CN113736880B - 用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字pcr试剂盒及引物和探针 - Google Patents

用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字pcr试剂盒及引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测华氏巨球蛋白血症(WM)相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针。本发明的试剂盒中含有用于检测CXCR4S338X位点的突变的引物和探针。本发明试剂盒采用数字PCR技术，对人类CXCR4S338X突变位点进行定量检测，为临床医生对WM患者靶向用药的疗效监测及临床用药提供参考。

Description

用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒 及引物和探针
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针。
背景技术
华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia，WM)是一种惰性B细胞肿瘤，1944年由瑞典学者Jan G.Waldenstrom首次报道。WHO将其定义为分泌单克隆免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)的淋巴浆细胞淋巴瘤。2012年，Treon等证实9 1％的WM患者存在MYD88L265P基因突变。2014年，Hunter等发现CXCR4WHIM突变在WM患者中占27％。这两个重现性体细胞突变的发现，为华氏巨球蛋白血症的诊断、治疗及预后评估揭开了新篇章。
CXCR4WHIM突变是一种体细胞突变，该突变最早在WHIM综合征(以疣、低丙种球蛋白血症、感染、粒细胞缺乏为特征的免疫缺陷病)中发现。CXCR4WHIM在WM中的体细胞突变是该基因首次在癌症中发现的体细胞突变，其一般为杂合突变。突变可分为无义突变(nonsense,NS)(也称为CXCR4WHIM/NS)和移码突变(frame shift,FS)(也称为CXCR4WHIM/FS)两类。CXCR4WHIM突变中最为常见的是S338X点突变；S338X突变有两种类型：一种突变是C>G，另一种是C>A。CXCR4WHIM突变可导致CXCR4蛋白结构C末端产生异常，使得具有调节功能的丝氨酸丢失，导致CXCR4的内化受损和激活延长。CXCR4与其配体CXCL12结合后，使得丝氨酸/苏氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶信号系统异常活化；同时，CXCR4对于淋巴浆细胞的存活、跨内皮细胞迁移归巢及黏附于骨髓基质都有很大作用。CXCR4WHIM突变率在WM患者中仅次于MYD88L265P突变，突变比率25％-30％。而在其他B细胞淋巴瘤如B-CLL、毛细胞性白血病及浆细胞病如多发性骨髓瘤和轻链型淀粉样变中均未发现突变。
MYD88L265P和CXCR4WHIM突变状态对于WM患者具有一定的临床预后意义。分析显示:①MYD88L265PCXCR4WHIM/NS双突变患者的骨髓肿瘤负荷最重、血清IgM水平最高、起病时症状最多；②MYD88L265PCXCR4wT及MYD88L265PCXCR4WHIM/FS患者的骨髓肿瘤负荷居中；③MYD88wTCXCR4wT患者的骨髓肿瘤负荷最轻；④MYD88L265PCXCR4WHIM相对MYD88L265PCXCR4wT患者较少出现淋巴结肿大；⑤MYD88wT患者的死亡风险更高，而CXCR4WHIM突变与生存预后无关。因此，将MYD88和CXCR4两种基因突变情况相结合，可以得到更为精准的临床预后提示。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。
本发明的第三发明目的在于提供用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的引物和探针。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测CXCR4 S338X位点的突变的引物和探针。
可选的，用于检测CXCR4 S338X位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQID NO:4所示。
可选的，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团；优选的，所述SEQ ID NO:3的荧光基团选自FAM、荧光淬灭基团选自MGB；所述SEQ ID NO:4的荧光基团选自VIC、荧光淬灭基团选自MGB。
可选的，所述上游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；所述下游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；所述探针的浓度为0.12～0.24μmol/L，优选0.18μmol/L。
可选的，所述试剂盒中还含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为含有SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示的片段化质粒标准品。
可选的，所述试剂盒所适用的样本选血浆标本或骨髓标本。
本发明还涉及该数字PCR试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
S1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；
