂盒。本发明中所述的多内参结合SPRT分析方法可实现标准化操作以及数字化判读，避免了传统IHC/FISH的一致性差及易产主观误差的缺点。采用多内参的方法可以帮助判定HER2基因所在的17号染色体的异常情况，通过本发明所述的试剂盒和使用方法能显著提高HER2基因拷贝数变异状态判定的准确性，大幅度减少了需要采用FISH再次进行复检的样本数量。因此，较IHC/FISH方法更加适合作为HER2基因拷贝数是否发生变异的初次检测及判定。
附图说明
说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为一种多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法的检测流程。
图2示出了HER2基因(FAM通道)的数字PCR检测1D散点图。
图3示出了CEP17基因(HEX通道)的数字PCR检测1D散点图。
图4示出了EIF2C1基因(CY5通道)的数字PCR检测1D散点图。
图5为使用本发明所述的试剂盒及方法检测30个样本的结果，其中有两个样本为不可分类的，其它均与已知的IHC/FISH结果一致。
图6为通过增加HER2基因的有效阳性微滴数对图5中不可分类的两个标本进行重复检测分析的结果，结果为可以进行明确分类。
具体实施方式
下面结合参考附图以及实施例对本发明做进一步的详细说明，但它们仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法的建立
本实施例利用乳腺癌细胞系的石蜡样本建立HER2基因拷贝数变异的检测方法，并初步评价本方法的检测能力。实施例1至3均是按照图1所示的流程图进行试剂盒的使用及后续数据的统计分析。
1、本发明所涉及的引物及探针核的苷酸序列表如表1所示。
表1、引物及探针的核苷酸序列表
编号 名称 核苷酸序列
SEQ ID NO：1 HER2-FPrimer 5'-CTAGCACCTTGCTAAGCA-3'
SEQ ID NO：2 HER2-RPrimer 5'-GAGCACCATTCACAGAAA-3'
SEQ ID NO：3 CEP17-FPrimer 5'-TCTGCCTAATCTACCAATG-3'
SEQ ID NO：4 CEP17-RPrimer 5'-GCACCTCTGTAAGTAGAG-3'
SEQ ID NO：5 EIF2C1-FPrimer 5'-CCCTAACTCTCTTCAATTC-3'
SEQ ID NO：6 EIF2C1-RPrimer 5'-GAACCAATCTCTACTAGC-3'
SEQ ID NO：7 HER2-Probe(FAM) 5'-CCAGGAGGCACCATTCACA-3'
SEQ ID NO：8 CEP17-Probe(HEX) 5'-ATGTGGCACCTCCCTGATCC-3'
SEQ ID NO：9 EIF2C1-Probe(CY5) 5'-CTACCTTACCTCTGTTGGC-3'
2、样品准备：30个乳腺癌细胞系的石蜡样本。
3、DNA提取：采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat#56404)提取石蜡样本中的总DNA，具体的操作步骤参见QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit操作指南。
4、使用数字PCR检测方法，如表2所示配制数字PCR反应液。
表2、数字PCR反应液
数字PCR反应液 加入体积(μL)
数字PCR酶预混液 5
荧光素钠盐溶液(1μM) 2.5
引物及探针混合液(引物浓度10μM/each；探针浓度5μM/each) 4
样本提取的DNA 2
ddH<sub>2</sub>O 11.5
总体积 25
5、数字PCR反应体系配制完成后，将PCR反应管涡旋混匀15s后，瞬时离心15s。
6、取出Sapphire chip，使用移液器将25μL反应液加入到Sapphire chip的孔中，盖上白色长盖。
7、数字PCR操作流程参照NaicaTM Crystal Digital PCR System用户指南，反应程序包括微滴生成、cDNA生成、预变性、PCR反应、释放压力，程序设置如表3所示。
表3数字PCR反应程序表
Figure BDA0002676841170000051
8、数字PCR完成后，调用优化的扫描条件、补偿文件以及校准参数，使用NaicaTMprism 3微滴阅读分析系统进行信息采集。
9、在本实施例中，通过使用本发明所述的试剂盒及使用方法可以扩增得到30个乳腺癌细胞系石蜡样本中目的基因的荧光信号数据(表4)：FAM通道的荧光信号代表HER2基因的扩增信号(图2)，HEX通道的荧光信号代表内参基因CEP17基因的扩增信号(图3)；CY5通道的荧光信号代表内参基因EIF2C1基因的扩增信号(图4)。
表4、采用本发明所述的试剂盒及使用方法对30个乳腺癌细胞系石蜡样本的检测结果
Figure BDA0002676841170000052
Figure BDA0002676841170000061