S2、配制数字PCR反应混合液：将所述数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到数字PCR反应混合液；优选的，所述数字PCR反应液与所述样品处理液的体积比为6:14；
S3、将所述数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，封膜，然后进行数字PCR扩增反应；
S4、读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddPCR反应体系内CXCR4 S338X位点的突变的拷贝数。
可选的，所述数字PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温13～16sec、58℃保温58～60sec，共进行39～41个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；优选的，首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15sec、58℃保温60sec，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；更优选的，升降温的速度≤2℃/s。
本发明涉及采用数字PCR检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的引物和探针，所述引物和探针用于检测CXCR4 S338X位点的突变的引物和探针。
可选的，用于检测CXCR4 S338X位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQID NO:4所示。优选的，所述SEQ ID NO:3的荧光基团选自FAM、荧光淬灭基团选自MGB；所述SEQ ID NO:4的荧光基团选自VIC、荧光淬灭基团选自MGB。
本发明至少具有以下有益的效果：
本试剂盒采用数字PCR技术，对人类CXCR4 S338X突变进行定量检测，为临床医生对CLL患者疗效监测、制定个体化治疗方案提供参考。
附图说明
图1为CXCR4 S338X突变位点示意图；
图2为检测过程中的界面示意图。
具体实施方式
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例根据CXCR4 S338X突变位点设计了CXCR4 S338X位点的数字PCR检测试剂盒，CXCR4 S338X突变位点示意图如图1所示，突变位点具体如表1所示。CXCR4S338X突变可导致CXCR4蛋白结构C末端产生异常，使得具有调节功能的丝氨酸丢失，导致CXCR4的内化受损和激活延长。CXCR4与其配体CXCL12结合后，使得丝氨酸/苏氨酸激酶和丝裂原活化蛋白激酶信号系统异常活化；同时，CXCR4对于淋巴浆细胞的存活、跨内皮细胞迁移归巢及黏附于骨髓基质都有很大作用。此外，CXCR4S338X突变状态对于WM患者具有一定的临床预后意义。故此对该位点进行引物探针的设计具有重要意义。
表1
CXCR4突变类型 碱基的改变 氨基酸的改变
无义突变 C.1013C<A S338X
无义突变 C.1013C<G S338X
本发明实施例涉及一种用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒，试剂盒中含有核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中含有用于检测CXCR4 S338X位点的突变的引物和探针。具体的，引物和探针的核苷酸序列为如表2所示：
表2
引物探针名称 序列编号 核苷酸序列 修饰
CXCR4 S338X-F SEQ ID NO:1 agagggtccagcctcaagat —
CXCR4 S338X-R SEQ ID NO:2 acatctgtgttagctggagtga —
CXCR4 S338X-MT-P SEQ ID NO:3 gacattratctgtttccact 5’-FAM，3’-MGB
CXCR4 S338X-WT-P SEQ ID NO:4 gacattcatctgtttccact 5’-VIC，3’-MGB
可选的，在核酸扩增试剂中，上游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；下游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；探针的浓度为0.12～0.24μmol/L，优选0.18μmol/L。
可选的，试剂盒中还含有阴性对照和阳性对照，阴性对照为工艺用水。阳性对照为含有表3所示的片段化质粒标准品：
表3
Figure BDA0003245362560000041
可选的，试剂盒所适用的样本选血浆标本或骨髓标本。
本发明还涉及该数字PCR试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
S1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；
S2、配制数字PCR反应混合液：将所述数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到数字PCR反应混合液；优选的，所述数字PCR反应液与所述样品处理液的体积比为6：14；
S3、将所述数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，封膜，然后进行数字PCR扩增反应；
S4、读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddPCR反应体系内CXCR4 S338X位点的突变的拷贝数。
其中，数字PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温13～16sec、58℃保温58～60sec，共进行39～41个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；优选的，首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15sec、58℃保温60sec，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；更优选的，升降温的速度≤2℃/sec。
本发明实施例还涉及一种采用数字PCR检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的引物和探针，引物和探针用于检测CXCR4 S338X位点的突变的引物和探针，核苷酸序列具体如表1所示。
下面通过具体实施方式对本发明实施例做进一步的解释和说明，本发明试剂盒所用到的试剂来源为：引物探针合成来自英潍捷基(上海)贸易有限公司；2×ddPCR MIX3来自bio-rad；质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
仪器型号为：QX200 Droplet Digital PCR系统(美国BioRad公司)。
实施例1
一种用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒，试剂盒的具体组成如表4所示：
表4
Figure BDA0003245362560000051
/>
Figure BDA0003245362560000061
适用仪器：QX200 Droplet Digital PCR系统(美国BioRad公司)。
样本要求：适用于从血浆标本中提取的人类基因组游离DNA(cfDNA)或骨髓标本中提取的人类基因组DNA的检测。
阳性判断值或者参考区间：对2ng/μL DNA可测到0.5‰CXCR4 S338X基因突变。
检验方法：
1.样本处理：
自行进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取DNA)，以此作为PCR反应模板。提取完的核酸建议立即进行检测，否则于-20℃以下保存。
2.扩增试剂准备及加样：
a.从试剂盒中取出相应的反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液：4μL混合液ddPCR+10μL 2×ddPCR MIX3，将上述配制好的PCR预混液，分别按每管14μL的量，分装于各PCR管内。
b.基因组DNA模板浓度测定(qubit测定)好后，用水稀释至2ng/μL，取模板6μL加至装有上述PCR预混液的PCR管中。
c.每个反应体系的总体积为20μL。
d.盖紧PCR管盖，振荡混匀20s以上，瞬时离心后进行微滴制备.
3.制备微滴：
a.将8个20μL反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内。
注意：1)必须先在DG8 cartridge中间1排加样品(若样品不足8个时，空孔请加入20μL BX ddPCR Buffer Control；加样前将移液枪调制20μL示数，取样时吸取管中所有液体)。
2)加样本时，避免产生气泡，如有肉眼可见气泡，可用一洁净枪头戳破气泡。
b.在DG8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μL Droplet Generation oil，盖上胶垫(gasket)，将DG8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2min之内完成。
c.微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μL)转移到96孔板中。
5.封膜
微滴转入96孔板内后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s，无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后应该在30min内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR。
6.PCR扩增：
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μL，注意升降温速度≤2℃/s。
7.微滴读取：
a.先打开电脑，再打开Droplet Reader电源，在使用前需预热至少30min；
b.将之前完成PCR的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中。
c.打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，完成后即可进行Run。注意：1)Supermix选择“ddPCR Supermix for probes”
2)Dye Set选择“FAM/VIC”
8.结果分析：
检测完成后，点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。此图允许手工或自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
点击“Auto Analyze”重设阈值；
手工指定阈值：
使用阈值十字线指定整个点图的分类区域(仅在热图模式下可选)；
使用椭圆，矩形或套索阈值调节工具来分类点图区域：点击相应工具按钮，然后在“Working cluster selector”点击区域类型，使用工具选择相应区域。界面示意图如图2所示：
注意：荧光阈值线的设置参照阴性对照和阳性对照：在2D Amplitude中，荧光阈值线的位置应该使阴性对照的微滴簇在“ch1-ch2-”区间内，阳性对照的4种微滴簇分别位于四个区间内。
检验结果的解释：
1.有效性判定：
阴性对照有效性判定：“ch1+”区的点＜3个点且落在“ch2+”区的点＜3个点。