10、将表4中CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI，并计算出C/EI的比值，并求出30个群体样本C/EI比值的平均值为0.98，经计算得知30个样本的C/EI比值95％置信区间为0.30～1.66，若C/EI的比值位于95％置信区间内的样本则说明其染色体正常，若C/EI的比值位于95％置信区间外的样本则疑似存在染色体异常现象。表4显示出24号样本的C/EI比值为1.69，因此可以初步判定24号样本为疑似存在染色体异常现象。
11、进一步对上述30个群体样本中的每个样本进行SPRT分析来确定每个样本C/EI的比值是否处于可接受误差的范围内，或者确定是否需要增加阳性微滴数来判定HER2基因拷贝数变异的状态。
(1)总微滴数简写为dTotal、HER2基因的拷贝数简写为H、HER2基因的阳性微滴数简写为dH、仅包含HER2的阳性微滴数简写为NHER2(NHER2＝dH-dH×dC/dTotal)、仅包含HER2基因的阳性微滴占比简写为Pr(Pr＝NHER2/(NHER2+NCEP17))、CEP17基因的拷贝数简写为C、CEP17基因的阳性微滴数简写为dC、仅包含CEP17基因的阳性微滴数简写为NCEP17(NCEP17＝dC-dH×dC/dTotal)。
(2)对所检测的30个样本的每一个样本的HER2基因的拷贝数变异结果进行序贯概率比检验分析：将HER2基因发生拷贝数变异的阈值线简写为T，T是以群体样本中每个样本的dH/dC的比值绘制接受者操作特征曲线(ROC)的线下与坐标轴围成的面积最大时(AUC)对应的值。在此实施例中AUC值为1.87，TNONAMP与TAMP分别对应阈值线±0.05。群体样本微滴中的CEP17拷贝数的平均值简写为MCEP17，MCEP17＝-Ln(1-dC/dTotal)。根据T及MCEP17计算在HER2基因的拷贝数变异接受备择假设时，仅包含HER2基因阳性微滴的比例q1，q1＝[1-exp(-T-0.05)]×(1–dC/dTotal)/{1-exp(-T-0.05)×MCEP17+dC/dTotal-2[(1-exp(-T-0.05)MCEP17]×(dC/dTotal)}；根据T及MCEP17计算在无HER2基因的拷贝数变异的情况下接受原假设时，仅包含HER2基因阳性微滴的比例q0，q0＝[1-exp(-T+0.05)]×(1–dC/dTotal)/{[(1-exp(-T+0.05)×MCEP17]+dC/dTotal–2[1-exp(-T+0.05)MCEP17]×(dC/dTotal)}；
(3)由上述两种情况下的仅包含HER2基因阳性微滴的比例可以计算得到30个样本的HER2基因拷贝数变异判定的阈值线：Upper(高值)＝{(Ln 8)/(NHER2+NCEP17)-Ln[(1-q1)/(1-q0)]}/Ln[q1(1-q0)/q0(1-q1)]；Lower(低值)＝{(Ln 1/8)/(NHER2+NCEP17)-Ln[(1-q1)/(1-q0)]}/Ln[q1(1-q0)/q0(1-q1)]
(4)将群体样本中每个样本经过数字PCR检测所得到数值代入SPRT公式后进行统计分析后，得到每个样本的阈值，计算分析后的结果如表5所示，若Pr值高于Upper(高值)，则判定样本的HER2基因拷贝数变异为阳性，若Pr值低于Lower(低值)，则判定样本的HER2基因拷贝数变异为阴性，若Pr值处于Upper(高值)和Lower(低值)之间，则判定样本的HER2基因拷贝数变异为不可分类，则需要增加样本的阳性微滴数来进一步确定分类。结果显示，虽然24号样本的CEP17/EIF2C1的比值位于95％置信区间外，但是经过SPRT分析后被归类为阴性，因此，需要进行FISH检测。21号与26号样本的CEP17/EIF2C1比值虽然位于95％置信区间内，但是SPRT分析值位于其Upper(高值)和Lower(低值)之间，确定为不可分类，因此需要将21号与26号样本的模板上样量增加至之前的五倍再进行数字PCR检测，以增加有效阳性微滴数量，从而得到明确的分类结果(表6)。其它27个样本的CEP17/EIF2C1的比值位于95％置信区间内，并且SPRT分析也显示为可正确分类，并且显示出与IHC/FISH相同的阴性或阳性结果(图5)。
表5、使用本发明所述的试剂盒及使用方法对上述30个群体样本中每个样本的SPRT分析结果
Figure BDA0002676841170000071
Figure BDA0002676841170000081
表6、采用本发明所述的多内参结合SPRT分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法对21号与26号样本的模板上样量增加至之前的五倍再进行数字PCR检测，以增加有效阳性微滴数量，得到的明确的分类结果。
Figure BDA0002676841170000082
Figure BDA0002676841170000091
(5)本次检测结果表明21号与26号样本，CEP17/EIF2C1结果分别为1.05与0.97，位于95％范围内，说明该样本染色体正常。经过增加有效的阳性微滴数再经过SPRT分析即可以将该样本正确分类为HER2基因拷贝数变异为阳性，与IHC/FISH结果相同(图6)。
通过对以上30个石蜡样本的检测，筛查出1个样本为染色体疑似异常，其余与FISH检测结果完全一致，准确性为100％，说明本发明所涉及的试剂盒及使用方法具有使用的合理性与正确性，可以确定对于SPRT分析为阳性的样本维持之前的判定，对于染色体疑似异常并且SPRT分析为阴性的样本推荐再进行FISH检测。
实施例2用本发明所述的试剂盒及使用方法检测10例石蜡组织切片样本的HER2基因拷贝数变异的状态，并与使用CEP17单内参直接计算出的比例的准确性进行比较，CEP17/EIF2C1计算所得的置信区间与HER2/CEP17阈值线均与实施例1相同。
1、样品准备：10个乳腺癌细胞系石蜡样本。
2、DNA提取及数字PCR检测流程同实施例1。
3、数字PCR检测以及SPRT分析结果如表7和表8所示。
表7、采用本发明所述的试剂盒及使用方法对10个乳腺癌细胞系石蜡样本HER2基因拷贝数变异状态的检测结果
Figure BDA0002676841170000092
表8、使用本发明所述的试剂盒及使用方法对10个乳腺癌细胞系石蜡样本中每个样本的SPRT分析结果
Figure BDA0002676841170000101
4、通过检测结果可以看出，34、35、37、37号样本经过SPRT分析显示为HER2基因拷贝数变异不可分类的结果，因此增加模板加入量至之前五倍进行数字PCR，进行数字PCR复检(表9)，最终Pr值至可分类状态，显示结果如表9显示，与FISH检测结果一致。
表9、不可分类乳腺癌细胞系石蜡样本中HER2基因拷贝数变异状态的检测结果
Figure BDA0002676841170000102
实施例3本发明所述的试剂盒及使用方法与CEP17单内参分析方法的比较
1、综合实施例1与实施例2中所涉及到的两部分样本信息，本发明所述的试剂盒及使用方法与CEP17单内参分析方法的比较结果件见表10。
表10、在40例乳腺癌细胞系石蜡样本中，使用本发明所述的试剂盒及使用方法与CEP17单内参分析方法的比较
Figure BDA0002676841170000111
2、经过全面分析发现，在40例标本中，使用CEP17单内参分析方法检测HER2基因拷贝数变异的状态，显示出26、34、35、37、40号样本的检测结果与IHC/FISH结果不符合，准确率为87.5％(35/40，95％CI 73.89％-94.54％)，而且无法判定17号染色体的状态，此外，接近阈值线的值，一定概率会出现假阳性或假阴性结果，其检出准确率低于本发明所述试剂盒及使用方法。而本发明所述的试剂盒及使用方法可以检出1例疑似染色体异常且SPRT分析呈现阴性的样本需要再进行FISH复检，其余样本有6例在初筛时为不可分类，但通过增加样本量进行复检后最终转换为准确判读，由此提高检测准确性至100％。因此，CEP17单内参分析HER2基因拷贝数变异的状态的方法准确性低于本发明所述的试剂盒及使用方法。准确率由87.5％提高到100％。
实施例4本发明所述的试剂盒及使用方法与IHC方法的比较
1、综合实施例1与实施例2中所涉及到的两部分样本信息，本发明所述的试剂盒及使用方法与IHC方法的比较结果件见表11。
表11、在40例乳腺癌细胞系石蜡样本中，使用本发明所述的试剂盒及使用方法与IHC方法的比较
Figure BDA0002676841170000121
Figure BDA0002676841170000131
2、实施例4的检测及分析结果显示，初次使用IHC检测方法不能准确判定HER2基因拷贝数变异状态(IHC显示结果为2+)的样本数量所占比例为32.5％(13/40)，并需再次进行FISH检测才能得到如表11中的IHC/FISH结果。使用本发明所述的试剂盒及使用方法检测的结果中可以判定出疑似染色体异常且SPRT分析为阴性结果的样本所占比例为2.5％(1/40，第24号样本)，才需再进行FISH检测。虽然有15％(6/40)的样本在初筛时显示HER2基因拷贝数变异状态为不可分类，但通过增加HER2基因有效微滴数量后，即可转换为准确判读结果，不用再进行FISH检测。此结果说明使用本发明所涉及的试剂盒及使用方法对HER2基因拷贝数变异的状态进行初次检测，可以大大降低再次需要FISH检测的样本量，将需要再次进行FISH检测的样本量所占的比例由32.5％降低到2.5％。
通过以上实施例可以证明，IHC方法作为前期初步筛查HER2基因拷贝数变异的状态是并不适宜的。虽然FISH方法是目前检测HER2基因拷贝数变异的“金标准”，但是FISH存在检测周期长、成本高、并且受专业知识和实验室条件的限制大，作为HER2基因拷贝数变异状态的初次检测同样是不适宜的。本发明所述一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法可实现标准化操作与数字化判读，避免了传统IHC/FISH方法的一致性差及主观误差大的缺点。在使用多内参判定HER2基因所在17号染色体是否异常的同时，还可以大幅度减少需要进行FISH检测以确定HER2基因拷贝数变异的样本数量。
序列表
<110> 北京爱普拜生物技术有限公司
<120> 一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法
<141> 2020-09-11