阳性对照有效性判定：落在“ch1+ch2-”区的点≥3个点且突变比例≥0.5‰。
无效结果的判定：每个反应管的total微滴数应≥8000，若total微滴数＜8000，该反应孔的微滴生成则不理想，需重新进行微滴生成。
2.结果判定：
2.1定性判定
(1)若样本落在“ch1+ch2-”区的点≥3个且突变比例≥0.5‰，则判定CXCR4 S338X位点突变。
(2)如不符合(1)，
若样本DNA≥50拷贝
若样本落在“ch1+ch2-”区的点为<3个或突变比例＜0.5‰，则判定CXCR4 S338X位点无突变或突变低于最低检测限值。
若样本落在“ch1+ch2-”区的点为1-2个，且突变比例≥0.5‰，则判定CXCR4 S338X位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1+ch2-”区的点≥3个且突变比例≥0.5‰，则判定CXCR4 S338X位点突变。反之，判定CXCR4 S338X位点无突变或突变低于最低检测限值。
若样本DNA＜50拷贝，则提示加入的DNA质量不佳或者含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA后或重新取样后再做。重新检测后，样本DNA<50拷贝且不符合(1)，则判定DNA质量不符合要求。反之，按上述条件进行相应判定。
2.2定量判定
样本CXCR4 S338X位点突变，可按Ch1/(Ch1+Ch2)公式进行突变百分比计算。
实验例1引物筛选试验
按一般原则配制引物探针反应液，在每一需要检测的位点上先配制20人份小样进行预实验。
1、根据CXCR4 S338X位点配制表5内的组分。再将引物F1/R2，F2/R1，F2/R2进行替换表4中的F1/R1进行实验，使用通过其他检测方法如NGS测序获得的已知突变频率的标准品进行微滴反应试验来比较各引物搭配之间的好坏，选择最优搭配方案。
表5：CXCR4 S338X反应液
名称 浓度 1人份 20人份
CXCR4 S338X-F1 50μmol/L 0.14μL； 2.8μL
CXCR4 S338X-R1 50μmol/L 0.14μL 2.8μL
CXCR4 S338X-WT 50μmol/L 0.07μL 1.4μL
CXCR4 S338X-MT 50μmol/L 0.07μL 1.4μL
TE 3.58μL 71.6μL
TOTAL 4μL 80μL
引物序列如表6所示：
表6
引物名称 序列编号 核苷酸序列
CXCR4 S338X-F1 SEQ ID NO:7 taaaacctctgcccagcacg
CXCR4 S338X-R1 SEQ ID NO:8 tgaagactcagactcagtgga
CXCR4 S338X-F2 SEQ ID NO:1 agagggtccagcctcaagat
CXCR4 S338X-R2 SEQ ID NO:2 acatctgtgttagctggagtga
CXCR4 S338X引物筛选试验结果如表7～表10所示：
表7：CXCR4 S338X F1/R1引物筛选试验结果
Figure BDA0003245362560000091
表8：CXCR4 S338X F2/R2引物筛选试验结果
Figure BDA0003245362560000092
/>
表9：CXCR4 S338X F2/R1引物筛选试验结果
Figure BDA0003245362560000093
表10：CXCR4 S338X F1/R2引物筛选试验结果
Figure BDA0003245362560000094
通过表7至表10所示微滴读取结果可以看出，CXCR4 S338X F1/R1引物混合的反应液对于阳性标准品突变率检测出的准确性最高，且在阴性样本中有着较好的检测特异性，同时未发现非特异性的突变点数(ch1+ch2-点数)。
引物浓度和探针浓度在整个PCR反应中是相互关联的，因此选用了这两种因素对稀释至10％的质粒参考品进行交叉实验对PCR反应体系进行优化，具体如表11所示。
表11：CXCR4 S338X引物浓度和探针浓度试验结果
Figure BDA0003245362560000101
以上实验结果表明，在节约原材料及保证检测准确性的前提下引物浓度0.35μM，探针浓度为0.18μM的组合为最有效的检测搭配。表明了在拷贝数不受影响的前提检测出的突变率与参考品一致。根据此配制方案进行灵敏度、准确性、稳定性等试验。
实验例2检测限实验
检测灵敏度的确定和依据选取含有突变的临床样本按一定比例与野生的临床样本混合后进行梯度稀释，以确定反应液突变率的参考值，其检测结果如表12所示：
表12：CXCR4 S338X检测限设定试验结果
Sample ch1+ch2-点数 ch1+ch2-拷贝数 ch1-ch2+拷贝数 ratio％ 微滴数
2ng/μL-15％ 821 140 751 15.7 14219
2ng/μL-10％ 555 75 740 9.2 16810
2ng/μL-1％ 86 11.1 752 1.46 17766
2ng/μL-0.5％ 59 8.5 807 1.04 18082
2ng/μL-0.2％ 26 3.2 713 0.45 18030
2ng/μL-0.1％ 11 1.7 776 0.22 18269
2ng/μL-0.05％ 3 0.4 747 0.053 17825
1ng/μL-15％ 685 71 331 17.7 15507
1ng/μL-10％ 270 25.5 333 7.1 16776
1ng/μL-1％ 96 7.7 362 2.08 19052
1ng/μL-0.5％ 32 2.7 338 0.79 19207
1ng/μL-0.2％ 17 1.4 303 0.45 18053
1ng/μL-0.1％ 13 0.95 334 0.28 19745
1ng/μL-0.05％ 2 0.31 325 0.1 18855
0.5ng/μL-15％ 234 21.8 118 15.6 14289
0.5ng/μL-5％ 67 5 104 4.6 17230