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagcacctt gctaagca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcaccatt tctaccaatg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgcctaat ctaccaatg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcacctctgt aagtagag 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctaactct cttcaattc 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaccaatct ctactagc 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaggaggca ccattcaca 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtggcacc tccctgatcc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctaccttacc tctgttggc 19

Claims (1)

1.一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异试剂盒的非诊断目的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）提取待测样本的DNA作为模板，以一种多内参结合序贯概率比检验分析HER2基因拷贝数变异试剂盒中配置的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物核苷酸序列溶液作为扩增引物，并加入试剂盒中配置的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示的探针核苷酸序列溶液作为检测探针，并加入试剂盒中配置的数字PCR酶预混液、荧光素钠盐溶液和ddH2O进行数字PCR扩增，扩增之后对扩增结果进行拷贝数及微滴数统计并将HER2基因的拷贝数简写为H、CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI、HER2基因的阳性微滴数简写为dH、CEP17基因的阳性微滴数简写为dC、扩增的总微滴数简写为dTotal、仅包含HER2的阳性微滴数简写为NHER2、仅包含CEP17的阳性微滴数简写为NCEP17、仅包含HER2的阳性微滴占比简写为Pr、HER2扩增的阈值线简写为T、群体样本微滴中的CEP17拷贝数的平均值简写为MCEP17；所述的NHER2= dH-dH×dC/dTotal；所述的NCEP17=dC-dH×dC/dTotal；所述的Pr= NHER2/（NHER2+NCEP17）；所述的T为以dH/dC的比值绘制接受者操作特征曲线的线下与坐标轴围成的面积最大时对应的值；所述的MCEP17= -Ln（1-dC/dTotal）；
（2）计算每个样本C/EI比值以及群体样本的C/EI的平均值并统计群体样本的C/EI比值的95%的置信区间，若某个样本的C/EI比值处于置信区间内，则判定为HER2基因所在的17号染色体为正常，若某个样本的C/EI比值处于置信区间之外，则判定为HER2基因所在的17号染色体疑似异常；
（3）对所检测的群体样本的HER2基因的拷贝数变异结果进行序贯概率比检验分析：根据（1）中所得到的T及MCEP17计算在HER2扩增接受备择假设时，仅包含HER2阳性微滴的比例q1，q1=[1-exp（-T-0.05）]×(1–dC/dTotal)/｛1-exp（-T-0.05）×MCEP17+ dC/dTotal-2[(1-exp（-T-0.05）MCEP17]×（dC/dTotal）｝；
（4）根据T及MCEP17计算在无HER2扩增的情况下接受原假设时，仅包含HER2阳性微滴的比例q0，q0=[1-exp(-T+0.05)]×(1–dC/dTotal)/｛[(1-exp(-T+0.05)×MCEP17]+dC/dTotal–2[1-exp（-T+0.05）MCEP17]×（dC/dTotal）｝；
（5）由上述两种情况下的仅包含HER2基因阳性微滴的比例，计算得到HER2基因拷贝数变异判定的阈值线：高值=｛（Ln 8）/（NHER2+NCEP17）-Ln[（1-q1）/（1-q0）]｝/Ln[q1（1-q0）/q0（1-q1）]；低值=｛（Ln 1/8）/（NHER2+NCEP17）-Ln[（1-q1）/（1-q0）]｝/Ln[q1（1-q0）/q0（1-q1）]；
（6）若HER2基因的Pr值高于阈值线高值，则判定HER2基因拷贝数变异状态为阳性；若Pr值低于阈值线低值，则判定HER2基因拷贝数变异状态为阴性；若Pr值介于高值和低值二者之间，则判定HER2基因拷贝数变异状态为不可分类；
（7）若判定HER2基因拷贝数变异状态为不可分类，则通过数字PCR检测增加更多的HER2基因阳性微滴数，直至得到明确的HER2基因拷贝数变异为阳性或阴性的结果；
（8）对于判定为HER2基因所在的17号染色体疑似异常并且通过序贯概率比检验分析后HER2基因拷贝数变异为阴性结果的样本需要再次使用荧光原位杂交的方法进行检测以确定HER2拷贝数变异的真实状态。
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