0.5ng/μL-1％ 12 0.89 116 0.77 18483
0.5ng/μL-0.5％ 1 0.7 151 0.5 11690
0.5ng/μL-0.1％ 2 0.13 104 0.12 18691
0.5ng/μL-0.05％ 0 0 109 0.06 18222
通过观察微滴读取结果可以看出，当样本浓度在2ng/ul的时候能在0.05％处检出。因此将定性检测范围定为≥0.05％。
检测限的检测结果：根据以上实验结果，采用CXCR4 S338X突变比例为确定的检测限，重复20次，检测结果如表13所示：
表13：CXCR4 S338X检测限结果
Figure BDA0003245362560000111
由以上结果可以看出，在95％的置信区间的条件下，使用CXCR4 S338X检出限参考品(突变率＝0.05％)进行实验，重复20次的实验结果的阳性符合率为100％，，显示为有效的检测灵敏度。
实验例3准确度实验及结果
选用3例临床检测CXCR4 S338X为阳性的华氏巨球蛋白血症患者的DNA样本，进行检测实验并与经过高通量测序方法检测为阳性的突变率进行比较，实验结果如表14所示。
表14：CXCR4 S338X临床样本准确性实验结果
Figure BDA0003245362560000112
根据结果可知，YXX、YX和LXX的样本呈现CXCR4 S338X突变阳性，突变率分别为13.60％、25.00％和22.80％，结果与经过NGS检测计算出的频率相一致。
实验例4:特异性实验及结果
选取CXCR4 S338X经高通量测序检测为阴性的临床样本23例进行检测。实验结果如表15所示。
表15：CXCR4 S338X试剂盒特异性结果
Figure BDA0003245362560000113
Figure BDA0003245362560000121
以上结果显示：CXCR4 S338X试剂盒检测阴性样本结果均为阴性，提示试剂盒特异性好。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
苏州云泰生物医药科技有限公司
<120> 用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagggtcca gcctcaagat 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acatctgtgt tagctggagt ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacattratc tgtttccact 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattcatc tgtttccact 20
<210> 5
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcagagggtc cagcctcaag atcctctcca aaggaaagcg aggtggacat tcatctgttt 60
ccactgagtc tgagtcttca agttttcact ccagc 95
<210> 6
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagagggtc cagcctcaag atcctctcca aaggaaagcg aggtggacat taatctgttt 60
ccactgagtc tgagtcttca agttttcact ccagc 95
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaaacctct gcccagcacg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaagactca gactcagtgg a 21

Claims (6)

1.一种用于检测华氏巨球蛋白血症相关基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测CXCR4 S338X位点突变的引物和探针；
用于检测CXCR4 S338X位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团；
所述SEQ ID NO:3的荧光基团为FAM、荧光淬灭基团为MGB；所述SEQ IDNO:4的荧光基团为VIC、荧光淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求2所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为0.35μmol/L；所述下游引物的浓度为0.35μmol/L；所述探针的浓度为0.18μmol/L。
4.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为含有SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示的片段化质粒标准品。
5.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自血浆标本或骨髓标本。
6.一种采用数字PCR检测华氏巨球蛋白血症的相关基因突变的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针为用于检测CXCR4 S338X位点的突变的引物和探针；
用于检测CXCR4 S338X位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，所述SEQ ID NO:3的荧光基团为FAM、荧光淬灭基团为MGB；所述SEQ ID NO:4的荧光基团为VIC、荧光淬灭基团为MGB。
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